На правах рукописи КОРРЕКЦИЯ СОДЕРЖАНИЯ МЕЛАТОНИНА
advertisement
ФГБОУ ВПО РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ КАФЕДРА АКУШЕРСТВА И ГИНЕКОЛОГИИ С КУРСОМ ПЕРИНАТОЛОГИИ На правах рукописи ЕРМОЛЕНКО КРИСТИНА СТАНИСЛАВОВНА КОРРЕКЦИЯ СОДЕРЖАНИЯ МЕЛАТОНИНА В ПРОГРАММАХ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 14.00.01 - Акушерство и гинекология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.м.н., проф. Радзинский В.Е.; д.м.н., проф. Рапопорт С.И. МОСКВА 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ Список условных сокращений…………………………………………………..3 Введение……………………………………………………………………………4 Глава I. Современное состояние проблемы реализации фертильной функции женщин старшего репродуктивного возраста. Обзор литературы……………10 Глава II. Контингент, материал и методы исследования………………………29 Глава III. Клиническая характеристика обследованных женщин ……………41 Глава IV. Результаты лабораторных и инструментальных методов исследования ……………………………………………………………………. 56 4.1. Результаты ультразвукового исследования органов малого таза ………56 4.2. Результаты гистероскопии…………………………………………………..59 4.3. Результаты гормонального исследования………………………………….61 4.4. Определение уровня эндометриального белка АМГФ в менструальной крови.………………………………………………………………………………64 4.5. Содержание мелатонина у женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием…………………………………………….66 Глава V. Повышение результативности экстракорпорального оплодотворения у женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием…………………………………………………………………………70 5.1. Обоснование возможности влияния на патогенетические звенья нарушений гомеостаза у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием…………………70 5.2. Эффективность включения мелатонина в программу ЭКО……………….73 5.3. Преодоление трубно-перитонеального бесплодия…………………………80 Заключение………………………………………………………………………….87 Выводы…………………………………………………………………………….102 Практические рекомендации…………………………………………………….103 Указатель литературы…………………………………………………………..104 3 Список условных сокращений. АМГ – антимюллеровый гормон. АМГФ - α2-микроглобулин фертильности (гликоделин А, плацентарный протеин - РР14, PEP). ВМК – внутриматочный контрацептив. ВРТ – вспомогательные репродуктивные технологии. ГСЗ – гнойно-септические заболевания. ГнРГ (GnRH) – гонадотропин рилизинг гормон. ГнИГ (GnIH) – гонадотропин ингибирующий гормон. ЗППП – заболевания, передаваемые половым путем. ИМТ – индекс массы тела. ЛГ – лютеинизирующий гормон НЛФ – недостаточность лютеиновой фазы. ПН – плацентарная недостаточность. ПИН – повторные имплантационные неудачи. ПОНРП – преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты. СГЯ – синдром гиперстимуляции яичников. СПКЯ – синдром поликистозных яичников. ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение. ФСГ – фолликулостимулирующий гормон. ФПС – фетоплацентарная система. ХГ – хорионический гонадотропин. УЗИ – ультразвуковое исследование. 4 ВВЕДЕНИЕ. Актуальность проблемы. воспроизводства, Наряду со сложившейся моделью характеризующейся резким падением суженного коэффициента рождаемости и снижением доли повторных рождений, прослеживается и оборотная сторона проблемы – это увеличение числа супружеских пар, страдающих инфертильностью. Бесплодные браки за последнее время возрастают с пугающей скоростью: их частота увеличилась с 10-15% до 2530% и, по всей видимости, тенденция к их снижению наметится не скоро [8; 95]. В России зарегистрировано 6,5 млн. женщин, страдающих бесплодием, и около 4 млн. мужчин с этим диагнозом, и их число с каждым годом увеличивается [50]. Присуждение Нобелевской премии 2010 года 85-летнему британскому ученому Роберту Эдвардсу явилось признанием того факта, что вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) открыли новую эру в решении демографических проблем. По данным В.С.Корсака (2011) [19], только в 2010 году родилось 100000 «детей ЭКО», что составляет 1 на 200 родов в США и более 1 на 50 родов в Великобритании, Франции, Скандинавии и Израиле. Бесплодный брак остается одной из важнейших медицинских, социальных и общегосударственных проблем. Частота бесплодного брака в России составляет 15-17%, это при том, что показатель, равный 15%, является критическим и проблема бесплодия приобретает государственное значение. Исходя из существующей ситуации, лечение бесплодия следует рассматривать как резерв рождения желанных детей, перспективное репродуктивного потенциала страны. Именно поэтому увеличение важнейшим и принципиальным этапом в лечении бесплодия явилось разработка и внедрение в клиническую практику методов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), сделав возможным реализовывать функцию деторождения практически при всех формах женского бесплодия, в том числе и тех, которые ранее считались бесперспективными. Эффективность метода ЭКО и переноса эмбрионов (ПЭ) 5 по показателю частоты наступления беременности на перенос эмбрионов в европейских и российских клиниках колеблется от 20% до 30%, составляя в среднем 26,2%, что приближается к показателям естественной фертильности человека [30]. Однако, несмотря на столь оптимистические данные, в России выполняется менее 2% циклов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ), регистрируемых в мире, в то время как около 2 млн. бесплодных женщин нуждаются в них. Тенденция позднего материнства, зародившаяся в конце XX века в европейских странах, в настоящее время нашла широкое распространение в России. К сожалению, нет оснований рассчитывать, что ситуация будет меняться, напротив, по статистическим прогнозам доля позднего материнства в России неуклонно растет [31]. В то же время, неоспорим факт того, что биологические возможности деторождения потенциальных матерей старшего репродуктивного возраста ограничены естественным снижением фертильности и бесплодием. Выключение репродуктивной системы происходит за 7-8 лет до менопаузы и за 3-4 года до начала возрастных нарушений цикла. По данным Т.А.Назаренко, К.В.Краснопольской (2012) [27], наблюдается увеличение числа женщин старшего репродуктивного возраста (после 35-38 лет), обращающихся в центры ЭКО с целью лечения бесплодия. Доля таких пациенток составляет около 40%. А частота наступления беременности у пациенток старшего репродуктивного возраста составляет не более 15% [25]. Актуальность выбранной темы обусловлена, прежде всего, тем, что до настоящего времени, несмотря на успехи в развитии фармакологии и усовершенствование методов ВРТ, добиться более высоких показателей наступления беременности не удается. ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: улучшить исходы программ ВРТ у женщин позднего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным бесплодием, включая в прегравидарную коррекцию нормализацию содержания 6 мелатонина. ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. 1. Оценить состояние здоровья и эндокринной системы женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием и возможностью прогнозирования результатов восстановления фертильности. 2. Определить особенности экскреции мелатонина у женщин позднего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным бесплодием. 3. Установить возможные механизмы влияния экзогенного приема мелатонина на репродуктивную систему. 4. Определить возможность и результативность использования препаратов мелатонина в прегравидарной подготовке женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием в программах ЭКО. 5. Разработать рекомендации дифференцированного подхода к осуществлению ВРТ в зависимости от уровня мелатонина у женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием и оценить их эффективность. НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Расширены представления о патогенетических механизмах формирования неудач ВРТ у женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием. Впервые у женщин позднего репродуктивного периода с трубноперитонеальным бесплодием на основании клинико-лабораторных методов исследования: - получены сведения о содержании мелатонина в различные фазы менструального цикла; - определены уровни мелатонина в разное время суток и составлена «мелатониновая кривая»; - оценено влияние мелатонина на репродуктивную систему; - научно обоснована коррекция содержания мелатонина в крови перед ВРТ; 7 - оценено влияние прегравидарного приема мелатонина на показатели раннего эмбриогенеза, частоту наступивших беременностей и живорождений. В результате выполненной работы впервые получены данные, позволяющие расширить существующие представления о роли эпифизарного гормона мелатонина в репродукции, в частности, его влиянии на гормональный гомеостаз, эндометриальный белок АМГФ, показатели раннего эмбриогенеза, полноту и глубину имплантации . ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Расширены представления о состоянии репродуктивного здоровья у пациенток позднего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным бесплодием перед ЭКО. На основе сопоставления результатов клинико-статистического анализа с результатами ультразвукового исследования, гистероскопии, гормональных исследований (включая показатели дополнительные характеристики секреции мелатонина) определены состояния репродуктивной системы и возможности восстановления фертильности с помощью ЭКО. Проведенное исследование позволило: 1) выявить особенности синтеза мелатонина и его влияния на репродуктивную систему пациенток с бесплодием трубно-перитонеального генеза; 2) оценить эффективность прегравидарного применения мелатонина в программах ЭКО и его влияния на исходы стимуляции суперовуляции у женщин позднего репродуктивного периода; 3) рекомендовать методы коррекции недостаточной экскреции мелатонина для прегравидарной подготовки в программах ЭКО; 4) доказать, что прегравидарное применение мелатонина достоверно увеличивает частоту живорождений в рамках программ ЭКО. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. 1. Нарушения гомеостаза женского организма, помимо основной причины 8 бесплодия как основания для включения в программу ЭКО, гетерогенны и полиморфны. Основными причинами инфертильности являются: не диагностированные ранее болезни эндометрия (25%); гидросальпинксы (17,4%), синдром поликистозных яичников (СПКЯ (14,1%). 2. Для женщин позднего репродуктивного возраста с трубно- перитонеальным бесплодием характерно не только снижение содержания мелатонина в крови, но и десинхроноз его секреции: смещается пик выброса мелатонина на 3-6 часов вместо 2 - 4 часов; концентрация в ночное время превышает дневные показатели лишь в 2,5 раза (в норме в 5-10 раз). 3. Прегравидарная коррекция содержания мелатонина увеличивает коэффициент имплантации, снижает частоту ранних репродуктивных потерь с 50% до 17,6% и увеличивает частоту рождения живых детей с 50% до 82,4% у пациенток позднего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным бесплодием. ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы, все - в изданиях, рецензируемых ВАК РФ. По материалам диссертации читаются лекции и проводятся практические занятия со студентами и клиническими ординаторами кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии и с курсантами кафедры акушерства и гинекологии факультета повышения квалификации медицинских работников ФГБОУ ВПО «РУДН». Основные положения работы доложены на научных конференциях ФГБОУ ВПО «РУДН» (Москва, 2011, 2012, 2013), на VI Общероссийском научнопрактическом семинаре «Репродуктивный потенциал России: версии и контраверсии» (Сочи, 2013). Результаты исследований внедрены в практическую работу городского родильного дома № 17, г.Москва (гл. врач Торубаров С.Ф.). 9 ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав по результатам собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц и 6 рисунков. Указатель литературы включает 112 работ, из них - 39 на русском и - 73 на иностранных языках. 10 ГЛАВА I. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ РЕАЛИЗАЦИИ ФЕРТИЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ПРОБЛЕМЫ ЖЕНЩИН СТАРШЕГО РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Современная демографическая ситуация, формируемая процессами естественного движения населения, является результатом инерционного воздействия демографических показателей предыдущих лет. Уменьшение численности населения - прямая угроза национальной безопасности и, более того, сохранению России как государства. Проблема народонаселения в России стала особенно острой после распада страны и отделения азиатских республик, в которых рождаемость была стабильно высокой, впрочем, как и детская смертность. Демографические десятилетий носят показатели неблагоприятный Российской характер: Федерации рождаемость последних не имеет тенденции к увеличению, определяя с превышающей её смертностью отрицательный прирост населения (-1,8 на 1000 населения); суммарный коэффициент рождаемости (1,57) – в 1,5 раза ниже необходимого для простого воспроизводства населения; неуклонное постарение населения страны (количество пожилых людей превышает количество детей – 22% и 16,3% соответственно); преобладание однодетных семей (60-70%), высокая доля внебрачных рождений (26,1%), увеличение среднего возраста рождения (26 лет) [17]. Долгосрочный демографический прогноз воспроизводства населения и рождаемости констатирует угрозу сокращения репродуктивного возраста на 23,9% [3]. численности женщин Уровень рождаемости в РФ значительно не изменится - показатель итоговой рождаемости будет умеренно снижаться с уровня 1,6 ребенка на женщину вследствие того, что откладывание рождений у молодых поколений продолжается, а склонность к наверстыванию отложенных рождений по мере увеличения возраста женщины оказывается 11 слабой. Современные тенденции в распределении числа детей по очередности рождения предполагают последующее увеличение доли однодетных семей (выше 35%) и, возможно, умеренный рост числа женщин, не имеющих детей, за счет сокращения доли двухдетных семей [39]. К медицинским факторам, оказывающим составляющие естественного движения значимое влияние на населения (общую смертность и рождаемость), наряду с абортами, плодово-младенческими потерями, относят супружеское бесплодие. Бесплодие современности, в браке несмотря остается на наиболее значительное актуальной количество проблемой исследований, посвященных различным её аспектам. В третьем тысячелетии частота бесплодных браков увеличилась с 10 до 18% и имеет тенденцию к дальнейшему росту [84]. P. Török, T. Major (2013) [107] отмечают, что на долю женского бесплодия приходится 40%, мужского – 40%, а сочетание и женского и мужского факторов имеет место у 20% бесплодных пар. В век глобализации женщины в стремлении к свободе, независимости, самостоятельности расставляют жизненные приоритеты в пользу первостепенности получения образования, реализации карьерных амбиций, отодвигая на второй план истинно женское предназначение – рождение и воспитание ребенка. Наряду с искажением приоритетов современного общества, во многом причиной откладывания деторождения является изменение в брачном поведении нации, которое проявляется в повышении возраста вступления в брак [31]. Изменение репродуктивных ориентаций привело к тому, что к моменту, когда гонка за достижением желаемого социального уровня завершена, карьерные успехи достигнуты, материнство в иерархии ценностей женщины выходит на первое место, оказывается, что драгоценное время уже упущено. 12 Процессы истощения репродуктивной системы у мужчин и женщин кардинально отличаются друг от друга. У мужчин потеря способности к зачатию наступает по причине физиологической старости, угасание репродуктивной функции полностью соответствует старению других органов и систем [60; 97]. У женщин процесс истощения фолликулярного аппарата происходит постоянно, усиливаясь к концу репродуктивного периода (после 37 лет в яичниках остается примерно 25 тыс. фолликулов, а к перименопаузе – около 1 тыс.) [7; 33]. Репродуктивная система, как любая эндокринная система является саморегулирующей, работающая по принципу положительной и отрицательной обратной связи. Основными звеньями этой системы являются гипоталамус, гипофиз, яичники. Репродуктивная система поддерживает свое единство за счет циклической циркуляции от периферии к центрам и от центров к периферии, подчиненной определенным циркадианным ритмам. Последние десятилетия отмечены большими достижениями в выяснении причин снижения репродуктивного потенциала женщины с возрастом. Однако единого мнения о первостепенности яичникового или гипаталамо- гипофизарного фактора не достигнуто. С одной стороны, многочисленными клиническими наблюдениями установлено, что в позднем репродуктивном периоде инволютивные процессы в высших регулирующих центрах репродуктивной системы и в периферических эндокринных железах и возникают одновременно [20; 111]. С другой стороны, широко распространено мнение, что инволюция репродуктивной системы начинается с яичникового звена. Так, несмотря на достоверно более высокое число получаемых ооцитов у женщин с поликистозом яичников, в возрасте старше 40 лет пациентки имеют сходные клинические показатели беременности и живорождения при сравнении с женщинами с трубным фактором бесплодия. Эти данные позволяют утверждать, что репродуктивное окно, несмотря на высокий овариальный 13 резерв, у женщин с поликистозом яичников не может быть продлен при СПКЯ. Все пациенты с бесплодием своевременно должны обращаться за ВРТ, несмотря на высокие показатели овариального резерва [69]. М. Szafarowska, М. Jerzak (2013) [102] считают, что уменьшение количества фолликулов сопровождается снижением их качества, включая, в основном, нарушения ядра (расхождение хроматина, деконденсация хромосом). Это приводит к неправильному гаметогенезу, оплодотворению, раннему развитию эмбриона и аномальной имплантации. С увеличением возраста у женщин в яичниках диагностирована аномальная васкуляризация. Снижение перфузии крови в микроокружении созревающих яйцеклеток приводит к гипоксии и, тем самым, к цепочке реакций окислительного стресса. Согласно данным американских исследователей, при первом статистически значимом повышении базального уровня ФСГ, который приходится в среднем на конец третьего, начало четвертого десятилетия жизни женщины, происходит уменьшение общего числа фолликулов. Это приводит к тому, что уменьшается число антральных фолликулов, из которых происходит селекция доминантного. Эти фолликулы продуцируют гормон ингибин В, который определяет базальный уровень ФСГ. С возрастом уровень ингибина В уменьшается, что приводит не только к повышению базального уровня ФСГ, но и к более быстрой селекции доминантного фолликула, и соответственно, овуляция происходит раньше. Все это приводит к сокращению фолликулярной фазы цикла у женщин старшей возрастной группы. Важно отметить, что при этом продолжительность, претерпевают и другие показатели существенных продолжительности изменений, менструального цикла лютеиновой и у фазы, не само сокращение женщин происходит преимущественно за счет фолликулярной фазы [70]. Наряду с вышеизложенным, следует отметить, что женщины позднего репродуктивного возраста чаще имеют отягощенный гинекологический 14 анамнез, что находит отражение в снижение их репродуктивного потенциала [26]. Наличие длительно текущих воспалительных процессов органов малого таза, сопровождающиеся выраженным склерозом тканей с нарушением питания яичникового фолликулярного аппарата, оперативные вмешательства в области малого таза, генитальный эндометриоз существенно снижают овариальный резерв [71; 74]. Кроме того, с возрастом прогрессивное снижение фертильности наблюдается не только из-за уменьшения числа яйцеклеток [2], но и ухудшения их качества, увеличения числа дегенеративных ооцитов, анеуплоидии и снижения частоты оплодотворения [54; 66]. Резюмируя вышеизложенное, можно заключить, что процессы «увядания» репродуктивной системы обусловлены десинхронозом гипоталамо- гипофизарно-гонадных отношений. Ведущая причина бесплодия - воспалительное поражение маточных труб, которое составляет 20 - 54% всех форм нарушения репродуктивной функции. В ближайшем будущем вряд ли стоит ждать изменения структуры причин бесплодия, поскольку воспалительные заболевания внутренних органов занимают лидирующее положение в структуре острой гинекологической патологии. Удельный вес воспалительных заболеваний составляет 60-65% всех гинекологических больных [22]. Результат – уже в первые годы активного репродуктивного периода жизни у каждой третьей женщины выявляется абсолютное или относительное бесплодие. От 11,7% до 37,1% случаев трубноперитонеального бесплодия приходится на болезни маточных труб после оперативных вмешательств [37]. Несмотря на значительные успехи и внедрение в клиническую практику новых диагностических и лечебных репродуктивных технологий, проблема бездетности далека от своего окончательного разрешения. 