файл диссертации в формате (1508 Kb.)
advertisement
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ федеральное государственное бюджетное учреждение «НАУЧНЫЙ ЦЕНТР АКУШЕРСТВА, ГИНЕКОЛОГИИ И ПЕРИНАТОЛОГИИ ИМЕНИ АКАДЕМИКА В.И. КУЛАКОВА» На правах рукописи ВАНЯН Роза Эдуардовна КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АУТОИММУННЫХ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПРИ «БЕДНОМ» ОВАРИАЛЬНОМ ОТВЕТЕ НА СТИМУЛЯЦИЮ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.01.01- акушерство и гинекология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: доктор медицинских наук Долгушина Н.В. кандидат медицинских наук Менжинская И.В. Москва 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ …………………………………………………………………………………5 Глава 1. Современные представления о «бедном» овариальном ответе на стимуляцию суперовуляции в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы)…………………………………………………………12 1.1 Преждевременная недостаточность яичников как медицинская и социальная проблема…………………………………………………………………………………….12 1.2 Определение и основные причины «бедного» овариального ответа в программах ВРТ……………………………………………………………………..................................13 1.3 Роль аутоиммунных антител в развитии «бедного» овариального ответа в программах ВРТ ……………………………………………………………………............17 1.4 Взаимосвязь генетических факторов и «бедного» овариального ответа в программах ВРТ…………………………………………………………………………….24 1.5. Тактика ведения пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции в клинике ЭКО…………………………………………………………....31 1.6. Эффективность применения глюкокортикоидов у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции и наличием аутоантител к ткани яичника……………………………………………………………………………………...34 Глава 2 Материалы и методы исследования…………………...…… …………….....37 2.1. Дизайн исследования для задач 1 и 2…………………………………………...........37 2.2. Дизайн исследования для задачи 2…………………………………………………...39 2.3. Дизайн исследования для задач 3 и 4…………………………………………...........41 2.4. Расчет объема выборки………………………………………………………………..43 2.5. Методы исследования……............................................................................................44 2.5.1. Общеклинические методы исследования…………………………………………47 2.5.2. Гормональное исследование………………………………………………………47 3 2.5.3. Ультразвуковое исследование органов малого таза……………………………….48 2.5.4.Иммунологические исследования…………………………………………………...49 2.5.5. Генетические исследования…………………………………………………………52 2.6.Стимуляция функции яичников и трансвагинальная пункция яичников.................55 2.7. Оплодотворение и культивирование эмбрионов in vitro……………………………56 2.8. Перенос эмбрионов в полость матки и посттрансферный период…………………56 2.9. Статистический анализ полученных данных…………………………………...........57 Глава 3. Клинико-анамнестические и ятрогенные факторы риска, и исходы программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с «бедным» овариальным ответом ………………………………………………………....................59 3.1. Клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариального ответа у пациенток программ ВРТ.………………………………………………………………..59 3.2. Клинико-лабораторное обследование пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ………………………………………………………………………….65 3.3. Влияние различных протоколов стимуляции суперовуляции на параметры фолликуллогенеза и оогенеза у пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ………………………………………………………………………….....67 3.4. Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции………………………………..…70 Глава 4. Роль аутоиммунных антител и генетических факторов в развитии «бедного» овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий …………………………………………………………………………............75 4.1. Результаты иммунологического исследования у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции…………………………………..75 4.1.1. Исследование аутоантител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости…………………………………………………………………………………….75 4.1.2. Взаимосвязь между уровнем аутоантител и параметрами оогенеза, раннего эмбриогенеза и исходами программ ВРТ…………………………………………………80 4.2. Результаты молекулярно-генетического исследования у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции…………………………………83 4 4.2.1. Число CGG-повторов в гене FMR1 и овариальный ответ в программах ВРТ…………………………………………………………………………………………83 4.2.2. Полиморфизмы гена ВМР15 и овариальный ответ в программах ВРТ…………………………………………………………………………………………85 4.2.3. Полиморфизм СAG-повтора гена андрогенного рецептора и овариальный ответ в программах ВРТ ……………………………………………………………………………89 4.3. Взаимосвязь аутоиммунных и генетических факторов у пациенток с «бедным» овариальным ответом………………………………………………………………………89 4.4. Модель прогноза «бедного» овариального ответа в программах ВРТ на основании оценки клинико-анамнестических, иммунологических и генетических факторов………………………………………………………………………………….95 Глава 5. Обсуждение полученных результатов ……………………………………100 Выводы……………………………………………………………………………………120 Практические рекомендации…………………………………………………..............122 Список сокращений и условных обозначений…………………………………………124 Список литературы………………………………………………………………………127 Приложение………………………………………………………………………………147 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования «Бедный» овариальный ответ (БОО) – это созревание менее 3-х фолликулов при стимуляции суперовуляции большими дозами гонадотропинов (более 300 МЕ/сутки) [138]. В программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) распространенность «бедного» ответа составляет 9-24% [149]. БОО приводит к снижению количества полученных ооцитов, отмене циклов ЭКО и значительному уменьшению Американского вероятности наступления Общества беременности Репродуктивной По [49]. Медицины и данным Общества Вспомогательных Репродуктивных Технологий (2011) до половины всех циклов ЭКО прерываются по причине «бедного» овариального ответа [174]. В 2011 г. Европейское Общество Репродукции Человека и Эмбриологии (ESHRE) впервые представило диагностические критерии БОО: снижение овариального резерва (количество антральных фолликулов менее 5-7 и/или уровень антимюллерова гормона (АМГ) в крови менее 0,5-1,1 нг/мл); наличие факторов риска снижения овариального резерва; БОО в анамнезе. Для диагноза БОО необходимо наличие как минимум двух из трех перечисленных критериев или указание на два и более эпизода БОО в анамнезе [138]. Этиология развития БОО при стимуляции суперовуляции неизвестна. Доказанными факторами риска являются состояния, приводящие к снижению фолликулярного пула: возраст женщины более 40 лет, операции на яичниках в анамнезе, ожирение, химио- и рентгенотерапия и т.д. [147]. Однако БОО часто наблюдается у пациенток без наличия этих факторов риска с нормальным овариальным резервом. Предполагаемыми патогенетическими факторами развития БОО у этих женщин могут быть некоторые численные и структурные аномалии Х-хромосомы, или аутоиммунное поражение тканей яичников [13, 76]. Была отмечена связь неслучайной инактивации Х-хромосомы, а также структурных изменений в области ее длинного плеча (Хq) с развитием 6 преждевременной недостаточности яичников (ПНЯ) [77, 104]. Ген FMR1, расположенный на длинном плече Х-хромосомы в локусе Xq27.8, может содержать различное число тринуклеотидных CGG-повторов [28, 155]. Было установлено, что число CGG-повторов, равное 26-34 (в среднем – 30), характерно для половины женского населения. Более высокое или более низкое число CGGповторов часто связано с развитием ПНЯ, снижением овариального резерва и коррелирует с уровнем фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и АМГ, что влияет на овариальную функцию [76]. Ген BMP15, расположенный в локусе Хр11.2, ингибирует мРНК, участвующую в формировании рецепторов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в гранулезных клетках. Вследствие этого подавляется поздняя ФСГ-зависимая стадия развития фолликулов и ФСГзависимая продукция прогестерона, в результате чего предотвращается преждевременная лютеинизация фолликула. Мутации в гене BMP15, выявляемые у 4-10% больных с ПНЯ, могут приводить к повышению чувствительности гранулезных клеток к ФСГ и преждевременной лютеинизации фолликулов, а также влиять на число кумулюсных клеток и качество ооцитов [60, 128]. И хотя роль генов FMR1 и BMP15 в генезе ПНЯ является доказанной, данные об их значении в развитии БОО и эффективности программ ЭКО практически отсутствуют в мировой научной литературе. Иммунологические факторы играют существенную роль в развитии БОО наряду с генетическими причинами. До 30% случаев ПНЯ являются следствием аутоиммунных нарушений и, в основном, обусловлены повреждающим действием различных антител на ткани яичников. В группе антиовариальных антител (АОА) различают антитела к zona pellucida, антитела к ФСГ, а также антитела к стероидпродуцирующей ткани яичника. Однако данные по влиянию этих антител на развитие БОО противоречивы [89, 99]. Изучение патогенеза развития «бедного» овариального ответа на стимуляцию суперовуляции в программе ЭКО способствует поиску предикторов этого состояния. Возможность раннего прогноза ответа яичников при лечении бесплодия с помощью вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) 7 обуславливает возможность своевременного планирования семьи и выбора оптимального метода стимуляции суперовуляции в программах ВРТ в группах риска развития БОО. Цель исследования Целью исследования является повышение эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции на основании изучения диагностической значимости аутоиммунных и генетических факторов в развитии этого состояния. Задачи исследования 1. Изучить клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариального ответа у пациенток программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). 2. Проанализировать влияние различных протоколов стимуляции суперовуляции на развитие «бедного» овариального ответа и исходы программ ВРТ (параметры фолликулогенеза, оогенеза, раннего эмбрионального развития, частоту наступления беременности и репродуктивных потерь в I триместре). 3. Определить связь между наличием различных видов аутоантител, в том числе к тканям яичника, и снижением овариального ответа в программах ВРТ. 4. Оценить влияние генетических факторов (числа тринуклеотидных CGG-повторов в гене FMR1 и полиморфизмов гена BMP15) на овариальный ответ пациенток в программах ВРТ. 5. Разработать алгоритм ведения пациенток с «бедным» овариальным ответом в клинике ВРТ на основании оценки диагностической значимости 8 клинико-анамнестических, аутоиммунных и генетических факторов в развитии этого состояния. Научная новизна работы На основании использования современных молекулярно-генетических и иммунологических методов были расширены представления о генезе истощения фолликулярного аппарата и развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ и получены следующие новые знания: влияние Выявлены клинико-анамнестические факторы риска и определено различных протоколов стимуляции суперовуляции на развитие «бедного» овариального ответа в программах ВРТ. Исследована зависимость развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ от уровня различных аутоантител к тканям яичника, корреляции содержания различных аутоантител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости, и установлены пороговые уровни аутоантител к тканям яичника, связанные с развитием БОО в программах ВРТ. Изучено влияние числа тринуклеотидных CGG-повторов в гене FMR1и полиморфизмов гена BMP15 на овариальный ответ при стимуляции суперовуляции в программах ВРТ. Определено число CGG повторов в гене FMR1, влияющее на нормальную функцию яичников, и число повторов в зависимости от наличия или отсутствия аутоиммунного поражения яичников в этой группе пациенток. Практическая значимость работы Вследствие проведения данного исследования были выявлены аутоиммунные факторы, коррелирующие с развитием БОО, а также пороговые уровни различных аутоантител к тканям яичника, связанные с развитием БОО и, как следствие, эффективностью программ ВРТ. Также были выявлены 9 молекулярно-генетические предикторы развития БОО, такие как число CGG повторов в гене FMR1 и полиморфизмы гена BMP15, которые могут быть использованы в качестве диагностических и прогностических критериев на этапе подготовки к программе ВРТ у пациенток с риском развития БОО. На основании выявленных клинико-анамнестических, молекулярно-генетических факторов обследования планирующих пациенток, риска был иммунных разработан беременность путем и алгоритм ЭКО, для своевременного выявления групп риска развития БОО. В результате определения влияния различных протоколов стимуляции суперовуляции на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом был разработан алгоритм ведения пациенток групп риска развития БОО с выбором оптимальных схем стимуляции суперовуляции. Положения, выносимые на защиту 1. «Бедный» овариальный ответ в программах ВРТ не зависит от клинико-анамнестических факторов риска за исключением возраста пациенток и возраста наступления менопаузы у их матерей. При этом сниженный овариальный резерв не является абсолютным прогностическим фактором ответа яичников на стимуляцию суперовуляции и выявляется лишь у 81,5% женщин с «бедным» ответом. 2. Протокол стимуляции суперовуляции не оказывает значимого влияния на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом, однако применение агонистов гонадотропин-рилизинг гормона может оказывать позитивное влияние на число полученных фолликулов и ооцитов в данной группе пациенток. 3. «Бедный» овариальный ответ на стимуляцию суперовуляции следует рассматривать как доклинический вариант преждевременной недостаточности яичников, в генезе которого задействованы иммунные и генетические механизмы. У пациенток программ ВРТ при наличии числа CGG-повторов в гене FMR1 более 10 34 «бедный» ответ на стимуляцию суперовуляции наблюдается в 6 раз чаще, а при наличии полиморфизмов гена BMP15 – в 2,5 раз чаще. У пациенток с «бедным» ответом определяются более высокие уровни аутоиммунных антител, в том числе антител к тканям яичника, среди которых особое значение в реализации овариальной функции имеют антитела к блестящей оболочке ооцита. 4. При числе CGG-повторов в гене FMR1 от 26 до 34 у пациенток с «бедным» ответом можно предположить наличие аутоиммунного поражения тканей яичников, тогда как при нормальном уровне антиовариальных антител «бедный» овариальный ответ может быть ассоциирован с генетическими нарушениями (повышением числа CGG-повторов более 34, наличием полиморфизмов гена BMP15). При наличии аутоиммунного фактора БОО характеризуется лучшей сохранностью фолликулярного пула по сравнению с генетически обусловленным «бедным» ответом. Внедрение результатов исследования в практику Результаты исследования внедрены и используются в практической работе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия, лаборатории клинической иммунологии и лаборатории молекулярно-генетических методов исследования ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Материалы и результаты исследования используются в учебном процессе в виде лекций и практических занятий для клинических ординаторов и аспирантов ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Результаты исследования изложены в двух обзорных статьях и четырех оригинальных статьях, опубликованных в журналах «Акушерство и гинекология» (импактфактор 0,621), «Гинекология» (импакт-фактор 0,576), «Проблемы репродукции» (импакт-фактор 0,448), «Иммунология» (импакт-фактор 0,429) 11 Апробация результатов Основные положения работы доложены на ХIV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2013), 9-м Международном конгрессе по аутоиммунологии (Ницца, 2014), 7-м Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Геленджик, 2014), ХV Всероссийском форуме «Мать и дитя» (Москва, 2014). Работа доложена на заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России 18 мая 2015 г. Структура и объем диссертации Диссертация изложена в традиционной форме. Состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, приложения. Работа представлена на 149 страницах, иллюстрирована 16 рисунками и 29 таблицами. Библиографический указатель включает 9 работ на русском и 188 работ на английском языке. 12 Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О «БЕДНОМ» ОВАРИАЛЬНОМ ОТВЕТЕ НА СТИМУЛЯЦИЮ СУПЕРОВУЛЯЦИИ В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Преждевременная недостаточность яичников как медицинская и социальная проблема Совершенствование методов ВРТ помогает в лечении бесплодия супружеским парам во всем мире. Однако даже при самых современных технологиях требуется получение достаточного количества качественных ооцитов, что определяется овариальным резервом женщины [54]. Наиболее частыми причинами снижения овариального резерва являются возраст, операции на яичниках, курение, воздействие радиации, инфекции, химиотерапия, а также генетические и аутоиммунные причины [123, 124, 141, 151]. Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ) характеризуется снижением и прекращением гормональной функции яичников у женщин в возрасте до 40 лет. ПНЯ диагностируется при наличии аменореи в возрасте до 40 лет и повышением уровня фолликулостимулирующего гормона (ФСГ)>40 МЕ/л, определенного дважды в течение 1 месяца [148]. По данным ряда авторов, ПНЯ охватывает период от начала снижения овариального резерва до полного истощения фолликулярного аппарата, однако чаще является проявлением выраженного снижения овариального резерва, что характеризуется снижением уровня антимюллерова гормона (АМГ) и числа антральных фолликулов [154,172, 178]. ПНЯ является необратимой причиной женского бесплодия, сопровождается значительным психоэмоциональным стрессом и риском развития заболеваний сердечно-сосудистой и центральной нервной системы, а также остеопороза [132]. 13 Распространенность ПНЯ в популяции составляет 1%. При этом в возрасте до 20 лет встречаемость данного заболевания составляет 1:10000 женщин, в возрасте до 30 лет – 1:1000 женщин, в возрасте до 40 лет – 1:100 женщин [46, 56]. По данным Goswami D. et al. (2007), первичная аменорея у пациенток с ПНЯ встречается в 10-28% случаев, вторичная аменорея – в 4-18% случаев [84]. При этом менструальная функция сохраняется до истощения фолликулярного аппарата. В дальнейшем периодически могут возникать овуляторные циклы (примерно в 50% случаев) [107]. Однако шансы наступления спонтанной беременности крайне невысоки и не превышают 5-10% [162]. Таким образом, бесплодие и поиск лечебных подходов в его преодолении являются одной из основных проблем пациенток, страдающих ПНЯ [3]. 1.2. Определение и основные причины «бедного» овариального ответа в программах ВРТ Вспомогательные репродуктивные технологии для лечения бесплодия широко применяются во всех странах мира. По данным литературы приблизительно 2,5 % новорожденных детей в Европе рождается вследствие проведения программ ВРТ [136]. Несмотря на постоянное развитие новых технологий, частота наступления беременности в цикле ЭКО по-прежнему не превышает 30-40% [152]. Целью стимуляции функции яичников, являющейся одним из этапов программы ЭКО, является получение большого количества фолликулов, достаточного и адекватного числа высококачественных ооцитов для возможности компенсации ошибок эмбриологического этапа, выбора лучших эмбрионов и их переноса [70]. В 1978 г. гинеколог Steptoe P.C. и физиолог Edwards R.G. сообщили о рождении здорового младенца (девочки) после выполненной программы ЭКО и переноса эмбриона (ПЭ) в естественном цикле [176]. Вскоре после этого новаторского события в практику была введена стимуляция суперовуляции, позволяющая получать большое количество ооцитов, и, как следствие, высокие 14 шансы наступления беременности [147]. Тем не менее, даже после 40-летнего накопленного опыта применения программ ВРТ, по-прежнему есть женщины, плохо отвечающие на проводимую стимуляцию суперовуляции. У пациенток с «бедным» овариальным ответом (БОО) получают мало ооцитов и эмбрионов, что снижает шансы наступления беременности и эффективность программ ВРТ [49]. Распространенность «бедного» овариального ответа на стимуляцию суперовуляции весьма высока, и колеблется по данным литературы от 9 до 24% [21, 63, 149,185]. В исследованиях ASRM/SART были получены данные об отмене 14,1% циклов ЭКО, в 50% - по причине «бедного» овариального ответа [174]. Большой размах в определении распространенности этого явления связан с различиями в дефиниции этого явления. Долгое время в литературе не было единого международного термина ответа яичников на стимуляцию. Наиболее часто использовались следующие определения: «бедный» («poor»), «низкий» («low»), «несоответствующий» («inadequate»), «субоптимальный» («suboptimal»). Часто термин «бедный» овариальный ответ ассоциировался с низким овариальным резервом. Во множестве научных публикаций на тему БОО до 2010 года заключения авторов сводились к одному и тому же: из-за отсутствия единых критериев определения «бедного» овариального ответа нет достаточного числа доказательств для внедрения практических рекомендаций по улучшению исходов лечения этих пациенток [149]. Первая попытка точно охарактеризовать женщин с «бедным» овариальным ответом была предпринята Европейским Обществом Репродукции и Эмбриологии Человека (ESHRE) в 2010 г. на семинаре в Болонье (Италия) [138]. По критериям ESHRE «бедный» овариальный ответ – это созревание менее 3-х фолликулов при стимуляции суперовуляции большими дозами гонадотропинов (более 300 МЕ/сутки). Для диагностики «бедного» овариального ответа необходимо наличие как минимум двух из трех перечисленных критериев: возраст женщины более 40 лет или наличие других факторов риска «бедного» овариального ответа; 15 указание на «бедный» овариальный ответ в анамнезе; данные, указывающие на снижение овариального резерва: количество антральных фолликулов менее 5-7, показатель АМГ в крови менее 0,5-1,1 нг/мл. В возрасте менее 40 лет при отсутствии сниженного овариального резерва для диагностики БОО достаточно наличия 2х эпизодов «бедного» ответа в анамнезе [138]. Однако, несмотря на принятые критерии диагностики БОО, среди ученых до сих пор существуют разногласия в определении этого состояния. По мнению ряда авторов, критерием БОО помимо числа доминантных фолликулов может быть уровень эстрадиола (Е2) менее 100 пг/мл на 5-й день гормональной стимуляции или уровень эстрадиола (Е2) менее 300-500 пг/мл в день введения триггера овуляции [118]. Также нет единого мнения по поводу дозы ежедневно используемых для стимуляции гонадотропинов (Гн). Shaker A. et al. (1993) считают, что для диагностики БОО необходимо использование в программе 44 ампул Гн (по 75 или 100 МЕ) [18]. По мнению Toth T. et al. (1996) суточная доза должна быть больше 300 МЕ [179]. Существуют и другие критерии, такие как определение отношения ФСГ к лютеинизирующему гормону (ЛГ), или измерение базального уровня E2 [149]. По данным Назаренко Т.А. и соавт. (2012) «бедный» овариальный ответ может быть диагностирован при недостаточной реакции яичников на введение даже больших доз гонадотропинов (более 300 МЕ/сутки), когда при трансвагинальной пункции яичников не удается получить больше 3 ооцитов [4]. Однако нельзя диагностировать БОО по наличию единственного эпизода, так как он может быть случайным и не произойти в следующем цикле, если увеличить стартовую дозу Гн или изменить протокол стимуляции [138]. Помимо отсутствия единого мнения по поводу определения БОО существуют различные его классификации. Некоторые авторы разделяют пациенток с «бедным» овариальным ответом на тех, у кого он был отмечен ретроспективно в предыдущих циклах ЭКО, и тех, у кого можно ожидать данное состояние из-за снижения овариального резерва и наличия других факторов 16 риска, таких как возраст или хирургические вмешательства на яичниках [62]. Другие исследователи разделяют пациенток с БОО на следующие две группы. Первая группа включает пациенток молодого возраста (≤37лет) с нормальным индексом массы тела (ИМТ) (вес ≤70 кг), у которых после 9 дней стимуляции яичников гонадотропинами в дозе до 225 МЕ/сутки созревает менее 5 ооцитов. Вторая группа включает пациенток старше 37 лет с массой тела больше 70 кг, у которых в результате 9-дневной стимуляции функции яичников гонадотропинами в дозе более 300 МЕ/сутки получают менее 5 ооцитов [83]. Этиология «бедного» овариального ответа неизвестна, однако существуют доказанные факторы риска его развития [147]: возраст старше 37 лет; указание на оперативные вмешательства на яичниках в анамнезе; наличие эндометриоза; высокий ИМТ; преждевременная недостаточность яичников; воспалительные заболевания органов малого таза (ВЗОМТ) и спаечный процесс в малом тазу; влияние вредных факторов окружающей среды, курение; влияние различных ятрогенных факторов (химио-, радиотерапия при онкологических заболеваниях). Непредвиденный БОО может встречаться у группы пациенток молодого возраста, имеющих нормальные результаты предварительного обследования, у которых отсутствуют доказанные причины «бедного» ответа на стимуляцию функции яичников. Лечение молодых пациенток с БОО - одна из наиболее трудных и нерешенных проблем в репродуктивной медицине [147]. Padhy N. et al. (2008) ретроспективно исследовали различные факторы риска у 104 пациенток с «бедным» овариальным ответом [58]. Изучались такие факторы риска, как возраст, ИМТ, вид бесплодия, продолжительность бесплодия, а также влияние внешних факторов: стресс на работе, курение, наличие операций на 17 органах малого таза в анамнезе, предыдущие попытки ЭКО, базальный уровень ФСГ, средний возраст наступления менопаузы у их матерей. Возраст, указание на операции на органах малого таза и наследственность были основными предикторами БОО. Так, возраст старше 35 лет наблюдался у 60% женщин с «бедным» овариальным ответом и 36,4% женщин контрольной группы, что было статистически значимо. Средний возраст наступления менопаузы у матерей был на 4 года меньше в группе женщин с «бедным» овариальным ответом. Мужской фактор и необъяснимое бесплодие значительно чаще наблюдалось у пациенток с нормальным овариальным ответом. Значительная часть женщин с БОО (31,7%) имела в анамнезе операции на органах малого таза. Тем не менее, «бедный» овариальный ответ может наблюдаться у молодых пациенток без наличия вышеуказанных факторов риска. В таком случае БОО может быть проявлением как клинически выраженной формы ПНЯ при наличии сниженного овариального резерва у женщин моложе 40 лет, так и скрытой формы ПНЯ, когда БОО развивается на фоне нормального овариального резерва. При этом существует несколько этиологических факторов, влияющих на ответ яичников на стимуляцию суперовуляции. Некоторые из этих факторов генетически детерминированы, другие являются приобретенными [147]. 1.3. Роль аутоиммунных антител в развитии «бедного» овариального ответа в программах ВРТ Известно, что снижение фертильности у женщин может быть обусловлено не только заболеваниями половых органов и нейроэндокринной системы, но и иммунологическими нарушениями. Аутоиммунные поражения репродуктивной системы могут быть связаны как с общей активацией иммунной системы, так и с реакциями иммунной системы, направленными непосредственно против антигенов тканей яичников [89]. ПНЯ и субклиническая форма этого состояния, выражающаяся в снижении овариального резерва и БОО на стимуляцию 18 суперовуляции в программах ВРТ, может быть следствием поражающего воздействия аутоантител на ткани репродуктивной системы женщины [145]. Впервые гипотезу об аутоиммунном механизме развития ПНЯ вследствие повреждающего действия антиовариальных антител (AOA) предложил Moncayo R. et al. в 1990 г. [127]. Однако существуют противоречивые данные о роли различных аутоантител в повреждении тканей яичника, эмбриона, нарушении процесса имплантации и формировании плаценты [152]. Яичник может быть мишенью для аутоиммунной атаки при некоторых органоспецифических и системных аутоиммунных заболеваниях [120]. От 10 до 30% женщин с ПНЯ имеют аутоиммунную патологию, наиболее часто – аутоиммунный тиреоидит с гипофункцией щитовидной железы [20]. Неоднократные неудачные попытки ЭКО также часто связывают с наличием антител к ткани щитовидной железы [66]. Кроме тиреоидита, ПНЯ ассоциируется с миастенией, системной красной волчанкой, ревматоидным артритом и болезнью Крона [20]. Это объясняется тем, что органоспецифические аутоиммунные заболевания, такие как тиреоидит, могут развиться вторично на фоне аутоиммунных нарушений, которые непосредственно влияют на исход программ ВРТ [184]. Неудачи в циклах ЭКО и нарушения в репродуктивной системе женщины, по мнению некоторых авторов, распространенности различных антифосфолипидных (AФА), могут видов быть связаны аутоантител, антиспермальных, с в увеличением том числе антиэндометриальных, антинуклеарных, антител к ткани щитовидной железы, к гладкой мускулатуре [13, 89]. Кроме того, существует точка зрения, что в генезе ПНЯ и БОО важное значение имеет развитие общей активации иммунной системы [72]. Тем не менее, до половины случаев ПНЯ ассоциируются с аутоиммунными реакциями именно в тканях яичника [89]. Наличие тканеспецифических, повреждающих ткань яичника, аутоантител часто связано с местным инфекционно-воспалительным процессом или ятрогенными манипуляциями [39]. Аутоиммунный оофорит является важной причиной обратимой формы ПНЯ. В его развитии участвуют как 19 клеточное, так и гуморальное звено иммунитета. активность периферических Т-лимфоцитов. Отмечается повышенная Нарушения могут быть как изолированными, так и связанными с другими аутоиммунными эндокринными заболеваниями [173]. Существуют данные о том, что аутоиммунный оофорит может возникать в подростковом возрасте как компонент аутоиммунного полиэндокринного синдрома (APS) [110]. Определение аутоиммунного генеза ПНЯ затрудняется тем, что это заболевание диагностируется тогда, когда у женщины уже полностью истощен овариальный резерв и отсутствуют антигены-мишени в ткани яичника. Генез заболевания нельзя доказать при проведении ретроспективных исследований. Но его можно предположить, так как у женщин с ПНЯ отмечается высокая распространенность (до 30-67% случаев) неорганоспецифических аутоантител [44]. АОА и других органо- и Поскольку распространенность АОА у пациенток с «бедным» овариальным ответом и ПНЯ сопоставима, было предложено считать БОО ранним этапом развития аутоиммунной формы ПНЯ [89]. На сегодняшний день данные по влиянию АОА на развитие осложнений в программах ЭКО, в частности «бедного» овариального ответа, противоречивы [99]. Негативное влияние АОА связывают не только с развитием БОО, но и повреждающим действием АОА на ооцит и эндометрий, что может явиться причиной неудачной имплантации [175]. Прослеживается прямая зависимость между персистенцией АОА и повреждением ткани яичника. Так, по мнению Pogacnik KR. et al. (2014) АОА играют решающую роль в неэффективности программ ВРТ и обнаруживаются у 20-30% пациенток с ПНЯ [148]. Их наличие свидетельствует об аутоиммунном повреждении ткани яичника [61, 148]. Было продемонстрировано, что часто первичная манифестация AOA происходит после пункции фолликулов, а существовавшие ранее титры АОА увеличиваются в зависимости от числа попыток ЭКО [175]. Несмотря на то что АОА класса IgG определяются у пациенток с разными видами бесплодия, специальных эпидемиологических исследований по изучению их распространенности не 20 проводилось. По разным оценкам аутоиммунными формами ПНЯ страдает около 1,1 млн. женщин в США. В связи с этим, аутоиммунные поражения яичников являются более часто встречающейся аутоиммунной патологией, чем болезнь Аддисона, миастения или системная красная волчанка [120]. Антиовариальные антитела были впервые выявлены в 1966 году Vallotton M.B. et al. в яичниках кролика [193]. На сегодняшний момент в группе АОА различают антитела к блестящей оболочке ооцита, антитела к рецептору ФСГ, а также антитела к белкам и ферментам стероид-продуцирующей ткани яичника [89]. По данным Luborsky J. et al. (2002) АОА обнаруживаются в сыворотке крови пациенток с бесплодием неясного генеза в 33±6,1% случаев [120]. Количество этих антител коррелирует с уровнем ФСГ и ингибина В и поэтому эти антитела могут рассматриваться в качестве маркеров аутоиммунного поражения яичников, предсказывая будущее угасание функции яичников у женщин с необъяснимым бесплодием. На сегодняшний день, определение АОА может иметь значение для прогноза исхода лечения бесплодия методом ЭКО [31]. По мнению ряда авторов, роль АОА в негативных исходах программ ВРТ значительна, поэтому определение их количества должно производиться до начала программы ЭКО и ПЭ, чтобы оценить овариальный ответ и определить дальнейшую тактику ведения пациенток [99]. Антиооцитарные антитела были обнаружены в фолликулярной жидкости пациенток в программах ВРТ. Частота выявления этих антител была значительно выше у пациенток с БОО, а также при отсутствии оплодотворения ооцитов (40% и 50% соответственно) [30]. К антиооцитарным антителам относятся, в частности, антитела к блестящей оболочке ооцита (zona pellucida), которые часто определяются в сыворотке женщин с ПНЯ и бесплодием [68, 85]. Антитела к блестящей оболочке наиболее часто определяются в крови и фолликулярной жидкости пациенток с 2-мя и более неудачными попытками ЭКО и при эндометриозе [100]. Блестящая оболочка млекопитающих представляет собой внеклеточный матрикс, окружающий ооциты. Через нее осуществляются двухсторонние связи 21 между яйцеклеткой и клетками гранулезы [186]. Установлена ее важнейшая роль в процессе фолликулогенеза и имплантации [57]. Появление антител к блестящей оболочке ооцита может привести к нарушению развития фолликула и созревания яйцеклетки [186]. Учитывая иммуногенность блестящей оболочки, было предпринято несколько попыток создать на ее основе контрацептивную вакцину. Однако в экспериментах на животных было показано, что наличие антител к блестящей оболочке ведет к повреждению ткани яичника с формированием аутоиммунного оофорита [68]. В своей работе по исследованию блестящей оболочки неоплодотворенных ооцитов у пациенток в программах ВРТ Koyama K. et al. (2005) выявили значительные титры антител к ней у 5 из 10 пациенток с ПНЯ и у 2 из 17 женщин с другими видами бесплодия. На основании полученных результатов авторы сделали заключение о важной роли антител к блестящей оболочке в генезе ПНЯ и нарушений процесса оплодотворения [68]. Другой мишенью аутоантител могут стать гонадотропины и их рецепторы. Первоначально изучалась роль антител к рецептору лютеинизирующего гормона (ЛГ). Эти антитела были выявлены у 30% пациенток в программах ВРТ и у 50% бесплодных женщин с эндометриозом [157]. У незначительной части пациенток с ПНЯ также были обнаружены антитела к рецептору ФСГ [89]. В дальнейших исследованиях была определена их патофизиологическая роль в генезе ПНЯ и БОО [94]. Одной из причин появления антител к ФСГ и ЛГ в программах ВРТ может быть иммунизация организма женщины экзогенно вводимыми гонадотропинами [50]. Уровень антител к ФСГ коррелирует с уровнем ФСГ крови и зависит от циклических изменений, происходящих в яичниках [182]. По последним исследованиям Haller K. et al. (2008) существует обратная корреляционная связь между уровнем антител к ФСГ класса IgG и IgA в день трансвагинальной пункции яичников и количеством полученных ооцитов. Высокий титр этих антител влияет на эффективность стимуляции суперовуляции, снижает количество растущих фолликулов и число полученных зрелых ооцитов [88]. Помимо аутоиммунной агрессии к ткани яичника, анти-ФСГ антитела могут влиять на биологическую активность экзогенного или эндогенного ФСГ [45]. 