Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный
advertisement
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации Кафедра молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева медико-биологического факультета На правах рукописи СУКНОВАЛОВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА ЗАВИСИМОСТЬ РЕАЛИЗАЦИИ ПРОГРАММЫ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ОТ КОЛИЧЕСТВА И СРОДСТВА ГЕСТАГЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ МОНОНУКЛЕАРОВ КРОВИ К ПРОГЕСТЕРОНУ И ДИДРОГЕСТЕРОНУ У ПАЦИЕНТОК С БЕСПЛОДИЕМ. 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор КАРЕВА ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА Москва 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. 1.1 6 Обзор литературы Эпидимиология бесплодия, эффективность методов лечения 1.2 1.3 10 10 Причины низкой эффективности ВРТ и возможные пути ее повышения 11 Критерии прогноза эффективности программы 22 ЭКО 1.4 Прогестерон как основное координирующее звено процесса пролонгации гестации 25 1.4.1 Молекулярный механизм действия женских половых стероидов 1.4.2 Женские половые гормоны и иммунитет 1.5 29 38 Заключение 39 Материалы и методы исследования 41 2.1 Характеристика клинического материала 39 2.2 Лабораторное оборудование и используемые ГЛАВА 2. химические реактивы 46 2.3 Методы исследования 48 2.4 Статистическая обработка результатов 62 Результаты собственных исследований 63 ГЛАВА 3. 3.1 Концентрация рецепторов половых стероидов в пайпель биопсии эндометрия при первичном обследовании 3.2 Данные лабораторного исследования крови пациенток 3.3 63 Относительная связывающая активность 66 3 прогестерона и дидрогестерона с РП мононуклеаров периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО 3.4 94 Сравнительный анализ данных связывающей активности радиолигандов и сопутствующих 3.5 ГЛАВА 4. факторов 97 Результаты проведенного цикла ЭКО и ПЭ 109 Обсуждение собственных результатов 114 ВЫВОДЫ ПРАКТИЧЕСКИЕ 122 РЕКОМЕНДАЦИИ СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 124 125 127 4 Условные обозначения. аГнРГ – агонист гонадотропин-релизинг гормона антГнРГ – антагонист гонадотропин-релизинг гормона БСА – бычий сывороточный альбумин БНГ – бесплодие неясного генеза ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии ГЧЭ – гормон чувствительный элемент ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИКСИ – интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида ИЛ – интерлейкины ИМТ – индекс массы тела ИПФР – инсулиноподобный фактор роста ИПФРСП – инсулиноподобный фактор роста связывающих протеинов ИФН – интерферон КСФ – колониестимулирующий фактор ЛГ – лютеонизирующий гормон ЛИФ (LIF) – лейкемия - ингибирующий фактор ММ – молекулярная масса МНФ – мононуклеарная фракция МНФК – мононуклеарная фракция клеток НГЭ – наружный генитальный эндометриоз ПИБФ – прогестерониндуцированный блокирующий фактор ПМ – плазматическая мембрана ПП14 – плацентарный протеин с мм 14 ПЦР – полимеразная цепная реакция ПЧЭ – прогестерон чувствительный элемент ПЭ – подсадка эмбриона 5 РНК – рибонуклеиновая кислота РП – рецептор прогестерона РЭ – рецептор эстрадиола СГСЯ – синдром гиперстимуляции яичников СПКЯ – синдром поликистозных яичников СЭФР (VEGF) – сосудисто-эндотелиальный фактор роста Тх1 – Т-хелпер 1 Тх2 – Т-хелпер 2 УЗИ – ультразвуковое исследование ФНО – фактор некроза опухолей ФРП – фактор роста плаценты ФСГ – фолликулостимулирующий гормон ХГ – хорионический гонадотропин ХГЧ – хорионический гонадотропин человека ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение AF – транскрипционная активационная функциональная единица COX-2 – циклооксигеназа 2 Е2 – эстрадиол 17 β HLA – главный комплекс гистосовместимости MCP-1 – моноцит - хемотаксический пептид 1 NC – клетки - натуральные киллеры NLS – ядерные локализованные сигналы Р4 – прогестерон TORCH – токсоплазма, краснуха, цитомегаловирус, герпес и другие внутриутробные инфекции 6 Введение. Бесплодный брак является одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. Отмечается постоянная тенденция к росту частоты трубных и трубно-перитонеальных форм бесплодия, доля которых составляет 20-40% в структуре причин женского бесплодия. У женщин с непроходимостью маточных труб единственным способом реализации генеративной функции является экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) [12]. Однако эффективность этого метода не достаточно высока, составляет в среднем 32,3% [17, 108], при этом 30% из общего числа женщин понесших имплантацию сталкиваются с проблемой выкидышей и не вынашивания [1], что диктует необходимость более глубокого изучения механизмов не только инициации, но и пролонгации гестации. Главная задача программы ЭКО это беременность и рождение здорового ребенка. Данная задача осуществляется множеством действий, из которых основным является получение большого числа (10, 20) зрелых жизнеспособных ооцитов для дальнейшего оплодотворения их in vitro. Для этого проводят стимуляцию суперовуляции, воздействуя на процесс фолликулогенеза большими дозами экзогенных гонадотропинов [61]. Процесс имплантации эмбриона зависит от адекватного действия женских половых гормонов. Женские половые стероиды реализуют свою гормональную активность через рецепторы, относящиеся к суперсемейству ядерных рецепторов NR [11]. Эффективность гормональной терапии зависит от рецепторного статуса ткани-мишени. С одной стороны, уровень РЭ и РП (РП/РЭ) в эндометрии перед подготовкой к имплантации влияет на эффективность переноса бластоцисты [5]. С другой стороны, ответная иммунная реакция организма матери на отцовские антигены эмбриона находится под контролем женских половых гормонов [18, 73]. Строго координированный гормональный контроль функции, как эндометрия, так и иммунокомпетентных клеток является абсолютно необходимым условием 7 успешной имплантации. В литературе представлены скудные данные о рецепции женских половых стероидов в эндометрии и отдельных фракциях клеток белой крови при имплантации [52, 88, 113, 114,]. Однако, представленные данные весьма противоречивы, носят качественный и статичный характер. Следовательно, актуальным является динамический количественный анализ рецепции эстрадиола и прогестерона в клетках эндометрия и МНФК в предимплантационный период в зависимости от исхода ВРТ, а так же поиск возможности персонализованного подхода к назначению гормональной терапии с целью поддержания гестации наранних сроках и повышения эффективности ВРТ. Цель исследования. Изучение роли специфического связывания половых стероидов в эндометрии и мононуклеарах периферической крови пациенток в реализации программы ЭКО. Поиск фармако-биохимических критериев для персонализации гестагенной терапии у пациенток на ранних сроках беременности, включенных в программу ЭКО. Задачи. 1. Определение уровня прогестерона и эстрадиола в плазме крови до начала стимуляции суперовуляции и в предимплантационный период у пациенток программы ЭКО. 2. Определение уровня цитозольных рецепторов прогестерона и эстрадиола радиолигандным методом в эндометрии до начала стимуляции суперовуляции у пациенток программы ЭКО в зависимости от ее успеха. 3. Определение уровня специфического связывания 3H-прогестерона и 3 H-эстрадиола радиолигандным методом в мононуклеарной фракции клеток периферической крови пациенток, включенных экстракорпорального оплодотворения в динамике. в программу 8 4. Анализ специфического связывания 3 H-прогестерона и 3 H- эстрадиола радиолигандным методом в мононуклеарной фракции клеток периферической крови на 21-23 день менструального цикла, у пациенток программы ЭКО в зависимости от ее успеха. 5. Анализ специфического связывания дидрогестерона в мононуклеарах периферической крови пациенток программы ЭКО. Научная новизна. Впервые была определена количественная составляющая рецепторного профиля МНФК у пациенток, участвующих в программе ЭКО. Продемонстрирована тесная положительная корреляция между уровнем рецепторов прогестерона в мононуклеарной фракции клеток периферической крови и цитозоле эндометрия пациенток программы ЭКО. Предложен способ позволяющий персонализировать гестагенную поддержку первого триместра беременности у пациенток программы ЭКО. Практическая значимость работы. Предложен новый способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции (патент на изобретение №2430379). Предложен алгоритм введения пациенток в длинный протокол программы ЭКО, для повышения эффективности данной технологии, основанный на малоинвазивном методе определения уровня рецепторов половых стероидов в МНФК. 9 Выявлены вариации специфического связывания дидрогестерона с МНФК, которые могут позволить индивидуализировать подбор препаратов гормональной терапии. Внедрение полученных результатов исследования в практику. Результаты исследования по повышению эффективности лечения бесплодия методом ЭКО и ПЭ, основанном на анализе специфического связывания прогестерона в мононуклеарной фракции периферической крови пациенток программы ЭКО, внедрены в практическую деятельность ЭКО КДО ГБУЗ ЦПСиР ДЗ, а так же используются в материалах лекций для студентов кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева медико-биологического факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на заседании совместной научно-практической конференции коллектива кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии им. академика П.В. Сергеева ГОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ, 07 марта 2012 года, протокол № 20. 10 Глава 1. Обзор литературы. 1.1 Эпидемиология бесплодия, эффективность методов лечения. Состояние репродуктивного здоровья населения России относится к наиболее острым проблемам развития общества, в связи с этим снижение материнской и младенческой смертности, стабилизация численности народонаселения и улучшение в целом медико-демографической ситуации провозглашены приоритетными задачами государственной национальной политики России. Сохранение репродуктивного здоровья женщин и научное планирование семьи, предупреждение и лечение гинекологических заболеваний вошли в число важнейших направлений деятельности в сфере медицины [108]. Частота бесплодных браков в России превышает 20% что, по мнению экспертов ВОЗ, считается критическим уровнем [17, 19, 133,]. Способы решения проблемы бесплодия зависят от его типа, который определяется причинами его вызывающими. Наиболее частой причиной бесплодия является полная или частичная непроходимость маточных труб, в результате перенесенных заболеваний органов малого таза. По частоте встречаемости данный тип стоит на первом месте и составляет 40-60% от общего числа существующих форм бесплодия [133]. Практически единственным способом восстановления репродуктивной функции в этой ситуации являются методы вспомогательной репродуктивной технологии (ВРТ) – экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), подсадка эмбриона (ПЭ) и интрацитоплазматическая (внутриклеточная) инъекция сперматозоида (ИКСИ). Однако эффективность экстракорпорального оплодотворения зависит как от успеха имплантации, так и от обеспечения пролонгирования гестации, и в среднем составляет 30-50% [1]. Программа ЭКО подразумевает прохождение женщиной определенных этапов, включающих стимуляцию суперовуляции и получение большого числа 11 ооцитов, пункцию этих ооцитов, дальнейшую подсадку эмбрионов. Все этапы могут сопровождаться нежелательными явлениями, но наиболее частым осложнением программы является синдром гиперстимуляции яичников (СГЯ). Поэтому актуальным остается поиск путей повышения эффективности и безопасности ВРТ. 1.2. Причины низкой эффективности ВРТ и возможные пути ее повышения. Репродуктивная система женщины представляет собой совокупность анатомических структур и эндокринных механизмов, функционирование которых строго скоординировано в пространстве и времени. Эндокринная составляющая представлена белково-пептидными и стероидными гормонами. Основную роль, так или иначе, играют гонадотропные и стероидные гормоны, которые регулируют как менструальный цикл женщины, так и механизмы, связанные с имплантацией и дальнейшей гестацией. Однако, помимо «основных» гормонов не маловажную функцию осуществляют ингибины и активины, роль которых изучена достаточно хорошо. Ингибины представляют собой димерные белки, состоящие из 2 цепей альфа и бета. Предшественник цепи альфа (про-α-С), ранее считавшийся собственно ингибином, и определяемый в крови в высоких концентрациях, не обладает высокой активностью, и не имеет диагностической ценности. Цепь бета представлена двумя вариантами: А и В. Каждый из этих вариантов может быть ковалентно соединен с цепочкой альфа и соответственно образует ингибины альфа - бета А (ингибин А) и альфа - бета В (ингибин В). Молекулярная масса обоих ингибинов составляет примерно 31 - 32 кДа. Две цепочки бета могут образовывать димеры, которые называются активинами и соответственно существуют активины А, В и АВ. Основная роль ингибинов состоит в торможении выделения ФСГ клетками передней доли гипофиза, в то время как активины - способствуют выбросу ФСГ. Синтез ингибинов и 12 активинов происходит в головном мозге человека, плаценте, костном мозге, гипофизе, яичках и яичниках, однако у женщины детородного возраста главным источником являются клетки гранулезы фолликулов [59]. Концентрации ингибина А, активина А в плазме крови увеличиваются во время беременности, достигая пика к 36 неделе беременности [67]. Долгое время оставались неизвестными механизмы регуляции уровня ФСГ в начале менструального цикла. Предположения о том, что это может происходить под воздействием эстрадиола не оправдались, так как уровень синтеза этого гормона значителен только после достижения фолликулом диаметра 10 мм и более [110]. Однако благодаря работам группы Groome N. из Оксфордского университета показано, что клетки гранулезы предоминантных фолликулов (до 10 мм в диаметре) продуцируют ингибин В и именно он регулирует продукцию ФСГ в начале и середине менструального цикла. В то же время доминантный фолликул и желтое тело продуцируют ингибин А и эстрадиол, которые в свою очередь ингибируют выделение ФСГ гипофизом [73]. Контроль менструального цикла неразрывно связан с эстрогенами, синтез которых имеет свои особенности. Согласно современным данным, в растущих фолликулах начала менструального цикла, синтез андрогенов из холестерина происходит в клетках теки фолликулов под воздействием стимулирующего действия ЛГ. Тестостерон мигрирует в клетки гранулезы фолликулов, где с помощью фермента ароматазы конвертирует в эстрадиол. Основным стимулятором ароматазы является ФСГ. Уровень синтеза эстрадиола в фолликуле зависит от его размера - при диаметре до 10 мм он остается невысоким. При увеличении размера (доминантный фолликул более 10 мм) на клетках гранулезы появляются рецепторы не только к ФСГ, но и к ЛГ. Под воздействием ФСГ и ЛГ, синтез эстрадиола резко увеличивается. Высокая концентрация эстрадиола в крови вызывает, по принципу отрицательной обратной связи, снижение выделения ФСГ гипофизом. При 13 снижении уровня ФСГ, все фолликулы, которые не успели достигнуть 10 мм в диаметре, подвергаются атрезии. Данный механизм называется селекция доминантного фолликула, который характерен для моноовулярных млекопитающих [67, 100]. В то же время уровень синтеза эстрадиола в доминирующем фолликуле растет экспоненциально и тесно коррелирует с диаметром фолликула. При достижении фолликулом овуляторного диаметра (16-23 мм), высокий уровень эстрадиола вызывает, по принципу положительной обратной связи пик ЛГ, разрыв оболочек и овуляцию [106]. После овуляции яйцеклетка захватывается фимбриями и продвигается по маточной трубе, где происходит оплодотворение, дробление и формирование зиготы. Через 3-4 дня после формирования 4-8 клеточной стадии зиготы образуется морула, а через 5-6 дней - бластоциста, готовая к имплантации [125]. После оплодотворения яйцеклетки трофобласт наряду с другими гормонами начинает продуцировать ХГ (хорионический гонадотропин). Уровень ХГ - показатель успешной имплантации и жизнеспособности беременности. При уровнях в плазме крови меньше 50 МЕ/л (+14) – 14-е сутки после пика ЛГ и 200 МЕ/л (+21) – прогноз наступления беременности отрицательный. ХГ снижает концентрацию эндотелина-1, обеспечивая инвазию трофобласта [134]. ХГ стимулирует продукцию эстрогенов и прогестерона желтым телом. Функция желтого тела – обязательное условие сохранения беременности в течение первых 8-10 недель. Трофобласт берет на себя функцию выработки прогестерона и эстрогенов, достаточных для поддержания беременности, после 10 нед. гестации. Залогом успешной имплантации и последующего соответствие течения функционированием всех развития плода физиологических иммунной системы, является процессов: не только адекватным оплодотворением и предимплантационным развитием оплодотворенного яйца, но и подготовка слизистой матки к приему бластоцисты. Данная подготовка заключается в 14 созревании эндометрия и дальнейшей способности принять оплодотворенную яйцеклетку , имплантации и гестации. Имплантация бластоцисты происходит, как правило, на 7-8-й день после оплодотворения, при условии адекватного содержания в организме женщины эстрогенов, прогестерона и нормальной секреторной трансформации эндометрия. Программа ЭКО воспроизводит все перечисленные стадии максимально приближенно к физиологическим процессам. У человека процесс имплантации начинается с 5-7-го дня после овуляции, хотя его точное время остается до конца неизвестным. В начале имплантации бластоцист имеет 100–120 клеток [15, 65]. Эмбрион может имплантироваться только в определѐнный очень ограниченный промежуток времени, который называется "имплантационным окном" [76]. Время готовности эмбриона к имплантации и максимальной рецептивности эндометрия должны совпадать для осуществления успешной имплантации. Как правило «имплантационное окно» открыто на 5-6 сутки после овуляции. Но иногда оно смещается по времени вперѐд или назад и тогда готовый к имплантации эмбрион не находит себе места и погибает. В период покровного имплантации эпителия главной является анатомической появление особенностью микропротрузионов (микробугорков) от апикальной поверхности эпителия к слизистой оболочке матки [105]. Эти микропротрузионы называются «пиноподы». Они появляются на 6-й день после пика ЛГ (ЛГ+6, 20-21 день м.ц.) и обнаруживаются в течение 48–72 ч. По другим данным пиноподы сохраняются до 28-го дня м.ц. (малыми группами на большой площади) [30, 50]. 15 Появление пинопод ингибируется эстрогенами и стимулируется прогестероном. Возникновение пинопод совпадает с окном имплантации. На стадии контакта бластоциста с эпителием, пиноподы находящиеся на апикальной поверхности покровного эпителия, выделяют особую жидкость, свободно распространяющуюся по полости матки. В результате бластоцист входит в тесный контакт с эпителием матки и прикрепляется к ней – стадия адгезии [132]. Адгезия бластоциста может быть определена как стадия тесных функциональных взаимодействий, между наружными мембранами клеток трофобласта и эндометрия. Синцитиотрофобласт прорастает между эпителиальными клетками (интерстициальный вид инвазии) в строму так глубоко, что покровный эпителий полностью смыкается над ним. В течение предимплантационной фазы менструального цикла различные компоненты эндометрия: железистый эпителий, покровный эпителий, стромальные клетки, стромальные сосуды и межклеточная матрица, претерпевают морфологические, клеточные и молекулярные изменения. Некоторые их них имеют ограниченный жизненный цикл. Хотя каждый компонент эндометрия это отдельная анатомическая единица, в совокупности они функционально и паракринно взаимосвязаны. В период имплантации увеличивается митотическая активность желез эндометрия. Толщина слизистой оболочки матки увеличивается от 5 мм на 1й день пика ЛГ (ЛГ+0) до 10 мм на 8-й день после пика ЛГ (ЛГ+8) и положительно коррелирует с концентрацией эстрадиола в плазме крови. В это время секреторная активность желез достигает максимума. Только во время секреторной фазы видны 3 характерные структурные черты желез эндометрия: гигантские митохондрии, гликогеновые отложения и система ядерных каналов. Секрет эндометриальных биологически активных веществ. желез содержит ряд 16 Плацентарный протеин 14 (ПП14) является главным секреторным продуктом желез эндометрия в течение второй половины лютеиновой фазы цикла и I (раннего) триместра беременности. ПП14 –гликопротеин с ММ 42 кДа, содержащий 17% углеводородов. Показано, что ПП14 – прогестеронзависимый эндометриальный белок, концентрация которого снижена при ановуляторных циклах [80]. Ген ПП14 содержит прогестерончувствительные элементы [143]. ПП14 проявляет выраженную иммуномодулирующую активность, в частности препятствует лимфопролиферации и тормозит Т - киллеры, которые присутствуют в больших количествах в эндометрии на стадии ранней беременности. Считается, что ПП14 защищает имплантируемый эмбрион от отторжения материнской иммунной системой [87]. Женщины, перенесшие повторные внутриматочные манипуляции, имеют пониженные концентрации ПП14 в маточной жидкости по сравнению со здоровыми ровесницами. ПП14 прямо ингибирует ФГА - стимулированную пролиферацию Т-клеток и секрецию цитокинов МНФК (ИЛ-2). Введение активаторов протеинкиназы С и ионофоров Са++ отменяет такое действие ПП14, что свидетельствует о рецептор – опосредованном его эффекте. Взаимодействие клеток эндометрия между собой и трофобластом осуществляется с участием молекул адгезии. Молекулы адгезии являются клеточными поверхностными рецепторами. Существуют четыре главные группы молекул адгезии: интегрины, кадгерины, селектины и иммуноглобулины. Интегрины – трансмембранные гликопротеины, которые представлены двумя изоформами: интегрины α и β. Они взаимодействуют с гликопротеинами межклеточной матрицы и молекулами клеточной мембраны. Интегрины участвуют в клеточной миграции, взаимодействии клеток с межклеточной матрицей, а также в межклеточных коммуникациях, т. е. задействованы во всех стадиях имплантации [48, 69, 140] Появление пинопод 17 и эндометриальных интегринов является сигналом открытия рецептивной фазы эндометрия (имплантационного окна) [134]. Интегрины синтезируются и экспонируются различными клетками эндометрия в течение пролиферативной и лютеиновой фаз цикла [57, 62]. Наличие некоторых интегринов в эндометрии совпадает с периодом его максимальной рецептивной активности [43, 98]. Интегрин α4β1 отсутствует в пролиферативном эндометрии, появляется сразу после овуляции в железистых эпителиальных клетках (14-й день м.ц.) и исчезает на 24-й день цикла. Интегрин αvβ3 выделяется железистыми эпителиальными клетками после 19-го дня цикла, при открытии имплантационного окна. Интегрин αvβ3–адгезивная молекула лигандом, которой служит остеопонтин. Остеопонтин (локализован рядом с интегрином) обеспечивает связывание эмбриона с апикальной поверхностью эндометрия для инвазии [99]. На 24-й день интегрин αv β1 впервые появляется в покровном маточном эпителии. Молекула интегрина α1β1 экспрессируется эпителиальными клетками в период от 15-го до 28-го дня цикла. Появление всех трех интегринов – α1β1, α4β1 и αvβ1 происходит в эпителиальных клетках только в течение 4 дней: от 20-го по 24-й день цикла. Следствием появления этих интегринов может служить признание эмбриона материнской иммунной системой и последующая успешная имплантация бластоциста [31,91]. У женщин с нарушениями репродуктивной функции отсутствует адекватный синтез интегринов в эндометрии. Эндометриальные железы и покровные эпителиальные клетки женщин с необъяснимым бесплодием не выделяют интегрин α4 во время лютеиновой фазы м.