15 Метод лечения бесплодия, основанный на экстракорпоральном оплодотворении яйцеклеток и переносе эмбрионов в матку, совершил революционный переворот в области репродукции. В 1978г. впервые в мировой клинической практике был применен новый метод лечения так называемого абсолютного трубного бесплодия, смысл которого состоит в том, что полученная из яичников яйцеклетка оплодотворяется in vitro и уже в виде эмбриона преимплантационного периода переносится в полость матки (через 13 дня) и имплантируется в ней, а далее беременность развивается естественным путем. В 1978г. в Великобритании путем кесарева сечения родилась Луиза Браун - первый человек, зародыш которого до 3-й стадии морулы выращивался в пробирке. Этот метод был разработан английским эмбриологом R.Edwards и гинекологом P.Steptoe в кембриджской клинике «Борн-Холл». В английской литературе он был назван «оплодотворение in vitro и перенос эмбрионов» (IVF & ЕТ). В русской литературе используется термин - экстракорпоральное оплодотворение и перенос эмбрионов (ЭКО и ПЭ). Сегодня признано, что это наиболее экономичный и эффективный метод лечения бесплодия не только женского, но и мужского. Однако, несмотря на современные технологии, используемые при ВРТ, эффективность данного метода составляет около 33,1% на попытку, то есть почти достигает средней, довольно низкой плодовитости человека на одну попытку в естественных условиях - 30-35% [30]. По данным В.С.Корсака (2011) [19], в России продолжается увеличение числа циклов ВРТ (2010г. – 187,5 на 1млн. населения, а в 2011 – 219,2 цикла соответственно), частота наступления беременности в циклах ВРТ не имеет тенденции к увеличению – снижение и подъем данного показателя происходят в пределах 1-1,5%. Серьезной проблемой ЭКО являются повторные имплантационные неудачи (ПИН). ПИН – неудача в достижении беременности после пересадки как минимум 10 высококачественных эмбрионов за несколько попыток. 16 Причинами подобных неудач являются генетические аномалии, нарушения иммунной системы, патологическое заболевания состояние матки маточных (синехии, труб миома, полипы), (гидросальпинкс, нарушение моторики), тромбофилия, мужской фактор. Процесс имплантации возможен лишь при условии соответствия степени чувствительности имплантации. эндометрия Эмбрионы, которые и способности начинают бластоцисты взаимодействие к с нечувствительным (неготовым) эндометрием, не имплантируются, что дало толчок к развитию теории о существовании “окна имплантации”. У человека имплантационное окно ограничено, как правило, 18-24 днем менструального цикла, способность эндометрия к рецепции бластоцисты полностью пропадает на 24-й день. В это время маточный эндометрий наиболее восприимчив к эмбриону, что проявляется выработкой большого количества разнообразных биологически активных многокомпонентную продуктов. систему, Эндометрий структурной представляет единицей которой собой является маточная железа с окружающими её стромой и прилежащими сосудами. В ответ на воздействие яичниковых гормонов происходит процесс децидуализации эндометрия, включающий в себя изменения транскрипции большого числа генов, приводящие к быстрому нарастанию сосудистой проницаемости с развитием отека стромы в месте имплантации в строго определенный, короткий период репродуктивного цикла, называемый «окном имплантации» [29]. Внедрение бластоцисты через маточный эпителий вглубь эндометрия происходит в течение 7-12 суток после оплодотворения, причем этот сложнейший процесс «биологическим далеко парадоксом», не расшифрован поскольку речь идет и называется о слиянии трофобластического слоя бластоцисты с маточным эпителием, то есть двух различных по наследственным и иммунологическим свойствам типов эпителия. 17 Ещё до оплодотворения прогестерон вызывает децидуальные превращения эндометрия и готовит его к имплантации, способствуя дополнительному ветвлению эндометриальных желез и гипертрофии их эпителиоцитов, синтезирующих эндометриальные белки, к которым относится АМГФ, или гликоделин. АМГФ - это α2-микроглобулин фертильности (гликоделин А, плацентарный протеин - РР14, PEP и др.), открытый отечественными биохимиками Д. Д. Петруниным и Ю.С. Татариновым (I976). Являясь прогестеронзависимым белком [44], он присутствует в эпителии маточных труб, секреторном эндометрии, децидуальной оболочке плаценты и семенных пузырьках, не выявляется в нормальных тканях яичника, молочной железы, предстательной железы, яичка, эпидидимуса, семявыносящих протоков, а также не обнаруживается в не относящихся к репродуктивному тракту органов плодов и взрослых. У небеременных женщин синтез АМГФ осуществляется железистыми эпителиальными клетками эндометрия и мерцательным эпителием маточных труб [6]. АМГФ является мощным иммуносупрессором. Установлено, что при нормальной функции яичников уровень АМГФ очень низок в периовуляторном периоде, увеличение его концентрации начинается во время последней недели лютеиновой фазы и достигает пика во время менструации, причем этот высокий уровень сохраняется в течение первых дней следующего цикла. Особенно интересно отметить, что начало синтеза и секреции АМГФ совпадает со временем попадания бластоцисты в полость матки, где этот белок обеспечивает локальное подавление иммунного ответа матери на развивающийся эмбрион [23]. K.H.So et al. (2012) [100] отмечают, что АМГФ ограничивает миграцию клеток эндометрия, но стимулирует полноценную инвазию трофобласта. Десинхронизация процессов дифференцировки эндометрия и эмбриогенеза приводит к отсутствию или дефекту имплантации, что, в свою 18 очередь, обусловливает бесплодие или раннюю потерю беременности. R.E.Leach et al. (2012) [73] выявили у женщин с инфертильностью преждевременное повышение гликоделина А - в середину секреторной фазы, что, по мнению авторов, является маркером преждевременного закрытия окна имплантации и, соответственно, причиной имплантационных неудач. Кроме того, важной функцией АМГФ в период, когда плацента только формируется и отсутствует плацентарная циркуляция, может быть транспорт необходимых для эмбрионального развития гидрофобных молекул из тканевого окружения. Поскольку АМГФ является прогестеронзависимым белком, роль прогестерона в развитии ранней беременности не ограничивается его влиянием на рост и развитие миометрия, поддержание миометрия в состоянии покоя путем нейтрализации действия окситоцина, снижения простагландинов. Прогестерон опосредованно через АМГФ синтеза препятствует отторжению зародыша. Женское бесплодие является следствием различных заболеваний и сопровождается нарушениями во всех звеньях репродуктивной системы с поражением органов-мишеней. Не вызывает сомнения тот факт, что снижение частоты наступления имплантации при той или иной форме бесплодия наступает в результате одновременного воздействия целого комплекса причинно-следственных факторов. Формируя и поддерживая патологический процесс в репродуктивной системе женщины, они воздействуют на развитие ооцитов и эмбрионов и/или секреторную трансформацию эндометрия – главные составляющие процесса имплантации [30]. В этой связи разумным было бы проведение комплексной подготовки перед ЭКО, с учетом характера выявленных нарушений [15]. По данным Т.А.Назаренко, К.В.Краснопольской (2012) [27], наблюдается увеличение числа женщин старшего репродуктивного возраста (после 35-38 лет), обращающихся в центры ЭКО с целью лечения бесплодия. 19 Доля таких пациенток составляет около 40%. Ещё в руководстве ВОЗ (1997) по стандартизированному обследованию и диагностике бесплодных супружеских пар сказано, что "задачей врача, занимающегося лечением бесплодия в браке, является не упустить ничего важного и не сделать ничего лишнего, что растягивало бы во времени и заводило бы в тупик процесс обследования, стоило бы больше, чем нужно материальных затрат". Ухудшение эффективности программ ВРТ связывают со снижением «овариального резерва» у женщин позднего репродуктивного возраста и как следствие этого, бедным ответом яичников на стимуляцию суперовуляции. Отсутствие комплексного дифференцированного подхода в преодолении бесплодия, неадекватная оценка функционального состояния репродуктивной системы и, как следствие, эмпирический характер последующего лечения, а также неприемлемость самой идеи комплексной подготовительной терапии перед ВРТ многими специалистами-репродуктологами, на наш взгляд, является одной из причин низкой эффективности ВРТ. Итак, неуклонно увеличивается количество женщин позднего репродуктивного возраста, обращающихся в клиники ЭКО, с желанием иметь детей. Но вследствие дискоординации гипоталамо-гипофизарной системы, истощения овариального резерва и снижения качества репродуктивного материала эффективность программ ВРТ остается низкой. Вместе с тем в последние годы пристальное внимание исследователей привлекает роль мелатонина в синхронизации циркадианных биоритмов, регуляции физиологических и и сезонных патологических состояний организма человека. Биологическая ритмичность является фундаментальным свойством всех живых систем. В настоящее время в человеческом организме обнаружено более 500 биоритмов на различных структурных уровнях: клеточном, тканевом, органном, организменном. На сегодняшний день четко определено, что все биологические ритмы находятся в строгой подчиненности 20 основному водителю ритмов, расположенному в супрахиазматических ядрах гипоталамуса [4]. Эпифизу отводится ключевая роль в качестве гуморального эффектора и модулятора в циркадианном механизме организма [40]. Гормоном, доносящим сигналы от эпифиза до органов и тканей, является мелатонин. Посредством физиологических мелатонина функций эпифиз организма, чутко выполняет реагируя регуляцию на ситуации, возникающие внутри и вне организма, а так же обеспечивает его устойчивость к воздействию факторов окружающей среды. Установлено, что нарушение ритма и уровня секреции мелатонина является пусковым моментом к возникновению десинхроноза, за которым следует развитие органической патологии [36]. H. Tamura et al. (2014) [105] отмечают, что мелатонин (Nацетил-5-метокситриптамин) секретируется в темное время суток шишковидной железой. Кроме того, показано, что мелатонин вырабатывается в обоих яичниках и в плаценте [93]. После попадания в кровоток мелатонин действует как эндокринный фактор: регулирует целый ряд важных центральных и периферических действий, связанных с циркадным ритмом и воспроизводством. Многие взаимодействием находящимися с действия конкретными мелатонина опосредованы мембраносвязанными рецепторами, не только в центральной нервной системе, но и в периферических тканях. Мелатонин также действует через не-рецепторопосредованный механизм, так он выступает в качестве акцептора реактивных форм кислорода и активного азота. Мелатонин противодействует окислительному стрессу и регулирует клеточный метаболизм. Именно это свойство позволило L. Shi et al. (2013) [96] рассматривать возможность применения мелатонина при бесплодии. В научной литературе достаточно много исследований посвящено применению мелатонина при соматических заболеваниях, доказана его высокая эффективность в кардиологии [48; 77], онкологии [85], неврологии 21 [49], при расстройствах сна в неонтологии и педиатрии [65], широко обсуждается его значение во время беременности [41; 53]. Кроме того, мелатонин может стимулировать иммунную систему, защищать организм от бактериальных и вирусных инфекций [90]. В то же время, роль этого гормона в репродукции окончательно не определена, имеющиеся сведения о характере и степени его участия в регуляции гипоталамо-гипофизарного звена носят разрозненный характер, а опыт применения препарата экзогенного мелатонина при различных нарушениях репродуктивной системы скуден. В настоящее время не вызывает сомнения факт наличия циркадианных ритмов продукции мелатонина эпифизом. Мелатониновая кривая – изменение концентрации этого гормона в течение суток, имеет общие черты у всех людей - ночная концентрация в 5-10 раз превышает дневной уровень, достигая максимума в 2-4 часа ночи, затем постепенно снижается и с 7-8 утра до 8 часов вечера остается низкой. Для каждого человека мелатониновая кривая стабильна, но вариабельна в популяции. Установлено, что с возрастом снижается продукция мелатонина как у человека, так и у животных. Старение связано с изменениями в нескольких основных параметрах циркадианных ритмов у млекопитающих, ведущих к циркадной дисфункции. U. Mattam, A. Jagota (2014) [81] вводили старым крысам подкожно мелатонин через 1 ч после наступления темноты в течение 11 дней. В последующем было выявлено, что введение экзогенного мелатонина приводило к восстановлению суточного ритма экспрессии различных часовых генов в супрахиазматических ядрах гипоталамуса. Результаты исследования J. Cipolla-Neto et al. (2014) [51] показали, что возрастное снижение мелатонина способствует формированию резистентности к инсулину, нарушению толерантности к глюкозе, нарушениям сна, - все это, 22 по мнению авторов, лежит в основе формирования метаболического синдрома с увеличением возраста. Возрастное снижение мелатонина может свидетельствовать о прогрессивном снижении и фертильной функции. Ряд авторов демонстрируют негативный эффект темноты на репродуктивную функцию. Так, A. Bellastella et al. (2014) [43] отмечают, что слепота может влиять на функцию половых желез в организме человека. У слепых выявлены повышенные уровни мелатонина в плазме на фоне значительного увеличения соотношения ФСГ / ЛГ, что может указывать на возможное субклинический ухудшение функции яичек у мужчин и яичников у женщин. Кроме того, авторами установлено, что для женщин, живущих в Финляндии, в регионе с сильным сезонным отличием световой активности, характерно повышение мелатонина и снижение секреции гонадотропинов в темное время года, с последующим сокращением частоты наступления беременностей. Возможный механизм отрицательной обратной связи между мелатонином и гормонами гипофиза объясняется присутствием рецепторов к гонадотропинам и половым стероидным гормонам в человеческих пинеалоцитах и, наоборот, рецепторов мелатонина в гипоталамусе, гипофизе, яичниках, яичках. R.J. Reiter et al. (2014) [92] развитие родовой деятельности именно в ночное время объясняют синергизмом между ночным увеличением мелатонина и окситоцина. Особенно повышен риск развития ановуляторных циклов и гиперпластических процессов у женщин, работающих по ночам (сменные операторы на телеграфе и радио, медицинские сестры, стюардессы, диспетчеры, продавцы круглосуточных магазинов и т. д.), у людей, страдающих бессонницей [45]. Получены достоверные доказательства о важной роли мелатонина в активизации гипоталамо-гипофизарно-гонадальной оси при половом 23 созревании, то есть мелатонин запускает секрецию гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ) в гипоталамусе [47]. Если существование функциональной взаимосвязи мелатонина с половыми железами определено, то вопросы об уровне и характере продукции гормона и его патогенетическом значении в нарушении функции яичников остаются спорными. В литературе по этому поводу представлены противоречивые данные. В одних исследованиях на домашних кошках, мелатонин рассматривается как универсальный ингибитор эндокринных функций и, прежде всего, в отношении оси гипоталамус гипофиз – гонады [63], в других работах, указывается на то, что стимуляция функции шишковидной железы не всегда дает эффект ингибирования гонадотропной функции системы гипоталамус-гипофиз у крыс [18]. Приводятся данные, что мелатонин регулирует генную экспрессию и секрецию ГнРГ, контролирующего ритм и уровень выброса ЛГ и ФСГ, воспроизводя 24 - часовую цикличность, координацию гормонального статуса в течение всего менструального цикла, снижает уровень эстрадиола [55]. В других исследованиях не выявлен эффект воздействия мелатонина на созревание фолликула и функцию яичника в эксперименте на животных [60]. В то же время у женщин с низким уровнем мелатонина сульфата в суточной моче установлено значительное повышение гонадотропных гормонов, как ФСГ, так и ЛГ [1]. Данные о влиянии мелатонина на секрецию прогестерона также неоднозначны. В одних исследованиях показано, что мелатонин снижает уровень ЛГ и эстрадиола, но не оказывает такого влияния на ФСГ и прогестерон [55]. А работа E. Toffol et al. (2013) [106] демонстрирует, что мелатонин модулирует секрецию прогестерона и эстрадиола. Наряду с этим имеются сведения, что мелатонин существенно увеличивает синтез прогестерона и количество рецепторов к прогестерону в 24 тканях яичника в лютеиновую фазу цикла [94], это косвенно подтверждает выводы об уменьшении уровня прогестерона после пиниелоэктомии [80]. Мелатонин, присутствующий в фолликулярной жидкости, участвует в понижении степени окислительного стресса в фолликулах яичников и защищает ооциты от повреждающего действия свободных радикалов [103]. Назначение экзогенного мелатонина увеличивает концентрацию мелатонина в фолликулярной жидкости, снижает уровень оксидативного стресса, увеличивает частоту оплодотворения [104]. M.G. Showell et al. (2013) [99] в Кокрановском обзоре представили сравнение различных исследований, изучавших влияние антиоксидантов, в том числе мелатонина, на репродуктивную функцию. Применение антиоксидантов не было связано с увеличением клинической частоты наступления беременности и рождаемости. Исследования F. Mohammadghasemi et al. (2012) [86] на половозрелых мышах, получавших никотин, никотин и мелатонин, показали, что никотин значительно сокращает количество преантральных и антральных фолликулов, а также концентрацию эстрадиола. У мышей, получавших никотин и мелатонин, было выявлено значительное увеличение атретических фолликулов и уровня эстрадиола. Результаты этого исследования показывают, что мелатонин оказывает защитный эффект в отношении повреждающего эффекта никотина на яичники на различных стадиях роста фолликулов. R.J. Reiter et al. (2014) [93] отмечает, что мелатонин защищает яйцеклетку от токсичных форм кислорода и повышает частоту наступления беременности в протоколах ЭКО. Кроме того, авторы полагают, что мелатонин участвует в функционировании и поддержании оптимального плацентарного гомеостаза, снижая скорость апоптоза ворсинчатого цитотрофобласта, защищая синцитиотрофобласт от окислительного повреждения. Мелатонин снижает окислительные повреждения в плаценте и может улучшать гемодинамику в 25 маточно-плацентарной области. Исследователи предлагают рассматривать возможность использования мелатонина для лечения преэклампсии. Аналогичное мнение высказывают отмечают, что при старении T. Lord et al. (2013) [78]. Авторы ухудшается качество метафазы II ооцитов посредством окислительного стресса, ускоряющего наступление апоптоза в ооцитах. Добавление мелатонина к ооцитам мышей позволило значительно уменьшить зависящий от времени окислительный стресс в ооцитах и, как следствие, значительно задержать начало апоптоза в ооцитах. Кроме того, добавление мелатонина продлевает оптимальное окно для оплодотворения ооцитов в возрасте 8 и 16 ч в пробирке и значительно улучшает качество получаемых эмбрионов. L.M. Seko et al. (2014) [98] оценили пять контролируемых рандомизированных исследований о влиянии мелатонина на контролируемую стимуляцию яичников при ВРТ. Авторы отмечают, что в исследованиях не сообщается о частоте живорождения или врожденных аномалий. Оценки были неточными для определения эффекта и пользы мелатонина. По их мнению, необходимы дополнительные исследования, изучающие роль мелатонина в преодолении бесплодия, прежде чем рекомендовать его использование в клинической практике. A.S. Batıoğlu et al. (2012) [42] оценили эффективность влияния мелатонина на качество ооцитов у женщин, прибегнувших к ЭКО. 85 женщин, проходящих ЭКО, были разделены на две группы, в зависимости от факта получения мелатонина. Среднее число ооцитов (15,33 против 14,27) и среднее число зрелых ооцитов не отличались между двумя группами (12,63 против 10,94). Частота оплодотворения не отличалась между двумя группами (72,75 против 71,16). Среднее число эмбрионов 1 класса было выше у женщин, получавших мелатонин (3,28 против 2,53). Клиническая частота наступления беременности была выше у женщин, получавших мелатонин, хотя различия не 26 имели статистической значимости. Вывод авторов о том, что мелатонин, «вероятно, улучшает качество яйцеклетки и эмбриона» у женщин, повергнутых ЭКО, требует как минимум подтверждения, максимум - уточнения механизма этого «улучшения». O.G. Eryilmaz et al. (2011) [59] также приходят к выводу, что применение мелатонина улучшает качество яйцеклетки и эмбриона. Лишенные доказательств механизмы влияния мелатонина на «качество» яйцеклетки и эмбриона представляют интерес, но вызывают определенные сомнения. В экспериментальных