Столяр М.А. Статья в БЛС - Сибирский федеральный университет
advertisement
ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ МЕТОДОМ ИМПЕДАНСОМЕТРИИ М.А. Столяр, Ольховский И.А. Сибирский Федеральный Университет, Красноярский филиал ФГБУ ГНЦ Минздравсоцразвития России, КНЦ СО РАН В последнее десятилетие отмечается нарастающая тенденция к увеличению интереса к оценке функциональной активности тромбоцитов в связи с их ключевой ролью в атеротромбозе и прогрессивно расширяющимся использованием дезагрегантов в профилактике сосудистых катастроф. Закономерно расширяется и рынок коммерческих предложений специализированного оборудования, а также спектр лабораторных методов исследования традиционным функций тромбоцитов. оптическим тестам В современной приходят новые, агрегометрии более на смену информативные и стандартизованные методики и, в частности, основанные на импедансометрии цельной крови. Настоящий обзор посвящен описанию методов оценки функциональной активности тромбоцитов. Структурные особенности тромбоцитов Тромбоциты были описаны в первой половине XIX века. Несколько позже ряд исследователей не только констатировали наличие в крови очень мелких частиц, но и показали, что они накапливаются в местах повреждения сосудов и образования кровяного сгустка. Итальянец Биззозеро первым предложил термин кровяная пластинка (blood platelet). Термин тромбоцит (thrombocyte) был введён только в начале XX века. В настоящее время в зарубежных публикациях, в первую очередь англоязычных, термин пластинка (platelet) применяется для обозначения безъядерных тромбоцитов у млекопитающих, а тромбоцит (thrombocyte) – для ядерных клеток птиц, рептилий, рыб и некоторых других животных. К настоящему времени накоплено очень много фактического материала о структуре кровяных пластинок. Следует отметить некоторые примечательные особенности этих компонентов кровообращения. Тромбоциты, или кровяные пластинки – самые мелкие, безъядерные, форменные элементы крови. Неактивированные тромбоциты имеют форму дисков с диаметром 2-3 мкм, образуются из мегакариоцитов костного мозга и циркулируют в кровотоке в течение 7-10 суток, затем разрушаются в селезенке. Нельзя не упомянуть и об альтернативной теории образования кровяных пластинок из разрушающихся в капиллярах легочной ткани циркулирующих мегакариоцитов [1]. Плазматическая мембрана тромбоцитов, состоящая из полярных фосфолипидов и белков, имеет толщину 7-8 нм. Углеводородные остатки гликопротеидов и гликолипидов плазматической мембраны образуют внешнюю оболочку 1 клеток, называемую гликокаликсом [2]. К специфическим органеллам тромбоцитов относятся три типа гранул: α-гранулы, плотные гранулы и лизосомы, а также митохондрии, вакуоли, пероксисомы, аппарат Гольджи. Каждая из этих органелл имеет собственную мембрану, а митохондрии - двойную мембрану. Плотные гранулы (δгранулы) содержат АДФ, АТФ, серотонин, пирофосфат, ионы Са2+; α-гранулы - фактор роста, ß-тромбоглобулин, фактор VIII, антиген фактора Виллебранда, фактор V, фибриноген, тромбоспондин, фибронектин, лизосомальные гранулы - фосфатазы, арилсульфатазы, кислые гидролазы [3]. У кровяных пластинок также имеются две дискретные системы мембран: открытых каналов и плотная тубулярная система. Последняя подобна эндоплазматическому ретиккулуму скелетной мышцы. А через систему открытых каналов тромбоциты секретируют содержимое своих гранул. В цитозоле расположены структуры, не имеющие мембран - микротрубочки, микрофиламенты и гранулы гликогена. Микротрубочки и микрофиламенты являются основными компонентами цитоскелета, который определяет форму и объем клеток, а также их способность прикрепляться к различным поверхностям, перемещать органеллы из одной части клетки в другую и образовывать многочисленные псевдоподии [4]. Многогранность функций тромбоцитов Тромбоциты, выполняют ключевую роль в свёртывании крови, участвуя в процессе остановки кровотечения в первую очередь, при нарушении целостности стенки сосудов артериального русла. В нормальных условиях циркулирующие в крови тромбоциты практически не взаимодействуют с сосудистой стенкой, которая изнутри покрыта монослоем эндотелиальных клеток. Однако при повреждении сосуда тромбоциты вступают в контакт со структурами, расположенными под эндотелием, т.