докторской диссертации
advertisement
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ____________________ ГУ РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР им. Н.Н. Блохина На правах рукописи КАРАМЫШЕВА АИДА ФУАДОВНА РЕГУЛИРУЮЩАЯ ЛИМФАНГИОГЕНЕЗ РЕЦЕПТОРНАЯ ТИРОЗИНКИНАЗА FLT4 (VEGFR3) И ЕЕ УЧАСТИЕ В ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ 14.00.14 «Онкология» ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2003 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Стр. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Основные типы клеток, входящие в состав сосудов. Формирование первичной сосудистой сети (васкулогенез) и ангиогенез 2. Активация ангиогенеза при опухолевом росте 3. Факторы роста клеток эндотелия сосудов 3.1. Факторы роста фибробластов 3.2. Фактор роста эндотелия сосудов VEGF-A Изоформы фактора роста VEGF-A 3.3. Другие факторы роста семейства VEGF Фактор роста VEGF-B Фактор роста VEGF-С Фактор роста VEGF-D Фактор роста VEGF-Е Плацентарный фактор роста 4. Рецепторы факторов роста семейства VEGF 4.1. Рецепторы, взаимодействующие с фактором роста VEGF-A (VEGFR1 и VEGFR2) 4.2. Рецептор VEGFR3 4.3. Нейропилины 5. Сигнальная система Tie2/Ang 5.1. Семейство рецепторов Tie и взаимодействующие с ними факторы роста 3 5.2. Процессы, контролируемые сигнальной системой Tie2/Ang-1 при формировании сосудов 6. Процесс формирования сосудов в норме и в опухоли и участие в нем сигнальных систем 7. Сигнальные пути, в которых участвуют рецепторы семейства VEGFR 7.1. Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR1 7.2. Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR2 7.3. Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR3 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Клонирование гена FLT4 (VEGFR3) человека 1.1.Секвенирование и анализ клонов, кодирующих трансмембранный и тирозинкиназные домены белкового продукта гена FLT4 (VEGFR3) 1.2.Секвенирование и анализ клонов, кодирующих внеклеточную область белкового продукта гена FLT4 (VEGFR3) 1.3.Секвенирование и анализ клонов, содержащих 3’-область гена FLT4 (VEGFR3) 2. Определение хромосомной локализации генов Flt4 (VEGFR3) мыши и FLT4 (VEGFR3) человека 3. Частичное клонирование гена Flt4 (VEGFR3) мыши 4. Исследование экспрессии гена FLT4 (VEGFR3) в линиях клеток человека и грызунов, в плаценте человека и в нормальных тканях мыши методом Норзерн блот-гибридизации 4.1. Исследование экспрессии гена FLT4 (VEGFR3) в линиях опухолевых клеток и плаценте человека 4.2. Исследование экспрессии гена Flt4 (VEGFR3) в нормальных тканях мыши и в трансформированных линиях клеток грызунов 4 5. Исследование экспрессии генов рецептора FLT4 (VEGFR3) и его лиганда VEGF-С в линиях опухолевых клеток человека и трансформированных клеток экспериментальных животных методом RT-PCR 6. Исследование роли VEGF-С/FLT4 (VEGFR3)-зависимой сигнальной системы в регуляции пролиферации клеток 7. Исследование экспрессии гена Flt4 (VEGFR3) в спонтанных и перевиваемых гепатомах мыши 8. Исследование экспрессии генов FLT4 (VEGFR3) и его лиганда VEGF-C в опухолях человека 8.1. Исследование экспрессии FLT4 (VEGFR3) в опухолях человека методом Норзерн блот-гибридизации 8.2. Исследование экспрессии FLT4 (VEGFR3) и заимодействующего с ним фактора роста VEGF-C при злокачественной и доброкачественной патологии щитовидной железы человека методом RT-PCR 8.3. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков FLT4 (VEGFR3) и VEGF-C в опухолях щитовидной железы человека. Сравнение с нормальной окружающей тканью 8.4. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков FLT4 (VEGFR3) и CD 31 в опухолях щитовидной железы человека ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПРИЛОЖЕНИЕ 1 ПРИЛОЖЕНИЕ 2 ПРИЛОЖЕНИЕ 3 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ БЛАГОДАРНОСТИ 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ VEGF – фактор роста эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor) VEGFR – рецептор фактора роста эндотелия сосудов (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor) FGF – фактор роста фибробластов (Fibroblast Growth Factor) FGFR – рецептор фактора роста фибробластов (Fibroblast Growth Factor Receptor) PDGF – тромбоцитарный фактор роста (Platelet Derived Growth Factor) PDGFR – рецептор тромбоцитарного фактора роста (Platelet Derived Growth Factor Receptor) TK-домены – тирозинкиназные домены ИГ-домены – иммуноглобулинподобные домены ТМ домен – трансмембранный домен РТК – рецепторные тирозинкиназы bp – пары оснований 6 ВВЕДЕНИЕ Необходимым условием роста и развития опухолей является ангиогенез – возникновение в них новой сосудистой системы. Понимание механизмов, регулирующих процессы формирования и развития систем кровеносных и лимфатических сосудов опухоли, может предоставить дополнительные возможности для терапии и диагностики злокачественных новообразований. Важным достижением исследований в этой области за последнее десятилетие явилось обнаружение специфических рецепторов (VEGFR), локализованных на поверхностной мембране клеток эндотелия сосудов и взаимодействующих с ними факторов роста (VEGF). Рецепторы VEGFR и их лиганды через связанные с ними сигнальные системы регулируют многие ключевые этапы формирования сосудов, включая пролиферацию клеток эндотелия кровеносных и лимфатических сосудов, их дифференцировку из клеток-предшественников, а также процессы, приводящие к образованию зрелой сосудистой системы. Экспрессия всех 3-х рецепторов VEGFR совершенно необходима для формирования сосудов: отсутствие хотя бы одного из этих рецепторов приводит к нарушениям, несовместимым с жизнью эмбриона. Рецепторы VEGFR и их лиганды – VEGF оказались удобными молекулярными маркерами, исследование экспрессии которых дает возможность оценить состояние сосудистой системы и активность ангиогенеза в ткани. Оценка этих показателей является важной с точки зрения прогноза дальнейшего развития новообразований, т.к. увеличение размеров и прогрессия опухоли тесно связаны со стимуляцией роста в ней новых сосудов. Кроме того, обнаружение рецепторов VEGFR и их лигандов предоставило возможность для поиска подходов к изменению активности ангиогенеза в ткани за счет стимуляции или ингибирования связанных с этими молекулами сигнальных систем. 7 В нашей работе был впервые клонирован один из рецепторов клеток эндотелия сосудов – FLT4 (VEGFR3). Анализ структуры рецептора FLT4 (VEGFR3) показал, что он принадлежит к суперсемейству рецепторных тирозинкиназ и наиболее гомологичен рецепторам FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2) семейства факторов роста эндотелия сосудов VEGF. При этом оказалось, что в отличие от двух других рецепторов VEGFR, локализованных, в основном, на клетках эндотелия кровеносных сосудов, FLT4 (VEGFR3) преимущественно локализован на клетках эндотелия лимфатических сосудов, являясь тем самым одним из первых специфических маркеров лимфатических сосудов [Kaipainen A., et al, 1995]. Идентификация FLT4 (VEGFR3) в качестве маркера лимфатической системы, исследование уровня его генной экспрессии и распределения белка в опухолях и в нормальной ткани давали возможность изучить изменения, происходящие в лимфатической системе в процессе развития опухоли. Ранее, из-за отсутствия специфических маркеров, позволяющих различать эндотелий кровеносных и лимфатических сосудов, характеристика изменений, происходящих с лимфатической сосудистой системой при озлокачествлении ткани, была затруднена. Цель дальнейшей работы заключалась в исследовании возможной роли рецептора FLT4 (VEGFR3) и связанных с ним сигнальных систем в опухолевой прогрессии и в регуляции пролиферации экспрессирующих этот рецептор клеток. В соответствии с этим, были поставлены следующие задачи: 1. Исследовать экспрессию FLT4 (VEGFR3) и его лиганда VEGF-С в культурах нормальных и трансформированных клеток человека и грызунов. 2. Исследовать роль FLT4 (VEGFR3)-зависимой сигнальной системы в регуляции пролиферации экспрессирующих этот рецептор клеток. 8 3. Исследовать экспрессию гена FLT4 (VEGFR3) в спонтанных и индуцированных гепатомах мыши. 4. Исследовать экспрессию гена FLT4 (VEGFR3) и его лиганда VEGF-С в образцах с различной патологией щитовидной железы человека, включающей в себя как доброкачественные и злокачественные опухоли, так и неопухолевые пролиферативные изменения. 5. Исследовать распределение белка FLT4 (VEGFR3) и VEGF-С в аденомах и аденокарциномах щитовидной железы человека. 6. Сравнить распределение и активность маркера кровеносных сосудов CD31 и маркера лимфатических сосудов FLT4 (VEGFR3) в аденокарциномах щитовидной железы человека. При исследовании экспрессии генов FLT4 (VEGFR3) и его лиганда VEGF-С в культуральных линиях трансформированных клеток было установлено, что в линиях клеток, происходящих из солидных опухолей человека, ген FLT4 (VEGFR3) экспрессирован крайне редко, в отличие от практически всегда экспрессирующегося в этих линиях гена VEGF-С. Однако в тех исключительных случаях, когда в этих клетках наблюдается ко-экспрессия обоих генов, связанная с ними сигнальная система может вносить заметный вклад в регуляцию клеточной пролиферации. В нашей работе были впервые получены данные об экспрессии генов рецептора FLT4 (VEGFR3) и одного из его лигандов – VEGF-С в образцах с различной патологией щитовидной железы человека: в злокачественных и доброкачественных опухолях, а также при различных зобных патологиях и аутоиммунных тироидитах. Впервые было показано, что экспрессия и гена, и белка FLT4 (VEGFR3) в аденокарциномах щитовидной железы достоверно снижена по сравнению с его экспрессией в аденомах, в других 9 исследованных тиреоидных патологиях или в нормальной ткани щитовидной железы человека. Иммуногистохимическое сравнение экспрессии FLT4 (VEGFR3) и маркера кровеносной системы, CD 31, в аденокарциномах щитовидной железы не выявило аналогичного снижения уровня экспрессии последнего. Таким образом, в нашей работе также впервые показано, что некоторые не являющиеся эндотелиальными опухолевые линии клеток могут экспрессировать рецептор FLT4 (VEGFR3) и его лиганд VEGF-С, и в таких клетках FLT4 (VEGFR3)-зависимая сигнальная система вносит существенный вклад в регуляцию их пролиферациив В нашей работе впервые показано снижение уровня экспрессии маркера лимфатических сосудов FLT4 (VEGFR3) в аденокарциномах щитовидной железы человека по сравнению с другими пролиферативными тиреоидными патологиями и нормальной тканью щитовидной железы. Эти данные указывают на то, что в злокачественных опухолях щитовидной железы не только не происходит стимуляции лимфангиогенеза, но система лимфатических сосудов находится, скорее, в подавленном состоянии. Сравнение экспрессии маркеров лимфатической – FLT4 (VEGFR3) – и кровеносной – CD 31 – систем показало, что такое подавление характерно только для лимфатических сосудов. Более того, уменьшение экспрессии рецептора FLT4 (VEGFR3) в аденокарциномах может приводить к стимуляции ангиогенеза опухоли за счет того, что лиганды этого рецептора – VEGF-C и VEGF-D – в большей степени могут взаимодействовать со своим вторым рецептором – VEGFR2, являющимся основным регулятором формирования кровеносной сосудистой системы. . . 10 ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Проблема стимуляции роста новых сосудов, или ангиогенеза, при развитии опухолевого процесса давно привлекала внимание онкологов. Понимание механизмов, приводящих к возникновению в опухоли новой капиллярной сети, могло предоставить новые возможности для лечения опухолей путем ингибирования ангиогенеза. Более 30 лет назад J.Folkman выдвинул гипотезу о том, что рост солидных опухолей и возникновение метастазов тесно связаны с образованием новых кровеносных сосудов [33]. В настоящее время эта гипотеза в значительной степени подтверждена последними открытиями в области молекулярных и клеточных процессов, участвующих в ангиогенезе опухолей, и прежде всего процессов, касающихся регуляции пролиферации, миграции и взаимодействия клеток, образующих сосуды. В частности, идентифицированы некоторые ключевые молекулы, активирующие и контролирующие эти процессы. I.1. Основные типы клеток, входящие в состав сосудов. Формирование первичной сосудистой сети (васкулогенез) и ангиогенез. Одним из основных типов клеток, формирующих кровеносные сосуды, являются клетки эндотелия, выстилающие внутреннюю поверхность капилляров, артерий и вен. С образования капилляроподобных трубок, стенки которых состоят из эндотелиальных клеток, начинается формирование кровеносной системы при эмбриональном развитии. Далее вокруг капилляров начинают собираться другие клетки мезодермального происхождения, такие как перициты, которые по мере укрупнения сосудов замещаются полностью дифференцированными гладкомышечными клетками, образующими стенки крупных сосудов. И таким образом, исследование процессов, регулирующих пролиферацию, миграцию и 11 взаимодействие именно этих типов клеток в первую очередь необходимо для понимания механизмов ангиогенеза. В эмбриогенезе кровеносные сосуды развиваются в результате 2-х процессов: васкулогенеза и ангиогенеза [18; 120; 126]. Васкулогенез включает в себя дифференцировку клеток эндотелия из клеток- предшественников мезодермального происхождения – ангиобластов, а также пролиферацию, миграцию клеток эндотелия и их последующую сборку в первичную незрелую, слабо функциональную сосудистую сеть. Дальнейшее формирование более сложной и зрелой сосудистой сети происходит в результате ангиогенеза, при котором наблюдается увеличение количества сосудов за счет ветвления и разделения первоначальных капилляров. На этом же этапе происходит созревание сосудов, при котором за счет рекрутирования перицитов и гладкомышечных клеток формируется стенка сосуда. Формирование стенки стабилизирует вновь образованные сосуды, ингибирует пролиферацию и миграцию клеток эндотелия и стимулирует образование внеклеточного матрикса. В организме взрослых млекопитающих сеть кровеносных сосудов обычно находится в покоящемся состоянии, за исключением строго регулируемых процессов, связанных с женскими репродуктивными циклами. Клетки эндотелия – одни из наиболее долгоживущих клеток организма: в нормальном кровеносном сосуде взрослого человека только 1 из каждых 10 000 клеток эндотелия (0,01%) находится в цикле клеточного деления в каждый данный момент времени. Для сравнения, около 14% нормальных клеток эпителия кишечника находятся в цикле клеточного деления. Таким образом, время замещения клеток кишечника измеряется днями, а клеток эндотелия – годами [54]. Однако, в ответ на соответствующие стимулы покоящаяся сосудистая система может быть активирована в отношении роста новых капилляров. Во взрослом организме новые сосуды образуются только в результате ангиогенеза. Постнатальный ангиогенез начинается с активации клеток 12 эндотелия: их пролиферации, миграции и последующего формирования просвета сосуда, при этом, в отличие от васкулогенеза, где происходит дифференцировка эндотелия, клеток участвующие эндотелия в из предшественников, ангиогенезе, являются клетки полностью дифференцированными клетками, происходящими из предсуществующих кровеносных сосудов. Активация клеток эндотелия в родительском сосуде сопровождается разрушением базальной мембраны при участии плазмина и других протеаз, в результате чего облегчается последующая миграция клеток эндотелия в интерстициальное пространство. Формирование просвета сосуда, "«захват"» перицитов и образование базальной мембраны завершают процесс. I.2. Активация ангиогенеза при опухолевом росте. Активация ангиогенеза может происходить при таких патологических процессах в организме как заживление ран и рост опухоли. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что в условиях отсутствия сосудов опухолевый клон достигает всего лишь нескольких миллиметров в диаметре, и только после того как в опухоли "включится" ангиогенез и первичный опухолевый клон получит доступ к сосудистой системе, начинается его усиленный рост [33; 54]. Действительно, для того чтобы популяция опухолевых клеток могла увеличиваться необходимо, чтобы клетки были обеспечены питательными веществами и кислородом, которые поступают из близлежащих кровеносных сосудов. В отсутствие доступа к адекватному кровоснабжению опухолевые клетки некротизируются и/или вступают в апоптоз, ограничивая тем самым увеличение объема опухоли независимо от того, насколько высокими пролиферативными возможностями обладают сами опухолевые клетки. Существуют данные, свидетельствующие о том, что "включение" ангиогенеза может происходить уже на ранних, пренеопластических 13 стадиях развития опухоли [54]. Так, например, при иследовании ангиогенеза на экспериментальных моделях роста злокачественных опухолей у трансгенных мышей, несущих в своем геноме доминирующие онкогены и/или поврежденные гены-супрессоры опухолевого роста, где опухоли в процессе своего развития проходили через гистологически различающиеся стадии, "включение" ангиогенеза наблюдалось во время ранних стадий, предшествующих появлению солидных опухолей [83]. Аналогичные данные получены и для некоторых опухолей человека. В опухолях человека для визуализации капилляров на гистологических срезах широко используются такие иммунологические маркеры как фактор фон Виллебранда (vWF) и поверхностный маркер клеток эндотелия CD31. CD31 (другие названия: endoCAM-1 (endothelial cell adhesion molecule) или PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule)) представляет собой молекулу клеточной адгезии, в высокой степени экспрессирующуюся на поверхности клеток эндотелия [3]. В одной из работ при иммуногистохимическом окрашивании на vWF биопсийного материала с такими пренеопластическими изменениями молочной железы как гиперплазия и дисплазия эпителия протоков, а также участков, соответствующих карциноме in situ, некоторые из участков с карциномой in situ были охарактеризованы как ангиогенные. На основании этого наблюдения было сделано предположение, что участки карциномы in situ, отличающиеся повышенным уровнем ангиогенеза, могут представлять промежуточную стадию, разделяющую преангиогенную карциному in situ и инвазивный рак [54]. При анализе с помощью иммуногистохимического окрашивания на vWF биопсийного материала с различными изменениями шейки матки, "включение" ангиогенеза происходило на стадии дисплазии. Небольшое первоначальное увеличение количественной плотности сосудов было отмечено уже на стадии ранней дисплазии, что позволило сделать вывод о том, что "включение" ангиогенеза является, по-видимому, очень ранним 14 событием при развитии инвазивного плоскоклеточного рака, имеющим, возможно, две фазы: средней и интенсивной неоваскуляризации. Существуют данные, свидетельствующие о том, что для определенных видов злокачественных опухолей количество капилляров, обнаруживаемых в первичной опухоли, коррелирует с появлением метастазов. Так, например, в работе Horak E.R и соавт. была исследована взаимосвязь степени васкуляризации опухолей молочной железы с их размерами, стадией васкуляризации гистологического заболевания, оценивался по среза, [58]. метастазированием количеству сосудов выявлявшихся Уровень на с 1 мм2 помощью иммуногистохимического окрашивания на CD31. В этой работе было установлено, что количественная плотность сосудов в метастазирущих опухолях существенно выше, чем в опухолях без метастазов и в нормальной ткани (Табл. I.1). Таблица I.1. Уровень васкуляризации в опухолях и в нормальной ткани. Тип ткани Количество сосудов/1 мм2 Нормальная ткань 65 (42 – 98) Опухоль с метастазами 85 (36-260) Опухоль без метастазов 201 (57-325) Кроме того, было показано, что если количественная плотность сосудов в опухоли превышает 100 сосудов на 1 мм2 гистологического среза, то риск возникновения метастазов существенно увеличивается (Табл. I.2). Аналогичные данные о взаимосвязи между количеством капилляров при раке молочной железы и метастазированием получены еще целым рядом авторов [45; 103; 156; 157; 165]. Данные о взаимосвязи количества капилляров в опухоли и метастазированием были получены также для 15 меланомы [143; 19], раков легкого [90; 106], простаты [161; 164], мочевого пузыря [23], яичника [11], шейки матки [2], толстого кишечника [149]. Таблица I.2. Количество капилляров в опухолях, различающихся по своим размерам и статусу лимфоузлов. Количество капилляров на 1 мм2 Опухоли с Опухоли без метастазами метастазов 143,6 ± 58,3 83,6 ± 38,1 % опухолей с р метастазами 0,0005 28 2,1 – 4 229,5 ± 47,4 101,6 ± 61,2 0,0001 41 >4 202,0 ± 48,0 116,2 ± 66,3 0,01 60 Размер опухоли (см) <2 ∗ * приводится оценка достоверности различий в уровнях васкуляризации опухолей с метастазами и без метастазов Показано также, что количественная плотность сосудов является важным прогностическим показателем для карцином молочной железы [41; 85; 88; 156; 157; 165], немелкоклеточного [37; 46] и мелкоклеточного рака легкого [128], опухолей полости рта [89], рака толстой кишки [149], рака простаты [161] и инвазивных карцином мочевого пузыря [10; 104] – прогноз был хорошим в случае низкой количественной плотности сосудов и ухудшался с увеличением этого показателя. Вместе с тем следует отметить, что не всегда существует прямая взаимосвязь между количественной плотностью сосудов в опухоли и такими показателями развития опухолевого процесса как метастазирование и продолжительность жизни пациентов. Например, в случае аденокарциномы поджелудочной железы не было найдено статистически значимых различий в продолжительности жизни групп оперированных пациентов с высокой и низкой количественной плотностью капилляров опухоли. Хотя тенденция к увеличению продолжительности жизни у пациентов с более низкой количественной плотностью сосудов в опухоли 16 наблюдалась и в этом случае. Есть данные и об отсутствии корреляций между прогнозом и уровнем васкуляризации опухоли в случае меланом [16]. I.3. Факторы роста клеток эндотелия сосудов. Большинство накопленных в настоящее время данных говорит о том, что индукция ангиогенеза в опухоли активно регулируется самими опухолевыми клетками. На это указывает, например, тот факт, что капиллярная сеть развивается в опухоли независимо от того, имплантирована ли она в участок ткани с высоким или низким уровнем васкуляризации. Известно также, что кондиционированная среда от различных культур трансформированных клеток повышает митогенную активность клеток эндотелия [54]. Эти данные указывали на то, что опухоль секретирует растворимые активаторы ангиогенеза, которые являются сигналом начала процесса ветвления новых капилляров для покоящейся сосудистой системы. Эта гипотеза стимулировала поиск так называемых факторов ангиогенеза опухоли. Известен целый ряд факторов, ангиогенных в условиях in vivo, это – факторы роста фибробластов (aFGF и bFGF) [139], эпидермальный фактор роста (EGF) [97], трансформирующие факторы роста (TGFα и TGFβ) [94], фактор некроза опухоли (TNFα) [42], гепатоцитарный фактор роста (HGF) [122], тромбоцитарный фактор роста клеток эндотелия (PD-ECGF) [63], ангиогенин [35], интерлейкин-8 [78] и некоторые другие. Однако далеко не все из перечисленных факторов могут претендовать на роль основных регуляторов ангиогенеза. Прежде всего, большинство из них не являются специфичными для клеток эндотелия, стимулируя размножение также и других типов клеток. Только часть этих факторов (aFGF, bFGF, EGF, TGFα, HGF, PD-ECGF, интерлейкин-8) способна стимулировать рост клеток 17 эндотелия сосудов при непосредственном воздействии на них в условиях in vitro. Другие факторы практически не оказывают влияния на размножение клеток эндотелия в условиях in vitro, или даже ингибируют их рост (например, TGFβ1) [147]. Предполагается, что ангиогенное действие таких факторов осуществляется действующих за счет непосредственно на паракринной клетки активации эндотелия, других, ангиогенных факторов. В настоящей главе будут рассмотрены только факторы роста, непосредственно взаимодействующие с рецепторами, локализованными на поверхности клеток эндотелия сосудов, и регулирующие такие процессы как дифференцировка, пролиферация и миграция клеток эндотелия, а также их взаимодействие с периэндотелиальными клетками. I.3.1. Факторы роста фибробластов. Из перечисленных ангиогенных факторов наибольшее внимание в качестве основных регуляторов ангиогенеза привлекали факторы роста фибробластов, aFGF и bFGF (acidic and basic Fibroblast Growth Factors) [75]. Оба эти фактора высокоэффективны в отношении стимуляции ангиогенеза in vivo и индукции пролиферации клеток эндотелия сосудов in vitro [76]. Эти свойства, а также широкий спектр экспрессии aFGF и bFGF в нормальных тканях взрослых мышей и человека, давали основание предполагать, что именно эти факторы являются основными медиаторами ангиогенеза нормальных тканей, хотя последний и является очень редким для большинства тканей событием. Вместе с тем, факторы роста фибробластов не являются специфичными для клеток эндотелия и вызывают митогенный эффект у целого ряда клеток различного типа. Необычным оказалось и отсутствие в структуре этих факторов сигнального пептида, необходимого для внеклеточного транспорта секретируемых белков. Вследствие отсутствия сигнального пептида, FGFs 18 накапливаются внутри вырабатывающих их клеток и очевидно не имеют непосредственного доступа к клеткам-мишеням. Они могут быть инкорпорированы в базальную мембрану и выделяются, когда эта структура разрушается специфическими ферментами. Однако, как уже было отмечено, ангиогенные факторы, регулирующие ангиогенез в опухоли, должны быть секретируемыми и поэтому FGFs не подходили на роль таких регуляторов. I.3.2. Фактор роста эндотелия сосудов VEGF-A. В настоящее время принято считать, что среди различных факторов роста ключевую роль в ангиогенезе опухолей играет клонированный в 1989г. фактор роста эндотелия сосудов – VEGF-А (Vascular Endothelial Growth Factor) [134; 32; 48; 73; 154]. VEGF-А – мощный митоген клеток эндотелия сосудов, при этом он, очевидно, не обладает заметной митогенной активностью в отношении других типов клеток [32; 48]. VEGF-А вызывает миграцию клеток эндотелия, их инвазию в коллагеновый гель и образование трубчатых структур. Еще одной важной характеристикой VEGF-А является его способность повышать проницаемость сосудов. Предполагается, что именно этот фактор является специфическим медиатором, обеспечивающим повышенную проницаемость сосудов в опухолях [87]. Уровень экспрессии VEGF-A заметно повышается в условиях гипоксии [138; 116]. VEGF-А экспрессируется клетками большинства солидных опухолей. Повышенная экспрессия этого фактора роста найдена в карциномах легкого [95], щитовидной железы [15], молочной железы [156; 157], желудочнокишечного тракта [14], почки [13; 129], мочевого пузыря [13], яичника [110; 114] и шейки матки [2], так же как и в ангиосаркомах, саркомах Капоши [5] в опухолях из зародышевых клеток и неоплазиях центральной нервной системы [8; 98]. Высокий уровень экспрессии VEGF-А наблюдавшийся в 19 метастатических опухолях головного мозга, возникших из ангиосаркомы, карцином почки, меланом и аденокарцином, свидетельствует о высокой активности VEGF-А в метастазах опухолей человека [8]. При исследовании генной экспрессии VEGF-А в ткани опухоли методом гибридизации in situ мРНК VEGF-А обнаруживается в клетках опухоли, свидетельствуя о том, что именно опухолевые клетки являются клетками-продуцентами этого фактора роста. Отсутствие мРНК VEGF-А в клетках эндотелия указывает на то, что VEGF-А представляет собой паракринный медиатор. В опухолях, существенной составляющей которых является некроз, таких как мультиформная глиобластома, распределение экспрессии мРНК VEGF-А неравномерно, при этом VEGF-А- положительными прежде всего оказываются кластеры опухолевых клеток, непосредственно прилежащие к местам некроза опухоли [116]. Таким образом, уровень мРНК VEGF-А существенно повышается в условиях гипоксии. Показано также, что гипоксия стимулирует экспрессию VEGF-А не только в опухолевых клетках, но и в таких клетках опухолевой стромы как фибробласты и гладкомышечные клетки. Исследование распределения белка VEGF-А в ткани опухоли с помощью иммуногистохимии выявляет VEGF-А не только в продуцирующих его клетках опухоли, (где в меньшинстве клеток обнаруживалась диффузная окраска цитоплазмы, а в большинстве – только окраска структур аппарата Гольджи или отсутствие окраски), но и интенсивное специфическое окрашивание появляющихся в опухоли новых сосудов. Такое распределение указывало на то, что секретируемый опухолевыми клетками VEGF-А накапливается в клетках-мишенях. Экспрессия VEGF-А обнаруживается также и в нормальных тканях, таких как легкие, почки, сердце, надпочечники; в меньшей степени – в печени, селезенке, слизистой оболочке желудка; и еще меньше – в молочной железе. Однако эндотелий этих тканей в большинстве случаев находится в покоящемся состоянии, т.е. VEGF-А в них – неактивен. Чаще 20 всего иммуногистохимия обнаруживает VEGF-А в цитоплазме нормальных клеток. Было сделано предположение о том, что этот факт отражает наличие VEGF-А в этих клетках в связанной форме, необходимой для быстрой секреции в случае местного повреждения или каких-то других стимулов. Оказалось, что, действительно, существуют секретируемые и связанные изоформы VEGF-А, кодируемые разными транскриптами. Изоформы фактора роста VEGF-A. Известны четыре основные изоформы VEGF-А – VEGF-А121, VEGFА165, VEGF-А189 и VEGF-А206 – различающиеся по своей длине и состоящие из, соответственно, 121, 165, 189 и 206 аминокислот (Рис. I.1) [59]. Первые 26 амк в структуре VEGF-А представляют собой последовательность, характерную для сигнального пептида, указывающую на то, что VEGF-А – секретируемые белки. В секретирующих VEGF-А нормальных и трансформированных клетках преимущественно обнаруживается изоформа VEGF-А165, зрелая форма которой представляет собой гомодимер с мол. массой 45 кДа. В большинстве экспрессирующих VEGF-А клеток обнаруживаются также транскрипты, кодирующие VEGF-А121 и VEGF-А189, тогда как изоформа VEGF-А206 встречается крайне редко. Анализ кодирующей VEGF-А геномной последовательности показал, что все 4 изоформы кодируются единственным геном и образуются в результате альтернативного сплайсинга экзонов [155]. Кодирующая область гена VEGF-А распределена между 8 экзонами, при этом в изоформе VEGFА165 отсутствуют 24 амк, кодируемые экзоном 6, а в изоформе VEGF-А121 отсутствуют аминокислотные остатки, кодируемые экзонами 6 и 7. Структурные различия изоформ VEGF-А обуславливают различия в их химико-биологических свойствах. Так, VEGF-А121 – полипептид, обладающий слабо кислотными свойствами и не связывающийся с гепарином. VEGF-А165 – это основной, гепарин-связывающий белок, а 21 22 изоформы VEGF-А189 и VEGF-А206 – характеризуются еще более основными свойствами и проявляют более высокую аффинность в отношении связывания с гепарином. Такие различия в свойствах существенно влияют на биологическую активность изоформ VEGF-А. VEGF-А121 – секретируемый белок, полностью растворимый в кондиционированной среде экспрессирующих эту изоформу клеток. VEGF-А165 – также секретируется из клеток, но при этом значительная его часть остается в связанном состоянии на клеточной поверхности или во внеклеточном матриксе. Изоформы VEGF-А189 и VEGFА206 практически полностью находятся в связанном с внеклеточным матриксом состоянии [60]. Связанные формы VEGF-А могут высвобождаться в результате воздействия таких агентов как сурамин, гепарин, или гепариназа. Тот факт, что гепарин высвобождает более длинные формы VEGF-А, дает основание предположить, что местами их связывания могут быть содержащиеся на клеточной поверхности или во внеклеточном матриксе гепарин- содержащие протеогликаны [60]. Длинные формы VEGF-А могут быть также высвобождены в результате воздействия такой протеазы как плазмин, образующейся в результате расщепления активатором плазминогена протеолитически неактивного плазминогена. Эта протеаза расщепляет VEGF-А189 или VEGFА206 в области СООН-конца с образованием протеолитического фрагмента с мол. весом приблизительно 34 кДа, проявляющего активность в качестве митогена для клеток эндотелия и агента, повышающего проницаемость сосудов. Следовательно, VEGF-А может становиться доступным для клеток эндотелия с помощью по крайней мере 2-х различных механизмов: как свободный полностью растворимый белок (VEGF-А121 и VEGF-А165) или в результате активации протеаз и расщепления более длинных изоформ. Образование биологически активного VEGF-А с помощью протеолитического расщепления может играть особенно важную роль в 23 опухолях, поскольку известно, что в опухолях наблюдается повышенная экспрессия протеаз, в том числе, активаторов плазминогена. Таким образом, белковые продукты, кодируемые одним единственным геном, могут обеспечивать достаточно гибкую систему контроля ангиогенеза. Короткие формы VEGF-А в случае необходимости могут быть быстро и эффективно секретированы из экспрессирующих их клеток. В то же время, длинные формы, находящиеся в связанном состоянии во внеклеточном матриксе, могут представлять собой некий резервуар молекул VEGF-А, из которого более короткие растворимые формы могут быть высвобождены при разрушении этой структуры. I.3.3. Другие факторы роста семейства VEGF. В настоящее время семейство VEGF состоит из 6 факторов роста: VEGF-А, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-Е и плацентарного ростового фактора PlGF (Рис. I.1). Фактор роста VEGF-B. Фактор роста VEGF-B был клонирован в 1996 г. [108; 49]. Ген, кодирующий VEGF-B, локализован на хромосоме 11q13 и состоит из 8-и экзонов. В результате альтернативного сплайсинга образуются 2 транскрипта, кодирующие 2 изоформы этого ростового фактора – VEGFB167 и VEGF-B186, при этом у транскрипта, кодирующего VEGF-B167, отсутствует экзон 6 (Рис. I.1.). Делеция 6-го экзона в данном случае приводит не только к уменьшению размера белкового продукта, но и к сдвигу рамки считывания, в результате чего СООН-области изоформ VEGF-B отличаются друг от друга, во многом обуславливая биологические и физико-химические различия этих изоформ [109]. 24 Короткая форма VEGF-B представляет собой негликозилированный, связанный дисульфидными мостиками димер, ассоциированный с клеточной поверхностью, по-видимому, благодаря своей СООН-области, содержащей значительное количество основных аминокислотных остатков. Длинная форма VEGF-В О-гликозилирована в СООН-области и секретируется из клетки. Обе изоформы могут образовывать гетеродимеры с VEGF-A в случае ко-экспрессии обоих ростовых факторов в клетке. Образование таких гетеродимеров может служить одним из путей регуляции активности VEGF-A. VEGF-B экспрессируется во многих нормальных тканях человека, в том числе, в сердце, скелетных мышцах, поджелудочной железе, простате, почках, легком. Экспрессия этого фактора роста обнаружена также в ряде злокачественных опухолей человека, в частности, в карциномах молочной железы, лимфомах, меланомах, а также в метастазах. VEGF-B – митоген для клеток эндотелия. Отличительной особенностью VEGF-B является удивительная стабильность его экспрессии: в клетках, продуцирующих VEGF-B, уровень мРНК этого фактора роста не изменялся под действием таких активаторов VEGF-A как гипоксия, онкобелок Ras или мутантный р53. Воздействие на клетки сыворотки, факторов роста EGF и TGFβ и известного промотора канцерогенеза форбол-миристат-12,13-ацетата также не приводило к изменениям в уровне экспрессии мРНК VEGF-B [29]. Биологическая роль фактора роста VEGF-B пока недостаточно выяснена, однако есть данные о том, что связывание VEGF-B со своим рецептором VEGFR1 в клетках эндотелия приводит к повышению экспрессии и ферментатавной активности так называемого активатора плазминогена урокиназного типа (uPA) и ингибитора 1 активатора плазминогена, что дает возможность предположить роль VEGF-B в деградации внеклеточного матрикса, а также в регуляции адгезии клеток и их миграции [107]. 25 Фактор роста VEGF-С. Фактор роста VEGF-C был клонирован в 1996 г. [67; 86]. Ген VEGF-C кодирует единственный транскрипт размером 2,4 кб, в результате трансляции которого образуется полипептид, содержащий 399 аминокислотных остатков. Фактор роста VEGF-C, в отличие от VEGF-A и VEGF-B, не содержит связывающихся с гепарином областей, обогащенных основными аминокислотными остатками. Другим отличием этого фактора роста является протяженная СООН-область, отсутствующая у факторов роста VEGF-A и VEGF-B, характерной особеностью которой является наличие 4-х обогащенных цистеином повторов С-Х10-С-Х-С-Х-С, типичных для белка колец Бальбиани 3 (Balbiani ring 3 protein или BR3P) (Рис. I.1). Зрелая форма фактора роста VEGF-C, полипептид с мол.массой 23 кДа, образуется в результате посттрансляционного протеолитического процессинга первичного белкового продукта, при котором отщепляются NH2-концевая область, содержащая сигнальный пептид, и значительная часть СООН-области, и представляет собой гомодимер, основную часть которого составляет VEGF-A-гомологичная область [68]. Интересно, что в процессе созревания фактора роста VEGF-C меняется аффинность его связывания со своими двумя рецепторами – VEGFR2 и VEGFR3. Менее зрелая форма VEGF-C преимущественно взаимодействует с VEGFR3, тогда как более зрелая форма имеет большее сродство к VEGFR2. Такое изменение аффинности фактора роста к своим рецепторам, по-видимому, также является одним из механизмов, регулирующих активность этих сигнальных систем. VEGF-C экспрессируется во многих нормальных тканях человека, в том числе, в сердце, плаценте, мышечной ткани, яичнике и тонком кишечнике. Менее выражена экспрессия VEGF-C в ткани мозга, печени, тимуса [67; 29]. 