012416 Область техники, к которой относится изобретение

012416
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к ингибиторам PARP и включает соединения и композиции, содержащие названные соединения. Кроме того, настоящее изобретение представляет способы использования названных ингибиторов PARP, например, в качестве лекарства.
Предпосылки к созданию изобретения
Ядерный фермент поли(ADP-рибоза)полимераза-1 (PARP-1) является представителем семейства
ферментов PARP. Данное увеличивающееся семейство ферментов состоит из PARPs, таких как, например, PARP-1, PARP-2, PARP-3 и Vault-PARP; и танкираз (TANKs), таких как, например, TANK-1, TANK2 и TANK-3. PARP также называют поли(аденозин 5'-дифосфорибоза)полимеразой или PARS
(поли(ADP-рибоза)синтетазой).
PARP-1 является основным ядерным белком с массой 116 кДа, состоящим из трех следующих доменов: N-концевого ДНК-связующего домена, содержащего два цинковых пальца, аутомодифицирующего домена и С-концевого каталитического домена. Он присутствует почти во всех эукариотах. Фермент
синтезирует поли(ADP-рибозу), разветвленный полимер, который может состоять из свыше 200 звеньев
ADP-рибозы. Белковые акцепторы поли(ADP-рибозы) прямо или опосредованно вовлечены в поддержание целостности ДНК. Они включают в себя гистоны, топоизомеразы, ДНК- и РНК-полимеразы, ДНКлигазы и Са2+- и Mg2+-зависимые эндонуклеазы. Белок PARP интенсивно экспрессируется во многих
тканях, больше всего в иммунной системе, сердце, мозге и половых клетках. В нормальных физиологических условиях наблюдается минимальная активность PARP. Однако повреждение ДНК вызывает немедленную активацию PARP, достигающую 500-кратной.
Танкиразы (TANKs) были идентифицированы как компоненты теломерного комплекса человека.
Предполагают также, что они играют роль в движении везикул и могут содействовать белкам, вовлеченным в другие разнообразные клеточные процессы.
Теломеры, которые необходимы для обеспечения нормального функционирования хромосом и их
стабильности, обслуживаются теломеразой, специализированной обратной транскриптазой. TANKs
представляют собой (ADP-рибоза)трансферазы с некоторыми характеристиками как сигнальных, так и
цитоскелетных белков. Они содержат домен PARP, который катализирует поли-ADP-рибозилирование
субстратных белков, чистый альфа-мотив, который поделен некоторыми сигнальными молекулами и
ANK-доменом, который содержит 24 повтора анкирина, гомологичные цитоскелетному белку анкирину.
ANK-домен взаимодействует с теломерным белком, фактором-1 теломерного повторяющегося связывания (TRF-1). Данные белки, таким образом, получили название TRF-1-взаимодействующих, анкиринсвязанных ADP-рибоза-полимераз (TANKs).
Одна из наиболее характерных функций TANK заключается в ADP-рибозилировании TRF-1. Человеческая теломерная функция нуждается в двух теломерспецифичных ДНК-связывающих белках TRF-1
и TRF-2. TRF-2 защищает концы хромосом, a TRF-1 регулирует длину теломеры. ADP-рибозилирование
ингибирует способность TRF-1 связываться с теломерной ДНК. Данное поли-ADP-рибозилирование
TRF-1 высвобождает TRF-1 из теломер, открывая теломерный комплекс и давая доступ теломеразе. Следовательно, TANK функционирует как положительный регулятор длины теломеры, допуская удлинение
теломер теломеразой.
Среди многих функций, приписываемых PARP и особенно PARP-1, одна заключается в том, что она
играет главную роль в облегчении репарации ДНК посредством ADP-рибозилирования и, следовательно,
координирования числа ДНК-репарирующих белков. Как результат активации PARP, уровни NAD+ значительно снижаются. Значительная активация PARP приводит к тяжелому истощению NAD+ в клетках,
испытывающих массивное повреждение ДНК. Короткий период полураспада поли(ADP-рибозы) приводит к значительной интенсивности кругооборота. Как только образовалась поли(ADP-рибоза), она быстро разрушается конститутивно-активной поли(ADP-рибоза)гликогидролазой (PARG) совместно с фосфодиэстеразой и (ADP-рибоза)протеин-лиазой.
PARP и PARG образуют цикл, который конвертирует большие количества NAD+ в ADP-рибозу.
Менее чем за час чрезмерная стимуляция PARP может вызвать уменьшение NAD+ и АТФ до уровня менее 20% от нормального уровня. Такой сценарий особенно губителен при ишемии, когда недостаток кислорода уже радикально подверг опасности клеточную энергопроизводительность.
Последующее продуцирование свободных радикалов при реперфузии, как полагают, представляет
собой основную причину повреждения тканей. Часть уменьшения АТФ, которое типично для многих
органов при ишемии и реперфузии, могло бы быть связано с истощением NAD+ в силу кругооборота поли (ADP-рибозы). Таким образом, предполагают, что ингибирование PARP или PARG сохранит клеточный уровень энергии, тем самым, делая возможным выживание ишемических тканей после инсульта.
Синтез поли(ADP-рибозы) также вовлечен в индуцированную экспрессию ряда генов, существенных для воспалительного ответа. Ингибиторы PARP подавляют продуцирование индуцибельной синтетазы оксида азота (iNOS) в макрофагах, селектина Р-типа и молекулы-1 межклеточной адгезии (ICAM-1)
в эндотелиальных клетках. Данная активность лежит в основе сильных противовоспалительных эффектов, проявляемых ингибиторами PARP. Ингибирование PARP также способно уменьшить некроз путем
предотвращения перемещения и инфильтрации нейтрофилов в поврежденные ткани.
-1-
012416
PARP активируется поврежденными фрагментами ДНК, и после активации катализирует присоединение вплоть до 100 звеньев ADP-рибозы к множеству белков ядра, включая гистоны и сам PARP. При
большинстве клеточных стрессов обширная активация PARP может быстро привести к повреждению
клетки или ее гибели вследствие истощения энергоресурсов. Поскольку четыре молекулы АТФ расходуются на каждую регенерируемую молекулу NAD+, a NAD+ истощена из-за массивной активации PARP,
то в стремлении ресинтезировать NAD+ также может быть истощена АТФ.
Сообщалось, что активация PARP играет ключевую роль как в NMDA-, так и в NO-индуцированной
нейротоксичности. Это было продемонстрировано для кортикальных культур и для долек гиппокампа,
причем предотвращение токсичности прямо коррелировало с эффективностью ингибирования PARP.
Потенциальная роль ингибиторов PARP при лечении нейродегенеративных заболеваний и травмы
головы, таким образом, осознана, даже если точный механизм действия еще не выяснен.
Аналогично, показано, что однократные инъекции ингибиторов PARP уменьшают размер инфаркта,
вызванного ишемией и реперфузией, в сердце или скелетной мышце кроликов. В этих исследованиях
единственная инъекция 3-аминобензамида (10 мг/кг) либо за минуту до окклюзии, либо за минуту до
реперфузии вызывала сходные уменьшения объема инфаркта в сердце (32-42%), тогда как 1,5дигидроксиизохинолин (1 мг/кг), другой ингибитор PARP, уменьшал объем инфаркта с сопоставимым
значением (38-48%). Данные результаты позволяют обоснованно предположить, что ингибиторы PARP
могли бы спасти ранее ишемическое сердце или уменьшить повреждение при реперфузии скелетной
мышечной ткани.