е. во внутренних слоях сосудистой стенки. В результате этого контакта тромбоциты прикрепляются (адгезируют) к компонентам субэндотелиального матрикса сосуда. Главные субстраты адгезии – присутствующие в субэндотелии коллаген и фактор Виллебранда. Фактор Виллебранда содержится не только в тканевом матриксе, но и циркулирует в кровотоке, и может попадать в участки повреждения сосуда в результате сорбции из плазмы крови. Кроме адгезивных субстратов тромбоциты взаимодействуют с появляющимися в зоне повреждения так называемыми растворимыми агонистами (индукторами), главные из которых – тромбин, АДФ и тромбоксан А2 (ТХА2) [5]. Тромбин образуется в результате активации плазменных факторов свертывающей системы, а АДФ и ТХА2 высвобождаются из самих тромбоцитов и/или из повреждённых клеток крови и 2 сосудистой стенки. Взаимодействие адгезивных субстратов и растворимых агонистов со специфическими рецепторами инициирует активацию тромбоцитов, выражающуюся в изменении их морфологии, внутренней структуры и в стимуляции различных функциональных реакций. Таким образом, тромбоциты активируются в результате воздействия на них многочисленных эндогенных индукторов, как входящих в составе внутренних слоев сосудистой стенки, так и появляющихся в плазме крови в зоне повреждения сосуда. Многообразие путей активации тромбоцитов обеспечивает большой запас прочности для этой реакции (рис.1). Именно поэтому недостаточная эффективность одного или даже нескольких индукторов, как правило, компенсируется и не приводит к критическим поломкам системы тромбоцитарного гемостаза. Рисунок 1 – Многогранность роли тромбоцитов в гемостазе [3]. Начальная адгезия тромбоцитов опосредуется через фактор Виллебранда (vWF), связывающийся с рецептором GP Ib/IX/V на поверхности тромбоцитов. Тромбоциты начинают замедляться и временно задерживаются или катятся вдоль стенки сосуда. Взаимодействие коллагена с GP VI приводит к активации клеток, в результате чего происходит адгезия и распространение сигнала через активацию рецепторов GP IIb/IIIa и α2β1. Адгезия тромбоцитов приводит также к реализации внутриклеточной сигнализации и активации тромбоцитов в результате дегрануляции, в том числе высвобождению АДФ, образованию тромбоксана, активации GP IIb/IIIa комплекса и экспозиции анионов фосфолипидов, генерации прокоагулянтов микровезикул. Это способствует вовлечению остальных тромбоцитов в месте повреждения в результате опосредованной агрегации фактором Виллебранда и фибриногеном через «мостики» между активированными GP IIb/IIIa соседних клеток. После связывания индукторов со своими рецепторами на поверхности тромбоцитов активирующий сигнал передается через 3 плазматическую мембрану и затем распространяется с помощью так называемых вторичных посредников. К вторичным посредникам относят полиинозитолтрифосфат, внутриклеточный ионизированный кальций и циклические нуклеотиды (цАМФ, цГМФ). В свою очередь вторичные мессенджеры активируют каскадные реакции фосфорилирования различных эффекторных белков, регулирующих активность ферментов метаболических путей и функциональную активность клетки. Активационно-зависимая перестройка цитоскелета тромбоцитов стимулирует их морфологические изменения – превращение из гладких дисков в сферы с отростками, образование псевдоподий и феномен распластывания на повреждённой поверхности сосуда. Эти изменения увеличивают площадь контакта и прочность прикрепления тромбоцитов к субэндотелиальным компонентам сосудистой стенки. Активированные тромбоциты секретируют биологически активные соединения, дополнительно усиливающие их активацию (АДФ, ТХА2, серотонин и др.), и способствующие привлечению новых циркулирующих тромбоцитов в зону повреждения. Эти агонисты высвобождаются из внутриклеточных гранул или же синтезируются de novo из арахидоновой кислоты, освобождающейся из мембранных фосфолипидов (ТХА2). Одно из важнейших следствий активации тромбоцитов – приобретение ими способности к взаимодействию с фибриногеном. Активация тромбоцитов индуцирует конформационные перестройки комплекса мембранных гликопротеинов IIb-IIIa и формирование во внеклеточной части этого рецептора участка связывания фибриногена. Фибриноген образует молекулярные «мостики» между активированными тромбоцитами, что вызывает их «склеивание», или агрегацию. Тромбоциты выполняют не только кровоостанавливающую функцию, но также участвуют в воспалительных и репаративных процессах [3]. Активированные тромбоциты взаимодействуют с лейкоцитами крови, способствуя их мобилизации в зону повреждения. В этих взаимодействиях ключевую роль играют белки клеточной адгезии – Р-селектин и гликопротеин IIb-IIIa. Кроме того, тромбоциты являются источником некоторых хемокинов, привлекающих лейкоциты (RANTES, тромбоцитарный фактор 4 и др.), и цитокинов, вызывающих провоспалительную активацию эндотелиальных клеток. Тромбоциты вовлечены и в процессы заживления (репарации) тканей. Они