«Молекулярные механизмы регуляции инсулином транспорта

"УТВЕРЖДАЮ"
Председатель ученого совета биолого-почвенного факультета СПбГУ
профессор И.А. Горлинский
"_____"_____________________ 2008 года
Отчет МЕЛЬНИЦКОЙ Анастасии Валерьевны, ассистента кафедры биофизики
по программе поддержки молодых кандидатов наук СПбГУ за 2007/2008 год.
Научный руководитель: профессор кафедры биофизики СПбГУ,
доктор биологических наук З.И. Крутецкая.
Тема научной работы А.В. Мельницкой «Молекулярные механизмы регуляции инсулином транспорта
Na+ в осморегулирующем эпителии кожи лягушки»
1. Научная работа:
Изучение механизмов транспорта ионов через мембраны является одним из
фундаментальных направлений современной биофизики, физиологии и медицины.
Классическими модельными объектами для исследования механизмов транспорта ионов
через биологические мембраны являются кожа и мочевой пузырь амфибий. Транспорт Na+
в осморегулирующих эпителиях представляет собой сложную, многокомпонентную
систему, работа которой обеспечивает создание и поддержание электролитического и
водного гомеостаза.
Известно, что инсулин играет важную роль в регуляции водно-натриевого или
водно-осмолярного баланса. Нарушения регуляции инсулином активности различных
ион-транспортирущих систем, например гиперинсулинемия или резистентность к
инсулину, часто сопровождаются развитием сердечно-сосудистых заболеваний и
2
гипертонии. Способность инсулина стимулировать транспорт Na+ через мембраны
эпителиальных клеток амфибий впервые была продемонстрирована в 1965 году (Herrera,
1965). Регуляция инсулином транспорта Na+ в осморегулирующих эпителиях является
предметом интенсивных исследований в течение последних десятилетий. Однако
молекулярные
механизмы,
лежащие
в
основе
данного
процесса,
по-прежнему,
неизвестны. В связи с этим, задача настоящего исследования состоит в выявлении
возможных клеточных эффекторов, вовлеченных в реализацию регуляторного действия
инсулина на различные компоненты системы транспорта Na+ в осморегулирующем
эпителии кожи лягушки.
В последнее время появляются сообщения о том, что регуляторное действие
инсулина осуществляется путем модуляции гормоном редокс-состояния клеток-мишеней
(Goldstein et al., 2005). Однако работ, освещающих роль окислительной модификации в
регуляции инсулином транспорта Na+ в эпителии кожи лягушки или других нативных
эпителиальных системах, в доступной литературе обнаружить не удалось. В то же время,
исследование роли редокс-регуляции в передаче сигнала от инсулинового рецептора
имеет несомненное теоретическое и практическое значение, так как известно, что
активные формы кислорода играют важную роль в патофизиологии сосудистых
осложнений диабета, а также в развитии самого заболевания (Brownlee, 2001; Ceriello,
Motz, 2004).
Для
регистрации
вольт-амперных
характеристик
(ВАХ)
кожи
лягушки
использовали автоматизированную установку фиксации потенциала (Крутецкая и др.,
2006). Из ВАХ определяли электрические параметры кожи: ток короткого замыкания ISC
(ISC = IT при VT = 0, где IT - трансэпителиальный ток), потенциал открытой цепи VOC (VOC
= VT при IT = 0, где VT - трансэпителиальный потенциал) и трансэпителиальную
проводимость gT. Транспорт Na+ оценивали как амилорид-чувствительный ISC (Крутецкая
и др., 2003).
Первым этапом (2006 – 2007 гг.) исследования является изучение роли агентов,
изменяющих редокс-состояние клетки, в регуляции базального уровня транспорта Na+ в
коже лягушки.
С использованием метода фиксации потенциала исследовано влияние на транспорт
Nа+ в коже лягушки широкого спектра окисляющих и восстанавливающих агентов:
окислителей (цистамин, цистин, окисленный глутатион (GSSG) и его синтетический
аналог препарат Глутоксим) и восстановителей (дитиотреитол (DTT)).
Известно, что мембраны эпителиальных клеток структурно и функционально
ассиметричны,
при
этом
транспорт
Na+ через эпителий является результатом
3
координированной активности Nа+/K+-ATФазы, расположенной в базолатеральной
мембране, и эпителиальных Na+-каналов (ENaC), локализованных в апикальной мембране
эпителиальных клеток. Калий, поступающий в клетку благодаря активности Nа+/K+ATФазы, удаляется из клетки по К+-селективным каналам в базолатеральной мембране. В
связи с этим, для исследования характера действия окисляющих и восстанавливающих
агентов на транспорт Na+ в коже лягушки, а также для определения возможных мишеней,
опосредующих это влияние, представлялось целесообразным изучить влияние указанных
агентов при приложении их как с апикальной, так и с базолатеральной поверхности кожи.