Активацию PARP можно также использовать как критерий повреждения, следующего за нейротоксическими инсультами, являющимися результатом воздействия любого из следующих индукторов, таких
как глутамат (через стимуляцию NMDA рецептора), реакционноспособные кислородные интермедиаты,
амилоидный β-белок, N-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МРТР) или его активный метаболит
N-метил-4-фенилпиридин (МРР+), которые участвуют в таких патологических состояниях, как паралич,
болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. В других работах продолжается исследование роли активации PARP в тучных клетках мозжечка in vitro и при МРТР-нейротоксичности. Чрезмерное воздействие
глутамата на нервную систему, который служит преобладающим нейротрансмиттером центральной
нервной системы и воздействует на рецепторы N-метил-D-аспартата (NMDA) и рецепторы другого подтипа, чаще всего имеет место вследствие паралича или других нейродегенеративных процессов. Лишенные кислорода нейроны высвобождают глутамат в больших количествах при ишемическом инсульте
головного мозга, таком как при параличе или сердечном приступе. Данное избыточное высвобождение
глутамата, в свою очередь, является причиной чрезмерной стимуляции (эксцитотоксичности) рецепторов
N-метил-D-аспартата (NMDA), АМРА, Kainate и MGR, которые открывают ионные каналы и допускают
неконтролируемый поток ионов (например Са2+ и Na+ в клетки и K+ из клеток), что приводит к чрезмерной стимуляции нейронов. Чрезмерно стимулированные нейроны секретируют больше глутамата, создавая цикл обратной связи или эффект домино, который, в конечном счете, приводит к повреждению клеток или их смерти вследствие продуцирования протеаз, липаз и свободных радикалов. Избыточная активация глутамат-рецепторов вовлечена в различные неврологические заболевания и состояния, включая
эпилепсию, паралич, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз
(ALS), болезнь Хантигтона, шизофрению, хроническую боль, ишемию и гибель нейронов после гипоксии, гипогликемию, ишемию, травму и инсульт нервной системы. Глутаматное воздействие и стимулирование вовлечено также как базис в заболевания, включающие навязчивые состояния, в частности в
лекарственную зависимость. Доказательство включает данные, полученные для многих видов животных,
а также для церебральных кортикальных культур, обработанных глутаматом или NMDA, о том, что антагонисты глутаматного рецептора (т.е. соединения, которые блокируют связывание глутамата со своим
рецептором или активацию его рецептора) препятствуют повреждению нервной системы, следующим за
сосудистым параличом. Попытки предотвратить эксцитотоксичность блокированием рецепторов NMDA,
АМРА, Kainate и MGR оказались трудными, поскольку каждый рецептор имеет много сайтов, с которыми может связываться глутамат, и, следовательно, обнаружение эффективной смеси антагонистов или
универсального антагониста для предотвращения связывания глутамата со всем рецептором и для проверки данной теории представляется затруднительным. Более того, многие композиции, которые эффективны при блокировании рецепторов, также являются токсичными для животных. По существу, в настоящее время отсутствует общепризнанный эффективный способ лечения глутаматных расстройств.
Стимуляция глутаматом NMDA-рецепторов, например, активирует фермент нейрональную азотоксидную синтазу (nNOS), приводящую к образованию оксида азота (NO), которым также опосредована
нейротоксичность. NMDA-нейротоксичность можно предотвратить при воздействии ингибиторами азотоксидной синтазы (NOS) или путем прицельной генетической деструкции nNOS in vitro.
Другим использованием ингибиторов PARP является лечение повреждений периферийных нервов и
проистекающего из них патологического болевого синдрома, известного как невропатическая боль, такая, которая индуцируется хроническим констрикционным повреждением (CCI) обычного седалищного
нерва и при которой имеет место транссинаптическое изменение дорсального рога спинного мозга, характеризуемое гиперхромностью цитоплазмы и нуклеплазмы (так называемые "черные" нейроны).
-2-
012416
Существуют также данные, что ингибиторы PARP подходят для лечения воспалительных заболеваний пищеварительного тракта, таких как колит. В частности, колит индуцировали у крыс путем интралуминального введения гаптен тринитробензолсульфокислоты в 50% этаноле. Обработанные крысы получали 3-аминобензамид, специфический ингибитор PARP-активности. Ингибирование PARPактивности уменьшало воспалительный ответ и восстанавливало морфологию и энергетический статус
дистального отдела толстой кишки.
Другие данные говорят о том, что ингибиторы PARP подходят для лечения артрита. Более того,
оказывается, что ингибиторы PARP подходят для лечения диабета. Показано, что ингибиторы PARP
подходят для лечения эндотоксического шока или септического шока.
Ингибиторы PARP также использовали для увеличения продолжительности жизни и способности к
пролиферации клеток, включая лечение таких заболеваний, как старение кожи, болезнь Альцгеймера,
атеросклероз, остеоартрит, остеопороз, мышечная дистрофия, дегенеративные заболевания скелетных
мышц, включая репликативное старение, обусловленная возрастом мышечная дегенерация, старение иммунной системы, СПИД и другие заболевания, обусловленные старением иммунной системы, и для изменения генной экспрессии в состарившихся клетках.
Также известно, что ингибиторы PARP, такие как 3-аминобензамид, воздействуют на общую репарацию ДНК, например, в ответ на действие пероксида водорода и ионизирующей радиации.
Центральная роль PARP в репарации разрывов нити ДНК хорошо известна, особенно когда она
прямо вызывается воздействием ионизирующей радиации или опосредованно, после ферментативной
репарации ДНК-повреждений, индуцированных метилирующими агентами, ингибиторами топоизомераз
I и другими химиотерапевтическими агентами, такими как цисплатин и блеомицин. Разнообразные исследования с использованием "нокаутированных" мышей, транс-доминантных моделей ингибирования
(чрезмерная экспрессия ДНК-связывающего домена), антисмысловых и низкомолекулярных ингибиторов продемонстрировали роль PARP в репарации и клеточном жизнеобеспечении после индукции повреждения ДНК. Ингибирование ферментативной активности PARP должно приводить к повышенной
чувствительности опухолевых клеток по отношению к ДНК-повреждающим способам лечения.
Сообщалось, что ингибиторы PARP эффективны при радиосенсибилизации (гипоксических) опухолевых клеток и для предотвращения восстановления опухолевых клеток от потенциально летального и
сублетального повреждения ДНК после лучевой терапии, предположительно, вследствие их способности
предотвращать соединение разрыва нити ДНК и путем воздействия на некоторые сигнальные пути ДНКповреждения.
Ингибиторы PARP использовали для лечения рака. Кроме того, в патенте США № 5177075 обсуждаются несколько изохинолинов, использованных для усиления летального эффекта ионизирующего излучения или химиотерапевтических агентов по отношению к опухолевым клеткам. В работе Weltin et al.,
"Effect of 6(5-Phenanthridinone), an Inhibitor of Poly(ADP-ribose) Polymerase, on Cultured Tumor Cells", Oncol. Res., 6:9, 399-403 (1994) обсуждается ингибирование активности PARP, пониженная пролиферация
опухолевых клеток и заметный синергетический эффект при обработке опухолевых клеток совместно с
алкилирующим лекарством.
Опубликованы обзоры по данному уровню техники: Li and Zhang в IDrugs 2001, 4(7): 804-812, Ame
at al., в Bioassays 2004, 26: 882-883 и Nguewa et al., в Progress in Biophysic & Molecular Biology 2005, 88:
143-172.
Продолжает существовать потребность в эффективных и сильнодействующих ингибиторах PARP и
более конкретно в ингибиторах PARP-1, которые вызывают минимальные побочные эффекты. Настоящее изобретение предоставляет соединения, композиции и способы для ингибирования активности
PARP для лечения рака и/или предотвращения клеточного, тканевого и/или органного повреждения,
происходящего вследствие повреждения или гибели клетки, например, по причине некроза или апоптоза.
Соединения и композиции по настоящему изобретению особенно походят для повышения эффективности химиотерапии и радиотерапии, где первичный эффект лечения вызван повреждением ДНК в клеткахмишенях.
Уровень техники
Патент GB 1062357, опубликованный 22 марта 1967 г., раскрывает производные хиназолона, обладающие антигипертензивными действиями.
Патент DE 2258561, опубликованный 20 июня 1973 г., раскрывает производные замещенного пиридинона с антигипертензивным действием.
Патент ЕР 13612, опубликованный 11 ноября 1983 г., раскрывает производные замещенного пиперидинилалкилхиназолина. Описанные соединения представляют собой антагонисты серотонина. Более
конкретно, раскрыто соединение № 63 настоящего изобретения.
Патент ЕР 669919, опубликованный 9 июня 1994 г., раскрывает диметилбензофураны и диметилбензопираны в качестве 5-НТ3 антагонистов.
Патент US 5374637, опубликованный 20 декабря 1994 г., раскрывает производные бензамида. Раскрытые соединения обладают свойствами стимулировать сократительную способность желудочнокишечного тракта.
-3-
012416
Патент ЕР 885190, опубликованный 23 декабря 1998 г., раскрывает производные 1,4дизамещенного пиперидина, обладающие гастрокинетическими свойствами.
Патент ЕР 1036073, опубликованный 17 июня 1999 г., раскрывает производные замещенного хиназолиндиона. Описанные соединения обладают свойствами фундальной релаксации.
Патент ЕР 1355888, опубликованный 20 июня 2002 г., раскрывает производные хиназолинона как
ингибиторы PARP.