ц. Интегрин α4β1 связывется с фибронектином, трофобластах. компонентом, присутствующим на фетальных 18 Отсутствие интегрина α4β1, на клетках железистого и покровного эпителия у женщин с необъяснимым бесплодием, может отражать неполное признание эмбриона материнской иммунной системой, прямым следствием которой является неудачная имплантация [89]. Интегрины активируются системой ИЛ-1. ИЛ-1β (экспрессирован в бластоцисте) индуцирует экспрессию VEGF в эндометрии, который в свою очередь стимулирует ангиогенез и экспрессию интегринов в эндометриальных клетках [134]. Интегрин αvβ3 представлен как в строме, так и в железистых клетках эндометрия, его концентрация варьирует у пациенток с необъяснимым бесплодием [44]. Lessey B. и соавторы [98] сообщили, что эндометрий женщин, страдающих от эндометриоза, не экспонирует интегрин β3. Недостаток выделения данного интегрина также был выявлен в эндометрии у женщин с замедленным его развитием, а также у пациенток, перенесших как минимум 4 попытки ЭКО [92]. Низкий уровень интегринов (главным образом α4β1 и αvβ3 вырабатываемых эндометрием) у женщин, страдающих от неудачных попыток имплантации, необъяснимого бесплодия, эндометриоза или дефекта лютеиновой фазы цикла, указывает на то, что измененная рецептивная активность эндометрия и неудачная имплантация могут служить причиной необъяснимого бесплодия у женщин. Индукция децидуальной трансформации стромальных фибробластов находится под контролем цитокинов. В течение преимплантационного периода в тканях эндометрия присутствует широкий спектр цитокинов и факторов роста. Они выделяются эпителиальными клетками, макрофагами и лимфоцитами. Хотя эндометрий человека имеет множество цитокинов, их роль в имплантации остается малоизученной [53]. Показано, что система ИЛ1 состоит из двух цитокинов (ИЛ-1α и ИЛ-1β), являющихся агонистами, и 19 двух рецепторов (ИЛ-1R типов I и II), а также рецептора антагониста ИЛ-1 (РА-ИЛ). Последний связывается с ИЛ-1R типа I, предотвращая трансиндукцию многих функций, связанных с активацией ИЛ-1R типа I in vivo и in vitro. В эндометрии человека ИЛ-1 и ИЛ-1β обнаруживаются в макрофагах и эндометриальных клетках. Экспрессия ИЛ-1β активируется в среднюю лютеиновую фазу цикла [131]. Клетки покровного эпителия содержат ИЛ-1R типа I, плотность которых увеличивается в предимплантационный период. Показано, что эмбриональный ИЛ-1 и эндометриальный ИЛ-1R типа I вовлечены на ранних стадиях в эмбрио - материнский «диалог» [58, 136]. Система ИЛ-1 способствует экспрессии интерферонов γ в Тлимфоцитах. Децидуальные натуральные киллеры взаимодействуют с трофобластом, вызывая образование LIF (ЛИФ), который индуцирует синтез желатиназы, принципиального фермента инвазии трофобласта [134]. ИЛ-15 – один из кандидатов на маркеры имплантационного окна, регулирует функцию натуральных киллеров. Прогестерон стимулирует экспрессию ИЛ-15 в строме эндометрия. Оказалось, что провоспалительный цитокин ИЛ-1β значительно ингибирует прогестерон-зависимую экспрессию ИЛ-15 и стимулирует – ИЛ-8 (провоспалительный цитокин) [116]. Миграция лейкоцитов в эндометрий осуществляется под контролем ИЛ-8. Активация антигена CD40 приводит к увеличению экспрессии COX-2 и ИЛ-8 в фибробластах эндометрия. Лиганды для CD40 поступают из матки и тромбоцитов. В норме процесс контролируется прогестероном, который в высоких концентрациях предотвращает активацию CD40 [85] Ил-6 стимулирует пролиферацию стромальных клеток в лютеиновую фазу [146]. 20 ИЛ-8 - хемокин стимулирующий нейтрофилы и Т-клетки. Ил-1 и ФНОα время- и дозозависимо стимулируют синтез ИЛ-8. В литературе имеются сведения об изменении профиля цитокинов, экспрессируемых в натуральных киллерах периферической крови у пациенток с привычными абортами и нарушением имплантации. Пропорция ИФНγ/ФНОα и ФНОα/гранулоцит-макрофаг колониестимулирующий фактор (КСФ) в клетках CDbright значительно выше у пациенток с спонтанными абортами по сравнению со здоровыми женщинами. В этих же клетках ИЛ4/ИЛ-10 (менее 2%) значительно ниже в опытной группе [62]. Другой цитокин хорошо изученный при бесплодии и имеющий доказанное значение - KSF-1 (колоний стимулирующий фактор). Является гликопротеином с ММ 60 кДа. Первоначально он был описан как фактор роста, индуцирующий пролиферацию и дифференциацию моноядерных фагоцитов. Роль KSF-1 в имплантации была продемонстрирована в модельных экспериментах на мышах c остеопорозом [121]. Было предположено, что взаимодействие эмбрионального рецептора для KSF-1 и эндометриального белка KSF-1 облегчает инициальную стадию имплантации бластоциста [142]. Уровень KSF-1 увеличивается от пролиферативной к секреторной фазе цикла и достигает максимума в I триместре беременности. Главное место синтеза KSF-1 – цитотрофобластом маточный [137]. эпителий. Рецепторы KSF-1 KSF-1 также синтезируется присутствуют и на эндометриальных клетках и на клетках эмбриона. В процессе имплантации активно задействованы стромальные клетки слизистой матки. Строма эндометрия состоит главным образом из 2 различных популяций клеток: фибробластов и лейкоцитов [19]. 21 Во второй половине секреторной фазы цикла фибробласты под воздействием прогестерона трансформируются в децидуальные клетки, которые выглядят как большие клетки с темным очерченным ядром. Гистамины, простагландины, лейкотриены, фактор роста плаценты (ФРП), прогестерон индуцированный блокирующий фактор (ПИБФ), ИЛ-1 и ангиотензин-II также вовлечены в индукцию децидуальной трансформации стромальных фибробластов. Эти факторы секретируются иммунокомпетентными клетками. Количество клеток CD8+ (Т-супрессор) заметно увеличивается в период от 4-го до 7-го дня после пика ЛГ (ЛГ+4 – ЛГ+7), в то время как количество макрофагов CD68+ увеличивается от 10-го до 13-го дня после пика ЛГ (ЛГ+10 – ЛГ+13) [141]. Количество лимфоцитов в эндометрии с необычным фенотипом (СD56+ СD38+ СD2+) повышается после 7-го дня от пика ЛГ (ЛГ+7) в процессе имплантации [47]. Вариации числа и состава клеток белой крови могут сопровождать развитие разных вариантов бесплодия, что в свою очередь подчеркивает значение этих клеток в репродукции. Женщины, страдающие необъяснимым бесплодием, имеют значительно меньшее число стромальных СD56+, CD68+, СD38+ и СD8+ в лютеиновую фазу цикла по сравнению с контрольной группой беременных, что отражает неадекватную материнскую иммуносупрессию и/или неблагоприятный ответ организма матери на внедрение трофобласта [90]. Т-клеточные иммунные механизмы так же принимают непосредственное участие в контроле имплантации и гестации в целом, в частности, речь идет о клетках Т-хелперах (Тх1, Тх2) и секретируемых ими цитокинах. В организме эти клетки активируются по очереди. Считают, что реакции обусловленные клетками Тх2, способствуют сохранению беременности, в то время как реакции, обусловленные клетками Тх1, не совместима с беременностью. 22 Установлено, что клетки Тх1 вырабатывают цитокины: ИФН-γ, ИЛ-2, ФНО-α,β. Эти цитокины способны оказывать абортивное действие, вызывая апоптоз трофобласта [49]. Клетки Тх2 обеспечивают гуморальный иммунитет и вырабатывают цитокины ИЛ-4, 5, 6, 9, 10, 13. Эта группа цитокинов способствует поддержанию иммуннитета [138]. Тем не менее, участие иммунной системы в поддержке имплантации дальнейшей гестации требует контроля активности стероидными гормонами, через их рецепторный аппарат функции имунокомпетентных клеток. В случаях, если рецепторы половых стероидов не достаточно представлены в слизистой матки, нормальный уровень яичниковых гормонов не может обеспечить необходимых условий для развития плодного яйца, что приводит к прерыванию беременности после имплантации [16]. Таким образом, ключевыми гормонами в регуляции имплантации являются: гонадотропины, стероидные гормоны, а так же паракринные агенты ПП14, ПИБФ, интегрины, цитокины, ингибины, активины, которые в свою очередь находятся под контролем женских половых стероидов. Основным гормоном пролонгации гестации является прогестерон. 1.3. Критерии прогноза эффективности программы ЭКО. Современные схемы ЭКО воспроизводят параметры гормональной регуляции нормальной овуляции и имплантации. В схеме ЭКО используется агонист гонадолиберина, который «отключает» продукцию собственных гонадотропинов. На этом фоне вводят ЛГ и ФСГ. Дозы рассчитаны таким образом, чтобы в результате получить 10-20 полноценных зрелых яйцеклеток. Избыточное количество яйцеклеток необходимо для эмбриологических целей. Наиболее распространенной схемой стимуляции суперовуляции, является так называемый длинный протокол, рис.1.1 23 Рисунок.1.1 "Длинный" протокол стимуляции суперовуляции с использованием агониста Гн-РГ. Процедуры и фармакологическое обеспечение длинного протокола: 1. УЗИ на 4-7 день м.ц. (для общей оценки состояния органов малого таза). 2. Десенситизация - УЗИ на 19-23 день м.ц., отсутствие противопоказаний при толщине эндометрия 8-10 мм – начало ежедневных подкожных инъекций дифферелина (аналог гонадолиберина) в дозе 0,1-0,05 мг 18 дней. 3. Суперовуляция - на 3-5 день м. ц. (продолжая инъекции дифферелина), начало стимуляции суперовуляции гонадотропинами гоналом Ф, пурегоном или менопуром (ЛГ и ФСГ) 150-300 МЕ/сут п/к или в/м 8 дней. 4. Триггер финального созревания ооцитов. Для получения достаточного количества яйцеклеток, однократно вводят (ХГ) – хорионический гонадотропин 10000 МЕ в/м (прегнил или овитрель). 5. Трансвагинальная пункция яичников под производится через 34-36 часов после инъекции ХГ. общим в/в наркозом, 24 6. Трансфер - через 1-4 суток после пункции осуществляется перенос эмбрионов в полость матки. 7. Поддержка функции желтого тела – гестагены (прогестерон или дидрогестерон). Эффективность экстракорпорального оплодотворения в среднем составляет 30-50% [1]. Точная информация о предстоящем исходе программы крайне ценна. В настоящее время критерии прогноза эффективности ЭКО можно разделить на две группы: 1. Анамнестические: Возраст; Длительность бесплодия; Беременности и роды в анамнезе; Количество неудачных попыток ЭКО в анамнезе; Курение; Ожирение; 2. Клинико-лабораторные: Фолликулярный резерв яичников; Качество эмбрионов; Морфофункциональное состояние эндометрия; Рецепторный статус эндометрия; Доплерометрия маточных артерий. Значимость анамнестических признаков не является абсолютной, а из лабораторных критериев самым востребованным является морфология эндометрия (что отражено в протоколе ЭКО) – если его толщина не больше 6 25 мм начинать протокол не рационально. Тем не менее, важность этого критерия в литературе активно обсуждается. Rogers P. и Murphy S. [112] исследовали морфологическую картину эндометрия у пациенток, получавших заместительную гормонотерапию (28 дней) по поводу недостаточности желтого тела. С помощью сканирующей электронной микроскопии биоптатов эндометрия были выявлены 7 морфологических характеристик эпителия у 23 пациенток. Так как у женщин с наличием этих анатомических маркеров в последующих циклах ЭКО и ПЭ наступала беременность, авторы заявили об отсутствии корреляции между всеми изученными морфологическими характеристиками эндометрия и его акцепторной активностью [14, 79, 123, 145]. Несмотря на очевидную заинтересованность эндометрия в процессе имплантации, большинство исследований свидетельствует об отсутствии абсолютной зависимости, между благополучным исходом ЭКО и толщиной эндометрия [13, 115, 117]. Следовательно, вопрос о маркере/ах прогноза эффективности программ ВРТ остается открытым. Для поиска потенциальных кандидатов на эту роль необходимо проанализировать текущую научную информацию о физиологии репродуктивной системы. 1.4. Прогестерон как основное координирующее звено процесса пролонгации гестации. Прогестерон - синтезируется желтым телом, плацентой и корой надпочечников. В период половой зрелости при нормальной функции яичников прогестерон поступает в кровь женщины во второй фазе менструального цикла, когда после овуляции формируется желтое тело. По мере нарастания функциональной активности желтого тела выработка им прогестерона увеличивается, а к концу менструального цикла, в связи с 26 обратным развитием желтого тела, снижается. Это способствует периодическому отторжению слизистой оболочки матки (эндометрий). Наступление беременности, сопровождающееся сохранением функциональной активности желтого тела, характеризуется постепенно повышающейся выработкой прогестерона. Начиная с 4 месяца беременности, основным местом образования прогестерона становится плацента, из которой он поступает в организм женщины в возрастающих количествах. Прогестерон выполняет в организме широкий спектр функций, в том числе: способствует переходу эндометрия из пролиферации в состояние секреции; стимулирует децидуализацию; активирует метаболизм эстрадиола (в эстрон и эстриол); расслабляет маточную мускулатуру, увеличивая потенциал покоя миометрия и предупреждая экспозицию белков межклеточных контактов (connexin D43) на поверхности утеромиоцита; уменьшает сократимость маточных труб; увеличивает вязкость цервикальной слизи; стимулирует выделение лютеинизирующего гормона в малых дозах и угнетает в больших [21]. В разные периоды жизни женщины прогестерон оказывает неодинаковое действие на репродуктивную систему, поскольку количество гестагенных рецепторов зависит от уровня эстрогенов, который также подвержен возрастным колебаниям [3]. Недостаток прогестерона и эстрадиола в организме является одной из частых причин бесплодия, нарушения менструального цикла и спонтанного прерывания беременности [120]. 27 Частота невынашивания беременности в популяции колеблется от 10 до 20-25%, а в группе беременных после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) достигает 30% [1]. Поскольку одной из основных причин не вынашивания в I триместре беременности в ходе ВРТ является недостаточность желтого тела, обусловленная длительной десенситизацией гипофиза и аспирацией фолликулярной жидкости вместе с клетками гранулезы, целесообразность назначения препаратов прогестерона после переноса эмбрионов не подвергается сомнению [103]. В связи с тем, что длительное применение инъекций масляного раствора прогестерона сопряжено с дискомфортом и риском возникновения осложнений в виде образования олеом, постинъекционных абсцессов и др., возник вопрос о возможности применения в программах вспомогательной репродукции не инъекционных аналогов прогестерона, а именно дидрогестерона. Успешное применение дидрогестерона для лечения угрозы прерывания беременности продолжается уже не один десяток лет [32]. К достоинствам препарата относят его лекарственную форму (пероральный путь введения) при достаточном гестагенном влиянии [94]. Его молекулярная структура очень сходна по своему строению с природным прогестероном и имеет уникальные особенности, которые повышают его пероральную доступность. В молекуле дидрогестерона конфигурация на С9 и С10 расположена наоборот по сравнению с прогестероном. Кроме того, существует дополнительная двойная связь С6-С7 [126], которая преобразует молекулу в структуру, максимально подходящую для связывания с РП, повышает его активность, тогда как прогестерон, структура которого обеспечивает более легкое связывание с различными рецепторами, менее избирателен (рис. 1.2). 28 Рисунок. 1.2. Молекулярное строение (а) прогестерона и (б) дидрогестерона. Благодаря высокой биодоступности и прогестагенной активности дидрогестерона, для обеспечения одного и того же эффекта необходима его доза в 10-20 раз меньше, чем доза микронизированного прогестерона. Благодаря чему, дидрогестерон безопасен для матери и эмбриона при длительном применении, так как не вызывает признаков вирилизации у матери и маскулинизации у плода женского пола [139]. Таким образом, структурные различия молекул прогестерона и дидрогестерона, с одной стороны, и индивидуальные колебания аффинитета рецепторов прогестерона конкретных женщин, с другой, могут обеспечить персонализованный подход к назначению гормональной терапии с целью повышения ее эффективности [21]. 1.4.1 Молекулярный механизм действия женских половых стероидов. Половым стероидам присущи многие физиологические функции с преимущественно геномными аспектами действия [68]. 29 Согласно связываются классической со внутриклеточными теории специфическими действия рецепторами, транскрипционными стероидов, гормоны которые являются факторами и вызывают положительный или отрицательный эффект на экспрессию генов-мишеней [36]. Молекулярный механизм взаимодейсвия стероида с клеткой-мишенью изображен на рисунке 1.3. Рисунок.1.3 Молекулярный механизм действия гормона в клетке-мишени [9]. Дополнительно к геномному эффекту стероиды проявляют различные внегеномные свойства [60, 72]. Впервые быстрый эффект стероидов был обнаружен в 1942 году Гансом Селье, который описал проявление незамедлительного анестетического действия интраперитонеальной аппликации крысам [128]. прогестерона, при его 30 В последнее время все чаще стали появляться публикации, доказывающие, что начальным этапом реализации гормонального сигнала на биологический ответ клетки является специфическое "узнавание" и связывание гормона с плазматической мембраной (ПМ) впервые обоснованное академиком П.В. Сергеевым [28]. Академиком П.В.Сергеевым в 1987 году были опубликованы основные положения мембраннорецепторной теории действия стероидных гормонов. В соответствии с этой теорией: 1) стероид узнается плазматической мембраной клетки-мишени; 2) плазматическая мембрана связывает и осуществляет перенос лиганда в клетку; 3) включает систему вторичных посредников, в распознавании и транслокации гормона принимают участие мембраны субклеточных органелл; 4) в превращении химического гормонального сигнала в биологический ответ клетки-мишени первостепенное значение имеют процессы транскрипции и трансляции. Помимо классических тканей мишеней объектами действия эстрадиола и прогестерона являются практически все ткани и органы, которые различаются по плотности рецепторов и степени выраженности в них эффектов половых стероидов [22]. Иллюстрацией такому заявлению служит то, что гормонзаместительная терапия у женщин в постменопаузе носит выраженный остеопротекторный характер, значительно снижает риск развития кардио - васкулярных заболеваний и предупреждает развитие отдельных патологий ЦНС (болезнь Альцгеймера) [33, 55, 147]. Молекулы рецепторов эстрадиола и прогестерона выделены в 70-е годы. Клонирован рецептор эстрадиола в 1985 году [127] и рецептор прогестерона – в 1987г. [109]. Позже стало известно о гетерогенности рецепторов половых 31 стероидов. Так, различают РЭ и [77, 130] ПР – А и В [46, 74]. Отдельные участки рецепторной молекулы способны взаимодействовать с репортерным геном и индуцировать его транскрипцию [8]. Поэтому такие участки получили название транскрипционные активационные функциональные единицы (TAF или AF). AF-1 находится на N-конце рецептора прогестерона, AF-2 локализован на С-конце [107]. AF-3 обнаружен только у В-изоформы рецептора прогестерона в дополнительной аминокислотной последовательности N-конца [126]. Особенность AF-3 заключается в относительной автономности его активности – он самостоятельно работает как транскрипционный активатор или проявляет функциональный синергизм с AF-1 и AF-2. В некоторых клеточных и промоторных контекстах AF-1 и AF-2 могут функционировать независимо, но в большинстве случаев для полного транскрипционного ответа необходим функциональный синергизм обоих активационных участков [34]. После присоединения лиганда-агониста молекула стероидного рецептора претерпевает внутримолекулярное связывание AF-1 и AF-2 [139]. Когда в качестве лиганда выступает антагонист (мифепристон), взаимодействия двух функциональных доменов рецепторной молекулы между собой не происходит [7, 21]. Именно прямое взаимодействие AF-1 и AF-2 определяет полную активацию гормон-рецепторного комплекса. Указанный процесс протекает более интенсивно в ПР-В (за счет дополнительной аминокислотной последовательности) по сравнению с ПР-А, что по-видимому отражает значительно больший активационный транскрипторный потенциал ПР-В по сравнению с ПР-А [139]. РЭ и РП принадлежат к суперсемейству ядерных рецепторов NR. К этому суперсемейству помимо стероидных, тиреоидных и рецепторов витамина Д, относятся рецепторы ретиноидной кислоты (, , и κάππα ), 32 рецептор пролифератора пероксисом (PPARS) и целый ряд так называемых рецепторов-сирот (орфан-), лиганды для которых пока не идентифицированы [45, 63]. Линейное строение рецепторных молекул NR вне зависимости от их размеров стандартно включает в себя, по меньшей мере, четыре дискретных структурно-функциональных фрагмента (домена) – А/В, С, D, E. В некоторых случаях выявляется пятый фрагмент – домен F. Наиболее функционально значимыми и абсолютно необходимыми являются домены Е и С [9]. Рецепторы стероидов способны образовывать в среде с низкой ионной силой крупномолекулярные гетеромеры 8-9S формы [122]. Вне связи с лигандом рецептор прямо или опосредованно связан с различными вспомогательными белками (в настоящее время известно 8 таких белков) [122]. Hsp 90 – наиболее постоянный компонент белкового комплекса. Семь других белков это – hsp70, р60, р23, три больших иммунофиллина (FK506, FKBP52 и FKBP54) и циклоспорин А-связывающий протеин CyР40 [45, 81 121].Имеет место еще и трансцидентный компонент комплекса – протеин р48 [121, 122]. Белки теплового шока выполняют функцию шaперонов, способствуя правильному образованию надпервичных структур белковой молекулы после (в процессе) синтеза и поддерживая рецептор в неактивном состоянии. Связывание гормона с рецептором ведет к конформационным изменениям последнего [82]. последующим Такая модификация привлечением вызывает корегуляторов и каскад событий с активацией/репрессией транскрипции [68]. Взаимодействие стероида с рецептором вызывает димеризацию последнего. Впервые это было подтверждено in vivo [75] для рецептора прогестерона. Исходя из наличия двух форм рецептора прогестерона, логично предположить существование трех вариантов димеров А:А, А:В и В:В. Относительная концентрация каждой димерной пары прямо 33 пропорциональна уровню экспрессии ПР-А и ПР-В. Активированный димер связывается с ДНК через ДНК-связывающие домены и вызывает генную транскрипцию [144]. Активный транспорт рецепторов в ядро зависит от наличия в молекуле рецептора так называемых ядерных локализационных сигналов (NLS), являющихся короткими основными мотивами, богатыми аргинином и лизином. NLS узнается и связывается с NLS-связывающими протеинами, которые располагаются в непосредственной близости с ядерными порами и имеют идентификационную последовательность для узнавания, связывания и транспорта ПР и РЭ в ядро [41, 75, 124]. Стероид-рецепторный димер взаимодействует со специфической ДНК в регуляторной области гена-мишени. Такой cis-элемент был назван ГЧЭ – гормон - чувствительный последовательность 15 элемент. основных ГЧЭ пар представляет нуклеотидов. Их собой структура палиндромна. Одна молекула рецептора связывается с половиной сайта. Идентифицированы три класса ГЧЭ – прогестерон/глюкокортикоид чувствительный элемент, эстрадиол- и тиреоидответственные единицы. Последовательность прогестерон - чувствительного элемента ДНК идентична андрогенному и минералокортикоидному элементам. Несмотря на это, для каждого специфического рецептора требуются свои особенные условия для связывания со своим отвечающим элементом [28]. ГЧЭ с высоким сродством (Касс 10 8-11 моль/л) способны связывать гормон - рецепторные комплексы [42]. Универсальные минимальные структуры в составе ГЧЭ – консенсус последовательности - необходимы для узнавания гормон - рецепторных комплексов. Предполагают, что два сета минимальной структуры ГЧЭ обусловливают связывание гормон - рецепторного комплекса в его димерной форме, причем каждый сет 34 связывает мономер; этим обеспечивается кооперативность транскрипционного эффекта. Механизм, за счет которого взаимодействие рецептора с ДНК изменяет генную транскрипцию, до конца не выяснен. На первый план выходят белокбелковые взаимодействия с основными транскрипционными факторами или с промежуточными коактиваторами. Полученный в результате комплекс инициирует или блокирует транскрипцию через РНК - полимеразу II [111]. Стероидные рецепторы прямо изменяют скорость транскрипции, влияя на стабильность преинициального комплекса. Рецептор - активированная транскрипция находится под контролем различных кофакторов, которые усиливают или ослабляют эффект стероида [35]. Обычно, белковые факторы, выделенные из клеток-мишеней, взаимодействуют со стероидными рецепторами по лиганд - зависимому образу [71]. Избыточная экспрессия одного рецептора может ингибировать сигнал, индуцированный другим рецептором, так же связывающимся с соответствующим ГЧЭ. Это так называемый эффект протеста (squelching effect). Например, оверэкспрессия РЭ подавляет стимулирующее действие прогестерона на ген-мишень [51]. Еще одним важным аспектом регуляции функции рецепторов является фосфорилирование. Посттранскрипционная модификация рецептора является одним из механизмов саморегуляции активности рецепторной функции. Общий уровень фосфорилирования увеличивается во время лигандзависимой активации клетки [116]. Рецептор прогестерона фосфорилируется по трем остаткам серина (211, 260 и 530). Серины 211 и 260 относятся к А/В району, Серин 530 – к D-домену. Базальный уровень фосфорилирования серинов составляет 20, 20 и 2%, соответственно. При добавлении прогестерона он возрастает до 35, 35 и 35%. Указанное фосфорилирование не 35 является необходимым для процессов связывания, активации и даун регуляции РП, однако заметно модулирует активность рецепторной молекулы. Вопрос о механизмах терминации рецепторного цикла остается дискутабельным. Одним из механизмов обратимой терминации рецепторного цикла может быть инактивация рецептора с помощью дефосфорилирования. Фосфорилирование связывающую белка активность и быстро восстанавливает рециклизирует тем его самым гормонрецептор. Необратимая инактивация рецепторных белков осуществляется в результате их протеолиза по убикитин-протеосомному пути [102]. В конце 70-х и начале 80-х были охарактеризованы 2 изоформы рецептора прогестерона [74, 83]. Тонкие эксперименты позволили оценить физиологическое значение А- и В-типов РП [40]. Так, у животных, лишенных РП-А, (PRACO) на фоне нарушенной функции яичников и матки (некомпенсированная прогестероном пролиферация клеток), практически не страдают молочные железы и тимус. И, наоборот, у PRBCO-мышей (без РПВ) фертильность не нарушена (успешная беременность с нормальным количеством плодов) и, по мнению авторов, одних лишь рецепторов прогестерона-А достаточно, чтобы противостоять эстроген-индуцированной пролиферации тканей матки. Тип РП принципиально важен для развития и морфогенеза молочных желез, здесь доминирует РП-В [47]. РП-В имеет молекулярную массу 110-120 кДа и дополнительные 164 аминокислотные остатка на N-конце. ПР-А – 72-86 кДа. Обе изоформы кодируются единственным геном, но регулируются различными промоторами. У крыс и людей изоформы ПР имеют различные мРНК, тогда как у цыплят – они являются продуктами альтернативного процессинга мРНК [46, 74]. 