секретируют факторы роста, стимулирующие пролиферацию гладкомышечных и некоторых других типов клеток [6]. Гидродинамика тока крови – ещё один фактор, влияющий на функциональную активность тромбоцитов. Высокая скорость сдвига – одна из важнейших характеристик кровотока в артериальных сосудах. Этот показатель определяет степень различия в движении слоев жидкости относительно друг друга. Данные параметры играют ключевую роль при взаимодействии тромбоцитов с фактором Виллебранда. При высоких 4 скоростях сдвига фактор Виллебранда служит основным субстратом для первичной адгезии тромбоцитов к участкам повреждения сосудистой стенки. Экстремальные повышения скорости сдвига, которые могут развиваться при сужении просвета мелких артерий в результате разрастания атеросклеротических бляшек или при спазме этих сосудов, стимулируют взаимодействие тромбоцитов не только с иммобилизованными на поверхности, но и присутствующим в плазме фактором Виллебранда [3]. Дефект функции тромбоцитов влечёт за собой повышенный риск кровотечения или напротив - тромбообразования. Артериальные тромбы формируются, как правило, на месте атеросклеротического поражения сосуда, определяя развитие ишемии и в т.ч. инсульта и инфаркта миокарда - двух основных причин заболеваемости и смертности в России странах. В связи с этим антитромбоцитарная терапия занимает ведущее место в лечении и профилактике тромботических состояний. Вместе с тем, использование дезагрегантов приводит к увеличению частоты кровотечений, в том числе представляющих серьёзную опасность для жизни пациента [7]. Для диагностики тромбоцитопатий, и определения чувствительность пациентов к дезагрегантам чаще всего и исследуют агрегацию тромбоцитов. Агрегометрия тромбоцитов Качественные изменения в методологии изучения тромбоцитов начались приблизительно в середине XX века. Важным этапом стало появление методов выделения тромбоцитов, изолированных от других клеток крови, а затем и от плазменных компонентов. Основной методологический прорыв в исследовании физиологии тромбоцитов произошёл в начале 1960-х годов, когда двое учёных из Великобритании – Борн и О’Брайен независимо друг от друга разработали простой оптический метод измерения агрегации тромбоцитов. Это по-прежнему наиболее широко используемый тест для выявления и диагностики дефектов функции тромбоцитов, который осуществляется с использованием коммерчески доступных агрегометров. Агрегометры с анализом агрегации в цельной крови на основе технологии импеданса широко доступны и могут сочетать в себе люминометр с одновременным измерением секреции гранул (рис.2) (фирма Chrono-Log, США). 5 Рисунок 2 – Агрегометр Chrono-Log В России наиболее популярны также агрегометры фирмы БИОЛА (Россия) (рис.3), Солар (Белоруссия). Преимуществом этих приборов является возможность анализа тромбоцитарных микроагрегатов. Рисунок 3 – Агрегометр БИОЛА Ultegra-RPFA –ещё один прибор, основанный на турбидиметрическом анализе (см. ниже) с оптической системой детектирования (рис.4). Он измеряет индуцированную агрегацию как увеличение поглощения света. Эта модификация агрегометрического прибора изначально разрабатывалась как система мониторинга действия антитромбоцитарных препаратов. Тест может успешно выполняться в лаборатории, не требует транспортировки проб и длительного ожидания результатов анализа. 6 Рисунок 4 – Агрегометр Ultegra-RPFA В последние годы получил распространение аппарат для измерения агрегации, называемый «The Verify Now System» или «VerifyNow» (рис.5). Рисунок 5 – Агрегометр VerifyNow Этот аппарат использует цельную кровь, метод основан на анализе светопропускания. Но в кювете прибора кроме крови присутствуют покрытые фибриногеном пластиковые шарики, агглютинирующие вместе с активированными тромбоцитами, содержащими рецептор фибриногена. При этом весь процесс – от взятия крови до получения результатов, может быть проведен у постели больного в течение 1015 минут. Ограничивает метод высокая стоимость одноразовых кювет. Широкое 7 распространение получил также прибор, называемый анализатор функции тромбоцитов (Platelet Function Analyser, PFA-100) (рис.6). Рисунок 6 – Агрегометр PFA-100 В этом приборе цельную кровь пропускают через картридж, в котором она проходит вначале через узкий стальной капилляр, а затем через небольшое отверстие в мембране покрытой коллагеном и растворимым агонистом. Фактически измеряется не адгезия или агрегация тромбоцитарного тромбоцитов, гемостаза. Однако а этот суммарная метод не интенсивность обладает процесса достаточной чувствительностью для измерения антитромботических