диссертация Никишиной Ю.О. - институт биологии развития
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук На правах рукописи Никишина Юлия Олеговна РОЛЬ ДОФАМИНА МОЗГОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ В ЭНДОКРИННОЙ РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИЙ ГИПОФИЗА В РАЗВИВАЮЩЕМСЯ ОРГАНИЗМЕ 03.03.01 – физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, академик РАН Михаил Вениаминович Угрюмов Москва - 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................. 5 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................................................................... 10 1.1. Дофаминергическая система мозга в онтогенезе ................................................................... 10 1.1.1 Образование дофаминергических нейронов .................................................................... 11 1.1.2 Морфогенез развивающихся дофаминергических нейронов ......................................... 12 1.1.3 Функциональная характеристика дофаминергических нейронов в онтогенезе ........... 14 1.1.2 Нервная и гуморальная регуляция развития дофаминергической системы.................. 23 1.2. Гематоэнцефалический барьер в онтогенезе .......................................................................... 24 1.2.1 Общая структурно-функциональная характеристика гематоэнцефалического барьера ........................................................................................................................................................ 24 1.2.2 Формирование гематоэнцефалического барьера для катехоламинов ............................ 27 1.3. Периферическая дофамин-продуцирующая система в онтогенезе ...................................... 28 1.3.1 Периферические органы, синтезирующие дофамин ....................................................... 28 1.3.2 Синтез дофамина в периферических органах .................................................................. 29 1.3.3 Запасание и выделение дофамина ..................................................................................... 30 1.3.4 Захват дофамина .................................................................................................................. 31 1.3.5 Деградация дофамина ......................................................................................................... 32 1.3.6 Рецепторы к дофамину ....................................................................................................... 34 1.3.7 Паракринная и аутокринная роль дофамина в регуляции функционирования периферических органов-мишеней ............................................................................................ 35 1.3.8 Роль дофамина в развитии периферических органов-мишеней ..................................... 36 1.4. Эндокринная регуляция дофамином секреции пролактина гипофиза ................................. 37 1.4.1 Гипоталамо-гипофизарная дофаминергическая система ................................................ 38 1.4.2. Развитие гипофиза в онтогенезе ....................................................................................... 38 1.4.3 Гипоталамо-гипофизарная система циркуляции в онтогенезе ....................................... 41 1.4.4 Роль дофамина в регуляции секреции пролактина у взрослых животных и в онтогенезе ..................................................................................................................................... 42 3 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................................. 44 2.1 Животные .................................................................................................................................... 44 2.2. Эксперименты............................................................................................................................ 45 2.2.1. Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс ...................................................................................................................... 45 2.3 Взятие и обработка материала .................................................................................................. 48 2.4. Методы ....................................................................................................................................... 50 2.4.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография ........................................................... 50 2.3.2 Иммуногистохимия ............................................................................................................. 50 2.4.3 Иммуноферментный анализ ............................................................................................... 51 2. 3.4 Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени ..................................................... 51 2.4 Статистическая обработка результатов ................................................................................... 53 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ .................................................................................................................... 54 3.1. Определение влияния дофамина на синтез пролактина in vitro ........................................... 54 3.1.1 Концентрация и содержание пролактина в среде и гипофизе в ходе оценки влияния дофамина на синтез пролактина in vitro .................................................................................... 54 3.1.2 Концентрация и содержание пролактина в среде и гипофизе в ходе оценки специфичности влияния дофамина на синтез пролактина in vitro .......................................... 55 3.2. Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге крыс на П2 .... 57 3.2.1 Концентрация ДА и его метаболитов в мозге, плазме крови, двенадцатиперстной кишке, желудке и почках после подкожного введения 6-ГДА................................................ 57 3.2.2 Концентрация дофамина и его метаболитов в мозге, плазме крови, двенадцатиперстной кишке, желудке, почках и надпочечниках после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 ................................................... 61 3.3. Оценка морфофункционального состояния медиобазального гипоталамуса при хроническом выключении синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс ............................... 65 3.3.1 Концентрация ДА в гипоталамусе, стриатуме, среднем мозге, стволе и остальной части мозга после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 ................................................................................................................................ 65 4 3.3.2 Определение активности тирозингидроксилазы после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2...................................................... 66 3.3.3 Определение количества моно- и биферментных нейронов, синтезирующих дофамин в аркуатном ядре после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 ...................................................................................................................... 67 3.4. Изучение влияния дофамина, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, на синтез пролактина in vivo ................................................................................................................ 67 3.4.1 Определение содержания пролактина в гипофизе и плазме крови через 72 после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга ......................................... 67 3.4.2 Определение содержания мРНК пролактина и Д2-рецепторов в гипофизе через 72 после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга. ............................. 68 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ..................................................................................... 69 4.1 Влияние дофамина на синтез пролактина гипофизом неонатальных крыс in vitro............. 70 4.2 Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс.................................................................................................................................................... 72 4.3 Оценка морфофункционального состояния тубероинфундибулярной системы гипоталамуса при моделировании хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс........................................................................................................................... 75 4.4 Определение влияния дофамина, поступающего из мозга в общую систему циркуляции на синтез пролактина in vivo ................................................................................................................ 77 ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................... 79 ВЫВОДЫ .............................................................................................................................................. 80 CПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .................................................................................................................. 81 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................................... 82 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность и современное состояние проблемы Мозг, и особенно гипоталамус, у взрослых животных является центральным звеном системы нейроэндокринной регуляции важнейших функций и поддержания постоянства внутренней среды организма. Особое внимание в литературе уделяется формированию и функционированию нейроэндокринной системы регуляции в онтогенезе, поскольку в процессе развития гипоталамические нейрогормоны и гормоны эндокринных желез контролируют не столько функциональную активность органов-мишеней, сколько их развитие. В последнем случае действие упомянутых сигнальных молекул носит необратимый (импринтинговый, морфогенетический) характер [Gorski, 1988; Lauder, 1993; Ugrumov, 1997]. Согласно сложившейся к концу 80-х годов концепции, мозг до своего полного созревания, т.е. до формирования межнейрональных синаптических связей и гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), не участвует в нейроэндокринной регуляции периферических органов и только после окончательной дифференцировки нейронов и установления синаптической нейротрансмиссии берет под свой контроль гипофиз, а через него опосредованно и все остальные эндокринные железы [Мицкевич, 1978; Dörner, 1981; Fuse, 1996; O'Shaughnessy et al., 1998]. В последние годы представления о роли мозга в нейроэндокринной регуляции в онтогенезе претерпели существенные изменения. Ранее в нашей лаборатории при анализе данных литературы и результатов собственных исследований было замечено, что нейроны начинают синтезировать и выделять сигнальные молекулы задолго до формирования межнейрональных синаптических связей и ГЭБ [Ugrumov et al., 1989a; Borisova et al., 1991; Ugrumov et al., 1994; Ugrumov, 2010]. Это наблюдение послужило триггером для формулирования гипотезы, согласно которой мозг в онтогенезе до формирования ГЭБ функционирует как эндокринный орган, выделяя в общую систему циркуляции физиологически активные вещества и оказывая, таким образом, влияние на развитие и функционирование периферических органов и клеток-мишеней [Угрюмов, 2004, Ugrumov, 2010]. В данной гипотезе можно выделить два основных положения: 1) Мозг является источником сигнальных молекул в общей системе циркуляции с момента образования нейронов и до окончательного формирования синаптических связей и закрытия ГЭБ. 2) Сигнальные молекулы, секретируемые мозгом в общую систему циркуляции в данный период онтогенеза, способны оказывать прямое парааденогипофизарное эндокринное влияние на периферические органы-мишени. 6 Первое положение гипотезы нашло подтверждение в предыдущих исследованиях нашей лаборатории. На модели обратимого специфического ингибирования синтеза катехоламинов в мозге неонатальных животных [Сайфетярова и др., 2011] были получены прямые доказательства того, что мозг в раннем постнатальном периоде развития до формирования ГЭБ, является источником дофамина в общей системе циркуляции. В ходе проверки справедливости второго положения гипотезы в нашей лаборатории в экспериментах in vitro были получены данные, согласно которым дофамин, поступающий из мозга в общую систему циркуляции, оказывает ингибиторное влияние на выделение пролактина лактотрофами гипофиза [Сайфетярова и др. 2012]. В то же время, данные о влиянии сигнальных молекул мозга (в частности, гонадотропин-рилизинг гормон и дофамин), поступающих непосредственно из мозга в общую систему циркуляции до закрытия ГЭБ, на длительно протекающие процессы, опосредованные через геном (такие как синтез), до сих пор не были получены. Однако данный вопрос является очень важным на пути доказательства гипотезы авторов. У взрослых животных нейроэндокринная регуляция осуществляется в основном через гипоталамо-гипофизарную портальную систему циркуляции. В перинатальном периоде развития у крыс в отсутствие ГЭБ теоретически возможна регуляция, как через портальную, так и через общую систему циркуляции. Однако до сих пор не было получено данных о том, каков вклад в нейроэндокринную регуляцию функционирования и развития периферических органов каждого из путей. Ответ на данный вопрос является принципиально важным не только для доказательства эндокринной функции мозга, но и для понимания развития и функционирования системы нейроэндокринной регуляции в онтогенезе вообще. Цель и задачи исследования Целью данной работы является изучение роли дофамина мозгового происхождения в эндокринной регуляции функций гипофиза в развивающемся организме. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: 1) Оценка на модели in vitro (в культуре аденогипофиза) влияния дофамина в концентрации, в которой он содержится в общей системе циркуляции, на синтез пролактина гипофизом у крыс в раннем постнатальном периоде (до формирования ГЭБ). 2) Создание модели хронического специфического выключения синтеза дофамина в мозге у крыс в раннем постнатальном периоде до формирования ГЭБ. 7 3) Оценка на разработанной модели морфофункционального состояния дофаминергических нейронов тубероинфундибулярной системы мозга. 4) Оценка на разработанной модели эндокринного влияния дофамина мозгового происхождения через общую систему циркуляции на синтез и выделение пролактина лактотрофами гипофиза. Научная новизна полученных результатов Впервые на модели in vitro получено прямое доказательство ингибиторного влияния дофамина в той концентрации, в которой он содержится в общей системе циркуляции неонатальных животных, на синтез пролактина у крыс в неонатальном периоде онтогенеза. Впервые при помощи нейротоксина 6-гидроксидофамина была разработана модель хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс. На данной модели впервые удалось ингибировать синтез дофамина во всех основных популяциях дофаминергических нейронов за исключением нейронов медиобазального гипоталамуса. Впервые на разработанной модели получены доказательства того, что в раннем постнатальном периоде дофаминовая регуляция синтеза пролактина осуществляется мозгом через общую систему циркуляции. Научная и практическая значимость работы В данной работе получены доказательства эндокринного влияния мозга на функционирование лактотрофов гипофиза в раннем постнатальном периоде онтогенеза до формирования ГЭБ. Полученные результаты вносят существенный вклад в современные представления о процессе становления нейроэндокринной регуляции функционирования гипофиза гипоталамусом и могут быть использованы в курсах и учебниках по физиологии и фундаментальной медицине для студентов. Кроме того, на основе самой концепции о мозге как эндокринном органе и на полученных в данной работе результатах, в частности, возможен пересмотр сложившихся представлений о патогенезе различных врожденных заболеваний. Изучение механизмов эндокринного влияния мозга на развитие периферических органов-мишеней до формирования ГЭБ в будущем приведет к качественному изменению подхода к диагностике и лечению различных врожденных заболеваний. 8 Основные положения, выносимые на защиту 1. Разработана экспериментальная модель хронического специфического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс. Синтез дофамина на данной модели был выключен во всех основных популяциях дофаминергических нейронов мозга за исключением нейронов медиобазального гипоталамуса. Синтез дофамина в периферических органах также оставался неизменным. 2. На разработанной модели показано, что в раннем постнатальном периоде до формирования ГЭБ регуляция лактотрофов гипофиза дофамином осуществляется через общую систему циркуляции. 3. На моделях in vivo и in vitro получены доказательства эндокринного влияния мозга через общую систему циркуляции до закрытия ГЭБ. Степень достоверности и апробация результатов Основные материалы диссертации были представлены и обсуждены на российских и международных симпозиумах: II Международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций» (г. Бодрум, Турция, 22-29 июня 2012 г.); конференциях молодых ученых ИБР РАН (Москва, 29-30 ноября 2012 г., 89 декабря 2014 г.); III конференции молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология» ФГБУ НИИНФ им. П.К. Анохина РАМН (Москва, 29 ноября 2012 г.); Federation of European Biochemical Societies Congress 2013 ―Mechanism in Biology‖ (СанктПетербург, 6-11 июля 2013 г.); XXII Съезде Физиологического общества им. Н.П. Павлова (Волгоград, 16-20 сентября 2013 г.); XXII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2015» (Москва, 13-17 апреля 2015 г.). Работа была выполнена при поддержке грантов: Российский фонд фундаментальных исследований № 11-04-01840-а (2011-2013гг.); Российский фонд фундаментальных исследований № 14-04-01732-a (2014-2016 гг.); Научные школы НШ-91.2014.4 (2014-2015гг.); Российский научный фонд № 14-15-01122 (2014-2016гг.); Федеральная целевая программа ―Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы‖ (уникальный идентификатор проекта RFMEFI60414X0073). 9 Публикации По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих перечню ВАК – 4, статей в иностранных рецензируемых журналах – 1, тезисов и материалов конференций – 7 Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, описания результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка наиболее часто встречающихся сокращений и литературы. Текст диссертации изложен на 104 страницах, содержит 4 таблицы и иллюстрирован 26 рисунками. Список литературы содержит 286 источников. 10 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Дофаминергическая система мозга в онтогенезе Дофамин (ДА) является одним из основных катехоламинергических медиаторов центральной нервной системы у позвоночных. Тела ДА-ергических нейронов образуют следующие группы, перечисленные в каудо-ростральном направлении: ДА-ергические нейроны среднего мозга расположены в двух ядрах – компактной части черной субстанции и венрально-тегментальной области, а так же в ретрорумбальной области. Исторически сложилось так, что группы этих нейронов были обозначены А8, А9 и А10 [Dahlström, Fuxe, 1964; Prakash, Wurst, 2006; Björklund, Dunnett, 2007]. Другое скопление ДА-ергических нейронов находится в промежуточном мозге и включает в себя группы А11-А15. Крупнейшими группами являются ДА-ергические нейроны заднего гипоталамуса (А11) и зоны инсерта, расположенной в вентральном таламусе (А13). Кроме того, ДА-ергические нейроны гипоталамуса расположены в аркуатном (А12), паравентрикулярном и перивентрикулярном (А14) ядрах [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001; Prakash, Wurst, 2005]. Некоторые авторы считают, что нейроны группы А15 являются частью ДАергической системы переднего мозга [Vitalis et al., 2000; Marín et al., 2005]. И наконец, небольшая популяция ДА-ергических нейронов находится в переднем мозге и включает в себя нейроны группы А16, расположенные в обонятельных луковицах, и нейроны группы А17, расположенные в сетчатке [Prakash, Wurst, 2005]. Описанные выше группы клеток ДА-ергических нейронов имеют соответствующие проекции. Так, нейроны группы А9 иннервируют дорзальный стриатум и формируют так называемый нигростриатный тракт. Нейроны групп А8 и А10 иннервируют вентральный стриатум, поясную извилину, гипокамп и т.д., формируя мезолимбическую систему. Кроме того, нейроны этих групп иннервируют префронтальную кору, формируя мезокортикальную ДА-ергическую систему [Dahlström, Fuxe, 1964; Björklund, Lindvall, 1984; Björklund, Dunnett, 2007]. Тела нейронов заднего гипоталамуса группы А11 имеют нисходящие проекции на нижние отделы ствола головного мозга и спинной мозг, формируя диэнцефалоспинальный тракт. Нейроны группы А13 имеют диффузные проекции в дорсальный и передний отделы медиального таламуса, а так же в перивентрикулярной области, формируя инсертогипоталамическую ДА-ергическую систему [Prakash, Wurst, 2005; Björklund, Dunnett, 2007]. 11 Нейроны групп А12 и А14 иннервируют срединное возвышение в рамках тубероинфундибулярной ДА-ергической системы [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001; Prakash, Wurst, 2005]. Проекции нейронов группы А15 (боковой и вентральный гипоталамус) пока не установлены [Prakash, Wurst, 2005]. ДА-ергические нейроны конечного мозга, относящиеся к группам А16 и А17, в отличие от выше перечисленных, имеют локальные проекции в той же области и являются достаточно автономными (Рисунок 1б) [Prakash, Wurst, 2005; Björklund, Dunnett, 2007]. Каждая ДА-ергическая система участвует в модуляции конкретных функций мозга. Так, нигростриатная системы мозга контролирует движения и положение тела в пространстве. Мезолимбическая и мезокортикальные системы участвуют в регуляции когнитивных функций и эмоционального поведения. Тубероинфундибулярная и инсерогипоталамическая системы осуществляют нейроэндокринный контроль, например секреции гонадотропин рилизинг гормона и пролактина (ПРЛ) [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001; Smidt, Burbach, 2007]. 1.1.1 Образование дофаминергических нейронов Средний мозг Время образования первых постмитотических нейронов среднего мозга до сих пор является предметом дискуссий. Так, Di Porzio с соавторами, используя специальный метод фиксации, показал, что первые ДА-ергические нейроны образуются в вентральной части среднего мозга на 9-9,5 день эмбрионального развития (Э) у мышей [Di Porzio et al., 1990]. Однако в основном считается, что первые ДА-ергические нейроны среднего мозга появляются на Э10,5 у мышей и Э12,5 у крыс [Voorn et al., 1988]. Тирозингидроксилаза (ТГ) – первый скорость лимитирующий фермент синтеза ДА начинает экспрессироваться в данных клетках на день позже [Prakash, Wurst, 2005]. В среднем мозге образование ДА-ергических нейронов происходит не одновременно. Так, нейроны черной субстанции и ретрорумбольной области образуются с Э12 по Э15, а нейроны вентротегментальной области на день позже [Bayer et al., 1995]. Кроме того, на основании окончательного расположения ДА-ергических нейронов в этих областях можно сделать вывод о рострокаудальном градиенте нейрогенеза. Миграция ДА-ергических нейронов в их окончательное положение в вентральной части среднего мозга, и иннервация областеймишеней мозга происходит в последующие дни эмбрионального развития и в первые недели 12 постнатального периода развития. Так, у крыс ДА-ергическая система среднего мозга достигает уровня развития взрослых животных к концу третьей недели постнатального развития. Промежуточный мозг Нейроны, экспрессирующие ТГ, образуются в гипоталамусе в начале второй половины внутриутробного развития с Э12 по Э16. Нейроны зоны инсерта образуются раньше других популяций и в течение наиболее короткого периода времени – у самцов на Э12-13. Половые особенности динамики образования нейронов проявляются в том, что у самок пик увеличения числа нейронов наблюдается позже, чем у самцов, а период нейрогенеза у них более растянут во времени. ДА-ергические нейроны перивентрикулярного ядра образуются позже. Максимум их образования приходится на Э12-13. В дальнейшем ежедневное прирост числа нейронов замедляется до Э16 , причем у самцов быстрее, чем у самок. ТГ-иммунореактивные нейроны аркуатного ядра представляют собой наиболее позднюю популяцию. Пик образования нейронов у самок приходится на Э14, а у самцов на Э15 [Borisova et al., 1993; Balan et al., 1996]. Таким образом, образование нейронов, экспрессирующих ТГ, происходит в соответствии с дорсовентральным градиентом, и существует половой диморфизм в динамике образования этих нейронов. Рисунок 1 - Распределение групп дофаминергических нейронов в развивающемся и взрослом мозге грызунов [Björklund, Dunnett, 2007]. 1.1.2 Морфогенез развивающихся дофаминергических нейронов Промежуточный мозг Вновь образованные нейроны представляют собой мелкие овальные клетки с одним или двумя неразветвленными отростками, заканчивающимися колбами роста. В перинатальном 13 периоде у незрелорождающихся животных можно выделить три типа нейронов: а) мелкие уни и биполярные нейроны с короткими узкими неразветвленными отростками, сосредоточенные в основном в вентральном гипоталамусе – супрахиазматическом и аркуатном ядрах; б) крупные мультиполярные нейроны с длинными разветвленными отростками, локализующиеся в зоне инсерта, дорсомедиальном и паравентрикулярном ядрах; в) довольно крупные биполярные нейроны, сосредоточенные в перивентрикулярном ядре [Piotte et al., 1988; Ugrumov et al., 1989b]. Эфферентные и афферентные проекции Первые катехоламинергические волокна прорастают в гипоталамус из ствола и среднего мозга в составе медиального пучка переднего мозга начиная с Э13 [Jaeger, 1986; Ugrumov et. al., 1989a; Borisova et. al., 1991]. Чуть позднее они прорастают в медиальную ретрохиазматическую область, диагональный пучок, септум, переднюю камиссуру, оптическую хиазму, срединное возвышение, зону инсерта, паравентрикулярное и дорсомедиальное ядра [Foster et. al., 1985; Jaeger, 1986, Ugrumov et. al., 1989a]. С Э16-18 наряду с волокнами, берущими начало в стволе и среднем мозге, в иннервации гипоталамуса принимают участие аксоны дифференцирующихся ДА-ергических нейронов самого гипоталамуса. Средний мозг Первые ДА-ергические нейроны среднего мозга представляют собой округлые клетки с одним, максимум двумя отростками [Olson, Seiger, 1972; Lauder, Bloom, 1974; Voorn et. al., 1988]. Предшественники ДА-ергических нейронов среднего мозга локализуются в вентральной зоне покрышки. После образования молодые нейроны начинают мигрировать. Существует две основные модели миграции ДА-ергических нейронов среднего мозга. Согласно первой из них существует только радиальная миграция перпендикулярно желудочковой зоне [Kawano, Ohyama, 1995], согласно же второй наряду с радиальной миграцией идет также тангенсальная [Hanaway, McConnell, 1971]. При изучении развития мозга крысы было показано, что ДАергические нейроны среднего мозга взаимодействуют с радиальной глией для миграции в места их окончательной локализации между Э12 и Э20 [Shults et al., 1990]. К П14 структуры вентрального мезенцефалона формируются окончательно. Афферентные проекции Первые ТГ-иммунопозитивные волокна появляются в стриатуме на Э13,5 [Specht et al. 1981], ДА-иммунопозитивные на Э14 [Voorn et al., 1988]. Они образуют массивный пучек, идущий вдоль будущего нигростиатного тракта и оканчивающийся в ганглионарном возвышении. Часть волокон простирается в направлении коры. На Э17 ДА-ергические волокна в стриатуме образуют огромные пучки, которые тесно связаны с пучками внутренней капсулы. 