Описание изобретения
Настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)
их N-оксидным формам, фармацевтически приемлемым аддитивным солям и стереохимически изомерным формам, где
пунктирные линии обозначают необязательные связи;
X представляет собой >N-, >CH- или >CR2-, где R2 представляет собой аминокарбонил; или
когда X представляет собой >CR2-, тогда R2, взятый вместе с -L-Z, может образовывать бивалентный радикал формулы
где R10 представляет собой фенил;
представляет собой -N-C(O)- или -N=CR4-, где R4 представляет собой гидрокси;
1
R представляет собой водород, галоген, C1-6алкилоксигруппу или C1-6алкил;
R3 представляет собой водород или С1-6алкилоксигруппу;
Z представляет собой радикал, выбираемый из
где каждый R5, R6, R7 и R8 независимо выбирают из водорода, галогена, аминогруппы, C1-6алкила
или C1-6алкилоксигруппы; или R7 и R3, взятые вместе, могут образовывать бивалентный радикал формулы
где каждый R9 независимо выбирают из водорода или C1-6алкила; и
L представляет собой бивалентный радикал, выбираемый из -С(О)-, -C(O)-NH-, -С(О)-C1-6алкандиила- или -С (О)-O-C1-6алкандиила-; или
L может представлять собой непосредственную связь, когда X представляет собой >CR2- или когда
Z представляет собой радикал формулы (b-11);
при условии, когда X представляет собой >СН-,
представляет собой -N-C(O)-, вторая
пунктирная линия не является связью, Z представляет собой радикал формулы (b-2) и L представляет
собой -С(О)-, тогда C1-6алкандиил- отличается от -СН2-СН2-.
Соединения формулы (I) могут также существовать в виде своих таутомерных форм. Подразумевается, что такие формы, хотя и не изображенные непосредственно в вышеприведенной формуле, охваты-4-
012416
ваются рамками настоящего изобретения.
Ряд терминов, использованных в предшествующих определениях и далее по тексту, объяснен здесь
ниже. Эти термины иногда используются сами по себе или в составных терминах.
В том смысле, в котором он использован в предшествующих определениях и далее по тексту, галоген представляет собой родовой термин для фтора, хлора, брома и йода; С1-6алкил обозначает насыщенные углеводородные радикалы c линейной и разветвленной цепью, имеющие от 1 до 6 атомов углерода,
такие как, например, метил, этил, пропил, бутил, пентил, гексил, 1-метилэтил, 2-метилпропил, 2метилбутил, 2-метилпентил и т.п.; C1-6алкандиил обозначает бивалентные насыщенные углеводородные
радикалы с линейной и разветвленной цепью, имеющие от 1 до 6 атомов углерода, такие как, например,
метилен, 1,2-этандиил, 1,3-пропандиил, 1,4-бутандиил, 1,5-пентандиил, 1,6-гександиил и их разветвленные изомеры, такие как 2-метилпентандиил, 3-метилпентандиил, 2,2-диметилбутандиил, 2,3диметилбутандиил и т.п.
Под термином "фармацевтически приемлемые соли" подразумеваются фармацевтически приемлемые кислые или основные аддитивные соли. Подразумевают, что фармацевтически приемлемые кислые
или основные аддитивные соли, вышеупомянутые здесь, включают терапевтически активные нетоксичные кислые и нетоксичные основные аддитивные солевые формы, которые способны образовывать соединения формулы (I). Соединения формулы (I), которые имеют основные свойства, можно превратить в
их фармацевтически приемлемые кислые аддитивные соли обработкой указанной основной формы подходящей кислотой. Подходящие кислоты включают, например, неорганические кислоты, такие как галогеноводородные кислоты, например, соляную или бромоводородную кислоту; серную; азотную; фосфорную и подобные кислоты; или органические кислоты, такие как, например, уксусную, пропановую,
гидроксиуксусную, молочную, пировиноградную, щавелевую, малоновую, янтарную (т.е. бутандиовую
кислоту), малеиновую, фумаровую, яблочную, винную, лимонную, метансульфоновую, этансульфоновую, бензолсульфоновую, п-толуолсульфоновую, цикламовую, салициловую, п-аминосалициловую, памоиновую и подобные кислоты. Соединения формулы (I), которые имеют кислотные свойства, можно
превратить в их фармацевтически приемлемые основные аддитивные соли обработкой указанной кислотной формы подходящим органическим или неорганическим основанием. Подходящие основные солевые формы включают, например, аммонийные соли, соли щелочного и щелочно-земельного металла,
например литиевые, натриевые, калиевые, магниевые, кальциевые соли и т.п., соли с органическими основаниями, например бензатиновые, N-метил-D-глюкаминные, гидрабаминовые соли и соли с аминокислотами, такими как, например, аргинин, лизин и т.п. Термины кислые или основные аддитивные соли
также включают гидраты и формы с аддитивным растворителем, которые способны образовывать соединения формулы (I). Примерами таких форм являются, например, гидраты, алкоголяты и т.п.
Термин «стереохимически изомерные формы соединений формулы (I)», использованный здесь выше, обозначает все возможные соединения, образованные теми же атомами, связанными той же последовательностью связей, но имеющие различные трехмерные структуры, не являющиеся равнозначными,
которыми могут обладать соединения формулы (I). Если не указано или обозначено особо, то химическое наименование соединения заключает в себе смесь всех стереохимически возможных изомерных
форм, которыми может обладать указанное соединение. Указанная смесь может содержать все диастереомеры и/или энантиомеры базовой молекулярной структуры указанного соединения. Подразумевается,
что все стереохимически изомерные формы соединений формулы (I) как в чистой форме, так и в виде
смеси друг с другом охватываются рамками настоящего изобретения.
Подразумевают, что N-оксидные формы соединений формулы (I) включают те соединения формулы (I), в которых один или несколько атомов азота окислены в так называемый N-оксид, в частности те
N-оксиды, в которых один или большее число пиперидиновых или пиперазиновых азотов N-окислены.
Всякий раз здесь далее подразумевается, что термин "соединения формулы (I)" включает также Nоксидные формы, фармацевтически приемлемые кислые или основные аддитивные соли и все стереоизомерные формы.
Патент GB 1062357 раскрывает производные хиназолона, обладающие антигипертензивными действиями. Патент DE 2258561 раскрывает производные замещенного пиридинона с антигипертензивным
действием. Патент ЕР 13612 раскрывает производные замещенного пиперидинилалкилхиназолина, которые представляют собой антагонисты серотонина. Патент ЕР 669919 раскрывает диметилбензофураны и
диметилбензопираны в качестве 5-НТ3 антагонистов. Патент US 5374637 раскрывает производные бензамида, которые обладают свойствами стимулировать сократительную способность желудочнокишечного тракта. Патент ЕР 385190 раскрывает производные 1,4-дизамещенного пиперидина, обладающие гастрокинетическими свойствами. Патент ЕР 1036073 раскрывает производные замещенного
хиназолиндиона, которые обладают свойствами фундальной релаксации. Патент ЕР 1355888 раскрывает
производные хиназолинона как ингибиторы PARP.
Неожиданно было найдено, что соединения по настоящему изобретению обнаруживают PARPингибирующую активность.
Первая группа вызывающих интерес соединений состоит из тех соединений формулы (I), где действует одно или большее число следующих ограничений:
-5-
012416
a) X представляет собой >N- или >CR2-, где R2 представляет собой аминокарбонил;
b) когда X представляет собой >CR2-, тогда R2, взятый вместе с -L-Z, может образовывать бивалентный радикал формулы (а-1);
с)
представляет собой -N-C(O)- или -N=CR4-, где R4 представляет собой гидроксигруппу, а вторая пунктирная линия представляет собой связь;
d) R1 представляет собой галоген, С1-6алкилоксигруппу или C1-6алкил;
e) R3 представляет собой С1-6алкилоксигруппу;
f) Z представляет собой радикал, выбираемый из (b-1), (b-3), (b-4), (b-5), (b-6), (b-7), (b-8), (b-9),
(b-10), (b-11);
g) каждый R5, R6, R7 и R8 независимо выбирают из водорода, аминогруппы, C1-6алкила или
C1-6алкилоксигруппы;
h) L представляет собой бивалентный радикал, выбираемый из -C(O)-NH-, -C(O)-C1-6алкандиилаили -C(O)-O-C1-6алкандиила-.
Вторая группа вызывающих интерес соединений состоит из тех соединений формулы (I), где действует одно или большее число следующих ограничений:
a) X представляет собой >СН- или >CR2-, где R2 представляет собой аминокарбонил;
b) когда X представляет собой >CR2-, тогда R2, взятый вместе с -L-Z, может образовывать бивалентный радикал формулы (а-1);
c) R1 представляет собой водород;
d) R3 представляет собой водород;
e) Z представляет собой радикал формулы (b-1), (b-2) или (b-11);
f) каждый R5, R6, R7 и R8 независимо выбирают из водорода или галогена;
g) L представляет собой бивалентный радикал, выбираемый из -С(О)-, -C(O)-NH- или
-С(О)-C1-6алкандиила-; и
h) L может представлять собой непосредственную связь, когда X представляет собой >CR2- или когда Z представляет собой радикал формулы (b-11).
