Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства

Государственное научное учреждение
Всероссийский научно-исследовательский и технологический
институт птицеводства
Российской академии сельскохозяйственных наук
(ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии)
На правах рукописи
КОРШУНОВА ЛЮДМИЛА ГЕОРГИЕВНА
Трансгенез и экспрессия генов
у сельскохозяйственной птицы
06.02.07 – разведение, селекция и генетика
сельскохозяйственных животных
Диссертация на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Научный консультант:
доктор сельскохозяйственных наук,
профессор,
академик Россельхозакадемии
Фисинин В.И.
Сергиев Посад
2012
2
СОДЕРЖАНИЕ
Введение .................................................................................................................. 4
1. Обзор литературы ........................................................................................... 11
1.1. Современное состояние и перспективы использования
трансгенеза в птицеводстве ..................................................................... 14
1.2. Экспрессия вителлогенинового гена и биосинтез вителлогенина в
печени кур.................................................................................................. 44
1.3. Роль митохондрий в становлении вителлогенной функции печени
у кур............................................................................................................ 72
2. Материал и методы исследований .............................................................. 94
2.1. Методы получения и исследования трансгенных перепелов............... 94
2.2. Методы исследования эстрогениндуцированного вителлогенеза и
биогенеза рибосом печени цыплят.......................................................... 97
2.3. Методы исследования роли митохондрий печени в становлении
ее вителлогенной функции..................................................................... 100
3. Результаты исследований ........................................................................... 103
3.1. Получение и изучение трансгенных перепелов с геном гормона
роста быка ................................................................................................ 103
3.2. Изучение эстрогениндуцированного вителлогенеза и биогенеза
рибосом печени цыплят.......................................................................... 132
3.3. Изучение роли митохондрий в вителлогенезе печени ........................ 156
4. Обсуждение результатов.............................................................................. 165
4.1. Получение трансгенных перепелов, экспрессия и наследование
гена гормона роста быка ........................................................................ 165
4.2. Экспрессия вителлогенинового гена и биогенез рибосом печени
цыплят ...................................................................................................... 186
4.3. Роль митохондрий в вителлогенезе печени кур .................................. 203
3
5. Выводы............................................................................................................ 210
6. Сведения о практическом использовании результатов
исследований.................................................................................................. 213
7. Рекомендации по использованию научных выводов ............................ 214
Список литературы .......................................................................................... 215
П р и л о ж е н и я ................................................................................................... 284
4
Введение
Актуальность темы. Современная селекция в птицеводстве базируется на отборе лучшего поголовья из высокопродуктивных семей и семейств и
требует длительного времени. Одним из нетрадиционных подходов к генетическому улучшению птицы может стать трансгенез – внедрение в их геном
инородных генов. Несмотря на методические трудности, работы по созданию
трансгенной птицы как актуального направления в отрасли активно ведутся
во многих странах, поскольку перспективны с точки зрения экономической
выгоды, возможностью достижения эффекта селекции в короткие сроки.
Трансгенез расширяет возможности получения животных с измененными
признаками, многие из которых могут быть использованы в селекции, при
этом отпадает необходимость длительных обратных скрещиваний для удаления из популяции «ненужных» генов, неизбежно передаваемых при обычной
гибридизации. Очевидно, что методами трансгенеза могут быть введены в
популяцию совершенно новые фенотипические признаки, кодируемые генами других видов и родов животных.
Дальнейшее развитие селекции и генетики сельскохозяйственной птицы
предполагает разработку новых методов и приемов оценки генома, основанных на знаниях механизмов организации и функционирования живых организмов, в частности, механизмов яйцеобразования у кур. Процесс яйцеобразования связан со значительным усилением биосинтетических процессов в печени, где происходит синтез большинства желточных белков. Белки желтка в
основном происходят из вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), синтез которых начинается в печени кур по достижении ими
репродуктивного возраста. С наступлением яйценоскости печень курицы приобретает новую вителлогенную функцию без утраты предшествующих. Такая
дифференцировка уже специализированной ткани находится под контролем
эстрогенов. Синтез вителлогенина и ЛОНП может быть вызван у цыплят введением им эстрадиола. Этот феномен позволяет изучать гормониндуцирован-
5
ную экспрессию «молчащих» генов, то есть последовательность процессов,
приводящих к синтезу определенного белкового продукта, не синтезируемого
ранее, а также определенные этапы этих процессов. Реализация генетической
информации во многом зависит от рибосом, содержание которых определяет
интенсивность белкового синтеза.