14 Рострально ДА-ергическая иннервация стриатума имеет четкий вентролатеральный и дорсомедиальный градиент, в то время как более каудально ДА-ергические волокна иннервируют стриатум в вентромедиальном положении. Первые варикозы в стриатуме появляются только после рождения. В дальнейшем их число быстро увеличивается и достигает уровня взрослых животных к П20 [Voorn et al., 1988]. Формирование синаптических контактов в стриатуме начинается в постнатальном периоде развития. Пик синаптогенеза приходится на П13-П17 [Hattori, McGeer, 1973]. Первые ДА-ергические волокна достигают зачатков латерального неокортекса к Э15. Однако фактически ДА-ергическая иннервация коры начинается лишь после рождения [Verney et al., 1982; Kalsbeek et al., 1988]. Таким образом, морфологическое развитие ДА-ергичекой системы мозга занимает довольно длительный период и заканчивается примерно к П30. 1.1.3 Функциональная характеристика дофаминергических нейронов в онтогенезе 1.1.3.1 Синтез дофамина ДА синтезируется из общего клеточного метаболита тирозина в серии реакций, состоящей из двух шагов: тирозин превращается в L-дигидроксифенилаланин (L-ДОФА) ферментом ТГ, из L-ДОФА образуется ДА под действием фермента декарбоксилазы ароматических L-аминокислот (ДАА) (рисунок 2). Оба этапа синтеза происходят в цитоплазме [Iversen, 1967; Nagatsu, Sjarne, 1998]. ТГ относится к классу оксигеназ и катализирует присоединение гидроксильной группы к L-тирозину в мета-положении с образованием L-ДОФА. В качестве субстрата ТГ использует молекулярный кислород и тирозин. ТГ так же может осуществлять гидроксилирование фенилаланина до тирозина с последующим образование L-ДОФА [Fitzpatrick, 2000]. Константа Михаэлиса для тирозина лежит в микромолярных концентрациях, в связи с чем в тканях поддерживается его высокая концентрация. Кроме того, субстратом для ТГ могут так же являться аминокислотные аналоги тирозина, например, α-метил-п-тирозин. Кофактором в данной реакции является тетрагидробиоптерин, выступающий в качестве донора водорода. В связи с тем, что тетрагидробиоптерин является кофактором в ряде других биохимических реакций (например, гидроксилирование триптофана в процессе метаболизма серотонина), его доступность является ограничивающим фактором в регуляции активности ТГ, что делает данный этап синтеза ДА скорость-лимитирующим [Nagatsu, Ichinose, 1999]. Активность ТГ регулируется по принципу отрицательной обратной связи продуктами синтеза – L-ДОФА, ДА и 15 норадреналином. Еще одним путем регуляции активности ТГ является ее обратимое взаимодействие с полианионами (например, сульфат гепарина) или фосфолипидами (например, фосфатидилсерин), которое способствует снижению константы Михаэлиса для тетрагидробиоптерина. Кроме того, для регуляции ТГ осуществляется ее посттрансляционное фосфорилирование киназами, которые активируются входящими в клетку ионами кальция [Kumer, Vrana, 1996; Tank et al., 1998]. Уровень активности ТГ в различных областях мозга коррелирует с общим содержанием ДА [Iversen, 1967]. Финальным этапом синтеза ДА является декарбоксилирование L-ДОФА до ДА под действием ДАА. Кофактором в данной реакции является пиридоксаль фосфат (активная форма витамина В6). Константа Михаэлиса данной реакции для L-ДОФА достаточно низкая, а максимальная скорость реакции напротив высокая, что говорит о том, что под действием ДАА L-ДОФА достаточно быстро и продуктивно превращается в ДА. В ряде работ было показано, что активность ДАА во много раз выше активности ТГ [Levitt et al.,1965]. На активность ДАА оказывают влияние различные факторы. Так, ионы Mg2+, Ca2+ и Al3+ увеличивают активность фермента, а ионы Cu2+, Zn2+ и Hg2+ снижают ее [Christenson et al., 1970]. Наряду с L-ДОФА субстратом для ДАА могут также являться другие ароматические Lаминокислоты. Так, ДАА может катализировать превращение 5-гидрокситриптофана в серотонин и триптофана в триптамин [Elsworth, Roth, 1997]. Известно, что помимо истинно ДА-ергических нейронов, экспрессирующих оба фермента синтеза ДА, существуют также нейроны, содержащие по одному из ферментов. Такие моноферментные нейроны впервые были обнаружены в 80-ые годы прошлого века с помощью двойного иммуногистохимического мечения в различных отделах головного мозга [Meister et al., 1988; Okamura et al., 1988; Ugrumov, 2013]. Кроме того, в ряде работ было показано, что данные нейроны способны в кооперации совместно синтезировать ДА [Ugrumov et al., 2004; Ugrumov, 2013]. Онтогенез Экспрессия ТГ в нейронах промежуточного мозга начинается не одновременно во всех популяциях нейронов, а в соответствии с дорсовентральным направлением. Так, например, в зоне инсерта (группа А13) ТГ начинает синтезироваться сразу после образования нейронов, а в аркуатном ядре (группа А12) лишь спустя несколько дней [Ugrumov et al., 1989b; Borisova et al., 1993; Balan et al., 1996]. Уровень синтеза ТГ постепенно увеличивается на протяжении второй недели постнатального развития, а активность продолжает возрастать вплоть до периода полового созревания [Kedzierski, Porter 1990; Arbogast, Voogt, 1991]. 16 Для нейронов вентрального таламуса (А13) было показано, что экспрессия ТГ в данной области контролируется транскрипционными факторами cсемейства Dlx. Он начинает экспрессироваться на самых ранних этапах нейрогенеза (Э9-Э10,5 для мышей). Эндрюс с коллегами показали, что у нокаутных эмбрионов мышей Dlx1/2-/- экспрессия ТГ в нейронах группы А13 полностью отсутствует [Andrews et al., 2003]. Синтез ДА нейронами среднего мозга начинается сразу после их образования (у крыс на Э12,5). В стриатуме ДА начинает детектироваться лишь с Э16 [Fiszman et al., 1991]. Для нейронов среднего мозга было показано, что экспрессия гена ТГ контролируется несколькими транскрипционными факторами. Так, ядерные рецепторы Nurr1 индуцируют экспрессию ТГ в развивающихся ДА-ергических нейронах. Было показано, что у эмбрионов нокаутных мышей Nurr1-/- в нейронах среднего мозга не запускается экспрессия ТГ, в то время как в популяциях нейронов, расположенных в других отделах мозга, ТГ экспрессируется на нормальном уровне [Zetterstrom et al., 1997; Castillo et al., 1998; Saucedo-Cardenas et al., 1998; Smits et al., 2003]. Еще одним транскрипционным фактором, влияющим на экспрессию ТГ в данной области является Ptx3. У мутантных мышей Ptx3-/-, так же как и у мышей Nurr1-/- , в нейронах среднего мозга ТГ не экспрессируется вообще [Smidt et al., 2003]. Как и в случае ТГ, экспрессия ДАА происходит в соответствии с дорсовентральным градиентом [Jaeger, 1986]. Несмотря на то, что отсутствуют специальные исследования последовательности экспрессии ТГ и ДАА в нейронах гипоталамуса, по всей вероятности, в процессе развития реализуются оба варианта – экспрессия ТГ предшествует ДАА и наоборот. Так, существует мнение, что в некоторых случаях ДАА может экспрессироваться еще до момента образования ДА-ергических нейронов, т.е. в нейроэпителиальных клетках- предшественниках, тогда как экспрессия ТГ начинается после выселения нейронов в места их окончательной закладки [Teitelman et al., 1983]. В некоторых отделах гипоталамуса, например в аркуатном ядре, истинные ДАергические нейроны у незрелорождающихся животных появляются только в постнатальном периоде развития. Так, доля нейронов, экспрессирующих одновременно ТГ и ДАА, в аркуатном ядре крысы до П9 не превышает 30%, а в пренатальном периоде составляет всего 1 % (Ershov, 2002). Было показано, что данные моноферментные нейроны осуществляют совместный синтез ДА. В пренатальном и раннем постнатальном периоде развития данный путь синтеза ДА в аркуатном ядре является основным [Ugrumov et al., 2004; Ugrumov, 2013]. 17 Рисунок 2 – Схема синтеза дофамина 1.1.3.2 Запасание и выделение дофамина Как уже было отмечено ранее, превращение тирозина в L-ДОФА, и L-ДОФА в ДА происходит в цитоплазме. Вновь синтезированный ДА запасается в везикулы. Транспорт ДА в везикулы обеспечивается специфическим везикулярным моноаминовым транспортером 2-ого типа (ВМАТ2). Он представляет собой белок с двенадцатью трансмембранными доменами, который может осуществлять транспорт через везикулярную мембрану различных биогенных аминов. Механизм переноса КА через мембрану является АТФ-зависимым процессом, ассоциированным с протонной помпой. Концентрация КА внутри везикул может достигать 0,5 моль/л. Везикулы в ДА-ергическом нейроне выполняют ряд важных функций: 1) предотвращение ферментативной деградации ДА под действием моноаминоксидазы (МАО); 2) предотвращение выделения ДА из клетки при помощи диффузии; 3)упрощение регуляции высвобождения медиатора; 4) быстрое восстановление истощенных запасов нейротрансмиттера [Ben-Jonathan 2001]; 5) существует гипотеза, согласно которой везикулы предохраняют клетку от токсического действия ДА [Lohr et al. 2014]. Существует 2 вида везикул, содержащих ДА: мелкие полупрозрачные пузырьки, которые называются синаптическими везикулами, и большие плотные пузырьки, которые называются секреторными гранулами [Millhorn, Hokfelt, 1988]. Первые формируют так называемый функциональный (легко выделяемый) пул ДА, который расположен в 18 непосредственной близости пресинаптической мембраны. При активации кальциевых каналов везикулы мгновенно сливаются с мембраной, и происходит высвобождение медиатора в синаптическую щель. Секреторные гранулы формируют так называемый резервный пул, он начинает реагировать на потенциал действия только при полном истощении функционального пула. При этом 30% ДА находится в функциональном пуле и 70% в резервном [Iversen, 2010] (рисунок 3). Выделение ДА в синаптическую щель может быть стимулированным и спонтанным. Считается, что спонтанное выделение является Ca2+-независимым процессом, однако, существуют данные, согласно которым кальций может принимать участие в данном процессе. Физиологическая роль спонтанного выделения является недостаточно хорошо изученной. Так, долгое время считалось, что оно приводит лишь к потере незначительного количества медиатора и не играет какой-либо важной роли [Raiteri et al., 1979]. Однако существуют данные, согласно которым данный вид выделения играет важную роль в регуляции синтеза дендритных белков и таким образом влияет на экспрессию рецепторов на постсинаптической мембране [Glitsch, 2008]. Стимулированное выделение является Ca2+-зависимым процессом. С его помощью происходит синаптическая передача сигнала от нейрона к нейрону [Elsworth, Roth, 1997]. В большинстве нейронов медиатор после выделения в синаптическую щель связывается с рецепторами на постсинаптической мембране. Однако нейросекреторные нейроны гипоталамуса не имеют настоящих синаптических контактов. В данном случае ДА диффундирует через периваскулярное пространство и транспортируется по сосудам портальной системы циркуляции к гипофизарным клеткам-мишеням. Скорость высвобождения медиатора из таких нейронов гораздо ниже, чем из классических [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001]. Онтогенез Впервые экспрессию ВМАТ2 выявляют в клетках нейроэпителия на Э12. С Э14 ВМАТ 2 детектируют во всех основных моноаминергических группах клеток [Schütz et al., 1998]. Вопрос об эксперссии изоформы ВМАТ1 в центральной нервной системе (ЦНС) является открытым. Так, Schutz с коллегами показали, что ВМАТ1 не экспрессируется в ЦНС в процессе развития организма. В то же время, Hansson и др. с помощью метода in situ гибридизации показали, что в отдельных областях мозга существует транзиторная экспрессия мРНК ВМАТ1 в пре- и раннем постнатальном периоде развития организма [Hansson et al., 1998a]. Механизм стимулированного выделения ДА в ответ на деполяризацию обнаруживается вскоре после образования нейронов. Для нейронов гипоталамуса было показано, что К +- 19 стимулированное выделение нейротрансмиттера наблюдается с Э16 и возрастает до пубертатного периода [Borisova et al., 1991; Ugrumov et al., 1994]. Рисунок 3 - Схема запасания и стимулированного выделения дофамина 1.1.3.3 Обратный захват Действие ДА заканчивается вследствие захвата пресинаптическими нервными окончаниями при помощи специфического мембранного транспортера ДА (ДАТ). ДАТ относится к семейству Na+/Cl- - зависимых транспортеров, к которому также относятся транспортеры серотонина, норадреналина, ГАМК, глицина, таурина и т.д. [Giros, Caron 1993; Amara, Sonders, 1998; Torres et al., 2003]. ДАТ является молекулой белковой природы, ассоциированной с пресинаптической мембраной, и содержит 12 трансмембранных доменов с локализованными в цитоплазме амино- и карбоксиконцами. Требующиеся для работы транспортера внеклеточные ионы натрия и хлора транспортируются одновременно с медиатором. При захвате одной молекулы ДА одновременно осуществляется транспорт двух ионов натрия и одного иона хлора. Регуляция ДАТ может осуществляться как на генном уровне, так и при помощи посттрансляционной модификации. Некоторые протеинкиназы и фосфатазы могут регулировать поверхностную экспрессию и функциональные свойства ДАТ [Reith et al.,1997; Vaughan et al., 1997]. Считается, что ДАТ экспрессируется в мозге исключительно на ДА-ергических нейронах [Ciliax et al., 1995, Hoffman et al., 1998]. Однако существуют данные, согласно 20 которым ДАТ может так же экспрессироваться в глиальных клетках (астроцитах) [Takeda et al., 2002]. Наибольшая экспрессия ДАТ наблюдается в ДА-ергических нейронах нигростриатной и мезолимбической систем, в гипоталамусе и коре его выявляется значительно меньше [Elsworth, Roth, 1997]. Онтогенез ДАТ впервые определяется в нейронах среднего мозга с Э14, и к Э18 его экспрессия достигает уровня взрослых животных. В гипоталамусе мРНК ДАТ не выявляется в процессе развития организма [Fujita et all., 1993]. Специфический обратный захват ДА нейронами среднего мозга обнаруживается на Э1516, что соответствует времени начала иннервации стриатума. Между Э16 и Э18 высокоафинный обратный захват ДА резко возрастает, и к моменту рождения выходит на постоянный уровень [Fiszman et al., 1991]. Несмотря на то, что экспрессия ДАТ не выявляется в нейронах гипоталамуса, специфический захват ДА в данной области так же обнаруживается с Э16 и возрастает до П9 [Borisova et al., 1991]. 1.1.3.4 Деградация дофамина Катаболизм является наиболее эффективным способом инактивации ДА [Boulton, Eisenhofer, 1998]. Он включает в себя несколько путей: окислительное дезаминирование с помощью моноаминоксидазы (МАО) и О-метилирование с помощью катехоламинтрансферазы (КОМТ) (рисунок 4). Выбор того или иного пути метаболизма зависит от локализации специфических ферментов. Так, МАО ассоциирована с внешней митохондриальной мембраной и работает преимущественно внутриклеточно, в то время как КОМТ может быть связана внешней клеточной мембраной или находится в свободном состоянии в цитоплазме. МАО имеет два изомера, А и Б, которые кодируются двумя разными генами. Они различаются как субстратной специфичностью, так селективностью к ингибиторам. МАО А содержится преимущественно в катехоламинергических нейронах, а МАО Б в серотонинергических и гистаминергических нейронах, а так же в глиальных клетках [Luque et al., 1995]. В процессе дезаминирования ДА при помощи МАО образуется дигидроксифенилуксусная кислота (ДОФУК). Определение соотношения концентраций 21 ДОФУК / ДА является хорошим методом для оценки быстрых изменений активности нейронов, не требующим введения каких-либо дополнительных препаратов [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001]. Конечным продуктом метаболизма ДА при помощи МАО и КОМТ является гомованилиновая кислота. Онтогенез мРНК МАО-А начинает определяться в среднем мозге только после рождения. Ее уровень возрастает до П10, а затем остается постоянным на протяжении всей жизни. В гипоталамусе МАО-А начинает экспрессироваться раньше, чем в среднем мозге. Так, в нейронах зоны инсерта (А13) мРНК МАО-А начинают детектировать с Э16, в перевентрикулярном ядре (А14) с Э18. Экспрессию МАО-Б определяют только в ДАергических нейронах преоптической области (А15), начиная с П4 [Vitalis et al., 2002]. КОМТ впервые обнаруживается на 15й эмбриональный день [Coyle, Henry, 1973]. Каталитическая активность МАО и КОМП впервые обнаруживается на Э13 в мезенцефалоне и на Э15 в стриатуме. Метаболиты ДА начинают выявляться на три дня позже [Fiszman et al., 1991]. Рисунок 4 – Схема деградации дофамина 22 1.1.3.5 Рецепторы к дофамину На основании различий в сигнальных механизмах и чувствительности к различным ингибиторам выделяют два основных класса рецепторов к ДА: Д1-подобные и Д2-подобные (рисунок 5). Оба типа рецепторов относятся к суперсемейству рецепторов, сопряженных с Gбелками. Они характеризуются семью гидрофобными трансмембранными доменами с внеклеточно локализованным N-концом и внутриклеточно локализованным С-концом[Sibley, Monsma, 1992]. К Д1-подобным рецепторам относят Д1 и Д5-рецепторы. Данный тип рецепторов стимулирует аденилатциклазу, что приводит к повышению уровня цАМФ. Д5 – рецепторы обладают большей аффинностью к ДА по сравнению с Д1[Jackson, Westlind-Danielsson, 1994]. Д2-подобные рецепторы включают в себя Д2, Д3 и Д4-рецепторы. Эти рецепторы ингибируют аденилатциклазу и Ca2+-каналы и активирую и K+-каналы [Brady et al., 2005]. Д1-подобные рецепторы локализованы в стриатуме, хвостатом ядре, обонятельном бугорке и коре. Кроме того, Д1-рецепторы детектируют в лимбической системе, гипоталамусе и таламусе. Через Д1-рецепторы ДА оказывает влияние на локомоторную активность и обучение. Д2-подобные рецепторы локализованы преимущественно в среднем мозге, стриатуме и гипоталамусе. Д2-рецепторы участвуют в регуляции моторного поведения, а также в нейроэндокринной регуляции [Missale, 1998]. Рисунок 5 - Рецепторы к дофамину [Brady et al., 2005] Онтогенез Впервые экспрессию Д1 и Д2-рецепторов выявляют в период нейрогенеза в нейроэпителии желудочков мозга. В других отделах мозга экспрессия рецепторов отмечена после выселения нейронов в места их окончательной закладки, у грызунов – в конце 23 пренатального периода. В этот период нейроны, экспрессирующие Д1-рецепторы, обнаружены в стриатуме, коре, супрахиазматическом и вентромедиальном ядрах, обонятельных бугорках и т.д. [Schambra et al., 1994] Д2-рецепторы обнаруживают в зоне инсерта, септуме, дорсомедиальном и латеральном мамиллярном ядрах, стриатуме, черной субстанции и вентротегментально области [Sales et al., 1989; Schambra et al., 1994]. Не все нейроны гипоталамуса, имеющие ДА-ергическую афферентную иннервацию, экспрессируют рецепторы к ДА. К таким исключениям относятся нейроны аркуатного, перивентрикулярного и паравентрикулярного ядер [Sales et al., 1989]. 1.1.2 Нервная и гуморальная регуляция развития дофаминергической системы На развитие ДА-ергической системы мозга влияет большое количество физиологически активных веществ. Большое влияние на дифференцировку ДА-ергических нейронов оказывают катехоламины, причем характер их действия зависит от периода развития. Во время нейрогенеза катехоламины запускают экспрессию ДА-ергического фенотипа клеткамипредшественниками [De Virty et al., 1991]. В процессе дальнейшего развития и до конца пренатального периода катехоламины стимулируют увеличение поверхности нейрона, что связано с ростом и развитием отростков [Bernabe et al., 1996]. Наряду с нейротрансмиттерами на развитие ДА-ергической системы могут оказывать влияние гормоны гипофиза. Однако механизмы их действия до конца не изучены. Так, у мутантных мышей с дефицитом ПРЛ в гипоталамусе существенно снижено содержание ДА [Phelps, 1994]. Это связано с недостаточностью дифференцировки ДА-ергических нейронов и может корректироваться введением ПРЛ в критический период развития (Romero, Phelps, 1994) Меланоцитстимулирующий гормон также оказывает влияние на развитие ДАергической системы гипоталамуса. В раннем постнатальном периоде (у крыc между П4 и П8) происходит формирование регуляции по принципу обратной связи между ДА-ергическими нейронами аркуатного ядра и клетками гипофиза, продуцирующими меланоцитстимулирующий гормон [Davis et al., 1984]. Среди гормонов периферических эндокринных желез наибольшее влияние на развитие ДА-ергической системы оказывают гормоны щитовидной железы и половые стероиды. Так, тиреоидные гормоны оказывают стимулирующее влияние на дифференцировку ДА-ергических нейронов, что проявляется в увеличении размера тел нейронов, протяженности и разветвленности их отростков [Puymirat et al., 1983]. 24 Андрогены оказывают морфогенетическое влияние на гипоталамус в период маскулинизации мозга. Их действие в это время приводит к снижению числа ДА-ергических нейронов у взрослых животных, что можно объяснить либо запуском апоптоза нейронов, либо предотвращением их миграции из нейроэпителия в места их окончательной закладки [Simerly et al., 1985, 1989]. 1.2. Гематоэнцефалический барьер в онтогенезе 1.2.1 Общая структурно-функциональная характеристика гематоэнцефалического барьера Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) представляет собой физиологический барьер между общей системой циркуляции и внутренней средой мозга. Основной функцией барьера является поддержание постоянства внутримозговой среды, что необходимо для нормального функционирования мозга [Bernacki et al., 2008]. Следует отметить, что ГЭБ – в большей степени функциональное понятие, чем анатомическое. Выделяют три основные составляющие ГЭБ, за счет которых обеспечивается барьерная функция: физическую, транспортную и метаболическую [Abbott et al., 2010]. Физическая составляющая ГЭБ представляет собой эндотелиальные клетки сосудов мозга, которые образуют между собой так называемые плотные контакты (рисунок 6.) Наличие плотных контактов между клетками эндотелия обеспечивает барьер для проникновения макромолекул и полярных молекул. Комплекс контактов между клетками эндотелия включает в себя адгезионные и плотные контакты. Адгезионные контакты формируются с участием кадгерина и катенинов и необходимы для формирования плотных контактов. В формировании плотных контактов участвуют окклюдины и клаудины (3 и 5), а также молекулы адгезии. Окклюдин и клаудины связаны с цитоплазматическими белками ZO-1, 2 и 3 и цингулином [Bauer et. al., 2004; Abbott et al., 2010] . 25 Рисунок 6 - Структура плотных контактов ГЭБ [Begley, Brightman, 2003] Регуляция проницаемости осуществляется за счѐт белков ZO и связана с изменением концентрации кальция и действия некоторых веществ, например, цитокинов. Транспортная составляющая ГЭБ подразумевает под собой наличие специальных механизмов транспорта веществ (рисунок 7). Межклеточный транспорт. В капиллярах периферических органов и тканей, транспорт веществ осуществляется в основном через фенестрации сосудистой стенки и межклеточные промежутки. В норме между клетками эндотелия сосудов мозга такие промежутки отсутствуют. В связи с этим питательные вещества проникают в мозг лишь через клеточную стенку. Вода, глицерин и мочевина являются примерами тех небольших поляризованных молекул, которые могут свободно диффундировать через плотные контакты между эндотелиальными клетками ГЭБ [Abbott et al., 2006; Abbott et al., 2010]. Пассивный транспорт. Широкий спектр жирорастворимых молекул может свободно проникать через ГЭБ посредством диффузии. Существует корреляция между скоростью проникновения веществ в ЦНС и их растворимостью в липидах [Liu et al, 2004]. Кроме того, газообразные молекулы, такие как кислород и углекислый газ, также свободно проникают через ГЭБ. Транспорт при помощи переносчиков. Выделяют два типа переносчиков, при помощи которых вещества могут проникать через ГЭБ. Первый тип переносчиков – белки, растворимые в клеточной мембране. При помощи данного вида переносчиков осуществляется так называемая облегченная диффузия. Таким образом, происходит транспорт через эндотелий достаточно крупных полярных молекул, например, глюкозы [Zhang et al., 2002]. Транспортѐры могут осуществлять перенос веществ в одном или двух направлениях. Транспорт веществ идет по градиенту концентрации и не требует затраты энергии [Abbott et al., 2006]. 26 Второй тип переносчиков – белки, которые осуществляют активный транспорт веществ через ГЭБ против градиента концентрации. Данный вид транспорта используется для оттока различных веществ из мозга и является энергозависимым. Основной функцией активного транспорта является удаление из ЦНС потенциально нейротоксичных эндогенных молекул и ксенобиотиков [Abbott et al., 2010]. Рецептор-опосредованный трансцитоз. С помощью рецептор-опосредованного трансцитоза происходит перенос больших молекул. На обращѐнной в просвет сосуда поверхности клетки расположены специальные рецепторы для опознавания и связывания определѐнных веществ. После контакта рецептора с веществом-мишенью происходит их связывание, участок мембраны инвагинируется в полость клетки и образуется внутриклеточный пузырѐк — везикула. Затем она перемещается к обращѐнной к нервной ткани поверхности эндотелиальной клетки, сливается с ней и высвобождает связанные вещества. Таким образом, во внеклеточное пространство мозга переносятся трансферрин, липопротеины низкой плотности, из которых образуется холестерин, инсулин и другие пептидные гормоны [Ballabh et. al., 2004; Abbott et al., 2010]. Абсорбцио-опосредованный трансцитоз. Одним из подвидов везикулярного транспорта является абсорбцио-опосредованный трансцитоз. Отмечается «прилипание» ряда положительно заряженных веществ (катионов) к отрицательно заряженной клеточной мембране с последующим образованием везикулярного пузырька и его переносом к противоположной поверхности клетки. Данный вид транспорта также называется катионным. Он проходит относительно быстрее рецептор-опосредованного трансцитоза [Abbott et al., 2006]. Рисунок 7 - Транспорт веществ через ГЭБ [Abbott et al., 2006] 27 Метаболическая составляющая ГЭБ подразумевает под собой наличие ферментов, активность которых ограничивает поступление веществ из кровотока. Так, например, при высокой концентрации морфологическую в кровотоке составляющую ГЭБ, часть но моноаминов сразу же может разрушаются проникать МАО и через КОМТ (энзиматическая составляющая) [Hardebo, 1979]. 