22 Кроме того, анти-ФСГ антитела нарушают связывание гормона с рецептором. Эта гипотеза подтверждается данными литературы, согласно которым большая часть антител к ФСГ направлена против 78–93 аминокислот антигенной детерминанты β-субъединицы ФСГ, которая играет ключевую роль во взаимодействии гормона и его рецептора [69]. Многие исследователи отмечают важное значение титра антител к ФСГ в развитии БОО яичников, однако механизм участия антител в патогенезе БОО до сих пор не установлен. Известно, что кроме учета клинических данных целесообразно проводить определение исходного уровня антител к ФСГ в нестимулированном спонтанном цикле [88]. Определение уровня антител до начала стимуляции овуляции важно для решения вопроса о проведении иммуносупрессивной подготовки к протоколу ЭКО. Кроме того, титры антител во время стимуляции снижаются за счет образования иммунных комплексов с препаратами рекомбинантного ФСГ или эндогенным ФСГ [50]. Уровень антител IgМ к ФСГ остается неизменным во время стимуляции, но увеличивается после каждой попытки ЭКО, что может быть связано с гормональной стимуляцией функции яичников и с пункцией фолликулов [157]. Антитела к ФСГ могут поступать из крови в фолликулярную жидкость. Уровни антител к ФСГ классов G и A в фолликулярной жидкости коррелируют с их уровнем в сыворотке крови. Концентрация анти-ФСГ IgG увеличивается с ростом фолликула, в то время как уровень в сыворотке анти-ФСГ IgG значительно снижается во время стимуляции овуляции. Уровень антител к ФСГ класса IgG также коррелирует с количеством вводимого во время стимуляции овуляции рекомбинантного препарата ФСГ [88]. Haller K. et al. в 2008 г., исследуя концентрацию антител к ФСГ у пациенток в циклах ЭКО, доказали наличие связи между уровнем IgG и IgA и неблагоприятными исходами ВРТ. При высоком уровне антител (более 1,0 усл. ед.) наблюдался «бедный» овариальный ответ (≤ 3 ооцитов) (ОШкор для IgG составило 6,95, p=0,005, для IgA - 3,60, p=0,039). На основании полученных данных авторы предположили, что сывороточные 23 антитела к ФСГ ассоциируются с БОО и могут оказывать местный антагонистической эффект на функцию ФСГ в созревании фолликулов [88]. Антитела к стероид-продуцирующей ткани яичника (27α-гидроксилаза, десмолаза, 3β-гидроксистероид дегидрогеназа, 21-гидроксилаза, альдегид дегидрогеназа, селен-связывающий протеин 1, белок теплового шока 90-β, антиальфа энолаза) были описаны впервые в 1968 г. Anderson J.R. et al. у двух пациентов с болезнью Аддисона [98]. Irvine W.J. et al. (1968) выявили наличие этих антител у 10 пациенток с болезнью Аддисона, из которых у 5 болезнь Аддисона сочеталась с аутоиммунной формой ПНЯ. В сыворотке крови этих пациенток содержались антитела, направленные против коры надпочечников, трофобласта, тека-клеток и гранулезных клеток половых желез [97]. Наиболее часто подобные антитела вырабатываются против тека-клеток яичника, реже против желтого тела и гранулезных клеток [31]. В таких случаях именно текаклетки преантральных и антральных фолликулов являются мишенями для аутоиммунных процессов. При этом аутоиммунная воспалительная реакция не влияет на первичные фолликулы и гранулезные клетки до момента лютеинизации, которая происходит уже после овуляции. Антитела к стероид-продуцирующей ткани яичника блокируют выработку андростендиона, и, впоследствии, эстрадиола. Снижение уровня Е2 приводит к росту ФСГ, который при высоких значениях стимулирует не только рост фолликулов, но и приводит к образованию кист. При этом уровень ингибина В, продуцируемого гранулезными клетками, не изменяется [168]. Таким образом, поскольку антитела к стероид-продуцирующей ткани яичника не повреждают первичный растущий фолликул, фертильность при данном виде оофорита может быть сохранена, однако происходит постепенное угасание функции яичников, конечной точкой которого является ПНЯ [128]. Антитела к стероид-продуцирующей ткани яичника встречаются чаще у пациенток, имеющих ПНЯ в сочетании с другой аутоиммунной патологией, чем при изолированной форме ПНЯ (6,5-8%). Наиболее часто антитела выявляются при сочетании ПНЯ с болезнью Аддисона (от 73-87% до 100% случаев) [29, 177]. 24 Таким образом, антитела к стероид-продуцирующей ткани яичников являются маркерами ПНЯ у пациенток с сопутствующей аутоиммунной патологией [31]. 1.4. Взаимосвязь генетических факторов и «бедного» овариального ответа в программах ВРТ Помимо иммунологических факторов, влияющих на функцию яичников, БОО может быть детерминирован генетическими причинами. С тех пор как была создана карта генома человека, были достигнуты значительные успехи в поиске генов, связанных с овариальной функцией [114]. Встречаемость семейных форм ПНЯ примерно у каждой 3–4 пациентки приводит к выводу о большой значимости генетических факторов в генезе преждевременного истощения фолликулярного пула [3]. Предполагаемыми патогенетическими факторами развития «бедного» овариального ответа у женщин с ПНЯ могут быть некоторые численные и структурные аномалии Х-хромосомы [76]. Ген FMR1, расположенный на длинном плече Х-хромосомы в локусе Xq27.8, может содержать различное число тринуклеотидных CGG-повторов [28]. Установлено, что именно ген FMR1 является наиболее частой генетической причиной развития ПНЯ [155]. Премутация данного гена, характеризующаяся генотипом 55-200 CGG повторов, на протяжении долгого времени является достоверным фактором развития ПНЯ, в то время как «серая» зона (или промежуточный генотип 45-55 CGG повторов) приводит к данной патологии значительно реже [183]. Однако такое разделение на генотипы описано для определения рисков нервно-психических заболеваний. Истинная мутация гена FMR1 характеризуется генотипом >200 CGG повторов, является частой наследственной причиной аутизма и умственной отсталости у мужчин, и носит название синдрома хрупкой или ломкой Х-хромосомы (FRAXA) [55, 87,183]. Ген FMR1 кодирует РНК-связывающий белок, который называется «белком умственной отсталости хрупкой Х-хромосомы» - FMRP [87]. Соответственно, 25 FMR1 ген относится к группе генов, мутации которых ассоциируются с нервнопсихическими заболеваниями и приводят к таким болезням, как миотоническая дистрофия и болезнь Хангтингтона [87]. Сегодня широко изучаются эффекты гена FMR1 на функцию яичников [55], так как данный ген играет значительную роль в контроле овариального резерва и процессе старения яичников [75]. Bretherick K. et al. (2005) and Bodega B. et al. (2006) выявили в своих исследованиях, что риск развития ПНЯ определяется не только премутацией гена FMR1, но и числом CGG повторов в диапазоне 41-55, при котором вероятность преждевременного истощения фолликулярного аппарата яичников высока. В работах данных авторов утверждается, что чем выше число CGG повторов в гене FMR1, чем ближе это число к премутации гена, тем чаще выявляется ПНЯ и снижение овариального резерва в молодом возрасте. При невыраженном повышении числа повторов возможно раннее снижение овариального резерва без развития ярко выраженной клинической картины ПНЯ [38, 102]. К таким же выводам пришел Gleicher N. в 2010 году, установив в результате своих исследований, что регуляция овариальной функции геном FMR1 определяется числом тринуклеотидных CGG повторов. Число повторов, определяющих риск для нервно-психических состояний, отличается от такового для ПНЯ и снижения овариального резерва [75]. Было установлено, что «нормальное» число CGG-повторов, равное 26-34, встречается у половины женского населения [76]. Женщины с двумя аллелями в пределах этой нормы имеют нормальный генотип, при отклонении одного из аллелей гена от 26-34 повторов - гетерозиготный генотип, при отклонении обоих аллелей от этого диапазона - гомозиготный генотип [73]. В зависимости от того, в какую сторону отклоняется от нормального диапазона число CGG повторов - в большую или меньшую сторону, выделяют соответствующие субгенотипы (high/low) [73]. Генотипы и субгенотипы гена FMR1 отражают различные модели угасания функции яичников [75]. По последним данным, очень важно определение субгенотипов гена, так как они показывают не просто модель старения яичников, 26 а создают неоспоримую ассоциацию между функцией яичников и, следовательно, фертильностью женщины, и аутоиммунитетом [67]. В ряде работ зарубежных авторов было выявлено, что число CGG-повторов коррелирует с основными показателями овариального резерва-уровнями ФСГ и АМГ [76]. Число повторов в пределах 29-30 соответствует нормальному овариальному резерву. Более высокое или более низкое число CGG-повторов часто связано с развитием ПНЯ и снижением овариального резерва [76]. Gleicher N. et al. в своих работах доказали связь числа тринуклеотидных CGG-повторов с уровнем АМГ и овариальным резервом. Так, при снижении числа CGG-повторов менее 28 с каждым последующим снижением на 5 повторов овариальный резерв снижается на 40%. При повышении числа CGG-повторов выше 35 увеличение на каждые 5 повторов снижает уровень АМГ и уровень овариального резерва на 50% [166]. По данным исследований Chatterjee S. et al. (2009), у пациенток с числом CGG-повторов более 30 значимо повышается уровень ФСГ [41]. Вследствие того, что CGG-повторы в гене FMR1 коррелируют с уровнем АМГ, они также могут коррелировать с клиническими исходами программ ВРТ. По данным Streuli I. et al. (2009) у женщин, проходящих терапию бесплодия методом ЭКО, при отсутствии ответа на стимуляцию гонадотропинами, при исследовании аллелей гена FMR1 число CGG повторов находится в промежуточной зоне или близко к премутации гена [103]. По результатам своих исследований Gleicher N. et al. выявили, что у пациенток с числом CGG-повторов менее 35 в возрасте до 38 лет отмечался значительно более высокий уровень АМГ. Таким пациенткам требовались значительно меньшие дозы гонадотропинов, и было получено больше ооцитов, чем у женщин с числом повторов более 35. Таким образом, определение числа CGG-повторов гена FMR1 является предиктором овариального ответа и дает объяснение его зависимости от дозы назначаемых гонадотропинов, что важно не только для прогнозирования будущего риска ПНЯ у молодых женщин, но и может помочь в оценке риска развития «бедного» овариального ответа в программе ЭКО [166]. В других работах по изучению исходов программы ЭКО, связанных с геном FMR1, было 27 выявлено, что гетерозиготный субгенотип с числом повторов менее 28 приводит не только к снижению овариального резерва, БОО, снижению качества ооцитов, но и снижению шансов наступления беременности в цикле ЭКО [67]. Таким образом, ген FMR1, помимо регулирования нейро-психических процессов, играет ключевую роль в физиологии яичника и фертильности женщины [76]. Идиопатические формы ПНЯ часто бывают вызваны генетическими изменениями, которые являются непосредственной причиной яичниковой недостаточности, при этом мутации могут возникнуть не в одном, а в целом наборе генов, отвечающих за сохранение овариального резерва [12]. Persani L. et al. (2009) отмечают, что ген BMP15 представляет первый детерминирующий функцию яичника ген, расположенный на Х-хромосоме, гетерозиготная мутация которого может быть одной из основных причин ПНЯ наряду с FMR1 [155]. Ген BMP15, расположенный в локусе Хр11.2, ингибирует мРНК, участвующую в формировании рецепторов ФСГ в гранулезных клетках. Вследствие этого подавляется поздняя ФСГ-зависимая стадия развития фолликулов и ФСГзависимая продукция преждевременная прогестерона, лютеинизация в результате фолликулов. чего Мутации предотвращается в гене BMP15, выявляемые у 4-10% женщин с ПНЯ, могут приводить к повышению чувствительности гранулезных клеток к ФСГ и преждевременной лютеинизации фолликулов, а также влиять на число кумулюсных клеток и качество ооцитов [128]. Субстанция BMP15 из подсемейства костных морфогенетических протеинов (BMP) представляет вырабатываемый ооцитом фактор роста из суперсемейства трансформирующих факторов TGF-b, которые участвуют в развитии фолликула, являясь важнейшим регулятором многих процессов, происходящих в гранулезных клетках [106, 165]. Экспрессия BMP15, с увеличением которой усиливается рост и развитие ооцитов, происходит в ооцитах внутри яичника [42]. Фактор BMP-15 важен не только для роста и дифференцировки ооцитов. Установлено его огромное значение в процессе рекрутирования под действием гонадотропинов числа фолликулов, способных к 28 овуляции [91]. С помощью двусторонних коммуникационных связей яйцеклетка влияет на кумулюсные и гранулезные клетки, окружающие ее. Координация между данными клетками необходима для созревания ооцита, достижения им зрелости и последующего оплодотворения [71]. BMP15, а также другие факторы роста и дифференцировки, активины и ингибины, обеспечивают пролиферацию и развитие окружающих ооцит клеток [158]. Экспрессия антиапоптотического фактора Bcl-2 и проапоптотического фактора Bax в гранулезных клетках, которая приводит к атрезии фолликулов и снижает жизнеспособность ооцитов, также регулируется BMP-15 [137]. При завершении процесса трансляции BMP15 представляет собой пропептид, состоящий из сигнального белка, зрелого белка и крупной про-области. После удаления сигнального белка про-пептид димиелинизуется и подвергается протеолизу. Установлена важная роль про-пептида BMP15 в сохранении фертильности и яичникового резерва [91, 128]. На животных моделях было доказано, что BMP15, вырабатываемый ооцитом для паракринного регулирования, является важнейшим фактором нормального фолликулогенеза. Многие встречающиеся мутации гена BMP15, выявленные у некоторых пород овец, оказывают глубокое воздействие на их рождаемость. У гомозиготных носителей этих мутаций блокируется развитие и рост фолликулов, в то время как у гетерозиготных особей происходит овуляция и отмечается более высокая фертильность [132]. В опытах при стимуляции овуляции гонадотропинами у женских особей трансгенных мышей с мутацией BMP15 созревало меньшее число фолликулов, снижалось количество и качество полученных ооцитов и их способность к оплодотворению [86]. В совокупности все эти исследования показали, что повышенная экспрессия BMP15 увеличивает процессы митоза в гранулезных клетках и является причиной атрезии фолликулов вследствие ингибирования рецепторов ФСГ [139]. У женщин значение полиморфизмов и мутаций BMP15 широко изучено в патогенезе ПНЯ [34]. Впервые данная мутация была описана при недостаточности яичников у 2-х сестер с гипергонадотропной аменореей и дигенезией гонад. В положении 704 гена BMP15 был обнаружен 29 переход A-G. Данная мутация приводит к неконсервативной замене Y235C в прообласти BMP-15 (BMP-15Y235C). Интересен тот факт, что это была гетерозиготная мутация, хотя на животных моделях только носители гомозиготных мутаций страдали дисгенезией гонад [59]. В дальнейшем при проведении генетических исследований у женщин с идиопатическими формами ПНЯ выявлялось все больше новых вариантов BMP15. В разные периоды исследователи изучали полиморфизмы гена BMP15 у разных популяций женщин со снижением овариального резерва по всему миру [35, 126, 130, 131, 169]. На основании всех полученных данных многие исследователи сделали вывод о важнейшем значении гена BMP15, расположенного на Х-хромосоме, в регулировании овариального резерва женщины [114]. Была обнаружена обратная корреляционная зависимость между тяжестью мутации в гене BMP15 и возрастом проявления клинических симптомов ПНЯ [14]. Редкие делеции и миссенс-мутации в кодирующей области BMP15 также приводят к быстрому истощению яичникового резерва [135]. Rossetti R. et al. (2009), занимаясь исследованием миссенс-мутаций у 300 пациенток с идиопатическими формами ПНЯ, сделали выводы о том, что гетерозиготные мутации BMP15 приводят к раннему началу недостаточности яичников, при этом адекватное количество субстанции BMP15 в фолликулярной жидкости необходимо для нормального роста фолликулов [36]. Генетические полиморфизмы гена BMP15 могут влиять на исход стимуляции функции яичников в программе ЭКО [17]. Однако на сегодняшний день данные весьма противоречивы. В работе Hanevik H.I. et al. (2009) по изучению влияния SNP (single nucleotide polymorphism) полиморфизмов гена BMP15 на результат стимуляции суперовуляции было установлено более частое присутствие G аллеля в положении 905 у пациенток с «бедным» ответом. При этом, у женщин с гиперстимуляцией яичников был обнаружено преобладание G аллеля SNP с. -9 С >G. [16]. В исследовании, посвященном изучению связи между полиморфизмом с. -9 С>G с бесплодием, ановуляцией и СПКЯ, никаких корреляций между данными состояниями обнаружено не было [27]. Молекулярные механизмы, лежащие в основе действия SNP BMP15 не 30 установлены, однако считается, что данные полиморфизмы могут изменять активность фактора BMP15, влияя на его секрецию ооцитом [37]. Изучение мутаций гена BMP15 у женщин с бесплодием и «бедным» овариальным ответом поможет перенести фундаментальные знания об этом гене в клиническую практику [140]. Соотношение андрогенов и эстрогенов в сыворотке крови и фолликулярной жидкости играет важную роль в росте и созревании фолликулов и в формировании обратной отрицательной связи между яичником и гипофизом. Все андрогены действуют через андрогеновый рецептор, который является фактором ядерной транскрипции для генов, участвующих в процессе фолликулогенеза [153]. Андрогеновый рецептор (AR) человека расположен в области Xq11.2 на Ххромосоме и содержит полиморфную последовательность числа CAG повторов. Исследования показали, что присутствует обратная связь между числом CAG повторов в гене AR и его активностью, и многие клинические ситуации, включая бесплодие, ПНЯ, СПКЯ, были объяснены ролью AR [125]. По данным Laisk T.et al. (2010) длина CAG-AR значительно короче у пациенток со снижением овариального резерва и с СПКЯ, при этом отмечается положительная корреляционная связь между неслучайной инактивацией Х-хромосомы и уровнем ФСГ [22]. Однако результаты исследований зарубежных авторов в этом вопросе часто расходятся. Так, Chatterjee S. et al. (2009) при изучении пациенток с несемейными формами ПНЯ выявили, что средняя длина CAG повторов в экзоне 1 гена андрогенового рецептора у данной группы была значимо выше, чем в контрольной группе, и составила 23,6±3,8 и 20,08±3,45 повторов соответственно (р<0,001) [117]. Случайная инактивация хромосомы X (XCI) относится к общебиологическому процессу. Однако в ряде случаев происходит неслучайная (избирательная) инактивация хромосомы X (SXCI) одного из родителей, которая не связана с развитием какой-либо видимой патологии. Частота SXCI в популяции оценивается в 1,5-3,5% [113]. Инактивация Х-хромосомы может привести к изменению деятельности Х-сцепленных генов [22]. Изучена связь SXCI с ПНЯ. При этом частота ее встречаемости у пациенток с ПНЯ в 31 зависимости от этнической принадлежности изучаемой популяции составляет от 20 до 50% [167]. 1.5. Тактика ведения пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляцию в клинике ЭКО На сегодняшний день ряд гормональных и клинических параметров, таких как уровень ФСГ, эстрадиола, ингибина В, АМГ, возраст пациентов, количество антральных фолликулов, используется для оптимизации и прогнозирования ответа яичников на стимуляцию суперовуляции. Широко используются несколько биохимических маркеров (уровень ФСГ, ингибина B и AMГ), отражающих способность яичников «обеспечить» рост полноценных фолликулов, содержащих яйцеклетки [142]. В целом, измерение уровня ФСГ и эстрадиола на 2-4 дни менструального цикла можно отнести к разряду специфических, но не чувствительных маркеров ответа яичников на стимуляцию. Значения этих показателей в пределах нормативных не обязательно исключают наличие сниженного овариального резерва [156]. AMГ является на сегодняшний день одним из наиболее чувствительных маркеров для определения овариального резерва, поскольку его величина не зависит от дня менструального цикла [171]. Вместе с тем при интерпретации результатов уровня АМГ необходимо учитывать возраст и вес пациентки. Так, у женщин с ожирением в позднем репродуктивном возрасте уровень AMГ на 65% ниже по сравнению с женщинами с нормальным весом [25]. Кроме того, АМГ жестко коррелирует с числом антральных фолликулов, с величиной пула примордиальных фолликулов, но не коррелирует ни с количеством, ни с качеством получаемых в результате ооцитов. Поэтому поиск генетических маркеров, способных отражать одновременно количество и качество ооцитов, позволит в будущем повысить полноценность проводимого обследования пациенток [70]. Несмотря на современные достижения в области лечения бесплодия, существует необходимость индивидуализировать и оптимизировать подготовку 32 больных к программе ЭКО, протоколов стимуляции суперовуляции, снизить вероятность неадекватного ответа яичников и развития осложнений, повышая эффективность и безопасность программ ВРТ, а также вероятность рождения живого здорового ребенка. Важность определения причины развития «бедного» овариального ответа до проведения повторных попыток ЭКО определяется возможностью профилактики этого осложнения. Повышение дозы гонадотропинов является наиболее часто используемой тактикой получения ооцитов у пациенток с БОО. По мнению большинства авторов, стартовая доза гонадотропинов в протоколах стимуляции суперовуляции у пациенток с БОО должна составлять не менее 300 МЕ/сутки [118, 147]. По мнению других авторов, у пациенток с низким количеством антральных фолликулов нецелесообразно удваивать стандартную стартовую дозу препаратов Гн [64]. Также существует мнение, что тактика повышения дозы гонадотропинов может быть оправдана только у пациенток с недостаточным порогом чувствительности к ФСГ [133]. Lekamge D.N. et al. (2008) в ретроспективном исследовании показали, что у пациенток со сниженным овариальным резервом, прогнозируемом по низкому уровню АМГ, нецелесообразно назначение повышенных стартовых доз ФСГ [101]. Многие исследователи вначале проявляли энтузиазм по поводу использования рекомбинантных ФСГ (рФСГ) у пациенток с БОО, что было связано с полученными данными о большем количестве получаемых ооцитов, более высоким удельным весом зрелых ооцитов, лучшем качестве эмбрионов и более высоком коэффициенте наступления беременности при применении рФСГ по сравнению с препаратом очищенного мочевого ФСГ [163]. Однако впоследствии эти оптимистичные результаты не были подтверждены другими исследователями [105]. В проведенном мета-анализе также не было получено статистически значимых различий между результатами ВРТ при назначении рФСГ и очищенного мочевого ФСГ [143]. Тактика введения ФСГ в лютеиновой фазе впервые была предложена в конце 1990-х годов [164]. Предполагалось, что более раннее введение ФСГ может 33 увеличить количество проведенного селективных рандомизированного фолликулов. клинического В дальнейшем испытания данные (РКИ) не подтвердили эти предположения [147]. В исследовании Kucuk T. et al. (2007) в результате раннего введения рФСГ в лютеиновой фазе цикла одновременно с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона («длинный» протокол) у пациенток с БОО было получено большее число ооцитов в метафазе II по сравнению с «коротким» протоколом с аГнРг и введением высоких доз ФСГ [111]. Было выявлено, что исходы программ ВРТ с началом введения ФСГ в лютеиновой фазе были аналогичны таковым при введении ФСГ в фолликулярной фазе, а, значит, начало применения ФСГ в лютеиновой фазе может быть альтернативным протоколом для пациенток с БОО [161]. Тем не менее, исследования, проводимые до недавнего времени, являются небольшими, а результаты - противоречивыми. Необходимо проведение масштабного рандомизированного исследования для решения этой проблемы. Препараты лютеинизацию аГнРГ предотвращают фолликулов, но их преждевременную использование также овуляцию и связано с необходимостью введения более высоких доз Гн. В стандартных протоколах стимуляции суперовуляции аГнРг начинают вводить в середине лютеиновой фазы. У пациенток с БОО рекомендованы более низкие дозы аГнРг или изменение срока начала введения препаратов аГнРг [147]. Существуют различные вариации в подборе дозы аГнРг [147]. Например, при использовании аГнРг «stop» протоколов введение аГнРг начинается в середине лютеиновой фазы менструального цикла и прекращается при блокаде функциональной активности гипофиза, после чего начинается стимуляция функции яичников. В проведенном РКИ Garcia-Valesco J.A. et al. (2000) сравнили традиционный «длинный» протокол с аГнРг и так называемый «стоп» протокол у женщин с БОО. Ни в одном исследовании не было найдено статистически значимой разницы в исходах программ ВРТ и наступлении беременности [93]. Таким образом, на сегодняшний день не существует достаточных доказательств того, что аГнРГ в «стоп» протоколах могут существенно улучшить исходы программ ВРТ у пациенток с 34 БОО, и такие протоколы не могут предотвратить паразитарный пик ЛГ и преждевременную овуляцию [180]. Отсутствие эффективных альтернативных схем лечения женщин с БОО привело к попыткам проведения программ ВРТ в естественном цикле [147]. В РКИ, проведенном Morgia F. et al. (2004), сравнивались исходы ЭКО в естественном цикле с так нвазываемым «коротким» протоколом с аГнРг [11]. В результате, не было выявлено статистически значимой разницы в наступлении беременности. Однако были отмечены преимущества естественного цикла или так называемого модифицированного естественного цикла, такие как отсутствие экзогенной гормональной нагрузки на организм женщины, дешевизна, отсутствие риска развития синдрома гиперстимуляции яичников, отсутствие осложнений, связанных с многоплодной беременностью. Основным недостатком был риск преждевременного выброса ЛГ и спонтанной овуляции, происходившей в 30-60% циклов, а также отсутствие возможности выбора эмбриона лучшего качества для переноса в полость матки [147]. Таким образом, выбор правильной и оптимальной тактики ведения пациенток с БОО является сложной задачей репродуктологии. Продолжаются исследования по оптимизации исходов программ ВРТ у этой группы женщин. 1.6. Эффективность применения глюкокортикоидов у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции и наличием аутоантител к ткани яичника Целесообразность определения уровней разных видов АОА заключается не только в прогнозировании исхода программы ЭКО, но и в возможности проведения подготовительного этапа с применением иммуносупрессивных (глюкокортикоидных) препаратов. Согласно данным литературы, глюкокортикоиды (ГК) повышают вероятность наступления беременности у пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе [51]. Известно также о 35 позитивном влиянии ГК на эффективность стимуляции суперовуляции у пациенток с «бедным» овариальным ответом иммунного генеза [51]. Тем не менее, отсутствуют четкие доказательства эффективности этой терапии, а также не определены наиболее эффективные схемы ее назначения. ГК являются препаратами, обладающими иммуносупрессивным действием, которые широко используются в различных областях медицины при лечении гормональнозависимых, ревматоидных и хронических воспалительных заболеваний. При выявлении различных иммунологических нарушений ГК назначаются беременным пациенткам и женщинам, планирующим беременность. Безопасность и клиническая эффективность данной группы препаратов доказана в клинических испытаниях. Возможный иммуносупрессивный эффект применения глюкокортикоидов с целью улучшения функции яичников у пациенток с аутоантителами изучался многими авторами. Изначально использование ГК началось у пациенток с аутоиммунными формами ПНЯ [53]. В дальнейшем позитивное влияние ГК терапии было описано при разных клинических случаях у пациенток с ПНЯ и аменореей, у которых на фоне ГК терапии возобновлялись менструации и даже спонтанно наступали беременности. Но никто из многочисленных исследователей не смог привести убедительные доказательства эффективности кортикостероидов у данной категории пациенток [31]. Впервые о положительном влиянии ГК на исходы программ ВРТ сообщили Kemeter P. и Feichtinger W. в 1986 г. [108]. В разных программах изучалась эффективность перорального приема метилпреднизолона, либо дексаметазона, до начала гормональной стимуляции и вплоть до установления факта беременности. В настоящее время существуют разные схемы орального назначения преднизолона в программах ЭКО. В основном, рекомендуются низкие дозы, по 10 мг/сутки в течение 1 месяца до начала программы ЭКО, по 0,5 мг/кг/сутки преднизолона, начиная с момента контролируемой индукции овуляции (КИО) до получения положительного результата ХГЧ, с последующим постепенным снижением дозы и полной отменой препарата к концу 1–го триместра беременности [40]. 