Пирог, Т.П. Регуляция метаболизма ацетата у штамма

Пирог, Т.П. Регуляция метаболизма ацетата у штамма Acinetobacter sp.,
растущего на этаноле / Т. П. Пирог, Ю. В. Кузьминская // Прикладная
биохимия и микробиология. – 2003. – 39, № 2. – С. 180-188.
УДК 579.841: 577.15
РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА АЦЕТАТА У ШТАММА Acinetobacter sp.,
РАСТУЩЕГО НА ЭТАНОЛЕ
Пирог Т.П., Кузьминская Ю.В.
Институт микробиологии и вирусологии Национальной академии наук
Украины, 03143, Киев, e-mail tapirog@usuft.kiev.ua
Показано, что «узким» местом метаболизма этанола у Acinetobacter sp. является
ассимиляция ацетата: реакция, катализируемая ацетил-КоА-синтетазой (КФ 6.2.1.1),
является скорость-лимитирующей. Ингибиторами ацетил-КоА-синтетазы являются
ионы натрия, а также продукты окисления этанола и ацетальдегида - НАДН и НАДФН.
Активаторами фермента являются пантотеновая кислота, катионы калия и магния.
Подобраны условия культивирования Acinetobacter sp., позволяющие обеспечить
одинаковую скорость окисления этанола, ацетальдегида и ацетата в интактных клетках
бактерий и в три раза повысить активность ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном
экстракте.
Исследования по регуляции
активности ацетил-КоА-синтетазы у мутантного
штамма Acinetobacter sp., не образующего экзополисахариды, будут являться основой
для усовершенствования технологии получения полисахарида этаполана на С2субстратах.
Штамм Acinetobacter sp.12S - продуцент
высоковязкого комплексного
экзополисахарида (ЭПС) этаполана, получаемого на среде с этанолом [1]. Ранее
нами
были начаты исследования метаболизма этанола у мутантного штамма Acinetobacter sp.
1НГ, не образующего экзополисахариды [2], так как клетки исходного штамма не
отделялись от ЭПС и не могли быть использованы для проведения энзимологических
исследований.
Было показано [2], что окисление этанола до ацетальдегида у Acinetobacter sp.
катализируется НАД+-зависимой алкогольдегидрогеназой (КФ 1.1.1.1.). Акцепторами
электронов в ацетальдегиддегидрогеназной реакции являются НАД+ и НАДФ+. Ацетат
2
вовлекается в метаболизм Acinetobacter sp. при участии ацетил-КоА-синтетазы (КФ
6.2.1.1.). Наличие
изоцитратлиазы (КФ 4.1.3.1.) свидетельствует о том, что
анаплеротической последовательностью реакций, восполняющих пул С4-дикарбоновых
кислот в клетках Acinetobacter sp., является глиоксилатный цикл.
При изучении особенностей С2-метаболизма у
Acinetobacter sp. основное
внимание уделяли метаболизму ацетата в клетках, растущих на этаноле. При
выращивании на этаноле как исходного ЭПС-образующего, так и ЭПС---штамма в среде
необходимо наличие достаточно емкого фосфатного буфера с нейтральным значением
рН. При культивировании Acinetobacter sp. в незабуференной среде наблюдалось
снижение рН культуральной жидкости до 4,5 из-за накопления ацетата (50-65 мМ) [2]. В
таких условиях прекращался рост бактерий и синтез
ЭПС. Накопление ацетата
происходило также при выращивании Acinetobacter sp.
на забуференной Na+-
содержащей среде при отсутствии или недостаточной концентрации пантотеновой
кислоты - предшественника коэнзима А, посредством которого ацетат включается в
метаболизм [2]. Следует отметить, что
Acinetobacter sp. является ауксотрофом по
пантотеновой кислоте [1]. Ранее было установлено ингибирование окисления ацетата в
интактных клетках и активности ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном экстракте
ионами натрия, а также лимитирование С2-метаболизма коэнзимом А [2]. Показано, что
при культивировании бактерий на среде, не содержащей соединений натрия с
повышенной концентрацией пантотеновой кислоты (0,0009%) не наблюдалось снижения
рН и накопления ацетата в культуральной жидкости [2].