1.2.2 Формирование гематоэнцефалического барьера для катехоламинов Известно, что у взрослых животных катехоламины не способны проникать через ГЭБ [Axelrod et al., 1959; Glowinski et al., 1964; Bertler et al., 1966]. У крыс начало формирования барьера отмечено в период Е11-Е17 с образования плотных контактов [Abbott et al., 2010]. Высокое электрическое сопротивление, характерное для ГЭБ, обнаруживают у крыс, начиная с Э21 [Butt, 1995; Butt et al., 1990], что также указывает на образование плотных контактов еще в пренатальном периоде развития. Основной функциональной составляющей ГЭБ для катехоламинов являются ферменты метаболизма МАО и КОМТ. Так, было показано, что при высокой концентрации в кровотоке часть моноаминов может проникать через морфологическую составляющую ГЭБ, но сразу же разрушаются МАО и КОМТ [Hardebo et al., 1979]. У крыс активность МАО сильно увеличивается после рождения и достигает максимального уровня к Р10 [Betz, Goldstein, 1981; Kalaria, Harik, 1987]. МАО В у грызунов начинает экспрессироваться астроцитами только после рождения [Nicotra et al., 2004]. На клетках эндотелия сосудов, участвующих в формировании ГЭБ, присутствуют переносчики катехоламинов, такие как транспортер норадреналина и полиспецифический натрий-независимый электрогенный транспортѐр органических катионов. Последний переносит преимущественно серотонин и ДА. Экспрессируется в основном в хороидном плексусе, но также в клетках эндотелия сосудов мозга. Локализован на апикальной мембране эпителиальных клеток, то есть, обеспечивает транспорт моноаминов из цереброспинальной жидкости в кровь [Okura et al., 2011; Duan, Wang, 2013]. В целом считается, что при рождении ГЭБ для катехоламинов является проницаемым и окончательно формируется лишь к концу второй недели постнатального развития [Loizou, 1970; Miyaguchi et al., 1999]. Таким образом, если физическая составляющая ГЭБ формируется довольно рано, то энзиматическая несколько отстаѐт от неѐ по времени [Kostrzewa, 2007]. 28 1.3. Периферическая дофамин-продуцирующая система в онтогенезе 1.3.1 Периферические органы, синтезирующие дофамин ДА синтезируется в качестве промежуточного или конечного продукта во многих клетках и органах. Так ДА является промежуточным продуктом синтеза норадреналина в симпатической нервной системе, хромаффинных клетках надпочечников и параганглиев. Не смотря на то, что большая часть ДА в данных органах превращается в норадреналин, считается, что он так же может выделяться в общую систему циркуляции как самостоятельный продукт [Chritton et al., 1997]. В качестве самостоятельного продукта ДА синтезируется в клетках извитых канальцев почек [Baines, Chan, 1980; Gerbi et al., 1997], энтерохромаффинных клетках мезентерических органов (желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), поджелудочная железа, селезенка) [Eisenhofer et al., 1997], клетках иммунной системы (лимфоциты) [Koslow, 1976; Koslow, 1977; Goldstein et al., 1971, Pickel et al., 1975], а так же SIF-клетках (мелкие интенсивно флуоресцирующие клетки) симпатических ганглиев [Björklund et al., 1970]. Существует предположение, согласно которому сердце и легкие так же способны синтезировать ДА. Так было показано, что интракардиальные и интрапульмональные ганглии обладают хромаффинными клетками [Jacobowitz, 1967; Jacobowitz et al., 1973]. Кроме того, трансплантаты ткани миокарда имеют удивительно высокие концентрации ДА [Regitz, Fleck, 1992], а в легочной ткани человека и овцы при помощи гибридизации in situ были обнаружены клетки, экспрессирующие ТГ [Goldstein et al., 1995]. Онтогенез Большинство клеток, синтезирующих катехоламины в периферических органах, являются производными нервного гребня. К ним относят нейроны симпатической нервной системы, SIF-клетки симпатических ганглиев, хромаффинные клетки мозгового вещества надпочечников и экстраадреналовые хромаффинные клетки [Le Douarin, Kalcheim, 1999]. Сначала клетки образуют так называемый первичный симпатический ганглий в районе дорсальной аорты, где они дифференцируются в ТГ-содержащие предшественники симпатоадреналовых клеток. Затем они мигрируют в места их окончательной закладки, где продолжается их дифференцировка по определенному типу (симпатические нейроны, хромаффинные или SIF-клетки) [Anderson, 1993; Anderson, Axel, 1986; Huber et al., 2009; Unsicker at al., 2013]. 29 Самым крупным скоплением экстрахромаффинных клеток является орган Цукеркандля (ОЦ), который располагается в районе бифуркации брюшной аорты. Данный орган наиболее активен в эмбриональном периоде развития и достигает максимума функциональной активности к моменту рождения. К концу же второй недели постнатального развития большая часть клеток претерпевает инволюцию путем аутофагии [Schober et al., 2013]. В отличие от хромаффинной ткани ОЦ, хромаффинная ткань надпочечников остается гистологически и биохимически незрелой в течение всего периода эмбрионального развития [Artal, 1980]. Значительный рост уровня катехоламинов наблюдается в надпочечниках в течение первых двух недель постнатального развития [De Gallardo et al., 1974]. Первые катехоламин-флуоресцентные клетки обнаруживаются в симпатических ганглиях с Э14, далее количество этих клеток растет до Э17. В дальнейшем происходит дифференцировка этих клеток с образованием симпатических нейронов и SIF-клеток [Coughlin et al., 1978; Hall, Landis 1991]. Симпатическая иннервация периферических органов происходит в течение первых двух недель постнатального развития [Ackerman et al., 1987; Kirby, McCarty, 1987]. Происхождение энтерохромаффинных клеток мезентерических органов достаточно мало изучено. Существует лишь несколько работ, в которых на куриных эмбрионах было показано, что данный тип клеток не является производным нервного гребня [Andrew, 1974; Fontaine, Le Douarin, 1977]. 1.3.2 Синтез дофамина в периферических органах В периферических органах существует два вида синтеза ДА. Во-первых, это классический или полный синтез ДА, аналогичный таковому в ЦНС. То есть ДА синтезируется из тирозина при помощи двух ферментов – ТГ и ДАА. Таким образом ДА синтезируется в хромаффинных клетках мозгового вещества надпочечников и параганглиев, нейронах симпатической нервной системы, SIF-клетках симпатических ганглиев, энтерохромаффинных клетках мезентерических органов и лимфоцитах. Второй путь синтеза является неполным, при этом ДА синтезируется при помощи фермента ДАА из L-ДОФА, который захватывается клеткой из общей системы циркуляции. Такой вид синтеза встречается в клетках извитых канальцев почки и коре надпочечников [Buu, Lussier, 1990; Goldstein et al., 1995]. 30 Онтогенез Катехоламин-индуцированная флуоресценция, а также основные ферменты синтеза ДА – ТГ и ДАА обнаруживаются у крыс в симпатоадреналовых клетках-предшественниках, располагающихся в первичном симпатическом ганглии, достаточно рано - на Э12,5 [Cochard et al., 1978; Ahonen, 1987]. В процессе миграции клеток к местам их окончательной закладки экспрессия ферментов синтеза сохраняется [Ahonen, 1987]. У мышей в верхнем шейном ганглии активность ТГ интенсивно растет до Э17, а затем наблюдается лишь умеренный рост, и к моменту рождения она выходит на постоянный уровень [Coughlin et al., 1978]. В зачатках надпочечников ферменты синтеза ДА – ТГ и ДАА начинают выявлять с Э13,5. В мозговом веществе надпочечников данные ферменты выявляются с Э17 [Verhofstad et al., 1979; Bohn et al., 1981]. Клетки ОЦ достигают района бифуркации брюшной аорты к Э21. Показано, что на данном этапе развития ОЦ хорошо васкуляризован. В этот же период ОЦ достигает максимума своего функционального развития [Ahonen, 1987]. Катехоламин-индуцированная флуоресценция появляется в клетках мезентерических органов в течение первой недели постнатального развития [Ekelund et al., 1985], хотя сами клетки (а также синтез в них различных пептидов) появляются еще до рождения [Ekelund et al., 1985; Modlin, Tang, 1996]. Интересным является тот факт, что в кишечнике на ранних этапах эмбрионального развития, с Э11,5 по Э14,5, наблюдаются клетки, временно экспрессирующие ТГ [Cochard et al., 1978]. В почках ДАА начинает выявляться довольно рано - с Э15, а максимальное количество ДАА-иммунореативных клеток наблюдается с П5 по П15. Катехоламин-индуцированная флуоресценция обнаруживается в клетках извитых канальцев почки с Э21 [Meister et al., 1992]. 1.3.3 Запасание и выделение дофамина В периферических органах и тканях, так же как и в ЦНС, ДА запасается в везикулах. Транспорт ДА из цитоплазмы в везикулы происходит при помощи специальных везикулярных транспортеров моноаминов. Наряду с ВМАТ2, который осуществляет перенос ДА в везикулы в ЦНС, в периферических органах также присутствует ВМАТ1. Он так же как ВМАТ 2 является трансмембранным белком. Процесс переноса ДА в везикулу с помощью ВМАТ 1 как и в случае с ВМАТ 2 является АТФ-зависимым. Считается, что ВМАТ1 и ВМАТ2 гомологичны на 60%, и 31 отличаются чувствительностью к субстрату и различным ингибиторам [Bertil, Goldstein, 1988; Weihe et al., 1994]. ВМАТ2 наряду с нейронами ЦНС экспрессируется в симпатических нейронах и периферической нервной системы, небольшой популяции хромаффинных клеток мозгового вещества надпочечников, а также в некоторых популяциях энтерохромаффинных клеток мезентерических органов [Weihe et al., 1994; Mezey et al., 1996; Mezey et al., 1998]. ВМАТ1 был обнаружен во всех хромаффинных клетках мозгового вещества надпочечников, в SIF-клетках симпатических ганглиев, а также в энтерохромаффинных клетках мезентерических органов [Weihe et al., 1994; Mezey et al., 1996; Mezey et al., 1998]. Механизм выделения ДА из периферических органов изучен недостаточно. Было показано, что хромаффинные клетки, так же как и нервные, выделяют катехоламины посредством экзоцитоза в ответ на деполяризацию клеточной мембраны [Aunis, Langley, 1999]. Основная регуляция выделения катехоламинов из надпочечников осуществляется чревным нервом [De Diego et al., 2008]. Однако вопрос о том, выделяется ли ДА в процессе экзоцитоза наряду с норадреналином и адреналином, остается открытым. Механизмы выделения катехоламинов из других периферических органов фактически не изучены. Онтогенез Во всех клетках симпатоадреналовой линии нервного гребня оба везикулярных моноаминовых транспотрера начинают экспрессироваться на Э14. В энтерохрофиных клетках кишечника ВМАТ 1 впервые выявляется на Э19, а в желудке ВМАТ 2 на Э16 [Schütz et al 1998]. 1.3.4 Захват дофамина На периферии захват катехоламинов условно делят на 2 вида: 1. Нейрональный захват, т.е. обратный захват нейромедиатора в симпатические нейроны. В литературе данный вид захвата часто называют Захват 1. Основными функциями данного процесса являются быстрое восстановление запасов нейромедиатора в нейроне, а также модуляция интенсивности и времени действия сигнальных молекул на орган-мишень. Показано, что при выделении норадреналина из симпатических нейронов 87% нейромедиатора захватывается обратно в клетку. Захват 1 в симпатической нервной системе осуществляется так же как и в ЦНС с помощью ДАТ [Eisenhofer, 2001; Bertil, Goldstein, 1988]. 32 2. Ненейрональный захват (Захват 2), т.е. захват катехоламинов в ненейрональные клетки. Так как на периферии все ферменты деградации катехоламинов локализованы внутриклеточно, основной функцией данного вида захвата является клиренс катехоламинов [Eisenhofer, 2001; Bertil, Goldstein, 1988]. Захват 2 в периферических органах осуществляется посредством различных мембранных транспортеров. Так, ДАТ присутствует в энтерохромаффинных клетках ЖКТ [Mezey et al., 1996; Mezey et al., 1998]. Наряду с ДАТ, в периферических органах присутствуют так называемые ненейрональные транспортеры. Они в отличие от ДАТ обладают гораздо более низкой субстратной специфичностью и имеют сродство к большому количеству эндогенных и экзогенных сигнальных молекул. Кроме того, данные транспортеры не являются Na/Cl–зависимыми и, соответственно, имеют специфический профиль ингибирования. Выделяют три вида периферических транспортеров: экстранейрональные транспотреры моноаминов (ЭМТ) и транспортеры органических катионов (ОКТ1 и ОКТ2). Все транспортеры относятся к семейству амфифильных растворенных посредников и имеют высокую степень гомологии. Они, так же как и классические транспортеры моноаминов, имеют 12 трансмембранных доменов, однако, отличаются от первых по своей первичной структуре. Наиболее высокое сродство к ДА имеют ОКТ 1 и ОКТ 2, сродство ЭМТ к ДА является наименьшим. Все три вида транспортеров активно экспрессируются в почках и печени. Кроме того, ЭМТ экспрессируется в сердце, эндотелиальных клетках кровеносных сосудов, плаценте и сетчатке [Eisenhofer, 2001; Bertil, Goldstein, 1988]. Онтогенез Данных о том, когда в онтогенезе появляется специфический захват ДА в периферических органах крайне мало. Известно, что в почке ОКТ2 начинает экспрессироваться с Э13, а ОКТ 1 с Э17 [Sweet et al., 2006]. В печени ОКТ1 начинает экспрессироваться лишь после рождения и достигает уровня экспрессии взрослых животных к концу второй недели постнатального развития [Alnouti et al., 2006]. 1.3.5 Деградация дофамина Как уже было отмечено ранее, ферменты деградации ДА на периферии расположены внутриклеточно, поэтому первичным механизмом его дезактивации является не метаболизм ферментами, а захват. В связи с этим существует тесная взаимосвязь между этими двумя процессами. В ряде случаев активность внутриклеточных ферментов метаболизма может 33 влиять на захват ДА и его концентрацию в межклеточном пространстве [Eisenhofer, 2001; Bertil, Goldstein, 1988]. Основным ферментом метаболизма ДА в нервных клетках является МАО, в то время как КОМТ играет лишь второстепенную роль. В отличие от этого, в экстранейрональном метаболизме ДА активное участие принимают оба фермента. Было показано, что при ингибировании лишь одного фермента деградации уровень катехоламинов на периферии фактически не меняется, и только при ингибировании обоих ферментов одновременно снижается уровень катехоламинов в периферических органах и плазме крови [Halbrugge et al., 1993; Eisenhofer, Finberg, 1994; Friedgen et al., 1994; Blaha et al., 1996]. Эти данные свидетельствуют о том, что активность ферментов деградации на периферии настолько высока, что при ингибировании одного из них второй способен полностью взять на себя его функцию. Обе изоформы МАО обнаруживаются в печени, почках, легких и SIF-клетках. Кроме того, МАО-А локализуется в щитовидной железе и плаценте, а МАО-Б – в тромбоцитах и надпочечниках [Denney et al., 1983; Grimsby et al., 1990; Shih et al., 1999]. КОМТ была обнаружена в печени, почках и мезентерических органах [Karhunen et al., 1994]. Еще один путь метаболизма ДА – конъюгирование при помощи ферментов сульфотрансфераз и глюкоронидаз. Показано, что основная часть ДА в периферической крови находится в конъюгированной форме. Так, у крыс 89% ДА в плазме представлено глюкоронигированной формой и 2,4% сульфоконъюгированной [Wang et al., 1983]. Ферменты, осуществляющие конъюгирование ДА, экспрессируются главным образом в печени, мезентерических органах, почках, надпочечниках и тромбоцитах [Shoaf, Elchisak, 1983, Goldstein et al., 1995]. Однако основные источники конъюгированных форм ДА в крови на данный момент не совсем ясны [Cuche еt al., 1990]. Физиологическое значение конъюгирования ДА в организме на данный момент активно обсуждается. Существует несколько точек зрения, объясняющие данный процесс. Во-первых, конъюгирование можно рассматривать как способ протекции организма от токсически высоких концентраций ДА, так как данный процесс препятствует увеличению уровня свободного нейротрансмиттера в межклеточном пространстве [Goldstein et al., 1995]. Во-вторых, конъюгированные формы ДА стойки по отношению к ферментам деградации – МАО и КОМТ, кроме того, in vivo показано, что конъюгированный ДА может превращаться в свободные формы ДА, норадреналина и адреналина [Merits, 1976] Поэтому данный процесс может рассматриваться как запасной источник свободных форм катехоламинов. В-третьих, процессы конъюгирования в ЖКТ могут быть рассмотрены как часть гисто-гематического барьера, предотвращающие токсический эффект катехоламинов, синтезирующихся из поступающих 34 вместе с пищей аминокислотных предшественников. В-четвертых, конъюгирование ДА в сосудах может быть рассмотрено как способ ограничения доступа физиологически активного свободного ДА к клеткам- и органам-мишеням, где ДА может выступать в качестве аутокринного/паракринного агента [Goldstein et al., 1995]. Онтогенез Данные о появлении ферментов метаболизма ДА в онтогенезе носят достаточно фрагментарный характер. МАО на периферии начинают определять достаточно рано. Так, в печени и почках экспрессия МАО впервые обнаружена на Э15, однако, на протяжении всего эмбрионального периода она остается на низком уровне. К моменту рождения происходит резкое увеличение уровня экспрессии, причем в процессе дальнейшего развития он растет незначительно [Vinsent et al., 1992]. В сердце МАО-Б появляется в конце эмбрионального периода и достигает уровня взрослых животных к 2-3 неделям постнатального развития. В то же время, активность МАО-А в сердце достаточно низкая даже после рождения, однако, в процессе дальнейшего развития она резко возрастает. В организме взрослого животного активность МАО-А в сердце гораздо выше, чем активность МАО-Б [Strolin et al., 1991 Wang et al., 2013]. Экспрессия КОМТ впервые обнаруживается на Э18 в дистальной части проксимальных канальцев почки, а так же в эпителии мочеточника [Meister et al., 1993]. Было показано, что различные виды сульфотрансфераз начинаю экспрессироваться в периферических органах (почки, двенадцатиперстная кишка, печень) за несколько дней до рождения и достигают уровня взрослых животных к пубертатному периоду [Alnouti, 2006]. 1.3.6 Рецепторы к дофамину Рецепторы к ДА экспрессируются во многих периферических органах. Так, в надпочечниках обнаружены как Д1, так и Д2-подобные рецепторы. В почке также экспрессируются оба типа рецепторов. Так, в юкста-гломерулярном аппарате, почечных клубочках, проксимальных канальцах и восходящем отделе петли Генле экспрессируются Д1-подобные рецепторы, в то время как в корковых собирательных трубочках экспрессируются оба типа рецепторов [Edwards, 1986; Kurtz et al., 1988; Meister et al., 1989; Nash et al., 1993; Missale et al., 1998]. В постганглионарных окончаниях симпатических ганглиев обнаружены Д2-подобные рецепторы [Missale et al., 1988]. 35 Достаточно широко рецепторы к ДА представлены в сердечно-сосудистой системе. В адвентициальной и внутренней оболочке почечной, селезеночной и мезентерической артерий, а также в артериальных сосудах находятся Д2-подобные рецепторы, а в средней мышечной оболочке почечной, селезеночной и мезентерической артерий – Д1-подобные рецепторы [Goldberg et al., 1978; Missale et al., 1988]. В сердце обнаружены Д4-рецепторы [O'Malley et al., 1992]. В мезентерических органах экспрессируются все подтипы ДА-рецепторов. Наиболее широко представлены Д1- и Д3-рецепторы [Willems et al., 1985; Li et al., 2006]. Онтогенез. Экспрессия ДА рецепторов в периферических органах в онтогенезе изучено достаточно плохо. Существуют лишь фрагментарные данные по отдельным органам. Так, в клетках почечных канальцев Д1-рецепторы начинают экспрессироваться на Э15, одновременно с началом синтеза ДА [Svennilson, Aperia, 1999]. В желудке и кишечнике Д1-Д4-рецепторы начинают экспрессироваться с Э10 у мышей, а Д5-рецепторы с Э14. Экспрессия всех типов рецепторов поддерживается на высоком уровне вплоть до рождения [Li et al., 2006]. 1.3.7 Паракринная и аутокринная роль дофамина в регуляции функционирования периферических органов-мишеней В симпатической нервной системе ДА является промежуточным продуктом синтеза норадреналина. Кроме того, считается, что через Д2-рецепторы на окончаниях симпатических ганглиев ДА ингибирует выброс норадреналина [Goldberg еt al., 1978; Missale et al., 1988; Amenta et al., 1990]. В клубочковой зоне коры надпочечников ДА при воздействии на Д2-рецепторы ингибирует выделение альдостерона на базовом уровне и в ответ на ангиотензин II [Missale et al., 1988, Fraser et al., 1989; Missale et al., 1989]. В мозговом веществе надпочечников ДА регулирует содержание норадреналина и адреналина. Так, через Д2-рецепторы происходит ингибирование синтеза катехоламинов, а через Д1-рецепторы его стимуляция [Bigornia et al., 1988, 1990; Artalejo et al., 1990]. ДА оказывает свое влияние и на работу почки [Jose et al., 1992]. Большое значение ДА играет в процессах почечной фильтрации и, в частности, процессах натрийуреза и диуреза через стимуляцию Д1- и Д2-подобных рецепторов, расположенных на мембране проксимальных канальцев [Edwards, 1985, 1986]. ДА почечных канальцев вовлечен в процесс реабсорбции Na+: 36 через активацию Д1-подобных рецепторов ДА ингибирует работу протонного насоса в клетках проксимальных канальцев [Gesek, Schoolwerth, 1990; Jadhav, Liu, 1992]. Через одновременную активацию Д1- и Д2-рецепторов ДА регулирует процесс обратного захвата Na+, ингибируя действие Na+/К+ -АТФазы [Baines et al., 1992]. Активация Д1-рецепторов клеток проксимальных канальцев приводит к ингибированию фосфатного транспорта [Isaac et al., 1992]. Кроме того, действие ДА на Д1-рецепторы юкста-гломерулярного аппарата приводит к повышает секрецию ренина [Missale et al., 1989]. ДА играет важную роль в регуляции функций сердечно-сосудистой системы. Было показано, что непосредственное воздействие ДА на Д1-подобные рецепторы приводит к расширению сосудов, увеличению сердечного выброса, в то время как стимуляция Д2подобных рецепторов вызывает сужение сосудов и снижает частоту сердечных сокращений [Goldberg, et al., 1978; Zeng et al., 2007]. Кроме того, ДА в высоких концентрациях может воздействовать на адренорецепторы. В результате стимуляция α-адренорецепторов повышает систолическое артериальное давление, а при стимуляции β-адренорецепторов увеличивается сила сердечных сокращений [Brodde, 1990]. В желудке ДА ингибирует секрецию соляной кислоты, а также уменьшает внутрижелудочное давление [Willems et al., 1985; Glavin, Szabo, 1990; Goldstein et al., 1995]. В двенадцатиперстной кишке ДА стимулирует секрецию бикарбонатов [Flemstrom, Safsten, 1994]. Кроме того, ДА через Д1-рецепторы вызывает расслабление продольной гладкой мускулатуры желудка, а через α-адренорецепторы вызывает сокращение кольцевой мышцы. Еще одной функцией ДА в ЖКТ является регуляция процесса абсорбции ионов Na+ слизистой оболочкой кишечника: так, ингибирование синтеза ДА приводит к увеличению натриевой абсорбции [Finkel et al., 1994]. 1.3.8 Роль дофамина в развитии периферических органов-мишеней В связи с тем, что синтез ДА и его рецепторы в онтогенезе появляются довольно рано, можно предположить, он способен оказывать влияние на развитие периферических органов. Однако данных об этом в литературе достаточно мало. Было показано, что у нокаутных мышей по гену DARPP-32 (белок, передающий сигнал от ДА рецептора на внутриклеточные эффекторы) значительно снижено количество нефронов в почке, а также соотношение веса тела к весу почки [Svennilson, Aperia, 1999]. Эти данные свидетельствуют о том, что ДА является важным химическим сигналом для правильного развития почки. 37 Кроме того, было показано, что нокаутные мыши по гену ТГ являются нежизнеспособными, предположительно из-за нарушений в работе сердечно-сосудистой системы [Zhou et al., 1995]. Однако ТГ является ключевым ферментом синтеза не только ДА, но и норадреналина, поэтому нельзя точно утверждать, что данные патологии вызваны именно дефицитом ДА. Таким образом, можно сказать, что вопросы, связанные с развитием периферической ДА-продуцирующей системы и ролью ДА в процессе развития организма изучены достаточно плохо и требуют внимательного рассмотрения в дальнейшем. 1.4. Эндокринная регуляция дофамином секреции пролактина гипофиза ПРЛ представляет собой белковый гормон, получивший свое название благодаря способности инициировать лактацию у млекопитающих. Наличие секреции ПРЛ отмечено у всех видов позвоночных. Молекула ПРЛ представлена цепью аминокислот, объединенных тремя дисульфидными мостиками между цистеиновыми остатками (Cys4-Cys11, Cys58-Cys174, Cys191-Cys199). Исследования по изучению вторичной структуры белка показали, что до 50% аминокислот упорядочено в виде α-спирали, в то время как остальные аминокислоты образуют сплетения [Bewley, Li, 1972]. Предположительно, третичная структура ПРЛ включает четыре длинные антипараллельные α-спирали [de Vos et al., 1992]. ПРЛ является гормоном передней доли гипофиза, который у взрослых самок млекопитающих непосредственно стимулирует рост и развитие молочных желез, стимулирует секрецию молока, контролирует развитие и функционирование желтого тела в яичниках, поддерживает эстральный цикл [Neill, 1980]. Функциональное значение ПРЛ у самцов менее изучено, хотя известно, что он необходим для развития и нормального функционирования органов размножения [Morishige, Rothchild, 1974]. Кроме того, у самцов и самок ПРЛ участвует в осморегуляции и влияет на поведенческие реакции [Bliss, Lote, 1982]. Клетки, продуцирующие ПРЛ (лактотрофы), чувствительны к целому ряду пептидов и низкомолекулярных трансмиттеров [Freeman et al.,, 2000]. Стимулирующее действие на секрецию ПРЛ оказывают серотонин, вазопрессин, ангиотензин II и ряд других нейропептидов (субстанция Р, галанин, нейротензин, холецистокинин, эндотелины). Ингибиторный гипоталамический контроль секреции ПРЛ осуществляется посредством ДА, гаммааминомасляной кислоты и, возможно, ацетилхолина [Mogg, Samson, 1990; Flores et al., 1992]. Наиболее физиологически значимым фактором, влияющим на секрецию ПРЛ, является ДА. 38 1.4.1 Гипоталамо-гипофизарная дофаминергическая система Гипоталамо-гипофизарная система - объединение структур гипофиза и гипоталамуса, которое играет важную роль в регуляции эндокринных желез и поддержании гомеостаза. Гипоталамо-гипофизарная система состоит из ножки гипофиза, начинающейся в вентромедиальной области гипоталамуса, и трѐх долей гипофиза: аденогипофиз (передняя доля), нейрогипофиз (задняя доля) и промежуточная доля гипофиза. Работа всех трѐх долей управляется гипоталамусом [Amar, Weiss, 2003]. Согласно данным анатомических и функциональных исследований было выделено две гипоталамические ДА-ергические системы, которые регулируют секрецию ПРЛ: тубероинфундибулярная и туберогипофизарная системы. Тела нейронов туберогипофизарной системы локализованы в перивентрикулярном ядре гипоталамуса, поэтому данную систему также принято называть перивентрикулярногипофизарной ДА-ергической системой. Нейроны данной области проецируют свои отростки в промежуточную и заднюю долю гипофиза [Kawano, Daikoku, 1987; Goudreau et al., 1995]. Нейроны ТИДАС играют ключевую роль в регуляции секреции ПРЛ. Их тела локализованы в аркуатном ядре гипоталамуса и имеют довольно короткие отростки, которые оканчиваются в наружной зоне срединного возвышения близ первичного сплетения капилляров портальной системы циркуляции, откуда ДА поступает в переднюю долю гипофиза [BenJonathan, Hnasko, 2001]. 