работах на крысах доказана связь уровня мелатонина и пролиферации эндометрия. Установлено, что мелатонин ограничивает пролиферацию эндометрия, что, по мнению авторов, может быть использовано при проведении заместительной гормональной терапии у женщин в постменопаузе [52]. Данные о сезонных отличиях в уровне имплантации весьма противоречивы. D.P. Braga et al. (2012) [46] установили, что результативность программы ЭКО и ИКСИ была выше весной. Весной отмечено увеличение почти на 50% оплодотворившихся яйцеклеток, концентрация эстрадиола в ооцитах была значительно выше именно весной (для сравнения зимой - 235,8 пг/мл, весной - 282,1 пг/мл, летом - 226,1 пг/мл и осенью - 228,7 пг/мл). Эти изменения коррелировали с длительностью светового дня и скоростью его приращения, но не с температурой, влажностью или другими параметрами окружающей среды. Попытки использовать мелатонин в лечении бесплодия, улучшая качество ооцитов, увеличивая частоту оплодотворения и наступления беременности, предпринимались многими исследователями [93; 103]. Безопасность экзогенного мелатонина была показана во многих исследованиях [72; 104]. У женщин, получавших 3мг мелатонина с 5 дня цикла, предшествующего стимуляции суперовуляции до дня пункции, качество эмбрионов было лучше, 27 чем в группе контроля [104]. На пинеалоэктомированных крысах установлено, что механизм такого воздействия может быть двойственным, за счет непосредственного действия мелатонина на рецепторы или же опосредованно через стероидные гормоны яичника и желтого тела. Подавляя секреторную функцию клеток, продуцирующих стероидные гормоны, мелатонин тем самым опосредованно увеличивает концентрацию ФСГ и пролактина. Кроме того, действуя на свои рецепторы, мелатонин регулирует суточную активность гипоталамо- гипофизарной оси, что в свою очередь синхронизирует развитие фолликула и эндометрия. Отклонения сроков овуляции, является возможным следствием недостатка или полного отсутствия мелатонина в крови, что показано на пинеалоэктомированных крыс. Подтверждением тому служит нормализация ритмики при введении эндогенного мелатонина. Безусловно, в данных процессах мелатонин оказывает необходимое воздействие на пролиферацию и дифференцировку гранулезных клеток и клеток эндометрия матки, а также изменения концентрации эстрадиола (Е 2), ФСГ, ГнРГ в крови [57]. Резюме. Анализ приведенных литературных данных показал чрезвычайную актуальность вопроса возможного применения мелатонина у женщин позднего репродуктивного периода в рамках программ ЭКО. Установлено, что большую роль в старении организма играет нейропептид мелатонин, одной из основных функций которого является синхронизация работы всех органов и систем организма. Десинхронизация циркадианной периодичности шишковидной железы, которая выражается в снижении ночных пиков мелатонина, может быть связана с угасанием фертильной функции женщины. Дискутабельными остаются вопросы о влиянии мелатонина на основные звенья репродуктивной системы, а именно его роль в гипоталамо-гипофизарной регуляции, влияние на развитие ооцитов, частоту оплодотворения и наличие 28 бластоцист в программах ЭКО. Имеются разноречивые данные о воздействии мелатонина на морфофункциональное состояние эндометрия. Не установлены особенности экскреции мелатонина у женщин позднего репродуктивного возраста. Практически не известны в силу единичных опубликованных работ данные о: - роли мелатонина в патогенезе бесплодия; - целесообразности проведения прегравидарной подготовки женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием; - возможностях применения мелатонина у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием в рамках программ ЭКО. В связи с этим, учитывая важную роль мелатонина в нейроэндокринной регуляции репродуктивной системы, становится необходимым исследовать особенности экскреции мелатонина у женщин позднего репродуктивного возраста и возможности использования его в прегравидарной подготовке женщин позднего репродуктивного периода в рамках программ ЭКО. 29 ГЛАВА II. КОНТИНГЕНТ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. Для выполнения задач исследования были обследованы 92 пациентки позднего репродуктивного периода (старше 35 лет) с трубно-перитонеальным бесплодием. Все они были разделены на две группы, в зависимости от факта приема препарата экзогенного мелатонина (рис.1): I группа – 58 пациенток, принимавших мелатонин на этапе прегравидарной подготовки к программе ЭКО в дозе 3 мг в день, за 30 минут до сна, в течение 4 месяцев; II - 34 пациентки, не принимавшие мелатонин перед ЭКО. 0 0 34 58 I группа II группа Рис.1. Контингент обследованных женщин. Работа выполнена в 2010-2014 гг. на кафедре акушерства и гинекологии c курсом перинатологии (зав.каф. - проф. Радзинский В.Е.) ФГБОУ ВПО "Российский университет дружбы народов", городском родильном доме № 17, г.Москва (гл. врач Торубаров С.Ф.), в лаборатории «Хрономедицина и новые технологии в клинике внутренних болезней» Первого Московского 30 государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова (зав.лабораторией - проф. Рапопорт С.И.). Методы исследования. Клинико-статистический анализ. Клиническую оценку состояния здоровья обследованных женщин проводили с помощью разработанной нами статистической карты. Изучаемые параметры отражали паспортные данные, сведения о наличии профессиональных вредностей. При сборе анамнеза обращали внимание на: - время появления первой менструации, характер менструальной функции, регулярность и длительность циклов; - особенности половой жизни: с какого возраста началась, состоит ли в браке, какой брак по счету; - детородную функцию: паритет, интергенетический интервал, сведения о каждой из предшествовавших беременностей - исход для матери и плода, течение родов, послеродового периода, масса плода, оперативные вмешательства; - перенесенные гинекологические заболевания, их длительность, течение и исход; - перенесенные ранее оперативные вмешательства: доступ (лапароскопия или лапаротомия), объем, течение послеоперационного периода. После получения необходимых анамнестических данных приступали к наружному осмотру, при котором обращали внимание на телосложение, проводили антропометрическое обследование, рассчитывали росто-весовой коэффициент – индекс массы тела (ИМТ), оценивали характер и выраженность оволосения по шкале Ferriman-Gallway, особенности послеоперационных рубцов на передней брюшной стенке. Учитывалось наличие или отсутствие галактореи. 31 Индекс массы тела (англ. body mass index (BMI), ИМТ) был рассчитан по формуле: , где: m — масса тела в килограммах, h — рост в метрах (кг/м²). В соответствии с рекомендациями ВОЗ (2004) разработана следующая интерпретация показателей ИМТ (табл.1): Таблица 1. ИМТ по ВОЗ (2004г.). Индекс массы Соответствие между массой человека и его тела ростом 16 и менее Выраженный дефицит массы 16—18,5 18,5—24,9 25—29,9 30—34,9 Недостаточная (дефицит) масса тела Норма Избыточная масса тела (предожирение) Ожирение первой степени 35—39,9 Ожирение второй степени 40 и более Ожирение третьей степени (морбидное) Всем пациенткам проводили бимануальное гинекологическое исследование. Экстрагенитальные заболевания выявлялись в результате комплекса клинических, лабораторных и функциональных исследований. Ультрасонографический метод исследования органов малого таза. Всем пациенткам произведено данное исследование в реальном масштабе времени на ультразвуковом аппарате «SonoAce X8 Medison» (Samsung Medison, Южная Корея) с использованием абдоминального датчика частотой 3,5 МГц и вагинального датчика частотой 6,5 МГц. Оценивали: состояние шейки матки; 32 толщину и однородность эндоцервикса; положение, величину и форму тела матки, состояние эндо - и миометрия, особое внимание уделяли диагностике таких патологических процессов, как гиперплазия эндометрия, хронический эндометрит, аденомиоз, миома матки; при исследовании придатков, помимо наличия признаков воспалительного процесса в них, оценивали состояние яичников (их размеры, положение, состояние фолликулярного аппарата); косвенно определяли наличие спаечного процесса в малом тазу. Проводился ультразвуковой мониторинг числа и размера фолликулов, а также толщины эндометрия во всех стимулированных циклах. Предиктором состояния фолликулярного резерва являлось количество антральных фолликулов до 10 мм в диаметре, определяемых по УЗИ на 2-3 день менструального цикла. В зависимости от их числа выделяли пациенток с: - нормальным фолликулярным резервом – 6-10 фолликулов в обоих яичниках; - малым фолликулярным резервом – 5 и менее фолликулов в обоих яичниках; - мультифолликулярными яичниками – более 10 фолликулов в обоих яичниках. Определение содержания гормонов в сыворотке крови проводили иммуноферментным методом: пролактин (ПРЛ), лютеинизирующий (ЛГ), фолликулостимулирующий (ФСГ) гормоны, антимюллеровый гормон (АМГ), свободный тироксин (Т4 свободный), тиреотропный гормон (ТТГ), эстрадиол (Е2), прогестерон, тестостерон. В качестве нормы использовали показатели содержания гормонов в сыворотке крови у здоровых женщин репродуктивного возраста с регулярным ритмом менструаций. Определение концентрации метаболита мелатонина - мелатонина сульфата в моче проводили в 8 точках в течение суток каждые 3 часа методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-системы IBL: melatonin sulfat 6-sulfatoxymelatonin диагностическом отделении (ELISA, Hаmburg), в Университетской лабораторно- клинической больницы 33 №2 Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова (зав. лабораторией - к.м.н. Гитель Е.П.). Определение содержания эндометриального белка - 2 - микроглобулина фертильности (АМГФ) в менструальной крови. Для определения содержания АМГФ в менструальной крови использовался иммуноферментный анализ на тест – системах с использованием моноклональных антител к АМГФ, созданных в лаборатории клеточной иммунопатологии и биотехнологии НИИ морфологии человека (зав. лаб. д.б.н. Болтовская М.Н.). Гибридомы, эндометриальных продуцирующие белков, моноклональные создавали по антитела против общепринятой схеме (Дж.Ф.Кирней,1989). Мышей-самок Balb/c иммунизировали, выделенными из амниотической жидкости АМГФ, меняя способ, дозу и кратность введения антигенов. В качестве партнеров для гибридизации использовали лимфоциты селезенки или подколенных лимфоузлов иммунизированных животных и клетки сингенной миеломы линий X63.Ag8.653, Sp2/0.Ag14, PAI. После селекции и тестирования на продукцию специфических моноклональных антител, позитивные первичные гибридомы клонировали методом предельных разведений в жидкой фазе. Отобранные клоны переводили в массовые культуры in vitro и in vivo. Для сохранения гибридных клеток на каждом этапе проводилось их криоконсервирование. Для отбора антиген-специфических гибридом и последующей характеристики моноклональных антител были использованы два варианта иммуноферментного анализа (ИФА) – с иммобилизацией на твердой фазе антигена или кроличьих иммуноглобулинов мыши. моноспецифических Специфичность полученных антител против моноклональных антител оценивали по перекрестному связыванию с трофобластическим глобулином, ХГЧ, -фетопротеином, плацентарным лактогеном, сывороточным 34 альбумином. Концентрацию АМГФ в сыворотке крови определяли в «сэндвич»-варианте ИФА с помощью пар моноклональных антител к разным эпитопам молекулы АМГФ. Для иммуногистохимического исследования материал (менструальную кровь, полученную на 2-3 день менструации) заливали в среду для замораживания Tissue-Tek (Miles Inc., USA) и готовили криостатные срезы толщиной 5мкм, которые затем фиксировали 4% параформальдегидом (10мин) с дофиксацией метанолом (10мин). Определение АМГФ проводили методом непрямого иммунопероксидазного окрашивания с помощью моноклональных антител. В качестве хромогена использовали 3,3-диаминобензол. Были использованы следующие оценочные критерии: нормальный менструальный цикл - 16 000-70 000 нг/мл; недостаточность лютеиновой фазы 2 000-12 000 нг/мл; ановуляторный менструальный цикл - менее 2 000 нг/мл; субклинический выкидыш - более 80 000 нг/мл; маточные кровотечения не связанные с менструацией - менее 500 нг/мл. Результаты спермограммы оценивали в соответствии с рекомендациями ВОЗ по лабораторному исследованию спермы человека (2010) [112]. При этом критериями фертильности спермы считали: объем эякулята 1,5мл и более; концентрацию сперматозоидов – 15 млн/мл и более; общая подвижность сперматозоидов (А+В) 40%; сперматозоидов с прогрессивным движением 32% и более; жизнеспособность 58% и более; морфологические нормальные формы 4% и более. Характер подготовительной и сопутствующей терапии в лечебных циклах ЭКО. Прием экзогенного препарата мелатонина на этапе прегравидарной подготовки к программе ЭКО (ИКСИ) в дозе 3 мг в день, за 30 минут до сна, в течение 4 месяцев, был согласован и одобрен Этическим комитетом ФГБОУ ВПО протокол №6 от 29.04.13. "Российский университет дружбы народов", 35 Лечение методом ЭКО включало: 1. Диагностика причины бесплодия и отбор супружеских пар. 2. Стимуляция суперовуляции. 3. Мониторинг роста и развития фолликулов (ультразвуковой и гормональный). 4. Трансвагинальная пункция фолликулов под контролем УЗИ и получение преовуляторных ооцитов. 5. Получение спермы и подготовка её к инсеминации in vitro. 6. Инсеминация ооцитов in vitro, культивирование половых клеток и эмбрионов, установление факта оплодотворения ооцитов и дробления эмбрионов. 7. Перенос эмбрионов в матку матери. 8. Поддержка лютеиновой фазы стимулированного цикла. 9. Диагностика Стимуляция беременности, суперовуляции. гонадотропными препаратами. её ведение Стимуляция и родоразрешение. суперовуляции Доза препаратов и проводилась схемы подбирались индивидуально с учетом гормонального статуса (уровня ЛГ, ФСГ), а также параметров ультразвукового мониторинга роста фолликулов и толщины эндометрия. Использовали следующий протокол стимуляции суперовуляции: Введение ХГ 1 2 3 4 введение антогогистов ГнРг введение препаратов ФСГ 5 6 7 8 9 10 11 12 13 дни менструального цикла ТВП ПЭ 14 15 16 17 18 19 20 21 поддержка посттрансферного периода Рис. 2. «Короткий» протокол стимуляции суперовуляции. 36 Учитывая тот факт, что пациентки с трубно-перитонеальным бесплодием были в позднем репродуктивном периоде, то стимуляция суперовуляции велась по «короткому» протоколу - гонадотропные препараты вводились со 2-3-го дня менструального цикла, по достижении диаметра лидирующего фолликула 14 мм (6-7-ой день стимуляции) вводились антагонисты ГнРГ. Пункцию фолликулов проводили через 35-36 часов после введения овуляторной дозы ХГ. Пунктировали и аспирировали все фолликулы диаметром более 14 мм. При этом использовали ультразвуковой влагалищный датчик (7,5МГц) со специальной насадкой – проводником для иглы. Применяли иглу с наружным диаметром 1,6мм, длиной 25см, на кончике которой имеется эхо-контрастная насечка, видимая при проведении трансвагинального УЗИ. К ней подсоединяли систему для аспирации фолликулярной жидкости и после пункции производили отсасывание содержимого фолликулов в пробирку путем создания в аспирационной системе отрицательного давления (около 120-150 мм.водн.ст.). Аспирационная жидкость из одного или нескольких фолликулов собиралась в одну пробирку, которая менялась на следующую, по мере заполнения предыдущей. Далее контейнер с пробирками переносился в ламинарный бокс «K-System» с вертикальным протоком стерильного воздуха и подогреваемой поверхностью стола. Отмечалось общее количество аспирированной фолликулярной жидкости в мл, после чего содержимое каждой пробирки переливались в стерильную пластиковую чашку Петри для идентификации преовуляторных ооцитов. Найденные ооциты, определяемые визуально по серебристому массивному (1 – 5 мм) кумулюсу, переносились в питательную среду в чашках NUNC или Петри с помощью стерильных пластиковых капилляров, соединённых с роликовым пипетором. После отмывания кумулюса от примеси крови, комплекс «кумулюс-корона-ооцит» исследовался под бинокулярным микроскопом при двадцати-, сорока- кратном увеличении для оценки количества, качества и степени преовуляторного 37 созревания полученных ооцитов. В зависимости от числа полученных преовуляторных комплексов они помещались в одну или более лунок чашек NUNK в 0,6 мл свежей питательной среды, предварительно профильтрованной через антибактериальный (антивирусный) мембранный 0,2 фильтр. Далее чашки с ооцитами инкубировались в СО2 термостате Forma Scientific при 5% углекислоты в воздухе, температуре + 370,1С и 98% влажности до времени осеменения. Сперму получали путем мастурбации сразу же после успешно выполненной пункции. Сперма собиралась в мерную стерильную пробирку Falcon диаметром 3 см, подписанную фамилией мужа. В андрологическом протоколе отмечались объём, консистенция, цвет, время разжижения, рН эякулята. После полного разжижения спермы дальнейший анализ проводился в микрокапле в камере Маклера на компьютерном анализаторе Semen Analyser фирмы «Hamilton-Thorn». После эякулят переносился в стерильные центрифужные пробирки Falcon для отмывания от семенной плазмы. Отмывание проводилось одним из двух способов: простое центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности. Пробирки с отмытыми сперматозоидами инкубировались в ламинарном боксе на поверхности стола с температурой 36 с в течение 0,5 – 8 часов до времени инсеминации ооцитов. Осеменение ооцитов in vitro. Для осеменения ооцитов чашки NUNC из инкубатора помещались под бинокулярную лупу, вмонтированную в подогреваемый стол ламинарного бокса. При десяти-, двадцати- кратном увеличении суспензия сперматозоидов из надосадочной жидкости с помощью стерильного пластикового капилляра добавлялась в лунки с ооцитами до концентрации 50000 – 100000 подвижных сперматозоидов/мл. Перед добавлением сперматозоидов к ооцитам производилась оценка качества спермы по пятибалльной шкале в зависимости от степени и характера подвижности 38 сперматозоидов, количества, числа патологических форм. Диапазон оценки колебался от 1до 5 (1, 2 – сперматозоиды непригодны для инсеминации, 3удовлетворительные, 4, 5 – соответственно хорошие и отличные). Сразу после добавления сперматозоидов чашки с ооцитами и сперматозоидами возвращались в инкубатор для дальнейшего культивирования. Через 16-20 часов после осеменения ооциты подвергались визуальному контролю под бинокулярной лупой (увеличение х40-75) и/или на инвертированном микроскопе при увеличении х200. Ооциты, осеменённые по стандартной методике, подвергались пипетированию для освобождения от клеток corona radiata. Для ооцитов после процедуры ICSI, подобная манипуляция не была нужна. При микроскопическом исследовании определялось наличие пронуклеусов, их число, характер расположения проядрышек, а также состояние цитоплазмы. Зиготы, имеющие признаки патологии оплодотворения (три и более пронуклеусов, грубая зернистость или лизис цитоплазмы, вакуолизация), в дальнейшей работе не использовались и подвергались уничтожению. Отобранные нормальные зиготы переносились в лунку (или микрокапли) со свежей питательной средой и культивировались в течение 30 и более часов (стадии 8 бластомеров, морула, бластоциста) до момента переноса в полость матки. Контроль за характером дробления предимплантационных эмбрионов определялся дважды в течение рабочего дня. Время переноса эмбрионов определялись гинекологом - лечащим врачом женщины, совместно с эмбриологом и пациенткой. Избыточные эмбрионы, с согласия женщины подвергались криоконсервации и длительному хранению в жидком азоте. Качество проведенного ЭКО оценивалось по интегральной шестибалльной шкале от 0 до 5 для последующего анализа. В качестве составляющих включались такие критерии как: процент оплодотворения и 39 дробления, соответствие стадии дробления времени культивирования, степень фрагментации отдельных эмбрионов. Отсутствие оплодотворения оценивалось как 0, остановка развития на стадии пронуклеусов или их полная фрагментация как 1- очень плохое. Далее по числу эмбрионов, отстающих в развитии, фрагментированных, имеющих грубую зернистость цитоплазмы, неправильную форму и различный размер бластомеров эффективность ЭКО оценивалась как 2 – неудовлетворительное, 3 – удовлетворительное, 4 – хорошее, 5 – отличное. Перенос эмбрионов в матку. Отбираемые для переноса зародыши также оценивались исходя из критериев шестибалльной шкалы оценки ЭКО. При этом эмбрионы с оценкой 1 и 2 – не подлежали переносу в матку женщины. Перенос эмбрионов осуществляли на третьи сутки после начала культивирования in vitro при помощи катетера COOK («CooK», Австралия). После переноса эмбрионов и извлечения катетера, последний просматривали под микроскопом с целью исключения возможности их оставления в нем. Число перенесенных эмбрионов было индивидуальным и колебалось от 1 до 2. Все процедуры проводились в амбулаторных условиях. Всем пациенткам дополнительно вводили ХГ по 500-2000 ЕД в/м в день переноса эмбрионов, далее на каждый четвертый день после переноса эмбрионов, а также использовался микронизированный прогестерон интравагинально до 600мг/сут. В случаях синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) препарат ХГ не вводился. При задержке развития эндометрия со дня пункции фолликула назначался эстрадиола-валерат 2-4 мг/сут до момента диагностики беременности и далее в зависимости от её течения до 5-6-ой недели гестации. беременности На 21-ый день после пункции с целью диагностики определяли ß-субъединицу ХГ в сыворотке крови (количественный анализ). С целью подтверждения факта наступившей 40 беременности и установления локализации и числа имплантировавшихся эмбрионов проводили УЗИ органов малого таза трансвагинальным доступом. Наступившие беременности в дальнейшем велись в соответствии общепринятыми нормативными документами (приказ №572н). Математическая обработка полученных результатов. Для создания базы данных и обработки статистического материала использовался персональный компьютер PENTIUМ-V. В качестве основного программного обеспечения выбран пакет модулей для статистической обработки данных STATISTICA for Windows, Release 6,0 компании StatSoft Inc., США (2001). Вычислялось среднее арифметическое «М», среднеквадратическое отклонение «q», ошибки средней арифметической «m», доверительные интервалы «p». Для выявления достоверности различий между параметрами случайных величин пользовались критерием Стьюдента. Вычисление его предполагает нормальный или близкий к нормальному закон распределения. Исходя из этого, в большинстве случаев мы представляли результаты обработки данных в виде М±m. Объем выборки обозначили «n». 