В связи с этим предположили, что в таких условиях возможно выращивание
Acinetobacter sp. на незабуференной среде, что
позволило уменьшить
фосфорных солей на ее приготовление и, следовательно,
расход
снизить затраты на
культивирование бактерий. Проверка этого предположения являлась одной из задач
настоящего исследования.
Цель работы - изучение регуляции метаболизма ацетата у Acinetobacter sp. при
выращивании
на этаноле и подборе условий культивирования, позволяющих
предотвратить накопление ацетата в культуральной жидкости при выращивании
бактерий на незабуференной среде.
3
МЕТОДИКА
Объекты исследований. В работе использовали мутантный штамм бактерий
Acinetobacter sp. 1НГ, не образующий ЭПС [3], а также исходный ЭПС-синтезирующий
штамм Acinetobacter sp. 12S, описанный нами ранее [1].
Культивирование
Acinetobacter
sp.
Бактерии
выращивали
на
жидкой
минеральной среде следующего состава (г/л): KH2PO4 – 6,8; КOH – 1,8; КCl – 1,4;
NH4NO3 – 0,6; MgSO4x7H2O – 0,4; CaCl2x2H2O – 0,1; FeSO4x7H2O – 0,001 (стандартная
среда А, емкость буфера 0,05 М). Культивирование проводили также на средах Б и В,
емкость буфера в которых была снижена в 2 и 3,4 раза. Среда Б (г/л): KH2PO4 - 3,4; КOH
– 0,9; КCl – 4,4; NH4NO3 – 0,6; MgSO4x7H2O – 0,4; CaCl2x2H2O – 0,1; FeSO4x7H2O –
0,001; среда В (г/л): KH2PO4 – 2,0; КOH – 0,55; КCl – 5,6; NH4NO3 – 0,6; MgSO4x7H2O –
0,4; CaCl2x2H2O – 0,1; FeSO4x7H2O – 0,001. В одном из вариантов опыта содержание
MgSO4x7H2O в среде А и Б повышали до 1,2 г/л, концентрация К+ во всех средах - 100
мМ, рН – 6,8-7,0.
Культивирование бактерий проводили также на среде, содержащей соединения
натрия (K+, Na+-среда) [2]. Состав ее аналогичен среде А, за исключением того, что KOH
и KCl заменены на эквимолярные концентрации NaOH и NaCl.
Во все среды дополнительно вносили 0,5% (по объему) дрожжевого автолизата и
пантотенат кальция (0,0006 - 0,0012%). В качестве источника углерода и энергии
использовали этанол в концентрации 0,5 и 1% (по объему), а также ацетат калия в
концентрации 1,6%. Такое содержание ацетата калия
соответствует по углероду
концентрации этанола 1% (по объему). При начальной концентрации этанола в среде
0,5% повторно вносили 0,5% в середине экспоненциальной фазы роста бактерий.
Содержание пантотената кальция в среде 0,0006% при начальной концентрации этанола
0,5% и 0,0009-0,0012% - при концентрации 1,0% или ацетата калия 1,6%. В одном из
вариантов бактерии культивировали до середины экспоненциальной фазы роста (16-18
ч) на среде А, содержащей 1% этанола, после чего в среду вносили ацетат калия (0,050,5%).
Acinetobacter sp.
выращивали в колбах на качалке (220 об/мин) при 30оС в
течение 16 - 96 ч. В качестве посевного материала использовали суточную культуру,
выращенную на смешанной агаризованной среде (мясо-пептонный агар + сусло-агар в
соотношении 1:1).
4
Биомассу определяли по оптической плотности клеточной суспензии
с
последующим пересчетом на сухую массу клеток по калибровочному графику.
Максимальную удельную скорость роста бактерий рассчитывали как описано в работе
[4].