Активизация биосинтеза в печени связана с дополнительными энергозатратами, что предполагает значительное увеличение энергетической нагрузки на митохондрион печени, обеспечивающий производство необходимого
количества макроэргических соединений для анаболических процессов. Наличие в митохондриях собственного генетического материала обуславливает
свои особенности во взаимодействии ядерного и митохондриального геномов
в процессе развития и специализации органов и тканей.
Новые знания о сопряженности экспрессии вителлогенинового гена с
биогенезом рибосом, митохондриальной энергетикой клеток печени и их использование будут способствовать максимальной реализации продуктивного
потенциала у кур.
Цель и задачи исследований. Основной целью настоящей работы было изучение воздействия интегрированной генной конструкции, с геном гормона роста быка на биологические и продуктивные признаки генетически
модифицированных перепелов, а также изучение гормональной экспрессии
генов в печени цыплят.
В связи с указанным были поставлены следующие задачи:
– получить трансгенных перепелов с встроенным геном гормона роста
быка;
– провести оценку экспрессии трансгена, биологических и продуктивных показателей трансгенных перепелов в ряду поколений: динамика роста и
иммунный статус перепелов, гормональный статус крови, масса перепелиных
яиц, их биохимический состав и морфологические показатели, яйценоскость;
– изучить экспрессию генов на модели гормониндуцированного вителлогенеза у цыплят: синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой
6
плотности, биохимические показатели крови и печени, биогенез рибосом после однократного и повторного введения цыплятам 17-β-эстрадиола и в зависимости от его дозы;
– определить влияние гормональной экспрессии генов, вызванной 17-βэстрадиолом, на биогенез и биоэнергетические параметры митохондрий печени цыплят.
Научная новизна работы. Впервые проведена оценка экспрессии
трансгена, генетический и фенотипический анализ трансгенных по гену гормона роста быка перепелов, полученных методом микроинъекции экзогенной
ДНК в зародышевые диски яйцеклеток, и их потомков в ряду поколений.
Впервые на примере трансгенных перепелов по гену гормона роста быка показана возможность существенного улучшения продуктивности птицы
методами трансгенеза.
Впервые изучена сопряженность эстрогениндуцированной экспрессии
вителлогенинового гена, выраженной в усилении синтетических процессов в
печени и увеличении содержания вителлогенина, ЛОНП и триглицеридов в
плазме крови с синтезом РНК и биогенезом рибосом в печени цыплят.
Выявлено, что синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой
плотности в печени эстрогенизированных цыплят имеют разные динамики,
то есть относительно независимую регуляцию экспрессии соответствующих
генов.
Обосновано, что необходимым условием для становления вителлогенной функции печени является синтез мРНК в первые часы после введения 17β-эстрадиола цыплятам. Биогенез рибосом определяет количественные характеристики ответа печени на гормон. Увеличение числа рибосом в печени
после повторного введения эстрадиола цыплятам больше, чем после однократного.
Получены новые данные о том, что различия функционального состояния митохондрий печени кур-несушек и цыплят нивелируются в ходе эстрогениндуцированного вителлогенеза: в митохондриях печени цыплят проис-
7
ходят изменения параметров сопряжения и активного транспорта ионов
кальция, которые приближаются к таковым в митохондриях печени курнесушек.
Практическая ценность работы. Перепела опытной группы, потомки
трансгенных по гену гормона роста быка, в ряду поколений сохранили превосходство по живой массе на 5–15% и массе яиц на 10–20% по сравнению с
обычными, что свидетельствует о возможном практическом использовании
трансгенеза в селекционной работе, направленной на повышение продуктивных показателей птицы в короткие сроки. Производственная проверка подтвердила результаты исследований. Разница по массе яиц перепелок трансгенного происхождения и эстонской породы составила 18,7%.