эффектов таких препаратов как ацетилсалициловая кислота и антагонисты АДФ рецептора. Также ограничивает и высокая стоимость одноразовых картриджей. Фотометрический метод оценки агрегации. В большинстве лабораторий используется фотометрический метод индуцированной агрегации тромбоцитов. Принцип этого метода основан на регистрации изменения светопропускания обогащённой тромбоцитами плазмы (ОТП). После добавления индуктора агрегации и формирования тромбоцитарных агрегатов наблюдается просветление ОТП. Мерой агрегационного процесса является графически регистрируемое падение оптической плотности и увеличение светопропускания плазмы крови [8]. Этот метод обычно называют турбидиметрическим – от английского слова turbidity – мутность. Он же часто называются 8 методом Борна или агрегометрией по Борну, несправедливо забывая ещё одного создателя метода – О’Брайена. Существенным недостатком турбодиметрического метода является сильная зависимость от соблюдения условий многоэтапного процесса подготовки проб [9]. Кроме того, необходимость предварительного центрифугирования отнимает время, отпущенное на проведение тестирования образцов крови - агрегометрия должна проводиться в течение 3-х часов после взятия крови, и соответственно ограничивает количество одновременно анализируемых образцов. Импедансный метод оценки агрегации. На смену вышеуказанному методу приходит более современный, технологически упрощённый тест импедансометрии в цельной крови (таб. 1). Принцип метода заключается в том, что регистрируются микротоки, протекающие в специальном электродном блоке, при погружении его в образец крови. При этом измеряется изменение импеданса (сопротивления) системы электродов. Увеличение импеданса прямо пропорционально тромбоцитарной массе, осажденной на электродный блок. Кинетика импеданса позволяет количественно судить о кинетике процесса агрегации. Первоначальный контакт электродов с образцом крови приводит к образованию на них монослоя тромбоцитов. Затем при добавлении агонистов (АДФ, коллаген, арахидоновая кислота, ристоцетин и др.) происходит постепенная агрегация тромбоцитов на электродах, которая и приводит к характерным изменениям электрических свойств системы [10]. Данный метод позволяет также учитывать феномен лейкоцитарно-тромбоцитарной адгезии, наблюдающийся в пробах некоторых пациентов и достаточно подробно исследованный [4]. Таблица 1 Сравнительные характеристики оптического и импедансного методов агрегометрии Параметр Этап подготовки плазмы Оптический тест Критичен для качества результатов, в ходе центрифугирования тромбоциты теряют нативные свойства, наиболее крупные клетки удаляются с осадком [8]. Влияние других Отсутствует во время форменных элементов измерения. крови и их медиаторов Чувствительность к Регистрируются 9 Импедансный тест Отсутствует. Использование цельной крови значительно снижает общее время проведения исследования. Может зависеть от состава и функциональной активности других присутствующих в пробе клеток крови. Преимущественная формирующимся тромбоцитарным агрегатам миниагрегаты и макроагрегаты [9]. Чувствительность к патологическим значениям агрегации Влияние преаналитических погрешностей Более чувствителен к выявлению лиц с гипоагрегацией [9]. Проведение теста невозможно в гемолизированных, липопротеинимичных пробах. Риск влияния Минимальный при аналитических использовании разовых погрешностей при расходных материалов использовании прибора Требуется контроль за состоянием оптической системы. Время 30 мин непосредственного исследования одного образца при одноканальном режиме работы Параметры агрегатограммы. Для регистрация макроагрегатов, т.к. они могут значительно изменять регистрирующееся прибором сопротивление [7]. Более чувствителен к выявлению лиц с гиперагрегацией [9]. Проведение теста возможно в гемолизированных, липопопротиенимичных пробах [13]. Возможна погрешность измерений в связи с недостаточной очисткой многоразовых электродов, требует проведение их тщательной промывки и высушивания [9]. 