1.4.2. Развитие гипофиза в онтогенезе 1.4.2.1 Общая структурно-функциональная характеристика гипофиза Передняя доля гипофиза состоит из железистого эпителия, в котором выделяют три типа клеток, различающихся по способности окрашиваться кислыми и основными красками: хромофобные, эозинофильные и базофильные клетки. Хромофобные клетки – резервный материал, из которого развиваются эозинофильные и базофильные клетки. Средняя доля гипофиза состоит из эпителиальной ткани. Задняя доля гипофиза образована нейроглией, в которой содержатся большие пирамидальные или веретенообразные клетки – питуициты [Amar, Weiss, 2003]. Большая часть гормонов передней доли гипофиза выполняет роль специфических регуляторов других эндокринных желез. Это так называемые тропные гормоны гипофиза: 39 Тиреотропный гормон (ТТГ) — главный регулятор биосинтеза и секреции гормонов щитовидной железы. Адренокортикотропный гормон (АКТГ) — стимулирует кору надпочечников. Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) — способствует созреванию фолликулов в яичниках, симуляция пролиферации эндометрия. Лютеинизирующий гормон (ЛГ) — вызывает овуляцию и образование жѐлтого тела. Соматотропный гормон (СТГ) — важнейший стимулятор синтеза белка в клетках, образования глюкозы и распада жиров, а также роста организма. Лютеотропный гормон (пролактин) — регулирует лактацию, дифференцировку различных тканей, ростовые и обменные процессы, инстинкты заботы о потомстве. Средняя доля гипофиза вырабатывает гормон интермедии, или меланоцитстимулирующий гормон, который регулирует пигментный обмен в покровных тканях [Розен, 1984]. Задняя доля гипофиза – эндокринный орган, аккумулирующий и выделяющий гормоны, синтезируемые в крупноклеточных ядрах переднего гипоталамуса и переходящие по аксонам в заднюю долю гипофиза. К нейрогипофизарным гормонам у млекопитающих относятся: вазопрессин, регулирующий водный обмен и тонус артериол, а также выполняющий медиаторную функцию в некоторых синапсах гипоталамических нейронов [Brownstein et al., 1980; Lehmann et al., 1990]; окситоцин – гормон, регулирующий родовой акт и секрецию молока грудными железами [Brownstein et al., 1980]. Онтогенез Аденогипофиз развивается из эпителия крыши ротовой полости. На Э6 образуется эпителиальное выпячивание в виде гипофизарного кармана (карман Ратке), из которого вначале формируется железа с внешним типом секреции. Затем проксимальный отдел кармана редуцируется, и аденомер становится обособленной эндокринной железой. Нейрогипофиз образуется из материала инфундибулярной части дна III-го желудочка мозга и имеет нейральное происхождение. Эти две разные по происхождению части вступают в контакт, образуя гипофиз [Dubois, Hemming, 1991; Amar, Weiss, 2003]. Дифференцировка клеток гипофиза из единого предшественника начинается с Э12. Первыми на Э15,5 появляются кортикотрофы, а затем на 1-2 дня позже - меланотрофы. Клетки, секретирующие глипротеиновые гормоны (гонадотрофы и тиреотрофы), начинают определяться между Э17,5-Э18,5. Соматрофы и лактотрофы являются наиболее поздними 40 популяциями. Их впервые выявляют в небольшом количестве на Э18,5. Процентное соотношение различных типов клеток меняется в процессе онтогенеза. Так, кортикотрофы, тиреотрофы и гонадотрофы составляют лишь 10% от общего числа клеток в постнатальном периоде. Процент соматрофов резко возрастает до 40-50% в течение первых трех недель постнатального развития, а затем незначительно снижается. Количество лактотрофов непрерывно возрастает после рождения и у взрослых животных составляет 15% у самцов и 50% у самок [Kioussi et al., 1999; Scully, Rosenfeld, 2002]. 1.4.2.2 Морфофункциональная характеристика лактотрофов в онтогенезе Лактотрофы – эозинофильные клетки, расположенные в передней доле гипофиза. У крыс лактотрофы сосредоточены в вентролатеральном отделе передней доли гипофиза и вдоль ее границы с промежуточной долей [Tougard, Tixier-Vidal, 1988; Scully, Rosenfeld, 2002]. Лактотрофы отличаются наличием хорошо развитого секреторного аппарата, включающего стэки параллельных цистерн эндоплазматического ретикулума и комплекс Гольджи, а также различные по размеру секреторные гранулы. В зависимости от размера секреторных гранул в популяции лактотрофов выделяют три типа клеток: первый тип содержит маленькие (100 нм) сферические гранулы; второй - полиморфные гранулы среднего размера (150-250 нм), третий тип клеток отличается наличием довольно крупных (300-700 нм) плеоморфных гранул. Данные морфологические особенности обусловлены функциональной гетерогенностью различных видов клеток. Так, клетки с маленькими секреторными гранулами интенсивно выделяют ПРЛ, при этом фактически не запасая его. Клетки с большими секреторными гранулами, напротив, содержат большое количество ПРЛ, при этом выделяя его достаточно слабо [Childs, 2006; Takahashi, 1995]. Кроме истинных лактотрофов, т.е. клеток, которые синтезируют только ПРЛ, существуют также клетки, в которых одновременно идет синтез сразу двух гормонов – гормона роста и ПРЛ. Данные клетки были названы мамосоматотрофами. Было показано, что их количество зависит от уровня стероидных гормонов в организме. Считается, что они выполняют резервную функцию [Frawley et al., 1991; Kineman et al., 1991; Porter et al., 1991]. Онтогенез Данные о том, когда происходит появление лактотрофов в онтогенезе, весьма противоречивы. Наиболее раннее обнаружение лактотрофов датируется Э16 [Nemeskeri et al., 1988], однако, ряд исследователей впервые выявляют лактотрофы в передней доле гипофиза в первые дни после рождения [Hoeffler et al., 1985]. Наиболее часто встречаются работы, в 41 которых лактотрофы впервые выявляют в конце эмбрионального периода на Э18-Э21 [Takahashi, 1995]. Период активной пролиферации лактотрофов приходится на первые недели постнатального развития [Takahashi, 1995; Taniguchi et al., 2002]. Дифференцировка лактотрофов в гипофизе идет в рострокаудальном и вентродорсальном направлениях [Nemeskeri, 1988]. Существование региональной разницы в дифференцировке лактотрофов показывает, что есть факторы, которые отвечают за дифференцировку клеток гипофиза. Считается, что нормальная дифференцировка лактотрофов у неонатальных крысят стимулируется материнскими сигналами, поступающими с молоком [Porter et al., 1991]. Такими сигналами могут быть гонадотропин-рилизинг гормон [Baram et al., 1977; Amarant et al., 1982; Smith, Ojeda, 1984], тиреотропин-рилизинг гормон [Štrbák et al., 1980; Heritier, Dubois, 1993], нейротензин [Westrom et al., 1987]; соматотропин-рилизинг гормон [Werner et al., 1988]; соматостатин [Takeyama et al., 1990], эпидермальный фактор роста [Carpenter, 1980], инсулиноподбный фактор роста [Prosser et al., 1991] и др. Считается, что данные сигнальные молекулы могут принимать участие в регуляции экспрессии гена ПРЛ, взаимодействуя с транскрипционным фактором Pit-1 [Takahashi, 1995; Denef, 2003; Scully, Rosenfeld, 2002]. В экспериментах in vitro было показано, что спонтанное выделение ПРЛ начинается одновременно с его синтезом [Khorram et al., 1984; Nemeskeri et al., 1995]. В пренатальном периоде ПРЛ выделяют лишь 5% всех лактотрофов. После рождения число клеток, выделяющих ПРЛ, растет и к П10 достигает 35% [Nemeskeri et al., 1995]. 1.4.3 Гипоталамо-гипофизарная система циркуляции в онтогенезе Кровоснабжение гипофиза осуществляется из верхних и нижних гипофизарных артерий, являющихся ответвлениями внутренней сонной артерии. Верхние гипофизарные артерии вступают в воронку гипоталамуса и, проникая в мозг, разветвляются в первичную гемокапиллярную сеть; эти капилляры собираются в портальные вены, которые направляются по ножке в переднюю долю гипофиза, где снова разветвляются на капилляры, образуя вторичную капиллярную сеть. Нижние гипофизарные артерии снабжают кровью преимущественно заднюю долю. Верхние и нижние гипофизарные артерии анастомозируют друг с другом. Венозный отток происходит в пещеристые и межпещеристые синусы твѐрдой мозговой оболочки [Page, 1986; Fing, 2012] Сосудистая сеть всех компонентов гипофиза образуется из поверхностной сети кровеносных сосудов, охватывающей прозэнцефалический желудочек. Первичные портальные вены появляются на Э13, а васкуляризация передней доли гипофиза видна уже на Э15. Крупные 42 портальные вены появляются на Э16 [Szabo, Csanyi, 1982]. Промежуточная доля гипофиза и срединное возвышение остаются неваскуляризованными на протяжении всего эмбрионального периода [Szabo, Csanyi, 1982]. Несмотря на то, что в ряде работ капилляры на поверхности срединного возвышения обнаруживают еще до рождения, внутреннее сплетение капиллярных петель развивается после рождения и окончательно формируется к концу первой недели постнатального развития [Page, 1986; Glydon, 1957]. Считается, что из-за недоразвития портальной системы циркуляции гипоталамические факторы не оказывают влияния на развитие гипофиза в перинатальном периоде онтогенеза [Chatelain et al. 1976; Watanabe, Daikoku 1976; Gash et al. 1977; Begeot et al. 1981]. 1.4.4 Роль дофамина в регуляции секреции пролактина у взрослых животных и в онтогенезе В конце 1970-х годов впервые было показано, что тоническое ингибирующее влияние ДА на секрецию ПРЛ лактотрофами гипофиза опосредовано через Д2-рецепторы. Существует две изоформы Д2-рецепторов: короткая Д2к и длинная Д2д. Обе изоформы кодируются одним геном и приобретают специфическую структуру в процессе альтернативного сплайсинга. Они имеют аналогичные фармакологические свойства и совместно экспрессируются в одних и тех же клетках, однако, могут быть сопряжены с различными G-белками. Обе изоформы ингибируют аденилатциклазу, а Д2к также участвует в фосфолипазном сигнальном пути. Д2д изоформа является преобладающей [Missale et al., 1998; Ben-Jonathan, Hnasko, 2001]. Несмотря на то, что физиологический эффект ингибиторного воздействия ДА на секрецию ПРЛ описан достаточно давно, точный механизм данного процесса до сих пор обсуждается. Считается, что в течение первых нескольких секунд воздействия ДА вызывает гиперполяризацию клеточной мембраны, что приводит к инактивации кальциевых каналов и снижению уровня внутриклеточного кальция. В результате происходит подавление выделения ПРЛ. Если ДА воздействует на Д2-рецепторы более продолжительный промежуток времени (от нескольких минут до нескольких часов), то происходит подавление активности аденилатциклазы и метаболизма инозитолфосфата, что приводит к подавлению экспрессии гена ПРЛ, а также к изменениям в морфологии клеток. При воздействии ДА продолжительностью более 12 часов происходит подавление пролиферации лактотрофов и уменьшение размеров гипертрофированных лактотрофов [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001; Gregerson et. al., 2001]. 43 Кроме того, в нескольких работах было показано, что низкие концентрации ДА (0,1нМ) способны стимулировать выделение ПРЛ [Denef et al., 1980; Burris, Freeman, 1993]. Однако данный вопрос является весьма спорным и требует дополнительного изучения. Было показано, что Д4-рецепторы также экспрессируются в передней доле гипофиза, однако, их роль до сих пор остается неясной [Van Tol et al., 1992; Missale et al., 1998]. Онтогенез Д2-рецепторы начинают экспрессироваться в гипофизе достаточно рано – на Э16 у крыс [Sales et al., 1989]. Однако ингибирующее влияние ДА на секрецию ПРЛ впервые выявляют лишь на Э20, что может быть связано с достаточно поздней дифференцировкой самих лактотрофов [Melnikova et al., 1998]. 44 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Животные Работа проводилась на самцах крыс линии Вистар на второй день постнатального периода развития (П2) (питомник лабораторных животных «Столбовая» РАМН). День рождения крысят считали первым днем постнатального периода развития. Животные содержались в стандартных условиях вивария при 12-ти часовом световом цикле и свободном доступе к пище и воде. Все манипуляции с животными были проведены в соответствии с протоколом, утвержденным комиссией по биоэтике Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, и находящимся в соответствии с национальными и международными требованиями. Количество животных, использованных в экспериментах, представлено в таблице 1. Таблица 1 - Количество животных, использованных в экспериментах. Эксперименты Животные Возраст Количество Количество пометов животных 3 18 12 60 13 60 Определение влияния ДА на синтез ПРЛ in vitro Органотипическая культура гипофизов П2 Разработка модели хронического выключения синтеза ДА в мозге Определение концентрации КА после подкожного П2 введения 6-ГДА Определение концентрации КА после П2 стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга Оценка морфофункционального состояния медиобазального гипоталамуса при хроническом выключении синтеза ДА в мозге Определение концентрации КА после П2 3 20 3 20 2 10 стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга Определение активности ТГ после П2 стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга Определение количества моно- и биферментных П2 нейронов, синтезирующих ДА в аркуатном ядре 45 после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга Определение влияния ДА, поступающего из мозга в общую систему циркуляции на синтез ПРЛ in vivo Определение содержания ПРЛ после П2 3 20 10 48 стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга Определение содержания мРНК пролактина и Д2- П2 рецепторов после стереотаксического введения 6ГДА в боковые желудочки мозга 2.2. Эксперименты 2.2.1. Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс 2.2.1.1 Подкожное введение нейротоксина В первой серии экспериментов использовали 60 животных от 12 пометов. В опыте животным подкожно вводили 100 мкг 6-гидроксидофамина (6-ГДА) (Sigma, США) – специфического нейротоксина катехоламинергических нейронов. Для того, чтобы вызвать избирательную гибель только ДА-ергических нейронов и сохранить норадренергические, за 30 минут до введения 6-ГДА подкожно вводили 25 мг/кг десметилимипромина (ДМИ) (Sigma, США) – ингибитора обратного захвата норадреналина, а следовательно, и 6-ГДА в норадренергические нейроны. Контрольным животным вместо 6-ГДА вводили 0,9% NaCl (Sigma, США). Сбор материала осуществляли через 72 или 96 часов после инъекции (Рис. 1). 2.2.1.2 Стереотаксическое введение нейротоксина в боковые желудочки мозга В данном эксперименте было использовано 78 животных от 15 пометов. В опыте (40 животных) в боковые желудочки мозга однократно вводили 100 мкг 6-ГДА в 2 мкл 0,9% NaCl с 0,1% аскорбиновой кислотой; контрольным животным (38 животных) вводили 2 мкл 0.9% NaCl с 0,1% аскорбиновой кислотой. Для этого крысам под эфирным наркозом делали надрез на коже черепа (0,8-1 см) и латерально от брегмы вырезали окошко 2 х 2 мм в черепной коробке. Затем животных помещали в стереотаксический прибор (Narishige Group, Япония), адаптированный для молодых животных, и вводили стеклянную микроканюлю (диаметр 50 46 мкм), содержащую раствор для инъекции и соединенную тефлоновой трубкой с микрошприцом Hamilton (―Hamilton Company‖, США), в латеральный желудочек мозга по координатам 1.2 мм латерально от брегмы, 2.0-2.5 мм вглубь мозга [Ugrumov, Mitskevich, 1980]. За 30 минут до стереотаксических инъекций всем животным подкожно вводили 25 мг/кг ДМИ. Сбор материала осуществляли через 72 или 96 часов после инъекции (рисунок 8). Рисунок 8 - Схема разработки модели хронического выключения синтеза ДА в мозге неонатальных крыс 2.2.1.3 Определение активности тирозигидроксилазы Для определения активности ТГ через 72 часа после стереотаксической инъекции 6-ГДА за 30 минут до начала сбора всем животным в опыте и контроле внутрибрюшинно вводили ингибитор ДАА – 3-дигидроксибензилгидразин (NSD-1015, Sigma, США) в концентрации 100 мг/кг веса тела [Carlsson, 1973]. В собранных образцах активность ТГ оценивали по накоплению L-DOPA, измеренного с помощью ВЭЖХ (методику см. в разделе II.4) 47 2.2.1.4 Влияние дофамина на синтез пролактина in vitro Органотипическая культура Крыс декапитировали, головы помещали в стерильный раствор PBS (0,02 М, рН 7,2-7,4) c антибиотиком (Antibiotic Antimycotic Solution (100 x), Sigma, США), промывали 2 раза. Затем выделяли гипофиз, отделяя при этом переднюю долю гипофиза от задней и туберальной долей. Переднюю долю гипофиза (далее – гипофиз) делили пополам и помещали в стерильную среду (500 мкл) DMEM F12 (Sigma, США) - по 3 половинки от двух животных в одну пробирку. Все манипуляции проводили на льду. Перед посадкой культуры ткань осаждали центрифугированием (5-10 сек), среду отбирали и заменяли на новую. Гипофизы переносили в лунки 24 луночного планшета (Corning, США) и помещали на сеточки для клеточных культур Millicell (0,4 мкм, 12 мм) (Millipore, США). В каждую лунку добавляли по 1 мл среды. Ткань культивировали в течение 18-20 часов в СО2 –инкубаторе (5% СО2) при 37 ºС. Все манипуляции проводили в стерильных условиях. Ткань гипофиза инкубировали в течение 8 часов. В опыте каждые 2 часа заменяли среду на свежеприготовленную (500 мкл), содержащую ДА (Sigma, США) в концентрации 1,5 нг/мл и аскорбиновую кислоту (0,13 мМ) (Sigma, США). В контроле среду заменяли на свежую без ДА. Для доказательства специфичности действия ДА на гипофиз в среду наряду с ДА добавляли галоперидол, ингибитор рецепторов ДА (0,1 нМ) (Sigma, США). Отобранные образцы среды замораживали и хранили при -70 ºС. По окончании эксперимента ткань взвешивали и также замораживали при -70 ºС. ДА или ДА или 0.9%NaCl 0.9%NaCl Посадка культуры 18-20 ч. 2 ч. ДА или ДА или 0.9%NaCl 0.9%NaCl инк. среда 2 ч. 2 ч. 2 ч. инк. среда инк. среда инк. среда, ткань ИФА Рисунок 9 - Схема инкубации органотипической культуры гипофизов крыс на П2 с экзогенным ДА в концентрации 1,5 нг/мл; в контроле в среду добавляли 0.9% NaCl 48 Для оценки выживаемости клеток в конце экспериментов по одному фрагменту ткани из опытной и контрольной групп диспергировали в 200 мкл среды EBSS (1X) (Gibco), окрашивали трипановым синим (0,04 %) и подсчитывали количество живых (неокрашенных) и мѐртвых (окрашенных) клеток в камере Горяева в 5 больших квадратах по диагонали. Затем вычисляли процент живых клеток. 2.3 Взятие и обработка материала При разработке модели хронического выключения синтеза ДА в мозге у крыс после подкожных и стереотаксических инъекций 6-ГДА под наркозом (хлорал гидрат, 400мг/кг) (Sigma, США) собирали кровь из сердца, выделяли мозг (стриатум, медиобазальный гипоталамус, средний мозг и ствол) и периферические органы (почки, ростральную часть двенадцатиперстной кишки и желудок). На пробу приходился материал от одного животного. Отделы мозга выделяли согласно Рисунку 10. стр – стриатум, пк – передняя комиссура, г – медиобазальный гипоталамус, нг – ножка гипофиза, см – средний мозг, ств – ствол мозга Рисунок 10 - Схема выделения структур мозга после введения нейротоксина Для определения ДА кровь переносили в пробирку, содержащую 30 мкл 5% раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (Sigma, США) и 10 мкл 10% раствора метабисульфита натрия (Sigma, США). Затем отделяли плазму от форменных элементов центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут и добавляли в нее 250 пмоль/мл 3,4- 49 дигидроксибензиламин гидробромида (ДГБА) – внутренний стандарт (Sigma, США) в 0,1 н HClO4 (Sigma, США). Для освобождения от высокомолекулярных белков плазму центрифугировали при 14000 об/мин 20 минут, переносили в эппендорф и хранили при -70 °С до определения катехоламинов и метаболитов. Перед определением ДА и его метаболиты осаждали на оксиде алюминия, элюировали 0,2 н HClO4 и центрифугировали при 4000 об/мин. Выделенные области мозга и периферические органы гомогенизировали в 10 объемах 0,1 н HClO4 с содержанием ДГБА 250 пмоль/мл при помощи ультразвукового гомогенизатора (Labsonic M, Sartorius, Франция), центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 20 минут и в полученном супернатанте определяли ДА и его метаболиты. Для определения активности ТГ у крыс после стереотаксической инъекции выделяли медиобазальный гипоталамус и остальную часть мозга. Пробы до определения уровня L-ДОФА хранили в кельвинаторе при -70°С. Для оценки количества моно- и биферментных нейронов в аркуатном ядре методом иммуногистохии у крыс после стереотаксической инъекции 6-ГДА проводили транскардиальную перфузию сначала 0.02 М ФСБ (рН = 7,2-7,4) в течение 10-15 минут, а затем охлажденным (до +4°С) 4% параформальдегидом на 0.2 М фосфатном буфере (рН=7,3) в течение 15 мин. Затем выделяли мозг и проводили постфиксацию также в 4% параформальдегиде в течение 12 часов при +4°C. После этого мозг промывали в 0,02 М ФСБ 3 раза по 15 минут, инкубировали в 20% сахарозе в течение 24 часов при +4°С и замораживали в гексане при -40°С. До проведения иммуногистохимии образцы хранили в кельвинаторе при 70 °С. Для определения ПРЛ в плазме крови у животных под наркозом (хлорал гидрат, 400 мг/кг) собирали кровь из сердца, а затем центрифугировали при скорости 7000 об/мин в течение 20 минут при температуре +4°С. В полученном супернатанте определяли ПРЛ методом иммуноферментного анализа (ИФА). Для определения ПРЛ в ткани гипофизов проводили предварительную экстракцию гормона. Для этого выделенные гипофизы гомогенизировали при помощи ультразвукового гомогенизатора в 0.05 M карбонатно - бикарбонатном буфере (рН 10.0), после чего в течение часа проходила экстракция ПРЛ. Затем образцы центрифугировали 30 минут при температуре +4 °С и скорости 5000 об/мин и отбирали полученный супернатант. После нейтрализации супернатанта с помощью 0.01 н HCl проводили измерение ПРЛ. Для определения содержания мРНК ПРЛ и Д2-рецепторов у крыс после стереотаксических инъекций выделяли переднюю долю гипофиза. На пробу приходился материал от трех животных. До выделения РНК образцы хранили в кельвинаторе при -70°С. 50 2.4. Методы 2.4.1 Высокоэффективная жидкостная хроматография Измерение катехоламинов и метаболитов в осажденной плазме крови и в полученных супернатантах ткани мозга и периферических органов проводили при помощи обратно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (Amperometric detector LC 4B, Bioanalytical Systems, США) при потенциале 850 мВ. Пробы вводили в инжектор (Rheodyne 7125,США) с петлей объемом 20 мкл. Разделение производили на 10-ти сантиметровой колонке с внутренним диаметром 4 мм и наполнителем С-18, 3.3 мкм (Dr. Maisch GmbH, Германия). Подвижной фазой служил 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, содержащий 0.3 мМ октансульфоната натрия (Sigma), 0.1 мМ ЭДТА (Sigma) и 8% ацетонитрила (Sigma) (pH 2,8). Скорость потока 0,7 мл/мин обеспечивалась насосом (Gilson 307, Франция). Пики катехоламинов и метаболитов идентифицировали, ориентируясь на время выхода веществ в стандарте. Содержание рассчитывали методом внутреннего стандарта с помощью программы ―Мультихром‖ (Россия), используя отношение площадей пиков в стандартной смеси и в образце: (1) СКАпр – концентрация ДА в пробе, SКАпр – площадь пика КА в пробе, SДГБАпр – площадь пика ДГБА в пробе, SДГБАст – площадь пика ДГБА в стандарте, SКАст – площадь пика КА в стандарте, СДГБАпр – концентрация ДГБА в пробе. 2.3.2 Иммуногистохимия ТГ и ДАА выявляли на срезах медиобазального гипоталамуса толщиной 20 мкм, приготовленных на криостате и монтированных на стекла. Срезы последовательно инкубировали с: (а) 3% бычьим сывороточным альбумином (Sigma, США) и 0.3% Triton Х-100 (Sigma, США) на 0.02 М ФСБ в течение 30 минут при +20°С; (б) 1% лаурилсульфатом натрия (SDS, Sigma, США) на 0.02 М ФСБ в течение 3-х минут при +20°С; (в) поликлональными антителами овцы к ТГ (1:700) (Chemicon, США) и поликлональными кроличьими антителами к ДАА (1:300) (Abcam, США) на 0.02 М ФСБ, 51 содержащем 1% бычий сывороточный альбумин и 0.1% Triton Х-100 в течение 24 часов при +20°С; (г) с FITC-конъюгированными антителами осла против гамма-глобулинов овцы (1:40) (FITC antisheep, Sigma, США), и Су3-конъюгированными антителами козы против гаммаглобулинов кролика (1:500) (CY3 antirabbit, Sigma, США) на 0.02 М ФСБ в течение 2-х часов при +20°С. После каждой инкубации, кроме последней, срезы отмывали в 0.02 М ФСБ в течение 15 минут. После последней инкубации срезы промывали в 0.02 М ФСБ в течение часа, а затем заключали в гидрофильную среду Mowiol (Calbiochem, Germany). Срезы гипоталамуса после двойного мечения на ТГ и ДАА были исследованы с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Observer Z1, который был оснащен фильтрами для FITC (для ТГ), Cy3 (для ДАА), с использованием программного обеспечения AxioVision 4.8. 2.4.3 Иммуноферментный анализ Измерение ПРЛ в ткани передней доли гипофиза, образцах плазмы и инкубационной среды проводили с помощью метода иммуноферментного анализа, c использованием коммерческих наборов SPIbio-Rat Prolactin EIA Kit (Bertin Pharma, France). 2. 3.4 Обратная транскрипция и ПЦР в реальном времени Выделение тотальной РНК проводили гуанидин-изотиоцианатным методом. Пробы гомогенизировали пестиком в 1 мл TRI Reagent (Sigma, США), добавляли 200 мкл 1-бром-3хлорпропанола (Sigma, США), инкубировали 10 мин при комнатной температуре и периодическом вортексировании и центрифугировали при 14000 g в течение 20 мин. Верхнюю водную фазу отбирали, добавляли 500 мкл изопропанола (Sigma, США), инкубировали 5 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 14000 g в течение 15 мин. Осажденную РНК отмывали 70% этанолом, высушивали на воздухе и растворяли в воде (Water RNAse free, Fermentas, США). Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре Nanodrop 8000 (Thermo Scientific, США). Обработка РНК ДНКазой. Для удаления примеси геномной ДНК выделенную РНК обрабатывали ДНКазой (Fermentas, США) при 37ºC в течение 30 мин в реакционной смеси, 52 содержащей РНК, 1Х буфер (10 мМ Tris-HCl, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мМ CaCl2, pH 7,5), ингибитор РНКаз RiboLock (1 ЕА/мкл) (Fermentas, США), ДНКазу I (1 ЕА на 1 мкг РНК) (Fermentas, США). Реакцию останавливали добавлением EDTA (до концентрации 5 мМ) (Fermentas, США) и прогреванием при 70ºC в течение 5 минут. Переосаждение РНК этанолом. РНК переосаждали добавлением хлорида лития (до концентрации 300 мМ) (Sigma, США) и этанола (до объемной концентрации 70%), инкубацией в –20 ºC в течение как минимум 2 ч и последующим центрифугированием при 14000 g в течение 20 мин. Осадок РНК отмывали в 70% этаноле, высушивали на воздухе и растворяли в воде. Обратная транскрипция. Синтез кДНК проводили в реакционной смеси, содержащей РНК, 1Х буфер (70 мМ Tris-HCl, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 7,5 мМ MgCl2, pH 8,3), рандомные гексануклеотиды (10 мкМ), смесь нуклеотидтрифосфатов (0,4 мМ каждого), ингибитор РНКаз RiboLock (1 ЕА/мкл) и обратную транскриптазу M-MLV (100 ЕА на 1 мкг РНК) (Fermentas, США); смесь инкубировали 10 мин при комнатной температуре, 30 мин при 37ºC и 1,5 ч при 42ºC. Реакцию останавливали прогреванием при 70ºC в течение 5 мин. ПЦР в реальном времени проводили в коммерческой реакционной смеси, содержащей 1Х буфер (KCl, Трис-HCl, 2,5 мМ MgCl2, pH 8,8), смесь нуклеотидтрифосфатов, глицерин, Tween 20, интеркалирующий краситель SYBR Green, пассивный референсный краситель ROX, ДНК полимеразу Taq и ингибирующие активность полимеразы антитела, к которой добавляли кДНК и специфические олигонуклеотиды (0,2 мкМ каждого) (Fermentas, США). ПЦР проводили на автоматическом амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) по следующей схеме: 2 мин при 50ºC; предварительная денатурация и активация полимеразы 10 мин при 95ºC; 40 циклов амплификации: денатурация 15 с при 95ºC; элонгация 1 мин при 60ºC; диссоциация для построения кривой плавления. Накопление продукта ПЦР регистрировали на стадии элонгации по флуоресценции интеркалирующего красителя SYBR Green, нормированной по флуоресценции пассивного референсного красителя ROX. Обработку результатов проводили с помощью программы 7500 Software (Applied Biosystems, США). Отсутствие праймер-димеров оценивали по кривым плавления. Расчет относительной экспрессии гена проводили методом ΔΔCt с учетом эффективности ПЦР [Bookout et al., 2005]. Эффективность ПЦР определяли методом построения стандартных кривых [Bookout et al., 2005]. 53 2.4 Статистическая обработка результатов Статистическую обработку данных выполняли в среде интегрированных программ GraphPad Prism Version 6.0 для Windows (GraphPad Software, США). Данные представлены в виде: среднее арифметическое ± средняя ошибка среднего арифметического (M±m). Для определения статистической значимости полученных результатов были использованы параметрический t-критерий Стьюдента (t-тест) и непараметрический U-критерий МаннаУитни (U- тест) 54 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ 3.1. Определение влияния дофамина на синтез пролактина in vitro 3.1.1 Концентрация и содержание пролактина в среде и гипофизе в ходе оценки влияния дофамина на синтез пролактина in vitro Инкубация гипофизов неонатальных крыс с ДА в концентрации 1,5 нг/мл приводила к достоверному снижению концентрации ПРЛ в культуральной среде уже через 2 часа после начала инкубации по сравнению с контролем, которое сохранялось на протяжении 8 часов (рисунок 11). Концентрация ПРЛ в ткани гипофиза, а также суммарное содержание ПРЛ в среде и ткани после 8 часов инкубации также достоверно снижались (рисунок 12). * * * * * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, U-тест) Рисунок 11 - Концентрация пролактина в культуральной среде в течение 8 часов инкубации гипофизов в среде DMEM F12, содержащей экзогенный дофамин в концентрации 1,5 нг/мл; в контроле гипофизы инкубировали в среде без дофамина 55 DMEM F12 ДА 1.5 нг/мл Б А * * * - достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05; U-тест) Рисунок 12 - Концентрация пролактина в гипофизе (А) и суммарное содержание пролактина в ткани гипофиза и среде (Б) через 8 часов инкубации в DMEM F12 с дофамином в концентрации 1,5 нг/мл; в контроле гипофизы инкубировали в среде без дофамина 3.1.2 Концентрация и содержание пролактина в среде и гипофизе в ходе оценки специфичности влияния дофамина на синтез пролактина in vitro Инкубация органотипической культуры гипофизов в среде, содержащей 1,5 нг/мл ДA и 0,1нМ галоперидола, приводила к увеличению концентрации пролактина в культуральной среде по сравнению с контролем, которое сохранялось на протяжении 8 часов (рисунок 13). В качестве контроля в данной серии экспериментов использовали органотипическую культуру гипофиза, которую инкубировали в среде, содержащей 1,5 нг/мл ДА. Концентрация ПРЛ в ткани гипофизов, а также суммарное содержание ПРЛ в среде и ткани после 8 часов инкубации также достоверно увеличивались (рисунок 14). 56 * * * * * - достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05; U-тест) Рисунок 13 - Концентрация пролактина в культуральной среде в течение 8 часов инкубации гипофизов в среде с 1,5 нг/мл дофамина и 0,1 нМ галоперидола; в контроле гипофизы инкубировали в среде с 1,5 нг/мл дофамина ДА А ДА+галоперидол Б * * * - достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05; U-тест). Рисунок 14 - Концентрация пролактина в гипофизе (А) и суммарное содержание пролактина в ткани гипофиза и среде (Б) через 8 часов инкубации с 1,5 нг/мл дофамина и 0,1 нМ галоперидола; в контроле гипофизы инкубировали в среде с 1,5 нг/мл дофамина 57 3.2. Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге крыс на П2 3.2.1 Концентрация ДА и его метаболитов в мозге, плазме крови, двенадцатиперстной кишке, желудке и почках после подкожного введения 6-ГДА Через 96 и 72 часа после подкожного введения 25 мг/кг ДМИ и 100 мкг 6-ГДА не происходило достоверных изменений в концентрации ДА, ДОФУК и норадреналина ни в периферических органах, ни в одной из изученных областей мозга, ни в плазме крови по сравнению с контролем (рисунок 15, 16, 17, 18; таблица 2). ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин Рисунок 15 - Концентрация дофамина в различных областях мозга через 96 часов после подкожного введения 25 мг/кг ДМИ и 100 мкг 6-ГДА; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl 58 ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА Б А ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин Рисунок 16 - Концентрация дофамина в периферических органах (А) и плазме крови (Б) через 96 часов после подкожного введения 25 мг/кг ДМИ и 100 мкг 6-ГДА; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин Рисунок 17 - Концентрация дофамина в различных областях мозга через 72 часа после подкожного введения 25 мг/кг ДМИ и 100 мкг 6-ГДА; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl 59 ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА А Б ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин Рисунок 18 - Концентрация дофамина в периферических органах (А) и плазме крови (Б) через 72 часа после подкожного введения 25 мг/кг ДМИ и 100 мкг 6-ГДА; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl 60 Таблица 2 - Концентрация дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и норадреналина в различных областях мозга, периферических органах и плазме крови через 96 и 72 часа после подкожного введения 25 мг/кг ДМИ и 100 мкг 6-ГДА Группа Стриатум Гипоталамус Средний мозг Ствол Почки Двенадцатиперстная кишка Желудок Плазма Норадреналин (нг/г) 0,9% NaCl/ 96 или 72 ч.@ 6-ГДА/96ч. 259.1±36.4 295.1±22.3 316.1±37.1 142.1±16.7 106.6±11.3 436.6±45.1 240.8±24.9 2.0±0.25 242.6±26.4 301.8±33.8 309.2±32.7 149.5±16.4 112.8±12.5 415.9±48.3 215.6±23.1 2.3±0.24 6-ГДА/72ч. 222.3±28.7 282.70±27.6 306.4±30.5 154.9±14.2 100.2±10.9 470.3±49.2 225.2±26.1 2.1±0.22 ДОФУК (нг/г) 0,9% NaCl/ 96 или 72 ч.@ 6-ГДА/96ч. 192.9±14.2 47.3±7.2 315.3±38.8 46.6±6.2 7.1±1.1 4.2±0.58 1.5±0.19 0.44±0.06 219.5±25.3 51.8±5.4 292.2±33.1 44.1±4.2 6.3±0.8 4.4±0.51 1.2±0.22 0.5±0.06 6-ГДА/72ч. 208.2±11.3 49.8±6.1 269.2±23.2 39.7±4.8 8.2±0.9 5.0±0.65 1.7±0.29 0.38±0.05 @ Концентрации норадреналина и ДОФУК были сопоставимы в контроле через 96 и 72 часа после инъекции 0,9% NaCl 61 3.2.2 Концентрация дофамина и его метаболитов в мозге, плазме крови, двенадцатиперстной кишке, желудке, почках и надпочечниках после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 Через 96 часов после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга в стриатуме концентрация ДА снижалась на 93%, в среднем мозге на 33%, а в стволе на 46%. При этом концентрация ДА в гипоталамусе не менялась по сравнению с контролем (рисунок 19). Снижение концентрации ДОФУК коррелировало со снижением концентрации ДА и составило в стриатуме 86%, в среднем мозге 31%, в стволе 23%. Уровень ДОФУК в гипоталамусе не менялся по сравнению с контролем (таблица 3). Концентрация норадреналина незначительно снижалась в стриатуме, гипоталамусе и среднем мозге, в то время как в стволе не менялась по сравнению с контролем (таблица 3). В желудке, двенадцатиперстной кишке и плазме крови концентрация ДА, норадреналина и ДОФУК не менялась по сравнению с контролем (рисунок 20; таблица 3). В надпочечниках концентрация ДА увеличилась на 35%, а концентрация норадреналина на 30% по сравнению с контролем (рисунок 20). При этом концентрация ДОФУК была на уровне контроля (таблица 3). ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА * * * * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, Т-тест) ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин Рисунок 19 - Концентрация дофамина в различных областях мозга через 96 часов после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне подкожного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl 62 А ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА В Б * ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, Т-тест) Рисунок 20 - Концентрация дофамина в желудке, почках, двенадцатиперстной кишке (А), надпочечниках (Б) и плазме крови (В) через 96 часов после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне подкожного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl Через 72 часа после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА крысам на П2 в боковые желудочки мозга концентрация ДА в мозге снижалась на 54%, а в плазме крови на 73%. В периферических органах концентрация ДА не менялась по сравнению с контролем (Рис. 11). Концентрация ДОФУК в мозге снизилась на 45%, а в плазме крови и периферических органах не менялась по сравнению с контролем (таблица 2). Концентрации норадреналина в мозге снижалась незначительно, а в плазме крови и периферических органах оставалась неизменной (таблица. 2). 63 Б А В * * ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА Г ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, Т-тест) Рисунок 21 - Концентрация дофамина в мозге (А), плазме крови (Б), надпочечниках (В), желудке, почках и двенадцатиперстной кишке (Г) через 72 часа после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне подкожного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl 64 Таблица 3 - Концентрация дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и норадреналина в различных областях мозга, периферических органах и плазме крови через 96 и 72 часа после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 на фоне 25 мг/кг ДМИ Группа Мозг Стриатум Гипоталамус Средний мозг Ствол Почки Двенадцати перстная кишка Желудок Надпочечни ки Плазма 136.1±14.2 (х103) 177.1±17.6* (х103) 144.2±15.8 (х103) 3.79±0.4 Норадреналин, нг/г 0,9% NaCl/ 96 или 72 ч.@ 6-ГДА/96ч. 6-ГДА/72ч. 171.7±17.5 138.7±28.7 307.7±16.9 262.6±31.7 170.3±17.8 92.1±9.3 496.3±50.2 270.4±27.1 Не определяли 124.1±12.1* 77.8±10.1* 246.9±15,5* 194.4±32.7* 153.3±19.4 92.9±10.3 455.6±49.7 245.3±26.4 96.4±10.1 485.1±52.3 225.2±24.5 Не определяли 3.4±0.4 3.2±0.3 ДОФУК, нг/г 0,9% NaCl/ 96 или 72 ч.@ 6-ГДА/96ч. 6-ГДА/72ч. @- 58.6±5.2 143.4±15.8 34.8±4.2 251.7±26.4 32.3±3.8 8.3±1.5 5.4±0.6 2.3±0.2 159.4±16.9 0.22±0.03 Не определяли 32.9±2.9* 19.3±2.4* 31.7±2.7 174.6±21.8* 24.7±4.5* 8.9±1.2 5.7±0.6 1.9±0.2 169.7±18.5 0.30±0.03 7.9±1.0 5.2±0.7 2.4±0.3 171.4±19.2 0.27±0.03 Не определяли концентрации норадреналина и ДОФУК были сопоставимы в контроле через 96 и 72 часа после инъекции 0,9% NaCl * - достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05; Т-тест) 65 3.3. Оценка морфофункционального состояния медиобазального гипоталамуса при хроническом выключении синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс 3.3.1 Концентрация ДА в гипоталамусе, стриатуме, среднем мозге, стволе и остальной части мозга после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 Через 72 часа после введения 6-ГДА концентрация ДА в стриатуме снижалась на 92%, в среднем мозге на 40%, в стволе на 44%. В то же время, в гипоталамусе концентрация ДА не менялась по сравнению с контролем. В остальной части мозга уровень ДА падал на 62% (рисунок 22). Концентрация ДОФУК так же достоверно снижалась во всех рассматриваемых областях мозга, за исключением гипоталамуса (таблица 4). Концентрация норадреналина незначительно снижалась в стриатуме, гипоталамусе и среднем мозге, в то время как в стволе не было выявлено достоверных изменений (таблица 4). ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА * * * * ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, Т-тест) Рисунок 22 - Концентрация дофамина в различных областях мозга через 72 часа после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне подкожного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl 66 Таблица 4 - Концентрация дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК) и норадреналина в различных областях мозга 72 часа после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 на фоне 25 мг/кг ДМИ Группа Стриатум Гипоталамус Средний мозг Ствол Ост. часть мозга Норадреналин, нг/г 0,9% NaCl 201.4±20.5 279.3±30.4 253.8±28.4 164.3±17.1 145.4±15.3 6-ГДА 172.6±19.2* 221.5±22.5* 181.4±19.7* 137.5±12.4 97.1±10.6* ДОФУК, нг/г 0,9% NaCl 146.1±15.2 43.8±5.2 219.8±22.6 39.3±4.3 92.9±11.2 6-ГДА 22.3±3.1* 52.6±6.4 153.1±15.8* 31.8±4.0 64.4±6.1* * - достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05; Т-тест) 3.3.2 Определение активности тирозингидроксилазы после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 Активность ТГ оценивали по уровню накопления L-ДОФА после введения ингибитора ДАА – NSD 1015. В гипоталамусе концентрация L-ДОФА не менялась по сравнению с контролем, в то время как в остальной части мозга наблюдалось ее достоверное снижение (рисунок 23). ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА * ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, Т-тест) Рисунок 23 - Активность тирозингидроксилазы, оцениваемая по накоплению дигидроксифенилаланина (L-ДОФА) через 30 минут после введения м-гидроксибензилгидразина, в гипоталамусе и остальной части мозга на модели хронического ингибирования синтеза дофамина в мозге с помощью 6-ГДА 67 3.3.3 Определение количества моно- и биферментных нейронов, синтезирующих дофамин в аркуатном ядре после стереотаксического введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга крысам на П2 Через 72 часа после введения 6-ГДА в аркуатном ядре количество моноферментных ТГ+ДАА-, моноферментных ТГ-ДАА+ и биферментных ТГ+ДАА+ нейронов не менялось по сравнению с контролем (рисунок 24). ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин Рисунок 24 - Количество моноферментных ТГ+ДАА-, моноферментных ТГ-ДАА+ и биферментных ТГ+ДАА+ нейронов в аркуатном ядре через 72 часа после введения 100 мкг 6ГДА в боковые желудочки мозга на фоне системного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl 3.4. Изучение влияния дофамина, поступающего из мозга в общую систему циркуляции, на синтез пролактина in vivo 3.4.1 Определение содержания пролактина в гипофизе и плазме крови через 72 после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга Через 72 часа после введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки крысам на П2 концентрация пролактина достоверно увеличивалась в плазме крови на 70%, а в гипофизе на 48% (рисунок 25). 68 ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА Б 35 35 30 30 Пролактин, нг/мг Пролактин, нг/мл А 25 20 15 10 * 25 20 * 15 10 5 5 0 0 гипофиз плазма ДМИ – десметилимипромин; 6-ГДА – 6-гидроксидофамин * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, Т-тест) Рисунок 25 - Концентрация пролактина в плазме крови (А) и гипофизе (Б) через 72 часа после введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне системного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl 3.4.2 Определение содержания мРНК пролактина и Д2-рецепторов в гипофизе через 72 после стереотаксического введения 6-ГДА в боковые желудочки мозга. Через 72 часа после введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки крысам на П2 содержание мРНК пролактина в гипофизе увеличилось в 2.5 раза, в то время как содержание мРНК Д2-рецепторов к ДА не менялось по сравнению с контролем (рисунок 26). ДМИ+0.9% NaCl ДМИ+6-ГДА * * - Достоверные различия между контролем и опытом (p<0.05, U-тест) Рисунок 26 - Содержание мРНК пролактина и Д2-рецепторов к дофамину в гипофизе через 72 часа после введения 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга на фоне системного введения 25 мг/кг ДМИ; в контроле вводили 25 мг/кг ДМИ и 0,9% NaCl 69 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ У взрослых животных ДА обеспечивает тонический ингибиторный контроль секреции ПРЛ [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001]. Вопрос о том, когда устанавливается гипоталамический контроль функционирования гипофиза до сих пор остается открытым. С одной стороны, большинство гипоталамических факторов, в том числе и ДА, начинают синтезироваться в мозге млекопитающих достаточно рано (еще до рождения) [Ugrumov et al., 1989; Borisova et al., 1991; Ugrumov et al., 1994] . Фактически одновременно с началом синтеза ДА в мозге в гипофизе появляются Д2-рецепторы к ДА [Sales et al., 1989]. Эти данные дают основание предполагать, что установление гипоталамического дофаминового контроля секреции ПРЛ возможно еще в пренатальном периоде развития. С другой стороны, существует предположение, согласно которому гипоталамические факторы никак не влияют на развитие и функционирование гипофиза в пренатальном периоде, так как внутренне сплетение капиллярных петель срединного возвышения формируется лишь к концу первой недели постнатального развития [Chatelain et al. 1976; Watanabe, Daikoku 1976; Gash et al. 1977; Begeot et al. 1981]. Однако ранее в нашей лаборатории были полученны данные, согласно которым галоперидол, антагонист рецепторов к ДА, повышает уровень ПРЛ в плазме крови впервые на Э20, что свидетельствует о включении дофаминового ингибиторного контроля секреции пролактина в данный период [Melnikova et al., 1998]. Еще одним интересным фактом является то, что в отсутствие ГЭБ, который у крыс для катехоламинов формируется лишь к концу второй недели постнатального развития [Kostrzewa, 2007; Miyaguchi et al., 1999], весь мозг в целом может выделять в общую систему циркуляции физиологически активные вещества и, таким образом, оказывать влияние на развитие и функционирование периферических органов-мишеней [Ugrumov, 2010]. В данной гипотезе, которая была выдвинута в нашей лаборатории, можно выделить два принципиально важных момента: во-первых, мозг в период с момента образования нейронов и начала специфического синтеза физиологически активных веществ может являться их источником в общей системе циркуляции до закрытия ГЭБ; во-вторых, данные вещества, поступающие из мозга в общую систему циркуляции, могут оказывать влияние на развитие и функционирование периферических органов мишеней. На модели кратковременного специфического ингибирования синтеза ДА в мозге неонатальных крыс были получены прямые доказательства того, что мозг является источником ДА в общей системе циркуляции. При этом в периферической крови создается физиологически активная концентрация ДА, сопоставимая с таковой в гипоталамо-гипофизарной портальной системе циркуляции у взрослых животных [Сайфетярова и др. 2011; Ugrumov et al., 2012]. Принимая во внимание данный факт, можно 70 предположить, что дофаминовый контроль секреции ПРЛ в перинатальном периоде онтогенеза может осуществляться как через портальную систему циркуляции нейронами тубероинфундибулярной системы гипоталамуса, так и нейронами других ДА-ергических популяций мозга через общую систему циркуляции. Изучение данного вопроса является очень важным как с точки зрения доказательства второй части нашей гипотезы об эндокринном влиянии развирающегося мозга на периферические органы-мишени, так и с точки зрения понимания процесса становления нейроэндокринной регуляции функционирования гипофиза гипоталамусом. 4.1 Влияние дофамина на синтез пролактина гипофизом неонатальных крыс in vitro Первая часть данной работы посвящена вопросу о том, какое влияние может оказывать ДА на функционирование лактотрофов гипофиза в неонатальном периоде онтогенеза. Считается, что у взрослых животных длительность действия ДА на Д2-рецепторы на лактотрофах обуславливает различные эффекты на секрецию ПРЛ. Так, кратковременное влияние ДА (от нескольких секунд до нескольких минут) приводит к инактивации кальциевых каналов и снижению уровня внутриклеточного кальция, в результате чего происходит ингибирование выделения ПРЛ. Влияние на синтез ПРЛ осуществляется посредством изменения активности аденилатциклазы, что требует значительно большего времени воздействия (по различным данным от нескольких минут до нескольких часов) [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001]. Ранее в нашей лаборатории в экспериментах ex vivo при кратковременной инкубации гипофизов неонатальных крыс в Кребс-Рингер буфере были получены доказательства того, что ДА в той концентрации, в которой он содержится в периферической крови неонатальных крыс, оказывает ингибирующее влияние на выделение ПРЛ из лактотрофов гипофиза [Сайфетярова и др. 2012]. Однако инкубация «переживающих» гипофизов возможна в течение относительно короткого времени, что позволяет судить только о регуляции выделения ПРЛ, но не его синтеза. Поэтому для выяснения возможности влияния ДА на синтез ПРЛ в ходе данной работы использовали органотипическую культуру, что позволило поддерживать жизнеспособность ткани в течение гораздо более длительного времени по сравнению с инкубацией в Кребс-Рингер буфере. В проведенных нами ранее экспериментах было показано, что концентрация ДА в плазме крови 3-дневных крыс, у которых отсутствует ГЭБ, составляет 1,9 нг/мл и снижается до 0,4 нг/мл после специфического ингибирования синтеза ДА в мозге (Сайфетярова и др., 2011, Ugrumov et al., 2012). Следовательно, доля ДА мозгового происхождения составляет 1.5 нг/мл. Именно в этой концентрации добавляли ДА в 71 культуру аденогипофиза в данной работе. Показателем изменения уровня синтеза ПРЛ служило его суммарное содержание в ткани и среде. При использовании такой in vitro модели важно было контролировать, в каком функциональном состоянии находится ткань гипофиза в процессе инкубирования. Для этого мы использовали стандартную методику подсчета живых и мертвых клеток в камере Горяева в ткани гипофизов после инкубации при окрашивании красителем трипановым синим. После содержания ткани гипофизов в условиях in vitro в течение суток количество живых клеток составляло около 70%. Через два часа после начала инкубации органотипической культуры гипофизов с ДА в концентрации 1,5 нг/мл наблюдалось достоверное снижение концентрации ПРЛ в инкубационной среде. Эти данные еще раз подтверждают, что ДА в той концентрации, в которой он содержится в периферической крови неонатальных крыс, оказывает влияние на выделение ПРЛ лактотрофами гипофиза. Через восемь часов после начала инкубации гипофизов двухдневных крыс в культуральной среде, содержащей ДА, суммарное содержание ПРЛ в клетках гипофиза и в среде достоверно уменьшалось по сравнению с контролем, что является доказательством ингибирующего влияния ДА на синтез ПРЛ. Для доказательства специфичности действия ДА, гипофизы культивировали в течение того же времени (8 часов) в среде в присутствии одновременно ДА и галоперидола – ингибитора рецепторов к ДА на лактотрофах гипофиза. При этом суммарное содержание ПРЛ в клетках гипофиза и в среде сохранилось на уровне контроля. Другими словами, галоперидол вызвал «отмену» действия ДА, что доказывает специфичность его ингибирующего влияния на синтез ПРЛ лактотрофами. Несмотря на то, что полученные нами данные о влиянии ДА на синтез ПРЛ являются достаточно убедительными, исследования in vitro, как правило, не дают полной картины физиологических процессов, протекающих в организме. Лактотрофы в условиях in vivo находятся под постоянным тоническим воздействием ДА, при этом в условиях in vitro клетки гипофиза долгое время содержатся в среде без ДА, что, по мнению некоторых ученых, может качественно менять физиологию клетки. Кроме того, в данной серии экспериментов мы оценивали влияние той концентрации ДА, которая поддерживается в периферической крови неонатальных крыс, но при этом до сих пор неизвестно в какой концентрации находится ДА в портальной крови. На данный момент решение этого вопроса представляется методически невыполнимым, так как портальные сосуды неонатальных животных настолько малы, что нет возможности их конюлирования. То есть используемый нами в данной работе подход не дает нам возможности оценить через какую именно систему циркуляции (портальную или общую) идет регуляция секреции ПРЛ. 72 Анализ литературных данных позволил нам предположить, что данную проблему можно решить при хроническом (длительном) ингибировании синтеза ДА в мозге с помощью 6гидроксидофамина (6-ГДА) - специфического нейротоксина КА-ергических нейронов. 6-ГДА является наиболее распространенным нейротоксином, используемым при моделировании дефицита ДА [Kostrzewa, Jacobowitz, 1974; Blum et al., 2001] . Он представляет собой гидроксилированный аналог ДА. Специфичность воздействия 6-ГДА обусловлена тем, что он может поступать в клетку лишь с помощью переносчиков ДА и норадреналина. После попадания в клетку 6-ГДА ингибирует процесс окислительного фосфорилирования в митохондриях, что приводит к ее гибели [Blum et al., 2001]. То есть использование данного нейротоксина позволит нам получить хроническое снижение уровня ДА в мозге неонатальных крыс. Кроме того, в ряде исследований было показано, что ДА-ергические нейроны тубероинфундибулярной системы имеют низкую чувствительность к различным нейротоксинам, в том числе и к 6-ГДА, по сравнению с другими ДА-ергическими нейронами мозга [Yokoyama et al., 1992; Benskey et. al., 2012, 2013]. Поэтому можно ожидать, что при введении в мозг он вызовет дегенерацию ДА-ергических нейронов, расположенных в основном за пределами тубероинфундибулярной системы. В связи с этим данную модель, вероятно, можно будет использовать для дифференцированной оценки влияния ДА, поступающего к гипофизу через общую систему циркуляции, на функционирование лактотрофов у неонатальных животных. 