Материалы исследований легли в основу разработанного способа отбора перепелок по массе яиц (Патент РФ № 2402209). Результаты еженедельных взвешиваний яиц перепелок, отличающихся по средним показателям, с
7- до 50- недельного возраста позволили определить целесообразный возраст
проведения оценки перепелок по этому признаку (11-12 недель). Именно в
этом возрасте масса яйца соответствует средним показателям за весь период
яйценоскости.
Выявленные у цыплят различия в динамике индукции синтеза вителлогенина и ЛОНП в ответ на введение 17-β-эстрадиола являются обоснованием
возможности раздельной селекции кур по этим признакам.
Линейная зависимость содержания фосфопротеидного фосфора и общего кальция в крови эстрогенизированных цыплят позволяет использовать
каждый из них для ранней оценки яичной продуктивности кур. Использование в качестве показателя общего кальция из соображений методического
характера является предпочтительным.
На основании изученных параметров окислительного фосфорилирования и цитохромоксидазной активности митохондрий печени получено экспериментальное подтверждение оптимальным нормам кормления, режимам
выращивания и содержания птицы (Фисинин В.И., Коршунова Л.Г., 1988;
8
Байковская И.П., Коршунова Л.Г., 1989), Методическое руководство для зоотехнических лабораторий (1998).
Основные положения, выносимые на защиту. В результате выполненных исследований и производственной проверки разработаны и выносятся на защиту следующие основные положения:
1. Экспрессии трансгена у перепелов, полученных методом микроинъекции генной конструкции с геном гормона роста быка в зародышевые диски
яйцеклеток, и их потомков в ряду поколений.
2. Рост, продуктивность, гормональный статус крови, иммунный статус
трансгенных по гену гормона роста быка перепелов и их потомков в ряду поколений.
3. Синтез вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности, показатели крови и печени, биогенез рибосом после однократного и повторного
введения цыплятам 17-β-эстрадиола и в зависимости от его дозы.
4. Интеграция гормональной индукции вителлогенной функции печени
цыплят с биогенезом, активностью окислительного фосфорилирования и
функциональной специализацией митохондрий.
Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на Ученых советах ВНИТИП в ежегодных отчетах 1980–2010 г.г.;
на 11 Всесоюзном симпозиуме по биохимии митохондрий, Пущино (1981);
на Всесоюзном симпозиуме по биохимии с.-х. животных, Витебск (1982); на
научно–методической комиссии по селекции и генетике птицеводства Отделения животноводства ВАСХНИЛ (1983); на Всесоюзном биохимическом
съезде, Киев (1986); на Всесоюзном симпозиуме «Биохимия сельскохозяйственных животных и продовольственная программа», Ташкент (1986); на 2
Всесоюзном симпозиуме «Научные основы витаминного питания с.-х. животных», Юрмала (1987); на Всесоюзной научно-технической конференции
«Эффективное использование кормов в птицеводстве», Новосибирск (1990);
на Всесоюзной научной конференции «Использование физических и биологических факторов в ветеринарии и животноводстве», Витебск (1991); на Ук-
9
раинской конференции с международным участием «Актуальные проблемы
современного птицеводства», Харьков (1991); на международном симпозиуме «Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и изменении геномов
с.-х. животных», С.-Петербург, Пушкин (1994); на ежегодных отчетах в отделении зоотехнии и животноводства РАСХН (1995–2005 г.г.); на научных
конференциях «Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве,
животноводстве и ветеринарии», Москва (1996, 2000 гг.); на II Международной выставке «Инновации-99. Технологии живых систем» Всероссийский
выставочный центр, Москва (1999), где был присужден Диплом II степени за
разработку «Получение трансгенной птицы»; на конференции «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России». С.Петербург (2008), на XVI конференции Российского отделения Всемирной
научной ассоциации по птицеводству «Достижения в современном птицеводстве: Исследования и инновации», Сергиев Посад (2009); а также за рубежом
на 10 Европейской конференции по птицеводству, Иерусалим, Израиль
(1998); на 6 Конференции Балтийских стран по птицеводству, Вильнюс, Литва (1998), на 8 конференции стран Балтии по птицеводству, Турку, Финляндия (2000); на 21 Международном конгрессе по птицеводству, Монреаль, Канада (2000).
Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований опубликованы в трудах ВНИТИП, материалах Россельхозакадемии, республиканских и международных научных конференций, научных и
научно-производственных
журналах,
информационной
экспресс-
информации. Всего по теме диссертационной работы опубликовано
56 статей, в том числе 14 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства
образования и науки РФ, методическое руководство для зоотехнических лабораторий «Оценка качества кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы»,
1998, получен патент РФ(2009 г.) на изобретение.
Научные исследования выполнены в соответствии с планом (1980–
2010 гг.) Всесоюзного научно-исследовательского и технологического ин-
10
ститута птицеводства ныне ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии по темам:
«Разработать методы прогнозирования яйценоскости кур с помощью введения в раннем возрасте экзогенных гормонов», № гос. рег. 81090364; «Разработка переносов генов в геном птиц» № гос. рег. 01980008817, «Разработать
новые и усовершенствовать существующие методы получения трансгенной
птицы с заданными признаками», № гос. рег. 01200120268; «Разработать методы получения генетически модифицированной птицы с ценными хозяйственными признаками», № гос. рег. 01200602327.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение; обзор литературы; материал и методика исследований; результаты исследований и их обсуждение; выводы; список литературы; приложения. Материал изложен на 305 страницах машинописного текста, иллюстрирован 44 таблицами и 26 рисунками. Список литературы включает 644 библиографических источника, в том числе 205 отечественных и 439
иностранных авторов. Приложение включает дополнительные таблицы и рисунки, иллюстрирующие результаты исследований; Патент РФ на изобретение №2402209 «Способ отбора перепелок по массе яиц», 2009; Акт производственной проверки, 2009; Удостоверение на рационализаторское предложение, 1981; Методическое руководство, 1998.
Личный вклад соискателя. Автору принадлежит постановка темы
диссертации, ее разработка и решение. Экспериментальная часть работы и
обработка полученных результатов выполнена непосредственно при личном
авторском участии диссертанта, а также совместно с соисполнителями, что
нашло отражение в списке публикаций по теме исследований.
11
1.
Обзор литературы
Мировое и отечественное птицеводство является наиболее динамично
развивающейся отраслью агропромышленного комплекса. За последние 20
лет среднегодовой прирост яиц и мяса птицы в мире превышает 4%. В России производство яиц и мяса птицы возрастает благодаря вводу новых мощностей, повышению продуктивности и сохранности поголовья, уменьшению
расхода кормов на единицу продукции, снижению энергетических и ресурсных затрат, глубокой переработке и расширению ассортимента продукции
[180].
Повышение продуктивности птицы и увеличение валового производства продуктов птицеводства в значительной степени зависят от качества племенной птицы. Племенная работа – это фундамент, обеспечивающий количественный и качественный подъем промышленного птицеводства в стране.
Каждый этап развития птицеводческой отрасли характеризовался конкретными селекционно-генетическими разработками, направленными на их
использование. Так, в период экстенсивного развития отрасли при наличии
большого количества пород и породных групп птицы, имевших невысокий
уровень продуктивности, учеными была доказана эффективность получения
помесной птицы при скрещивании разных пород для повышения продуктивных показателей [89; 114; 145]. В период становления интенсивного развития
птицеводства учеными-селекционерами была обоснована целесообразность
создания промышленных линий [25; 116; 142]. Современное промышленное
птицеводство базируется на основе использования высокопродуктивной гибридной птицы, полученной на основе скрещивания отселекционированных
дифференцированных по отдельным признакам сочетающихся линий всех
видов: куры [13; 27; 48; 85; 166; 168], цесарки [122], индейки [42], утки и гуси
[123].