Концентрацию ЭПС определяли весовым методом [1]. Содержание ацетата в
культуральной жидкости определяли с использованием ацетаткиназы [5]. Количество
этанола
в
культуральной
жидкости
определяли
методом
газо-жидкостной
хроматографии на хроматографе «Цвет-4» (Чехия) с пламенно-ионизационным
детектором (колонка 2 м, твердый носитель целит-545, неподвижная жидкая фаза –
полиэтиленгликоль ПЭГ-400 (20%), газ-носитель – гелий, температура 1500С).
Получение бесклеточных экстрактов. После окончания культивирования
клетки Acinetobacter sp. 1НГ отделяли центрифугированием при 4000 g, 15 мин. и 4оС.
Клетки дважды отмывали от остатков среды 0,05 М трис-HCl буфером (рН 7,0) или 0,05
М К+-фосфатным
буфером (рН 7,4) при 4000 g, 15 мин. и 4оС. Отмытые клетки
ресуспендировали в 0,05 М трис-HCl буфере (рН 7,0) или 0,05 М фосфатном буфере (рН
7,4) и разрушали ультразвуком (22 кГц) 3 раза по 30 с при 4оС на УЗДН-1 (Россия).
Полученный гомогенат центрифугировали (12000 g, 30 мин., 4оС), осадок отбрасывали,
надосадочную жидкость использовали в качестве бесклеточного экстракта. Для
получения бесклеточных экстрактов использовали клетки Acinetobacter sp. 1НГ в
экспоненциальной фазе роста на 16-20 ч культивирования.
Энзиматическте анализы. Активность алкогольдегидрогеназы (КФ 1.1.1.1.) и
альдегиддегидрогеназы (КФ 1.2.1.3 и КФ 1.2.1.4) определяли по восстановлению НАД+
или НАДФ+ при 340 нм [6, 7].
Активность ацетил-КоА-синтетазы (КФ 6.2.1.1) анализировали по образованию
ацетил-КоА,
используя
его
реакцию
с
гидроксиламином
с
образованием
ацетилгидроксамата [8]. Продукт реакции ацетилгидроксамата с хлорным железом
определяли спектрофотометрически при 540 нм. Активность изоцитратлиазы (КФ
4.1.3.1) определяли по скорости образования фенилгидразона глиоксилата при 324 нм
[9].
При изучении влияния катионов на активность ацетил-КоА-синтетазы в
бесклеточном экстракте Acinetobacter sp. 1НГ клетки бактерий отмывали и разрушали
ультразвуком в 0,05 М трис-НСl буфере (рН 7,0). Катионы (K+ и Mg2+) вносили в
5
реакционную смесь в виде 25%-ного раствора KCl и 10%-ного раствора MgCl2x6H2O.
Концентрация K+ составляла 10-100 мМ, Mg2+ - 2-10 мМ. При исследовании влияния
структурных аналогов ацетиладенилата (НАДН, НАДФН, АМФ, аденин, аденозин) на
активность ацетил-КоА-синтетазы эти соединения вносили в реакционную смесь в
концентрации 10 мМ.
Активность ферментов определяли при температуре 28-30оС, оптимальной для
роста Acinetobacter sp., и выражали в нмоль/мин мг белка. Содержание белка в
бесклеточных экстрактах определяли по Бредфорду.
Определение скорости окисления
субстратов интактными клетками
Acinetobacter sp. 1 НГ. Скорость окисления этанола, ацетальдегида, ацетата калия и
сукцината калия (скорость дыхания интактных клеток в присутствии субстратов)
определяли
по
скорости
потребления
кислорода
в
реакционной
полярографически при помощи электрода закрытого типа на полярографе
смеси
ППТ-1
(Россия) при температуре 28-300С. Удельную скорость потребления кислорода
выражали в нмоль О2/ мин мг клеток. Концентрация субстратов составляла 10 мМ.
С целью снижения уровня
эндогенного дыхания получали голодные клетки
Acinetobacter sp. 1НГ в 0,05 М К+-фосфатном буфере (рН 7,0). Определение скорости
дыхания клеток в присутствии субстратов проводили в 0,05 М К+-фосфатном буфере
(рН 5,5 и 7,0).