36 Со временем эффективность некоторые исследователи иммуносупрессивной терапии поставили [119]. под сомнение Впоследствии были проведены рандомизированные плацебо-контролируемые испытания, в которых изучалась эффективность ГК у пациенток с ПНЯ и «бедным» овариальным ответом [119]. Эти исследования изучали эффективность ГК в когорте женщин с ПНЯ без проведения их стратификации по наличию аутоиммунной патологии. Поэтому полученные данные об эффективности ГК нельзя экстраполировать на пациенток с БОО аутоиммунного генеза. Эффективность ГК-терапии у пациенток при наличии АОА и неудачных попыток ЭКО в анамнезе была исследована Forges T. и Monnier-Barbarino P. [51]. Они назначали преднизолон с первого дня менструального цикла до конца первого триместра беременности в случае ее наступления. Никаких негативных эффектов при терапии ГК не наблюдалось. Уровень АОА класса IgG значительно снизился у пациенток, получавших ГК, по сравнению с пациентками группы сравнения. Частота наступления беременности и живорождения были выше у пациенток, получавших преднизолон, и составляли соответственно 38,8%/26,5% и 14,4%/0% в группах женщин, получавших и не получавших преднизолон (p<0,0001). Данное исследование подтверждает эффективность ГК-терапии у пациенток с предыдущими неудачными попытками ЭКО и значительным уровнем АОА в сыворотке крови [51]. Таким образом, проблема «бедного» овариального ответа остается до сих пор весьма актуальной, так как, несмотря на активное ее изучение, остается много неясного в понимании патогенеза этого состояния, нет единого мнения об оптимальной тактике стимуляции суперовуляции при проведении повторных циклов ЭКО в этой группе пациенток и профилактике БОО, что требует дальнейшего всестороннего изучения. 37 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проводилось на базе отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (руководитель д.м.н. Калинина Е.А.), лаборатории клинической иммунологии (руководитель к.м.н. Кречетова Л.В.) и лаборатории молекулярно-генетических методов (руководитель д.б.н. Трофимов Д.Ю.) ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (далее - Центр). В период с ноября 2012 г. по май 2014 г. были обследованы 225 женщин, обратившихся в отделение ВРТ для лечения бесплодия. В соответствие с заданными критериями включения были отобраны 150 пациенток, подписавших добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено Комиссией по этике Центра (протокол №33 от 14.12. 2012 г.). Все участницы исследования были обследованы в соответствии с приказом Минздрава России №107н от 30.08.2012 г. "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению" [5]. 2.1. Дизайн исследования для задач 1 и 2 Для выявления клинико-анамнестических факторов риска развития «бедного» овариального ответа у пациенток программ ВРТ было проведено ретроспективное исследование случай-контроль. Группы формировались путем метода подбора пар по региону проживания пациенток. Группу случаев (Группа 1) составили пациентки с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции (созревание менее 3-х фолликулов при стимуляции овуляции дозами гонадотропинов более 250-300 МЕ/сутки), который был диагностирован на основании указания на два и более эпизода БОО в 38 анамнезе или наличия хотя бы двух из ниже перечисленных критериев ESHRE (2011 г.): - наличие признаков сниженного овариального резерва (количество антральных фолликулов менее 5-7, АМГ менее 0,5-1,1 нг/мл); - наличие факторов риска снижения овариального резерва и развития БОО (возраст женщины более 40 лет, операции на яичниках в анамнезе, и др.); - указание на развитие хотя бы одного эпизода БОО в анамнезе. Группу контролей (Группа 2) составили пациентки с нормальным ответом на стимуляцию овуляцию без наличия критериев ESHRE развития БОО. Предполагаемыми факторами риска развития БОО явились следующие факторы, которые были проанализированы с помощью специально созданной анкеты (Приложение): - возраст пациентки; - возраст менопаузы у родственниц I линии (мать, сестры); - наличие признаков ПНЯ и снижения фолликулярного резерва; - указание на операции или травмы внутренних половых органов в анамнезе; - проведение химио- или лучевой терапии в анамнезе; - перенесенные воспалительные и инфекционные заболевания половых органов; - наличие эндометриоза/ спаечной болезни; - число попыток ЭКО в анамнезе и методы стимуляции овуляции в предыдущих попытках ЭКО (дозы гонадотропинов и длительность стимуляции); - акушерский анамнез (число беременностей, родов и абортов в анамнезе); - наличие аутоиммунной патологии (аутоиммунный тиреоидит и др.); - наличие экстрагенитальных заболеваний (сахарный диабет, заболевания почек, ревматические заболевания, аллергические заболевания, гипотиреоз, ожирение и др.); - влияние так называемого «длинного» протокола стимуляции суперовуляции и протокола с ант-ГнРг Первичной конечной точкой данной части исследования было скорректированное отношение шансов развития «бедного» овариального ответа 39 под влиянием различных факторов риска, оцененное с помощью многофакторного анализа – логистической регрессии. Вторичными конечными точками явились: - среднее число полученных ооцитов в настоящем цикле ЭКО в зависимости от протокола стимуляции суперовуляции у пациенток с БОО, и в группах пациенток с БОО и нормальным овариальным ответом; - корреляционная зависимость между числом полученных фолликулов, ооцитов и дозой вводимых Гн у пациенток с БОО, и в группах пациенток с БОО и нормальным овариальным ответом. 2.2. Дизайн исследования для задачи 2 Изучение влияния различных протоколов стимуляции суперовуляции на развитие БОО проводилось в рамках ретроспективного исследования случайконтроль, описанного для решения задачи №1. Для изучения влияния различных схем стимуляции суперовуляции на исходы программ ВРТ у пациенток с БОО было проведено проспективное когортное исследование. Группами сравнения явились пациентки с установленным диагнозом БОО (Группа 1) и его отсутствием (Группа 2) на основании критериев ESHRE, которым в настоящем протоколе подбирались различные методы стимуляции суперовуляции в зависимости от овариального резерва, возраста и анамнеза. Группы 1 и 2 были разделены на подгруппы в зависимости от схемы стимуляции суперовуляции: - Группы 1.1. и 2.1. – пациентки с БОО и нормальным овариальным ответом соответственно, у которых в данном цикле ЭКО стимуляция суперовуляции проводилась в т.н. «длинном» протоколе с аГН-РГ; - Группы 1.2. и 2.2. - пациентки с БОО и нормальным овариальным ответом соответственно, у которых в данном цикле ЭКО стимуляция суперовуляции проводилась в протоколе с ант-ГнРГ (рисунок 1). 40 «Длинный» протокол с а-ГнРГ Пациентки ЭКО с «бедным» овариальным ответом согласно критериям ESHRE Беременность* (+) Параметры эмбриогенеза** Пациентки ЭКО с нормальным овариальным ответом Протокол с ант-ГнРГ Беременность* (-) **Параметры эмбриогенеза: -количество полученных эмбрионов -качество полученных эмбрионов (% эмбрионов класса А, В, С, D) *Беременность: - % биохимической беременности -% клинической беременности -% потерь беременности в 1-м триместре % живорождений Рисунок 1. Дизайн исследования для задачи 2 Первичной скорректированное конечной точкой отношение данной шансов части исследования наступления было беременности, самопроизвольного выкидыша и живорождения в группах пациенток с БОО и нормальным овариальным ответом и в группах с БОО в зависимости от схемы стимуляции суперовуляции. Вторичными конечными точками явились: - средние значения различных параметров раннего эмбрионального развития в группах пациенток с БОО и нормальным овариальным ответом и в группах с БОО в зависимости от схемы стимуляции суперовуляции; - корреляционная зависимость между числом полученных ооцитов и параметрами раннего эмбрионального развития. Критериями включения в данную часть исследования были: - соответствие критериям ESHRE «бедного» овариального ответа для группы 1; 41 - наличие нормального овариального резерва и базальной концентрации фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) < 12 мМЕ/мл для группы 2; - нормальный кариотип супругов; - нормозооспермия у супруга; - отсутствие противопоказаний к ВРТ, в том числе отсутствие злокачественных заболеваний, генитального эндометриоза III-IV степени, миомы матки больших размеров, хронического эндометрита, опухолевых и опухолевидных образований яичников; - отсутствие пороков развития внутренних половых органов у женщин, включая состояния после хирургической коррекции пороков развития внутренних половых органов; - отсутствие указания на воздействие радиации и химиотерапии в анамнезе; - ВРТ с донорской яйцеклеткой; - информированное согласие на включение в исследование. Критериями исключения были развитие синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) средней или тяжелой степени в данном цикле ЭКО, а также другие состояния и осложнения, требующие отмены переноса эмбрионов в изучаемом цикле (кровотечения в брюшной полости, воспалительные осложнения). 2.3. Дизайн исследования для задач 3 и 4 Для определения связи между наличием различных видов аутоантител, в том числе аутоантител к тканям яичника, и снижением овариального ответа в программах ВРТ, а также для оценки влияния генетических факторов (числа тринуклеотидных CGG-повторов в гене FMR1, полиморфизмов гена BMP15) на овариальный ответ пациенток в программах ВРТ было проведено одномоментное исследование в параллельных группах. Группами сравнения явились пациентки с установленным диагнозом БОО (Группа 1) и его отсутствием (Группа 2) на основании критериев ESHRE. 42 Пациентки были стратифицированы на группы в зависимости от овариального резерва: группа с БОО и сниженным овариальным резервом (Группа 1а), группа с БОО и нормальным овариальным резервом (Группа 1б), группа с нормальным овариальным ответом и нормальным овариальным резервом (Группа 2а), группа с нормальным овариальным ответом и сниженным овариальным резервом (Группа 2б). Во всех группах проводился однократный забор периферической крови в момент пункции яичников и фолликулярной жидкости для определения уровня аутоантител и проведения цитогенетического и молекулярно-генетического исследования (см. Методы исследования). Конечными точками данной части исследования были: - средние значения/медианы уровней различных антител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости в группах пациенток с «бедным» и нормальным овариальным ответом в зависимости от наличия или отсутствия сниженного овариального резерва; - корреляционная зависимость между уровнями различных аутоантител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости; - корреляционная зависимость между уровнями различных аутоантител и уровнем АМГ, числом полученных фолликулов, ооцитов и эмбрионов; - определение пороговых уровней различных аутоантител, влияющих на развитие БОО в программах ВРТ; - распределение CGG-повторов по 2ум аллелям гена FMR1 в группах пациенток с «бедным» и нормальным овариальным ответом в зависимости от наличия или отсутствия сниженного овариального резерва; - распределение CAG-повторов гена AR в группах пациенток с «бедным» и нормальным овариальным ответом; - ОШ выявления различных полиморфизмов гена BMP15 у пациенток с БОО по сравнению с нормальным овариальным ответом; - средние значения/медианы уровня аутоантител в группах пациенток с БОО и различным числом CGG-повторов; 43 - ОШ выявления аутоантител выше порогов отсечки у пациенток с БОО в зависимости от числа CGG-повторов в гене FMR1; - средний уровень АМГ и других половых гормонов в группах пациенток с различным уровнем аутоантител и числом CGG-повторов. Критериями включения в данную часть исследования были все критерии согласно задаче 2, а также отсутствие указаний на прием кортикостероидной и иммуномодулирующей терапии за один месяц до проведения исследования. Критериями исключения были развитие синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) средней или тяжелой степени в данном цикле ЭКО, а также другие состояния и осложнения, требующие отмены переноса эмбрионов в изучаемом цикле (кровотечения в брюшной полости, воспалительные осложнения). 2.4. Расчет объема выборки Для решения задачи 1 (выявление факторов риска развития БОО) объем выборки был рассчитан в соответствии с числом изучаемых факторов риска, которое составило 15. В виду того, что максимальное число предикторов, включенных в модель, не должно быть больше, чем число исходов, деленное на значение от 5 [47] до 20 [10], для изучения 15 факторов риска необходимо включить минимум 75 человек в группу. Для решения данной задачи было сформировано две группы наблюдения с приблизительно равным числом участниц, поэтому общее число включенных в исследование пациенток составило 150 человек. Для решения задачи 2 (оценка исходов ВРТ в зависимости от протокола стимуляции суперовуляции у пациенток с БОО) расчет объема выборки был произведен с помощью программы STATISTICA 10 (США) и был основан на данных литературы об эффективности различных схем стимуляции суперовуляции у пациенток БОО [48]. Число полученных ооцитов у пациенток с БОО при назначении протокола с ант-ГнРг составило 1,5±0,8, при назначении т.н. «длинного» протокола – 1,9±0,9 (p≤0,01). При принятии уровня альфа 0,05 и 44 уровня достоверности исследования 80% для получения валидных данных достаточно включить 65 пациенток в каждую группу. Так как исследование не является экспериментальным, а представляет собой обсервационное когортное исследование, в котором частота назначения различных схем стимуляции суперовуляции является неравномерной с весьма редким использованием т.н. «длинного» протокола с а-ГнРГ, мы сочли достаточным для включения в исследование 150 пациенток согласно задаче №1. Для решения задач 3 и 4 (оценка влияния генетических и аутоиммунных факторов на развитие БОО) расчет объема выборки был произведен с помощью программы STATISTICA 10 (США) и был основан на данных литературы о вероятности развития БОО при аутоиммунной патологии [88, 175]. При выявлении IgG анти-ФСГ >1,0 БОО развивается у 31,3%, нормальный ответ – у 9,1% пациенток; при выявлении АОА беременность наступила у 4,8%, при их отсутствии – у 25% пациенток. При принятии уровня альфа 0,05 и уровня достоверности исследования 90% для получения валидных данных достаточно включить 65 пациенток в каждую группу. Для решения данной задачи было сформировано две группы наблюдения с приблизительно равным числом участниц, поэтому общее число включенных в исследование пациенток составило 150 человек. 2.5. Методы исследования Обследование перед вступлением в программу ЭКО/ПЭ проводилось в амбулаторных условиях и включало обязательные исследования, исследования по медицинским показаниям и специальные методы исследования. Все обследования в рамках проводимого исследования, за исключением УЗИ, проводились однократно. Обязательные исследования включали: - определение суммарных антител к бледной трепонеме в крови методом иммунохемилюминесценции на аналитическом анализаторе Architekt (Abbott), антител класса IgM, IgG к вирусу иммунодефицита человека 1/ 2 (ВИЧ 1/2) 45 методом иммуноферментного анализа (ИФА); HBS- антигена и антител к HCV (оба супруга) методом ИФА; - гормоны крови (на 2-3 день менструального цикла): лютеинизирующий гормон (ЛГ), фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), эстрадиол(Е2), антимюллеров гормон (АМГ), тиреотропный гормон (ТТГ), трийодтиронин (Т3) свободный тироксин (Т4св), дегидроэпиандростерона сульфат (ДГА-С), пролактин (ПРЛ), соматоторопный гормон (СТГ), кортизол, тестостерон (Т), прогестерон (П); - микроскопическое исследование отделяемого половых органов на состав микрофлоры: аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, грибы рода Candida, атрофозоиты трихомонад; - молекулярно-биологическое исследование на хламидию (Chlamidia trachomatis), микоплазмы (Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium), уреаплазмы, вирус простого герпеса и цитомегаловирус; - клинический анализ крови; - биохимический анализ крови; - гемостазиограмма; - определение группы крови и резус-фактора; - общий анализ мочи; - определение антител класса M, G к вирусу краснухи в крови; - цитологическое исследование шейки матки; - ультразвуковое исследование органов малого таза на 5-8 день цикла; - флюорографию или рентген грудной клетки; - электрокардиограмму (ЭКГ); - заключение терапевта о состоянии здоровья; - УЗИ (до 35 лет) молочных желез или маммографию (после 35 лет). - спермограмма. Исследования по показаниям включали: - исследование состояния матки и маточных труб (гистеросальпингография или гистероскопия и лапароскопия); 46 - консультацию других специалистов (эндокринолога, андролога); - медико-генетическое консультирование и кариотипирование для пар, имеющих в анамнезе случаи врожденных пороков развития и хромосомных болезней у детей, а также при старшем возрасте супругов. Специальные методы исследования включали: - определение различных видов антиовариальных антител методом иммуноферментного анализа (ИФА) в сыворотке крови и фолликулярной жидкости; - определение других аутоантител: антифосфолипидные антитела, анти-ФСГ, анти-ХГЧ, анти-ГнРГ методом ИФА в сыворотке крови и фолликулярной жидкости; - определением числа CAG-повторов гена AR, числа CGG-повторов FMR1 гена путем флуоресцентной ПЦР, полиморфизма гена BMP15 путем секвинирования кодирующего региона гена (таблица 1). Таблица 1 Схема обследования пациентов 2-3 день Пункция 4-5 день 2 недели 3 недели 9-10 цикла после после ПЭ после ПЭ недель пункции после ПЭ Обязательное исследование Генетические исследования Аутоиммунные антитела в крови Аутоиммунные антитела в фолликулярной жидкости АМГ Ингибин В Перенос эмбрионов ХГЧ УЗИ Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х Х 47 2.5.1. Общеклинические методы исследования При сборе анамнеза обращалось внимание на наследственность (возраст менопаузы у матери пациентки), перенесенные детские инфекции (эпидемический паротит, корь, краснуха), соматические, аутоиммунные заболевания, функцию щитовидной железы и наличие антител к ее ткани. Детально оценивали менструальный цикл (возраст менархе, регулярность, продолжительность цикла, характер менструации, дисменорея), число, исход и осложнения предыдущих беременностей. При наличии в анамнезе предыдущих попыток ЭКО обращалось внимание на наличие «бедного» ответа, протокол стимуляции, число полученных ооцитов и результат лечения. Изучалось наличие в анамнезе инфекционных и неинфекционных заболеваний органов малого таза, эндометриоза. При наличии оперативных вмешательств на органах малого таза требовалось предоставление выписки об объеме операции для исключения операций на яичниках. Индекс массы тела рассчитывался по формуле Кетле: ИМТ = масса тела/рост (кг/м2) При гинекологическом исследовании оценивались особенности наружных половых органов и степень их развития, характер оволосения, состояние шейки матки. Определение размера и формы матки, ее подвижности, болезненности, возможное смещение, а также наличие образований в области придатков матки и степень выраженности спаечного процесса проводилось при бимануальном исследовании. Осмотр шейки матки проводился в зеркалах, при необходимости использовалась кольпоскопия. 2.5.2. Гормональное исследование Гормональное исследование проводилось в научно-диагностической лаборатории ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России с целью оценки овариального резерва и состояния эндокринной системы пациентки. Использовался радиоиммунологический метод определения концентрации 48 гормонов в крови (тест-системы «Hoffmann – La Roche, Ltd.» Швейцария). Нормальное содержание гормонов в сыворотке крови соответствует показателям, представленным в таблице 2. Таблица 2 Нормальная концентрация гормонов в сыворотке крови Наименование ФСГ ЛГ Пролактин Эстрадиол Прогестерон Тестостерон Кортизол ДГЭА-С СТГ ТТГ Т4 св. 17-ОП АМГ Нормативы Фолликулиновая фаза Лютеиновая фаза 3,0 – 8,0 МЕ/л 3,0 – 10,0 МЕ/л 120 – 500 мМе/л 150 – 450 пмоль/л 280 – 740 пмоль/л 1,8 – 2,2 нмоль/л 9 – 83 нмоль/л 1,0 – 2,5 нмоль/л 200 – 500 нмоль/л 0,9 – 11,7 мкмоль/л 0,15 – 13,0 мМЕ/л 1,0 – 3,0 мМЕ/л 10 – 25 пмоль/л 0,3 – 3 нмоль/л 2 – 15 нмоль/л 1,0 – 10,6 нг/мл 2.5.3. Ультразвуковое исследование органов малого таза Ультразвуковое исследование выполнось при опорожненном мочевом пузыре с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,1 МГц на аппарате «Flex Focus 1202» (фирма «B-K Medical ApS», Дания). Первое УЗИ исследование выполнялось в первую фазу менструального цикла, предшествующего циклу стимуляции суперовуляции. Главными параметрами оценки были размеры и структура тела матки, толщина эндометрия, объем яичников и количество антральных фолликулов. Также диагностировалось отсутствие объемных образований в малом тазу. Непосредственно в цикле стимуляции УЗ-мониторинг проводился в день начала введения препаратов Гн (на 2-3 день цикла), на 5-6 день стимуляции суперовуляции с целью определения даты начального введения ант-ГнРГ (при использовании протокола с ант-ГнРГ), далее ежедневно или через день до введения овуляторной дозы хорионического гонадотропина. Особое внимание уделялось росту фолликулов для возможности 49 коррекции дозы вводимых Гн и определения даты трансвагинальной пункции фолликулов. При наличии положительного анализа на ß-ХГ после переноса эмбрионов в полость матки последнее УЗИ органов малого таза выполнялось для диагностики развивающейся маточной беременности. 2.5.4. Иммунологические исследования Образцы крови и фолликулярной жидкости у пациенток были взяты в день трансвагинальной пункции центрифугирования образцы яичников и хранились аспирации фолликулов. до исследования при После -70ºС. В исследовании использовались образцы фолликулярной жидкости, не содержащие примеси крови. Сыворотку крови для исследования разводили в соотношении 1:100, фолликулярную жидкость – 1:10. Исследование проводилось в лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «НЦАГ и П им. В.И. Кулакова» Минздрава России (руководитель к.м.н. Кречетова Л.В.). С помощью метода иммуноферментного анализа (ИФА) у пациенток определяли антитела классов IgM, IgG и IgA к блестящей оболочке (анти-ZP), общие антиовариальные антитела (АОА), антикардиолипиновые антитела (АКЛ), антитела к β2-гликопротеину-1 (анти-β2-ГП), к ФСГ (анти-ФСГ), к гонадотропинрилизинг гормону (анти-ГнРГ), антитела к хорионическому гонадотропину (антиХГ) в сыворотке крови. У пациенток с БОО проводили также определение выше перечисленных аутоантител классов IgA и IgG в фолликулярной жидкости методом ИФА. Определение антител к блестящей оболочке и общих антиовариальных антител проводили по методу непрямого твердофазного ИФА с использованием наборов фирмы BIOSERV Diagnostics (Германия). В лунки микропланшетов, покрытых смесью яичниковых протеинов, вносили разведенные в соотношении 1:100 образцы сыворотки крови пациенток и контрольные образцы. В течение инкубации АОА и анти-ZP антитела связывались с антигеном на поверхности лунок, и, таким образом, иммобилизовывались на планшете. Конъюгаты антител 50 против иммуноглобулинов человека классов IgA, IgM, IgG с пероксидазой хрена связывались с комплексом антиген-антитело на твердой фазе в течение инкубации. После удаления путем промывки несвязанного конъюгата, добавляли субстрат, содержащий 3,3,5,5-тетраметилбензидин(ТМБ). В результате ферментативной реакции отмечалось изменение цвета раствора. Развитие окраски останавливали добавлением 0,25 М серной кислоты. Проводили измерение оптической плотности (ОП) при 450 нм с использованием микропланшетного спектрофотометра MULTISCAN EX (Thermo Electron (Shanghai) Instruments Co., Китай). Методом непрямого твердофазного ИФАопределяли антитела классов G и M к кардиолипину и к β2-гликопротеину-1 с использованием наборов фирмы Orgentec Diagnostica (Германия). Калибраторы, контроли и предварительно разведенные 1:100 образцы сыворотки пациенток вносили в лунки микропланшета, покрытого высокоочищенным препаратом кардиолипина или β2гликопротеина соответственно. Присутствующие в образцах антитела связывались с антигеном, иммобилизованным на поверхности лунок. После 30минутной инкубации лунки промывали, при этом промывочный раствор удалял несвязанные компоненты сыворотки. В лунки добавляли раствор конъюгата антител против IgG или IgM человека с пероксидазой хрена для выявления аутоантител, связанных с иммобилизованным антигеном. После 15-минутной инкубации избыток ферментного конъюгата удалялся путем проиывания планшета. Затем добавляли раствор хромогенного субстрата, содержащий ТМБ. В течение 15 минут цвет раствора изменялся на голубой. Развитие окраски останавливали добавлением 1 М соляной кислоты в качестве стоп-раствора. Цвет раствора изменялся на желтый. Интенсивность окраски была прямо пропорциональна концентрации IgM или IgG в образце. Оптическую плотность измеряли на фотометре MULTISCAN EX (Thermo Electron (Shanghai) Instruments Co., Китай) при 450 нм. Изучение спектра антител к гормонам проводилось с использованием методик ИФА, разработанных в лаборатории клинической иммунологии. Для 51 определения антител к гормонам в сыворотке крови и фолликулярной жидкости применялась вышеописанная методика непрямого твердофазного ИФА с использованием полистирольных планшетов MaxiSorp (Nunc, Дания). На поверхности лунок микропланшета иммобилизовали высокоочищенный препарат рилизинг гормона лютеинизирующего гормона (Sigma-Aldrich Co., США) из фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБР) с концентрацией гормона 3 мкг/мл апри 20±2ºС в течение ночи. После каждого этапа планшет промывался ФСБР с 0,5 % твина-20 (ФСБРТ). Свободные центы связывания на полистироле блокировались 1% раствором БСА в ФСБР в течение 1,5 часов. Образцы сыворотки крови или ФЖ и антитела против IgA, IgM или IgG человека, меченные пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich Co., США), разводились в ФСБРТ, содержащем 0,5 % БСА. Инкубация проводилась на встряхивателе при 20±2ºС в течение 1 часа. Для определения АТ к ФСГ и ХГЧ на полистирольные микропланшеты иммобилизовались высокоочищенные препараты ФСГ или ХГ человека посредством мышиных моноклональных антител к α-субъединице гормонов (Sigma-Aldrich Co., США). Для выявления связавшихся антител использовались конъюгаты мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена против IgA, IgM или IgG человека (Sigma-Aldrich Co., США). После промывания в лунках инкубировался субстратно-хромогенный раствор, содержащий ТМБ и перекись водорода, при 20±2ºС в течение 15-20 мин. Ферментативная реакция останавливалась добавлением равного объема 1 М серной кислоты. Оптическая плотность измерялась на фотометре MULTISCAN EX (Thermo Electron (Shanghai) Instruments Co., Китай) при длине волны 450 нм. Результат ИФА считался положительным, если средняя ОП исследуемого образца превышала на 3 стандартных отклонения и более среднюю ОП контрольных сывороток. 52 2.5.5. Генетические исследования В лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ «НЦАГ и П им. В.И. Кулакова» Минздрава России (руководитель д.б.н. Трофимов Д.Ю.) из 150 образцов периферической крови, взятой с ЭДТА в качестве антикоагулянта, выделялась ДНК для проведения генотипирования с помощью комплекта реагентов «Проба-ГС-генетика» ООО «НПО ДНК-Технология», Россия. После выделения ДНК были получены образцы объемом 100 мкл со средней концентрацией ДНК мкг/мл, 50-100 определенной с помощью ДНК- минифлуориметра (Ноеfer, США). В последующем проводилась оценка числа СAG-повторов в первом экзоне гена рецептора андрогенов (AR), определение числа CGG-повторов в нетранслируемой области гена FMR1 и полиморфизмов в гене ВМР15. По методике, разработанной в лаборатории молекулярно-генетических методов, было произведено определение длины CAG повторов гена AR с помощью ПЦР-реакции и с олигонуклеотидами (праймерами), один из которых нес на себе флуоресцентную метку FAM. Данные олигонуклеотиды были локализованы на фланкирующие область CAG повторов участки гена AR. После завершения ПЦР-реакции с помощью агарозного гель-электрофореза (1% гель, окраска бромистым этидием) был проведен контроль наличия ПЦР-продуктов. При определении данных специфических продуктов ПЦР-реакции в ожидаемом диапазоне, а также в случае чистоты отрицательных контрольных образцов согласно протоколу производителя осуществлялся фрагментный анализ на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130 с использованием геля POP-7 и размерного стандарта GS400HD Rox (Applied Biosystems, США). С помощью метода секвенирования по Сэнгеру с прямого и обратного праймеров на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130 с наборами реактивов BigDye 3.1 (Applied Biosystems, США) было определено количество CAG повторов в ПЦР-продуктах амплификации гена AR. В дальнейшем был проведен 53 фрагментный анализ положительных контрольных образцов для точности определения длин ПЦР-продуктов. Используя метод стандартной ПЦР с рядом модификаций, повышающих качество амплификации и позволяющих успешно устанавливать оба аллельных варианта гена, было определено количество CGG-повторов в 5’-нетранслируемой области гена FMR1. Данная методика была разработана в лаборатории молекулярно-генетических методов. При проведении ПЦР использовался прямой и обратный праймеры, локализованные на фланкирующих CGG-область участках гена FMR1. При этом один из праймеров имел флуоресцентную метку FAM. В том случае, если определялось наличие аллеля с нормальным количеством CGG повторов, проводились амплификация и детектирование продукта с помощью фрагментного анализа на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130 с использованием геля POP-7 и размерного стандарта LIZ-600 (Applied Biosystems, США) в канале FAM. Другая группа праймеров f-CGG имела флуоресцентную метку HEX и была идентична последовательности 5’-конца праймера CGG. При выявлении нормы, премутации или мутации гена, с данных праймеров амплифицировались продукты, отличавшиеся длиной на 3 нуклеотида (один повтор CGG). При этом количество пиков коррелировало с числом повторов в области CGG гена FMR1. После амплификации проводился фрагментный анализ полученных продуктов на автоматическом секвенаторе ABI 3130 (Applied Biosystems, США). Количество CGG-повторов вычислялось по формуле: L-(L1+L2):3 Где L- общая длина ампликона L1 – число нуклеотидов с первого нуклеотида прямого праймера до начала CGGповторов L2- число нуклеотидов от конца повторов до последнего нуклеотида обратного праймера Проводился SNP анализ гена ВМР15 в трех позициях: 202 C>T (Arg68Trp, rs104894763), 538G>A (А180T, rs104894767) и 905G>A (rs3897937). С помощью модифицированного метода «примыкающих проб» (adjacent probes, kissing 54 probes), используя наборы реагентов ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия), были определены замены одиночных нуклеотидов. При идентификации данных замен ПЦР изначально проводился с праймерами, общими для обоих вариантов нуклеотидной последовательности, после чего температуру реакционной смеси понижали с целью гибридизации полученной матрицы с олигонуклеотидными пробами. Использовались два типа гибридизующихся на матрицу олигонуклеотидов для определения варианта последовательности: один общй олигонуклеотид, содержавший гаситель флуоресценции, и два сиквенс- специфичных олигонуклеотида, несущие различные флуорофоры. Измерение уровня дуплексов флуоресценции в ходе температурной денатурации олигонуклеотидов и матриц, полученных после ПЦР и гибридизации, проводили в режиме реального времени. Генотип определялся с помощью анализа кривых плавления. ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных проб проводились с помощью детектирующего амплификатора ДТ-964 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия). С целью выявления новых полиморфизмов гена ВМР15, как возможных предикторов «бедного» овариального ответа, в последующем было проведено секвенирование двух фрагментов обоих экзонов данного гена. Оба фрагмента были получены с помощью ПЦР-реакции с уникальными праймерами (первый фрагмент – праймеры bmp_a1 и bmp_s1, длина ампликона около 650 н.