Селекционная работа всегда была направлена на совершенствование
существующих и создание новых методов и приемов [26; 59]. В 50-е годы
12
прошлого столетия исследователями была показана возможность изменения
некоторых признаков птицы при многократных, в нескольких поколениях,
переливаниях крови и создания «вегетативных гибридов» (гемогибридизация) [18; 31; 41]. Таким методом были созданы ленинградские белые куры –
курам породы леггорн переливали кровь австралорпов [148], цесарки – серокрапчатым цесаркам приливали кровь от петухов московской белой породной группы [40]. Исследователи неоднократно обращались к получению
межвидовых гибридов. Известны межвидовые гибриды: петух × цесарка, курица × перепел, курица × индейка, курица × фазан, курица × павлин и др. В
промышленном птицеводстве используются межвидовые гибриды – муларды, полученные от скрещивания мускусных селезней с утками домашних пород. Муларды обладают высокой скоростью роста и небольшой ожиренностью тушек, способностью к откорму на жирную печень. Следует отметить
невысокий вывод мулардов (30–35%), что явилось сдерживающим фактором
их широкого использования в практике. В большинстве случаев межвидовые
гибриды бесплодны, поэтому большого практического значения не имеют.
Бесплодие гибридов проявляется в виде утраты плодовитости только одним
полом, у птиц бесплодны самки [85; 115; 124]. Разрабатываются методы ортотропной
трансплантации,
которые
позволят
получить
несушек-
реципиентов, фертильных благодаря функциям трасплантанта. Таких кур
можно будет использовать в качестве искусственных производителей донорского потомства [81; 82; 163; 183].
Не всегда научные разработки быстро находят широкое применение на
практике. В этом плане интересен пример использования генов К-к, S-s, описанных А.С. Серебровским еще в 1926 году [133]. И только спустя многие
десятилетия особенность оперяемости цыплят, связанная с наличием этих генов, нашла широкое применение. Большинство современных высокопродуктивных кроссов кур являются аутосексными, что позволяет в суточном возрасте разделить их по полу с точностью до 98–99% по развитию перьев крыла или цвету пуха, а не по половым бугоркам [54; 71; 185; 190]. Сексирование
13
цыплят в суточном возрасте по внешним признакам позволяет значительно
сократить затраты на их сортировку, не требует специальной длительной
подготовки специалистов, не приводит к травмированию молодняка, значительно сокращает ошибки сортировки, обеспечивает значительное повышение продуктивных показателей птицы при ее раздельном по полу выращивании [45; 70]. Многие десятилетия генетикам был известен ген карликовости
(dw), определяющий невысокую массу и укороченную длину ноги птицы,
описанный Ф.Б. Хаттом [184], и только в последние десятилетия в промышленном птицеводстве нашел широкое применение в материнских родительских формах яичных и мясных кур. Живая масса у кур-носителей гена dw невысокая, что обеспечивает снижение затрат корма на производство племенной и промышленной продукции [47; 49; 58]. И еще не менее интересный
пример. Понятие «геногеография» и спектр вопросов входящих в него ввел
А.С. Серебровский в 1928 году, а сегодня это направление получило свое
развитие: проводится анализ распространения генетических маркеров в популяциях крупных регионов, проводится генотипирование ДНК и классических маркеров: однородительских (митохондриальной ДНК, Y-хромосомы),
генетико-биохимических и других систем. Конечной целью таких исследований является сохранение и эффективное использование в селекции того огромного генетического потенциала, который все еще сохраняется у отечественных сельскохозяйственных видов животных [96].
Текущее столетие для птицеводов – это век генетики и селекции. Если
на международных конкурсных испытаниях в 1925 году средняя яйценоскость кур 176 яиц оценивалась как высокая, то на конкурсах в 2002–2005 гг.
поставлялась птица белых и коричневых яичных кроссов с продуктивностью
330–340 яиц в год и выходом 21 кг яичной массы, что в 12 раз больше массы
их тела. Несомненно, что в ближайшие 15–20 лет на смену «классической»
селекции придут инновационные методы генной инженерии. И в этой связи
важно сохранить биологическое разнообразие редких и исчезающих пород
домашней птицы, мировой и отечественный генофонд [179; 181; 202].