При исследовании
влияния катионов на скорость дыхания интактных клеток
Acinetobacter sp. 1НГ для их отмывания, голодания и
скорости окисления субстратов использовали
инкубации при определении
трис-НСl
буфер (0,05 M, pH 7,0).
Катионы (K+ и Mg2+) вносили в инкубационную смесь в виде 25%-ного раствора KCl и
10%-ного раствора MgCl2x6H2O. Концентрация K+ составляла 10-100 мМ, Mg2+ - 2-10
мМ.
Р Е З УЛ Ь Т А Т Ы И О Б С УЖ Д Е Н И Е
При культивировании штамма Acinetobacter sp. 1НГ на средах Б и В с
молярностью К+-фосфатного буфера 0,025 и 0,015 М, наблюдалось снижение рН до 5,95,5, обусловленное накоплением ацетата (табл. 1). В таких условиях отмечали снижение
уровня биомассы. Аналогичные результаты были получены и при выращивании на
средах Б и В ЭПС-образующего штамма бактерий. В этом случае наблюдали также
снижение количества синтезированных ЭПС. Таким образом, несмотря на отсутствие в
6
среде соединений натрия и повышенную концентрацию пантотеновой кислоты,
снижение емкости буфера сопровождалось накоплением ацетата. Следовательно,
существуют иные, не установленные нами ранее, причины лимитирования метаболизма
ацетата в клетках Acinetobacter sp., растущих на этаноле.
Исследование
скорости
окисления
С2-субстратов
интактными
клетками
Acinetobacter sp. 1НГ, выращенными на K+, Na+-среде и среде А (К+-среда) показало, что
после голодания клеток в течение 20 ч скорость дыхания в присутствии этанола и
ацетальдегида не изменялась, а в присутствии ацетата снижалась в 2 раза (на среде А) и
в 4 раза (для клеток с K+, Na+-среды) (табл. 2). При этом скорость окисления этанола и
ацетальдегида клетками, выращенными на обоих средах, практически не отличалась, а
скорость окисления ацетата была выше у клеток, культивируемых на К+-среде (причем
разница в скорости дыхания увеличивалась в процессе голодания клеток). Обращает на
себя внимание и тот факт, что скорость дыхания интактных клеток в присутствии
ацетата после их длительного голодания была в 2,5-6 раз ниже, чем скорость дыхания в
присутствии этанола и ацетальдегида (табл. 2).
Анализ
активности
ключевых
ферментов
метаболизма
этанола
при
культивировании Acinetobacter sp. 1НГ на средах, содержащих 1% этанола и 0,0006%
пантотената кальция,
показал, что активность ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном
экстракте бактерий в 3,5 - 5 раз ниже, чем активность алкоголь- и альдегиддегидрогеназ
(табл. 3).
Данные табл. 1-3 позволили сделать вывод о том, что реакция, катализируемая
ацетил-КоА-синтетазой, является скорость-лимитирующей. Вполне вероятно, что
в
клетках Acinetobacter sp., растущих на этаноле, ацетат образуется с более высокой
скоростью, чем вовлекается в дальнейший метаболизм. Избыток ацетата выделяется
клетками в культуральную жидкость, обуславливая снижение рН. Наличие буфера в
среде «гасит» колебания рН, вызванные накоплением ацетата. Можно предположить,
что в таких условиях (при значениях рН, близких к нейтральному) ацетат вновь
транспортируется в клетки бактерий и вовлекается в метаболизм. При отсутствии
буфера поступление ацетата в культуральную жидкость вызывает более заметные
изменения рН. При этом происходит постепенное снижение рН до значения, при
котором транспорт ацетата в клетки замедляется или становится невозможным. В этом
случае постепенное накопление ацетата приводит либо к дальнейшему снижению рН до
7
уровня, при котором культура не может расти, либо к ингибированию роста бактерий
высокими концентрациями ацетата. Так, в работах [10, 11] отмечается, что ацетат в
высоких концентрациях может ингибировать рост бактерий посредством различных
механизмов: неспецифического торможения ферментативных реакций вследствие
подкисления цитоплазмы, влияния на энергетику бактериальной клетки и прежде всего
на такой важный ее компонент, как электрохимический градиент протонов   Н+. Этот
эффект связан со свойствами ацетата как проникающей слабой кислоты. Соединения
такого класса (бензоат, салицилат и др.) обладают способностью при прохождении
через бактериальную мембрану в протонированной форме снимать  рН.