Третья группа вызывающих интерес соединений состоит из тех соединений формулы (I), где действует одно или большее число следующих ограничений:
a) X представляет собой >СН- или >CR2-, где R2 представляет собой аминокарбонил;
b) R1 представляет собой водород;
c) R3 представляет собой водород;
d) Z представляет собой радикал формулы (b-1) или (b-2);
e) каждый R5, R6, R7 и R8 независимо выбирают из водорода или галогена;
f) L представляет собой бивалентный радикал, выбираемый из -С(О)- или -C(O)-NH-; и
g) L может представлять собой непосредственную связь, когда X представляет собой >CR2-.
Группа предпочтительных соединений состоит из тех соединений формулы (I), где X представляет
собой >СН- или >CR2-, причем R2 представляет собой аминокарбонил; когда X представляет собой
>CR2-, тогда R2, взятый вместе с -L-Z, может образовывать бивалентный радикал формулы (а-1); R1
представляет собой водород; R3 представляет собой водород; Z представляет собой радикал формулы
(b-1), (b-2) или (b-11); каждый R5, R6, R7 и R8 независимо выбирают из водорода или галогена; L представляет собой бивалентный радикал, выбираемый из -С(О)-, -C(O)-NH- или -С (О)-C1-6алкандиила-; и L
может представлять собой непосредственную связь, когда X представляет собой >CR2-или когда Z представляет собой радикал формулы (b-11).
Группа предпочтительных соединений состоит из тех соединений формулы (I), где X представляет
собой >СН- или >CR2-, причем R2 представляет собой аминокарбонил; R1 представляет собой водород;
R3 представляет собой водород; Z представляет собой радикал формулы (b-1) или (b-2); каждый R5, R6,
R7 и R8 независимо выбирают из водорода или галогена; L представляет собой бивалентный радикал,
выбираемый из -С(О)- или -C(O)-NH- и L может представлять собой непосредственную связь, когда X
представляет собой >CR2-.
Наиболее предпочтительными соединениями являются соединения 4, 5, 11, 12 и 14.
-6-
012416
Соединения формулы (I) могут быть получены в соответствии со способами, носящими общий характер, описанными в ЕР 13612. Исходные вещества и некоторые из интермедиатов представляют собой
известные соединения и являются коммерчески доступными или могут быть получены согласно общепринятым способам проведения реакций, широко известным в данной области. Некоторые способы получения будут описаны здесь далее более подробно. Другие способы получения целевых соединений
формулы (I) описаны в примерах.
Соединения формулы (I), где
представляет собой -N-C(O)-, а вторая пунктирная линия
представляет собой связь, именуемые здесь соединениями формулы (I-а), могут быть получены из подходящих замещенных 2-аминокарбонилбензамидов формулы (II) циклизацией последних, следуя известным в данной области способам циклизации.
Альтернативно, соединения формулы (I), где -C1-6алкандиил- представляет собой -СН2-СН2- и
представляет собой -N-C(O)-, а вторая пунктирная линия является связью, именуемые здесь
соединениями формулы (I-b), могут быть получены циклизацией интермедиата формулы (III) с подходящим замещенным 2-аминокарбонилбензамидом формулы (IV), следуя известным в данной области
способам циклизации.
представляет собой -N-C(O)-, а вторая пунктирная линия
Соединения формулы (I), где
не является связью, именуемые здесь соединениями формулы (I-c), могут быть получены из подходящего замещенного 2-аминобензамида формулы (V) циклизацией последнего с подходящим замещенным
интермедиатом формулы (VI). Указанная реакция циклизации может быть легко осуществлена совместным перемешиванием реагентов в присутствии подходящего растворителя, например, спирта, например,
метанола, этанола, пропанола и т.п. Для увеличения скорости реакции можно применять несколько повышенную температуру и добавку каталитического количества подходящей сильной кислоты, например
хлороводородной кислоты и т.п.
-7-
012416
Соединения формулы (I) могут быть также превращены друг в друга с использованием известных в
данной области реакций или превращений функциональных групп. Некоторые из этих трансформаций
уже описаны здесь выше. Другими примерами являются гидролиз эфиров карбоновых кислот до соответствующих карбоновых кислот или спиртов, гидролиз амидов до соответствующих карбоновых кислот
или аминов, гидролиз нитрилов до соответствующих амидов; аминогруппы при имидазоле или фениле
могут быть замещены на водород с использованием известной в данной области реакции диазотирования
и последующего замещения диазогруппы на водород; спирты могут быть превращены в сложные и простые эфиры; первичные амины могут быть превращены во вторичные или третичные амины; двойные
связи могут быть гидрированы до соответствующей одинарной связи; йодорадикал при фенильной группе может быть превращен в сложноэфирную группу посредством введения монооксида углерода в присутствии подходящего палладиевого катализатора.
Настоящее изобретение также относится к соединениям формулы (I), как определено выше, для использования в качестве лекарства.
Соединения по настоящему изобретению обладают PARP-ингибирующими свойствами, как это
можно видеть из приводимой ниже экспериментальной части.
Термин "PARP" использован здесь для обозначения белка, имеющего поли-ADP-рибозилирующую
активность. В рамках значения данного термина PARP охватывает все белки, кодируемые PARP-геном,
их мутации и альтернативные slice-белки. Альтернативно, в том смысле, как он использован здесь, термин "PARP" включает аналоги PARP, гомологи и аналоги других животных.
Термин "PARP" включает, но не ограничивается, PARP-1. Рамками значения данного термина могут быть охвачены PARP-2, PARP-3, vault-PARP (PARP-4), PARP-7 (TiPARP), PARP-8, PARP-9 (Bal),
PARP-10, PARP-11, PARP-12, PARP-13, PARP-14, PARP-15, PARP-16, TANK-1, TANK-2 и TANK-3.
Соединения, которые ингибируют как PARP-1, так и танкиразу 2, могут иметь выгодные свойства,
заключающиеся в том, что они усиливали активности, ингибирующие рост раковых клеток.
Настоящее изобретение также предполагает использование соединений для получения лекарственного средства для лечения любых заболеваний и нарушений у животного, описанных здесь, причем указанные соединения представляют собой соединения формулы (I)
их N-оксидные формы, фармацевтически приемлемые аддитивные соли и стереохимически изомерные
формы, где
пунктирные линии обозначают необязательные связи;
X представляет собой >N-, >CH- или >CR2-, где R2 представляет собой аминокарбонил; или
когда X представляет собой >CR2-, тогда R2, взятый вместе с -L-Z, может образовывать бивалентный радикал формулы
где R10 представляет собой фенил;
представляет собой -N-C(O)- или -N=CR4-, где R4 представляет собой гидрокси;
1
R представляет собой водород, галоген, C1-6алкилоксигруппу или C1-6алкил;
R3 представляет собой водород или C1-6алкилоксигруппу;
Z представляет собой радикал, выбираемый из
-8-
012416
где каждый R5, R6, R7 и R8 независимо выбирают из водорода, галогена, аминогруппы, C1-6алкила
или С1-6алкилоксигруппы; или
R7 и R8, взятые вместе, могут образовывать бивалентный радикал формулы
где каждый R9 независимо выбирают из водорода или C1-6алкила; и
L представляет собой бивалентный радикал, выбираемый из -С(О)-, -C(O)-NH-, -С(О)-С1-6алкандиила- или -С(О)-O-C1-6алкандиила-; или
L может представлять собой непосредственную связь, когда X представляет собой >CR2- или когда
Z представляет собой радикал формулы (b-11).
Принимая во внимание их PARP-связывающие свойства, соединения по настоящему изобретению
могут быть использованы в качестве эталонных препаратов или индикаторных соединений, и в случае
этого один из атомов в молекуле может быть замещен, например, радиоактивным изотопом.
Для получения фармацевтических композиций по данному изобретению эффективное количество
индивидуального соединения в форме основной или кислой аддитивной соли в качестве активного ингредиента комбинируют в гомогенной смеси с фармацевтически приемлемым носителем, который может
быть различным в зависимости от формы препарата, в виде которой желательно проводить введение.