п., второй фрагмент – праймеры bmp_a3 и bmp_s4, длина ампликона около 900 н.п.,) Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе ABI 3130 (Applied Biosystems, США) набором реактивов BigDye 3.1 (Applied Biosystems, США). Из полученных хроматограмм осуществлялся анализ нуклеотидных последовательностей с помощью программного обеспечения BioEdit (Ibis Biosciences, США). При этом проводилось выравнивание против референсной последовательности, взятой из GenBank (NCBI). 55 2.6. Стимуляция функции яичников и трансвагинальная пункция яичников В отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздрава России в рамках данного исследования было произведено 150 циклов ЭКО или ЭКО/ИКСИ. С целью получения достаточного количества зрелых ооцитов проводилась индукция суперовуляции в рамках протокола с Гн и ант-ГнРГ или т.н. «длинного» протокола с препаратами Гн и а-ГнРГ. Протокол с ант-ГнРГ начинался со 2-3 дня менструального цикла с введения гонадотропинов. Начало «длинного» протокола соответствовало 19-21 дню цикла, при этом в начале проводилась блокада гипоталамо-гипофизарнояичниковой системы путем ежедневного подкожного введения а-ГнРГ. А со 2-3 дня менструального цикла начиналась стимуляция суперовуляции при продолжающемся введении а-ГнРГ. Согласно анамнезу и клинико-лабораторным показателям овариального резерва женщины определялась стартовая доза для ежедневного подкожного введения препаратов рекомбинантного человеческого фолликулостимулирующего гормона (фоллитропин α, фоллитропин β). В зависимости от динамики роста фолликулов при проведении УЗ-мониторинга при необходимости производилась коррекция дозы препарата рФСГ. Введение антГнРГ начиналось при достижении максимальным фолликулом диаметра 14 мм. Препарат антГнРГ в дозе 0,25 мг/сутки вводился подкожно в одно и то же время суток до финального дня созревания фолликулов с целью предупреждения преждевременной лютеинизации фолликулов. Для возможности получения зрелых ооцитов за 35 часов до трансвагинальной пункции (ТВП) фолликулов при достижении одним или несколькими фолликулами диаметра 18 мм вводился препарат ХГ в дозе 5000-10000 ЕД внутримышечно. ТВП проводили амбулаторно в условиях малой обезболиванием. операционной под кратковременным внутривенным Под контролем УЗИ с помощью пункционной иглы под отрицательным давлением в диапазоне 90-100 мм водного столба производилась 56 аспирация фолликулярной жидкости, которая помещалась в стерильные пробирки с 0,5 мл гепарина (2500 ЕД/мл). 2.7. Оплодотворение и культивирование эмбрионов in vitro Полученная фолликулярная жидкость передавалась эмбриологу, который оценивал количество и зрелость полученных ооцитов. Преинкубация и оплодотворение ооцитов проводились с использованием стандартов ЭКО или ИКСИ. В средах для культивирования фирмы «Cook Group, Inc.» (США) осуществлялось культивирование эмбрионов. Через 48 часов после ТВП оценивалось качество эмбрионов с учетом показателей скорости дробления эмбрионов, симметричности цитоплазматической бластомеров, фрагментации. На количества основании ядер и степени морфологических характеристик эмбрионы классифицировались на 4 группы: А – отсутствие фрагментации, В - <25% фрагментации, С – 25-50% фрагментации и D – более 50% фрагментации. 2.8. Перенос эмбрионов в полость матки и посттрансферный период В зависимости от клинической ситуации производился перенос 1 или 2 эмбрионов в полость матки на 3 или 5 сутки культивирования при помощи катетера Wallace (Великобритания). Оставшиеся эмбрионы хорошего качества были криоконсервированы. По общепринятой схеме вели посттрансферный период. На следующий день после ТВП и до момента диагностики беременности всем пациенткам назначали препарат натурального миронизированного прогестерона в дозе 600 мг/сут во влагалище. Через 14 дней после переноса эмбрионов проводилась диагностика беременности на основании определения сывороточной концентрации ßсубъединиц ХГ. Тест на беременность считали положительным при уровне ß-ХГ 57 более 20 МЕ/л («биохимическая беременность»). Клиническая беременность диагностировалась на основе повышения уровня β - ХГЧ и визуализации плодного яйца при ультразвуковом исследовании через 21 день после переноса эмбрионов. 2.9. Статистический анализ полученных данных Статистическая обработка данных выполнялась на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пaкета статистических программ «Statistica V10», StatSoft Inc. (США), «SAS V8” (США) и «SPSS Statistics V17» (США). Для качественных данных определяли риски (%). Для сравнения качественных данных в 2-х и более группах, и установления значимых различий между ними использовали тест χ2, для вычисления которого прибегали к построению таблиц сопряженности, а также точный критерий Фишера для небольших выборок. Для сравнения бинарных данных мерой сравнения явилось отношение шансов (ОШ) с использованием метода логистической регрессии с построением ROC-кривой для контроля множественных конфаундеров. Перед проведением сравнительного анализа количественных данных в исследуемых группах определяли вид распределения данных (тест КолмогороваСмирнова, графический анализ данных). При нормальном виде распределения данных определяли среднее значение со стандартным отклонением (СО), для оценки различий в группах применяли методы параметрической статистики (tтест для сравнения данных в 2-х группах или ANOVA для сравнения данных в нескольких группах). При ненормальном распределении данных определяли медиану с интерквартильным размахом, для оценки различий в группах применяли методы непараметрической статистики (тест Манна-Уитни для сравнения данных в 2-х группах или тест Крускала-Уоллиса для сравнения данных в нескольких группах). 58 Зависимые данные оценивались с помощью коэффициента корреляции. Корреляционный анализ проводился с использованием непараметрического корреляционного критерия Спирмена. Математические модели прогноза развития заболевания создавались с помощью метода логистической регрессии. Анализ принятия решений был выполнен с помощью программы SPSS V17 с применением инструмента Quest. Все модели были разработаны с применением разделения и калибровки и использованием теста Хошмера – Лемешева. Достоверность моделей была проверена путем построения кривых ROC. Различия между статистическими величинами считали статистически значимыми при уровне достоверности p <0,05. Для уменьшения ошибки выборки использовались строгие критерии отбора пациентов. Для уменьшения информационной ошибки исследования использовались одни и те же методы диагностики (на базе одних и тех же лабораторий) для всех пациентов. Оценка воздействующего фактора и исхода также была едина для всех пациентов. 59 Глава 3. КЛИНИКО-АНАМНЕСТИЧЕСКИЕ И ЯТРОГЕННЫЕ ФАКТОРЫ РИСКА И ИСХОДЫ ПРОГРАММ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ У ПАЦИЕНТОК С «БЕДНЫМ» ОВАРИАЛЬНЫМ ОТВЕТОМ 3.1. Клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариального ответа у пациенток программ ВРТ Для решения задачи №1 было проведено ретроспективное исследование случай-контроль. Согласно критериям ESHRE (2011 г.) была сформирована группа случаев из 65 пациенток с БОО (группа 1) и группа контроля из 85 пациенток с нормальным овариальным ответом (группа 2). Первоначально в исследование было включено 180 женщин – по 90 человек в группу. Пациентки, не соответствующие критериям включения, а также не предоставившие полной информации о данных анамнеза и лабораторных исследований, были исключены из анализа (рисунок 2). Нами был проведен анализ клинико-анамнестических данных пациенток, как возможных конфаундеров. Все пациентки были проанкетированы. При сборе анамнеза учитывались следующие факторы: возраст пациентки; возраст наступления менопаузы у матери женщины; указание на операции или травмы внутренних половых органов в анамнезе; перенесенные воспалительные и инфекционные заболевания половых органов; наличие эндометриоза/ спаечной болезни; число попыток ЭКО в анамнезе; акушерский анамнез (число беременностей, родов и абортов в анамнезе); прием комбинированных оральных контрацептивов (КОК); наличие аутоиммунной патологии и ревматических заболеваний (аутоиммунный тиреоидит, ревматизм, системная красная волчанка, ревматоидный артрит); краснуха); ожирение. перенесенные детские инфекции (паротит, корь, 60 Рисунок 2. Дизайн исследования: профиль набора пациенток Средний возраст пациенток был значимо больше в группе БОО и составил (34,7±3,9) лет по сравнению с (31,9±3,9) лет в группе контроля (р<0,0001). Проведенный анализ антропометрических данных не выявил значимых различий в средних показателях роста, массы тела и ИМТ пациенток (таблица 3). Таблица 3 Антропометрические показатели пациенток, включенных в исследование Группа 1 (n=65) Показатели р*-уровень Группа 2 (n=85) Средний рост 163,9±14,3 165,1±5,3 пациенток (см) Средняя масса тела 65±12,04 63,9±13,04 пациенток (кг) ИМТ пациенток 23,7±4,4 23,4±4,3 данные представлены как средние ± стандартное отклонение; * t-тест Оценка менструальной менструального выявила, что цикла, у функции (возраст продолжительность женщин основной 0,47337 0,597625 0,706478 менархе, менструального группы отмечался длительность кровотечения) более короткий 61 менструальный цикл (p=0,0030) и более короткая продолжительность менструальных кровотечений (p=0,0020) (таблица 4). Таблица 4 Особенности менструального цикла пациенток, включенных в исследование Показатели Группа 1 (n=65) Группа 2 (n=85) р-уровень* Возраст менархе (лет) 13,2±1,2 13,2±1,3 0,96945 Длина цикла (дней) 27,4±2,7 28,9±3,3 0,0030 4,3±1,2 5,1±1,1 Дебют половой жизни (лет) 18,8±3,2 18,5±2,5 данные представлены как средние ± стандартное отклонение; * t-тест 0,0002 0,51661 Длительность менструации (дней) Изучение акушерского анамнеза (общее число беременностей, искусственных абортов, самопроизвольных выкидышей, своевременных и преждевременных родов) показало, что у пациенток основной группы отмечалось большее число самопроизвольных выкидышей (с/в) и искусственных прерываний беременности в анамнезе. При этом число спонтанных беременностей было сопоставимо в 2-х группах. У женщин с БОО было больше стимуляций овуляции в анамнезе, но сопоставимое с группой контроля число беременностей после попыток ЭКО. Продолжительность бесплодия была более длительной у женщин с БОО и составила 7,06±3,8 лет по сравнению с 5,4±3,7 лет у женщин с нормальным ответом яичников (р=0,0078) (таблица 5). Среди гинекологических заболеваний в основной группе пациенток чаще отмечались аденомиоз и эндометриоз (в 13,8% наблюдений) по сравнению с 5,9% в группе контроля (р=0,0966). Частота воспалительных, инфекционных и других заболеваний гениталий (хронический эндометрит, сальпингоофорит, миома матки, полипы эндометрия, хламидиоз, уреаплазмоз, микоплазмоз, хронический цервицит/ вульвовагинит) была сопоставимой у пациенток с «бедным» и нормальным ответом яичников (таблица 6). 62 Таблица 5 Акушерский анамнез пациенток, включенных в исследование Группа 1 n=65 Группа 2 n=85 р-уровень Средняя продолжительность 7,06±3,8 5,4±3,6 0,0078 бесплодия (лет)* Число пациенток с первичным 24 (36,9%) 48 (56,5%) 0,0180 бесплодием/число пациенток** Число попыток ЭКО в анамнезе 140 145 Среднее число попыток ЭКО в 2,2±1,1 1,7±1,04 0,0131 анамнезе* Число беременностей после ЭКО 13 (9,2%) 7 (4,8%) 0,1410 /число попыток ЭКО в анамнезе** Число беременностей в анамнезе 82 73 Число родов/число беременностей в 18 (21,9%) 18 (24,6%) 0,8019 анамнезе** Число искусственных абортов/число 27 (32,9%) 14 (19,1%) 0,0530 беременностей в анамнезе** Среднее число искусственных абортов 0,4±0,8 0,2±0,5 0,0301 в анамнезе* Число с/в /число беременностей в 27 (32,9%) 18 (24,6%) 0,2580 анамнезе** Среднее число с/в в анамнезе* 0,4±0,6 0,2±0,5 0,0387 Число эктопических беременностей/ 10 (12,2 %) 23 (31,5 %) 0,0030 число беременностей в анамнезе** *данные представлены как средние ± стандартное отклонение, t-тест; **данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест. Таблица 6 Структура гинекологической патологии у пациенток, включенных в исследование Заболевание Группа 1 n=65 n % 45 69,2 Группа 2 n=85 n % 58 68,2 Всего n % 103 68,7 руровень 0,8963 Хронический сальпингоофорит ПНЯ 2 3,1 0 0 2 3,1 0,1035 Аденомиоз/эндометриоз 9 13,8 5 5,9 14 9,3 0,0966 1-2 ст. Миома матки 18 27,7 16 18,8 34 22,7 0,4302 Полипы эндометрия в 15 23,1 12 14,1 27 18 0,1569 анамнезе Гиперплазия эндометрия 4 6,2 3 3,5 7 4,7 0,4502 в анамнезе Хронический эндометрит 7 10,8 8 9,4 15 10 0,7836 Эктопия шейки матки 24 36,9 34 40 58 38,7 0,7014 Уреаплазмоз в анамнезе 8 12,3 15 17,6 23 15,3 0,3685 Микоплазмоз в анамнезе 3 4,6 3 3,5 6 4 0,7366 Хламидиоз в анамнезе 4 6,2 11 12,9 15 10 0,1697 2 Данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ -тест. 63 Анализ данных о частоте операций на органах малого таза (сальпингоовариолизис, тубэктомия, лапароскопия, миомэктомия, полипэктомия) не выявил различий в группах сравнения (таблица 7). Таблица 7 Сведения о перенесенных оперативных вмешательствах на органах малого таза у пациенток, включенных в исследование Оперативное Группа 1 n=65 Группа 2 n=85 Всего р-уровень вмешательство n % n % n % Сальпингоовариолизис 36 55,4 46 54,1 82 54,7 0,8772 Тубэктомия 15 23,1 28 32,9 43 28,7 0,1855 Коагуляция очагов НГЭ 7 10,8 9 10,6 16 10,7 0,9716 Миомэктомия 8 12,2 8 9,4 16 10,7 0,5691 Полипэктомия 15 23,1 12 14,1 27 18 0,1782 Данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест. Заболеваемость детскими инфекционными заболеваниями (эпидемический паротит и краснуха) и соматическая заболеваемость, включающая аутоиммунные заболевания, не отличалась статистически значимо у наблюдаемых пациенток. Спектр сопутствующих экстрагенитальных заболеваний представлен в табл. 8. Таблица 8 Особенности соматической заболеваемости у пациенток, включенных в исследование Заболевание Группа 1 n=65 n % 8 12,3 Группа 2 n=85 n % 11 12,9 Всего N % 19 12,7 руровень 0,9079 Аллергические заболевания Эпидемический паротит 4 6,1 7 8,2 11 7,3 0,6279 Краснуха 19 29,2 17 20 39 26 0,1896 Болезни органов дыхания 7 10,8 10 11,8 17 11,3 0,8488 Сердечно-сосудистые 2 3,1 2 2,4 4 2,7 0,7850 заболевания Болезни ЖКТ 8 12,3 11 12,9 19 12,7 0,9079 Урологические 6 9,2 10 11,8 16 10,7 0,6183 заболевания Аутоиммунный 9 13,9 6 7,1 15 10 0,1711 тиреоидит гипофункцией щитовидной железы Аутоиммунные 2 3,1 0 0 2 3,1 0,1035 заболевания Хронический тонзилит 22 33,8 19 22,4 41 27,3 0,2869 Миопия 2 3,1 4 4,7 6 4 0,6139 Данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %; χ2-тест 64 Заболевания органов дыхания включали бронхиальную астму и хронический бронхит. перенесенную пневмонию, Основными заболеваниями сердечно-сосудистой системы были синусовая тахикардия, пролапс митрального клапана и артериальная гипертензия. Среди перенесенных заболеваний мочевыделительной системы отмечались хронический цистит и хронический пиелонефрит. Патология желудочно-кишечного тракта проявлялась хроническим гастритом и язвенной болезнью желудка в стадии ремиссии. Из заболеваний эндокринной системы наблюдались узловой зоб и аутоиммунный тиреоидит с гипофункцией щитовидной железы. Среди другой аутоиммунной патологии у 2-х пациенток с БОО в анамнезе был ревматоидный артрит. При изучении семейного анамнеза было выявлено, что у матерей пациенток основной группы менопауза наступила значимо раньше, чем у матерей женщин контрольной группы. Так средний возраст наступления менопаузы у матерей женщин с БОО составил (48,2±2,1) лет по сравнению с (49,7±2,2) лет у матерей пациенток, нормально ответивших на стимуляцию овуляции (р<0,0001). При оценке других клинико-анамнестических факторов риска развития БОО был установлен факт более редкого и менее длительного приема КОК в основной группе женщин (таблица 9). Таблица 9 Клинико-анамнестические факторы риска развития «бедного» овариального ответа у пациенток, включенных в исследование Факторы риска Группа 1 n=65 Группа 2 n=85 р-уровень Возраст менопаузы у матери (лет)* 48,2±2,1 49,7±2,2 <0,0001 Прием КОК в анамнезе, %** 8 (12,3%) 22 (25,9%) 0,0394 Длительность приема КОК (лет)* 2,8±1,2 3,9±1,2 0,0458 *данные представлены как средние ± стандартное отклонение; -t-тест; ** данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест. Мы провели многофакторный анализ оценки шансов развития БОО с учетом клинико-анамнестических факторов риска. При этом значимыми факторами риска явились возраст пациенток и возраст менопаузы у матерей пациенток. Остальные факторы риска явились конфаундерами в созданной модели (площадь под кривой - AUC=75%). Указанные переменные были 65 представлены в виде бинарных данных с определением порогов отсечки, при которых созданная модель была максимально достоверной. ОШкор БОО при возрасте пациентки более 34 лет и возрасте менопаузы у матери менее 48 лет составило 6,2 (95% ДИ=2,4; 15,7) (рисунок 3). 34 года 48 лет Рисунок 3. ROC-кривые зависимости развития БОО от возраста пациенток и возраста наступления менопазы у матерей пациенток 3.2. Клинико-лабораторное обследование пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ Перед включением в протокол ЭКО пациентки были обследованы согласно приказу Минздрава Российской Федерации от 30.08.2012 №107н "О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению" [5]. Для определения влияния возможных конфаундеров в исследуемых группах был произведен анализ результатов лабораторных исследований всех пациенток. Данные обязательных инструментальных (флюорография органов грудной клетки, ЭКГ, УЗИ молочных желез, кольпоскопия) и лабораторных исследований (клинический анализ крови, биохимический анализ крови, общий анализ мочи, цитологическое исследования шейки матки) у пациенток обеих групп не отличались между собой и были в пределах нормы. При оценке овариального резерва с помощью УЗИ органов 66 малого таза были выявлены признаки истощения фолликулярного аппарата яичников (уменьшение объема яичников и снижение числа антральных фолликулов ≤ 5-7) у 81,5 % женщин с «бедным» ответом. Результаты проведенного гормонального обследования пациенток не выявили значимых отличий показателей в группах сравнения за исключением более высокого уровня ФСГ и значительно более низкого уровня АМГ в группе БОО (таблица 10). На основании уровня АМГ у пациенток с БОО был выявлен сниженный фолликулярный резерв (у 53 из 65 пациенток) по сравнению с группой сравнения (у 8 из 85 женщин) (ОШ=42,5; 95% ДИ=14,9; 125,9). Нормальный овариальный резерв был выявлен лишь у 18,5% женщин с БОО, что полностью соответствовало данным УЗИ. Таблица 10 Данные гормонального исследования у пациенток, включенных в исследование Показатели ФСГ (МЕ/л) р*-уровень <0,0001 Группа 1 (n=65) 8,6±3,4 Группа 2 (n=85) 6,7±2,2 0,64±0,52 2,29±1,9 <0,0001 5,4±3,8 5,6±2,9 0,7719 Пролактин (мМЕ/л) 280,3±199,9 234,4±173,5 0,1382 Эстрадиол (пмоль/л) 147,7±115 146±132,7 0,9356 Прогестерон (22д.ц.) (нмоль/л) 12,4±16,9 9,9±14,8 0,7118 1,7±1,7 0,8938 17-ОП (нмоль/л) 1,6±1,9 1,3±1 0,9±0,2 0,4237 ТТГ (мМЕ/л) 1,8±1,6 1,8±1,2 0,9631 Т4 св. (пмоль/л) 11,5±4,8 12,2±4,5 0,3403 129,9±316,9 218,5±370,3 0,5108 АМГ (нг/мл) ЛГ (МЕ/л) Тестостерон (нмоль/л) Анти -ТПО Анти-ТГ 39,4±60,9 17,7±10,3 Данные представлены как средние ± стандартное отклонение; *t-тест. 0,4062 ОШ развития БОО при уровне АМГ менее 1,0 нг/мл (найденный порог отсечки) составил 22,0 (95% ДИ 9,3; 51,9). ОШ развития БОО при уровне ФСГ более 10 МЕ/мл (найденный порог отсечки) составил 7,7 (95% ДИ 2,5; 24,3). 67 3.3. Влияние различных протоколов стимуляции суперовуляции на параметры фолликулогенеза и оогенеза у пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ В соответствии с задачей №2 у включенных в исследование пациенток проводилась оценка параметров оогенеза. Индукция суперовуляции осуществлялась в рамках протокола с Гн и ант-ГнРг или «длинного» протокола с Гн и а-ГнРГ. С целью получения оптимального количества зрелых ооцитов индивидуально подбирались соответствующий протокол стимуляции и стартовая доза гонадотропинов. «Длинный» протокол начинался с 19-21 дня менструального цикла с блокады с гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы путем ежедневного подкожного введения а-ГнРГ. При этом стимуляция суперовуляции начиналась со 2-3 дня менструального цикла при продолжающемся введении а-ГнРГ. С введения стартовой дозы препаратов Гн на 2-3 день цикла начинался протокол с ант-ГнРГ. В дальнейшем, при проведении УЗ-мониторинга при необходимости производилась коррекция дозы препарата рФСГ. При достижении лидирующим пулом фолликулов размера 14 мм и вплоть до дня введения триггера овуляции производилось введение препарата ант-ГнРГ для профилактики преждевременной лютеинизации фолликулов. С целью финального дозревания ооцитов при достижении одним или несколькими фолликулами диаметра 18 мм вводился препарат ХГ в дозе 5000-10000 ЕД внутримышечно, после чего через 35-36 часов производилась трансвагинальная пункция фолликулов и аспирация ооцитов. В результате 150 циклов ЭКО или ЭКО + ИКСИ было получено 638 ооцитов: 108 ооцитов у пациенток основной группы и 530 – в группе контроля. Из них было всего 86 зрелых ооцитов в группе с БОО и 434 ооцита в группе с нормальным ответом (p<0,0001). Пациентки 2-х групп отличались по среднему числу созревших фолликулов (1,9±0,3 и 7,9±3,1; p<0,0001) и полученных ооцитов 68 (1,7±0,6 и 6,2±2,5; p<0,0001). Характеристика полученных ооцитов участниц исследования приведена в таблице 11. Таблица 11 Параметры оогенеза у пациенток, включенных в исследование Данные оогенеза Группа 1 (n=65) Группа 2 (n=85) р-уровень Число полученных ооцитов 108 530 Среднее число ооцитов на 1 1,7±0,6 6,2±2,5 <0,0001 пациентку* Число зрелых ооцитов/число 86 (79,6%) 434 (77,4%) <0,0001 полученных ооцитов** Среднее число зрелых ооцитов на 1,3±0,8 5,1±2,9 <0,0001 1 пациентку* Число незрелых ооцитов/число 12 (11,1%) 48 (9,1%) 0,0166 полученных ооцитов** Среднее число незрелых ооцитов 0,2±0,4 0,6±0,9 0,0030 на 1 пациентку* Число дегенеративных 10 (9,3%) 48 (9,1%) 0,0984 ооцитов/число полученных ооцитов** Среднее число дегенеративных 0,1±0,4 0,6±1,1 0,0070 ооцитов на 1 пациентку* *данные представлены как средние ± стандартное отклонение, t-тест; ** данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест. Нами было оценено влияние протокола с ант-ГнРГ и «длинного» протокола с а-ГнРГ на число полученных фолликулов и ооцитов в программах ВРТ. «Длинный» протокол с а-ГнРГ был назначен 13,3% пациенток - 10 из 65 пациенток с «бедным» и 10 из 85 пациенток с нормальным овариальным ответом. Число полученных фолликулов и ооцитов было несколько выше у пациенток с БОО при назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ, составив 2,0±0,1 и 1,9±0,3 фолликулов и 1,9±0,3 и 1,6±0,6 ооцитов соответственно, что, однако, не было статистически значимо (р>0,05). У пациенток группы контроля, наоборот, при назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ было получено несколько меньшее число фолликулов и ооцитов, составив (6,4±3,1) и (8,1±3,0) фолликулов, и (5,8±2,6) и (6,3±2,5) ооцитов соответственно (р>0,05) (рисунок 4). 69 10 Среднее значение Среднее значение±СО 9 8 Число ооцитов 7 6 5 4 3 2 1 F(3;146) = 69,564; p < 0,0001 0 2 1 4 3 2 - БОО/ант-ГнРГ; 1 - БОО/аг-ГнРГ; 4 - N ответ/ант-ГнРГ; 3 - N ответ/аг-ГнРГ Рисунок 4. Коробочный график, отражающий среднее число полученных ооцитов у пациенток с «бедным» и нормальным овариальным ответом в зависимости от протокола стимуляции суперовуляции Таким образом, протокол стимуляции суперовуляции не влиял значимо на число полученных фолликулов и ооцитов у пациенток обеих групп. Но, при этом, число полученных фолликулов и ооцитов было несколько выше у пациенток с БОО при назначении а-ГнРГ по сравнению с женщинами группы контроля, у которых протокол с ант-ГнРГ имел преимущество. При оценке эффективности назначения а-ГнРГ у пациенток с БОО в зависимости от уровня АМГ было выявлено, что протоколы с а-ГнРГ способствуют получению относительно большего числа ооцитов у пациенток с более низким уровнем АМГ. Медиана АМГ в группе БОО составила 0,5 нг/мл. Из 30 пациенток с уровнем АМГ<0,5 нг/мл четырем был назначен протокол с а-ГнРГ. Из 35 пациенток с уровнем АМГ>0,5 нг/мл протокол с а-ГнРГ был назначен шести пациенткам. При назначении а-ГнРГ по сравнению с ант-ГнРГ число полученных ооцитов было относительно выше у пациенток с уровнем АМГ< 0,5 нг/мл, составив соответственно 2,0±0,0 и 1,5±0,6 ооцитов (δ=0,5), по сравнению с 70 женщинами, имеющими уровень АМГ >0,5 нг/мл, у которых число полученных ооцитов составило 1,8±0,4 и 1,7±0,6 соответственно (δ=0,1). При назначении аГнРГ число полученных ооцитов было относительно выше у пациенток с уровнем АМГ<0,5 нг/мл, составив 2,0±0,0, по сравнению с женщинами, имеющими уровень АМГ >0,5 нг/мл, у которых число полученных ооцитов составило 1,8±0,4, и было несколько выше, чем при назначении ант-ГнРГ (соответственно, 1,5±0,6 и 1,7±0,6). Доза вводимых гонадотропинов имела обратную корреляционную зависимость с числом полученных фолликулов (r=-0,5636, p=0,0001), ооцитов (r=0,5591, p=0,0001) и эмбрионов (r=-0,4681, p=0,0001), что объясняется необходимостью дополнительного введения высоких доз Гн при резистентности яичников к стимуляции суперовуляции. Средние дозы вводимых Гн группе с БОО составили 273±58 МЕ/день и были выше, чем в группе контроля – 162±35 МЕ/день (р<0,0001). 3.4. Характеристика раннего эмбриогенеза и исходов ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции В соответствии с задачей №2 в ходе проспективного когортного исследования у включенных в исследование пациенток проводилась оценка параметров эмбриогенеза и исходов программ ВРТ. Все полученные ооциты были оплодотворены путем инсеминации или с помощью ИКСИ. Из них было получено 450 эмбрионов: 81 эмбрион в группе БОО (в среднем 1,2±0,8 эмбриона на 1 пару) и 369 эмбрионов в группе с нормальным ответом яичников (в среднем 4,3±2,6 эмбриона на 1 пару) (p<0,0001). В основном все полученные эмбрионы были хорошего качества (А и В): 93,8% и 94,3% в группах сравнения соответственно. В каждом цикле проводился перенос двух эмбрионов сходного качества (таблица 12). Число полученных ооцитов коррелировано с числом полученных эмбрионов (r=0,87, p<0,0001), а также с их качеством (r=0,84, p<0,0001). 71 На 14-15-й день после переноса эмбрионов в полость матки в 49 случаях была диагностирована биохимическая беременность: 15 в группе БОО (23,1%) и 34 в группе сравнения (40,0%) (р=0,0285). Клинически было диагностировано 43 беременности: 12 – в группе БОО (18,5%), 31 – в группе нормального ответа яичников (36,5%) (р=0,0156). ОШгр наступления беременности составило 2,53 (95% ДИ=1,17; 5,49). С учетом выявленных конфаундеров (возраст, характер менструального цикла, длительность бесплодия, уровни ФСГ и АМГ, число полученных ооцитов и эмбрионов) ОШкор наступления беременности составило 1,48 (95% ДИ=0,57; 3,85). Таблица 12 Параметры раннего эмбриогенеза у пациенток, включенных в исследование Характеристика эмбриогенеза Группа 1 (n=65) Группа 2 (n=85) р-уровень Число полученных эмбрионов 81 369 Среднее число эмбрионов на 1 1,2±0,8 4,3±2,6 <0,0001 пациентку* Эмбрионы хорошего качества 76 (93,8%) 348 (94,3%) <0,0001 (классы Аи В)/число полученных эмбрионов** Среднее число эмбрионов хорошего 1,17±0,8 4,1±2,5 <0,0001 качества на 1 пациентку* Эмбрионы плохого качества 5 (6,2%) 20 (5,4%) 0,5081 (классы С и D)/ число полученных эмбрионов** Среднее число эмбрионов плохого 0,08±0,3 0,2±0,9 0,1700 качества на 1 пациентку* *данные представлены как средние ± стандартное отклонение, t-тест **данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест. Проведя анализ исходов беременностей в изучаемых группах, мы выявили большее число самопроизвольных прерываний беременности в первом триместре у пациенток с «бедным» овариальным ответом. Всего в сроке до 8-9 недель беременности было отмечено 10 прерываний и неразвивающихся беременностей: 4 – в основной группе (33,3% от общего числа беременностей в этой группе), 6 – в группе сравнения (19,35% от общего числа беременностей в этой группе) (р=0,8257). Остальные наступившие в результате ВРТ беременности закончились родами. 72 Таким образом, в группе БОО беременность завершилась родами у 8 пациенток. Всего родилось 10 живых детей. В 2 случаях произошли преждевременные роды двойней на 35-й и 36-й неделе гестации соответственно. В группе сравнения беременность закончилась родами у 25 пациенток. Всего в этой группе родилось 33 живых ребенка. У 8 женщин произошли роды двойней, у остальных 17 пациенток родилось по одному ребенку. Роды двойней в данной группе также были преждевременными на сроках 34-36 недель гестации. Таким образом, в группе пациенток с «бедным» ответом число живорождений было статистически значимо меньшим по сравнению с группой контроля. В основной группе частота живорождения составила 12,3% (8 из 65), а в контрольной группе – 29,4% (25 из 85) (р=0,0122). Отношение шансов живорождения в зависимости от ответа яичников на проводимую гормональную стимуляцию составило 2,97 (95% ДИ = 1,25; 7,08) (рисунок 5). 40% 36,50% 29,40% 23,10% 18,50% 12,30% Биохимические беременности Клинические беременности Группа 1 Живорождения Группа2 Рисунок 5. Исходы программ ВРТ у пациенток, включенных в исследование Мы проанализировали влияние протоколов стимуляции суперовуляции на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» и нормальным овариальным ответом. Всего в группе пациенток с БОО «длинный» протокол с а-ГнРГ был назначен 15,4% пациенток (10 из 65) (группа 1.1), протокол с ант-ГнРГ – 84,6% пациенток (55 из 65) (группа 1.2), в группе с нормальным овариальным ответом - 73 11,8% пациенток (10 из 85) (группа 2.1), и 88,2% женщин (75 из 85) (группа 2.2) соответственно. Согласно полученным данным, применение а-ГнРГ приводит к получению большего количества ооцитов и, как следствие, эмбрионов. Всего в группе 1.1 было получено 1,5±0,7 эмбрионов, в группе 1.2 – 1,2±0,8 эмбрионов (р>0,05), в группе 2.1 -3,8±2,2 и эмбриона, в группе 2.2 – 4,4±2,7эмбриона соответственно (р>0,05). Параметры эмбриогенеза представлены в таблице 13. Таблица 13 Параметры раннего эмбриогенеза у пациенток, включенных в исследование, в зависимости от протокола стимуляции суперовуляции Характеристика эмбриогенеза Группа 1.1 (n=10) полученных 15 Группа рГруппа Группа р1.2 уровень 2.1 2.2 уровень (n=55) (n=10) (n=75) 66 38 331 Число эмбрионов Среднее число эмбрионов на 1,5±0,7 1,2±0,8 0,2852 3,8±2,2 4,4±2,7 0,4940 1 пациентку* Эмбрионы хорошего 15 61 38 311 качества (классы Аи (100%) (92,4%) (100%) (93,9%) В)/число полученных эмбрионов** Среднее число эмбрионов 1,5±0,7 1,1±0,9 0,1873 3,8±2,2 4,1±2,5 0,6888 хорошего качества на 1 пациентку* Эмбрионы плохого качества 0 5 0 20 (классы С и D)/ число (7,6%) (6,1%) полученных эмбрионов** Среднее число эмбрионов 0 0,1±0,3 0,4150 0 0,3±0,9 0,3720 плохого качества на 1 пациентку* *данные представлены как средние ± стандартное отклонение, t-тест **данные представлены как абсолютное число пациенток и доли пациенток в %, χ2-тест. Так как применение а-ГнРГ в группе женщин с БОО приводит к получению несколько большего числа ооцитов и эмбрионов, их применение должно быть более эффективным при «бедном» ответе, чем применение ант-ГнРГ. Однако в нашем исследовании беременность в большей степени наступала у пациенток, стимуляция суперовуляции у которых проводилась с помощью протокола с антГнРГ. В группе 1.1 биохимическая беременность наступила у 3(30%) пациенток, в группе 1.2. – у 12 пациенток (21,8%) (р=0,5721). В группе 2.1. биохимическая 74 беременность наступила у 3 пациенток (30%), в группе 2.2. – у 31 пациентки (41,3%) (р=0,4919). Клиническая беременность наступила у 1 пациентки из группы 1.1. (10%) и у 11 пациенток из группы 1.2. (20%) (р=0,4534), у 3 пациенток из группы 2.1. (30%) и у 28 пациенток из группы 2.2. (37,3%) (р=0,6508) Частота наступления беременности определялась из расчета на перенос эмбрионов. ОШ наступления беременности при стимуляции суперовуляции с применением ант-ГнРГ по сравнению с а-ГнРГ в группе с БОО составило 2,25 (95% ДИ=0,25; 100,01), в группе с нормальным ответом яичников - 1,39 (95% ДИ=0,33; 7,06). Таким образом, по нашим данным результатам беременность чаще наступала у пациенток, стимуляция суперовуляции у которых проводилась с помощью протокола с ант-ГнРГ, чем в программах с «длинным» протоколом, однако число ограниченным. «длинных» протоколов, примененных в исследовании, было 75 Глава 4. РОЛЬ АУТОИММУННЫХ АНТИТЕЛ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В РАЗВИТИИ «БЕДНОГО» ОВАРИАЛЬНОГО ОТВЕТА В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 4.1. Результаты иммунологического исследования у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции. 4.1.1. Исследование аутоантител в сыворотке крови и в фолликулярной жидкости В соответствии с задачей №3 было проведено одномоментное исследование в параллельных группах. Пациентки из группы с «бедным» овариальным ответом (65 женщин) и группы с нормальным овариальным ответом (85 женщин) были стратифицированы на подгруппы в зависимости от наличия или отсутствия признаков снижения овариального резерва: Группа 1а (n=53) - пациентки с БОО и сниженным овариальным резервом; Группа 1б (n=12) - пациентки с БОО и сохраненным овариальным резервом; Группа 2а (n=77) - пациентки с нормальным овариальным ответом и сохранным овариальным резервом; Группа 2б (n=8) - пациентки с нормальным овариальным ответом и сниженным овариальным резервом (рисунок 6). 