41 ГЛАВА КЛИНИЧЕСКАЯ III. ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСЛЕДОВАННЫХ ЖЕНЩИН. В соответствии с поставленной целью и задачам исследования, были проспективно обследованы 92 пациентки позднего репродуктивного возраста (старше 35 лет) с трубно-перитонеальным бесплодием. Ни одна из пациенток, вошедших в исследование, не работала ночью. Критерии отбора пациенток для лечения трубно-перитонеального бесплодия с применением ВРТ были таковы, что изначально в группы исследования вошли женщины позднего репродуктивного возраста от 35 до 42 лет, средний возраст которых составил 39,13±1,37 лет (табл.2). Таблица 2. Возраст обследованных пациенток, лет. Группа n I 58 II 34 Всего 92 М±m 39,38±1,52 38,98±1,26 39,68±1,37 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). Позднее материнство сопровождалось поздним отцовством, возраст мужей обследуемых пациенток варьировал от 37 до 45 лет и составил в среднем 40,37±2,18лет. Распределение обследованных по профессиональной принадлежности (табл.3) показало, что подавляющее большинство составили служащие (80,4%), межгрупповых статистически значимых различий не выявлено. 42 О профессиональных вредностях не упомянула ни одна из опрошенных. Таблица 3. Распределение обследованных по профессиональной принадлежности. Служащие Группы n I Рабочие Домохозяйки Учащиеся абс. % абс. % абс. % абс. % 58 47 81,0 - - 11 18,9 - - II 34 27 79,4 - - 7 20,6 - - Всего 92 74 80,4 - - 18 19,6 - - Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). В группах исследования не было выявлено ни одной женщины рабочей специальности и учащейся, в то время как домохозяйкой являлась каждая пятая обследованная (19,6%), межгрупповых различий не выявлено. При объективной оценке телосложения оценивали показатели роста и веса (табл.4). Таблица 4. Антропометрические показатели обследованных. Группы n Рост, см Вес, кг I 58 166,7+6,4 76,5+11,9 II 34 166,2+5,7 77,1+10,6 Всего 92 166,4+6,1 76,8+11,3 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). Установлено, что по росту и весу все обследованные пациентки были сопоставимы. 43 Была проведена более детальная оценка весо-ростовых показателей с определением ИМТ (табл.5). Таблица 5. Степень выраженности ожирения. Группы Ожирение n I II III I 58 8 (13,8%) 3 (5,2%) - II 34 5 (14,7%) 2 (5,9%) - Всего 92 13 (14,1%) 5 (5,4%) - Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). Установлено, что у каждой пятой (18 (19,6%) женщины, вошедшей в исследование, диагностировано ожирение. Каждая седьмая женщина (14,1%) страдала ожирением I степени, ожирение II степени диагностировано в среднем у 5,4% , межгрупповых различий не выявлено. Ожирение III степени не встречалось ни в одной из изучаемых групп. Изучение структуры сопутствующих экстрагенитальных заболеваний показало (табл.6), что достоверно преобладали заболевания органов пищеварения (хронический гастрит, хронический холецистит, у одной пациентки – поликистоз печени) и мочеполовой системы (инфекции мочевыводящих путей, хронический пиелонефрит, хронический цистит). Болезни органов пищеварения диагностированы практически у каждой второй (44,6%), межгрупповых статистически значимых различий не выявлено. 44 Таблица 6. Структура сопутствующих экстрагенитальных заболеваний. Группы n Болезни системы кровообращения абс. % Болезни органов дыхания абс. % Болезни органов пищеварения абс. % Болезни мочеполовой системы Болезни щитовидной железы абс. % абс. % I 58 6 10,3 6 10,3 26 44,8 21 36,2 4 6,9 II 34 4 11,8 4 11,8 15 44,1 12 35,3 2 5,9 Всего 92 10 10,8 10 10,8 41 44,6 33 35,8 6 6,5 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). 45 Болезни мочеполовой системы (хронический пиелонефрит, мочекаменная болезнь) занимали второе место по распространенности и встречались у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием более чем у каждой третьей (35,8%). Статистически значимых различий между группами не выявлено. Болезни органов кровообращения (гипертоническая болезнь, соматоформная дисфункция), а также болезни органов дыхания (хронический бронхит) диагностированы с одинаковой частотой - у каждой девятой – десятой, достоверных межгрупповых различий не выявлено. Болезни щитовидной железы (аутоимунный тиреоидит, гипотиреоз) встречались примерно с одинаковой частотой – у 6 (6,5%) женщин, статистически значимых различий между группами не выявлено. В целом на одну обследованную пациентку приходилось 1,1 экстрагенитальное заболевание. Не было выявлено межгрупповых достоверных различий в выявленных соматических заболеваниях, в структуре которых лидирующие позиции занимали болезни органов пищеварения и мочеполовой системы. Возраст менархе представлен в табл. 7. Как видно из Таблица 7. Основные показатели менструальной функции обследованных. ПродолжиДлительность тельность менструации, менструального дни цикла, дни Группы n Возраст менархе, лет I 58 13,1+1,36 5,3+0,9 27,8+5,1 II 34 13,15+1,37 5,4+1,3 27,1+4,7 Всего 92 13,05+1,27 5,3+1,0 27,4+4,8 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). 46 представленных данных, возраст менархе колебался от 12 до 14 лет. Средний возраст наступления первой менструации не имел статистически значимых различий. По таким анализируемым показателям как длительность менструаций и продолжительность менструального цикла статистически значимых различий также выявлено не было. Анализ характера менструальной функции показал, что большинство женщин (83 (90,2 %) имели регулярный менструальный цикл длительностью 28-30 дней. У 9 (9,8%) наблюдалось укорочение менструального цикла до 23-24 дней, межгрупповых статистически значимых различий не выявлено. Средний возраст начала половой жизни не имел статистически значимых различий по группам и в среднем составил 16,7 +1,7 лет (табл.8). Таблица 8. Возраст начала половой жизни. Группы n Возраст начала половой жизни, лет I 58 16,4+1,5 II 34 16,9 +2,02 Всего 92 16,7 +1,7 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). В браке состояли все обследованные пациентки, межгрупповых различий не выявлено (табл.9). Каждая четвертая женщина программы ЭКО на момент обследования находилась в повторном браке. Полученные данные являются подтверждением того, что в бесплодных браках имеет место неустойчивость семейных отношений. 47 Таблица 9. Семейное положение обследованных. Первый Повторный Группы n брак брак абс. % абс. % I 58 43 74,1 15 25,9 II 34 26 76,5 8 23,5 Всего 92 69 75 23 25 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). Изучение контрацептивного поведения обследованных пациенток показало, что до момента установления факта бесплодия большинство женщин (62 (67,4%) от беременности никогда не предохранялись. Остальные 30 женщин в разные временные периоды использовали тот или иной способ контрацепции (табл.10). Таблица 10. Структура используемых контрацептивных средств. Группа n Барьерный ВМК Гормональная метод Другие контрацепция абс. % абс. % абс. % абс. % I 19 3 15,8 4 21,0 2 10,5 10 52,6 II 11 2 18,2 2 18,2 1 9,1 6 54,5 Всего 30 5 16,7 6 20 3 10 16 53,3 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). Каждая шестая супружеская пара в качестве контрацептивного средства применяла презерватив. Каждая десятая женщина использовала комбинированные оральные контрацептивы, межгрупповых различий не выявлено. Следует отметить, что каждая четвертая (20%) женщина с трубно- 48 перитонеальным бесплодием указывала на использование внутриматочного контрацептива (ВМК). Длительность использования ВМК была от 1 до 9 лет, в среднем 4,5+2,4 года. Более половины пациенток, предохранявшихся от нежелательной беременности, отдавали предпочтение ритм-методу и прерванному половому акту. Статистически значимых межгрупповых различий не выявлено. Анализ структуры сопутствующих заболеваний репродуктивной системы показал (табл.11), что, как правило, пациентки программ ЭКО имели одновременно несколько гинекологических заболеваний. В среднем на одну больную показатель заболеваемости составил 1,5. Так, три из четырех (76,1%) пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием указывали на наличие хронических воспалительных заболеваний придатков, по поводу чего проводилось неоднократное амбулаторное и стационарное лечение. Кроме того, каждая третья - указывала на хронический эндометрит в анамнезе. Достоверных межгрупповых различий не выявлено. В структуре гиперпластических заболеваний матки у женщин с трубноперитонеальным бесплодием достоверно преобладали гиперпластические заболевания эндометрия (железистая гиперплазия) – у каждой шестой (17,4%); миома матки диагностирована у каждой восьмой (13,0%) обследованной. Достоверных межгрупповых различий не выявлено. Указания на наружный генитальный эндометриоз в анамнезе встречались у каждой восьмой (11,9%) обследованной. В целом, в структуре гинекологических заболеваний у женщин позднего репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным бесплодием лидирующие позиции занимали придатков. хронические воспалительные заболевания матки и 49 Таблица 11. Структура сопутствующих гинекологических заболеваний. Группы n I 58 II 34 Всего Хронический сальпингит и оофорит Хронический эндометрит Миома матки Гиперпластические процессы эндометрия Наружный генитальный эндометриоз абс. % 44 75,8 19 32,7 8 13,8 10 17,2 7 12,1 абс. 26 11 4 6 4 % 76,5 32,3 11,8 17,6 11,8 16 17,4 11 11,9 абс. 70 30 12 % 76,1 32,6 13,0 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). 92 50 Гинекологические операции в анамнезе были у 76 (82,6%) пациенток. Данные о характере и количестве перенесенных операций представлены в таблице 12. Представленные в таблице данные демонстрируют, что частота ранее перенесенных лапароскопий составила 73,9%, гистероскопий и диагностических выскабливаний эндометрия – 32,6%. У одной пациентки в анамнезе была лапаротомия по поводу внутреннего кровотечения после тупой травмы живота. В структуре перитонеальным пластические гинекологических операций у пациенток с трубно- бесплодием операции на достоверно преобладали маточных трубах реконструктивно- (сальпингоовариолизис, фимбриопластика, сальпингостомия и т.п.) - практически у каждой третьей (31,5%). Нами не выявлено достоверных межгрупповых различий. Ни у одной из женщин, перенесших реконструктивно-пластические операции на маточных трубах, беременность в течение первого года после оперативного лечения не наступила. Указания на тубэктомию в анамнезе встречались у 19 (20,6%) обследованных - у каждой пятой, в том числе, - у 9 (9,8%) была двухсторонняя тубэктомия, межгрупповых различий не выявлено. Гистероскопия в анамнезе имела место у каждой третьей (30 (32,6%) обследованной, из них более чем у каждой второй (16 (53,3%) после диагностического выскабливания эндометрия гистологически верифицирован гиперпластический процесс эндометрия (железистая гиперплазия). Нами не выявлено достоверных межгрупповых различий. Коагуляция очагов наружного генитального эндометриоза встречалась в анамнезе у каждой восьмой-девятой (11,9%), статистически значимых различий между группами не выявлено. 51 Таблица 12. Структура перенесенных гинекологических операций. Группы I II Всего Тубэктомия n односторонняя двухсторонняя Реконструктивнопластические операции на маточных трубах Резекция яичника/ яичников Коагуляция очагов эндометриоза Гистероскопия, диагностиче ское выскабливание эндометрия Консервативная миомэктомия 58 абс. % 7 12,1 6 10,3 17 29,3 3 5,2 7 12,1 19 32,8 3 5,2 34 абс. 3 3 11 2 4 11 1 % 8,8 8,8 32,3 5,9 11,8 32,3 2,9* 11 11,9 30 32,6 4 4,3 абс. 10 9 29 5 % 10,9 9,8 31,5 5,4 Примечание: * достоверность различий установлена (р<0,05). 92 52 Резекция яичников имела место у 5 (5,4%) пациенток, вошедших в исследование, достоверных различий между группами не выявлено. Консервативная миомэктомия диагностирована у пациенток достоверно чаще (р<0,05) I группы – у 5,2%, в то время как во II группе – у 2,9%. Основной жалобой всех пациенток являлось бесплодие (100%). Изучение репродуктивной функции женщин показало, что первичным бесплодием страдали 43 (46,7%) пациентки, а вторичным – 49 (53,3%) (табл.13). Достоверных межгрупповых различий не выявлено. Таблица 13. Бесплодие. Первичное бесплодие абс. % Вторичное бесплодие абс. % Группы n I 58 27 46,6 31 53,4 II 34 16 47,1 18 52,9 Всего 92 43 46,7 49 53,3 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). Длительность бесплодия у пациенток варьировала от 1 до 17 лет и составила в среднем 7,17±3,0 лет. Большая продолжительность заболевания обусловлена безуспешным предыдущим лечением по поводу бесплодия. Хочется обратить особое внимание на то, что длительность выжидательного периода после оперативных вмешательств (реконструктивно-пластических операциях на маточных трубах, консервативной миомэктомии, коагуляции эндометриоидных очагов и т.п.), сопровождавшаяся восстановления фертильности, превышала во всех случаях 4 года. отсутствием 53 Изучение репродуктивного анамнеза у пациенток, страдающих вторичным бесплодием, показало (табл.14), что в среднем на одну пациентку приходилось 1,07+0,97 беременностей. Из них лишь каждая третья (16 (32,6%) завершилась родами, среднее число родов составило 0,32±0,18. Не было выявлено достоверных межгрупповых различий. Более чем у каждой второй (26 (53,1%) женщины с трубно- перитонеальным вторичным бесплодием был в анамнезе артифициальный аборт. Причем практически послеабортные осложнения - каждая третья (8 (30,8%) указывала на послеабортный эндометрит. Большая часть женщин первый аборт сделали в период, предшествующий браку: 18 из 26 (69,2%) - до брака (р<0,05). До 18 лет артифициальный аборт сделала каждая четвертая (7 (26,9%) пациентка. У 19 анамнезе (38,7%) пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием в была трубы/труб. эктопическая беременность, завершившаяся удалением Не было выявлено статистически значимых различий между группами (в I группе эктопическая беременность в анамнезе - у 13 (41,9%), а во II – у 6 (33,3%). В целом, у пациенток с вторичным трубно-перитонеальным бесплодием исходы ранее наступавших беременностей представлены следующим образом: артифициальный аборт (53,1%); эктопическая беременность (38,7%); (32,6%). роды 54 Таблица 14. Особенности репродуктивного анамнеза женщин с вторичным бесплодием (Mm) Группа n I 31 II 18 Всего 49 Всего беременностей Всего родов 1,04±1,01 0,32±0,24 1,10 ±0,94 1,07+ 0,97 Артифициальный Эктопическая аборт беременность 0,62±0,35 0,49±0,15 0,66±0,44 0,46±0,20 0,64+0,39 0,47+0,18 0,33±0,12 0,32±0,18 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). 55 Резюме. Проведенный клинико-статистический анализ анамнеза пациенток позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием, включенных в программу ЭКО, показал, что, помимо основного заболевания, к факторам, препятствующим наступлению беременности в естественном цикле, а также снижающим эффективность программы ЭКО, следует относить: - возраст старше 35 лет; - длительность бесплодия свыше 7 лет; - отягощенный соматический анамнез – болезни органов пищеварения (44,6%), мочеполовой системы (35,8%), ожирение (19,6%); - сопутствующие сальпингоофорит гинекологические (76,1%), заболевания хронический - хронический эндометрит (32,6%), гиперпластические процессы эндометрия (17,4%); - высокая частота оперативных вмешательств в анамнезе (82,6%); - длительность выжидательного периода после оперативного лечения (реконструктивно-пластических операций на маточных трубах, коагуляции очагов наружного генитального эндометриоза, консервативной миомэктомии, резекции яичника/яичников) свыше одного года (у всех более 4 лет); - длительное использование ВМК в анамнезе (20%) – более 5 лет; - артифициальный аборт первой беременности в анамнезе - более чем у каждой второй с вторичным бесплодием (53,1%). 56 ГЛАВА РЕЗУЛЬТАТЫ IV. ЛАБОРАТОРНЫХ И ИНСТРУМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ. 4.1. Результаты ультразвукового исследования органов малого таза. Всем обследованным пациенткам проводилось неоднократное ультразвуковое исследование. При УЗИ обследованных пациенток, помимо признаков ранее указанных сопутствующих гинекологических заболеваний (глава III), впервые были выявлены ряд заболеваний, которые могли препятствовать восстановлению фертильности с помощью программы ЭКО (табл.15). Из 92 пациенток у 23 (25%) – каждой четвертой диагностированы заболевания эндометрия, межгрупповых различий не выявлено. Им всем в последующем была выполнена лечебно-диагностическая гистероскопия. Эхографическая картина поликистозных яичников имела место у каждой седьмой (14,1%), достоверно значимых межгрупповых различий не выявлено. У этих женщин динамическая фолликулометрия выявила картину хронической ановуляции. У каждой шестой пациентки (в I группе – у 18,9%, во II группе – у 14,7%, достоверность различий не выявлена) обнаружены гидросальпинксы. Обращает на себя внимание то, что у 8 (50%) пациенток из 16 был гидросальпинкс единственной маточной трубы. Им всем перед программой ЭКО была выполнена лапароскопическая тубэктомия. Впервые выявленная миома матки имела место у 6,5% женщин, у всех были интрамуральные миоматозные узлы малых размеров. Эхографические признаки эндометриоза матки I-II степени диагностированы у 6,5% женщин, межгрупповых достоверных различий не выявлено. 57 Таблица 15. Эхографическое исследование органов малого таза (признаки). Группа n Поликистозные яичники Гидросальпинксы Миома матки Заболевания эндометрия Эндометриоз матки абс. % абс. % абс. % абс. % абс. % I 58 8 13,8 11 18,9 4 6,9 15 25,9 4 6,9 II 34 5 14,7 5 14,7 2 5,9 8 23,5 2 5,9 Всего 92 13 14,1 16 17,4 6 6,5 23 25 6 6,5 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). 58 Все пациентки с трубно-перитонеальным бесплодием в зависимости от исходного состояния фолликулярного аппарата были разделены следующим образом (рис. 3, 4). 21% 14% 65% Норма Мультифолликулярные яичники Скудный фолликулярный запас Рис.3. Состояние фолликулярного запаса у пациенток I группы. 20% 15% Норма 65% Мультифолликулярные яичники Скудный фолликулярный запас Рис.4. Состояние фолликулярного запаса у пациенток II группы. Большинство женщин имело нормальный фолликулярный запас (в I группе – у 38 (65,5%), во II – у 22 (64,7%), в то время как скудный фолликулярный запас диагностирован у каждой пятой (в I группе – у 12 59 (20,7%), во II – у 7 (20,6%). Статистически значимых межгрупповых различий не выявлено. Резюме. Проведенное ультразвуковое исследование показало, что: 1) основными причинами инфертильности, помимо основного фактора, являются: не диагностированные ранее болезни эндометрия (25%); гидросальпинксы (17,4%), СПКЯ (14,1%); 2) у каждой пятой (20,6%) пациентки, включенной в программу ЭКО, имеет место скудный фолликулярный запас. 