Известно, что одной из основных редокс буферных систем в клетках является
система глутатион/окисленный глутатион (GSH/GSSG). В клетках различных типов (в том
числе и эпителиальных) система GSH/GSSG участвует в регуляции экспрессии генов,
передаче сигналов в норме и при патологии, в том числе сигналов, запускающих апоптоз.
Показано, что приложение GSSG и Глутоксима в концентрации 10 – 1200 мкг/мл со
стороны апикальной поверхности кожи вызывало подавление транспорта Na+. При этом
наибольшее ингибирующее действие оказывали низкие (10 – 300 мкг/мл) концентрации
обоих агентов. В то же время, добавление Глутоксима со стороны базальной поверхности
кожи лягушки вызывало увеличение транспорта Na+.
Цистин (дицистеин; 3,3’ – дитиобис (2 – аминопропионовая кислота); цистеин
дисульфид)
–
серосодержащая
аминокислота,
димер
цистеина,
содержащий
дисульфидную связь, играющую важную роль в стабилизации пространственной
структуры белков. Цистин - важный антиоксидант, а также источник для синтеза
глутатиона, являющегося основным внутриклеточным буфером свободных радикалов.
Цистамин (цистинамин; 2,2’-дитиобис (этиламин); 2,2’-диаминодиэтилдисульфид)
– радиопротекторное средство, повышает устойчивость организма к воздействию
ионизирующей радиации. Установлено, что цистамин окисляет SH-группы белков и
образует смешанные дисульфиды с тиолами белков (Thor et al., 1985). Так показано, что
цистамин ингибирует тиол-зависимые ферменты, такие как трансглутаминаза и каспазы,
образуя смешанный дисульфид в активном центре ферментов (Lesort et al., 2003). Кроме
того, цистамин действует как антиоксидант и увеличивает содержание глутатиона в
клетках (Jokay et al., 1997).
Показано, что приложение к апикальной поверхности кожи лягушки цистамина
(50 - 800 мкг/мл) или цистина (5 - 50 мкг/мл) вызывает подавление транспорта Na+ в коже
лягушки. При этом наибольшим ингибирующим действием на транспорт Na+ обладает
цистин. Предварительная обработка кожи лягушки дитиотреитолом (ДТТ) (1 мМ),
восстанавливающим S – S связи в белках, существенно снижает ингибирующее действие
4
цистина на транспорт Na+ в коже лягушки. Это свидетельствует о том, что влияние
дисульфидсодержащих агентов на ISC в коже лягушки опосредовано их взаимодействием с
функционально важными остатками цистеина Na+-транспортирующих белков. При
добавлении тех же концентраций цистина и цистамина со стороны базальной поверхности
кожи сохранялось подавление транспорта Na+.
Ведущую
роль
в
осуществлении
направленного
переноса
Na+
играют
эпителиальные Na+-каналы (ENaC). Мутации субъединиц ENaC приводят к гипер- или
гипотонии и лежат в основе ряда наследственных заболеваний, таких как синдром Лиддла
(Liddle et al., 1963) или псевдогипоальдостеронизм типа 1 (диабет почечный солевой)
(Cheek, Perry, 1957; Ashcroft, 2000; Snyder, 2005). Известно, что транспорт Na+ в
эпителиальных клетках – сложная многокомпонентная система, включающая в себя
различные Na+-транспортирующие белки, являющиеся мишенью для окислительного и
восстановительного стресса (Мельницкая и др., 2006). Однако, введение в конце каждого
эксперимента в раствор, омывающий апикальную поверхность кожи блокатора ENaC
амилорида (20 мкМ), вызывало практически полное подавление ISC, что свидетельствует о
том, что влияние окисляющих агентов на транспорт Na+ связано преимущественно с
модуляцией активности ENaC.
По-видимому,
приложенные
к
все
исследованные
апикальной
поверхности
дисульфидсодержащие
кожи,
взаимодействуют
соединения,
с
высоко
консервативными богатыми цистеином экстраклеточными доменами ENaC, что приводит
к ингибированию активности ENaC и подавлению транспорта Na+ в коже лягушки. Кроме
того, цистин и цистамин могут также проникать в эпителиальные клетки. Цистамин,
будучи
незаряженным,
хорошо
проникает
через
мембрану.