Установлено, что экзогенный ацетат калия, внесенный в этанолсодержащую
среду в экспоненциальной фазе роста Acinetobacter sp. 1НГ, вовлекался в метаболизм
бактерий при рН 6,7-6,8, о чем свидетельствовало повышение рН и отсутствие ацетата в
культуральной жидкости через 24 ч после его внесения и не ассимилировался при рН 5,5
(табл. 4).
Исследование скорости дыхания интактных клеток в присутствии С2-
субстратов при различных значениях рН показало, что ацетат, в отличие от этанола и
ацетальдегида, практически не окислялся клетками при рН 5,5.
Дальнейшие исследования были направлены на поиск факторов, позволяющих
обеспечить одинаковую скорость образования и дальнейшего метаболизма ацетата в
клетках Acinetobacter sp., растущих на этаноле. В качестве основных критериев оценки
состояния метаболизма ацетата у бактерий, выращиваемых на этаноле, мы использовали
величину скорости дыхания целых клеток в присутствии С2-субстратов (в частности,
скорость окисления ацетата длительно голодавшими клетками), а также уровень
активности алкоголь- и
ацетальдегиддегидрогеназ и ацетил-КоА-синтетазы в
бесклеточном экстракте. При этом каждый из двух названных критериев имел свои
недостатки. Так, скорость дыхания интактных клеток в присутствии различных
субстратов не всегда отражает реальный процесс, происходящий в клетках при
культивировании бактерий, из-за возможного влияния на него такого важного фактора,
как транспорт субстрата (особенно в случае, если субстрат поступает в клетки путем
+
  Н -зависимого активного транспорта, на который может влиять состав буфера, рН и
т.д.). Величина ферментативной активности в бесклеточном экстракте не всегда
соответствует скорости реального процесса в интактных клетках, которая зависит не
только от содержания фермента, но и от пула субстратов, регуляции фермента и т.д. В
8
работе [12] отмечается, что существуют определенные ограничения и трудности,
которые следует учитывать при работе как с интактными клетками, так и с
бесклеточными экстрактами. Авторы отмечают, что данные экспериментов с целыми
клетками необходимо сопоставлять с результатами, полученными при работе с
бесклеточными экстрактами и выделенными из них ферментами. Мы предполагали, что
одновременное
применение
полярографических
и
энзиматических
методов
исследования, а также проверка полученных результатов в ростовых экспериментах
позволит получить близкое к реальному представление о процессах, происходящих в
клетках и разработать подходы к регуляции С2-метаболизма у Acinetobacter sp.
Из литературы известно, что ацетил-КоА-синтетаза является Mg2+-зависимым
ферментом
[13,
14].
Кроме
того,
активаторами
ацетил-КоА-синтетазы,
функционирующей в клетках многих эу- и прокариот являются ионы калия [13-18].
Установлено, что скорость окисления ацетата интактными клетками Acinetobacter sp. 1
НГ, а также активность ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном экстракте повышалась в
присутствии K+ и Mg2+ (табл. 5). В отсутствие катионов магния активность ацетил-КоАсинтетазы снижалась в 2 раза, введение 100 мМ К+ в реакционную смесь, содержащую
10 мМ Mg2+, повышало активность фермента на 30-35%. Активность
ацетил-КоА-
синтетазы, определяемая в К+-фосфатном буфере выше, чем в трис-НСl буфере. Следует
отметить, что К+ практически не влиял на скорость дыхания интактных клеток бактерий
в присутствии этанола и сукцината. При всех исследованных концентрациях Mg2+ не
наблюдали изменения скорости окисления этанола, в то время как скорость дыхания
клеток в присутствии сукцината снижалась при концентрации катионов магния выше 5
мМ (табл. 5).