76 Пациентки, проходящие программу ЭКО (n=150) Группа 1 Пациентки с БОО (n=65) Группа 1а Пациентки со сниженным овариальным резервом (n=53) Группа 1б Пациентки с сохраненным овариальным резервом (n=12) Группа 2 Пациентки с нормальным ответом (n=85) Группа 2а Пациентки с сохраненным овариальным резервом (n=77) Группа 2б Пациентки со сниженным овариальным резервом (n=8) Рисунок 6. Распределение пациенток на группы в зависимости от овариального ответа (ESHRE 2011 г.) и овариального резерва Всем пациенткам, включенным в исследование, в день пункции фолликулов проводилось определение различных видов аутоантител в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа (ИФА). Определялись антитела к тканям яичника классов IgM и IgG (антитела к zona pellucida (анти-ZP), общие антиовариальные антитела (АОА), антитела к ФСГ (анти-ФСГ), и антитела к ГнРГ (анти-ГнРГ)), а также другие виды аутоиммунных антител классов IgM и IgG (антикардиолипиновые антитела (АКЛ), антитела к β2-гликопротеину-1 (анти-β2ГП), антитела к хорионическому гонадотропину (анти-ХГ)). Согласно полученным данным отмечалось статистически значимое отличие в уровне общих АОА IgM, анти-ZP IgM и IgG, анти-ГнРГ IgG и анти-β2-ГП-1 IgG, которые были выше у женщин с БОО (p<0,05) (рисунок 7). Другие виды аутоантител хотя и были выше в группе женщин с БОО, но не статистически значимо (таблица 14). 77 Таблица 14 Средний уровень различных аутоантител в сыворотке крови в группах с «бедным» и нормальным овариальным ответом Вид аутоантител*и ед. Группа 1 (n=65) Группа 2 (n=85) измерения Общие АОА IgM ед. ОП 0,184±0,045 0,165±0,035 Общие АОА IgG ед. ОП 0,154±0,039 0,156±0,039 Анти-ZP IgM ед. ОП 0,167±0,030 0,154±0,028 Анти-ZP IgG ед. ОП 0,209±0,065 0,179±0,048 Анти-ФСГ IgM ед. ОП 0,312±0,106 0,283±0,099 Анти-ФСГ IgG ед. ОП 0,313±0,127 0,284±0,108 Анти-ГнРГ IgM ед. ОП 0,238±0,118 0,236±0,092 Анти-ГнРГ IgG ед. ОП 0,324±0,126 0,290±0,081 Анти-ХГ IgM Ед/мл 21,123±8,190 19,518±9,390 Анти-ХГ IgG Ед/мл 24,431±16,075 21,188±12,539 АКЛ IgM Ед/мл 2,432±1,896 2,355±0,927 АКЛ IgG Ед/мл 3,349±2,425 3,380±1,586 Анти-β2-ГП1 IgM Ед/мл 2,423±2,829 1,880±0,983 Анти-β2-ГП1 IgG Ед/мл 2,575±3,374 1,621±0,854 *Данные представлены как средние ± стандартное отклонение ** t-тест. 0,50 0,45 0,40 ед.ОП 0,35 р-уровень** 0,0043 0,7575 0,0070 0,0012 0,0928 0,1352 0,9189 0,0451 0,2749 0,1672 0,7441 0,9255 0,1018 0,0133 Среднее значение±СО АОА IgM АОАIgG анти-ZP IgM анти-ZP IgG анти-ГнРГ IgM анти-ГнРГ IgG 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0 1 Группы пациенток: 0 - БОО, 1 - нормальный ответ Рисунок 7. Коробочный график, отражающий средний уровень различных аутоантител в группах пациенток с «бедным» и нормальным овариальным ответом 78 При стратификации групп в зависимости от овариального резерва было установлено, что у женщин с БОО и нормальным овариальным резервом наблюдались более высокие уровни антител по сравнению с пациентками с БОО и сниженным овариальным резервом, нормальным ответом и нормальным овариальным резервом и нормальным ответом и сниженным резервом яичников. Данные представлены в таблице 15. Таблица 15 Уровни аутоантител в зависимости от ответа яичников на стимуляцию суперовуляции и овариального резерва Вид аутоантител* и ед. Группа 1а Группа 1б Группа 2а измерения (n=53) (n=12) (n=77) Общие АОА IgM ед. ОП 0,181±0,046 0,196±0,037 0,167±0,035 Общие АОА IgG ед. ОП 0,155±0,038 0,159±0,046 0,154±0,039 Анти-ZP IgM ед. ОП 0,165±0,031 0,155±0,028 0,175±0,021* Анти-ZP IgG ед. ОП 0,207±0,053 0,180±0,049 0,219±0,104* Анти-ФСГ IgM ед. ОП 0,305±0,109 0,337±0,087 0,287±0,100 Анти-ФСГ IgG ед. ОП 0,315±0,133 0,300±0,093 0,290±0,108 Анти-ГнРГ IgM ед. ОП 0,235±0,118 0,246±0,117 0,238±0,095 Анти-ГнРГ IgG ед. ОП 0,323±0,130 0,327±0,108 0,289±0,079 Анти-ХГIgM Ед/мл 20,981±8,240 21,75±8,292 19,948±9,654 Анти-ХГIgG Ед/мл 25,169±17,049 21,167±10,727 21,649±12,767 АКЛ IgM Ед/мл 2,443±2,089 2,383±0,528 2,405±0,952 АКЛ IgG Ед/мл 3,319±2,563 3,483±1,77 3,419±1,628 Анти-β2-ГП1 IgM Ед/мл 2,549±3,113 1,867±0,579 1,909±1,017 Анти-β2-ГП1 IgG Ед/мл 2,419±2,515 3,267±5,974 1,644±0,876 Данные представлены как средние ± стандартное отклонение *ANOVA, p<0,05 Мы проанализировали влияние различных Группа 2б (n=8) 0,144±0,02 0,149±0,035 0,139±0,017 0,165±0,027 0,246±0,094 0,214±0,063 0,216±0,057 0,293±0,105 15,375±4,955 16,750±9,618 1,87±0,409 3,0±1,106 1,60±0,509 1,40±0,595 клинико-анамнестических данных пациенток на уровень изучаемых антител в сыворотке крови. Было отмечено, что на уровень антител к тканям яичника оказывали влияние следующие факторы. На уровень ФСГ класса IgM - возраст пациенток (р=0,0442), число родов (р=0,0343), эктопических беременностей (р=0,0007) и тубэктомий в анамнезе (р=0,0479), а также наличие хронического аднексита (р=0,0210). На уровень анти-ГнРГ IgM - число родов в анамнезе (р=0,0343). На уровень АОА IgM – число попыток ЭКО в анамнезе (р=0,0383). На уровень анти-Zp IgM наличие лапароскопий в анамнезе (р=0,0479). На уровень других аутоантител оказывали влияние такие факторы как число беременностей (на уровень анти-ХГ 79 IgG (р=0,0213)), число абортов (на уровень анти- β2-ГП IgM (р=0,0149) и анти-ХГ IgG (р=0,0174)), число эктопических беременностей (на уровень анти-ХГ IgG (р=0,0174)), наличие эндометриоза (на уровень анти- β2-ГП IgM (р=0,0396) и уровень анти- β2-ГП IgG (р=0,0267)), перенесенный эпидемический паротит (на уровень АКЛ IgM (р=0,0357)) и наличие аллергических заболеваний (на уровень АКЛ IgM (р=0,0320)). У пациенток с «бедным» ответом в фолликулярной жидкости, полученной при трансвагинальной пункции яичников и заборе ооцитов путем аспирации, определяли следующие аутоантитела с помощью ИФА: общие АОА IgA и IgG, анти-ZP IgA и IgG, анти-ФСГ IgA и IgG, анти-ГнРГ IgA и IgG, анти-ХГ IgA, IgM и IgG, АКЛ IgG, анти-β2-ГП IgG (таблица 16). Таблица 16 Уровень различных аутоантител в фолликулярной жидкости у пациенток с «бедным» овариальным ответом (n=30) Вид аутоантител и единицы Уровень антител * измерения Общие АОА IgА ед. ОП 0,177±0,031 Общие АОА IgG ед. ОП 0,259±0,065 Анти-ZP IgА ед. ОП 0,234±0,059 Анти-ZP IgG ед. ОП 0,303±0,081 Анти-ФСГ IgА ед. ОП 0,381±0,172 Анти-ФСГ IgG ед. ОП 0,368±0,142 Анти-ГнРГ IgА ед. ОП 0,27±0,106 Анти-ГнРГ IgG ед. ОП 0,341±0,114 Анти-ХГ IgM ед. ОП 0,093±0,042 Анти-ХГ IgG ед. ОП 0,363±0,195 Анти-ХГ IgА ед. ОП 0,527±0,283 АКЛ IgG Ед/мл 4,35±1,429 Анти-β2-ГП1 IgG Ед/мл 1,26±0,339 *Данные представлены как средние ± стандартное отклонение Было обнаружено, что выявленный в фолликулярной жидкости уровень антител к гормонам классов IgG и IgA был в 5-10 раз ниже, чем их уровень в сыворотке крови. При оценке корреляционной связи между уровнями аутоантител в сыворотке крови и фолликулярной жидкости отмечалась значимая прямая корреляционная зависимость между уровнями анти-ZP IgG (r=0,3929, p=0,0320) и между уровнями анти-ФСГ IgG (r=0,4695, p=0,0090). Между уровнями других 80 аутоантител в сыворотке и фолликулярной жидкости значительной корреляции выявлено не было (таблица 17). Таблица 17 Корреляционная зависимость между уровнями аутоантител в крови и фолликулярной жидкости пациенток с БОО Фолликулярная АОА IgА жидкость Кровь АОА IgM r = 0,0099 p=0,9590 АОА IgG r =0,1313 p=0,4890 Анти-ZP IgM АОА IgG Анти-ZP IgА Анти-ZP IgG r =0,2152 p=0,2530 r =0,0915 p=0,6300 r =0,0061 p=0,9750 r =0,3929 p=0,0320 АКЛ IgG r=0,1176 p=0,5360 r =0,2616 p=0,1630 Анти-ZP IgG АКЛ IgM r=0,0861 p=0,6510 r=0,0357 p=0,8510 АКЛ IgG Анти-β2-ГП1 IgM r =0,0133 p=0,9440 r =0,0869 p=0,6480 Анти-β2-ГП1 IgG Фолликулярная Антижидкость ФСГ IgА Кровь АнтиФСГ IgM АнтиФСГ IgG АнтиГнРГ IgM АнтиГнРГ IgG АнтиХГ IgM АнтиХГ IgG Анти-β2ГП IgG r =0,0335 p=0,861 r =0,1626 p=0,391 АнтиФСГ IgG АнтиГнРГ IgА АнтиГнРГ IgG АнтиАнтиХГ IgM ХГ IgG Анти-ХГ IgА r =0,2945 p=0,114 r=0,1249 p=0,511 r=-0,092 p=0,627 r=0,019 p=0,917 r=0,4695 p=0,009 r =0,1189 r p=0,531 =0,0783 p=0,681 r =0,0784 r =-0,060 p=0,681 p=0,752 r =0,1993 p=0,291 r =0,2956 p=0,113 r=0,0992 p=0,602 81 4.1.2. Взаимосвязь между уровнем аутоантител и параметрами оогенеза, раннего эмбриогенеза и исходами программ ВРТ В результате 150 циклов ЭКО было получено 86 зрелых ооцитов в группе с БОО и 434 ооцита в группе контроля (p<0,0001). Пациентки 2-х групп отличались по среднему числу созревших фолликулов (1,9±0,3 и 7,9±3,1; p<0,0001) и полученных ооцитов (1,7±0,6 и 6,2±2,5; p<0,0001). При корреляционном анализе между уровнем аутоантител в сыворотке крови и параметрами оогенеза была выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнем антител к блестящей оболочке IgM/IgG в сыворотке крови, уровнем антител к ФСГ IgA в фолликулярной жидкости и числом полученных фолликулов и ооцитов (таблица 18). Таблица 18 Корреляционная зависимость между уровнями аутоантител в сыворотке крови (СК) и фолликулярной жидкости (ФЖ) и параметрами оогенеза у наблюдаемых пациенток Антитела Общие АОА IgM в СК Общие АОА IgG в СК Общие АОА IgA в ФЖ Общие АОА IgG в ФЖ Анти-ZP IgM в СК Анти-ZP IgG в СК Анти-ZP IgA в ФЖ Анти-ZP IgG в ФЖ Анти-ФСГ IgM в СК Анти-ФСГ IgG в СК Анти-ФСГ IgА в ФЖ Анти-ФСГ IgG в ФЖ Анти-ГнРГ IgM в СК Анти-ГнРГ IgG в СК Анти-ГнРГ IgА в ФЖ Анти-ГнРГ IgG в ФЖ АКЛ IgM в СК АКЛ IgG в СК АКЛ IgG в ФЖ Анти-β2-ГП1 IgM в СК Анти-β2-ГП1 IgG в СК Анти-β2-ГП1 IgG в ФЖ Количество фолликулов r=- 0,2108 p=0,2630 r=0,3004 p=0,1070 r=0,2807 p=0,1330 r=-0,2738 p=0,1430 r = - 0,5122 p=0,0040 r = -0,2002 p= 0,2890 r=-0,0838 p=0,6600 r=-0,1312 0,4900 r=0,0754 p=0,6920 r=0,1755 p=0,3540 r=-0,4045 p=0,0270 r=0,0013 p=0,9950 r=0,0911 p=0,6320 r=0,1415 p=0,4560 r=0,1145 p=0,5470 r=-0,1382 p=0,4670 r=-0,0002 p=0,9900 r=0,2743 p=0,1420 r=0,1765 p=0,3510 r=-0,1202 p=0,5270 r=-0,1178 p=0,5350 r=0,0619 p=0,7450 Количество ооцитов r=- 0,1653 p=0,3830 r=0,1304 p=0,4920 r=0,1034 p=0,5870 r=-0,2423 p=0,1970 r = -0,3721 p=0,0430 r = -0,1070 p=0,5740 r=-0,1177 p=0,5360 r=-0,1090 p=0,5660 r=-0,0799 p=0,6750 r=0,2143 p=0,2560 r=-0,3391 p=0,0670 r=0,0553 p=0,7720 r=-0,0254 p=0,8940 r=0,1399 p=0,4610 r=0,1413 p=0,4560 r=-0,0567 p=0,7660 r =0,0483 p=0,5570 r=0,2468 p=0,1890 r=-0,0712 р=0,7090 r=-0,2027 p=0,2830 r=-0,0759 p=0,6890 r=0,0541 p=0,7770 82 Также была выявлена отрицательная корреляционная связь между уровнем АМГ и сывороточным уровнем анти-ZP IgM (=-0,3741, p=0,0420). Все ооциты были оплодотворены, и из них было получено 450 эмбрионов: 81 эмбрион в группе БОО (в среднем 1,2±0,8 эмбриона на 1 пару) и 369 эмбрионов в группе с нормальным ответом яичников (в среднем 4,3±2,6 эмбриона на 1 пару) (p<0,0001). Наблюдалась статистически значимая отрицательная корреляционная связь между сывороточным уровнем анти-ZP IgM и числом полученных эмбрионов (r=-0,1615, р=0,047) и погранично значимая корреляционная связь между уровнем анти-ФСГ IgG и числом полученных эмбрионов (r=-0,3395, p=0,0660). Клинически было диагностировано 43 беременности: 12 – в группе БОО (18,5%), 31 – в группе нормального ответа яичников (36,5%) (р=0,0156). С помощью регрессионного анализа с построением ROC-кривых нами был определен пороговый уровень антител к блестящей оболочке ооцита при развитии БОО, который составил для IgM 0,140 ед. ОП, для IgG 0,152 ед. ОП. При построении ROC-кривой для анти-Zp IgM чувствительность модели составила 87,7%, специфичность – 65,9%, площадь под кривой (AUC) - 60,9%. ОШ риска БОО при выявлении уровня анти-ZP IgM более 0,140 ед. ОП составило 3,7 (95% ДИ=1,5; 8,8). При построении ROC-кривой для анти-Zp IgG чувствительность модели составила 86,2%, специфичность – 62,4%, площадь под кривой (AUC) 61,9%. При выявлении уровня анти-ZP IgG более 0,152 ед. ОП ОШ риска БОО составило 3,7 (95% ДИ=1,6; 8,6) (рисунок 8). 83 Рисунок 8. ROC-кривые вероятности БОО в программах ВРТ в зависимости от уровня антител к блестящей оболочке ооцита: (а) AUC для анти-ZP IgM=60,9%, (б) AUC для анти-ZP IgG=61,9%, p<0,05 4.2. Результаты молекулярно-генетического исследования у пациенток с «бедным» овариальным ответом на стимуляцию суперовуляции 4.2.1. Число CGG-повторов в гене FMR1 и овариальный ответ в программах ВРТ У всех 150 включенных в исследование женщин в день трансвагинальной пункции фолликулов был произведен забор крови для оценки числа CGGповторов в гене FMR1. Среднее число повторов в аллеле 1 в группе женщин с БОО составило 25,9±4,2 (от 16 до 36), в группе с нормальным ответом – 26,1±3,5 (от 19 до 31) (р=0,8401). Среднее число повторов в аллеле 2 в группе женщин с БОО составило 32,1±5,1 (от 22 до 49), в группе с нормальным ответом – 29,6±2,3 (от 22 до 38) (р<0,0001) (рисунок 9, таблица 19). 84 38 CGG-повторы аллель 1 CGG-повторы аллель 2 Число CGG-повторов гена FMR1 36 34 32 30 28 26 24 22 20 Ящик: Среднее значение ± ошибка с редней; Ус ы: с тандартное отклонение 0 1 Группы пациенток: 0 - БОО, 1 - нормальный ответ Рисунок 9. Число CGG-повторов в FMR1-гене у женщин с «бедным» и нормальным овариальным ответом Таблица 19 Число CGG-повторов в гене FMR1 в зависимости от ответа яичников на стимуляцию Число CGG-повторов Группа 1 Группа 2 в гене FMR1 (n=65) (n=85) В аллеле 1 25,9±4,2 26,1±3,5 В аллеле 2 32,1±5,1 29,6±2,3 Данные представлены как средние ± стандартное отклонение ANOVA, p-уровень 0,8401 <0,0001 Фолликулярный резерв не был статистически значимо связан с числом CGG-повторов в обеих аллелях. Число CGG-повторов в аллеле 1 у пациенток группы 1 со сниженным овариальным резервом составило 26,2±4,3, с нормальным овариальным резервом – 24,7±4,02 (р=0,2791); у пациенток группы 2 со сниженным резервом – 25,7±3,5, с нормальным резервом – 26,1±3,6 (р=0,7824). Число CGG-повторов в аллеле 2 у пациенток группы 1 со сниженным овариальным резервом составило 32,6±5,5, с нормальным резервом – 30,0±2,01 85 (р=0,1167); у пациенток группы 2 со сниженным резервом – 28,7±0,5, с нормальным резервом – 29,7±2,4 (р=0,2837) (таблица 20). Таблица 20 Число CGG-повторов в гене FMR1 в зависимости от ответа яичников на стимуляцию и овариального резерва Число CGG-повторов Группа 1а Группа 1б Группа в гене FMR1 (n=53) (n=12) (n=77) Аллель 1 26,2±4,3 24,7±4,02 26,1±3,6 Аллель 2 32,6±5,5 30,0±2,01 29,7±2,4 Данные представлены как средние ± стандартное отклонение 2а Группа (n=8) 25,7±3,5 28,7±0,5 2б Gleicher N. et al. (2010) и другие исследователи (Chen L.S. et al., 2003; Fu Y.H. et al., 1991) в своих работах определили, что число CGG-повторов в диапазоне от 26 до 34 связано с нормальной функцией яичников [79, 181, 196]. Всего в аллеле 1 число повторов менее 26 и/или более 34 было выявлено у 26 женщин из группы 1 (40%) и 29 из группы 2 (34,1%) (р=0,4587). Из них число повторов более 34 было выявлено у 1 пациентки в группе 1 (1,5%) и не выявлено в группе 2 (р=0,8670). В аллеле 2 число повторов менее 26 и/или более 34 было выявлено у 18 женщин из группы 1 (27,7%) и у 7 из группы 2 (8,2%) (р=0,0015). Из них более 34 повторов было выявлено у 15 пациенток в группе 1 (23,1%) и 4 пациенток из группы 2 (4,7%) (р=0,0020). Значение ОШ при наличии числа CGGповторов более 34 в каком-либо из аллелей гена составило 6,1 (95% ДИ=1,8; 26,3). Т.е. у женщин с наличием большого числа CGG-повторов (более 34) в каком-либо из аллелей гена FMR1 риск развития БОО был в 6 раз выше, чем при нормальном числе повторов. При наличии числа CGG-повторов менее 26 высокого риска развитии БОО нами не было обнаружено. 4.2.2. Полиморфизмы гена ВМР15 и овариальный ответ в программах ВРТ У всех включенных в исследование 150 пациенток было произведено исследование генетических факторов, включавшее детектирование известных single nucleotide polymorphism (SNP), а также анализ частичных нуклеотидных 86 последовательностей двух экзонов гена ВМР15. Для анализа SNP гена ВМР15 в трех позициях: 202C>T (Arg68Trp, rs104894763), 538G>A (А180T, rs104894767) и c.328+905A>G(rs3897937) были определены замены одиночных нуклеотидов модифицированным методом «примыкающих проб». С целью выявления новых полиморфизмов гена ВМР15, как возможных предикторов «бедного» овариального ответа, в последующем было проведено секвенирование двух фрагментов обоих экзонов данного гена. При проведении секвенирования гена BMP15 были выявлены 4 известных SNP гена (c.308A>G; c.46 G>А; c.538 G>A; c.202С>Т), обозначенных в базе данных GenBank (NCBI) и описанных в литературе, а также обнаружены два новых, не описанных ранее SNP: замена с.607 С>T и делеция c.-8delC. Взаиморасположение выявленных полиморфных локусов представлено на рисунке 10. Результаты генотипирования представлены в таблице 21. Почти все выявленные полиморфизмы находились в гетерозиготном состоянии. Частота минорного аллеля колебалась от 0,007 до 0,526. При оценке распространенности аллеля использовали фенотипическую частоту. Рисунок 10. Схематичное изображение геномной структуры BMP15 с локализацией выявленных полиморфных локусов 87 Таблица 21 Выявленные SNP в гене BMP15 Позиция* Расположение Замена Замена Частота аминокислоты (транскрибция) минорного аллеля rs41308602 50911091 Экзон1 Asn103Ser c.308A>G 0,020 rs138281369 50910829 Экзон1 Val16Met c.46 G>А 0,020 rs104894767 50915966 Экзон2 Ala180Thr c.538 G>A 0,013 rs104894763 50910985 Экзон1 Arg68Trp c.202С>Т 0,007 rs3897937 50912016 Интрон 1 -------------c.328+905A>G 0,526 50916035 Экзон2 -------------c.607 C>T 0,020 50910775 Экзон1 -------------с.-8delC 0,040 *Положение гена согласно NCBI Build 38.1. SNP При анализе известных аллелей гена BMP15 была определена ассоциация между БОО и SNP в экзоне1 rs41308602 (с.308 A>G) с более частым выявлением аллеля G у пациенток с БОО по сравнению с контрольной группой (0,046 vs. 0,0; р=0,0454). Частота в интроне гена SNP rs3897937 (c.328+905A>G) также погранично значимо отличалась между группами с более частым выявлением аллеля G в группе с БОО (0,615 vs. 0,458; р=0,0570) (рисунок 11, таблица 22). Частота других известных полиморфизмов не отличалась значимо между группами (таблица 23). БОО Контроль 100% 89,2% 91,8% 90% 80% 70% 54,2% 60% 50% 38,5% 61,5% 50,8% 45,9% 37,6% 40% 30% 20% 10,7% 8,2% 10% 0% AA AG GG A G Генотип Аллель р=0,1632 p=0,5970 p=0,0570 Рисунок 11. Ассоциация полиморфизма гена BMP15 c.328+905A>G с «бедным» ответом яичников на стимуляцию 88 Таблица 22 Ассоциация аллелей полиморфизма гена BMP15 c.328+905A>G у пациенток с «бедным» и нормальным ответом яичников на стимуляцию Группа 1 n=65 25 (38,5%) 33 (50,8%) 7 (10,7%) 58 (89,2%) 40 (61,5%) AA AG GG A G Группа 2 n=85 46 (54,2%) 32 (37,6%) 7 (8,2%) 78 (91,8%) 39 (45,9%) p-уровень 0,1632 0,5970 0,0570 Таблица 23 Частота выявления мутаций гена BMP15 у пациенток с «бедным» и нормальным ответом яичников на стимуляцию SNP Число пациентов rs41308602 rs138281369 rs104894767 rs104894763 rs3897937 c.607 C>T с.-8delC 150 150 150 150 150 150 150 Частота минорного аллеля Группа 1 Группа 2 n=65 n=85 0,046 (n=3) 0 0,015 (n=1) 0,023 (n=2) 0,015(n=1) 0,011(n=1) 0,015(n=1) 0 0,615 (n=40) 0,459 (n=39) 0 0,035 (n=3) 0,061 (n=4) 0,023 (n=2) Аллельный χ2 p-уровень 4,003 0,124 0,036 1,316 3,621 2,340 1,385 0,0454 0,7240 0,8481 0,2512 0,0570 0,1260 0,2391 В экзоне 2 нами была обнаружена новая вариация гена BMP15 в положении 656 мРНК с заменой c.607 C>T, которая выявлялась только у пациенток без БОО, что может быть связано с защитной ролью этого SNP в развитии БОО. Также в кодирующей последовательности гена BMP15 нами была выявлена не описанная ранее однонуклеотидная делеция с.-8delC в позиции 42. Эта делеция, хотя и не статистически значимо, но в 3 раза чаще выявлялась у пациенток с БОО. В мРНК такая делеция не нарушает рамки считывания, поскольку находится в 5' — нетранслируемой области, однако все же может мешать инициации трансляции белка, то есть нарушать работу гена, что, возможно, приводит к снижению яичникового резерва и количеству полученных ооцитов (таблица 23). Мы проанализировали разницу в суммарном выявлении изученных гаплотипов гена BMP15 в группах сравнения. Было выявлено, что суммарно у 89 пациенток с БОО в 2,7 раз чаще выявлялись изученные SNP по сравнению с группой контроля. При анализе суммарного выявления SNP, расположенных в экзоне 1 и областью рядом с экзоном 1 (c.308A>G; c.202С>Т; c.328+905A>G), которые по данным литературы ассоциируются с овариальным ответом яичников на стимуляцию овуляции, было выявлено, что у пациенток с БОО данные SNP встречались в 2,5 раз чаще (таблица 24). Таблица 24 Cуммарная частота выявления вариантов гена BMP15 у пациенток с «бедным» и нормальным ответом яичников на стимуляцию Сочетание редких генотипов c.308A>G; c.46 G>А; c.538 G>A; c.202С>Т; c.328+905A>G; c.607 C>T c.308A>G; c.202С>Т; c.328+905A>G Группа 1 n=65 Группа 2 n=85 ОШ (95% ДИ) 0,767 0,550 2,7 (1,25; 5,96) 0,676 0,458 2,47 (1,20;5,14) 4.2.3. Полиморфизм СAG-повтора гена андрогенного рецептора и овариальный ответ в программах ВРТ У всех пациенток, включенных в исследование, было произведено определение длины CAG повторов гена AR с помощью ПЦР-реакции. В общей популяции женщин количество CAG-повторов в гене AR варьирует от 11 до 35, наиболее часто встречаются аллели, содержащие около 20 повторов [160]. В нашем исследовании длина тринуклеотидных САG-повторов колебалась от 11 до 36. Мы не нашли разницы в числе CAG-повторов гена AR по обеим аллелям. У всех пациенток, кроме одной пациентки в контрольной группе, число CAGповторов было в пределах референсных значений. Число CAG-повторов в группе с БОО варьировало от 11 до 31, в группе с нормальным ответом - от 12 до 36. Наиболее распространенными аллелями как у женщин с «бедным» ответом, так и в контрольной группе были 21 и 23 CAG, частота которых в группах составила 38,5% (25/65) и 36,5% (31/85) соответственно. Среднее число CAG-повторов по 90 аллелю 1 в группе с БОО было 20,3±2,6, в группе с нормальным ответом яичников - 20,3±2,5 (р=0,9237). По аллелю 2 число повторов составило в группе 1 – 24,1±2,5, в группе 2 – 23,5±3,1 (р=0,2697). 4.3. Взаимосвязь аутоиммунных и генетических факторов у пациенток с «бедным» овариальным ответом Мы проанализировали связь между уровнем антител к ткани яичника и числом CGG-повторов в группе женщин с БОО. Для этого пациентки с БОО были разделены на 2 группы: группа 1а – пациентки, у которых число CGG-повторов по обеим аллелям было в пределах референсных значений (26-34) (n=31), и группа 1б – пациентки, у которых число CGG-повторов было больше или меньше референсных значений по хотя бы одному из аллелей (n=34) (рисунок 12). Пациентки с «бедным» ответом (n=65) Группа 1 а (n=31) Группа 1 б (n=34) Пациентки с числом CGGповторов в пределах 26-34 Пациентки с числом CGGповторов больше 34 или меньше 26 Рисунок 12. Распределение пациенток с БОО на группы в зависимости от числа CGG-повторов в гене FMR1 Распределение уровня антител к ткани яичника (АОА и анти-ZP) и антител к гонадотропинам (анти-ФСГ и анти-ГнРГ) классов IgM и IgG представлено в таблице 25. 91 Таблица 25 Уровни аутоантител (ед. ОП) в зависимости от числа CGG-повторов FMR1-гена у пациенток с БОО Антитела Группа 1а n=31 Группа 1б n=34 ZP-IgM 0,178 (0,156-0,193) 0,163 (0,147-0,176) ZP-IgG 0,206 (0,164-0,263) 0,192 (0,161-0,232) AOA-IgM 0,192 (0,146-0,226) 0,177 (0,148-0,199) AOA-IgG 0,150 (0,134-0,174) 0,142 (0,124-0,181) Анти-ФСГ IgM 0,303 (0,230-0,370) 0,292 (0,235-0,402) Анти-ФСГ IgG 0,269 (0,233-0,363) 0,274 (0,227-0,358) Анти-ГнРГ IgM 0,181 (0,146-0,256) 0,226 (0,166-0,307) Анти-ГнРГ IgG 0,316 (0,265-0,365) 0,292 (0,256-0,319) Данные представлены как медианы с интерквартильным размахом. Тест Манна-Уитни, р-уровень 0,0411 0,3969 0,2371 0,4904 0,8695 1,0000 0,0841 0,0612 Было выявлено, что у пациенток с БОО и нормальным числом CGGповторов средний уровень антител к тканям яичника был выше, чем у пациенток с числом GGG-повторов, выходящим за пределы нормального диапазона: средний уровень IgM к ZP был статистически значимо выше (p=0,0411) (рисунок 13), а средний уровень IgG к ГнРГ - несколько выше с пограничным значением p (р=0,0612). 92 0,50 Ящик: медиана с интерквартильным размахом; Усы: диапазон без выбросов 0,45 ZP_IgM: KW-H(1;65) = 4,173; p = 0,0411 ZP_IgG: KW-H(1;65) = 0,7178; p = 0,3969 0,40 анти-ZP IgM Выбросы анти-ZP IgG Выбросы ед.ОП 0,35 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 2 1 Группы: 1 - 1а (n=31), 2-1б (n=34) Рисунок 13. Уровень антител к ZP IgM (ед.ОП) в зависимости от числа CGGповторов FMR1-гена у пациенток с БОО Нами был определен порог отсечки по уровню изучаемых антител у пациенток с «бедным» ответом по медиане распределения и 75-ой перцентили (таблица 26). Таблица 26 Медиана и 75-ая перцентиль распределения уровня антител к тканям яичника и гонадотропинам (ед. ОП) у пациенток с БОО Антитела ZP-IgM ZP-IgG AOA-IgM AOA-IgG Анти-ФСГ IgM Анти-ФСГ IgG Анти-ГнРГ IgM Анти-ГнРГ IgG Медиана распределения 0,167 0,195 0,188 0,147 0,301 0,27 0,206 0,299 75-ая перцентиль 0,189 0,244 0,213 0,179 0,37 0,359 0,265 0,34 Уровень антител IgM к ZP более 0,167 ед. ОП (медиана распределения) был выявлен у 21 женщины с нормальным числом повторов (67,7%) и у 13 пациенток 93 с числом повтором, отличающихся от референсных значений (38,2%) (р=0,0171). Выше 0,189 ед. ОП (75-ая перцентиль) уровень IgM анти-ZP был выявлен у 12 пациенток группы 1а (38,7%) и у 5 пациенток группы 1б (14,7%) (р=0,0281). Уровень антител к ZP IgG более 0,195 ед. ОП (медиана распределения) был выявлен у 18 пациенток группы 1а (58,1%) и у 15 женщин группы 1б (44,1%) (р=0,2613). Выше 0,244 ед. ОП (75-ая перцентиль) уровень IgG анти-ZP был выявлен у 11 пациенток группы 1а (35,5%) и у 6 (17,6%) женщин группы 1б (17,6%) (р=0,1021). Всего выше 75-ой перцентили антитела к ZP (>0,189 ед. ОП для IgM и 0,244 ед. ОП для IgG) были выявлены у 19 пациенток группы 1а (61,3%) и у 11из группы 1б (32,3%) (ОШ=3,3, 95% ДИ=1,07; 10,4). Уровень общих АОА и антител к Гн не отличался значимо между группами (таблица 27, 28). Таким образом, более высокий уровень антител к тканям яичника (анти-ZP) выявлялся у пациенток с числом CGG-повторов от 26 до 34 по сравнению с пациентками с числом повторов меньше или больше этого диапазона. Таблица 27 Частота выявления антител к ткани яичника с уровнем выше заданного порога отсечки в зависимости от числа CGG-повторов FMR1-гена у пациенток с БОО Порог отсечки антител Группа 1а n=31 Группа 1б n=34 ZP-IgM (медиана) ZP-IgM (75-ая перцентиль) ZP-IgG (медиана) ZP-IgG (75-ая перцентиль) Суммарные IgM/IgG анти-ZP (медиана) Суммарные IgM/IgG анти-ZP (75 перцентиль) АОА-IgM (медиана) АОА-IgM (75 перцентиль) АОА-IgG (медиана) АОА-IgG (75 перцентиль) Суммарные IgM/IgG АОА (медиана) Суммарные IgM/IgG АОА (75 перцентиль) Суммарные IgM/IgG анти-ZP и АОА (медиана) Суммарные IgM/IgG анти-ZP и АОА (75 перцентиль) 21 (67,7%) 12 (38,7%) 18(58,1%) 11(35,5%) 27(87,1%) 19(61,3%) 13 (38,2%) 5(14,7%) 15 (44,1%) 6(17,6%) 22(64,7%) 11(32,4%) χ2-тест руровень р=0,0171 р=0,0281 р=0,2613 р=0,1021 р=0,0361 р=0,0192 17 (54,8%) 10 (32,3%) 16(51,6%) 8(25,8%) 25(80,6%) 14(45,2%) 16 (47,1%) 7 (20,6%) 17 (50%) 9(26,5%) 24(70,6%) 12(35,3%) р=0,5313 р=0,2854 р=0,8975 р=0,9511 р=0,3472 р=0,4173 30(96,8%) 28(82,4%) р=0,0614 24(77,4%) 18(52,9%) р=0,0395 94 Таблица 28 Частота выявления антител к гонадотропинам с уровнем выше заданного порога отсечки в зависимости от числа CGG-повторов FMR1-гена у пациенток с БОО Порог отсечки антител Группа 1а n=31 Группа 1б n=34 антиФСГ-IgM (медиана) антиФСГ-IgM (75-ая перцентиль) антиФСГ-IgG (медиана) антиФСГ-IgG (75-ая перцентиль) Суммарные IgM/IgG антиФСГ (медиана) Суммарные IgM/IgG антиФСГ (75 перцентиль) антиГнРГ-IgM (медиана) антиГнРГ-IgM (75 перцентиль) антиГнРГ-IgG (медиана) антиГнРГ-IgG (75 перцентиль) Суммарные IgM/IgG антиГнРГ (медиана) Суммарные IgM/IgG антиГнРГ (75 перцентиль) Суммарные IgM/IgG антиФСГ и антиГнРГ (медиана) Суммарные IgM/IgG антиФСГ и антиГнРГ (75 перцентиль) 18 (58,1%) 9 (29%) 14(45,2%) 8(25,8%) 22(70,9%) 13(41,9%) 15 (44,1%) 8 (23,5%) 20 (58,8%) 9(26,5%) 24(70,6%) 15 (44,1%) χ2-тест руровень р=0,2612 р=0,6141 р=0,2713 р=0,9514 р=0,9732 р=0,8596 15 (48,4%) 6 (19,4%) 20(64,5%) 10(32,3%) 27(87,1%) 14(45,2%) 18 (52,9%) 11 (32,4%) 14(41,2%) 7(20,6%) 26(76,5%) 16(47,1%) р=0,7145 р=0,2343 р=0,0604 р=0,2853 р=0,2702 р=0,8781 29(93,5%) 28(82,4%) р=0,1705 19(61,3%) 20(58,8%) р=0,8395 Проведенный нами сравнительный анализ между женщинами с «нормальным» числом CGG-повторов и носительницами «аномальной» длины повторов показал, что антитела к ZP значительно чаще встречаются в группе с нормальным числом повторов (26-34). Таким образом, нормальное число CGGповторов у пациенток с «бедным» ответом может свидетельствовать о возможном аутоиммунном генезе поражения тканей яичников, и, наоборот, отсутствие антиовариальных антител может указывать на генетически-обусловленный БОО. Уровень АМГ отличался в группах с наличием и отсутствием повышенного уровня антител к ZP (IgM или IgG). У пациенток с уровнем анти-ZP более 75-ой перцентили содержание АМГ было выше и составило (0,77 (0,401,50)) нг/мл по сравнению с (0,44(0,30-0,69)) нг/мл у женщин с уровнем анти-ZP менее 75-ой перцентили (р=0,0013). Отмечалась прямая корреляционная связь между уровнем АМГ и уровнем анти-ZP IgM (r=0,28, p=0,0218). Также у пациенток с высокими и низкими уровнями антител к тканям яичника не 95 отмечалось значительного различия по частоте нормального овариального резерва по данным УЗИ (соответственно,23,3% и 14,3%; р=0,3486). У пациенток с числом CGG-повторов менее 26 и/или более 34 по какому-либо из аллелей FMR1 гена уровень АМГ хоть и не статистически значимо, но был ниже по сравнению с пациентками, у которых число CGG-повторов находилось в пределах 26-34, и составил соответственно (0,67±0,49) нг/мл и (0,74±0,63) нг/мл (р=0,6322). Это может быть связано с менее значительным повреждением ткани яичника аутоиммунными антителами по сравнению с генетически обусловленным поражением яичников и, как следствие, повышением уровня АМГ (рисунок 14). QQ диаграмма уровня АМГ и анти-ZP IgM A Диаграмма рассеивания уровня АМГ по сравнению с CGG в аллеле 2 B АМГ = -1,7425+14,5191*x АМГ = 0,9015-0,0066*x; 0,95 Conf.Int. 2,0 1,8 1,8 анти-ZP IgM/АМГ: r=0,2841, p=0,0218 1,6 1,4 1,4 1,2 1,2 1,0 1,0 АМГ АМГ 1,6 2,0 0,8 0,8 0,6 0,6 0,4 0,4 0,2 0,2 0,0 0,0 -0,2 0,06 -0,2 20 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 0,22 0,24 25 анти-ZP IgM 30 35 40 45 50 55 СGG-повторы в аллеле 2 Рисунок 14. Уровень АМГ у пациенток с различным уровнем анти-ZP IgM (A) и числом CGG-повторов в аллеле 2 (B) Уровень тестостерона был ниже у пациенток с наличием повышенного уровня антител по сравнению с группой сравнения и составил 1,4±1,6 нмоль/л и 2,2±2,8 нмоль/л соответственно (р=0,2079). По всей видимости, при наличии АОА клетки теки страдают в большей степени, чем клетки гранулезы, что приводит к снижению уровня тестостерона. Уровни других половых гормонов не различались значимо между группами пациенток с БОО и различным уровнем аутоантител, а также различным числом CGG-повторов гена FMR1. 