4.2. Результаты гистероскопии. Всем пациенткам (n=23), с выявленными в ходе ультразвукового исследования болезнями эндометрия, непосредственно перед стимуляцией суперовуляции проводилась патологические изменения гистероскопия. были В подтверждены ходе у гистероскопии всех (100%) обследованных (табл.16). Гиперплазия эндометрия выявлялась практически у трех четвертей обследованных, во II группе прослеживалась тенденция к увеличению частоты данной патологии, но статистически значимых различий не выявлено. В целом, частота гиперплазий эндометрия в обеих группах составила 17,4%. Синдром Ашермана (внутриматочные синехии) диагностирован у каждой седьмой-восьмой (в среднем у 13,0%), достоверных межгрупповых различий не выявлено. Сочетание синдрома Ашермана с гиперплазией эндометрия диагностировано достоверно чаще (р<0,05) у пациенток II группы (12,5%). Хронический эндометрит имел место у каждой третьей (в среднем у 34,7%) пациентки. Выявлена тенденция к увеличению частоты хронического эндометрита во II группе (37,5% против 26,7%), однако достоверных различий не выявлено. Все женщины с диагностированным хроническим 60 Таблица 16. Результаты гистероскопии (признаки) (Mm). Группа n Гиперплазия Внутриматочные Внутриматочные эндометрия синехии синехии + гиперплазия эндометрия абс. % абс. % абс. % Хронический эндометрит Эндометриоз абс. % абс. % I 15 10 66,7 2 13,3 1 6,7 5 33,3 4 26,7 II 8 6 75 1 12,5 1 12,5* 3 37,5 3 37,5 Всего 23 16 69,6 3 13,0 2 8,7 8 34,7 7 30,4 Примечание: * достоверность различий установлена (р<0,05). 61 эндометритом имели в анамнезе артифициальный аборт, а 4 пациентки указывали на длительное использование ВМК в анамнезе. Практически у каждой третьей (30,4%) в ходе гистероскопии выявлены эндометриоидные ходы. Межгрупповых достоверных различий не выявлено. Резюме. Проведенное гистероскопическое исследование, с раздельным диагностическим выскабливанием цервикального канала и стенок полости матки, на предварительном этапе программы ЭКО показало, что: 1) достоверно чаще выявляемыми внутриматочными являются: гиперплазия эндометрия (69,6%); эндометрит (34,7%), эндометриоз болезнями хронический (30,4%) (подтвержденные морфологически); 2) в структуре внутриматочных болезней у пациенток с трубноперитонеальным бесплодием внутриматочные синехии встречаются у каждой седьмой-восьмой (13,0%). 4.3. Результаты гормонального исследования. Изучение состояния гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы проводилось в раннюю фолликулиновую фазу менструального цикла (табл.17). Определение исходного уровня изучаемых гормонов показало, что статистически значимые различия по их содержанию между группами не выявлены. Определение аппарата основных маркеров состояния фолликулярного показало, что средний уровень ФСГ был выше 10 МЕд/мл и составил в среднем 14,6+7,39 МЕд/мл. Ещё один маркер фолликулярного запаса – АМГ - был на нижней границе допустимых значений и составил в среднем 1,0+0,69 нг/мл. Полученные показатели уровней АМГ и ФСГ свидетельствуют о скудном фолликулярном запасе в двух изучаемых группах и предполагаемом «бедном» ответе на стимуляцию суперовуляции. 62 Таблица 17. Содержание гормонов крови в раннюю фолликулярную фазу. ЛГ ФСГ АМГ Пролактин Эстрадиол Группа n (МЕд/мл) (МЕд/мл) (нг/мл) (МЕ/мл) (пг/мл) I 58 5,63±1,47 14,18±7,81 1,02±0,75 219,2±83,2 35,7+3,2 II 34 6,11±1,89 15,13±6,97 0,98±0,74 236,6±72,4 34,7+4,1 Всего 92 5,87+1,68 14,6+7,39 1,0+0,69 227,9+77,8 35,2+3,6 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). 63 Более чем у каждой третьей (36,9%) пациентки АМГ был ниже 1,0 нг/мл (в I группе – у 21 (36,2%) женщины, а во II группе – у 13 (38,2%). Сопоставление полученных результатов с данными УЗИ показало, что соответствие низкого уровня АМГ и высокой концентрации ФСГ ультразвуковой картине скудного фолликулярного запаса имело место лишь у каждой второй обследованной (в I группе – у 12 (57,1%) женщин, а во II – у 7 (53,8%). У остальных 15 (44,1%) пациенток при УЗИ состояние фолликулярного запаса расценено как нормальное. Концентрации таких гормонов как ЛГ, пролактин, эстрадиол находились в пределах референсных значений. Определение уровня прогестерона во II фазу менструального цикла (22-24 день) показало (табл.18), что уровень прогестерона в целом был низким, составив в среднем 10,3±4,6 нмоль/л. Таблица 18. Содержание прогестерона, нмоль/л. Группа n М±m Полноценная II фаза НЛФсиндром абс. % абс. % абс. % 13,8 11,8 19 12 32,7 35,3 31 18 53,4 52,9 13,0 31 33,7 49 53,3 I 58 10,6±4,4 II 34 9,9±4,9 8 4 Всего 92 10,3±4,6 12 Ановуляция Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). Так, более чем у каждой второй (53,3%) диагностирован ановуляторный менструальный цикл, НЛФ-синдром – у каждой третьей (33,7%), а полноценная II фаза имела место лишь у каждой седьмой-восьмой (13,0%). 64 Резюме. Проведенное гормональное исследование менструального цикла у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием позднего репродуктивного возраста показало, что: 1)более чем каждая третья пациентка имеет скудный фолликулярный запас, что предполагает «бедный» ответ на стимуляцию суперовуляции; 2)соотношение уровня гормонов АМГ и ФСГ с данными УЗИ показало, что чувствительность ультразвуковой оценки характера фолликулярного запаса составляет 55,9%; 3)у каждой второй (53,3%) диагностирован ановуляторный менструальный цикл, НЛФ-синдром – у каждой третьей (33,7%), а полноценная II фаза имела место лишь у каждой седьмой-восьмой (13,0%). 4.4. Определение уровня эндометриального белка АМГФ в менструальной крови. У всех инфертильных женщин было проведено определение АМГФ в менструальной крови. Были получены следующие результаты (табл.19). В целом, средний уровень АМГФ в изучаемых группах был достоверно ниже по сравнению с нормативными показателями (при двухфазном менструальном цикле АМГФ - 16 000-70 000 нг/мл) и составил в I группе 4026,5±2801,2 нг/мл, а во II - 3868,9±3372,9 нг/мл. Статистически значимых различий между группами не выявлено. Таблица 19. АМГФ в менструальной крови, нг/мл. Группа n Всего М+m Овуляторный менструальный цикл абс. % Ановуляция НЛФ-синдром абс. % абс. % I 58 4026,5±2801,2 8 13,8 19 32,7 31 53,4 II 34 3868,9±3372,9 4 11,8 12 35,3 18 52,9 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). 65 Овуляторный менструальный цикл имел место у каждой седьмойвосьмой обследованной, достоверных различий между группами не выявлено. Ановуляция (АМГФ менее 2000 нг/мл) диагностирована у каждой третьей пациентки с трубно-перитонеальным бесплодием, достоверных различий между группами не выявлено. Более чем у каждой второй, несмотря на овуляцию, II фаза менструального цикла была неполноценной (АМГФ 2000-12000 нг/мл), статистически значимых межгрупповых различий не выявлено. Сопоставление уровня прогестерона во II фазу менструального цикла и уровня АМГФ подтвердило, что продукция АМГФ зависит от уровня прогестерона (табл. 18,19). Очевидно, выраженный дефицит продукции АМГФ, свидетельствующий о дисфункции эндометриальных желез, может являться одним из патогенетических механизмов имплантационных неудач в рамках программы ЭКО. Резюме. Проведенное менструальной крови исследование содержания АМГФ в у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием показало, что: 1. Более чем у каждой второй, несмотря на овуляцию, II фаза менструального цикла неполноценная (АМГФ 2000-12000 нг/мл), то есть имеет место дефицит эндогенного прогестерона. 2. Продукция АМГФ зависит от уровня прогестерона. 3. Недостаточная рецепция прогестерона клетками-мишенями эндометрия ведет к дисфункции эндометриальных желез, с последующей дефицитной продукцией АМГФ. Выраженный дефицит АМГФ железистым эпителием эндометрия может являться механизмов имплантационных неудач. одним из патогенетических 66 4.5. Содержание мелатонина у женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием. Изучение содержания мелатонина сульфата в моче позволило выявить разнонаправленные нарушения секреции мелатонина у 100% исследуемых пациенток. Эти нарушения заключались как в нарушении ритма продукции мелатонина, так и снижении его уровня. В зависимости от уровня мелатонина сульфата в моче нами не было выявлено статистически значимых различий между группами (табл.20). У всех обследованных инфертильных женщин было выявлено снижение уровня мелатонина сульфата в моче, как в дневное, так и ночное время суток. Таблица 20. Уровень мелатонина сульфата в моче (нг/мл), (Mm). Группа n Среднесуточная концентрация Днем Ночью I 58 26,6±18,9 13,3±7,4 38,9±21,1 II 34 28,4±19,6 15,0±7,3 38,7±21,5 Всего 92 27,5±18,87 14,2±7,3 38,8±21,3 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). Более детальная оценка суточного ритма секреции мелатонина сульфата обследованных пациенток показала (табл.21) отсутствие статистически значимых межгрупповых различий. Было выявлено, что, начиная с 24 часов, происходит увеличение мелатонина сульфата в моче сравнению с предыдущими тремя часами в 2,4-2,5 раза по (интервал 21-24 часа). Максимальная концентрация мелатонина сульфата приходится на 3-6 часов, с последующим постепенным его снижением. Самый низкий уровень мелатонина сульфата был зарегистрирован в 15-18 часов. Нами не было выявлено физиологического увеличения ночной концентрации мелатонина 67 Таблица 21. Суточный ритм мелатонина сульфата в моче (нг/мл), часы. Группа n I 58 44,3±12,1 25,5±9,9 15,1±5,9 15,3±12,4 4,5±3,8 6,8±9,4 14,9±12,4 36,6±15,7 II 34 42,3±11,3 26,5±8,9 15,8±5,3 14,8±12,0 4,6±3,9 6,8±9,0 15,0±12,4 35,9±15,7 Всего 92 43,3±11,7 25,8±9,4 15,4±5,6 15,1±12,2 4,5±3,9 6,8±9,2 14,9±12,4 36,8±15,7 3-6 6-9 9-12 12-15 15-18 18-21 Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). 21-24 24-3 68 по сравнению с дневным его уровнем (в норме в 5-10 раз). Кроме того, пик уровня мелатонина у всех инфертильных женщин был смещен на 3-6 часов, вместо 2-4 часов. Так или иначе, но у всех пациенток позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием имело место снижение уровня и нарушение ритма продукции мелатонина. Резюме. Проведенные лабораторные и инструментальные методы исследования показали, что: 1. Основными причинами инфертильности, помимо основного фактора, являются: не диагностированные ранее болезни эндометрия (25%); гидросальпинксы (17,4%), СПКЯ (14,1%). 2. У каждой пятой (20,6%) пациентки, включенной в программу ЭКО, имеет место скудный фолликулярный запас. 3. Достоверно чаще выявляемой внутриматочной патологией являются: гиперплазия эндометрия (69,6%); хронический эндометрит (34,7%), эндометриоз (30,4%). У пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием внутриматочные синехии встречаются у каждой седьмой-восьмой (13,0%). 4.Более чем каждая третья пациентка имеет скудный фолликулярный запас, что предполагает «бедный» ответ на стимуляцию суперовуляции. 5.Соотношение уровня гормонов АМГ и ФСГ с данными УЗИ показало, что чувствительность ультразвуковой оценки характера фолликулярного запаса составляет 55,9%. 6. У каждой второй (53,3%) обследованной диагностирован ановуляторный менструальный цикл, НЛФ-синдром – у каждой третьей (33,7%), а полноценная II фаза имела место лишь у каждой седьмой-восьмой (13,0%). 7.Более чем у каждой второй, несмотря на овуляцию, II фаза менструального цикла была неполноценной (АМГФ 2000-12000 нг/мл), то есть имел место дефицит эндогенного прогестерона. 8.Продукция АМГФ зависит от уровня прогестерона. 69 9. Недостаточная рецепция прогестерона клетками-мишенями эндометрия, ведет к дисфункции эндометриальных желез, с последующей дефицитной продукцией АМГФ. Выраженный дефицит продукции АМГФ железистым эпителием эндометрия может быть одним из патогенетических механизмов имплантационных неудач. 10.У всех пациенток позднего репродуктивного периода с трубноперитонеальным бесплодием имело место снижение уровня мелатонина сульфата в моче. 11. У всех инфертильных женщин не было выявлено физиологического 5-10 кратного увеличения ночной концентрации мелатонина по сравнению с дневным его уровнем. Уровень концентрации в ночное время превышал дневные показатели лишь в 2,5 раза. Пик уровня мелатонина смещался на 3-6 часов (вместо 2 - 4 часов в популяции). 70 ГЛАВА V. ПОВЫШЕНИЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ПОЗДНЕГО РЕЗУЛЬТАТИВНОСТИ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ РЕПРОДУКТИВНОГО ПЕРИОДА У ЖЕНЩИН С ТРУБНО- ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ БЕСПЛОДИЕМ. 5.1. Обоснование возможности влияния на патогенетические звенья нарушений гомеостаза у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием. Трубно-перитонеальное бесплодие в современном мире продолжает удерживать ведущие позиции в структуре женской инфертильности из-за болезней, передаваемых половым путем, небезопасных абортов и послеродовых инфекций органов малого таза [88]. Одним из основных факторов, определяющих успех ЭКО, является возраст пациентки. C возрастом уменьшается фолликулярный запас, ухудшается качество ооцитов. Частота наступления клинической беременности и родов живым плодом при применении ВРТ не превышает 33% и 24,8% соответственно [24]. Y.A. Wang et al. (2012) [109] показали, что самый высокий коэффициент рождаемости у доноров яйцеклеток в возрасте 30-34 года (25, 0%), у доноров в возрасте 35 -39 лет этот показатель составил - 20,7%, а в возрасте старше 40 лет - 11,5%. Вместе с тем в последние годы пристальное внимание исследователей привлекают роль эпифиза и продуцируемого им гормона мелатонина в синхронизации суточных и сезонных биоритмов, в антистрессовой защите, а также его участии в нейроэндокринной регуляции репродуктивной системы. M.H. Cruz et al. (2014) [56] отмечают, что мелатонин является мощным антиоксидантом и антиапоптотическим агентом, что связано с его прямым влиянием на токсичные производные кислорода и способности уменьшать образование активных форм кислорода. Гаметы и эмбрионы млекопитающих очень чувствительны к окислительному стрессу. Мелатонин защищает их от свободных радикалов. У мужчин добавление мелатонина значительно улучшает жизнеспособность сперматозоидов, а его добавление в культуральную среду улучшает качество яйцеклетки. 71 P.L. Rangel, C.G. Gutierrez (2014) [91] отмечают, что инициирование репродуктивного сезона у кур связано со снижением выработки мелатонина и GnIH (гонадотропинингибирующего гормона), обусловленного увеличением светового дня. Снижение GnIH позволяет гонадолиберинам и гонадотропинам стимулировать рост фолликулов. F.Wang [110] обнаружили, что мелатонин способствует et al. (2013) развитию в пробирке мышиных эмбрионов. Об этом свидетельствовало увеличение скорости дробления бластоцисты, количества качественных бластоцист. достоверно Было установлено, что у мышей, получавших мелатонин, возрастала частота наступления беременности (95,0% в сравнении с контролем 67,8%), размеры помета (4,1 щенка в сравнении с контролем 2,7) и послеродовая выживаемость потомства (96,8% по сравнению с контролем 81,2%) по сравнению с мышами, мелатонин не получавших. Авторы показали, что мелатонин активирует экспрессию гена антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы и антиапоптозный фактор Bcl-2, на фоне снижения экспрессии про-апоптотических генов р53 и каспазы-3. Именно поэтому мелатонин, по мнению авторов, способствует имплантации бластоцист с более высоким качеством, что приводит к рождению здорового потомства и увеличению выживаемости детенышей. B.E. Fernández et al. (2013) [61] исследовали влияние мелатонина на эндокринные функции яичника в процессе старения у крыс. Было установлено, что у крыс среднего возраста (13 месяцев) мелатонина способствовало увеличению применение объема яичников, созреванию доминантных фолликулов, но при этом мелатонин не оказывал влияние на плотность фолликулов в яичниках. У старых крыс (возраст 22 месяца) на фоне мелатонина нормализовалось содержание эстрадиола по уровню сопоставимое с молодыми крысами. Исходя из представленных малочисленных исследований (особенно в человеческой популяции), направленных на изучение различных аспектов влияния мелатонина на репродуктивную функцию, нет полных научно 72 обоснованных данных о возможностях применения мелатонина с целью влияния на репродуктивную функцию вообще, и на качество яйцеклеток, бластоцист, имплантацию в частности. Проведенное нами изучение содержания мелатонина сульфата в моче позволило выявить разнонаправленные нарушения секреции мелатонина у 100% исследуемых пациенток. Эти нарушения заключались как в нарушении ритма продукции мелатонина, так и снижении его уровня. В зависимости от уровня мелатонина сульфата в моче нами не было выявлено статистически значимых различий между группами до приема экзогенного мелатонина. У всех обследованных инфертильных женщин было выявлено снижение уровня мелатонина сульфата в моче, как в дневное, так и ночное время суток. Более детальная оценка суточного ритма секреции мелатонина сульфата обследованных пациенток показала отсутствие статистически значимых межгрупповых различий. Было выявлено, что, начиная с 24 часов, происходит увеличение мелатонина сульфата в моче сравнению с предыдущими тремя часами в 2,4-2,5 раза по (интервал 21-24 часа). Максимальная концентрация мелатонина сульфата приходится на 3-6 часов, с последующим постепенным его снижением. Самый низкий уровень мелатонина сульфата был зарегистрирован в 15-18 часов. Нами не было выявлено физиологического увеличения ночной концентрации мелатонина по сравнению с дневным его уровнем (в норме в 5-10 раз). Кроме того, пик уровня мелатонина у всех инфертильных женщин был смещен на 3-6 часов, вместо 2-4 часов. Так или иначе, но у всех инфертильных женщин не было выявлено физиологического 5-10 кратного увеличения ночной концентрации мелатонина по сравнению с дневным его уровнем. Уровень концентрации в ночное время превышал дневные показатели лишь в 2,5 раза. Пик уровня мелатонина смещался на 3-6 часов, вместо 2 - 4 часов. В связи с доказанными взаимообусловленными болезнями нарушениями реципрокных взаимоотношений у инфертильных пациенток и 73 позднего репродуктивного возраста нами предпринята попытка оценить эффективность применения мелатонина у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием позднего репродуктивного возраста. Результаты исследования (глава IV) показывают целесообразность дополнительного назначения экзогенного мелатонина в рамках программ ВРТ для повышения их эффективности в этой возрастной группе. В связи с выявлением нарушения секреции мелатонина пациенткам был предложен прием препарата экзогенного мелатонина на этапе прегравидарной подготовки к программе ЭКО в дозе 3 мг в день, за 30 минут до сна, в течение 4 месяцев. Все пациентки были разделены на две группы, в зависимости от факта приема препарата экзогенного мелатонина: I группа – 58 пациенток, принимавших мелатонин; II - 34 пациентки, не принимавшие мелатонин перед ЭКО. 5.2. Эффективность включения мелатонина в программу ЭКО. Через 4 месяца прегравидарного приема мелатонина была повторно проведена оценка гормонального гомеостаза (табл.22). Таблица 22. Содержание гормонов крови в раннюю фолликулярную фазу. ЛГ ФСГ АМГ Пролактин (МЕ/мл) Эстрадиол Группы n I 58 5,4±1,7 13,0±7,4 1,12±0,75 186,15±63,35 38,4+3,8 II 34 6,1±1,9 15,1±6,9 1,0±0,74 219,24±83,16 35,7+3,2 (МЕд/мл) (МЕд/мл) (нг/мл) (пг/мл) Примечание: достоверность различий не установлена (р=0,05). Исходя из представленных в таблице данных, нами не было выявлено статистически значимой разницы в уровне изучаемых гормонов в зависимости от приема экзогенного мелатонина. 74 Дальнейшее сопоставление уровня изучаемых гормонов до и после проводимой терапии показало (рис.5), что прослеживалась тенденция к 16 14 12 10 До терапии 8 После терапии 6 4 2 0 ФСГ ЛГ АМГ Рис.5. Содержание ФСГ, ЛГ, АМГ до и после терапии мелатонином. снижению уровня ФСГ, ЛГ на фоне приема мелатонина, однако статистически значимых различий не выявлено. Уровень АМГ достоверно не менялся. Также отмечена тенденция к снижению проводимой терапии с пролактина на фоне 219,2±83,2 МЕ/мл до 186,15±63,35 МЕ/мл, достоверных различий не выявлено. Применение мелатонина не влияло на содержание такого гормона как эстрадиол: до терапии 35,7+3,2 пг/мл, после 38,4+3,8 пг/мл. Определение уровня прогестерона во II фазу менструального цикла (22-24 день) показало (табл.23), что уровень прогестерона пациенток, принимавших мелатонин, был достоверно выше при сравнении с женщинами, не принимавшими его. 75 Таблица 23. Содержание прогестерона, нмоль/л. Группа n М±m I 58 16,7±4,8* II 34 10,9±4,3 Полноценная II фаза НЛФсиндром Ановуляция абс. % абс. % абс. % 17 4 29,3* 11,8 17 12 29,3 35,3 24 18 41,4 52,9 Примечание: *достоверность различий установлена (р<0,05). Внутригрупповое сопоставление уровня прогестерона до и после проводимой терапии мелатонином показало (табл.24), что на фоне достоверно значимого возрастания прогестерона в сыворотке крови Содержание прогестерона нмоль/л. Группа n М±m пациенток Таблица 24. I группы до и после терапии Полноценная II фаза НЛФсиндром абс. абс. % % Ановуляция абс. % I – до 10,6±4,4 8 13,8 19 32,7 31 53,4 58 терапии I – после 16,7±4,8* 17 29,3* 17 29,3 24 41,4 58 терапии Примечание: *достоверность различий установлена (р<0,05). происходило статистически значимое увеличение полноценных двухфазных менструальных циклов с 13,8% до 29,3%, то есть более чем в 2,1 раза. Практически не изменилось число женщин с НЛФ-синдромом, но снизилось количество ановуляторных менструальных циклов с 53,4% до 41,4% - в 1,3 раза, однако статистически значимых различий не выявлено. Определение АМГФ в менструальной крови на фоне проводимой терапии показало (табл.25), что уровень АМГФ 76 Таблица 25. АМГФ в менструальной крови до и после терапии мелатонином , нг/мл. Группа Всего n М+m до терапии I 58 II Овуляторный менструальный цикл абс. % Ановуляция НЛФ-синдром абс. % абс. % 4026,5±2801,2 8 13,8 19 32,7 31 53,4 после 8387,9±4986,9* терапии 17 29,3* 17 29,3 24 41,4 3868,9±3372,9 4 11,8 12 35,3 18 34 Примечание: * достоверность различий установлена (р<0,05). 