4.2 Разработка модели хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс При разработке модели использовали крыс линии Вистар в неонатальном периоде развития, т.е. до закрытия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Разрабатываемая модель должна была удовлетворять следующим требованиям: синтез ДА должен быть выключен в течение длительного времени (как минимум нескольких суток), причем только в мозге, не затрагивая при этом синтез ДА в периферических органах. В связи с этим нейротоксин вводили стереотаксически в боковые желудочки мозга. Как уже отмечалось ранее, при моделировании мы использовали нейротоксин катехоламинергических нейронов 6-ГДА. Так как 6-ГДА может захватываться как в ДА-ергические, так и в норадренергические нейроны, необходимо было «защитить» норадренергические нейроны от действия токсина. Чтобы вызвать избирательную гибель только ДА-ергических нейронов и сохранить норадренергические, за 30 минут до 73 введения 6-ГДА подкожно вводили ДМИ – ингибитор обратного захвата норадреналина, а следовательно, и 6-ГДА в норадренергические нейроны. Однако в отсутствие ГЭБ при внутрижелудочковом введении нельзя было исключить диффузию нейротоксина в кровь, и, как следствие, его действие на ДА-синтезирующие клетки в периферических органах [Goldstein et al., 1995]. Поэтому в первую очередь необходимо было подобрать такую дозу 6-ГДА, которая бы максимально снижала содержание ДА в мозге, не влияя при этом на его содержание в периферических ДА-синтезирующих органах, экспрессирующих переносчик ДА. В качестве наиболее репрезентативных органов для изучения токсических эффектов 6-ГДА нами были выбраны желудок, двенадцатиперстная кишка и почки. В этих органах ДА синтезируется в достаточно больших количествах, причем как самостоятельный продукт [Goldstein et al., 1995]. Так, в мезентерических органах ДА синтезируется из тирозина с помощью обоих ферментов синтеза (ТГ и ДАА), а в почках из LДОФА с помощью ДАА. Кроме того, важным является тот факт, что в желудке и двенадцатиперстной кишке активно экспрессируется ДАТ [Mezey et al., 1997; Yuemin et al., 2007]. Вопрос об экспрессии ДАТ в почке до сих пор остается спорным, однако, в ней был обнаружен специфический захват и ненейрональные мембранные переносчики ДА (ОКТ1, ОКТ2 и ЕМТ) [Koepsell, 1998; Eisenhofer, 2001; Sugamori et al., 1999; Wu et al., 2000]. Кроме того, ряд исследователей отмечают снижение уровня катехоламинов в данных органах после системного введения животным 6-ГДА. Интересно, что хромаффинная ткань надпочечников не чувствительна к действию 6-ГДА. Даже в условиях in vitro хромаффинные клетки начинают гибнуть лишь под действием высоких (нефизиологических) концентраций токсина (10 -4 - 10-3 М) [Galindo et al., 2003]. В такой концентрации 6-ГДА может оказывать скорее общетоксический эффект на клетки, чем специфический. С учетом того, что в мозговом веществе надпочечников активно экспрессируется мембранный переносчик норадреналина, механизм данной резистентности не очень понятен. Существуют работы, в которых было показано, что токсин МФП+, действие которого аналогично действию 6-ГДА, при попадании в хромаффинные клетки сразу упаковывается в везикулы, поэтому его попадание в митохондрии ограничено, и токсический эффект не наблюдается [Reinhard et al., 1987]. В связи с этим надпочечники были выбраны нами, чтобы оценить возможные компенсаторные процессы, которые могут проявляться при длительном выключении синтеза ДА. В первой серии экспериментов мы проводили подбор максимальной дозы нейротоксина, которая бы при системном введении и поступлении в кровь не влияла на уровень синтеза ДА ни в мозге, ни в периферических органах. Мы предположили, что в дальнейшем при введении данной дозы токсина в боковые желудочки мозга мы получим максимально возможный эффект в мозге, при отсутствии влияния на периферию. Поскольку другими авторами было показано, 74 что доза 100 мкг 6-ГДА при внутрижелудочковом введении в раннем постнатальном периоде приводит к максимальной (до 97%) гибели ДА-ергических нейронов нигростриатной системы [Towle et al., 1989; Yokoyama et al., 1992], в данной работе первоначально оценивали влияние этой дозы на содержание ДА при системном введении. Кроме того, было очень важно подобрать оптимальный интервал времени между введением токсина животным и сбором материала. С одной стороны, этот период должен быть достаточно длительным, чтобы нейротоксин вызвал максимальную дегенерацию нейронов, и чтобы изменение концентрации ДА оказало влияние на синтез ПРЛ. С другой стороны, в ответ на снижение ДА могут включаться различные компенсаторные процессы, которые очень важно свести к минимуму при моделировании. По данным литературы, максимальная гибель ДАергических нейронов в мозге наблюдается через 96 часов после введения нейротоксина [Yokoyama et al., 1992]. Поэтому первоначально мы использовали именно такой промежуток времени. Так как мозг содержит несколько различных ДА-ергических систем с различным уровнем экспрессии мембранного переносчика ДА, а, следовательно, и с различной чувствительностью к нейротоксину, нельзя было исключить возможность нивелирования снижения концентрации ДА при определении его в целом мозге. Поэтому в данной серии экспериментов мы оценивали уровень ДА отдельно по областям мозга, содержащим ДАергические нейроны. Было показано, что при подкожном введении 100 мкг 6-ГДА не происходило изменения концентрации ДА и норадреналина ни в периферических источниках, ни в одной из изученных областей мозга, ни в плазме крови по сравнению с контролем. Совокупность этих данных дала возможность использовать данную дозу для дальнейшего введения в мозг. Введение 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки мозга через 96 часов привело к значительному снижению концентрации ДА в стриатуме, среднем мозге и стволе, в то время как в гипоталамусе никаких изменений выявлено не было. В желудке, двенадцатиперстной кишке и почках концентрация ДА также не изменилась, что свидетельствует о специфическом выключении синтеза ДА в мозге, но не в периферических органах. Однако, вопреки нашим ожиданиям, концентрация ДА в плазме крови не изменилась по сравнению с контролем. При этом в надпочечниках наблюдалось ее достоверное увеличение. Согласно литературным данным, хромаффинные клетки надпочечников экспрессируют Д2-рецепторы к ДА. Считается, что ДА таким образом влияет на проводимость кальциевых каналов, и, соответственно, на выделение КА [Bigornia et al., 1988; Kujacic et al., 1990]. В связи с этим мы предположили, что длительное снижение ДА в плазме крови могло привести к усилению секреции ДА надпочечниками через 96 часов. 75 Для того чтобы избежать влияния компенсаторных процессов на уровень ДА в плазме, в следующей серии экспериментов мы сократили время воздействия нейротоксина на организм до 72 часов. При стереотаксическом введении 100 мкг 6-ГДА в боковые желудочки концентрацию ДА определяли в целом мозге, чтобы сопоставить изменения концентраций ДА в мозге и плазме крови. Через 72 часа после введения 6-ГДА было показано снижение концентрации ДА в мозге на 54 %. При этом в плазме крови наблюдалось резкое (на 73%) снижение уровня ДА. Таким образом, нам удалось свести компенсаторные процессы в организме к минимуму и показать, что мозг играет ведущую роль в формировании физиологически активной концентрации ДА в крови. В почках, желудке и двенадцатиперстной кишке и надпочечниках после введения нейротоксина не произошло достоверных изменений концентрации ДА. Концентрация норадреналина в мозге снижалась незначительно, а в плазме крови и периферических органах оставалась неизменной, что говорит о нейроспецифичности разработанной модели. 4.3 Оценка морфофункционального состояния тубероинфундибулярной системы гипоталамуса при моделировании хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс Следующей задачей данной работы являлось изучение на разработанной модели морфофункционального состояния ДА-ергических нейронов в туберо-инфундибулярной системе, а, следовательно, возможности ее дальнейшего использования для дифференциальной оценки дофаминовой регуляции секреторной активности лактотрофов гипофиза через портальную и общую систему циркуляции. В отличие от взрослых животных, у которых ДА, поступающий из гипоталамуса к гипофизу, регулирует функционирование периферических мишеней только через портальную систему циркуляции, у неонатальных животных, согласно нашей гипотезе, ДА в отсутствие ГЭБ может также поступать из всех популяций нейронов непосредственно в общую систему циркуляции. Ранее нам не удавалось разобщить эти два пути эндокринной регуляции у неонатальных животных. Было показано, что уровень экспрессии ДАТ в нейронах гипоталамуса достаточно низкий [Elsworth, Roth, 1997]. Это можно объяснить тем, что большинство нейронов данной области не образуют классических синапсов и являются нейросекреторными, то есть нейромедиаторы из них выделяются не в синаптическую щель, а в сосуды портальной системы циркуляции и действуют на мишени как гормоны [Ben-Jonathan, Hnasko, 2001]. Однако у 76 взрослых животных введение 6-ГДА в боковые желудочки мозга вызывает гибель ДАергических нейронов медиобазального гипоталамуса, хотя данный эффект менее выражен, чем, например, в нигростриатной системе [Bell et al., 1970]. По литературным данным, 6-ГДА у неонатальных животных не вызывает дегенерацию ДА-ергических нейронов тубероинфундибулярной системы, что связывают с недостаточным уровнем развития механизмов захвата [Towle et al., 1989; Yokoyama et al., 1992]. Эти данные дали нам возможность предположить, что на разрабатываемой модели хронического выключения синтеза ДА в мозге нам удастся разобщить описанные выше пути регуляции функциональной активности лактотрофов гипофиза ДА мозгового происхождения. На основании имеющихся в литературе данных нельзя сделать однозначный вывод о том, что эффекты, которые будут наблюдаться на модели, обусловлены только ДА, поступающим из мозга в общую систему циркуляции. Для того чтобы оценить, влияет ли нейротоксин на ДА-синтезирующие нейроны аркуатного ядра, мы, в первую очередь, оценили содержание ДА и его метаболитов в данной области после введения 6-ГДА. Было показано, что на разработанной модели уровень ДА в медиобазальном гипоталамусе не меняется по сравнению с контролем, в то время как в стриатуме, среднем мозге и стволе наблюдается его достоверное снижение. Эти данные можно рассматривать как интегральный показатель того, что секреторная активность гипоталамуса не меняется под действием токсина. Синтез ДА осуществляется из аминокислоты тирозина с помощью двух ферментов: ТГ и ДАА. В данной цепи реакций скорость лимитирующим этапом является синтез L-ДОФА из тирозина под действием ТГ [Nagatsu, 2006]. Поэтому в качестве прямого показателя синтеза ДА на разработанной модели мы оценивали активность данного фермента путем определения накопления L-ДОФА в медиобазальном гипоталамусе после ингибирования второго фермента сминтеза ДА – ДАА. Оказалось, что уровень L-ДОФА в данной области не менялся по сравнению с контролем, то есть активность ТГ не меняется под действием нейротоксина. В то же время, в остальной части мозга концентрация L-ДОФА снижалась в 2 раза по сравнению с контролем. При оценке степени деградации нейронов мозга под действием 6-ГДА в основном используют метод иммуномечения по ТГ. Однако известно, что помимо истинно ДАергических нейронов, экспрессирующих оба фермента синтеза ДА, существуют также нейроны, содержащие по одному из ферментов. Такие моноферментные нейроны впервые были обнаружены в 80-ые годы прошлого века с помощью двойного иммуногистохимического мечения в различных отделах головного мозга [Meister et al., 1988; Okamura et al., 1988; Ugrumov, 2013]. В нашей лаборатории ранее было показано, что в аркуатном ядре у крыс в перинатальном периоде развития число моноферментных нейронов значительно превышает 77 число биферментных. Так, на Э21 количество моноферментных нейронов в данной области составляет 99%, а биферментных всего 1%. На П9 биферментные нейроны составляют 38% [Ershov et al., 2002]. При этом было показано, что моноферментные нейроны способны осуществлять совместный синтез ДА [Ugrumov et al., 2004; Ugrumov et al., 2014]. Кроме того, было показано, что при функциональной недостаточности тубероинфундибулярной системы гипоталамуса, вызванной введением в мозг 6-ГДА, у взрослых животных увеличивается число как ТГ-, так и ДАА-содержащих моноферментных нейронов [Ershov et al., 2005]. По-видимому, такая реакция является проявлением компенсаторных процессов. В связи с этим в данной работе на модели дефицита ДА мы оценивали количество нейронов в аркуатном ядре с помощью двойного иммуномечения по ТГ и ДАА. Было показано, что на разработанной модели количество биферментных, моноферментных ТГ-содержащих и моноферментных ДААсодержащих нейронов не менялось по сравнению с контролем. Таким образом, на разработанной модели мы получили доказательство того, что специфическое выключение синтеза ДА в мозге с помощью нейротоксина 6-ГДА не меняет морфофункциональное состояние тубероинфундибулярной системы гипоталамуса. Это означает, что если на данной модели будут наблюдаться изменения в синтезе ПРЛ, то они будут обусловлены влиянием ДА исключительно через общую систему циркуляции. 4.4 Определение влияния дофамина, поступающего из мозга в общую систему циркуляции на синтез пролактина in vivo Синтез ПРЛ, как и любого другого белка, включает в себя этапы транскрипции, трансляции и процессинга. Считается, что для характеристики процесса синтеза белковой молекулы необходимой и достаточной является оценка двух показателей: мРНК, как показатель, характеризующий процесс транскрипции, и сам белок, как показатель, характеризующий процесс трансляции. Было показано, что при снижении уровня ДА в плазме крови на 73% концентрация ПРЛ увеличилась на 50%. Данный показатель характеризует уровень выделения ПРЛ лактотрофами гипофиза. Столь значительное увеличение концентрации ПРЛ в плазме в ответ на снижение концентрации ДА говорит о том, что в данный период онтогенеза (первая неделя постнатального развития) лактотрофы гипофиза уже находятся под стойким ингибиторным контролем ДА, причем скорее всего данное влияние оказывается именно через общую систему циркуляции, а не через портальную. Интересным является тот факт, что при моделировании дефицита ДА концентрация ПРЛ в гипофизе увеличивается на 48%. Это говорит о том, что ДА, 78 поступающий к гипофизу через общую систему циркуляции не просто ингибирует выделение ПРЛ, но и оказывает влияние на его синтез, что также указывает на зрелость механизмов дофаминового ингибиторного контроля в данный период онтогенеза. Для того чтобы подтвердить влияние ДА на синтез ПРЛ на разработанной модели мы также оценивали уровень его мРНК. Было показано, что уровень экспрессии мРНК ПРЛ у животных с дефицитом ДА возрастал в гипофизе в 2,5 раза по сравнению с контрольными. Учитывая то, что влияние ДА на лактотрофы гипофиза осуществляется через Д2рецепторы, можно предположить, что изменение уровня ДА в плазме крови могло привести также к изменению уровня экспрессии Д2-рецепторов на лактотрофах. Так, Johnston с коллегами в экспериментах in vitro показали, что ДА оказывает стимулирующее влияние на экспрессию Д2-рецепторов [Johnston et al., 1993]. Однако в данной работе на разработанной модели дефицита ДА в мозге неонатальных крыс экспрессия Д2-рецепторов в гипофизе оставалась на уровне контроля. Это может быть связано с тем, что данный механизм запускается лишь при более длительном дефиците ДА. Так, существуют данные, согласно которым агонисты и антагонисты рецепторов к ДА не влияют на экспрессию Д2-рецепторов в течение пяти суток [Autelitano et al., 1989]. 79 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в данной работе нам удалось показать, что в раннем постнатальном периоде до формирования ГЭБ ДА, выделяемый мозгом в общую систему циркуляции, оказывает ингибирующее влияние на синтез и выделение ПРЛ лактотрофами гипофиза. Согласно нашей гипотезе об эндокринной функции мозга до формирования ГЭБ, в раннем постнатальном периоде могут быть возможны два пути дофаминовой регуляции секреции ПРЛ гипофизом: ДА-ергическими нейронами гипоталамуса через портальную систему циркуляции и другими популяциями ДА-ергических нейронов через общую систему циркуляции. На основании полученных данных можно предположить, что на протяжении исследуемого нами периода онтогенеза регуляция функционирования лактотрофов гипофиза через общую систему циркуляции вносит существенный вклад в регуляцию секреции ПРЛ. В связи с этим мы можем предполагать, что, скорее всего, в процессе онтогенетического развития организма происходит постепенная качественная смена механизмов нейроэндокринной регуляции. Кроме того, так как рецепторы к ДА в онтогенезе появляются достаточно рано не только в гипофизе, но в других периферических органах (например, в почках и мезентерических органах), можно ожидать, что эндокринное влияние ДА распространяется и на другие периферические органы. Однако все высказанные предположения требуют дальнейшего изучения. 80 ВЫВОДЫ 1. Впервые разработана экспериментальная модель хронического выключения синтеза дофамина в мозге неонатальных крыс до формирования гематоэнцефалического барьера. На данной модели впервые удалось ингибировать синтез дофамина во всех основных популяциях дофаминергических нейронов за исключением нейронов медиобазального гипоталамуса. 2. На разработанной модели были получены доказательства того, что в раннем постнатальном периоде нейроэндокринная регуляция функционирования лактотрофов гипофиза через общую систему циркуляции вносит существенный вклад в регуляцию секреции пролактина. 3. На примере лактротрофов гипофиза в экспериментах in vivo и in vitro получены прямые доказательства эндокринного влияния мозга до закрытия гематоэнцефалического барьера на функционирование периферических органов-мишеней. 4. Полученные данные подтверждают гипотезу о том, что мозг в онтогенезе до формирования гематоэнцефалического барьера играет роль эндокринного органа и оказывает, таким образом, влияние на развитие и функционирование периферических органов-мишеней. 81 CПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6-ГДА – 6-гидроксидофамин; L-ДОФА – L-диоксифенилаланин; ВМАТ – везикулярный моноаминовый транспортер; ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография; ГЭБ – гематоэнцефалический барьер; ДА – дофамин; ДАА – декарбоксилаза ароматических аминокислот; ДАТ – мембранный транспортер дофамина; ДГБА – 3, 4-дигидроксибензиламин гидробромида; ДМИ-десметилимипромин; ДОФУК – 3, 4-дигидроксифенилуксусная кислота; ЖКТ – желудочно-кишечный тракт; КОМТ – катехол-о-метилтрансфераза; МАО – моноаминоксидаза; ОКТ – транспортер органических катионов; ОЦ – орган Цукеркандля; П – постнатальный день развития; ПРЛ – пролактин; ТГ – тирозингидроксилаза; ЦНС – центральная нервная система; Э – эмбриональный день развития; ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота; ЭМТ – экстранейрональный транспортер моноаминов. 82 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Мицкевич, М. С. Гормональные регуляции в онтогенезе животных / М. С. Мицкевич. - М. Наука. – 1978. – 224 с. 2. Розен, В. Б. Основы эндокринологии / В. Б. Розен. - М. Высшая школа. – 1984 – 336 с. 3. Сайфетярова, Ю. Ю. Эндокринная функция дофаминергических нейронов мозга у крыс в перинатальном периоде / Ю. Ю. Сайфетярова, Е.А. Дегтярева, А. Я. Сапронова, М.В. Угрюмов // Нейрохимия. – 2011. – Т.28. – №3. – C .192-199. 4. Сайфетярова, Ю.Ю. Эндокринная функция дофаминергических нейронов целостного мозга у крыс в онтогенезе: регуляция секреции пролактина. / Ю. Ю. Сайфетярова, А. Я. Сапронова, М. В. Угрюмов // ДАН. – 2012. – Т. 443. – № 6. – С. 1-4. 5. Угрюмов , М. В. Механизмы нейроэндокринной регуляции / М. В. Угрюмов. – М. Наука. – 1999. – 299с. 6. Угрюмов, М. В. Мозг в роли эндокринной железы во взрослом и развивающемся организме / М. В. Угрюмов // Российский физиологический журнал им. ИМ Сеченова. – 2004. – Т. 90. – №. 5. – С. 625-637. 7. Abbott, N. Structure and function of the blood–brain barrier / N. Abbott, A. Patabendige, D. Dolman et al. // Neurobiol. Dis. – 2010. – Vol. 37, N. 1. – P. 13-25. 8. Abbott, N. Astrocyte–endothelial interactions at the blood–brain barrier / N. Abbott, L. Rönnbäck, E. Hansson // Nat Rev Neurosci. – 2006. – Vol. 7, N. 1. – P. 41-53. 9. Ackerman, K. Noradrenergic sympathetic innervation of the spleen: III. Development of innervation in the rat spleen / K. Ackerman, S. Felten, D. Bellinger et al. // J. Neurosci. Res. – 1987. – Vol. 18, N. 1. – P. 49-54. 10. Ahonen, M. Pre-and postnatal development of rat retroperitoneal paraganglia / M. Ahonen, S. Soinila, T. Joh // J. Auton. Nerv. Syst. – 1987. – Vol. 18, N. 2. – P. 111-120. 11. Alnouti, Y. Tissue distribution and ontogeny of organic cation transporters in mice / Y. Alnouti, J. Petrick, C. Klaassen // Drug. Metab. Dispos. – 2006. – Vol. 34, N. 3. – P. 477-482. 12. Amar, A. Pituitary anatomy and physiology / A. Amar, M. Weiss // Neurosurg. Clin. N. Am. – 2003. – Vol. 14, N. 1. – P. 11-23. 13. Amara, S. G., Sonders M. S. Neurotransmitter transporters as molecular targets for addictive drugs / S. Amara, M. Sonders // Drug. Alcohol. Depend. – 1998. – Vol. 51, N. 1. – P. 87-96. 14. Amarant, T. Luteinizing Hormone Releasing Hormone and Thyrotropin‐Releasing Hormone in Human and Bovine Milk / T. Amarant, M. Fridkin, Y. Koch // Eur. J. Biochem. – 1982. – Vol. 127, N. 3. – P. 647-650. 83 15. Amenta, F., Collier W. L., Rícci A. Autoradiographic localization of vascular dopamine receptors / F. Amenta, W. Collier, A. Rícci // Am. J. Hypertens. – 1990. – Vol. 3, N. 6 Pt 2. – P. 34S-36S. 16. Anderson, D. Molecular control of cell fate in the neural crest: the sympathoadrenal lineage / D. Anderson // Annu. Rev. Neurosci. – 1993. – Vol. 16, N. 1. – P. 129-158. 17. Anderson, D. A bipotential neuroendocrine precursor whose choice of cell fate is determined by NGF and glucocorticoids / D. Anderson, R. Axel // Cell. – 1986. – Vol. 47, N. 6. – P. 10791090. 18. Andrew, A. Further evidence that enterochromaffin cells are not derived from the neural crest / A. Andrew // J. Embryol. Exp. Morphol. – 1974. – Vol. 31, N. 3. – P. 589-598. 19. Andrews, G. Dlx transcription factors regulate differentiation of dopaminergic neurons of the ventral thalamus / G. Andrews et al. // Mol. Cell. Neurosci. – 2003. – Vol. 23, N. 1. – P. 107120. 20. Arbogast, L. Ontogeny of tyrosine hydroxylase mRNA signal levels in central dopaminergic neurons: development of a gender difference in the arcuate nuclei / L. Arbogast, J. Voogt // Dev. brain res. – 1991. – Vol. 63, N. 1. – P. 151-161. 21. Artal, R. Fetal adrenal medulla / R. Artal // Clin. Obstet. Gynecol. – 1980. – Vol. 23, N. 3. – P. 825-836. 22. Artalejo, C. Activation of facilitation calcium channels in chromaffin cells by D1 dopamine receptors through a cAMP/protein kinase A-dependent mechanism / C. Artalejo, M. Ariano, R. Perlman // Nature. – 1990. – Vol. 348. – N. 6298. – P. 239-242. 23. Aunis, D. Physiological aspects of exocytosis in chromaffin cells of the adrenal medulla / D. Aunis, K. Langley // Acta Physiol. Scand. – 1999. – Vol. 167, N. 2. – P. 89-97. 24. Autelitano, D. Dopamine D 2-receptor messenger RNA is differentially regulated by dopaminergic agents in rat anterior and neurointermediate pituitary / D. Autelitano, L. Snyder, S. Sealfon et al. // Mol. and Cell. Endocrinol.– 1989. – Vol. 67, N. 1. – P. 101-105. 25. Axelrod, J. Distribution of catechol-o-methyl transferase in the nervous system and other tissues / J. Axelrod, W. Albers, C. Clemente // J. Neurochem. – 1959. – Vol. 5, N. 1. – P. 68-72. 26. Baines, A. D. Proximal tubular dopamine production regulates basolateral Na-K-ATPase / A. D. Baines, P. Ho, R. Drangova, // Am. J. Physiol. Renal Physiology. – 1992. – Vol. 262. – N. 4. – P. F566-F571. 27. Baines, A. D. Production of urine free dopamine from DOPA; a micropuncture study / A. D. Baines, W. Chan // Life Sci.. – 1980. – Vol. 26. – N. 4. – P. 253-259. 84 28. Balan, I. S. Birthdates of the tyrosine hydroxylase immunoreactive neurons in the hypothalamus of male and female rats / I. S. Balan, M. V. Ugrumov, N. A. Borisova, et al. // Neuroendocrinology. – 1996. – Vol. 64. – N. 6. – P. 405-411. 29. Ballabh, P. The blood–brain barrier: an overview: structure, regulation, and clinical implications / P. Ballabh, A. Braun, M. Nedergaard // Neurobiol Dis.– 2004. – Vol. 16. – N. 1. – P. 1-13. 30. Baram, T. Gonadotropin-releasing hormone in milk / T. Baram, Y. Koch, E. Hazum, et al. // Science. – 1977. – Vol. 198. – N. 4314. – P. 300-302. 31. Bauer, H. C. Proteins of the tight junction in the blood-brain barrier / H. C. Bauer, A. Traweger, H. Bauer // Blood-Spinal Cord and Brain Barriers in Health and Disease. – 2004. – P, 1-10. 32. Bayer, S. A. Time of neuron origin and gradients of neurogenesis in midbrain dopaminergic neurons in the mouse / S. A. Bayer, K. V. Wills, L. C. Triarhou, et al. // Exp Brain Res. – 1995. – Vol. 105. – N. 2. – P. 191-199. 33. Begeot, M. Induction of pituitary lactotrope differentiation by luteinizing hormone alpha subunit / M. Begeot, F. J. Hemming, P. Dubois, et al. // Science. – 1984. – Vol. 226. – N. 4674. – P. 566-568. 34. Begley, D. J. Structural and functional aspects of the blood-brain barrier. Peptide transport and delivery into the central nervous system / D. J. Begley, M. W. Brightman // Birkhäuser Basel. – 2003. – P. 39-78. 35. Bell, L. J. Time course of the effects of 6‐hydroxydopamine on catecholamine‐containing neurones in rat hypothalamus and striatum / L. J. Bell, L. L. Iversen, N. J. Uretsky // Br J Pharmacol. – 1970. – Vol. 40. – N. 4. – P. 790-799. 36. Ben-Jonathan, N. Dopamine as a prolactin (PRL) inhibitor / N. Ben-Jonathan, R. Hnasko // Endocr Rev. – 2001. – Vol. 22. – N. 6. –P. 724-763. 37. Benskey, M. Recovery of hypothalamic tuberoinfundibular dopamine neurons from acute toxicant exposure is dependent upon protein synthesis and associated with an increase in parkin and ubiquitin carboxy-terminal hydrolase-L1 expression / M. Benskey, B. Behrouz, Sunryd, et al. // Neurotoxicology. – 2012. – Vol. 33. – N. 3. – P. 321-331. 38. Benskey M. Sustained resistance to acute MPTP toxicity by hypothalamic dopamine neurons following chronic neurotoxicant exposure is associated with sustained up-regulation of parkin protein / M. Benskey, K. Y. Lee, K. Parikh, et al. // Neurotoxicology. – 2013. – Vol. 37. – P. 144-153. 