12 мин количественного описания агрегации применяют такие параметры, как: степень агрегации - оценивается по максимальной амплитуде агрегатограммы, которая соответствует максимальному увеличению сопротивления на электроде после внесения индуктора; скорость агрегации – оценивается по амплитуде агрегатограммы за 1 мин после начала агрегации; время задержки – оценивается по времени в сек, прошедшему после добавления индуктора и до начала регистрации агрегации; площадь под кривой агрегации является произведением амплитуды на скорость её достижения. Наряду с вышеуказанными параметрами агрегации важное значение для её характеристики имеет также обратимость/необратимость агрегационного ответа. Если агрегация имеет обратимый характер, то после достижения максимума сопротивления наблюдается снижение его уровня, обусловленное частичным или полным распадом образованных агрегатов (дезагрегация). Для необратимой агрегации, обычно регистрируемой при высоких концентрациях индукторов, характерно постоянное 10 увеличение сопротивления в процессе его регистрации. Иногда, при соответствующих концентрациях слабых индукторов (АДФ) на агрегатограмме можно выделить развитие второй, необратимой волны агрегации, зависящей от действия высвобождаемых из тромбоцитов эндогенных агонистов (ТХА2 и/или АДФ). Повышение концентрации индуктора приводит к слиянию первой и второй волн агрегации. Вторая волна подавляется ацетилсалициловой кислотой и не развивается при дефиците плотных гранул [2]. Диагностические параметры импедансной агрегации в анализе патологических состояний тромбоцитов Тромбоцитарные патологии можно разделить на три группы: тромбоцитарные дисфункции с нормальным, сниженным и повышенным количеством тромбоцитов. Тромбоцитарные дисфункции с нормальным количеством тромбоцитов Дисфункции тромбоцитов с их количеством в пределах нормы обычно указывают на качественное расстройство тромбоцитов. Они могут индуцироваться лекарствами – аспирин, антагонисты рецептора IIa/IIIb, тиенопиридины. Тромбастения Гланцмана проявляется во врожденном дефиците или дисфункции гликопротеина IIb/IIIa - рецептора для фибриногена. Это аутосомно-рецессивное заболевание, которое сопровождается кровотечениями кожи и слизистых оболочек. Агрегационный ответ отсутствует при добавлении АДФ, коллагена, арахидоновой кислоты и адреналина, в то время как ристоцетин-индуцированная агрегация в норме [2]. Синдром Бернара-Сулье проявляется во врождённой недостаточности гликопротеина IIbα/Ibβ/V тромбоцитов. Наследуется как аутосомно-рецессивный признак с тяжёлыми кровотечениями. Агрегация тромбоцитов в норме при индукции АДФ, коллаген, адреналин и арахидоновую кислоту, но отсутствует после добавления ристоцетина. Требуются дополнительные лабораторные обследования для дифференцировки данной патологии от болезни Виллебранда [5]. В основе болезни Виллебранда лежат генетические мутации, приводящие к количественным и/или качественным изменениям фактора Виллебранда и угнетению реакций тромбоцитов, зависящих от взаимодействий с этим белком. Часто возникают носовые и десневые кровотечения, регистрируется склонность к появлению синяков. Частота заболевания составляет около 1:100000 человек, а число асимптотических случаев снижения фактора Виллебранда в крови может достигать 1:100 человек. Геморрагические симптомы могут быть крайне умеренными и обычно проявляются лишь при травмах и 11 хирургических операциях. Пациентов, клиническая история которых предполагает геморрагические нарушения, очень часто исследуют на наличие нарушений системы свертывания. Проверка дисфункции тромбоцитов зачастую не проводится, так как оптическая агрегометрия требует больших время затрат и при этом может не дать однозначного ответа [2]. Для выявления болезни Виллебранда ристоцитин-агрегация на основе цельной крови импедансным методом намного более надежна, чем длительный процесс измерения кофакторной активности фактора Виллебранда на фиксированных тромбоцитах. Высокочувствительный импедансный метод позволяет очень быстро и точно провести скрининг пациентов из этой группы риска. Графики агрегационного ответа на ристомицин представлены на рис.7. Рисунок 7 – Пример динамики агрегационного ответа после индуцирования разными концентрациями ристомицина: 1 – конечная концентрация ристомицина 1мг/мл для диагностики болезни Виллебранда 1 и 3 типов. Наличие агрегации более 5 Ом свидетельствует об отсутствии патологии; 2 – конечная концентрация ристомицина 0,25 мг/мл для диагностики болезни Виллебранда 2B (тромбоцитарного) типа. Отсутствие агрегации свидетельствует об отсутствии патологии. 