52,9 77 после терапии мелатонином достоверно увеличился с 4026,5±2801,2 нг/мл до 8387,9±4986,9 нг/мл - в 2,1 раза. Увеличение АМГФ напрямую коррелировало с увеличением прогестерона во II фазу менструального цикла на фоне терапии мелатонином и подтвердило известный факт, что АМГФ является прогестеронзависимым эндометриальным белком. Изучение содержания мелатонина сульфата в моче на фоне проводимой терапии мелатонином (табл.26) показало, что его концентрация Таблица 26. Уровень мелатонина сульфата в моче до и после терапии (нг/мл), (Mm). Группа Среднесуточная концентрация до терапии 26,6±18,9 n I 58 II Днем Ночью 13,3±7,4 38,9±21,1 после терапии 61,9±43,0* 29,4±9,9* 94,6±37,3* 34 28,4±19,6 15,0±7,3 38,7±21,5 Примечание: * достоверность различий установлена (р<0,05). достоверно возрастала как в дневное, так и ночное время суток. Так, среднесуточная концентрация мелатонина сульфат достоверно возросла в 2,3 раза, составив в среднем 61,9±43,0 нг/мл. Дневной уровень мелатонина достоверно возрос с 13,3±7,4 нг/мл до 29,4±9,9 нг/мл, то есть в 2,2 раза. Ночной уровень мелатонина сульфат достоверно вырос с 38,9±21,1 нг/мл до 94,6±37,3 нг/мл, то есть в 2,4 раза. Более детальная оценка суточного ритма секреции мелатонина сульфата обследованных показала (табл.27), привела к статистически значимому что, проводимая терапия увеличению мелатонина во все анализируемые интервалы. Так, начиная с 21 часа, наблюдалось постепенное 78 Таблица 27. Суточный ритм мелатонина сульфата в моче до и после терапии (нг/мл), часы. Группа I n 58 до терапии 3-6 6-9 44,3±12,1 25,5±9,9 9-12 34 42,3±11,3 26,5±8,9 15-18 15,1±5,9 15,3±12,4 4,5±3,8 после 124,9±21,1* 67,8±13,5* 42,8±8,0* терапии II 12-15 30,9 ±13,3* 18-21 21-24 24-3 6,8±9,4 14,9±12,4 36,6±15,7 22,5±3,9* 21,4±3,8 57,2±9,4* 128,3±20,2 * * 15,8±5,3 14,8±12,0 4,6±3,9 Примечание: * достоверность различий установлена (р<0,05). 6,8±9,0 15,0±12,4 35,9±15,7 79 увеличение уровня мелатонина сульфата в моче с пиковой концентрацией в 24-3 часа. Обращает на себя внимание, что высокий уровень мелатонина в моче имел место до 6 утра, с последующим постепенным его снижением. Низкое плато уровня мелатонина сульфата в моче регистрировалось в интервале 15-21 час. Нами представлена «мелатониновая кривая» у обследованных пациенток (рис.6). 140 128 125 120 100 80 68 60 40 57 44 43 37 31 26 23 20 15 15 5 0 До терапии, нг/мл 21 15 7 После терапии нг/мл Рис. 6. «Мелатониновая кривая» до и после терапии мелатонином. Как видно из представленных данных, после терапии мелатонином нормализовался ритм его выброса. Так, пиковый уровень мелатонина приходился на физиологический временной интервал 2-4 часа. Кроме того, разница между дневным и ночным уровнями мелатонина увеличилась - 80 ночной уровень мелатонина превышал дневной в 4 раза. Однако, достичь 510 кратной разницы между ночным и дневным показателями, то есть приблизиться к физиологическим показателям, несмотря на экзогенный прием мелатонина, не удалось. 5.3. Преодоление трубно-перитонеального бесплодия. Стимуляция суперовуляции проводилась гонадотропными препаратами по «короткому» протоколу. Анализ показателей фолликулогенеза и раннего эмбриогенеза показал (табл.28), что количество аспирированных фолликулов достоверно отличалось между группами. Так, у пациенток, получавших прегравидарно мелатонин, среднее число аспирированных фолликулов было достоверно больше и составило 4,8±1,1, для сравнения у пациенток, не получавших мелатонин, - 3,1±1,2. У одной пациентки (1,7%) I группы, несмотря на проведение стимуляции суперовуляции в рамках программы ЭКО, не было получено ни одного фолликула. У пациенток, принимавших мелатонин, получено достоверно большее число зрелых ооцитов - 2,9±1,1, в то время как во II группе - 2,2±1,3. Не было выявлено статистически значимых различий в количестве полученных эмбрионов и бластоцист, однако прослеживалась тенденция к увеличению их числа у женщин, получавших в течение 4 месяцев мелатонин (в I группе - 2,1 ±1,1, во II группе - 1,8±0,9). В целом, у 6 (6,5%) пациенток не было получено ни одного зрелого ооцита. Не было выявлено статистически значимых межгрупповых различий: в I группе – у 4 (6,9%), во II группе – у двух (5,9%) женщин. У 13 (14,1%) пациенток не было получено ни одного эмбриона. Так, у 8 (14,8%) пациенток, получавших мелатонин, не получено эмбрионов, а среди женщин, не получавших мелатонин, - эмбрионы не получены у 5 (14,7%), то есть статистически значимых различий между группами не выявлено. Таким образом, до этапа переноса эмбрионов в полость матки не дошло 19 (20,6%) женщин, то есть каждая пятая. 81 Таблица 28. Показатели фолликулогенеза и раннего эмбриогенеза, М+m. Группа n Количество фолликулов Количество ооцитов Количество эмбрионов Количество бластоцист Перенесено эмбрионов 3,2±0,5 Количество зрелых ооцитов 2,9±1,1* I 58 4,8±1,1* 2,2 ±1,2 2,1 ±1,1 1,4±0,8 II 34 3,1±1,2 2,8±1,0 2,2±1,3 1,9±1,1 1,8±0,9 1,1±0,9 Примечание: * достоверность различий установлена (р<0,05). 82 Нами не проводился селективный перенос в полость матки одного эмбриона или не более двух эмбрионов. Учитывая «бедный» ответ яичников на индукторы овуляции в обеих группах, в полость матки осуществлялся перенос всех качественных эмбрионов: в I группе - 1,4±0,8, во II группе 1,1±0,9. Не было выявлено статистически значимых межгрупповых различий по числу перенесенных в полость матки эмбрионов. Перенос эмбрионов в полость матки был осуществлен у 73 (79,3%) пациенток. В подавляющем большинстве (83,5%) проводился перенос эмбрионов в полость матки на третий день культивирования, когда эмбрионы достигали стадии 8 бластомеров, поскольку не было уверенности и гарантий их дальнейшего развития. Оценка частоты наступления беременности в стимулированном цикле показала, что (табл.29) беременность наступила у 25 пациенток (26,9%). Таблица 29. Частота наступления беременности, на цикл. Группа n Беременности абс. % Ранние репродуктивные потери абс. % Роды живым плодом I 58 17 29,3 3 5,2 14 24,1 II 34 8 23,5 4 11,7* 4 11,7* Всего 92 25 26,9 7 7,6 18 19,6 Примечание: * достоверность различий установлена (р<0,05). У женщин, получавших мелатонин, прослеживалась тенденция к увеличению частоты наступления беременности - в 1,3 раза выше, при 83 сравнению с обследованными, не принимавшими данный препарат (29,3% против 23,5% соответственно). Однако статистически значимых различий не выявлено. Дальнейшая оценка течения данной беременности показала (табл.30), что в группе женщин, не принимавших мелатонин, у четырех женщин из 8 забеременевших беременность прервалась на ранних сроках гестации (у одной ранний самопроизвольный выкидыш, у трех – неразвивающаяся беременность). В то же время в группе пациенток, получавших мелатонин, ранние репродуктивные потери диагностированы достоверно реже - у трех из 17 (17,6%), то есть в 2,8 раза меньше. Таблица 30. Исходы наступивших беременностей. Группы n Самопроизвольный выкидыш Неразвивающаяся беременность Роды живым плодом абс. % абс. % абс. % I 17 1 5,9 2 11,7 14 82,4 II 8 1 12,5* 3 37,5* 4 50* Всего 25 2 8 5 20 18 72 Примечание: * достоверность различий установлена (р<0,05). В структуре ранних репродуктивных потерь преобладала неразвивающаяся беременность, достоверно чаще диагностированная у пациенток, не принимавших мелатонин (37,5%). В подавляющем большинстве у женщин, принимавших мелатонин, наступившая беременность в рамках программы ЭКО завершилась родами живым плодом (14 (82,4%). У женщин, не принимавших мелатонин, роды 84 живым плодом имели место лишь у каждой второй (50%) с наступившей беременностью. На рисунке (рис.6) представлено наше видение механизма влияния мелатонина на репродуктивную систему. Шишковидная железа: мелатонин гипоталамус GnRH GnIH Гипофиз: гонадотропины и гонадолиберины Яичники и другие органы репродуктивной системы: эстрадиол, тестостерон, прогестерон прогестерон АМГФ Рис.6. Механизм влияния мелатонина на репродуктивную систему женщин. Резюме. Результаты проведенного исследования позволяют сделать следующие выводы: 85 1. Прием мелатонина не оказывает влияния на состояние фолликулярного запаса. Уровни АМГ и ФСГ достоверно не меняются на фоне его применения. 2. Прием мелатонина способствует достоверному увеличению экскреции прогестерона, что приводило к статистически значимому увеличению полноценных двухфазных менструальных циклов с 13,8% до 29,3%, то есть более чем в 2,1 раза; снижению ановуляторных менструальных циклов с 53,4% до 41,4% - в 1,3 раза. 3. Уровень АМГФ после терапии мелатонином достоверно увеличивался с 4026,5±2801,2 нг/мл до 8387,9±4986,9 нг/мл - в 2,1 раза. Увеличение АМГФ напрямую коррелирует с увеличением прогестерона во II фазу менструального цикла на фоне терапии мелатонином и подтверждает известный факт, что АМГФ является прогестеронзависимым эндометриальным белком. 4. Терапия мелатонином способствует приближению «мелатониновой кривой» к физиологическим показателям: нормализуется время пикового выброса мелатонина – в 2-4 часа; увеличивается разница между дневным и ночным уровнями мелатонина - ночной уровень превышает дневной в 4 раза. Однако, достигнуть 5-10 кратной разницы между ночным и дневным показателями, то есть приблизиться к физиологическим показателям, несмотря на экзогенный прием мелатонина, не удалось. 5. Прием мелатонина достоверно увеличивает количество аспирированных фолликулов, однако, несмотря на его применение, ответ на стимуляцию гонадотропинами характеризуется сниженной реакцией («бедный»). 6. Мелатонин не влияет на показатели раннего эмбриогенеза – число перенесенных эмбрионов в полость матки не имело статистически значимых различий между группами. 7. Мелатонин беременностей, не но оказывает способствует влияние на частоту наступивших полноценной инвазии трофобласта. 86 Опосредованно через статистически значимое увеличение уровня прогестерона и прогестеронзависимого эндометриального белка АМГФ мелатонин способствует качественной имплантации, что определяет успешный исход наступившей беременности: ранние репродуктивные потери диагностированы достоверно реже - у 17,6%, то есть в 2,8 раза меньше; частота рождений живым плодом - у 82,4%, то есть в 1,65 раза выше. 87 ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Современная демографическая ситуация в Российской Федерации ставит перед государством и обществом необходимость обращения пристального внимания на реализацию репродуктивной функции у каждой женщины, желающей родить ребенка [11]. За период 1999-2011 гг. заболеваемость женского населения (на 100000 человек в возрасте 18 лет и старше) эндометриозом возросла на 72,9% (1999г. – 218,0; 2009 г. – 376,5), расстройствами менструального цикла – на 53%, бесплодием на 34,9% (1999г. – 389,0; 2009 г. – 524,9) [35]. Высокая частота бесплодия в настоящее время является одной из сложнейших проблем современной медицины. Около 15% супружеских пар страдают бесплодием [9]. Воспалительное поражение маточных труб - ведущая причина бесплодия. В РФ в группах работающих женщин до 36 лет воспалительные заболевания органов малого таза встречаются у 19% [21]. Такие неутешительные показатели могут продолжать расти, так как все больше женщин откладывают вступление в брак и имеют несколько сексуальных партнеров в течение 10-15 лет половой жизни, что увеличивает риски осложнений воспалительных заболеваний органов малого таза. Воспалительные заболевания внутренних органов занимают лидирующее положение в структуре острой гинекологической патологии, хотя в последнее время отмечается стабилизация заболеваемости острыми воспалительными заболеваниями придатков матки. Удельный вес воспалительных заболеваний составляет 60-65% всех гинекологических больных [22]. С развитием ВРТ многие проблемы, в том числе, связанные с преодолением трубно-перитонеального бесплодия, были успешно преодолены. По оценкам экспертов, 2% - 3% всех родов в развитых странах являются результатом программ ЭКО [64]. Однако далеки от разрешения вопросы преодоления бездетности у пациенток с недостаточным ответом яичников на стимуляцию гонадотропинами в программах ЭКО. 88 Актуальность этой проблемы обусловлена, прежде всего, увеличением числа женщин старшего репродуктивного возраста, обращающихся в центры ЭКО с целью лечения бесплодия. По данным N.P. Polyzos et al. (2013) [89], частота наступления беременности у пациенток со сниженным показателем овариального резерва составляет 8,8% на одну попытку. До настоящего времени, несмотря на успехи в развитии фармакологии и усовершенствование методов ВРТ, добиться более высоких показателей наступления беременности не удается. В этой связи поставлена цель исследования: улучшить исходы программ ВРТ у женщин позднего репродуктивного возраста с трубно- перитонеальным бесплодием, включая в них коррекцию гормонального гомеостаза для нормализации содержания мелатонина. Для выполнения задач исследования были обследованы 92 пациентки позднего репродуктивного периода (старше 35 лет) с трубно- перитонеальным бесплодием. Все они были разделены на две группы, в зависимости от факта приема препарата экзогенного мелатонина: I группа – 58 пациенток, принимавших мелатонин на этапе прегравидарной подготовки к программе ЭКО в дозе 3 мг в день, за 30 минут до сна, в течение 4 месяцев; II - 34 пациентки, не принимавшие мелатонин перед ЭКО. Проведенный клинико-статистический анализ анамнеза пациенток позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием, включенных в программу ЭКО, показал, что помимо основного заболевания, к факторам, препятствующим наступлению беременности в естественном цикле, а также снижающим эффективность программы ЭКО следует относить: возраст старше 35 лет; длительность бесплодия свыше 7 лет; отягощенный соматический анамнез – болезни органов пищеварения (44,6%), мочеполовой системы (35,8%), ожирение (19,6%); сопутствующие гинекологические заболевания - хронический сальпингоофорит (76,1%), хронический эндометрит (32,6%), гиперпластические процессы эндометрия (17,4%); высокую частоту оперативных вмешательств в анамнезе (82,6%); 89 длительность выжидательного периода после оперативного лечения (реконструктивно-пластических операций на маточных трубах, коагуляции очагов наружного генитального эндометриоза, консервативной миомэктомии, резекции яичника/яичников) свыше одного года (у всех более 4 лет); длительное использование ВМК (20%) артифициальный аборт первой беременности в анамнезе – более 5 лет; - более чем у каждой второй с вторичным бесплодием (53,1%). Критерии отбора пациентов для проведения лечения трубно- перитонеального бесплодия с применением ВРТ были таковы, что изначально в группы исследования вошли женщины позднего репродуктивного возраста от 35 до 42 лет, средний возраст которых составил 39,13±1,37 лет. Позднее материнство сопровождалось поздним отцовством, возраст мужей обследуемых пациенток варьировал от 37 до 45 лет и составил в среднем 40,37±2,18лет. Представленные в нашем исследовании сведения о возрасте, демонстрируют современные особенности гендерных отношений. По данным Г.Б.Дикке, Л.В.Ерофеевой (2013) [12], современное социальноэкономическое состояние РФ оказывает существенное влияние на жизненные приоритеты молодежи, вектор которых направлен в основном на повышение материального благополучия и не совпадает с созданием семьи и рождением детей. В браке состояли все обследованные пациентки, межгрупповых различий не выявлено. Каждая четвертая женщина программы ЭКО на момент обследования находилась в повторном браке. Полученные данные являются подтверждением того, что в бесплодных браках имеет место неустойчивость семейных отношений. По мнению А.Р.Ивановой (2010) [15], к факторам, оказывающим неблагоприятное влияние на исход лечения бесплодия, относят психогенные факторы немедицинского характера, в том числе проблемы в семейно-супружеских отношениях. Демографические показатели РФ последних десятилетий демонстрируют, что средний возраст 90 рождения составляет 26 лет, а доля внебрачных рождений составляет 26,1% [17]. Изучение контрацептивного поведения обследованных пациенток показало, что до момента установления факта бесплодия большинство женщин (62 (67,4%) от беременности никогда не предохранялись. низкий уровень исследователей знаний о контрацепции указывают На множество [32; 67]. Следует отметить, что каждая четвертая (20%) женщина с трубно-перитонеальным бесплодием указывала на использование внутриматочного контрацептива (ВМК). Длительность использования ВМК была от 1 до 9 лет, в среднем 4,5+2,4 года. Более половины пациенток, предохранявшихся от нежелательной беременности, отдавали предпочтение ритм-методу и прерванному половому акту, то есть использовали низкоэффективные методы контрацепции. Анализ структуры сопутствующих заболеваний репродуктивной системы показал, что, как правило, пациентки программы ЭКО имели одновременно несколько гинекологических заболеваний. В среднем на одну больную приходился показатель заболеваемости 1,5. Так, три из четырех (76,1%) пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием указывали на наличие хронических воспалительных заболеваний придатков, по поводу чего проводилось неоднократное амбулаторное и стационарное лечение. Кроме того, каждая третья - указывала на хронический эндометрит в анамнезе. Достоверных межгрупповых различий не выявлено. Полученные данные не противоречат результатам исследования А.О.Духина и соавт. (2013) [14], показавшего, что при трубно-перитонеальном бесплодии признаки хронических воспалительных заболеваний органов малого таза встречаются у 26% - 100% женщин. В структуре гиперпластических заболеваний матки у женщин с трубноперитонеальным бесплодием достоверно преобладали гиперпластические заболевания эндометрия (железистая гиперплазия) – у каждой шестой (17,4%); миома матки диагностирована у каждой восьмой (13,0%) 91 обследованной. Достоверных межгрупповых различий не выявлено. Указания на наружный генитальный эндометриоз в анамнезе встречались у каждой восьмой (11,9%) обследованной. Гинекологические операции в анамнезе были у 76 (82,6%) пациенток, в том числе лапароскопии - у 73,9%, гистероскопии и диагностические выскабливания эндометрия – у 32,6%. Гистероскопия в анамнезе имела место у каждой третьей (30 (32,6%) обследованной, из них более чем у каждой второй (16 (53,3%) после диагностического выскабливания эндометрия гистологически верифицирован гиперпластический процесс эндометрия (железистая гиперплазия). Нами не выявлено достоверных межгрупповых различий. По мнению Э.В.Вартанян (2012) [8], структурно-функциональные изменения эндометрия имеют место практически у всех пациенток с бесплодием. Так, при трубно-перитонеальных формах у 100% женщин имеют место склеротические изменения эндометрия. В структуре гинекологических операций у пациенток с трубно- перитонеальным бесплодием достоверно преобладали реконструктивнопластические операции на маточных трубах (сальпингоовариолизис, фимбриопластика, сальпингостомия и т.п.) - практически у каждой третьей (31,5%). Нами не выявлено достоверных межгрупповых различий. Ни у одной из женщин, перенесших реконструктивно-пластические операции на маточных трубах, беременность в течение первого года после оперативного лечения не наступила. Указания на тубэктомию в анамнезе встречались у 19 (20,6%) обследованных - у каждой пятой, в том числе, - у 9 (9,8%) была двухсторонняя тубэктомия, межгрупповых различий не выявлено. Длительность бесплодия у пациенток варьировала от 1 до 17 лет и составила в среднем 7,17±3,0 лет. Большая продолжительность заболевания обусловлена безуспешным предыдущим лечением по поводу бесплодия. Многими авторами четко указывается на тот факт, что наиболее оптимальным выжидательным периодом наступления беременности в естественном цикле является первый год после оперативного лечения, в 92 случае отсутствия восстановления беременности по истечении данного года необходимо прибегать к ВРТ [13; 16; 28]. Наше исследование выжидательного продемонстрировало, периода после (реконструктивно-пластических что оперативных операциях на длительность вмешательств маточных трубах, консервативной миомэктомии, коагуляции эндометриоидных очагов и т.