Данные фармацевтические композиции по желанию применимы в виде единичной лекарственной формы, предпочтительно, для перорального, ректального, подкожного введения или парентеральной инъекции. Например, при получении композиций в виде лекарственной формы для перорального применения
может быть использована любая обычная фармацевтическая среда, такая как, например, вода, гликоли,
масла, спирты и т.п. в случае жидких препаратов для перорального применения, таких как суспензии,
сиропы, эликсиры и растворы; или такие твердые носители, как крахмалы, сахара, каолин, лубриканты,
вяжущие, измельчающие агенты и т.п. в случае порошков, пилюль, капсул и таблеток. Вследствие легкости их применения, таблетки и капсулы представляют собой наиболее преимущественную стандартную
лекарственную форму для перорального введения, в случае которой, безусловно, применяют твердые
фармацевтические носители. Для парентеральных композиций носитель обычно будет включать стерильную воду, по крайней мере, в значительной части, однако можно включать другие ингредиенты, например, для улучшения растворимости. Можно получать, например, растворы для инъекций, в которых
носитель включает физиологический раствор, раствор глюкозы или смесь физиологического раствора и
раствора глюкозы. Можно также получать суспензии для инъекций, в случае которых можно использовать подходящие жидкие носители, глюкозы. Можно также получать суспензии для инъекций, в случае
которых можно использовать подходящие жидкие носители, суспендирующие агенты и т.п. В композициях, подходящих для подкожного введения, носитель не обязательно включает агент, увеличивающий
проникающую способность, и/или подходящий увлажняющий агент, не обязательно соединяемый с подходящими добавками любой природы, используемыми в незначительных количествах, причем данные
добавки не оказывают существенного вредного воздействия на кожу. Указанные добавки могут облегчать нанесение на кожу и/или могут быть полезными для получения желаемых композиций. Эти композиции можно применять различными способами, например, как трансдермальный пластырь, точечным
-9-
012416
нанесением, мазь. Особенно выгодно составлять вышеуказанные фармацевтические композиции в виде
стандартной лекарственной формы для облегчения введения и единообразного дозирования. Стандартная лекарственная форма, как она используется здесь в описании и формуле изобретения, относится к
физически дискретным единицам, подходящим для единичных дозировок, причем каждая единица содержит заранее определенное количество активного ингредиента, рассчитанное на создание желаемого
терапевтического эффекта совместно с требуемым фармацевтическим носителем. Примерами таких лекарственных форм являются таблетки (включая таблетки с насечкой или покрытые оболочкой таблетки),
капсулы, пилюли, порошковые пакеты, облатки, растворы или суспензии для инъекций, чайные ложки,
столовые ложки и т.п. и их отдельные кратные единицы.
Соединения по настоящему изобретению могут лечить или предотвращать тканевое повреждение,
являющееся результатом повреждения или гибели клеток вследствие некроза или апоптоза; могут улучшить состояние после повреждения кардиоваскулярной или нервной ткани, включая повреждение, следующее за очаговой ишемией, инфарктом миокарда и повреждением при реперфузии; могут лечить различные заболевания и состояния, вызванные или усугубленные активностью PARP; могут продлевать
или увеличивать продолжительность жизни клеток или их способность к пролиферации; могут изменять
экспрессию генов в стареющих клетках; могут радиосенсибилизировать и/или хемосенсибилизировать
клетки. В целом, ингибирование активности PARP избавляет клетки от потери энергии, предотвращая в
случае нервных клеток необратимую деполяризацию нейронов, и, таким образом, обеспечивает нейропротекцию.
Согласно вышесказанному настоящее изобретение, кроме того, относится к способу введения терапевтически эффективного количества вышеопределенных соединений в количестве, достаточном для
ингибирования активности PARP, для лечения или предотвращения тканевого повреждения, являющегося результатом повреждения или гибели клеток вследствие некроза или апоптоза, для воздействия на
нейрональную активность, которая не опосредована NMDA-токсичностью, для воздействия на нейрональную активность, опосредованную NMDA-токсичностью, для лечения повреждения нервной ткани,
возникающего вследствие ишемии и реперфузионного повреждения, неврологических нарушений и нейродегенеративных заболеваний; для предотвращения или лечения васкулярного паралича; для лечения
или предотвращения кардиоваскулярных нарушений; для лечения других состояний и/или нарушений,
таких как возрастная мышечная дегенерация, СПИД и другие заболевания, обусловленные старением
иммунной системы, воспаление, подагра, артрит, атеросклероз, кахексия, рак, дегенеративные заболевания скелетных мышц, включая репликативное старение, диабет, травма головы, воспалительные заболевания пищеварительного тракта (такие как колит и болезнь Крона), мышечная дистрофия, остеоартрит,
остеопороз, хроническая и/или острая боль (такая, как невропатическая боль), почечная недостаточность,
ишемия сетчатки, септический шок (такой, как эндотоксический шок) и старение кожи, для увеличения
продолжительности жизни и способности к пролиферации клеток; для изменения генной экспрессии стареющих клеток; хемосенсибилизации и радиосенсибилизации (гипоксических) опухолевых клеток. Настоящее изобретение также относится к лечению заболеваний и состояний у животного, которое включает введение в указанное животное терапевтически эффективного количества вышеопределенных соединений.
В частности, настоящее изобретение относится к способу лечения, предотвращения или подавлению неврологического нарушения у животного, которое включает введение в указанное животное терапевтически эффективного количества вышеопределенных соединений. Неврологическое нарушение выбирают из группы, состоящей из периферической невропатии, вызываемой физическим повреждением
или болезненным состоянием, травматического повреждения головного мозга, физического повреждения
спинного мозга, паралича, связанного с поражением головного мозга, очаговой ишемии, глобальной
ишемии, реперфузионного повреждения, демиелинизирующего заболевания и неврологического нарушения, относящегося к нейродегенерации.
Настоящее изобретение также предполагает использование соединений формулы (I) для ингибирования PARP-активности, для лечения, предотвращения и подавления тканевого повреждения, возникающего в результате клеточного повреждения или клеточной смерти вследствие некроза или апоптоза, для
лечения, предотвращения или подавления неврологического нарушения у животного.
Термин "предотвращение нейродегенерации" включает способность предотвращать нейродегенерацию у пациентов с недавно диагностированным нейродегенеративным заболеванием, или у которых
имеется риск развития нового дегенеративного заболевания, и предотвращать дальнейшую нейродегенерацию у пациентов, которые уже страдают от симптомов или имеют симптомы нейродегенеративного
заболевания.
Термин "лечение", использованный здесь, охватывает любое лечение заболевания и/или состояния
у животного, в частности у человека, и включает: (i) предотвращение возникновения заболевания и/или
состояния у субъекта, который может иметь предрасположенность к заболеванию и/или состоянию, но у
которого оно еще не было диагностировано; (ii) подавление заболевания и/или состояния, т.е. приостановка его развития; (iii) облегчение заболевания и/или состояния, т.е. вызывание регрессии заболевания
и/или состояния.
- 10 -
012416
Термин "радиосенсибилизатор", использованный здесь, определяют как молекулу, предпочтительно
молекулу с низкой молекулярной массой, вводимую в животное в терапевтических эффективных количествах для повышения чувствительности клеток к ионизирующему излучению и/или для содействия
лечению заболеваний, которые лечат с использованием ионизирующего излучения. Заболевания, которые лечат ионизирующим излучением, включают опухолевые заболевания, доброкачественные и злокачественные опухоли и раковые клетки. Другие неуказанные здесь заболевания, которые лечат с использованием ионизирующего излучения, также предусматриваются настоящим изобретением.
Термин "хемисенсибилизатор", использованный здесь, определяют как молекулу, предпочтительно
молекулу с низкой молекулярной массой, вводимую в животное в терапевтических эффективных количествах для повышения чувствительности клеток к химиотерапии и/или для содействия лечению заболеваний, которые лечат с использованием химиотерапии. Заболевания, которые лечат химиотерапией,
включают опухолевые заболевания, доброкачественные и злокачественные опухоли и раковые клетки.
Другие неуказанные здесь заболевания, которые лечат с использованием химиотерапевтического лечения, также предусматриваются настоящим изобретением.
Соединения, композиции и способы по настоящему изобретению особенно полезны для лечения
или предотвращения тканевого поражения, возникающего в результате гибели или поражения клеток
вследствие некроза или апоптоза.
Соединения по настоящему изобретению могут быть "противораковыми агентами", причем этот
термин включает "агенты, предотвращающие рост опухолевых клеток" и "противоопухолевые агенты".