36 Функциональные свойства изоформ рецептора прогестерона достаточно хорошо изучены в транскрипционных системах in vitro [130]. Несмотря на схожий аффинитет различных агонистов и антагонистов к изоформам РП, они реализуют различные функции: РП-В действует как транскрипционный активатор генов (например, вируса опухоли молочной железы, гена тирозинаминотрансферазы и тимидинкиназы) в различных клетках. РП-А – не активирует транскрипцию, a чаще действует как строгий репрессор транскрипционной активности, опосредуемой через РП-В и другие стероидные рецепторы (эстрогенов, глюкокортикоидов, минералокортикоидов и андрогенов) [129]. Различия в транскрипционной активности диктуются различиями в строении молекул отдельных изоформ РП. Рецептор имеет 3 активационнофункциональные единицы (фактора) – AF-1, 2 и 3 (рис.1.4). Рисунок.1.4 Структурная организация изоформ ядерных рецепторов прогестерона [65]. ПР-А IF AF-1 DBD AF-2 LBD ПР-В AF-3 IF AF-1 DBD AF-2 LBD Первые два фактора представлены в обеих изоформах, тогда как AF-3 есть только в ПР-В [66]. Более того, обнаруженный вблизи AF-1 37 ингибиторный фактор (IF), активен только в ПР-А. Это связано с тем, что IF ингибирует AF-1 и AF-2, но не AF-3, присутствующий исключительно в ПРВ [84]. Гомодимеры ПР-В проявляют большую связывающую способность к ДНК-последовательности, тогда как гетеродимеры А/В являются менее стабильными и менее эффективно связываются с ДНК [97]. Очевидно, что существует сложная коммуникационная сеть рецепторов стероидных гормонов и других путей сигнальной передачи. Стероиды регулируют систему вторичных посредников, которые, в свою очередь, регулируют транскрипционную активность стероидных рецепторов. Например, фосфорилирование может обеспечивать или препятствовать связыванию рецептора с ДНК. Прогестерон вызывает фосфорилирование Ser 294, медиируемое митоген активируемыми протеинкиназами (MAРKs). Такое фосфорилирование является сигналом для деградации рецепторной молекулы по убикитин-зависимому пути и включению в 26S-протеосомы. Следовательно, другой функцией фосфорилирования является проведение сигнала негативной регуляции прогестероном своего рецептора и медиируется MAРKs [65, 94]. Изоформы ПР имеют разную тканевую локализацию. Синтез изоформ РП регулируются разными эстроген-индуцированными промоторами. Повидимому, такое разнообразие путей проведения гестагенового сигнала в организме обеспечивает весь спектр биологической активности прогестерона. Направленный поиск лекарственных препаратов селективного действия необходим для дифференциальной фармакологической коррекции состояний, в патогенезе развития которых предоминирует одна из изоформ рецептора прогестерона (неоплазии, патологии ЦНС и др.). 38 1.4.2 Женские половые гормоны и иммунитет. Вопрос взаимосвязи иммунологических факторов и беременности остается актуальным для выяснения причин неуспеха ЭКО [24, 64]. Женские половые стероидные гормоны участвуют в нормализации иммунного ответа на всех стадиях беременности. Под влиянием прогестерона активируются лимфоциты и начинают вырабатывать белок – прогестерониндуцированный блокирующий фактор оказывает действие способствует антиабортивное и (ПИБФ), который сохранению беременности [64, 70]. Этот фактор вырабатывается CD56+ -клетками, находящимися на фетоплацентарной поверхности мембраны. Влияние ПИБФ отражается как на клеточных, так и на гуморальных иммунных механизмах. ПИБФ на клеточном уровне оказывает влияние на синтез цитокинов в лимфоцитах Т-хелперов. Прогестерон и релаксин стимулируют синтез ПП14 в эндометрии [135]. In vivo аллоантигенная и митогенная стимуляция вызывает увеличение уровня рецепторов прогестерона в лимфоцитах. Считается, что увеличение числа рецепторов прогестерона в этих клетках при беременности может быть связано с присутствием зародыша, который выступает в роли аллоантигенного стимулятора [123]. При нормально протекающей беременности происходит сдвиг в сторону увеличения Тх2 и продукции ими цитокинов при одновременном снижении Тх1. Этот механизм способствует сохранению беременности. В присутствии ПИБФ в активированных лимфоцитах вырабатывается в 8 раз больше цитокина Тх2 (ИЛ-2), чем в его отсутствие. Увеличение продукции цитокинов Тх2 влечет за собой повышение выработки иммуноглобулинов. При введении ПИБФ животным было отмечено появление новой подгруппы иммуноглобулинов – асимметричных антител. 39 Эти антитела способны связываться с антигенами, конкурировать с антителами той же специфичности и выступать в качестве «блокирующих» антител [20]. ПИБФ появляется в крови женщин с ранних сроков беременности, его концентрация нарастает, достигая максимума к 40 неделям беременности. Содержание ПИБФ резко падает после родов. При невынашивании беременности и вне беременности определяют низкие уровни ПИБФ в крови. Прогестерон – мощный ингибитор синтеза LIF, а эстрадиол – его стимулятор. Эстроген в плазме крови отражает уровень фолликулярного ИЛ1β и коррелирует с эффективностью трансфера эмбриона в программе ЭКО [101]. Мифепристон (антигестаген) повышает продукцию провоспалительных агентов – ИЛ-8, моноцит - хемотаксического пептида (MCP-1), циклооксигеназы-2 [7, 82]. Эстрогены стимулируют миграцию лейкоцитов в эндометрий, в основном за счет натуральных киллеров и макрофагов. Количество Т-клеток в эндометрии не зависит от уровня эстрадиола. При этом не меняется экспрессия хемокинов M-CSF и MCP-1, и уменьшается – ИЛ-8 в железах [29]. Кроме того, прогестерон стимулирует экспрессию α1β1 интегрина в эндометрии [99] а Е2 ингибирует синтез β3 субъединицы интегрина αv β3 в строме [86] . 1.5 Заключение. Очевидно, что строго координированный гормональный контроль функции как эндометрия, так и иммунокомпетентных клеток является абсолютно необходимым условием успешной имплантации. В свою очередь, способность клеток адекватно отвечать на гормональный сигнал зависит от 40 представленности соответствующих рецепторов в клетках-мишенях. В литературе имеются скудные данные о рецепции женских половых стероидов в эндометрии и отдельных фракциях клеток белой крови при имплантации [29]. При этом представленные данные весьма противоречивы и носят преимущественно качественный характер. Следовательно, изучение рецепторного статуса клеток мононуклеарной фракции крови, а так же эндометрия, необходимо для выяснения тонких механизмов контроля имплантации и ее нарушения при разных вариантах женского бесплодия. Такое исследование эффективности позволит программы выявить ЭКО, в дополнительные то время как предикторы поиск способа персонализации гестагенной поддержки первого триместра, поможет снизить риск самопроизвольных беременность. выкидышей и сохранить долгожданную 41 Глава 2. Материалы и методы. 2.1. Характеристика клинического материала. В исследование вошли 50 женщин от 26 до 39 лет, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения. Все пациентки наблюдались на базе отделения ЭКО (зав. Отделением ЭКО КДО – врач высшей категории Лебедева Е.Г.) Центра Планирования и Репродукции Семьи (главный врач центра – главный акушер – гинеколог г. Москвы, д.м.н. профессор, чл. – корр. РАМН Курцер М.А.). Условиями включения в исследование явилось отсутствие у пациенток тяжелой соматической патологии и выраженных метаболических нарушений, а также бесплодный брак. Пациенток ретроспективно разделили на 2 группы в зависимости от результатов лечения: в I группу вошли 28 пациенток с наступившей беременностью, во II – 22 пациентки с безуспешной попыткой ЭКО и ПЭ. Дальнейший анализ результатов проведенных исследований проводился по группам. I группа (пациентки с наступившей беременностью). Возраст пациенток I группы составил 26-38 лет, средний возраст – 32,8±3,5, года медиана – 33,5 года. Индекс массы тела (ИМТ) или индекс Кетле большинства пациенток был менее 26 кг/м2, лишь у 3-х пациенток (11%) ИМТ находился в пределах 26-30 кг/м2. Менархе у всех паценток установилось своевременно – с 11 до 14 лет, в среднем в 12,4±0,2 лет. Длительность менструального цикла составила от 27 до 33 дней, в среднем – 28,6±1,2 дней, длительность менструации от 4 до 7 дней, в среднем – 5,4±0,9 дней. У всех пациенток отмечался регулярный менструальный цикл, отклонений гормональных показателей от нормы не выявлено. У 7 женщин I группы (25%) бесплодие было первичное, вторичное бесплодие встречалось у 21 пациентки (75%). 42 В репродуктивном анамнезе 3-х пациенток (10,7%) беременности в данном браке уже завершались родами. В 2-х случаях беременности наступили самопроизвольно и завершились срочными родами и рождением доношенных здоровых детей. В 1-м случае беременность наступила после 3й попытки ЭКО и ПЭ и преждевременные роды произошли путѐм экстренного кесарева сечения, ребѐнок родился недоношенным и в последствии страдал детским церебральным параличом. У 8 (28,6%) пациенток данной группы в анамнезе был искусственный аборт. У 6 женщин (21,6%) в анамнезе был самопроизвольный выкидыш, у одной пациентки это произошло дважды. У 7 пациенток (25%) в анамнезе были внематочные беременности, у 2-х из них – два раза. Длительность бесплодия варьировала в диапазоне от 1 до 19 лет. Оперативные вмешательства по поводу трубно-перитонеального бесплодия (в 16 случаях) или наружного генитального эндометриоза (в 7-ми случаях) перенесли большинство пациенток – 19-ти из 28 пациенток (68%). У 18 пациенток (64%) – трубно-перитонеальный фактор, причем у 13 пациенток (46%) он был единственной причиной бесплодия. Абсолютный трубный фактор, т.е. отсутствие обеих маточных труб встречался у 7 пациенток (25%) данной группы. У 6 пациенток I группы (21%) бесплодие было связано с мужским фактором, из них у 3-х данный тип сочетался с трубным фактором или эндометриозом в анамнезе. У 6 пациенток (21%) были выявлены два или более факторов бесплодия. У 7 пациенток (25%) был наружный генитальный эндометриоз I-III стадии в анамнезе, являющийся единственным фактором бесплодия. У 4-х пациенток (14%) бесплодие было неясного генеза. 5 пациенток (18%) находились в позднем репродуктивном возрасте, т.е. от 37 до 39 лет. 16 пациенток (57%) вступали в 1-ую попытку ЭКО, 7 (25%) – во 2ую, 3 (10,7%) – в 3-ю, 1 (3,65%) – в 4-ю и 1 (3,65%) – в 5-ю. При УЗИ органов малого таза у большинства пациенток не было выявлено патологии яичников и матки. У 2-х пациенток (7%) были признаки 43 аденомиоза и хронического эндометрита. У 1-й пациентки по данным УЗИ была диагностирована миома матки с интерcтициально-субсерозным расположением единственного узла диаметром 25 мм. У 4-х пациенток (14%) был снижен овариальный резерв яичников – количество антральных фолликулов в каждом было менее 5, что предполагало бедный ответ на стимуляцию суперовуляции. II группа (пациентки с не наступившей беременностью). Возраст пациенток II группы составил от 27 до 39 лет, средний – 34,3±3,3 года, медиана – 35,5 лет. ИМТ или индекс Кетле большинства пациенток был до 26 кг/м2, лишь у 3-х пациенток (14%) ИМТ был в пределах 26-30 кг/м2. ИМТ в среднем составил 24,1±0,86 кг/м2. Менархе у всех установилось своевременно: с 12-14 лет, в среднем в 12,2±0,3 лет. Длительность менструального цикла составила от 26 до 35 дней, в среднем – 28,6±2 дней, длительность менструации от 4 до 7 дней, в среднем – 5,5±0,8 дней. У всех пациенток отмечался регулярный менструальный цикл, отклонений гормональных показателей от нормы не было выявлено. Также не было выявлено клинических признаков гиперандрогении. У 7 женщин II группы (31,8%) бесплодие было первичное, вторичное бесплодие встречалось чаще – у 15 пациенток (68,2%). В репродуктивном анамнезе 2-х пациенток (9%) естественные беременности уже завершались родами и рождением доношенных здоровых детей. У 6 пациенток (27%) данной группы в анамнезе был искусственный аборт. У 4 женщин (18%) в анамнезе был самопроизвольный выкидыш, у одной пациентки это случилось дважды. У 5 пациенток (23%) в анамнезе были внематочные беременности, у 1-й из них – два раза. Длительность бесплодия варьировала в диапазоне от 2 до 15 лет. Оперативные вмешательства по поводу трубно-перитонеального бесплодия 44 (в 11 случаях) или наружного генитального эндометриоза (в 3-х случаях) были произведены большинству пациенток – 14-ти из 22 (64%). У 14 пациенток (64%) – трубно-перитонеальный фактор, причем у 10 (45%) он был единственной причиной бесплодия. Абсолютный трубный фактор, т.е. отсутствие обеих маточных труб как следствие двусторонней тубэктомии по причине трубных беременностей в анамнезе встречался у 4 пациенток (18%) данной группы. У 5 пациенток II группы (23%) бесплодие было связано с мужским фактором из которых у 1-й (4,5%) мужской фактор сочетался с трубным фактором. У 2 пациенток (9%) были выявлены 2 фактора бесплодия. У 3 пациенток (14%) был наружный генитальный эндометриоз IIII стадии в анамнезе, являющийся единственным фактором бесплодия у 2-х женщин. У 2-х пациенток (9%) бесплодие было неясного генеза. 6 пациенток (27%) были позднего репродуктивного возраста, т.е. от 37 до 39 лет. 11 пациенток (50%) вступали в 1-ую попытку ЭКО, 5 (23%) – во 2-ую, 2 (9%) – в 3-ю, 2 (9%) – в 4-ю, 1 (4,5%) – в 5-ю и 1 (4,5%) – в 6-ю. При УЗИ органов малого таза у пациенток этой группы не было выявлено патологии яичников и матки. У 4-х пациенток (18%) был снижен овариальный резерв яичников – количество антральных фолликулов в каждом было менее 5, что предполагало бедный ответ на стимуляцию суперовуляции. Анализ анамнестических данных всех исследованных пациенток без распределения их на группы по наличию имплантации показал, что возраст пациенток составил в среднем 33,08 ± 3,4 года. Большее количество женщин, включенных в исследование, относится к позднему репродуктивному возрасту, тогда как к репродуктивному возрасту относятся - 44% исследуемых. Дальнейший анализ анамнестических данных показал, что пациентки также могут быть разделены на группы по фактору бесплодия, количеству 45 попыток ЭКО, наличию или отсутствию синдрома гиперстимуляции яичников и длительности бесплодия. Таблица 2.1. Анализ частоты распределения пациенток по данным анамнеза (количество пациенток (%)). тип первичное 13 (26%) бесплодия вторичное 37 (74%) трубный 28 (56%) фактор неясный 7 (14%) бесплодия мужской 10(20%) сочетанный 5 (10%) количество одна 28 (56%) попыток две и более 22 (44%) синдром есть 11 (22%) гиперстимуляции яичников нет 39 (78%) длительность До 2 лет 15 (30%) бесплодия более 2-х лет 35 (70%) По представленным в таблице данным видно, что количество пациенток с первичным бесплодием - 13 (26%), тогда как с вторичным, при наличии в анамнезе одной или нескольких беременностей, закончившихся родами, абортом или внематочной беременностью, после чего беременность не наступала в течение двух и более лет - 37 (74%) пациенток. Наиболее частой причиной бесплодия у всех пациенток, вступивших в программу ЭКО, оказалась непроходимость маточных труб (абсолютная или относительная) - 28 (56%) пациенток; у 10 пациенток (20%) бесплодие было 46 связано с мужским фактором; сочетанная форма у 5 пациенток (10%), бесплодие неясного генеза - у 7 женщин (14%). По количеству проведенных попыток ЭКО пациентки были разделены на 2 группы, к группе с одной попыткой относятся 28 (56%) исследуемых, а к группе с двумя и более попытками - 22 (44%) женщин. По наличию синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ), пациентки были разделены на группу с СГЯ – 11 (22%) пациенток, и без СГЯ – 39 (78%) женщин. В результате индивидуальной реакции пациенток на гиперстимуляцию ячников и возникновение побочного эффекта в виде СГЯ. К группе с длительностью бесплодия до 2-х лет относятся 15 (30%) исследуемых пациенток, а в группу с длительностью бесплодия более 2-х лет включены 35 (70%) женщин. 27 пациенток вступали в 1-ую попытку ЭКО, 12 – во 2-ую, 5 – в 3-ю, 3 – в 4-ю, 2 – в 5-ю и 1 – в 6-ю. Все пациентки подписали информированное согласие на участие в исследовании. 2.2. Лабораторное оборудование и используемые химические реактивы. 1) Лабораторное оборудование: Центрифуга с охлаждением РС-6 (Россия) Ультрацентрифуга UP-65M (Германия) Жидкостной сцинтилляционный радиометр SL-30 Intertechnique (Франция) Спектрофотометр СФ-46 (Россия) Микроразмельчитель тканей РТ-2 (Россия) рН-метр Checker (США) Проточный цитофлюориметр-сортер FACSAria (Becton Dickenson Co) 47 Стерильные пипетки на 5 мл Эппендорфы стерильные на 1,5 и 0,2 мл Пипетки на 1000, 200 и 10 мкл Насадки для микропипеток на 1000, 200 и 10 мклс/без аэрозольного барьера Вортекс microspin FV-2400 (BioSan, Латвия) Микроцентрифуга eppendorf mini spin (Eppendorf, Германия) Термостат Гном (ДНК-Технология, Россия) Прибор iCycler iQ5 real-time PCR (BioRad, Германия) Плоскодонные и круглодонные 96-луночные планшеты («Медполимер», Россия) 2) Химические реактивы: ТЭД-буфер рН 7,4 (10 мМ трис-аминометан («Merck», Германия), 1,5 мМ ЭДТА («Sigma», США), 0,5 мМ дитиотрейотол («Calbiochem», Англия)) 3 Н-Р4 («Amersham», Англия) 3 Н-Е2 («Amersham», Англия) Прогестерон («Merck», Германия) Диэтилстильбэстрол («Merck», Германия) Гидрокортизон («Merck», Германия) Дидрогестерон («Serva», Германия) Активированный уголь (Norit А («Serva», Германия)) Сцинтилляционная жидкость: 0,2 мг РОРОР (1,4-бис-2-метил-5- фенилоксизалилбензол, «Serva», Германия); 5 мг РРО (2,5-дифенилоксазол, «Serva», Германия); 750 мл диоксана; 250 мл толуола Стеклянные фильтры Whatman GF/B 48 Для проточной цитофлюориметрии: изотипические антитела («Becton Dickenson Co»); mous-a-human CD-3 FITS, mous-a-human CD-19 APS, mous-a-human CD-14 Pe-Cy5 («Becton Dickenson Co»), PBS - буфер («Becton Dickenson Co»), 2% р-р параформальдегида. Раствор Хэнкса («ПанЭко», Россия) Раствор Фиколла-урографина, ρ=1,077 г/см3 («ПанЭко», Россия) Для ПЦР-РТ: реактивы "Реакционной смеси 2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I" («Синтол», Россия) Наборы реагентов для выделения мРНК «Рибо-преп» (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) Получение кДНК на матрице мРНК «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) Праймеры для полимеразной цепной реакции («Синтол», Россия) 2.3. Методы исследования. Все пациентки прошли клинические обследования в Центре Планирования Семьи и Репродукции, на базе отделения ЭКО, врач Клименко Мария Петровна, и были включены в программу экстракорпорального оплодотворения по стандартному длинному протоколу. 2.3.1 Клинические методы исследования Анамнез: Из анамнеза жизни пациенток особое внимание уделяли отягощѐнности преморбидного фона. Изучали: А) возраст и состояние здоровья родителей при рождении пациентки, особенности течения беременности и родов у матери, наличие у родственников эндокринно-обменных и бесплодия и не вынашивания беременности; онкологических заболеваний, 49 Б) перенесенные в т.ч. инфекционные заболевания, наличие вредных привычек, резкого колебания массы тела, наличие хронических соматических заболеваний; В) становление и регулярность менструаций, их длительность, обильность и болезненность Г) репродуктивная функция – уточняли характер бесплодия, при вторичном бесплодии уточняли количество беременностей, их количество, хронология, исходы и осложнения Д) гинекологические заболевания, перенесенные специфические инфекции, частота, длительность, методы и эффективность лечения. Стандартные клинические методы исследования: У обоих супругов определяли группу крови и резус-фактор, производили анализ крови на ВИЧ, RW, HBs и HCV. Пациенткам также назначали общий анализ мочи, клинический и биохимический анализ крови, коагулограмма, определение антител к инфекциям TORCH-комплекса. Исследовали мазки на флору из цервикального канала и влагалища, а также проводили скрининговое исследование цитологических мазков из экто- и эндоцервикса. При выявлении кандидоза, бактериального вагиноза проводили предварительное лечение. Инструментальные методы: Из инструментальных флюорографию ультразвуковое и методов всем электрокардиографию, исследование органов пациенткам а малого также таза проводили скрининговое в первую фазу менструального цикла. УЗИ проводили при помощи УЗ-аппарата «Siemens» 50 (Германия) с использованием трансвагинального датчика с частотой 7,5 МГц и трансабдоминального датчика с частотой 3,5 МГц. В ходе стимуляции овуляции проводили УЗ-мониторинг за ростом фолликулов и эндометрия. УЗ диагностику наличия беременности осуществляли на 20-23-й день после ПЭ. При этом в полости матки выявляли одно или два плодных яйца, а в яичниках – множество желтых тел, как следствие стимуляции суперовуляции. УЗ определение сердцебиения плода осуществляли при сроке беременности 6-7 акушерских недель. На 20-22 день менструального цикла проводили пайпель-биопсию эндометрия (у 31 пациентки, т.е. у 62%, у остальных данная процедура оказалась технически невыполнимой). Материал сразу же замораживали для последующего определения РЭ и РП. В этот же день производили забор венозной крови из кубитальной вены с последующим определением уровня эстрадиола, прогестерона и уровня рецепторов на клетках МНФ (контрольная точка). Дополнительно забор крови для определения уровня рецепторов на клетках МНФ осуществляли также в день забора яйцеклеток (2-я точка определения) и в день трансфера эмбрионов в полость матки (3-я точка определения). Определение уровня гормонов в плазме крови. На 2-4 дни менструального цикла в крови пациенток натощак определяли следующие гормональные показатели: ФСГ, ЛГ, эстрадиол, прогестерон, ТТГ, пролактин, тестостерон. Определение концентрации ФСГ, ЛГ, пролактина, тестостерона, хемилюминесцентным прогестерона методом с и эстрадиола помощью проводили автоматизированной аналитической системы ― Immulite 2000‖ производства фирмы «Siemens Healthcare Diagnostics Inc.» (США). 