14
В эпоху развития промышленного птицеводства резко сократилось количество используемых пород птицы. Специально созданные и отобранные
генотипы являются наиболее рентабельными в данных конкретных условиях.
Но стоит возникнуть новым требованиям рынка, сразу же, появится экономическая необходимость в создании новых пород и линий с новыми свойствами. Необходимо привлечение новых генных ресурсов в генетике птицы.
1.1. Современное состояние и перспективы использования
трансгенеза в птицеводстве
Принципиальные возможности, которыми обладает современная молекулярная генетика, позволяют изменять генотип и фенотип целого организма.
Конечно, человек воздействовал на генотипы растений и животных тысячелетия, с тех пор как он начал заниматься сельским хозяйством. Но новейшая
биология дает мощные и специфические средства воздействия на живые организмы. Поскольку не существует видового барьера для интеграции чужеродных генов, могут быть созданы линии трансгенных особей совершенно
нового типа. В настоящее время намечены несколько направлений создания
трансгенных животных [198; 202]. Самым очевидным и уже реализованном
на практике является использование трансгенных животных в качестве «фабрик» по производству определенных белков для медицинских и промышленных целей. Второе направление – получение промышленных линий с наследственной устойчивостью к конкретным инфекционным заболеваниям [197].
Наиболее сложным представляется повышение путем трансгенеза продуктивных качеств с использованием ростовых и прочих количественных признаков, которые, как правило, имеют полигенную основу [19; 21; 203].
Методы трансгенеза обладают большим потенциалом в приложении к
практическому птицеводству. Использование трансгенеза для переноса полезного гена даже от одной линии птицы к другой (что достижимо и обычными селекционными методами) может дать большую экономию времени и
средств за счет исключения возвратных скрещиваний, необходимых для уда-
15
ления ненужных генов, передающихся при естественной половой гибридизации. Однако истинные выгоды от применения трансгенеза будут понятны
только после создания и полного изучения трансгенной птицы. Получение
трансгенной птицы для хозяйственного использования предполагает создание линий. С этой точки зрения птица обладает большим преимуществом перед сельскохозяйственными млекопитающими благодаря быстрому половому созреванию и высокой плодовитости. Использование трансгенеза для передачи полезного гена от одной породы или линии к другой даже у быстроразмножающейся птицы экономило бы многие годы, необходимые на многочисленные скрещивания.
Результаты направленной селекции путем трансгенеза на сегодняшний
день достаточно скромны, из-за сложности взаимодействия изменения генотипа и фенотипа. Во ВНИТИП Россельхозакадемии разработан метод получения трансгенной птицы путем микроинъекции чужеродной ДНК в яйцеклетки [62; 65; 172; 173; 192]. Этим методом были получены трансгенные куры с различными генными конструкциями [77–79] и перепела с геном гормона роста крупного рогатого скота. Полученные трансгенные перепела имели
некоторые фенотипические особенности в сравнении с обычными перепелами. Самой заметной из особенностей, были сносимые перепелами необычно
крупные яйца [66; 176]. Этот признак оказался наследуемым в ряде генераций перепелов [69; 80].
На сегодняшний день совершенно недостаточно изучена динамика изменений фенотипа в ряде поколений уже полученных трансгенных организмов [56; 204]. Применение генетической модификации в животноводстве вообще и в птицеводстве в частности по большей части находится на раннем
этапе. Основная часть результатов исследований остается на научном уровне,
и пока не настало время активного внедрения разработок в практику. Поэтому научное обоснование применения новых методов и приемов в селекции
открывает более эффективный путь развития современного птицеводства.
16
Методы получения трансгенного организма
Трансгеника – это новый раздел биологической науки, посвященный
внедрению инородных генов в геном животного или растительного организма.