Например, способы по настоящему изобретению полезны для лечения раковых заболеваний и хемосенсибилизации и/или радиосенсибилизации опухолевых клеток в карциномах, таких как АКТГпродуцирующие опухоли, острый лимфоцитарный лейкоз, острый нелимфоцитарный лейкоз, рак надпочечника, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак груди, рак цервикальной области, хронический
лимфоцитарный пищевода, саркома Юинга, рак желчного пузыря, волосато-клеточный лейкоз, рак головы и шеи, лимфома Ходжкина, саркома Капоши, рак почки, рак печени, рак легкого (мелкоклеточный
и/или немелкоклеточный), злокачественный перитонеальный выпот, злокачественный плевральный выпот, меланома, мезотелиома, множественная миелома, нейробластома, неходжкинская лимфома, остеосаркома, рак яичника, герминогенный рак яичника, рак предстательной железы, рак поджелудочной железы, рак полового члена, ретинобластома, рак кожи, саркома мягких тканей, плоскоклеточный эпидермоидный рак, рак желудка, рак яичка, рак щитовидной железы, трофобластическая болезнь, рак матки,
рак влагалища, рак вульвы и опухоль Вильмса.
Таким образом, соединения по настоящему изобретению можно использовать в качестве "радиосенсибилизаторов" и/или "хемосенсибилизаторов".
Радиосенсибилизаторы, как известно, повышают чувствительность раковых клеток к токсическим
воздействиям ионизирующего излучения. В литературе предложено несколько механизмов действия радиосенсибилизаторов, включая радиосенсибилизаторы гипоксических клеток (например, соединения 2нитроимидазола и соединения бензотриазин-диоксида), имитирующих кислород или наоборот ведущих
себя как биовосстановители при гипоксии; радиосенсибилизаторов негипоксических клеток (например,
галогенированные пиримидины), которые могут быть аналогами оснований ДНК и предпочтительно
включаться в ДНК раковых клеток и тем самым способствовать индуцированному облучением разрыву
молекул ДНК и/или препятствовать нормальным механизмам репарации ДНК; сформулированы и другие
различные потенциальные механизмы действия радиосенсибилизаторов при лечении заболевания.
В настоящее время во многих протоколах лечения рака применяют радиосенсибилизаторы в сочетании с облучением рентгеновскими лучами. Примеры активируемых рентгеновскими лучами радиосенсибилизаторов включают следующие соединения, но не ограничиваются ими: метронидазол, мизонидазол, десметилмизонидазол, пимонидазол, этанидазол, ниморазол, митомицин С, RSU 1069, SR 4233, Е09,
RB 6145, никотинамид, 5-бромдезоксиуридин (BUdR), 5-иоддезоксиуридин (IUdR), бромдезоксицитидин, фтордезоксиуридин (FudR), гидроксимочевину, цисплатин и их терапевтически эффективные аналоги и производные.
В фотодинамической терапии (PDT) рака видимый свет используют в качестве излученияактиватора сенсибилизатора. Примеры фотодинамических радиосенсибилизаторов включают следующие
соединения, но не ограничиваются ими: производные гематопорфирина, фотофрин, производные бензопорфирина, этиопорфирин олова, феофорбид-а, бактериохлорофилл-а, нафталоцианины, фталоцианины,
фталоцианин цинка и их терапевтически эффективные аналоги и производные.
Радиосенсибилизаторы можно применять в сочетании с терапевтически эффективным количеством
одного или большего числа других соединений, включая, но не ограничиваясь следующими: соединения,
которые содействуют включению радиосенсибилизаторов в клетки-мишени; соединения, которые контролируют поток лекарств, питательных веществ и/или кислорода в клетках-мишенях; химиотерапевтические агенты, которые воздействуют на опухоль совместно с дополнительным облучением или без него;
или другие терапевтически эффективные соединения для лечения рака или другого заболевания. Примеры дополнительных терапевтических агентов, которые можно использовать в сочетании с радиосенсибилизаторами, включают, но не ограничиваются ими: 5-фторурацил, лейковорин, 5'-амино-5'- 11 -
012416
дезокситимидин, кислород, карбоген, трансфузии эритроцитов, перфторуглеводороды (например, Fluosol
10 DA), 2,3-DPG, BW12C, блокаторы кальциевых каналов, пентоксифиллин, антиангиогенезные соединения, гидралазин и LBSO. Примеры химиотерапевтических агентов, которые можно использовать в сочетании с радиосенсибилизаторами, включают, но не ограничиваются ими: адриамицин, каптотецин,
карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доцетаксел, доксорубицин, интерферон (альфа, бета, гамма),
интерлейкин 2, иринотекан, паклитаксел, топотекан и их терапевтически эффективные аналоги и производные.
Хемосенсибилизаторы можно применять в сочетании с терапевтически эффективным количеством
одного или большего числа других соединений, включая, но не ограничиваясь следующими: соединения,
которые содействуют включению хемосенсибилизаторов в клетки-мишени; соединения, которые контролируют поток лекарств, питательных веществ и/или кислорода в клетках-мишенях; химиотерапевтические агенты, которые воздействуют на опухоль или другие терапевтически эффективные соединения
для лечения рака или другого заболевания. Примеры дополнительных терапевтических агентов, которые
можно использовать в сочетании с хемосенсибилизаторами, включают, но не ограничиваются ими: метилирующие агенты, ингибиторы топоизомеразы I и другие химиотерапевтические агенты, такие как
цисплатин и блеомицин.
Соединения формулы (I) также можно использовать для детектирования или идентификации PARP
и конкретнее рецептора PARF-1. Для этой цели соединения формулы (I) можно пометить. Указанную
метку можно выбрать из группы, состоящей из радиоизотопа, спиновой метки, антигенной метки, ферментной помечающей флуоресцентной группы или хемолюминесцентной группы.
Специалисты в данной области могли бы легко определить эффективное количество из тестовых
результатов, далее представленных здесь. В целом, предполагается, что эффективное количество составляло бы от 0,001 до 100 мг/кг массы тела и в частности от 0,005 до 10 мг/кг массы тела. Может оказаться
уместным применять требуемую дозу в виде двух, трех, четырех или большего числа субдоз через подходящие интервалы в течение дня. Указанные субдозы можно приготовить в виде стандартных лекарственных форм, содержащих, например, от 0,05 до 500 мг и в частности от 0,1 мг до 200 мг активного ингредиента в стандартной лекарственной форме.
Экспериментальная часть
В дальнейшем "DCM" означает дихлорметан, "DMF" означает N,N-диметилформамид, "MeOH" означает метанол, "MIK" означает метил изобутил кетон, "MEK" означает метил этил кетон, "TEA" означает триэтиламин, "THF" означает тетрагидрофуран.
А. Получение промежуточных соединений.
Пример А1.
Получение интермедиата 1.
Смесь 2-[(4-хлор-1-оксобутил)амино]бензамида (0,03 моль), 4-фенил-4-пиперидинкарбоксамида
(0,03 моль) и TEA (0,1 моль) в ацетонитриле (150 мл) перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение ночи, затем растворитель упаривали и к остатку добавляли воду. Маслянистый слой
экстрагировали трихлорметаном, высушивали, фильтровали и упаривали растворитель. Остаток очищали, пропуская через силикагель на стеклянном фильтре (элюент: трихлорметан/МеОН 95/5). Фракции
продукта собирали и упаривали растворитель с получением 5 г (40,8%) интермедиата 1.
- 12 -
012416
Пример А2.
Получение интермедиата 6.
Смесь 4-хлор-1,1-диэтоксибутана (0,05 моль), 4-фенил-4-пиперидинкарбоксамида (0,03 моль), карбоната натрия (0,05 моль) и иодида калия (q.s.) в 4-метил-2-пентаноне (250 мл) перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение ночи, затем реакционную смесь охлаждали, добавляли воду и
разделяли слои. Органический слой высушивали, фильтровали и упаривали растворитель с получением
9 г (86%) интермедиата 6.
В. Получение целевых соединений.
Пример В1.
Получение соединения 3.
Смесь 2-[(1-оксо-1-пропенил)амино]бензамида (0,02 моль), 1-(4-фторфенил)-2-(4-пиперидинил)этанона (0,02 моль) и бикарбоната натрия (4 г) в 2-пропаноле (150 мл) перемешивали и кипятили с
обратным холодильником в течение ночи, затем реакционную смесь фильтровали горячей и упаривали
растворитель. Остаток дважды очищали колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: трихлорметан/МеОН 95/5). Фракции продукта собирали и упаривали растворитель. Остаток кристаллизовали из 2пропанола и образовавшийся осадок собирали с получением 2 г (25%) соединения 3, т.пл. 159,1°С.
Пример В2.
Получение соединения 4.
