1 005270 2 Предпосылки изобретения
advertisement
1 Предпосылки изобретения Семейство TNF состоит из пар лигандов и их специфических рецепторов, относящихся к лигандам семейства TNF и рецепторам семейства TNF (Bazzoni and Beutler, 1996; Aggarwal and Natarajan, 1996). Лиганды, такие как TNF, обычно располагаются на клеточных поверхностях в виде мембраносвязанных структур, или, в некоторых случаях, они селективно отщепляются от клеточной поверхности и секретируются. Лиганды связываются со специфическими рецепторами, и в результате связывания происходит агрегация двух или нескольких рецепторов. Внутриклеточные домены данных рецепторов могут определенным образом воспринимать данное изменение и передавать данную информацию внутрь клетки посредством механизма передачи сигнала. Данное семейство вовлечено в регуляцию иммунной системы и, возможно, других неиммунных систем. Регуляция часто находится на таком уровне "главного переключения", что сигналы семейства TNF могут приводить к большому количеству последующих событий, лучше всего иллюстрируемых на примере TNF. TNF может запускать основную защитную воспалительную реакцию организма в ответ на внедрение чужеродного агента, которая включает изменение профиля молекул адгезии, участвующих в миграции клетки, продукцию хемокинов, направляющих определенные клетки в определенные участки, и примирование различных эффекторных клеток. Поэтому регуляция данных путей имеет клиническую значимость. Семейство рецепторов TNF представляет собой ряд родственных белков, которые обычно включают внеклеточный домен, трансмембранный домен и внутриклеточный сигнальный домен. Внеклеточный домен состоит из 2-6 копий прочно связанного дисульфидными мостиками домена и распознается на основании уникального расположения остатков цистеина (Banner et al., 1993). Каждый рецептор связывается с соответствующим лигандом (лигандами), хотя один лиганд может участвовать во взаимодействии с несколькими рецепторами. В некоторых случаях, очевидно, существуют естественные растворимые формы рецепторов, не содержащие трансмембранного участка и/или внутриклеточного домена. В природе усеченные варианты данных рецепторов могут иметь прямые биологические регулирующие роли. Примером такого процесса является система остеопротегерина. Остеопротегерин представляет собой секретируемый рецептор семейства TNF, блокирующий сигнал, передаваемый через RANK-L (также называемый TRANCE) и/или TRAIL, к рецепторам, стимулирующим активацию остеокластов. Блокирование данных рецепторов, в большей степени рецептора RANK, препятствует резорбции костной ткани, и масса костной ткани увеличивается (Вuсау et al., 1998). Очевидно, вирусы используют данную тактику для ингибиро- 005270 2 вания активности TNF в организме-хозяине (Smith et al., 1994). Данные рецепторы могут давать сигнал для запуска ряда процессов, включающих дифференцировку клеток, гибель клеток или сигналы выживаемости клеток. Сигнал, приводящий к гибели клетки, часто стимулируется посредством относительно прямых связей с каскадом протеаз в случае рецепторов Fas и TNF. Рецепторы TNF являются мощным инструментом для выяснения работы биологических путей, поскольку они легко подвергаются преобразованию в иммуноглобулиновые гибридные белки, имеющие большой период полужизни в сыворотке. Димерные растворимые формы рецептора могут ингибировать процессы, опосредуемые как непосредственно секретируемыми, так и связанными с поверхностью лигандами. Связываясь с данными лигандами, такие белки, полученные слиянием, препятствуют взаимодействию лиганда с клеточными рецепторами и ингибируют передачу соответствующего сигнала. Данные гибридные белки Ig-рецептор применяются в экспериментальных целях и также успешно используются в клинике, например TNF-R-Ig применяют для лечения воспалительных заболеваний кишечника, ревматоидного артрита и острого клинического синдрома, сопровождающего введение ОКТ3 (Eason et al., 1996; Feldmann et al., 1997; van Dullemen et al., 1995). Управление многими процессами, опосредованными сигналами, передаваемыми рецепторами семейства TNF, может иметь применение для лечения заболеваний иммунной системы, так же, как и широкого круга заболеваний человека, имеющих осложнения, связанные с вовлечением иммунной системы. Например, было показано, что растворимая форма вышеописанного рецептора - остеопротегерин - блокирует потерю костной массы (Simmonet et al., 1997). Таким образом, процессы, контролируемые передачей сигналов рецепторами семейства TNF, необязательно ограничиваются регуляцией иммунной системы. Антитела к рецепторам могут блокировать связывание лигандов и, таким образом, также имеют клиническое применение. Подобные антитела часто являются долгоживушими и могут иметь преимущества над растворимыми гибридными белками Ig-рецептор, которые имеют меньший период полужизни в крови. Несмотря на то, что ингибирование рецептор-опосредованных путей представляется наиболее используемым терапевтическим применением данных рецепторов, первоначально изучали активацию рецепторов TNF, показавшую перспективность в клиническом отношении (Aggarwal and Natarajan, 1996). Активация рецепторов TNF может запускать процесс клеточной гибели в клетках-мишенях, и, следовательно, применение в отношении опухолевых клеток было и остается актуальным (Eggermont et 3 al., 1996). Рецептор может быть активирован как введением лиганда, т.е. естественным путем, так и введением антител, которые могут связываться с рецептором. Применение антител может быть выгодным для лечения, например, злокачественных опухолей, поскольку антитела могут персистировать в крови в течение длительного периода в противоположность лигандам, которые обычно имеют короткое время жизни в крови. Антитела-агонисты являются пригодным инструментом для лечения злокачественной опухоли, поскольку рецепторы могут экспрессироваться более селективно в тканях опухолей, или они могут передавать сигнал клеточной гибели или дифференцировки только в ткани опухолей. Также многие позитивные иммунологические процессы могут опосредоваться через рецепторы семейства TNF, например воспалительные реакции в организме, продукция антител и прочие, и поэтому антитела-агонисты могут быть полезны в отношении других, неонкологических применений. Парадоксально, но ингибирование биологических путей также может быть клинически выгодно при лечении опухолей. Например, лиганд Fas экспрессируется некоторыми опухолями, и данная экспрессия может приводить к гибели Fas-позитивных лимфоцитов, таким образом, способствуя свойству опухоли избегать контроля иммунной системы. В данном случае ингибирование системы Fas может позволить иммунной системе далее реагировать на опухоль другим образом, когда становится возможным доступ к опухоли (Green and Ware, 1997). Первый член данного семейства рецепторов - рецептор лимфотоксина-бета (LTβR) - связывается с поверхностным лимфотоксином (LT), который состоит из тримерного комплекса альфа- и бета-цепей лимфотоксина (Crowe et al., 1994). Данная пара рецептор-лиганд вовлечена в развитие периферической иммунной системы и регуляцию процессов в лимфоузлах и селезенке в зрелой иммунной системе (Ware et al., 1995; Mackay et al., 1997; Rennert et al., 1996; Rennert et al., 1997; Chaplin and Fu, 1998). Гибридный белок, полученный слиянием рецептора лимфотоксина-β и иммуноглобулина, может быть получен из LTβR и IgG (LTβR-Ig), который блокирует передачу сигнала от поверхностного лиганда LT к рецептору, что отражается на функциональном состоянии фолликулярных дендритных клеток (Mackay and Browning, 1998). Такое блокирование, более того, может привести к ослаблению аутоиммунного заболевания на модели грызунов (Mackay et al., 1998, U.S.S.N. 08/505,606, поданная 21 июля 1995 года, и U.S.S.N. 60/029,060, поданная 26 октября 1996 года). Второй член данного семейства рецепторов, названный HVEM по медиатору проникновения вируса герпеса, связывается с лигандом, названным Light (Mauri et al., 1998), так же, как 005270 4 и с гетеромерным лигандом LT. Функция данного рецептора еще остается неясной, но гибридный белок HVEM-Ig может быть пригоден для лечения иммунологических заболеваний, и данная конструкция показала в тестах in vitro способность воздействовать на иммунные функции (Harrop, J.A., et al., 1998) . Несмотря на пригодность в клиническом отношении членов семейства TNF, что обсуждалось выше, остается необходимость в способе получения желаемого количества гибридов рецептора и Ig, пригодных для применения в клиническом отношении. Например, белок LTβR-Ig