51 Метод лечения – стандартный длинный протокол с аГнРГ. Предварительную десенситизацию гипофиза проводили агонистом гонадотропин-релизинг-гормона (аГнРГ) трипторелином – диферелином фирмы ― Beaufour Ipsen International‖, Франция (диферелин 3,75мг однократно или 0,1мг ежедневно подкожно). Применение аГнРГ приводит к временной блокаде выработки гонадотропинов гипофизом, что, соответственно, влечѐт за собой обратимое угнетение функции яичников. Механизм действия аналогов гонадолиберина на репродуктивную систему заключается в их прочном связывании с рецепторами гонадолиберина в гонадотрофах гипофиза, что приводит сначала к кратковременной активации, а затем угнетению секреции гонадотропинов [25]. В результате возникает состояние десенситизации гипофиза и наступает временная фармакологическая кастрация. После контроля УЗИ в начале менструального цикла, через 10-14 дней десенситизации аГнРГ начинали cтимуляцию суперовуляции препаратами гонадотропинов, рекомбинантными (фоллитропином альфа – гонал Ф фирмы ― Merck Serono‖, Швейцария, а также фоллитропином бета – пурегон фирмы ― Organon‖, Нидерланды) или мочевыми (менотропинами – менопур фирмы ― Ferring‖, Германия) в дозах от 100 до 300 МЕ на фоне продолжающегося ежедневного подкожного введения диферелина 0,1мг в половинной дозе, т.е. по 0,05мг. В ходе стимуляции суперовуляции проводили ультразвуковой мониторинг за ростом фолликулов и эндометрия. На 6-8 день стимуляции, а далее через 2-3 дня исследовали диаметр растущих фолликулов. Критерием окончания стимуляции фолликулогенеза являлись следующие параметры: размер лидирующих фолликулов 18-23 мм, толщина эндометрия не менее 8-9 мм. При достижении вышеуказанных параметров назначали ― овуляторную‖ дозу хорионического гонадотропина 10000 МЕ (прегнил фирмы ― Organon‖, Нидерланды). Поддержка лютеиновой фазы всем пациенткам назначали 52 одинаковую: микронизированный прогестерон (утрожестан фирмы ― Besins‖) 600 мг/сут в 3 приема интравагинально до результата на ХГЧ, в случае наступления беременности – еще, как минимум, 2 недели. Данный протокол применялся во всех 50 случаях. Трансвагинальная пункция и аспирация преовуляторных ооцитов проводили через 35-36 часов после инъекции ХГЧ. Пункцию производили в амбулаторных условиях, на гинекологическом кресле с помощью ультразвукового аппарата фирмы ― Bruel & Kier‖ (Дания). На влагалищный датчик надевали специальный адаптер для фиксации иглы. Пукцию проводили под контролем ультразвуковой картины на мониторе одноразовыми пункционными однопросветными иглами фирмы ― Wallace‖ (Великобритания), аспирационной соединенными системой. На проводниками экране монитора с автоматической направление иглы определялось специальной пунктирной линией. С помощью фолликулярную вакуумного жидкость отсоса, под аспирировали давлением в 20 стерильные мм рт.ст. флаконы. Полученную фолликулярную жидкость передавали эмбриологу с целью идентификации ооцитов, их отбора и последующего оплодотворения, а также дальнейшего культивирования полученных эмбрионов. Преовуляторные ооциты помещали в питательную среду для культивирования, в специальный инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия при 5% СО2 в воздухе и с влажностью до 95%. Сперму мужа подвергали специальной обработке – центрифугированию, флотированию для увеличения подвижности сперматозоидов путѐм очистки от лейкоцитов и неподвижных сперматозоидов. После 4-5 часов инкубации производили инсеминацию ооцитов сперматозоидами из расчѐта не менее 50000 в 1 мл. Далее в течение 2-5-ти 53 дней проводили культивирование эмбрионов до стадий раннего эмбриогенеза. Перенос эмбрионов в полость матки осуществляли через 48-120 часов после начала культивирования in vitro. Перенос выполняли в амбулаторных условиях в операционной на гинекологическом кресле. Условия инкубации эмбрионов при этом были одинаковы для всех пациенток исследования. Одной пациентке переносили до 3-х эмбрионов под контролем УЗИ абдоминальным датчиком аппарата фирмы ― Bruel & Kier‖ (Дания). Эмбрионы на стадиях 2-10 бластомеров или на стадии бластоцисты набирали в специальный стерильный одноразовый катетер (мягкий катетер фирмы ― Wallace‖, Великобритания или ― Labotech‖, Германия). При невозможности пройти цервикальный канал мягким катетером использовали наборы Set TDT фирмы ― C.C.D. International‖, Франция. Эмбрионы в катетере с минимальным количеством среды (10-15 мл) вводили через цервикальный канал и переносили в середину полости матки. 2.3.2. Определение уровня цитозольных рецепторов половых стероидов в эндометрии. А) Получение цитозольной фракции из ткани эндометрия. Образцы эндометрия измельчали ножницами, а затем в микроразмельчителе тканей РТ-2 при 3000 об/мин в течение 5-ти минут с 3-х секундным перерывом через каждые 5 секунд, в 5-6 объемах ТЭД-буфера рН 7,4, содержащего 10% глицерина. Гомогенат центрифугировали в течение 15 минут при 1500 g на центрифуге РС-6. Из супернатанта получали цитозольную фракцию, центрифугируя пробы при 105000 g в течение 60 минут, в которой определяли содержание цитозольных рецепторов прогестерона и эстрадиола (ультрацентрифуга UP-65M). Супернатант, представляющий собой цитозольную фракцию, осторожно сливали. Все операции проводили в температурном режиме 0-40С. 54 Б) Определение белка в цитозольной фракции. Белок определяли методом Lowry [104]. В качестве стандарта использовали БСА. В) Определение связывания прогестерона (3Н-Р4) и эстрадиола (3Н-Е2) в цитозольной фракции эндометрия. Определение рецепторов прогестерона и эстрадиола в цитозольной фракции проводили радиолигандным методом [2]. Для определения общего связывания пробы содержали 20 мкМ 3Н-Р4 и 1мМ гидрокортизона или 5 мкМ 3 Н-Е2 в исследуемой фракции ткани. Для определения неспецифического связывания пробы дополнительно содержали 3 мМ прогестерон и 1 мМ диэтилстильбэстрола соответственно, стероиды вносили в пробирки в виде спиртового раствора. Этанол, после раскапывания, испаряли в токе азота. Затем для определения связывания прогестерона добавляли исследуемую фракцию ткани (цитозольная фракция 1-5 мг белка/мл), тщательно встряхивали и инкубировали 2 часа, после чего добавляли 100 мкл ТЭД - буфера с 50% глицерином, встряхивали и инкубировали еще 2 часа. После чего добавляли по 200 мкл суспензии активированного угля, тщательно встряхивали и инкубировали 30 минут. Затем пробы центрифугировали в течение 15 минут при 1500 g и 200 мкл надосадочной жидкости из каждой пробы помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости для радиометрирования. Для определения связывания эстрадиола добавляли исследуемую фракцию ткани (цитозольная фракция 1-5 мг белка/мл), тщательно встряхивали и инкубировали 18-20 часов, после чего добавляли по 100 мкл суспензии активированного угля, тщательно встряхивали и инкубировали 15 минут. Затем пробы центрифугировали в течение 15 минут при 1500 g и 100 мкл надосадочной жидкости из каждой пробы помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости для радиометрирования. Все исследования проводили в триплетах. 55 Связывание стероидных гормонов в цитозоле выражали в фемтомолях гормона, связанного одним мг цитозольного белка. Эту величину рассчитывали по формуле 1: N = (T-NSB)*К/(2,22хАхC), где N – специфическое связывание (фемтомоль/мг белка цитозоля); Т - средняя величина общего (в отсутствии конкурента-избыточного количества немеченого гормона) связывания меченого гормона в имп/мин., регистрируемых -радиометром; NSB - средняя величина неспецифического (в присутствии конкурентаизбыточного количества немеченого гормона) связывания в аналогичной аликвоте в имп/мин., регистрируемых -радиометром; К - коэффициент, учитывающий разведение пробы суспензией угля и эффективность счета -радиометра; 2,22-коэффициент пересчета из имп./мин, регистрируемых - радиометром, в Ci /mmol; А - удельная радиоактивность 3Н-стероида в Ci/mmol С - концентрация белка в аликвоте в мг/мл. Г) Жидкостная сцинтилляционная радиометрия. В основе метода лежит свойство -частиц вызывать сцинтилляцию веществ в специальных средах. Это дает возможность с большой эффективностью регистрировать -излучение, обладающее малой энергией. Для регистрации радиоактивности 200 мкл образца помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости. Смесь перемешивали, и радиоактивность образца регистрировали на жидкостном сцинтилляционном радиометре SL30 Intertechnique. Эффективность счета для 3Н составила 50-55%. 56 2.3.3. Определение уровня рецепторов половых стероидов в МНФ клеток периферической крови. А) Выделение мононуклеарной фракции крови по методу Boyum [39]. Кровь с гепарином (10 мл) разводили таким же количеством раствора прозрачного Хэнкса, т. е. в соотношении 1:1 (по обьему). Затем кровь с Хэнксом в объеме 5 мл наслаивали на 3 мл теплого раствора фиколла– урографина. Затем центрифугировали 45 минут при 2000 об/мин. После центрифугирования стерильной пипеткой отбирали фракцию мононуклеаров. Полученную фракцию переносили в чистую пробирку и доводили раствором Хэнкса до 10 мл. Далее центрифугировали 15 минут при 1600 об/мин. После чего сливали надосадочную жидкость и осадок доводили раствором Хэнкса до 10 мл, затем центрифугировали 15 минут при 1600 об/мин. Далее сливали надосадочную жидкость и получали суспензию МНФ, путем ресуспензирования осадка с остатками раствора Хэнкса. Все операции проводили в температурном режиме 0-40С. Клеточный состав выделенной фракции МНФ периферической крови оценивали с помощью проточной цитофлюориметрии Б) Определение специфического связывания прогестерона (3Н-Р4) и эстрадиола (3Н-Е2) в МНФ клеток периферической крови. Определение специфического связывания прогестерона и эстрадиола в мононуклеарной фракции проводили радиолигандным методом [2]. Для определения общего связывания пробы содержали 20 мкМ 3Н-Р4 и 1мМ гидрокортизона или 5 мкМ 3Н-Е2. Для определения неспецифического связывания пробы дополнительно содержали 3 мМ прогестерона или 1 мМ диэтилстильбэстрола соответственно, стероиды вносили в лунки 96луночного планшета в виде спиртового раствора. Этанол, после раскапывания, испаряли в токе азота. Затем добавляли исследуемую фракцию крови (0,5 – 1 млн/клеток на лунку) и инкубировали 60 минут для 57 определения связывания прогестерона и 30 минут – для эстрадиола, после чего по 100 мкл суспензии из каждой лунки помещали на стеклянные фильтры Whatman GF/B и промывали 100 кратным избытком ТЭД - буфера. Стеклянный фильтр из каждой пробы помещали во флаконы с 5 мл сцинтилляционной жидкости для радиометрирования. Все исследования проводили в триплетах. Связывание стероидных гормонов в МНФ выражали в фемтомолях гормона, связанного одним мкл фракции. Эту величину рассчитывали по формуле 1. В) Определение специфического связывания дидрогестерона в МНФ клеток периферической крови. Для оценки взаимодействия дидрогестерона с рецепторами прогестерона использовали мононуклеарную фракцию периферической крови в которой предварительно определяли содержание рецепторов прогестерона радиолигандным методом [2]. Величину специфического связывания дидрогестерона (9β, 10α - прегна 4, 6 - диен - 3, 20 – дион, «Serva», Германия) с рецепторами прогестерона (% ингибирования специфического связывания 3Н-прогестерона дидрогестероном) вычисляли по формуле 2 [26]: И = (В спец. преп./В спец. горм.)*100%, где И – ингибирование специфического связывания с рецептором 3 Н- прогестерона дидрогестероном, В спец. преп. – специфическое связывание 3 Н-прогестерона в присутствии избытка дидрогестерона; В спец. горм. – специфическое связывание 3Н-прогестерона в отсутствии дидрогестерона 58 Д) Метод проточной цитофлюориметрии (проточный цитофлюориметр сортер FACSAria (Becton Dickenson Co)). Окрашивание производили в пробирках типа Eppendorf объемом 1,5 мл по следующей схеме: Клетки (приблизительно 1 млн.) разбавляли в 100 мкл буфера для окрашивания. В каждую пробирку добавляли по 15 мкл меченых антител к одному из изучаемых поверхностных маркеров (анти-CD-3 к Т-лимфоцитам, анти-CD-19 к В-лимфоцитам, анти-CD-14 к моноцитам). В образцы, служащие отрицательным контролем, добавляли соответствующие изотипические антитела. Клеточную суспензию перемешивали несколько секунд на вихревой мешалке и инкубировали в холодильнике при температуре +4 оС в течение 60 минут. После инкубации клетки осаждали центрифугированием при 5000 об/мин в течение 4 мин. После удаления супернатанта, клетки отмывали 2 раза в 1 мл буфера для окрашивания. После удаления супернатанта клетки фиксировали в 0,5 мл 2% раствора параформальдегида и доводили конечный объем до 1 мл раствором PBS (натрий-фосфатный буфер). Полученную клеточную суспензию фильтровали через фильтр с диаметром пор 30 мкм для исключения клеточных агрегатов. 2.3.4. Выделение РНК из клинического материала. Выделение мРНК из клеток МНФК периферической крови проводили с помощью набора «Рибо-преп» (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя. А) Реакция обратной транскрипции. 59 Получение кДНК на матрице мРНК проводили с использованием комплекта готовых реагентов «Реверта-L» (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инстукции производителя. Б) Полимеразная цепная реакция в реальном времени (PCR-RT) для определения уровня экспрессии генов рецепторов эстрадиола и прогестерона с контрольным геном Gapdh. Для реакции использовали набор готовых реактивов для ПЦР в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I "Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I" на приборе iCycler iQ5 real-time PCR («Синтол» Россия). В качестве контрольного гена использовали ген Gapdh. Схема ПЦР-РТ: 1. Приготовление реакционной смеси на 12 реакций: смешать 117 мкл H2Oд, 117 мкл MIX-смеси, 13 мкл MgCl2, перемешать на вортексе, отобрать 19 мкл для контроля красителя. 2. Добавить по 24 мкл верхнего и нижнего праймеров (up и low), перемешать на вортексе, отобрать по 23 мкл для контроля праймеров (последовательности праймеров приведены в таблице 2.1.) 3. Разлить готовую реакционную смесь по 200 мкл эппендорфам. 4. Добавить в эппендорфы с готовой смесью по 2 мкл кДНК, тщательно перемешать и поставить в амплификатор. 5. Запустить программу амплификации: а) 1 цикл: 10:00 мин – 950С б) 2-40 циклы: 00:15 мин - 950С 6. Запустить программу плавления: a) 1 цикл: 01:00 мин – 950C 60 б) 2 цикл: 01:00 мин – 550С в) 3-84 цикл: 00:10 мин – 550 Таблица 2.1. Последовательности праймеров для определения экспрессии генов рецепторов прогестерона и эстрадиола в МНФК. Наименование рецептора m-ER Последовательности праймеров Up: agg-gac-aag-ctg-agg-ctg-ta Low: gtc-tac-acg-gca-ctg-ctg-aa ER-α Up: tgc-caa-gga-gac-tcg-cta-ct Low: ctg-gcg-ctt-gtg-ttt-caa-c ER-β Up: tca-gct-tgt-gac-ctc-tgt-gg Low: tgt-atg-acc-tgc-tgc-tgg-ac PR-A Up: aaa-tca-ttg-cca-ggt-ttt-cg Low: tac-agc-atc-tgc-cca-ctg-ac PR-B Up: gac-tga-gct-gaa-ggc-aaa-gg Low: cga-aac-tcc-agg-caa-ggt-gt PR-7 Up: tgc-cct-gct-gtg-tga-tct-ta Low: gat-agc-tga-ggc-tcc-tgg-at PR-1 Up: tgc-cct-gct-gtg-tga-tct-ta Low: gat-agc-tga-ggc-tcc-tgg-at Контрольный ген Gapdh Up: gaa-ggt-gaa-ggt-cgg-agt Low: gaa-gat-ggt-gat-ggg-att-tcc 61 Рисунок 2.1. Пример кривых амплификации кДНК ( Gapdh, m-ER, PR-A). Рисунок 2.2. Пример кривых плавления кДНК (Gapdh, m-ER, PR-A). Используя метод РТ-ПЦР было выявлено, что прогестерон связывается со следующими типами рецепторов: PR-B, PGRMC1, m-PR, PR-A, а эстрадиол с 62 рецепторами: m-ER, ER-β, ER-α. Указанные типы рецепторов, представлены в порядке убывания их активности. 2.4. Статистическая обработка результатов. Обработка результатов проводили с использованием статистического пакета Statistics 6.0. и GraphPad Prism 5. Для каждой из непрерывных величин приведены - среднее (М) и стандартное отклонение (CD) или медиана и верхняя и нижняя квартили в зависимости от типа распределения исследуемой величины. Гипотеза о нормальном распределении изучаемого показателя проверялись с использованием критерия Колмогорова - Смирнова. При сравнении групп пациентов по основным показателям, полученным при включении в исследование, в зависимости от характера распределений использовались U- критерий Манна-Уитни. Для статистического изучения связи между различными параметрами применялся непараметрический коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) [4]. метод - 63 Глава 3. Результаты собственных исследований. Все обследованные нами пациентки были ретроспективно разделены на 2 группы в зависимости от исхода вспомогательной репродуктивной технологии: в I группу вошли 28 пациенток с положительным исходом, во II – 22 пациентки с отсутствием имплантации в результате ЭКО и ПЭ. Дальнейший анализ полученных результатов проводили по этим группам. 3.1. Концентрация рецепторов половых стероидов в цитозоле эндометрия пациенток при первичном обследовании. Действие любого гормона реализуется через рецепторный аппарат ткани – мишени. Эндометрий является основным органом – мишенью для половых стероидов. Поэтому для оценки готовности эндометрия к имплантации можно исследовать эндометрий на предмет содержания в нем цитозольных рецепторов половых стероидов: эстрадиола и прогестерона. Результаты анализа рецепторного статуса эндометрия обследованных пациенток представлены в таблице 3.1. Таблица 3.1. Описательная статистика значений уровня цитозольных рецепторов эстрадиола и прогестерона в эндометрии у всех пациенток, включенных в программу ЭКО (фемтомоль/мг белка). Показатель Рецептор Рецептор прогестерона эстрадиола минимум 0,0 0,0 25% перцентиль 0,0 0,0 медиана 0,9 1,2 75% перцентиль 224,0 24,7 максимум 506,0 110,0 64 среднее 110,7 17,5 Стандартное отклонение 170,8 30,8 Стандартная ошибка 41,4 7,4 Нижняя граница доверительного 22,9 1,7 198,5 33,4 интервала 95% Верхняя граница доверительного интервала 95% Тест Колмогорова-Смирнова P -значение P<0,0001 P<0,0001 Нормальность распределения нет нет Приведенные в таблице данные свидетельствуют о том, что закон распределения отличен от нормального. Поэтому в данном случае необходимо использовать непараметрические методы статистической обработки данных. По общему мнению большинства исследователей широкий разброс показателей свидетельствует об активной динамике рецепторов прогестерона и эстрадиола в эндометрии даже в пределах одной фазы менструального цикла [37]. 3.1.1. Концентрация рецепторов половых стероидов в цитозоле эндометрия пациенток при первичном обследовании в зависимости от исхода программы ЭКО. Из общего числа пациенток (50 человек) нами выделена группа, состоящая из 31 женщины, у которых был получен биоптат эндометрия (пайпель) на 21 – 23 день менструального цикла для определения уровня цитозольных РП и РЭ. Получение биоптата эндометрия является травматичной и болезненной процедурой, что в ряде случаев является причиной отказа пациенток от нее. Также не всем пациенткам удаѐтся произвести данную процедуру в связи со спазмом внутреннего зева, стенозом или особенностями направления хода цервикального канала. 65 Результаты анализа плотности рецепторов в цитозоле эндометрия обследованных пациенток в зависимости от исхода программы ЭКО представлены на диаграмме 3.1. Диаграмма. 3.1. Уровень цитозольных рецепторов эстрадиола (РЭ) и прогестерона (РП) в эндометрии пациенток, включенных в цикл ЭКО в зависимости от успеха имплантации до начала лечения. 180 фемтомоль/мг белка 160 140 120 100 есть имплантация 80 нет имплантации 60 40 20 0 РП РЭ Анализ полученных данных показал, что у пациенток с успешной имплантацией уровень цитозольных рецепторов эстрадиола в ткани эндометрия до начала лечения был максимальным и равнялся 30,614,3 фемтомоль/мг белка цитозоля. У женщин с отсутствием имплантации средняя величина этого показателя была ниже и равнялась 9,39,3 фемтомоль/мг белка. Средняя концентрация рецепторов прогестерона в ткани эндометрия у пациенток с успешной имплантацией составляла 152,965,7 фемтомоль/мг белка, тогда как при ее отсутствии - 164,3107,4 фемтомоль/мг белка (р≥1). Индивидуальный анализ полученных данных показал, что у пациенток с успешной имплантацией частота встречаемости нулевых значений уровня 66 стероидных рецепторов в цитозоле эндометрия достоверно ниже по сравнению со второй группой: для РП - 37% против 57% (р≤0,05), для РЭ 12% против 42% (р≤0,01) Не удивительно, что это правило распространяется и на отрицательные по обоим рецепторам образцы эндометрия: 12% в первой группе (успех имплантации) против - 29% во второй (р≤0,01). Таким образом, окончательный анализ результатов нашего исследования не подтвердил гипотезу о достаточной информативности рецепции стероидов в эндометрии для прогноза успеха ЭКО. При этом, биопсия эндометрия является травматичной и болезненной процедурой, что в ряде случаев является причиной отказа пациенток от нее. Более того, массированная инфильтрация эндометрия иммунокомпетентными клетками в период имплантационного окна [52] позволяет переместить наше внимание на рецепцию женских половых стероидов именно в этих клетках. 3.2. Данные лабораторного исследования крови пациенток. 3.2.1. Общая картина крови. Результаты общего анализа крови у пациенток, включенных в наше исследование, представлены в таблице 3.2. Таблица 3.2. Общий анализ крови пациенток программы ЭКО. Показатель (ед. измерения) Общий анализ Нормативные крови пациенток показатели Эритроциты (х1012/л) 4,28±0,5 3,7-4,7 Лейкоциты (х1012/л) 6,36±1,2 4-9 Тромбоциты (х109/л) 229,25±31,2 180-320 Палочкоядерные клетки (%) 1±0,02 1-5 Сегментоядерные клетки (%) 59,3±3,4 45-70 67 Эозинофилы (%) 1,4±0,5 1-5 Базофилы (%) 0,5±0,03 0-1 Лимфоциты (%) 31,7±5,0 20-40 Моноциты (%) 6,1±0,9 2-10 Как видно из таблицы, состав крови пациенток находился в пределах референсных значений. Нами так же был проведен сравнительный анализ показателей клеточного состава крови пациенток I и II групп (таблица 3.3.). Таблица 3.3. Клеточный состав крови пациенток программы ЭКО до начала стимуляции в зависимости от успеха имплантации. Показатель (ед. измерения) I группа II группа Нормативные (сть (нет показатели имплантация) имплантации) Эритроциты (x1012/л) 4,270,31 4,380,32 3,7-4,7 Тромбоциты (x109/л) 24455,6 23129,2 180-320 Лейкоциты (x1012/л) 6,161,39 6,211,59 4-9 Палочкоядерные % 1,71,25 2,291,38 1-5 Сегментоядерные % 58,420,31 60,977,3 45-70 Эозинофилы % 1,70,92 1,51,5 1-5 Базофилы % 0,540,57 0,010,03 0-1 Моноциты % 6,262,5 4,270,31 2-10 Лимфоциты % 32,246,8 28,7411,35 20-40 68 Как видно из таблицы № 3.3., все показатели клинического анализа крови пациенток находятся в пределах нормы и не влияют на успех имплантации. 3.2.2. Результаты исследования состава МНФК периферической крови. Принимая во внимание, что основным объектом нашего исследования являлась мононуклеарная фракция периферической крови пациенток, нами был проведен индивидуальный анализ данной фракции на содержание В- и Т-лимфоцитов и моноцитов с помощью проточного цитофлюориметра сортера FACSAria (Becton Dickenson Co). Результаты проведенного исследования отражены в таблице 3.4. Таблица 3.4. Результаты анализа мононуклеарной периферической крови у пациенток, включенных в программу ЭКО. фракции 69 Из представленных результатов видно, что полученные данные не отличаются от нормативных показателей мононуклеарной фракции периферической крови пациенток. 3.2.3. Результаты исследования содержания гормонов в плазме крови у пациенток до лечения. Исследование гормонального статуса является обязательной процедурой для всех пациенток с бесплодием, в том числе включенных в программу ЭКО. Показатели гормонального статуса женщин, включенных в программу ЭКО до начала стимуляции суперовуляции представлены в таблице 3.5. Таблица 3.5. Показатели гормонального статуса без значений прогестерона и эстрадиола в плазме крови обследованных пациенток, включенных в программу ЭКО до начала стимуляции (21 - 23 день м.