Ранее [2] нами было показано, что в присутствии 25-100 мМ Na+ активность
ацетил-КоА-синтетазы снижалась в 1,3-2 раза (как и скорость окисления ацетата калия
интактными клетками). Такие же концентрации NH4+ не влияли на скорость дыхания
клеток в присутствии ацетата и активность ацетил-КоА-синтетазы в бесклеточном
экстракте.
Полученные экспериментальные данные (табл. 5) позволили предположить, что
одним из факторов регуляции метаболизма ацетата в клетках Acinetobacter sp. 1НГ,
растущих на этаноле, может быть изменение содержания катионов калия и магния в
среде культивирования. При этом мы принимали во внимание то обстоятельство, что
9
содержание катионов в среде культивирования не обязательно соответствует их
внутриклеточной концентрации. Концентрация катионов калия в среде Acinetobacter
sp.
100 мМ (такая концентрация одновалентных катионов необходима для синтеза
ацилированного полисахарида ЭПС-образующим штаммом [19]), а содержание Mg2+ 1,6 мМ.
Установлено, что скорость дыхания в присутствии ацетата калия интактных
клеток бактерий, выращенных на среде с повышенным содержанием Mg2+, была выше,
чем у клеток со стандартной среды А, не снижаясь после длительного голодания (табл.
6). В аналогичных условиях наблюдали снижение почти в два раза скорости дыхания
клеток, выращенных на среде А без дополнительного внесения Mg2+. Важным является
также то, что увеличение содержания Mg2+ в среде для культивирования бактерий
позволило снизить емкость буфера в 2 раза (табл. 6).
Следует отметить, что ацетат является не только промежуточным продуктом
метаболизма этанола, но и ростовым субстратом для Acinetobacter sp. [1]. Как видно из
представленных в табл. 6 данных, скорость дыхания в присутствии ацетата клеток
Acinetobacter sp. 1 НГ, выращенных на среде
с ацетатом,
не снижалась после
голодания. Таким образом, вполне вероятно, что снижение скорости дыхания клеток,
выращенных на этаноле, в присутствии ацетата обусловлено ингибирующим действием
продуктов окисления этого ростового субстрата
(например, НАДН) на активность
ацетил-КоА-синтетазы.
В настоящее время механизм реакции, катализируемой ацетил-КоА-синтетазой,
исследован недостаточно. Предполагается, что реакция с участием этого фермента
протекает в две стадии, при этом промежуточным соединением является ацетил-АМФ
(аденозин-51-ацетилфосфат или ацетиладенилат) [20]:
1. Ацетат + АТФ
Ацетил-АМФ + ФФ
2. Ацетил-АМФ + КоА
Ацетил-КоА + АМФ
Структурные аналоги ацетиладенилата (АМФ, НАДН, НАДФН и др.) могут
ингибировать активность ацетил-КоА-синтетазы, как это показано в ряде работ [20 - 22].
Наши исследования показали, что в присутствии НАДН и НАДФН (а именно эти
соединения образуются при НАД+- и НАДФ+-зависимом окислении этанола и
ацетальдегида)
активность
ацетил-КоА-синтетазы
в
бесклеточном
экстракте
10
Acinetobacter sp. 1 НГ снижалась почти в два раза (рис. 1). Ингибирующее действие на
активность фермента оказывали также аденин, аденозин и АМФ.
Для устранения ингибирующего действия продуктов окисления этанола и
ацетальдегида на активность ацетил-КоА-синтетазы предложено снижение начальной
концентрации этанола в среде с дальнейшей дробной его подачей в процессе
культивирования бактерий. Установлено, что при уменьшении концентрации этанола в
среде в два раза наблюдалось увеличение скорости дыхания клеток в присутствии
ацетата, причем ее величина практически не отличалась от скорости окисления этанола
и ацетальдегида (табл. 7). Кроме того,
скорость дыхания в присутствии ацетата
существенно не изменялась при длительном голодании клеток. Интересно отметить, что
при концентрации этанола в среде 0,5% содержание пантотената кальция могло быть
снижено с 0,0009 до 0,0006%, при этом не было необходимости в дополнительном
введении Mg2+ в среду. Кроме того, в таких условиях возможна реализация процесса
культивирования бактерий на практически незабуференной среде В (табл. 7).