Трансгеника зародилась в 70-х годах ХХ столетия благодаря успехам молекулярной биологии, генетики, генной инженерии. Были разработаны методы, позволяющие идентифицировать и выделять определенные гены из растительных и животных геномов, «размножать» и «склеивать» их в тех или иных сочетаниях, создавая таким образом генные конструкции. Вследствие единообразия строения двойной цепи ДНК и универсальности генетического кода, в
генных конструкциях можно использовать ДНК от различных донорских организмов. Однако следует иметь в виду, что при экспрессии введенного гена
могут возникать совершенно новые взаимодействия в зависимости от происхождения ДНК донора и реципиента. Так, например, было замечено, что уровень экспрессии генных конструкций, содержащих прокариотические части, в
трансгенном организме млекопитающих заметно снижается. На уровень экспрессии также оказывает влияние строение генной конструкции. Было показано, что содержащие интроны природные гены по сравнению с комплементарными ДНК, полученных обратным синтезом с матричных РНК и поэтому не
содержащих интроны, продуцируют в 10–100 раз больше мРНК [247].
Получение трансгенного организма включает три стадии: создание
генной конструкции, внедрение ее в геном организма, анализ и селекцию модифицированных организмов. Наиболее разработанной на сегодняшний день
является первая стадия этого процесса. Так, если становится известным, что
какой-либо признак животного или растения связан с определенным геном,
выделить, размножить этот ген и изготовить из него конструкцию для трансгенеза не является сегодня серьезной проблемой.
Сложнее обстоит дело со второй частью работы. Доставку генных конструкций в геном животных осуществляют разными способами, наиболее отработанными из которых являются:
– микроинъекция ДНК в ядро оплодотворенной яйцеклетки;
17
– применение ретровирусов как средства доставки чужеродной ДНК в
геном, поскольку они способны встраиваться в хромосомы клеток;
– получение эмбриональных химер – внедрение в эмбрион генетически трансформированных чужеродной ДНК первичных половых клеток, выделенных из другого эмбриона.
Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки.
Микроинъекция ДНК
Для получения трансгенных животных чаще всего прибегают к микроинъекции ДНК в яйцеклетки. При этом исследователи стремятся к тому, чтобы трансген содержался во всех клетках животного и обязательно в половых – для передачи потомству. Поэтому перенос генов производят на самых
ранних стадиях развития организма. Подходящим временем является пребывание его в состоянии в одной-единственной клетки – зиготы. Классический
метод получения трансгенных млекопитающих предусматривает микроинъекцию генной конструкции в одно из ядер свежеоплодотворенной яйцеклетки – до начала ее дробления. Яйцеклетку вымывают из половых путей самки
и после микроинъецирования помещают в половые пути другой самки, где
она нормально развивается.
Впервые микроинъецирование было произведено в 1974 г. [369]. В то
время, до развития технологии рекомбинантных ДНК, единственным источником чистой ДНК служили вирусы. Исследователи вводили в яйцеклетки
лабораторных мышей ДНК вируса SV40. Позднее было показано, что инъецированная в яйцеклетки чужеродная ДНК с достаточно высокой вероятностью встраивается в геном и наследуется по законам Менделя [246; 370].
Стало ясно, что не существует никакого видового барьера для интеграции чужеродных генов. Гены можно пересаживать в геном организма другого вида, рода, семейства и т.д. Вскоре было показано, что микроинъекция
раствора ДНК в пронуклеус является возможным путем получения трансгенных млекопитающих [327]. После микроинъекции клонированных вирусных
ДНК в пронуклеус оплодотворенных яйцеклеток мыши было доказано их
18
присутствие у части развившихся из таких эмбрионов плодов. Несколько
позже было доказано встраивание эукариотических генов в хромосомную
ДНК развившихся плодов [610; 612] и взрослых животных, а также передача
трансгенов следующей генерации [282; 328; 611].
Первым трансгенным животным с заданными свойствами стала мышь
необычно большого размера, содержащая в геноме генную конструкцию с
гормоном роста, находящегося под контролем металлотионинового промотора, обеспечивающим экспрессию гена соматотропина [503]. Это явилось
мощным толчком для начала работ по применению трансгенеза к сельскохозяйственным животным. Ведь появилась возможность создавать индивидуумы с новыми, необычными свойствами, или с существенно улучшенными
привычными признаками.