12 Аномалии секреции могут быть обусловлены либо дефицитом тромбоцитарных гранул, либо дефектом в сигнальной трансдукции событий, регулирующих секрецию и агрегацию тромбоцитов. Дефект плотных гранул можно рассматривать как особую клиническую форму или как часть других наследственных расстройств – синдромы Чедиака-Хигаси, Германского-Пудлака. Агрегационный ответ снижается на АДФ, адреналин и коллаген, в норме агрегация с арахидоновой кислотой и ристомицином [10]. Дефицит α-гранул носит название синдром серых тромбоцитов, при котором α-гранулы отсутствуют или их число снижено, нарушена коллаген-индуцированная агрегация. При дефекте α-гранул при квебекском синдроме нарушен белковый состав этих гранул и снижена адреналин-индуцированная агрегация [5]. В дополнение к аномалиям секреции, дефект тромбоцитов может реализоваться в виде нарушений передачи сигнала. Эти расстройства еще мало изучены, но могут представлять собой значительный процент больных с аномалиями вторичной волны агрегации и снижением секреции гранул. Можно выделить дефекты рецепторов коллагена и адреналина, поскольку они демонстрируют селективный дефект агрегации на один агонист. Другие значительные нарушения функции тромбоцитов при сохранении числа клеток в пределах нормы, как правило, приобретенные и связаны с наличием другого заболевания или лекарственной терапии. Дисфункции тромбоцитов часто наблюдается у больных с хронической почечной недостаточностью или заболеваниями печени, у пациентов, испытывающих различные миелопролиферативные и лимфопролиферативные расстройства (например, полицитемия, миелофиброз, острая миелоидная лейкемия, и волосатоклеточный лейкоз). Дисфункции тромбоцитов также могут быть связаны с различными клиническими материалов. Нарушения сценариями, тромбоцитов в например, этих имплантациями случаях, как протезных правило, трудно охарактеризовать, потому что присутствуют неспецифические дефекты агрегации тромбоцитов [12]. Тромбоцитарные дисфункции с повышенным количеством тромбоцитов Пациенты с увеличенным количеством тромбоцитов могут иметь клинические проявления в виде кровотечений, протекать бессимптомно или же иметь тромбозы. Иногда, несмотря на очень высокие значения тромбоцитоза (1,2 — 1,6 млн клеток на мл) из-за неполноценности кровяных пластинок, напротив, наблюдается склонность к кровоточивости. По этой же причине рекомендуют весьма осторожно подходить к назначению дезагрегантов при высоких значениях тромбоцитоза [11]. 13 Дифференциальный диагноз определяется в первую очередь между реактивным тромбоцитозом и миелопролиферативными заболеваниями. Исследование агрегации полезно при диагностике основных миелопролиферативных расстройств, когда снижена или отсутствует адреналин-индуцированная агрегация. Данное нарушение происходит в связи с дефектом α2-адренорецепторов у таких пациентов. Такая же реакция может наблюдается и у пациентов с редким врожденным дефектом α2-адренорецепторов, но они, как правило, имеют нормальное количество тромбоцитов. Другие варианты дисфункции тромбоцитов у лиц с миелопролиферативными расстройствами включают снижение интенсивности агрегации тромбоцитов при ответе на АДФ или коллаген. Однако некоторые пациенты могут иметь повышенный агрегационный ответ на разные индукторы. В отличие от пациентов с миелопролиферативными заболеваниями, у пациентов с реактивным тромбоцитозом, как правило, функции тромбоцитов остаются в пределах нормы. Реактивный или вторичный тромбоцитоз может обусловливаться недостатком железа, воспалительными и инфекционными заболеваниями, развитием злокачественных опухолей, наблюдаться после спленэктомии, а также быть связан с табакокурением [5]. Поскольку показатели агрегатограммы зависят от числа тромбоцитов, при проведении теста следует учитывать цель обследования. Если такой анализ относится к установлению наличия или отсутствия патологического функционирования тромбоцитарного звена в целом, то методически не имеет смысл дополнительно разбавлять цельную кровь. Но в том случае, если идёт речь об диагностике тромбоцитопатий и нарушений функции кровяных пластинок, то есть основание развести пробу крови до нормального уровня тромбоцитов, что бы корректно сравнивать результаты с нормальной агрегатограммой. Пример агрегатограммы в пробах с исходным тромбоцитозом и разведённой до значений нормального диапазона содержания тромбоцитов представлен на рисунке 8. 14 Рисунок 8 – Агрегационный ответ в случае с неразведённым образцом крови (1) и с разведением в 5 раз (2) у пациента с тромбоцитозом (965х109/л) Тромбоцитарные дисфункции со сниженным количеством тромбоцитов Нарушения, при которых количество тромбоцитов уменьшается, могут быть разделены по размерам тромбоцитов, а также характеру возникновения – приобретенные или наследственные. Тромбоцитопения с небольшими по размеру тромбоцитами наблюдается у больных с синдромом Вискотта-Олдрича. Он характеризуется повторяющимися инфекционными заболеваниями, экземой. Агрегация и секреция снижена на все индукторы. Тромбоцитопении с крупными тромбоцитами являются врождёнными и встречаются редко. При таких состояниях агрегационный ответ в норме со