п.), сопровождавшаяся отсутствием восстановления фертильности, превышала во всех случаях 4 года. Полученные данные демонстрируют известный факт, что затягивание принятия решения прибегнуть к ВРТ способствовало не только усугублению нарушений состояния репродуктивного здоровья, но и пресловутому увеличению биологического возраста женщины, что вкупе снижало вероятность успешных попыток ЭКО. Изучение репродуктивного анамнеза у пациенток, страдающих вторичным бесплодием, показало, что в среднем на одну пациентку приходилось 1,07+0,97 беременностей. Из них лишь каждая третья беременность (16 (32,6%) завершилась родами, среднее число родов составило различий. 0,32±0,18. Не было выявлено достоверных межгрупповых Более чем у каждой второй (26 (53,1%) женщины с трубно- перитонеальным вторичным бесплодием был в анамнезе артифициальный аборт. Причем практически послеабортные осложнения - каждая третья (8 (30,8%) указывала на послеабортный эндометрит. Большая часть женщин первый аборт сделали в период, предшествующий браку: 18 из 26 (69,2%) - до брака (р<0,05). До 18 лет артифициальный аборт сделала каждая четвертая (7 (26,9%) пациентка. Полученные данные наглядно отражают современную ситуацию в вопросах полового воспитания – отсутствие качественной информации нежеланной беременности о надежной контрацепции, хирургическим прерывание методом и т.п. Несовершеннолетние матери, равно как и их партнеры, не имеют точного представления о методах контрацепции, а в случае наступления беременности 85% девушек данную беременность прерывают [75]. 93 У 19 (38,7%) пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием в анамнезе была эктопическая беременность, завершившаяся удалением трубы/труб. Не было выявлено статистически значимых различий между группами (в I группе эктопическая беременность в анамнезе - у 13 (41,9%), а во II – у 6 (33,3%). Большинство авторов [68; 83] считают, что не выбор объема оперативного лечения трубной беременности (лапароскопическая сальпингостомия или сальпингэктомия) оказывает влияние на восстановление фертильности в будущем, а состояние противоположной маточной трубы. Проведенное ультразвуковое исследование показало, что основными причинами инфертильности, помимо основного фактора, являются: не диагностированная ранее патология эндометрия (25%); гидросальпинксы (17,4%), СПКЯ (14,1%). Y. Song et al. (2012) [101] указывают, что трансвагинальное УЗИ имеет чувствительность - 37,04%, специфичность 98,71%, положительную прогностическую отрицательную прогностическую ценность - ценность - 90,91%, 81,85% для диагностики раздельным диагностическим внутриматочной патологии. Проведенные гистероскопии, с выскабливанием цервикального канала и стенок полости матки, на предварительном этапе программы ЭКО показали, что: достоверно чаще выявляемыми внутриматочными эндометрия (69,6%); хронический болезнями эндометрит являются: гиперплазия (34,7%), эндометриоз (30,4%). В целом, частота гиперплазий эндометрия в обеих группах составила 17,4%. В структуре внутриматочных болезней у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием внутриматочные синехии встречались у каждой седьмой-восьмой (13,0%). Полученные нами данные сопоставимы с результатами исследования М.И.Базиной и соавт. (2013) [5], показавших, что гиперплазия эндометрия у пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием выявляется у 17% обследованных, что, по мнению авторов, требует более 94 широкого применения гистероскопического исследования у данных пациентов. Мы полностью согласны с мнением C.H. Tu et al. (2013) [108], которые отмечают, что поражение эндометрия является серьезным заболеванием, резко ограничивающим способность к имплантации, особенно это касается ситуаций, сопровождающихся фиброзом. Потеря эндометрием стволовых клеток, находящихся в базальном слое, вызывает пролиферацию фиброзной ткани с последующим формированием синехий. Биологический возраст женщины не является достоверным прогностическим признаком репродуктивного старения. В последние годы активно изучались биомаркеры, помогающие лучше охарактеризовать отдельные фазы этого процесса [38]. Так, C. Ficicioglu et al. (2014) [62] указывают, что значение АМГ ≤ 1 нг / мл является предиктором снижения яичникового резерва, плохого ответа яичников на стимуляцию суперовуляции в рамках программы ЭКО. Проведенное гормональное исследование в раннюю фолликулярную фазу менструального цикла у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием позднего репродуктивного возраста показало, что более чем каждая третья пациентка имела скудный фолликулярный запас, что предполагало «бедный» ответ на стимуляцию суперовуляции. В дальнейшем у 6 (6,5%) пациенток не было получено ни одного зрелого ооцита. Не было выявлено статистически значимых межгрупповых различий: в I группе – у 4 (6,9%), во II группе – у двух (5,9%) женщин. У 13 (14,1%) пациенток не было получено ни одного эмбриона. Так, у 8 (14,8%) пациенток, получавших мелатонин, не получено эмбрионов, а среди женщин, не получавших мелатонин, эмбрионы не получены у 5 (14,7%), то есть статистически значимых различий между группами не выявлено. Таким образом, до этапа переноса эмбрионов в полость матки не дошло 19 (20,6%) женщин, то есть каждая пятая. По данным И.В.Тетериной и соавт. (2013) [34], распространенность 95 «бедного» ответа на стимуляцию суперовуляции весьма высока и колеблется от 9% до 24%. Определение уровня прогестерона во II фазу менструального цикла (22-24 день) показало, что уровень прогестерона в целом был низким, составив в среднем 10,3±4,6 нмоль\л. Более чем у каждой второй (53,3%) диагностирован ановуляторный менструальный цикл, НЛФ-синдром – у каждой третьей (33,7%), а полноценная II фаза имела место лишь у каждой седьмой-восьмой (13,0%). По данным Е.М.Галлямовой и соавт. (2014) [10], частота НЛФ-синдрома в естественных циклах достигает 8,1%. У всех инфертильных женщин было проведено определение АМГФ в менструальной крови. В целом, средний уровень АМГФ в изучаемых группах был достоверно ниже по сравнению с нормативными показателями (при двухфазном менструальном цикле АМГФ - 16 000-70 000 нг/мл) и составил в I группе - 4026,5±2801,2 нг/мл, а во Статистически значимых различий II между - 3868,9±3372,9 нг/мл. группами не выявлено. Овуляторный менструальный цикл имел место у каждой седьмой-восьмой обследованной, достоверных различий между группами не выявлено. Ановуляция (АМГФ менее 2000 нг/мл) диагностирована у каждой третьей пациентки с трубно-перитонеальным бесплодием, достоверных различий между группами не выявлено. Более чем у каждой второй, несмотря на овуляцию, II фаза менструального цикла была неполноценной (АМГФ 200012000 нг/мл), статистически значимых межгрупповых различий не выявлено. Сопоставление уровня прогестерона во II фазу менструального цикла и уровня АМГФ показало, что продукция АМГФ зависит от уровня прогестерона. Очевидно, выраженный дефицит продукции АМГФ, свидетельствующий о дисфункции эндометриальных желез, может являться одним из патогенетических механизмов имплантационных неудач в рамках программы ЭКО. N.C. Douglas et al. (2013) [58] считают, что АМГФ предсказывает вероятность имплантации эмбриона у реципиенток донорских яйцеклеток при ЭКО: АМГФ был выше у реципиенток, достигших 96 беременности. R.E. Leach et al. (2012) [73] установили, что у бесплодных пациенток имеет место преждевременное увеличение АМГФ в эндометрии в середине секреторной фазы менструального цикла, что, по мнению авторов, свидетельствует о раннем закрытии «окна имплантации». Определение мелатонина сульфата в моче у пациенток позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием показало, что: - у всех обследованных имело место снижение уровня мелатонина сульфата в моче; - у всех инфертильных женщин не было выявлено физиологического 5-10 кратного увеличения ночной концентрации мелатонина по сравнению с дневным его уровнем. Уровень концентрации в ночное время превышал дневные показатели лишь в 2,5 раза. Пик уровня мелатонина смещался на 3-6 часов (вместо 2 - 4 часов в популяции). Нами предпринята попытка оценить эффективность применения мелатонина у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием позднего репродуктивного возраста. В связи с выявлением нарушения секреции мелатонина пациенткам был предложен прием препарата экзогенного мелатонина на этапе прегравидарной подготовки к программе ЭКО в дозе 3 мг в день, за 30 минут до сна, в течение 4 месяцев. Через 4 месяца прегравидарного приема мелатонина была повторно проведена оценка гормонального гомеостаза. Не было выявлено статистически значимой разницы в уровне таких гормонов как АМГ, ФСГ, ЛГ, пролактин, эстрадиол в зависимости от приема экзогенного мелатонина. Лишь прослеживалась тенденция к снижению уровня пролактина, ФСГ и АМГ на фоне приема мелатонина, однако статистически значимых различий не выявлено. Определение уровня прогестерона во II фазу менструального цикла (22-24 день) показало, что уровень прогестерона пациенток, принимавших мелатонин, достоверно возрастал при сравнении с женщинами, не принимавшими его: с 10,6±4,4 нмоль\л до 16,7±4,8 нмоль\л. 97 Внутригрупповое сопоставление уровня прогестерона до и после проводимой терапии мелатонином показало, что на фоне достоверно значимого возрастания прогестерона в сыворотке крови происходило статистически значимое увеличение полноценных двухфазных менструальных циклов с 13,8% до 29,3%, то есть более чем в 2,1 раза. Практически не изменилось число женщин с НЛФ-синдромом, но снизилось количество ановуляторных менструальных циклов с 53,4% до 41,4% - в 1,3 раза, однако статистически значимых различий не выявлено. Полученные нами данные перекликаются с данными C.C. Maganhin et al. (2013) [79], показавших, что в яичниках крыс через 2 месяца после пиниелоэктомии значительно увеличивалось число антральных и преантральных фолликулов, однако желтых тел выявлено не было. Кроме того, отмечалось соединительнотканной увеличение оболочки толщины фолликула) на теки фоне (наружной уменьшения количества рецепторов к прогестерону. Определение АМГФ в менструальной крови на фоне проводимой терапии показало, что уровень АМГФ после терапии мелатонином достоверно увеличился с 4026,5±2801,2 нг/мл до 8387,9±4986,9 нг/мл - в 2,1 раза. Увеличение АМГФ напрямую коррелировало с увеличением прогестерона во II фазу менструального цикла на фоне терапии мелатонином и подтвердило известный факт, что АМГФ является прогестеронзависимым эндометриальным белком. Изучение содержания мелатонина сульфата в моче после проводимой терапии мелатонином показало, что его концентрация достоверно возрастала как в дневное, так и ночное время суток. Так, среднесуточная концентрация мелатонина сульфат достоверно возросла в 2,3 раза, составив в среднем 61,9±43,0 нг/мл. Дневной уровень мелатонина достоверно возрос с 13,3±7,4 нг/мл до 29,4±9,9 нг/мл, то есть в 2,2 раза. Ночной уровень мелатонина сульфат достоверно вырос с 38,9±21,1 нг/мл до 94,6±37,3 нг/мл, то есть в 2,4 раза. 98 Более детальная оценка суточного ритма секреции мелатонина сульфата обследованных показала, статистически значимому что, проводимая терапия привела к увеличению мелатонина во все анализируемые интервалы. Так, начиная с 21 часа, наблюдалось постепенное увеличение уровня мелатонина сульфата в моче с пиковой концентрацией в 24-3 часа. Обращает на себя внимание, что высокий уровень мелатонина в моче имел место до 6 утра, с последующим постепенным его снижением. Низкое плато уровня мелатонина сульфата в моче регистрировалось в интервале 15-21 час. После терапии мелатонином нормализовался ритм его выброса. Так, пиковый уровень мелатонина приходился на физиологический временной интервал 2-4 часа. Кроме того, разница между дневным и ночным уровнями мелатонина увеличилась - ночной уровень мелатонина превышал дневной в 4 раза. Однако, достичь 5-10 кратной разницы между ночным и дневным показателями, то есть приблизиться к физиологическим показателям, несмотря на экзогенный прием мелатонина, не удалось. Стимуляция суперовуляции проводилась гонадотропными препаратами (пурегон, гонал-ф) по «короткому» протоколу. Анализ показателей фолликулогенеза и раннего эмбриогенеза показал, что количество аспирированных фолликулов достоверно отличалось между группами. Так, у пациенток, получавших прегравидарно мелатонин, среднее число аспирированных фолликулов было достоверно больше и составило 4,8±1,1, для сравнения у пациенток, не получавших мелатонин, - 3,1±1,2. У одной пациентки (1,7%) I группы, несмотря на проведение стимуляции суперовуляции в рамках программы ЭКО, не было получено ни одного фолликула. В нашем исследовании у пациенток, принимавших мелатонин, получено достоверно большее число зрелых ооцитов - 2,9±1,1, в то время как во II группе - 2,2±1,3. Не было выявлено статистически значимых различий в количестве полученных эмбрионов и бластоцист, однако прослеживалась тенденция к увеличению их числа у женщин, получавших в течение 4 99 месяцев мелатонин (в I группе - 2,1 ±1,1, во II группе - 1,8±0,9). T.Nishihara et al. (2014) [87] отмечают, что экзогенный прием мелатонина в течение не менее 2 недель не приводил к созревания увеличению фолликулов, скорости существенным различиям в частоте количестве оплодотворения бластоцист, и но способствовал достоверному увеличению эмбрионов хорошего качества (48,0 против 65,6%). По мнению авторов, это происходило за счет снижения окислительного повреждения. Нами не проводился селективный перенос в полость матки одного эмбриона или не более двух эмбрионов. Учитывая «бедный» ответ яичников на индукторы овуляции в обеих группах, в полость матки осуществлялся перенос всех качественных эмбрионов: в I группе - 1,4±0,8, во II группе 1,1±0,9. Не было выявлено статистически значимых межгрупповых различий по числу перенесенных в полость матки эмбрионов. Перенос эмбрионов в полость матки был осуществлен у 73 (79,3%) пациенток. В подавляющем большинстве (83,5%) проводился перенос эмбрионов в полость матки на третий день культивирования, когда эмбрионы достигали стадии 8 бластомеров, поскольку не было уверенности и гарантий их дальнейшего развития. С данным положением согласны практически все репродуктологи: у женщин с низким показателем овариального резерва безопаснее переносить эмбрионы на третий день культивирования [27], кроме того, частота наступления беременности выше при переносе трехдневных эмбрионов по сравнению с пятидневными (55,4% и 46,7% соответственно) [76]. Оценка частоты наступления беременности в стимулированном цикле показала, что беременность наступила у 25 пациенток (26,9%). У женщин, получавших мелатонин, прослеживалась тенденция к увеличению частоты наступления беременности - в 1,3 раза выше, при сравнению с обследованными, не принимавшими данный препарат (29,3% против 23,5% соответственно). Однако статистически значимых различий не выявлено. Дальнейшая оценка течения данной беременности показала, что каждая 100 вторая (50%) беременность в группе женщин, не принимавших мелатонин, прервалась на ранних сроках гестации. В то же время в группе пациенток, получавших мелатонин, ранние репродуктивные потери диагностированы достоверно реже - у 17,6%, то есть в 2,8 раза меньше. В структуре ранних репродуктивных потерь преобладала достоверно чаще диагностированная неразвивающаяся у пациенток, беременность, не принимавших мелатонин (37,5%). В подавляющем большинстве у женщин, принимавших мелатонин, наступившая беременность в рамках программы ЭКО завершилась родами живым плодом (14 (82,4%). У женщин, не принимавших мелатонин, роды живым плодом имели место лишь у каждой второй (50%) с наступившей беременностью. B.McAvey et al. (2011) [82] пришли к выводу, что в циклах, где получено пять и менее ооцитов метафазы II, было статистически значимое снижение вероятности зачатия и живорождения, по сравнению с циклами, где получено шесть и более зрелых ооцитов. Полученные нами результаты позволяют констатировать, что увеличение количества полученных зрелых яйцеклеток является независимой переменной, связанной с увеличением живорождения. В целом, показано, что прием мелатонина достоверно увеличивает количество аспирированных фолликулов, однако, несмотря на его применение, ответ на стимуляцию гонадотропинами характеризуется сниженной реакцией («бедный»). Мелатонин не влияет на показатели раннего эмбриогенеза – число перенесенных эмбрионов в полость матки не имело статистически значимых различий между группами. Мелатонин не оказывает влияние на частоту наступивших беременностей, но способствует полноценной инвазии трофобласта. Опосредованно через статистически значимое увеличение уровня эндометриального белка АМГФ прогестерона и прогестеронзависимого мелатонин способствует качественной имплантации, что определяет успешный исход наступившей беременности: 101 ранние репродуктивные потери диагностированы достоверно реже - у 17,6%, то есть в 2,8 раза меньше; частота рождений живым плодом - у 82,4%, то есть в 1,65 раза выше. 102 ВЫВОДЫ. 1. Клиническими факторами риска неудачных попыток ЭКО у женщин позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием являются: возраст старше 35 лет; длительность бесплодия свыше 7 лет; отягощенный соматический анамнез – болезни органов пищеварения (44,6%), мочеполовой системы (35,8%); хронический сопутствующие сальпингоофорит гинекологические заболевания - (76,1%), хронический эндометрит (32,6%); оперативные вмешательства в анамнезе длительный выжидательный период после оперативного лечения четырех лет); (82,6%); (свыше артифициальный аборт первой беременности в анамнезе (53,1%). Недоучет этих факторов приводит к неадекватной оценке состояния репродуктивной функции и снижает эффективность программ ЭКО. 2. У всех пациенток позднего репродуктивного периода с трубно- перитонеальным бесплодием снижен уровень мелатонина сульфата в моче на фоне отсутствия физиологического 5-10 кратного увеличения ночной концентрации его по сравнению с дневным уровнем (концентрация в ночное время превышает дневные показатели лишь в 2,5 раза). Пиковый уровень мелатонина смещается на 3-6 часов, вместо физиологических 2 - 4 часов. 3. Прием мелатонина не оказывает влияния на состояние фолликулярного запаса: АМГ и ФСГ достоверно не меняются на фоне его применения. Но мелатонин способствует достоверному увеличению прогестерона и прогестеронзависимого эндометриального белка АМГФ, что приводит к увеличению полноценных двухфазных менструальных циклов с 13,8% до 29,3%, то есть более чем в 2,1 раза; снижению ановуляторных менструальных циклов с 53,4% до 41,4% - в 1,3 раза. 4. Терапия мелатонином способствует приближению «мелатониновой кривой» к физиологическим показателям: нормализуется время пикового выброса мелатонина – в 2-4 часа; увеличивается разница между дневным и ночным уровнями мелатонина - ночной уровень превышает дневной в 4 раза. 103 5. Частота наступления беременности в программах ЭКО у женщин позднего репродуктивного периода не зависит от приема мелатонина и составляет 26,9% на одну попытку, но его дотация достоверно увеличивает количество аспирированных фолликулов. В то же время ответ на стимуляцию гонадотропинами снижен («бедный»); мелатонин не влияет на показатели раннего эмбриогенеза. 6. Прегравидарный прием мелатонина необходимо рекомендовать пациенткам позднего репродуктивного периода с трубно-перитонеальным бесплодием как препарат, способствующий полноценной инвазии трофобласта опосредованно через достоверное увеличение прогестерона и прогестеронзависимого эндометриального белка АМГФ, тем самым повышая качество имплантации. Это определяет успешный исход наступившей беременности: ранние репродуктивные потери диагностируются достоверно реже - у 17,6% против 50% (в 2,8 раза меньше); частота рождений живым плодом достоверно выше - 82,4% против 50% (в 1,65 раза выше). ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ. 1. Всем инфертильным женщинам необходимо определение количества мелатонина в моче. Сниженную экскрецию мелатонина необходимо корригировать. 2. Женщины позднего репродуктивного возраста представляют группу риска по снижению экскреции мелатонина. 3. Прегравидарный прием экзогенного мелатонина на этапе подготовки к программе ЭКО в дозе 3 мг в день, за 30 минут до сна, в течение 4 месяцев увеличивает эффективность живорождений. стимуляций суперовуляций и частоту 104 УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Анисимов В.Н., Виноградова И.А. Старение женской репродуктивной системы и мелатонин. – СПб.: Изд-во «Система». - 2008. 2. Амирова А.А., Назаренко Т.А., Мишиева Н.Г. Факторы, влияющие на исходы ЭКО (обзор литературы) // Проблемы репродукции. – 2010. - №1. – С.68—74. 