может экспрессироваться в двух формах, при экспрессии в клетках cos обезьяны или в клетках яичников китайского хомячка. Одна форма связывает лиганды с высокой аффинностью, в то время как другая низкоаффинна. Поэтому есть необходимость в способе получения большого количества формы с высокой аффинностью, минимизируя при этом присутствие низкоаффинной формы. Сущность изобретения Настоящее изобретение относится к способам экспрессии с большим выходом гибридов белков и Ig, обладающих высокой аффинностью связывания соответствующих лигандов, называемых здесь как "активная" форма, культивируя клетки-хозяева, трансформированные с помощью ДНК, кодирующей желаемые гибриды, в системе культивирования при низкой температуре, минимизируя, таким образом, количество неправильно уложенных и неправильно сшитых форм белка. Изобретение в различных воплощениях относится к способам экспрессии с большим выходом в экспрессирующих системах млекопитающих с помощью культивирования трансформированных клеток-хозяев при температуре приблизительно от 27 до 35°С. Предпочтительно клетки-хозяева млекопитающих могут быть культивированы при температуре приблизительно от 27 до 32°С. Согласно другим воплощениям изобретение относится к способам экспрессии большого количества активных гибридных белков с помощью культивирования трансформированных клеток-хозяев в дрожжевой экспрессирующей системе при низких температурах. При экспрессировании желаемых белков дрожжами предпочтительная температура составляет приблизительно от 10 до 25°С, более предпочтительно от 15 до 20°С. В определенных способах заявленного изобретения гибрид белок-Ig включает представителя семейства рецепторов TNF, такой как рецептор лимфотоксина-β или его фрагмент. Альтернативно заявленные способы могут касаться экспрессии желаемого гибридного белка в любой экспрессирующей системе при низких температурах, такой как инсектная или бактериальная система. 5 Согласно другим воплощениям заявленное изобретение относится к активным гибридам белок-Ig, полученным с помощью заявленных способов, и к фармацевтическим композициям, содержащим их. Согласно еще другим воплощениям изобретение относится к способам получения фармацевтических препаратов, которые включают в себя культивирование клетокхозяев, трансформированных с помощью ДНК, кодирующей желаемый гибрид белок-Ig, в системе культивирования при низкой температуре приблизительно от 27 до 35°С, предпочтительно от 27 до 32°С, с экспрессией большого количества активных гибридных белков, выделение активных гибридных белков из системы культивирования и объединение полученных активных гибридных белков с фармацевтически приемлемым носителем. Согласно предпочтительным воплощениям гибрид белок-Ig содержит лимфотоксин-β или его фрагмент или HVEM или его фрагмент. Согласно еще другим воплощениям заявленное изобретение относится к фармацевтическим композициям, полученным с помощью описанных способов. Заявленное изобретение согласно различным воплощениям относится к экспрессирующей системе млекопитающих, так же, как и к другим системам экспрессии, таким как дрожжи, бактериальные системы или инсектные системы. Согласно некоторым воплощениям изобретение относится к способам экспрессии с высоким уровнем активных гибридных белков дрожжами с помощью культивирования при низких температурах приблизительно от 10 до 25°С, более предпочтительно от 15 до 20°С. Также включены активные гибриды, полученные с помощью данного способа экспрессии дрожжами, и фармацевтические композиции, содержащие данные активные гибриды. Способы получения фармацевтических препаратов, содержащих активные гибриды белок-Ig, находятся в пределах изобретения, что включает культивирование дрожжевых клеток, трансформированных с помощью ДНК, кодирующей желаемый гибрид, при низкой температуре, предпочтительно от 10 до 25°С, более предпочтительно от 15 до 20°С. Согласно наиболее предпочтительным воплощениям всех композиций и способов изобретения гибрид белок-Ig включает рецептор лимфотоксина-β, HVEM или их фрагмент. Краткое описание фигур Фиг. 1: изображение химерного белка рецептор-иммуноглобулин. Слева представлено изображение типичной молекулы IgG, Fcдомены закрашены черным цветом, вариабельные домены тяжелой цепи показаны серым и легкие цепи показаны белым цветом. Средняя часть содержит схематический рисунок молекулы LTβR-Ig, включая внутриклеточный (темно- 005270 6 серый) и внеклеточный (светло-серый) домены. Справа представлено схематическое изображение гибридного белка LTβR-Ig. Фиг. 2: схематическое представление возможного дефекта функционально неактивной формы LTβR-Ig, хотя реальные неправильно уложенные или неправильно сшитые аминокислоты не идентифицированы. Фиг. 3: анализ с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ LTβR-Ig человека до и после обработки PNG-азой F. Полосы 1 и 2 содержат LTβR-Ig человека, выделенный из супернатанта культуры клеток СНО, культивированных при 37°С, с помощью аффинной хроматографии с белком А. Полоса 3 представляет собой тот же препарат после обработки PNG-азой F для удаления всех N-связанных олигосахаридов. Полосу 1 прогоняли в невосстанавливающих условиях, полосы 2 и 3 прогоняли в условиях восстановления. Белковые полосы визуализировали окрашиванием геля кумасси бриллиантовым синим. Фиг. 4: ДСН-полиакриламидный гельэлектрофорезный анализ белка при невосстанавливающих условиях, прошедшего через аффинную колонку с AGH1, и белка, элюированного фосфатным буфером с рН 3,5. Белок до аффинной очистки представлен полосой в правой части геля. Белковые полосы визуализировали окрашиванием геля кумасси бриллиантовым синим. Фиг. 5: способность прошедшей сквозь AGH1-аффинную колонку (нижняя) и элюированной (верхняя) фракций связывать поверхностный лимфотоксин. Средние значения интенсивности флуоресценции были получены с помощью FACS-анализа, как описано. Примеры FACS-профилей показаны справа, где LTβR-Ig сравнивают со связыванием контрольного белка LFA-3-Ig. Фиг. 6: аналитическая HIC хроматография LTβR-Ig человека с применением колонки POROS ether и снижающегося градиента сульфата аммония. Пик 1 представляет собой мелкую, неактивную форму LTβR-Ig, пик 2 - крупную, активную форму LTβR-Ig. Фракции, соответствующие пикам 1 и 2, соответственно собирали и анализировали с помощью 4-20% ДСНполиакриламидного гель-электрофореза (вставлен на фигуре). Полоса, помеченная 1, содержит неактивное вещество, полученное при пике 1, полоса 2 - активное вещество, полученное при пике 2 хроматографии HIC. Исходное вещество представлено на полосе L. Полоса, помеченная М, содержит маркеры молекулярных масс. Фиг. 7: препаративная HIC-хроматография (хроматография гидрофобных взаимодействий) LTβR-Ig человека с применением колонки Pharmacia Source 15PHE. Элюат, содержащий LTβR-Ig человека, полученный при хроматографии с белком А, доводили с помощью 5 М 7 NaCl до конечной концентрации 1,5 М NaCl, 20 мМ фосфата натрия, рН 7,0 и вносили в колонку. Колонку промывали 5 объемами 1,5 М NaCl, 20 мМ фосфата натрия, рН 7,0 и проводили элюцию с помощью 20 мМ фосфата натрия, рН 7,0. По оси Х отложено время в минутах, по оси Y отложено поглощение при 280 нм. Представленная на фигуре вставка является изображением 4-20% ДСН-полиакриламидного геля при невосстанавливающих условиях, окрашенного кумасси бриллиантовым синим, с прошедшей сквозь (FT) и элюированной (Е) фракциями. Положения активной и неактивной форм показаны стрелками. Фиг. 8: ДСН-ПААГЭ/Вестерн-блоттинг анализ LTβR-Ig человека, секретированного клетками СНО при различных температурах культивирования. Супернатанты, полученные из клеток СНО, культивированных при указанных температурах, и содержащие LTβR-Ig человека, анализировали в дублях с помощью ДСНполиакриламидного гель-электрофореза при невосстанавливающих условиях, применяя 420% градиентные гели с последующим проведением Вестерн-блоттинга. Фиг. 9: влияние температуры культивирования на процентное содержание неактивного вещества в общем количестве LTβR-Ig человека, секретированного клетками млекопитающих. Продублированные колбы, содержащие клетки СНО, секретирующие рекомбинантный LTβR-Ig человека, культивировали при указанных температурах и секретированный LTβR-Ig человека очищали с помощью аффинной хроматографии с белком А. Процентное содержание "неактивной" формы LTβR-Ig человека оценивали в дублях с помощью аналитической хроматографии HIC. По оси Х отложена температура культивирования, по оси Y отложено количество "неактивного" экспрессируемого вещества в процентном содержании от общего