всеми индукторами [9]. Стоит отметить, что оптическая агрегометрия приводит к неправильным результатам для пациентов с синдромом гигантских тромбоцитов, где должна учитываться потеря тромбоцитов при центрифугировании. В этом случае импедансная агрегометрия является наиболее оптимальной. Повышенная функциональная активность тромбоцитов Хотя большинство пациентов с эссенциальной тромбоцитемией и полицитемией имеют гиперагрегацию, некоторые из них не показывают повышенный ответ на индукцию адреналином [13]. Активация тромбоцитов, как известно, возникает у больных с сопутствующими сердечно-сосудистыми заболеваниями, гипертонией и сахарным 15 диабетом, из-за активации тромбоцитов вторичной сосудистой травмой [14]. Кроме того, повышенное неферментативное гликозилирования мембранных белков способствуют нарушению функции тромбоцитов у больных сахарным диабетом. Увеличивается степень агрегации на все используемые индукторы. Тест имеет очень важное значение для выявления пациентов с гиперфункцией тромбоцитов и, как следствие, с наиболее повышенным риском атеротромботических осложнений. Импедансная агрегометрия в цельной крови является наиболее адекватным средством для определения гиперагрегации и рекомендуется для исследования пациентов с риском тромбоэмболических осложнений. Данный метод более чувствителен и адекватен по сравнению с оптической агрегацией, поскольку измерение происходит в присутствии всех элементов цельной крови, включая эритроциты и лейкоциты. Таким образом, для точной диагностики нарушений функциональных состояний тромбоцитов используют различные индукторы агрегации. Полный спектр состояний, выявляемых посредством агрегометрии, представлен в таблице 2 и на рисунке 9 отдельными агрегатограммами функционального ответа. 16 Таблица 2 Характеристика агрегации АДФ Арахидоновая кислота Адреналин Коллаген Ристоцетин Н Н Н ↓**, Н или ↑*** О О О О Н Н Н вариабельно Н ↓ вариабельно Н Н Н Н Н или ↓ Н Н Н или ↓ ↓ ↓, О Н Н Болезни сигнальной трансдукции Н ↓ ↓ ↓ ↓ Н Аспириноподобный синдром или дефект тромбоксансинтазы Н Н или ↓ ↓, О ↓ ↓, О Н Заболевание (фактор) Болезнь Виллебранда первичная волна Н* вторичная волна Н Тромбастения Гланцмана О**** Синдром Бернара-Сулье Дефекты δ-гранул Дефекты α-гранул Н Н Н ↓ ↓или отсутствует задержка лагфазы Н Н или ↓ Н Н или ↓ Н Н Н Н Н Н Миелопролиферативные заболевания Н Н Н Синдром Скотта Уремия Н Н Н ↓ Тиенопиридины (клопидогрел и тиклопидин) ↓ О GP IIb/IIIa антагонисты Примечание: * - в норме ** - снижение *** - увеличение **** - отсутствие ↓, О ↓, О ↓, О 17 ↓, О ↓, О Н 18 Рисунок 9 – Использование агрегатограмм для диагностики тромбоцитарных патологий А – характер агрегатограммы в связи с патологией тромбоцитов; Б – агрегация с коллагеном: 1 – в дозе 2 мг/мл; 2 – в дозе 5 мг/мл. Увеличение амплитуды свидетельствует о наличии аспиринового эффекта. Оценка эффективности терапевтического действия антитромботических препаратов Интенсивно развивающееся направление в анализе индуцированной агрегации тромбоцитов – оценка терапевтической эффективности действия антиагрегантных препаратов. Известны методы оценки агрегационного ответа после приёма пациентом определённой назначенной дозы препарата. Обуславливается такая необходимость наличием случаев нечувствительности или повышенной чувствительности к антитромбоцитарным медикаментозным воздействиям. Однако известные тесты весьма неудобны для пациента, т.к. он вынужден повторно сдавать кровь, также наблюдается некий эмпирический подход к назначению препарата, что совершенно неприемлемо для больных лиц. Поэтому в последние годы предложены методы оценки агрегационного ответа тромбоцитов после 19 инкубации пробы крови с антиагрегантным препаратом, в частности ацетилсалициловой кислотой [15;16], что сокращает количество визитов пациента и делает тест прогностическим. В лаборатории ФГБУ «Гематологический научный центр Минздравсоцразвития» г. Красноярска в настоящее время проводятся исследования по оптимизации метода диагностики чувствительности к ацетилсалициловой кислоте in vitro в образцах цельной крови. На рисунке 10 представлены агрегатограммы, записанные до и после инкубации пробы с ацетилсалициловой кислотой. Комбинация различных индукторов позволяет оценить антиагрегантное действие препарата на различные пути активации тромбоцита и формировать рекомендации для пациента в индивидуальном порядке. Рисунок 10 - Агрегационный ответ до и после инкубации проб с АСК при тестировании импедансным методом, индуктор-АДФ: 1 - кривая агрегации до инкубации пробы с АСК, 2 – кривая агрегации после инкубации пробы с АСК. В ходе вышеупомянутых исследований установлено, что результаты оптического и импедансного методов не коррелируют друг с другом при анализе индивидуальной чувствительности пациентов к ацетилсалициловой кислоте in vitro [17]. Также показаны половые различия в эффекте ацетилсалициловой кислоты при АДФ-индуцированной агрегации [18]. Выявлены различные активационные внутритромбоцитарные пути, соотношение которых in vitro отражается при анализе агрегации с разными индукторами. 