ц. 22±1). Исследуемый I группа (есть II группа (нет Нормативные Единицы гормон имплантация) имплантации) значения измерения n=28 n=22 ФСГ 7,2±1,6 7,4±1,9 2 – 12 мМЕ/мл ЛГ 5,5±1,3 5,0±1,4 0,61 – 16,3 мМЕ/мл ЛГ/ФСГ 0,78±0,2 0,75±0,4 0,3 – 1,4 мМЕ/мл ТТГ 1,7±0,6 1,8±0,62 0,4-4,2 мкМЕ/мл Пролактин 317±103 293±94 40-530 мМЕ/мл Тестостерон 2,2±0,9 2,2±0,8 0,7-4,13 нмоль/л 70 Исследования гормонального статуса пациенток на 21 - 23-й дни менструального цикла (до включения в программу ЭКО) показали, что уровни гонадотропинов, их соотношение, концентрация ТТГ, у всех женщин не выходили за пределы референсных значений. Уровень ФСГ в первую фазу менструального цикла колебался от 4,2 до 9,8 мМЕ/мл у пациенток I группы, от 3,2 до 9,9 мМЕ/мл - у пациенток II группы, составив в среднем в исследуемых группах 7,2±1,6 и 7,4±1,9 мМЕ/мл соответственно (p>0,05). Количество ЛГ в первую фазу менструального цикла у пациенток I группы варьировало от 3,2 до 8,2 мМЕ/мл, у пациенток II группы - от 2,2 до 8,6 мМЕ/мл, в среднем в исследуемых группах - 5,5±1,3 и 5,0±1,4 соответственно мМЕ/мл (p>0,05). Соотношение ЛГ/ФСГ колебалось от 0,58 до 1,53 у пациенток I группы, от 0,31 до 1,62 - у пациенток II группы, в среднем составив в исследуемых группах 0,78±0,2 и 0,75±0,4 соответственно (p>0,05). Уровень пролактина изменялся от 143 до 489 мМЕ/мл у пациенток I группы, от 130 до 437 мМЕ/мл- у пациенток II группы, в среднем в исследуемых группах составил 317±103 и 293±94 мМЕ/л соответственно (p>0,05). Содержание тестостерона составило от 1,1 до 3,82 нмоль/л у пациенток I группы, от 0,92 до 3,86 нмоль/л - у пациенток II группы, в среднем в исследуемых группах составив 2,2±0,9 и 2,2±0,8 нмоль/л соответственно (p>0,05). Уровень ТТГ изменялся от 0,82 до 2,86 мкМЕ/мл - у пациенток I группы, от 0,85 до 2,96 мкМЕ/мл - у пациенток II группы, в среднем в исследуемых группах этот показатель составил 1,7±0,6 и 1,8±0,6 мМЕ/л соответственно (p>0,05). 71 При сравнении уровней ФСГ, ЛГ, пролактина, тестостерона, ТТГ и соотношения ЛГ/ФСГ у пациенток обеих групп, достоверных различий между значениями данных параметров не выявлено (р>0,05), поэтому перечисленные параметры не могут рассматриваться в качестве кандидатов в маркеры прогноза успеха ЭКО. 3.2.3.1. Результаты исследования содержания прогестерона и эстрадиола в плазме крови пациенток в процессе лечения. Для динамического контроля за содержанием эстрадиола и прогестерона в плазме крови пациенток, включенных в программу ЭКО, нами выбраны три временные точки, привязанные к визитам пациенток в клинику: 1 точка (до стимуляции супеорвуляции) – 21-23 день м.ц., 2 точка (пункция фолликулов) – 13-15 день м.ц., 3 точка (перенос эмбрионов) – 17-18 день м.ц. Результаты проведенных клинических исследований содержания половых стероидов в плазме крови пациенток в динамике лечения отображены в таблице 3.6. Таблица 3.6. Концентрация половых стероидов в плазме крови пациенток в динамике лечения. гормон Эстрадиол (пикомоль/л) Прогестерон (наномоль/л) Соотношение эстрадиол/ точка цикла Контроль 447,1±14,7 43,7±4,7 прогестерон 10,2 Пункция 3984,686,0* 25,74,4* 155,0* 428,1±19,3* 10,7 Трансфер 4585,6±103,8* Нормативные значения Овуляторный пик Нрмативные значения 124,8-1468,4 1,53-5,47 0,23 99,1-903,1 3,0-66,8 10,5 72 II фаза м.ц. Примечание: * - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной точки (р≤0,001) Из представленных в таблице данным видно, что концентрация половых стероидов в периферической крови пациенток в контрольной точке (до начала стимуляции суперовуляции) находилась в пределах нормативных значений: уровень эстрадиола составил в среднем – 447,114,7 пикомоль/л с индивидуальными вариациями от 241,4 - 848,2 пикомоль/л, а прогестерона 43,74,7 пикомоль/л с колебаниями от 12,5 до 72,2 пикомоль/л. Соотношение показателей эстрадиол/прогестерон также не превышало нормы, составляя – 10,2. В день пункции концентрация эстрадиола в плазме крови пациенток в среднем равнялась 3984,686,0 пикомоль/л с вариациями от 591-11094 пикомоль/л, что практически в 9 раз выше по сравнению с контрольной точкой, содержание прогестерона в плазме крови составило 25,74,4 наномоль/л, с индивидуальными колебаниями от 6,65 до 62,3 наномоль/л, что в 1,7 раза ниже по сравнению с контрольной точкой. Уровень и эстрадиола и прогестерона превышали нормативные значения, соответственно эстрадиол в 5 раз, а прогестерон в 7 раз. Соотношение концентраций эстрадиол/прогестерон, превышало норму в среднем в 673 раза. В момент трансфера эмбриона в полость матки концентрация эстрадиола была выше нормативных значений практически в 46 раз и составляла 4585,6103,8 пикомоль/л, с индивидуальными вариациями от 742,2-12834,1 пикомоль/л, и в 10 раз выше, чем в контрольной точке. Концентрация прогестерона составляла 428,119,3 наномоль/л с колебаниями от 165,3 до 967,1 наномоль/л, что в 10 раз превышает значения 73 в контрольной точке, и в 9 раз нормативные значения. Соотношение концентраций гормонов практически не превышало норму. Диаграмма 3.2. Концентрация гормонов прогестерона и эстрадиола в плазме крови пациенток (до начала стимуляции, в день пункции и в день трансфера эмбриона). P4 E2 Примечание: - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной точки (p>0,05). Результаты детального анализа значений уровня половых стероидных гормонов в плазме крови обследованных пациенток в динамике по группам представлены в таблице 3.7. Таблица 3.7. Концентрация эстрадиола и прогестерона и их соотношение в плазме крови пациенток обеих групп в динамике цикла ЭКО. показатель Эстрадиол Прогестерон Соотношение (пикомоль/л) (наномоль/л) эстрадиол/прогестерон Трансфер Пункция Контроль 74 I гр. (есть 441184 3917 11,3 362189 3215 11,3 I гр. (есть имплантация) 45353092* 2617* 139,4 II гр. (нет 42122894* 2215* 179,7 46303860* 438 244* 13,4 4150 3640* 438244* 8,9 124,8-1468,4 1,5-5,4 0,23 99,1-903,1 3,0-66,8 10,5 имплантация) II гр. (нет имплантации) имплантации) I гр. (есть имплантация) II гр. (нет имплантации) Нормативные значения овуляторный пик Нормативные значения II фаза м.ц. Примечание: * - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной точки (p>0,05). Приведенные в таблице данные показали, что уровень эстрадиола при первичном обследовании в середине лютеиновой фазы колебался от 141 до 822 пм/л у пациенток I группы, от 127 до 848 пм/л - у пациенток II группы, составив в среднем в исследуемых группах 441184 и 362189 пм/л соответственно (p>0,05). Уровень прогестерона в первой точке, в середине лютеиновой фазы составил 2,6-63,7 нмоль/л у пациенток I группы, 4-58 нмоль/л у пациенток II группы, составив в среднем в исследуемых группах 3917 и 3215 нмоль/л соответственно (p>0,05). 75 Уровень эстрадиола в день пункции фолликулов пациенток изменялся от 734 до 11094 пм/л у пациенток I группы, от 826 до 12264 пм/л - у пациенток II группы, составив в среднем в исследуемых группах 45353092 и 42122894 пм/л соответственно (p>0,05). Уровень прогестерона в день пункции фолликулов пациенток составил 6,65-62,3 нмоль/л у пациенток I группы, 5,4-58,5 нмоль/л у пациенток II группы, составив в среднем в исследуемых группах 3617 и 3215 нмоль/л соответственно (p>0,05). Уровень эстрадиола в день трансфера эмбрионов колебался от 876 до 12164 пм/л у пациенток I группы, от 934 до 13164 пм/л - у пациенток II группы, составив в среднем в исследуемых группах 46303860 и 41503640 пм/л соответственно (p>0,05). Уровень прогестерона в день трансфера эмбрионов составил 154-820 нмоль/л у пациенток I группы, 94-760 нмоль/л у пациенток II группы, составив в среднем в исследуемых группах 438244 и 371194 нмоль/л соответственно (p>0,05). Таким образом, учитывая полученные результаты исследования гормонального статуса пациенток, можно сказать, что уровень исследованных гормонов и их соотношение, у всех пациенток, не был связан с исходом проведенного вспомогательной исследования репродуктивной показали, что технологии. Результаты гормональная стимуляция вызывает одинаковое увеличение концентрации гормонов в плазме крови у пациенток обеих групп, что соответствует литературным данным. Т.е. уровень половых гормонов не может служить надежным критерием успеха ЭКО. Дополнительный анализ гормонального статуса пациенток программы ЭКО показал отсутствие зависимости изученных параметров от возраста, регулярности менструального цикла, фактора и причины бесплодия. 76 3.2.4. Специфическое связывание прогестерона в МНФ клеток периферической крови. Известно, что мононуклеарные клетки крови находятся под гормональным контролем, т.к. в достаточном количестве экспрессируют рецепторы половых стероидов [42]. Анализ полученных данных показал, что средняя емкость связывания прогестерона в МНФК равнялась 4,25 0,87 фемтомоль/млн. клеток, с вариациями от 0,2 до 22,9 фемтомоль/млн.клеток. Результаты статистической обработки массива данных представлены в таблице 3.8. Эти результаты были проверены на нормальность распределения с помощью критериев Колмагорова-Смирнова. Таблица 3.8. Описательная статистика значений специфического связывания прогестерона в МНФ клеток периферической крови, всех пациенток включенных в программу ЭКО группы в зависимости от исхода ЭКО до начала стимуляции суперовуляции. Специфическое Показатель связывание прогестерона в МНФК (фемтомоль/млн кл) минимум 0,0 25% перцентиль 0,20 медиана 1,75 75% перцентиль 6,27 максимум 22,90 среднее 4,25 Стандартное отклонение 5,82 Стандартная ошибка 0,87 Нижняя граница доверительного интевала 95% 2,48 Верхняя граница доверительного интевала 95% 6,02 77 Тест Колмогорова-Смирнова KS distance 0,13 Р-значение Р<0,0001 Приведенные в таблице 3.8 данные свидетельствуют о том, что закон распределения в данной группе отличен от нормального. Поэтому в данном случае целесообразно использовать непараметрические методы статистического анализа. Емкость связывания прогестерона в МНФ клеток периферической крови пациенток включенных в программу ЭКО и статистическая обработка массива данных представлены на диаграмме 3.4 и в таблице 3.9. Таблица 3.9. Описательная статистика значений емкости связывания прогестерона в МНФ клеток периферической крови пациенток программы ЭКО в динамике цикла (фемтомоль/млн клеток). Показатель контроль пункция трансфер минимум 8,76 11,60 9,90 25% перцентиль 10,80 12,45 10,80 медиана 25,00 28,90 24,00 75% перцентиль 34,00 59,80 47,70 мaксимум 40,70 63,30 78,90 среднее 23,39 36,48 32,37 Стандартное отклонение 10,90 22,28 24,34 Стандартная ошибка 3,288 7,425 9,20 Нижняя граница доверительного 16,06 19,35 9,85 30,71 53,60 54,89 KS distance 0,13 0,16 0,16 Р-значение 0,0046 0,0036 0,0064 интевала 95% Верхняя граница доверительного интевала 95% Тест Колмогорова-Смирнова 78 Нормальность распределения нет нет нет Диаграмма. 3.4. Специфическое связывание прогестерона в МНФ клеток периферической крови пациенток программы ЭКО. 40 фемто моль/млн клеток 35 30 контроль 25 пункция 20 трансфер 15 10 5 0 Примечание: - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной точки ( р 0,005) Приведенные данные свидетельствуют о том, что введение пациенткам препаратов для суперовуляции вызывает изменение плотности рецепторов прогестерона в клетках периферической крови. Так, в день пункции фолликулов величина этого параметра увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контрольной точкой и составила в среднем 36,48 7,42 фемтомоль/млн.клеток с индивидуальными колебаниями от 4,3 до 63,4 фемтомоль/млн.клеток. А в момент трансфера равнялась 32,37 9,2 фетомоль/млн.клеток с изменениями от 1,1 до 78,9 фемтомоль/млн.клеток. 79 Достоверность различий в специфическом связывании прогестерона в МНФ клеток периферической крови в трех точках определяли, используя непараметрический критерий Манна-Уитни. Таким образом, введение пациенткам препаратов для стимуляции суперовуляции (агонисты гонадолиберинов в высоких дозах) вызывает у них увеличение специфического связывания прогестерона в МНФК МНФ клеток периферической крови. 3.2.5. Специфическое связывание эстрадиола в периферической крови пациенток включенных в программу ЭКО. В мононуклеарной фракции крови определяли специфическое связывание 3Н-эстрадиола-17-бета. Анализ полученных данных показал, что средняя концентрация РЭ в контрольной точке была минимальной и равнялась 2,72 0,54 фемтомоль/млн.клеток, с вариациями от 0,0 до 16,78 фемтомоль/млн.клеток. Полученные результаты были проверены на нормальность распределения с помощью критериев Колмогорова-Смирнова (таблица № 3.10): Таблица 3.10. Описательная статистика значений специфического связывания эстрадиола в МНФ клеток периферической крови пациенток включенных в программу ЭКО до начала стимуляции (фемтомоль/млн клеток). Специфическое Показатель связывание эстрадиола минимум 0,0 25% перцентиль 0,47 80 медиана 1,15 75% перцентиль 3,66 мaксимум 16,78 среднее 2,72 Стандартное отклонение 3,58 Стандартная ошибка 0,54 Нижняя граница доверительного интевала 95% 1,63 Верхняя граница доверительного интевала 95% 3,81 Тест Колмогорова-Смирнова KS distance 0,22 P-значение P<0,0001 Нормальность распределения нет Показания уровня значимости (P<0,0001) в обоих тестах свидетельствуют о том, что закон распределения в приведенном массиве данных отличен от нормального. Поэтому в данном случае целесообразно использовать непараметрические методы статистического анализа данных. Результаты исследования емкости связывания эстрадиола в МНФ клеток периферической крови пациенток в динамике цикла ЭКО, описательная статистка результатов представлены в таблице 3.11. и данные сравнительного анализа на диаграмме 3.5. Таблица 3.11. Описательная статистика динамики специфического связывания эстрадиола в МНФ клеток периферической крови пациенток включенных в программу ЭКО (фемтомоль/млн клеток). Показатель контроль пункция трансфер минимум 0,22 1,40 1,00 25% перцентиль 0,87 3,55 1,90 медиана 2,37 5,50 6,00 81 75% перцентиль 10,45 8,85 19,80 мaксимум 16,80 20,60 26,40 среднее 5,25 7,27 9,64 Стандартное отклонение 5,45 5,65 9,66 Стандартная ошибка 1,51 1,88 3,65 Нижняя граница доверительного интевала 95% 1,95 2,92 0,70 Верхняя граница доверительного интевала 95% 8,54 11,63 18,58 KS distance 0,23 0,27 0,2 P-значение 0,03 0,04 0,07 Нормальность распределения нет нет да Тест Колмогорова-Смирнова Показания уровня значимости по определению нормальности распределения свидетельствуют о том, что закон распределения в приведенном массиве данных отличен от нормального. Поэтому в данном случае целесообразно использовать непараметрические методы статистического анализа данных. Диаграмма. 3.5. Специфическое связывания эстрадиола в МНФ клеток периферической крови пациенток в динамике цикла ЭКО. 10 фемто моль/млн клеток 9 8 7 контроль 6 пункция 5 трансфер 4 3 2 1 0 82 Примечание: - значение статистически достоверно отличается от показателей контрольной точки (р 0,01). Специфическое связывание эстрадиола в МНФК имела тенденцию к увеличению при стимуляции суперовуляции. Так, в день пункции яйцеклетки величина этого параметра увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контрольной точкой и составила в среднем 7,28 1,8 фемтомоль/млн.клеток с индивидуальными колебаниями от 1,4 до 20,6 фемтомоль/млн.клеток, а в момент трансфера – практически в 2 раза и равнялась 9,64 3,65 фемтомоль/млн.клеток с изменениями от 1,0 до 26,4 фемтомоль/млн.клеток. Уровень различий в специфическом связывании эстрадиола в МНФ клеток периферической крови в трех точках достиг достоверности. Сравнительный анализ специфического связыванияполовых стероидов в МНФК в динамике (диаг. 3.4 и 3.5) продемонстрировал достоверное повышение (РП) и тенденцию к повышению (РЭ) плотности рецепторов половых стероидов, что не удивительно, так как первую (контроль) и вторую (забор ооцитов) точки разделяет введение высоких доз гонадотропинов, что как видно из приведенных данных, отражается не только на рецепторном профиле тканей репродуктивного тракта женщины, но и влияет на емкость связывания иммунокомпетентных клеток. Повышение емкости связывания рецепторов половых стероидов является признаком увеличения чувствительности клеток к стероидным сигналам, что необходимо для координации инициации и поддержки процесса имплантации. 3.2.6. Соотношение уровней специфического связывания прогестерона и эстрадиола в МНФ клеток периферической программы ЭКО в динамике лечения. крови пациенток 83 Статистический анализ значений соотношения РП/РЭ в МНФ клеток периферической крови пациенток включенных в программу ЭКО представлен в таблице 3.12. Таблица 3.12. Описательная статистика значений соотношения связывающей активности эстрадиола и прогестерона в МНФ клеток периферической крови пациенток включенных в программу ЭКО в динамике. Показатель контроль пункция трансфер минимум 0,66 3,00 0,80 25% перцентиль 1,62 3,27 1,20 медиана 3,64 7,10 2,20 75% перцентиль 22,21 10,53 41,50 мaксимум 33,78 11,50 47,70 среднее 10,96 7,06 14,21 Стандартное отклонение 11,95 3,56 20,86 Стандартная ошибка 3,45 1,26 7,88 Нижняя граница доверительного интевала 3,36 4,08 -5,08 18,55 10,04 33,51 KS distance 0,31 0,19 0,39 P-значение 0,002 P > 0,100 0,001 Нормальность распределения нет да нет 95% Верхняя граница доверительного интевала 95% Тест Колмогорова-Смирнова Показания уровня значимости в обоих тестах по определению нормальности распределения свидетельствуют о том, что закон распределения в приведенном массиве данных отличен от нормального. Поэтому в данном случае целесообразно использовать непараметрические методы статистического анализа данных. 84 Анализ полученных данных показал, что средняя концентрация РП/РЭ в контрольной точке равнялась 10,962 3,45, в день пункции яичников величина этого параметра составила в среднем 7,063 1,26, в момент трансфера – 14,241 7,8. При проверке на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Вилкса (таблица 3.12.): уровень значимости в контрольной точке р=0,011 и в день трансфера – р=0,001 свидетельствуют о том, что закон распределения в данных группах отличен от нормального. Диаграмма 3.6. Соотношение специфической связывающей активности прогестерона и эстрадиола в МНФ клеток периферической крови пациенток включенных в программу ЭКО в динамике. 16 14 12 10 контроль 8 пункция 6 трансфер 4 2 0 Примечание: - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной точки (р 0,05) 3.2.7. Специфическое связывание половых стероидов в МНФ клеток периферической крови у обследованных пациенток в зависимости от успеха имплантации. Учитывая основную цель нашего исследования – поиск критерия прогноза эффективности длинного протокола ЭКО, мы провели сравненение связывающей активности половых стероидов в МНФ периферической крови 85 с наличием или отсутствием имплантации в первую контрольную точку (до стимуляции). Таблица 3.13. Описательная статистика специфического связывания меченых стероидных гормонов с МНФК пациенток, включенных в программу ВРТ в зависимости от успеха имплантации Показатель Успешная Отсутствие имплантация имплантации фемтомоль/млн. клеток P4 E2 P4 E2 количество пациенток 28 28 22 22 минимум 0,0 0,0 0,0 0,0 25% перцентиль 0,83 0,56 0,0 0,17 медиана 2,04 1,15 0,90 1,54 75% перцентиль 7,10 4,16 4,15 3,60 мaксимум 22,93 16,78 16,71 11,88 среднее 4,77 2,79 3,32 2,59 Стандартное отклонение 5,96 3,82 5,65 3,22 Стандартная ошибка 1,12 0,72 1,41 0,80 Нижняя граница ДИ 95% 2,46 1,31 0,31 0,87 Верхняя граница ДИ 95% 7,08 4,28 6,33 4,30 Медиана уровня рецепторов прогестерона в МНФК у пациенток I группы (с наступившей в результате лечения беременностью) в середине лютеиновой фазы предшествующего ЭКО цикла составило 2,04 фемтомоль/млн клеток. В случае неудачной попытки ЭКО (II группа) данный параметр был в 2 раза ниже и составил 0,90 фемтомоль/млн.клеток, что оказалось статистически значимо ниже, чем в I группе (р=0,043). 86 Медиана уровня рецепторов эстрадиола в МНФК у пациенток I группы (с наступившей в результате лечения беременностью) в середине лютеиновой фазы предшествующего ЭКО цикла составило 2,79 фемтомоль/млн клеток. В случае неудачной попытки ЭКО (II группа) данный параметр составил 2,59 фемтомоль/млн. клеток, что оказалось статистически не отличимо от первой группы. Диаграмма 3.7. Специфическое связывание меченых стероидных гормонов с МНФК пациенток, включенных в программу ЭКО в зависимости от успеха имплантации. фемто моль/млн клеток 5 4 3 есть имплантация 2 нет имплантации 1 0 РП Примечание: РЭ - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной группы р=0,043 Анализ концентрации рецепторов стероидных гормонов в МНФК пациенток включенных в программу ВРТ в зависимости от успеха имплантации мы провели также с поправкой на внеэндометриальные причины отсутствия имплантации, в частности такого фактора, как «эмбрионы сомнительного качества» (таблица 3.14 и диаг. 3.8). Таблица 3.14. Описательная статистика данных специфического связывания меченых стероидных гормонов с МНФК пациенток, включенных 87 в программу ЭКО в зависимости от успеха имплантации (с поправкой – на качество эмбриона) Показатель Успешная Отсутствие имплантация имплантации фемтомоль/млн. клеток P4 E2 P4 E2 количество пациенток 28 28 10 10 минимум 0,0 0,0 0,0 0,0 25% перцентиль 0,83 0,56 0,0 0,0 медиана 2,04 1,15 0,13 0,80 75% перцентиль 7,10 4,16 0,98 4,55 мaксимум 22,93 16,78 4,68 11,88 среднее 4,77 2,79 0,77 2,72 Стандартное 5,96 3,82 1,43 3,96 Стандартная ошибка 1,12 0,72 0,45 1,25 Нижняя граница 2,46 1,31 -0,24 -0,11 7,08 4,28 1,80 5,56 KS distance 0,25 0,245 0,31 0,26 P-значение P<0,0001 0,0002 0,0046 0,0523 Нормальность нет нет нет да отклонение доверительного интевала 95% Верхняя граница доверительного интевала 95% Тест КолмогороваСмирнова распределения Показания уровня значимости в обоих тестах по определению нормальности распределения свидетельствуют о том, что закон 88 распределения в приведенном массиве данных отличен от нормального. Поэтому в данном случае целесообразно использовать непараметрические методы статистического анализа данных. Диаграмма 3.8. Специфическое связывание меченых стероидных гормонов с МНФК пациенток, включенных в программу ЭКО в зависимости фемтомоль/млн клеток от успеха имплантации (с поправкой на качество эмбрионов) 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 есть имплантация нет имплантации РП Примечание: РЭ - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной группы (р=0,0024). Таблица 3.15. Описательная статистика значений соотношения специфического связывания прогестерона и эстрадиола в МНФ клеток периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО в зависимости от успеха имплантации. 89 Успешная Показатель Нет успеха имплантация количество пациенток 28 22 минимум 0,0 0,0 25% перцентиль 0,27 0,0 медиана 1,10 0,0 75% перцентиль 6,75 1,80 мaксимум 75,50 9,80 среднее 8,36 1,68 Стандартное отклонение 17,14 3,63 Стандартная ошибка 3,23 1,37 Нижняя граница доверительного интевала 95% 1,72 -1,67 Верхняя граница доверительного интевала 95% 15,01 5,05 KS distance 0,35 0,37 P-значение P<0,0001 0,003 Нормальность распределения нет нет Тест Колмогорова-Смирнова Показания уровня значимости в обоих тестах по определению нормальности распределения свидетельствуют о том, что закон распределения в приведенном массиве данных отличен от нормального. Поэтому в данном случае целесообразно использовать непараметрические методы статистического анализа данных. Достоверность различий в РП/РЭ в МНФ клеток периферической крови определяли, используя непараметрический критерий Манна-Уитни. Результаты анализа приведены на диаг. 3.9. Диаграмма 3.9. Соотношение специфического связывания прогестерона и эстрадиола в МНФ клеток периферической крови 90 пациенток, включенных в программу ЭКО в зависимости от успеха имплантации. 9 8 7 6 есть имплантация 5 нет имплантации 4 3 2 1 0 Примечание: - значение статистически достоверно отличается от показателя контрольной группы (р=0,011). Обращает на себя внимание резкое снижение соотношения РП/РЭ в МНФК при отсутствии успеха лечения. Таким образом, проверка рабочей гипотезы позволила сделать следующее заключение - рецепция прогестерона в МНФК может служить прогностическим признаком эффективности ЭКО. 3.2.8. Создание алгоритма введения пациенток в программу ЭКО, на основании специфической связывающей активности прогестерона в МНФК. В результате проведенного нами исследования было показано, что снижение рецепции прогестерона в МНФК периферической крови пациенток может быть причиной отсутствия успеха имплантации. Однако, для создания алгоритма введения пациенток в цикл ЭКО, с целью определения его 91 эффективности, необходимо выявить пороговое значение интересующего параметра. В нашем исследовании данные рецепции прогестерона в МНФК не подчиняются нормальному распределению, поэтому для выявления порогового значения нами использован дискриминантный анализ, т.