количества LTβR-Ig человека, секретируемого клетками. Фиг. 10: ДСН-ПААГЭ анализ при невосстанавливающих условиях HVEM-Ig, полученного при 28, 32 и 37°С. Препараты HVEM-Ig, очищенные с помощью белка А и полученные из клеточной культуры при 28, 32 и 37°С, смешивали с невосстанавливающим пробным ДСНПААГЭ буфером и проводили электрофорез на подготовленных 4-20% ДСН-полиакриламидных гелях. Белковые полосы визуализировали окрашиванием геля кумасси синим. Полоса, отмеченная стрелкой, содержит неагрегированный HVEM-Ig. Видимые на геле полосы с высокой молекулярной массой соответствуют агрегированным формам. Фиг. 11: FACS-анализ связывания HVEMIg, полученного при 37°С по сравнению с полученным при 32°С, с поверхностным LIGHT и/или LTα/β. А) Связывание HVEM-Ig в виде функции концентрации с клетками 293, транс- 005270 8 фецированными с помощью LIGHT человека, показывающей, что вещество, полученное при 32°С, характеризуется лучшим связыванием по сравнению с веществом, полученным при 37°С. В) Пример FACS-профилей, наблюдаемых при связывании HVEM-Ig с концентрацией 2 мкг/мл с LIGHT трансфецированных клеток 293. С) Дополнительный пример лучшего связывания HVEM-Ig, полученного при 32°С, с поверхностью клеток II23 Т-клеточной гибридомы, экспрессирующей как LIGHT, так и поверхностный комплекс лимфотоксина-α/β (LTα/β). Фиг. 12: BIAcore-анализ связывания лигандов LIGHT и лимфотоксина-α (LTα) с HVEM-Ig, связанным с чипами BIAcore и полученным при трех различных температурах. Каждая кривая показывает процесс связывания при определенной концентрации лиганда, и применяли следующие концентрации: 30, 15, 7,5, 3,75, 1,87, 0,93, 0,47, 0,23, 0,11 и 0,0 мкг/мл. Каждый чип нагружали до такого значения уровня RU, при котором связывалось равное количество рецептор-Ig. Подробное описание Далее будет представлено подробное объяснение настоящего изобретения. Данное изобретение относится к возможности получения большого выхода функциональных или активных форм гибридных белков, полученных слиянием иммуноглобулина и рецепторов семейства TNF. Успех клинических воздействий гибридными белками рецептор-Ig требует длительного срока действия и возможности длительного или минимального лечения в течение вспышек заболевания. Идеально, препараты, содержащие подобные гибридные белки, для применения человеком не должны содержать каких-либо агрегированных, неактивных или неправильно уложенных форм, поскольку их присутствие будет уменьшать эффективность лекарственного препарата, и измененные структуры могут вызвать антительный ответ, что может способствовать выведению препарата, таким образом, уменьшая его эффективность. Более того, антитела к рецептору могут непосредственно связывать естественный рецептор на поверхности клетки, таким образом, активируя его, т.е. антителаагонисты, подобные описанным в Browning et al. 1996, JEM. Антитела-агонисты активируют систему, и таким образом дальнейшая терапия с помощью рецептора-Ig может быть менее эффективна или даже вредна. Термин "иммуноглобулиновые гибридные белки" авторы применяют к любому гибриду, включающему любые функциональные участки внеклеточного домена полипептида и любой участок из константных областей иммуноглобулина, например домены СН1, СН2 или СН3 или их комбинации. Предпочтительно, белок является представителем семейства рецепторов TNF. Участки молекулы Ig могут происходить из любых различных изо- 9 типов иммуноглобулинов, включая, например, IgG1, IgG2, IgM, IgA и т.п. К "семейству рецепторов TNF" авторы относят любой рецептор, естественно мембраносвязанный или секретируемый (как в случае остеопротегерина), который имеет стандартные участки семейства TNF с дисульфидной связью между цистеинами, или любой рецептор, который связывается с определенным членом из семейства лигандов TNF (например, Banner et al., 1993). Заявленное изобретение согласно другим воплощениям относится к гибридам рецептора семейства TNF-Ig, полученным способами, описанными здесь, так же, как и к фармацевтическим препаратам, их содержащим. Белок LTβR-Ig экспрессируется в двух формах в клетках cos обезьян или в клетках яичников китайского хомячка. Одна форма связывает лиганд с высокой аффинностью - "активная" форма, в то время как другая, "неактивная", форма низкоаффинна. Данная смесь активной и неактивной форм прежде не была описана для любого из гибридных белков рецептора TNF-Ig, однако, природа неактивной формы неясна. Две формы были обнаружены с помощью присутствия двух полос при анализе ДСНполиакриламидного гель-электрофореза. Экспрессируемое вещество содержало значительную гликозилированную гетерогенность; однако, данная гетерогенность, наиболее вероятно, не являлась причиной функциональных проблем, описанных здесь. Например, в случае, когда рецептор экспрессируется в виде растворимой мономерной формы, лишенной трансмембранного домена и Fc-области иммуноглобулина, получаются не-, моно- и ди-Nсвязанные гликозилированные формы. Как одинарная, так и двойная гликозилированные формы могут быть иммунопреципитированны с помощью антител BDA8, которые распознают только функционально активные формы. Более того, афинноочищенные формы содержат подобную гликозилированную гетерогенность. Авторы предположили, что, более вероятно, экспрессия немембраносвязанной формы ведет к некоторому образованию аберрантных дисульфидных связей, выражающемуся в несоответствующем связывании между двумя плечами димера рецептор-Ig. Семейство рецепторов TNF, в основном, содержит 3-4 повторяющихся домена во внеклеточном лигандсвязывающем участке с тремя дисульфидными мостиками на домен. Понятно, что несоответствующая укладка может привести как к неправильному виду дисульфидных связей, так и к отсутствию образования некоторых дисульфидных связей (схематически проиллюстрированных на фиг. 2). В случае гибридного белка рецептор-Ig возможно, что ранняя укладка Fc-домена может способствовать его последующей димеризации, что приводит две 005270 10 цепи LTβR, т.е. два плеча рецептора, в близкое расположение. Если домены рецептора еще не завершили своей укладки, то есть возможность спаривания свободных сульфгидрильных групп между плечами, т.е. образование мостиков между плечами. Может иметь место подобная неправильная укладка, или беспорядочное образование дисульфидных связей может происходить между свободными сульфгидрильными группами, расположенными непосредственно рядом с уже сформированными дисульфидными связями, в обоих случаях приводя к ошибкам укладки. Также возможно, что неправильная укладка может иметь место в пределах одного плеча, т.е. ошибки укладки внутри плеча, хотя подобные ошибки не могут приводить к радикально отличающейся форме конечной молекулы. В данном случае активные и неактивные формы не могут быть легко разделимы с помощью обычных способов определения размера. В заключениe, было показано, что четвертый домен в рецепторе TNFR55, т.е. домен, ближайший к трансмембранному участку, является решающим для связывания лиганда, в случае экспрессии рецептора в виде гибридного иммуноглобулинового белка (Marsters et al., 1992). Данный домен может быть определяющим для многих рецепторов TNF. Другое исследование TNFR55 показало, что это является решающим только в отношении иммуноглобулинового гибридного белка и что мембранная форма, лишенная четвертого домена, будет полностью активна по отношению к связыванию TNF-лиганда (Corcoran et al., 1994).Однако недавно кристаллографический анализ показал возможные критические функции, связанные с четвертым доменом (Naismith et al., 1996). Четвертый домен относительно сохранен среди видов, еще нуждающихся в непосредственном контакте с лигандом (Banner et al., 1993). Возможно, что образование мостиков между плечами на данном участке между двумя четвертыми доменами, которые располагаются рядом с шарнирной областью и СН2+СН3 Fc-доменами, не будет заметно изменять общую форму молекулы и, следовательно, может быть невидимым в способах, основанных на разделении по размеру. Тем не менее, данная молекула будет проявлять более слабое связывание лиганда. Рецепторы, содержащие только три домена, будут вести себя подобным образом. Снижение температуры в процессе культивирования клеток приводит к существенному уменьшению количества неправильно уложенной мелкой формы (т.е. неактивной формы), которая секретируется. Данное усовершенствование, вероятно, ведет к уменьшению скорости укладки полипептида, что будет давать большее время для укладки отдельных доменов участков предшественника LTβR для сборки гибридного белка рецептора Ig в ожидаемую димерную 11 форму. Абсолютная температура, требующаяся для замедления скорости процесса укладки, зависит от вида клетки-хозяина. Для клеток млекопитающих (т.