96 Таким образом, аутоиммунная форма «бедного» ответа является клинически менее выраженной по сравнению с генетически-обусловленным БОО и характеризуется лучшей сохранностью фолликулярного пула. 4.4. Модель прогноза «бедного» овариального ответа в программах ВРТ на основании оценки клинико-анамнестических, иммунологических и генетических факторов В ходе проведенного исследования случай-контроль нами были выявлены значимые клинико-анамнестические факторы риска, оказывающие влияние на развитие «бедного» овариального ответа в программах ВРТ, которыми явились возраст женщин и их наследственность. Отношение шансов БОО при возрасте пациентки более 34 лет и возрасте менопаузы у матери менее 48 лет составило 6,2 (95% ДИ=2,4; 15,7). Другие потенциальные факторы риска, такие как прием гормональных контрацептивов и предшествующие попытки ЭКО в анамнезе, не доказали свою значимость в созданной модели предикции БОО и явились лишь конфаундерами. Результаты проведенного гормонального обследования пациенток не выявили значимых отличий показателей в группах сравнения за исключением более высокого уровня ФСГ и значительно более низкого уровня АМГ в группе БОО. Пороговый уровень АМГ, при котором было отмечено наиболее вероятное развитие БОО, составил 1,0 нг/мл, а пороговый уровень ФСГ – 10 МЕ/мл. ОШ развития БОО при уровне АМГ менее 1,0 нг/мл составило 22,0 (95% ДИ 9,3; 51,9), а ОШ развития БОО при уровне ФСГ более 10 МЕ/мл составил 7,7 (95% ДИ 2,5; 24,3). Протокол стимуляции суперовуляции («длинный» с а-ГнРг или протокол с ант-ГнРГ) не оказывал значимого влияния на число полученных ооцитов и развитие БОО в программах ЭКО. При исследовании уровня аутоиммунных антител в сыворотке крови значимая разница в их концентрации была выявлена лишь для антител к zona 97 pellucida классов IgM и IgG, общих антиовариальных антител класса IgM, антител к ГнРГ класса IgG и антител к β2-ГП1 класса IgG. Однако значимая корреляционная связь была определена лишь между уровнем полученных ооцитов и антителами к zona pellucida. С помощью регрессионного анализа с построением ROC-кривых нами был определен пороговый уровень антител к блестящей оболочке ооцита при развитии БОО, который составил для IgM 0,140 ед. ОП, для IgG 0,152 ед. ОП. ОШ БОО при уровне анти-ZP IgM более 0,140 ед. ОП составило 3,7 (95% ДИ=1,5; 8,8). При выявлении уровня анти-ZP IgG более 0,152 ед. ОП было определено ОШ БОО, равное 3,7 (95% ДИ=1,6; 8,6). Изучение числа CGG-повторов в гене FMR1 у пациенток с БОО по сравнению с группой контроля показало наличие более длинных повторов по обеим аллелям в группе с БОО. ОШ БОО при наличии числа CGG-повторов более 34 в каком-либо из аллелей гена составило 6,1 (95% ДИ=1,8; 26,3). Подобной зависимости в развитии БОО при наличии числа CGG-повторов менее 26 нами обнаружено не было. При проведении анализа частичных нуклеотидных последовательностей двух экзонов гена ВМР15 была установлена ассоциация между БОО и SNP в экзоне1 rs41308602 (с.308 A>G) с более частым выявлением аллеля G у пациенток с БОО по сравнению с контрольной группой, и между БОО и SNP в интроне 1 rs3897937 (c.328+905A>G) с более частым наличем аллеля G у пациенток с БОО по сравнению с контрольной группой. Изучение суммарного выявления SNP, расположенных в экзоне 1 и областью рядом с экзоном 1 (c.308A>G; c.202С>Т; c.328+905A>G), которые по данным литературы ассоциируются с овариальным ответом яичников на стимуляцию суперовуляции, было установлено, что у пациенток с БОО данные SNP встречались в 2,5 раз чаще (ОШ=2,47, 95% ДИ=1,20; 5,14). Все указанные выше предикторы были включены в создание моделей прогноза «бедного» овариального ответа в программах ВРТ, созданной с помощью метода логистической регрессии. Модель №1 была разработана на основании включения в модель бинарных предикторов с применением разделения 98 и калибровки и использованием теста Хошмера – Лемешева (p=0,9362). Достоверность модели была проверена путем построения кривой ROC. Площадь под кривой (AUC) составила 89,6%. Итак, было получено следующее правило прогнозирования БОО в программах ВРТ на основании оценки клиникоанамнестических данных, иммунологических и генетических параметров (1). (1) Exp(-8,4+1,1*В+2,6*М+3,8*АМГ+1,8*CGG +3,7*Zp_IgM+1,8*Zp_IgG) Р(БОО)= -------------------------------------------------------------------------------------1+Exp(-8,4+1,1*В+2,6*М+3,8*АМГ+1,8*CGG +3,7*Zp_IgM+1,8*Zp_IgG) где Р(БОО) – вероятность «бедного» ответа в программах ВРТ, Exp – экспонента, В – возраст пациентки более 34 лет, М – возраст менопаузы у матери пациентки менее 48 лет, АМГ – уровень АМГ менее 1,0 нг/мл, CGG – число CGG-повторов в гене FMR1 более 34 в любом из аллелей гена, Zp_IgM – уровень антител класса IgM к zona pellucida более 0,140 ед. ОП, Zp_IgG – уровень антител класса IgG к zona pellucida более 0,152 ед. ОП. Рассмотрим три ситуации. Предположим, что в клинику ВРТ обратилась пациентка в возрасте 35 лет, у матери которой менопауза наступила в возрасте 45 лет, уровень АМГ которой составляет 0,8 нг/мл, число CGG-повторов по аллелю 2 равно 37, уровень анти-Zp IgM составляет 0,150 ед. ОП, а анти-Zp IgG – 0,160 ед. ОП. У такой пациентки вероятность развития БОО на стимуляцию овуляции велика и составляет: Exp(-8,4+1,1+2,6+3,8+1,8+3,7+1,8) Р(БОО)= ----------------------------------------------- = 99,8% 1+Exp(-8,4+1,1+2,6+3,8+1,8+3,7+1,8) В случае обращения в клинику ВРТ пациентки в возрасте 30 лет, у матери которой менопауза наступила в возрасте 55 лет, уровень АМГ которой составляет 2,8 нг/мл, число CGG-повторов по аллелю 1 и 2 равно 28/30, уровень анти-Zp IgM определен в 0,130 ед. ОП, а анти-Zp IgG – 0,140 ед. ОП, вероятность развития БОО у этой женщины на стимуляцию суперовуляции мала и составляет: 99 Exp(-8,4+0) Р(БОО)= ----------------- = 0,02% 1+Exp(-8,4+0) При обращении в клинику ВРТ пациентки в возрасте 40 лет, у матери которой менопауза наступила в возрасте 50 лет, уровень АМГ составляет 0,5 нг/мл, число CGG-повторов по аллелю 1 и 2 равно 26/31, уровень анти-Zp IgM составляет 0,150 ед. ОП, а анти-Zp IgG – 0,140 ед. ОП, вероятность развития БОО на стимуляцию суперовуляции составляет у данной женщины: Exp(-8,4+1,1+0+3,8+0+3,7+0) Р(БОО)= --------------------------------------------- = 54,9% 1+Exp(-8,4+1,1+0+3,8+0+3,7+0) Модель №2 была разработана на основании включения в модель непрерывных переменных с применением разделения и калибровки и использованием теста Хошмера – Лемешева (p=0,8453). Достоверность модели была проверена путем построения кривой ROC. Площадь под кривой (AUC) составила 84%. Итак, было получено следующее правило прогнозирования БОО в программах ВРТ на основании оценки клинико-анамнестических данных, иммунологических и генетических параметров (2). (2) Exp(1,87+0,17*В-0,31*М+0,27*ФСГ+0,16*CGG2) Р(БОО)= --------------------------------------------------------------1+Exp(1,87+0,17*В-0,31*М+0,27*ФСГ+0,16*CGG2) где Р(БОО) – вероятность «бедного» ответа в программах ВРТ, Exp – экспонента, В – возраст пациентки, М – возраст менопаузы у матери пациентки, ФСГ – уровень ФСГ, CGG2 – число CGG-повторов во 2-ом аллеле в гене FMR1. Рассмотрим две ситуации. Предположим, что в клинику ВРТ обратилась пациентка в возрасте 35 лет, у матери которой менопауза наступила в возрасте 45 лет, уровень ФСГ составляет 11,8 МЕ/л, число CGG-повторов по аллелю 2 равно 37, то у такой пациентки развития БОО на стимуляцию овуляции велика и составляет: 100 Exp(1,87+0,17*35-0,31*45+0,27*11,8+0,16*37) Р(БОО)= -------------------------------------------------------------- = 95,1% 1+Exp(1,87+0,17*35-0,31*45+0,27*11,8+0,16*37) При обращении в клинику ВРТ пациентки в возрасте 30 лет, у матери которой менопауза наступила в возрасте 55 лет, уровень ФСГ составляет 5,8 МЕ/л, число CGG-повторов по аллелю 2 равно 30, вероятность развития БОО на стимуляцию суперовуляции в данном случае мала и составляет: Exp(1,87+0,17*30-0,31*55+0,27*5,8+0,16*30) Р(БОО)= -------------------------------------------------------------- = 2,3% 1+Exp(1,87+0,17*30-0,31*55+0,27*5,8+0,16*30) 101 Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ В последние годы в области ВРТ были достигнуты большие успехи. Однако успех всей программы ЭКО в целом по-прежнему зависит от проведения успешной стимуляции суперовуляции и получения достаточного количества качественных ооцитов. У пациенток с «бедным» овариальным ответом малое количество яйцеклеток остается главной проблемой в оптимизации процента живорождения. Недостаточное число ооцитов приводит к уменьшению количества годных для переноса в полость матки эмбрионов, что является причиной снижения вероятности наступления беременности у женщин с БОО по сравнению с пациентками с оптимальным числом полученных ооцитов [121]. Вероятность наступления беременности у пациенток с «бедным» ответом низкая и составляет, по некоторым данным, около 2-4% [49]. Существует предположение, что снижение количества полученных ооцитов сочетается со снижением их качества, что также может быть причиной низкого уровня имплантации [115]. Распространенность «бедного» ответа у пациенток в клиниках ЭКО оценивается в 9-24%, и, согласно последним литературным обзорам, доля данного осложнения ВРТ растет ежегодно [19, 146]. Несмотря на то, что в последние два десятилетия было опубликовано множество работ, посвященных проблеме БОО, до сих пор не существует четких подходов к улучшению клинических исходов программы ЭКО у данного контингента пациенток. Физиологическое истощение овариального резерва индивидуально, при этом пик потери большей части фолликулярного пула приходится на 37-38 лет [134]. После этого через 10-13 лет наступает менопауза [32, 33, 134]. У пациенток с «бедным» овариальным ответом данные временные рамки не соблюдаются и снижение овариального резерва наступает преждевременно. В нашей работе мы рассматривали «бедный» ответ как клинический вариант преждевременной недостаточности яичников. Патогенез данного заболевания основан на 102 выраженном снижении яичникового резерва, которое проявляется в молодом возрасте (до 40 лет) [133]. Распространенность ПНЯ в женской популяции составляет около1%. В возрасте до 20 лет данное заболевание встречается с частотой 1:10000, в возрасте до 30 лет – 1:1000, в возрасте до 40 лет – 1:100 женщин [46, 56]. Ярко выраженная клиническая картина ПНЯ развивается не сразу. Дебюту яичниковой фертильности на фоне недостаточности регулярного соответствует снижение менструального цикла и нормальных концентраций основных гормонов овариального резерва (АМГ и ФСГ). Данная стадия заболевания считается скрытой [7, 133]. Таким образом, «бедный» овариальный ответ может быть проявлением как клинически выраженной формы преждевременной недостаточности яичников при наличии сниженного овариального резерва у женщин моложе 40 лет, так и скрытой формы ПНЯ, когда БОО развивается на фоне нормального овариального резерва. Прогнозирование ответа яичников перед началом гормональной стимуляции является единственным способом эффективного и безопасного лечения женщин, вступающих в программу ЭКО. Наиболее значимыми в клинической практике прогностическими факторами биохимические параметры, такие как ФСГ и АМГ, объем антральных фолликулов [15]. Однако являются возраст, яичников и число вышеуказанные маркеры функционирования яичников не обладают высокой предиктивной точностью [112]. Для успешного лечения пациенток с «бедным» ответом, необходимо проводить поиск новых биомаркеров овариального резерва [129]. В нашем исследовании у большинства пациенток с «бедным» овариальным ответом выявлялся сниженный овариальный резерв, повышенный уровень ФСГ и более низкий уровень АМГ. Данные показатели вместе с низким уровнем ингибина В являются главными клинико-лабораторными маркерами прогнозирования БОО в предстоящем протоколе ЭКО [142]. При этом следует учитывать, что при повышении базального ФСГ и снижении АМГ не исключается наличие нерастущих нерекрутированных фолликулов в яичниках [78]. Базальный уровень ФСГ начинает постепенно повышаться приблизительно за 10 лет до 103 наступления менопаузы, и, согласно последним исследованиям, является информативным пороговых для предикции овариального резерва только при высоких значениях данного показателя [15]. АМГ продуцируется преантральными и малыми антральными фолликулами [23, 170]. Уровень АМГ имеет низкую вариабельность от цикла к циклу, однако некоторые факторы (курение, прием КОК) могут изменять его уровень в сыворотке крови [189]. АМГ отражает величину пула растущих фолликулов и является ценным маркером яичникового резерва, но не может с точностью свидетельствовать о полном отсутствии фолликулярного аппарата в яичниках [7, 150, 192]. Для более ранней предикции снижения овариального резерва и развития БОО в программах ВРТ проводятся многочисленные исследования, направленные на поиск новых прогностических факторов развития данного состояния. Тем не менее, несмотря на многочисленность подобных работ, их данные весьма противоречивы [58, 65, 109]. Мы провели анализ, направленный на поиск значимых факторов риска в когорте пациенток, обратившихся по поводу лечения бесплодия в отделение вспомогательных методов лечения бесплодия ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова». При проведении многофакторного анализа в ретроспективном исследовании случай-контроль с учетом 15 возможных факторов значимыми факторами риска развития БОО явились старший репродуктивный возраст пациенток и более ранний возраст наступления менопаузы у их матерей. Средний возраст пациенток с БОО был на 3 года больше, а средний возраст наступления менопаузы у их матерей – на 1,5 года меньше, чем в группе женщин с нормальным ответом яичников. Пороговый возраст, предсказывающий наибольшую разницу между развитием и отсутствием БОО в протоколе ЭКО, составил 34 года, пороговый возраст менопаузы у матерей пациенток составил 48 лет. Наши данные совпали с данными, полученными Padhy N. et al. (2010), которые ретроспективно исследовали различные демографические и клинические аспекты у 104 пациенток с БОО [58]. Аналогично нашему исследованию изучались такие факторы риска, как возраст, ИМТ, вид и продолжительность 104 бесплодия, влияние внешних факторов, наличие операций на органах малого таза в анамнезе, предыдущие попытки ЭКО, базальный уровень ФСГ, средний возраст наступления менопаузы у их матерей. При этом, исследователи доказали, что возраст и наследственность были основными предикторами «бедного» овариального ответа. Так, возраст старше 35 лет наблюдался у 60% женщин с БОО и 36,4% женщин контрольной группы. Средний возраст наступления менопаузы у матерей был на 4 года меньше в группе женщин с БОО. Для пациенток старшего репродуктивного возраста характерно физиологическое истощение фолликулярного аппарата яичников, поэтому они с повышением базального уровня ФСГ «бедно» отвечают на стимуляцию. Но возраст женщины не может быть использован в качестве единственного и главного прогностического критерия развития БОО, так как не всегда является его точным предиктором [63]. БОО может наблюдаться у молодых пациенток и отсутствовать у пациенток позднего репродуктивного возраста с сохранным овариальным резервом [64]. Снижение овариального резерва в раннем возрасте может являться доклинической стадией ПНЯ, которая может быть наследственно обусловлена у каждой 3–4 пациентки [3]. Учитывая большую значимость генетических факторов в генезе преждевременного истощения фолликулярного пула, наследственный фактор наравне с возрастом пациентки имеет большое значение как предиктор БОО [114]. В нашем исследовании было выявлено, что БОО чаще развивался у пациенток с большим число самопроизвольных выкидышей, искусственных прерываний беременности и стимуляций овуляции в анамнезе. Тем не менее, данные факторы показали значимость лишь при проведении однофакторного анализа, но не в созданной многофакторной модели. Мы не нашли данных литературы, указывающих на роль числа прерываний беременности в развитии БОО, но, можно предположить, что травматизация полости матки при повторных потерях беременности может влиять на снижение фолликулярного пула и развитие БОО опосредованно через развитие ВЗОМТ. Влияние стимуляции яичников на состояние овариального резерва изучалось в работе La Marca А. et 105 al. (2004), в которой был исследован уровень эстрадиола и АМГ в течение спонтанного менструального цикла и при индукции овуляции препаратом ФСГ [24]. Было показано, что овариальная стимуляция Гн не затрагивает примордиального пула фолликулов и не снижает овариальный резерв, так как при экзогенном введении Гн эксплуатируется лишь Гн-зависимая фаза фолликулогенеза. Отсутствие значения предыдущих стимуляций на функцию яичников показано также в работах других зарубежных авторов [24]. Представляют интерес данные о защитной роли гормональных контрацептивов на сохранение овариального резерва. Было выявлено, что у пациенток с более редким и менее длительным приемом КОК чаще развивался БОО, что, тем не менее, было статистически значимым лишь при проведении однофакторного анализа. Эти данные противоречат изученным патогенетическим механизмам старения яичников. В 2011 г. рабочая группа экспертов из 5 ведущих стран мира (STRAW), изучавшая этапы старения репродуктивной системы, определила современные биомаркеры, отражающие стадийность формирования ПНЯ [90]. Было выявлено, что длительное применение КОК подавляет гипоталамо-гипофизарную систему и приводит к уменьшению объема яичников за счет снижения в нем количества антральных фолликулов диаметром более 6 мм. При этом не имеется никакого влияния на уровень сывороточного АМГ и пула малых антральных фолликулов [159]. Протокол стимуляции суперовуляции, по нашим данным, не влиял значимо на число полученных фолликулов и ооцитов у пациенток обеих групп, но при этом число полученных фолликулов и ооцитов было несколько выше у пациенток с БОО при назначении а-ГнРГ по сравнению с женщинами группы контроля, у которых протокол с ант-ГнРГ имел преимущества. До сих пор нет единого мнения об оптимальной схеме стимуляции суперовуляции для пациенток с БОО. На сегодняшний день считается, что протокол с ант-ГнРГ сокращает продолжительность стимуляции, при этом используются меньшие дозы Гн. Количество полученных ооцитов и процент отмены циклов ЭКО сопоставимы с таковыми при «длинном» протоколе [81]. А-ГнРГ предотвращают 106 преждевременную овуляцию и лютеинизацию фолликулов, но их использование также связано с необходимостью введения более высоких доз Гн [147]. По мнению ряда ученых, а-ГнРГ при «бедном» ответе эффективнее, чем ант-ГнРГ, так как число ооцитов, полученных при стимуляции, несколько выше при использовании «длинного» протокола [116]. По мнению других авторов, у пациенток со сниженными показателями овариального резерва, при стимуляции которых ожидается БОО, протокол с ант-ГнРГ не снижает эффективность программ ЭКО [64]. Проведенный в 2006 году мета-анализ по изучению влияния различных протоколов стимуляции суперовуляции у пациенток с «бедным» ответом показал, что требуются дальнейшие рандомизированные контролируемые исследования для решения этого вопроса [80]. По результатам нашего исследования, беременность чаще наступала у пациенток, стимуляция суперовуляции которых проводилась с помощью протокола с ант-ГнРГ, что может объясняться малым количеством «длинных» протоколов, использованных в исследовании. Безусловно, выявление сниженного овариального резерва до начала программы ЭКО является важнейшим прогностическим фактором риска «бедного» ответа. Однако в проведенном нами исследовании у 18,5 % женщин с БОО выявлялся сохранный яичниковый резерв, при этом в 9,4% случаев снижения овариального резерва у женщин отмечался нормальный ответ яичников на стимуляцию. Как уже отмечалось, лабораторные методы (АМГ и базальный ФСГ), с помощью которых оценивается сохранность фолликулярного аппарата яичников, определяются только в период непродолжительного времени созревания преантральных и антральных фолликулов, что и может быть причиной расхождения овариального резерва с типом овариального ответа. Одной из причин БОО у женщин как со снижением, так и без снижения овариального резерва может быть повреждение тканей яичника различными аутоиммунными антителами. Согласно данным Horejsi J. et al. (2000), вероятность выявления антиовариальных антител значительно выше у пациенток с «бедным» овариальным ответом, а также у пациенток с низким уровнем фертилизации 107 ооцитов (40 % и 50 % соответственно) [30]. По мнению Pogacnik KR. et al. (2014), АОА, обнаруживающиеся у 20-30 % пациенток с ПНЯ, играют решающую роль в неэффективности программ ВРТ [148]. Их наличие свидетельствует об иммунном повреждении ткани яичника [61, 148, 188]. В нашем исследовании у женщин с БОО был выявлен статистически значимо более высокий уровень общих АОА класса IgM, а также антител к ZP классов IgM и IgG (p<0,05) по сравнению с пациентками группы контроля. На сегодняшний день в литературе имеется мало данных по оценке роли антител разных классов к блестящей оболочке ооцита в развитии ответа яичников на стимуляцию суперовуляции и генезе БОО. Установлено, что блестящая оболочка, представляющая собой внеклеточный матрикс, окружающий ооциты, играет важнейшую роль в процессе фолликулогенеза и имплантации [57]. Наличие антител к блестящей оболочке приводит к нарушению развития фолликула и созревания яйцеклетки, а также может вызвать повреждение ткани яичников с формированием аутоиммунного оофорита [68]. В своей работе Koyama K. et al. (2005) показали важную роль антител к блестящей оболочке в генезе ПНЯ и нарушений процесса оплодотворения [68]. Антитела к блестящей оболочке наиболее часто определяются в крови и фолликулярной жидкости пациенток с 2-мя и более неудачными попытками ЭКО, и при эндометриозе [100]. В нашем исследовании наблюдалась статистически значимая отрицательная корреляционная связь между уровнем анти-ZP IgM и числом полученных эмбрионов. Следует отметить, что у наблюдаемых нами пациенток 75-ый перцентиль распределения антиовариальных антител не превышал порог референсного значения. При этом медианный уровень был значимо выше у пациенток с БОО. Хотя средние уровни АОА в обеих группах были ниже порога референсного значения, в группе с БОО средний уровень АОА был значительно выше, чем в группе сравнения. Пороговые значения уровня антител к ZP, определенные с помощью регрессионного анализа с построением ROC-кривых, также были значительно ниже принятых референсных значений и составили 0,140 ед. ОП для 108 IgM и 0,152 ед ОП для IgG. По-видимому, для повышения эффективности диагностики аутоиммунных поражений яичников необходимо проведение дополнительных исследований на большом клиническом материале с уточнением референсных значений для АОА и антител к ZP. Многими исследователями изучалась патофизиологическая роль антител к гонадотропинам в генезе ПНЯ и «бедного» овариального ответа [88, 89, 157]. По мнению некоторых ученых, одной из причин появления этих антител может быть иммунизация организма женщины экзогенно вводимыми гонадотропинами [50]. В настоящее время изучается индуцированная и спонтанная продукция антител к ГнРГ. Действие контрацептивных вакцин, используемых для контроля фертильности и лечения гормонально-ассоциированных опухолей, основано на индукции образования антител к ГнРГ [82]. Существуют единичные данные о возможной продукции антител к ГнРГ в ответ на лечение аналогами гормона [43], а также о спонтанной продукции анти-ГнРГ антител [144, 197], которая, может наблюдаться при невынашивании беременности и снижении фертильности [1]. Учитывая важную физиологическую роль, которую играет ГнРГ в репродуктивной системе, мы решили изучить возможную взаимосвязь между антителами к ГнРГ и «бедным» овариальным ответом. В современной литературе также широко обсуждается роль антител к ФСГ разных классов в развитии ПНЯ и БОО. По данным Haller K. et al. (2008), повышение титра антител к ФСГ класса IgG и IgA в день трансвагинальной пункции яичников может стать причиной неэффективности программ ВРТ из-за снижения количества растущих фолликулов и полученных ооцитов [88]. Данные антитела, нарушая связывание гормона с рецептором, снижают биологическую активность экзогенно вводимого или эндогенного ФСГ [45, 69]. По полученным нами данным у женщин с БОО был выявлен статистически значимо более высокий уровень IgG анти-ГнРГ антител (p<0,05) и более высокий уровень антител к ФСГ, чем в группе сравнения. Отсутствие значимых различий между группами по анти–ФСГ антителам может быть связано с ограниченным числом пациенток в исследуемых группах. 109 В нашем исследовании мы выявили повышение уровня анти-β2-ГП-1 IgG у пациенток с БОО. Роль антифосфолипидных антител (АФА), в том числе антител анти-β2-ГП-1, хорошо изучена в генезе привычного невынашивания беременности, широко обсуждается их значение при ПНЯ и бесплодии неясного генеза [26]. Неудачные циклы ЭКО, по мнению некоторых авторов, могут быть связаны с действием АФА [13, 72]. Это объясняется негативным влиянием АФА на процессы имплантации [52, 187]. Однако согласно данным, полученным Matsubayashi H. et al. (2006), антифосфолипидные антитела класса IgG являются проявлением генерализованной активации иммунной системы и могут вызывать непосредственное повреждение ооцита и эмбриона [96]. Повышение уровня антител анти-β2-ГП-1 у пациенток в группе с БОО свидетельствует о том, что в развитии этой патологии важное значение имеет не только наличие специфических антиовариальных антител, но и общая активация иммунной системы. Мы проводили определение аутоантител в крови и фолликулярной жидкости пациенток с целью определения возможных корреляционных связей между ними. Согласно данным зарубежных авторов, аутоантитела к ткани яичника определяются не только в крови пациенток с ПНЯ и БОО, но и в фолликулярной жидкости, и между ними существует прямая корреляционная зависимость. Так, по результатам Horejsi J. et al. (2000) и Luborsky J. et al. (2002), антиооцитарные антитела были обнаружены в крови и фолликулярной жидкости пациенток программ ВРТ. Частота выявления этих антител была значительно выше у пациенток с БОО [30, 120]. Уровни антител к ФСГ классов G и A в фолликулярной жидкости коррелировали с их уровнем в сыворотке крови, так как анти-ФСГ антитела могут поступать из крови в фолликулярную жидкость. [88]. Титры антител к блестящей оболочке ооцита возрастали в крови и фолликулярной жидкости у пациенток с ПНЯ и неудачными попытками ЭКО [178]. По мнению Matsubayashi H. et al. (2006), у пациенток, страдающих ПНЯ, уровни IgG АФА в крови и фолликулярной жидкости коррелировали [96]. В нашем исследовании значимая корреляционная зависимость была определена между уровнями анти-ZP 110 IgG и анти-ФСГ IgG в сыворотке и фолликулярной жидкости (r=0,3929 и r=0,4695 соответственно, p<0,05). Корреляционной зависимости между другими аутоантителами выявить не удалось, что, вероятно, объясняется недостаточным количеством образцов фолликулярной жидкости, в которой производилось определение антител. По нашим данным, у 18,5% женщин с «бедным» ответом определялся нормальный овариальный резерв. Именно у этих пациенток наблюдались наиболее высокие уровни аутоантител, что может свидетельствовать о ранней фазе аутоиммунного поражения яичников. Наши данные подтверждаются данными других исследователей, которыми было продемонстрировано появление АОА в сыворотке крови за несколько лет до появления симптомов ПНЯ, что характеризует начальную фазу аутоиммунного повреждения яичников [74]. Мы согласны с данными Forges T. et al. (2004) о том, что определение АОА может иметь значение для прогноза исхода лечения бесплодия методом ЭКО [31]. По данным литературы, АОА обнаруживаются в сыворотке крови пациенток с бесплодием неясного генеза в 1/3 случаев [120]. Количество этих антител коррелирует с уровнем ФСГ и АМГ, поэтому эти антитела могут рассматриваться в качестве маркеров аутоиммунного поражения яичников, предсказывая будущее угасание репродуктивной функции у женщин с необъяснимым бесплодием. Превалирующая роль генетической изменчивости в снижении овариального резерва в развитии ПНЯ подтверждена многими исследователями. Наследуемость возраста менопаузы, поражение яичников при синдроме Тернера и других Хсцепленных заболеваниях указывают на значимость генов, расположенных на Ххромосоме в формировании клинической и доклинической стадии яичниковой недостаточности [92, 191]. Fu Y.H. et al. (1991) и Chen L.S. et al. (2003) в своих исследованиях выявили, что число CGG-повторов в гене FMR1, расположенного на длинном плече Х-хромосомы в локусе Xq27, равное 29-30, ассоциировано с нормальной работой яичников и может быть принято за условную норму в отношении овариальной функции [181, 196]. Эти данные подтвердил Gleicher N. et al. (2010), которые определили, что нормальная функция яичников наиболее 111 часто выявляется у женщин, имеющих число CGG-повторов в диапазоне от 26 до 34 [79]. Таким образом, число CGG-повторов может быть предиктором овариального ответа, что важно для прогнозирования риска развития ПНЯ и определения стратегии ведения пациенток в программах ВРТ [9, 166]. В нашем исследовании число пациенток с числом CGG-повторов ниже 26 и/или выше 34 было сопоставимо в обеих сравниваемых группах. Однако число повторов более 34 по обоим аллелям гена значительно чаще выявлялось у пациенток с БОО по сравнению с группой контроля. Среднее число повторов по аллелю 2 также было выше у пациенток с БОО. Таким образом, при наличии числа CGG-повторов более 34 шансы развития БОО в нашей группе пациенток повышались в 6,1 раз. Подобной зависимости в развитии «бедного» ответа при наличии числа CGG-повторов менее 26 нами не было обнаружено. Полученные данные лишь частично согласуются с данными литературы, в которых отмечается, что сниженный овариальный резерв в равной степени связан как с более высоким, так и с более низким числом CGG-повторов [76]. По данным Gleicher N. et al. (2009), если число CGG-повторов составляет менее 28, снижение этого числа на каждые 5 повторов ассоциируется со снижением овариального резерва на 40%. Аналогично, если число CGG-повторов составляет более 35, увеличение этого числа на каждые 5 повторов снижает уровень АМГ и уровень овариального резерва на 50% [166]. Некоторые ученые (Chatterjee S. et al ., 2009) показали в своих работах, что у женщин с числом CGG-повторов более 30 значимо повышается уровень ФСГ и раньше истощается яичниковый резерв [41]. Bretherick K. et al. (2005) и Bodega B. et al. (2006) выявили, что чем больше число CGG-повторов, тем больше вероятность развития ПНЯ и снижения овариального резерва. Даже при невыраженном повышении числа повторов возможно раннее снижение овариальной функции [38, 102]. Мы проанализировали связь между наличием антител к ткани яичника и числом CGG-повторов в группе женщин с БОО. У пациенток с числом CGGповторов в диапазоне 26-34 уровень антител к тканям яичника был выше по сравнению с теми, у кого число повторов выходило за нормативный диапазон. 