При
снижении
концентрации
этанола
в
среде
наблюдалась
также
интенсификация роста бактерий, в частности, сокращение длительности лаг-фазы,
увеличение скорости потребления субстрата, повышение максимальной удельной
скорости роста и сокращение времени ее достижения, уменьшение времени
культивирования бактерий, необходимого для синтеза максимальной биомассы (рис. 2,
табл. 7).
В табл. 3 представлены активности ключевых ферментов метаболизма этанола у
бактерий Acinetobacter sp. 1НГ, выращенных в различных условиях культивирования.
При концентрации этанола в среде 1,0% независимо от других изменений в составе
среды, активность алкоголь- и ацетальдегиддегидрогеназ оставалась на уровне 340-370
нмоль/мин мг белка. При этом на среде, не содержащей соединений натрия, активность
ацетил-КоА-синтетазы увеличивалась до 95 нмоль/мин мг белка. Повышение
концентрации пантотената кальция и Mg2+ в среде сопровождалось
увеличением
активности фермента до 130-180 нмоль/мин мг белка. При снижении концентрации
этанола в среде
до 0,5% активность ацетил-КоА-синтетазы достигала
220-230
нмоль/мин мг белка. В последнем случае наблюдалось снижение активности алкоголь- и
ацетальдегиддегидрогеназ до 260-280 нмоль/мин мг белка. В табл. 3 приведены данные,
11
полученные при выращивании Acinetobacter sp. 1 НГ на среде А. Аналогичные
результаты получены при культивировании бактерий на среде В.
Таким образом, установлены условия культивирования Acinetobacter sp. 1 НГ,
позволяющие повысить в 3 раза активность ацетил-КоА-синтетазы и обеспечить
практически одинаковую скорость образования и дальнейшего метаболизма ацетата в
клетках бактерий, растущих на этаноле. Интересно отметить, что в исследуемых
различных условиях культивирования изменения активности изоцитратлиазы были
аналогичны изменениям активности ацетил-КоА-синтетазы. Можно предположить, что
индуктором изоцитратлиазы в клетках бактерий является ацетил-КоА, образующийся из
С2-соединений.
На заключительном этапе исследований закономерности, установленные для
ЭПС---мутанта Acinetobacter sp. 1 НГ, были проверены при культивировании ЭПСобразующего исходного штамма (табл.
8).
Эксперименты показали, что как
для
мутантного, так и для ЭПС-образующего штамма снижение концентрации этанола в
среде в два раза позволило предотвратить снижение рН и накопление ацетата в
культуральной жидкости и дало возможность реализовать процесс культивирования
бактерий на практически незабуференной среде. Кроме того, в этих условиях
увеличивалось количество синтезированных ЭПС (на 20-25%) и их выход по
отношению к биомассе (почти в 1,5 раза), а также сокращалась длительность процесса
культивирования.
Таким образом, в результате проведенной работы установлено, что реакция,
катализируемая ацетил-КоА-синтетазой у Acinetobacter sp. 1НГ, является скоростьлимитирующей; ингибиторами ацетил-КоА-синтетазы являются ионы натрия, а также
продукты окисления этанола и ацетальдегида, в частности, НАДН и НАДФН.
Аналогичным ингибирующим действием обладают аденин, аденозин и АМФ. Можно
предположить, что в клетках Acinetobacter sp. реакция, катализируемая ацетил-КоАсинтетазой, протекает в две стадии с образованием промежуточного продукта аденозин5I-ацетилфосфата (ацетиладенилата); активаторами ацетил-КоА-синтетазы являются
пантотеновая кислота, катионы магния и калия.