е. СНО) заявленный способ предпочтительно осуществляется при температуре приблизительно от 27 до 35°С, более предпочтительно температура составляет от 27 до 32°С. В заявленных способах также могут применяться дрожжевые системы культивирования. Дрожжевая культура нуждается в культивировании при температуре приблизительно от 10 до 25°С, предпочтительно от 15 до 20°С для достижения существенного преимущества. Применение заявленного изобретения позволяет корректировать укладку активных гибридов белок-Ig. При некоторых обстоятельствах может быть необходимо проводить культивирование клеток при более высоких температурах, например приблизительно от 37 до 43°С, в ходе которого будет наблюдаться только очень низкий уровень экспрессии клонированного гена. После необходимого периода роста гибриды могут быть экспрессированы при низких температурах для обеспечения увеличенного выхода активных гибридов. Низкие температуры для систем млекопитающих, описанных выше, предпочтительно составляют приблизительно от 27 до 35°С, более предпочтительно от 27 до 32°С. Таким образом, заявленные способы с помощью понижения температуры, при которой происходит экспрессия гибридов белок-Ig, позволяют специалистам в данной области регулировать укладку как белка, так и участков Ig в желаемом белке. Кроме того, применяя заявленный способ, включающий проведение аффинной и/или стандартной хроматографии, специалисты могут существенно очистить активные фракции для использования химерных белков с целью блокирования иммунологической функции при различных клинических применениях. Кроме того, при применении заявленных способов, включающих в себя низкотемпературные (т.е. ≤32°С для СНО и ≤25°С для дрожжей) условия культивирования клеток, сейчас является возможным получить культуральный супернатант, который высокообогащен крупной, активной формой LTβR-Ig человека. Более того, возможно, что другие представители данного семейства рецепторов имеют подобные проблемы. Например, авторы наблюдали две схожие полосы на ДСН-полиакриламидном геле при невосстанавливающих условиях для TNFR-55-Ig (также называемого р55 или р60 TNFR). Также свойства другого рецептора семейства TNF, называемого HVEM, улучшают с помощью секреции при низких температурах. Этот рецептор может служить примером ошибочной внутриплечевой укладки, поскольку нет заметной разницы в размерах материалов, полученных при различных температурах. Тем не менее, несмотря на 005270 12 механизм, заявленные способы обеспечивают, в результате, высокий процент более активных гибридных белков, секретированных при низких температурах, в препаратах, содержащих эти и другие представители семейства TNF. Примеры Пример 1. мАТ, специфически распознающие функционально активную форму LTβR-Ig человека. Белок LTβR-Ig (фиг. 1), секретируемый как клетками COS, так и клетками СНО, трансфецированными плазмидой, может быть очищен с помощью стандартного белка А на основе методов аффинной хроматографии. Очищенный белок состоит из двух близко расположенных полос, соответствующих приблизительно 100 кДа, на ДСН-акриламидном геле при невосстанавливающих условиях (фиг. 3). Две полосы различались по кажущемуся размеру приблизительно 5 кДа. Когда белок был восстановлен, в основном, определялись две полосы, соответствующие приблизительно 50 кДа, являющиеся результатом гетерогенного гликозилирования (фиг. 3). Две полосы, наблюдаемые при невосстанавливающих условиях, однако, не являются непосредственно результатом различий в гликозилировании, которые дают пару восстановленных полос. Применяя панель моноклональных антител к LTβR человека, авторы показали, что антитела из группы I, т.е. AGH1 и BDA8, распознают только крупную по молекулярной массе форму рецептора (табл. 1; все данные, за исключением селективности для верхней и нижней полос, были взяты из Browning et al., 1996). Антитела из данной группы непосредственно связываются с лигандсвязывающим участком, что доказано с помощью наблюдения, в котором Fab-фрагмент BDA8 может быть блокирован. Группа II моноклональных антител также может блокировать связывание лиганда, однако, в биологических тестах данные мАТ показали смешанные свойства агониста и антагониста. В случае проведения аффинной хроматографии данными мАТ (в данных экспериментах применяли AGH1) для смеси крупных и мелких форм LTβR-Ig, более мелкая форма рецептора проходила через колонку и более крупная форма задерживалась в матриксе колонки. Элюция при низком рН давала чистый препарат, содержащий крупную форму (фиг. 4). Две фракции анализировали на их способность связываться с поверхностью активированных форболовым сложным эфиром клеток II23 Т-клеточной гибридомы, т.е. клетками, экспрессирующими поверхностный комплекс лимфотоксина (как описано в Browning et al., 1995), и только фракция, связывающаяся с мАТ, была способна связаться с поверхностным лимфотоксином. Фракция, прошедшая через колонку, т.е. нижняя полоса молекулярных масс, была полностью неактивной (фиг. 5). Подробно, супернатанты, полученные из клеток СНО, транс- 13 фецированных конструкцией LTβR-Ig, были пропущены через колонку с белком А для выделения белка. Чистый белок элюировали 25 мМ фосфатно-натриевым буфером при рН 2,8 и фракции, содержащие белок, нейтрализовали 1/10 объемом 0,5 М фосфата натрия с рН 8,6. Проводили иммунопреципитацию в объеме 0,25 мл с 3 мкг LTβR-Ig и 4 мкг мАТ к LTβR-Ig с последующей иммобилизацией мАТ с помощью каппа-задерживающих гранул сефарозы, распознающих только каппа-цепь мышиных мАТ и не взаимодействующих с Fc-доменом человека. Гранулы удаляли центрифугированием и супернатант очищали от оставшегося иммуноглобулина с помощью сефарозы с белком А. Гранулы промывали пробным буфером для ДСН-ПААГЭ (без восстанавливающего агента) и буфер наносили на ДСН-полиакриламидные гели. Проводили гель-электрофорез, гели переносили на фильтр Hybond и проводили Вестерн-блоттинг с Fc-фрагментом антител к IgG человека, связанным с пероксидазой хрена (LTβR-мАТ) с последующим HRP антимышиных IgG и определением хемилюминесценции HRP (Amersharm). Для использования способности AGH1 специфически распознавать активную форму LTβR-Ig готовили AGH1-аффинную колонку, применяя CNBr-активированную сефарозу (Pharmacia, Piscataway, NJ) согласно описанной технологии. Колонку хорошо промывали с помощью PBS, наносили LTβR-Ig, очищенный белком А, и собирали фракцию, прошедшую через колонку. Колонку промывали с помощью PBS и далее проводили элюцию 25 мМ раствором фосфата натрия, рН 2. Фракции, содержащие элюент, сразу же нейтрализовали, как описано выше. Концентрации белка определяли по поглощению при 280 нм, принимая единицу оптической плотности равной 1 мг/мл. Прошедшую сквозь колонку и элюированную фракции, содержащие LTβR-Ig, тестировали по связыванию с помощью FACS-анализа, как описано в Browning et al., 1995. Фракция, прошедшая через колонку, не показала FACS-окрашивания при связывании с клетками, экспрессирующими поверхностный лимфотоксин, в то время как элюированная фракция сохраняла полную связывающую активность. Пример 2. Стандартное хроматографическое разделение функционально активных и неактивных компонентов LTβR-Ig человека. Возможные структурные различия между крупными и небольшими по молекулярной массе компонентами, указанные выше, применяли при создании способов разделения, применяя стандартные хроматографические стадии. Например, белок может быть разделен по размеру с помощью гель-фильтрации в PBS для получения частичного разделения крупных и мелких форм. Данные препараты далее могут быть опять нанесены на эту же колонку для получе- 005270 14 ния препаратов, содержащих крупные и мелкие формы LTβR-Ig человека, которые более чем на 90% обогащены соответствующими компонентами. Альтернативно может быть применена хроматография гидрофобных взаимодействий (HIC) для достижения подобного результата. Смесь белков разбавляли сульфатом аммония, наносили на HIC-колонку и проводили дифференциальную элюцию крупных и мелких компонентов с помощью снижающегося солевого градиента. В данных условиях получали базовое разделение двух компонентов LTβR-Ig человека (фиг. 6). Данные способы так же, как и вышеописанный иммунноаффинный метод, пригодны для получения мг количеств препаратов, содержащих крупные и мелкие формы LTβR-Ig, но остается большая необходимость получения большего количества данных компонентов для фармацевтического