39. Bernabe, J. Pharmacological model of catecholamine depletion in the hypothalamus of fetal and neonatal rats and its application / J. Bernabe, E. Proshlyakova, A. Sapronova et al. // Cell Mol Neurobiol. – 1996. – Vol. 16. – P. 617-624. 85 40. Bernacki J. Physiology and pharmacological role of the blood-brain barrier / J. Bernacki, , A. Dobrowolska, K. Nierwiñska, et al. // Pharmacol Rep. – 2008. – Vol. 60. – N. 5. – P. 600-622. 41. Bertil, K. Catecholamines and their metabolites. B / K. Bertil, D. S. Goldstein // J Chromatogr. – 1988. – Vol. 429. – P. 177-233. 42. Bertler, A. B. The localization of monoaminergic blood-brain barrier mechanisms / A. Bertler, B. Falck, C. Owman, et al. // Pharmacol Rev. – 1966. – Vol. 18. – N. 1. – P. 369-385. 43. Betz, A. L. Developmental changes in metabolism and transport properties of capillaries isolated from rat brain / A. L. Betz, G. W. Goldstein // J Physiol. – 1981. – Vol. 312. – N. 1. – P. 365-376. 44. Bewley, T. A. Molecular weight and circular dichroism studies of bovine and ovine pituitary growth hormones / T. A. Bewley, C. H. Li // Biochemistry. – 1972. – Vol. 11. – N. 5. – P. 927931. 45. Bigornia, L. D2 dopamine receptors modulate calcium channel currents and catecholamine secretion in bovine adrenal chromaffin cells / L. Bigornia, C. N. Allen, C. R. Jan, et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1990. – Vol. 252. – N. 2. – P. 586-592. 46. Bigornia, L. Dopamine receptors on adrenal chromaffin cells modulate calcium uptake and catecholamine release / L. Bigornia, M. Suozzo, K. A. Ryan, et al. // J Neurochem. – 1988. – Vol. 51. – N. 4. – P. 999-1006. 47. Björklund, A. Dopamine neuron systems in the brain: an update / A. Björklund, S. B. Dunnett // Trends Neurosci. – 2007. – Vol. 30. – N. 5. – P. 194-202. 48. Björklund, A. Dopamine-containing systems in the CNS / A. Björklund, O. Lindvall// Handbook of chemical neuroanatomy. – 1984.– P. 55-122. 49. Björklund, A. Dopamine‐Containing Cells in Sympathetic Ganglia / A. Björklund, L. Cegrell, , B. Falck, et al. // Acta Physiol Scand.. – 1970. – Vol. 78. –N. 3. – P. 334-338. 50. Blaha, C. D.. Does monoamine oxidase inhibition by pargyline increase extracellular dopamine concentrations in the striatum? / C. D. Blaha, A. Coury, A. G Phillips // Neuroscience. – 1996. – Vol. 75. – N. 2. – P. 543-550. 51. Bliss, D. J. Prolactin release in response to infusion of isotonic or hypertonic saline / D. J. Bliss, C. J. Lote / J Endocrinol. – 1982. – Vol. 92. – N. 2. – P. 273-278. 52. Blum, D. Molecular pathways involved in the neurotoxicity of 6-OHDA, dopamine and MPTP: contribution to the apoptotic theory in Parkinson's disease / D. Blum, S. Torch, N. Lambeng, // Prog Neurobiol. – 2001. – Vol. 65. – N. 2. – P. 135-172. 53. Bohn, M. C. Role of glucocorticoids in expression of the adrenergic phenotype in rat embryonic adrenal gland / M. C. Bohn, M. Goldstein, I. B. Black // Dev Biol. – 1981. – Vol. 82. – N. 1. – P. 1-10. 86 54. Bookout, A. L. High‐Throughput Real‐Time Quantitative Reverse Transcription PCR / A. L. Bookout, C. L. Cummins, D. J. Mangelsdorf, et al. // Curr Protoc Mol Biol.– 2006. – P. 15-8. 55. Borisova, N. A. Development of the tuberoinfundibular system in rats: birthdates of the tyrosine hydroxylase-immunopositive neurons / N. A. Borisova, M. V. Ugrumov, I. S. Balan, et al. // Dev. Brain. Res. – 1993. – Vol. 73. – N. 2. – P. 173-176. 56. Borisova, N. A. Ontogenesis of the hypothalamic catecholaminergic system in rats: synthesis, uptake and release of catecholamines / N. A. Borisova, A. Y. Sapronova, E. V. Proshlyakova, et al. // Neuroscience. – 1991. – Vol. 43. – N. 1. – P. 223-229. 57. Boulton, A. A. Catecholamines bridging basic science with clinical medicine / D. S. Goldstein, G. Eisenhofer, R. McCarty. – Academic Press, New York. – 1998. – P. 273-292. 58. Brady, S. Basic neurochemistry: molecular, cellular and medical aspects / Brady, S., Siegel, G., Albers, R. W. et al. // Academic Press. – 2005. 59. Brodde, O. E. Physiology and pharmacology of cardiovascular catecholamine receptors: implications for treatment of chronic heart failure / O. E. Brodde // Am Heart J. – 1990. – Vol. 120. – N. 6. – P. 1565-1572. 60. Brownstein, M. J. Synthesis, transport, and release of posterior pituitary hormones / M. J. Brownstein, J. T. Russell, H. Gainer // Science. – 1980. – Vol. 207. – N. 4429. – P. 373-378. 61. Burris, T. P. Low concentrat ions of dopamine increase cytosolic calcium in lactotrophs / T. P. Burris, M. E. Freeman // Endocrinology. – 1993. – Vol. 133. – N. 1. – P. 63-68. 62. Butt, A. M. Effect of inflammatory agents on electrical resistance across the blood-brain barrier in pial microvessels of anaesthetized rats / A. M. Butt // Brain Res. – 1995. – Vol. 696. – N. 1. – P. 145-150. 63. Butt, A. M. Electrical resistance across the blood‐brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study / A. M. Butt, H. C. Jones, N. J. Abbott // J Physiol. – 1990. – Vol. 429. – N. 1. – P. 47-62. 64. Buu, N. T. Origin of dopamine in the rat adrenal cortex / N. T. Buu, C. Lussier // Am J Physiol– 1990. – Vol. 258. – N. 2. – P. F287-F291. 65. Carlsson, A. In-vivo measurements of tryptophan and tyrosine hydroxylase activities in mouse brain / A. Carlsson, M. Lindqvist // J Neural Transm. – 1973. – Vol. 34. – N. 2. – P. 79-91. 66. Carpenter, G. Epidermal growth factor is a major growth-promoting agent in human milk / G. Carpenter // Science. – 1980. – Vol. 210. – N. 4466. – P. 198-199. 67. Castillo, S. O. Dopamine biosynthesis is selectively abolished in substantia nigra/ventral tegmental area but not in hypothalamic neurons in mice with targeted disruption of the Nurr1 gene / S. O. Castillo, J. S. Baffi, M. Palkovits, et al. // Mol. Cell. Neurosci. – 1998. – Vol. 11. – N. 1. – P. 36-46. 87 68. Chatelain, A. Ontogenesis of cells producing polypeptide hormones (ACTH, MSH, LPH, GH, prolactin) in the fetal hypophysis of the rat: influence of the hypothalamus / A. Chatelain, J. P. Dupouy, M. P. Dubois // Cell Tissue Res. – 1979. – Vol. 196. – N. 3. – P. 409-427. 69. Childs, G. V. Gonadotropes and lactotropes / G. V. Childs // Physiology of Reproduction. Amsterdam, Elsevier. – 2006. – P. 1483-1580. 70. Christenson, J. G. Preparation and properties of a homogeneous aromatic L-amino acid decarboxylase from hog kidney / J. G. Christenson, W. Dairman, S. Udenfriend // Arch Biochem Biophys– 1970. – Vol. 141. – N. 1. – P. 356-367. 71. Chritton, S. L. Adrenomedullary secretion of DOPA, catecholamines, catechol metabolites, and neuropeptides / S. L. Chritton, S. L. Chinnow, C. Grabau, et al. // J Neurochem. – 1997. – Vol. 69. – P. 2413-2420. 72. Ciliax, B. J. The dopamine transporter: immunochemical characterization and localization in brain / B. J. Ciliax, C. Heilman, L. L. Demchyshyn, et al. // J Neurosci. – 1995. – Vol. 15. – N. 3. – P. 1714-1723. 73. Cochard, P. Ontogenetic appearance and disappearance of tyrosine hydroxylase and catecholamines in the rat embryo / P. Cochard, M. Goldstein, I. B. Black // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1978. – Vol. 75. – N. 6. – P. 2986-2990. 74. Coughlin, M. D. Factors regulating development of an embryonic mouse sympathetic ganglion / M. D. Coughlin, M. D. Dibner, D. M. Boyer, et al. // Dev Biol. – 1978. – Vol. 66. – N. 2. – P. 513-528. 75. Coyle, J. T. Catecholamines in fetal and newborn rat brain / J. T. Coyle, D. Henry // J Neurochem– 1973. – Vol. 21. – N. 1. – P. 61-67. 76. Cuche, J. L. Conjugated catecholamines in human plasma: where are they coming from? / J. L. Cuche, P. Brochier, N. Klioua, et al. // J Lab Clin Med. – 1990. – Vol. 116. – N. 5. – P. 681686. 77. Dahlström, A. Evidence for the existence of monoamine-containing neurons in the central nervous system. I. Demonstration of monoamines in the cell bodies of brain stem neurons / A. Dahlström, K. Fuxe // Acta Physiol. Scand. Suppl. – 1964. – P. SUPPL 232: 1 78. Davis, M. D. Early postnatal development of pituitary intermediate lobe control in the rat by dopamine neurons / M. D. Davis, W. Lichtensteiger, M. Schlumpf, et al. // Neuroendocrinology. – 1984. – Vol. 39. – P. 1-12. 79. De Diego, A. M. G. physiological view of the central and peripheral mechanisms that regulate the release of catecholamines at the adrenal medulla / A. M. G. De Diego, L. Gandia, A. G. Garcia Acta Physiol (Oxf). – 2008. – Vol. 192. – N. 2. – P. 287-301. 88 80. De Gallardo, M. R. The organ of Zuckerkandl of the newborn rat and its postnatal involution / M. R. De Gallardo, F. Freire, J. H. Tramezzani // Acta Physiol Lat Am. – 1974. – Vol. 24. – N. 4. – P. 290. 81. De Vitry, F. Dopamine increases the expression of tyrosine hydroxylase and aromatic amino acid decarboxylase in primary cultures of fetal neurons / F. De Vitry, J. Hillion, J. Catelon, et al. // Dev. Brain Res. – 1991. – Vol. 59. – N. 2. – P. 123-131. 82. De Vos, A. M. Human growth hormone and extracellular domain of its receptor: crystal structure of the complex / A. M. De Vos, M. Ultsch, A. A. Kossiakoff // Science. – 1992. – Vol. 255. – N. 5042. – P. 306-312. 83. Denef, C. Paracrine control of lactotrope proliferation and differentiation / C. Denef // Trends Endocrinol Metab. – 2003. – Vol. 14. – N. 4. – P. 188-195. 84. Denef, C. Dopaminergic stimulation of prolactin release / C. Denef, D. Manet, R. Dewals // Nature. – 1980. – Vol. 285. – P. 243 – 246 85. Denney, R. M. Use of a monoclonal antibody for comparative studies of monoamine oxidase B in mitochondrial extracts of human brain and peripheral tissues / R. M. Denney, R. R. Fritz, N. T. Patel, et al. // Mol. Pharmacol. – 1983. – Vol. 24. – N. 1. – P. 60-68. 86. Di Porzio,U. Early appearance of tyrosine hydroxylase immunoreactive cells in the mesencephalon of mouse embryos / U. Di Porzio, A. Zuddas, D. B. Cosenza-Murphy, et al. // Int. J. Dev. Neurosci. – 1990. – Vol. 8. – N. 5. – P. 523-532. 87. Dörner, G. Sex hormones and neurotransmitters as mediators for sexual differentiation of the brain / Endokrinologie. – 1981. – Vol. 78. – N. 2-3. – P. 129-138. 88. Duan, H. Impaired monoamine and organic cation uptake in choroid plexus in mice with targeted disruption of the plasma membrane monoamine transporter (Slc29a4) gene / H. Duan, J. Wang // J. Biol. Chem. – 2013. – Vol. 288. – N. 5. – P. 3535-3544. 89. Dubois, P. M. Fetal development and regulation of pituitary cell types / P. M. Dubois, F. J. Hemming // J Electron Microsc Tech. – 1991. – Vol. 19. – N. 1. – P. 2-20. 90. Edwards, R. M. Response of isolated renal arterioles to acetylcholine, dopamine, and bradykinin / R. M. Edwards // Am J Physiol. – 1985. –Vol. 248. – N. 2. – P. F183-F189. 91. Edwards, R. M. Comparison of the effects of fenoldopam, SK&F R-87516 and dopamine on renal arterioles in vitro / R. M. Edwards // Eur J Pharmacol. – 1986. – Vol. 126. – N. 1. – P. 167-170. 92. Eisenhofer, G. Substantial production of dopamine in the human gastrointestinal tract / G. Eisenhofer, A. Aneman, P. Friberg et al. // J Clin Endocrinol Metab. – 1997. – Vol. 82. – N. 11. – P. 3864-3871. 89 93. Eisenhofer, G. The role of neuronal and extraneuronal plasma membrane transporters in the inactivation of peripheral catecholamines / G. Eisenhofer // Pharmacol Ther. – 2001. – Vol. 91. – N. 1. – P. 35-62. 94. Eisenhofer, G. Different metabolism of norepinephrine and epinephrine by catechol-Omethyltransferase and monoamine oxidase in rats / G. Eisenhofer, J. P. Finberg // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1994. – Vol. 268. – N. 3. – P. 1242-1251. 95. Ekelund, M. Endocrine cells and parietal cells in the stomach of the developing rat / M. Ekelund, R. Håkanson, J. Hedenbro, et al. // Acta Physiol Scand. – 1985. – Vol. 124. – N. 4. – P. 483-497. 96. Elsworth, J. D. Dopamine synthesis, uptake, metabolism, and receptors: relevance to gene therapy of Parkinson's disease / J. D. Elsworth, R. H. Roth // Exp Neurol. – 1997. – Vol. 144. – N. 1. – P. 4-9. 97. Ershov, P. V. Degeneration of dopaminergic neurons triggers an expression of individual enzymes of dopamine synthesis in non-dopaminergic neurons of the arcuate nucleus in adult rats / P. V. Ershov, M. V. Ugrumov, A. Calas, et al. // J. Chem. Neuroanat. – 2005. – Vol. 30. – N. 1. – P. 27-33. 98. Ershov, P. V. Neurons possessing enzymes of dopamine synthesis in the mediobasal hypothalamus of rats: topographic relations and axonal projections to the median eminence in ontogenesis / P. V. Ershov, M. V. Ugrumov, A. Calas, et al. // J. Chem. Neuroanat. – 2002. – Vol. 24. – N. 2. – P. 95-107. 99. Finkel, Y. Endogenous dopamine modulates jejunal sodium absorption during high-salt diet in young but not in adult rats / Y. Finkel, A. C. Eklof, L. Granquist et al. // Gastroenterology. – 1994. – Vol. 107. – P. 675-679. 100.Fiszman, M. L. Dopamine synthesis precedes dopamine uptake in embryonic rat mesencephalic neurons / M. L. Fiszman, A. Zuddas, M. I. Masana, et al. // J Neurochem. – 1991. – Vol. 56. – N. 2. – P. 392-399. 101.Fitzpatrick, P. F. The aromatic amino acid hydroxylases / P. F. Fitzpatrick // Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. – 2000. – Vol. 74. – P. 235-294. 102.Flemström, G. Role of dopamine and other stimuli of mucosal bicarbonate secretion in duodenal protection / G. Flemström, B. Säfsten // Dig Dis Sci. – 1994. – Vol. 39. – N. 9. – P. 1839-1842. 103.Flores, C. M. Partial characterization of a neurotransmitter pathway regulating the in vivo release of prolactin / C. M. Flores, B. A. Hulihan-Giblin, P. J. Hornby et al. // Neuroendocrinology. – 1992. – Vol. 55. – P. 519-528. 90 104.Fontaine, J. Analysis of endoderm formation in the avian blastoderm by the use of quail-chick chimaeras The problem of the neurectodermal origin of the cells of the APUD series / J. Fontaine, N. M. Le Douarin // Journal of embryology and experimental morphology. – 1977. – Vol. 41. – N. 1. – P. 209-222. 105.Foster, G. A. Ontogeny of phenylethanolamine N‐methyltransferase‐and tyrosine hydroxylase‐ like immunoreactivity in presumptive adrenaline neurones of the foetal rat central nervous system / G. A. Foster, M. Schultzberg, M. Goldstein et al. // Journal of Comparative Neurology. – 1985. – Vol. 236. – N. 3. – P. 348-381. 106.Fraser, R. The role of dopamine in the control of corticosteroid secretion and metabolism / R. Fraser, J. M. Connell, G. Inglis et al. / J Steroid Biochem. – 1989. – Vol. 32. – P. 217-222. 107.Frawley, L. S. Mammosomatotropes: Presence and Functions in Normal and Neoplastic Pituitary Tissue / L. S. Frawley, F. R. Boockfor // Endocr Rev. – 1991. – Vol. 12. – N. 4. – P. 337-355. 108.Freeman, M. E. Prolactin: structure, function, and regulation of secretion / M. E. Freeman, B. Kanyicska, A. Lerant, et al. // Physiol Rev– 2000. – Vol. 80. – N. 4. – P. 1523-1631. 109.Friedgen, B. Roles of uptake1 and catechol-O-methyltransferase in removal of circulating catecholamines in the rabbit / B. Friedgen, T. Halbrugge, K. H. Graefe // Am J Physiol. – 1994. – Vol. 267. – N. 6. – P. E814-E821. 110.Fujita, M. Ontogeny of dopamine transporter mRNA expression in the rat brain / M. Fujita, S. Shimada, T. Nishimura, et al. // Brain Res Mol Brain Res. – 1993. – Vol. 19. – N. 3. – P. 222226. 111.Fuse, Y. Development of the hypothalamic-pituitary-thyroid axis in humans / Y. Fuse // Reprod Fertil Dev. – 1996. – Vol. 8. – N. 1. – P. 1-21. 112.Galindo, M. F. Chromaffin cell death induced by 6‐ hydroxydopamine is independent of mitochondrial swelling and caspase activation / M. F. Galindo, J. Jordán, C. González‐ García, et al. // J. Neurochem. – 2003. – Vol. 84. – N. 5. – P. 1066-1073. 113.Gash, D.. Cytodifferentiation of pituitary primordia transplanted to the kidney capsule of adult hosts / D. Gash, N. Ahmad, J. Schechter // Anat Rec. – 1977. – Vol. 189. – N. 2. – P. 149-159. 114.Gerbi, A. Specific modulation of two neuronal digitalis receptors by anaesthesia / A Gerbi, J. M. Maixent, M. J. Zerouga, et al. // J Recept Signal Transduct Res. – 1997. Vol. 17. – P. 137147. 115.Gesek, F. A. Hormonal interactions with the proximal Na (+)-H+ exchanger / F. A. Gesek, A. C. Schoolwerth / Am J Physiol. – 1990. – Vol. 258. – N. 3. – P. F514-F521. 116.Giros, B. Molecular characterization of the dopamine transporter / B. Giros, M. G. Caron // Trends Pharmacol Sci. – 1993. – Vol. 14. – N. 2. – P. 43-49. 91 117.Glavin, G. B. Dopamine in gastrointestinal disease / G. B. Glavin, S. Szabo // Dig Dis Sci. – 1990. – Vol. 35. – P. 1153-1161. 118.Glitsch, M. D. Spontaneous neurotransmitter release and Ca 2+—How spontaneous is spontaneous neurotransmitter release? / M. D. Glitsch / Cell Calcium. – 2008. – Т. 43. – №. 1. – С. 9-15. 119.Glowinski, J. Physiological disposition of H3-norepinephrine in the developing rat / J. Glowinski, J. Axelrod, I. J. Kopin, et al. // J Pharmacol Exp Ther. – 1964. – Vol. 146. – N. 1. – P. 48-53. 120.Glydon, R. S. J. The development of the blood supply of the pituitary in the albino rat, with special reference to the portal vessels / R. S. J. Glydon // J Anat. – 1957. – Vol. 91. – N. Pt 2. – P. 237. 121.Goldberg, L. I. comparison of the vascular dopamine receptor with other dopamine receptors / L. I. Goldberg, P. H. Volkman, J. D. Kohli // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. – 1978. – Vol. 18. – N. 1. – P. 57-79. 122.Goldstein, D. S. Is there a third peripheral catecholaminergic system? Endogenous dopamine as an autocrine/paracrine substance derived from plasma DOPA and inactivated by conjugation / D. S. Goldstein, E. Mezey, T. Yamamoto et al. // Hypertension Res. – 1995. – Vol. 18. – N. SupplementI. – P. S93-S99. 123.Goldstein M. Immunohistochemical studies on phenylethanolamine-N-methyltransferase, dopadecarboxylase and dopamine-β-hydroxylase / M. Goldstein, K. Fuxe, T. Hokfelt et al. // Experientia. – 1971. – Vol. 27. – N. 8. – P. 951-952. 124.Gorski R.A. Structural sex differences in the brain: their origin and significance / R.Gorski // Lakoski J.M., Perez-Polo J.R., Rassin D.K., Gustavson C.R., Watson C.S. (Eds.). Neural control of reproductive function. - New York. Alan R. Liss Inc, 1988. - P. 33-44. 125.Goudreau, J. L. Periventricular-hypophysial dopaminergic neurons innervate the intermediate but not the neural lobe of the rat pituitary gland / Goudreau, J. L., Falls, W. M., Lookingland, K. J. et al. // Neuroendocrinology. – 1995. – Vol. 62. – N. 2. – P. 147-154. 126.Gregerson, K. A. Mechanisms of dopamine action on the lactotroph / K. A. Gregerson // Prolactin. – Springer US. – 2001. – P. 45-61. 127.Grimsby, J. Tissue distribution of human monoamine oxidase A and B mRNA / J. Grimsby, N. C. Lan, R. Neve, et al. // J Neurochem. – 1990. – Vol. 55. – N. 4. – P. 1166-1169. 128.Halbrügge, T. Effects of catechol-O-methyltransferase inhibition on the plasma clearance of noradrenaline and the formation of 3, 4-dihydroxyphenylglycol in the rabbit / T. Halbrügge, B. Friedgen, J. Ludwig, et al. // Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. – 1993. – Vol. 347. – N. 2. – P. 162-170. 92 129.Hall, A. K. Early commitment of precursor cells from the rat superior cervical ganglion to neuronal or nonneuronal fates / A. K. Hall, S. C. Landis // Neuron. – 1991. – Vol. 6. – N. 5. – P. 741-752. 130.Hanaway, J. Histogenesis of the substantia nigra, ventral tegmental area of Tsai and interpeduncular nucleus: an autoradiographic study of the mesencephalon in the rat / J. Hanaway, J. A. McConnell, M. G. Netsky // J Comp Neurol. – 1971. – Vol. 142. – N. 1. – P. 5973. 131.Hansson S. R., Hoffman B. J., Mezey É. Ontogeny of vesicular monoamine transporter mRNAs VMAT1 and VMAT2: I. The developing rat central nervous system1Published on the World Wide Web on 3 August 1998.1 //Dev. brain res.. – 1998 a. – Т. 110. – №. 1. – С. 135-158. 132.Hardebo, J. E. Studies on the enzymatic blood‐ brain barrier: Quantitative measurements of DOPA decarboxylase in the wall of microvessels as related to the parenchyma in various CNS regions / J. E. Hardebo, B. FALCK, , C. H. Owman, et al. // Acta Physiol. Scand. – 1979. – Vol. 105. – N. 4. – P. 453-460. 133.Hattori, T. Synaptogenesis in the corpus striatum of infant rat / T. Hattori, P. L. McGeer // Exp Neurol. – 1973. – Vol. 38. – N. 1. – P. 70-79. 134.Heritier, A. G. Influence of thyroliberin on the rat pituitary cell type differentiation: an in vitro study / A. G. Heritier, P. M. Dubois // Endocrinology. – 1993. – Vol. 132. – N. 2. – P. 634-639. 135.Hoeffler, J. P. Ontogeny of Prolactin Cells in Neonatal Rats: Initial Prolactin Secretors also Release Growth Hormone / J. P. Hoeffler, F. R. Boockfor, L. S. Frawley // Endocrinology. – 1985. – Vol. 117. – N. 1. – P. 187-195. 136.Hoffman, A. F. Dopamine transporter activity in the substantia nigra and striatum assessed by high-speed chronoamperometric recordings in brain slices / A. F. Hoffman, C. R. Lupica, G. A. Gerhardt // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1998. – Vol. 287. – N. 2. – P. 487-496. 137.Huber, K. The development of the chromaffin cell lineage from the neural crest / K. Huber, C. Kalcheim, K. Unsicker // Auton Neurosci. – 2009. – Vol. 151. – N. 1. – P. 10-16. 138.Isaac, J. Mechanism of dopamine inhibition of renal phosphate transport / J. Isaac, R. P. Glahn, M. M. Appel, et al. // J Am Soc Nephrol. – 1992. – Vol. 2. – P.1601-1607. 139.Iversen, L. L. Dopamine handbook / L. L. Iversen // Oxford University Press. – 2010. 140.Iversen, L. L. The catecholamines / L. L. Iversen // Nature. – 1967. – Vol. 214. – P. 8-14. 141.Jackson, D. M. Dopamine receptors: molecular biology, biochemistry and behavioural aspects / D. M. Jackson, A. Westlind-Danielsson // Pharmacol. Ther. – 1994. – Vol. 64. – N. 2. – P. 291370. 93 142.Jacobowitz, D. Histochemical studies of the relationship of chromaffin cells and adrenergic nerve fibers to the cardiac ganglia of several species / D. Jacobowitz, // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1967. – Vol. 158. – N. 2. – P. 227-240. 143.Jacobowitz, D. Histofluorescent study of catecholamine-containing elements in cholinergic ganglia from the calf and dog lung / D. Jacobowitz, K. M. Kent, J. H. Fleisch, et al. / / Proc Soc Exp Biol Med. – 1973. – Vol. 144. – N. 2. – P. 464-466. 144.Jadhav, A. L. DA1 receptor mediated regulation of Na+-H+ antiport activity in rat renal cortical brush border membrane vesicles / A. L. Jadhav, Q. Liu // Clinical and Experimental Hypertension. Part A: Theory and Practice. – 1992. – Vol. 14. – N. 4. – P. 653-666. 145.Jaeger, C. B. Aromatic l-aminoacid decar ylase in the rat brain: Immunocytochemical localization during prenatal development / C. B. Jaeger // Neuroscience. – 1986. – Vol. 18. – N. 1. – P. 121-150. 146.Johnston, J. M. Dopamine regulates D 2 receptor gene expression in normal but not in tumorous rat pituitary cells / J. M. Johnston, D. F. Wood, S. Read, et al. // Mol Cell Endocrinol. – 1993. – Vol. 92. – N. 1. – P. 63-68. 147.Jose, P. A. The renal dopamine receptors / P. A. Jose, J. R. Raymond, M. D. Bates et al. // J. Am Soc Nephrol. – 1992. – Vol. 2. – P. 1265-1278. 148.Kalaria, R. N. Differential Postnatal Development of Monoamine Oxidases A and B in the Blood‐Brain Barrier of the Rat / R. N. Kalaria, S. I. Harik // J Neurochem. – 1987. – Vol. 49. – N. 5. – P. 1589-1594. 149.Kalsbeek, A. Development of the dopaminergic innervation in the prefrontal cortex of the rat / A. Kalsbeek, P. Voorn, R. Buijs, et al. // J Comp Neurol. – 1988. – Vol. 269. – N. 1. – P. 58-72. 150.Karhunen, T. Distribution of catechol-O-methyltransferase enzyme in rat tissues / Karhunen, T., Tilgmann, C., Ulmanen, et al. // J Histochem Cytochem. – 1994. – Vol. 42. – N. 8. – P. 1079-1090. 151.Kawano, H. Migration of dopaminergic neurons in the embryonic mesencephalon of mice / H. Kawano, K. Ohyama, K. Kawamura, et al. / Dev. brain res. – 1995. – Vol. 86. – N. 1. – P. 101113. 152.Kawano, H. Functional topography of the rat hypothalamic dopamine neuron systems: retrograde tracing and immunohistochemical study / H. Kawano, S. Daikoku // J. Comp. Neurol. – 1987. – Vol. 265. – N. 2. – P. 242-253. 153.Kedzierski, W. Quantitative study of tyrosine hydroxylase mRNA in catecholaminergic neurons and adrenals during development and aging / W. Kedzierski, J. C. Porter // Mol. Brain Res. – 1990. – Vol. 7. – N 1. – P. 45-51. 94 154.Khorram, O. Hypothalamic control of prolactin secretion during the perinatal period in the rat / O. Khorram, L. R. Depalatis, S. M. McCann // Endocrinology. – 1984. – Vol. 115. – N. 5. – P. 1698-1704. 155.Kineman, R. D. Mammosomatotropes Are Abundant in Bovine Pituitaries: Influence of Gonadal Status* / R. D. Kineman, W. J. Faught, L. S. Frawley, et al. // Endocrinology. – 1991. – Vol. 128. – N. 5. – P. 2229-2233. 156.Kioussi C. A model for the development of the hypothalamic–pituitary axis: transcribing the hypophysis / C. Kioussi, C. Carrière, M. G. Rosenfeld // Mech Dev. – 1999. – Vol. 81. – N. 1. – P. 23-35. 157.Kirby, R. F. Ontogeny of functional sympathetic innervation to the heart and adrenal medulla in the preweanling rat / R. F. Kirby, R. McCarty // J Auton Nerv Syst. – 1987. – Vol. 19. – N. 1. – P. 67-75. 158.Koepsell, H. Organic cation transporters in intestine, kidney, liver, and brain / H. Koepsell // Annu Rev Physiol. – 1998. – Vol. 60. – N. 1. – P. 243-266. 159.Koslow SH (1976) - Mass fragmentographic analysis of SIF cell catecholamines of normal and experimental rat sympathetic ganglia. SIF Cells, Structure and Function of the Small Intensely Fluorescent Sympathetic Cells, ed. O. Eranko, Fogarty Int. Cent. Proc. No. 30, DHEW Pub.:8288. 160.Koslow, S. H. Dopamine and other catecholamine-containing SIF cells / S. H. Koslow // Adv. Biochem. Psychopharmacol. – 1977. – Vol. 16. – P. 553-556. 161.Kostrzewa, R. M. The blood-brain barrier for catecholamines—Revisited / R. M. Kostrzewa // Neurotox Res. – 2007. – Vol. 11. – N. 3-4. – P. 261-271. 162.Kostrzewa, R. M.Pharmacological actions of 6-hydroxydopamine / R. M. Kostrzewa, D. M. Jacobowitz // Pharmacol Rev. – 1974. – Vol. 26. – N 3. – P. 199-288. 163.Kujacic, M. Acute changes in dopamine levels in rat adrenal glands after administration of dopamine receptor agonists and antagonists / M. Kujacic, K. Svensson, L. Löfberg, et al. / Eur. J. Pharmacol. – 1990. – Vol. 177. – N. 3. – P. 163-170. 164.Kumer, S. C. Intricate regulation of tyrosine hydroxylase activity and gene expression / S. C. Kumer, K. E. Vrana // J Neurochem. – 1996. – Vol. 67. – N. 2. – P. 443-462. 