Цистин
может
транспортироваться в клетку с участием гетеромерных переносчиков аминокислот: bO,+
переносчика, обнаруженного в апикальной мембране эпителиальных клеток, или в
результате обращенного режима работы переносчика LAT2/4F2hc, локализованного в
базолатеральной мембране эпителиальных клеток (Wagneret al., 2001). Более выраженное
ингибирующее влияние цистина и цистамина на транспорт Na+ (по сравнению с другими
использованными агентами), по-видимому, связано именно с сочетанным действием
цистина и цистамина как на экстраклеточные, так и на расположенные со стороны
цитозоля
функционально
важные
остатки
цистеина
ENaC
и/или
других
Na+-
транспортирующих белков. Эти данные согласуются с результатами, полученными на
ооцитах Xenopus, в соответствии с которыми ENaC быстро и обратимо ингибируются (на
20 - 50 %) различными внутри- и экстраклеточными окисляющими агентами [Kellenberger
et al., 2005; Snyder et al., 1998; Sheng et al., 2001).
5
В то же время, GSSG и Глутоксим могут взаимодействовать с богатыми цистеином
доменами
рецептора
инсулина,
локализованного
в
базолатеральных
мембранах
эпителиальных клеток. Это предположение согласуется с данными, полученными ранее
для рецептора эпидермального фактора роста, который, как и рецептор инсулина,
содержит богатые цистеином экстраклеточные домены. Так, на клетках эпидермоидной
карциномы человека линии А431 установлено, что GSSG и Глутоксим вызывают
трансактивацию рецептора эпидермального фактора роста и активацию его собственной
тирозинкиназной активности (Бурова и др., 2005; Василенко и др., 2006). По-видимому,
увеличение ISC, наблюдаемое нами после приложения GSSG или Глутоксима со стороны
базолатеральной поверхности кожи, может быть связано именно с трансактивацией
рецептора инсулина, ведущей к активации ENaC и стимуляции транспорта Na+.
Таким образом, нами впервые показано, что транспорт Na+ в коже лягушки
чувствителен к окислительному стрессу и модулируется окисляющими агентами,
приложенными как с апикальной, так и базолатеральной поверхности кожи (Мельницкая
и др., 2007 а-в; Melnitskaya et al., 2007; Крутецкая и др., 2008; Melnitskaya et al., 2008).
Полученные нами данные позволяют также предположить, что основными мишенями для
модулирующего действия различных тиол-модифицирующих агентов на транспорт Na+ в
коже лягушки являются эпителиальные Na+-каналы. В то же время, механизмы,
опосредующие регуляторное действие тиол-модифицирующих агентов на ENaC и другие
компоненты системы транспорта Na+ в коже лягушки, остаются по-прежнему, неясными.
Вторым этапом (2007 – 2008 гг.) настоящего исследования является определение
роли окислительно-восстановительного состояния клетки в регуляции инсулином
транспорта Nа+ в коже лягушки. Полученные нами данные о влиянии тиолмодифицирующих агентов на транспорт Na+ в коже лягушки свидетельствуют о том, что
стимулирующее действие на транспорт Na+ GSSG и бинарных каталитических систем
(препарат Глутоксим) сходно с влиянием на трансэпителиальный транспорт Na+ инсулина,
приложенного к базолатеральной стороне кожи. Обнаружено также, что после
предварительной обработки кожи лягушки GSSG (10 - 100 мкг/мл) или Глутоксимом (10 100 мкг/мл), введение в раствор, омывающий базолатеральную поверхность кожи
лягушки инсулина (1 мкМ) (на фоне развившегося стимулирующего влияния окисляющих
агентов), уже не вызывает увеличения транспорта Na+. Полученные результаты также
подтверждают наше предположение о том, что влияние тиол-модифицирующих агентов
(GSSG, Глутоксим) и инсулина на транспорт Na+ в коже лягушки, реализуется при
участии сходных и/или единых молекулярных механизмов. Таким образом, GSSG и
бинарные каталитические системы, приложенные к базолатеральной поверхности кожи,
6
имитируют действие инсулина и, подобно инсулину, стимулируют трансэпителиальный
транспорт Na+.