3. Архангельский В.Н. Рождаемость и репродуктивное поведение в современной России, их детерминация // Материалы Всемирного конгресса "Внутриутробный ребенок и общество. Роль пренатальной психологии в акушерстве, неонатологии, психотерапии, психологии и социологии". – М., 2007. – с.30-32. 4. Арушанян Э.Б. Хронофармакология на рубеже веков. // Ставрополь: Изд-во СтГМА. - 2005. - 575с. 5. Базина М.И., Сыромятникова С.А., Егорова А.Т. и др. Прегестационная иммуноморфологическая оценка эндометрия и обоснование терапии у женщин с нарушением репродуктивной функции // Акуш. и гинек. – 2013. – №10. – С.46-50. 6. Болтовская М.Н., Назимова С.В., Старосветская Н.А. и др. Экспрессия белков – маркеров функциональной активности эндометрия при нормальной и неразвивающейся беременности // Вестник РУДН. Серия «Медицина». Акушерство и гинекология. – 2009. - №7. – С.70-75. 7. Боярский К.Ю., Гайдуков С.Н. Молекулярные основы фолликулогенеза: от стадии больших антральных фолликулов до овуляции // Проблемы репродукции. – 2010. – Том 16, №5. – С.13-23. 8. Вартанян Э.В. Преодоление повторных неудач ВРТ: Автореф. дис. … док. мед. наук. – М., 2012. – 34с. 9. Владимирова И.В., Калинина Е.А., Донников А.Е. Молекулярно- генетические маркеры как прогностические факторы овариального ответа в программах вспомогательных репродуктивных технологий // Акуш. и гинек. – 2014. – №3. – С.16-20. 105 10. Галлямова Е.М., Перминова С.Г., Дуринян Э.Р. и др. Современные подходы к ведению лютеиновой фазы в программе экстракорпорального оплодотворения // Акуш. и гинек. – 2014. – №1. – С.15-22. 11. Готт М.Ю. Эффективность предгравидарной подготовки пациенток, перенесших внематочную беременность // Вестник РУДН. Серия Медицина. Акушерство и гинекология. – 2013. - №5.- С.109 -113. 12. Дикке Г.Б., Ерофеева Л.В. Особенности репродуктивного поведения молодежи // Акуш. и гинек. – 2013. – №12. – С.96-101. 13. Дубинская Е.Д. Тазовые перитонеальные спайки (этиология, патогенез, диагностика, профилактика) : Автореф. дис.... док. мед. наук. - М. – 2012.С.35. 14. Духин А.О., воспалительные Любешкина заболевания В.А., органов Тараскина малого Е.В. таза: Хронические контраверсии сегодняшнего дня // Вестник РУДН. Серия Медицина. Акушерство и гинекология. – 2013. - №5.- С.201 -209. 15. Иванова А.Р. Медико-психологические особенности женщин во время лечения бесплодия: Автореф. дис.... канд. мед. наук. - М. – 2010.- С.24. 16. Квициани К.Д. Комплексная оценка состояния маточных труб у женщин с трубно-перитонеальным бесплодием: Автореф. дис.... канд. мед. наук.- М. – 2010.- С.19. 17. Костин И.Н. Резервы снижения репродуктивных потерь в Российской Федерации: Автореф. дисс…докт.мед.наук. – Москва. – 2012. – 48 с. 18. Керкешко Г.О., Степанов М.Г., Кореневский A.B. и др. Влияние мелатонина на гипоталамическую регуляцию репродуктивной функции крыс при хроническом воздействии ксенобиотиков / Нейрохимия. - 2001. - Т. 18, № 1. - С. 67-74. 19. Корсак В.С. ВРТ в России. Отчет за 2008 год. // Проблемы репродукции. – 2011. - Том 16, №6. – С.15-16. 106 20. Курило Л.Ф., Михалева Л.В., Адамян А.Г. и др. Количественный анализ состава фолликулов яичника при эндометриозе. // Проблемы репродукции. – 2006. - Т.12, №3. – С.53-59. 21. Леваков С.А., Кедрова А.Г., Челнокова Н.Н. Фармакотерапия неосложненных воспалительных заболеваний органов малого таза // Акуш. и гинек. – 2013. - №9. – С.79-83. 22. Манюхина И.А. Органосохраняющие операции при острых гнойных воспалительных заболеваниях придатков матки: Автореф. дис.... канд. мед. наук.- М. – 2011.- С.21. 23. Милованов А.П., Кириченко А.К. Морфологическая характеристика второй волны цитотрофобластической инвазии // Архив патологии.– 2010. №1. – С.3-6. 24. Митюрина Е.В., Перминова С.Г., Демура Т.А. и др. Рецептивность эндометрия в программе экстракорпорального оплодотворения // Акуш. и гинек. – 2014. - №2. – С.14-20. 25. Мишиева Н.Г. Бесплодие у женщин позднего репродуктивного возраста: принципы диагностики и лечения в зависимости от овариального резерва: Автореф. дис….док.мед.наук. - Москва, 2008. – 46с. 26. Мусаева М.Г.К. Оптимизация подготовки пациенток с бесплодием при неудавшихся попытках вспомогательных репродуктивных технологий: Автореф. дис.... канд. мед. наук.- М. – 2009.- С.21. 27. Назаренко Т.А., Краснопольская К.В. «Бедный ответ». Тактика ведения пациенток со сниженной реакцией на стимуляцию гонадотропинами в программах ЭКО // М.: МЕДпресс-информ, 2012. – 80с. 28. Опарин И.С. Репродуктивное здоровье женщин после хирургического лечения распространенных форм наружного генитального эндометриоза: Автореф. дис.... канд. мед. наук.- М. – 2013.- С.20. 29. Радзинский В.Е., Садекова О.Н., Вознюк Д.А. и др. Транскрипционные и морфологические особенности предимплантационного эндометрия у 107 женщин с привычным невынашиванием беременности // Вестник РУДН. Серия «Медицина». Акушерство и гинекология. – 2010. - №6. – С.9-17. 30. Ранние сроки беременности (2-е изд., испр. и доп.) / Под ред. В.Е.Радзинского, А.А.Оразмурадова. – М.: Status Praesens, 2009. – 480c. 31. Рождаемость и планирование семьи в России: История и перспективы. Сборник статей / Под ред. Троицкой И.А., Авдеева А.А. – М., 2011. – "Демографические исследования", выпуск 18. – 177 с. 32. Семятов С.М. Репродуктивное здоровье девушек-подростков Московского мегаполиса в современных социально-экономических и экологических условиях: Автореф. дис….док.мед.наук. - Москва, 2009. – 54с. 33. Табеева Г.И., Шамилова Н.Н., Жахур Н.А. и др. Преждевременная недостаточность яичников – загадка XXI века // Акуш. и гинек. – 2013. №12. – С.16-21. 34. Тетерина И.В., Ванян Р.Э., Калинина Е.А. и др. «Бедный» овариальный ответ в программах ЭКО // Акуш. и гинек. – 2013. - №9. – С.4-12. 35. Тулупова М.С., Хамошина М.Б., Календжян А.С. и др. Гинекологическая заболеваемость и репродуктивные потери в России в первой декаде XXI века // Вестник РУДН. – 2011. - № 5. – С.280-283. 36. Чернилевский В. Е. Участие биоритмов организма в процессах развития и старении. Гипотеза резонанса [Текст] / В. Е. Чернилевский // Сборник МОИП № 41. Секция геронтологии. — М.: [б.и.]. - 2008. — С. 123 — 139. 37. Читанава Ю.С., Духин А.О., Опарин И.С. Современные представления о спайкообразовании и методах профилактики после хирургических вмешательств на органах малого таза // Вестник РУДН. – 2012. - № 5. – С.525-531. 38. Юренева С.В., Ильина А.М., Сметник В.П. Старение репродуктивной системы женщин: от теории к клинической практике. Часть I. Эндокринные и 108 клинические характеристики стадий репродуктивного старения женщин // Акуш. и гинек. – 2014. - №3. – С.21-27. 39. Фрейк Т. Рождаемость в России и Германии: сходства и различия // Демоскоп Weekly. – 2010. - №421-422. 40. Arendt J. Melatonin: characteristics, concerns and prospects // J. Biol. Rhythms.—2005.—V. 20.—P. 291–303. 41. Aversa S., Pellegrino S., Barberi I. et al. Potential utility of melatonin as an antioxidant during pregnancy and in the perinatal period. // J. Matern. Fetal Neonatal. – 2012. - V.25. - P.207–221. 42. Batıoğlu A.S., Sahin U., Gürlek B. et al. The efficacy of melatonin administration on oocyte quality. // Gynecol Endocrinol. – 2012. - V.28(2). – P.91-93. 43. Bellastella A., De Bellis A., Bellastella G. et al. Opposite Influence of Light and Blindness on Pituitary-Gonadal Function. // Front Endocrinol (Lausanne). – 2014. - V.4. – P.205. 44. Bentin-Ley U., Lindhard A., Ravn V. et al. Glycodelin in endometrial flushing fluid and endometrial biopsies from infertile and fertile women. // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. – 2011. – V.156, №1. – Р.60-66. 45. Bhatti P., Mirick D.K., Davis S. The impact of chronotype on melatonin levels among shift workers. // Occup Environ Med. – 2014. - V.71(3). – P.195200. 46. Braga D.P., Setti A., Figueira R.de C. et al. Seasonal variability in the fertilization rate of women undergoing assisted reproduction treatments. // Gynecol Endocrinol. – 2012. - V.28(7). – P.549-552. 47. Brzezinski A. Melatonin and human reproduction: why the effect is so elusive? // In: Pandi-Perumal SR, Cardinali Melatonin DP, editors. From molecules to therapy. New York: Nova Science Publishers. - 2007. – pp. 219– 225. 48. Burgess H.J. Melatonin: an adjunctive treatment for cardiometabolic disease? //Sleep.- 2012. - V.35(10). – P.1319-1320. 109 49. Cardinali D.P., Pagano E.S., Bernasconi S. et al. Melatonin and mitochondrial dysfunction in the central nervous system.// Horm. Behav. – 2013. doi:10.1016/j.yhbeh.2012.02.020. 50. Chandra A., Copen C.E., Stephen E.H. Infertility service use in the United States: data from the national survey of family growth, 1982-2010 // Natl Health Stat Report. – 2014. - V.73. – P.1-21. 51. Cipolla-Neto J., Amaral F.G., Afeche S.C. et al. Melatonin, energy metabolism, and obesity: a review. // J Pineal Res. – 2014. - doi: 10.1111/jpi.12137 52. Ciortea R., Costin N., Braicu I. et al. Effect of melatonin on intra- abdominal fat in correlation with endometrial proliferation in ovariectomized rats. // Anticancer Res. – 2011. - V.31(8). – P.2637-2643. 53. Chen Y.C., Tain Y.L., Sheen J.M. et al. Melatonin utility in neonates and children. // J. Formos. Med. Assoc. – 2012. - V.111. – P. 57–66. 54. Cheng E.Y., Hunt P.A., Naluai-Cecchini T.A. et al. Meiotic recombination in human oocytes. // PLoS Genet. - 2009. – V.5(9):e1000661. 55. Chuffa L.G., Fábio R.F., Wagner J. et al. Melatonin reduces LH, 17 beta- estradiol and induces differential regulation of sex steroid receptors in reproductive tissues during rat ovulation // Reproductive Biology and Endocrinology. - 2011. – V.9. – P.108. 56. Cruz M.H., Leal C.L., Cruz J.F. et al. Role of melatonin on production and preservation of gametes and embryos: A brief review. // Anim Reprod Sci. – 2014. - Feb 1. pii: S0378-4320(14)00025-6. doi: 10.1016/j.anireprosci.2014.01.011. 57. Dair E.L., Simoes R.S., Simoes M.J. et al. Effects of melatonin on the endometrial morphology and embryo implantation in rats. //Fertility and sterility – 2008. – V.89(5 Suppl):1299-1305. 58. Douglas N.C., Thornton M.H., Nurudeen S.K. et al. Differential expression of serum glycodelin and insulin-like growth factor binding protein 1 in early pregnancy. // Reprod Sci. – 2013. - V.20(11). – P.1376-1381. 110 59. Eryilmaz O.G., Devran A., Sarikaya E. et al. Melatonin improves the oocyte and the embryo in IVF patients with sleep disturbances, but does not improve the sleeping problems. // J Assist Reprod Genet. - 2011. - V.28(9). – P.815-820. 60. Farahavar A., Shahne A. Z., Kohram H. et al. Effect of melatonin on in vitro maturation of bovine oocytes // African Journal of Biotechnology. – 2010. - V. 9 (17). - P.2579-2583. 61. Fernández B.E., Díaz E., Fernández C. et al. Ovarian aging: melatonin regulation of the cytometric and endocrine evolutive pattern. // Curr Aging Sci. – 2013. - V.6(1). – P.1-7. 62. Ficicioglu C., Cenksoy P.O., Yildirim G. et al. Which cut-off value of serum anti-Müllerian hormone level can predict poor ovarian reserve, poor ovarian response to stimulation and in vitro fertilization success? A prospective data analysis. // Gynecol Endocrinol. – 2014. - Feb 28. [Epub ahead of print] 63. Graham L.H., Swanson W.F., Wildt D.E. et al. Influence of oral melatonin on natural and gonadotropin-induced ovarian function in the domestic cat // Theriogenology. - 2004. - V. 61(6). - P. 1061-1076. 64. Gearhart J., Coutifaris C. In vitro fertilization, the Nobel Prize, and human embryonic stem cells. // Cell Stem Cell. – 2011. - Elsevier Inc. 8. – P.12-15. 65. Gitto E., Aversa S., Reiter R.J. et al. Update on the use of melatonin in pediatrics. // J. Pineal Res. - 2011. – V. 50. – P. 21–28. 66. Hassold T., Hunt P. Maternal age and chromosomally abnormal pregnancies: what we know and what we wish we knew. // Curr Opin Pediatr. – 2009. – V.21(6). – P.703-708. 67. Holness N. A global perspective on adolescent pregnancy. // Int J Nurs Pract. – 2014. - Mar 26. doi: 10.1111/ijn.12278. 68. Juneau C., Bates G.W. Reproductive outcomes after medical and surgical management of ectopic pregnancy. // Clin Obstet Gynecol. – 2012. – V.55(2). – P.455-460. 69. Kalra S.K., Ratcliffe S.J., Dokras A. Is the fertile window extended in women with polycystic ovary syndrome? Utilizing the Society for Assisted 111 Reproductive Technology registry to assess the impact of reproductive aging on live-birth rate. // Fertil Steril. – 2013. - V.100(1). – P.208-213. 70. Kasum M., Radakovic B., Simunic V. et al. Preovulatory progesterone rise during ovarian stimulation for IVF. // Gynecol Endocrinol. – 2013. – V.29(8). – P.744-748. 71. Khoufache K., Michaud N., Harir N. et al. Anomalies in the inflammatory response in endometriosis and possible consequences: a review. // Minerva Endocrinol. – 2012. - V.37 (1). – P.75-92. 72. Kim M.K., Park E.A., Kim H.J. et al. Does supplementation of in-vitro culture medium with melatonin improve IVF outcome in PCOS? // Reprod Biomed Online. – 2013. - V.26 (1). – P.22-29. 73. Leach R.E., Jessmon P., Coutifaris C. et al. High throughput, cell type- specific analysis of key proteins in human endometrial biopsies of women from fertile and infertile couples. // Hum Reprod. - 2012. – V.27, №3. – Р.814-828. 74. Lemos N., Arbo E., Scalco R. et al. Decreased AMH and altered ovarian follicular cohort in infertile patients with mild/minimal endometriosis. // Fertility and Sterility. - 2008. - V. 89. – P.1064-1068. 75. Lewin A., Mitchell S.J., Hodgkinson S. et al. Pregnancy Intentions among Expectant Adolescent Couples. // J Pediatr Adolesc Gynecol. – 2014. - pii: S10833188(13)00298-2. doi: 10.1016/j.jpag.2013.09.012. 76. Li R.R., Dong Y.Z., Guo Y.H. et al. Comparative study of pregnancy outcomes between day 3 embryo transfer and day 5 blastocyst transfer in patients with progesterone elevation. // J Int Med Res. – 2013. – V.41 (4). – P.1318-1325. 77. Lochner A., Huisamen B., Nduhirabandi F. Cardioprotective effect of melatonin against ischaemia/reperfusion damage. //Front Biosci (Elite Ed). – 2013. - V.5. – P.305-315. 78. Lord T., Nixon B., Jones K.T. et al. Melatonin prevents postovulatory oocyte aging in the mouse and extends the window for optimal fertilization in vitro. // Biol Reprod. - 2013. – V.88 (3). – P.67. 112 79. Maganhin C.C., Fuchs L.F., Simões R.S. et al. Effects of melatonin on ovarian follicles. // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. - 2013. – V.166 (2). – P.178-184. 80. Manca M.E., Manunta M.L., Spezzigu A. et al. Melatonin deprival modifies follicle and corpora lutea growth dynamics in a sheep model // Reproduction. - 2014 Feb 25. [Epub ahead of print] 81. Mattam U., Jagota A. Differential role of melatonin in restoration of age- induced alterations in daily rhythms of expression of various clock genes in suprachiasmatic nucleus of male Wistar rats. // Biogerontology. - 2014 Mar 12. [Epub ahead of print]. 82. McAvey B., Zapantis A., Jindal S.K. et al. How many eggs are needed to produce an assisted reproductive technology baby: is more always better? // Fertil Steril. – 2011. - V.96 (2). – P.332-335. 83. Mol F., van Mello N.M., Strandell A. et al. Salpingotomy versus salpingectomy in women with tubal pregnancy (ESEP study): an open-label, multicentre, randomised controlled trial. // Lancet. – 2014. - Jan 31. pii: S01406736(14)60123-9. doi: 10.1016/S0140-6736(14)60123-9. 84. Mosalanejad L., Parandavar N., Abdollahifard S. Barriers to infertility treatment: an integrated study. // Glob J Health Sci. – 2013. - V.6 (1). – P.181191. 85. Mirick D.K., Davis S. Melatonin as a biomarker of circadian dysregulation. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. – 2008. - V.17. – P. 3306–3313. 86. Mohammadghasemi F., Jahromi S.K., Hajizadeh H. et al. The Protective Effects of Exogenous Melatonin on Nicotine-induced Changes in Mouse Ovarian Follicles. // J Reprod Infertil. – 2012. - V.13 (3). – P.143-150. 87. Nishihara T., Hashimoto S., Ito K. et al. Oral melatonin supplementation improves oocyte and embryo quality in women undergoing in vitro fertilizationembryo transfer. // Gynecol Endocrinol. – 2014. - Mar 17. [Epub ahead of print]. 88. Ombelet W. Is global access to infertility care realistic? The Walking Egg Project. // Reprod Biomed Online. – 2014. – V.28(3). – P.267-272. 113 89. Polyzos N.P., Nwoye M., Corona R. et al. Live birth rates in Bologna poor responders treated with ovarian stimulation for IVF/ICSI. // Reprod Biomed Online. - 2013. - Dec 4. pii: S1472-6483(13)00626-3. doi: 10.1016/j.rbmo.2013.11.010. 90. Radogna F., Diederich M., Ghibelli L. Melatonin: A pleiotropic molecule regulating inflammation. // Biochem. Pharmacol. – 2010. - V.80, P.1844–1852. 91. Rangel P.L., Gutierrez C.G. Reproduction in hens: Is testosterone necessary for the ovulatory process? // Gen Comp Endocrinol. - 2014. - pii: S0016- 6480(14)00114-2. doi: 10.1016/j.ygcen.2014.03.040. 92. Reiter R.J., Tan D.X., Tamura H. et al. Clinical relevance of melatonin in ovarian and placental physiology: a review. // Gynecol Endocrinol. – 2014. V.30(2). – P.83-9. 93. Reiter R.J., Tan D.X., Korkmaz A. et al. Melatonin and stable circadian rhythms optimize maternal, placental and fetal physiology. // Hum Reprod Update. – 2014. - V.20(2). – P.293-307. 94. Romeu L.R.G., Motta E.L.A., Maganhin C.C. et al. Effects of melatonin on histomorphology and on the expression of steroid receptors, VEGF, and PCNA in ovaries of pinealectomized female rats. // Fertil Steril. – 2011. - V.95. – P.13791384. 95. Ried K., Alfred A. Quality of life, coping strategies and support needs of women seeking Traditional Chinese Medicine for infertility and viable pregnancy in Australia: a mixed methods approach. // BMC Womens Health. – 2013. - V.13, №1. – Р.17. 96. Shi L., Li N., Bo L. et al. Melatonin and hypothalamic-pituitary-gonadal axis. // Curr Med Chem. – 2013. – V.20(15). – P.2017-2031. 97. Sibert L. Lacarrière E., Safsaf A. et al. Aging of the human testis // Presse Med. – 2014. – V.43(2). – P.171-177. 98. Seko L.M., Moroni R.M., Leitao V.M. et al. Melatonin supplementation during controlled ovarian stimulation for women undergoing assisted reproductive 114 technology: systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. // Fertil Steril. – 2014. – V.101(1). – P.154-161. 99. Showell M.G., Brown J., Clarke J. et al. Antioxidants for female subfertility. // Cochrane Database Syst Rev. – 2013. - Aug 5;8:CD007807. doi: 10.1002/14651858.CD007807.pub2. 100. So K.H., Lee C.L., Yeung W.S. et al. Glycodelin suppresses endometrial cell migration and invasion but stimulates spheroid attachment. // Reprod Biomed Online. – 2012. - V.24, №6. – Р.639-645. 101. Song Y., Shen L.C., Huang W. et al. Diagnostic value of endometrial thickness determined by transvaginal sonography in infertile women with endometrial polyps. // Chin Med J (Engl). - 2012. - V.125(13). – P.2279-2283. 102. Szafarowska М., Jerzak М. Ovarian aging and infertility // Ginekol Pol. 2013. – V.84 (4). – P.298-304. 103. Tamura H., Takasaki A., Miwa I. et al. Oxidative stress impairs oocyte quality and melatonin protects oocytes from free radical damage and improves fertilization rate. // J Pineal Res. - 2008. – V.44. – P.280–287. 104. Tamura H., Takasaki A., Taketani T. Melatonin as a free radical scavenger in the ovarian follicle. // Endocr J. - 2013. - V.60(1). – P.1-13. 105. Tamura H., Takasaki A., Taketani T. et al. Melatonin and female reproduction. // J Obstet Gynaecol Res. - 2014. - V.40(1). – P.1-11. 106. Toffol E., Kalleinen N., Haukka J. et al. Melatonin in perimenopausal and postmenopausal women: associations with mood, sleep, climacteric symptoms, and quality of life. // Menopause. – 2013. - Sep 23. [Epub ahead of print] 107. Török P., Major T. New methods for the ambulatory evaluation of female infertility. //Orv Hetil. – 2013. - V.154(33). – P.1287-1290. 108. Tu C.H., Yang X.L., Qin X.Y. et al. Management of intrauterine adhesions: a novel intrauterine device. // Med Hypotheses. - 2013. - V.81 (3). – P.394-396. 115 109. Wang Y.A., Farquhar C., Sullivan E.A. Donor age is a major determinant of success of oocyte donation/recipient programme. // Hum Reprod. – 2012. V.27(1). – P.118-125. 110. Wang F., Tian X., Zhang L. et al. Melatonin promotes the in vitro development of pronuclear embryos and increases the efficiency of blastocyst implantation in murine. //J Pineal Res. – 2013. - V.55(3). – P.267-274. 111. Wise P.M., Gerhold L.M., Cashion A.B. Neuroendocrine modulation of menopause: evolution of our thinking // Hormones, Age and Cancer / Berstein L.M. (Ed).—St.Petersburg: Nauka. - 2005.—P. 94–111. 112. World Health Organization WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. Fifth edition - 2010. – 271с.