применения. Авторами предложен новый способ применения HICметода к смолам, которые могут быть получены в большом количестве, и определены условия хроматографии, которые позволяют проходить мелкой форме LTβR-Ig человека сквозь колонку, при этом крупный по размеру компонент задерживается и может быть отдельно элюирован (фиг. 6). Элюированное вещество может быть подвержено конечному этапу, такому как вытеснительная по размеру молекул или ионобменная хроматография, для удаления агрегированного вещества и других примесей, и после сочетания с подходящим физиологическим буфером вещество может применяться в работе in vivo. Ниже в первом примере (А) представлены специфические условия, которые применимы для аналитической оценки количества неактивного вещества в препарате, содержащем LTβRIg. Во втором примере (В) описан процесс препаративной очистки, в результате которого препарат, содержащий LTβR-Ig, сильно обогащен активным компонентом. А) Аналитическая хроматография гидрофобных взаимодействий (HIC) может применяться в качестве количественного теста для оценки количества неактивного LTβR-Ig. Базовое разделение мелких, неактивных и крупных, активных компонентов рекомбинантного LTβR-Ig человека проводили на колонке Perseptive Biosystems Poros ether/m (4,6х100 мм, номер в каталоге Р091М526), уравновешенной 1,5 М сульфатом аммония с последующей элюцией в понижающемся градиенте сульфата аммония. Препараты, содержащие LTβR-Ig, разбавляли до концентрации 0,1 мг/мл и переносили в конечный буфер, состоящий из 1,5 М сульфата аммония, 20 мМ фосфата натрия, рН 9 (буфер А). Порцию (1 мл, содержащий 100 мкг белка) вносили в колонку Роrоs ether/m. Колонку промывали 8,3 мл буфера А. Активный и неактивный компоненты дифференциально элюировали с помощью линейного градиента (общий 15 градиентный объем составляет 16,6 мл) от 100% буфера А до 100% буфера В (20 мМ фосфат натрия, рН 9) с последующей промывкой 16,6 мл буфера В. Определяли поглощение при 214 нм выходящего из колонки раствора. Всю процедуру проводили при комнатной температуре со скоростью потока в колонке 1 мл/мин. Профиль элюции типичной аналитической хроматограммы HIC показан на фиг. 5. Пику 1 соответствует неактивная фракция и пику 2 - активная фракция LTβR-Ig. Для количественного определения относительного вклада двух форм площади пиков интегрировали с помощью Perseptive instruments Vison integration software. В) Препаративная очистка рекомбинантного LTβR-Ig человека. Очистка и концентрация кондиционированной среды. Из 10 л кондиционированной среды удаляли осколки клеток, полученных из выросших в культуре клеток СНО, секретирующих рекомбинантный LTβR-Ig, пропуская неактивный конечный фильтрат через 5 мкм полипропиленовый мембранный фильтр площадью 5 кв.футов Calyx (Microseparation Inc., Westborogh, MA) с последующим пропусканием через 0,2 мкм 4дюймовый патронный фильтр Opticap (Millipore Corp., Bedford, MA). Очищенную среду концентрировали с помощью ультрафильтрации до приблизительно 1 л, применяя три последовательно соединенных спиральных патрона для ультрафильтрации S1Y30 (Amicon, Beverly, MA). Аффинная хроматография с белком А. Концентрированную кондиционированную среду пропускали под действием силы тяжести через быстротечную колонку (Pharmacia), содержащую 10 мл сефарозы с белком А при 4°С. Колонку промывали с помощью 50 мл PBS, 50 мл PBS, содержащего 0,5 М NaCl, и 50 мл PBS. Для удаления загрязнения бычьим IgG колонку промывали 50 мл 25 мМ сульфата натрия, рН 5,5. Связавшийся LTβR-Ig элюировали под действием силы тяжести с помощью 25 мМ сульфата натрия, 100 мМ NaCl, рН 2,8 фракциями по 3 мл и сразу же нейтрализовали с помощью 0,3 мл 0,5 М фосфата натрия, рН 8,6. Фракции, содержащие белок, определяли с помощью абсорбционной спектроскопии, объединяли и хранили при -70°С. Хроматография гидрофобных взаимодействий. Объединенную элюированную фракцию, полученную при хроматографии с белком А (40 мл при концентрации 2,5 мг/мл), разбавляли с помощью 40 мл 3 М хлорида натрия, 40 мМ фосфата натрия рН 7 и 20 мл 1,5 М хлорида натрия, 20 мМ фосфата натрия рН 7 (все растворы находились при комнатной температуре). Объединенную фракцию вносили в 10х100 мм (7,8 мл) Source PH15 (Pharmacia, Piscataway NJ) при скорости элюции 2 мл/мин. Колонку промывали с 005270 16 помощью 79 мл 1,5 М хлорида натрия, 20 мМ фосфата натрия рН 7 при скорости потока 20 мл/мин. Связавшийся белок элюировали с помощью 20 мМ фосфата натрия рН 7 при скорости элюции 2 мл/мин. Определяли поглощение входящей фракции при 280 нм и собирали 9 мл фракции. Элюированные фракции, содержащие белок, определяли с помощью УФ абсорбционной спектроскопии, объединяли и хранили при -70°С. На фиг. 7 представлен типичный профиль элюции хроматограммы гидрофобных взаимодействий. При данных условиях неактивное вещество проходило через колонку, не задерживаясь, и активное вещество связывалось со смолой. Вставка на фиг. 7 содержит сканированное изображение NR ДСН-полиакриламидного геля, выдержанного в кумасси синем, содержащем соответственно прошедшую сквозь и элюированную фракции. Вытеснительная xроматография по размеру молекул. Приблизительно 100 мл (1,3 мг/мл) объединенной элюированной фракции, полученной при проведении HIC, содержащей активные компоненты LTβR-Ig, концентрировали с помощью ультрафильтрации до 9 мл, применяя центрифугу centriprep 30 (Amicon, Beverly, МА). Концентрат (10,3 мг/мл) вносили в 1,6х100 см колонку Superose-6 prep grade (Pharmacia, Uppsala, Sweden), уравновешенную с помощью PBS, при скорости потока 1 мл/мин. Собирали входящий раствор фракциями по 3 мл. Фракции, содержащие белок, определяли с помощью УФ абсорбционной спектроскопии. Выбранные фракции анализировали на содержание агрегатов с помощью NR ДСН-полиакриламидного гель-электрофореза с внесением 3 мкг в лунку. Объединяли фракции, содержащие минимально определяемые агрегаты, и хранили при -70°С. Таким образом, LTβR-Ig может быть получен с минимальным содержанием неактивного компонента LTβR-Ig, который присутствует в неочищенной культуральной среде. Пример 3. Низкотемпературные условия ферментации, повышающие содержание крупного, активного компонента LTβR-Ig человека в ходе стадии клеточного культивирования. При стандартных условиях культивирования клеток млекопитающих LTβR-Ig человека секретируется в виде смеси, состоящей приблизительно из 50% крупных и 50% мелких по размеру компонентов. При применении клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом, для экспрессии данного белка наблюдается сильное снижение количества мелкой формы. Поскольку клетки насекомых культивировали при 28°С, авторы исследовали влияние низкой температуры культивирования клеток млекопитающих, секретирующих LTβR-Ig человека, на соотношение количества крупной и мелкой форм. На 17 фиг. 8 представлены супернатанты, полученные из клеток СНО, секретирующих LTβR-Ig человека, культивированных в Т-образных колбах при 28, 30, 33, 35 и 37°С, и анализированных с помощью Вестерн-блоттинга. Крупная и мелкая формы (указанные стрелками) присутствовали в культурах, культивированных при 33, 35 и 37°С. Присутствие очень небольшого количества мелкой формы можно заметить в полосах, содержащих культуральный супернатант, полученный из клеток, культивированных при 30 и 28°С. Таким образом, понижение температуры в ходе культивирования клеток резко снижает количество мелкой, неактивной формы LTβR-Ig человека. Для количественного определения соотношения между температурой культивирования клеток и степенью обогащения крупной, активной формой LTβR-Ig человека были приготовлены продублированные колбы для культивирования и проводили культивирование при температурах от 28 до 37°С с интервалом в 1°. Образцы LTβR-Ig человека, очищенного с помощью аффинной хроматографии с белком А, анализировали проведением аналитической хроматографии HIC для определения количественного соотношения крупного и мелкого компонентов LTβR-Ig человека, присутствующих в препаратах, полученных из клеток, культивированных при различных температурах. Как показано графически на фиг. 9, количество компонента, соответствующего нижней полосе, быстро уменьшается приблизительно в 5 раз при снижении температуры с 37 до 32°С. Снижение температуры культивирования до 28°С продолжает уменьшать количество компонента, соответствующего нижней полосе, но в гораздо в меньшей степени. Данные результаты показали, что снижение температуры культивирования с 37°С только на несколько градусов резко уменьшает количество мелкой по молекулярной массе формы, таким