26 VEGF-С непосредственно воздействует на клетки эндотелия в культуре, стимулируя митогенную активность этих клеток, а также их миграцию в коллагеновый гель. В отличие от VEGF-A, VEGF-C не индуцируется гипоксией [29; 121; 168]. Фактор роста VEGF-D. Фактор роста VEGF-D был клонирован в 1997 г. [1; 167]. Ген, кодирующий единственный транскрипт размером 2,2 кб этого фактора роста, локализован на хромосоме Хр22.31. Клонирован также мышиный гомолог этого гена [111]. Однако, в отличие от тканей человека, в тканях мыши обнаружено 2 транскрипта этого гена с размерами 2,4 и 3,7 кб. Первоначально мышиный гомолог VEGF-D был описан как фактор роста, индуцируемый c-fos (FIGF) и вызывающий митогенез фибробластов. Тот факт, что ген VEGF-D мыши индуцируется с-fos, указывает на возможную регуляцию c-fos экспрессии гена VEGF-D человека. Это предположение подтверждается обнаружением в области промотора гена VEGF-D нуклеотидной последовательности, соответствующей консенсусу сайта связывания АР-1. По своей структуре VEGF-D наиболее близок фактору роста VEGF-C (48% гомологии аминокислотного состава). Ген VEGF-D, так же как и ген, кодирующий VEGF-C, помимо NH2-области, кодирующей сигнальный пептид, и VEGF-A-гомологичной области, содержит протяженную СООНобласть, содержащую BR3P повторы (Рис. I.1). Аналогично VEGF-C, белковый продукт VEGF-D подвергается посттрансляционному протеолитическому процессингу с образованием зрелой формы белка с мол.массой 22 кДа в восстанавливающих условиях [144]. Как первичный белок, так и зрелая форма VEGF-D обладали способностью взаимодействовать с рецептором VEGFR3 и индуцировать его фосфорилирование. Однако, в отличие от VEGF-С, наибольшую 27 активность в этом отношении проявляла более зрелая форма VEGF-D, содержащая VEGF-A-гомологичную область. Эта же форма активировала рецептор VEGFR2, тогда как взаимодействия с этим рецептором первичного белка выявлено не было. Интересно, что сушествуют видовые различия в специфичности взаимодействия этого фактора роста с рецепторами: в отличие от человека, VEGF-D мыши VEGF-D взаимодействует только с рецептором VEGFR3, но не VEGFR2 [6]. Данные о сходстве посттрансляционного структуры, процессинга, аналогичном специфичности в механизме отношении рецепторов дают основания для выделения VEGF-C и VEGF-D в отдельную подгруппу ростовых факторов семейства VEGF. VEGF-D, также как и другие факторы роста семейства, экспрессируется во многих нормальных тканях человека. Наиболее выражена его экспрессия в легком, сердце, тонком кишечнике; в меньшей степени – в скелетных мышцах, прямой кишке и поджелудочной железе. VEGF-D вызывает пролиферацию клеток эндотелия в культуре. Фактор роста VEGF-Е. В 1999 г. в геноме (orf) parapox вируса был обнаружен ген, кодирующий гомолог VEGF-A. Были обнаружены 2 штамма орф вируса, NZ2 и NZ7, кодирующие различные варианты VEGF-E, степень гомологии которых составляет всего лишь 43%. Оба варианта VEGF-E взаимодействуют только с VEGFR2. При действии на клетки эндотелия в культуре VEGF-E вызывает их пролиферацию, он также способен индуцировать проницаемость сосудов в условиях in vivo [99; 105]. 28 Плацентарный фактор роста. Плацентарный фактор роста PlGF был клонирован в 1991г. [91]. Обнаружены изоформы 2 альтернативного сплайсинга PlGF, (Рис. образующиеся I.1). Длинная в результате изоформа PlFG152 отличается от короткой PlGF131 вставкой из 21 амк, содержащей большое количество основных аминокислотных остатков, благодаря которой длинная изоформа связывается с гепарином. Короткая изоформа – не связывающийся с гепарином протеогликан. Обе изоформы представляют собой гомодимеры. PlGF может образовывать гетеродимеры с VEGF-A. Ни короткая, ни длинная изоформа PlFG не были способны стимулировать пролиферацию клеток эндотелия in vitro, хотя и взаимодействовали с клеточными рецепторами. Однако PlFG152 усиливал митогенное действие на клетки эндотелия низких концентраций VEGF-A. В отличие от других факторов роста семейства VEGF, плацентарный фактор роста экспрессируется почти исключительно в плаценте. I.4. Рецепторы факторов роста семейства VEGF. Реализация биологического эффекта VEGF-А осуществляется через его взаимодействие со своими высокоаффинными рецепторами. В настоящее время известно 2 таких рецептора: Flt1 (VEGFR1) [22] и KDR (VEGFR2) [151], принадлежащих к классу III суперсемейства рецепторных тирозинкиназ и образующих в этом суперсемействе отдельную группу, характеризующуюся 7-ю иммуноглобулинподобными доменами во внеклеточной области [158; 30]. Клонирован также мышиный гомолог гена KDR (VEGFR2) – Flk-1 [96; 101; 118]. К этому же классу относится и клонированный нами и одновременно группой Alitalo K. (Финляндия) рецептор – FLT4 (VEGFR3) [4; 112; 43; 44]. Рецептор FLT4 (VEGFR3) взаимодействует с VEGF-С и VEGF-D, но не с VEGF-А [4]. 29 Эта группа рецепторов представляет собой трансмембранные белки со сходной структурой: их внеклеточная рецепторная часть состоит из 7 иммуноглобулинподобных доменов, а во внутриклеточной области находится тирозинкиназный домен, разделенный на 2 участка короткой последовательностью, так называемой интеркиназной вставкой, специфичной для каждого рецептора (Рис. I.2). Существует специфичность во взаимодействии факторов роста с рецепторами: так, VEGF-A взаимодействует с рецепторами VEGFR1 и VEGFR2, но не с рецептором VEGFR3, лигандами которого являются VEGF-C и VEGF-D (Рис. I.3). В результате взаимодействия со своим лигандом происходит димеризация рецепторов с последующей активацией их каталитической активности, приводящей сначала к взаимному фосфорилированию самих рецепторов, а затем – к фосфорилированию их цитоплазматических субстратов, осуществляющих дальнейшую передачу сигнала в клетке. I.4.1. Рецепторы, взаимодействующие с фактором роста VEGF-A (VEGFR1 и VEGFR2). Рецепторы VEGF-А (VEGFR1 и VEGFR2) экспрессируются почти исключительно в клетках эндотелия кровеносных сосудов, преимущественно в сосудах, прилегающих к опухоли и проникающих в нее. Существуют 2 изоформы рецептора VEGFR1, более длинная из которых содержит дополнительные 65 аминокислотных остатков в СООНобласти [22]. Изоформ рецептора VEGFR2 не обнаружено. Реакция клеток на воздействие VEGF-А может быть различной, в зависимости от того, с каким из рецепторов свяжется этот фактор роста. Повидимому, основным рецептором, через который реализуется большая часть передаваемых VEGF-A сигналов, является VEGFR2. 30 31 32 На это указывают, например, результаты опытов, где клетки эндотелия аорты свиньи, в которых отсутствуют эндогенные рецепторы VEGF-А, были трансфицированы векторами, экспрессирующими VEGFR1 или VEGFR2 [162; 81]. При этом VEGF-А стимулировал хемотаксис и митогенез только в тех клетках, где был экспрессирован VEGFR2, но не VEGFR1. Аналогично, в работе Bernatchez и соавт. антисенс олигонуклеотиды против мРНК рецептора VEGFR2, но не против рецептора VEGFR1 подавляли индуцируемое VEGF-A повышение пролиферации и миграции клеток эндотелия аорты быка [9]. О функциональных различиях сигнальных путей, осуществляемых посредством передачи сигнала через рецепторы VEGFR1 и VEGFR2, свидетельствуют также данные, полученные на гомозиготных мышах с поврежденным геном VEGFR1 или VEGFR2. В обоих случаях такие повреждения приводили к гибели эмбриона на 9-й день развития. Однако в случае повреждения VEGFR2 наблюдалось отсутствие васкулогенеза и дифференцировки клеток эндотелия [136; 135], тогда как при повреждении VEGFR1 дифференцировка клеток происходила, но при этом наблюдалось расширение сосудов и дезорганизация сборки клеток эндотелия, то есть нарушались более поздние стадии васкулогенеза [36]. В табл. I.3. приведены некоторые биологические характеристики, регуляция которых осуществляется при участии VEGFR1 и/или VEGFR2 (в таблице приведены данные из работы [137]). Из таблицы видно, что сигналы VEGF-A, передаваемые через рецепторы VEGFR2 и VEGFR1 регулируют большинство процессов, необходимых для образования сосудистой сети - от стимуляции пролиферации клеток эндотелия до регуляции организации клеток эндотелия и формирования трубчатых структур. Вместе с тем, пока еще не выясненным остается механизм индукции фактором роста VEGF-A повышенной проницаемости сосудов. 33 Таблица I.3. Сравнительная характеристика биологической активности рецепторов VEGFR1 и VEGFR2. Аффинность к VEGF-A, Kd VEGFR1 VEGFR2 10-20 рМ 400-900 рМ Гипоксия - ↑ Малигнизация ↑ ↑ Проницаемость сосудов - ? Дифференцировка - + Пролиферация ? + Стимуляция синтеза ДНК - + -∗/+# + Реорганизация актина + - Регуляция клеточной адгезии - + Организация клеток эндотелия + - Формирование трубчатых структур - + Стимуляция активаторов плазминогена + - Миграция ↑- повышение уровня экспрессии рецептора; ∗ - клетки эндотелия; # - моноциты. В работе Stacker и сотр. было показано, что мутантная форма VEGFA, не способная взаимодействовать с рецептором VEGFR2, тем не менее обладала такой же способностью индуцировать повышение проницаемости сосудов как и дикий тип VEGF-A [145]. Кроме того, фактор роста VEGF-D, также взаимодействующий с рецептором VEGFR2, не вызывал повышения проницаемости сосудов. Авторы предполагают возможность существования еще одного рецептора VEGF-A, осуществляющего регуляцию проницаемости сосудов. Данные, полученные на мышах, гомозиготных по дефекту гена VEGFR2, свидетельствуют о важной роли этого рецептора в васкулогенезе. Эмбрионы таких мышей нежизнеспособны и погибают на 9-й день 34 развития, при этом у них не только не происходит дифференцировка клеток эндотелия, но и отсутствует гемопоэз [136]. На основании этих данных был сделан вывод о том, что клетки эндотелия и стволовые клетки гемопоэза имеют общих предшественников, экспрессирующих рецептор VEGFR2. Эти клетки-предшественники были названы гемангиобластами (Рис.I.4). ВАСКУЛОГЕНЕЗ VEGFR2 Гемангиобласты + VEGF-А - VEGF-А VEGFR2 Ангиобласты VEGFR2 Гемопоэтические стволовые клетки 2. Клетки эндотелия Рис. I.4. Участие фактора роста VEGF-A и его рецептора VEGFR2 в васкулогенезе. При отсутствии фактора роста VEGF-A гемангиобласты дифференцируются в стволовые клетки гемопоэза, экспрессия VEGFR2 в которых затем ингибируется. Фактор роста VEGF-A стимулирует дифференцировку гемангиобластов в ангиобласты и далее в клетки эндотелия, сохраняющие экспрессию рецептора VEGFR2 [27]. Рецептор VEGFR1 помимо функций передачи сигнала в клетки, может быть также негативным регулятором активности VEGF-A и других взаимодействующих с рецепторами VEGFR1 и VEGFR2 факторов роста. В эндотелиальных клетках пупочной вены была обнаружена растворимая форма рецептора VEGFR1 – sFLT1 [74]. Эта форма рецептора образуется в результате альтернативного сплайсинга, и в ней отсутствуют 7-й 35 иммуноглобулин-подобный домен, трансмембранный домен и цитоплазматический домен. Такой растворимый рецептор, конкурируя с клеточным рецептором за связывание с VEGF-А, способен ингибировать индуцируемый этим фактором роста митогенез клеток эндотелия. В условиях in vivo рост опухолей, вызываемых подкожной перевивкой иммунодефицитным мышам клеток фибросаркомы человека НТ 1080, был существенно подавлен в том случае, если в эти клетки был трансфицирован sFLT1 [47]. Значительно увеличивалась продолжительность жизни мышей с привитыми клетками глиобластомы НТ человека а 1080, также если D54-MG, с в привитыми них был клетками стабильно трансфицирован sFLT1. Эти данные указывали на возможность подавления роста опухоли за счет ингибирования взаимодействия ангиогенных факторов роста со своими рецепторами и связанного с этим снижения активности ангиогенеза опухоли. Действительно, данные о торможении опухолевого роста при ингибировании активности VEGF-А с помощью рекомбинантной растворимой формы другого рецептора – VEGFR2 – были получены на клетках глиобластомы линии С6 [100]. Рост глиобластомы при перевивке клеток С6 мышам существенно подавлялся в том случае, если опухолевые клетки вводились совместно с клетками, экспрессирующими доминантнонегативную мутантную форму VEGFR1, в которой отсутствовал тирозинкиназный домен. Таким образом, блокируя передачу сигнала от фактора роста VEGF-А к его рецепторам, можно ингибировать процесс неоангиогенеза и тем самым замедлить рост опухоли. Рецепторы VEGFR1 и VEGFR2 могут образовывать гетеродимеры. Очевидно, что фосфорилирующая активность и, возможно, специфичность гетеродимерных и гомодимерных форм рецепторов различны. И следовательно, образование гетеродимеров представляет собой еще один механизм регуляции активности рецепторов. 36 I.4.2. Рецептор VEGFR3. Третий из рецепторов факторов роста семейства VEGF, VEGFR3 или FLT4, на ранних стадиях эмбриогенеза также экспрессируется в эндотелии кровеносных сосудов, но позднее его экспрессия сосредоточивается в клетках эндотелия лимфатических сосудов и во взрослом организме этот рецептор экспрессируется исключительно в эндотелии лимфатических сосудов [69; 82]. Этот факт дал основания предполагать, что лимфангиогенез, возможно, регулируется через взаимодействие именно этого рецептора со своими лигандами. Действительно, гиперэкспрессия VEGF-С, одного из лигандов VEGFR3, в коже лимфатических, но трансгенных не мышей кровеносных приводила сосудов, к гиперплазии проявлявшейся в пролиферации эндотелия и увеличении размеров сосудов [66]. И наоборот, экспрессия в коже трансгенных мышей растворимой формы рецептора VEGFR3, связывающей VEGF-С и тем самым снижающей эффективность его взаимодействия с клеточным рецептором, приводила к ингибированию эмбрионального лимфангиогенеза, хотя кровеносная сосудистая сеть при этом развивалась нормально. Для таких мышей характерен фенотип, схожий с лимфедемой человека, при котором наблюдаются отеки конечностей, а также отечность и фиброз кожи [93]. Кроме того, при наследственной лимфедеме человека были найдены 4 близкорасположенные гетерозиготные смысловые мутации в высоко консервативной области тирозинкиназного домена рецептора VEGFR3, приводящие к инактивации рецептора [70; 62]. Аналогичная гетерозиготная мутация в той же самой области тирозинкиназного домена VEGFR3 была найдена у мышей Chy, представляющих собой экспериментальную модель лимфедемы человека [71]. 37 Такого рода мутации приводят к ослаблению сигнала, реализуемого через этот рецептор, поскольку в этом случае при димеризации рецептора, взаимодействующего с своим лигандом, наряду с нормально функционирующим димером образуются димеры, состоящие из 2-х мутантных, нефункциональных форм и димеры, содержащие одну нормальную и одну мутантную форму. И таким образом, 2/3 образующихся рецепторов либо не способны проводить сигнал вообще, либо проводят его намного хуже, чем нормальные рецепторы. Кроме того, время жизни мутантных рецепторов на поверхности клетки больше, чем у рецепторов, функционирующих нормально, из-за того, что интактные рецепторы после взаимодействия с лигандом и передачи сигнала подвергаются интернализации и деградации. Увеличение концентрации лиганда может в этом случае частично компенсировать дефектную функцию рецептора. Так, была предпринята попытка лечения мышей Chy с помощью введения экспрессирующей VEGF-С аденовирусной конструкции, что привело к развитию в коже мышей дополнительных лимфатических сосудов и уменьшению отеков. Существует 2 изоформы рецептора VEGFR3, различающиеся по своей длине и образующиеся в результате альтернативного сплайсинга, причем длинная изоформа отличается от короткой наличием 65 дополнительных аминокислотных остатков в СООН-терминальной области. Показано, что биологические свойства длинной и короткой изоформ рецептора VEGFR3 различны: только длинная изоформа была способна трансформировать клетки Rat-2 в культуре [12]. VEGFR3 не способен образовывать гетеродимеры с рецепторами VEGFR1 и VEGFR2 [113]. 38 I.4.3. Нейропилины. Недавно обнаружен еще один класс экспрессирующихся на клетках эндотелия рецепторов, также обладающих способностью связываться с факторами роста семейства VEGF, хотя и не являющихися для них строго специфичными. Это – нейропилины, представляющие собой поверхностные рецепторы нейронных клеток, которые взаимодействуют с гликопротеинами семейства коллапсинов/семафоринов, участвующими в развитии и функционировании нервной системы [72; 148; 20; 55; 79]. Факт обнаружения взаимодействия нейропилинов с факторами роста семейства VEGF, причем с эффективностью, сравнимой со специфичными для VEGF рецепторами, сам по себе удивителен, поскольку ранее считалось, что эти рецепторы регулируют рост аксонов в эмбриональном развитии. Оказалось, что нейропилин-1 связывается с VEGF-А, причем только с изоформой VEGF-А165, но не VEGF-А121 [140]. Кроме того, нейропилин-1 проявляет себя как ко-рецептор VEGFR2, усиливая взаимодействие последнего с изоформой VEGF-А165. Второй из рецепторов этого класса, нейропилин-2, взаимодействует с VEGF-С, причем такое взаимодействие, по-видимому, способно вносить определенный вклад в VEGF-С-зависимую регуляцию лимфангиогенеза. Так, например, дефекты развития лимфатической системы у мышей Chy наблюдаются в коже, но не в кишечнике. Это, по-видимому, связано с тем, что в кишечнике экспрессируется нейропилин-2, взаимодействие которого с VEGF-С в какой-то степени компенсирует недостаточно эффективную работу VEGFR3. Экспрессия этого рецептора в коже мышей не обнаружена [71]. Спектр экспрессии нейропилинов в ткани человека достаточно широк: нейропилин-1 экспрессируется в сердце, плаценте, легком, печени, скелетных мышцах, нейропилина-1 почках найдена в и поджелудочной некоторых линиях железе. клеток Экспрессия опухолевого 39 происхождения, а также в культурах клеток эндотелия. И хотя доказательства непосредственного участия нейропилинов в регуляции ангиогенеза в настоящее время отсутствуют, уже имеющиеся данные позволяют расширить представления о роли этих рецепторов. I.5. Сигнальная система Tie2/Ang. I.5.1. Семейство рецепторов Tie и взаимодействующие с ними факторы роста. На поверхности клеток эндотелия сосудов экспрессируются еще 2 рецептора –Tie1 и Tie2/Tek – также принадлежащих к семейству рецепторных тирозинкиназ и образующих в нем подсемейство Tie (Тирозинкиназы с Иммуноглобулин и EGF-гомологичными доменами) [26; 65; 130]. Аналогично рецепторам факторов роста семейства VEGF, экспрессия рецепторов Tie жизненно необходима для формирования эмбриональной сосудистой сети [117; 131; 15]. Мыши, дефицитные по гену Tie1, погибают в период между 13,5 днем эмбрионального развития и рождением, имея дефекты целостности сосудов, приводящие к отекам и геморрагии. Мыши, у которых инактивирован ген Tie2, погибают в период между 9,5 и 10,5 днем эмбрионального развития. При этом сосудистая сеть таких мышей выглядит незрелой, нарушена типичная для нормальной сосудистой системы организация: расширенными сосудистая кровеносными сеть сосудами, представлена мало в основном различающимися по диаметру, при этом отсутствуют как крупные собирательные сосуды, так и мелкие капилляры. Эти данные указывают на то, что рецепторы семейства Tie включаются в регуляцию ангиогенеза на более поздних стадиях, чем рецепторы фактора роста VEGF-А, поскольку в случае, например, 40 инактивации гена VEGFR2 у мышей вообще не происходит дифференцировка клеток эндотелия из их предшественников, тогда как при инактивации Tie2 клетки эндотелия присутствуют в нормальном количестве и формируют трубочки, но нарушены более поздние стадии, такие как созревание и стабилизация сосудистой сети. Рецепторы семейства Tie не взаимодействуют с факторами роста семейства VEGF. Лигандами рецептора Tie2 являются ангиопоэтины: Ang1, Ang-2 и Ang-3/Ang-4 [21; 92; 159]. Лиганд рецептора Tie1 пока не найден. Инактивация генов, кодирующих тот или иной ангиопоэтин, поразному отражается на эмбриональном развитии мышей. Мыши, дефицитные по гену Ang-1, погибают на 12,5 день эмбрионального развития, при этом у них наблюдаются такие же нарушения в формировании сосудистой системы, как и у мышей с неработающим геном Tie2, хотя и в менее выраженной форме [146]. Инактивация гена Ang-2 также летальна: мыши Ang-2-/- погибали незадолго до рождения или в течение первых нескольких дней после рождения, тогда как мыши с инактивированным геном Ang-3, по-видимому, жизнеспособны [84]. Взаимодействуя с рецептором Tie2, ангиопоэтины Ang-1 и Ang-2 вызывают противоположные эффекты. Например, при эмбриональном развитии мышей, у которых гиперэкспрессирован Ang-2, проявлялся фенотип, сходный с фенотипом мышей с инактивированными генами Ang-1 или Tie2, при этом наблюдаемые дефекты развития сосудистой сети эмбрионов обычно имели даже более выраженный характер. Противоположность действия ангиопоэтинов Ang-1 и Ang-2 проявляется и при их воздействии на культуру клеток эндотелия в условиях in vitro: ангиопоэтин Ang1 вызывает миграцию этих клеток, тогда как ангиопоэтин Ang-2 не оказывает такого эффекта, а избыток этого лиганда рецептора Tie2 ингибирует действие Ang-1 [166]. Столь различные действия двух ангиопоэтинов объясняются тем, что последствия их взаимодействия со своим рецептором совершенно 41 различны. В опытах in vitro ангиопоэтины Ang-1 и Ang-2 связываются с рецептором Tie2 с одинаковой эффективностью, однако Ang-1 индуцирует аутофосфорилирование рецептора Tie2 в культуре клеток эндотелия, тогда как связывание не Ang-2 приводит к последующему аутофосфорилированию цитоплазматического тирозинкиназного домена. Таким образом, Ang-2 ингибирует действие Ang-1, конкурируя с ним за связывание с Tie2 и тем самым блокируя вызываемую Ang-1 активацию этого рецептора. Ангиопоэтин Ang-2, по-видимому, является первым примером естественного лиганда-антагониста для рецептора тирозинкиназного типа, и существование лигандов с противоположной направленностью действия говорит о том, что активация рецептора Tie2 подвергается очень тонкой регуляции в условиях in vivo. Возможно, что противоположный характер действия ангиопоэтинов Ang-1 и Ang-2 является специфическим для клеток эндотелия: как оказалось, в тех редких случаях, когда Tie2 экспрессируется в неэндотелиальных клетках, например, в культуре клеток фибробластов, Ang-2 так же как и Ang-1, индуцировал аутофосфорилирование этого рецептора. Аналогично Ang-1 и Ang-2, противоположным действием на рецептор Tie2 обладают ангиопоэтины Ang-3 и Ang-4: Ang-4 активировал Tie2, тогда как Ang-3 действовал как антагонист [159]. Интересно, что на самом деле ангиопоэтины Ang-3 и Ang-4 представляют собой гомологи одного и того же гена, соответственно, у мыши и у человека. Необычным для этих генов является очень высокая степень их дивергенции. Так, если для гомологов гена Ang-1 человека и мыши идентичность кодируемых ими аминокислотных последовательностей в области наиболее аналогичных консервативного гомологов гена домена Ang-2 – достигает 87%, то 99%, а для идентичность аминокислотных последовательностей, кодируемых генами Ang-3 и Ang-4 в 42 этой же области составляет всего лишь 65%. И таким образом, хотя Ang-3 и Ang-4 являются гомологичными генами, соответственно, мыши и человека, их структурные различия привели к тому, что кодируемые ими белковые продукты обладают совершенно различными функциями. Эти данные представляют собой удивительный пример структурной и функциональной дивергенции одного и того же генного локуса у мыши и человека. I.5.2. Процессы, контролируемые сигнальной системой Tie2/Ang-1 при формировании сосудов. Роль сигнальной системы Tie2/Ang-1, по-видимому, заключается в осуществлении взаимодействия как между самими клетками эндотелия сосудов, так и между клетками эндотелия и находящимися в окружающей мезенхиме перицитами и гладкомышечными клетками, то есть в регуляции процесса сборки мышечной стенки сосудов, обеспечивающего созревание и стабилизацию сосудистой сети [34; 53]. В пользу такого предположения, свидетельствуют прежде всего приводившиеся выше фенотипические характеристики сосудистой системы эмбрионов мышей с инактивированными генами Ang1 или Tie2, а также паракринный характер экспрессии ангиопоэтина Ang1, выявляемый во взрослом организме: клетками, конститутивно секретирующими этот белок, являются периэндотелиальные клетки (перициты и гладкомышечные клетки), но не клетки эндотелия. Данные, полученные в эксперименте, также подтверждают эту гипотезу. В опытах in vitro ангиопоэтин Ang-1 стимулирует миграцию клеток эндотелия, но не индуцирует ни пролиферацию этих клеток, ни сборку клеток эндотелия в трубчатые структуры. В условиях in vivo ангиопоэтин Ang-1 проявляет себя как естественный ингибитор проницаемости сосудов. Так, при гиперэкспрессии Ang-1 сосуды становятся более резистентными к индуцируемому VEGF-А повышению их 43 проницаемости [153]. И напротив, у мышей с инактивированным геном Ang-1 клетки эндотелия имеют более округлую форму, менее распластаны, слабо ассоциированы с прилежащим матриксом, у них нарушено взаимодействие с периэндотелиальными клетками. Получены также данные о том, что при наследуемой сосудистой патологии, характерной особенностью которой является недостаток гладкомышечных клеток в крупных сосудах человека была найдена мутация в тирозинкиназном домене рецептора Tie2 [160]. Созревание сосудов при участии периэндотелиальных клеток является важным этапом ангиогенеза: клетки эндотелия, которым обычно уделяется наибольшее внимание, могут лишь инициировать, но не завершить процесс ангиогенеза. Клетки стенок сосудов стабилизируют вновь образованные капилляры, ингибируя пролиферацию и миграцию клеток эндотелия и стимулируя развитие внеклеточного матрикса, что защищает новые сосуды от разрушения и регрессии. При активации ангиогенеза во взрослом организме для того, чтобы клетки эндотелия могли мигрировать за пределы сосуда из области своей постоянной локализации на внутренней стенке сосуда, зрелые сосуды должны быть дестабилизированы. Для этого необходимо, чтобы межэндотелиальные клеточные контакты были ослаблены; также должны быть ослаблены и периэндотелиальные поддерживающие структуры: контакты между гладкомышечными клетками и внеклеточным матриксом. Роль такого дестабилизатора может выполнять ангиопоэтин Ang-2, поскольку он является ингибитором усиливающей контакты сигнальной системы Tie2/Ang-1. Действительно, во взрослом организме Ang-2 экспрессируется преимущественно там, где происходит реконструкция сосудов [92]. Предполагается, что вызываемая Ang-2 дестабилизация в отсутствие VEGF-А приводит к регрессии сосудов, а присутствие высокого уровня экспрессии VEGF-А, стимулирующего пролиферацию и миграцию клеток эндотелия, облегчает ангиогенный ответ, вызываемый этим 44 ростовым фактором, и таким образом, Ang-2, по крайней мере, в присутствии VEGF-А, также ангиогенен. I.6. Процесс формирования сосудов в норме и в опухоли и участие в нем сигнальных систем. Таким образом, факторы роста семейства VEGF и ангиопоэтины, повидимому, играют комплементарную и координированную роль в развитии сосудистой системы (Рис. I.5, представляет собой частично модифицированный рисунок из работы [126]). В эмбриогенезе фактор роста VEGF-А через рецептор VEGFR2 стимулирует дифференцировку мезодермальных клеток в гемангиобласты [27]. Предполагается, что при дальнейшей дифференцировке из гемангиобластов происходят как предшественники клеток эндотелия (ангиобласты), так и предшественники гемопоэтических клеток, поскольку у этих видов клеток-предшественников имеется несколько общих поверхностных маркеров, в том числе, рецептор VEGFR2. Взаимодействие VEGF-A с рецептором VEGFR2 в последующем вызывает пролиферацию клеток эндотелия и образование первичной капиллярной сети. После формирования первичной сети капилляров дальнейшее развитие сосудистой сети происходит в результате ангиогенеза. Более зрелая сосудистая сеть образуется в результате ветвления капилляров, при этом происходит миграция деградация прилежащей базальной мембраны, и пролиферация эндотелиальных клеток, сборка клеток эндотелия в трубочки. Новые сосуды могут также образовываться в результате разделения сосудов или увеличения размеров уже существующих сосудов. Дальнейшая реконструкция первичной сосудистой сети, происходящая с участием VEGFR3-зависимой сигнальной системы, приводит к образованию разветвленной сосудистой сети, которая включает 45 Формирование мезодермы Гемангиобласты Формирование кровяных островков ВАСКУЛОГЕНЕЗ VEGFR2 Е8,5 ДИФФЕРЕНЦИРОВКА Гемопоэтические клетки Клетки эндотелия ПРОЛИФЕРАЦИЯ МИГРАЦИЯ ОРГАНИЗАЦИЯ VEGFR1 Е8,5 Первичная капиллярная сеть АНГИОГЕНЕЗ Tie2 E9,5 Е10,5 Ветвление Разделение сосуда Увеличение просвета сосуда VEGFR3 Е9,5 РЕКОНСТРУКЦИЯ Усечение избыточных капилляров Слияние Регрессия Рис. I.5. Схема, иллюстрирующая процесс формирования сосудистой системы и участие в нем некоторых сигнальных систем. 46 в себя различающиеся по размерам сосуды. На этом этапе происходит усечение избыточных капилляров, регрессия одних сосудов и слияние других с образованием сосудов большего диаметра. Далее происходит созревание сосудов вследствие рекрутирования перицитов и гладкомышечных клеток. В поддержании и стабилизации зрелых сосудов участвует Ang-1 через рецептор Tie2, стимулируя взаимодействие между клетками эндотелия и окружающими поддерживающими клетками, о чем свидетельствует и обнаруживаемый в покоящихся сосудах взрослого организма низкий уровень экспрессии этого рецептора. Образование внеклеточного матрикса и базального слоя создает поддерживающую основу для сосудов. В опухолях Ang-2 и VEGF-А очевидно выполняют те же роли, которые они играют во время реконструкции сосудов в нормальных тканях. В процессе индукции ангиогенеза в опухоли происходит как рост новых сосудов, так и их регрессия. Это продемонстрировано на ряде экспериментальных моделей перевиваемых опухолей при исследовании возникновения в опухолевой ткани сосудистой сети. При этом оказалось, что представления о том, что большинство опухолей и метастазов возникает как лишенная сосудов масса клеток, и лишь позднее, благодаря индукции ангиогенеза в ней формируется поддерживающая развитие опухоли сосудистая сеть, не вполне справедливы. Вначале опухоли быстро кооптируют уже существующие сосуды организма-хозяина, образуя достаточно хорошо васкуляризованную опухолевую массу. В дальнейшем, возможно, в результате действия защитных механизмов организма, наблюдается значительная регрессия этих первичных кооптированных сосудов, приводящая ко вторичной неваскуляризованной опухоли и существенной потере клеток опухоли. Однако, оставшаяся часть опухоли в конце концов выживает за счет активно идущего ангиогенеза на периферии опухоли. 47 Факторы роста VEGF-А и Ang-2 непосредственно участвуют в этих процессах. В кооптированных опухолью сосудах, еще до индукции экспрессии VEGF-А клетками опухоли, наблюдается значительная стимуляция экспрессии Ang-2, что, возможно, является наиболее ранним признаком возникновения сосудов опухоли. Интенсивная аутокринная экспрессия Ang-2 клетками эндотелия сосудов опухоли может нарушать паракринную стабилизацию сосудов, обеспечиваемую низким уровнем конститутивной экспрессии Ang-1 в нормальной ткани. Предполагается, что Ang-2 «помечает» кооптированные апоптотическому механизму, взаимодействия между который клетками сосуды может эндотелия для регрессии включать и по разрушение окружающими их поддерживающими клетками. Однако, активация экспрессии VEGF-А одновременно с экспрессией Ang-2 может свести к нулю регрессивный сигнал Ang-2, что согласуется с наблюдением о необходимости VEGF-А для выживания сосудов опухоли. В таком случае вызываемая Ang-2 дестабилизация сосудов фактически может способствовать проявлению ангиогенного действия VEGF-А. Таким образом, соотношение уровней экспрессии VEGF-А и Ang-2 может являться важным фактором, регулирующим баланс между ростом сосудов опухоли и их регрессией, и терапия рака, направленная на понижение уровня VEGF-А, не только предотвращает дальнейший ангиогенез опухоли, но также может способствовать регрессии вновь образованных плохо дифференцированных и недостаточно зрелых сосудов опухоли. I.7. Сигнальные пути, в которых участвуют рецепторы семейства VEGFR. Пути передачи сигналов через рецепторы семейства VEGFR пока исследованы недостаточно. Как и многие другие рецепторы, рецепторы 48 семейства VEGFR передают сигнал в ядро клетки через сложную сеть взаимодействий с цитоплазматическими белками. В результате взаимодействия со своими лигандами происходит димеризация рецепторов, приводящая к их последующей активации, вследствие чего сначала происходит взаимное фосфорилирование самих рецепторов, а затем фосфорилирование – их цитоплазматических субстратов, осуществляющих дальнейшую передачу сигнала в клетке. Цитоплазматические сигнальные белки узнают активированные рецепторы благодаря содержащимся в них SH2 (Src-Homology) и PTB (PhosphoTyrosine Binding) доменам, взаимодействующим с содержащими фосфорилированный тирозин последовательностями рецепторов [17; 77; 115; 141]. SH2 и PTB домены имеют очень мало общего на уровне первичных аминокислотных последовательностей и, по-видимому, узнают различные фосфотирозиновые сайты. Важную роль в белок-белковом взаимодействии сигнальных молекул играют также SH3 домены, способные связываться с богатыми пролином участками белков мембран и цитоскелета. В настоящее время известно уже довольно большое количество сигнальных фосфотирозин цитоплазматических домены. протоонкогенов Src и К ним белков, относятся, содержащих узнающие в продукты Abl, представляющие частности, собой нерецепторные тирозинкиназы, PI3K (фосфатидилинозит-3-киназа), PLC-γ (фосфолипаза Сγ), GAP(GTP-фосфатаза G-белка), Grb2 (Growth factor receptor binding), SHC, и др. Среди этих белков есть белки, обладающие ферментативной активностью, (например, PI3K, PLC-γ, GAP, тирозинкиназы), и адапторные белки, у которых такая активность отсутствует. Адапторные белки, (к ним относятся, например, такие участвующие в активации Ras белки как Grb2, Crk и Nck), передают сигнал, благодаря белок-белковым взаимодействиям с другими сигнальными молекулами, такими как, например, «обменный» фактор гуанидин-нуклеотида SOS. Все эти белковые молекулы связываются 49 со множеством других внутриклеточных белков и участвуют в передаче сигналов большого количества сигнальных путей. I.7.1. Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR1. Основными потенциальными сайтами фосфорилирования рецептора VEGFR1 являются фосфорилируются Tyr-1213 сайты и в Tyr1242; Tyr-1327 и меньшей Tyr-1333 степени [64]. Были идентифицированы содержащие SH2-домен белки, связывающиеся с фосфорилированными тирозинами: PLC-γ связывается с Tyr 1213 и Tyr 1333, и Grb2 SHP-2 (SH2-containing protein tyrosine phosphatase) взаимодействуют с Tyr-1213, адапторные белки Nck и Crk – с Tyr1333. Grb2 – небольшой адапторный белок, который содержит один SH2 и два SH3 домена. Благодаряя своей способности образовывать стабильный комплекс с «обменным» фактором гуанидин-нуклеотида SOS, регулирующим активность Ras, Grb2 непосредственно участвует в Rasзависимой активации каскада MAPK (Mitogen-Activating Protein Kinases), являющегося основным сигнальным путем, инициирующим сигналы клеточного роста и дифференцировки. Таким образом, взаимодействуя с Grb2, рецептор VEGFR1 может стимулировать активацию Ras-зависимого сигнального пути. Небольшие адапторные молекулы Crk и Nck также могут связываться с SOS и участвовать в активации Ras. Кроме того, показано, что v-Crk может участвовать в активации еще одного близкого к МАР-киназному сигнального пути, конечным звеном которого является фосфорилирование так называемой c-Jun NH2-терминальной киназой (JNK) продукта онкогена c-Jun: v-Crk активировал JNK через взаимодействие с «обменным» белком гуанидин-нуклеотида C3G [150]. Однако, следует заметить, что несмотря на то, что VEGFR1 способен взаимодействовать с сигнальными молекулами, участвующими в регуляции 50 Ras-зависимого сигнального пути, добавление VEGF-A к клеткам, экспрессирующим VEGFR1, не вызывает их пролиферации или дифференцировки. Возможно, это связано с незначительным уровнем фосфорилирования данного рецептора. Существование растворимой формы VEGFR1, высокая аффинность его связывания с VEGF-A, наряду с низким уровнем фосфорилирования трансмембранной формы рецептора дают возможность сделать предположение о том, что основной функцией VEGFR1 в клетках может являться регуляция взаимодействия VEGF-A со своим вторым рецептором – VEGFR2. В пользу этого предположения свидетельствуют и данные, полученные на гомозиготных мышах VEGFR1TK-/-, у которых отсутствовал тирозинкиназный домен VEGFR1. Такие мыши были жизнеспособны и у них развивалась нормальная кровеносная система [57]. Таким образом, основным функциональным рецептором VEGF-A, через взаимодействие с которым реализуются эффекты стимуляции пролиферации клеток эндотелия и их дифференцировки из клеток-предшественников, повидимому, является рецептор VEGFR2. I.7.2. Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR2. При активации рецептора VEGFR2 его лигандом VEGF-A в клетках эндотелия РАЕ и фибробластах NIH 3T3 было обнаружено 4 сайта аутофосфорилирования: Tyr-951, Tyr-996, Tyr-1054 и Tyr-1059 [24]. В ряде работ установлено, что активированый VEGFR2 способен связываться с такими сигнальными белками как PLC-γ, GAP, Nck-Grb2 и Shc-Grb2 [52; 162; 133; 81]. Показано также, что в клетках HUVEC VEGFR2 был конститутивно связан с р85 субъединицей PI3K и эта взаимосвязь не зависела от стимуляции VEGF-A [152]. PI3K представляет собой гетеродимер, состоящий и адапторной субъединицы 85 кДа (р85) и каталитической 51 субъединицы 110 кДа (р110). Субъединица р85 содержит два SH2-домена, связывающиеся с фосфорилированными по тирозину рецепторами, а также SH3-домен. Область, расположенная между двумя SH2-доменами р85, ответственна за связывание с субъединицей р110, необходимое для проявления ее каталитической активности. Стимуляция клеток HUVEC фактором роста VEGF-A приводила к фосфорилированию субъединицы р85, повышению активности PI3K и МАР-киназы с последующей активацией c-fos и стимуляцией перехода клеток в S-фазу. Все эти данные свидетельствуют о том, что взаимодействие рецептора VEGFR2 с PI3K вносит важный вклад в регуляцию Ras-MAP-киназного сигнального пути. Помимо стимуляции пролиферации и дифференцировки клеток эндотелия, фактор роста VEGF-A в условиях in vivo индуцирует также повышение проницаемости сосудов. Было показано, что в реализации этого эффекта играют важную роль некоторые киназы семейства Src (SFK) [28]. VEGF-A не повышал проницаемость сосудов у гомозиготных мышей с поврежденными генами src-/- и yes-/-, в то время как мыши с поврежденным геном fyn-/- оставались чувствительными к этому воздействию. Причем отсутствие белков рр60c-src и pp62c-yes блокировало лишь VEGF-Aзависимую индукцию повышения проницаемости сосудов, так как реакция мышей src-/- на действие аллил-изотиоцианата, вызывающего воспалительную реакцию, не изменилась. Авторы делают вывод о том, что сигнальные пути, регулирующие индукцию повышенной проницаемости сосудов при воспалении и при действии VEGF-A, различны. Интересно, что ангиогенез у мышей, дефицитных по белкам рр60c-src и pp62c-yes, не нарушен: эти мыши жизнеспособны и у них развивается нормальная капиллярная сеть. Однако, мыши, у которых отсутствует комбинация белков src, yes и fyn, погибают на 9,5 день эмбрионального развития. Эти факты свидетельствуют о том, что в клетках существует механизм, позволяющий компенсировать отсутствие отдельных SFK. 52 I.7.3. Сигнальные пути с участием рецептора VEGFR3. Как отмечалось выше, существуют 2 различающиеся по СООН-концу изоформы рецептора VEGFR3, причем лишь длинная изоформа, VEGFR3l, вызывает трансформацию культуры клеток Rat-2 in vitro [39]. В СООНобласти VEGFR3l, содержащей отсутствующие у короткой изоформы 65 аминокислотных остатков, идентифицированы 3 тирозиновых остатка, представляющих собой потенциальные сайты связывания сигнальных цитоплазматических белков – Y 1333, Y 1337 и Y 1363. Было показано, что только один из тирозинов – Y 1337 – ответственен за трансформирующую активность VEGFR3l. Предполагается, что этот же тирозин является потенциальным сайтом аутофосфорилирования этой изоформы VEGFR3 [38; 39]. При исследовании взаимодействия VEGFR3 с адапторными белками оказалось, что этот рецептор связывается с SHC и Grb2, но не с PLC-γ, p85, PI3K, GAP или c-src [113]. Далее было показано, что адапторный белок SHC, связывающий рецепторные и нерецепторные тирозинкиназы с Ras/MAPK сигнальным путем, узнает последовательность, содержащую Y 1337. Ген SHC человека кодирует 3 изоформы белка – 46, 52 и 66 кДа. Все изоформы SHC содержат 2 домена, взаимодействующих с фосфотирозином: SH2-домен в СООНобласти и PTB-домен в NH2-области, позволяющие им взаимодействовать с различными фосфотирозин-содержащими последовательностями. Оказалось, что за взаимодействие с VEGFR3l отвечает РТВ-домен белка SHC. В результате такого взаимодействия в клетках Rat-2 одновременно фосфорилируются тирозины Y 239/Y 240 и Y 313 белка SHC, при этом создаются сайты связывания для другого адапторного белка – Grb2, комплексирующегося с SHC. Такой комплекс обеспечивает взаимосвязь с RAS-зависимым сигналингом: SH3-домен белка Grb2 53 связывается с активатором G-белков SOS-1, запускающим сеть RAS/MAPK сигнальных путей [40]. С активацией этого сигнального пути, возможно, связан митогенный эффект VEGF-C на клетки эндотелия сосудов. Установлено, что рецептор VEGFR3 участвует в активации еще одного близкого к МАР-киназному сигнального пути, конечным звеном которого является фосфорилирование c-Jun NH2-терминальной киназой (JNK) продукта онкогена c-Jun: стимуляция клеток эндотелия человека НEL лигандом VEGFR3 – VEGF-C активировала JNK. Вышележащим звеном JNK сигнального пути является RAFTK (Related Adhesion Focal Tyrosine Kinase) (другие названия этой тирозинкиназы – Pyk2 и CAK-β), фосфорилирование которой также происходило в результате активации VEGFR3 ростовым фактором VEGF-C [163]. Вообще же, RAFTK активируется в результате передачи сигналов от многих ростовых факторов и цитокинов, в частности, bFGF, IL-6, VEGFa, TNFα, и, по-видимому, является ключевой тирозинкиназой, активирующей целый ряд внутрицитоплазматических киназ и адапторных молекул, передающих поверхностные сигналы к цитоскелету. Активированная RAFTK через СООН-концевой богатый пролином домен связывается с паксиллином, основным компонентом комплекса фокальной адгезии, участвующим в контактах с прилежащим внеклеточным матриксом. Под действием VEGF-C в клетках HEL усиливалось фосфорилирование паксиллина и увеличивалась его ассоциация с RAFTK. Возможно, что именно этот механизм ответственен за стимулирующий эффект VEGF-C на миграцию клеток эндотелия. RAFTK также активирует Ras/MAPK сигнальный путь взаимодействуя с Grb2/SOS. Приведенные данные свидетельствуют о том, что взаимодействие ростовых факторов семейства VEGF со своими рецепторами приводит к активации таких известных сигнальных путей как PI3K-, PLCγ-PKC-, Ras- 54 MAPK- и JNK-зависимые пути, регулирующие размножение и миграцию клеток. Таким образом, имеющиеся в настоящее время данные дают возможность выделить рецепторы VEGFR1 (FLT1), VEGFR2 (Flk1/KDR) и VEGFR3 (FLT4) в отдельную подгруппу семейства РТК на основании сходства их структуры и особенностей функционирования в клетке, обусловленных их преимущественной локализацией на клетках эндотелия сосудов и взаимодействием с ростовыми факторами семейства VEGF. Сигнальные пути, в функционирование которых включены эти рецепторы, контролируют такие жизненно важные для нормальной и опухолевой ткани процессы как возникновение и развитие кровеносной и лимфатической систем. Исследование механизмов, регулирующих активность этих сигнальных путей, может дать возможность стимулировать рост сосудов в тех случаях, когда это необходимо, либо блокировать их развитие при опухолевом росте. 55 ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. II.1. МАТЕРИАЛЫ. Все исследованные в работе культуры клеток были получены из коллекции лаб. генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза РОНЦ РАМН (рук. – проф. А.А. Ставровская). Все образцы гепатом мыши были получены в лаб. канцерогенных веществ НИИ канцерогенеза РОНЦ РАМН (рук. – проф. В.С. Турусов). Для получения спонтанных гепатом использовались мыши-самцы линии CВА. Перевиваемая гепатома ДЭНА + ФБ была первоначально индуцирована введением 1,2-диэтилнитрозамина (ДЭНА) с последующим нанесением фенобарбитала (ФБ). Перевиваемая гепатобластома была получена от докт. B.A. Diwan J.M. и Rice (NCI, Frederick, MA, USA). Образцы ткани с различной патологией щитовидной железы человека, исследованные на экспрессию генов FLT4 (VEGFR3) и VEGF-C методами RT-PCR и иммуногистохимии были получены в Эндокринологическом Научном Центре РАМН, г. Москва, благодаря сотрудничеству с проф. М.И. Бронштейн. Гистологическая характеристика тиреоидных патологий была дана проф. М.И. Бронштейн. Образцы меланом, мезотелиом, рака толстого кишечника, рака яичника и рак молочной железы человека, использовавшиеся при исследовании экспрессии гена FLT4 (VEGFR3) методом Норзерн блотгибридизации, а также образцы с различными патологиями щитовидной железы человека, исследованные методом имуногистохимии на экспрессию FLT4 (VEGFR3) и CD31 были любезно предоставлены докт. J. Jacquemier, Institute Paoli-Calmettes, Марсель, Франция. 56 II.2. ОСНОВНЫЕ РАСТВОРЫ. 20х SSC: 20х (0,15M NaCl; 0,015M Na-лимонно-кислый) 20х SSPE: 20х (0,15М NaCl; 0,01М NaH2PO4; 1 мМ ЭДТА); рН 7,4 5х TBE: 0,089М Трис-борат; 0,089 М борной кислоты; 10 мМ ЭДТА. Т10Е1: 10 мМ Трис-HCl; 1 мМ ЭДТА. Т50Е1: 50 мМ Трис-HCl; 1 мМ ЭДТА. 1М NapB: 1М NaH2PO4 x 2H2O; pH 7,0. Раствор Денхардта (50х): 5г Ficoll (Type 400, Pharmacia); 5г поливинил-пирролидон; 5г BSA (Fraction V, Sigma) на 500 мл воды. Wash-blot: 0,3 М Na2HPO4; 0,2 M NaH2PO4; 1,5% пирофосфата Na; 2,5% SDS. 61х: 6х SSC; 1х Денхардт. 21х: 2х SSC; 1х “Wash-blot”. 6х ”Sample”: 10 мМ Трис-HCl, рН 7,9; 1 мМ ЭДТА; 0,25% бромфенолового синего; 30% глицерин. 6x “Sample”/РНК готовился на Н2О/DEPC. H2O/DEPC: 1 мл DEPC добавлялся к 1 л Н2О и раствор стоял в бутылке с приоткрытой крышкой при 37оС в течение ночи. 10х MOPS: 2 М MOPS (морфолинпропансульфокислота); 0,5 М Naацетат; 10 мМ ЭДТА; рН 7,0 доводится NaOH. Фенол. Фенол растапливался в кипящей водяной бане, затем к нему добавлялся равный объем 0,2 М Трис-HCl, рН 8,0. После интенсивного перемешивания и отстаивания смеси верхняя фаза отбиралась и процедура повторялась несколько раз до тех пор, пока рН фенола не достигал 7,6. К полученному таким образом забуференному фенолу добавлялся 8гидрокси-хинолин до конечной концентрации 0,1%. Фенол хранился при 4оС, над поверхностью фенола оставлялось небольшое количество буфера. 57 II.3. МЕТОДЫ. Посев клонотек фага λ. Исходная культура клеток-хозяина (Y 1090 для λgt 11; NM 514 для λgt 10; XL-1 для Lambda ZAP II “Stratagene”) выращивалась в 5 мл среды NZCYM или LB с добавлением 0,2% мальтозы и 10 мМ MgSO4 до достижения А600=0,6, затем центрифугировалась в течение 15 мин, 3500 об/мин, и суспендировалась в 1,6 мл холодного (4оС) раствора 10 мМ MgSO4. Далее 100 мкл разведенного фага (приблизительно 50000 pfu на чашку) смешивалось со 100 мкл концентрированных клеток-хозяина и инкубировалось в течение 15 мин при 37оС, без встряхивания – для лучшей адсорбции фага. NZCYM верхний агар (0,65% агарозы) растапливался в водяной бане при 55оС, после чего к нему добавлялся MgSO4 до конечной концентрации 10 мМ. К инфицированной фагом культуре добавлялось 4 мл/90 мм чашку или 10 мл/150 мм чашку верхнего агара и вся смесь сразу же выливалась на чашки с NZCYM агаром. Чашки помещались на 1 час в холод (4оС), для того чтобы затвердел верхний агар, и затем инкубировались в течение 6-7 часов при 37оС. При инкубации следовало избегать появления участков сплошного лизиса. Скрининг клонотек фага λ (по методу Benton W.D., Davis R.W. [7]). На чашки с клонами фага λ помещались на 4 мин нитроцеллюлозные фильтры, вырезанные по диаметру чашки. Фильтры помечались с 3-х сторон чернилами таким образом, чтобы одновременно были помечены и чашки с клонами. 58 Далее фильтры последовательно помещались на 2 мин на поверхность денатурирующего раствора (1,5 М NaCl; 0,5 M NaOH), нейтрализующего раствора (1,5 М NaCl; 0,5 М Трис-HCl, рН 8,0) и 2х SSPE. Фильтры не должны погружаться в растворы. Затем фильтры подсушивались и запекались в течение 2 часов при 80оС. Для проведения гибридизации фильтры предварительно инкубировались в течение 1-3 часов при 68оС в буфере 61х. Гибридизация проводилась в том же буфере, с добавлением меченого зонда, в течение ночи, при 68оС. При проведении гибридизации в менее жестких условиях фильтр инкубировался с меченым зондом при 55оС в буфере 61х в течение ночи, затем отмывался дважды в растворе 2х SSC; 0,1% SDS. После гибридизации фильтры отмывались 3 раза по 20 мин, при температуре 65оС, в буфере 21х, затем подсушивались и экспонировались с рентгеночувствительной пленкой “Kodak” в течение нескольких часов, при температуре –20оС. Выделение плазмиды in vivo. Кусочки агара, содержащие лизисные плашки с позитивными клонами, помещались в пробирки Eppendorf, объемом 1,5 мл, содержащие 500 мкл буфера CSM и 10 мкл хлороформа. Пробирка встряхивалась на Vortex, для того чтобы фаговые частицы вышли из агара в буфер, и смесь инкубировалась 1-2 часа при комнатной температуре или при 4оС в течение ночи. Далее в 50 мл пробирке смешивалось 200 мкл клеток XL1-Blue, с А600=1; 200 мкл приготовленной фаговой смеси, содержащей не менее 1х105 фаговых частиц; 1 мкл фага-помощника R408 (> 1х106 pfu/мл). Смесь инкубировалась при 37оС, 15 мин. Затем к смеси добавлялось 5 мл среды 2х 59 YT и все инкубировалось в течение 3 часов при 37оС в термостатируемом встряхивателе. После инкубации пробирка прогревалась при 70оС, 20 мин, и центрифугировалась в течение 5 мин, 4000 g. Супернатант, содержащий pBluescript phagemid, переносился в стерильную пробирку и хранился при 4оС. Для того чтобы получить колонии, содержащие плазмиду pBluescript с клонированной вставкой ДНК, приготавливалось 2 смеси: а) 10 мкл исходного и б) 10 мкл разведеного в 10-2 степени полученного супернатанта фага смешивалось с 200 мкл клеток XL1-Blue с А600=1 и инкубировалось при 37оС, 15 мин. Затем от 1 до 10 мкл смеси наносилось на чашки с LB агаром с добавлением ампициллина и инкубировалось при 37оС в течение ночи. Образовавшиеся колонии содержали плазмиду pBluescript с клонированной вставкой ДНК. Скрининг бактериальных колоний (по методу Grunstein M., Hogness D. [50]). Для проведения скрининга колоний бактериальная культура высевалась на накрытые нитроцеллюлозным фильтром чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин. Чашки инкубировались при 37оС, в течение ночи. Затем с исходных фильтров приготавливались реплики. Для этого чистые нитроцеллюлозные фильтры помещались для увлажнения на несколько минут на поверхность чашек с LB-агаром, к которому был добавлен ампициллин. Исходные фильтры снимались с чашек, чашки выбрасывались. Исходный и новый фильтры плотно прижимались друг к другу и на них, протыкая оба фильтра насквозь, с 3-х сторон наносились метки чернилами. Далее новый фильтр помещался на чашку с LB-агаром с добавлением ампициллина, а исходный – на чашку с LB-агаром, к которому 60 были добавлены ампициллин и хлорамфеникол Чашки инкубировались при 37оС, в течение ночи. Далее исходные фильтры анализировались с помощью гибридизации in situ. Для этого они последовательно помещались на 4 мин на поверхность раствора 10% SDS, денатурирующего раствора (1,5 М NaCl; 0,5 M NaOH), нейтрализующего раствора (1,5 М NaCl; 0,5 М Трис-HCl, рН 8,0) и 2х SSPE. После чего фильтры подсушивались и запекались при 80оС, 2 часа. Гибридизация фильтров проводилась согласно аналогичной процедуре для скрининга клонотек фага λ. Приготовление компетентных клеток XL-Blue. Клетки культивировались в течение ночи в 5 мл среды LB с добавлением тетрациклина. Затем 1 мл суспензии ночной культуры клеток переносилось в 100 мл среды 2 х YT с добавлением тетрациклина и клетки размножались до тех пор, пока оптическая плотность суспензии не достигала 0,6 при длине волны 600 нм. После чего клетки охлаждались во льду в течение 30 мин, а затем центрифугировались в течение 15 мин при 2000 об/мин. Получившийся осадок осторожно суспендировался в 50 мл холодного 50 мМ CaCl и помещался в лед на 60 мин. Затем клетки центрифугировались в течение 15 мин при 2000 об/мин, осторожно суспендировались в 10 мл 50 мМ CaCl2 + 20% глицерина (w/v), разливались на аликвоты по 250 мкл и хранились при –80оС. Трансформация компетентных клеток XL-Blue. Клетки размораживались во льду. В пробирке осторожно смешивались ДНК (1-5 мкл); раствор, содержащий 50 мМ CaCl2 + 30 мМ MgCl2 (общий объем этого раствора и вносимой ДНК должен составлять 50 мкл), и 100 мкл компетентных клеток XL-Blue. Смесь держалась во льду в 61 течение 20 мин, затем нагревалась при 37оС, 2 мин, в водяной бане, после чего к смеси добавлялось 300 мкл среды 2х YT и смесь инкубировалась при 37оС в течение 50 мин в термостатируемом встряхивателе. За 20 мин до окончания инкубации на чашки с LB-агаром, к которому был добавлен ампициллин, наносиллось по 40 мкл 2% XGal и 100 мкл 100 мМ IPTG. Каждая из реакций трансформации разливалась на 2 приготовленные чашки. Чашки оставлялись на 10 мин при комнатной температуре, затем переворачивались и инкубировались в течение ночи при 37оС. В том случае, если для трансформации клеток XL-Blue использовались продукты реакции лигирования, обычно получали как белые (содержащие плазмиды с встроенной клонируемой вставкой), так и голубые (содержащие только исходные плазмиды) бактериальные клоны. Соответственно, для последующего анализа отбирались только белые клоны. Быстрое выделение плазмидной ДНК (“Mini-prep”). Отдельные колонии отбирались стерильной деревянной зубочисткой, засевались на чашку с соответствующим антибиотиком и затем помещались в пробирку Eppendorf, объемом 1,5 мл, с 1 мл среды “Terrific Broth”. Среда “Terrific Broth” приготавливалась добавлением 100 мл раствора 0,17 М KH2PO4 + 0,72 M K2HPO4 к 900 мл среды, содержащей 12 г BactoTryptone, 24 Bacto дрожжевого экстракта и 4 г глицерина. Пробирки с отобранными колониями инкубировались в течение ночи, при 37оС, в термостатируемом встряхивателе. Далее выращенная культура центрифугировалась 30-60 сек при 12000 об/мин, супернатант выливался. К осадкам добавлялось по 200 мкл лизирующей смеси, содержащей 10 мМ Трис-HCl, рН 7,9; 50 мМ ЭДТА; 8% сахарозы и 0,5% кристаллического Triton X-100, лизоцима. а После также по несколько чего пробирки гранул интенсивно 62 встряхивались 30-60 сек, помещались в кипящую водяную баню ровно на 40 сек и центрифугировались при комнатной температуре 5 мин, 12000 об/мин. Образовавшийся осадок отбирался стерильной зубочисткой. К супернатанту добавлялось по 20 мкл 3М ацетата Na и 250 мкл изопропанола. Смесь оставлялась при комнатной температуре на 5-15 мин, центрифугировалась 15 мин, при 12000 об/мин. Супернатант отбрасывался, а осадок промывался 70% этанолом, после чего растворялся в 50 мкл Т10Е1. Для проведения реакции рестрикции использовались 96-луночные плашки. В каждую из лунок вносилось по 10 мкл полученной ДНК, к которой добавлялось по 40 мкл ферментной смеси. Приведем расчет приготовления ферментной смеси для анализа 24 клонов: 125 мкл 10х буфера; 25 мкл РНКазы А; 100-200 ед соответствующей рестриктазы; Н2О – до 1 мл. Реакционная смесь инкубировалась 2 часа при 37оС и результаты рестрикции анализировались с помощью электрофореза. Выделение плазмидной ДНК (“Mini-Maxi”). Отобранный клон помещался в 50 мл среды LB с добавлением соответствующего антибиотика и инкубировался в течение ночи при 37оС в термостатируемом встряхивателе. Затем выращенную культуру переносилась в 50 мл пластиковые центрифужные пробирки Falcon и центрифугировалась 15 мин, 3000 об/мин, при 4оС. Осадки суспендировались в 7 мл T50E1, переносились в 5 пробирок Eppendorf, объемом 1,5 мл, и центрифугировлись 2 мин при 12000 об/мин. В каждой из пробирок супернатант отбрасывался, а осадок суспендировался в 400 мкл раствора STE, содержащего 15% сахарозы; 50 мМ Трис-HCl, рН 7,9; 50 мМ ЭДТА. Пробирки помещались в лед, в них добавлялось по несколько гранул кристаллического лизоцима. Затем пробирки встряхивались и оставлялись во льду на 10 мин. Далее в каждую 63 из пробирок добавлялось по 300 мкл раствора ТТЕ, содержащего 0,1% тритона Х-100; 50 мМ трис-HCl, рН 7,9; 50 мМ ЭДТА, все перемешивалось и оставлялось во льду еще на 10 мин. Смесь время от времени встряхивалась. Затем в каждую из пробирок добавлялось по 2 мкл DEPC, и пробирки снова встряхивались. Далее пробирки помещались ровно на 45 сек в кипящую баню, после чего центрифугировались 15 мин, 12000 об/мин. Образовавшиеся осадки отбирались стерильной зубочисткой. К супернатантам добавлялось по 1 мл 100% этанола комнатной температуры и пробирки сразу же центрифугировались 10 мин, 12000 об/мин. После центрифугирования супернатант отбрасывался, осадки подсушивались и растворялись в 100 мкл Т10Е1. Далее содержимое пробирок объединялось в одну пробирку, к нему добавлялось 5 мкл РНКазы А (с концентрацией 5 мг/мл) и смесь инкубировалась 15-30 мин при 37оС. Затем проводились 2-3 отмывки забуференным фенолом и 1 отмывку смесью хлороформ:изоамиловый спирт = 24:1, после чего к раствору ДНК добавлялись 5 М NaCl до конечной концентрации 0,2 М и 100% этанол с температурой –20оС. Смесь немедленно центрифугировалась 15 мин, 12000 об/мин, осадок подсушивался и растворялся в 200-500 мкл Т10Е1, в зависимости от полученного количества. Рестриктный анализ фрагментов ДНК. Для проведения реакции рестрикции использовались рестриктазы фирмы Boeringer Mannheim с удельными активностями 10-12 ед/мкл (низкая активность) и 40-50 ед/мкл (высокая активность). В стандартных условиях использовались рестриктазы с низкой активностью, рестриктазы с высокой активностью обычно использовались для расщепления больших количеств ДНК при выделении фрагментов для переклонирования и дальнейшего рестриктного анализа. 64 Стандартная реакция рестрикции содержала 5-10 мкл ДНК; 2-5 мкл рестриктазы; 5 мкл 10х буфера; общий объем реакционной смеси составлял 50 мкл. Инкубация проводилась в течение 2 часов при 37оС. В случае использования в реакции рестрикции 2-х ферментов, работающих при разных концентрациях солей, первая инкубация проводилась с рестриктазой, работающей в буфере с меньшей ионной силой. В данном случае объем реакционной смеси составлял 30 мкл, инкубация длилась 1 – 1,5 часа, при 37оС, после чего к смеси добавлялось 5 мкл буфера с более высокой ионной силой, 2-5 мкл второго фермента и реакция продолжалась еще в течение 2 часов, при 37оС. При расщеплении ферментами рестрикции больших количеств ДНК объем реакционной смеси увеличивался до 300-500 мкл и использовались рестриктазы с высокой удельной активностью. Продукты рестрикции рекомбинантных плазмид и фрагментов ДНК анализировались с помощью электрофореза в агарозном геле. Линеаризация плазмид. Для линеаризации отбиралось 50-100 мкг плазмиды и ставилась реакция рестрикции с выбранными рестриктазами, реакция продолжалась не менее 3 час. Для контроля степени расщепления плазмиды отбирался 1 мкл реакционной смеси и анализировался с помощью электрофореза. Далее образовавшиеся продукты реакции рестрикции отмывались 1-2 раза фенолом и 2 раза смесью хлороформ:изоамиловый спирт = 24:1, переосаждались в 2 объемах этанола с добавлением 5М NaCl до конечной концентрации 0,2 М, осадок подсушивался и растворялся в 20-40 мкл Н2О. Далее определялась оптическая плотность раствора ДНК и концентрация ДНК доводилась до 1 мкг/мл. 65 Определение концентрации ДНК и РНК. Для определения концентрации из исходного раствора ДНК или РНК отбирались аликвоты 5-10 мкл, которые далее разводились в 50-100 раз водой, и определялась оптическая плотность полученного раствора при длине волны 260 нм. Концентрация растворов нуклеиновых кислот определялась из расчета, что А260 = 1 соответствует концентрации 47 мкг/мл раствора ДНК и 40 мкг/мл раствора РНК. Электрофорез ДНК. Электрофорез ДНК проводился в 1% агарозном геле в буфере 0,5х TBE, рН 8,0; при 100v. Для приготовления геля к 3 г агарозы добавлялось 270 мл Н2О и смесь кипятилась в водяной бане или в микроволновой печи до исчезновения гранул. Затем агароза охлаждалась при комнатной температуре на магнитной мешалке до 60-65оС, к ней добавлялось 30 мл 5х TBE, бромистый этидий (5 мг/мл) до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и раствор переливался в форму для застывания геля. Наносимые на гель образцы ДНК смешивались с 6x “Sample”-буфером. Выделение фрагментов ДНК с помощью центрифугирования содержащего этот фрагмент кусочка геля. Агарозный гель, в котором проводилось разделение фрагментов ДНК, помещался на поверхность трансиллюминатора и кусочек геля, содержащий нужный фрагмент ДНК, вырезался скальпелем, при этом желательно, чтобы объем геля, содержащего фрагмент, был минимальным. Вырезанный кусочек геля помещался в пробирку Eppendorf, объемом 1,5 мл, на дне которой было предварительно сделано отверстие с помощью раскаленной 66 иглы. Отверстие прикрывалось сверху небольшим количеством силиконизированной стеклянной ваты. Затем пробирка с кусочком геля вставлялась в другую пробирку Eppendorf и центрифугировалась в течение 10 мин, 6000 об/мин. При центрифугировании раствор, содержащий ДНК, попадал в нижнюю пробирку, а сам гель задерживался стекловатой. Полученная таким образом ДНК была пригодна для большинства дальнейших манипуляций: лигирования, приготовления меченого зонда, и т.п. Метод обычно применялся для выделения небольших количеств ДНК. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля с помощью очистки на колонках BND. Агарозный гель, в котором проводилось разделение фрагментов ДНК, помещался на поверхность трансиллюминатора и кусочек геля, содержащий нужный фрагмент ДНК, вырезался скальпелем. Метод обычно применялся для выделения больших количеств ДНК, для миграции которых в геле объединяли несколько дорожек. Вырезанный фрагмент геля помещался в диализный мешок, который заполнялся буфером для электрофореза, герметично зажимался с обоих концов и снова помещался в камеру для электрофореза в том же направлении, в котором происходила миграция ДНК. В результате электроэлюции ДНК выходила из геля в диализный мешок, процесс электроэлюции контролировался с помощью трансиллюминатора. После того как вся ДНК вышла из геля в диализный мешок, его содержимое дважды пропускалось через колонку, заполненную BND. Затем колонка элюировалась буфером, содержащим 1 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, 1 М NaCl и 15% этанола, для чего на нее наносилось 3-5 раз по 400 мкл буфера. Элюат собирался в пробирки Eppendorf, объемом 1,5 мл, к каждой пробирке добавлялось по 1 мл холодного этанола (4оС), смесь охлаждалась в течение 15 мин при – 20оС, центрифугировалась 10-15 мин, 12.000 об/мин, осадки подсушивались и растворялись в ТЕ или Н2О. 67 Приготовление колонок BND. Несколько грамм сухого суспендировалось BND в буфере, содержащем 10 мМ трис-HCl; 1 мМ ЭДТА; 0,3 М NaCl; 15% этанола. Полученная взвесь хранилась при 4оС. Для приготовления колонок отбиралось 1-2 мл взвеси, наносилось на колонку и дважды промывалось буфером, содержащим 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА и 0,3 М NaCl. Клонирование фрагментов ДНК. В качестве использовались вектора варианта 2 для клонирования плазмиды фрагментов ДНК и KS+, Bluescript: SK+ различающиеся направлением последовательности сайтов рестрикции встроенного полилинкера (Рис.II.1.). Выбранный для клонирования фрагмент ДНК вырезался с помощью подходящих рестриктаз и после миграции в агарозном геле выделялся с помощью колонок BND или центрифугированием содержащего нужный фрагмент кусочка агарозного геля. Плазмида Bluescript (SK+ или KS+) также подвергалась рестрикции теми же ферментами для получения совпадающих с выделенным фрагментом ДНК “липких” концов. В том случае, если рестриктные сайты, по которым вырезался фрагмент ДНК, “затуплялись” в и полилинкере данный отсутствовали, фрагмент концы клонировался фрагмента в векторе, линеаризованном рестриктазой SmaI. Для достраивания «липких» концов собиралась следующая реакционная смесь: 25 мкл выделенного фрагмента ДНК (1 мкг); 5 мкл дНТФ с исходной концентрацией 10 мМ; 5 мкл 10х буфера для ДНК-полимеразы фага Т4; 1 мкл ДНК-полимеразы фага Т4 68 69 (1 ед/мкл); общий объем смеси составлял 50 мкл. Реакция проводилась при 11оС, в течение 20 мин. Далее фермент инактивировался нагреванием при 75оС, 10 мин, ДНК отмывалась несколько раз забуференным фенолом и смесью хлороформ: изоамиловый спирт = 24:1, переосаждалась в этаноле и растворялась в Т10Е1. В некоторых случаях при отсутствии на концах фрагмента ДНК подходящих сайтов удавалось подобрать изошизомер для какой-либо из рестриктаз, имеющих сайт в полилинкере вектора, что давало возможность провести реакцию лигирования. Однако в этом случае полученный в результате лигирования сайт переставал узнаваться какойлибо из рестриктаз. Реакция лигирования. Для проведения реакции лигирования к 7 мкл ДНК добавлялся 1 мкл плазмиды Bluescript (SK+ или KS+), обработанной соответствующими рестриктазами; 1 мкл 10х лигазного буфера и 1 мкл лигазы. Реакционная смесь инкубировалась в течение ночи, при 4оС. Далее проводилась трансфекция продуктами реакции лигирования компетентных клеток XL-Blue. Блот-гибридизация по Саузерну. После завершения миграции ДНК гель помещался в денатурирующий буфер, содержащий 1,5 М NaCl и 0,5 М NaOH, и инкубировался при комнатной температуре в течение 40 мин, с покачиванием. После денатурации гель инкубировался в тех же условиях в нейтрализующем буфере, содержащем 1М NapB, pH 7,0. Для переноса ДНК использовались нитроцеллюлозные фильтры Hybond-C extra (Amersham), которые предварительно смачивались в 2х SSC. Перенос проводился в 20х SSC в 70 течение ночи, при комнатной температуре. Далее фильтры подсушивались и запекались в течение 2 часов при 80оС. Для проведения гибридизации фильтр предварительно инкубировался в течение 1-2 часов при 65-68оС в буфере 61х. Гибридизация проводилась в том же буфере, к которому был добавлен меченый зонд, в течение ночи, при 65-68оС. После гибридизации фильтр отмывался 3 раза по 20 мин, при температуре заворачивался 65оС, в в буфере пленку 21х. “Saran Затем Wrap” фильтр и подсушивался, экспонировался с рентгеночувствительной пленкой “Kodak” в течение нескольких часов или в ночь, при температуре –70оС. Приготовление меченого зонда. Для проведения реации мечения использовался набор для мечения фирмы Amercham. К фрагменту ДНК, взятому в качестве зонда, добавлялась Н2О до конечного объема 60 мкл. Затем ДНК денатурировалась нагреванием в кипящей водяной бане в течение 7 мин с последующим охлаждением во льду в течение 15-20 мин. Перед добавлением следующих компонентов реакции пробирка с ДНК центрифугировалась в течение нескольких секунд для осаждения жидкости со стенок пробирки. Затем к ДНК добавлялись 10 мкл OLB, 2 мкл BSA; 1 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I с удельной активностью 2 ед/мкл; 5 мкл 32 Р- дЦТФ с удельной активностью не менее 1х106 cpm/мкг ДНК. Реакционная смесь инкубировалась 2 часа при 37оС. 71 Очистка меченого зонда от невключившихся дНТФ. Очистка меченого зонда проводилась с помощью колонок, заполненных “Biogel 60”. “Biogel 60” предварительно замачивался для набухания в течение не менее 4-х часов, в буфере, содержащем 10 мМ трисHCl, рН 7,4; 0,1% SDS; 2% азид Na; в соотношении 1 г “Biogel 60” на 28 мл Н2О. Для приготовления колонок использовались 2 мл пластиковые шприцы, внутрь которых помещался вырезанный по диаметру шприца фильтр GF/B. Шприц полностью заполнялся взвесью “Biogel 60”, затем помещался в 15 мл пластиковую центрифужную пробирку и центрифугировался в течение 3 мин, 1800 об/мин, для удаления избытка буфера. На приготовленную таким образом колонку наносился меченый зонд, предварительно разбавленный добавлением 200 мкл 5 мМ ЭДТА или Т10Е1, и пробирка снова центрифугировалась в течение 5 мин, 1800 об/мин. Не включившийся в ДНК 32Р-дЦТФ сорбировался на колонке. Из собранной в пробирке смеси отбиралось 2 мкл для подсчета радиоактивности. После чего к очищенной смеси добавлялось 200 мкл ДНК Salmon sperm, в концентрации 5 мг/мл, и полученный зонд денатурировался нагреванием в течение 10 мин в кипящей водяной бане с последующим охлаждением во льду. Секвенирование ДНК. Для секвенирования ДНК использовался набор реактивов “Sequenase Version 2.0” (фирма “US Biochemical”). Секвенирование ДНК проводилось согласно протоколу “Sequenase Version 2.0” с использованием плазмиды Bluescript (“Stratagene”) в качестве одно- или двунитевой матрицы и модифицированного фермента Т7 ДНК-полимеразы. 72 Реакция с использованием двунитевой матрицы. Для проведения реакции аннилинга в пробирке “Eppendorf” смешивалось 7 мкл ДНК, 2 мкл буфера, 1 мкл праймеров М13-40 и смесь центрифугировалась в течение нескольких секунд. Затем смесь прогревалась в течение 2 мин при 65оС и медленно охлаждалась до <35оС, после чего ставилась в лед. Смесь для реакции мечения составлялась следующим образом (приведен расчет для 6 реакций): 6 мкл дитиотреитола (ДТТ); 2,4 мкл Lab Mix (без дАТФ); 3 мкл 32 S-дАТФ; 1,5 мкл Т7 ДНК-полимеразы; 9,6 мкл Н2О; 10,5 мкл ферментного буфера. Все центрифугировалось в течение нескольких секунд; общий объем смеси составлял 33 мкл. Для проведения реакции мечения к каждой из пробирок со смесью ДНК и праймеров добавлялось по 5,5 мкл смеси для реакции мечения и смесь инкубировалась при комнатной температуре 5 мин. Затем из каждой пробирки с реацией мечения по 3,5 мкл реакционной смеси переносилось в 4 пробирки с 2,5 мкл предварительно прогретых при 37оС «терминационных» смесей для нуклеотидов Г, А, Т, С. Реакция продолжалась в течение следующих 5 мин при 37оС, после чего к пробиркам с реакционной смесью добавлялось по 4 мкл “Stop”-раствора. Непосредственно перед нанесением на секвенирующий гель образцы прогревались при 75оС в течение 2 мин. Реакция с использованием однонитевой матрицы. Для проведения реакции аннилинга в пробирке “Eppendorf” смешивалось 6 мкл ДНК; 2 мкл праймеров М13-40; 2 мкл 0,5 N NaOH. Смесь прогревалась при 80оС, 2 мин и затем медленно охлаждалась до 37оС. После охлаждения к смеси добавлялось 2 мкл 0,5 N HCl и 2 мкл буфера для аннилинга. 73 Смесь для реакции мечения составлялась следующим образом (приведен расчет для 6 реакций): 18 мкл Lab Mix (без дАТФ); 3 мкл 32 S- дАТФ; 12 мкл Т7 ДНК-полимеразы, разведенной до концентрации 1,5 ед/мкл; 7 мкл Н2О. Смесь центрифугировалась в течение нескольких секунд; общий объем смеси составлял 40 мкл. Для проведения реакции мечения к каджой из пробирок со смесью ДНК и праймеров добавлялось по 6 мкл смеси для реакции мечения, и пробирки инкубировались при комнатной температуре 5 мин. Затем из каждой пробирки с реакцией мечения по 4,5 мкл переносилось в 4 пробирки с 2,5 мкл предварительно прогретых при 37оС «терминационных» смесей для нуклеотидов Г, А, Т, С. Реакция продолжалась в течение следующих 5 мин при 37оС, после чего к пробиркам с реакционной смесью добавлялось по 5 мкл смеси для остановки реакции. Непосредственно перед нанесением на секвенирующий гель образцы прогревались при 75оС в течение 2 мин. Для проведения сиквенса ДНК использовался 8% или 6% полиакриламидный гель. Гель готовился на буфере 1х TBE, рН 8,3; 8% гель содержал 38 г акриламида; 2 г бисакриламида А; 210 г мочевины в 500 мл H2O. Непосредственно перед заливкой геля в раствор акриламида добавлялось 500 мкл TEMED. После завершения электрофореза гель вымачивался в течение 2 час в растворе, содержащем 10% уксусной кислоты; 10% метанола, высушивался и экспонировался с рентгеночувствительной пленкой “Kodak”. Анализ проводился секвенированных с (Intelligenetics). использованием последовательностей программного нуклеотидов обеспечения PC-gene 74 Определение хромосомной локализации генов Flt4 мыши и FLT4 (VEFGR3) человека. Для исследования хромосомной локализации гена FLT4 (VEFGR3) человека были использованы препараты хромосом, полученные из фитогемагглютинин-стимулированных лимфоцитов нормальной периферическрй крови. Клетки культивировали в течение 72 часов с добавлением 5-бром-дезоксиуридина на период последних 6 часов культивирования, после чего приготавливали хромосомные препараты общепринятым методом.. В качестве зонда для гибридизации использовалась плазмида клона pHP3L, содержащая вставку 0,35 kbp гена FLT4 (VEFGR3) человека. Зонд метился 3Н с помощью реакции никтрансляции и добавлялся в смесь для гибридизации в конечной концентрации 3 – 25 нг/мл. Чашки покрывались эмульсией (Kodak NTB2) и экспонировались от 10 до 14 дней. Затем хромосомы окрашивались красителем Гимза, приготовленном на фосфатном буфере, и метафазы фотографировались. R-banding осуществлялся с помощью FPG метода и метафазы снова фотографировали для анализа. Выделение РНК. Вся посуда для выделения ДНК обрабатывалась раствором 0,1% DEPC и автоклавировалась. Все растворы готовились на воде, обработанной DEPC (H2O/DEPC). 1. Выделение РНК с помощью ультрацентрифугирования через градиент CsCl. Кусочки ткани или клетки разбивались с помощью механического гомогенизатора “Polytron” и суспендировались в 23 или 46 мл раствора 75 изотиоцианата гуанидина (ГТЦ), содержащего 4,25 М изотиоцианата гуанидина; 0,5% лауроил саркозината Na; 5 мМ Na лимонно-кислого, рН 7,0 доводился NaOH. Непосредственно перед выделением в раствор ГТЦ добавлялся β–меркаптоэтанол до 0,1 М. Полученный гомогенат центрифугировался в течение 10 мин при 4000 об/мин. В центрифужные пробирки вносилось по 12 мл раствора CsCl, содержащего 5,7 М CsCl; 50 мМ трис-HCl; 50 мМ ЭДТА, рН 7,8 доводился HCl. Сверху наносилось по 23,5 мл супернатанта, полученного после центрифугирования гомогената; все центрифугировалось в течение 18 часов при 25000 об/мин, 20оС. После центрифугирования супернатант отбирался пипеткой до тех пор, пока в пробирке не оставалось 1-2 мл раствора, который выливался осторожно переворачиванием протирались чистой пробирки. фильтровальной Стенки бумагой, пробирки осадок подсушивался. Пробирки с осадком РНК помещались в лед и осадки растворялись в 0,5-2 мл Н2О/DEPC и после растворения прогревались при 65оС, 5 мин. Далее к раствору, содержащему РНК, добавлялся 5 М NaCl до конечной концентрации 0,2 М, при необходимости делались отмывки смесью фенол-хлороформ-изоамиловый спирт, затем добавлялось 2,5 объема этанола при температуре – 20оС. Полученная смесь оставлялась для переосаждения на 2 часа при –20оС. После чего РНК осаждалась центрифугированием в течение 30 мин при 12000 об/мин, 4оС. Осадок промывался 80% этанолом и снова переосаждался в тех же условиях. Осадок подсушивался и растворялся в 0,5-2 мл Н2О/DEPC. Далее измерялась оптическая плотность полученной РНК и подсчитывалась ее концентрация, считая, что 1 О.