е. включение в исследование нескольких переменных, с целью определения той из них, которая наилучшим образом разделяет выборку на группы. В качестве переменной нами использована уменьшающаяся плотность РП в МНФК с шагом, равным ошибке среднего (табл.3.15). При расчете использовали условные обозначения, определения и формулы стандартной четырехпольной таблицы Флетчера Р. [27]. Одним из подходов к количественной оценке прогностической ценности методики является определение ее чувствительности и специфичности, где чувствительность это - доля положительных результатов в группе больных, а специфичность - доля отрицательных результатов в группе здоровых. Таким образом, метод с высокой чувствительностью часто дает положительный результат при наличии заболевания (обнаруживает его), при этом являясь наиболее информативным при отрицательном результате, а именно не допускает ложноотрицательных результатов. Напротив, высокая специфичность теста редко допускает ложноположительный результат и является наиболее значимой при положительном результате. Кроме того, нами оценивалась доля истинно положительных результатов среди всех положительных (positive predictive value, +PV) и доля истинно отрицательных ответов среди всех отрицательных (negative predictive value, -PV). 92 Таблица 3.15. Маркеры успеха имплантации, вычисленные по выборке рецепторного профиля образцов МНФК до стимуляции суперовуляции в длинном протоколе ВРТ (шаг равен стандартной ошибке). «3,7» «2,5» «1,3» χ2, степень свободы 2,04 2,37 8,71 P 0,15 0,12 0,003 Относительный риск 2,50 2,16 3,33 95% ДИ 0,62 до 10,00 0,72 дo 6,45 1,17 дo 9,46 Отношение шансов 3,25 3,05 8,00 95% ДИ 0,61 дo 17,29 0,712 дo 13,13 1,82 дo 35,00 Чувствительность 0,83 0,81 0,86 95% ДИ 0,51 дo 0,97 0,54 дo 0,95 0,66 дo 0,97 Специфичность 0,39 0,41 0,54 95% ДИ 0,29 дo 0,57 0,23 дo 0,61 0,32 дo 0,75 +PV - положительное 0,33 0,43 0,66 95% ДИ 0,17 дo 0,52 0,25 дo 0,62 0,47 дo 0,82 -PV - отрицательное 0,86 0,80 0,80 95% ДИ 0,59 дo 0,98 0,51 дo 0,95 0,51 дo 0,95 отношение 1,37 1,38 1,91 Пороговое значение параметра (фемтомоль/млн клеток) прогностическое значение прогностическое значение правдоподобия Для предположения об абсолютной достоверности диагностического теста необходимо вычисление интервальных оценок критерия, которые мы 93 приводим в данной таблице. Определение интервальных оценок чувствительности и специфичности должно стать обязательным этапом в любой программе тестирования достоверности диагностических и скрининговых технологий [6]. На основании данных приведенных в таблице, был выявлен новый критерий введения пациенток в программу ЭКО. Уровень РП в МНФК более 1,3 фемтомоль/млн клеток, будет считаться позитивным прогностическим признаком, а пациентки будут безбоязненно допущены к стимуляции суперовуляции. При анализе характеристик маркера успеха имплантации (с учетом выбранного порогового значения) показано, что чувствительность метода составила 86,9%, а специфичность - 54,5%. При этом, доля истинно положительных результатов диагностического теста (+PV) составляет – 66,7%, а доля истинно отрицательных результатов диагностического теста (PV) – 80%. На основании полученных данных с целью повышения эффективности ЭКО нами разработан алгоритм введения пациенток в программу. При соблюдении всех требований к включению пациенток в программу ЭКО, первым этапом предлагается проведение анализа рецепции прогестерона в МНФК периферической крови в 21 день менструального цикла. Пациенткам со сниженным уровнем РП необходимо будет провести терапию гормональных нарушений, вызывающих снижение уровня РП, пока уровень РП не будет приведен к норме (что требует лабораторного подтверждения). Схема. 3.1 Алгоритм введения пациенток в программу экстракорпорального оплодотворения на прогестерона в МНФК. основании анализа специфичкеского связывания 94 3.3. Относительная связывающая активность прогестерона и дидрогестерона с рецепторами прогестерона мононуклеаров периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО. Проведение поддерживающей гестагенной терапии является обязательным этапом в перечне процедур, предусмотренных циклом ЭКО. Для этой цели используют препараты натурального прогестерона или дидрогестерон, но они, к сожалению не всегда эффективны. Кроме того, в настоящее время не существует четких рекомендаций по выбору гестагенного препарата при проведении ЭКО, и врач назначает лечение эмпирически [19]. При этом структурные различия молекул прогестерона и дидрогестерона, с одной стороны, и индивидуальные колебания аффинитета рецепторов прогестерона конкретных женщин, с другой, могут обеспечить 95 персонализованный подход к назначению гормональной терапии с целью повышения ее эффективности [23]. Поскольку гравидопротекторная роль принадлежит не только тканям репродуктивного тракта, но и иммунной системе матери, в клетках которой экспрессированы рецепторы прогестерона [56], и которые более доступны для исследования, чем клетки эндометрия, то в качестве тест системы персонального подбора гестагенов в программе ЭКО мы предложили использовать клетки мононуклеарной фракции периферической крови. Определение активности специфического связывания прогестерона и дидрогестерона в МНФК периферической крови пациенток выявило широкие колебания изученного параметра, представленные в таблице 3.16. Таблица.3.16. Описательная статистика показателей рецепции прогестерона (фемтомоль/млн клеток) и специфической связывающей активности дидрогестерона (%) с мононуклеарами крови пациенток включенных в программу ЭКО. Показатель Прогестерон Дидрогестерон минимум 0,0 0,0 25% перцентиль 0,20 41,70 медиана 1,75 138,30 75% перцентиль 6,27 256,90 максимум 22,90 1126 среднее 4,25 196,40 Стандартное отклонение 5,82 229,40 Стандартная ошибка 0,87 37,70 Нижняя граница доверительного интервала 95% 2,48 119,90 Верхняя граница доверительного интервала 6,02 272,80 95% 96 При определении относительной связывающей активности в качестве препарата сравнения стандартно использован прогестерон, активность которого принята за 100%. В свою очередь, сила связывания лиганда с рецептором положительно коррелирует с эффективностью препарата. Поэтому, всех пациенток, вошедших в исследование можно разделить на две группы в зависимости от способности рецепторов прогестерона в МНФК связывать дидрогестерон: 1 группа – РП активнее связывают прогестерон, 2 группа – РП лучше связывают дидрогестерон. Сравнительная характеристика относительного связывания дидрогестерона в двух группах приведена в таблице 3.17 и на диаграмме 3.10. Таб.3.17 Характер распределения пациенток по группам, в зависимости от связывающей активности дидрогестерона с рецептора ми прогестерона в МНФК. Показатель I группа II группа Количество пациенток 19 31 28,57±8,17 298,32±49,68* Связывающая активность дидрогестерона с РП Примечание - *различия между группами статистически достоверно (p<0,0001) Диаграмма 3.10 Разделение пациенток на группы в зависимости от связывающей активности дидрогестерона с рецепторами прогестерона МНФК. 97 преимущественное связывание с дидрогестероном преимущественное связывание с прогестероном 38% 62% Специфическое связывание дидрогестерона с МНФК пациенток, включенных в программу ЭКО, варьирует от 0 до 298%. Среднее значение относительной связывающей активности РП с дидрогестероном у пациенток первой группы (38%; связывание прогестерона выше, чем дирогестерона) составило 28,57±8,17%, тогда как у пациенток второй группы (62%; связывание прогестерона ниже, чем дирогестерона) данный показатель составил 298,32 ± 49,68% (p<0,0001). Таким образом, можно предположить, что уровень связывающей активности дидрогестерона с рецепторами прогестерона более 100% может служить основанием выбора этого препарата в качестве компонента гестагенной терапии, а у пациенток с более низкими значениями, адекватная гестагенная терапия должна проводиться препаратами натурального данных связывающей активности прогестерона. 3.4. Сравнительный анализ радиолигандов и сопутствующих факторов. 3.4.1. Специфическое связывание эстрадиола и прогестерона в МНФК в зависимости от фактора бесплодия. 98 Для выявления возможной связи уровня рецепции стероидных гормонов в иммунокомпетентных клетках с различными причинами бесплодия разделение пациенток осуществляли по признаку причины бесплодия или известных факторов риска снижения эффективности ВРТ (трубно-перитонеальный фактор, поздний репродуктивный возраст, эндометриоз и т.д.). Группу сравнения в каждой аналитической серии составили «остальные» (пациентки без рассматриваемого признака из общей выборки = II группа). А. Трубно-перитонеальный фактор (ТПФ). Описательная статистика массива данных приведена в таблице 3.18. Таблица 3.18. Описательная статистика специфического связывания эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови пациенток с трубно-перитонеальным фактором бесплодия и в группе сравнения. Трубноперитонеальный остальные фактор Фемтомоль/млн клеток P4 E2 P4 E2 количество пациенток 29 17 29 17 минимум 0,0 0,0 0,0 0,0 25% перцентиль 0,65 0,0 0,40 0,15 медиана 2,30 0,80 1,20 0,94 75% перцентиль 8,70 2,05 3,54 3,23 мaксимум 22,90 10,80 16,78 7,28 среднее 5,08 1,54 2,89 1,88 Стандартное отклонение 6,23 2,60 4,10 2,26 Стандартная ошибка 1,15 0,63 0,76 0,54 Нижняя граница доверительного 2,71 0,20 1,32 0,72 интевала 95% 99 Верхняя граница доверительного 7,45 2,87 4,45 3,04 KS distance 0,23 0,27 0,24 0,26 P-значение 0,0003 0,001 0,0002 0,002 Нормальность распределения нет нет нет нет интевала 95% Тест Колмогорова-Смирнова Из приведенной таблицы видно, что данные не соответствуют нормальному распределению (тест Колмогорова-Смирнова), поэтому колоночный анализ проводим, используя непараметрический непарный tкритерий с коррекцией Уэлша (табл. 3.19) Таблица 3.19. Специфическое связывание эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови пациенток с трубным фактором бесплодия и в группе сравнения. Трубноперитонеальный Остальные р фактор Прогестерон 5,086 ± 1,157 1,541 ± 0,631 0,010 Эстрадиол 2,892 ± 0,762 1,883 ± 0,548 0,288 Приведенные данные свидетельствуют о том, что у пациенток с трубным фактором бесплодия емкость связывания гомонов с МНФК была достоверно выше, чем у женщин с иными причинами бесплодия, что отражает факт наибольшей эффективности ВРТ в лечении пациенток именно этой нозологической группы. Б. Поздний репродуктивный возраст Аналогичное разделение на 2 группы пациенток включенных в программу ЭКО в зависимости от возраста. В первую группу вошли 100 пациентки раннего репродуктивного возраста до 35 лет, а во вторую группу пациентки начиная с 35 лет, т.е. поздний репродуктивный возраст. Описательная статистика полученных данных приведена в таблице 3.20. Таблица 3.20. Описательная статистика значений специфического связывания эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови пациенток в зависимости от возраста. Прогестерон Эстрадиол I группа II группа I группа II группа 35 лет 35 лет 35 лет 35 лет количество пациенток 20 26 20 26 минимум 0,0 0,0 0,0 0,0 25% перцентиль 0,17 0,0 0,23 0,37 медиана 1,40 1,80 1,02 1,15 75% перцентиль 2,92 7,55 2,80 3,87 мaксимум 11,70 22,90 11,30 16,78 среднее 2,58 4,69 1,99 2,92 Стандартное отклонение 3,43 6,49 2,72 4,07 Стандартная ошибка 0,76 1,27 0,60 0,79 Нижняя граница доверительного 0,97 2,06 0,71 1,27 4,19 7,31 3,26 4,56 KS distance 0,72 0,74 0,71 0,72 P-значение P<0,0001 P<0,0001 P<0Э,000 P<0,0001 интевала 95% Верхняя граница доверительного интевала 95% Тест Колмогорова-Смирнова 1 Нормальность распределения нет нет нет нет 101 Из приведенной таблицы видно, что данные не соответствуют нормальному распределению (тест Колмогорова-Смирнова), поэтому колоночный анализ проводим, используя непараметрический непарный tкритерий с коррекцией Уэлша (табл. 3.21) Таблица 3.21. Специфическое связывание эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови пациенток в зависимости от возраста пациенток (фемтомоль/млн клеток). 35 лет 35 лет р Прогестерон 2,585 ± 0,76 4,692 ± 1,27 0,164 Эстрадиол 1,993 ± 0,60 2,923 ± 0,79 0,359 Из таблицы видно, что статистической значимости различий рецепции эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови достигнуто не было. Однако, обращает на себя внимание очевидная тенденция к снижению уровня РП у пациенток старшей возрастной группы, что перекликается с данными о снижении вероятности положительного результата ВРТ у этих пациенток. В. Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ). Аналогичное разбиение на группы в зависимости от наличия в анамнезе диагноза «наружный генитальный эндометриоз». Описательная статистика данных представлена в таблице 3.22. Таблица 3.22. Описательная статистика данных специфического связывания эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови в зависимости от наличия в анамнезе пациенток диагноза «наружный генитальный эндометриоз». 102 Прогестерон Эстрадиол I группа II группа I группа II группа с НГЭ без НГЭ с НГЭ без НГЭ Количество пациенток 11 35 11 35 минимум 0,0 0,0 0,03 0,0 25% перцентиль 1,00 0,0 0,42 0,22 медиана 2,20 1,10 1,20 1,08 75% перцентиль 10,10 4,70 3,65 3,41 мaксимум 16,70 22,90 16,78 11,88 среднее 4,77 3,46 2,99 2,36 Стандартное отклонение 6,02 5,29 4,79 3,12 Стандартная ошибка 1,81 0,89 1,44 0,52 Нижняя граница 0,72 1,64 -0,22 1,29 8,82 5,28 6,21 3,44 KS distance 0,74 0,69 0,6136 0,7508 P-значение 0,0017 P<0,0001 P<0,000 P<0,0001 доверительного интевала 95% Верхняя граница доверительного интевала 95% Тест Колмогорова-Смирнова 1 Нормальность распределения нет нет нет нет Из приведенной таблицы видно, что данные не соответствуют нормальному распределению (тест Колмогорова-Смирнова), поэтому колоночный анализ проводим, используя непараметрический непарный tкритерий с коррекцией Уэлша (табл. 3.23) Таблица 3.23. Специфическое связывание эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови в зависимости от наличия в анамнезе пациенток диагноза (фемтомоль/млн клеток). «наружный генитальный эндометриоз» 103 Наружный генитальный Остальные р эндометриоз Прогестерон 4,773 ± 1,818 3,463 ± 0,894 0,527 Эстрадиол 2,998 ± 1,445 2,368 ± 0,528 0,689 Из таблицы специфического видно, что связывания статистической эстрадиола и значимости прогестерона различий в МНФК периферической крови достигнуто не было. Тем не менее, можно отметить тенденцию к повышению уровня обьема связывания прогестерона в МНФК у пациенток с эндометриозом, что вполне ожидаемо, так как эндометриоз является эстрогенозависимым заболеванием и развивается на фоне относительной гиперэстрогеногистии. В свою очередь, эстрадиол является фактором промотирующим экспрессию РП в ткани (в том числе на МНФК). Г. Бесплодие неясного генеза (БНГ). Аналогичное разделение на группы в зависимости от наличия в анамнезе диагноза «бесплодие неясного генеза». Описательная статистика данных представлена в таблице 3.24. Таблица 3.24. Описательная статистика специфического показателей связывания эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови пациенток в зависимости от наличия в анамнезе диагноза «бесплодие неясного генеза». 104 Прогестерон Эстрадиол I II I II группа группа группа группа с БНГ без БНГ с БНГ без БНГ Количество пациенток 7 39 7 39 минимум 0,0 0,0 0,4 0,0 25% перцентиль 0,0 0,20 0,60 0,22 медиана 1,80 1,50 2,76 1,10 75% перцентиль 3,00 5,00 3,65 3,41 мaксимум 10,80 22,90 5,98 16,78 среднее 2,50 4,00 2,45 2,53 Стандартное отклонение 3,84 5,68 1,99 3,77 Стандартная ошибка 1,45 0,91 0,75 0,60 Нижняя граница доверительного интевала 95% -1,05 2,16 0,60 1,3 Верхняя граница доверительного интевала 95% 6,05 5,84 4,30 3,75 KS distance 0,70 0,72 0,90 0,68 P-значение 0,004 P<0,0001 0,356 P<0,0001 Нормальность распределения нет нет да нет Тест Колмогорова-Смирнова Из приведенной таблицы видно, что данные не соответствуют нормальному распределению (тест Колмогорова-Смирнова), поэтому колоночный анализ проводим, используя непараметрический непарный tкритерий с коррекцией Уэлша (табл. 3.25) Таблица 3.25. Специфическое связывание эстрадиола и прогестерона в МНФК периферической крови пациенток в зависимости от наличия в анамнезе диагноза «бесплодие неясного генеза» (фемтомоль/млн клеток). «бесплодие Остальные р неясного генеза» Прогестерон 2,500 ± 1,454 4,005 ± 0,910 0,398 Эстрадиол 2,453 ± 0,755 2,531 ± 0,604 0,936 105 Из таблицы специфического видно, что связывания статистической эстрадиола и значимости прогестерона различий в МНФК периферической крови достигнуто не было. Если ранее нами показано, что трубно-перитонеальный фактор ассоциируется с повышенной емкостью связывания прогестерона в МНФК, то вполне закономерны результаты о тенденции снижения рецепции прогестерона в МНФК при диагнозе «бесплодие неясного генеза». Корреляции между РП и РЭ в МНФК периферической крови пациенток, включенных в программу ВРТ. Известно, что половые стероиды осуществляют контроль над метаболическими и пролиферативными процессами тканей-мишеней. При этом их взаимоотношения в различных системах (тканевой и клеточный контекст) варьируют от потенцирования до антагонизма. Именно поэтому в отношении динамических процессов более надежными (объективными) показателями будут не столько абсолютные значения плотности рецепторов, сколько их количественное соотношение или наличие корреляционной связи. Поэтому для оценки стабильности (предсказуемости, управляемости) системы мы использовали корреляционный анализ. Результаты анализа приведены в таблице 3.26. Таблица 3.26. Результаты корреляционного анализа соотношения специфического связывания рецепторов эстрадиола и прогестерона в МНФК у пациенток включенных в длинный протокол ЭКО в зависимости от причины бесплодия. Причины бесплодия признак r р Трубный фактор 0,386 0,039 Возрастной фактор 0,107 0,651 106 Эндометриоз 0,191 0,573 Неясного генеза 0,222 0,662 Из приведенных данных видно, что относительная стабильность (положительная корреляция между РП и РЭ) наблюдается только у пациенток с трубным бесплодием. Тенденция к лучшей управляемости системы выявлена у пациенток более молодого возраста и у пациенток с четко определенной причиной бесплодия. Эти результаты соответствуют литературным данным о факторах риска низкой эффективности ВРТ. Такое соответствие дополнительно подтверждает адекватность выбранного нами в качестве маркера прогноза эффективности ВРТ – плотность рецепторов прогестерона в МНФК. 3.4.2. Сравнительный анализ рецепции эстрадиола и прогестерона в МНФК и цитозоле эндометрия. Показатели рецепции половых стероидов в МНФК (фемтомоль/млн кл.) и цитозоле эндометрия (фемтомоль/мг белка) значительно варьируют. Средние значения в МНФК: РП 4,49 фемтомоль/млн кл., РЭ - 2,53 фемтомоль/млн.кл. и РП/РЭ = 1,77; в цитозоле РП= 113 фемтомоль/мг белка, РЭ= 82 фемтомоль/мг белка; РП/РЭ = 1,38. Тем не менее, сравнительный анализ позволил выявить достоверную положительную корреляцию между рецепцией прогестерона в указанных объектах (МНФК и цитозоле эндомнтрия): для РП коэффициент корреляции Спирмена r = 0,71 (P=0,0032, alpha=0,05). В то же время не обнаружено корреляции в рецепции эстрадиола, что может быть следствием недостаточности объема выборки для данного параметра. Учитывая, что рецепция половых стероидов в эндометрии используется рядом исследователей в качестве предиктора эффективности имплантации [38], выявленная нами тесная положительная корреляция между рецепцией 107 прогестерона в эндометрии и МНФК может служить основанием для предложения в качестве аналогичного маркера использовать параметры стероидной рецепции в мононуклеарных клетках периферической крови. Насколько предложенный маркер будет чувствителен можно определить в сравнительном исследовании рецепции и исходов программы ЭКО у конкретных пациенток. Таким образом, нами выдвинута рабочая гипотеза: специфическое связывание прогестерона в МНФК может служить косвенным критерием функциональной активности (готовности к имплантации) эндометрия. 3.4.3. Сравнительный анализ специфического связывания прогестерона и эстрадиола МНФ клеток периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО до начала стимуляциии гормонального статуса. Анализ всего массива данных не позволил выявить наличия взаимосвязи между исследуемыми параметрами. Индивидуальный анализ и разделение пациенток на группы в зависимости от успеха ЭКО продемонстрировал некоторые закономерности, представленные в таблице 3.27 Таблица 3.27. Описательная статистика значений уровня половых стероидов в плазме крови и специфического связывания эстрадиола и прогестерона в МНФК пациенток, включенных в программу ЭКО в зависимости от успеха имплантации. 108 Рецепторы в МНФК Количество пациенток минимум 25% персентиль медиана 75% персентиль максимум Среднее значение Стандартное отклонение Стандартная ошибка РП-II Гормоны в плазме крови РП-I РЭ-I РЭ-I E2-I P4-I E2-II группа группа 28 28 22 22 28 28 22 22 0,0 0,0 0,0 0,0 73,40 1,08 127,0 4,02 0,85 0,35 0,0 0,08 312,0 30,90 200,3 21,35 2,05 1,15 0,70 1,08 415,0 41,05 344,0 32,30 7,15 4,16 2,70 3,41 573,0 47,78 449,0 44,65 22,90 16,78 16,70 11,88 822,0 63,70 848,0 58,20 4,71 2,76 2,98 2,27 438,80 37,59 361,70 32,48 5,96 3,85 5,24 3,04 203,10 18,38 188,90 14,81 1,12 0,72 1,20 0,69 42,34 3,91 45,82 3,59 2,45 1,26 0,45 0,80 351,0 29,44 264,50 24,87 7,08 4,25 5,51 3,73 526,70 45,74 458,80 40,10 0,25 0,241 0,32 0,22 0,10 0,17 0,11 0,10 группа группа группа группа группа P4-II группа Нижняя граница доверительного интевала 95% Верхняя граница доверительного интевала 95% KS расстояние 109 P значение P<0,0001 Нормальность распределения нет 0,0002 P<0,0001 нет нет 0,010 P > 0,10 нет да 0,074 да P > 0,10 P > 0,10 да да Единственная достоверная тесная отрицательная корреляция выявлена между уровнем эстрадиола-17-бета в крови и плотностью рецепторов прогестерона в МНФК ( r = -0,62, р = 0,008). И вновь наиболее достоверным параметром выступает рецепция прогестерона в МНФК. Следовательно, ни параметры уровня половых стероидов, ни сравнительный анализ количества гормонов и рецепторов, не могут служить надежным критерием эффективности программы ЭКО. 3.5 Результаты проведенного цикла ЭКО и ПЭ. 3.5.1 Cравнительный анализ клинических характеристик двух групп пациенток по основным параметрам цикла ЭКО и ПЭ. Суммарная доза гонадотропинов щироко варьировала от 1000 до 4200 МЕ на цикл. Трансвагинальная пункция яичников производилась через 11-16 дней от начала стимуляции. Было получено от 2 до 43 ооцитов (в среднем – 13), у 10-ти пациенток (20%) возник синдром гиперстимуляции яичников (СГСЯ) легкой степени, не потребовавший лечения, а у 1-й пациентки (2%) – средней степени тяжести, что потребовало проведения инфузионной терапии, госпитализации и динамического наблюдения. В 27 наблюдениях оплодотворение произошло в результате инсеминации ооцитов, частично (в 9 случаях) или полностью (в 14 случаях) было произведено ИКСИ. В результате оплодотворения было получено от 1 до 18 эмбрионов и на 2-6 сутки после пункции в полость матки были перенесены от 1 до 3 эмбрионов: 6 пациенткам (12%) был перенесен 1 эмбрион, 29 (58%) – 2 эмбриона, 15 (30%) пациенткам – 3 эмбриона. Показанием к переносу 3-х эмбрионов 110 являлся поздний репродуктивный возраст, 2 и более неудачные попытки ЭКО в анамнезе. Поддержкe лютеиновой фазы всем пациенткам осуществляли одинаково: с 1-го дня после пункции назначался препарат Утрожестан ежедневно в суточной дозе 600мг (200мг 3р/д) интравагинально до анализа крови на ХГ, который проводили через 12-14 дней после переноса эмбрионов. Таблица 3.28 Клинические характеристики пациенток в цикле ЭКО и ПЭ. Показатель I группа II группа (успех) (нет успеха) Количество пациенток 28 22 Суммарная доза гонадотропинов (МЕ на 2486±816 2536±798 Длительность стимуляции 11,4±1,4 11,6±1,3 Количество ооцитов 12,2±8,5 12,5±6,9 ИКСИ, % 27 28,6 Количество 2pn 6,1±4,2 7,8±3,8 Количество перенесенных эмбрионов 2,14±0,7 2,14±0,6 Сутки переноса 3,5±1,1 4,1±1,0 Толщина эндометрия в мм в день 12±1,9 11,8±1,9 0,4±0,5 0,6±0,5 цикл) трансфера Криоконсервация эмбрионов Как видно из таблицы 3.28, пациентки обеих групп достоверно не отличались по следующим параметрам: суммарной введенной дозе гонадотропинов (p>0,05), длительности стимуляции (p>0,05), количеству полученных при пункции яичников ооцитов (p>0,05), доле циклов с проведением ИКСИ (p>0,05), количеству 2рn зигот (p>0,05), количеству перенесенных в полость матки эмбрионов (p>0,05), суткам переноса (p>0,05), 111 толщине эндометрия в момент проведения трансфера (p>0,05) и количеству криоконсервированных эмбрионов (p>0,05). 