образом увеличивая выход крупной, активной формы LTβR-Ig человека. Основываясь на этих данных, выбрали температуры культивирования 32 и 28°С для проверки воспроизводимости данных результатов в широком масштабе при условиях, пригодных для производства, применяя клетки СНО, секретирующие рекомбинантный LTβR-Ig человека, которые адаптированы к росту в суспензии. Для данных исследований проводили выращивание клеток до плотности приблизительно 2х106 клеток/мл при 37°С, культуру разбавляли приблизительно 4 объемами среды для выращивания и инкубировали при 32°С до снижения клеточной жизнеспособности ниже 80%. Понижение температуры до 28°С в ходе фазы продукции также приводит к существенному снижению уровня содержания неактивного компонента в конечном объеме. Интересно отметить, что, хотя количество клеток существенно не увеличивается в ходе фазы продукции при 28 или 32°С, на- 005270 18 блюдается увеличение в несколько раз титра продукта в полученной кондиционированной среде по сравнению с культурой, культивированной исключительно при 37°С. Специфические условия, которые применяли при проведении процесса при 32 и 28°С, описаны ниже. Первоначально полученные данные дали возможность предположить, что понижение температуры культивирования приводит к подобному преимуществу в других системах клеток-хозяев, таких как дрожжи. Интересно, что для дрожжей преимущества низкотемпературной продукции наблюдали при гораздо более низких температурах, чем для клеток млекопитающих. Дрожжи, культивированные при 30°С, продуцировали преимущественно неактивную форму, культуры, выращенные при 25°С, содержали приблизительно равную по содержанию смесь неактивной и активной форм, и культуры, ферментированные при 16°С, продуцировали преимущественно активную форму LTβRIg человека. Данные наблюдения дали возможность предположить, что ферментация при низкой температуре будет приводить к существенно большему выходу активного компонента LTβR-Ig человека в любой секретирующей системе клеток-хозяев. Специалист в данной области может легко определить оптимальную температуру продукции для каждой системы. Ниже авторами представлен подробный пример применения данного процесса к продукции LTβR-Ig человека. Были разработаны два способа клеточного культивирования, в которых используется тот факт, что уменьшение температуры культивирования клеток существенно снижает количество неактивного компонента, присутствующего в секретированном клеткамихозяевами LTβR-Ig. Кроме того, неожиданное преимущество низкотемпературной ферментации представляет собой увеличение титра в несколько раз по сравнению со стандартной ферментацией, проводимой при 36-37°С. В табл. 2 представлены сравнительные выходы и относительное количество неактивных компонентов LTβR-Ig, полученных с помощью двух различных клеточных линий, трансфецированных различными конструкциями LTβR-Ig, которые различаются степенью гликозилирования (не подходящие to the thrust данного примера). Процесс клеточного культивирования при 32°С. Клетки СНО, секретирующие LTβR-Ig человека и адаптированные к росту суспензии, культивировали в среде для выращивания DME/HAM's F-12 (см. ниже табл. 3) с добавлением 10% FBS, 140 мг/л стрептомицина и 50 мг/л гентамицина. Для увеличения масштаба в две вращаемые колбы объемом 750 мл вносили приблизительно 2х105 клеток/мл в среде для выращивания. Культуры выращивали при 37°С 19 в атмосфере 5% СО2 до плотности приблизительно 3х106 клеток/мл. Суспензии клеток, полученные из обеих культур, выращенных при вращении, объединяли для внесения в крупномасштабный биореактор, содержащий приблизительно 10 л среды для выращивания. Культуру оксигенировали при 11% О2 и выращивали в течение 3 дней при 37°С до плотности приблизительно 2х106 клеток/мл. Данную культуру вносили в продуцирующий биореактор, содержащий 33 л среды для выращивания при плотности приблизительно 6,4х105 клеток/мл. Затем в биореакторе для осуществления продукции проводили культивирование в течение 8 дней при выгодной температуре 32°С с оксигенированием при 11% О2. Плотность клеток в день сбора клеток, выросших в культуре (8-й день) составила приблизительно 2х106 клеток/мл при жизнеспособности приблизительно 60%. При данных условиях получили титр 12 мг/л LTβRIg, который был в 2 раза больше, чем в случае культивирования подобных клеток при стандартной температуре 37°С. Относительное содержание неактивного компонента в препарате LTβR-Ig составило 17%, что представляло собой снижение более чем на 60% по сравнению с продуктом, полученным из культуры, выросшей при 37°С. Процесс клеточного культивирования при 28°С. Клетки СНО, секретирующие LTβR-Ig человека и адаптированные к росту суспензии, культивировали в среде для выращивания DME/HAM's F-12 (см. ниже табл. 3) с добавлением 10% FBS, 140 мг/л стрептомицина и 50 мг/л гентамицина. Для увеличения масштаба в две вращаемые колбы объемом 800 мл вносили приблизительно 2х105 клеток/мл в среде для выращивания. Культуры выращивали при 37°С в атмосфере 5% СО2 до плотности приблизительно 3,5х106 клеток/мл. Суспензии клеток, полученные из обеих культур, выращенных при вращении, объединяли для внесения в крупномасштабный биореактор, содержащий приблизительно 10 л среды для выращивания. Культуру оксигенировали при 11% О2 и выращивали в течение 2 дней при 37°С до плотности приблизительно 1,7х106 клеток/мл. Данную культуру вносили в два биореактора для осуществления продукции объемом по 40 л и один объeмом 10 л с первоначальной плотностью клеток 2,5-3х105 клеток/мл с соотношением деления материала 1:9. В биореакторах для осуществления продукции проводили культивирование при 37°С и оксигенирование при 11% O2 до достижения плотности клеток приблизительно 2х106 клеток/мл (2 дня). К концу второго дня понижали температуру в биореакторах до 28°С и проводили культивирование в биореакторах в течение дополнительных 5 дней. На 7-й день при плотности клеток приблизительно 3х106 клеток/мл и 005270 20 клеточной жизнеспособности меньше 75% проводили сбор выросших клеток в биореакторах и кондиционированную среду обрабатывали, как описано выше. При данных условиях достигался конечный титр, равный приблизительно 20 мг/л LTβR-Ig, который превышал в 3,3 раза титр, полученный при культивировании подобных клеток при 37°С. Относительное содержание неактивного компонента составило 10%, что представляет собой снижение на 80% по сравнению с веществом, полученным при 37°С. Пример 4. Изменения в Fc-домене для минимизирования количества неактивных форм в ходе продукции. Основываясь на гипотезе авторов, объясняющей появление неактивных молекул в данных препаратах, можно предсказать, что увеличение периода времени перед димеризацией Fcдоменов будет увеличивать фракцию рецептора с правильно уложенными доменами. Авторы исследовали несколько способов достижения данного результата. Возможно, что укладка различных Fc-доменов Ig проходит с разной скоростью, тем не менее, замена IgG1 домена на IgG4 домен не изменяет соотношение активной и неактивной формы. Во-вторых, остатки цистеина в шарнирной области, которые поперечно сшивают две белковые цепи, были удалены мутагенезом из Fc-домена IgG1. Fc-домены могут хорошо димеризоваться в отсутствие образования дисульфидных связей в шарнирной области, но скорость может замедляться при их отсутствии. Замена двух цистеиновых остатков на аланин приводит к уменьшению количества неактивной формы, что количественно определяли с помощью ДСН-полиакриламидного гельэлектрофореза и хроматографии гидрофобных взаимодействий HIC, при этом дикий тип LTβRIg будет содержать 50 и 5% неактивных форм при 37 и 28°С, делеция цистеинов в шарнирной области IgG1 приводит к 20 и 5% содержанию неактивной формы, полученной соответственно при данных температурах. Поэтому модификация шарнирной области с помощью замены обоих цистеиновых остатков может улучшить качество препарата и, более того, возможно, что замена только одного остатка цистеина может обеспечить данное преимущество. Подобные генетические модификации могут уменьшить процентное содержание неактивной формы в сочетании с низкотемпературными способами продукции. Пример 5. Делеция цистеиновых мостиков для устранения проблем укладки. Обычно является очень сложным определить пути, с помощью которых белок принимает конечную правильную форму. Тем не менее, некоторые дисульфидные мостики в семействе рецепторов TNF являются необычными и могут не быть необходимыми для конечной стадии укладки. Данные мостики являются хорошим 21 объектом для мутагенеза. Один подобный