Снижение начальной концентрации этанола в среде с 1,0 до 0,5% (с последующим
внесением 0,5% этанола в середине экспоненциальной фазы роста бактерий), отсутствие
соединений натрия в ростовой среде, наличие в среде 100 мМ К+ позволяет обеспечить
12
практически одинаковую скорость окисления этанола, ацетальдегида и ацетата в
интактных клетках бактерий и в три раза повысить активность ацетил-КоА-синтетазы,
определяемую в бесклеточном экстракте. Это дает возможность культивировать
Acinetobacter sp. на среде, буферная емкость которой снижена в 3,4 раза. Получение
аналогичного результата при начальной концентрации этанола 1,0% обеспечивало (на
фоне отсутствия солей натрия и наличия 100 мМ К+) повышение содержания
пантотеновой кислоты в среде до 0,0009-0,0012% и увеличение концентрации Mg2+ до 5
мМ. Исследования по регуляции
активности ацетил-КоА-син тетазы у мутантного
штамма Acinetobacter sp. 1 НГ, не образующего ЭПС, являются основой для
усовершенствования технологии получения этаполана на этаноле.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гринберг Т.А., Пирог Т.П., Малашенко Ю.Р., Пинчук Г.Э. Микробный
синтез экзополисахаридов на С1-С2-соединениях. Киев: Наукова думка, 1992.
212 с.
2. Пирог Т.П, Соколов И.Г., Кузьминская Ю.В., Малашенко Ю.Р. //
Микробиология. 2002. Т. 71. № 2 , С. 222-229.
3. Пирог Т.П., Столяр С.М., Малашенко Ю.Р. // Микробиология. 2000. Т.69. №
5. С. 674-680.
4. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М: Мир,
1978. 331 с.
5. Криштаб Т.П., Соколов И.Г. // Микробиол. журнал (Украина). 1985. Т. 47. N
1. С. 86-88.
6. Beardmore-Gray M., Anthony C. // J. Gen. Microbiol. 1983. V. 129. N 10. P.
2979-2983.
7. Hommel R., Kurth J., Kleber H.P. // J. Basic Microbiol. 1988. V. 28. N 1-2. P. 2533.
8. Beinert H., Green D.E., Hele P., Hift H., Von Korff R.W., Ramakrishnan C.V. // J.
Biol. Chem. 1953. V. 203. N 1. P. 35-45.
9. Dixon G.H., Kornberg H.S. // Biochem. J. 1959. V. 72. N 1. P. 195-196.
10. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. // Микробиология. 1985. Т. 54. N 2. С. 252256.
11. Смирнова Г.В., Октябрьский О.Н. // Микробиология. 1988. Т. 57. N 4. С. 554559.
12. Дэгли С., Никольсон Д. Метаболические пути. М.: Мир, 1973. 310 с.
13. Roughan P.G., Ohlrogge J.B. // Anal. Biochem. 1994. V.216. N 1. P. 77-82.
14. Glasemacher J., Bock A.K., Schmid R., Schonheit P. // Eur. J. Biochem. 1997. V.
224. N 2. P. 561-567.
15. Webster L.T. // J. Biol. Chem. 1966. V. 241. N 23. P. 5504-5510.
16. O’Sullivan J., Ettlinger L. // Biochim. Biophys. Acta. 1976. V. 450. N 3. P. 410417.
13
17. Preston G.G., Wall J.D., Emerich D.W. // Biochem. J. 1990. V. 267. N 1. P. 179183.
18. Suelter C.H. // Science. 1970. V.168. N 3931. P. 789-795.
19. Пирог Т.П.. // Микробиология. 1996. Т. 65. N 5. С.639-643.
20. Гуляев Н.Н., Шаркова Е.В., Дедюкина М.М., Хомутов Р.М. // Биохимия.
1971. Т. 36. № 6. С. 1267-1273.
21. Grayson N.A., Westkaemper R.B. // Life Sci. 1988. V. 43. N 5. P. 437-444.
22.Coleman J.S., Bhattacharjee J.K. // Can. J. Microbiol. 1976. V. 22. N 5. P. 762-764.