Известно, что стимулирующее влияние инсулина на транспорт Na+ инициируется
связыванием гормона с рецептором, принадлежащим к суперсемейству рецепторов,
имеющих собственную тирозинкиназную активность (Cadena, Gill, 1992). Ранее нами
было показано, что действие инсулина на транспорт Na+ в коже лягушки Rana temporaria
зависит от активности тирозинкиназ и тирозинфосфатаз и осуществляется при участии
фосфатидилинозитолкиназ и протеинкиназы С (Мельницкая, 2004; Мельницкая и др.,
2004; Мельницкая и др., 2005; Мельницкая и др., 2006 а, б). Для подтверждения
предположения о том, что GSSG и Глутоксим способны к трансактивации рецептора
инсулина и активации тирозинкиназ, мы исследовали возможную роль тирозинкиназ в
регуляторном действии этих окисляющих агентов на транспорт Na+ в коже лягушки.
Обнаружено, что специфический ингибитор тирозинкиназ генистейн существенно
снижает стимулирующее действие GSSG и Глутоксима на транспорт Na+ в коже лягушки
(Мельницкая и др., 2007). Согласно полученным данным, тирозинкиназам принадлежит
важная роль в модуляции окисляющими агентами транспорта Na+ в коже лягушки.
Таким образом, нами впервые показано, что GSSG и бинарные каталитические
системы,
приложенные
к
базолатеральной
поверхности
кожи,
являются
инсулиномиметиками и стимулируют транспорт Na+ в коже лягушки (Крутецкая и др.,
2008; Melnitskaya et al., 2008). Можно предположить также, что GSSG
и бинарные
каталитические системы вызывают трансактивацию рецептора инсулина, что приводит к
активации амилорид-чувствительных Na+-каналов (ENaC) и стимуляции транспорта Na+.
Третьим этапом (2008 - 2009 гг.) исследования является изучение молекулярных
механизмов, вовлеченных в реализацию регуляторного действия инсулина на
транспорт Na+, осуществляемого путем модуляции гормоном редокс-состояния
белков-мишеней.
2. Педагогическая работа:
1.
Практикум по общему курсу биофизики для бакалавров 3 курса дневного
отделения (III/6) – 52 ч.
2.
Практикум по общему курсу биофизики для бакалавров 4 курса вечернего
отделения (IV/8) – 30 ч.
7
3.
Консультации по общему курсу биофизики для бакалавров 4 курса
вечернего отделения (IV/8) – 24 ч.
4.
Приём экзаменов – 8 ч.
Итого: 114 ч.
3. Публикации за 2006-2007 гг.:
1.
…Бутов
С.Н.,
…Крутецкая
З.И.,
…Курилова
Л.С.,
…Лебедев
О.Е.,
…Мельницкая А.В. и др. Большой практикум по физиологии человека и животных. М.,
Издательский центр «Академия», 2007. Т. 1. С. 161-186. (Учебное пособие, Учебнометодическое объединение по классическому университетскому образованию, «Высшее
профессиональное образование»).
2. Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Антонов В.Г. 2007 а. Влияние
окисляющих агентов на транспорт Na+ в коже лягушки. В матер. ХХ Съезда
Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва. 4-8 июня 2007. С. 331-332.
3. Melnitskaya A.V., Krutetskaya Z.I., Lebedev O.E., Antonov V.G., Butov S.N.,
Krutetskaya N.I. 2007. Redox modulation of Na+ transport in frog skin. В матер.
Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 5-7
июня 2007. С. 205-207.
4. Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Антонов В.Г., Рощина Н.Г. 2007
б. Влияние окисленного глутатиона и препарата Глутоксим на транспорт Na+ в коже
лягушки.
В
матер.
5-ой
национальной
научно-практической
конференции
с
международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и
здоровье человека». Смоленск. 18-22 сентября 2007. С. 59-60.
5. Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Антонов В.Г., Бутов С.Н. 2007 в.
Редокс регуляция транспорта Na+ в коже лягушки. В матер. 11-ой Пущинской школы –
конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI века». 29 октября – 2 ноября 2007.
Пущино. С. 62-64.
6. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Мельницкая А.В., Антонов В.Г., Ноздрачев А.Д.
2008. Влияние дисульфидсодержащих соединений на транспорт Na+ в коже лягушки. ДАН
(принята к печати).
7. Melnitskaya A.V., Krutetskaya Z.I., Lebedev O.E., Antonov V.G., Butov S.N.,
Krutetskaya N.I. 2008. The role of tyrosine kinases in the effect of oxidized glutathione and
8
Glutoxim on Na+ transport in frog skin. In: materials of the International symposium "Biological
Motility". Pushchino. 2008. May 11 – 15. Р. 164-166.