3.5.2 Результаты проведенного лечения Из леченных в цикле ЭКО и ПЭ пациенток плодное яйцо/яйца на 5 неделе беременности визуализировалось у 28 из 50, следовательно, процент наступления беременности составил 56%, процент живорожденных детей – 48%. Так как все 50 пациенток были ретроспективно разделены именно по основному результату лечения (по наступлению беременности в цикле ЭКО и ПЭ), то в данном разделе мы указали только исходы лечения пациенток I группы. Таблица 3.29 Результаты лечения пациенток I группы с успехом имплантации. Показатель Число пациенток (%) Количество пациенток 28 Одноплодная беременность 17 (61%) Бихориальные двойни 11 (39%) Замершие беременности в I триместре 2 (7%) Поздние самопроизвольные аборты (на 20 неделе 2 (7%) беременности) Роды 24 (86%) Из них срочные роды 18 (75%) Из них срочные роды одним плодом 12 (63%) Из них срочные роды двумя плодами 7 (37%) Преждевременные роды (от 32 до 37 нед.) 6 (25%) 112 Из них преждевременные роды одним плодом 4 (67%) Из них преждевременные роды двумя плодами 2 (33%) Неоперативные роды 9 (37,5%) Плановое кесарево сечение 11 (45,8%) Экстренное кесарево сечение 4 (16,7%) Количество живых рожденных детей 32 Из них из двоен 16 3.5.3 Отдаленные результаты проведенного впоследствии лечения у II группы пациенток с отсутствием имплантации. Пациентки II группы были также ретроспективно (спустя 2 года) разделены на 2 группы: к А группе были отнесены 10 забеременевших самопроизвольно или с помощью позднее проведенных циклов ВРТ, а к Б группе 12 так и не забеременевших (ни самопроизвольно, ни в результате повторно проведенного лечения) пациенток. В группе А 2 пациентки забеременели самопроизвольно, 2 пациентки забеременели в результате переноса размороженных криоконсервированных эмбрионов. Остальные 6 пациенток забеременели в результате проведения повторных попыток (2-6-й) ЭКО и ПЭ. В группе Б, даже несмотря на проведение повторных попыток ЭКО и ПЭ ни у одной из женщин беременность не наступила. Интересным оказался тот факт, что пациентки этих ретроспективно выделенных подгрупп имели различия по рецептивности МНФ в 1-й точке исседованного нами цикла. Таблица 3.30 Сравнительный анализ специфического связывания прогестерона и эстрадиола в МНФК у пациенток II группы (с отсутствием имплантации в прошедшем цикле ЭКО) в зависимости от успеха ЭКО спустя 2 года (фемтомоль/млн .клеток). 113 А группа Б группа (есть (нет имплантация) имплантации) 10 12 25 694,5 363,5 50 3871 647,25 75 0 0 25 2420 475,5 50 5072,5 1468 75 38,2 263 Соотношение 25 0,3 0,1 прогестерон/эстрадиол 50 4,0 1,9 (персентили) 75 0 0 Показатель Количество пациенток Прогестерон (персентили) Эстрадиол (персентили) р 22 0,4 0,2 0,6 Как видно из таблицы 3.30, на клетках МНФ периферической крови в последующем забеременевших пациенток содержалось большее количество как РП (среднее значение 3871 фемтомоль/млн.клеток против 647 фемтомоль/млн.клеток), так и РЭ (среднее значение 5072 фемтомоль/млн.клеток против 1468 фемтомоль/млн.клеток), а соотношение количества этих рецепторов РП/РЭ имело сдвиг в сторону преобладания по данному показателю группы А над группой В (в среднем 4,0 против 1,9). Однако, несмотря на такую тенденцию, разница не достигла статистически значимых отличий (p=0,4; p=0,2 и p=0,6 соответственно). 114 Глава 4. Обсуждение собственных результатов. В ходе работы обследовано 50 женщин, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения. Возраст пациенток был сопоставим и составил в среднем 33,4±3,4 лет, однако 11 пациенток (22%), принадлежали к группе позднего репродуктивного возраста (после 35). Средние показатели общего анализа крови пациенток соответствуют нормативным значениям. Индивидуальный анализ мононуклеарной фракции на содержание В- и Т-лимфоцитов и моноцитов с помощью проточного цитофлюориметра-сортера FACSAria (Becton Dickenson Co) показал, что Тлимфоциты составляют в среднем 57% от общей популяции, В-лимфоциты – 4,7% и моноциты – 6,1%. Уровень женских половых стероидов и их соотношение у пациенток до лечения находились в пределах нормативных значений. Стимуляция суперовуляции вызывала значительное увеличение концентрации и эстрадиола и прогестерона, по сравнению с нормой (при овуляции в физиологическом половом цикле) в 5 и в 7 раз, соответственно. Полученные результаты совпадают с литературными данными [93]. Избыток женских половых стероидов необходим для одновременного созревания большого количества яйцеклеток. В момент трансфера эмбриона в полость матки концентрация эстрадиола была выше нормативных значений практически в 46 раз и составляла 4585,6103,8 пикомоль/л и в 10 раз выше, чем в контрольной точке. Концентрация прогестерона составляла 428,119,3 наномоль/л, что в 10 раз превышает значения в контрольной точке, и в 9 раз нормативные значения. Соотношение концентраций гормонов практически не превышало норму 115 Обследованных нами пациенток мы ретроспективно разделили на 2 группы в зависимости от исхода лечения: в I группу вошли 28 пациенток с успешной имплантацией, во II – 22 пациентки с безуспешной попыткой ЭКО и ПЭ. Дальнейший анализ приведенных результатов обследования проводился по группам. Принимая во внимание тот факт, что самые популярные показатели прогноза успеха ЭКО это - возраст, длительность бесплодия, наличие родов и число неудачных попыток ЭКО в анамнезе [96], мы сначала проанализировали данные две группы именно по этим параметрам. Достоверных различий выявлено не было (p>0,05): средний возраст составил 33,5 и 35,5 лет в I и II группах соответственно, длительность бесплодия 5,55 у пациенток I группы и 6,05 лет у пациенток II группы. 75% женщин I и 68,2% II группы имели вторичное бесплодие, 57% и 50% пациенткам I и II групп соответственно, не имели в анамнезе попыток ЭКО и ПЭ. В настоящее время разрабатывается целый спектр различных методов прогнозирования, которые находятся на стадии исследования и нуждаются в дальнейших доработках [118]. Однако предлагаемые методы основаны на инвазивном вмешательстве в полость матки, что является травматичным и не сочетается с целью программы ЭКО [78]. В литературе отсутствуют достоверные данные описывающие уровень экспрессии РП в цитозоле эндометрия или на клетках МНФК в качестве маркера прогноза эффективности ЭКО. Условием эмбрионов эффективности хорошего качества, программы прежде ЭКО всего в случае является переноса готовность материнского организма к беременности [20, 54, 95], а именно состояние рецепторного статуса эндометрия и иммунокомпетентных клеток. Для оценки эндометрия мы проводили исследование содержания в нем рецепторов прогестерона и эстрадиола. С этой целью на 20-22 день 116 менструального цикла проводилась пайпель-биопсия эндометрия. Процедура удалось провести только у 31 пациентки, у 8 больных не удалось ее осуществить вообще, вследствие спазма внутреннего зева и болезненности , а в 11 случаях материала полученного при пайпель-биопсии оказалось недостаточно. В результате проведенных исследований нами не выявлено достоверной разницы в рецепции женских половых стероидов в цитозоле эндометрия у пациенток в зависимости от успеха имплантации. Разброс полученных данных был достаточно велик, что соответствует литературным источникам [37]. В частности, у пациенток с успехом ЭКО уровень цитозольных рецепторов эстрадиола был максимальным и равнялся 30,5714,28 фемтомоль/мг белка. У женщин с отсутствием имплантации величина этого показателя была ниже и составила 9,3259,325 фемтомоль/мг белка. Средняя концентрация рецепторов прогестерона у пациенток с успешной имплантацией составляла 152,965,69 фемтомоль/мг белка, а с ее отсутствием - 164,3107,4 фемтомоль/мг белка. Индивидуальный анализ полученных данных показал, что у пациенток с успешной имплантацией частота встречаемости нулевых значений уровня стероидных рецепторов в цитозоле эндометрия достоверно ниже по сравнению со второй группой пациенток: для РП - 37% против 57% (р≤0,05), для РЕ - 12% против 42% (р≤0,01). Это правило так же распространяется и на отрицательные по обоим рецепторам образцы эндометрия: 12% в первой группе, против - 29% во второй группе (р≤0,01). Таким образом, окончательный анализ результатов нашего исследования не подтвердил гипотезу о достаточной информативности рецепции прогестерона и эстрадиола в эндометрии для прогноза эффективности программы ЭКО. При этом биопсия эндометрия является травматичной и болезненной процедурой, что в ряде случаев является 117 причиной отказа пациенток от нее. При этом массированная инфильтрация эндометрия иммунокомпетентными клетками в период имплантационного окна [52] позволяет переместить наше внимание на рецепцию женских половых стероидов именно в этих клетках. Значение клеток мононуклеарной фракции периферической крови (МНФК) в функционировании маточно-плацентарной единицы подробно изучено [52]. В частности, им отводится роль сдерживания системной иммунной реакции матери на аллогенный трансплантат (эмбрион) за счет продукции прогестерон индуцированных блокирующих факторов. С другой стороны, мононуклеарные клетки крови находятся под гормональным контролем, т.к. в достаточном количестве экспрессируют рецепторы половых гормонов. Следовательно, нарушение рецепции половых стероидов на клетках МНФК может быть одной из причин бесплодия. Приведенные аргументы явились основанием для поиска критерия прогноза эффективности программы ЭКО и сравнения уровня рецепторов половых стероидов в МНФ периферической крови у пациенток двух групп. Среднее значение специфического связывания прогестерона в МНФК у пациенток I группы (с успешной имплантацией) в первой точке составило 4,78 фемтомоль/млн клеток. У пациенток II группы (без имплантации) данный параметр был в 1,8 раза ниже и составил 2,8 фемтомоль/млн. клеток, что оказалось статистически значимо ниже, чем в I группе (р=0,043). Еще более информативные данные получены при анализе специфического связывания прогестерона в МНФК пациенток включенных в программу ЭКО в зависимости от успеха имплантации с поправкой на внеэндометриальные причины отсутствия имплантации, «эмбрионы сомнительного качества». Уровень рецепторов прогестерона в группе пациенток с наступившей беременностью был достоверно выше по сравнению с уменьшенной на 7 пациенток II группой (р=0,0024). 118 При этом специфическое связывание эстрадиола в МНКФ у пациенток I группы до стимуляции составил в среднем 2,79 фемтомоль/млн клеток. В случае неудачной попытки ЭКО (II группа) данный параметр остался на том же уровне и составил 2,59 фемтомоль/млн. клеток. Даже с учетом фактора «эмбрионы сомнительного качества» специфическое связывание эстрадиола статистически достоверно не различался в обеих группах больных. Сравнительный анализ специфического связывания половых стероидов в МНФК в динамике продемонстрировал достоверное повышение РП и тенденцию к повышению РЭ. Следовательно, введение препаратов для стимуляции суперовуляции (гонадолиберины, гонадотропины и ХГ) у пациенток вызывает повышение специфического связывания прогестерона и эстрадиола в МНФ клеток периферической крови и обеспечивая адекватный процесс подготовки тканей репродуктивного тракта к имплантации. На основании полученных данных нами была выдвинута рабочая гипотеза: специфическое связывние прогестерона в МНФК может служить косвенным критерием имплантации) функциональной эндометрия. активности Сравнительный анализ (готовности позволил к выявить достоверную положительную корреляцию между рецепцией прогестерона в МНФК и цитозоле эндометрия: для РП коэффициент корреляции Spearman r = 0,76 (р = 0,000976, α = 0,05). В то же время не обнаружено аналогичной корреляции в рецепции эстрадиола, что может быть следствием недостаточности объема выборки для данного параметра. Однако данные рецепции половых стероидов в МНФК и цитозоле в динамике несут преимущественно научный интерес, тогда как практическое значение имеют результаты полученные до начала стимуляции суперовуляции (в первой точке). Выявленная нами тесная положительная корреляция между уровнем рецепторов прогестерона в МНФК крови и эндометрием в контрольной 119 точке, дает нам возможность избежать использования травматичной процедуры пайпель-биопсии с заменой последней на менее инвазивный метод забора периферической крови и дальнейшее определение РП в МНФК. Так как нашей целью было разработать критерий эффективности длинного протокола ЭКО и ПЭ, а т.к. специфическое связывание прогестерона в МНФК в контрольной точке (середине лютеиновой фазы цикла перед назначением аГнРГ) оказалось единственно прогностически ценным для наступления беременности, то данный параметр и был выбран таким критерием. Специфическое связывание прогестерона на клетках МНФ периферической крови в контрольной точке положительно коррелирует только с уровнем экспрессии РП в цитозоле эндометрия и, по результатам нашего исследования, не коррелирует с возрастом, видом и фактором бесплодия и другими характеристиками пациенток, т.е. является достаточно независимым показателем. Анализ исходов программы ЭКО для пациенток обеих групп показал следующее: из 28 с наступившей беременностью женщин I группы у 17 (61%) была одноплодная беременность, у 11 (39%) – беременность двойней. При этом у 24 (86%) беременность завершилась родами: у 18 - срочные роды и у 6 – преждевременные. У остальных 4 пациенток (14%) беременность прервалась в ранних сроках (2 женщины) и во 2 триместре (2 пациентки). Количество живорожденных детей всего – 32. Пациентки II группы (22) были ретроспективно (спустя 2 года) разделены на 2 группы: к А группе были отнесены 10 забеременевших самопроизвольно или с помощью позднее проведенных циклов ВРТ, а к В группе 12 так и не забеременевших (ни самопроизвольно, ни в результате повторно проведенного лечения) пациенток. 120 Интересным оказался тот факт, что пациентки этих ретроспективно выделенных подгрупп имели различия в рецептивности МНФК в контрольной точке исследованного нами цикла. Так, на клетках МНФК периферической крови в дальнейшем забеременевших пациенток содержалось большее количество, по сравнению с женщинами так и не забеременевших, как РП (среднее значение 6,43 фемтомоль/млн.клеток против 1,07 фемтомоль/млн.клеток), так и РЭ (среднее значение 8,43 фемтомоль/млн.клеток против 2,44 фемтомоль/млн.клеток), а соотношение количества этих рецепторов имело сдвиг в сторону преобладания успешной имплантации (в среднем 4,05 против 1,96). Однако, учитывая большой разброс данных, разница статистически не достоверна (p=0,456; p=0,203 и p=0,628 соответственно). Однако наступление беременности в результате проведенного лечения не всегда является гарантом рождения здорового ребенка, успех которого во много связан с правильным применением препаратов гестагенной поддержки. Проведение поддерживающей гестагенной терапии является обязательным этапом в перечне процедур, предусмотренных циклом ЭКО. Для этой цели используют препараты натурального прогестерона или дидрогестерон, но они, к сожалению не всегда эффективны. Кроме того, в настоящее время не существует четких рекомендаций по выбору гестагенного препарата при проведении ЭКО, и врач назначает лечение эмпирически [19]. При этом структурные различия молекул прогестерона и дидрогестерона, с одной стороны, и индивидуальные колебания аффинитета рецепторов прогестерона конкретных женщин, с другой, могут обеспечить персонализованный подход к назначению гормональной терапии с целью повышения ее эффективности [10]. Поэтому нами была исследована относительная связывающая активность прогестерона и дидрогестерона с РП. В результате данного исследования показано, что специфическое связывание дидрогестерона с рецепторами прогестерона 121 мононуклеарных клеток периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО, варьирует от 0 до 298%, при этом у 38% женщин дидрогестерон уступает прогестерону в конкуренции за гестагенные рецепторы, а 62% - превышают. Выявленные вариации специфического связывания дидрогестерона с рецепторами прогестерона являются резервом повышения эффективности вспомогательной репродуктивной технологии за счет индивидуального подбора препаратов гормональной терапии. 122 Выводы: 1. Уровень прогестерона и эстрадиола в плазме крови пациенток включенных в программу ЭКО в 21-23 день менструального цикла находился в пределах нормальных значений и не влиял на исход лечения. 2. Концентрация цитозольных рецепторов прогестерона и эстрадиола в эндометрии пациенток включенных в программу ЭКО, до начала стимуляции суперовуляции, выявленная радиолигандным методом, составила: 152,9 и 30,6 фемтомоль/мг белка соответственно в I группе (с успехом имплантации), и 164,3 и 9,3 фемтомоль/мг белка во 2 группе (с отсутствием имплантации), (p≥1). Не выявлено достоверной разницы в уровне рецепции эстрадиола и прогестерона в цитозоле эндометрия у обследованных пациенток обеих групп. 3. Специфическое связывание 3 3 H-прогестерона и H-эстрадиола, определенное радиолигандным методом,в мононуклеарной фракции клеток периферической крови пациенток программы ЭКО до начала стимуляции составило: 23,43,3 фемтомоль/млн. клеток и 5,91,5 фемтомоль/млн. клеток соответственно. В день пункции яйцеклетки величина специфического связывания стероидных гормонов увеличилась в 1,3 раза по сравнению с контрольной точкой. В день подсадки эмбриона в полость матки уровень специфического связывания 3H-прогестерона увеличился– в 1,3 раза, а 3Hэстрадиола в 2 раза по сравнению с контрольной точкой (p 0,005). 4. Уровень специфического связывания 3 H-прогестерона, определенный радиолигандным методом, с клетками мононуклеарной фракции крови в 21-23 день менструального цикла у пациенток I группы (с успешной имплантацией), составил: 4,7±2,2 фемтомоль/млн. клеток, во II группе (отсутствие имплантации) – 0,7±0,4 фемтомоль/млн. клеток, p=0,0024. Уровень специфического радиолигандным методом, связывания с 3 H-эстрадиола, мононуклеарами крови выявленный у пациенток 123 обследованных групп, не отличался: 2,79±1,2 vs 2,72±1,1 фемтомоль/млн. клеток в первой и второй группах соответственно, p=1,056. 5. У 31 пациентки (62%), включенной в программу ЭКО, отмечено преимущественное связывание дидрогестерона с гестагеновыми рецепторами мононуклеаров периферической прогестерона в среднем в 10,6 раз. крови, превышающее связывание 124 Практические рекомендации: 1. Рецепторный статус эндометрия не имеет положительной корреляции с успехом ЭКО, поэтому проведение данного, трудоемкого исследования нецелесообразно. 2. Пациенткам планирующим участвовать в программе ЭКО, рекомендуется определение уровня РП в МНФК перед началом стимуляции суперовуляции. При уровне рецепции прогестерона в МНФК ниже 1,3 фемтомоль/млн клеток пациенткам показана предварительная гормональная подготовка. 3. В первом триместре беременности необходима гестагенная поддержка, при этом эффективность данной процедуры зависит от индивидуального подбора препаратов. При связывающей активности РП с дидрогестероном превышающей порог в 100%, рекомендуется использование дидрогестерона, а при более низких значениях адекватную гестагенную терапию предлагается проводить препаратами натурального прогестерона. 125 Список научных работ опубликованных по теме диссертации. 1. Сукновалова М.В. Параметры рецепции женских половых гормонов в мононуклеарной фракции периферической крови, как маркер эффективности экстракорпорального оплодотворения // Материалы II Международной (XI Всероссийской) Пироговской студенческой научной медицинской конференции, Москва, -2007- С.314. 2. Сукновалова М.В. Состояние рецепции женских половых гормонов и эффективность экстракорпорального оплодотворения / Савельева Г.М., Карева Е.Н., Сукновалова М.В. и др. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии - 2011. – том 10 – №1 – С. 24-28. 3. Сукновалова М.В. Способ прогнозирования наступления беременности в программе экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов в стандартном длинном протоколе стимуляции суперовуляции / Г.М., Шимановский Н.Л., Сукновалова М.В. и др. Савельева // Бюллетень Изобретения Полезные Модели. Москва. - 2011. - № 27 (IV ч.) - С. 940 4. Сукновалова М.В. Связывающие свойства рецепторов прогестерона с дюфастоном у пациенток включенных в программу экстракорпорального оплодотворения / Сукновалова М.В., Крамаренко М.П., Карева Е.Н. // Вестник Российского Государственного Медицинского Университета. Специальный выпуск – 2011. - №1 - С. 217. 5. Сукновалова М.В. Способ прогнозирования наступления беременности у пациенток, включенных в программу экстракорпорального оплодотворения в стандартном длинном протоколе. / Савельева Г.М., Шимановский Н.Л., Сукновалова М.В. и др.// Лечащий врач – 2013.- №3 – С. 46-50. 6. Сукновалова М.В. Относительная связывающая активность дидрогестерона с рецепторами прогестерона мононуклеарных клеток периферической крови пациенток, включенных в программу ЭКО. / Сукновалова М.В., Бехбудова Л.Х., Клименко М.П. и др. // 126 Экспериментальная и клиническая фармакология – 2013. – том 76 - №7 – С. 24-26. 7. Сукновалова М.В. Фармакологическое обоснование применения дидрогестерона в длинном протоколе программы экстракорпорального оплодотворения. / Сукновалова М.В., Клименко М.П., Нефѐдова И.В. // Материалы II Молодежного международного форума медицинских наук ― MedWAYS": Сборник тезисов научно-практической конференции. Москва 2013, - С. 187. 127 Список литературы. 1. Аржанова О.Н., Жаворонкова Н.В., Пайкачева Ю.М. Невынашивание беременности после экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).// Акуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины. Мат. XXV науч. Сессии НИИ акуш. и гин.– С-П – 1996– 1997. – С. 17–19 2. Бассалык Л.С. Рецепторы стеродных гормонов в опухолях человека М. // Медицина, 1987. - 223 С. 3. Бехбудова Л.Х., Горенкова О.С., Карева Е.Н. Рецепция половых стероидов в мононуклеарах периферической крови пациенток с миомой матки. //Ж. Health & education millennium, 2014, том 16 № 2, С.1-3. 4. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика.– М. // «Практика» 1999 - 459 С. 5. Добротворцева О.А. Морфологические исследования эндометрия при различных формах бесплодия // Акушерство и гинекология – М. – 1987 – №11- С. 9-25. 6. Ицхоки О. Выбор модели и парадоксы прогнозирования // Квантиль 2006, № 1, С.43-51. 7. Карева Е. Н., Гаспарян Н. Д., Маняхина А. Е., Горенкова О. С. Рецепторы прогестерона и эстрадиола в мононуклеарной фракции клеток периферической крови у пациенток позднего репродуктивного возраста с миомой матки. // Психофармакология и биологическая наркология, Том 7, № 4 -2007. 8. Карева Е.Н., Шимановский Н.Л. Молекулярная фармакология эстрогенов.// Молекулярная медицина - 2011, N1, С.10-18 9. Карева Е.Н., Шимановский Н.Л. // Молекулярные механизмы действия гестагенов. Ж. Эксп. и клиническая фармакология, 2011, т.74, №4, С.36-42. 128 10. Карева Е.Н. Механизмы действия прогестерона. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2003, № 2, С.3-10. 11. Карева Е.Н., Ганковская Л.В., Шимановский Н.Л., Половые стероиды и иммунитет. // Российский иммунологический журнал, 2012, том 6(15), № 1, С. 3–13. 12. Кулаков В.И. Репродуктивное здоровье населения Poccии//Consilium medicum. - 2007. - №2.- С. 26 13. Михнина Е.А. Гормональная функция яичников и рецепция эстрадиола и прогестерона эндометрием у женщин с невынашиванием беременности ранних сроков: Автореф. дис. канд.мед.наук. – СанктПетербург ,1995. 14. Михнина Е.А. Морфофункциональное состояние эндометрия у женщин с бесплодием и невынашиванием беременности: Автореф. дис. доктора. мед.наук. – Санкт-Петербург , 2009. 15. Никитин А.И. Факторы неудач в программах вспомогательной репродукции. // Проблемы репродукции – М. – 1995 - №1(2) С. 36–43. 16. Побединский Н.М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия. // Акушерство и гинекология – М. – 2000 – №3 С. 5–7. 