20 Поэтому предложено выделять функциональную и истинную аспиринорезистентность [17]. Алгоритмы оценки функционального состояния тромбоцитов. В ряде стран существует нормативная стандартизированная процедура и алгоритм анализа тромбоцитарных дисфункций [6]. Эти алгоритмы используются для точного и своевременного установления диагноза, экономят время и позволяют уже на начальных этапах лабораторного анализа чётко дифференцировать поток образцов, которые нуждаются в той или иной процедуре анализа. Конечно, и здесь существуют некие исключения, возможны и нестандартные ситуации, при которых, как и в любом диагностическом тесте, необходимо опираться на опыт и квалификацию персонала лаборатории. Агрегометрия занимает одно из основных мест в таких схемах (рис. 11). 21 Рисунок 11 – Алгоритм оценки функции тромбоцитов у пациентов А - с нормальным и повышенным числом тромбоцитов; Б - со сниженным числом тромбоцитов Таким образом, изучение тромбоцитов – это классический пример продуктивного сотрудничества врачей-клиницистов фундаментальными биологическими и научных сотрудников, исследованиями. занимающихся Клинические описания геморрагических заболеваний, в том числе редких и уникальных, и последующая расшифровка их патогенеза, во многих случаях послужили основой для понимания молекулярных механизмов функционирования тромбоцитов. В то же время, именно фундаментальные работы по биохимии и физиологии тромбоцитов позволили создать специальные лабораторные тесты диагностики нарушений тромбоцитарного гемостаза и разработать эффективные методы лечения тромботических патологий. Список литературы 1. Martin J. F. A role for changes in platelet production in the cause of acute coronary syndromes // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1999. Vol. 19. P. 672-679. 2. Бышевский А.Ш., Галян С.Л., Дементьева И.А. Тромбоциты (состав, функции биомедицинское значение): Тюмень. 1996. 144 с. 3. Мазуров А.В. Физиология и патология тромбоцитов: М.: Литерра, 2011. 480 с. 22 4. Сисла Б. Руководство по лабораторной гематологии: М., 2011. 352 с. 5. Савченко А.П. Механизмы функционирования тромбоцитарного гемостаза // Фундаментальные исследования. 2009. №10. 6. Воробьёв А.И. Руководство по гематологии: М.: Медицина. 1985. 7. Шахматова О.О., Комаров А.Л. Ацетилсалициловая кислота. Последние новости о дозах, эффективности и безопасности длительного лечения. // Новости кардиологии. 2011. №3. 8. Harrison P. Platelet function analysis // Blood Reviews, 2005. Vol. 19. P. 111-123. 9. Moffat K.A., Hayward C.P., Raby A. Platelet Function Testing Performed by Light Transmittance Aggregometry // Hematology—coagulation. 2009. С. 1-8. 10. Gavin E. J. Platelet Aggregation in Whole Blood // Methods in Molecular Biology. 2004. Vol. 272. I. P. 77-87. 11. Kandice K., George C. The Laboratory Diagnosis of Platelet Disorders // Arch. Pathol. Lab. Med. 2002. Vol. 126. 12. Mackie I., Jones R., Machin S. Platelet impedance aggregation in whole blood and its inhibition by antiplatelet drugs // J. Clin. Pathol. 1984. Vol. 37. 13. Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза // М.Тверь, 2005. 227 с. 14. Harrison P., Mackie I., Mumford A. Guidelines for the Laboratory Investigation of Heritable Disorders of Platelet Function // British Committee for Standards in Haematology. 2011. 15. Гринштейн Ю. И., Филоненко И.В., Савченко А.А., Савченко Е.А., Гринштейн И. Ю. Способ диагностики резистентности к ацетилсалициловой кислоте // Патент России 2413953 2011. Опубл. 10.03.2011. 16. Иванов В.И., Дорофейков В.В., Вавилова А.В. Способ определения антитромботического эффекта ацетилсалициловой кислоты // Патент России 2379684. 2010. Опубл. 20.01.2010. 17. Столяр М.А., Ольховский И.А. Определение аспиринорезистентности тромбоцитов in vitro, по данным оптического и импедансометрического методов // Вестник НГУ, серия биология и клиническая медицина. 2012. №5 – принято в печать 18. Ольховский И.А., Столяр М.А. О критериях аспиринорезистентности в импедансном тесте агрегации тромбоцитов // Кардиоангиология и ревматология. 2012 – принято в печать 23