Отчет заслушан и утвержден на заседании кафедры биофизики СПбГУ протокол
№ 11 от 15.05.2008 г.
Заведующий кафедрой биофизики СПбГУ
З.И. Крутецкая
Секретарь кафедры
В.И. Бадюлина
9
Список литературы
Бурова Е.Б., Василенко К.П., Антонов В.Г., Никольский Н.Н. 2005. ДАН. Т. 404. №
1. С. 122-124.
Василенко К.П., Бурова Е.Б., Антонов В.Г., Никольский Н.Н. 2006. Цитология. Т.
48. № 6. С. 500-507.
Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Мельницкая А.В. 2003. Цитология. Т. 45. № 6. С. 590595.
Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Мельницкая А.В., Ноздрачев А.Д. 2006. ДАН. Т. 410.
№ 4. С. 568-570.
Мельницкая А.В. 2004. В Мат. Седьмой Всероссийской медико-биологической
конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье». Санкт-Петербург. 18
апреля 2004. С. 212-213.
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. 2004. В Мат. XIX съезда
физиологического общества им. И.П.Павлова. Екатеринбург. Тезисы докладов. Часть 2.
Рос. Физиол. Журн. Им. И.М.Сеченова. Т.90. № 8. С. 68.
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. 2006. Цитология. Т. 48. № 10. С.
817-840.
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Бутов С.Н., Рощина Н.Г. 2005. В
научных трудах I съезда физиологов СНГ. Сочи, Дагомыс. 19-23 сентября 2005. Изд.
Москва «Медицина-Здоровье». Том 2. С. 102.
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. 2006 а. В матер. 10-ой Пущинской
школы молодых ученых «Биология – наука ХХI века». 17-21 апреля 2006. Пущино. С. 115.
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. 2006 б. В матер. V Международной
конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения - 2006».
Морфология. Т. 129. N. 2. С. 61.
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Антонов В.Г. 2007 а. В матер. ХХ
Съезда Физиологического общества им. И.П. Павлова. Москва. 4-8 июня 2007. С. 331-332.
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Антонов В.Г., Рощина Н.Г. 2007 б.
В матер. 5-ой национальной научно-практической конференции с международным
участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека».
Смоленск. 18-22 сентября 2007. С. 59-60.
10
Мельницкая А.В., Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Антонов В.Г., Бутов С.Н. 2007 в. В
матер. 11-ой Пущинской школы – конференции молодых ученых «Биология – наука ХХI
века». 29 октября – 2 ноября 2007. Пущино. С. 62-64.
Крутецкая З.И., Лебедев О.Е., Мельницкая А.В., Антонов В.Г., Ноздрачев А.Д.
2008. ДАН (принята к печати).
Ashcroft F.M. 2000. Acad. Press. 481р.
Brownlee, M. 2001. Nature. 414: 813-820.
Cadena D.L., Gill G.N. 1992. FASEB J. 6: 2332-2337.
Ceriello A, Motz E. 2004. Arterioscler. Thromb. Vas. Biol. 24: 816-823.
Cheek D.B., Perry J.W. 1957. Arch. Dis. Child. 33: 252-256.
Goldstein B.J., Mahadev K., Wu X. 2005. Diabetes. 54: 311-321.
Herrera F.C. 1965. Am. J. Physiol. 209: 819-824.
Kellenberger S., Gautschi I., Pfister Y. et al. 2005. J. Biol. Chem. V. 280. P. 7739-7747.
Liddle G.W., Bledsoe T., Coppade W.S. 1963. Trans. Assog. Am. Physicians. 76: 199213.
Melnitskaya A.V., Krutetskaya Z.I., Lebedev O.E., Antonov V.G., Butov S.N., Krutetskaya
N.I. 2007. В матер. Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная
сигнализация». Пущино. 5-7 июня 2007. С. 205-207.
Melnitskaya A.V., Krutetskaya Z.I., Lebedev O.E., Antonov V.G., Butov S.N., Krutetskaya
N.I. 2008. In: materials of the International symposium "Biological Motility". Pushchino. 2008.
May 11 – 15. Р. 164-166
Snyder P.M. 2005. Endocrinology. 146. 5079-5085.
Snyder P.M., Cheng C., Prince L.S. et al. 1998. J. Biol. Chem. V. 273. P. 681-684.
Sheng S.H., Li J.Q., McNulty K.A. et al. 2001. J. Biol. Chem. V. 276. P. 1326-1334.
Wagner C.A., Lang F., Broer S. 2001. Am. J. Physiol. V. 281. P. C1077-C1093.