165.Kurtz, A. Rat juxtaglomerular cells are endowed with DA-1 dopamine receptors mediating renin release / A. Kurtz, R. D. Bruna, J. Pratz, et al. // J Cardiovasc Pharmacol. – 1988. – Vol. 12. – N. 6. – P. 658-663. 166.Lauder, J. M. Neurotransmitters as growth regulatory signals: role of receptors and second messengers / J. M. Lauder // Trends Neurosci. – 1993. – Vol. 16. – N. 6. – P. 233-240. 95 167.Lauder, J. M. Ontogeny of monoamine neurons in the locus coeruleus, raphe nuclei and substantia nigra of the rat. I. Cell differentiation / J. M. Lauder, F. E. Bloom // J. Comp. Neurol. – 1974. – Vol. 155. – N. 4. – P. 469-481. 168.Le Douarin, N. The neural crest / N. Le Douarin, C. Kalcheim // Cambridge University Press. – 1999. – N. 36. 169.Lehmann, E. Vasopressin mRNA in the neurolobe of the rat pituitary / E. Lehmann, J. Hanze, M. Pauschinger, et al. // Neurosci Lett. – 1990. – Vol. 111. – N. 1. – P. 170-175. 170.Leong, D. A. Neuroendocrine control of prolactin secretion / D. A. Leong, L. S. Frawley, J. D. Neill // Annu Rev Physiol. – 1983. – Vol. 45. – N. 1. – P. 109-127. 171.Levitt, M. Elucidation of the rate-limiting step in norepinephrine biosynthesis in the perfused guinea-pig heart / M. Levitt, S. Spector, A. Sjoerdsma et al. // J Pharmacol Exp Ther. – 1965. – Vol. 148. – N. 1. – P. 1-8. 172.Li, Z. S. Physiological modulation of intestinal motility by enteric dopaminergic neurons and the D2 receptor: analysis of dopamine receptor expression, location, development, and function in wild-type and knock-out mice / Z. S. Li, C. Schmauss, A. Cuenca, et al. // J. Neurosci. – 2006. – Vol. 26. – N. 10. – P. 2798-2807. 173.Liu, X. Development of a computational approach to predict blood-brain barrier permeability / X. Liu, M. Tu, R. S. Kelly, et al. // Drug Metab Dispos. – 2004. – Vol. 32. – N. 1. – P. 132-139. 174.Lohr K. M. Increased vesicular monoamine transporter enhances dopamine release and opposes Parkinson disease-related neurodegeneration in vivo / K. M. Lohr, A. I. Bernstein, K. A. Stout // PNAS. – 2014. – Vol. 111. – N. 27. – P. 9977-9982. 175.Loizou, L. A. Uptake of monoamines into central neurones and the blood‐brain barrier in the infant rat / L. A. Loizou // Br J Pharmacol. – 1970. – Vol. 40. – N. 4. – P. 800-813. 176.Luque, J. M. Cellular expression of mRNAs encoding monoamine oxidases A and B in the rat central nervous system / J. M. Luque, S. W. Kwan, C. W. Abell, et al. / J Comp Neurol.– 1995. – Vol. 363. – N. 4. – P. 665-680. 177.Marín, F. Ontogeny of tyrosine hydroxylase mRNA expression in mid‐and forebrain: Neuromeric pattern and novel positive regions / F. Marín, M. T. Herrero, S. Vyas, et. al. // Dev Dyn. – 2005. – Vol. 234. – N. 3. – P. 709-717. 178.Meister, B. Dopamine-and cAMP-regulated phosphoprotein (DARPP-32) and dopamine DA1 agonist-sensitive Na+, K+-ATPase in renal tubule cells / B. Meister, J. Fryckstedt, M. Schalling et al. // PNAS. – 1989. – Vol. 86. – N. 20. – P. 8068-8072. 179.Meister, B. Do tyrosine hydroxylase-immunoreactive neurons in the ventrolateral arcuate nucleus produce dopamine or only L-dopa? / B. Meister, T. Hökfelt, H. W. Steinbusch, et al. // J. Chem. Neuroanat. – 1987. – Vol. 1. – N. 1. – P. 59-64. 96 180.Meister, B. Catechol-O-methyltransferase mRNA in the kidney and its appearance during ontogeny / B. Meister, A. J. Bean, A. Aperia // Kidney Int. – 1993. – Vol. 44. – P. 726-726. 181.Melnikova, V. I. Prolactin secretion and its dopamine inhibitory control in rat fetuses / Melnikova, V. I., Orosco, M., Rouch, C.European et al. // Eur J Endocrinol. – 1998. – Vol. 139. – N. 3. – P. 337-342. 182.Merits, I. Formation and metabolism of [14 C] dopamine 3-O-sulfate in dog, rat and guinea pig / I. Merits. // Biochem Pharmacol. – 1976. – Vol. 25. – N. 7. – P. 829-833. 183.Mezey, E. Dopamine produced by the stomach may act as a paracrine/autocrine hormone in the rat / E. Mezey, G. Eisenhofer, S. Hansson, et al. // Neuroendocrinology. – 1998. – Vol. 67. – N. 5. – P. 336-348. 184.Mezey, E. A novel nonneuronal catecholaminergic system: exocrine pancreas synthesizes and releases dopamine / E. Mezey, G. Eisenhofer, G. Harta, et. al. // PNAS. – 1996. – Vol. 93. – N. 19. – P. 10377-10382. 185.Millhorn, D. E. Chemical messengers and their coexistence in individual neurons / D. E. Millhorn, T. Hokfelt // Physiology. – 1988. – Vol. 3. – N. 1. – P. 1-5. 186.Missale, C. Identification and characterization of postsynaptic D1- and D2-dopamine receptors in the cardiovascular system / C. Missale, L. Castelletti, M. Memo et al. // J Cardiovasc Pharmacol. – 1988. – Vol. 11. – P. 643-650. 187.Missale, C. Dopaminergic receptor mechanisms modulating the renin-angiotensin system and aldosterone secretion: an overview / C. Missale, C. Lombardi, R. De Cotiis et al. // J Cardiovasc Pharmacol 14 Suppl. – 1989. – Vol. 8. – P.29-39. 188.Missale, C. Dopamine receptors: from structure to function / C. Missale, S. R. Nash, S. W. Robinson et al. // Physiol Rev. – 1998. – Vol. 78. – N. 1. – P. 189-225. 189.Miyaguchi, H. Dopamine penetrates to the central nervous system in developing rats / H. Miyaguchi, I. Kato, T. Sano, et al. // Pediatr Int. – 1999. – Vol. 41. – N. 4. – P. 363-368. 190.Modlin, I. M. The gastric enterochromaffin-like cell: an enigmatic cellular link / I. M. Modlin L. H. Tang // Gastroenterology. – 1996. – Vol. 111. – N. 3. – P. 783-810. 191.Mogg, R. J. Interactions of Dopaminergic and Peptidergic Factors in the Control of Prolactin Release / R. J. Mogg, W. K. Samson // Endocrinology. – 1990. – Vol. 126. – N. 2. – P. 728-735. 192.Morishige, W. K. A paradoxical inhibiting effect of ether on prolactin release in the rat: comparison with effect of ether on LH and FSH / Morishige WK, Rothchild I // Neuroendocrinology. – 1974. – Vol. 16. – P.95-107. 193.Nagatsu, T. Regulation of pteridine-requiring enzymes by the cofactor tetrahydrobiopterin / T. Nagatsu, H. Ichinose // Mol Neurobiol. – 1999. – Vol. 19. – N. 1. – P. 79-96. 97 194.Nagatsu, T. Catecholamine synthesis and release. Overview / T. Nagatsu, L. Stjarne // Adv. Pharmacol. – 1998. – Vol. – N. 42. – H. 1-14. 195.Nagatsu, T. Cellular and molecular mechanisms of Parkinson’s disease: neurotoxins, causative genes, and inflammatory cytokines / T. Nagatsu, M. Sawada // Cell Mol Neurobiol. – 2006. – Vol. 26. – N. 4-6. – P. 779-800. 196.Nash, S. R. Cloning and characterization of the opossum kidney cell D1 dopamine receptor: expression of identical D1A and D1B dopamine receptor mRNAs in opossum kidney and brain / S. R. Nash, N. Godinot, M. G. Caron / Mol pharmacol. – 1993. – Vol. 44. – N. 5. – p. 918-925. 197.Neill J. D. Neuroendocrine regulation of prolactin secretion / J. D. Neill // Frontiers in neuroendocrinology. – 1980. – Vol. 6. – P. 129-155. 198.Nemeskeri, A. Prolactin-synthesizing and prolactin-releasing activity of fetal and early postnatal rat pituitaries: in vivo and in vitro studies using RIA, reverse hemolytic plaque assay and immunocytochemistry / A. Nemeskeri, Z. Acs, B. E. Tóth // Neuroendocrinology. – 1995. – Vol. 61. – N. 6. – P. 687-694. 199.Nemeskeri A. Ontogenesis of the three parts of the fetal rat adenohypophysis / A. Nemeskeri, G. Setalo, B. Halasz // Neuroendocrinology. – 1988. – Vol. 48. – N. 5. – P. 534-543. 200.Nicotra, A. Monoamine oxidase expression during development and aging / A. Nicotra, F. Pierucci, H. Parvez, et al. // Neurotoxicology. – 2004. – Vol. 25. – N. 1. – P. 155-165. 201.Okamura, H. Comparative topography of dopamine-and tyrosine hydroxylase-immunoreactive neurons in the rat arcuate nucleus / H. Okamura, K. Kitahama, I. Nagatsu, et al. // Neuroscience letters. – 1988. – Vol. 95. – N. 1. – P. 347-353. 202.Okura, T. Functional characterization of rat plasma membrane monoamine transporter in the blood–brain and blood–cerebrospinal fluid barriers / T. Okura, S. Kato, Y Takano, et.al. // J. Pharm. Sci. – 2011. – Vol. 100. – N. 9. – P. 3924-3938. 203.Olson, L. Early prenatal ontogeny of central monoamine neurons in the rat: fluorescence histochemical observations / L. Olson, A Z Seiger // Z Anat Entwicklungsgesch. 1972. – Vol. 137. – N.301-316. 204.O'Malley, K. L. The rat dopamine D4 receptor: sequence, gene structure, and demonstration of expression in the cardiovascular system / K. L. O'Malley, S. Harmon, L. Tang, et al. // New Biol. – 1992. – Vol. 4. – N. 2. – P. 137-146. 205.O’shaughnessy, P. J. Fetal Development of Leydig Cell Activity in the Mouse Is Independent of Pituitary Gonadotroph Function 1 / P. J. O'Shaughnessy, P. Baker, U. Sohnius, A. M. Haavisto et al. // Endocrinology. – 1998. – Vol. 139. – N. 3. – P. 1141-1146. 206.Page, R. B. The pituitary portal system Morphology of Hypothalamus and its Connections / R. B. Page // Springer Berlin Heidelberg. – 1986. – P. 1-47. 98 207.Phelps, C. J. Pituitary hormones as neurotrophic signals: anomalous hypophysiotrophic neuron differentiation in hypopituitary dwarf mice / C. J. Phelps // Exp. Biol. Med. – 1994. – Vol. 206. – N. 1. – P. 6-23. 208.Pickel, V. M. Cellular localization of tyrosine hydroxylase by immunohistochemistry / V. M. Pickel, T. H. Joh, P. M. Field, et al. // J Histochem Cytochem. – 1975. – Vol. 23. – N. 1. – P. 112. 209.Piotte, M. Light and electron microscopic study of tyrosine hydroxylase-immunoreactive neurons within the developing rat arcuate nucleus / M. Piotte, A. Beaudet, J. R. Brawer // Brain res. – 1988. – Vol. 439. – N. 1. – P. 127-137. 210.Porter, T. E. Evidence for Bidirectional Interconversion of Mammotropes and Somatotropes: Rapid Reversion of Acidophilic Cell Types to Pregestational Proportions after Weaning / T. E. Porter, C. D. Wiles, L. S. Frawley //Endocrinology. – 1991. – Vol. 129. – N. 3. – P. 1215-1220. 211.Prakash, N. Development of dopaminergic neurons in the mammalian brain / N. Prakash, W. Wurst / Cell Mol Life Sci. – 2006. – Vol. 63. – N. 2. – P. 187-206. 212.Prosser, C. G. The galactopoietic effect of bovine growth hormone in goats is associated with increased concentrations of insulin-like growth factor-I in milk and mammary tissue / C. G. Prosser, C. Royle, I. R. Fleet, et al. // J. endocrinol. – 1991. – Vol. 128. – N. 3. – P. 457-463. 213.Puymirat, J. Triiodothyronine enhances the morphological maturation of dopaminergic neurons from fetal mouse hypothalamus cultured in serum-free medium / J. Puymirat, A. Barret, R. Picart, et al. // Neuroscience. – 1983. – Vol. 10. – P. 801-810. 214.Raiteri, M. Dopamine can be released by two mechanisms differentially affected by the dopamine transport inhibitor nomifensine / M. Raiteri, F. Cerrito, A. M. Cervoni, et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1979. – Vol. 208. – N. 2. – P. 195-202. 215.Regitz, V. Myocardial adenine nucleotide concentrations and myocardial norepinephrine content in patients with heart failure secondary to idiopathic dilated or ischemic cardiomyopathy / V. Regitz, E. Fleck // Am. J. Cardiol. – 1992. – Vol. 69. – N. 19. – P. 15741580. 216.Reinhard, J. F. Subcellular compartmentalization of 1-methyl-4-phenylpyridinium with catecholamines in adrenal medullary chromaffin vesicles may explain the lack of toxicity to adrenal chromaffin cells / J. F. Reinhard, E. J. Diliberto, O. H. Viveros, et al. // PNAS. – 1987. – Vol. 84. – N. 22. – P. 8160-8164. 217.Reith, M. E. A. Pharmacology and regulation of the neuronal dopamine transporter / M. E. A. Reith, C .Xu, N. H. Chen // Eur J Pharmacol. – 1997. – Vol. 324. – N. 1. – P. 1-10. 99 218.Sales, N. Ontogeny of dopaminergic D-2 receptors in the rat nervous system: characterization and detailed autoradiographic mapping with [125 I] iodosulpride / N. Sales, M. P. Martres, M. L. Bouthenet // Neuroscience. – 1989. – Vol. 28. – N. 3. – P. 673-700. 219.Saucedo-Cardenas, O. Nurr1 is essential for the induction of the dopaminergic phenotype and the survival of ventral mesencephalic late dopaminergic precursor neurons / O. SaucedoCardenas, J. D. Quintana-Hau, W. D. Le, et al. // PNAS. – 1998. – Vol. 95. – N.7. – P. 40134018. 220.Schambra, U. B. Ontogeny of D 1A and D 2 dopamine receptor subtypes in rat brain using in situ hybridization and receptor binding / U. B. Schambra, G. E. Duncan, G. R. Breese, et al. // Neuroscience. – 1994. – Vol. 62. – N. 1. – P. 65-85. 221.Schober, A. Cell Loss and Autophagy in the Extra‐Adrenal Chromaffin Organ of Zuckerkandl are Regulated by Glucocorticoid Signalling / A. Schober, R. Parlato, K. Huber, et al. // J. neuroendocrinol. – 2013. – Vol. 25. – N. 1. – P. 34-47. 222.Schütz, B. Vesicular amine transporter expression and isoform selection in developing brain, peripheral nervous system and gut / B. Schütz, M. K. H. Schäfer, L. E. Eiden, et al. // Dev. brain res. – 1998. – Vol. 106. – N.1. – P. 181-204. 223.Scully, K. M. Pituitary development: regulatory codes in mammalian organogenesis / K. M. Scully, M. G. Rosenfeld // Science. – 2002. – Vol. 295. – N. 5563. – P. 2231-2235. 224.Shih, J. C. Monoamine oxidase: from genes to behavior / J. C. Shih, K. Chen, M. J. Ridd / Annu Rev Neurosci. – 1999. – Vol. 22. – P. 197. 225.Shoaf, S. E. Distribution of free and conjugated dopamine in rats and mice / S. E. Shoaf, M. A. Elchisak // Life Sci. – 1983. – Vol. 33. – N. 7. – P. 625-630. 226. Shults, C. W. Dopaminergic cells align along radial glia in the developing mesencephalon of the rat / C. W. Shults, R. Hashimoto, R. M Brady, et al. // Neuroscience. – 1990. – Vol. 38. – N. 2. – P. 427-436. 227.Sibley, D. R. Molecular biology of dopamine receptors / D. R. Sibley, F. J. Monsma // Trends Pharmacol Sci. – 1992. – Vol. 13. – P. 61-69. 228. Simerly, R. B. Influence of perinatal androgen on the sexually dimorphic distribution of tyrosine hydroxylase-immunoreactive cells and fibers in the anteroventral periventricular nucleus of the rat / R. B. Simerly, L. W. Swanson, R. J. Handa, et al. // Neuroendocrinology. – 1985. – Vol. 40. – N. 6. – P. 501-510. 229.Simerly, R. B. Estrogen differentially regulates neuropeptide gene expression in a sexually dimorphic olfactory pathway / R. B Simerly, B. J. Young, M. A. Capozza et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. – 1989. – Vol. 86. – N. 12. – P. 4766-4770. 100 230.Smidt, M. P. How to make a mesodiencephalic dopaminergic neuron / M. P. Smidt, J. P. H. Burbach // Nature Rev. Neurosci. – 2007. – Vol. 8. – N. 1. – P. 21-32. 231. Smith, S. S. Maternal Modulation of Infantile Ovarian Development and Available Ovarian Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) Receptors via Milk LHRH* / S. S. Smith, S. R. Ojeda // Endocrinology. – 1984. – Vol. 115. – N. 5. – P. 1973-1983. 232.Smits, S. M. Involvement of Nurr1 in specifying the neurotransmitter identity of ventral midbrain dopaminergic neurons / S. M. Smits, T. Ponnio, O. M. Conneely, et al. // European J. Neurosci. – 2003. – Vol. 18. – N. 7. – P. 1731-1738. 233.Specht, L. A. Light-microscopic immunocytochemical localization of tyrosine hydroxylase in prenatal rat brain. I. Early ontogeny // L. A. Specht, V. M. Pickel, T. H. Joh, et al. // J. Comp. Neurol. – 1981. – Vol. 199. – P. 233-253. 234.Štrbák, V. Transport of 3H-TRH from plasma to rat milk: accumulation and slow degradation in milk and presence of unaltered hormone in gastric content of pups / V. Štrbák, M. Alexandrova, L. Macho, et al. // Biol Neonate. – 1980. – Vol. 37. – N. 5-6. – P. 313-321. 235.Strolin, B. M. Developmental aspects of the monoamine-degrading enzyme monoamine oxidase / B. M. Strolin, P. Dostert, K. F. Tipton // Dev Pharmacol Ther. – 1991. – Vol. 18. – N. 3-4. – P. 191-200. 236. Sugamori, K. S. A cognate dopamine transporter-like activity endogenously expressed in a COS-7 kidney-derived cell line / K. S. Sugamori, F. J. Lee, Z. B. Pristupa, et al. // FEBS letters. – 1999. – Vol.451. – N. 2. – P. 169-174. 237.Svennilson, J. Dopamine in the developing kidney / J. Svennilson, A. Aperia // Int. J. Dev. Biol. – 1999. – Vol.43. – P. 441-443. 238.Sweet, D. H. Organic anion and cation transporter expression and function during embryonic kidney development and in organ culture models // D. H. Sweet, S. A. Eraly, D. A. Vaughn, et al. // Kidney int. – 2006. – Vol. 69. – N. 5. – P. 837-845. 239.Szabó, K. The vascular architecture of the developing pituitary-median eminence complex in the rat / K. Szabó, K. Csányi // Cell Tissue Res. – 1982. – Vol. 224. – N. 3. – P. 563-577. 240. Takahashi, S. Development and heterogeneity of prolactin cells / S. Takahashi // Int. Rev. Cytol. – 1995. – Vol. 157. – P. 33-98. 241.Takeda H. Astroglial dopamine transport is mediated by norepinephrine transporter/ H Takeda, M. Inazu, T. Matsumiya // Naunyn. Schmiedebergs. Arch. Pharmacol. – 2002. – Vol. 366. – N. 6. – P. 620-623. 242. Takeyama, M. Enzyme immunoassay of somatostatin (SS)-like immunoreactive substance in bovine milk / M. Takeyama, N. Yanaga, K. Yarimizu, et al. // Chemical Pharmacology Bulletin. – 1990. – Vol. 38. – P. 456–459. 101 243.Taniguchi, Y. Proliferation and differentiation of rat anterior pituitary cells / Y. Taniguchi, S. Yasutaka, R. Kominami, et al. // Anat. Embryol. (Berl). – 2002. – Vol. 206. – N. 1-2. – P. 1-11. 244.Tank, A. W. Regulation of tyrosine hydroxylase activity by muscarinic agonists in rat adrenal medulla / A. W. Tank, C. A. Osterhout, C. R. Sterling // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1998. Vol. 286. – N.2. – P 848-854. 245.Teitelman, G. Expression of amino acid decarboxylase in proliferating cells of the neural tube and notochord of developing rat embryo / G. Teitelman, C. B. Jaeger, V. Albert, et al. // J Neurosci. – 1983. – Vol. 3. – N. 7. – P. 1379-1388. 246.Torres, G. E. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function / G. E. Torres, R. R. Gainetdinov, M. G. Caron // Nature Rev. Neurosci. – 2003. – Vol. 4. – N. 1. – P. 13-25. 247.Tougard C, Tixier-Vidal A (1988) - Lactotropes and gonadotropes The Physiology of Repreoduction / Ed. E. Knobil, J. Neill, et al. - Raven Press, New York - P.1305-1333. 248.Towle, A. C. Serotonergic innervation of the rat caudate following a neonatal 6hydroxydopamine lesion: an anatomical, biochemical and pharmacological study / A. C. Towle, H. E. Criswell, E. Maynard, et al.// Pharmacol. Biochem. Behav. – 1989. – Vol. 34. – N. 2. – С. 367-374. 249.Ugrumov, M. V. Hypothalamic monoaminergic systems in ontogenesis: development and functional significance / M. V. Ugrumov // Int. J. Dev. Biol. – 1997. – Vol. 41. – P. 809-816. 250. Ugrumov, M. V. The adsorptive and transport capacity of tanycytes during the perinatal period of the rat / M. V. Ugrumov, M. S. Mitskevich // Cell Tissue Res. – 1980. – Vol. 211. – N. 3. – P. 493-501. 251.Ugrumov, M. V. Development of the suprachiasmatic nucleus in rats during ontogenesis: serotonin-immunopositive fibers / M. V. Ugrumov, A. P. Popov, S. V. Vladimirov et al. // Neuroscience. – 1994. – Vol.58. – P.161-165. 252.Ugrumov, M. V. Ontogenesis of tyrosine hydroxylase-immunopositive structures in the rat hypothalamus. An atlas of neuronal cell bodies / M. V. Ugrumov, J. A. Taxi, Tixier-Vidal, et al. // Neuroscience. – 1989a. – Vol. 29. – P.135-156. 253.Ugrumov, M. V. Ontogenesis of tyrosine hydroxylase-immunopositive structures in the rat hypothalamus. Fiber pathways and terminal fields / M. V. Ugrumov, A. Tixier-Vidal, J. Taxi, et al. // Neuroscience. – 1989b. – Vol.29. – P.157-166. 254.Ugrumov M. V. Developing brain as an endocrine organ: a paradoxical reality / M. V. Ugrumov // Neurochem. Res. – 2010. – Vol. 35. – N. 6. – P. 837-850. 102 255.Ugrumov M. V. Brain neurons partly expressing dopaminergic phenotype: location, development, functional significance, and regulation / M. V. Ugrumov // Adv. Pharmacol. – 2013. – Vol. 68. – P. 37-91. 256.Ugrumov, M. V. Dopamine synthesis by non-dopaminergic neurons expressing individual complementary enzymes of the dopamine synthetic pathway in the arcuate nucleus of fetal rats / M. V. Ugrumov, V. I. Melnikova, A. V. Lavrentyeva, et al. // Neuroscience. – 2004. – Vol. 124. – N. 3. – P. 629-635. 257.Ugrumov, M. V. Developing brain as an endocrine organ: secretion of dopamine / M. V. Ugrumov, J. Y. Saifetyarova, A. V. Lavrentieva, et. al. // Mol. Cell. Endocrinol.. – 2012. Vol. 348. – N. 1. – P. 78-86. 258.Ugrumov, M. Neurons expressing individual enzymes of dopamine synthesis in the mediobasal hypothalamus of adult rats: Functional significance and topographic interrelations / M. Ugrumov, J. Taxi, T. Pronina, et al. // Neuroscience. – 2014. – Vol. 277. – P. 45-54 259.Unsicker, K. Resolved and open issues in chromaffin cell development / K. Unsicker, K. Huber, A. Schober, et al. // Mech Dev. – 2013. – Vol. 130. – N. 6. – P. 324-329. 260.Van Tol, H. H. M. Multiple dopamine D4 receptor variants in the human population / H. H. Van Tol, C. M. Wu, H. C. Guan, et al. // Nature. – 1992. – Vol. 358. – N 6382. – P. 149-52. 261.Vaughan, R. A. Protein kinase C-mediated phosphorylation and functional regulation of dopamine transporters in striatal synaptosomes / R. A. Vaughan, R. A. Huff, G. R. Uhl et/ al. // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol. 272. – N. 24. – P. 15541-15546. 262.Verhofstad, A. A. J. Appearance of tyrosine hydroxylase, aromatic amino-acid decarboxylase, dopamine β-hydroxylase and phenylethanolamine N-methyltransferase during the ontogenesis of the adrenal medulla / A. A. J. Verhofstad, T. Hökfelt, M. Goldstein, et al. // Cell Tissue Res. – 1979. – Vol. 200. – N. 1. – P. 1-13. 263.Verney, C. Development of the dopaminergic innervation of the rat cerebral cortex. A light microscopic immunocytochemical study using anti-tyrosine hydroxylase antibodies / C. Verney, B. Berger, J. Adrien, et. al. // Dev. Brain Res. – 1982. – Vol. 5. – N. 1. – P. 41-52. 264. Vincent, D. R. Effect of PCB and DES on rat monoamine oxidase, acetylcholinesterase, testosterone, and estradiol ontogeny / D. R. Vincent, W. S. Bradshaw, G. M. Booth, et al. // Bull. Environ. Contam. Toxicol. – 1992. – Vol. 48. – N. 6. – P. 884-893. 265.Vitalis, T. Defects of tyrosine hydroxylase-immunoreactive neurons in the brains of mice lacking the transcription factor Pax6 / T. Vitalis, O. Cases, D. Engelkamp, et al. // J. Neurosci. – 2000. – Vol. 20. – N. 17. – P. 6501-6516. 103 266.Vitalis, T. Developmental expression of monoamine oxidases A and B in the central and peripheral nervous systems of the mouse / T. Vitalis, C. Fouquet, C. Alvarez, et al. / J. Comp. Neurol. – 2002. – Vol. 442. – N. 4. – P. 331-347. 267.Voorn, P. The pre-and postnatal development of the dopaminergic cell groups in the ventral mesencephalon and the dopaminergic innervation of the striatum of the rat / P. Voorn, A. Kalsbeek, B. Jorritsma-Byham , et.al // Neuroscience. – 1988. – Vol. 25. – N. 3. – P. 857-887. 268.Wang, P. C. Conjugation patterns of endogenous plasma catecholamines in human and rat. A new specific method for analysis of glucuronide-conjugated catecholamines / P. C. Wang, N. T. Buu, O. Kuchel, et al / J. Lab. Clin. Med. – 1983. – Vol. 101. – N. 1. – P. 141-151. 269.Wang, C. C. Monoamine oxidases in development / C. C. Wang, E. Billett, A. Borchert, et al. / Cellular and Molecular Life Sciences. – 2013. – Vol. 70. – N. 4. – P. 599-630. 270.Watanabe, Y. Immunohistochemical study on adenohypophysial primordia in organ culture / Y. G. Watanabe, S. Daikoku / Cell Tissue Res. – 1976. – Vol. 166. – N. 3. – P. 407-412. 271.Weihe, E. Localization of vesicular monoamine transporter isoforms (VMAT1 and VMAT2) to endocrine cells and neurons in rat / E. Weihe, M. K. H. Schäfer, J. D. Erickson, et al. // J. Mol. Neurosci. – 1994. Vol. 5. – N. 3. – P. 149-164. 272.Weiner, R. Role of classic and peptide neuromediators in the neuroendocrine regulation of LH and prolactin / R. Weiner // The physiology of reproduction. – 1988. 273.Weström, B. R. Levels of immunoreactive insulin, neurotensin, and bombesin in porcine colostrum and milk / B. R. Weström, R. Ekman, L. Svendsen, et al. // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. – 1987. – Vol. 6. – N. 3. – P. 460-465. 274.Willems, J. L. Neuronal dopamine receptors on autonomic ganglia and sympathetic nerves and dopamine receptors in the gastrointestinal system / J. L. Willems, W. A. Buylaert, R. A. Lefebvre, et al. // Pharmacol. Rev. – 1985. – Vol. 37. – P. 165-216. 275.Wu, X. Structure, function, and regional distribution of the organic cation transporter OCT3 in the kidney / X. Wu, W. Huang, M. E. Ganapathy, et al. // Am. J. Physiol.Renal Physiology. – 2000. – Vol. 279. – N. 3. – P449-458. 276.Yokoyama, C. Resistance of hypothalamic dopaminergic neurons to neonatal 6hydroxydopamine toxicity / C. Yokoyama, H. Okamura, Y. Ibata // Brain Res. Bull. – 1993. Vol. 30. – N. 5. – P. 551-559. 277.Yuemin, T. The Comparison of Distribution of Dopaminergic Cells and Different Expression of Gene TH and DAT among the Gastrointestinal Tract of Rat / T. Yuemin, C. Xin, W. Wei, et al. // Journal of Capital Medical University. – 2007. – Vol. 2 P. 028. 278.Zeng, C. The dopaminergic system in hypertension / C. Zeng, M. Zhang, L. D. Asico et al. // Clin Sci (Lond). – 2007. Vol.112. – P. 583-597. 104 279.Zetterström, R. H. Dopamine neuron agenesis in Nurr1-deficient mice / R. H. Zetterström, L. Solomin, L. Jansson, et al. // Science. – 1997. Vol. – 276. N. – 5310. – P. 248-250. 280.Zhang, E. Y. Structural biology and function of solute transporters: implications for identifying and designing substrates / E. Y. Zhang, G. T. Knipp, S. Ekins, et al. // Drug metabolism reviews. – 2002. Vol. 34. – N. 4. – P. 709-750. 281.Zhou, Q. Y. Targeted disruption of the tyrosine hydroxylase gene reveals that catecholamines are required for mouse fetal development / Q. Y. Zhou, C. J. Quaife, R. D. Palmiter // Nature. – 1995. – Vol. 374 – P. 640-643. 282.Мицкевич, М. С. Гормональные регуляции в онтогенезе животных / М. С. Мицкевич // М. Наука. – 1978. – C. 224. 283.Розен, В. Б. Основы эндокринологии / В. Б. Розен // М. Высшая школа. – 1984 – C. 336. 284.Сайфетярова, Ю. Ю. Эндокринная функция дофаминергических нейронов мозга у крыс в перинатальном периоде / Ю. Ю. Сайфетярова, Е.А. Дегтярева, А. Я. Сапронова, М.В. Угрюмов // Нейрохимия. – 2011. – Т.28. – №3. – C .192-199. 285.Сайфетярова, Ю.Ю. Эндокринная функция дофаминергических нейронов целостного мозга у крыс в онтогенезе: регуляция секреции пролактина. / Ю. Ю. Сайфетярова, А. Я. Сапронова, М. В. Угрюмов // ДАН. – 2012. – Т. 443. – № 6. – С. 1-4. 286.Угрюмов, М. В. Мозг в роли эндокринной железы во взрослом и развивающемся организме / М. В. Угрюмов // Российский физиологический журнал им. ИМ Сеченова. – 2004. – Т. 90. – №. 5. – С. 625-637.