Е. раствора РНК при длине волны 260 нм соответствует концентрации 40 мг/мл. 76 2. Выделение РНК с помощью тризола. Кусочки ткани замораживались в жидком азоте сразу же после выделения и хранились при температуре –80оС. При выделении РНК кусочки замороженной ткани растирались в ступке при температуре жидкого азота и затем гомогенизировались в стеклянном гомогенизаторе с 1 мл TRIzol (GIBCO BRL) или TRI reagent (Sigma). Клеточные культуры отмывались 1-2 раза в среде Хэнкса, после чего гомогенизировались в стеклянном гомогенизаторе с 1 мл TRIzol. Дальнейшую процедуру выделения РНК проводили согласно протоколам GIBCO BRL или Sigma, имеющим лишь несущественные отличия. Далее приведена процедура выделения РНК согласно протоколу Sigma. Гомогенат ткани или клеток переносили в пробирку Eppendorf, объемом 1,5 мл, и центрифугировали при 4оС, 12000 об/мин, 10 мин. Супернатант переносился в чистую пробирку и оставлялся при комнатной температуре на 5 мин для лучшей диссоциации нуклеопротеидного комплекса. Далее к супернатанту добавлялось 0,2 мл хлороформа, смесь интенсивно встряхивалась и оставлялась при комнатной температуре еще на 15 мин, после чего смесь центрифугировалась при 4оС, 12000 об/мин, 15 мин. В результате центрифугирования смесь разделялась на 3 фазы: нижняя органическая фаза содержала белок, интерфаза – ДНК и верхняя водная фаза – РНК. Верхняя фазу осторожно отбиралась пипеткой и переносилась в чистую пробирку, к которой добавлялось 0,5 мл изопропилового спирта. Смесь оставлялась при комнатной температуре на 5-10 мин, а затем центрифугировалась при 4оС, 12000 об/мин, 10 мин. Супернатант выливался, а содержащий РНК осадок растворялся в 20-50 мкл Н2О/DEPC или Т10Е1 и хранился при –20оС. 77 Проверочный электрофорез РНК. Для проверки качества выделенной РНК электрофорез проводился в буфере 1х TBE или 0,5х TBE, приготовленном на Н2О/ DEPC. Гель для электрофореза готовился на этом же буфере и содержал 1% агарозы. Для анализа отбиралось по 1-2 мкл выделенной РНК, к пробам добавлялось по 5 мкл 6х “Sample”/РНК, Н2О/DEPC до объема 30 мкл и 1 мкл бромистого этидия (5 мг/мл), приготовленного на Н2О/DEPC. Миграция РНК проводилась при 100-120 v, не более 30-40 мин. Качество выделенной РНК оценивалось по наличию полос рибосомальной РНК. Электрофорез РНК для Норзерн блот-гибридизации. Электрофорез РНК проводился в буфере, содержащем 1х MOPS; 10% формальдегида; 1 мМ ЭДТА. Гель для электрофореза РНК содержал 1% агарозу, 1х MOPS; 1% формальдегид; 1 мМ ЭДТА. Количество анализируемой РНК обычно составляло 15-20 мкг. Образцы РНК в концентрации не менее 2 мкг/мкл смешивались в соотношении 5 мкл : 15 мкл с буфером FFB, так чтобы конечные концентрации компонентов буфера в смеси составляли: 50% формамида; 10% формальдегида; 1х MOPS; 1 мМ ЭДТА; 0,05% бромфенолового синего. Смесь прогревалась в течение 10 мин при 65оС в водяной бане. Маркеры, содержащие фрагменты ДНК, денатурировались в течение 2 мин, 100оС, и смешивались с FFB в том же соотношении. Непосредственно перед нанесением на гель к пробам РНК и к маркерам добавлялось по 1 мкл бромистого этидия (5 мг/мл), приготовленного на Н2О/DEPC. Миграция РНК проводилась при 150v, в течение 5-6 часов. 78 Норзерн блот-гибридизация. После завершения миграции РНК гель промывался в дистиллированной воде, для того чтобы освободиться от остатков формальдегида. Для переноса РНК использовались нитроцеллюлозные фильтры Nytran (Amersham), которые предварительно смачивались в воде, а затем в 20х SSC. Перенос проводился в 20х SSC в течение ночи, при комнатной температуре. После завершения переноса фильтр подсушивался и запекался в течение 2 часов при 80оС. Для проведения гибридизации фильтр предварительно инкубировался в течение 1-2 часов при 65-68оС в буфере, содержащем 1% БСА; 1 мМ ЭДТА; 0,5 М NaPO4, рН 7,2; 7% SDS. Гибридизация проводилась в том же буфере, с добавлением меченого зонда в течение ночи, при 65-68оС. Условия мечения и очистки зонда были такими же, как и в случае гибридизации по Саузерну. Удельная активность меченого зонда составляла не менее 2-4x106 cpm/мкг ДНК. После гибридизации проводились отмывки фильтра по следующей схеме: 2 отмывки в растворе, содержащем 2х SSC; 0,1% SDS – по 30 мин, при комнатной температуре, и 2 отмывки в растворе, содержащем 0,2х SSC; 0,1% SDS – по 30 мин, при 42оС. Затем фильтр подсушивался, заворачивался в пленку “Saran Wrap” и экспонировался с рентгеночувствительной пленкой “Kodak” в течение 5-7 дней, при температуре –70оС. Для оценки количества нанесенной РНК фильтры в дальнейшем подвергались повторной гибридизации с зондом на глицеральдегидфосфатдегидрогеназу (GAPDH). 79 Дегибридизация фильтров. Для дегибридизации после проведения блот-гибридизации по Саузерну фильтры погружались в кипящий раствор, содержащий 1% SDS; 0,01% SSPE, после чего нагревание раствора прекращалось, и фильтры выдерживались в этом растворе в течение 30 мин. Для дегибридизации после проведения Норзерн блот-гибридизации фильтры инкубировались 15 мин при 70оС в растворе, содержащем 10 мМ трис-HCl, рН 7,9; 0,2 мМ ЭДТА; 0,01% раствора Денхардта. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RTPCR). Для исследования суммарной экспрессии короткой и длинной изоформ гена FLT4 (VEGFR3) человека использовались sense (S) праймер FG1 и antisense (АS) праймер FG3, амплифицирующие фрагмент, расположенный в области гена, кодирующей часть белкового продукта, прилежащего к клеточной мембране. Фрагмент короткой изоформы гена FLT4 (VEGFR3) (FLT4s) амплифицировался праймерами CTER1 (S) и SHORT2 (AS); фрагмент длинной изоформы гена FLT4 (VEGFR3) (FLT4l) амплифицировался праймерами CTER1 (S) (sense праймер CTER1 был общим для обеих изоформ гена) и CTER2 (AS); фрагмент гена VEGF-С амплифицировался Нуклеотидные праймерами VEGFc-F последовательности (S) и праймеров VEGFc-R и амплифицируемых фрагментов генов приведены в Таблице II.1. (AS). размеры 80 Таблица II.1. Нуклеотидные последовательности праймеров, использованных для проведения RT-PCR при исследовании экспрессии генов. Ген Название и нуклеотидная последовательность праймеров Размер фрагмента FLT4 FG1 (S): 5’-CCCACGCAGACATCAAGACG-3’ 380 bp FG3 (AS): 5’-TGCAGAACTCCACGATCACC-3’ CTER1 (S): 5'-TCCTCCAGGATGAAGACATTTGAG-3' 1. FLT4s 2. SHORT2 (AS): 5'-TGCTCCACCAGCTTCTTG-3' FLT4l 3. VEGFc 4. 420 bp CTER1 (S): 5'-TCCTCCAGGATGAAGACATTTGAG-3' CTER2 (AS): 5'-GCTCTAGAGCATTAGTAGCTGCTGTTG-3' VEGFc-F (S): 5'-CAGTTACGGTC TGTGTCCAGTGTAG-3 370 bp 300 bp VEGFc-R (AS): 5'-GGACA CACATGGAGGTTTAAAGAAG-3' Для проведения реакции RT-PCR использовался набор, содержащий Tet-Z полимеразу («Биомастер») или ферменты – обратная транскриптаза SuperScript TMII (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD) и Taq полимераза (Promega, Madison, WI). Реакцию PCR проводили в термостате PTC-100TM (MJ Research, Watertown, Ma, USA). В случае использования набора фирмы «Биомастер» синтез кДНК проводился в 20 мкл реакционной смеси, содержавшей 100 нг суммарной РНК; 100 нг antisense праймера; 1 мM MnCl2; 0.25 мM дНТФ; 67 мM ТрисHCl (pH 8.8); 16.6 мM (NH4)2SO4; 2.5% глицерина; 5 ед. TET-z полимеразы («Биомастер»), которая инкубировалась в течение 20 мин при 37oC, а затем охлаждалась во льду. Затем к полученной кДНК добавлялось 80 мкл реакционной смеси для PCR, содержавшей 67 мM Трис-HCl (pH 8.8); 16.6 мM (NH4)2SO4; 2 мM MgCl2; 100 нг sense праймера. При проведении реакции PCR 1-й цикл проводился при температурах: стадия денатурации – 94oC, 2 мин; стадия аннилинга – 60oC, 2 мин; стадия синтеза – 72oC, 3 мин. Последующие циклы были идентичными, отличаясь лишь 81 продолжительностью стадии денатурации, которая составляла 1 мин. Во время последнего цикла стадия синтеза продолжалась 7 мин. При использовании для получения кДНК обратной транскриптазы SuperScript TMII к 2 мкг суммарной РНК добавлялись random праймеры и обратная транскриптаза. Реакция PCR проводилась с использованием эквивалента 500 нг транскрибированной РНК, 50 pmol каждого из праймеров и 1 ед. Taq полимеразы в суммарном объеме 50 мкл. В качестве положительного контроля использовались плазмиды, содержащие гены FLT4 (VEGFR3) и VEGF-С (плазмида, содержащая ген VEGF-С была любезно предоставлена Dr. Lyman S., Immunex, Seattle, WA, USA). В качестве внутреннего контроля для оценки количества взятой в реакцию РНК определялась экспрессия β2-микроглобулина. Последовательности нуклеотидов, соответствующие праймерам для β2микроглобулина, амплифицирующим фрагмент гена размером 120 bp, были взяты из статьи Noonan и соавт. [102]. Реакция RT-PCR без добавления РНК использовалась в качестве отрицательного контроля. Продукты реакции RT-PCR анализировались с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением 0.5 мкг/мл бромистого этидия. Опыты на клеточных культурах. Культивирование клеток А549 и А432 велось на среде DMEM + RPMI 1640 с добавлением 5% сыворотки (Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова, Москва). Для проведения опытов на клеточных культурах используемые в эксперименте клетки высаживались в 24-луночные плашки в концентрации 1х104 клеток на лунку. Через 1 час после посева клеток к ним добавлялся растворимый белок sFLT4 в различных концентрациях. Клетки снимались с добавлением раствора Версена на 4-й день после добавления sFLT4. Клетки подсчитывались в 82 камере Горяева. Каждый опыт повторялся не менее 4-х раз. Белок sFLT4 был любезно предоставлен доктором G. Siemeister (Freiburg, Германия). Проведение иммуногистохимических реакций окрашивания гистологических срезов. Образцы ткани, использованные для иммуногистохимического анализа замораживались в жидком азоте сразу же после получения и хранились при температуре –70оС. Для проведения иммуногистохимической реакции криосрезы толщиной 5 µм, нарезались в криостате при температуре –20оС, наносились на стекла с адгезивным покрытием (PolylyzineTM microslides, Германия) и фиксировались в ацетоне этой же температуры в течение 10 мин. Для иммуногистохимической окраси срезов использовались общие для обеих изоформ гена FLT4 (VEGFR3) моноклональные антитела 9D9F9 и поликлональные антитела анти-VEGF-С (антитела были любезно предоставлены Dr. Alitalo K., Университет Хельсинки, Финляндия). Рабочие концентрации антител составляли: 1,44 мкг/мл для анти-FLT4 (VEGFR3) и 6 мкг/мл для анти-VEGF-С. Для иммуногистохимического окрашивания использовался набор Chemmate Detection Kit (BioTek, Winoski, VT; DACO, Glostrup, Дания), реакция окрашивания проводилась согласно приложенному протоколу. Вся процедура окрашивания проводилась при комнатной температуре. Стекла с криосрезами инкубировались не менее 10 мин в буфере PBS, затем с сывороткой, блокирующей неспецифическое взаимодействие с антителами и далее со специфическими антителами: 30 мин для анти-FLT4 (VEGFR3) и 2 часа для анти-VEGF-С, затем стекла отмывались 3 раза по 5 мин в PBS. Последующая пероксидазная реакция проводилась по следующей схеме. Стекла инкубировались со вторыми, биотинилированными 83 антителами (АВ2) – 25 мин, отмывались 3 раза по 5 мин в PBS, инкубировались с комплексом конъюгированного с пероксидазой стрептавидина (HRP) – 25 мин, отмывались 3 раза в PBS и затем инкубировались с 3-амино-9-этилкарбазолом (АЕС). Последний этап развития окраски как правило продолжался не более 1-2 мин и контролировался под микроскопом. Количественная оценка результатов иммуногистохимического окрашивания. Для количественной оценки положительно-окрашенных на FLT4 (VEGFR3) структур анализировались по 2-3 среза на каждый случай, при этом на каждом из срезов выбирались для подсчета 2-3 различных области, соответствующие наиболее интенсивной окраске. Стекла сканировались при увеличении х100 с помощью микроскопа Axiophot (Zeiss, Oberkochen, Германия) и камеры 3CCD Sony (Токио, Япония). Анализ окрашенных на FLT4 (VEGFR3) структур проводился с помощью системы компьютерного анализа изображений SAMBA IPS, разработанного для количественной оценки иммуногистохимически окрашенных сосудов (Unilog, Гренобль, Франция). Подсчитывались отдельные окрашенные клетки или группы клеток, отделенные от соседних окрашенных структур. Разветвленные структуры учитывались как единичные. Статистический анализ количественной оценки окрашивания на FLT4 (VEGFR3) проводился с помощью непараметрического метода Kruskal-Wallis. При полуколичественной оценке иммуногистохимической реакции на VEGF-С подсчитывались интенсивность процент окрашивания (1-3). (0-100%) окрашенных Для статистического клеток и анализа полученных результатов использовался непараметрический метод MannWhitney. 84 При полуколичественной оценке иммуногистохимической реакции на FLT4 (VEGFR3) и CD 31 на параллельных срезах анализировалось окрашивание всего среза. Срезы считались негативными (−) только в том случае, если окраски на специфический маркер не наблюдалось. Уровень окрашивания оценивался как незначительный (±) в том случае, если было окрашено не более 5% клеток и интенсивность окрашивания была низкой. В случае окрашивания 5-10% клеток и низкой интенсивности окрашивания окраска считалась слабой (+). При окрашивании 15-25% клеток или при интенсивном окрашивании более 10% клеток окраска считалась сильной (++), а при интенсивном окрашивании более 25% клеток – очень сильной (+++). Интенсивность окрашивания оценивалась двумя независимыми исследователями «слепым» методом. 85 Глава III. Результаты собственных исследований III.1. Клонирование гена FLT4 человека.∗ III.1.1. Секвенирование и анализ клонов, кодирующих трансмембранный и тирозинкиназные домены белкового продукта гена FLT4. Первый клон, содержащий кДНК гена FLT4 человека, был получен при скрининге λgt клонотеки кДНК плаценты человека (Clontech, Palo Alto, CA) зондом, содержащим фрагмент гена Flt3 мыши. Ген Flt3 представляет собой трансмембранный рецептор, принадлежащий к классу III семейства рецепторных тирозинкиназ (РТК) [123; 124]. Зонд, с помощью которого были получены первые клоны гена FLT4 человека, представлял собой фрагмент размером 1 kbp внутриклеточной области гена Flt3 мыши, содержащий высокогомологичные для членов семейства РТК последовательности, кодирующие тирозинкиназные домены белкового продукта этого гена (Рис. III.1). Один из Flt3-положительных клонов (НР3) содержал нуклеотидную последовательность размером 1,5 kbp, не совпадающую с нуклеотидной последовательностью гена Flt3, но имеющую высокую степень гомологии с генами семейства рецепторных тирозинкиназ (Рис. III.2). Рестриктаза EcoRI делит вставку клона НР3 на два фрагмента с размерами 1,16 kbp и 0,35 kbp , названные, в соответствии с уровнями их миграции в геле при электрофорезе НР3U (“upper”) и HP3L (“lower”). ∗ Эта часть работы была выполнена в в лаборатории докт. D. Birnbaum (U.119 INSERM, Марсель, Франция), совместно с F. Galland. 86 Рис. III.1. Схема, иллюстрирующая принцип клонирования новых генов семейства РТК на основе гомологии их областей, кодирующих тирозинкиназные домены. I-V – ИГ-подобные домены; ТМ – трансмембранный домен; ТК1, ТК2 – тирозинкиназные домены. 87 FLT4 SP I II III IV V VI VII ТМ SalI ТК1 ТК2 EcoRI EcoRI HP3 HP3L (0,35 kbp) HP3U (1,16 kbp) Рис. III.2. Схематическое изображение клона HP3U. SP – сигнальный пептид, I-VII – иммуноглобулинподобные домены, ТМ – трансмембранный домен, ТК1 и ТК2 – тирозинкиназные домены. Секвенирование этих фрагментов нового гена, названного FLT4, и сравнение кодируемых ими аминокислотных последовательностей с аминокислотными последовательностями, кодируемыми генами FLT1, KDR и FMS показали, что НР3U кодирует область, включающую в себя оба тирозинкиназных домена и часть следующей за ними 3′-области, тогда как клон HP3L кодирует область, соответствующую трансмембранному домену и часть прилегающего к нему внеклеточного домена. Приведем сравнительный анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых отдельными фрагментами гена FLT4 (клон НР3) и родственных ему генов FLT1, KDR и FMS. Прежде всего, представим трансмембранные домены и прилегающие к ним внутриклеточные области, кодируемые генами FLT4, FLT1, KDR и FMS (трансмембранный домен выделен жирным шрифтом). 88 FLT4 FLT1 IVILVGTGVIAVFFWVLLLLIFCNMRRPAHA--LITLTCTCVAATLFWLLLTLLIRKMKRSS-S--- KDR IIILVGTTVIAMFFWLLLVIILGTVKRANGG--∗ FMS Консенсус FLT4 FLT1 KDR FMS Консенсус ∗ ∗ ∗ ∗∗ ∗∗ 31 788 292 ∗ LFTPVVVACMSIMALLLLLLLLLLYKYKQKPKYQVRW A LL 550 DIKТGYLS---IIMDPGEVPLEEQCEYLSYDASQWEFPR EIKTDYLS---IIMDPDEVPLDEQCERLPYDASKWEFAR ELKTGYLS---IVMDPDEVPLDEHCERLPYDASKWEFPR ∗∗ ∗∗∗ ∗ ∗∗∗ ∗∗∗∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗∗∗∗ ∗∗∗ KIIESYEGNSYTFIDPTQ---------LPYN-EKWEFPR Y DP L Y WEF R 67 824 328 ∗ 579 В области трансмембранных доменов, кодируемых данными генами, обращает на себя внимание большое количество гидрофобной аминокислоты лейцина (L): 5-7 L из 22 аминокислот, что характерно для этой области рецепторов. Из сравнения кодируемых последовательностей видно, что ген FLT4 имеет более высокую степень гомологии с генами FLT1 и KDR (совпадающие аминокислоты отмечены символом ∗), а не с геном FMS (на рисунке приведен консенсус аминокислотных остатков, совпадающих для белковых продуктов, кодируемых 4-мя генами). Так, в прилегающей к мембране внутриклеточной области степень гомологии белковых продуктов, кодируемых первыми 3-мя генами равна 57%, тогда как степень гомологии этих же 3-х белков и белкового продукта, кодируемого геном FMS, составила всего 21%. В области трансмембранного домена, для которой характерна довольно низкая степень гомологии с другими генами, в том числе и близкородственными, гомология составила, соответственно, 36% и 13%. Намного более высокая степень гомологии белковых продуктов наблюдается в областях, соответствующих 1-му и 2-му тирозинкиназным доменам. В области 1-го тирозинкиназного домена степень гомологии белковых продуктов гена FLT4 и 2-х других генов этой группы семейства 89 составила 71% (совпадающие аминокислотные остатки отмечены ∗). Степень гомологии белка, кодирумого геном FMS и белковых продуктов, кодируемых 3-мя генами, близкородственными FLT4 в этой области также очень высока и составляет 50%. FLT4 ERLHLGRVLGYGAFGKVVEASAFGIHKGSSCDTVAVKMLKEGA 110 FLT1 ERLKLGKSLGRGAFGKVVQASAFGIKKSPTCRTVAVKMLKEGA 867 KDR DRLNLGKPLGRGAFGQEIEADAFGIDKTATCRTVAVKMLKEGA 371 ∗∗ ∗∗ ∗∗ ∗∗∗∗ ∗ ∗∗∗∗ ∗ ∗ ∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗ FMS NNLQFGKTLGAGAFGKVVEATAFGLGKEDAVLKVAVKMLKSTA 622 Консенсус L G LG GAFG A AFG K VAVKMLK A FLT4 FLT1 KDR TASEQRALMSELKILIHIGNHLNVVNLLGACTKPQGPLMVIVE 153 TASEYKALMTELKILTHIGNHLNVVNLLGACTKQGGPLMVIVE 910 THSEHRALMSELKILIHIGNHLNVVNLLGACTKPGGPLMVIVE 414 ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ FMS HADEKEALMSELKIMSHLGQHENIVNLLGACT–PQGPVLVITE 664 Консенсус E ALM ELKI H G H N VNLLGAST GP VI E FLT4 FLT1 KDR FMS Консенсус FCKYGNLSNFLRAKRD YCKYGNLSNYLKSKRD 169 926 FCKFGNLSTYLRSKRN 430 ∗∗ ∗∗∗∗ ∗ ∗∗ YCCYGDLLNFLRRKAE C G L L K 680 Очень высока степень гомологии белковых продуктов, кодируемых генами FLT4, FLT1, KDR также и в области 2-го тирозинкиназного домена – 69% (совпадающие аминокислотные остатки отмечены ∗); гомология этих же генов и гена FMS в этой области составила 46% (кодируемые аминокислотные последовательности приведены ниже). FLT4 LTMEDLVCYSFQVARGMEFLASRKCIHRDLAARNILLSESDVV FLT1 ITMEDLISYSFQVARGMEFLSSRKCIHRDLAARNILLSENNVV KDR LTLEHLICYSFQVAKGMEFLASRKCIHRDLAARNILLSEKNVV ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗ FMS LELRDLLHFSSQVAQGMAFLASKNCIHRDVAARNVLLTNGHVA Консенсус L S QVA GM FL S CIHRD AARN LL V 276 1036 539 792 90 FLT4 FLT1 KDR KICDFGLARDIYKDPDYVRKGSARLPLKWMAPESIFDKVYTTQ KICDFGLARDIYKNPDYVRKGDTRLPLKWMAPESIFDKIYSTK KICDFGLARDIYKDPDYVRKGDARLPLKWMAPETIFDRVYTIQ ∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗ ∗∗∗ FMS KIGDFGLARDIMNDSNYIVKGNARLPVKWMAPESIFDCVYTVQ Консенсус I DFGLARDI Y KG RLP KWMAPE IFD Y 319 1079 582 ∗ 835 FLT4 FLT1 KDR SDVWSFGVLLWEIFSLGASPYPGVQINEEFCQRVRDGTRMRAP 362 SDVWSYGVLLWEIFSLGGSPYPGVQMDEDFCSRLREGMRMRAP 1122 SDVWSFGVLLWEIFSLGASPYPGVKIDEEFCRRLKEGTRMRAP 625 ∗∗∗∗∗ ∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗∗ ∗∗∗∗∗∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗∗∗∗∗ FMS SDVWSYGILLWEIFSLGLNPYPGILVNSKFYKLVKDGYQMAQP 878 Консенсус SDVWS G LLWEIFSLG PYPG F G M P FLT4 FLT1 KDR ELATPAIRHIMLNCWSGDPKARPAFSDLVEILGDLLQGRGL EYSTPEIYQIMLDCWHRDPKERPRFAELVEKLGDLLQANVQ DYTTPEMYQTMLDCWHGEPSQRPTFSELVEHLGNLLQANAQ ∗∗ ∗∗ ∗∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗∗∗ ∗∗ ∗∗∗ FMS AFAPKNIYSIMQACWALEPTHRPTFQQICSFLQE--QAQED Консенсус M CW P RP F L Q 403 1163 666 917 В области как первого, так и второго тирозинкиназных доменов белков, кодируемых генами FLT4, FLT1 и KDR встречаются достаточно протяженные (до 17-18 амк) идентичные аминокислотные последовательности, что может быть характерно только для имеющих сходную функцию белков, кодируемых близкородственными генами. Намного большую вариабельность кодируемых аминокислотных последовательностей имеет область, разделяющая 1-й и тирозинкиназные домены, или так называемая интеркиназная вставка: FLT4 FLT1 KDR FMS AF---SPCAEKSPEQRGRFRAMVELARLDRRRPGSSDRVL-215 ∇ ∇ ∇∇∇∇ ∇∇∇ ∇ LFFLNKDAALHMEPKKEKMEPGLEQGKKPRLDSVTSSESF-975 EF-VPYKTKGARFRQGKDYVGAIPVDLKRRLDSITSSQSS-478 ∗ ∗ ∗ AMLGPSLSPGQDPEGGVDYKNIHLEKKYVRRDSGFSSQGVDT 731 Консенсус R S 2-й 91 FLT4 FLT1 KDR FMS Консенсус FARFSKTEGGARRASPDQEAEDLWLSP ∇∇∇∇∇ ∇ ∇∇∇∇∇∇∇∇∇∇ ∇ ∇∇ ASSGFQEDKSLSDVEEEEDSDDFYKEP ASSGFVEEKSLSDVEEEEAPEDLYKDF ∗ YVEMRPVSTSSNDSFSEQDLDKEDGRP 233 993 496 749 Как видно из приведенных аминокислотных последовательностей, в области интеркиназных вставок аминокислотные последовательности, кодируемые сравниваемыми генами, сильно различаются: лишь 2 аминокислоты оказались совпадающими у белков, кодируемых всеми 4-мя генами. В группе из 3-х близкородственных генов у белка, кодируемого геном FLT4, и у белков, кодируемых генами FLT1 и KDR, количество совпадающих аминокислот также невелико – всего 4 (отмечены ∗), однако 2 последних белка и в этой области имеют достаточно большую степень гомологии – 42% (совпадающие аминокислотные остатки отмечены ∇), и следовательно, являются более близкими друг к другу по своей структуре. Клон кодирующие содержал HP3 прилегающую также к небольшие клеточной последовательности, мембране внеклеточную рецепторную область и часть С-концевого внутриклеточного участка белкового продукта. Однако, поскольку при последующей работе были найдены клоны, содержащие более протяженные фрагменты этих областей, анализ этих последовательностей будет приведен ниже. Таким образом, секвенирование и анализ клона НР3 позволили сделать вывод о том, что содержащиеся в нем нуклеотидные последовательности принадлежат новому гену, FLT4, относящемуся к семейству рецепторных тирозинкиназ и имеющему наиболее близкое сродство к генам FLT1 и KDR, кодирующим рецепторы с 7-ю иммуноглобулинподобными доменами во внеклеточной области. 92 III.1.2. Секвенирование и анализ клонов, кодирующих внеклеточную область белкового продукта гена FLT4. Клоны, содержащие участки гена FLT4, кодирующие внеклеточную и 3’-области его белкового продукта (клоны SHP), были получены в результате скрининга клонотеки кДНК плаценты человека (Stratagene) с использованием в качестве зонда вставки, содержащейся в полученном ранее клоне НР3. Схематические изображения и рестриктные карты двух основных проанализированных клонов SHP17 и SHP26 и полученных из них субклонов приведены на Рис. III.3 - III.4. Всего в этой части работы было проанализировано и полностью или частично секвенировано более 50 клонов. Практически все проанализированные основные клоны содержали 1,3 kbp EcoRI-фрагмент, кодирующий тирозинкиназную область рецептора и большую часть гена, кодирующую находящиеся во внеклеточной области рецептора ИГ-подобные домены. Ранее, при анализе степени гомологии тирозинкиназной области белкового продукта, кодируемого геном FLT4, и белков, кодируемых генами FLT1, KDR/Flk1 и FMS было обнаружено, что этот ген наиболее близок по своей структуре генам FLT1 и KDR/Flk1. И следовательно, можно было предположить, что так же как и в случае белковых продуктов, кодируемых генами FLT1 и KDR/Flk1, кодируемая FLT4 внеклеточная область содержит 7 ИГ-подобных доменов. Это предположение подтвердилось при сравнении кодируемых геном FLT4 аминокислотных последовательностей ИГ-подобных доменов, прилегающих к мембране клетки c аналогичными последовательностями, кодируемыми генами FLT1 и FMS: оказалось, что в этой области предполагаемого белка FLT4 93 94 95 присутствуют VI и VII ИГ-подобные домены, отсутствующие у белка, кодируемого геном FMS (Приложение 3: 3.2.). Сравнение аминокислотных последовательностей ИГ-подобных доменов, кодируемых генами FLT4 и KDR/Flk1, приведено в п.3.3. Приложения 3. И таким образом, ген FLT4 действительно относится к подклассу генов FLT1 и KDR/Flk1, кодирующих трансмембранные тирозинкиназные рецепторы с 7-ю ИГ-подобными доменами во внеклеточной рецепторной области. Для иллюстрации степени гомологии 3-х генов семейства в области ИГ-подобных доменов приведем кодируемые ими аминокислотные последовательности VI и VII ИГ-подобных доменов. ИГ-домен VI FLT4 VLLSCQADSYKYEHLRWYRLNLSTLHDAHGNPLLLDCKNVHLFA ∇ ∇∇ ∇∇ KDR VSLLCTADRNTFENLTWYKLGSQATSVHMGESLTPVCKNLDALW FLT1 LKLSCTVNKFLYRDVTW--------------ILL---RTVNNRT ∗ ∗∗∗∗∗∗ ∗∗ ∗∗∗∗ ∗ ∗∗ ∗∗ ∗∗∗∗ Консенсус L C W L 607 599 FLT4 659 KDR FLT1 TPLAASLEEVAPGARHA-TLSLSIPRVAPEHEGHYVCEVQDRR 617 ∇ ∇∇∇ ∇ ∇ ∇ ∇ KLNGTMFSNSTNDILIVAFQNAS-----LQDQGDYVCSAQDKK 645 MHYSISKQKMAITKEHSITLNLTIMNVSLQDSGTYACRARNVY 642 ∗ ∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗∗ ∗ ∗∗∗ ∗∗∗ Консенсус FLT4 G Y C SHDKHCHKKYLSVQALEAPRLTQNLTDLLVNVSDS ∇ ∇ ∇ ∇∇ ∇∇ ∇ ∇ KDR TKKRHCLVKQLIILERMAPMITGNLENQTTTIGET FLT1 TGEEILQKKEITIRDQEAPYLLRNLSDHTVAISSS ∗ ∗∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗∗∗ ∗∗ ∗∗ ∗ ∗∗ ∗∗ ∗ Консенсус K AP NL 694 680 677 ИГ-домен VII FLT4 LEMQCLVAGAHAPSIVWYKDERLLEEKSGVDLADSNQKLSIQR 737 ∇ ∇ ∇ ∇ ∇ ∇∇∇∇∇ ∇ ∇∇ ∇ ∇ ∇ ∇ ∇ KDR IEVTCPASGNPTPHITWFKDNETLVEDSGIVLRDGNRNLTIRR 723 FLT1 TTLDCHANGVPEPQITWFKNNHKIQQEPGIILGPGSSTLFIER 720 ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗∗ ∗ ∗∗∗ ∗ ∗ ∗ Консенсус C G P P I W K G L L I R 96 FLT4 KDR FLT1 VREEDAGPYLCSVCRPKGCVNSSASVAVEGSEDKGSME 775 ∇ ∇∇ ∇ ∇ ∇ ∇ ∇ ∇ ∇ ∇ ∇∇∇ VRKEDGGLYTCQACNVLGCARAETLFIIEGAQEKTNLE 761 VTEEDEGVYHCKATNQKGSVESSAYLTVQGTSDKSNLE 758 ∗∗∗∗∗ ∗ ∗ ∗ ∗∗∗ ∗∗∗∗ ∗∗∗ ∗∗∗ ∗∗ ∗∗∗ Консенсус V ED G Y C G G K E Из приведенного сравнения аминокислотных последовательностей видно, что из 202 кодируемых FLT4 аминокислотных остатков всего 33 являются идентичными для белковых продуктов всех трех генов. Oднако количество аминокислотных остатков, совпадающих хотя бы в двух белковых продуктах, намного выше – 91 (отмечены ∗), что свидетельствует о достаточно высокой степени гомологии белков, кодируемых генами FLT1, Flk1/KDR и FLT4. Секвенирование 5’-области проводилось на основе анализа клонов SHP17 и SHP26 (Рис. III.3 и III.4). Однако ни один из этих клонов не содержал инициирующего кодона гена FLT4. Поэтому был проведен дополнительный скрининг кДНК клонотеки Stratagene с помощью клона SHP26RK, содержащего наиболее удаленную 5’-область гена (Рис. III.4). В результате проведенного скрининга был получен клон SHP32 (Рис.III.5), при анализе которого был обнаружен ATG-кодон, инициирующий трансляцию гена FLT4. Сложность идентификации инициирующего кодона состояла в том, что в области, соответствующей началу трансляции, было найдено 2 близко расположенных ATG (кодирующие, соответственно М-1 и М-27, Приложение 3: 3.1. и 3.2) и необходимо было определить, какой из этих двух кодонов является истиннно инициирующим. Начало инициации трансляции в случае клонирования гена, принадлежащего уже известному семейству, может быть определено, на основании гомологии кодируемых аминокислотных последовательностей в соответствующей области. Однако, такой анализ затрудняется тем, что степень гомологии в области ИГдоменов не слишком высока. Кроме того, известно, что в области инициации трансляции аминокислотная последовательность должна 97 98 соответствовать консенсусу, определяемому правилом Kozak [80]. Используя эти подходы был сделан вывод о том, что инициирующим является 1-й из двух ATG-кодонов. III.1.3. Секвенирование и анализ клонов, содержащих 3’-область гена FLT4. Большинство проанализированных основных клонов содержало транслируемую 3’-область FLT4, включая стоп-кодон, а также больший или меньший фрагмент следующей за стоп-кодоном не транслируемой области. Фрагмент наибольшей длины в области 3’-конца содержался в клоне SHP22 (Рис. III.6), однако были секвенированы и проанализированы также и некоторые другие клоны (SHP26, SHP4). Сиквенс 3’-области гена FLT4 показал, что на расстоянии 120 bp от EcoRI-сайта находится стоп-кодон TAG, за которым следует фрагмент размером около 500 bp нетранслируемой области гена, завершающийся поли-А (Приложение 3. 3.1.) Вместе с тем, при анализе 3’-области гена FLT4 был найден клон, который также содержал небольшой фрагмент FLT4 между EcoRI-сайтом и стоп-кодоном, однако вместо заканчивающейся стоп-кодоном последовательности нуклеотидов C AGG TAG в этом клоне была обнаружена последовательность C AGC TG, соответствующая PvuII-сайту. Размер клона составил 1,5 kbp и он состоял из 3-х EcoRI-фрагментов (Рис. III.7). Сиквенс этого клона был ограничен лишь транслируемой частью. Ниже приведены аминокислотные поледовательности, кодируемые 3’-областью короткой (FLT4s) и длинной (FLT4l) изоформами гена FLT4 (VEGFR3): 99 100 101 Эти данные позволили сделать вывод о том, что существуют 2 различающиеся по своей длине в области 3’-конца изоформы гена FLT4, при этом короткая изоформа представляет собой усеченную часть длинной изоформы. Таким образом, при скрининге λgt клонотеки кДНК плаценты человека (Clontech, Palo Alto, CA) и кДНК клонотеки плаценты человека (Stratagene) нами были получены клоны, содержащие нуклеотидные последовательности нового последовательности гена гена и – FLT4. Анализ аминокислотной нуклеотидной последовательности кодируемого им белкового продукта показал, что FLT4 относится к суперсемейству генов, кодирующих рецепторные тирозинкиназы и образует в этом суперсемействе отдельное подсемейство вместе с генами FLT1 и KDR/Flk1. Обнаружены 2 изоформы FLT4, различающиеся по своим 3’концам. Внеклеточная область белкового продукта 102 103 кодируемого геном FLT4 состоит из сигнального пептида и 7 ИГ-подобных доменов. III.2. Частичное клонирование гена Flt4 мыши. Клоны, содержащие последовательности гена Flt4 мыши были получены в результате скрининга геномной клонотеки эмбриональных стволовых клеток мыши (ES) c помощью зондов HP3U и HP3L (71 ML). Клон HP3U представляет собой EcoRI-фрагмент размером 1,16 кb, соответствующий области гена FLT4 (VEFGR3) человека, кодирующей тирозинкиназный домен. Клон 71 ML представляет собой EcoRI-SalI- фрагмент размером 0,35 кb этого же гена, включающий область, кодирующую трансмембранный домен (Рис.III.2). Были исследованы несколько FLT4 (VEFGR3)-положительных клонов. При этом оказалось, что некоторые из них (рАК2 и рАК6) содержат фрагменты генов, кодирующие тирозинкиназную область PDGFR-B и PDGFR-A мыши (Рис. III.8). Выявление клонов, содержащих близкородственные гены объясняется высокой степенью гомологии участков, кодирующих тирозинкиназные домены белков этого семейства. Ниже приведены аминокислотные последовательности части 2-го тирозинкиназного домена, кодируемые группой генов, в числе которых находятся гены, кодирующие рецепторы PDGF. FLT3 рАК6 (PDGFR-A) ### # # … CVHRDLAARNVLVTHGKVVKICDFGLARDIMSDSN … … CVHRDLAARNVLLAQGKIVKICDFGLARDIMHDSN … рАК2 (PDGFR-B) … CVHRDLAARNVLICEGKLVKICDFGLARDIMRDSN … FMS … CIHRDVAARNVLLTNGHVAKIGDFGLARDIMNDSN … KIT … CIHRDLAARNVLLTHGRITKICDFGLARDIKNDSN … ∗ ∗ ∗∗∗ ∗∗∗ ∗ ∗ ∗ 104 Из сравнения приведенных последовательностей можно видеть, что в целом для данного фрагмента характерна высокая степень гомологии между белками, кодируемыми этими генами. Особенно высока гомология белков FLT3, PDGFR-А и PDGFR-B, различающихся в этой области лишь 5-ю аминокислотами (отмечены #). Однако здесь можно выделить 2 области с последовательностями, специфичными для каждого из кодирующих генов (подчеркнутые последовательности, состоящие из 3-х и 2-х аминокислот), благодаря которым можно идентифицировать ген, кодирующий данный фрагмент. Таким образом было установлено, что клоны рАК2 и рАК6 содержат, соответственно, фрагменты генов PDGFR-B и PDGFR-А. Первый клон, содержащий фрагмент гена Flt4 мыши, был получен из cos ES2 (Рис. III.9). PvuII/EcoRI-вставка плазмид рКА3 и рКА4 содержала фрагмент размером 120 bp, кодирующий, в частности, характерную для второго тирозинкиназного домена этого семейства генов аминокислотную последовательность аминокислоты YK, …GLARDI… специфичные , вслед для за группы которой генов, находились кодирующих рецепторные тирозинкиназы, содержащие 7 ИГ-подобных доменов во внеклеточной части. Сиквенс клона приведен в Приложении 2.1. Консенсус фрагментов белковых продуктов, кодируемых генами Mu-Flt4, Hu-FLT4 (VEFGR3), FLT1, KDR и близкородственным геном FMS приведен ниже: ∇ Mu-Flt4 Hu-FLT4 FLT1 KDR FMS …CIHRDLAARNILLSESDIVKICDFGLARDIYKDPDYVRKG… …CIHRDLAARNILLSESDVVKICDFGLARDIYKDPDYVRKG… …CIHRDLAARNILLSENNVVKICDFGLARDIYKNPDYVRKG … …CIHRDLAARNILLSEKNVVKICDFGLARDIYKDPDYVRKG … ## # …CIHRDVAARNVLLTNGHVAKIGDFGLARDIMNDSNYIVKG … ***** ** ** ** ** ** ****** * ** 105 106 Из сравнения аминокислотных последовательностей, кодируемых клонированным фрагментом гена Flt4 мыши с соответствующим участком, кодируемым геном FLT4 (VEFGR3) человека видно, что они практически полностью совпадают, единственной заменой является V → I (на рисунке отмечено ∇). Сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых 3-мя генами этой группы также выявляет очень высокую степень их гомологии – из 40 аминокислот совпадающими у всех 3-х белковых продуктов являются 37 (3 несовпадающие аминокислоты отмечены #). Такая высокая степень гомологии является характерной для участков, кодирующих тирозинкиназные домены. Следует отметить, что если последовательности соответствующих нуклеотидных оснований сравнивать фрагментов ДНК, то различий между генами выявится больше, однако, часть из этих различий исчезает на уровне кодируемых ими аминокислот благодаря вырожденности генетического кода. Достаточно высокая степень гомологии кодируемых аминокислотных последовательностей в области тирозинкиназных доменов наблюдается и для генов, не находящихся в одной и той же группе. Так, если сравнить аминокислотные последовательности в области, кодируемой клонированным участком гена Flt4 мыши, генами FLT4 (VEFGR3), FLK1 и KDR, (белковые продукты которых содержат 7 ИГ-подобных доменов во внеклеточной области), и геном FMS, (белковый продукт которого содержит 5 аналогичных доменов), то можно видеть, что 24 из 40 аминокислотных последовательностей, находящихся в этой области, являются идентичными (отмечены ∗). Учитывая столь высокую степень гомологии родственных генов семейства в области, кодирующей тирозинкиназный домен, использовать данный клон в качестве зонда для гибридизации представлялось нежелательным и необходимо было клонировать фрагменты гена Flt4, 107 содержащие специфические для этого гена последовательности. Два таких фрагмента (клоны MuPP и MuPF), расположенные в области, кодирующей ИГ-подобные домены гена Flt4, были получены из клона ES.4-1 (в Приложении 1. представлены данные по рестриктному анализу клона ES 41). Клон MuPP содержал фрагмент гена Flt4, ограниченный сайтами рестриктаз PstI и PvuII. Этот фрагмент кодирует 102 амк, представляющие собой большую часть 5-го ИГ-подобного домена (сиквенс клона представлен в Приложении 2.2). Из сравнения аминокислотной последовательности, кодируемой содержащимся в клоне MuPP фрагментом гена Flt4 мыши, с аминокислотной последовательностью, кодируемой комплементарным участком гена FLT4 (VEFGR3) человека, видно, что степень гомологии генов FLT4 (VEFGR3) человека и мыши в области, кодирующей ИГ-подобные домены, лишь ненамного ниже, чем в области, кодируюшей тирозинкиназные домены: всего 11 несовпадающих аминокислот (отмечены ∇) из 102, содержащихся в этом фрагменте: Клон MuPP ∇ ∇ ∇ IG-4 ∇ Flt4 AAGLRQNISLELVVNVPPHIHEKEASSPSIYSRHSRQTLTCTAYGVPQPLS FLT4 AAGLRRNISLELVVNVPPQIHEKEASSPSIYSRHSRQALTCTAYGVPLPLS ∇ ∇ ∇ ∇ ∇∇ Flt4 VQWHWRPWTPCKTFAQRSLRRRQQRDGMPQCRDWKEVTTQDAVNPIESLDS FLT4 IQWHWRPWTPCKMFAQRSLRRRQQQDLMPQCRDWRAVTTQDAVNPIESLDT ∇ Клон MuPF (PstI-Fragment) (Приложение 1.2.) содержал фрагмент гена Flt4, ограниченный двумя сайтами рестриктазы PstI. Этот фрагмент кодирует 202 амк, представляющие собой область, начинающуюся во 2-м ИГ-подобном домене и включающую в себя полностью 3-й и 4-й ИГподобные домены (сиквенс клона приведен в Приложении 2.3). Сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых фрагментом гена Flt4, 108 содержащимся в клоне MuPF, и комплементарной последовательности, кодируемой геном FLT4 (VEFGR3) человека, представлено ниже: Клон MuPF ∇ ∇ ∇ ∇ ∇ IG-III Flt4 LQCETTWGDQNFLSNLFVVHITGNELYDIQLYPKKSMELLVGEKLVLNCTV FLT4 LQCETTWGDQDFLSNPFLVHITGNELYDIQLLPRKSLELLVGEKLVLNCTV ∇ ∇ ∇ Flt4 WAEFDSGVTFDWDYPGKQAERAKWVPERRSQQTHTELSSILTIHNVSQNDL FLT4 WAEFNSGVTFDWDYPGKQAERGKWVPERRSQQTHTELSSILTIHNVSQHDL ∇ ∇ ∇ ∇ IG-IV Flt4 GPYVCEANNGIQRFRESTEVIVHEKPFISVEWLKGPVLEATAGDELVKLPV FLT4 GSYVCKANNGIQRFRESTEVIVHENPFISVEWLKGPILEATAGDELVKLPV ∇ ∇∇ ∇ ∇ ∇ Flt4 KLAAYPPPEFQWYKDRKAVTGRHNPHALVLKEVTEASAGVYTLALWNSAA FLT4 KLAAYPPPEFQWYKDGKALSGRHSPHALVLKEVTEASTGTYTLALWNSAA PstI-сайт на 3′-конце клона MuPF совпадает с PstI-сайтом на 5′-конце клона MuPP, и таким образом вставки, содержащиеся в этих двух клонах, соответствуют непрерывному фрагменту гена Flt4, начинающемуся в области, кодирующей 2-й ИГ-подобный домен, и заканчивающемуся в области, кодирующей 5-й ИГ-подобный домен. Таким образом, скрининг геномной клонотеки ES мыши дал возможность получить и секвенировать несколько клонов, содержащих часть 5′-области гена Flt4, кодирующей несколько ИГ-подобных доменов, и клон, кодирующий часть 2-го тирозинкиназного домена этого гена. Клон, содержащий 3′-область гена Flt4 был получен в результате скрининга кДНК клонотеки яичек мыши (Stratagene, клоны SMT). В качестве зонда был использован клон SHP18, содержащий полноразмерный ген, кодирующий короткую форму FLT4 (VEFGR3) человека. В результате скрининга был получен клон SMT12 размером 1,6 кbp (Рис. III.10). 