Смесь интермедиата 1 (0,012 моль) в гидроксиде натрия (60 мл) и этаноле (100 мл) перемешивали и
кипятили с обратным холодильником в течение 1,5 ч, затем растворитель упаривали и к остатку добавляли воду. Маслянистый слой экстрагировали трихлорметаном, высушивали, фильтровали и упаривали
растворитель. Остаток кристаллизовали из MIK/2-пропанола, затем желаемый продукт собирали и высушивали с получением 2 г (41,7%) соединения 4, т.пл. 138,9°С.
Пример В3.
Получение соединения 5.
Смесь 2-аминобензамида (0,027 моль) и интермедиата 6 (0,027 моль) в этаноле (100 мл) нагревали и
подкисляли соляной кислотой с.р. (3 мл). Реакционную смесь перемешивали и кипятили с обратным холодильником в течение ночи, затем растворитель упаривали и к остатку добавляли воду и концентрированный раствор NH4OH. Образовавшийся осадок отфильтровывали и растворяли в трихлорметане, затем
высушивали и фильтровали. Растворитель упаривали, а остаток кристаллизовали из MeOH, затем образовавшийся осадок собирали и высушивали с получением 3 г (28%) соединения 5, т.пл. 216,1°С.
В табл. 1 приведен список соединений, которые получены в соответствии с одним из вышеприведенных примеров.
- 13 -
012416
Таблица 1
Фармакологический пример.
In vitro сцинтилляционный анализ близости (SPA) для PAPR-1 ингибирующей активности.
Соединения настоящего изобретения были протестированы анализом in vitro, основанным на способе SPA (запатентовано Amersham Pharmacia Biotech). В принципе, анализ основывается на хорошо известном способе SPA для детектирования поли(ADP-рибозил)ирования биотинилированных белковмишеней, т.е. гистонов. Данное рибозилирование индуцируют с использованием активированного разо- 14 -
012416
рванной ДНК фермента PARP-1 и [3Н]-никотинамидадениндинуклеотида ([3H]-NAD+) как ADPрибозильного донора.
В качестве индуктора активности фермента PARP-1 получена разорванная ДНК. Для этого 25 мг
ДНК (поставщик: Sigma) растворяли в 25 мл ДНКазного буфера (10 мМ Tris-HCl, pH 7,4; 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA); 5 мМ MgCl2⋅6H2O и 1мМ KCl), к которому добавляли 50 мкл раствора ДНКазы (1 мг/мл в 0,15 М NaCl). После инкубации в течение 90 мин при 37°С реакцию прекращали добавлением 1,45 г NaCl, за которым следовала дальнейшая инкубация при 58°С в течение 15 мин.
Реакционную смесь охлаждали льдом и диализировали при 4°С в течение соответственно 1,5 и 2 ч относительно 1,5 л 0,2 М KCl и дважды относительно 1,5 л 0,01 М KCl в течение 1,5 и 2 ч соответственно.
Смесь поделили на аликвоты и хранили при -20°С. Гистоны (1 мг/мл, тип II-A, поставщик: Sigma) биотинилировали с использованием комплекта для биотинилирования от Amersham и хранили в виде аликвот
при -20°С. Основной раствор 100 мг/мл SPA-поли(винилтолуольных) (PVT) гранул (поставщик: Amersham) получали в PBS. Основной раствор [3H]-NAD+ получали добавлением 120 мкл [3H]-NAD+
(0,1 мКю/мл, поставщик: NEN) к 6 мл инкубационного буфера (50 мМ Tris/HCl, pH 8; 0,2 мМ DTT; 4 мМ
MgCl2). Раствор 4 мМ NAD+ (поставщик: Roche) получали в инкубационном буфере (из 100 мМ основного раствора в воде, сохраняемого при -20°С). Фермент PARP-1 получали, используя известные в данной
области способы, т.е. клонирование и экспрессию белка, исходя из кДНК из человеческой печени. Информацию, касающуюся использованной белковой последовательности фермента PARP-1, включая литературные ссылки, можно найти в базе данных Swiss-Prot под главным инвентарным номером Р09874.
Биотинилированные гистоны и PVT-SPA гранулы смешивали и преинкубировали в течение 30 мин при
комнатной температуре. Фермент PARP-1 (концентрация зависела от партии) смешивали с разорванной
ДНК и смесь преинкубировали в течение 30 мин при 4°С. Равные части данного раствора гистонов/PVTSPA гранул и раствора фермента PARP-1/ДНК смешивали и 75 мкл данной смеси вместе с 1 мкл соединения в ДМСО и 25 мкл [3H]-NAD+ добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета микротитратора.
Окончательные концентрации в инкубационной смеси составляли 2 мкг/мл для биотинилированных гистонов, 2 мг/мл для PVT-SPA гранул, 2 мкг/мл для разорванной ДНК и в интервале 5-10 мкг/мл для фермента PARP-1. После инкубации смеси в течение 15 мин при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 100 мкл 4 мМ NAD+ в инкубационном буфере (окончательная концентрация 2 мМ)
и планшеты перемешивали. Гранулам позволяли осесть по крайней мере в течение 15 мин и планшеты
переносили в TopCountNXT™ (Packard) для счета сцинтилляции, причем величины выражали как число
отсчетов в минуту (cpm). Для каждого эксперимента параллельно тестировали контроли (содержащие
фермент PARP-1 и ДМСО без соединения), холостую инкубацию (содержащую ДМСО, но не содержащую фермент PARP-1 или соединение) и образцы (содержащие фермент PARP-1 и соединение, растворенное в ДМСО). Все протестированные соединения растворяли и, в конечном счете, далее разбавляли
ДМСО. В первом примере соединения тестировали при концентрации 10-5 М. Когда соединения проявляли активность при 10-5 М, то получали кривую зависимости доза-эффект, причем соединения тестировали при концентрациях между 10-5 и 10-8 М. Для каждого теста холостое значение вычитали как из контрольных значений, так и из значений, полученных для образцов. Контрольный образец показывал максимальную активность фермента PARP-1. Для каждого образца величину cpm выражали как процентное
отношение среднего значения cpm контролей. Когда это было уместно, вычисляли значения IC50 (концентрация лекарства, необходимая для снижения активности фермента PARP-1 до 50% контроля) с использованием линейной интерполяции между экспериментальными точками выше и ниже 50% уровня.
Здесь эффекты тестовых соединений выражаются как pIC50 (величина отрицательного логарифма значения IC50). В качестве эталонного соединения был включен 4-амино-1,8-нафтальимид для проверки достоверности SPA-анализа. Протестированные соединения показали ингибирующую активность при начальной тестовой концентрации в 10-5 М (см. табл. 2).
In vitro фильтрационный анализ для PAPR-1 ингибирующей активности.
Соединения настоящего изобретения были протестированы фильтрационным анализом in vitro,
оценивающим активность PARP-1 (запускаемую в присутствии разорванной ДНК) при посредстве его
поли (ADP-рибозил)ирующей активности по отношению к гистонам с использованием [32P]-NAD в качестве ADP-рибозильного донора. Радиоактивные рибозилированные гистоны осаждали трихлоруксусной
кислотой (ТСА) в 96-луночных фильтровальных планшетах и количество включенного [32Р] измеряли с
использованием сцинтилляционного счетчика.