мостик в третьем домене LTβR-Ig удаляли с помощью обычного сайт-специфического мутагенеза с заменой цистеинов 101 и 108 на аланины (нумерация взята из последовательности, определенной Ware et al., 1995), что ведет к улучшению соотношения неактивной/активной формы, определенного с помощью ДСН-полиакриламидного гель-электрофореза. Дикий тип LTβR-Ig обычно содержит 50 и 5% неактивной формы в случае продукции при 37 и 28°С соответственно. Мутантная форма с делецией одного цистеинового дисульфидного мостика содержит 20 и 5% неактивной формы, полученной при данных температурах. Пример 6. Применение низких температур для улучшения качества препарата HVEM-Ig. Медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM) представляет собой рецептор семейства TNF, относящийся к LTβR, и прочно связывается с лигандом LIGHT, прочно и легко с лигандом лимфотоксина-α (LTα) (Mauri et al., 1998). HVEM человека получали в виде гибридного иммуноглобулинового белка с помощью ПЦР-амплификации внеклеточного домена и слияния с СН2 и СН3-областью IgG1 человека, как описано для LTβR-Ig (Crowe et al., 1994). Конструкцию вставляли в вектор, названный СН269 (Chicheportiche et al., 1997), для кратковременной экспрессии в клеточной линии 293 эмбриональной почки человека с высокой экспрессией копий вектора с помощью системы EBNA (клетки 293-Е). Супернатант собирали и очищали HVEM-Ig с помощью аффинной хроматографии с белком А и элюции при низком рН. Рекомбинантный LTα получали, используя клетки насекомых, как описано (Browning et аl., 1996а). Рекомбинантный растворимый LIGHT человека получали проведением ПЦРамплификации полной кДНК, применяя РНК из активированных клеток II23, получая кодирующую область последовательности, описанную Mauri et al., 1998. Рецепторсвязывающий домен LIGHT амплифицировали с помощью ПЦР и присоединяли к лидерной последовательности фактора спаривания альфа и экспрессировали, в основном, как описано для других родственных белков (Browning et al., 1996). Вводили метку FLAG и область (G4S)3 аминокислотной последовательности между лидерной последовательностью и рецепторсвязывающим доменом, так чтобы секретируемый LIGHT содержал Nконцевую последовательность FLAG. Конструкция кодировала следующую молекулу: где двумя точками показана предполагаемая Nконцевая последовательность зрелого белка, который может далее подвергаться процессингу с помощью удаления следующих двух амино- 005270 22 кислот (ЕА). Белок выделяли из супернатанта проведением аффинной хроматографии с применением колонки с мАТ против FLAG и элюцией с помощью как низкой рН, так и хелатообразования с кальцием. Также вводили полноразмерный LIGHT в вектор СН269 для экспрессии на поверхности клеток 293-Е, как описано (Chicheportiche et al., 1997). Методы FACS для определения связывания гибрида рецептор-Ig с клеточными поверхностями и методы BIAcore для измерения связывания растворимых лигандов с иммобилизованным гибридом рецептор-Ig описаны (Mackay et al., 1997). Технология BIAcore позволяет измерить реальное время связывания белка с чипами (т.е. рецептором). Клетки СНО, экспрессирующие HVEM-Ig, выращивали до сливания при 37°С в бутылках с перемешиваемым при вращении содержимым, применяя среду для выращивания с добавлением 10% FBS. Когда клетки достигали сливания, истощенную среду заменяли свежей средой для выращивания и инкубировали культуры при 37, 32 и 28°С. Сбор клеток в культурах, инкубированных при 28 и 32°С, проводили 1 раз в неделю, в культуре, инкубированной при 37°С, каждые 4 дня. Секретированный HVEM-Ig очищали, как описано, с помощью аффинной хроматографии с белком А. Очищенные препараты до проведения анализа хранили при -70°С. После получения HVEM-Ig при 28, 32 и 37°С и его очистки все препараты вели себя схоже при проведении ДСН-полиакриламидного гельэлектрофореза (фиг. 10), давая предположение об отсутствии больших изменений в белке. Поэтому при наличии неправильных укладки/образования дисульфидного мостика они располагаются как внутри плеча, так и в ближайшем соседстве с шарнирной областью Fcдомена, т.е. образование мостиков внутри плеча, и, следовательно, заметно не влияют на общую форму молекулы при ДСН-ПААГЭ. Способность гибрида рецептор-Ig связываться с LIGHT, экспрессированным на клетках 293-Е, или с LIGHT на активированных клетках II23 оценивали с помощью FACS-анализа (фиг. 11). Для обоих типов клеток способность HVEM-Ig связываться с лигандом на поверхности клетки была лучше приблизительно в 2-3 раза по сравнению с экспрессией при 32°С. Применяя метод BIAcore, получили, что, когда чипы BIAcore были нагружены HVEM-Ig до сходных уровней (значения RU отражают количество белка на чип), продуцированный при более низких температурах HVEM-Ig связывал больше лиганда, чем белки, продуцированные при более высоких температурах (фиг. 12). Данный результат получили как для лиганда LIGHT, так и для LTα. Кривые связывания, полученные при проведении BIAcore, показывают реальное время в ходе и после процесса связывания, и можно увидеть, что процессы связывания имеют подобную независимость от температуры продукции. Поэто- 23 му часть препарата является действительно неактивной, и данную порцию минимизируют с помощью понижения температуры продукции. Авторы полагают, что более низкие температуры устраняют проблему неправильной укладки и увеличивают процентное содержание активных молекул, хотя и нет возможности непосредственного наблюдения фракции, содержащей неактивные молекулы. Технология аффинной хроматографии, как изложено выше, может быть пригодной для разделения активной/неактивной форм, следуя за оптимизацией получения с помощью понижения температуры культивирования и/или мутагенеза различных цистеинов как в шарнирной области, так и в самом рецепторе для предупреждения неправильной укладки. Пример 7. Общая схема минимизирования содержания неактивной формы других гибридных белков, включающих рецептор семейства TNF и иммуноглобулин. Большинство рецепторов семейства TNF получают в виде гибридных белковых конструкций с Fc-доменами иммуноглобулина. Ссылки р55 TNF-R (Loestcher et al., 1991, Marsters et al., 1992; Ashkenazi et al., 1991) p75 TNF-R (Mohler et al., 1993) (Crowe et al., 1994) LTβ-R Fas (Suda et al., 1993) CD27 (Goodwin et al., 1993) CD30 (Smith et al., 1993) CD40 (Fanslow et al., 1992) Oх40 (Baum et al., 1994) 4-1BB (Alderson et al., 1994) HVEM (Mauri et al., 1998) В некоторых случаях, наиболее значительно, Fas-Ig и CD40-Ig, например Fanslow et al., 1992, химерные белки являются менее активными по сравнению с растворимыми Fcформами двух рецепторов TNF. Возможно, что некоторые из данных препаратов представляют собой смеси активной и неактивной форм в различных соотношениях. К неактивной форме упрощенно относят молекулу, которая связывается с существенно более низкой аффинностью (в 10-1000 раз), чем активная форма, т.е. она может быть не полностью лишена связывающей активности, но взамен обладает сниженным сродством к лиганду по сравнению с высокоаффинной формой, естественно находящейся на клетках. Неправильно образованные дисульфидные связи между плечами рецептора или внутри плеча рецептора могут приводить к снижению активности белка. Для любых из данных рецепторов или других еще не идентифицированных рецепторов может быть получена панель с мАТ к рецептору с помощью стандартных способов. Данные антитела, способные блокировать связывание лиганда с рецептором, что предпочтительно оце- 005270 24 нивают с помощью анализа на связывание лиганда с естественным рецептором на поверхности клетки (хотя могут быть достаточными другие способы с применением рекомбинантных форм рецептора), могут быть использованы для получения аффинных колонок. Препарат, состоящий из смеси активной и неактивной форм рецептор-Fc, пропускают через колонку и собирают фракцию, прошедшую, не задерживаясь. Вещество, связавшееся с колонкой, элюируют с помощью буфера с низким рН (обычно рН 2,54,0), немедленно нейтрализуя. Две фракции связываются как с клетками в анализе FACS (или в любом другом стандартном анализе на связывание), так и с лигандом при различных концентрациях белка. Некоторые из данных мАТ будут селективно связываться с активной формой, и будет заметно различие между концентрацией, необходимой для достижения 50% связывания во фракции, прошедшей насквозь, и элюатом. Данный результат означает, что мАТ являются разграничивающими мАТ. Соотношение количества белка в элюате к фракции, прошедшей насквозь, будет указывать процентное содержание активной формы в препарате. Данные мАТ, таким