17. РАРЧ. Регистр центров ВРТ. Отчет за 2009 год. Проблемы репродукции №6 - 2011. 18. Розен В.Б. Основы эндокринологии. - М. – Медицина – 1994 - 384 С. 19. Савельева Г.М.// Акушерство, Геотар Медиа- Москва -2010 – 656 С. 20. Светлаков A.B., Яманова М.В., Салмина А.Б., Серебренникова O.A. Вероятность наступления имплантации у женщин с разными формами бесплодия при лечении методом ЭКО // Проблемы репродукции.2002.- № 3.- С. 61-66. 129 21. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л., Петров В.И. Рецепторы физиологически активных веществ: Монография.– Волгоград: 7 ветров, 1999-638 C. 22. Сергеев П.В., Шимановский Н.Л. Рецепторы. М. – 1987 – 400 С. 23. Сергеев П.В., Духанин А.С., Шимановский Н.Л. Плазматическая мембрана клетки-мишени и стероидные гормоны: начало спора или его завершение. // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 1995 – т. 120 - №10 – С.342-348. 24. Серова О.Ф., Гормональные препараты в программе прегравидарной подготовки женщин с невынашиванием беременности // Consilium Medicum (экстра выпуск). - 2000- С.11-12. 25. Смольникова В.Ю., Леонов Б.В. Аналоги гонадолиберина в программе ЭКО и переноса эмбрионов в полость матки. – 1996-№2-С. 82-84 26. Фисенко В.П. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ // Ремедиум, Москва – 2000 – 398 С. 27. Флетчер Р.Ф., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология // Основы доказательной медицины. – 1998 – 352 С. 28. Шимановский Н.Л., Епинетов М.А., Мельников М.Я. Молекулярная и нанофармакология. М. // Физматлит – 2010 - 624С. 29. Ace C. I and Okulicz W. C. Differential gene regulation by estrogen and progesterone in the primate endometrium //Molecular and Cellular Endocrinology - 1995 – Vol. 115 – P. 95-103 30. Acosta A.A., Elberger L., Borghi M. et al. Endometrial dating and determination of the window of implantation in healthy fertile women // Fertility and Sterility - Vol. 73 - 2000 – P. 788-798 31. Aplin J., Spanswick C., Behzard F. et al. Integrins b3, b5 and av are apically distributed in endometrial epithelium. // Mol Hum Reprod - 1996 - 2-P. 527– 534. 32. Backer M.N.// Paper presented at the Int Conf Horm Steroids.- Milan -1962. 130 33. Barzel U.S. Estrogens in the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis // American Journal of Medicine – 1988 – 85-P.847-850. 34. Beato M. Gene regulation by steroid hormones // Cell – 1989 – 324- P. 335344 35. Beato M., Chaves S., Truss M. Transcriptional regulation by steroid hormones // Steroids – 1996 – 61-P. 240-251 36. Beato M., Klug J. Steroid hormone receptors: An update // Hum Reprod Update – 2000 – 6- P. 225-236. 37. Bergqvist A., Fernö M., Skoog L. Quantitative enzyme immunoassay and semiquantitative immunohistochemistry of oestrogen and progesterone receptors in endometriotic tissue and endometrium.// J Clin Pathol. -1997 Jun;50(6)- P.496-500. 38. Boomsma C.M., Kavelaars A., Eijkemans M.J., Lentjes E.G., Fauser B.C., Heijnen C.J., Macklon N.S. Endometrial secretion analysis identifies a cytokine profile predictive of pregnancy in IVF.// Hum Reprod. - 2009 Jun;24(6):P.1427-1435. 39. Boyum A. Separation of leukocytes from blood and bone marrow//Scand.J.Clin.Lab.Investing. – 1968 – 21(97) – P.1-9. 40. Brodin T., Bergh T., Berglund L., Hadziosmanovic N., Holte J.High basal LH levels in combination with low basal FSH levels are associated with high success rates at assisted reproduction. //Hum Reprod. 2009 Nov;24(11)-P. 2755-2759. 41. Brosens J., Verhoeven H., Campo R., Gianaroli L., Gordts S., Hazekamp J., Hägglund L., Mardesic T., Varila E., Zech J., Brosens I. High endometrial aromatase P450 mRNA expression is associated with poor IVF outcome.// Hum Reprod.- 2004 Feb;19(2) – P.352-356. 131 42. Butts C.L., Shukair S.A., Duncan K.M., Harris C.W., Belyavskaya E., Sternberg E.M. Evaluation of steroid hormone receptor protein expression in intact cells using flow cytometry.// Nucl Recept Signal.- 2007. 43. Bischof P., Haenggeli L., Campana A. Gelatinase and oncofetal fibronectin secretion are dependent upon integrin expression in human cytotrophoblast. // Mol Hum Reprod – 1995 – 10- P. 734–742. 44. Ceydeli N., Kaleli S., Calay Z. et al. Difference in αvβ3 integrin expression in endometrial stromal cell in subgroups of women with unexplained infertility // European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology – Vol. 126 – 2006 – P. 206-211 45. Christin-Maitre S., Chabbert-Buffet N., Bouhard Ph. Action of estrogen and progesterone at the cellular level. // In: ― Estrogens and progestins in clinical practice‖ Ed. Fraser IS. – London – 1998 - P.119-134. 46. Conneely O.M., Kettelberger D.M., Tsai M.J., Schrader W.T., O’Malley B.W. The chicken progesterone receptor A and B isoforms are products of alternate translation initiation event. // J Biol Chem – 1989 – 264- P. 14062-14064. 47. Conneely O.M., Mulac-Jericevic B., DeMyo F. Reproductive functions of the progesterone receptor isoforms: lessons from knock-out mice // Mol Cell Endocrinol – 2001 - 179(1-2) - P.97-103 48. Creus M., Ordi J., Fabregues F. et al. //Hum Reprod- 2003; 18(4) – P. 683— 693 49. Cutolo M., CapellinoS., Montagna P., Ghiorzo P.,Sulli A; Villaggio B., Sex Hormone Modulation of Cell Growth and Apoptosis of the Human Monocytic/Macrophage// Cell Line Arthritis Res Ther. - 2005;7(5) – P.1124-1132 50. Coutifaris C., Myers E.R., Guzick D.S. et al. NICHD National Cooperative Reproductive Medicine Network. Histological dating of timed endometrial 132 biopsy tissue is not related to fertility status. //Fertility and Sterility 82, 2004- P. 1264–1272. 51. Cvoro A., Tatomer D., Tee M.K. et al. Selective estrogen receptor-beta agonists repress transcription of proinflammatory genes // Immunol. – 2008. – Vol.180, N1. – P.630-636. 52. Dekel N., Gnainsky Y., Granot I., Mor G. Inflammation and Implantation. //Am J Reprod Immunol.- 2010; 63(1) – P. 17–21. 53. Dosiou C., Hamilton A.E., Pang Y., Overgaard M.T., Tulac S., Dong J., Thomas P., Giudice L.C.: Expression of membrane progesterone receptors on human T lymphocytes and Jurkat cells and activation of G-proteins by progesterone.// J Endocrinol - 2008; 196-P.67–77. 54. Diedrich K., Fauser B.C., Devroey .P., Griesinger G. The role of the endometrium and embryo in human implantation.// Hum Reprod Update. 2007 Jul-Aug;13(4) – P.365-377. 55. Eaker E.D., Chesebro J.H., Sacks F.M., Wenger N.K., Whisnant J.P. AHA medical/scientific statement special report on cardiovascular disease in women.// Circulation - 1993;88(4) – P.1999-2009. 56. Ermisch C., Markert U.R., Geburtshilfe Z.,//Neonatology, 215(3) ,P.93-97 2011. 57. Erickson G. and Shimasaki S. The physiology of folliculogenesis: the role of novel growth factors. // Fertil Steril - vol. 76 – 2001 - P. 943-949. 58. El-Zibdeh M.J. et al. Interferons in dermatology: Present-Day Standard // Fertil Steril 1998 – 70 - P. 77-78. 59. Faddy M. and Gosden R. A mathematical model of follicle dynamics in the human ovary. // Human Reproduction - vol. 10 - 1995 - P. 770-775. 60. Falkenstein E., Tillman H.-C., Christ M., Feuring M., Wehling M Multiple actions of steroid hormones – a focus on rapid, nongenomic effects // Pharmacological Review – 2000 – 52 – P. 513-555 133 61. Freour T., Masson D., Mirallie S., Jean M., Bach K., Dejoie T., Barriere P. Active smoking compromises IVF outcome and affects ovarian reserve.// Reprod Biomed Online.- 2008- Jan;16(1)-P. 96-102. 62. Fukui A., Kwak-Kim J., Ntrivalas E. et al. Intracellular cytokine expression of peripheral blood natural killer cell subsets in women with recurrent spontaneous abortions and implantation failures // Fertility and Sterility – 2007 – P.427-431. 63. Funder J.W. Aldosterone and mineralocorticoid receptors: Orphan questions. // Kidney Int – 2000 – 57 – P. 1358-1363. 64. Genazzani A.R. Solvey Farmaceutical Sympoz. // Synergy Med. Education – 2002 – P. 11-13. 65. Giangrande H.P., Kimbrel E.A., Edwards DP, McDonell DP The opposing transcriptional activities of the two isoforms of hPR are due to differential cofactor binding.// Moll Cell Biol. – 2000 – 20 - P. 3102-3115. 66. Giangrande H.P., Pollio G., McDonell Mapping and characterization of the functional domains responsible for the differential activity of the A and B isoforms of the human progesterone receptor.// J Biol Chem – 1997 – 272 – P. 32889-32900. 67. Ginter O., Wiltbank M., Fricke P., Gibbons J. and Kot K. Immunological changes and stress are associated with different implantation rates in patients undergoing in vitro fertilization–embryo transfer // Fertility and Sterility, Vol. 76, 2001, P. 85-91 68. Glass C., Rosenfel M.G., The coregulator exchange in transcriptional functions of nuclear receptors. // Genes Dev – 2000 – 14 – P.121-141. 69. Glasser S.R., Aplin J.D., Giudice L.C., Tabibzadeh S.// The Endometrium. London: Taylor&Francis- 2002; P. 675. 70. Gougeon A. Regulation of ovarian follicular development in primates: facts and hypotheses. // Endocrine Reviews - vol. 17 - 1996 - P.121-155. 134 71. Greene G.L., Gilna P., Waterfield M., Baker A. et al. Sequence and expression of human estrogen receptor complementary DNA // Science – 1986 – 231 – P. 1150-1154. 72. Griekspoor A., Zwart W., Neefjes J., Michalides R., Visualizing the action of steroid hormone receotors in living cells.// The Open Access journal of the Nuclear Receptor Signaling Atlas – 2007 – P. 1-9. 73. Groome N., Illingworth P., O’Brien M. et al. Measurement of dimeric inhibin B throughout the human menstrual cycle. // J Clin Endocrinol Metab - vol. 81 – 1996 - P.1401-1405. 74. Guerra-Araiza C., Camacho-Arroyo I. Progesterone receptor isoforms: funktion and regulation. // Rev.Invest.Clinica – 2000 - vol.52 - 6th - P.686691. 75. Guiochon-Mantel A., Loosfelt H., Lescop P., Sar S., Atger M., PerrotApplant V., Milgrom E. Mechanism of nuclear localization of the progesterone receptor: evidence for interaction between monomers. // Cell – 1989 – 57 – P. 1147-1154. 76. Guiochon-Mantel A., Lescop P., Christin-Maitre S. et al. Nucleocytoplasmic shuttle of the progesterone receptor. // EMBO J – 1991 – 10 – P. 3851-3859. 77. Gustafsson J.-A. Estrogen receptor b - a new dimension in estrogen mechanism of action. // J Endocrinol – 1999 – 163 – P.379-383. 78. Guzeloglu-Kayisli O., Kayisli U.A., Taylor H.S.. The role of growth factors and cytokines during implantation: endocrine and paracrine interactions.// Semin Reprod Med. -2009 Jan;27(1) – P.62-79. 79. Hasty L.A., Lambris J.D., Lessey B.A., et al. Hormonal regulation of complement components and receptors through the menstrual cycle. // Am J Obstet Gynecol – 1994 – 170 – P.168–175. 135 80. Heilmann L., Schorsch M., Hahn T. CD3-CD56+CD16+ natural killer cells and improvement of pregnancy outcome in IVF/ICSI failure after additional IVIG-treatment.// Am J Reprod Immunol. - 2010 Mar 1;63(3) – P.263-265. 81. Heng S., Hannan N.J., Rombauts L..J, Salamonsen L.A., Nie G. PC6 levels in uterine lavage are closely associated with uterine receptivity and significantly lower in a subgroup of women with unexplained infertility.// Hum Reprod. - 2011- Apr;26(4) – P.840-846. 82. Hilary O. D. Critchley, Rodney W. K. Antiprogestins as a model for progesterone withdrawal // Steroids – Vol. 68 – 2003 – P. 1061-1068 83. Horwitz K.B., Alexander P.S. In situ photolinked nuclear progesterone receptors of human breast cancer cells: subunit molecular weight after transformation and translation. // Endocrinology – 1983 – 113 – P. 2195-2201. 84. Hovland A., Powell R., Takimoto G., Tung L., Horwitz K. An N-terminal inhibitory function, IF, supresses transcription by the A-isoform but not the Bisoform of hPR. // J Biol.Chem. – 1998 – 273 – P. 5455-5460. 85. Kelly R.W., King A.E., Critchley H.O. D. Inflammatory mediators and endometrial function—focus on the perivascular cell // Journal of Reproductive Immunology – Vol.57-2002 - P.81-93 86. Kimmins S., Lim H.C., Parent J. et al. The effects of estrogen and progesterone on prostaglandins and integrin beta 3 (β3) subunit expression in primary cultures of bovine endometrial cells // Domestic Animal Endocrinology – Vol. 25 – 2003 – P. 141-154 87. Klentzeris L.D., Bulmer J.N., Seppala M. et al. Placenta protein 14 in cycles with normal and retarded endometrial differentiation. // Hum Reprod – 1994 – 9 - P. 394–398. 88. Klentzeris L.D., Bulmer J.N., Warren М.A. Lymphoid tissue in the endometrium of women with unexplained infertility: morphometric immunohistochemical aspects. // Hum Reprod – 1994 - 9 – P. 646–652. 136 89. Klentzeris L.D., Bulmer J., Trejdosiewicz L. b1 integrin cell adhesion molecules in the endometrium of fertile and infertile women. // Hum Reprod – 1993 – 8 – P. 1223–1230. 90. Klentzeris L.D., Fishel S., McDermott H. A positive correlation between expression of b1 integrin cell adhesion molecules and fertilizing ability of human spermatozoa in vitro. // Mol Hum Reprod – 1995 – 10 – P. 728–733. 91. Klentzeris L.D., Fishel S., MacDermott H. The role of sperm b1-integrin cell adhesion molecules in fertilization by intracytoplasmic sperm injection. // Proceedings of the 51st Annual Meeting of the American Society for Reproductive Medicine – 1995 – P.7—12 92. Klentzeris L.D., Moran V., Turner R.. The endometrial profile of women with recurrent implantation failure following embryo transfer in an IVF programme. // Hum Reprod – 1997 – 12 – P. 35. 93. Kurita T., Ki-jun L., Saunders P.T. Regulation of progesterone receptors and decidualization in uterine stroma of the estrogen receotor- knockout mouse. // Biol Reprod – 2001-64-P.272-283. 94. Lange C.A., Shen T., Horwitz K.B. Phosphorilation of hPR at serine-294 by MAPK- signals their degradation by the 26S proteosome. // Proc Natl Acad Sci USA – 2000 – 97 – P. 1032-1037. 95. Lédée-Bataille N., Laprée-Delage G., Taupin J.L., Dubanchet S., Frydman R., Chaouat G. Concentration of leukaemia inhibitory factor (LIF) in uterine flushing fluid is highly predictive of embryo implantation.// Hum Reprod. 2002 Jan;17(1) – P.213-218. 96. Lee T.H., Liu C.H., Huang C.C., Hsieh K.C., Lin P.M., Lee M.S. Impact of female age and male infertility on ovarian reserve markers to predict outcome of assisted reproduction technology cycles.// Reprod Biol Endocrinol. - 2009- Sep 17 – P.100-107. 97. Leonhard S.A., Altman M., Edwards D.P. Agonist and antagonist induce homodimerization and mixed ligand heterodimerization of hPR in vivo by 137 mammalian two-hybrid assay. // Mol. Endocrinol – 1998 – 12 – P. 19141930. 98. Lessey B., Castlebaum A., Sawin S. Aberrant integrin expression in the endometrium of women with endometriosis. // Fertil Steril – 1994 – 79 – P. 643–649. 99. Lessey B.A., Ilesanmi A.O., Castelbaum A.J. Characterization of the functional progesterone receptor in an endometrial adenocarcinoma cell line (Ishikawa): Progesterone-induced expression of the α1 integrin // The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology – Vol. 59 – 1996 - P.31-39. 100. Lessey B.A. Two pathways of progesterone action in the human endometrium: implications for implantation and contraception // Steroids– Vol.68-2003, P.809-815 101. Levy D., Navarro J., Schattman G., Davis O., Rosenwaks Z. Exogenous LH: let’s design the future. // Human Reproduction - vol. 15 - 2000 - P. 22582265. 102. Lonard D.M., Nawaz Z., Smith C.L., O’Malley B.W. The 26s proteosome is required for estrogen receptor-alpha and coactivator turnover and for efficient ER transactivation. // Mol. Cell – 2000 – 5 – P. 939-948. 103. Lopata A. Implantation of the human embryo. // Hum Reprod – 1996 – 11 – P. 175–184. 104. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem., 193 – 1951 – P.265-275. 105. Maubon A., Faury A., Kapella M., Pouquet M., Piver P. Uterine junctional zone at magnetic resonance imaging: A predictor of in vitro fertilization implantation failure.// J. Obstet. Gynaecol. Res. Vol. 36, No. 32010 – P.611–618. 106. McGee E., Hsueh A. Initial and cyclic recruitment of ovarian follicles // Endocrine Reviews - vol. 21 – 2000 - P. 200-214. 138 107. McKenna N.J., Lanz R.B., O’Malley B.W. Nuclear receptor coregulators:Cellular and molecular biology. // Endocr Rev – 1999 – 20 – P.321–344 108. Mouzon J, V. Goossens, S. Bhattacharya, J.A. at al. The European IVF-monitoring (EIM) Consortium, Assisted reproductive technology in Europe, 2006: results generated from European registers by ESHRE,// Human Reproduction 2010 109. Misrahi M., Atger M., d’Auriol L. et al Complete amino acid sequence of the human progesterone receptor deduced from cloned cDNA. // Biochemical and Biohyesical Research Communications – 1987 – 143 – P. 740-748. 110. Miller V.M., Duckles S.P. Vascular Actions of Estrogens: Functional Implications // Pharmacol. Rev. – 2008. – Vol. 60, N2. – P.210–241. 111. Mulac-Jericevic B., Mullinax R.A., DeMayo F.J., Lydon J.P., Conneely O.M. Subgroup of reproductive functions of progesterone mediated by progesterone receptor-B isoform. // Science – 2000 - 289(5485) – P.17511754. 112. Murphy C.R., Rogers A.W. Effects of ovarian hormones on cell membranes in the rat uterus. III. The surface carbohydrates at the apix of the luminal epithelium. // Cell Biol – 1981 – 3 – P. 305–320. 113. Noci I., Borri P., Coccia M.E., et al. Taddei-Hormonal patterns, steroid receptors and morphological pictures of endometrium in hyperstimulated IVF cycles. // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol – 1997 - 75(2) – P. 215–220. 114. Noyes N., Hampton B.S., Berkeley A., et al. Factors useful in predicting the success of oocyte donation: a 3-year retrospective analysis. // Fertil Steril – 2001 - 76(1) – P. 92–97. 115. Heng S., Hannan N.J., Rombauts .LJ., Salamonsen L.A., Nie G. PC6 levels in uterine lavage are closely associated with uterine receptivity and 139 significantly lower in a subgroup of women with unexplained infertility.// Hum Reprod. 2011 -4 - P.840-846. 116. O’Malley B.W., Schrader W.T., Mani S., Smith C. et al. An alternative ligand-dependent pathway for activation of steroid receptors // Recent Progress in Hormone Research – 1995 – 50 – P. 333-347 117. Ozkan S., Jindal S, Greenseid K. at al. Replete vitamin D stores predict reproductive success following in vitro fertilization.// Fertil Steril. 2010 - 4 – P.1314-1319. 118. Orvieto R, Nahum R, Meltcer S. at al. Ovarian stimulation in polycystic ovary syndrome patients: the role of body mass index. Reprod Biomed Online. -2009- 3 – P.333-336. 119. Oudendijk J.F., Yarde F., Eijkemans M.J.C., Broekmans F.J.M., and Broer S.L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor? A systematic review Hum. Reprod. Update - Jan 2012 - 1 – P.1-11. 120. Pasqualini J.R. Progestins: presents and future. // J Steroid Biochem Molec Biol – 1996 – 59 – P.357-363. 121. Prapapanich V, Chen S, Nair SC, Rimermann RA et al. Molecular cloning of human p48 – a transient component of progesterone receptor complexes and an Hsp 70-binding protein. // Molecular Endocrinology – 1996 – 10 – P.420-431. 122. Pratt W.B., Toft D.O. Steroid receptor interactions with heat shock protein and immunophilin chaperones // Endocrinol Rev – 1997 – 18 – P. 306360. 123. Radhupathy R. Functions of embryonic interferons and of the main serum proteins specific for pregnancy // Hum Reprod – 2000 – 15 – P. 713718. 124. Ray R., Novotny N.M., Crisostomo P.R. et al. Sex Steroids and Stem Cell Function // Mol. Med. – 2008. Vol. 14, N (7-8). – P. 493–501. 140 125. Salha O., Abusheika N. and Sharma V. Dynamics of follicular growth and in vitro oocyte maturation. // Human Reproduction Update - vol.4 – 1998 P. 816-832. 126. Sartorius C.A., Melville M.Y., Hovland A.R. A third transactivation function (AF-3) of human progesterone receptors located in the unique Nterminal segment of the B-isoform. // Molecular Endocrinology – 1994 – 8 – P. 1347-1360. 127. Schwabe J.W.R., Chapman L., Finch J.T., Rhodes D. The crystal structure of the estrogen receptor DNA-binding domain bound to DNA: how receptor discriminate between their response element. // Cell – 1993 - 75 – P. 567-578. 128. Selye H. Correlation between the chemical structure and the pharmacological actions of the steroids // Endocrinology – 1942 – 30 – P. 437453 129. Serafini PC, Silva ID, Smith GD, at al. Endometrial claudin-4 and leukemia inhibitory factor are associated with assisted reproduction outcome. Reprod Biol Endocrinol. 2009 - 19 – P.30-37. 130. Shoonen W.G., Dijkema R., de Ries R.J., Wagenaas J.L. et al. Human progesterone receptor A and B isoforms in CHO cells. // J Steroid Biochem Molec Biol – 1998 – 64 – P. 157-170. 131. Simon C., Piquette G.N., Frances A. et al. Interleukin-1 type I receptor messenger ribonucleic acid (mRNA) expression in human endometrium throughout the menstrual cycle. // Fertil Steril – 1993 – 59 – P. 791–796. 132. Singh M., Chaudhry P., and Asselin E., Bridging endometrial receptivity and implantation: network of hormones, cytokines, and growth factors,//Journal of Endocrinology, 2011 – P.2105-2114. 133. Speroff L. and Marc A. Fritz// Clinical gynecologic endocrinology and infertility, 7-th edition, Lippincott Williams Wilkins - 2005. 141 134. Sunder S. and Lenton E.A. Endocrinology of the peri-implantation period // Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology – Vol. 14- 2000-P.789-800 135. Szekeres-Bartho J, Polgar B. PIBF: The Double Edged Sword. Pregnancy and Tumor.// Am J Reprod Immunol – 2010 - 64- P.77–86. 136. Tabibzadeh S. Patterns of expression of integrin molecules in human endometrium throughout the menstrual cycle. // Hum Reprod – 1992 – 7 – P. 876–888. 137. Tartakovsky B., Goldstein О., Broshi N. Colony stimulation factor-1 blocks early pregnancy in mice. // Biol Reprod – 1991 – 44 – P. 906–912. 138. Tavaniotou A., Bourgain C., Albano C.et al. Endometrial integrin expression in the early luteal phase in natural and stimulated cycles for in vitro fertilization// European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology – Vol.108-2003-P.-67-71 139. Tetel MJ., Giangrande PH., Leonhardt SA.,Donald P. McDonnell, and Dean P. Edwards Hormone-Dependent Interaction between the Amino- and Carboxyl-Terminal Domains of Progesterone Receptor in Vitro and in Vivo // Molecular Endocrinology – 1999 – 13 – P.910–924. 140. Tei C., Maruyama T., Kuji N. at al. Reduced expression of alphavbeta3 integrin in the endometrium of unexplained infertility patients with recurrent IVF-ET failures: improvement by danazol treatment. // J Assist Reprod Genet. 2003 – 20 - P.13-20. 141. Thum M.Y., Bhaskaran S., Bansal A.S. at al. Enumerations of peripheral blood natural killer (CD56+ NK) cells, B cells and T cells have no predictive value in IVF treatment outcome. //Hum Reprod. - 2005 - 20– P.1272-1276. 142. Quenby S., Kalumbi C., Bates M., Farquharson R., Vince G.Prednisolone reduces preconceptual endometrial natural killer cells in women with recurrent miscarriage. //Fertil Steril. – 2005 - 84– P.980-984. 142 143. Vegeto E., Shahbaz M., Wen X., Goldman M., O’Malley B.W. Human progesterone receptor A form is a cell- and promoter- specific repressor of human progesterone receptor B function. // Mol. Endocrinol. – 1993 – 7 – P. 1244-1255. 144. Walter P., Green S., Greene G. et al Cloning of the human estrogen receptor cDNA. // Proceedings of the National Academy of Science – USA – 1985 – 82 – P.7889-7893. 145. Yaman C., Ebner T., Sommergruber M., et al. Role of three-dimensional ultrasono-graphic measurement of endometrium volume as a predictor of pregnancy outcome in an IVF-ET program: a preliminary study. // Fertil Steril – 2000 - 74(4) – P.797–801. 146. Yoshioka H., Harada T. Menstrual cycle–specific inhibition of the proliferation of endometrial stromal cells by interleukin 6 and its soluble receptor // American Journal of Obstetrics and Gynecology, Vol. 180 – 1999 – P.1088-1094. 147. Zhou L., Li R., Wang R., Huang H.X., Zhong K. Local injury to the endometrium in controlled ovarian hyperstimulation cycles improves implantation rates. //Fertil Steril. 89– 2007 - P.11661176.