109 110 Клон содержит 3′-область гена Flt4 мыши, которая начинается в области, кодирующей первый тирозинкиназный домен, включает в себя стоп-кодон и часть нетранслируемой области этого гена (Рис. III.10). Найденный клон был секвенирован лишь частично. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности секвенированных областей этого клона приведены в Приложении 2.4. Сравнение аминокислотной последовательности, кодируемой фрагментом гена Flt4, содержащимся в клоне SMT12, с аминокислотными последовательностями, кодируемыми короткой и длинной формами гена FLT4 (VEFGR3) человека, показало, что 3′-области этого гена соответствует длинная форма FLT4 (VEFGR3) (знаком ⊥ - отмечен стоп-кодон): FLT4s FLT4l Flt4 Консенсус QIESRHRQESGFRQIESRHRQESGFSCKGPGQNVAVTRAHPDSQGRRRRPERGARGGQ. ЕLESRHRPEGSFSCKGPGQHMDIPRGHPDPQGRRRRPTQGAQGGQG --ESRHR-E--FSCKGPGQ-----R-HPD-QGRRRRP--GA–GGQ– ⊥ FLT4l VFYNSEYGELSEPSEEDHCSPSARVTFFTDNSY-AASDKTPALGGSA Flt4 Консенсус VFYNNEYGRSPSHVQKVDCCPSAGSTFFADSSY-GTCGKASCPLLQP VFYN–EYG----------C-PSA--TFF-D-SY-----K-------- FLT4l GQGGQRLEAQAGNSSG-TLVAQECPL.PSLQTSQLGRAGLQGPRL Flt4 Консенсус ALTAG.LEAQVGNSTPLTPALEVFYVPPPLQPPYPGRVKLRQRGL ------LEAQ-GNS---T---------P-LQ----GR--L----L Как EcoRI-XhoI фрагмент клона SMT12, соответствующий полной вставке, содержащейся в этом клоне, так и более короткий SacI-XhoI фрагмент – SMT12s, не содержащий области с высокой степенью гомологии для этого семейства генов, кодирующие тирозинкиназные домены, использовались в качестве зондов для гибридизации (Рис. III.10). Дальнейшее клонирование гена Flt4 мыши не проводилось, поскольку основной целью данной части работы являлось нахождение генных зондов для исследования экспрессии этого гена в тканях мыши. 111 112 Полученные нами клоны, содержат как часть области, кодирующей ИГ-подобные домены, так и 3′-область гена, кодирующую тирозинкиназные домены и нетранслируемую часть гена и таким образом предоставляют возможность выбора генного зонда в широкой области Flt4 (Рис. III.11). III.3. Определение хромосомной локализации генов Flt4 мыши и FLT4 (VEFGR3) человека. Определение хромосомной локализации генов Flt4 мыши и FLT4 (VEFGR3) человека проводилось с помощью гибридизации in situ на препаратах хромосом. Для исследования хромосомной локализации гена FLT4 (VEFGR3) человека были использованы препараты хромосом, полученные из фитогемагглютинин-стимулированных лимфоцитов нормальной периферическрй крови. В качестве зонда для гибридизации использовалась плазмида клона pHP3L, содержащая вставку 0,35 kbp гена FLT4 (VEFGR3) человека. Было проанализировано 150 метафазных пластинок, в которых 412 гранул серебра были ассоциированы с хромосомами, из них 51 гранула (12,3%) была локализована на хромосоме 5 (Рис. III.12а). Распределение гранул по длине хромосомы 5 было неравномерным: 62,7% гранул было локализовано в области q34-q35 этой хромосомы, при этом максимальное количество гранул располагалось в области q35 (Рис. III.13а). 113 Полученные результаты позволили сделать предположение о том, что ген FLT4 (VEFGR3) локализован в дистальной области длинного плеча хромосомы 5 (5q35). При исследовании хромосомной локализации гена Flt4 мыши использовали хромосомы мышей линии WMP, у которых все аутосомы за исключением 19 представляют собой транслокации Робертсона. В этих экспериментах в качестве зонда использовалась плазмида, содержащаяся в клоне рКА-3. Было исследовано 100 метафазных пластинок, в которых 267 гранул серебра были ассоциированы с хромосомами, при этом 51 из ассоциированных гранул (19,1%) была локализована на хромосоме 11 (Рис. III.12б). Распределение гранул по длине 11 хромосомы было неравномерным: 68,8% гранул были локализованы в области А5-В6 (Рис. III.13б). На основании этих результатов был сделан вывод о том, что ген Flt4 мыши локализован в области А5-В6 хромосомы 11. 114 III.4. Исследование экспрессии гена FLT4 (VEFGR3) в линиях клеток человека и грызунов, в плаценте человека и в нормальных тканях мыши методом Норзерн блот-гибридизации. III.4.1. Исследование экспрессии гена FLT4 (VEFGR3) в линиях опухолевых клеток и плаценте человека. При исследовании экспрессии гена FLT4 (VEFGR3) в линиях опухолевых клеток и плаценте человека в качестве зонда для Норзерн блотгибридизации использовался EcoRI-фрагмент клона SHP17, содержащий внеклеточную и трансмембранную области гена (Рис. III.3), а также зонды FLT4-EC и FLT4-TM (Рис. III.13), а также зонды FLT4-RC и FLT4-TM (Рис. III.14). 115 116 ААААА 3’s PvuII XhoI PstI SalI EcoRI KpnI SmaI EcoRI ATG TAG SP I II III IV V VI VII TM TK1 TK2 TAA AAAAA 3’l FLT4-EC FLT4-TM Рис. III.14. Зонды FLT4-EC и FLT4-TM, использованные для гибридизации с РНК клеток человека. В РНК плаценты человека были выявлены 2 транскрипта гена FLT4 (VEFGR3) с размерами 5,8 кb и 4,7 кb (Рис. III.14). Рис. III.14. Экспрессия FLT4 (VEGFR3) в плаценте человека. Оба транскрипта давали довольно сильный сигнал примерно равной интенсивности. 117 Те же 2 транскрипта были обнаружены в РНК линии гемопоэтических клеток HEL. В остальных исследованных линиях сигнал FLT4 (VEFGR3) был очень слабым или отсутствовал вообще (Табл. III.1). Таким образом, исследование экспрессии гена FLT4 (VEFGR3) в линиях опухолевых клеток и плаценте человека выявило 2 транскрипта различной длины в РНК плаценты и линии клеток HEL, соответствующих 2-м изоформам гена FLT4 (VEFGR3) человека. Таблица III.1. Экспрессия гена FLT4 (VEFGR3) в опухолевых линиях клеток человека. Линии клеток Происхождение линии клеток HEL Эритролейкоз + HL 60 Промиелоцитарный лейкоз - K 562 Хронический миелоидный лейкоз - KG1 Острый миелоидный лейкоз - MOLT 4 Острый лимфобластный лейкоз Экспрессия FLT4 (VEFGR3) - Hep G2 Гепатома - mS Меланома - A 549 Карцинома легкого - IMR 90 Фибробласты легкого - 118 III.4.2. Исследование экспрессии гена Flt4 в нормальных тканях мыши и в трансформированных линиях клеток грызунов. При исследовании экспрессии гена Flt4 в тканях мыши в качестве зондов для гибридизации использовались фрагменты, содержащиеся в клонах SMT12 и SMT12s, включающие тирозинкиназную и 3’-области этого гена (Рис. III.10). В большинстве образцов РНК тканей мыши (легкие, лимфоузлы, мозг, мозжечок, надпочечники, печень, почки, простата, сердце, тимус, яичники) был обнаружен единственный транскрипт размером 5,8 кb (Рис. III.15. а, б). В РНК семенников мыши транскрипт 5,8 кb был выражен очень слабо, но присутствовали 2 других транскрипта с размерами 3,8 и 3,0 кb. Не было обнаружено экспрессии Flt4 в РНК, выделенной из тканей мочевого пузыря и скелетных мышц. Очень низкой была экспрессия Flt4 в РНК плаценты мыши, в отличие от довольно высокого уровня экспрессии FLT4 (VEFGR3) в РНК плаценты человека. Еще одним отличием от ткани человека является отсутствие более короткого транскрипта размером 4,5 кb, выявленного в тканях человека. Таким образом, в тканях мыши был обнаружен единственный транскрипт гена Flt4, что подтверждает существование у мышей только одной изоформы этого гена. Экспрессия гена Flt4 также была исследована с помощью Норзерн блот-гибридизации в ряде линий трансформированных клеток грызунов (Табл. III.2). 119 120 Таблица III.2. Экспрессия гена Flt4 в трансформированных линиях клеток грызунов. Линия клеток Вид животного 1. Hep 27 Крыса Гепатома - 2. MCA RH 7777 Крыса Гепатома - 3. Hep 22 Мышь Гепатома - 4. Raq Мышь 5. 6. GT 11B HET-SR2SC-LNM 7. DEF-4/21 Сирийский хомяк Сирийский хомяк Происхождение линии клеток Карцинома почки Гепатома Фибробласты, трансформированные SV-40 Джунгарский Фибробласты, хомячок трансформированные RSV Экспрессия Flt4 - - + Как видно из таблицы, из всех линий клеток, исследованных в этой серии, единственной линией клеток, где была найдена экспрессия Flt4, оказались клетки DEF-4/21. Ни в одной из других линий экспрессия Flt4 выявлена не была. Экспрессия Flt4 также была исследована в некоторых клонах с приобретенной множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), полученных из линий клеток человека mS и HepG2, а также линии клеток гепатомы Сирийского хомяка GT 11B. Известно, что в клетках с МЛУ изменены некоторые пути сигнальной трансдукции, поэтому можно было предположить и возможное измененение активности гена Flt4. Однако в клонах с МЛУ экспрессия Flt4 также не была найдена. Таким образом, в данном разделе нашей работы экспрессия гена FLT4 (VEFGR3) была исследована методом Норзерн блот-гибридизации в 9 линиях опухолевых клеток человека и в 7 видах трансформированных 121 клеток различных видов грызунов, происходящих как из спонтанных опухолей грызунов, так и в результате трансформации фибробластов вирусами. При этом экспрессия FLT4 (VEFGR3) была найдена лишь в 2-х исследованных линиях – линии клеток эритролейкоза HEL и линии фибробластов Сирийского хомяка, трансформированных вирусом SV-40. Эти данные указывали либо на то, что экспрессия этого гена – довольно редкое событие для трансформированных паренхимальных клеток, либо на очень низкий уровень экспрессии этого гена в линиях клеток. Поэтому в дальнейшей работе при исследовании экспрессии гена FLT4 (VEFGR3) мы использовали метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). III.5. Исследование экспрессии генов рецептора FLT4 (VEFGR3) и его лиганда VEGF-C в линиях опухолевых клеток человека методом RT-PCR. Поскольку при изучении экспрессии FLT4 (VEFGR3) в культурах клеток методом Норзерн блот-гибридизации мРНК этого гена была выявлена лишь в 2 из 16 исследованных культур, при дальнейшей работе был использован более чувствительный метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). С помощью этого метода была исследована экспрессия FLT4 (VEFGR3) в серии культур клеток, происходящих из солидных опухолей человека, и в культурах гемобластозов. Ко времени начала этого исследования из литературных данных стало известно, что белковый продукт FLT4 (VEFGR3) представляет собой рецептор, взаимодействующий с одним из факторов роста эндотелия сосудов VEGF – VEGF-C. Поэтому в этой серии опытов была исследована экспрессия мРНК не только FLT4 (VEFGR3), то и его лиганда – VEGF-C. Результаты исследования приведены в Таблицах III.3 и III.4. 122 Таблица III.3. Экспрессия генов FLT4 (VEFGR3) и VEGF-C в культурах гемобластозов. Линия клеток Происхождение клеток JURKAT Т-клеточный лейкоз HL 60 K 562 MOLT 4 H9 HUT 78 Rajii Промиелоцитарны й лейкоз Хронический миелоидный лейкоз Острый лимфобластный лейкоз Острый лимфобластный лейкоз Т-клеточная лимфома Лимфомма Беркитта Экспрессия FLT4 (VEFGR3) Экспрессия VEGF-C - - - - + - + - ± +++ - + + - Таблица III.4. Экспрессия генов FLT4 (VEFGR3) и VEGF-C в культурах клеток, происходящих из солидных опухолей человека. Линия клеток LIM 1215 mS MCF 7 А 431 А 549 Происхождение клеток Карцинома толстой кишки Меланома Симпсона Карцинома молочной железы Плоскоклеточная карцинома кожи Карцинома легкого Экспрессия FLT4 (VEFGR3) Экспрессия VEGF-C - - - ++ - +++ - ++++ + ++++ 123 Как видно из данных, приведенных в таблицах, при исследовании экспрессии FLT4 (VEFGR3) более чувствительным методом RT-PCR FLT4 (VEFGR3)-положительными оказались 1 из 5 линий клеток, происходящих из солидных опухолей человека, и 4 из 7 линий гемобластозов. При этом можно отметить, что некоторые линии клеток – А 549, К 562 и MOLT 4, в которых не было найдено экспрессии FLT4 (VEFGR3) с помощью метода Норзерн блот-гибридизации, оказались FLT4 (VEFGR3)-положительными при исследовании их методом RT-PCR, что свидетельствует об очень низком уровне экспрессии в них этого гена. Частота экспрессии FLT4 (VEFGR3) в двух исследованных группах культуральных клеток оказалась различной, и если экспрессия FLT4 (VEFGR3) в клетках, происходящих из солидных опухолей, по-видимому, является довольно редким событием, то в клетках, происходящих из лейкозов частота его экспрессии довольно высока. Необходимо отметить, что уровень экспрессии во всех случаях был не слишком высоким. В отличие от FLT4 (VEFGR3), мРНК VEGF-C в клетках, происходящих из солидных опухолей человека, была обнаружена в 4/5 исследованных линий, причем интенсивность экспрессии во всех VEGF-Cположительных линиях клеток была высокой. В клетках гемобластозов VEGF-C экспрессировался значительно реже, всего в 2-х линиях из 8, хотя уровень активности этого гена в тех клетках, где он экспрессировался, также был достаточно высоким. Из данных, приведенных в таблицах, также можно видеть, что коэкспрессия FLT4 (VEFGR3) и его лиганда VEGF-C в большинстве линий клеток отсутствовала: только в 2-х из 12 исследованных линий были экспрессированы оба гена – в линии Н9, где при высокой активности VEGFC наблюдался довольно слабый сигнал мРНК FLT4 (VEFGR3), и в клетках линии А549, где уровень экспрессии обоих генов был немного выше, чем в клетках Н9. 124 Линия клеток А549 была выбрана для дальнейшего исследования роли VEGF-C/FLT4 (VEFGR3)-зависимой сигнальной системы в регуляции пролиферации клеток. III.6. Исследование роли VEGF-C/FLT4 (VEFGR3)-зависимой сигнальной системы в регуляции пролиферации опухолевых клеток. В качестве модельной системы для исследования роли VEGF-C/ FLT4 (VEFGR3) - зависимой сигнальной системы в регуляции пролиферации опухолевых клеток была выбрана культуральная линия А549, в которой ранее была обнаружена ко-экспрессия обоих генов. Поскольку в клетках А549 экспрессированы фактор роста VEGF-С и его рецептор FLT4 (VEFGR3), можно было предположить, что эта сигнальная система вносит определенный вклад в регуляцию пролиферации этих клеток. Для того чтобы оценить степень участия данной сигнальной системы в стимуляции клеток к делению, к культуральной среде клеток А549 добавлялся рекомбинантный белок sFLT4, представляющий собой рецепторную часть белка FLT4 (VEFGR3), соединенную с Fc-областью иммуноглобулина IgG1 человека (Рис. III.16). Такой сливной белок, растворимый в культуральной среде, способен связывать фактор роста VEGF-C, блокируя тем самым его взаимодействие с FLT4 (VEFGR3)рецепторами, находящимися на клеточной мембране (Рис. III.17). 125 Такой сливной белок, растворимый в культурной среде, способен связывать фактор роста VRGF-C, блокируя тем самым его взаимодействие с FLT4 (VEGFR3)-рецепторами, находящимися на клеточной мембране (Рис. III.18) Прежде всего была исследована кинетика воздействия белка sFLT4 на рост клеток А549. Для этого к клеткам добавляли белок sFLT4 в концентрациях 10 нг/мл и 100 нг/мл и в течение 5 дней подсчитывали количество клеток в сериях опытных клеток и в контроле. Результаты опыта представлены на Рис. III.19. 126 Влияние sFLT4 на пролиферацию клеток А549 Количество клеток, х 10000 25 20 15 10 5 0 0 1 2 0 нг/мл sFLT4 10 нг/мл sFLT4 3 4 5 Дни инкубации 100 нг/мл sFLT4 Рис. III.19. Влияние добавления рекомбинантного белка sFLT4 на размножение клеток линии А549. Из рисунка видно, что белок sFLT4, добавленный в концентрации 10 нг/мл практически не оказывал влияния на скорость размножения клеток А549. При добавлении же sFLT4 в концентрации 100 нг/мл наблюдалось уменьшение количества клеток, причем максимальный эффект проявлялся на 4-й день культивирования клеток после добавления белка. Исходя из полученных результатов, в последующих опытах подсчет клеток производился на 4-й день после добавления белка. Для того, чтобы убедиться в том, что наблюдаемый ингибирующий эффект вызван специфическими рецепторными функциями добавляемого белка, были поставлены опыты, в которых к клеткам добавлялись различные концентрации нативного белка sFLT4 или sFLT4 денатурированного нагреванием, в результате чего нарушалась его структура. Результаты опытов представлены на Рис. III.20 127 . Из рисунка видно, что денатурированный белок sFLT4 не оказывал подавляющего действия на рост клеток А549, и следовательно, ингибирование роста клеток при добавлении sFLT4 связано с сохранением нативности структуры этого белка и, соответственно, с его способностью взаимодействовать с ростовым фактором. Высокий уровень экспрессии фактора роста VEGF-C характерен также для культуры клеток плоскоклеточной карциномы кожи А431, однако экспрессии рецептора FLT4 (VEFGR3) в этих клетках обнаружено не было. Метод RT-PCR не выявил в клетках А431 и экспресии второго рецептора VEGF-С – Flk1/KDR (VEGFR2). Следовательно, можно было предполагать, что добавление белка sFLT4 не должно влиять на размножение этих клеток. Действительно, как видно из Рис. III.21, добавление различных концентраций sFLT4 к культуре клеток А431 не влияло на их размножение. 128 Таким образом, в данной серии экспериментов продемонстрирована роль VEGF-C/FLT4 (VEGFR3)-зависимой сигнальной системы в регуляции размножения клеток. В том случае, если в клетках экспрессированы как ростовой фактор, так и его рецептор, эта сигнальная система может вносить заметный вклад в стимуляцию деления клеток. При отсутствии рецептора даже высокий уровень экспрессии ростового фактора не является стимулирующим для размножения клеток. III.7. Исследование экспрессии гена Flt4 в спонтанных и перевиваемых гепатомах мыши. Для того чтобы изучить возможную роль Flt4 в процессах возникновения и прогрессии опухолей, мы исследовали экспрессию этого гена в некоторых опухолях человека и грызунов. Прежде всего экспрессия Flt4 была исследована методом Норзерн блот-гибридизации в серии спонтанных и перевиваемых и перевиваемых гепатом мышей. 129 Были исследованы 5 образцов спонтанных гепатом мышей-самцов линии СВА; 2 образца перевиваемой гепатобластомы, развившейся у мышей BDF и 1 образец гепатомы, индуцированной у мышей-самцов линии СВА по схеме: ДЭНА + ФБ. Экспрессия Flt4 в опухолях сравнивалась с экспресией этого гена в окружающей опухоль ткани печени-носителя; были также исследованы 2 образца нормальной печени мышей-самцов СВА. Результаты гибридизации представлены на Рис. III.22. Рис. III.21. Экспрессия гена Flt4 в гепатомах и печени мыши. 1перевиваемая гепатома, индуцированная ДЭНА + ФБ; 2,3 – перевиваемая гепатобластома; 4-8 – спонтанные гепатомы мышей линии СВА; 9,10 – печень мышей опухоленосителей линии СВА; 11 – нормальная печень мыши линии СВА; 12 – культура фибробластов DEF-4/21. Из данных, представленных на рисунке, видно, что в 5 из 8 исследованных гепатом мыши наблюдалась экспрессия гена Flt4: положительными оказались 3 из 5 спонтанных гепатом; 1 из 2 перевиваемых гепатобластом и перевиваемая гепатома. Ни в одном из 130 образцов печени-опухоленосителя или нормальной печени сигналов Flt4 выявлено не было. Для дальнейшего количественного анализа сигналов Flt4, а также с целью контроля отсутствия деградации нанесенной РНК, фильтры подвергались повторной гибридизации с GAPDH. Авторадиограммы сканировались с помощью денситометра с последующей компьютерной обработкой полученных результатов. Цифры в приведенной ниже Таблице III.5. соответствуют интегрированным значениям пиков денситограмм сигналов Flt4 и GAPDH, рассчитанных в заданной стандартной маркерной области. Полученные данные выявили достаточно высокую частоту экспрессии Flt4 в гепатомах мыши (5/8 или 62,5%). При этом наибольшая интенсивность экспрессии Flt4 была обнаружена в спонтанных гепатомах (64,53 ± 18.01). Таблица III.5. Активность Flt4 в спонтанных и перевиваемых гепатомах. ДЭНА + ФБ 1.54 4.58 Flt.4/GAPDH, % 33.62 Гепатобластома 1.60 4.37 36.61 9.00 9.83 91.55 3.04 5.46 55.67 3.91 8.43 46.38 Flt.4 Спонтанные гепатомы 131 III.8. Исследование экспрессии генов FLT4 (VEFGR3) и его лиганда VEGF-C в опухолях человека. III.8.1. Исследование экспрессии FLT4 (VEFGR3) в опухолях человека методом Норзерн блот-гибридизации. Методом Норзерн блот-гибридизации была исследована экспрессия гена FLT4 (VEFGR3) в РНК ряда образцов некоторых злокачественных опухолей человека. Для гибридизации использовались зонды, соответствующие области гена, кодирующей внеклеточный (FLT4-EC) и трансмемранный (FLT4-TM) домены рецептора (Рис. III.13). Список исследованных образцов опухолей приведен в Таблице III.6. Таблица III.6. Злокачественные опухоли человека, исследованные на экспрессию гена FLT4 (VEFGR3) методом Норзерн блотгибридизации. Название опухоли Количество образцов 1. Меланомы 84 2. Мезотелиомы 5 3. Рак толстого кишечника 5 4. Рак яичника 9 5. Рак молочной железы 5 Ни в одном из исследованных образцов злокачественных опухолей человека экспрессии FLT4 (VEFGR3) обнаружено не было. Отрицательные результаты, полученные в данной части работы, свидетельствовали о том, что либо ген FLT4 (VEFGR3) крайне редко экспрессируется в опухолях человека, либо его экспрессия в опухолях очень незначительна и уровень чувствительности метода Норзерн блотгибридизации недостаточен для выявления экспрессии этого гена. 132 В связи с этим, при дальнейшем исследовании экспрессии FLT4 (VEFGR3) в опухолях человека был использован более чувствительный метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR). III.8.2. Исследование экспрессии генов FLT4 (VEFGR3) и фактора роста VEGF-С при злокачественной и доброкачественной патологии щитовидной железы человека методом RT-PCR. При изучении активности FLT4 (VEGFR3) методом RT-PCR, с помощью специального подбора праймеров исследовалась как суммарная экспрессия 2-х изоформ гена FLT4 (VEGFR3), так и экспрессия короткой (FLT4s) и длинной (FLT4l) изоформ этого гена по отдельности. Расположение использованных праймеров приведено на (Рис. III.23). Внеклеточная область ТМ Внутриклеточная область FLT4s FG1 FG3 CTER1 SHORT2 FLT4l CTER1 CTER2 Рис. III.22. Схематическое изображение расположения праймеров для RT-PCR, использованных при определении суммарной экспрессии 2-х изоформ гена FLT4 (FG1; FG3), его короткой (CTER1; SHORT2) и длинной (CTER1; CTER2) изоформ. Из рисуна видно, что праймеры FG1 и FG3, позволяющие оценить суммарную экспрессию 2-х изоформ FLT4 (VEFGR3), выбраны в области 133 гена, кодирующей фрагмент общей для обеих изоформ внутриклеточной области белкового продукта, прилегающей к трансмембранному домену. Для того чтобы различить экспрессию короткой и длинной изоформ FLT4 (VEFGR3), праймеры были выбраны в концевой 3’-области гена. При этом 5’-праймер (CTER1) был общим для обеих изоформ, а 3’-праймеры были различными: 3’-праймер для короткой изоформы (SHORT2) расположен в нетранслируемой области гена, а 3’-праймер для длинной изоформы (CTER2) расположен в 3’-конце транслируемой области, отсутствующей у короткой изоформы. Для того чтобы оценить возможную роль FLT4 (VEFGR3) на разных этапах развития опухолей, мы исследовали методом RT-PCR экспрессию его гена в образцах с различной патологией щитовидной железы человека (все образцы ткани щитовидной железы человека, исследованные в данном разделе, были получены в Эндокринологическом Научном Центре РАМН, г. Москва, благодаря сотрудничеству с проф. М.И. Бронштейн). Всего было исследовано 38 образцов, полученных от 31 больного с различной патологией щитовидной железы человека (Табл. III.7). При этом наряду с доброкачественными и злокачественными опухолями щитовидной железы были исследованы также различные виды пролиферативных зобных изменений, не являющихся опухолевыми. К такого рода зобным изменениям относятся аутоиммунные заболевания: диффузные зобы и тироидиты, а также различные узловые зобные патологии. Предполагалось, что сравнение экспрессии FLT4 (VEFGR3) в этих типах тиреоидных патологий может дать возможность отдифференцировать изменения в экспрессии FLT4 (VEFGR3), вызванные повышенной пролиферацией клеток в ткани, от изменений, связанных с трансформацией клеток, а также сравнить экспрессию FLT4 (VEFGR3) злокачественных тиреоидных опухолях. в доброкачественных и 134 Таблица III.7. Виды патологии щитовидной железы человека, исследованные на экспрессию мРНК генов FLT4 (VEGFR3) и VEGF-C. Название патологии Количество образцов Аутоиммунные заболевания (всего – 7) диффузные зобы тироидиты 2 5 Узловые зобные изменения 10 Аденомы (всего – 13) из А-клеток: микрофолликулярного типа фетального типа из клеток Ашкенази 2 6 5 Аденокарциномы (всего – 8) фолликулярного типа из С-клеток 5 3 Всего исследовано 38 Результаты RT-PCR анализа экспрессии мРНК генов FLT4 (VEFGR3) (суммарная экспрессия 2-х изоформ), короткой (FLT4s) и длинной (FLT4l) изоформ FLT4 (VEFGR3), а также гена VEGF-С при различных патологиях щитовидной железы человека представлены на Рис. III.24-27. Из приведенных на рисунках данных можно видеть, что суммарная экспрессия FLT4 (VEFGR3) в большинстве случаев коррелировала с экспрессией короткой изоформы этого гена, тогда как частота экспрессии длинной изоформы была, как правило, ниже. 135 136 137 138 139 Полученные данные могут быть представлены в виде следующей таблицы (Табл. III.8): Таблица III.8. Экспрессия мРНК генов VEGF-С, FLT4, FLT4s и FLT4l в образцах с различной патологией щитовидной железы человека. Патология VEGF-C Общее + кол-во образцов FLT4 + FLT4s + FLT4l + Аутоиммунные заболевания 7 7 7 7 4 Узловые зобные изменения 10 9 9 9 5 Аденомы 13 11 13 13 9 Аденокарциномы 8 5 3 3 1 Из рисунков III.24-27 и данных таблицы видно, что практически во всех образцах аутоиммунных заболеваний (Рис. III.24) и аденом (Рис. III.26) наблюдались достаточно высокая частота и уровень экспрессии всех исследованных генов. Лишь в единичных случаях интенсивность сигналов была слабой или отсутствовала. В то же время, в образцах с узловыми зобными изменениями (Рис. III.25) частота экспрессии длинной изоформы гена FLT4 (VEFGR3) была снижена (5/10 или 50%), при этом интенсивность сигнала практически во всех случаях была крайне низкой. В аденокарциномах частота суммарной экспрессии FLT4 (VEFGR3) и отдельных его изоформ была заметно снижена (Рис. III.27): короткая изоформа экспрессировалась в 3/8 или 37,5% образцов; длинная изоформа экспрессировалась в 1/8 или 12,5% образцов, причем уровень экспрессии FLT4l в единственном экспрессирующем этот ген образце был крайне низок (Рис. III.27, образец 5). Незначительное 140 снижение частоты экспрессии в аденокарциномах было обнаружено и для гена VEGF-С (5/8 или 62,5%). При сравнении интенсивности сигнала длинной изоформы FLT4 (VEFGR3) в различных патологиях щитовидной железы человека (Табл. III.9.) можно отметить, что наиболее выраженной активность этого гена была в образцах аденом (8 сигналов с высокой интенсивностью и 1 – с низкой) и от больных аутоиммунными заболеваниями (соответственно, 3 и 1), тогда как в образцах с узловыми зобными изменениями и особенно – в образцах аденокарцином (всего 1 слабый сигнал) интенсивность экспрессии FLT4l была снижена. Таблица III.9. Интенсивность экспрессии FLT4l в образцах с различной патологией щитовидной железы человека. Высокий уровень 3 Низкий уровень 1 Узловые зобные изменения 1 4 5 Аденомы 8 1 4 Аденокарциномы 0 1 7 Патология Аутоиммуные заболевания Нет экспрессии 3 Таким образом, полученные данные указывают на то, что в аденокарциномах щитовидной железы частота экспрессии гена FLT4 (VEFGR3), и особенно, его длинной изоформы снижается по сравнению с доброкачественными опухолями – аденомами и неопухолевыми тиреоидными пролиферативными патологиями. В образцах с узловыми зобными изменениями экспрессия FLT4 (VEFGR3) также была несколько снижена. 141 III.8.3. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков FLT4 и VEGFc в опухолях щитовидной железы человека. Сравнение с нормальной окружающей тканью. Результаты исследования экспрессии гена FLT4 (VEFGR3), полученные с помощью метода RT-PCR, были подтверждены с помощью иммуногистохимического окрашивания, позволяющего оценить количество экспрессирующих тот или иной белок клеток, их распределение в ткани, а также интенсивность экспрессии белка в клетках. Для того чтобы оценить экспрессию белка FLT4 в доброкачественных и злокачественных опухолях щитовидной железы человека и сравнить ее с экспрессией в нормальной окружающей тиреоидной ткани была проведена иммуногистохимическая окраска криосрезов дополнительной серии образцов, включавшей в себя 5 аденом и 6 аденокарцином (Рис. III.27). Из приведенных на рисунке фотографий можно видеть, что как в опухолевой, так и в окружающей опухоль нормальной тканях положительно окрашенные клетки располагались очень неравномерно: кластеры экспрессирующих FLT4 клеток как правило были окружены зонами, в которых наблюдалось лишь небольшое количество отдельных окрашенных клеток. Особенно большая гетерогенность отмечалась в аденокарциномах, где довольно часто в поле зрения микроскопа можно было наблюдать лишь несколько единичных положительно окрашенных клеток. 142 143 Среди положительно окрашенных клеток наряду с клетками эндотелия довольно часто встречались фибробласты и фиброцисты, а также отдельные эпителиальные клетки. Это наблюдение оказалось достаточно неожиданным, так как, по данным имеющейся в настоящее время литературы, экспрессия FLT4 во взрослом организме наблюдается исключительно в клетках эндотелия сосудов. Количественная оценка результатов иммуногистохимического окрашивания проводилась с помощью сканирующего микроскопа и компьютерной системы анализа изображений SAMBA IPS (Франция). На каждом срезе было выбрано несколько (2-3) наиболее интенсивно окрашенных областей и для каждой из них подсчитывались положительно окрашенные структуры в 20 последовательно расположенных полях зрения микроскопа. Затем для каждой из выбранных областей подсчитывалось усредненное количество FLT4-положительных структур на единицу поверхности среза. Результаты подсчета приведены в Табл. III.10. Данные, приведенные в Табл. III.10, хорошо иллюстрируют гетерогенность окраски на FLT4 практически во всех образцах: разброс усредненных значений количества положительно окрашенных структур, подсчитанных для наиболее интенсивно окрашенных областей каждого из исследованных случаев довольно велик. Тем не менее, статистическая обработка полученных данных позволила выявить достоверные количественные различия в окрашивании на FLT4 аденокарцином и аденом щитовидной железы. В Табл. III.11. приведены средние значения количества положительно окрашенных на FLT4 структур на 1 мм2 гистологического среза при различных патологиях щитовидной железы человека. 144 Таблица III.10. Количественная оценка FLT4-положительных структур при иммуногистохимической окраске криосрезов опухолей щитовидной железы человека. Аденомы № образца 3461 . 3845 . 3728 . 3669 . 3488 . . Нормальная ткань ∗ Аденокарциномы Кол-во Кол-во № № структур/ образца структур/ образца 0,67735 0,67735 2 мм мм2 61 567 90 567 33 24 18 8 144 473 24 473 52 23 26 16 824 22 824 52 3 34 85 759 15 759 38 70 18 9 42 483 4 483 56 6 447 11 447 15 Кол-во структур/ 0,67735 мм2 8 11 3 44 5 12 0 0 17 33 5 4 7 23 10 11 ∗ В качестве нормальной ткани оценивалась окружающая аденокарциномы ткань щитовидной железы. Таблица III.11. Средние значения количества положительно окрашенных на FLT4 структур на 1 мм2 гистологического среза при различных патологиях щитовидной железы человека. Аденокарциномы Аденомы Среднее значение Стандартное отклонение Нормальная ткань 20,30 48,26 11,50 13,92 15,71 6,10 145 Для статистической обработки полученных данных применялся непараметрический метод Kruskal-Wallis, выявивший статистически достоверные различия (р = 0,0093) в количестве FLT4-положительных структур между аденомами и аденокарциномами. По данным RT-PCR особенно выраженными были различия в экспрессии длинной изоформы FLT4. Однако при иммуногистохимическом анализе оценивается суммарная экспрессия белков короткой и длинной изоформ, поскольку антитела к FLT4 не различают отдельные изоформы. Тем не менее, даже при сравнении суммарной экспрессии белка FLT4 в аденомах и аденокарциномах различия оказались статистически значимыми. Далее было проведено иммуногистохимическое окрашивание гистологических срезов этих же образцов опухолей щитовидной железы антителами к VEGF-C. Положительно окрашенными на VEGF-C оказались исключительно опухолевые клетки. В окружающей опухоль нормальной ткани щитовидной железы экспрессирующих VEGF-C клеток обнаружено не было (Рис. III.28). Результаты иммуногистохимической реакции оценивались по количеству положительно окрашенных клеток (0-100%) и по степени интенсивности окраски (1-3). Полученные данные представлены в Табл. III.12. Из таблицы III.12 видно, что процент окрашенных на VEGF-C клеток был выше в аденокарциномах, интенсивность окрашивания в среднем также была выше в аденокарциномах (2-3), чем в аденомах (1-3). Однако полученные различия не были статистически значимыми. 146 147 Таблица III.12. Количественная оценка VEGF-C-положительных клеток при иммуногистохимической окраске криосрезов опухолей щитовидной железы человека. Аденомы № образца 3461 Количество окрашенных 20 клеток (%) Интенсивность 1 VEGF-C 3845 3728 3669 3488 80 40 10 30 2 1 1 3 473 824 759 483 447 100 100 30 80 10 3 3 2 2 2 Аденокарциномы № образца 567 Количество окрашенных 80 клеток (%) Интенсивность 2 VEGF-C Таким образом, иммуногистохимическое исследование, характеризующее экспрессию белка в ткани, так же как и данные, полученные нами при исследовании экспрессии генов FLT4 и VEGF-C методом RT-PCR, свидетельствуют о снижении экспрессии рецептора FLT4 в аденокарциномах щитовидной железы человека по сравнению с аденомами и нормальной тиреоидной тканью. III.8.4. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков FLT4 и CD31 в опухолях щитовидной железы человека. Поскольку рецептор FLT4 выявляется преимущественно в клетках эндотелия лимфатических сосудов, экспрессия этого белка отражает уровень развития в ткани лимфатической сосудистой системы. Представлялось интересным сравнить экспрессию FLT4 при различной 148 патологии щитовидной железы с экспрессией какого-либо из маркеров кровеносной системы и оценить, наблюдается ли для этого маркера аналогичное уменьшение экспрессии в аденокарциномах. Для характеристики кровеносной системы нами был выбран белок CD31, экспрессирующийся преимущественно в клетках эндотелия кровеносных сосудов, и дающий более тонкую картину капиллярной сети, чем, например, фактор фон Виллебрандта (vWB). В данной части работы нами было исследовано 16 образцов аденокарцином щитовидной железы человека (5 аденокарцином, происходящих из С-клеток; 5 папиллярных; 3 папиллярно-фолликулярных; 3 фолликулярных), 3 образца аденом, 3 образца с зобными патологиями и 2 образца метастазов щитовидной железы1. Серийные криосрезы образцов ткани окрашивались антителами к FLT4 или CD31, после чего проводилась полуколичественная оценка уровня экспрессии исследуемых маркеров в данной ткани. Примеры иммуногистохимического окрашивания образцов аденом и аденокарцином щитовидной железы человека антителами к FLT4 и CD 31 приведены на Рис. III.30. Результаты полуколичественной оценки уровня экспрессии FLT4 и CD 31 в исследованных образцах патологии щитовидной железы человека приведены в Таблицах III.13.-III.14. Из данных, приведенных в Таблице III.13., видно, что уровень экспрессии FLT4 в аденокарциномах был, как правило, ниже уровня экспрессии CD31, при этом прямой корреляции между уровнями экспрессии FLT4 и CD31 не наблюдалось. В данной части исследования был использован материал, любезно предоставленный докт. J. Jacquemier, Institute Paoli-Calmettes, Марсель, Франция. 