112 При этом у женщин с нормальным числом CGG-повторов уровень антител к ZP выше 75-ого перцентиля выявлялся в 3,3 раза чаще, чем у женщин с числом повторов, выходящих за референсные значения. Наши данные согласуются с данными Shamilоva NN. et al. (2013), у которых аутоиммунная форма ПНЯ в 19 раз чаще выявлялась у пациенток с числом CGG-повторов в диапазоне 28-36 [6, 190]. Мы объясняем выявленные закономерности тем, что у пациенток, у которых отсутствует генетическая предрасположенность к развитию ПНЯ или БОО, повреждающим фактором, действующим на ткань яичников, могут быть различные аутоиммунные антитела. На основании этого можно условно разделить наших пациенток на пациенток с генетически обусловленной формой БОО и аутоиммунной формой БОО. При этом эти две группы женщин отличались по тяжести проявления БОО. У пациенток с аутоиммунной формой БОО степень поражения яичников была менее выраженной. У них был выше уровень АМГ, чем у женщин с генетической формой БОО. Это может свидетельствовать о большей сохранности примордиального пула фолликулов при аутоиммунных поражениях яичников по сравнению с генетически обусловленными формами БОО [6, 190]. В 2008 году ведущие специалисты в области акушерства и гинекологии определили показания для определения CGG-повторов FMR1 гена. Было рекомендовано проведение данного исследования женщинам с подозрением на ПНЯ, включая ее скрытые формы, с наличием семейной предрасположенности к данному заболеванию [133]. Таким образом, число CGG-повторов в гене FMR1 играет важную роль в развитии ПНЯ, одним из клинических проявлений которой является «бедный» ответ на стимуляцию овуляции в программе ЭКО. При нормальном числе CGG-повторов гена FMR1 (от 26 до 34) у пациенток с БОО можно предположить наличие аутоиммунного поражения тканей яичников, тогда как при отсутствии антиовариальных антител БОО может быть ассоциирован с генетическими нарушениями. Аутоиммунная форма БОО характеризуется менее выраженными клиническими проявлениями по сравнению с генетически обусловленным БОО и характеризуется лучшей сохранностью фолликулярного 113 пула. Результаты молекулярно-генетических и иммунологических исследований могут быть полезными для предикции БОО при подготовке к программам ВРТ. Вышеперечисленные факторы риска развития «бедного» овариального ответа, показавшие значимое влияние на развитие данного состояния в нашем исследовании, а именно, возраст женщины, возраст менопаузы у матери пациентки, уровень АМГ, число CGG-повторов по обоим аллелям гена FMR1, и уровень антител к Zp классов IgM и IgG, были учтены при создании модели прогноза БОО. Достоверность созданных моделей была проверена путем построения кривой ROC. Площадь под кривой (AUC) созданных моделей составила 84% и 89,6%. Ген BMP15 (Bone morphogenetic protein gene), расположенный в локусе Хр11.2 Х-хромосомы, ингибирует мРНК, принимающую участие в формировании рецепторов ФСГ в гранулезных клетках яичников. Вследствие того, что мутации гена BMP15 определяют чувствительность гранулезных клеток к ФСГ, они могут влиять на количество полученных ооцитов и быть предиктором «бедного» овариального ответа (БОО) в программах ВРТ [2, 6, 128, 155]. Проведенное нами молекулярно-генетическое исследование гена ВМР15 у 150 пациенток, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО, выявило наличие делеций и миссенс-вариаций, представленных в гетерозиготном состоянии. Многими учеными была показана роль гена BMP15 в сохранении фертильности и яичникового резерва [91, 128], а также обратная корреляционная зависимость между наличием мутаций в гене BMP15 и возрастом появления клинических симптомов ПНЯ [14]. Было установлено, что редкие делеции и миссенс-мутации в кодирующей области BMP15 приводят к быстрому истощению яичникового резерва [135]. Рядом зарубежных авторов было выявлено, что генетические полиморфизмы изучаемого гена могут влиять на исход стимуляции функции яичников в программах ВРТ [17]. Изученные нами SNP BMP15 были ранее описаны в литературе в разных этнических популяциях женщин, страдающих ПНЯ (таблица 29). 114 Таблица 29 Исследования SNP гена BMP15 у женщин разных этнических групп, страдающих ПНЯ, снижением овариального резерва и укорочением репродуктивного периода жизни SNP Замена аминокисл оты Положен ие c.328+905A> G (rs3897937) --------------- Интрон1 c.308 A>G (rs41308602) Asn103Ser Экзон1 c.538 A>G (rs104894767) Ala180Thr Экзон2 c.202 C>T (rs104894763) Arg68Trp Экзон1 Число женщин в Женщины с Описано в исследуемой мутациями литературе популяции среди больных ПНЯ Испанская/ 307 --------------Morón et al. 2006 Европиоидная 275/1691 Zhao et al. (Австралия и 2008 Новая Зеландия)/4581 Австралия и 23/38 Hanevik et Новая al. 2011 Зеландия/338 Испанская/703 15/703 Мendoza et al. 2013 Испанская/944 69/175 Gónzalez et al. 2008 Европиоидная 7/50 Tiotiu et al. (Австралия и 2010 Новая Зеландия)/264 Европеоиды и 5/166 Di Pasquale неевропеоиды et al. 2006 /347 Испанская/202 3/202 Dixit et al. 2006 Европиоидная 2/50 Tiotiu et al. (Австралия и 2010 Новая Зеландия)/264 Европиоиды из 55/1693 Zhao et al. Австралии и 2008 Новой Зеландии/4581 Европиоиды/516 6/255 Rossetti et al. 2009 Итальянская/377 1/166 Di Pasquale et al. 2006 На первом этапе проводился анализ SNP гена ВМР15 в трех позициях: c.202C>T (Arg68Trp, rs104894763), c.538G>A (А180T, rs104894767) и c.328+905A>G (rs3897937). С целью выявления новых полиморфизмов гена ВМР15, как возможных предикторов «бедного» овариального ответа, в 115 последующем было проведено секвенирование обоих экзонов данного гена. В нашем исследовании полиморфизмы c.328+905A>G и с.308 A>G значимо чаще выявлялись у пациенток с «бедным» овариальным ответом. Несмотря на то, что частота других известных полиморфизмов не отличалась значимо между группами, при суммарном анализе изучаемых вариантов гена BMP15 было выявлено, что у пациенток с «бедным» ответом в 2,5-2,7 раз чаще выявлялись данные SNP по сравнению с группой контроля. В литературе имеются противоречивые сведения по поводу полиморфизма c.328+905A>G в отношении влияния на овариальную функцию. Известно, что SNP rs3897937 (c.328+905A>G) находится в интроне 1 гена BMP15. В работе Hanevik H.I. et al. (2009) по изучению влияния SNP гена BMP15 на результат стимуляции суперовуляции было установлено более частое присутствие аллеля G в позиции 905 у пациенток с «бедным» ответом [16]. Мendoza N. et al. (2013) при изучении ПНЯ в испанской популяции обнаружили укорочение фертильного периода жизни у женщин, имеющих сочетание аллеля G (c.328+905A>G) с рядом других генетических маркеров старения яичников [122]. В то же время Moron F.J. et al. (2006) обнаружили, что гаплотип ‘TGG’, включающий минорные аллели c.673C>T, c.328+905A>G и с.-9С>G значительно чаще встречается в группе пациенток с избыточным ответом на стимуляцию яичников препаратами ФСГ, в том числе у пациенток с синдромом гиперстимуляции яичников [37]. По мнению Gónzalez A. et al. (2008) генотип AG по сравнению с АА (rs3897937) оказывает протективное действие, защищая пациенток от развития ановуляции и бесплодия [27]. Аллель rs41308602 (с.308 A>G) расположен в экзоне 1 гена BMP15. Данный полиморфизм приводит к замене аминокислоты аспарагина на серин в позиции 103 белка. В ходе секвенирования кодирующего региона гена ВМР15 Dixit H. et al. (2006) обнаружили, что данный аллель встречался как в группе пациенток с первичной и вторичной аменореей, так и в группе здоровых женщин. Однако аллель G (с.308A>G) в сочетании с аллелью G (c.-9C>G) и аллелью T (c.852C>T) значимо чаще приводили к яичниковой недостаточности [126]. В исследовании 116 Tiotiu D. et al. (2010) значимых различий между группой пациенток с ПНЯ и здоровыми женщинами по наличию SNP с.308 A>G выявлено не было [194]. В 2006 г. Di Pasquale E. et al. провели генетические исследования в большой группе женщин европеоидной расы с первичной и вторичной аменореей и обнаружили новые варианты SNP в гене ВМР15, встречающиеся у 4,2% (7 из 166) женщин с ПНЯ, имеющих нормальный кариотип (2 миссенс-вариации: c.202С>Т и c.538A>G). В группе контроля данных SNP выявлено не было [95]. Такие же данные были получены в исследовании Zhao Z.Z. et al. (2008) [195]. Миссенсвариация rs104894767 (c.538 A>G) приводит к замене аминокислоты аланина на треонин в позиции 180 белка, а SNP rs104894763 (c.202С>Т) - к замене аргинина на триптофан в позиции 68 белка. При этом гетерозиготная мутация c.538A>G была выявлена у пациенток с ПНЯ многими зарубежными авторами [36, 95, 126]. Ledig S. et al. (2008) установили, что ранее трактуемая как миссенс-мутация c.538G>A является полиморфизмом, так как обнаруживается у здоровых пациенток в группе контроля, например у здоровой матери пациентки с ПНЯ. Авторы сделали предположение о том, что ранее полученные данные нужно интерпретировать с осторожностью, так как некоторые SNP представляют собой скорее функционально незначимый полиморфизм, чем мутацию, вызывающую заболевание [35]. При секвенировании гена ВМР15 мы выявили новый SNP c.607 C>T, определяемый только при нормальном ответе яичников на стимуляцию суперовуляции. Возможно, данная вариация способствует сохранению овариального резерва. Также была обнаружена однонуклеотидная делеция в позиции 42 последовательности мРНК гена ВМР15, встречающаяся в 3 раза чаще при «бедном» ответе. В мРНК такая делеция не нарушает рамки считывания, поскольку находится в 5' — нетранслируемой области, однако все же может мешать инициации трансляции белка, то есть нарушать работу гена, что, возможно, приводит к снижению яичникового резерва. Таким образом, ПЦР-анализ некоторых известных SNP и секвенирование кодирующей последовательности гена ВМР15 показали наличие у пациенток с 117 «бедным» овариальным ответом как новых аллельных вариантов, так и вариаций, ранее описанных в литературе. Для подтверждения значимости выявленных полиморфизмов необходимо проведение дальнейших исследований на большей выборке женщин. Проведенное исследование может свидетельствовать о значимости гена BMP15 в снижении овариального резерва у молодых женщин, что проявляется «бедным» овариальным ответом. Выявление полиморфизмов гена BMP15 потенциально может быть использовано в качестве предикторов «бедного» ответа. Таким образом, в результате проведенного нами исследования с участием 150 пациенток, проходящих терапию бесплодия методом ЭКО, мы выявили наиболее важные клинико-анамнестические факторы риска «бедного» овариального ответа, а также определили долгосрочные прогностические маркеры формирования аутоиммунной и молекулярно-генетической формы данного состояния. Основой в поиске этиологических факторов БОО были проведенные ранее исследования патогенетических механизмов преждевременного истощения фолликулярного аппарата при ПНЯ. Мы считаем, что выявленные нами молекулярно-генетические и аутоиммунные маркеры являются основанием для предикции «бедного» ответа на доклинической стадии у пациенток группы риска. Данные биомаркеры, которые следует использовать совместно с широко распространенными гормональными тестами овариального резерва, указывают на высокий риск развития «бедного» ответа, однако, не являются основанием для постановки какого-либо диагноза, включая ПНЯ. На основании полученных результатов нами было построено дерево решений и разработан алгоритм проведения программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом с учетом аутоиммунных и молекулярногенетических предикторов данного состояния (рисунок 15, 16). Дерево решений было построено с помощью метода Quest. Чувствительность модели составила 90,8%, специфичность – 32,9%. 118 Пациентки программы ВРТ: 65 пациенток с БОО и 85 пациенток с нормальным ответом яичников. Исследование гена FMR1: у 19 пациенток выявлено увеличение числа CGGповторов более 34 по какому-либо из аллелей гена, из них у 15 женщин был БОО (78,9%). При числе CGG-повторов менее 34 БОО был выявлен лишь у 38,2% женщин. Данное исследование обладает высокой специфичностью (95,3%), но низкой чувствительностью (23,1%). Поэтому всем пациенткам с числом CGG-повторов <34 модель предлагает исследовать антитела к ZP как наиболее значимо отличающиеся по уровню в группах сравнения. Уровень антител более 0,140 ед. ОП. был выявлен у 97 пациенток, из них у 44 пациенток (45,4%) с БОО. Рисунок 15. Дерево решений обследований пациенток в программах ВРТ для предикции овариального ответа на стимуляцию суперовуляции Таким образом, суммарно, назначение исследование гена FMR1 и определение уровня антител к ZP позволяет предсказать «бедный» ответ яичников у 90,8% пациенток программы ЭКО, у которых он разовьется впоследствии. 119 Наличие аутоиммунной патологии Иммунологические исследования: определение АОА, анти –ZP, анти-ГнРГ, анти-β2-ГП-1 в сыворотке крови Уровень анти-ZP IgM>0,140ед.ОП и/или анти-ZP IgG>0,152 ед.ОП, и/или другие аутоантитела выше референсных значений Прогностически более легкая аутоиммунная форма «бедного» ответа Ранний возраст менопаузы у матерей (менее 48 лет), ПНЯ у родственников Пациентки с бесплодием Уровень анти-ZP IgM<0,140ед.ОП и антиZP IgG<0,152 ед.ОП, и/или другие аутоантитела ниже референсных значений Лечение сопутствующей аутоиммунной патологии, ранняя реализация репродуктивной функции, применение а-ГнРГ в программах ВРТ Генетические исследования: определение CGG- повторов гена FMR1, исследование полиморфизмов гена BMP 15 Длина CGG повторов FMR1 гена <34 Отсутствие SNP BMP15: c.328+905A>G, с.308 A>G, c.202С>Т Ранняя реализация репродуктивной функции, банк ооцитов, применение а-ГнРГ в программах ЭКО Длина CGG повторов FMR1 гена >34 Выявление SNP BMP15: c.328+905A>G, с.308 A>G, c.202С>Т Прогностически более тяжелая генетическая форма «бедного» ответа Рисунок 16. Алгоритм ведения пациенток с бесплодием программ ВРТ 120 ВЫВОДЫ 1. Показатели овариального резерва не являются абсолютными прогностическими маркерами ответа яичников на стимуляцию суперовуляции. У 18,5 % женщин с «бедным» ответом выявляется сохранный яичниковый резерв, тогда как в 9,4% случаев снижения овариального резерва отмечается нормальный ответ яичников на стимуляцию суперовуляции. 2. «Бедный» овариальный ответ в программах ВРТ не зависит от клинико-анамнестических факторов риска за исключением возраста пациенток и возраста наступления менопаузы у их матерей. У пациенток в возрасте менее 34 лет при наступлении менопаузы у их матерей в возрасте более 48 лет шансы развития «бедного» ответа на стимуляцию суперовуляции уменьшаются в 6,2 раза. 3. Протокол стимуляции суперовуляции не оказывает значимого влияния на исходы программ ВРТ у пациенток с «бедным» овариальным ответом. Однако применение агонистов гонадотропин-рилизинг гормона по сравнению с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона в протоколах стимуляции суперовуляции позволяет получить более высокое число фолликулов и ооцитов в этой группе пациенток. 4. У пациенток с «бедным» овариальным ответом в программах ВРТ в сыворотке крови определяется более высокий уровень аутоантител к тканям яичника (антител к блестящей оболочке ооцита, общих антиовариальных антител), а также аутоантител к ФСГ, ГнРГ и β2-ГП1. Уровень аутоантител к тканям яичника в фолликулярной жидкости значимо коррелирует с уровнем аутоантител в сыворотке крови. Наиболее высокий уровень аутоантител ассоциируется с «бедным» ответом и нормальным овариальным резервом, что 121 может свидетельствовать о ранней фазе аутоиммунного поражения яичников в этой группе женщин. Особое 5. значение в реализации овариальной функции имеют аутоантитела к блестящей оболочке ооцита. У пациенток с уровнем аутоантител выше порогового значения (0,140 ед. ОП для IgM и 0,152 ед. ОП для IgG) шансы развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ увеличиваются в 3,7 раза. Численные и структурные аномалии Х-хромосомы, такие как 6. изменение числа CGG-повторов в гене FMR1 и полиморфизмы гена BMP15, относятся к возможным патогенетическим факторам развития «бедного» овариального ответа. Увеличение числа CGG-повторов более 34 в любом из аллелей гена FMR1 повышает шансы развития «бедного» ответа в предстоящем протоколе ЭКО в 6,1 раз, что не наблюдается при уменьшении числа CGGповторов менее 26. Полиморфизмы 7. гена BMP15 являются значимыми маркерами овариального ответа в программах ВРТ. Для пациенток с «бедным» ответом характерно более частое выявление аллеля G в позиции с.308 A>G (Asn103Ser) и в позиции c.328+905A>G. полиморфизмы (c.308A>G; гена Суммарно, BMP15, у пациенток ассоциированные с с «бедным» овариальной ответом функцией c.202С>Т; и c.328+905A>G), выявляются в 2,5 раза чаще по сравнению с пациентками с нормальным ответом яичников на стимуляцию суперовуляции. 8. продукции Развитие «бедного» овариального ответа на фоне повышенной аутоиммунных антител характеризуется менее выраженными клиническими проявлениями и лучшей сохранностью фолликулярного пула по сравнению с «бедным» ответом на фоне генетических нарушений (удлинение числа CGG-повторов в гене FMR1, наличие полиморфизмов гена BMP15). 122 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Генетическое исследование играет важную роль в предикции «бедного» овариального ответа на стимуляцию суперовуляции в программах ВРТ и должно быть рекомендовано пациенткам группы риска развития преждевременной недостаточности и «бедного» ответа яичников (ранний возраст менопаузы у матерей, преждевременная недостаточность яичников у родственниц). Генетическое исследование должно включать определение числа CGG-повторов в гене FMR1 и генотипирование BMP15. 2. При отсутствии генетических нарушений (число CGG-повторов в гене FMR1 менее 34 и отсутствие полиморфизмов гена BMP15) у пациенток группы риска развития «бедного» овариального ответа и у пациенток с развившимся «бедным» овариальным ответом, а также при наличии сочетанной аутоиммунной патологии можно предположить аутоиммунное поражение тканей яичников. Таким пациенткам рекомендовано проведение иммунологического исследования с определением уровня антиовариальных аутоантител и аутоантител к блестящей оболочке ооцита в сыворотке крови. 3. Для расчета индивидуального риска развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ может быть предложена математическая модель, включающая оценку анамнестических данных, определение уровня АМГ и ФСГ, числа CGG-повторов в гене FMR1, и уровня аутоантител к блестящей оболочке ооцита классов IgM и IgG. 4. В случае определения высокого риска развития «бедного» овариального ответа в программах ВРТ пациенткам должна быть рекомендована ранняя реализация репродуктивной функции, или банкирование ооцитов, а также лечение сопутствующей аутоиммунной патологии при ее наличии. 123 5. ответа Пациенткам с высоким риском развития «бедного» овариального следует персонифицированно подбирать протоколы стимуляции суперовуляции и более высокие стартовые дозы гонадотропинов с целью получения максимального числа фолликулов и ооцитов. 124 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ 17-ОПН -17-оксипрогестерон аГнРГ - агонисты гонадотроаин-рилизинг гормона антГнРГ - антогонисты гонадотроаин-рилизинг гормона анти-ГнРГ -антитела к гонадотропин-рилизинг гормону анти-ТГ - антитела к тиреоглобулину анти-ТПО - антитела к тиреопероксидазе анти-ФСГ - антитела к фолликулостимулирующему гормону анти-ХГ - антитела к хорионическому гонадотропину анти-ZP -антитела к блестящей оболочке ооцита анти-β2-ГП1 -антитела к β 2 гликопротеину 1 мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота рФСГ - рекомбинантный фолликулостимулирующий гормон АКА - антитела к кардиолипину АМГ - антимюллеров гормон АОА - антиовариальные антитела АФС - антифосфолипидный синдром БОО - «бедный» овариальный ответ ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии ГК - глюкокортикоиды ГнРГ - гонадотропин рилизинг гормон Гн - гонадотропины ДГЭА-S -дегидроэпиандростерона сульфат ДИ - доверительный интервал ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота Е2 - эстрадиол ИКСИ - внутрицитоплазматическая инъекция сперматозоида 125 в цитоплазму ооцита ИМТ - индекс массы тела ИППП - инфекции, передаваемые половым путем ИФА - иммуноферментный анализ КОК - комбинированные оральные контрацептивы ЛГ - лютеинизирующий гормон НЦ АГиП - Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И.Кулакова ОШ - отношение шансов ОШкор - скорректированное отношение шансов ПНЯ - преждевременная недостаточность яичников ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭ - перенос эмбрионов СГЯ - синдром гиперстимуляции яичников СО - стандартное отклонение СПКЯ - синдром поликистозных яичников СТГ - соматотропный гормон ТВП - трансвагинальная пункция яичников ТТГ - тиреотропный гормон Т4 - тироксин свободный УЗИ - ультразвуковое исследование ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ХГ - хорионический гонадотропин ЧМГ - человеческий менопаузальный гонадотропин ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота ЭКО - экстакорпоральное оплодотворение β-ХГ - β субъединицы хорионического гонадотропина AR - андрогенный рецептор ASRM - American society of reproductive medi (Американское общество репродуктивной медицины) 126 AUC - area under curve (площадь под кривой) BMP 15 - bone morphogenetic protein 15 CAG - цитозин-аденин-гуанин CGG - цитозин-гуанин гуанин ESHRE - European society of human reproduction and Embryology (Европейское общество по вопросам репродукции человека и эмбриологии) FMR 1 - fragile mental retardation 1 HBs-Ag - специфический антиген вируса гепатита В HCV - вирус гепатита С Ig A - иммуноглобулины класса А IgG - иммуноглобулины класса G IgM - иммуноглобулины класса M ROC - receiver operating characteristic (операционная характеристика надежности) SNP - single nucleotide polymorphism (однонуклеотныйполиморфизм) SXCI - неслучайная инактивация Х хромосомы 127 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Ассоциация антител против гонадотропин-рилизинг гормона с нарушениями репродуктивной функции человека / И. В. Менжинская [ и др. ] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2013. – Т. 155, № 6. – С. 675-678. 2. Возможности восстановления фертильности у пациенток с преждевременной недостаточностью яичников (обзор литературы) / Н. А. Жахур [ и др. ] // Проблемы репродукции. – 2010. – №1. – С. 40-48. 3. Жахур, Н. А. Дифференцированная тактика лечения больных с преждевременной недостаточностью яичников / Н.А. Жахур // АГ–инфо. – 2012. – № 1. – С. 38-42. 4. Назаренко Т.А. «Бедный ответ». Тактика ведения пациенток со сниженной реакцией на стимуляцию гонадотропинами в программах ЭКО / Т. А. Назаренко, К. В. Краснопольская. – М. : МЕДпресс-информ, 2012. – 80 с. 5. О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению : Приказ Министерства здравоохранения РФ от 30 августа 2012 г. № 107н [ Электронный ресурс ] // Режим доступа: http://www.garant.ru/products/ipo/prime/doc/70218364/ 6. Роль генетических и аутоиммунных нарушений в развитии преждевременной недостаточности яичников // Н. Н. Шамилова [ и др. ] // Акушерство и гинекология. – 2012. – №4/2. – С. 67-72. 7. Шамилова, Н. Н. Клинико-прогностическое значение различных молеклярно-биологических маркеров при преждевременной недостаточности яичников : Дис. … канд. мед. наук. – M., 2013. – С. 15-27. 128 8. Шамилова, Н. Н. ВМР15 - внутрифолликулярный предиктор развития преждевременной недостаточности яичников / Н. Н. Шамилова, Л. А. Марченко, Д. Ю. Трофимов // Проблемы репродукции. – 2011. – № 6. – С. 26-31. 9. Шамилова, Н. Н. Ген FMR1 : новые возможности оценки овариального резерва / Н. Н. Шамилова, Л. А. Марченко // Акушерство и гинекология. – 2011. – № 2. – С. 58-64. 10. A comparison of treatment for chlorosis of pin oak and silver maple / M. O. Harrel [ et al. ] // J. Arboric. – 1984. – 10. – P. 246-249. 11. A controlled trial of natural cycle versus microdose gonadotropin-releasing hormone analog flare cycles in poor responders undergoing in vitro fertilization / F. Morgia [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2004. – Vol. 81. – P. 1542-1547. 12. A novel mutation in the bone morphogenetic protein 15 gene causing defective protein secretion is associated with both increased ovulation rate and sterility in Lacaune sheep / L. Bodin [ et al. ] // Endocrinology. – 2007. – Vol. 148. – P. 393400. 13. A panoramic view to relationships between reproductive failure and immunological factors / A. Kokcu [ et al. ] // Arch. Gynecol. Obstet. – 2012. – Vol. 286 (5). – P. 1283-1289. 14. A susceptibility gene for premature ovarian failure (POF) maps to proximal Xq28 / F. Rossetti [ et al. ] // Eur. J. Hum. Genet. – 2004. – Vol. 12. – P. 829–834. 15. A systematic review of tests predicting ovarian reserve and IVF outcome Broekmans [ et al. ] // Hum. Reprod. Update. – 2006. – Vol. 12 (6). – P. 685-718. 16. A single nucleotide polymorphism in BMP15 is associated with high response to ovarian stimulation / H. I. Hanevik [ et al. ] // Reprod. Biomed. Online. – 2011. – Vol. 23 (1). – P. 97-104. 17. Abir, R. Invited commentary: a single nucleotide polymorphism in BMP15 is associated with high response to controlled ovarian hyperstimulation / R. Abir, B. Fisch // Reprod. Biomed. Online. – 2011. – Vol. 23 (1). – P. 77-80. 129 18. Absence of effect of adjuvant growth hormone therapy on follicular responses to exogenous gonadotropins in women: normal and poor responders / A. G. Shaker [ et al. ] // Fertil. Steril. – 1992. – Vol. 58 (5). – P. 919-923. 19. Addition of growth hormone to gonadotrophins in ovarian stimulation of poor responders treated by in-vitro fertilization: a systematic review and meta-analysis Kolibianakis [ et al. ] // Hum. Reprod. Update. – 2009. – Vol. 15 (6). – P. 613-622. 20. An immunological insight into premature ovarian failure (POF) / S. Dragojević-Dikić [ et al. ] // Autoimmun. Rev. – 2010. – Vol. 9. – P. 771–774. 21. An initial low response predicts poor outcome in in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection despite improved ovarian response in consecutive cycles / Z. Veleva [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2005. – Vol. 83. – P. 1384– 1390. 22. Androgen receptor epigenetic variations influence early follicular phase gonadotropin levels / T. Laisk [ et al. ] // Acta Obstet. Gynecol. Scand. – 2010. – Vol. 89 (12). – P. 1557-1563. 23. Anti-Müllerian hormone measurement on any day of the menstrual cycle strongly predicts ovarian response in assisted reproductive technology / A. La Marca [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2007. – Vol. 22 (3). – P. 766-771. 24. Anti-Mullerian hormone plasma levels in spontaneous menstrual cycle and during treatment with FSH to induce ovulation / A. La Marca [ et al. ] // Hum. Reprod. –2004. – Vol. 19 (12). – P. 2738-2741. 25. Anti-Mullerian hormone-based approach to controlled ovarian stimulation for assisted conception / S. M. Nelson [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2009. – Vol. 24. – P. 867-875. 26. Anti-phospholipid antibodies against phosphatidylinositol, and phosphatidylserine are more significant in reproductive failure than antibodies against cardiolipin only / Z. Ulcova-Gallova [ et al. ] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2005. – Vol. 54. – P. 112–117. 130 27. Association of genetic markers within the BMP15 gene with anovulation and infertility in women with polycystic ovary syndrome / A. Gonzalez [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2008. – Vol. 90. – P. 447–449. 28. Association of Serum AMH Level with Fragile X CGG Repeat Number Among Infertility Patients / S. Gustin [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2014. – Vol. 101 (2). – P. e6–e7. 29. Autoantibodies to steroidogenic enzymes in patients with premature ovarian failure with and without Addison'sdisease / C. Dal Pra [ et al. ] // Eur. J. Endocrinol. –2003. – Vol. 148. – P. 565-570. 30. Autoimmune antiovarian antibodies and their impact on the success of an in IVF/ET program / J. Horejsi [ et al. ] // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 2000. – Vol. 900. – P. 351-356. 31. Autoimmunity and antigenic targets in ovarian pathology / T. Forges [ et al. ] // Hum. Reprod. Update. – 2004. – Vol. 10 (2). – P. 163-175. 32. Barad, D. H. Age-specific levels for basal follicle stimulating hormone (FSH) assessment of ovarian function / D. H. Barad, A. Weghofer, N. Gleicher // Obstet. Gynecol. – 2007. – Vol. 109 (6). – P. 1404-1410. 33. Barad, D. H. Utility of age-specific serum anti-Müllerian hormone concentrations / D. H. Barad, A. Weghofer, N. Gleicher // Reprod. Biomed. Online. – 2011. Vol. 22 (3). – P. 284-291. 34. Beck-Peccoz, P. Premature ovarian failure / P. Beck-Peccoz, L. Persani // Orphanet. J. Rare. Dis. – 2006. – Vol. 1. – P. 9. 35. BMP15 mutations in XX gonadal dysgenesis and premature ovarian failure / S. Ledig [ et al. ] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2008. – Vol. 198. – P. 84.e1–84.e5. 36. BMP15 mutations associated with primary ovarian insufficiency cause a defective production of bioactive protein / R. Rossetti [ et al. ] // Hum. Mutat. – 2009. Vol. 30 (5). – P. 804-810. 37. Bone morphogenetic protein 15 (BMP15) alleles predict over-response to recombinant follicle stimulating hormone and iatrogenic ovarian hyperstimulation 131 syndrome (OHSS) / F. J. Moron [ et al. ] // Pharmacogenet.Genome. – 2006. – Vol. 16. – P. 485-495. 38. Bretherick, K. L. FMR1 repeat sizes in the gray zone and high end of the normal range are associated with premature ovarian failure / K. L. Bretherick, M. R. Fluker, W. P. Robinson // Hum. Genet. – 2005. – Vol. 117. – P. 376–382. 39. Byersdorfer, C. A. Diabetes is predicted by the β cell level of autoantigen / C. A. Byersdorfer, G. G. Schweitzer, E. R.Unanue // J. Immunol. – 2005. – Vol. 175 (7). – P. 4347-4354. 40. Can anti-ovarian antibody testing be useful in an IVF-ET clinic? / E. S. Pires [ et al. ] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2011. – Vol. 28 (1). – P. 55-64. 41. CGG repeat sizing in the FMR1 gene in Indian women with premature ovarian failure / S. Chatterjee [ et al. ] // Reprod. Biomed. Online. – 2009. – Vol. 19. – P. 281–286. 42. Characterization of the post-translational modification of recombinant human BMP-15 mature protein / S. Saito [ et al. ] // Protein Sci. – 2008. – Vol. 17 (2). – P. 362-370. 43. Chronic intestinal pseudo-obstruction due to buserelin-induced formation of anti-GnRH antibodies / B. Ohlsson [ et al. ] // Gastroenterology. – 2007. – Vol. 132 (1). – P. 45-51. 44. Circulating auto-antibodies against the zona pellucida and thyroid microsomal antigen in women with premature ovarian failure / R. L. Kelkar [ et al. ] // J. Reprod. Immunol. – 2005. – Vol. 66 (1). – P. 53–67. 45. CK-MM autoantibodies: prevalence, immune complexes, and effect on CK clearance / G. L. Warren [ et al. ] // Muscle & Nerve. – 2006. – Vol. 34 (3). – P. 335346. 46. Clinical characteristics and genetic analysis in women with premature ovarian insufficiency / E. Ferrarini [ et al. ] // Maturitas. – 2013. – Vol. 74 (1). – P. 6167. 47. Clinical prediction rules. Applications and methodological standards / J. H. Wasson [ et al. ] // N. Engl. J. Med. – 1985. – Vol. 313 (13). – P. 793-799. 132 48. Comparison of mild ovarian stimulation with conventional ovarian stimulation in poor responders / J. H. Yoo [ et al. ] // Clin. Exp. Reprod. Med. – 2011. – Vol. 38 (3). – P. 159-163. 49. Conception rates following assisted reproduction in poor responder patients: a retrospective study in 300 consecutive cycles / U. Ulug [ et al. ] // Reprod. Biomed. Online. – 2003. – Vol. 6. – P. 439-443. 50. Controlled ovarian hyperstimulation changes the prevalence of serum autoantibodies in in vitro fertilization patients / K. Haller [ et al. ] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2006. – Vol. 56 (5-6). – P. 364-370. 51. Corticosteroids in patients with antiovarian antibodies undergoing in vitro fertilization: a prospective pilot study / T. Forges [ et al. ] // Eur. J. Pharmacol. – 2006. – Vol. 62. – P. 699-705. 52. Coulam, C. B. Antiphospholipid antibody round table report / C. B. Coulam // Am. J. Reprod. Immunol. – 2002. – Vol. 48. – P. 262-265. 53. Coulam, C. B. Premature ovarian failure: evidence for the autoimmune mechanism / C. B. Coulam, R. D. Kempers, R.V. Randall // Fertil. Steril. – 1981; 36,238-240. 54. Cutting-edge issues in autoimmune orchitis / C. A. Silva [ et al. ] // Clin. Rev. Allergy Immunol. – 2012. – Vol. 42. – P. 256-263. 55. D’Hulst, C. Fragile X syndrome: from molecular genetics to therapy / C. D’Hulst, R. F. Kooy // J. Med. Genet. – 2009. – Vol. 46. – P. 577-584. 56. De Vos, M. Primary ovarian insufficiency / M. De Vos, P. Devroey, B. C. J. M. Fauser // Lancet. – 2010. – Vol. 376. – P. 911-921. 57. Dean, J. Oocyte-specific genes regulate follicle formation, fertility and early mouse development / J. Dean // J. Reprod. Immunol. – 2002. – Vol. 53. – P. 171180. 