Приготовили смесь гистонов (основной раствор: 5 мг/мл в H2O), NAD+ (основной раствор: 100 мМ в
Н2О) и [32P]-NAD+ в инкубационном буфере (50 мМ Tris/HCl, pH 8; 0,2 мМ DTT; 4 мМ MgCl2). Также
приготовили смесь фермента PARP-1 (5-10 мкг/мл) и разорванной ДНК. Разорванную ДНК получали, как
описано в in vitro SPA для PARP-1 ингибирующей активности. 75 мкл смеси фермента PARP-1/ДНК вместе с 1 мкл соединения в ДМСО и 25 мкл смеси гистоны-NAD+/[32Р] -NAD+ добавляли в каждую лунку
96-луночного фильтровального планшета (0,45 мкм, поставщик: Millipore). Окончательные концентрации в инкубационной смеси составляли 2 мкг/мл для гистонов, 0,1 мМ для NAD+, 200 мкМ (0,5 мкКю)
для [32P]-NAD+ и 2 мкг/мл для разорванной ДНК. Планшеты инкубировали в течение 15 мин при комнат- 15 -
012416
ной температуре и останавливали реакцию добавлением 10 мкл охлажденной льдом 100% ТСА, после
чего следовало добавление 10 мкл охлажденного льдом BSA-раствора (1% в Н2О). Белковой фракции
давали осесть в течение 10 мин при 4°С и планшеты подвергали вакуумному фильтрованию. Каждую
лунку планшета последовательно промывали 1 мл охлажденной льдом 10% ТСА, 1 мл охлажденной
льдом 5% ТСА и 1 мл 5% ТСА при комнатной температуре. Наконец, 100 мкл сцинтилляционного раствора (Microscint 40, Packard) добавляли в каждую лунку и планшеты переносили в TopCountNXT™ (поставщик: Packard) для счета сцинтилляции, причем величины выражали как число отсчетов в минуту
(cpm). Для каждого эксперимента параллельно тестировали контроли (содержащие фермент PARP-1 и
ДМСО без соединения), холостую инкубацию (содержащую ДМСО, но не содержащую фермент PARP-1
или соединение) и образцы (содержащие фермент PARP-1 и соединение, растворенное в ДМСО). Все
протестированные соединения растворяли и, в конечном счете, далее разбавляли ДМСО. В первом примере соединения тестировали при концентрации 10-5 М. Когда соединения проявляли активность при
10-5 М, то получали кривую зависимости доза-эффект, причем соединения тестировали при концентрациях между 10-5 и 10-8 М. Для каждого теста холостое значение вычитали как из контрольных значений,
так и из значений, полученных для образцов. Контрольный образец показывал максимальную активность
фермента PARP-1. Для каждого образца величину cpm выражали как процентное отношение среднего
значения cpm контролей. Когда это было уместно, вычисляли значения IC50 (концентрация лекарства,
необходимая для снижения активности фермента PARP-1 до 50% контроля) с использованием линейной
интерполяции между экспериментальными точками выше и ниже 50% уровня. Здесь эффекты тестовых
соединений выражаются как pIC50 (величина отрицательного логарифма значения IC50). В качестве эталонного соединения был включен 4-амино-1,8-нафтальимид для проверки достоверности фильтрационного анализа. Протестированные соединения показали ингибирующую активность при начальной тестовой концентрации в 10-5 М (см. табл. 2).
In vitro сцинтилляционный анализ близости (SPA) для TANK-2 ингибирующей активности.
Соединения настоящего изобретения были протестированы анализом in vitro, основанным на способе SPA с Ni-Flash планшетами (96 или 384 лунок). В принципе, анализ основывается на способе SPA
для детектирования ауто-поли(ADP-рибозил)ирования белка TANK-2 с использованием [3Н]никотинамидадениндинуклеотида ([3H]-NAD+) как ADP-рибозильного донора.
Основной раствор [3Н]-NAD+/NAD готовили добавлением 64,8 мкл [3H]-NAD+ (0,1 мКю/мл, поставщик: Perkin Elmer) и 46,7 мкл основного раствора NAD (10,7 мМ при -20°С, поставщик Roche) к
1888,7 мкл буфера для анализа (60 мМ Tris/HCl, pH 7,4; 0, 9 мМ DTT; 6 мМ MgCl2). Фермент TANK-2
получали, как описано в ЕР1238063. 60 мкл буфера для анализа вместе с 1 мкл соединения в ДМСО,
20 мкл [32Р] -NAD+/NAD и 20 мкл фермента TANK-2 (окончательная концентрация 6 мкг/мл) добавляли в
каждую лунку 96-луночного покрытого Ni flash-планшета (Perkin Elmer). После инкубации смеси в течение 120 мин при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 60 мкл стоп-раствора
(42,6 мг NAD в 6 мл Н2О). Планшеты закрывали с помощью укупорочной установки и помещали в TopCountNXT™ (Packard) для счета сцинтилляции. Величины выражали как число отсчетов в минуту (cmp).
Для каждого эксперимента параллельно тестировали контроли (содержащие фермент TANK-2 и ДМСО
без соединения), холостую инкубацию (содержащую ДМСО, но не содержащую фермент TANK-2 или
соединение) и образцы (содержащие фермент TANK-2 и соединение, растворенное в ДМСО). Все протестированные соединения растворяли и, в конечном счете, далее разбавляли ДМСО. В первом примере
соединения тестировали при концентрации 10-5 М. Когда соединения проявляли активность при 10-5 М,
то получали кривую зависимости доза-эффект, причем соединения тестировали при концентрациях между 10-5 и 10-8 М. Для каждого теста холостое значение вычитали как из контрольных значений, так и из
значений, полученных для образцов. Контрольный образец показывал максимальную активность фермента TANK-2. Для каждого образца величину cpm выражали как процентное отношение среднего значения cpm контролей. Когда это было уместно, вычисляли значения IC50 (концентрация лекарства, необходимая для снижения активности фермента TANK-2 до 50% контроля) с использованием линейной интерполяции между экспериментальными точками выше и ниже 50% уровня. Здесь эффекты тестовых
соединений выражаются как IC50 (величина отрицательного логарифма значения IC50). В качестве эталонных соединений были включены 3-аминобензамид и 4-амино-1,8-нафтальимид для проверки достоверности SPA анализа. Здесь описан анализ с использованием 96-луночных планшетов. В анализе с использованием 384-луночных планшетов использовали те же самые концентрации, а объемы адаптировали. Если имелись результаты, полученные на 96-луночном планшете, то в табл. 2 включены данные результаты, в противном случае приведены результаты, полученные из анализа на 384-луночном планшете.
- 16 -
012416
Таблица 2
Соединения можно, кроме того, оценить анализом на клеточную хемо- и/или радиосенсибилизацию, анализом, измеряющим ингибирование эндогенной активности PARP-1 в линиях раковых клеток и,
наконец, в тесте на радиосенсибилизацию in vivo.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединения формулы (I)
их N-оксидные формы, фармацевтически приемлемые аддитивные соли и стереохимически изомерные
формы, где
пунктирные линии обозначают необязательные связи;
X представляет собой >N-, >CH- или >CR2-, где R2 представляет собой аминокарбонил;
представляет собой -N-C(O)- или -N=CR4-, где R4 представляет собой гидрокси;
1
R представляет собой водород;
R3 представляет собой водород;
Z представляет собой радикал, выбираемый из
где каждый R5, R6, R7 и R8 независимо выбирают из водорода или галогена; или
- 17 -
012416
или
L представляет собой бивалентный радикал, выбираемый из -C(O)-NH- или -С (О)-С1-6алкандиил-,
L может представлять собой непосредственную связь, когда X представляет собой >CR2- или когда
Z представляет собой радикал формулы (b-11).
2. Соединение по п.1, где X представляет собой >СН- или >CR2-, причем R2 представляет собой
аминокарбонил; Z представляет собой радикал формулы (b-1), (b-2) или (b-11).
3. Соединение по п.1 или 2, где X представляет собой >СН- или >CR2-, причем R2 представляет собой аминокарбонил; Z представляет собой радикал формулы (b-1) или (b-2); L представляет собой бивалентный радикал -C(O)-NH- или L может представлять собой непосредственную связь, когда X представляет собой >CR2-.
4. Соединение по пп.1-3, где соединение выбирают из соединений 4, 5, 11 и 12.
Соединение 4
Соединение 5
Соединение 11
Соединение 12
5. Применение соединения по любому из пп.1-4 в качестве лекарства.
6. Фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически приемлемые носители и терапевтически эффективное количество соединения по любому одному из пп.1-4 в качестве активного ингредиента.
7. Способ получения фармацевтической композиции по п.6, где фармацевтически приемлемые носители и соединение по любому одному из пп.1-4 смешивают в гомогенную смесь.
8. Применение соединения по любому одному из пп.1-4 для получения медикамента для лечения
опосредованного PARP заболевания.
9. Применение по п.8 PARP-ингибитора формулы (I) для изготовления медикамента для лечения
опосредованного PARP-1 заболевания.
10. Применение по п.8 или 9, где лечение включает хемосенсибилизацию.
11. Применение по п.8 или 9, где лечение включает радиосенсибилизацию.
12. Комбинация соединения по любому одному из пп.1-4 с химиотерапевтическим агентом.
13. Способ получения соединения по п.1, отличающийся:
а) циклизацией подходящего замещенного 2-аминокарбонилбензамида формулы (II) в соединения
формулы (I-а), где обе пунктирные линии могут представлять собой связь и другие значения определены
в п.1
b) циклизацией подходящего замещенного 2-аминокарбонилбензамида формулы (VI) с интермедиа- 18 -
012416
том формулы (III) в соединения формулы (I-b), где -C1-6алкандиил- представляет собой -СН2-СН2-, и обе
пунктирные линии могут представлять собой связь и другие значения определены в п.1 или
с) циклизацией подходящего замещенного 2-аминобензамида формулы (V) с интермедиатом формулы (VI) в соединения формулы (I-c), где только одна из пунктирных линий может представлять собой
связь и другие значения определены в п.1
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 19 -