1 149 150 Таблица III.13. Количественная оценка уровня экспрессии FLT4 и CD 31 при иммуногистохимической окраске криосрезов аденокарцином щитовидной железы человека Морфологический тип аденокарцином № образца Из С-клеток 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Папиллярные Папиллярнофолликулярные Фолликулярные Уровень Уровень экспрессии экспрессии VEGFR3 CD31 ++ + + ++ ++ + + + + + +++ ++ ++ + ++ ± + ++ ± ± ++ ± + − ± ± +++ + ++ + ± − Поскольку количество образцов в каждой из групп аденокарцином определенного морфологического типа было невелико, оценить различия между группами в уровне экспрессии того или иного маркера не представляется возможным, хотя можно отметить, что в группе папиллярно-фолликулярных аденокарцином уровень экспрессии FLT4 был минимальным. Существенных различий между отдельными группами аденокарцином по уровню экспрессии CD31 не обнаружено. Суммарно уровни экспрессии FLT4 и CD31 в аденокарциномах щитовидной железы можно представить в виде следующей таблицы: 151 Таблица III.14. Сравнение уровней экспрессии FLT4 и CD31 в аденокарциномах щитовидной железы человека. FLT4 Высокий (+++/++) 2 Средний (+) 8 Низкий (±/−) 6 CD31 9 4 3 Маркер Из приведенной таблицы видно, что более, чем в половине исследованных образцов аденокарцином щитовидной железы (9/16) уровень экспрессии CD31 можно было оценить как высокий (++/+++), тогда как высокий уровень экспрессии FLT4 был найден лишь в 2/16 случаев, а в остальных образцах уровень экспрессии этого маркера был средним или низким. В отличие от аденокарцином, в аденомах щитовидной железы и зобных тиреоидных патологиях существенных различий в уровнях экспрессии изучаемых маркеров найдено не было (Табл. III.15. и III.16.). Таблица III.15. Сравнение уровней экспрессии FLT4 и CD31 в аденомах щитовидной железы человека. № образца 1 FLT4 CD31 + ++ 2 ++ ++ 3 +++ ++ Поскольку основной задачей данной части работы было исследование уровней экспрессии FLT4 и CD 31 в аденокарциномах, где ранее найдено снижение экспрессии FLT4, количество было 152 Таблица III.16. Сравнение уровней экспрессии FLT4 и CD31 в зобных тиреодиных патологиях человека. № образца 1 FLT4 CD31 ++ + 2 ++ ++ 3 ++ ++ исследованных аденом и образцов с зобной патологией невелико и не позволяет провести количественную оценку полученных результатов. Тем не менее, из данных, приведенных в Табл. III.15. и III.16., можно видеть, что экспрессия белков FLT4 и CD 31 как в образцах с зобными патологиями, так и в аденомах была более равномерной, чем в аденокарциномах: в подавляющем большинстве образцов экспрессия обоих маркеров была высокой (++/+++). Таким образом, данные иммуногистохимического анализа указывают на то, что в процессе озлокачествления опухолей щитовидной железы человека экспрессия маркера лимфатических сосудов FLT4 снижается, в отличие от экспрессии маркера кровеносных сосудов – CD31, уровень экспрессии которого в аденокарциномах, аденомах и зобных изменениях существенно не изменяется. Экспрессия FLT4 и CD31 была исследована также в 2-х образцах метастазов рака щитовидной железы (Табл. III.17.). Уровень экспрессии CD31 в этих образцах был невысоким, а клетки, окрашенные на FLT4, практически отсутствовали. 153 Таблица III.17. Экспрессия FLT4 и CD31 в метастазах рака щитовидной железы человека. № образца 1 Таким образом, VEGFR3 CD31 − ± 2 ± + результаты иммуногистохимического анализа подтвердили полученные нами ранее данные о снижении экспрессии FLT4 в аденокарциномах щитовидной железы человека. В отличие от FLT4 экспрессия маркера кровеносных сосудов CD 31 во всех исследованных тиреоидных патологиях существенно не различалась, что указывает на различия в регуляции лимфатической и аденокарциномах щитовидной железы человека. кровеносной систем в 154 ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ В нашей работе был клонирован новый ген, FLT4 (VEGFR3), кодирующий белок, относящийся к суперсемейству рецепторных тирозинкиназ (РТК) [43; 44]. РТК представляют собой трансмембранные белки, внеклеточная рецепторная часть которых взаимодействует со своими специфическими лигандами, а внутриклеточная область обладает тирозинкиназной активностью (Рис. IV.1) [158]. К суперсемейству РТК относятся рецепторы многих факторов роста и других цитокинов. В этом суперсемействе можно выделить 2 большие группы рецепторов, различающиеся по организации своего внутриклеточного тирозинкиназного домена: как видно из рисунка, у части этих белков тирозинкиназная область разбита на 2 домена интеркиназной вставкой. Внеклеточная рецепторная область таких РТК также имеет характерную структуру, сформированную последовательностью из 3-х, 5-и или 7-и иммуноглобулинподобных (ИГ) доменов. К классу РТК, имеющему 3 ИГ-домена во внеклеточной области, относятся рецепторы ростовых факторов фибробластов (FGF) (класс IV по классификации Ullrich A., Schlessinger J. [158]; класс РТК с 5-ю ИГ-доменами содержит рецепторы тромбоцитарного фактора роста (PDGFR-A, PDGFR-B), рецептор колониестимулирующего фактора (CSFR или c-fms), c-kit, FLT3 (класс IV по классификации Ullrich A., Schlessinger J. [158]. Рецептор FLT4 оказался наиболее близким по структуре рецепторам FLT1 [22] и Flk1/KDR [151], внеклеточная область которых сформирована 7-ю ИГ-доменами. Эти 3 рецептора образовали новый класс семейства РТК. (Рис. IV.2). Все они оказались рецепторами семейства факторов роста эндотелия сосудов VEGF и поэтому впоследствии их названия были изменены на VEGFR1 (FLT1), VEGFR2 (Flk1/KDR) и VEGFR3 (FLT4). 155 156 157 Первые клоны нового гена FLT4 (VEGFR3) были получены в результате скрининга в условиях пониженной жесткости гибридизации клонотеки кДНК плаценты человека зондом, содержащим фрагмент гена FLT3 мыши [124], кодирующий его тирозинкиназную (ТК) область. Из сравнения аминокислотных последовательностей, приведенных в главе «Результаты исследования» (с.000), видно, что в области, кодирующей как 1-й, так и 2-й ТК-домен РТК, степень гомологии генов, даже не принадлежащих к одной и той же подгруппе, очень высока. Это связано с тем, что ТК-домены кодируют область, обеспечивающую общую для всех генов семейства ферментативную тирозинкиназную активность. Благодаря столь высокой степени гомологии при скрининге клонотек зондом, содержащем фрагмент гена, кодирующий ТК-область, в условиях пониженной жесткости гибридизации могут выявляться клоны, содержащие аналогичные области других генов семейства. Именно таким образом и были получены первые клоны, содержащие фрагменты гена FLT4 (VEGFR3) (Рис. III.1). Сиквенс первых клонов показал, что содержащиеся в них последовательности не относятся ни к одному из ранее известных генов семейства. Вместе с тем, в кодируемых ими аминокислотных последовательностях были идентифицированы высоко консервативные короткие фрагменты, характерные для ТК-доменов РТК, такие как, например, --- HRDLAARN ---, --- GLARDY --- , --- MAPES ---, что свидетельствовало о принадлежности нового гена к семейству РТК. Сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых ТКдоменами нового гена FLT4 (VEGFR3), с гомологичными областями генов FLT1 (VEGFR1), Flk1/KDR (VEGFR2), а также гена FMS человека, относящегося к тому же классу РТК, что и ген FLT3 мыши, указывало на то, что этот ген имеет большую степень гомологии с генами FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2), чем с геном FMS. Однако в силу высокой консервативности ТК-доменов различия в степени гомологии были невелики. 158 Сходство FLT4 (VEGFR3) с генами FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2) более четко проявилось при анализе фрагментов, кодирующих белковые последовательности, не входящие в ТК-домены. На стр. приведен консенсус фрагментов всех 4-х генов, кодирующих трансмембранные и прилегающие к ним цитоплазматические домены, из которого видно, что количество кодируемых в этой области аминокислот, совпадающих у всех 3-х генов FLT4 (VEGFR3), FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2), составляет 34/67, а у генов FLT4 (VEGFR3) и FMS – всего 16/67. Если же учитывать кодируемые аминокислоты, совпадающие хотя бы у 2-х из 3-х генов FLT4 (VEGFR3), FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2), то окажется, что у белковых продуктов этих генов в области трансмембранного и прилегающего к нему цитоплазматического домена есть только 10 различающихся аминокислот. Особенно высокой вариабельностью в цитоплазматической области белковых продуктов генов FLT4 (VEGFR3), FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2) отличается интеркиназная вставка. И если трансмембранная область определяет положение рецептора в клеточной мембране, то область интеркиназной вставки ответственна за взаимодействие тирозинкиназы со своими специфическими субстратами – в этой области локализованы многие сайты узнавания для молекул-субстратов РТК. Консенсус нуклеотидных последовательностей генов FLT4 (VEGFR3), FLT1 (VEGFR1), Flk1/KDR (VEGFR2) и FMS в области интеркиназной вставки приведен на стр. . Как видно из приведенного сравнения аминокислотных последовательностей, эти 4 гена практически не содержат совпадающих аминокислот в этой области: всего 2 аминокислотных остатка совпали у всех 4-х генов, и 4 – у 3-х генов FLT4 (VEGFR3), FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2). Интересно, что гены FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2) проявили достаточно высокую степень гомологии и в этой области: из 67 аминокислот 29 оказались совпадающими (помечены ∇). 159 При дальнейшем клонировании 5’-области FLT4 (VEGFR3) оказалось, что фрагмент гена, кодирующий внеклеточный рецепторный домен его белкового продукта, представляет собой нуклеотидную последовательность протяженностью 2325 bp. Сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых генами FLT4 (VEGFR3), FLT1 (VEGFR1) и FMS дало возможность идентифицировать расположение всех 7-и ИГподобных доменов (Приложение 3.2). В начале и в конце каждого из ИГ- доменов, (за исключением домена IV), располагаются высококонсервативные для генов этого семейства остатки цистеинов (помечены #), стабилизирующие их структуру. Структура IV-го ИГ-подобный домена, по-видимому, отличается от структуры других доменов – в нем отсутствуют консервативные цистеины. Этот домен разделяет рецепторную часть белка FLT4 (VEGFR3) на 2 области, каждая из которых состоит из 3-х последовательно расположенных ИГ-подобных доменов. Из сравнения рецепторной части РТК, имеющих во внеклеточной области 5 ИГ-подобных доменов, с РТК, внеклеточная область которых состоит из 7 таких доменов, можно видеть, что дополнительные 2 домена появляются в области, непосредственно прилежащей к клеточной мембране (Рис. IV.3). 160 При клонировании 5’-терминальной области гена FLT4 (VEGFR3) необходимо было идентифицировать расположение инициирующего ATGкодона. Сложность состояла в том, что в 5’-области этого гена находились 2 потенциальных сайта инициации трансляции: на расстоянии –15 кодируемых аминокислот от первого обнаруженного ATG-кодона (ATG-1) располагался еще один ATG-кодон (ATG-2) (Рис. IV.4). Оба возможных инициирующих кодона находились в пределах открытой рамки считывания. Для того чтобы определить, какой из 2-х ATG-кодонов является инициирующим, прилежащие к ним нуклеотидные последовательности были сопоставлены последовательностью, с описанной Kozak представляющей [80] собой нуклеотидной консенсус 5’- нетранслируемой области, прилегающей к инициирующему ATG-кодону. ATG-1 GAG TAC T CC ATG ACC ATG-2 CGG CCG G AG ATG CAG Консенсус GCC GCC (A/G)CC ATG G Из приведенного сравнения видно, что, согласно консенсусной последовательности Kozak, 5’-нетранслируемая область обогащена GCпоследовательностями, что в большей степени соответствует ATG-2. Обнаруженный в 5’-области, непосредственно прилежащей к ATG-2 «стоп»-кодон также указывал на то, что именно ATG-2 является инициирующим кодоном гена FLT4 (VEGFR3). Перед инициирующим кодоном гена FLT4 (VEGFR3) располагается довольно протяженная нетранслируемая 5’-область, которая была нами секвенирована лишь частично. Аналогичные нетранслируемые 5’-области найдены и в мРНК других генов, например, гена PDGF. Предполагается, что эти области могут выполнять регулирующую роль, в частности, ингибируя трансляцию гена. 161 Так, например, прилегающая со стороны 5’- к инициирующему ATG-кодону GC-обогащенная нуклеотидная последовательность, 162 состоящая из 140 bp, ингибировала экспрессию белка PDGF почти в 40 раз [119]. Возможно, это связано с тем, что в отсутствие 5’-нетранслируемой области считываемая с гена мРНК более стабильна [31]. При использовании полученных клонов FLT4 (VEGFR3) в качестве зондов для Норзерн-блот гибридизации оказалось, что новый ген экспрессирован в плаценте человека в виде 2-х транскриптов с приблизительными размерами 5,8 кб и 4,7 кб, на основании чего можно было предполагать существование 2-х изоформ FLT4 (VEGFR3) с размерами около 1500 и 1900 амк (Рис. III.14). Действительно, при клонировании 3’-концевой области гена FLT4 (VEGFR3) были найдены клоны, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие 2 различных транскрипта этого гена (клоны SHP26PS и R1; R2; R3). Клон SHP26PS (Рис. III.4) содержал фрагмент размером 360 bp, следующий непосредственно за 2-м ТК-доменом и заканчивающийся «стоп»-кодоном TAG. И таким образом, размер предполагаемого белка, кодируемого этой изоформой гена FLT4 (VEGFR3), составил 1298 амк. Расположенная после «стоп»-кодона нетранслируемая 3’-область транскрипта, включала примерно 500 bp и заканчивалась поли-А. Учитывая тот факт, что размер короткого транскрипта, полученный при Норзерн-блот гибридизации FLT4 (VEGFR3) с мРНК плаценты человека, составляет 4,7 kbp, из которых 3894 bp представляют собой транслируемую область, а 500 bp – нетранслируемый 3’-конец, размер нетранслируемой 5’-области должен составлять примерно 300 bp. Фрагмент гена FLT4 (VEGFR3), содержащийся в клоне R2 (Рис. III.7), частично совпадал с полученной при секвенировании клона SHP26RS 3’концевой нуклеотидной последовательностью, заканчивающейся «стоп»кодоном TAG. Однако вместо TAG в этом клоне находился кодон TGG, в результате чего открытая рамка считывания продлевалась еще на 65 дополнительных аминокислотных остатка и заканчивалась «стоп»-кодоном 163 ТАА. Этот клон соответствовал 3’-области второй, более длинной изоформы гена FLT4 (VEGFR3). Размер предполагаемого белкового продукта, кодируемого этой изоформой, составляет 1363 амк. Таким образом, в результате анализа выявленных в нашей работе клонов удалось получить полный нуклеотидный сиквенс обеих изоформ гена FLT4 (VEGFR3). Клонированный в нашей работе новый ген, FLT4 (VEGFR3), принадлежит к семейству РТК и по своей структуре наиболее гомологичен генам, кодирующим рецепторы факторов роста семейства VEGF. В то время, когда был клонирован ген FLT4 (VEGFR3), были известны всего 2 фактора роста семейства VEGF – VEGF-A и PlGF, причем ни один из этих факторов не обладал способностью взаимодействовать с FLT4 (VEGFR3). Тем не менее, на основании сходства структур FLT4 (VEGFR3) и двух других рецепторов, входящих в эту группу – FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2) – являющихся рецепторами фактора роста VEGF-A (оба рецептора) и PlGF (рецептор FLT1 (VEGFR1)), можно было предположить, что лигандом FLT4 (VEGFR3) может быть еще не открытый фактор роста из этого же семейства. Это предположение подтвердилось позднее с обнаружением факторов роста VEGF-C [67; 86] и VEGF-D [167; 1], оказавшихся специфическими лигандами FLT4 (VEGFR3). В литературном обзоре уже была отмечена важная роль факторов роста семейства VEGF и взаимодействующих с ними рецепторов в ангиогенезе, в том числе, в ангиогенезе опухоли. Как было показано позднее, особенностью клонированного в нашей работе рецептора является его преимущественная экспрессия в клетках эндотелия лимфатических сосудов [69; 82]. И следовательно, в отличие от регулирующих ангиогенез сигнальных систем, связанных с рецепторами FLT1(VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2), FLT4 (VEGFR3)-зависимая сигнальная система регулирует лимфангиогенез ткани. Ряд данных, подтверждающих ключевую роль этой 164 системы в лимфангиогенезе, были приведены в литературном обзоре [62; 66; 70; 71; 93]. Важным практическим следствием экспрессии FLT4 (VEGFR3) в эндотелии лимфатических сосудов является возможность использования этого белка в качестве маркера лимфатических сосудов при иммуногистохимическом анализе. Ранее, отсутствие маркерных белков, специфически экспрессирующихся в клетках эндотелия лимфатических сосудов, не позволяло лимфатическую системы. анализировать Появление отдельно кровеносную специфического и маркера лимфатической системы давало возможность исследовать формирование и развитие лимфатических сосудов в нормальном организме, а также изменения, происходящие с этой системой при определенных заболеваниях, в том числе при прогрессии опухолей. В настоящее время известны еще несколько аналогичных маркеров, однако следует отметить, что одним из первых специфических маркеров лимфатической системы сосудов был FLT4 (VEGFR3). В нашей работе был также частично клонирован мышиный гомолог гена Flt4: были получены клоны, содержащие часть 2-го ТК-домена гена, а также фрагменты 5’- и 3’-областей этого гена. Использование полученных клонов гена Flt4 мыши в качестве зондов для Норзерн-блот гибридизации дало возможность выявить единственный транскрипт этого гена в тканях мыши размером 5,8 kb. Сравнение 3’-областей гомологов генов Flt4 мыши и FLT4 (VEGFR3) человека позволило установить, что 3’-область гена Flt4 мыши гомологична 3’-области длинной изоформы гена Flt4 человека и, соответственно, единственный транскрипт гена Flt4 мыши гомологичен длинной изоформе гена FLT4 (VEGFR3) человека. При определении хромосомной локализации гена FLT4 (VEGFR3) человека оказалось, что этот ген расположен в области q34-35 длинного плеча хромосомы 5 [4; 43]. Интересно, что на этом же плече хромосомы 5, в непосредственной близости от гена FLT4 (VEGFR3), расположен еще целый 165 кластер близких по структуре генов (Рис. IV.5). Это гены рецепторов FGFR4 (q35-ter), PDGFR-B и CSF1R/FMS (q33-3), так же как и FLT4 (VEGFR3) относящиеся к суперсемейству РТК. На этом же плече хромосомы 5 располагаются и гены, кодирующие некоторые из факторов роста, взаимодействующих с этими рецепторами: CSF1 (q33-1) и aFGF (q3132). Такое кластерное расположение в хромосомах характерно также и для других генов, кодирующих РТК (Рис. IV.6). Так, например, в области q1112 хромосомы 4 расположены гены, кодирующие рецепторы PDGFR-A и SLF-R/KIT, рядом с ними – ген VEGFR2 (KDR/Flk1) [127; 142]. Еще 2 близких гена, кодирующие рецепторы FLT1 (VEGFR1) [132] и FLT3 [96; 125] расположены в области q12 хромосомы 13. Существует гипотеза, объясняющая появление таких кластеров близких по структуре генов в процессе эволюции [124; 125]. Согласно этой гипотезе, на первом образовавшихся в этапе процессе происходит эволюции дупликация гена. Затем, первого в из результате происходящей in situ диверсификации генов образуются 2 различающиеся последовательности, кодирующие разные белки. И, наконец, может быть мультиплицирован целый сформировавшийся кластер. Предполагается, что хромосомы 4 и 5 произошли от общего предшественника и, следовательно, кластеры, содержащие гены PDGFR-A, SLF-R/KIT, KDR/Flk1 (VEGFR2) на хромосоме 4 и гены PDGFR-В, CSF1R/FMS, FLT4 (VEGFR3) на хромосоме 5 могли появиться в виде целого блока из общего предшественника. Исследование экспрессии мышиного гомолога гена Flt4 в нормальных тканях мыши выявило транскрипт этого гена в мРНК большинства исследованных органов (Рис. III.15. а,б) [44]. Особенно высоким был уровень экспрессии этого гена в сердце; экспрессия Flt4 отсутствовала в мРНК мышцы и мочевого пузыря. Такой широкий спектр экспрессии в тканях является типичным для рецепторов VEGF. 166 167 Для того чтобы оценить возможную роль FLT4 (VEGFR3) в эволюции опухолей человека, мы исследовали экспрессию этого гена в серии культур 168 трансформированных клеток человека и грызунов, в опухолях щитовидной железы человека, а также в спонтанных и перевиваемых гепатомах мышей. Достаточно высокой оказалась частота экспрессии Flt4 в гепатомах мыши: Flt4 экспрессировался в 3 из 5 спонтанных гепатомах, 1 из 2 перевиваемых перевиваемой гепатобластомах гепатоме, и в единственной индуцированной исследованной введением 1,2- диэтилнитрозоамина (ДЭНА) в качестве инициирующего канцерогенеза агента с последующим введением промотора канцерогенеза – фенобарбитала (ФБ) (Рис. IV.21). Во всех 3-х Flt4-положительных спонтанных гепатомах уровень экспрессии этого гена был достаточно высок: средняя относительная количественная величина интенсивности экспрессии составила 64,53 ± 18.01, что оказалось практически в 2 раза выше соответствующих величин, полученных для гепатобластомы (36,61) и гепатомы, индуцированной введением ДЭНА + ФБ (33,62) (Табл. IV.5). В этой серии опытов интересным оказался тот факт, что уровень экспрессии Flt4 в гепатобластоме, представляющей собой опухоль, происходящую из кровеносных сосудов, не превышал таковой в перевиваемой гепатоме и был ниже, чем в спонтанных гепатомах. Поскольку ген Flt4 по своей структуре наиболее близок к генам, кодирующим локализованные на клетках эндотелия кровеносных сосудов рецепторы факторов роста VEGF, можно было ожидать повышение его экспрессии в опухоли, происходящей из кровеносных сосудов печени. Низкий уровень экспрессии гена Flt4 в гепатобластоме мог указывать на отсутствие экспрессии этого рецептора в эндотелии кровеносных сосудов, что в дальнейшем было подтверждено в серии работ группы Alitalo, показавших, что во взрослом организме FLT4 (VEGFR3) экспрессируется преимущественно в эндотелии лимфатических сосудов [69; 82]. Экспрессия FLT4 (VEGFR3) была исследована методом Норзерн-блот гибридизации в серии культур трансформированных клеток человека и грызунов, среди которых были линии клеток гепатом грызунов и клетки 169 гепатомы HepG2 человека, фибробласты грызунов, трансформированные вирусами SV-40 и RSV, и ряд опухолевых линий клеток человека (всего в этой части работы было исследовано 16 линий клеток различного происхождения и видоспецифичности). Экспрессию гена FLT4 (VEGFR3) удалось обнаружить только в двух культурах клеток: в линии HEL, происходящей из клеток эритролейкоза человека и в фибробластах Джунгарского хомячка, трансформированных вирусом SV-40 (DEF-4/21) (Табл. III.1, 2). Эти данные говорили о том, что либо экспрессия FLT4 (VEGFR3) в культурах клеток является редким событием, либо уровень экспрессии этого гена в клетках ниже уровня чувствительности использованного нами метода Норзерн-блот исследовании гибридизации. экспрессии чувствительный метод FLT4 Поэтому (VEGFR3) полимеразной мы цепной при дальнейшем перешли реакции с на более обратной транскрипцией (RT-PCR). При исследовании экспрессии FLT4 (VEGFR3) методом RT-PCR в серии линий клеток гемобластозов, а также в культурах клеток, происходящих из солидных опухолей человека, было найдено что FLT4 (VEGFR3)-положительными были 4/7 линий клеток гемобластозов и только 1/5 линий опухолевых клеток солидного происхождения (Табл. III.3,4). Из полученных нами данных можно видеть, что экспрессия FLT4 (VEGFR3) в клетках солидных опухолей – достаточно редкое событие. Учитывая тот факт, что рецептор FLT4 (VEGFR3) в нормальном организме экспрессируется в клетках эндотелия лимфатических сосудов, отсутствие мРНК FLT4 (VEGFR3) в большинстве исследованных культуральных линий клеток не эндотелиального происхождения не является удивительным. И тем не менее, в одной из линий – в клетках карциномы легкого А 549 – экспрессия FLT4 (VEGFR3) была обнаружена, и следовательно, можно предположить, что в некоторых эпителиальных опухолевых клетках может быть активирована экспрессия FLT4 (VEGFR3). 170 Действительно, экспрессия двух других рецепторов семейства факторов роста VEGF – VEGFR1 (FLT1) и VEGFR2 (Flk1/KDR) в клетках плоскоклеточной карциномы головы и шеи недавно продемонстрирована с использованием иммуногистохимического анализа [56]. В том случае, если в некоторых клетках опухоли активированы рецепторы VEGFR, факторы роста семейства VEGF, помимо стимуляции роста кровеносных и лимфатических сосудов в опухоли, могут также служить дополнительными стимулами для пролиферации опухолевых клеток, внося свой вклад в развитие опухолевого процесса. При этом, в случае экспрессии клетками опухоли факторов роста VEGF может происходить как паракринная, так и аутокринная стимуляция деления самих опухолевых клеток. Для того чтобы выяснить, есть ли среди исследованных нами ранее на экспрессию FLT4 (VEGFR3) культур клетки ко-экспрессирующие рецептор и его лиганд, мы изучили в них экспрессию одного из лигандов FLT4 (VEGFR3) – VEGF-C, нового фактора роста семейства VEGF. В целом, частота экспрессии VEGF-C в клетках гемобластозов оказалась ниже, чем частота экспрессии гена рецептора FLT4 (VEGFR3): транскрипт VEGF-C был выявлен всего в 2-х линиях клеток из 7. В одной из этих линий клеток – клетках острого лимфобластного лейкоза Н9 – была обнаружена ко-экспрессия этих 2-х генов (Табл. III.3). В отличие от линий клеток гемобластозов, при исследовании экспрессии VEGF-C в эпителиальных трансформированных клетках оказалось, что для них характерна высокая частота экспрессии гена этого фактора роста: практически все они, за исключением клеток карциномы толстой кишки LIM 1215, экспрессировали достаточно высокие уровни VEGF-C. Ко-экспрессия генов фактора роста и его лиганда была найдена в линии А 549 (Табл. III.4), и таким образом, в этой линии клеток возможна аутокринная стимуляция их размножения фактором роста VEGF-C. 171 Клетки карциномы легкого А 549, а также клетки плоскоклеточной карциномы кожи А 431, экспрессирующие только фактор роста VEGF-C, но не его рецептор были выбраны нами в качестве модельной системы для того, чтобы исследовать роль FLT4 (VEGFR3)-зависимой сигнальной системы в регуляции размножения клеток, ко-экспрессирующих этот рецептор и взаимодействующий с ним фактор роста VEGF-C, а также оценить вклад этой системы в стимуляцию пролиферации клеток в культуре. С этой целью, в клетках А 549 было заингибировано взаимодействие VEGF-C со своим клеточным рецептором с помощью растворимого рекомбинантного белка sFLT4, представляющего рецепторную область FLT4 (VEGFR3), соединенную с Fc-областью иммуноглобулина IgG1 человека. Такой белок не встраивается в мембрану клетки из-за отсутствия у него трансмембранного домена и, будучи растворимым в культуральной среде, может связывать секретируемый клетками в среду фактор роста, конкурируя за него с рецепторами, расположенными на клеточной мембране. Добавление различных концентраций белка sFLT4 к клеткам А 549 тормозило их размножение более, чем в 2 раза (Рис. III.19). Эти данные продемонстрировали, что активация экспрессии рецептора FLT4 (VEGFR3) в эпителиальных клетках, экспрессирующих его лиганд, может приводить к значительному усилению их пролиферации вследствие аутокринной стимуляции этого процесса. И таким образом, в тех опухолях, где хотя бы в некоторых из клеток активируется экспрессия FLT4 (VEGFR3), роль FLT4 (VEGFR3)-зависимой сигнальной системы не ограничивается только регуляцией лимфангиогенеза опухоли, но может также стимулировать рост опухоли за счет усиления пролиферации самих опухолевых клеток. Аналогичный опыт был поставлен с клетками А 431, экспрессирующими только ген фактора роста VEGF-C, но не ген рецептора FLT4 (VEGFR3) (Рис. III.20). В клетках А 431 не было обнаружено и 172 экспрессии VEGFR2 (Flk1/KDR), второго из взаимодействующих с VEGF-C рецепторов. Как и ожидалось, в этом случае добавление рекомбинантного белка sFLT4 не приводило к подавлению скорости размножения клеток, подтверждая тот факт, что в отсутствие рецепторов фактор роста не оказывает стимулирующего пролиферацию действия на клетки. Для того, чтобы оценить роль FLT4 (VEGFR3) в процессе развития злокачественных новообразований, мы исследовали экспрессию этого гена в ряде опухолей человека. Методом Норзерн блот-гибридизации экспрессия FLT4 (VEGFR3) была исследована в 84 меланомах, 5 мезотелиомах, 5 образцах рака толстого кишечника, 9 раках яичника и 5 образцах рака молочной железы (Табл.III.6). Ни в одном из этих образцов экспрессии FLT4 (VEGFR3) обнаружено не было. Отсутствие детектируемого с помощью этого метода сигнала FLT4 (VEGFR3) указывало на то, что либо этот ген экспрессируется в опухолях человека крайне редко, либо уровень его экспрессии настолько низок, что для его определения необходимо использование более высокочувствительного метода. Поэтому, так же как и при исследовании экспрессии FLT4 (VEGFR3) в культурах клеток, в наших дальнейших исследованиях мы использовали метод RT-PCR. С помощью метода RT-PCR, экспрессия FLT4 (VEGFR3) и его лиганда – фактора роста VEGF-C была исследована в серии патологий щитовидной железы человека, включавшей как злокачественные опухоли, так и доброкачественные аденомы и пролиферативные зобные изменения (Табл. III.7). В этой части работы отдельно исследовалась экспрессия короткой и длинной изоформ гена FLT4 (VEGFR3). Высокая частота экспрессии генов VEGF-C и обеих изоформ FLT4 (VEGFR3) была обнаружена практически во всех исследованных патологиях щитовидной железы человека, за исключением аденокарцином (Рис. III.23-26; Табл.III.8). В аденокарциномах была несколько снижена частота экспрессии VEGF-C (5/8) и в еще большей степени – частота 173 экспрессии FLT4 (VEGFR3), особенно его длинной изоформы, экспрессия которой была найдена всего в 1-й опухоли из 8 исследованных (Табл. III.9). Частота экспрессии короткой изоформы FLT4 (VEGFR3) также была снижена в аденокарциномах (3/8), хотя и не в такой степени как частота экспрессии длинной изоформы. Аналогичные данные о резком снижении частоты экспрессии длинной изоформы в опухолях молочной железы человека были получены Gunningham, et al. [51]. Наши данные, также как и данные работы Gunningham et al., указывают на то, что при озлокачествлении опухолей может нарушаться регуляция экспрессии длинной изоформы FLT4 (VEGFR3). Однако, известно, что обе изоформы считываются с одного и того же гена и являются результатом альтернативного сплайсинга – в области 3’-конца считывается либо экзон, заканчивающийся «стоп»-кодоном TAG и заключающий более короткую транслируемую область, либо экзон, заканчивающийся «стоп»-кодоном ТАА, кодирующий дополнительные 65 аминокислотных озлокачествления остатков. клеток Можно предположить, происходит что нарушение в процессе механизма, регулирующего альтернативный сплайсинг, приводящее к почти полному отсутствию более длинной изоформы FLT4 (VEGFR3). Таким образом, исследование экспрессии генов VEGF-C и FLT4 (VEGFR3), в том числе, его отдельных изоформ, показало, что в аденокарциномах щитовидной железы человека частота экспрессии рецептора FLT4 (VEGFR3), и особенно, его длинной изоформы существенно снижена по сравнению с аденомами и неопухолевыми пролиферативными тиреоидными патологиями. Обнаруженный нами факт снижения частоты экспрессии FLT4 (VEGFR3) в аденокарциномах щитовидной железы человека был достаточно неожиданным и отличал этот рецептор от двух других рецепторов VEGF, экспрессия которых чаще всего повышается в злокачественных опухолях различных локализаций. Поэтому нам 174 представлялось необходимым убедиться в достоверности полученных методом RT-PCR данных, используя метод иммуногистохимического анализа опухолей щитовидной железы человека. Проведенные иммуногистохимические исследования подтведили данные, полученные нами при исследовании экспрессии мРНК FLT4 (VEGFR3) и VEGF-C методом RT-PCR: количество окрашенных антителами к FLT4 (VEGFR3) структур в аденокарциномах было значительно меньше, чем в аденомах и эти количественные различия были статистически значимыми (Табл.III.10,11). При этом необходимо отметить, что в действительности эти различия должны быть еще больше. Прежде всего, использованная нами компьютерная программа рассчитывала количество окрашенных структур не на количество подсчитанных клеток, а на единицу поверхности гистологического среза. Однако, количество клеток, приходящееся на 1 мм2 поверхности гистологического среза в аденомах и в аденокарциномах различается за счет того, что в аденомах, в отличие от аденокарцином, частично сохраняется железистая структура ткани щитовидной железы и поэтому на единицу поверхности среза в аденомах приходится меньшее количество клеток, чем в аденокарциномах. Кроме того, при подсчете положительно окрашенных структур нами были выбраны наиболее интенсивно окрашенные области как в аденомах, так и в аденокарциномах щитовидной железы и при этом не учитывалась гетерогенность распределения окраски в различных образцах. Однако, как это видно из Рис. III.27, в аденокарциномах FLT4 (VEGFR3)- положительные области встречались значительно реже, чем в аденомах, поэтому среднее количество FLT4 (VEGFR3)-окрашенных структур на единицу поверхности в аденокарциномах должно быть еще меньше. Сравнение количества FLT4 (VEGFR3)-положительных структур в опухолях и нормальной окружающей ткани щитовидной железы показало, 175 что в нормальной ткани экспрессия этого рецептора ниже, чем в аденокарциномах и тем более – аденомах. Исследование результатов иммуногистохимического окрашивания гистологических срезов аденом и аденокарцином щитовидной железы антителами к VEGF-C не выявило статистически значимых различий между уровнями экспрессии белка VEGF-C в этих 2-х типах тиреоидных патологий, хотя в аденокарциномах экспрессия VEGF-C была немного выше. Иммуногистохимические данные по экспрессии белка VEGF-C в опухолях щитовидной железы отличаются от данных, полученных нами при изучении экспрессии мРНК этого фактора роста. Такие различия могут быть связаны, например, с различиями в уровне чувствительности 2-х используемых методов. Нельзя также исключить возможности изменения времени жизни мРНК или белка VEGF-C в аденокарциномах. Однако это предположение требует дальнейшего исследования. В работе Bunone G. и соавт. также была исследована методом полуколичественного RT-PCR экспрессия генов FLT4 (VEGFR3), VEGF-C, а также генов Flk1/KDR и VEGF-A в аденомах и аденокарциномах щитовидной железы человека [15]. В этой работе повышенный по сравнению с нормальной тканью уровень экспрессии FLT4 (VEGFR3) был обнаружен в 24% папиллярных аденокарцином, 17% фолликулярных аденокарцином и в 83% медуллярных аденокарцином щитовидной железы, а также в 18% аденом. Экспрессия гена VEGF-C была повышена в 76% папиллярных аденокарцином, 42% фолликулярных аденокарцином и в 83% медуллярных аденокарцином, а также в 6% аденом. Данные Bunone G. и соавт. в целом согласуются с результатами, полученными в нашей работе: во всех типах аденокарцином, за исключением медуллярных, экспрессия FLT4 (VEGFR3) была повышена лишь в небольшом числе (18-24%) случаев. Следует также учесть, что в этой работе исследовалась суммарная экспрессия FLT4 (VEGFR3), а не отдельных его изоформ. В нашей работе при исследовании суммарной 176 экспрессии FLT4 (VEGFR3) в 2 их 8 (25%) аденокарцином интенсивность сигнала также была достаточно высокой. Выявленное в нашей работе снижение частоты экспрессии рецептора FLT4 (VEGFR3) в злокачественных опухолях щитовидной железы, отличающее поведение этого рецептора от 2-х других рецепторов VEGFR, могло указывать на то, что активации лимфангиогенеза, в отличие от стимуляции развития кровеносной системы или ангиогенеза, в этих опухолях не происходит. В связи с этим, представлялось интересным сравнить экспрессию в этих же патологиях FLT4 (VEGFR3), являющегося маркером лимфатических сосудов, с экспрессией известного маркера кровеносных сосудов CD31. Данные, полученные в этой части работы, показали, что, в отличие от FLT4 (VEGFR3), уменьшения экспрессии CD31 в аденокарциномах щитовидной железы обнаружено не было (Табл.III. 13,14). Как частота, так и уровень экспрессии этого маркера кровеносных сосудов в аденокарциномах, аденомах и зобных тиреоидных патологиях существенно не различались (Табл. III. 14-16). Следовательно, полученные нами данные указывают на то, что в злокачественных опухолях щитовидной железы человека происходит специфическое подавление экспрессии рецептора FLT4 (VEGFR3), что может говорить о том, что количество лимфатических сосудов в злокачественных опухолях уменьшается по сравнению с аденомами или зобными патологиями. При этом количество кровеносных сосудов, оцениваемое по экспрессии маркера CD31, существенно не изменяется. Снижение экспрессии рецептора FLT4 (VEGFR3) не только приводит к ингибированию лимфатической системы опухоли, но и может косвенным образом усиливать опухолевый ангиогенез. Оба фактора роста VEGF-C и VEGF-D, взаимодействующие с рецептором FLT4 (VEGFR3), способны также связываться с рецептором VEGFR2 (Flk1/KDR), локализованным на клетках эндотелия кровеносных сосудов и являющимся основным 177 рецептором, передающим сигналы, стимулирующие дифференцировку и пролиферацию клеток. Поэтому при уменьшении количества одного из 2-х рецепторов этих факторов роста (рецептора FLT4 (VEGFR3)) будет усиливаться сигнал через другой из рецепторов, VEGFR2 (Flk1/KDR), что приведет к дополнительной стимуляции роста кровеносных сосудов. Таким образом, в нашей работе был клонирован новый ген, FLT4 (VEGFR3), принадлежащий к семейству РТК, и кодирующий один из рецепторов факторов роста VEGF. Отличительной особенностью этого гена является то, что кодируемый им рецептор локализован преимущественно на клетках эндотелия лимфатических сосудов и играет ключевую роль в регуляции лимфангиогенеза. Ген FLT4 (VEGFR3) кодирует 2 изоформы белка, различающиеся по своему СООН-концу. Ген FLT4 (VEGFR3) экспрессирован в большинстве нормальных тканей мыши, а также в ряде культуральных линий трансформированных клеток человека и грызунов. В нашей работе показано, что могут существовать не эндотелиальные опухолевые клетки, в которых обнаруживается экспрессия гена FLT4 (VEGFR3), и в клетках, ко-экспрессирующих FLT4 (VEGFR3) и его лиганд VEGF-C, FLT4 (VEGFR3)-зависимая сигнальная система может вносить существенный вклад в регуляцию их пролиферации. При исследовании экспрессии FLT4 (VEGFR3) в образцах с различной патологией щитовидной железы человека было показано, что частота экспрессии этого гена в тиреоидных аденокарциномах снижена по сравнению с другими патологиями, что указывает на угнетение лимфатической сосудистой системы в этих опухолях, в отличие от хорошо развитой в них кровеносной системы. Полученные результаты свидетельствуют, что клонированный нами ген дает возможность исследовать изменения, происходящие в лимфатической системе при опухолевой прогрессии, а связанная с кодируемым геном FLT4 (VEGFR3) рецептором сигнальная система может служить мишенью для регуляции размножения опухолевых клеток. 