58. Demographic characteristics and clinical profile of poor responders in IVF/ICSI : a comparative study / N. Padhy [ et al. ] // J. Hum. Reprod. Sci. – 2010. – Vol. 3 (2). – P. 91-94. 133 59. Di Pasquale, E. Hypergonadotropic ovarian failure associated with an inherited mutation of human bone morphogenetic protein-15 (BMP15) gene / E. Di Pasquale, P. Beck-Peccoz, L. Persani // Am. J. Hum. Genet. – 2004. – Vol. 75. – P. 106111. 60. Diaz, F. J. Oocytes determine cumulus cell lineage Mouse ovarian follicles / F. J. Diaz, K. Wigglesworth, J. J. Eppig // J. Cell Sci. – 2007. – Vol. 120 (Pt. 8). – P. 1330-1340. 61. Do etiologies of premature ovarian aging (POA) mimic those of premature ovarian failure (POF)? / N. Gleicher [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2009. – Vol. 24 (10). – P. 2395-2400. 62. Evidence-based management of poor ovarian response / C. A. Venetis [ et al. ] // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2010. – Vol. 1205. – P. 199-206. 63. Expected poor ovarian response in predicting cumulative pregnancy rates : a powerful tool / D.J. Hendriks [ et al. ] // J. Reprod. Biomed. Online. – 2008. – Vol. 17. – P. 727-736. 64. Expected poor responders on the basis of an antral follicle count do not benefit from a higher starting dose of gonadotrophins in IVF treatment: a randomized controlled trial / E. R. Klinkert [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2005. – Vol. 20. – P. 611615. 65. Fauser, B. C. Evian Annual Reproduction (EVAR) Workshop Group 2007. Predictors of ovarian response: Progress towards individualized treatment in ovulation induction and ovarian stimulation / B. C. Fauser, K. Diedrich, P. Devroey // Hum. Reprod. Update. – 2008. – Vol. 14. – P. 1-14. 66. Female infertility related to thyroid autoimmunity: the ovarian follicle hypothesis / P. Monteleone [ et al. ] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2011. – Vol. 66 (2). – P. 108–114. 67. FMR1 genotype with autoimmunity-associated polycystic ovary-like phenotype and decreased pregnancy chance / N. Gleicher [ et al. ] // PLoS ONE. – 2010. – Vol. 5 (12). – P. e15303. 134 68. Follicular dysfunction induced by autoimmunity to zona pellucida / K. Koyama [ et al. ] // Reprod. Biol. – 2005. – Vol. 5 (3). – P. 269-278. 69. Fox, K. M. Three-dimensional structure of human follicle-stimulating hormone / K. M. Fox, J. A. Dias, P. van Roey // Molec. Endocr. – 2001. – Vol. 15 (3). – P. 378-389. 70. Genetic polymorphisms influence the ovarian response to rFSH stimulation in patients undergoing in vitro fertilization programs with ICSI / R. Boudjenah [ et al. ] // PLoS One. – 2012. – Vol. 7 (6). – P. e38700. 71. Gilchrist, R. B. Oocyte-secreted factors: regulators of cumulus cell function and oocyte quality / R. B. Gilchrist, M. Lane, J. G. Thompson // Hum. Reprod. Update. – 2008. – Vol. 14(2). – P. 159-177. 72. Gleicher, N. Antiphospholipid antibodies (aPL) affect in vitro fertilization (IVF) outcome / N. Gleicher // Am. J. Reprod. Immunol. – 2001. – Vol. 46 (5). – P. 330-331. 73. Gleicher, N. Cutting edge assessment of the impact of autoimmunity on female reproductive success / N. Gleicher, A. Weghofer, D. Barad // J. Autoimmun. – 2012. – Vol. 38 (2-3). – P. J74-J80. 74. Gleicher, N. Female infertility due to abnormal autoimmunity: frequently overlooked and greatly underappreciated. Part II / N. Gleicher, A. Weghofer, D. Barad // Expert Rev. Obstet. Gynecol. – 2007. – Vol. 2 (4). – P. 465-475. 75. Gleicher, N. Ovarian reserve determinations suggest new function of FMR1 (fragile X) gene in regulating ovarian aging / N. Gleicher, A. Weghofer, D. H. Barad // Reprod. Biomed. Online. – 2010. – Vol. 20. – P. 755-768. 76. Gleicher, N. The FMR1 Gene as Regulator of Ovarian Recruitment and Ovarian Reserve / N. Gleicher, D.H. Barad // Obstet. Gynecol. Surv. – 2010. – Vol. 65 (8). – P. 523-530. 77. Gleicher, N. Intermediate and normal sized CGG repeat on the FMR1 gene does not negatively affect donor ovarian response / N.N. Gleicher, A. Weghofer, D.H. Barad // Hum. Reprod. – 2012. – Vol. 27 (7). – P. 2241-2242. 135 78. Gleicher, N. Anti-Mullerian hormone (AMH) defines, independent of age, low versus good live-birth chances in women with severely diminished ovarian reserve / N. Gleicher, A. Weghover, D. H. Barad // Fertil. Steril. – 2010. – Vol. 94 (7). – P. 28242827. 79. Gleicher, N. Effects of race/ethnicity on triple CGG Counts on FMR1 gene in infertile women and egg donors / N. Gleicher, A. Weghofer, D. H. Barad // Reprod. Biomed. – 2010. – Vol. 20 (4). – P. 485-491. 80. GnRH agonist versus GnRH antagonist in poor ovarian responders: a meta- analysis. / J. G. Franco Jr. [ et al. ] / Reprod. Biomed. Online. – 2006. – Vol. 13 (5). – P. 618-627. 81. GnRH antagonist in IVF poor-responder patients: Results of a randomized trial / R. Marci [ et al. ] // Reprod. Biomed. Online. – 2005. – Vol. 11. – P. 189-193. 82. Gonadotropin-releasing hormone/human chorionic gonadotropin beta based recombinant antibodies and vaccines / G. P. Talwar [ et al. ] // J. Reprod. Immunol. – 2009. – Vol. 83 (1-2) – P. 158-163. 83. Gorgy, A. Defining and predicting the poor responder / A. Gorgy, M. Taranissi // Fertil. Steril. – 2001. – Vol. 75 (1). – P. 226-227. 84. Goswami, D. Premature ovarian failure / D. Goswami, G. S.Conway // Horm. Res. – 2007. – Vol. 68 (4). – P. 196-202. 85. Goswami, D. Premature ovarian failure / D. Goswami, G.S. Conway // Hum. Reprod. Update. – 2005. – Vol. 11. – P. 391-410. 86. Gueripel, X. Oocyte bone morphogenetic protein 15, but not growth differentiation factor 9, is increased during gonadotropin-induced follicular development in the immature mouse and is associated with cumulus oophorus expansion / X. Gueripel, V. Brun, A. Gougeon // Biol. Reprod. – 2006. – Vol. 75 (6). – P. 836-843. 87. Hagerman, R. J. Testing for fragile X mutations throughout the life span / R. J. Hagerman, P. J. Hagerman // J. Am. Med. Assos. – 2008. – Vol. 300. – P. 24192421. 136 88. Haller, K. Anti-FSH antibodies associate with poor outcome of ovarian stimulation in IVF / K. Haller, A. Salumets, R. Uibo // Reprod. Biomed. Online. – 2008. – Vol. 16 (3). – P. 350-355. 89. Haller-Kikkatalo, K. Review on Autoimmune Reactions in Female Infertility: Antibodies to Follicle Stimulating Hormone / K. Haller-Kikkatalo, A. Salumets, R. Uibo // Clin. Dev. Immunol. – 2012. – Article ID 762541. – 15 p. 90. Harlow, S.D. Menstruation and the Menopausal Transition / S.D. Harlow, P. Paramsothy // Obstet. Gynecol. Clin. N. A. – 2011. – Vol. 38 (3). – P. 595607. 91. Hashimoto, O. Posttranslational processing of mouse and human BMP-15: potential implication in the determination of ovulation quota / O. Hashimoto, R. K. Moore, S. Shimasaki // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2005. – Vol. 102. – P. 5426-5431. 92. Heritability of age at natural menopause in the Framingham Heart Study / J. M. Murabito [ et al. ] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2005. – Vol. 90 (6). – P. 34273430. 93. High doses of gonadotrophins combined with stop versus non-stop protocol of GnRH analogue administration in low responder IVF patients: a prospective, randomized, controlled trial / J. A.Garcia-Velasco [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2000. – Vol. 15. – P. 2292-2296. 94. High frequency of IgG antagonizing follicle-stimulating hormone- stimulated steroidogenesis in infertile women with a good response to exogenous gonadotropins / Y. Reznik [ et al. ] // Fertil. Steril. – 1998. – Vol. 69 (1). – P. 46-52. 95. Identification of new variants of human BMP15 gene in a large cohort of women with premature ovarian failure. Di Pasquale [ et al. ] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2006. – Vol. 91 (5). – P. 1976-1979. 96. IgG-antiphospholipid antibodies in follicular fluid of IVF ET patients are related to low fertilization rate of theiroocytes / H. Matsubayashi [ et al. ] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2006. – Vol. 55 (5). – P. 341-348. 137 97. Immunological aspects of premature ovarian failure associated with idiopathic Addison's disease / W. J. Irvine [ et al. ] // Lancet. – 1968. – Vol. 2. – P. 883887. 98. Immunological features of idiopathic Addison's disease: an antibody to cells producing steroid hormones / J. R. Anderson [ et al. ] // Clin. Exp. Immunol. – 1968. – Vol. 3. – P. 107-110. 99. Impact of antiovarian antibodies on ovarian responsiveness in vitro fertilization and embryo transfer / S. H. Zou [ et al. ] // Neuro. Endocrinol. Lett. – 2008. – Vol. 29 (6). – P. 949-952. 100. Incidence of antibodies in women after failure of assisted Reproduction / L. Bobak, [ et al. ] // Bratisl. Lek. Listy. – 2014. – Vol. 115 (3). – P. 145-149. 101. Increased gonadotrophin stimulation does not improve IVF outcomes in patients with predicted poor ovarian reserve / D. N. Lekamge [ et al. ] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2008. – Vol. 25. – P. 515-521. 102. Influence of intermediate and uninterrupted FMR1 CGG expansion in premature ovarian failure manifestation / B. Bodega [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2006. – Vol. 21. – P. 952-957. 103. Intermediate and permutation FMR1 alleles in women with occult primary ovarian insufficiency / I. Streuli [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2009. – Vol. 92. – P. 464-470. 104. Is autoimmunity a matter of sex? / A. Lleo [ et al. ] // Autoimmun. Rev. – 2008. – Vol. 7 (8). – P. 626-630. 105. Is recombinant follicle-stimulating hormone more effective in IVF poor responders than human menopausal gonadotrophins? / M. Eskandar [ et al. ] // Med. Sci. Monit. – 2008. – Vol. 10. – P. 16-19. 106. Juengel, J. L. The role of proteins of the transforming growth factor-beta superfamily in the intraovarian regulation of follicular development / J. L. Juengel, K.P. McNatty // Hum. Reprod. Update. – 2005. – Vol. 11. – P. 143-160. 107. Kalu, E. Spontaneous premature ovarian failure: management challenges / E. Kalu, N. Panay // J. Gynecol. Endocrinol. – 2008. – Vol. 24 (5). – P. 273-279. 138 108. Kemeter, P. Prednisolone supplementation to Clomid and/or gonadotrophin stimulation for in-vitro fertilization—a prospective randomized trial / P. Kemeter, W. Feichtinger // Hum. Reprod. – 1986. – Vol. 1 (7). – P. 441-444. 109. Klonoff-Cohen, H. Female and male lifestyle habits and IVF: What is known and unknown / H. Klonoff-Cohen // Hum. Reprod. Update. – 2005. – Vol. 11. – P. 179-203. 110. Kokcu, A. Premature ovarian failure from current perspective / A. Kokcu // Gynecol. Endocrinol. – 2010. – Vol. 26. – P. 555-562. 111. Kucuk, T. Luteal start of exogenous FSH in poor responder women / T. Kucuk, E. Sozen // J. Assist. Reprod. Genet. – 2007. – Vol. 24. – P. 635-638. 112. La Marca, A. Individualization of controlled ovarian stimulation in IVF using ovarian reserve markers: from theory to practice / A. La Marca, S. K. Sunkara // Hum. Reprod. Update. – 2014. – Vol. 20 (1). – P. 124-140. 113. Lanasa, M. The X chromosome and recurrent spontaneous abortions: the significance of transmanifesting carriers / M. Lanasa, W. Hogge, E. Hoffman // Am. J. Hum. Genet. – 1999. – Vol. 64 (4). – P. 934-938. 114. Layman, L. C. Editorial: BMP15–the first true ovarian determinant gene on the X-chromosome? / L.C. Layman // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2006. – Vol. 91. – P. 1673-1676. 115. Liu, K. Advanced reproductive age and fertility Liu, A. Case // J. Obstet. Gynaecol. Can. – 2011. – Vol. 33 (11). – P. 1165-1175. 116. Long gonadotropinreleasing hormone agonist versus short agonist versus antagonist regimens in poorresponders undergoing in vitro fertilization : a randomized controlled trial / S. K. Sunkara [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2014. – Vol. 101 (1). – P. 147153. 117. Longer CAG repeat length in the androgen receptor gene is associated with premature ovarian failure / S. Chatterjee [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2009. – Vol. 24 (12). – P. 3230-3235. 139 118. Loutradis, D. Poor responder protocols for in-vitro fertilization: options and results / D. Loutradis, E. Vomvolaki, P. Drakakis // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. – 2008. – Vol. 20 (4). – P. 374-378. 119. Low dose prednisolone administration in routine ICSI patients does not improve pregnancy and implantation rates / F. Ubaldi [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2002. – Vol. 17 (6). – P. 1544-1547. 120. Luborsky, J. Ovarian autoimmune disease and ovarian autoantibodies / J. Luborsky // J. Women's Health Gend. Based Med. – 2002. – Vol. 11. – P. 585-599. 121. Management of poor responders in IVF: is there anything new? Ubaldi [ et al. ] // Biomed. Res. Int. – 2014. – Article ID 352098. 122. Mendoza, N. A multigenic combination of estrogen related genes are associated with the duration of fertility period in the Spanish population Mendoza, J. E. Castro, R. Sánchez Borrego // Gynecol Endocrinol. – 2013. – Vol. 29 (3). – P. 235-237. 123. Menstrual and hormonal alterations in juvenile dermatomyositis / N. E. Aikawa [ et al. ] / Clin. Exp. Rheumatol. – 2010. – Vol. 28. – P. 571–575. 124. Menstrual and hormonal alterations in juvenile systemic lupus erythematosus / P. Medeiros [ et al. ] // Lupus. – 2009. – Vol. 18. – P. 38–43. 125. Mifsud, A. Androgen receptor gene CAG trinucleotiderepeats in anovulatory infertility and polycystic ovaries / A. Mifsud, S. Ramirez, E. L.Yong // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2000. – Vol. 85 (9). – P. 3484-3488. 126. Missense mutations in the BMP15 gene are associated with ovarian failure / H. Dixit [ et al. ] // Hum. Genet. – 2006. – Vol. 119. – P. 408–415. 127. Moncayo, R. Immunological risks of IVF / R. Moncayo, H. Moncayo, O. Dupont // Lancet. – 1990. – Vol. 335. – P. 180. 128. Moore, R.K. Molecular biology and physiological role of the oocyte factor, BMP-15 / R. K. Moore, S. Shimasaki // Mol. Cell Endocrinol. – 2005. – Vol. 234 (1-2). – P. 67-73. 129. Multi-marker assessment of ovarian reserve predicts oocyte yield after ovulation induction / M. Al-Azemi, [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2011. – Vol. 26 (2). – P. 414-422. 140 130. Mutational analysis of BMP15 and GDF9 as candidate genes for premature ovarian failure / A. L. Chand [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2006. – Vol. 86. – P. 1009-1012. 131. Mutations and sequence variants in GDF9 and BMP15 in patients with premature ovarian failure / P. Laissue [ et al. ] // Eur. J. Endocrinol. – 2006. – Vol. 154. – P. 739–744. 132. Mutations in the genes for oocyte-derived growth factors GDF9 and BMP15 are associated with both increased ovulation rate and sterility in Cambridge and Belclare sheep (Ovis aries) / J. P. Hanrahan [ et al. ] // Biol. Reprod. – 2004. – Vol. 70. – P. 900–909. 133. Nelson, L. M. Primary ovarian insufficiency / L. M. Nelson // N. Engl. J. Med. – 2009. – Vol. 360 (6). – P. 606-614. 134. Nikolaou, D. Early ovarian ageing: a hypothesis. Detection and clinical relevance / D. Nikolaou, A. Templeton // Hum. Reprod. – 2003. – Vol. 18 (6). – P. 1137-1139. 135. Novel variants in growth differentiation factor 9 in mothers of dizygotic twins / J. S. Palmer [ et al. ] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2006. – Vol. 91 (11). – P. 4713-4716. 136. Nygren, K. G. Assisted reproductive technology in Europe, 1999. Results generated from European registers by ESHRE / K. G. Nygren, A. N. Andersen, L. Gianaroli // Hum. Reprod. – 2002. – Vol. 17 (12). – P. 3260–3274. 137. Oltvai, Z. N. Bcl-2 heterodimerizes in vivowithaconservedhomolog, Bax, thatacceleratesprogrammed cell death / Z. N. Oltvai, C. L. Milliman, S. J. Korsmeyer // Cell. – 1993. – Vol. 74. – P. 609-619. 138. On behalf of the ESHRE working group ESHRE consensus on the definition of ‘poor response’ to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria / A. P. Ferraretti [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2011. – Vol. 26 (7). – P. 1616-1624. 139. Oocyte-specific overexpression of mouse bone morphogenetic protein-15 leads to accelerated folliculogenesis and an early onset of acyclicity in transgenic mice / H. E. McMahon [ et al. ] // Endocrinology. – 2008a. – Vol. 149 (6). – P. 2807-2815. 141 140. Otsuka, F. Integral role of GDF-9 and BMP-15 in ovarian function / F. Otsuka, K. J. McTavish, S. Shimasaki // Mol. Reprod. Dev. – 2011. – Vol. 78 (1). – P. 9-21. 141. Ovarian necrotizing vasculitis in a patient with lupus / R. M. Pereira [ et al. ] // Lupus. – 2009. – Vol. 18. – P. 1313-1315. 142. Ovarian reserve tests for predicting fertility outcomes for assisted reproductive technology: the International Systematic Collaboration of Ovarian Reserve Evaluation protocol for a systematic review of ovarian reserve test accuracy / N. P. Johnson [ et al. ] // Br. J. Obstet. Gynaecol. – 2006. – Vol. 113 (12). – P. 1472-1480. 143. Ovulation induction in the new millennium: recombinant folliclestimulating hormone versus human menopausal gonadotropin / H. Al-Inany [ et al. ] // Gynecol. Endocrinol. – 2005. – Vol. 20. – P. 161-169. 144. Patients with irritable bowel syndrome and dysmotility express antibodies against gonadotropin-releasing hormone in serum / B. Ohlsson [ et al. ] // Neurogastroenterol. Motil. – 2011. – Vol. 23 (11). – P. 1000-1006. 145. Physiopathological determinants of human infertility / D. T. Baird [ et al. ] // Hum. Reprod. Update. – 2002. – Vol. 8 (5). – P. 435-447. 146. Polyzos, N. P. A systematic review of randomized trials for the treatment of poor ovarian responders: is there any light at the end of the tunnel? / N. P. Polyzos, P. Devroey // Fertil. Steril. – 2011. – Vol. 96 (5). – P. 1058-1061. 147. Poor responders to controlled ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization (IVF) / L. Kamble [ et al. ] // Hum. Fertil. (Camb). – 2011. – Vol. 14 (4). – P. 230-245. 148. Possible role of autoimmunity in patients with premature ovarian insufficiency / L. R. Pogaсnik [ et al. ] // Int. J. Fertil. Steril. – 2014. – Vol. 7 (4). – P. 281-290. 149. Prediction and Diagnosis of Poor Ovarian Response: The Dilemma. / A. Badawy [ et al. ] // J. Reprod. Infertil. – 2011. – Vol. 12 (4). – P. 241-248. 150. Prediction of an excessive response in in vitro fertilization from patient characteristics and ovarian reserve tests and comparison in subgroups: an individual 142 patient data meta-analysis / S. L. Broer [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2013. – Vol. 100 (2). – P. 420-429. 151. Pregnancy and reproduction in autoimmune rheumatic diseases / M. Ostensen [ et al. ] // Rheumatology (Oxford). – 2011. – Vol. 50. – P. 657-664. 152. Pregnancy outcome is not affected by antiphospholipid antibody status in women referred for in vitro fertilization / I. T. Chilcott [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2000. – Vol. 73 (3). – P. 526-530. 153. Premature ovarian failure and androgen receptor gene CAG repeat lengths weighted by X chromosome inactivation patterns / F. Sugawa [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2009. – Vol. 91. – P. 649-652. 154. Primary ovarian insufficiency: autoimmune causes / A. La Marca, [ et al. ] // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. –2010. – Vol. 22. – P. 277-282. 155. Primary ovarian insufficiency: X chromosome defects and autoimmunity / L. Persani [ et al. ] // J. Autoimmun. – 2009. – Vol. 33. – P. 35-41. 156. Prognostic tests of ovarian reserve in Textbook of Assisted Reproductive Techniques / D. Gardner [ et al. ]. – 2009. – 3nd ed. – 994 p. 157. Putative predictors of antibodies against follicle-stimulating hormone in female infertility: a study based on in vitro fertilization patients / K. Haller [ et al. ] // Am. J. Reprod. Immunol. – 2007. – Vol. 57 (3). – P. 193-200. 158. Qinglei, L. Revisiting oocyte–somatic cell interactions: in search of novel intrafollicular predictors and regulators of oocyte developmental competence / L. Qinglei, L. J. McKenzie, M. M. Matzuk // Mol. Hum. Reprod. – 2008. – Vol. 14 (12). – P. 673-678. 159. Quantifying effect of combined oral contraceptive pill on functional ovarian reserve as measured by serum anti-Müllerian hormone and small antral follicle count using three-dimensional ultrasound / S. Deb [ et al. ] // Ultrasound Obstet. Gynecol. – 2012. – Vol. 39 (5). – P. 574-580. 160. Rajender, S. Phenotypic heterogeneity of mutations in androgen receptor gene / S. Rajender, L. Singh, K. Thangaraj // Asian J. Androl. – 2007. – Vol. 9. – P. 147-179. 143 161. Randomized controlled pilot trial of luteal phase recombinant FSH stimulation in poor responders / K. S. Kansal [ et al. ] // Reprod. Biomed. Online. – 2008. – Vol. 17. – P. 745-750. 162. Rebar, R. W. Premature ovarian failure / R. W. Rebar // Obstet. Gynecol. – 2009. – 113. – P. 1355-1363. 163. Recombinant follicle stimulating hormone is effective in poor responders to highly purified follicle stimulating hormone / G. De Placido [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2008. – Vol. 15. – P. 17-20. 164. Recruitment of follicles by recombinant human follicle-stimulating hormone commencing in the luteal phase of the ovarian cycle / L. Rombauts [ et al. ] // Fertil. Steril. – 1998. – Vol. 69. – P. 665-669. 165. Regulation of ovulation rate in mammals: contribution of sheep genetic models / S. Fabre [ et al. ] // Reprod. Biol. Endocrinol. – 2006. – Vol. 4. – P. 20. 166. Relevance of triple CGG repeats in the FMR1 gene to ovarian reserve / N. Gleicher [ et al. ] // Reprod. Biomed. Online. – 2009. – Vol. 19 (3). – P. 385-390. 167. Sato, K. Significance of skewed X-chromosome inactivation in premature ovarian failure / K. Sato, S. Uehara, M. Hashiyada // Am. J. Med. Genet. – 2004. – Vol. 130 (3). – P. 240-244. 168. Selective theca cell dysfunction in autoimmune oophoritis results in multifollicular development, decreased estradiol and elevated inhibin B levels / C. K. Welt [ et al. ] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2005. – Vol. 90. – P. 3069-3076. 169. Sequence variants in exons of the BMP-15 gene in Chinese patients with premature ovarian failure / P. Zhang [ et al. ] // Acta Obstet. Gynecol. Scand. – 2007. – Vol. 86. – P. 585-589. 170. Serum anti-Mullerian hormone throughout the human menstrual cycle / A. La Marca [ et al. ] // Hum. Reprod. – 2006. – Vol. 21 (12). – P. 3103-3107. 171. Serum Mullerian inhibiting substance levels during normal menstrual cycles / C. L. Cook [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2002. – Vol. 73 (4). – P. 859-861. 144 172. Silva, C. A. Maintenance of fertility in patients with rheumatic diseases needing antiinflammatory and immunosuppressive drugs / C. A. Silva, E. Bonfa, M. Ostensen // Arthritis Care Res. (Hoboken). – 2010. – Vol. 62. – P. 1682-1690. 173. Sinha, P. Premature ovarian failure / P. Sinha, N. Kuruba // J. Obstet. Gynaecol. – 2007. – Vol. 27. – P. 16-19. 174. Society for Assisted Reproductive Technology and the American Society for Reproductive Medicine. Assisted reproductive technology in the United States : 2001 results generated from the American Society for Reproductive Medicine/Society for Assisted Reproductive Technology registry // Fertil. Steril. – 2007. – Vol. 87 (6). – P. 1253-1266. 175. Specific and sensitive immunoassay detects multiple anti-ovarian antibodies in women with infertility / E. S. Pires [ et al. ] // J. Histochem. Cytochem. – 2007. – Vol. 55. – P. 1181-1190. 176. Steptoe, P. C. Birth after the reimplantation of a human embryo. / P. C. Steptoe, R. G. Edwards // Lancet. – 1978. – Vol. 2 (8085). – P. 366. 177. Steroid-cellautoantibodies are preferentially expressed in women with premature ovarian failure who have adrenal autoimmunity / A. Falorni [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2002. – Vol. 78. – P. 270-279. 178. Subclinical impairment of ovarian reserve in juvenile systemic lupus erythematosus after cyclophosphamide therapy / N. E. Aikawa [ et al. ] // Clin. Exp. Rheumatol. – 2012. – Vol. 30. – P. 445-459. 179. Suppression and flare regimens of gonadotropin-releasing hormone agonist. Use in women with different basal gonadotropin values in an in vitro fertilization program / T. L. Toth [ et al. ] // J. Reprod. Med. – 1996. – Vol. 41 (5). – P. 321-326. 180. Surrey, E. S. Management of the poor responder: the role of GnRH agonists and antagonists. / E. S. Surrey // J. Assoc. Reprod. Genet. – 2007. – Vol. 24. – P. 613-619. 181. The CGG repeat element within the 5` untranslated region of the FMR1message provides both positive and negative effects on in vivo translation of a 145 downstream reporter / L. S. Chen [ et al. ] // Hum. Mol. Genet. – 2003. – Vol. 12 (23). – P. 3067-3074. 182. The differential transcriptome and ontology profiles of floating and cumulus granulosa cells in stimulated human antral follicles / S. Kõks [ et al. ] // Molec. Hum. Reprod. – 2009. – Vol. 16 (4). – P. 229-240. 183. The FMR1 premutation and Reproduction / M. D. Wittenberger [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2007. – Vol. 87. – P. 456-465. 184. The immunological profile of infertile women after repeated IVF failure (preliminary study) / L. Putowski [ et al. ] // Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. – 2004. – Vol. 112 (2). – P. 192-196. 185. The influence of body mass index on in vitro fertilization outcome / R. Orvieto [ et al. ] // Int. J. Gynaecol. Obstet. – 2009. – Vol. 104. – P. 53-55. 186. The potential role of gap junction communication between cumulus cells and bovine oocytes during in vitro maturation / A. Atef [ et al. ] // Molec. Reprod. Devel. – 2005. – Vol. 71. – P. 358-367. 187. The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine: Antiphospholipid antibodies do not affect IVF success // Fertil. Steril. – 2004. – Vol. 82 (Suppl.1). – P. 184-185. 188. The presence of anti- thyroid and anti-ovarian auto-antibodies in familial POF / M. Ashrafi [ et al. ] // Int. J. Fertil. Steril. – 2008. – Vol. 1 (4). – P. 171-174. 189. The relationship between anti-Müllerian hormone in women receiving fertility assessments and age at menopause in subfertile women: evidence from large population studies / M. Dólleman , [ et al. ] // J. Clin. Endocrinol. Metab. – 2013. –Vol. 98 (5). – P. 1946-1953. 190. The role of genetic and autoimmune factors in premature ovarian failure / N. N. Shamilova [ et al. ] // J. Assist. Reprod. Genet. – 2013. – Vol. 30. – P. 617-622. 191. Toniolo, D. X-linked premature ovarian failure: a complex disease. / D. Toniolo // Curr Opin Genet Dev. – 2006. – Vol. 16 (3). – P. 293-300. 146 192. Undetectable serum anti-Müllerian hormone levels and occurrence of ongoing pregnancy / T. Fraisse [ et al. ] // Fertil. Steril. – 2008. – Vol. 89 (3). – P. 723.e9-723.e11. 193. Vallotton, M. B. Antibodies to cytoplasm of ova / M. B. Vallotton, A. P. Forbes // Lancet. – 1966. – Vol. 2 (7457). – P. 264-265. 194. Variants of the BMP15 gene in a cohort of patients with premature ovarian failure / D. Tiotiu [ et al. ] // Hum Reprod. – 2010. – Vol. 25 (6). – P. 1581-1587. 195. Variation in bone morphogenetic protein 15 is not associated with spontaneous human dizygotic twinning Zhao ZZ, [ et al. ] // Hum Reprod. – 2008. –Vol. 23 (10). – P. 2372-2379. 196. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox / Fu Y.H, [ et al. ] Cell. – 1991. – Vol. 67 (6). – P. 1047-1058. 197. Yu, B. The role of peripheral gonadotropin-releasing hormone receptors in female reproduction / B. Yu, J. Ruman, G. Christman // Fertil Steril. – 2011. – Vol. 95 (2). – P. 465-473. 147 Приложение Анкета для сбора анамнестических данных пациенток, проходящих терапию бесплодия методом ЭКО, с целью выявления групп риска «бедного» овариального ответа 1. Персональные данные пациентки _______________________________ 2. Дата рождения________________________________________________ 3. Возраст (полных лет)__________________________________________ 4. Профессиональные вредности (компьютер, физическая нагрузка, вредные вещества) ___________________________________________ 5. Курение (не курит, < ½ пачки/день, 1/2-1 пачку/день, >1 пачки/день) 6. Рост (см)____________________________________________________ 7. Вес(кг)______________________________________________________ 8. ИМТ________________________________________________________ Семейный анамнез: 9. Возраст наступления менопаузы у матери пациентки_______________ (указать наличие ПНЯ у ближайших родственников) Соматический анамнез: 10. Детские инфекции (корь, краснуха, эпидемический паротит) ________ 11. Аллергологический анамнез ___________________________________ 12. Эндокринные заболевания (аутоиммунный тиреоидит)______________ 13. Аутоиммунные заболевания ____________________________________ 14. Прием лекарственных препаратов _______________________________ 15. Химио/лучевая терапия в анамнезе)______________________________ Менструальная функция: 16. Возраст менархе (лет)_______________________________________ 17. Регулярность цикла (да/нет) 18. Продолжительность цикла (дней)______________________________ 19. Длительность менструального кровотечения (дней)_______________ 148 20. Характер менструаций (скудные, умеренные, обильные, болезненные, безболезненные) 21. Нарушения менструального цикла (нет, олигоменорея, полименорея, дисменорея, межменструальные кровянистые выделения, альгоменорея) 22. Контрацепция в анамнезе (презервативы, прерванный половой акт, ВМС, КОК, гормональная – другие формы, посткоитальная) 23. Период контрацепции _________________________________________ Репродуктивная функция: 24. Количество беременностей, полученных естественных путем, в анамнезе___________________________________________________ 25. Количество беременностей после ЭКО в анамнезе________________ 26. Количество родов в срок в анамнезе (естественным путем или кесарево сечение)____________________________________________________ 27. Количество преждевременных родов в анамнезе (естественным путем или кесарево сечение) _________________________________________ 28. Количество искусственных абортов в анамнезе____________________ 29. Количество самопроизвольных выкидышей в анамнезе (выкидыш/неразвивающаяся беременность)_______________________ 30. Количество внематочных беременностей в анамнезе________________ 31. Перенесенные гинекологические заболевания (хламидиоз, генитальный герпес, хронический вульвовагинит, хронический цервицит, эктопия шейки матки, предраковые заболевания ШМ, рак ШМ, миома матки, острый эндометрит, хронический эндометрит, внутренний эндометриоз, наружный эндометриоз, очаговый эндометриоз, диффузный эндометриоз, гиперплазия эндометрия, полип эндометрия, предрак эндометрия, рак эндометрия, ДМК, бесплодие I, бесплодие II, хронический сальпингоофорит, опухолевидные образования яичников, ПНЯ, дисгенезия гонад) 32. Перенесенные оперативные вмешательства на половых органах (на ШМ, на матке, на трубах, на яичниках, реконструктивные и пластические операции) 149 История заболевания: 33. Продолжительность бесплодия (лет)_____________________________ 34. Предыдущие стимуляции суперовуляции (количество) _____________ В случае наличия БОО в анамнезе: - протокол стимуляции __________________________________________ - дозы гонадотропинов__________________________________________ - количество растущих фолликулов и полученных ооцитов____________ - исход программы______________________________________________ Обследование пациентки: Гормональное Норма Норма исследование крови I фаза II фаза ФСГ (МЕ/л) 0,7-7,9 ЛГ (МЕ/л) Е2 (пмоль/л) Прогестерон (нмоль/л) 0,79-10,0 86-677 91-1148 0,09-4,29 5,84-96,0 Пролактин (мМЕ/л) 86-650 Кортизол (нмоль/л) 190,0-650,0 Тестостерон (нмоль/л) 0,8-2,9 ТТГ (мМЕ/л) 0,24-3,0 Т3св. (нмоль/л) 1,04-2,5 Т4 св. (нмоль/л) 65-160 АМГ 35. УЗИ органов малого таза : - объем яичников_____________________________________________ -число антральных фолликулов__________________________________