образом, идентифицированные, могут применяться для аффинной очистки активной формы. Более того, их применение в различных иммунологических анализах может быть использовано для оптимизирования экспрессии правильной формы желаемого гибрида рецептор-Fc. В дальнейшем анализ может применяться в сочетании с другими стандартными способами очистки для нахождения способов, с помощью которых можно очистить активную форму рецептора, не прибегая к аффинным способам. Применяя данные мАТ для описанных активной и неактивной форм, может быть оптимизирована температура культивирования и разработаны хроматографические способы для увеличения содержания активной формы. Альтернативно, могут применяться способы колоночной HIC для разделения активной и неактивной форм, и с помощью данного способа могут быть оптимизированы условия культивирования. Также данные анализы формируют основу для мутагенеза цистеинов участка рецепторов для установления проблемных дисульфидных связей, которые при устранении дают функционально активное вещество. Поскольку многие из данных рецепторов будут применяться в качестве терапевтических препаратов при заболеваниях человека и будет необходимость введения пациенту только правильно уложенных форм, данные способы будут иметь применение как для определения состава препарата, так и для удаления слабосвязывающихся форм. Специалистам в данной области будет понятно, что в способах по настоящему изобретению могут иметь место различные модификации и вариации без отступления от сущности и 25 005270 26 пределов изобретения. Таким образом, подразумевается, что настоящее изобретение охватывает модификации и вариации данного изобретения, обеспечивая, чтобы они находились в пределах прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов. Таблица 1 Краткая характеристика моноклональных антител к LTβR Цитотоксичность НТ29 а Тест, оценивающий способность антител блокировать связывание растворимого рецептора с активированными II23. nd=нет. b Планшет, покрытый козьими антителами против мышиных Fc, фиксированных мАТ против рецептора HT29s и IFNγ. с Блокирование d Потенцирование е Вариабельно, в некоторых тестах наблюдается частичное ингибирование, в других - нет ингибирования. f Преципитированная форма рецептора, полученная с помощью мАТ плюс каппазадерживающей системы. g Группы были определены на основании данных этой таблицы плюс эпитопное картирование с помощью технологии BIAcore. Таблица 2 Экспрессия конструкций LTβR-Ig культивированными клетками СНО при различных температурах культивирования a Уровень экспрессии оценивали с помощью аффинной хроматографии с белком А. b Количество неактивных компонентов, присутствующих в препарате LTβR-Ig, оценивали после аффинной очистки с белком А с помощью аналитической хроматографии HIC. Таблица 3 Компоненты среды для выращивания DME/HAM's F-12 a Компоненты смешивали с порошкообразной основой среды и объем далее доводили до 1 л. рН cреды доводили до 7,20-7,25 с помощью 50% НСl. Ссылки Aggarwal. В. and Natarajan, К. (1996) Eur. Cytokine Rev. 7:93 Alderson, M.R. et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24, 2219-27 Ashkenazi, A. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535-9 Banner. D.W. et al. (1993) Cell 73, 431-445 Baum. P.R. et al. (1994) Embo J. 13, 39924001 Bazzoni, F. and Beutler. B. (1996) New England J. Med. 334:1717 Browning, J.L. et al. (1995) J. Immunol. 154, 33-46 Browning, J. et al. (1996) J. Exp. Med. 183, 867-878 Browning, J.L. et al. (1996a) J. Biol. Chem. 271, 8618-8628 Bucay, N. et al. (1998) Genes and Development 12:1260 Chaplin, D. and Fu, Y-X. (1998) Current Opinion in Immunology 10, 289-297 Chiceportiche, Y. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 32401-32410 Corcoran, A. et al. (1994) Eur. J. Biochem. 223, 831-840 Crowe, P.D. et al. (1994) Science 264, 707-10 Eason, J.D. et al. (1996) Transplantation 61:224 Eggermont, A.M. et al. (1996) J. Clin. Oncology 14:2653 Fanslow. W.C. et al. (1992) J. Immunol. 149, 655-60 Feldmann, M. et al. (1997) Ann. Immunol. 64:283-350 Goodwin, R.G. et al. (1993) Cell 73, 447-56 Green, D. and Ware, C.F. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:5986 27 Harrop, J.A. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:27548 Loetscher. H. et al. (1991) J Biol Chem 266, 18324-9 Mackay, F. et al. (1998) Gastroenterology 115: 1484-1475 Mackay, F. and Browning, J. (1998) Nature 395:26 Mackay, F. et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2033-42 Marsters, S. et al. (1992) J. Biol. Chem. 267, 5747-5750 Mauri, D.N. et al. (1998) Immunity 8, 21-30 Mohler, et al. (1993) J. Immunol. 151, 1548-61 Naismith, J. et al. (1996) J. Mol. Recognition 9, 113-117 Rennert, P.D. et al. (1996) J. Exp. Med. 184, 1999-2006 Rennert, P.D., Browning, J.L., and Hochman, P.S. (1997) Int. Immunol. 9, 1627-39 Simmonet, W.S. et al. (1997) Cell 89:309 Smith, C.A., Farrah, Т., and Goodwin, R.G. (1994) Cell 76, 959-62 Smith, С.А. et al. (1993) Cell 73, 1349-60 Suda, Т., Takahashi, Т., Golstein, P., and Nagata, S. (1993) Cell 75, 1169-78 Van Dullemen, H.M. et al. (1995) Gastroenterology 109:129 Ware, C.F. et al. (1995) Current topics in Microbiology and Immunology 198, 175-218 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Композиция, содержащая по меньшей мере 70% биологически активного гибридного белка рецептор-иммуноглобулин (гибридного белка рецептор-Ig), полученного культивированием клетки-хозяина млекопитающего, трансформированной ДНК, кодирующей гибридный белок рецептор-Ig, в культуральной системе, имеющей температуру приблизительно от 27 до 35°С, где гибридный белок рецептор-Ig содержит представителя семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF). 2. Композиция по п.1, где указанный представитель семейства TNF представляет собой рецептор-55 фактора некроза опухоли или медиатор входа вируса герпеса (HVEM). 3. Композиция по п.2, где, по меньшей мере, один цистеиновый остаток представителя семейства TNF заменен аланином с повышением таким образом выхода биологически активных форм указанного гибридного белка. 4. Композиция по п.1, где указанный гибридный белок содержит рецептор лимфотоксина-β (LT-β-R). 5. Композиция по п.4, где цистеины в положениях 101 и 108 LT-β-R заменены аланинами. 6. Способ получения композиции, охарактеризованной в любом из пп.1-5, предусматривающий культивирование клеток-хозяев млекопитающего, трансформированных ДНК, коди- 005270 28 рующей желаемый гибридный белок в культуральной системе, имеющей температуру приблизительно от 27 до 35°С. 7. Способ по п.6, где температура составляет приблизительно от 27 до 32°С. 8. Способ по п.6, где указанные трансформированные клетки-хозяева сначала культивируют при температуре, превышающей приблизительно 33°С, в течение периода времени, достаточного для обеспечения роста указанных клеток-хозяев. 9. Способ по п.6, где выделение осуществляют по методу хроматографии, основанной на гибдрофобных взаимодействиях. 10. Фармацевтический препарат, полученный путем (a) культивирования хозяина, трансформированного ДНК, кодирующей гибридный белок рецептор-Ig в культуральной системе, имеющей температуру приблизительно от 27 до 32°С, где гибридный белок рецептор-Ig содержит представителя семейства рецепторов TNF, экспрессируя таким образом биологически активные гибридные белки рецептор-Ig; (b) выделения биологически активных гибридных белков рецептор-Ig из указанной культуральной системы и (c) объединения биологически активных гибридных белков рецептор-Ig, полученных на стадии (b), с фармацевтически приемлемым носителем. 11. Фармацевтический препарат по п.10, где гибридный белок рецептор-Ig содержит рецептор лимфотоксина-β. 12. Фармацевтический препарат по п.10, где гибридный белок рецептор-Ig содержит HVEM. 13. Композиция, содержащая биологически активный гибридный белок рецептор-Ig, полученный культивированием дрожжей, трансформированных ДНК, кодирующей гибридный белок рецептор-Ig, в культуральной системе, имеющей температуру приблизительно от 10 до 25°С. 14. Композиция по п.13, где указанный гибридный белок содержит представителя семейства TNF. 15. Композиция по п.13, где указанный гибридный белок содержит рецептор лимфотоксина-β или его фрагмент. 16. Композиция по п.13, где указанный гибридный белок содержит HVEM или его фрагмент. 29 Фиг. 1 005270 30 Фиг. 5 Фиг. 6 Фиг. 2 Фиг. 3 Фиг. 7 Фиг. 8 Фиг. 4 31 005270 32 Фиг. 9 Фиг. 11 Фиг. 10 Фиг. 12 Евразийская патентная организация, ЕАПВ Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2/6