178 ВЫВОДЫ 1. Клонирован принадлежащий новый семейству ген генов, – FLT4 (VEGFR3) кодирующих – рецепторные тирозинкиназы (РТК). Ген FLT4 (VEGFR3) вместе с генами FLT1 (VEGFR1) и Flk1/KDR (VEGFR2) составляет новую подгруппу генов, белковые продукты которых характеризуются 7-ю иммуноглобулинподобными доменами во внеклеточной области. Ген локализован в области q34-35 хромосомы 5 человека. 2. Найдены 2 изоформы гена FLT4 (VEGFR3), экспрессирующиеся в плаценте человека в виде 2-х транскриптов размером 5,8 kb и 4,7 kb. Секвенирование короткой и длинной изоформ гена FLT4 (VEGFR3) показало, что белковый продукт более длинной изоформы этого гена содержит дополнительные 65 амк в области СООН-конца. 3. Частично клонирован ген Flt4 мыши. Показано, что 3’- область гена Flt4 мыши гомологична длинной изоформе гена FLT4 (VEGFR3) человека. Ген Flt4 локализован в области А5-В1 хромосомы 11 мыши. Ген Flt4 экспрессируется в большинстве тканей мыши в виде единственного транскрипта размером 5,8 kb. 4. Частота экспрессии гена FLT4 (VEGFR3) в культивируемых опухолевых клетках невысока (3/7 в клетках гемобластозов и 1/5 в культурах клеток, происходящих из солидных опухолей человека). В единственных ко-экспрессирующих FLT4 (VEGFR3) и его лиганд VEGF-С клетках А549 эта сигнальная система вносит существенный вклад (до 50%) в стимуляцию пролиферации. 179 5. Уровень экспрессии гена FLT4 (VEGFR3) в нормальных и опухолевых тканях человека крайне низок. При исследовании экспрессии гена FLT4 (VEGFR3) в образцах с различной патологией щитовидной железы человека обнаружено существенное снижение частоты и уровня экспрессии короткой и особенно длинной изоформ гена в аденокарциномах по сравнению с аденомами, неопухолевыми пролиферативными и аутоиммунными заболеваниями. Полученные данные указывают на возможность использования экспрессии FLT4 (VEGFR3) в качестве диагностического маркера при некоторых опухолевых патологиях. 6. Иммуногистохимическое окрашивание параллельных срезов аденокарцином щитовидной железы выявило пониженную интенсивность экспрессии в них маркера лимфатических сосудов FLT4 (VEGFR3), но не маркера кровеносных сосудов CD31, свидетельствующую об ингибировании лимфатической, но не кровеносной системы в тиреоидных аденокарциномах. 180 СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ 1. Les genes FLT3 et FLT4, codant pour des recepteurs à tyrosine kinase apparentes aux produits de proto-oncogenes FMS et KIT // Les Journées Curie, Paris, France, Fevrier, 1992, p.18 (соавт. Rosnet O., Galland F., Marchetto S., Pebusque M.-J., Mattei M.G., Courcoul M.A., Dubreuil P., Birnbaum D.) 2. FLT3 and FLT4: receptors related to KIT and VEGFR // Proceedings of the 8th Oncogene Meeting, Frederick, USA, June, 1992, p.74 (соавт. Galland F., Rosnet O., Marchetto S., Pebusque M.-J., deLapeyriere O., Planche J., Courcoul M.A., Dubreuil P., Birg F., Birnbaum D.) 3. Chromosomal localization of FLT4, a novel receptor-type tyrosine kinase gene // Genomics, 1992, v.13, pp.475-478 (соавт. Galland F., Mattei M.-G., Rosnet O., Marchetto S., Birnbaum D.) 4. The FLT4 gene encodes a transmembrane tyrosine kinase rekated to the vascular endothelial growth factor receptor // Oncogene, 1993, v.8, pp. 1233-1240 (соавт. Galland F., Pebusque M.-J., Borg J.-P., Rottapel R., Dubreuil P., Rosnet O.) 5. FLT4 – новый ген семейства рецептороподобных тирозинкиназ –клонирование, экспрессия в опухолях // Материалы I Съезда онкологов России, 1996 г., М., ч.I, с. 82-83 (соавт. Шушанов С.С., Birnbaum D.) 6. Expression of the FLT4/VEGFR3 receptor tyrosine kinase encoding gene in hepatic tumors // Int. J. Oncology, 1996, v.8, pp. 921-924 (соавт. Shushanov S., Adelaide J., Kakpakova E., Abdryashitov R., Stavrovskaya A., Birnbaum D.) 7. VEGFc and FLT4/VEGFcR expression in human thyroid tumors and various thyroid proliferative disorders, and in cell culture // Proceedings of the UICC Cancer Management Meeting, Vienna, 1997, p.58 (соавт. Shushanov S., Bronstein M., Adelaide J., Shatalova L., Kakpakova E., Stavrovskaya A., Birnbaum D.) 181 8. VEGFc expression in various human thyroid diseases // J. Endocrinol. Invest., 1997, v.20, Suppl.2, p.76 (соавт. Bronstein M., Shushanov S., Adelaide J., Shatalova L., Stavrovskaya A., Birnbaum D.) 9. при Возможная роль экспрессии VEGFc и его рецептора FLT4 патологии Международной сигнализация», щитовидной конференции Пущино, 1998, железы человека «Рецепция с.95-96 и // Материалы внутриклеточная (соавт. Шушанов С.С., Бронштейн М.И., Шаталова Л.Д., Ставровская А.А 10. VEGFc modifies tumor cell proliferation in culture // Proceedings of the Int. Conference “Biological basis for antiangiogenic therapy”, 1999, Abstr. F-11 (соавт. Shushanov S.S., Kakpakova E.S., Siemeister G., Barleon B., Martiny-Baron G., Marme D., Birnbaum D., Stavrovskaya A.) 11. Expression of VEGFc and its receptor FLT4 (VEGFR3) in human thyroid diseases // Clinical Cancer Res., v.5, Suppl., 1999, Abstr. 32 (соавт. Shushanov S.S., Stavrovskaya A., Bronstein M., Adelaide J., Geneix J., Jacquemier J., Birnbaum D.) 12. Исследование роли нового ростового фактора VEGFc в канцерогенезе // Материалы симпозиума «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», М., 1999, с.18 (соавт. Шушанов С.С.) 13. Экспрессия нового ростового фактора семейства VEGF (VEGFc) и его рецептора FLT4 при различных патологиях щитовидной железы человека и в клеточных культурах // Цитология, т.41, 1999, с.324 (соавт. Шушанов С.С., Бронштейн М.И., Шаталова Л.Д., Ставровская А.А. 14. VEGFc and VEGFR3 expression in human thyroid pathologies // Int. J. Cancer, v.86, 2000, pp.47-52 (соавт. Shushanov S.S., Bronstein M.I., Adelaide J., Jussila L., Tchipysheva T., Jacquemier J., Stavrovskaya A., Birnbaum D.) 182 15. Сравнение экспрессии маркеров ангиогенеза CD31 и лимфангиогенеза VEGFR3 в опухолях щитовидной железы человека // V Ежегодная российская онкологическая конференция, М., 2001 (соавт. Jacquemier J., Birnbaum D., Ставровская А.А.) 16. сигнальной Изменение системы активности в процессе новообразований // Материалы VEGFc/VEGFR3-зависимой развития злокачественных международного симпозиума «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний», М., 2001, с.7 (соавт. Какпакова Е.С., Шушанов С.С., Шишкин А.А., Ставровская А.А.) 17. Факторы роста эндотелия сосудов (VEGF): сравнительная характеристика VEGFa- и VEGFc-зависимых систем // Цитология, т.43, 2001, с.353 18. Экспрессия мРНК фактора роста эндотелия сосудов VEGFc и двух изоформ его рецептора VEGFR3 в норме и опухолях человека // Вестник РОНЦ РАМН, №1, 2001, с.3-8 (соавт. Шушанов С.С., Шишкин А.А., Губина О.В., Давыдова И.Ю., Мусаткина Е.А., Кобзева В.К., Ставровская А.А.) 19. Ангиогенез опухоли: механизмы, новые подходы к терапии. В кн. «Канцерогенез», М., изд-во «Научный мир», 2001, с. 298-309. 20. Expression of markers of lymphangiogenesis (VEGFR3) and angiogenesis (CD31) in human thyroid tumors // Int. J. Cancer, Suppl. 13, 2002, р.219 (соавт. Jacquemier J., Geneix J., Stavrovskaya A., Birnbaum D.) 21. Изменение регулирующей лимфангиогенез VEGFR3- зависимой сигнальной системы в злокачественных опухолях человека // Вопросы гематологии/ онкологии и иммунопатологии в педиатрии, т.1, №2, с.96 183 ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Ген FLT4 (VEGFR3) человека. Нуклеотидная и полная аминокислотная последовательности короткой изоформы гена FLT4 (VEGFR3) человека. Сравнение аминокислотных последовательностей, соответствующих внеклеточной области белковых продуктов, кодируемых генами FLT4 (VEGFR3), FLT1 (VEGFR1) и KDR/Flk1 (VEGFR2) человека 184 Нуклеотидная последовательность короткой изоформы гена FLT4 (VEGFR3) человека и аминокислотная последовательность кодируемого им белкового продукта ACCCACGCGCAGCGGCCGGAGATGCAGCGG M Q R 30 3 GGCGCCGCGCTGTGCCTGCGACTGTGGCTCTGCCTGGGACTCCTGGACGGCCTGGTGAGT G A A L C L R L W L C L G L L D G L V S 90 23 GACTACTCCATGACCCCCCCGACCTTGAACATCACGGAGGAGTCACACGTCATCGACACC D Y S M T P P T L N I T E E S H V I D T 150 43 GGTGACAGCCTGTCCATCTCCTGCAGGGGACAGCACCCCCTCGAGTGGGCTTGGCCAGGA G D S L S I S C R G Q H P L E W A W P G * GCTCAGGAGGCGCCAGCCACCGGAGACAAGGACAGCGAGGACACGGGGGTGGTGCGAGAC A Q E A P A T G D K D S E D T G V V R D 210 63 270 83 TGCGAGGGCACAGACGCCAGGCCCTACTGCAAGGTGTTGCTGCTGCACGAGGTACATGCC C E G T D A R P Y C K V L L L H E V H A * * AACGACACAGGCAGCTACGTCTGCTACTACAAGTACATCAAGGCACGCATCGAGGGCACC N D T G S Y V C Y Y K Y I K A R I E G T * ACGGCCGCCAGCTCCTACGTGTTCGTGAGAGACTTTGAGCAGCCATTCATCAACAAGCCT T A A S S Y V F V R D F E Q P F I N K P 330 103 GACACGCTCTTGGTCAACAGGAAGGACGCCATGTGGGTGCCCTGTCTGGTGTCCATCCCC D T L L V N R K D A M W V P C L V S I P * GGCCTCAATGTCACGCTGCGCTCGCAAAGCTCGGTGCTGTGGCCAGACGGGCAGGAGGTG G L N V T L R S Q S S V L W P D G Q E V 510 163 GTGTGGGATGACCGGCGGGGCATGCTCGTGTCCACGCCACTGCTGCACGATGCCCTGTAC V W D D R R G M L V S T P L L H D A L Y 630 203 CTGCAGTGCGAGACCACCTGGGGAGACCAGGACTTCCTTTCCAACCCCTTCCTGGTGCAC L Q C E T T W G D Q D F L S N P F L V H * ATCACAGGCAACGAGCTCTATGACATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTG I T G N E L Y D I Q L L P R K S L E L L 690 223 390 123 450 143 570 183 750 243 GTAGGGGAGAAGCTGGTCCTCAACTGCACCGTGTGGGCTGAGTTTAACTCAGGTGTCACC V G E K L V L N C T V W A E F N S G V T * TTTGACTGGGACTACCCAGGGAAGCAGGCAGAGCGGGGTAAGTGGGTGCCCGAGCGACGC F D W D Y P G K Q A E R G K W V P E R R 810 263 TCCCAGCAGACCCACACAGAACTCTCCAGCATCCTGACCATCCACAACGTCAGCCAGCAC S Q Q T H T E L S S I L T I H N V S Q H 930 303 GACCTGGGCTCGTATGTGTGCAAGGCCAACAACGGCATCCAGCGATTTCGGGAGAGCACC D L G S Y V C K A N N G I Q R F R E S T * GAGGTCATTGTGCATGAAAATCCCTTCATCAGCGTCGAGTGGCTCAAAGGACCCATCCTG E V I V H E N P F I S V E W L K G P I L 990 323 1050 343 GAGGCCACGGCAGGAGACGAGCTGGTGAAGCTGCCCGTGAAGCTGGCAGCGTACCCCCCG E A T A G D E L V K L P V K L A A Y P P 1110 363 870 283 185 CCCGAGTTCCAGTGGTACAAGGATGGAAAGGCACTGTCCGGGCGCCACAGTCCACATGCC P E F Q W Y K D G K A L S G R H S P H A 1170 383 CTGGTGCTCAAGGAGGTGACAGAGGCCAGCACAGGCACCTACACCCTCGCCCTGTGGAAC L V L K E V T E A S T G T Y T L A L W N 1230 403 TCCGCTGCTGGCCTGAGGCGCAACATCAGCCTGGAGCTGGTGGTGAATGTGCCCCCCCAG S A A G L R R N I S L E L V V N V P P Q 1290 423 ATACATGAGAAGGAGGCCTCCTCCCCCAGCATCTACTCGCGTCACAGCCGCCAGGCCCTC I H E K E A S S P S I Y S R H S R Q A L 1350 443 ACCTGCACGGCCTACGGGGTGCCCCTGCCTCTCAGCATCCAGTGGCACTGGCGGCCCTGG T C T A Y G V P L P L S I Q W H W R P W * ACACCCTGCAAGATGTTTGCCCAGCGTAGTCTCCGGCGGCGGCAGCAGCAAGACCTCATG T P C K M F A Q R S L R R R Q Q Q D L M * CCACAGTGCCGTGACTGGAGGGCGGTGACCACGCAGGATGCCGTGAACCCCATCGAGAGC P Q C R D W R A V T T Q D A V N P I E S * CTGGACACCTGGACCGAGTTTGTGGAGGGAAAGAATAAGACTGTGAGCAAGCTGGTGATC L D T W T E F V E G K N K T V S K L V I 1410 463 1470 483 1530 503 1590 523 CAGAATGCCAACGTGTCTGCCATGTACAAGTGTGTGGTCTCCAACAAGGTGGGCCAGGAT Q N A N V S A M Y K C V V S N K V G Q D * GAGCGGCTCATCTACTTCTATGTGACCACCATCCCCGACGGCTTCACCATCGAATCCAAG E R L I Y F Y V T T I P D G F T I E S K 1650 543 CCATCCGAGGAGCTACTAGAGGGCCAGCCGGTGCTCCTGAGCTGCCAAGCCGACAGCTAC P S E E L L E G Q P V L L S C Q A D S Y * AAGTACGAGCATCTGCGCTGGTACCGCCTCAACCTGTCCACGCTGCACGATGCGCACGGG K Y E H L R W Y R L N L S T L H D A H G 1770 583 AACCCGCTTCTGCTCGACTGCAAGAACGTGCATCTGTTCGCCACCCCTCTGGCCGCCAGC N P L L L D C K N V H L F A T P L A A S * CTGGAGGAGGTGGCACCTGGGGCGCGCCACGCCACGCTCAGCCTGAGTATCCCCCGCGTC L E E V A P G A R H A T L S L S I P R V 1890 623 GCGCCCGAGCACGAGGGCCACTATGTGTGCGAAGTGCAAGACCGGCGCAGCCATGACAAG A P E H E G H Y V C E V Q D R R S H D K * CACTGCCACAAGAAGTACCTGTCGGTGCAGGCCCTGGAAGCCCCTCGGCTCACGCAGAAC H C H K K Y L S V Q A L E A P R L T Q N * TTGACCGACCTCCTGGTGAACGTGAGCGACTCGCTGGAGATGCAGTGCTTGGTGGCCGGA L T D L L V N V S D S L E M Q C L V A G * GCGCACGCGCCCAGCATCGTGTGGTACAAAGACGAGAGGCTGCTGGAGGAAAAGTCTGGA A H A P S I V W Y K D E R L L E E K S G 2010 663 1710 563 1830 603 1950 643 2070 683 2130 703 2190 723 GTCGACTTGGCGGACTCCAACCAGAAGCTGAGCATCCAGCGCGTGCGCGAGGAGGATGCG V D L A D S N Q K L S I Q R V R E E D A 2250 743 GGACCGTATCTGTGCAGCGTGTGCAGACCCAAGGGCTGCGTCAACTCCTCCGCCAGCGTG G P Y L C S V C R P K G C V N S S A S V * * * 2310 763 186 GCCGTGGAAGGCTCCGAGGATAAGGGCAGCATGGAGATCGTGATCCTTGTCGGTACCGGC A V E G S E D K G S M E I V I L V G T G 2370 783 GTCATCGCTGTCTTCTTCTGGGTCCTCCTCCTCCTCATCTTCTGTAACATGAGGAGGCCG V I A V F F W V L L L L I F C N M R R P 2430 803 GCCCACGCAGACATCAAGACGGGCTACCTGTCCATCATCATGGACCCCGGGGAGGTGCCT A H A D I K T G Y L S I I M D P G E V P 2490 823 CTGGAGGAGCAATGCGAATACCTGTCCTACGATGCCAGCCAGTGGGAATTCCCCCGAGAG L E E Q C E Y L S Y D A S Q W E F P R E 2550 843 CGGCTGCACCTGGGGAGAGTGCTCGGCTACGGCGCCTTCGGGAAGGTGGTGGAAGCCTCC R L H L G R V L G Y G A F G K V V E A S 2610 863 GCTTTCGGCATCCACAAGGGCAGCAGCTGTGACACCGTGGCCGTGAAAATGCTGAAAGAG A F G I H K G S S C D T V A V K M L K E 2670 883 GGCGCCACGGCCAGCGAGCAGCGCGCGCTGATGTCGGAGCTCAAGATCCTCATTCACATC G A T A S E Q R A L M S E L K I L I H I 2730 903 GGCAACCACCTCAACGTGGTCAACCTCCTCGGGGCGTGCACCAAGCCGCAGGGCCCCCTC G N H L N V V N L L G A C T K P Q G P L 2790 923 ATGGTGATCGTGGAGTTCTGCAAGTACGGCAACCTCTCCAACTTCCTGCGCGCCAAGCGG M V I V E F C K Y G N L S N F L R A K R 2850 943 GACGCCTTCAGCCCCTGCGCGGAGAAGTCTCCCGAGCAGCGCGGACGCTTCCGCGCCATG D A F S P C A E K S P E Q R G R F R A M 2910 963 GTGGAGCTCGCCAGGCTGGATCGGAGGCGGCCGGGGAGCAGCGACAGGGTCCTCTTCGCG V E L A R L D R R R P G S S D R V L F A 2970 983 CGGTTCTCGAAGACCGAGGGCGGAGCGAGGCGGGCTTCTCCAGACCAAGAAGCTGAGGAC R F S K T E G G A R R A S P D Q E A E D 3030 1003 CTGTGGCTGAGCCCGCTGACCATGGAAGATCTTGTCTGCTACAGCTTCCAGGTGGCCAGA L W L S P L T M E D L V C Y S F Q V A R 3090 1023 GGGATGGAGTTCCTGGCTTCCCGAAAGTGCATCCACAGAGACCTGGCTGCTCGGAACATT G M E F L A S R K C I H R D L A A R N I 3150 1043 CTGCTGTCGGAAAGCGACGTGGTGAAGATCTGTGACTTTGGCCTTGCCCGGGACATCTAC L L S E S D V V K I C D F G L A R D I Y 3210 1063 AAAGACCCCGACTACGTCCGCAAGGGCAGTGCCCGGCTGCCCCTGAAGTGGATGGCCCCT K D P D Y V R K G S A R L P L K W M A P 3270 1083 GAAAGCATCTTCGACAAGGTGTACACCACGCAGAGTGACGTGTGGTCCTTTGGGGTGCTT E S I F D K V Y T T Q S D V W S F G V L 3330 1103 CTCTGGGAGATCTTCTCTCTGGGGGCCTCCCCGTACCCTGGGGTGCAGATCAATGAGGAG L W E I F S L G A S P Y P G V Q I N E E 3390 1123 TTCTGCCAGCGCGTGAGAGACGGCACAAGGATGAGGGCCCCGGAGCTGGCCACTCCCGCC F C Q R V R D G T R M R A P E L A T P A 3450 1143 ATACGCCACATCATGCTGAACTGCTGGTCCGGAGACCCCAAGGCGAGACCTGCATTCTCG I R H I M L N C W S G D P K A R P A F S 3510 1163 187 GACCTGGTGGAGATCCTGGGGGACCTGCTCCAGGGCAGGGGCCTGCAAGAGGAAGAGGAG D L V E I L G D L L Q G R G L Q E E E E 3570 1183 GTCTGCATGGCCCCGCGCAGCTCTCAGAGCTCAGAAGAGGGCAGCTTCTCGCAGGTGTCC V C M A P R S S Q S S E E G S F S Q V S 3630 1203 ACCATGGCCCTACACATCGCCCAGGCTGACGCTGAGGACAGCCCGCCAAGCCTGCAGCGC T M A L H I A Q A D A E D S P P S L Q R 3690 1223 CACAGCCTGGCCGCCAGGTATTACAACTGGGTGTCCTTTCCCGGGTGCCTGGCCAGAGGG H S L A A R Y Y N W V S F P G C L A R G 3750 1243 GCTGAGACCCGTGGTTCCTCCAGGATGAAGACATTTGAGGAATTCCCCATGACCCCAACG A E T R G S S R M K T F E E F P M T P T 3810 1263 ACCTACAAAGGCTCTGTGGACAACCAGACAGACAGTGGGATGGTGCTGGCCTCGGAGGAG T Y K G S V D N Q T D S G M V L A S E E 3870 1283 TTTGAGCAGATAGAGAGCAGGCATAGACAAGAAAGCGGCTTCAGGTAGCTGAAGCAGAGA F E Q I E S R H R Q E S G F R --- 3930 1298 GAGAGAAGGCAGCATACGTCAGCATTTTCTTCTCTGCACTTATAAGAAAGATCAAAGACT TTAAGACTTTCGCTATTTCTTCTACTGCTATCTACTACAAACTTCAAAGAGGAACCAGGA GGACAAGAGGAGCATGAAAGTGGACAAGGAGTGTGACCACTGAAGCACCACAGGGAGGGG TTAGGCCTCCGGATGACTGCGGGCAGGCCTGGATAATATCCAGCCTCCCACAAGAAGCTG GTGGAGCAGAGTGTTCCCTGACTCCTCCAAGGAAAGGGAGACGCCCTTTCATGGTCTGCT GAGTAACAGGTGCCTTCCCAGACACTGGCGTTACTGCTTGACCAAAGAGCCCTCAAGCGG CCCTTATGCCAGCGTGACAGAGGGCTCACCTCTTGCCTTCTAGGTCACTTCTCACAATGT CCCTTCAGCACCTGACCCTGTGCCCGCCGATTATTCCTTGGTAATATGAGTAATACATCA AAGAGTAGTATTAAAAGCTAATTAATCATGTTTATAAAAA 3990 4050 4110 4170 4230 4290 4350 4410 4450 Подчеркнуты кодируемые геном FLT4 (VEGFR3) области сигнального пептида и трансмембранного домена; знаком * отмечены консервативно сохраняющиеся цистеины. 188 1.2. Сравнение аминокислотных последовательностей внеклеточных иммуноглобулинподобных доменов, кодируемых генами FLT4 (VEGFR3), FLT1 (VEGFR1) и FMS FLT4 FLT1 FMS consensus IG-1 MQRGAALCLRLWLCLG.LLDGLVSDYSMTPPTLNITEESHVIDT.GDSLS 48 MVSYWDTGVLLCALLSCLLLTGSSSGSKLKDPELSLKGTQHIMQAGQTLH 50 M....GPGVLL...L..LLVATAWHGQGIPVIEPSVPEL.VVKP.GATVT 39 M------GVLL---L--LL----S-GS--P--E-S--E--VI---G-TL- FLT4 FLT1 FMS consensus ISCRGQHPLEWAWPGAQEAPATGDKDSEDTGVVRDCEGTDARPYCKVLLL LQCRGEAAHKWSLPE......MVSKESERLSITKSACGRNGKQFCSTLTL LRCVGNGSVEWDGPASPHWTLYSDGSS..................SILST L-CRG----EW--P---------DK-SE----------------CS-L-L # 98 94 71 FLT4 FLT1 FMS consensus HEVHANDTGSYVCYYKYIKARIEGTTAASSYVFVRDFEQPFINK....PD NTAQANHTGFYSCKYLAVPTSKKKETESAIYIFISDTGRPFVEMYSEIPE NNATFQNTGTYRCT....EPGDPLGGSAAIHLYVKDPARPW....NVLAQ N-A-AN-TG-Y-C-Y----------T-AAIY-FV-D--RPF-------P# 144 144 113 FLT4 FLT1 FMS consensus FLT4 FLT1 FMS consensus FLT4 FLT1 FMS consensus FLT4 FLT1 FMS consensus IG-II TLLVNRKDAMWVPCLVSIPGLN..VTLRS.QSSVLWPDGQEVVWDDRRGM IIHMTEGRELVIPCRVTSPNIT..VTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGF EVVVFEDQDALLPCLLTDPVLEAGVSLVRVRGRPLMRHTN.YSFSPWHGF ---V-E------PCL-T-P-L---VTL-------L-PDG----WD-R-GF # LVSTPLLHDALYLQCETTWGDQDFLSNPFLVHITGNELYDIQLLPRKSLE IISNATYKEIGLLTCEAT.VNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVQISTPRPVK TIHRAKFIQSQDYQCSALMGGRKVMSISIRLKVQ.KVIPGPPALTLVPAE -IS-A-------LQCEAT-G-----S---L-H-Q-N-I-D-Q-LT--P-E # IG-III LLV..GEKLVLNCTVWAEFNSGVTFDWDYPGKQAERGKWVPERRSQQTHT LLR..GHTLVLNCTATTPLNTRVQMTWSYPDEKNKRAS..VRRRIDQSNS LVRIRGEAAQIVCSAS...SVDVNFD.VFLQHNNTKLA.IPQQSDFHNNR LLR--GE-LVLNCTA----N--V-FDW-YP---N-R----P-RR--Q-N# ELS...SILTIHNVSQHDLGSYVCKANNGIQRFRESTEVIVHENPFISVE HANIFYSVLTIDKMQNKDKGLYTCRVRSGPSFKSVNTSVHIYDKAFITVK YQKVL..TLNLDQVDFQHAGNYSCVASNVQGKHSTSMFFRVVESAYLNLS ------S-LTID-----D-G-Y-C-A-NG----S-ST-V-V-E-AF--V# FLT4 FLT1 FMS consensus IG-IV WLKGPILEATAGDELVKLPVKLAAYPP.PEFQWYKDGKALSGRHSPH... HRKQQVLETVAGKRSYRLSMKVKAFPS.PEVVWLKDGLPATEKSARYLT. SEQNLIQEVTVGEGL.NLKVMVEAYPGLQGFNWTYLGPFSDHQPEPKLAN --K--ILE-TAG--L--L-VKV-AYP--PEF-W-KDG--------P-L-- FLT4 FLT1 FMS consensus ...........ALVLKEVTEASTGTYTLALWNSAAGLRRNISLELVVNVP ........RGYSLIIKDVTEEDAGNYTILLSIKQSNVFKNLTATLIVNVK ATTKDTYRHTFTLSLPRLKPSEAGRYSFL..ARNPGGWRALTFELTLRYP ------------L-LK-VTE--AG-YT-LL-----G--RNLT--L-VNVP 191 192 162 241 241 211 289 287 256 336 337 304 382 385 353 421 427 401 189 FLT4 FLT1 FMS consensus IG-V PQIHEKEASS...PSIYSRHSRQALTCTAYGVPLPLSIQWHWRPW....T PQIYEKAVSSFPDPALYPLGSRQILTCTAYGIPQP.TIKWFWHPCNHNHS PEV..SVIWTF.......INGSGTLLCAASGYPQP.NVTWL..QCS.GHT PQI-EK--SS---P--Y---SRQ-LTCTAYG-PQP--I-W-W-PC---HT # FLT4 FLT1 FMS сonsensus P.CKMFAQRSLRRRQQQDLMPQCRDWRAVTTQDAVNPIESLDTWTEFVEG EARCDFCS.NNEESFILD...........ADSNMGNRIESITQRMAIIEG D.RCDEAQ.VLQ...................VWDDPYPEVLSQEPFH... --RCDFAQ--L------D-----------------N-IESL-Q-----EG 513 514 464 FLT4 FLT1 FMS consensus KNKTVSKLVIQNANVSAMYKCVVSNKVGQDERLIYFYVTTIPDGFTI..E KNKMASTLVVADSRISGIYICIASNKVGTVGRNISFYITDVPNGFHVNLE KVTVQSLLTVETLEHNQTYECRAHNSVGSGSWAFIPISAGAHTHPPD..E KNK--S-LVV-----S--Y-C-ASNKVG---R-I-FY-T--P-GF----E # 561 564 512 FLT4 FLT1 FMS consensus FLT4 FLT1 FMS consensus FLT4 FLT1 FMS consensus IG-VI SKPSEELLEGQPVLLSCQADSYKYEHLRWYRLNLSTLHDAHGNPLLLDCK KMPTE....GEDLKLSCTVNKFLYRDVTW...............ILL..R .................................................. --P-E----G----LSC------Y----W----------------LL--# NVHLFATPLAASLEEVAPGARHA.TLSLSIPRVAPEHEGHYVCEVQDRRS TVNNRTMHYSISKQKMAITKEHSITLNLTIMNVSLQDSGTYACRARNVYT .................................................. -V---------S----A----H--TL-L-I--V-----G-Y-C------# IG-VII HDKHCHKKYLSVQALEAPRLTQNLTDLLVNVSDSLEMQCLVAGAHAPSIV GEEILQKKEITIRDQEAPYLLRNLSDHTVAISSSTTLDCHANGVPEPQIT .................................................. ------KK-------EAP-L--NL-D--V--S-S----C---G---P-I# FLT4 FLT1 FMS consensus WYKDERLLEEKSGVDLADSNQKLSIQRVREEDAGPYLCSVCRPKGCVNSS WFKNNHKIQQEPGIILGPGSSTLFIERVTEEDEGVYHCKATNQKGSVESS .................................................. W-K---------G--L------L-I-RV-EED-G-Y-C-----KG-V-SS # FTL4 FLT1 FMS consensus ASVAVEGSEDKGSME AYLTVQGTSDKSNLE ............... A---V-G--DK---E 464 476 438 611 593 660 643 710 693 760 743 775 758 Над аминокислотной последовательностью FLT4 (VEGFR3) отмечено начало каждого из 7 ИГ-подобных доменов; # - пары цистеинов, присутствующие во всех ИГ-подобных доменах, за исключением IV-го, которые предположительно участвуют в формировании ИГ-подобной петли. 190 1.3. Сравнение аминокислотных последовательностей внеклеточных иммуноглобулинподобных доменов, кодируемых генами FLT4 (VEGFR3) и KDR/Flk1 (VEGFR2) человека FLT4 KDR consensus MQRGAALCLRLWLCLGLLDGLVSDYSMT..PPTLNITEESHVIDT MESKALLAVALWFCVETRAASVGLPGDFLHPPKLSTQKDILTILA M---A-L---LW-C-------V--------PP-L--------I-- FLT4 KDR consensus IG-1 GDSLSISCRGQHPLEWAWPGAQEAPATGDKDSEDTGVVRDCEGTDARPYC NTTLQITCRGQRDLDWLWPNAQRDSEERVLVTECGGGDSIFCKTLTIPRV ---L-I-CRGQ--L-W-WP-AQ----------E--G-------T---P-- FLT4 KDR consensus KVLLLHEVHANDTGSYVCYYKYIKARIEGTTAASSYVFVRDFEQPFINKP VG........NDTGAYKCSYRDVDI......ASTVYVYVRDYRSPFIASV ----------NDTG-Y-C-Y-----------A---YV-V-D---PFI--- FLT4 KDR consensus IG-II DTLLV......NRKDAMWVPCLVSIPGLNVTLRSQSSVLW..PDGQEVVW SDQHGIVYITENKNKTVVIPCRGSISNLNVSLCARYPEKRFVPDGNRISW -----------N-------PC--SI--LNV-L----------PDG----W FLT4 KDR consensus DDRRGMLVSTPLLHDALYLQCETTWGDQDFLSNPFLVHITGNELYDIQLL DSEIGFTLPSYMISYAGMVFCEAKINDETYQSIMYIVVVVGYRIYDVILS D---G----------A----CE----D----S----V---G---YD--L- FLT4 KDR consensus IG-III PRKSLELLVGEKLVLNCTVWAEFNSGVTFDWDYPGKQAERGKWVPERRSQ PPHEIELSAGEKLVLNCTARTELNVGLDFTWHSPPSKSHHKKIVNRDVKP P----EL--GEKLVLNCT---E-N-G--F-W--P-------K-V------ FLT4 KDR consensus QTHTELS...SILTIHNVSQHDLGSYVCKANNGIQRFRESTEVIVHENPF FPGTVAKMFLSTLTIESVTKSDQGEYTCVASSGRMIKRNRTFVRVHTKPF ---T------S-LTI--V---D-G-Y-C-A--G-------T-V-VH--PF FLT4 KDR consensus IG-IV ISVEW.LKGPILEATAGDELVKLPVKLAAYPPPEFQWYKDGKALSGRHSP IAFGSGMKKSLVEATVGSQ.VRIPVKYLSYPAPDIKWYRNGRPIESNYTM I------K----EAT-G---V--PVK---YP-P---WY--G--------- FLT4 KDR consensus HA...LVLKEVTEASTGTYTLALWNSAAGLRRNISLELVVNVPPQIHEKE IVGDELTIMEVTERDAGNYTVILTNPISMEKQSHMVSLVVNVPPQIGEKA -----L---EVTE---G-YT--L-N------------LVVNVPPQI-EK- FLT4 KDR consensus IG-V ASSPS.IYSRHSRQALTCTAYGVPLPLSIQWHWRPWTPCKMFA.QRSLRR LISPMDSYQYGTMQTLTCTVYANPPLHHIQWYWQLEEACSYRPGQTSPYA --SP---Y-----Q-LTCT-Y--P----IQW-W-----C-----Q-S--- FLT4 KDR consensus RQQQDLMPQCRDWRAVTTQDAVNPIESLDTWTEFVEGKNKTVSKLVIQNA .........CKEWRHVEDFQGGNKIEVTKNQYALIEGKNKTVSTLVIQAA ---------C--WR-V------N-IE---------EGKNKTVS-LVIQ-A 43 45 93 95 143 131 185 181 235 231 285 281 332 331 381 380 428 430 476 480 526 521 191 FLT4 KDR consensus IG-VI NVSAMYKCVVSNKVGQDERLIYFYVTTIPDGFTIESKPSEELLEGQPVLL NVSALYKCEAINKAGRGERVISFHVIRGPEITVQPAAQPTEQES...VSL NVSA-YKC---NK-G--ER-I-F-V---P-G---------E------V-L FLT4 KDR consensus SCQADSYKYEHLRWYRLNLSTLHDAHGNPLLLDCKNVHLFATPLAASLEE LCTADRNTFENLTWYKLGSQATSVHMGESLTPVCKNLDALWKLNGTMFSN -C-AD----E-L-WY-L---------G--L---CKN-------------- 626 618 FLT4 KDR consensus VAPGARH.ATLSLSIPRVAPEHEGHYVCEVQDRRSHDKHCHKKYLSVQAL STNDILIVAFQNAS.....LQDQGDYVCSAQDKKTKKRHCLVKQLIILER --------A----S---------G-YVC--QD------HC--K-L----- 675 663 FLT4 KDR consensus IG-VII EAPRLTQNLTDLLVNVSDSLEMQCLVAGAHAPSIVWYKDERLLEEKSGVD MAPMITGNLENQTTTIGETIEVTCPASGNPTPHITWFKDNETLVEDSGIV --P--T-NL-----------E--C---G---P-I-W-KD---L-E-SG-- FLT4 KDR consensus LADSNQKLSIQRVREEDAGPYLCSVCRPKGCVNSSASVAVEGSEDKGSME LRDGNRNLTIRRVRKEDGGLYTCQACNVLGCARAETLFIIEGAQEKTNLE L-D-N--L-I-RVR-ED-G-Y-C--C---GC---------EG---K---E 576 568 725 713 775 763 Над аминокислотной последовательностью FLT4 (VEGFR3) отмечено начало каждого из 7 ИГ-подобных доменов. 192 ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Схематическое изображение и сиквенс исследованных клонов гена Flt4 мыши. 193 2.1. Сиквенс клона Mu-Flt42. TGC ATT CAC AGA GAC CTG GCT GCT CGG AAC ATC CTA CTG TCA GAA AGT GAC C I H R D L A A R N I L L S E C D 51 17 ATA GTC AAG ATC TGC GAC TTT GGC CTC GCT CGG GAG ATC TAC AAA GAC CCC I V K I C D F G L A R D I Y K D P 102 34 GAC TAT GTC CGA AAG GGC D Y V R K G 120 40 2.2. Сиквенс клона MuPP. GCA GCT GGT CTG AGG CAA AAC ATC AGT CTG GAG CTG GTG GTG AAT GTG CCT A A G L R Q N I S L E L V V N V P 51 17 CCT CAC ATC CAC GAA AAG GAA GCC TCT TCA CCC AGC ATC TAC TCC CGC CAC P H I H E K E A S S P S I Y S R H 102 34 AGT CGC CAG ACC CTC ACC TGC ACC GCC TAT GGA GTA CCC CAA CCC CTC AGT S R Q T L T C T A Y G V P Q P L S 153 51 GTC CAG TGG CAC TGG AGG CCC TGG ACA CCC TGC AAG ACG TTT GCC CAG CGC V Q W H W R P W T P C K T F A Q R 204 68 AGC CTC CGG AGG CGG CAG CAG CGG GAT GGC ATG CCA CAG TGC CGA GAC TGG S L R R R Q Q R D G M P Q C R D W 255 85 AAG GAG GTG ACC ACT CAG GAT GCT GTG AAC CCC ATC GAG AGT CTG GAC AGC K E V T T Q D A V N P I E S L D S 306 102 2.3. Сиквенс клона MuPF. CTG CAG TGC GAG ACC ACC TGG GGT GAC CAG AAC TTC CTT TCC AAT CTC TTC L Q C E T T W G D Q N F L S N L F 51 17 GTC GTG CAC ATC ACA GGC AAT GAG CTC TAT GAC ATC CAG CTG TAC CCC AAG V V H I T G N E L Y D I Q L Y P K 102 34 AAG TCA ATG GAG CTG TTG GTT GGA GAG AAG CTG GTT TTG AAC TGT ACA GTG K S M E L L V G E K L V L N C T V 153 51 TGG GCT GAG TTC GAC TCA GGT GTC ACC TTC GAC TGG GAT TAT CCA GGG AAG W A E F D S G V T F D W D Y P G K 204 68 CAG GCA GAG CGG GCT AAG TGG GTA CCT GAG CGG CGT TCC CAG CAG ACC CAC Q A E R A K W V P E R R S Q Q T H 255 85 ACA GAA CTC TCC AGC ATC CTG ACC ATC CAC AAT GTC AGC CAG AAT GAC CTG T E L S S I L T I H N V S Q N D L 306 102 GGC CCC TAT GTG TGT GAG GCC AAC AAT GGG ATT CAG CGG TTC CGG GAA AGC G P Y V C E A N N G I Q R F R E S 357 119 2 Подчеркнуты области, кодирующие фрагменты 1-го и 2-го тирозинкиназных доменов. 194 ACA GAG GTC ATT GTG CAC GAA AAG CCC TTC ATC AGT GTC GAG TGG CTC AAA T E V I V H E K P F I S V E W L K 408 136 GGA CCT GTC CTG GAG GCC ACA GCC GGT GAC GAG CTG GTG AAG CTA CCC GTG G P V L E A T A G D E L V K L P V 459 153 AAG CTG GCA GCT TAT CCC CCA CCG GAG TTC CAA TGG TAC AAG GAC AGA AAG K L A A Y P P P E F Q W Y K D R K 510 170 GCA GTG ACT GGG CGC CAC AAT CCC CAT GCT CTG GTG CTC AAA GAG GTG ACC A V T G R H N P H A L V L K E V T 561 187 GAG GCC AGC GCA GGG GTC TAC ACT CTC GCC CTG TGG AAC TCT GCA GCT E A S A G V Y T L A L W N S A A 611 203 2.4. Частичный сиквенс клона SMT12. 2.4.1. 5′′-область клона SMT12. AAA GGC AGC AGC TGT GAC ACC GTG GCT GTG AAG ATG CTG AAA GAG GGC GCT K G S S C D T V A V K M L K E G A 51 17 ACT GCC AGC GAG CAC CGT GCC CTG ATG TCG GAG CTC AAG ATC CTA ATT CAC T A S E H R A L M S E L K I L I H 102 34 ATC GGC AAC CAT CTC AAC GTG GTC AAC CTC CTA GGG GCG TGC ACC AAG CCC 153 I G N H L N V V N L L G A C T K P 51 AAC GGC CCT CTC ATG GTG ATC GTG GAG TTT TGC AAA TAC GGC AAC CTC TCC N G P L M V I V E F C K Y G N L S 204 68 AAC TTC TTG CGT GTC AAG CGG GAC ACG TTC AAC CCC TAC GCG GAG AAG TCT N F L R V K R D T F N P Y A E K S 255 85 CCG GAG CAA CGC AGG CGC TTC CGC GCC ATG GTA GAA P E Q R R R F R A M V E 291 97 2.4.2. Клон SMT12s. AGC TCC GAG GAG GAT GGC TTC ATG CAG GCA TCC ACC ACA GCT CTA CAT ATC S S E E D G F M Q A S T T A L H I 51 17 ACC GAA GCA GAC GCT GAT GAT AGT CCA CCC AGC ATG CAT TGC CAC AGC CTG T E A D A D D S P P S M H C H S L 102 34 GCA GCC AGA TAT TAC AAC TGT GTG TCC TTT CCT GGG CGC CTG GCC AGA GGC 153 A A R Y Y N C V S F P G R L A R G 51 ACT AAG ACT CCA GGC TCT TCC AGG ATG AAG ACA TTT GAA GAA TTG CCC ATG T K T P G S S R M K T F E E L P M 204 68 ACC CCT ACA ACC TAC AAA GCC TCC ATG GAT AAC CAG ACA GAC AGC GGG ATG T P T T Y K A S M D N Q T D S G M 255 85 GTG CTG GCC TCA GAA GAG TTT GAG GAG CTA GAA AGC AGG CAT AGA CCA GAA 306 195 V L A S E E F E E L E S R H R P E 102 GGC AGC TTC AGC TGT AAA GGT CCT GGC CAG CAC ATG GAT ATT CCC AGA GGA G S F S C K G P G Q H M D I P R G 357 119 CAC CCT GAC CCC CAG GGG AGG CGG CGA CGG CCC ACT CAA GGG GCA CAA GGA H P D P Q G R R R R P T Q G A Q G 408 136 GGC AAG GTG TTT TAT AAC AAC GAG TAT GGG GAG GTC TCC CAG CCA TGT ACA G K V F Y N N E Y G E V S Q P T C 459 153 GAA GGT GAC TGC TGC CCG TCT GCT GGC TCC ACC TTC TTC GCA GAC AGC AGC E G D C C P S A G S T F F A D S S 510 170 TAC TAA GAACATGTGGCAAGGCCTCCTGCCCGTGTGCTGCAАCCGGCTCTGACAGCTG Y --- 568 171 GGCTGGAGGCCCAGGTTGGGAATTCAACTCCTСTGACTCCAGCCCTGGAGGTGTTTTATG 628 TCCCACCCCCACTACAGCCTCCAТATCCAGGAAGAGTCAAACTCAGACAACGAGGGCTC 687 ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Анализ клона cos ES.4-1. 197 В качестве иллюстрации методики клонирования приведем анализ одного из клонов, cos ES.4-1, содержащего последовательности гена Flt4 мыши. Клон cos ES.4-1 был получен в результате скрининга геномной клонотеки эмбриональных стволовых клеток мыши (ES) с помощью зонда 18u, представляющего собой Eco RI-фрагмент клона SHP 18, кодирующий внеклеточную область рецептора FLT4 (VEGFR3) человека (Рис. III.8). Плазмида cos ES.4-1 содержит вставку размером 45 kbp. Прежде всего необходимо было выявить те фрагменты вставки, которые содержат последовательности, соответствующие кодирующей области гена Flt4. Для выявления таких фрагментов был проведен рестриктный анализ ДНК вставки cos ES.4-1. Для этого были использованы рестриктаза EcoRI и комбинация EcoRI и одной из следующих рестриктаз: BamHI, BglII, DraII, EagI, HindIII, KpnI, PstI, PvuII, SacI, SalI, SmaI, XbaI, XhoI. Анализ получившихся фрагментов ДНК проводился с помощью электрофореза в 0,8 % агарозном геле (Рис.1). Рис. 1. Рестриктный анализ клона cos ES.4-1. 1 – маркеры; 2-15 – фрагменты, полученные в результате обработки рестриктазами: 2 Eco RI; 3 Eco RI +Bam HI; 4 Eco RI +BglII; 5 Eco RI +DraII; 6 Eco RI + EagI; 7 Eco RI +Hind III; 8 Eco RI +KpnI; 9 Eco RI +PstI; 10 Eco RI + PvuII; 11 198 Eco RI +SacI; 12 Eco RI +SalI; 13 Eco RI +SmaI; 14 Eco RI + XbaI; 15 Eco RI +XhoI. Далее был проведен блоттинг геля и гибридизация полученного фильтра меченым по 32 Р зондом 18u. Результаты гибридизации представлены на Рис.2. Рис. 2. Результаты блот-гибридизация геля, представленного на Рис. 1. 1-14 – фрагменты, полученные в результате обработки рестриктазами: 1 Eco RI; 2 Eco RI +Bam HI; 3 Eco RI +BglII; 4 Eco RI +DraII; 5 Eco RI + EagI; 6 Eco RI +Hind III; 7 Eco RI +KpnI; 8 Eco RI +PstI; 9 Eco RI + PvuII; 10 Eco RI +SacI; 11 Eco RI +SalI; 12 Eco RI +SmaI; 13 Eco RI + XbaI; 14 Eco RI +XhoI. Для дальнейшего анализа были выбраны фрагменты размерами 6,5 кbp и 0,9 кbp, получившиеся в результате обработки клона cos ES.4-1 рестриктазой EcoRI. Как видно из Рис.2, два других фрагмента, образовавшихся в последовательностей, результате этой гибридизующихся с реакции не зондом. Для содержали анализа и 199 дальнейшего клонирования выбранных фрагментов продукты EcoRI рестрикции вставки cos ES.4-1 разделялись с помощью электрофореза, полосы, соответствующие размерам 6,5 кbp и 0,9 кbp вырезались из геля, помещались в диализные мешки, элюировались и очищались на колонке BND. Анализ фрагмента 0,9 кbp Из Рис.2 видно, что фрагмент 0,9 кbp имеет сайт для фермента рестрикции BglII, и в результате его обработки этой рестриктазой образуется фрагмент размером порядка 600 bp, названный 0,9 BR (BglII-Eco RI), который также содержит последовательность, гибридизующуюся с зондом 18u. Фрагмент 0,9 BR был встроен в вектор Bluescript KS+ (Материалы и методы; Рис.1) по сайтам ферментов рестрикции EcoRI и BamHI и таким образом был получен клон 0,9 BR. Сайты рестрикции рестриктаз BglII (рестриктный сайт A/GATC/T) и BamHI (рестриктный сайт G/GATC/C) имеют одинаковые «липкие» концы, что позволяет встраивать фрагмент, полученный обработкой одной из этих рестриктаз, в вектор, имеющий сайт для другой рестриктазы. Однако, при этом сайт перестает узнаваться этими рестриктазами из-за концевых нуклеотидов, не соответствующих ни одному из исходных сайтов, поэтому при дальнейшем анализе полученного клона следует использовать какуюлибо из рестриктаз, сайт для которой в полилинкере находится вне области вставки, со стороны соответствующего «испорченного» сайта. В данном случае для дальнейшего анализа клона 0,9 BR использовались рестриктазы Eco RI и XbaI. Результаты Eco RI / XbaI рестрикции плазмид, содержащихся в 2-х клонах 0,9 BR представлены на Рис.3. 200 Рис 3. Электрофорез продуктов Eco RI/XbaI рестрикции плазмид, содержащихся в 2-х клонах 0,9 BR. Далее было проведено картирование фрагмента 0,9 BR (Рис.4). Рис. 4. Электрофорез продуктов рестрикции плазмиды 0,9 BR. 1 – маркеры; 2–10 – фрагменты, полученные в результате обработки рестриктазами: 2 AccI; 3 AvaI; 4 Bam HI; 5 DraII; 6 Hind III; 7 KpnI; 8 PstI; 9 PvuII; 10 SmaI. Из рисунка видно, что фрагмент гена Flt4, содержащийся в плазмиде 0,9 BR, имеет сайты для рестриктаз AccI, AvaI, PstI и PvuII. При этом наиболее подходящие для дальнейшего анализа фрагменты получаются в 201 результате обработки плазмиды рестриктазами AccI, PstI и PvuII. Фрагмент, образующийся в результате AvaI-рестрикции, слишком мал. С целью выбора фрагмента для последующего клонирования далее было проведено частичное картирование плазмиды 0,9 кbp комбинацией рестриктаз PstI, PvuII и EcoRI (Рис.5). Рис. 5. Электрофорез продуктов рестрикции плазмиды 0,9 BR комбинацией рестриктаз Eco RI, PstI и PvuII. 1 – маркеры; 2-5 – фрагменты, полученные в результате обработки рестриктазами:2 PstI; 3 PstI +Eco RI; 4 PvuII; 5 PvuII +Eco RI. Для дальнейшего клонирования был выбран фрагмент 0,9 BR/PstI размером порядка 500 bp. В результате переклонирования этого фрагмента была получена плазмида 0,9 BR/PstI. На Рис. 6. представлен электрофорез продуктов рестрикции плазмиды 0,9 BR/PstI рестриктазой PstI. Рис. 6. Электрофорез продуктов PstI-рестрикции плазмиды 0,9 BR/PstI. 202 Фрагмент 0,9 BR/PstI далее обрабатывался рестриктазой PvuII, в результате чего образовались 2 фрагмента размерами 300 и 200 bp (Рис. 7). Рис. 7. Электрофорез продуктов рестрикции фрагмента 0,9 BR/PstI рестриктазой PvuII. По результатам блот-гибридизации этих фрагментов для дальнейшего клонирования был выбран фрагмент размером 300 bp. Последующее секвенирование этого фрагмента, названного MuPP (PstI-PvuII), показало, что он действительно содержал нуклеотидные последовательности гена Flt4. Сиквенс MuPP приведен в Приложении 2.2. 203 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 1. Achen M.G., Jeltsch M., Kukk E., Makinen T., Vitali A., Wilks A.F., Alitalo K., Stacker S.A. Vascular endothelial growth factor D (VEGF-D) is a ligand for the tyrosine kinases VEGF receptor 2 (Flk1) and VEGF receptor 3 (Flt4). // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v.95, pp.548-553. 2. Ahn C.S., Kang J.Y., Rho J.S., et al. Angiogenesis in squamous epithelial lesions of the uterine cervix. // J. Clin. Oncol., 1997, v. 16, pp.552a. 3. Albelda S.M., Muller W.A., Buck C.A., Newman P.J. Molecular and cellular properties of PECAM-1 (endoCAM/CD31): a novel vascular cellcell adhesion molecule. // J. Cell. Biol., 1991, v.14, pp.1059-1068. 4. Aprelikova O., Pajusola K., Partanen J., Armstrong E., Alitalo R., Bailey S.K., McMahon J., Wasmuth J., Huebner K., Alitalo K. FLT4, a novel class III receptor tyrosine kinase in chromosome 5q33-qter. // Cancer Res., 1992, v.52, pp.746-748. 5. Arasteh K., Hannah A. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in AIDS-related Kaposi’s sarcoma. // The Oncologist, 2000, v.5, pp.28-31. 6. Baldwin M.E., Catimel B., Nice E.C., Roufail S., Hall N.E., Stenvers K.I., Karkkainen M.J., Alitalo K., Stacker S.A., Achen M.G. The specificity of receptor binding by vascular endothelial growth factor-D is different in mouse and man. // J. Biol. Chem., 2001, v.276, pp.19166-19171. 7. Benton W.D., Davis R.W. Screening λgt recombinant clones by hybridization to single plaques in situ. // Science, 1977, v.196, pp.180. 8. Berkman R.A., Merill M.J., Reinhold W.C., Monacci W.T., Saxena A., Clark W.C., Robertson J.T., Ali I.U., Oldfield E.H. Expression of the vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor gene in central nervous system neoplasms. // J. Clin. Invest., 1993, v.91, pp.153159. 204 9. Bernatchez P.N., Soker S., Sirois M.G. Vascular endothelial growth factor effect on endothelial cell proliferation, migration, and platelet-activating factor aynthesis is Flk-1-dependent. // J. Biol. Chem., 1999, v.274, pp.31047-31054. 10. Bochner B.H., Cote R.H., Weidner N. et al. Angiogenesis in bladder cancer: relationship between microvessel density and tumor prognosis. // J. Natl. Cancer Inst., 1995, v.87, pp.1603-1612. 11. Boocock C.A., Charnock-Jones D.S., Sharkey A.M., et al.. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flt and KDR in ovarian carcinoma. // J. Natl. Cancer Inst., 1985, v.87, pp.506-516. 12. Borg J.P., de Lapeyriere O., Noguchi T., Rottapel R., Dubreuil P., Birnbaum D. Biochemical characterization of two isoforms of FLT4, a VEGF receptorrelated tyrosine kinase. // Oncogene, 1995, v.10, pp.973-984. 13. Brown L.F., Berse B., Jackman R.W., Tognazzi K., Manseau E.J., Dvorak H.F., Senger D.R. Increased expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its receptors in kidney and bladder carcinomas. // Am. J. Pathol., 1993, v.143, pp.1255-1262. 14. Brown L.F., Berse B., Jackman R.W., Tognazzi K., Manseau E.J., Senger D.R., Dvorak H.F. Expression of vascular permeability factor (vascular endothelial growth factor) and its receptors in adenocarcinomas of the gastrointestinal tract. // Cancer Res., 1993, v.53, pp.4727-4735 15. Bunone G., Vigneri P., Mariani L., Buto S., Collini P., Pilotti S., Pierotti M.A., Bongarzone I. Expression of angiogenesis stimulators and inhibitors in human thyroid tumors and correlation with clinical pathological features. // Am. J. Pathol., 1999, v.155, pp.1967-1976. 16. Busam K.J., Berwick M., Blessing K., Fandrey K., Kang S., Karaoli T., Fine J., Cochran A.J., White W.L., Rivers J. Tumor vascularity is not a prognostic factor for malignant melanoma of the skin. // Am. J. Pathol., 1995, v.147, pp.1049-1056. 205 17. Cantley L.C., Auger K.R., Carpenter C., Duckworth B., Graziani A., Kapeller R., Soltoff S. Oncogenes and signal transduction. // Cell, 1991, v.64, pp.281-302. 18. Carmeliet P., Collen D. Molecular analysis of blood vessel formation and disease. // Am. J. Physiol., 1997, v.273, pp. H2091-H2104. 19. Carnochan P., Briggs J.C., Westbury G., Davies A.J.S. The vascularity of cutaneous melanoma: a quantitative histological study of lesions 0.85-125 mm thickness. // Br. J. Cancer, 1991, v.64, pp.102-107. 20. Chen H., Chedotal A., He Z., Goosman C.S., Tessier-Lavigne M. Neuropilin-2, a novel member of the neuropilin family, is a high affinity receptor for the semaphorins Sema E and Sema IV but not Sema III. // Neuron, 1997, v.19, pp.547-559. 21. Davis S., Aldrich T.H., Jones P.F., Acheson A., Compton D.L., Jain V., Ryan T.E., Bruno J., Raziejewski C., Maisonpierre P.C., Yancopoulos G.D. Isolation of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, by secretion-trap expression clonong. // Cell, 1997, v.87, pp.1161-1169. 22. De Vries C., Escobedo J.A., Ueno H., Houck K., Ferrara N., Williams L.T. The fms-like tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor. // Science, 1992, v.255, pp.989-991. 23. Dickinson A.J., Fox S.B., Persad R.A., Hollyer J., Sibley G.N.A., Harris A.L. Quantification of angiogenesis as an independent predictor of prognosis in invasive bladder carcinomas. // Br. J. Urol., 1994, v.74, pp.762766. 24. Dougher-Vermazen M., Hulmes J.D., Bohlen P., Terman B.I. Biological activity and phosphorylation sites of the bacterially expressed cytosolic domain of the KDR VEGF-receptor. // Biochem. Biophys. Res. Communs., 1994, v.205, pp.728-738. 25. Dumont D.J., Gradwohl G., Fong G.H., Puri M.C., Gertsenstein M., Auerbach A., Breitman M.L. Dominant-negative and targeted null mutations 206 in the endothelial receptor tyrosine kinase, tek, reveal a critical role in vasculogenesis of the embryo. // Genes Dev., 1994, v.8, pp.1897-1909. 26. Dumont D.J., Yamaguchi T.P., Conlon R.A., Rossant J., Breitman M.L. Tek, a novel tyrosine kinase gene located on mouse chromosome 4, is expressed in endothelial cells, and their presumptive precursors. // Oncogene, 1992, v.7, pp.1471-1480. 27. Eichmann A., Corbel C., Nataf V., Vaigot P., Breant C., Le Douarin N.M. Ligand-dependent development of the endothelial and hemopoietic lineages from embryonic mesodermal cells expressing vascular endothelial growth factor receptor 2. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v.94, pp.5141-5146. 28. Eliceiri B.P., Paul R., Schwartzberg P.L., Hood J.D., Leng J., Cheresh D.A. Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability. // Mol. Cell, 1999, v.4, pp.915-924. 29. Enholm B., Paavonen K., Ristimaki A., Kumar V., Gunji Y., Klefstrom J., Kivinen L., Laiho M., Olofsson B., Joukov V., Eriksson U., Alitalo K. Cоmparison of VEGF, VEGF-B, VEGF-C and Ang-1 mRNA regulation by serum, growth factors, oncoproteins and hypoxia. // Oncogene, 1997, v.14, pp.2475-2483. 30. Fantl W.J., Johnson D.E., Wiliams L.T. Signalling by receptor tyrosine kinases. // Annu. Rev. Biochem., 1993, v.62, pp.453-481. 31. Fen Z., Daniel T.O. 5’ Untranslated sequences determine degradative pathway for alternate PDGF B/c-sis mRNA’s. // Oncogene, 1991, v.6, pp.953-959. 32. Ferrara N., Henzel W.J. Pituitary follicular cells secrete a novel heparinbinding growth factor specific for vascular endothelial cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, v.161, pp.851-858. 33. Folkman J. Angiogenesis: therapeutic implications. // N. Engl. J. Med., 1971, v.285, pp.1182-1186. 34. Folkman J., D’Amore P. Blood vessel formation: what is its molecular basis? // Cell, 1996, v.87, pp.1153-1155. 207 35. Folkman J., Klagsbrun M. Angiogenic factors. // Science, 1987, v.235, pp.442-447. 36. Fong G.H., Rossant J., Gertsenstein M., Breitman M.L. Role of the Flt-1 receptor tyrosine kinase in regulating the assembly of vascular endothelium. // Nature, 1995, v.376, pp.66-70. 37. Fontanini G., Bigini D., Vignati S., Bassolo F., Mussi A., Lucchi M., Chine S., Angeletti C.A., Harris A.L., Bevilacqua G. Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. // J. Pathol., 1995, v.177, pp.57-63. 38. Fournier E., Blaikie P., Rosnet O., Margolis B., Birnbaum D., Borg J.P. Role of tyrosine residues and protein interaction domains of SHC adaptor in VEGF receptor 3 signaling. // Oncogene, 1999, v.18, pp.507-514. 39. Fournier E., Dubreuil P., Birnbaum D., Borg J.P. Mutatuion at tyrosine residue 1337 abrogates ligand-dependent transforming capacity of the FLT4 receptor. // Oncogene, 1995, v.11, pp.921-931. 40. Fournier E., Rosnet O., Marchetto S.,Turck C.W., Rottapel R., Pelicci P.G., Birnbaum D., Borg J.P. Interaction with the phosphotyrosine binding domain/phosphotyrosine interacting domain of SCH is required for the transforming activity of the FLT4/VEGFR3 receptor tyrosine kinase. // J. Biol. Chem., 1996, v.271, pp.12956-12963. 41. Fox S.B., Leek R.D., Weekes M.P., Whitehouse R.M., Gatter K.C., Harris A.L. Quantitation and prognostic value of breast cancer angiogenesis: comparison of microvassel density. Chalkley count and computer image analysis. // J. Pathol., 1995, v.177, pp.275-283. 42. Frater-Schroder M., Risau W., Hallmann R., Gautsch P., Bohlen P. Tumor necrosis factor type alpha, a potent inhibitor of endothelial cell growth in vitro, is angiogenic in vivo. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, v.84, pp.5277-5281. 208 43. Galland F., Karamysheva A., Mattei M.G., Rosnet O., Marchetto S., Birnbaum D. Chromosomal localization of FLT4, a novel receptor-type tyrosine kinase gene. // Genomics, 1992, v.13, pp.475-478. 44. Galland F., Karamysheva A., Pebusque M.J.., Borg J.P., Rottapel R., Dubreuil P., Rosnet O., Birnbaum D. The FLT4 gene encodes a transmembrane tyrosine kinase related to the vascular endothelial growth factor receptor. // Oncogene, 1993, v.8, pp.1233-1240. 45. Gasparini, G., Weidner N., Bevilacqua P., Maluta S., Dalla Palma P., Caffo O., Barbareschi M., Boracchi P., Marubini E., Pozza F. Tumor microvessel density, p53 expression, tumor size, and peritumoral lymphatic vessel invasion are relevant prognostic markers in node-negative breast carcinoma. // J. Clin. Oncol., 1994, v.12, pp.454-466. 46. Giatromanlaki A., Koukourakis M., O’Byrne K.M, Fox S., Whitehouse R., Talbot D.C., Harris A.L., Gatter K.C. Prognostic value of angiogenesis in operable non-small cell lung cancer. // J. Pathol., 1996, v.179, pp,80-88. 47. Goldman C.K., Kendall R.L., Cabrera G., Soroceanu L., Heike Y., Gillespie G.Y., Siegal G.P., Mao X., Bett A.J., Huckle W.R., Thomas K.A., Curiel D.T. Paracrine expression of a native soluble vascular endothelila growth factor receptor inhibits tumor growth, metastasis, and mortality rate. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v.95, pp.8795-8800. 48. Gospodarowicz D., Abraham J.A., Schilling J. Isolation and characterization of a vascular endothelial cell mitogen produced by pituitary-derived folliculo stellate cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, v.86, pp.73117315. 49. Grimmond S., Lagercrantz J., Drinkwater C., Silins G., Towson S., Pollock P., Gotley D., Carson E., Rakar S., Nordenskjold M., Ward L., Hayward N., Weber G. Cloning and characterization of a novel human gene related to vascular endothelial growth factor. // Genome Res., 1996, v.6, pp.124-131. 209 50. Grunstein M., Hogness D. Colony hybridization: A method for the isolation of cloned DNAs that contain a specific gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1975, v.72, pp.3961. 51. Gunningham S.P., Currie M.J., Han C., Robinson B.A., Scott P.A.E., Harris A.L., Fox S.B. The short form of the alternatively spliced flt-4 but not its ligand vascular endothelial growth factor C is related to lymph node metastasis in human breast cancers. // Clin. Cancer Res., 2000, v.6, pp.42784286. 52. Guo D., Jia Q.,Song H.Y., Warren R.S., Donner R. Vascular endothelial growth factor promotes tyrosine phosphorylation of mediators of signal transduction that contain SH2 domains. Association with endothelial cell proliferation. // J. Biol. Chem., 1995, v.270, pp.6729-6733. 53. Hanahan D. Signaling vascular morphogenesis and maintenance. // Science, 1997, v.277, pp.48-50. 54. Hanahan D., Folkman J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. // Cell, 1996, v.86, pp. 353-364. 55. He Z., Tessier-Lavigne M. Neuropilin is a receptor for the axonal chemorepellent Semaphorin III. // Cell, 1997, v.90, pp.739-751. 56. Herold-Mendel C., Mueller M., Fusenig N., Steiner H.H., Reisser C. Expression and functional significance of VEGF receptors in human tumor cells. // Proc. ELSO Meeting, 2002, Abstract 328. 57. Hiratsuka S., Minowa O., Kuno J., Noda T., Shibuya M. Flt-1 lacking the tyrosine kinase domain is sufficient for normal development and angiogenesis in mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v.95, pp.93499354. 58. Horak E.R., Leek R., Klenk N., LeJeune S., Smith K., Stuart N., Greenall M., Stepniewska K., Harris A.L. Angiogenesis, assessed by platelet/ endothelial cell adhesion molecule antibodies, as indicator of mode metastases and survival in breast cancer. // Lancet, 1992, v.340, pp.11201124. 210 59. Houck K.A., Ferrara N., Winer J., Cachianes G., Li B., Leung D.W. The vascular endothelial growth factor family: identification of a fourth molecular species and characterization of alternative splicing of RNA. // Mol. Endocrinol, 1991, v.5, pp. 1806-1814. 60. Houck K.A., Leung D.W., Rowland A.M, Winer J., Ferrara N. Dual regulation of vascular endothelial growth factor bioavailability by genetic and proteolytic mechanisms. // J. Biol. Chem., 1992, v.267, pp.2603126037. 61. Hung C.J., Ginzinger D.G., Zarnegar R., Kanauchi H., Wong M.G., Kebebew E., Clark O.H., Duh Q.Y.. Expression of vascular endothelial growth factor-C in benign and malignant thyroid tumors. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2003, 88, 3694-3699. 62. Irrthum A., Karkkainen M.J., Devriendt K., Alitalo K., Vikkula M. Congenital hereditary lymphedema caused by a mutation that inactivates VEGFR3 tyrosine kinase. // Am. J. Hum. Gen., 2000, v.67, pp.295-301. 63. Ishikawa K., Miyazono U., Hellman H., Drexler C., Wernstedt K., Hagiwara K., Usuki F., Takaku K., Risau W., Heldin C.H. Identification of the angiogenic activity and the cloning and expression of platelet-derived endothelial cell growth factor. // Nature, 1989, v.338, pp.557-562. 64. Ito N., Wernstedt C., Engstrom U., Claesson-Welsh L. Identification of vascular endothelial growth factor receptor-1 tyrosine phosphorylation sites and binding of SH2 domain-containing molecules. // J. Biol. Chem., 1998, v.273, pp.23410-23418. 65. Iwama A., Hamaguchi I., Hashiyama M., Murayama Y., Yasunaga K., Suda T. Molecular cloning and characterization of mouse TIE and TEK receptor tyrosine kinase genes and their expression in hematopoietic stem cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, v.195, pp.301-309. 66. Jeltsch M., Kaipainen A., Joukov V., Meng X., Lakso M., Rauvala H., Swartz M., Fukumura D., Jain R.K., Alitalo K. Hyperplasia of lymphatic vessels in VEGF-C transgenic mice. // Science, 1997, v.276, pp.1423-1425. 211 67. Joukov V., Pajusola K., Kaipainen A., Chilov D., Lahtinen I., Kukk E., Saksela O., Kalkkinen N., Alitalo K. A novel vascular endothelial growth factor, VEGF-C, is a ligand for the Flt4 (VEGFR-3) and KDR (VEGFR-2) receptor tyrosine kinases. // EMBO J., 1996, v.15, pp.290-298. 68. Joukov V., Sorsa T., Kumar V., Jeltsch M., Claesson-Welsh L., Cao Y., Saksela O., Kalkkinen N., Alitalo K. Proteolytic processing regulates receptor specificity and activity of VEGF-C. // EMBO J., 1997, v.16, pp.3898-3911. 69. Kaipainen A., Korhonen J., Mustonen T., van Hinsbergh V.W.M., Fang G.H., Dumont D., Breitman M., Alitalo K. Expression of the fms-like tyrosine kinase FLT4 gene becomes restricted to endothelium of lymphatic vessels during development. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v.92, pp.35663570. 70. Karkkainen M.J., Ferrell R.E., Lawrence E.C., Kimak M.A., Levinson K.L., McTigue M.A., Alitalo K., Finegold D.N. Missense mutations interfere with VEGFR-3 signaling in primary lymphoedema. // Nature Genet., 2000, v.25, pp.153-159. 71. Karkkainen M.J., Saaristo A., Jussila L., Karila K.A., Lawrence E.C., Pajusola K., Bueler H., Eichmann A., Kauppinen R., Kettunen M.I., YlaHerttuala S., Finegold D.N., Ferrell R.E., Alitalo K. A model for gene therary of human hereditary lymphedema. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, v.98, pp.12677-12682. 72. Kawakami A., Kitsukawa T., Takagi S., Fujisawa H. Developmentally regulated expression of a cell surface protein, neuropilin, in the mouse nervous system. // J. Neurobiol., 1995, v.29, pp.1-17. 73. Keck P.J., Hauser S.D., Krivi G., Sanzo K., Warren T., Feder J., Connolly D.T. Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. // Science, 1989, v.246, pp.1309-1312. 212 74. Kendall R.L., Thomas K.A. Inhibition of vascular endothelial cell growth factor activity by an endogenously encoded soluble receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v.90, pp.10705-10709. 75. Klagsbrun M. The fibroblast growth factor family: structural and biological properties. // Prog. Growth Factor Res., 1989, v.1, pp.207-235. 76. Klagsbrun M., D’Amore P.A. Regulators of angiogenesis. // Annu. Rev. Physiol., 1991, v.53, pp.217-239. 77. Koch C.A., Anderson D., Moran M.F., Ellis C., Pawson T. SH2 and SH3 domains: elements that control interactions of cytoplasmic signaling proteins. // Science, 1991, v.252, pp.668-674. 78. Koch A.E., Polverini P.J., Kunkel S.L., Harlow L.A., DiPietro L.A., Elner V.M., Elner S.G., Strieter R.M. Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis. // Science, 1992, v.258, pp.1798-1801. 79. Kolodkin A.L., Levengood D.V., Rowe E.G., Tai Y.T., Giger R.J., Ginty D.D. Neuropilin is a Semaphorin III receptor. // Cell, 1997, v.90, pp.753762. 80. Kozak, M. An analysis of 5’-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. // Nucl. Acids Res., 1987, v.15, pp.8125-8148. 81. Kroll J., Waltenberger J. The vascular endothelial growth factor receptor KDR activates multiple signal transduction pathways in porcrine aortic endothelial cells. // J. Biol. Chem., 1997, v.272, pp.32521-32527. 82. Kukk E., Lymboussaki A., Taira S., Kaipainen A., Jeltsch M., Joukov V., Alitalo K. VEGF-C receptor binding and pattern of expression with VEGFR-3 suggests a role in lymphatic vascular development. // Development, 1996, v.122, pp.3829-3837. 83. Larcher F., Robles A.I., Duran H., Murillas R., Quintanilla M., Сano A., Conti C.J., Jorcano J.L. Up-regulation of vascular endothelial growth factor/vascular permeability factor in mouse skin carcinogenesis correlates with malignant progression state and activated H-ras expression levels. // Cancer Res., 1996, v.56, pp.5391-5396. 213 84. Lauren J., Gunji Y., Alitalo K. Is angiopoietin-2 necessary for the initiation of tumor angiogenesis? // Am. J. Pathol., 1998, v.153, pp.1333-1339. 85. Lee A.H., Dublin E.A., Bobrow L.G., Poulsom R. Invasive lobular and invasive ductal carcinoma of the breast show distinct patters of vascularendothelial-growth-factor expression and angiogenesis. // J. Pathol., 1998, v.185, pp.394-401. 86. Lee J., Gray A., Yuan J., Luoh S.-M., Avraham H., Wood W.I. Vascular endothelial growth factor-related protein: A ligand and specific activator of the tyrosine kinase receptor Flt4. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v.93, pp.1988-1992. 87. Leung D.W., Cachianes G., Kuang W.J., Goeddel D.V., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen. // Science, 1989, v.246, pp.1306-1309. 88. Locopo N., Fanelli M., Gasparini G. Clinical significance of angiogenic factors in breast cancer. // Breast Cancer Res. Treat., 1998, v.52, pp.159173. 89. Lopez-Graniel C.M, Tamez de Leon D., Meneses-Garcia A., Gomez-Ruiz C., Frias-Mendivil M., Granados-Garcia M., Barrera-Franco J.L. Tumor angiogenesis as a prognostic factor in oral cavity carcinomas. // J. Exp. Clin. Cancer Res., 2001, v.20, pp.463-468. 90. Macchiarini P., Fontanini G., Hardin M.J., Squartini F., Angeletti C.A. Relation of neovascularisation to metastasis of non-small-cell lung cancer. // Lancet, 1992, v.340, pp.145-146. 91. Maglione D., Guerriero V., Viglietto G., Delli-Bovi P., Persico M.G. Isolation of a human placenta cDNA coding for a protein related to the vascular permeability factor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v.88, pp.9267-9271. 92. Maisonpierre P.C., Suri C., Jones P.F., Bartukova S., Wiegand S.J., Radziejewski C., Compton D., McClain J., Aldrich T.H., Papadopoulos N., Daly T.J., Davis S., Sato T.N., Yancopoulos G.D. Angiopoietin-2, a natural 214 antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis. // Science, 1997, v.277, pp.55-60. 93. Makinen T., Jussila L., Veikkola T., Karpanen T., Kettunen M.I., Pulkkanen K.J., Kauppinen R., Jackson D.G., Kubo H., Nishikawa S., Yla-Herttuala S., Alitalo K. Inhibition of lymphangiogenesis with resulting lymphedema in transgenic mice expressing soluble VEGF receptor-3. // Nature Med., 2001, v.7, pp.199-205. 94. Massague J. The transforming growth factor β family. // Ann. Rev. Cell. Biol., 1990, v.6, pp.597-641. 95. Mattern J., Koomagi R., Volm M. Association of vasculat endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel density and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma. // Br. J. Cancer, 1996, v.73, pp.931-934. 96. Matthews W., Jordan C.T., Gavin M., Jenkins N.A., Copeland N.G., Lemischka I.R. A receptor tyrosine kinase cDNA isolated from a population of enriched primitive hematopoietic cells and exhibiting close genetic linkage to c-kit. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, v.88, pp.9026-9030. 97. McAustin B.R., Bender V., Reilly W., Moss B.A. New functions of epidermal growth factor: stimulation of capillary endothelial cell migration and matrix dependent proliferation. // Cell. Biol. Int. Rep., 1985, v.9, pp.175-182. 98. Meiter D., Crawford S.E., Rademaker A.W., Cohn S. Tumor angiogenesis correlates with metastatic disease, m-myc amplification, and poor outcome in human neuroblastoma. // J. Clin. Oncol., 1996, v.14, pp.405-414. 99. Meyer M., Clauss M., Lepple-Wiemhues A., et al. A novel vascular endothelial growth factor encoded by Orf virus, VEGF-E, mediates angiogenesis via signalling through VEGFR-2 (KDR) but not VEGFR-1 (Flt-1) receptor tyrosine kinases. // EMBO J., 1999, v.18, pp.363-374. 215 100. Millauer B., Shawver L.K., Plate K.H., Risau W., Ullrich A. Glioblastoma growth inhibited in vivo by a dominant-negative Flk-1 mutant. // Nature, 1994, v.367, pp.576-579. 101. Millauer B., Wizigmann-Voos S., Schnurch H., Martinez R., Moller N.P., Risau W., Ullrich A. High affinity VEGF binding and developmental expression suggest Flk-1 as a major regulator of vasculogenesis and angiogenesis. // Cell, 1993, v.72, pp.835-846. 102. Noonan K.E., Beck C., Holzmayer T.A., Chin J.E., Wunder J.S., Andrulis E.L., Gazdar A.F., Willman C.L., Griffith B., Von Hoff D.D., Roninson I.B. Quantitative analyses of MDRI (multidrug resistance) gene expression in human tumors by polymerase chain reaction. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, v.37, pp.7160-7164. 103. Obermair A., Kurz C., Czerwenka K., Thoma M., Kaider A., Wagner T., Gitsch G., Sevelda P. Microvessel density and vessel invasion in lymphnode-negative breast cancer: effect on recurrence-free survival. // Int. J. Cancer, 1995, v.62, pp.126-131. 104. O’Brien T., Cranston D., Fuggle S., Bicknell R., Harris A.L. Different angiogenic pathways characterize superficial and invasive bladder cancer. // Cancer Res., 1995, v.55, pp.510. 105. Ogawa S., Oku A., Sawano A., Yamaguchi S., Yazaki Y., Shibuya M. A novel type of vascular endothelial growth factor: VEGF-E (NZ-7 VEGF) preferentially utilizes KDR/Flk-1 receptor and carries a potent mitotic activity without heparin-binding domain. // J. Biol. Chem., 1998, v.273, pp.31273-31282. 106. Ohta Y., Endo Y., Tanaka M., Shimizu J., Oda M., Hayashi Y., Watanabe Y., Sasaki T. Significance of vascular endothelial growth factor messenger RNA expression in primary lung cancer. // Clin. Cancer Res., 1996, v.2, pp.1411-1416. 107. Olofsson B., Korpelainen E., Pepper M.S., Mandriota S.J., Aase K., Kumar V., Gunji Y., Jeltsch M.M., Shibuya M., Alitalo K. Vascular endothelial 216 growth factor B (VEGF-B) binds to VEGF receptor-1 and regulates plasminogenactivator activity in endothelial cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, v.95, pp.11709-11714. 108. Olofsson B., Pajusola K., Kaipainen A., von Euler G., Joukov V., Saksela O., Orpana A., Pettersson R., Alitalo K., Eriksson U. Vascular endothelial growth factor B, a novel growth factor for endothelial cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v.93, pp.2576-2581. 109. Olofsson B., Pajusola K., von Euler G., Chilov D., Alitalo K., Eriksson U. Genomic organization of the mouse and human genes for vascular endothelial growth factor B (VEGF-B) and characterization of a second splice isoform. // J. Biol. Chem., 1996, v.271, pp.19310-19317. 110. Olson T.A., Mohanraj D., Carson L.F., Ramakrishnan S. Vascular permeability factor gene expression in normal and neoplastic human ovaries. // Cancer Res., 1993, v.54, pp.276-280. 111. Orlandini M., Marconcini L., Ferruzzi R., Oliviero S. Identification of a c- fos-induced gene that is related to the platelet-derived growth factor/ vascular endothelial growth factor family. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v.93, pp.11675-11680. 112. Pajusola K., Aprelikova O., Kohronen J., Kaipainen A., Petrovaara L., Alitalo R., Alitalo K. FLT4 receptor tyrosine kinase contains seven immunoglobine-like loops and is expressed in multiple human tissues and cell lines. // Cancer Res., 1992, v.52, pp.5738-5743. 113. Pajusola K., Aprelikova O., Pelicci G., Weich H., Claesson-Welsh L., Alitalo K. Signalling properties of FLT4, a proteolytically processed receptor tyrosine kinase related to two VEGF receptors. // Oncogene, 1994, v.9, pp.3545-3555. 114. Paley P.J., Staskus K.A., Gebhard K., Mohanraj D., Twiggs L.B., Carson L.F., Ramakrishnan S. Vascular endothelial growth factor expression in early stage ovarian carcinoma. // Cancer, 1997, v.80, pp.98-106. 217 115. Pelicci G., Lanfrancone L., Grignani F., McGlade J., Cavallo F., Forni G., Nicoletti I., Grignani F., Pawson T., Pelicci P.G. // Cell, 1992, v.70, pp.93104. 116. Plate K.H., Breier G., Weich H.A., Risau W. Vascular endothelial growth gactor is a potential tumor angiogenesis factor in human gliomas in vivo. // Nature, 1992, v.359, pp.845-848. 117. Puri M.C., Rossant J., Alitalo K., Bernstein A., Partanen J. The receptor tyrosine kinase TIE is required for integrity and survival of vascular endothelial cells. // EMBO J., 1995, v.14, pp.5884-5891. 118. Quinn T.P., Peters K.G., De Vries C., Ferrara N., Williams L.T. Fetal liver kinase 1 is a receptor for vascular endothelial growth factor and is selectively expressed in vascular endothelium. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v.90, pp.7533-7537. 119. Rao C.D., Pech M., Robbins K.C., Aaronson S.A. The 5’ untranslated sequence of the c-sis/platelet-derived growth factor 2 transcript is a potent translational inhibitor. // Mol. Cell. Biol., 1988, v.8, pp.284-292. 120. Risau W. Mechanisms of angiogenesis. // Nature, 1997, v.386, pp.671-674. 121. Ristimaki A., Narko K., Enholm B., Joukov V., Alitalo K. Proinflammatory cytokines regulate expression of the lymphatic endothelial mitogen vascular endothelial growth factor-C. // J. Biol. Chem., 1998, v.273, pp.8413-8418. 122. Rosen E.M., Grant D.S., Kleinman H.K., Goldberg I.D., Bhargava M.M., Nickoloff B.J., Kinsella J.L., Polverini P. Scatter factor (hepatocyte growth factor) is a potent angiogenic factor in vivo. // Symp. Soc. Exp. Biol., 1993, v.47, pp.227-234. 123. Rosnet O., Marchetto S., deLapeyriere O., Birnbaum D. Murine Flt3, a gene encoding a novel tyrosine kinase receptor of the PDGFR/CSF1R family. // Oncogene, 1991, v.6, pp.1641-1650. 124. Rosnet O., Mattei M.G., Marchetto S., Birnbaum D. Isolation and chromosomal localization of a novel FMS-like tyrosine kinase gene. // Genomics, 1991, v.9, pp.380-385. 218 125. Rosnet O., Stephenson D., Mattei M.G., Marchetto S., Shibuya M., Chapman V.M.., Birnbaum D. Close physical linkage of the FLT1 and FLT3 genes on chromosome 13 in man and chromosome 5 in mouse. // Oncogene, 1993, v.8, pp.173-179. 126. Saaristo A., Karpanen T., Alitalo K. Mechanisms of angiogenesis and their use in the inhibition of tumor growth and metastasis. // Oncogene, 2000, v.19, pp.6122-6129. 127. Sait S.N., Dougher-Vermazen M., Shows T.B., Terman B.I. The kinase insert domain receptor gene (KDR) has been relocated to chromosome 4q11→q12. // Cytogenet. Cell Genet., 1995, v.70, pp.145-146. 128. Salven P., Ruotsalainen T., Mattson K., Joensuu H. High pretreatment serum level of vascular endothelial growth factor (VEGF) is associated with poor outcome in small-cell lung cancer. // Int. J. Cancer, 1998, v.79, pp.144. 129. Sato K., Terada K., Sugiyama T., Takahashi S., Saito M., Moriyama M., Kakinuma H., Suzuki Y., Kato M., Kato T. Frequent overexpression of vascular endothelial growth factor gene in human renal cell carcinoma. // Tokohu J. Exp. Med., 1994, v.173, pp.355. 130. Sato T.N., Qin Y., Kozak C.A., Audus K.L. Tie-1 and tie-2 define a new class of putative receptor tyrosine kinase genes expressed in early embryonic vascular system. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, v.90, pp.9355-9358. 131. Sato T.N., Tozawa Y., Deutsch U., Wolburg-Buchholz K., Fujiwara Y., Gendron-Maguire M., Gridley T., Wolburg H., Risau W., Qin Y. Distinct roles of the receptor tyrosine kinases Tie-1 and Tie-2 in blood vessel formation. // Nature, 1995, v.376, pp.70-74. 132. Satoh H., Yoshida M.C., Matsushime H., Shibuya M., Sasaki M. Regional localization of the human c-ros-1 on 6q22 and flt on 13q12. // Jpn. J. Cancer Res. (Gann), 1987, v.78, pp.772-775. 219 133. Seetharam L., Gotoh N., Maru Y., Neufeld G., Yamaguchi S., Shibuya M. A unique signal transduction from FLT tyrosine kinase, a receptor for vascular endothelial growth factor VEGF. // Oncogene, 1995, v.10, pp.135-147. 134. Senger D.R., Perruzzi C.A., Feder J., Dvorak H.F. A highly conserved vascular permeability factor secreted by a variety of human and rodent tumor cell lines. // Cancer Res., 1986, v.46, pp.5629-5632. 135. Shalaby F., Ho J., Stanford W., Fisher K., Schuh A., Schwartz L., Bernstein A., Rossant J.A. A requirement for Flk-1 in primitive and definitive hematopoiesis and vasculogenesis. // Cell, 1997, v.89, pp.981-990. 136. Shalaby F., Rossant J., Yamaguchi T.P., Gertsenstein M., Wu X.F., Breitman M.L., Schuh A.C. Failure of blood-island formation and vasculogenesis in Flk-1-deficient mice. // Nature, v.376, pp.62-66, 1995. 137. Shibuya M., Ito N., Claesson-Welsh L. Structure and function of vascular endothelial growth factor receptor-1 and –2. // Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1999, v.237, pp.59-83. 138. Shweiki D., Itin A., Soffer D., Keshet E. Vascular endothelial growth factor induced by hypoxia may mediate hypoxia-initiated angiogenesis. // Nature, 1992, v.359, pp.843-845. 139. Slavin J. Fibroblast growth factors: at the heart of angiogenesis. // Cell Biol. Int., 1995, v.19, pp.431-444. 140. Soker S., Takashima S., Miao H.Q., Neufeld G., Klagsbrun M. Neuropilin-1 is expressed by endothelial and tumor cells as an isoform-specific receptor for vascular endothelial growth factor. // Cell, 1998, v.92, pp.735-745. 141. Songyang Z., Shoelson S.E., Chaudhuri M., Gish G., Pawson T., Haser W.G., King F., Roberts T., Ratnofsky S., Lechleider R.J., Neel B.G., Birge R.B., Fajardo J.E., Chou M.M., Hanafusa H., Schaffhausen B., Cantley L.C. SH2 domains recognize specific phosphopeptide sequences. // Cell, 1993, v.72, pp.767-778. 142. Spritz R.A., Strunk K.M., Lee S.T., Lu-Kuo J.M., Ward D.C., Le Paslier D., Altherr M.R., Dorman T.E., Moir D.T. A YAC contig spanning a cluster of 220 human type III receptor protein tyrosine kinase genes (PDGFRA-KIT-KDR) in chromosome segment 4q12. // Genomics, 1994, v.22, pp.431-436. 143. Srivastava A., Laidler P., Davies R.P., Horgan K., Hughes L.E. The prognostic significance of tumor vascularity in intermediate-thickness (0.764.0 mm thick) skin melanoma. // Am. J. Pathol., 1988, v.133, pp.419-423. 144. Stacker S.A., Stenvers K., Caesar C., Vitali A., Domagala T., Nice E., Roufail S., Simpson R.J., Moritz R., Karpanen T., Alitalo K., Achen M.G. Biosynthesis of vascular endothelial growth factor-D involves proteolytic processing which generates non-covalent homodimers. // J. Biol. Chem., 1999, v.274, pp.32127-32136. 145. Stacker S.A., Vitali A., Caesar C., Domagala T., Groenen L.C., Nice E., Achen M.G., Wilks A.F. A mutant form of vascular endothelial growth factor (VEGF) that lacks VEGF receptor-2 activation retains the ability to induce vascular permeability. // J. Biol. Chem., 1999, v.274, pp.3488434892. 146. Suri C., Jones P.F., Patan S., Bartunkova S., Maisonpierre P.C., Davis S., Sato T.N., Yancopoulos G.D. Requisite role of angiopoietin-1, a ligand for the TIE2 receptor, during embryonic angiogenesis. // Cell, 1997, v.87, pp.1161-1169. 147. Tada K., Fukunaga T., Wakabayashi Y., Masumi S., Izumi H., Kohno K., Kuwano M. Inhibition of tubular morphogenesis in human microvascular endothelial cells by co-culture with chondrocyte and involvement of transforming growth factor-β: a model for avascularity in human cartilage. // Biochem. Biophys. Acta, 1994, v.1201, pp.135-142. 148. Takagi S., Kasuya Y., Shimizu M., Matsuura T., Tsuboi M., Kawakami A., Fujisawa H. Expression of a cell adhesion molecule, neuropilin, in the developing chick nervous system. // Dev. Biol., 1995, v.170, pp.207-222. 149. Takahashi Y., Kitadai Y., Bucana C.D., Cleary K.R., Ellis L.M. Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor, KDR, correlates with 221 vascularity, metastasis, and proliferation of human colon cancer. // Cancer Res., 1995, v.55, pp.3964-3968. 150. Tanaka S., Ouchi T., Hanafusa H. Downstream of Crk adaptor signaling pathway: Activation of Jun kinase by v-Crk through the guanine nucleotide exchange protein C3G. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v.94, pp.23562361. 151. Terman B.I., Dougher-Vermazen M., Carrion M.E., Dimitrov D., Armeltno D.C., Gospodarowicz D., Bohlen P. Identification of the KDR tyrosine kinase as a receptor for vascular endothelial growth factor. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1992, v.187, pp.1579-1586. 152. Thakker G.D., Hajjar D.P., Muller W.A., Rosengart T.K. The role of phosphatidylinositol 3-kinase in vascular growth factor signaling. // J. Biol. Chem., 1999, v.274, pp.10002-10007. 153. Thurston G., Suri C., Smith K., McClain J., Sato T.N., Yancopoulos G.D., McDonald D. Angiopoietin-1 makes blood vessels resistant to plasma leakage. // Science, 2000, v.286, pp.2511-2514. 154. Tischer E., Gospodarowicz D., Mitchell R., Silva M., Schilling J., Lau K., Crisp T., Fiddes J.C., Abraham J.A. Vascular endothelial growth factor: a new member of the platelet-derived growth factor gene family. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, v.165, pp.1198-1206. 155. Tischer E., Mitchell R., Hartman T., Silva M., Gospodarowicz D., Fiddes J.C., Abraham J.A. The human gene for vascular endothelial growth factor. // J. Biol. Chem., 1991, v.266, pp.11947-11954. 156. Toi M., Hoshina S., Takayanagi T., Tominaga T. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis and with early relapse in primary breast cancer. // Jpn. J. Cancer Res., 1994, v.85, pp.10451049. 157. Toi M., Inada K., Suzuki H., Tominaga T. Tumor angiogenesis in breast cancer: Its importance as a prognostic indicator and the association with 222 vascular endothelial growth factor expression. // Breast Cancer Res. Treat., 1995, v.36, pp. 193-204. 158. Ullrich A., Schlessinger J. Signal transduction by receptors with tyrosine kinase activity. // Cell, 1990, v.61, pp.203-212. 159. Valenzuela D.M., Griffiths J.A., Rojas J., Aldrich T.H., Jones P.F., Zhou H., McClain J., Copeland N.G., Gilbert D.J., Jenkins N.A., Huang T., Papadopoulos N., Maisonpierre P.C., Davis S., Yancopoulos G.D. Angiopoietins 3 and 4: Diverging gene counterparts in mice and humans. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, v.96, pp.1904-1909. 160. Vikkula M., Boon L.M., Carraway K.L., Cavert J.T., Diamonti J.A., Goumnerov B., Pasy K.A., Marchuk D.A., Warman M.L., Cantley L.C., et al. Vascular dysmorphogenesis caused by an activating mutation in the receptor tyrosin kinase TIE2. // Cell, 1996, v.87, pp.1181-1190. 161. Wakui S., Furusato M., Itoh T., Sasaki H., Akiyama A., Kinoshita I., Asano K., Tokuda T., Aizawa S., Ushigome S. Tumour angiogenesis in prostatic carcinoma with and without bone marrow metastasis: a morphometric study. // Am. J. Pathol., 1992, v.168, pp.257-262. 162. Waltenberger J., Claesson-Welsh L., Siegbahn A., Shibuya M., Heldin C.H. Different signal transduction properties of KDR and FLT1, two receptors for vascular endothelial growth factor. // J. Biol. Chem., 1994, v.269, pp.26988-26995. 163. Wang J.F., Ganju R.K., Liu Z.Y., Avraham H., Avraham S., Groopman J.E. Signal trandsuction in human hematopoietic cells by vascular endothelial growth factor related protein, a novel ligand for the FLT4 receptor. // Blood, 1997, v.90, pp.3507-3515. 164. Weidner N., Carroll P.R., Flax J., Blumenfeld W., Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostate carcinoma. // Am. J. Pathol., 1991, v.143, pp.401-409. 223 165. Weidner N., Semple J.P., Welch W.R., Folkman J. Tumor angiogenesis and metastasis – correlation in invasive breast carcinoma. // N. Engl. J. Med., 1991, v.324, pp.1-8. 166. Witzenbichler B., Maisonpierre P.C., Jones P., Yancopoulos G.D., Isner J.M. Chemotactic properties of angiopoietin-1 and –2, ligands for the endothelial-specific receptor tyrosine kinase Tie2. // J. Biol. Chem., 1998, v.273, pp.18514-18521. 167. Yamada Y., Nezu J., Shimane M., Hirata Y. Molecular cloning of a novel vascular endothelial growth factor, VEGF-D. // Genomics, 1997, v.42, pp.483-488. 168. Yonekura H., Sakurai S., Liu X., Migita H., Wang H., Yamagishi S., Nomura M., Abedin M.J., Unoki H., Yamamoto Y., Yamamoto H. Placenta growth factor and vascular endothelial growth factor B and C expression in microvascular endothelial cells and pericites. // J. Biol. Chem., 1999, v.274, pp.35172-35178. 224 БЛАГОДАРНОСТИ Автор выражает свою искреннюю и глубокую благодарность руководителю лаборатории генетики опухолевых клеток НИИ канцерогенеза ГУ РОНЦ РАМН проф. Алле Александровне Ставровской, без помощи, внимания и участия которой значительная часть этой работы не могла бы быть выполнена, а также ведущему научному сотруднику этой же лаборатории к.б.н. Евгении Сергеевне Какпаковой за огромную и неоценимую помощь при постановке экспериментов на культурах клеток. Я очень признательна проф. Марии Ильиничне Бронштейн (Эндокринологический научный центр РАМН, г.Москва) за патоморфологическую характеристику исследованных в нашей работе образцов ткани с различной патологией щитовидной железы человека и за оказанную помощь в сборе этих образцов. Я чрезвычайно благодарна ведущему научному сотруднику лаборатории механизмов канцерогенеза к.б.н. Тамаре Адольфовне Чипышевой за предоставление криосрезов опухолей щитовидной железы человека и за помощь в освоении метода иммуногистохимии. Огромное спасибо всем сотрудникам лаборатории генетики опухолевых клеток и многим другим сотрудникам НИИ канцерогенеза и НИИ ЭДиТО, постоянное внимание и поддержку которых я ощущала во время подготовки этой работы.