Сложилась следующая классическая технология получения трансгенеза
у млекопитающих:
1. Подготовка доноров и извлечение яйцеклеток.
2. Микроинъекция ДНК в один или оба пронуклеуса яйцеклетки.
3. Пересадка инъецированных эмбрионов в яйцеводы или, после промежуточного культивирования, в матку синхронизированных реципиентов.
Однако при использовании этой технологии на сельскохозяйственных
животных возникли определенные проблемы, связанные с различиями в раннем эмбриональном развитии и морфологии их эмбрионов.
Так, например, при рассмотрении под обычным микроскопом ядерные
структуры в эмбрионах крупного рогатого скота и в некоторых случаях в эмбрионах овец и коз неразличимы или просматриваются нечетко из-за темных
липидосодержащих гранул. Для визуализации пронуклеусов в эмбрионах
овец достаточно использования интерференционной оптики. Для эмбрионов
крупного рогатого скота и свиней требуется центрифугирование, в результате которого ядерный материал приближается к клеточной мембране яйцеклетки и становится более различимым.
19
Таким образом, для успешного выполнения экспериментов по трансгенезу необходимо владеть методами извлечения эмбрионов, их пересадки и
ряда прочих манипуляций, а также четко знать время выполнения каждой из
операций для каждого вида сельскохозяйственных животных. Несмотря на
то, что на сегодняшний день все используемые на практике трансгенные
сельскохозяйственные животные получены методом микроинъекций, исследователей не устраивает эффективность этого способа. С наибольшей эффективностью этот метод реализуется на мышах. Эффективность составляет
10%, то есть от 100 животных, взятых в эксперимент можно в среднем получить 10 трансгенных особей. У сельскохозяйственных животных этот показатель по разным данным колеблется от 2–5% [22] до 20,6% (средняя частота
интеграции по восьми типам генов) по результатам внедрения чужеродных
генов в зиготы кроликов и полученных трансгенных животных [119]. Поэтому, активно ведутся исследования по разработке альтернативных микроинъекции методов трансгенеза у сельскохозяйственных животных [57; 300].
Ретровирусный трансгенез
Одним из альтернативных микроинъекционному трансгенезу методов
является применение ретровирусов для доставки определенных генов в геном
организма-хозяина. Как известно, в процессе своего жизненного цикла, после
проникновения в клетку, ретровирус синтезирует со своей РНК обратной
транскриптазой, так называемый провирус – ДНК, которая встраивается в
хромосому клетки. В дальнейшем трансляция и транскрипция вирусных генов, находящихся в хромосоме клетки-хозяина, дает начало новым вирусным
частицам. Таким образом, ретровирусы обладают очень ценным свойством
интегрировать в геном клетки и реплицироваться вместе с ним. Если вставить в ретровирусный геном нужные гены и удалить часть вирусных генов
для предотвращения размножения вируса, можно получить «самовстраивающуюся» генную конструкцию. Ретровирусные вектора обладают целым
рядом положительных особенностей: не ограничено число одновременно обрабатываемых клеток; отсутствует механическое повреждение клеток мик-
20
роинъекционной пипеткой; все клетки (100%), обработанные таким вектором, будут содержать интегрированную в геном генную конструкцию; трансген интегрируется в геном в одной точке, без образования тандемных последовательностей с большим числом копий трансгена, как это обычно наблюдается при микроинъекционном трансгенезе; интегрированная ДНК точно
соответствует провирусному геному, без делеций и вставок. Перечисленные
свойства ретровирусных векторов делают их очень перспективными не только для получения трансгенеза у животных, но и для генной терапии, так как
имеется возможность обрабатывать такими векторами часть тканей и органов
животных или человека.
Одними из первых ретровирусной технологией были получены трансгенные мыши. Из 119 обработанных и пересаженных 8-клеточных эмбрионов
мыши было получено 65 особей, 8 из них содержали бактериальный ген neo
[363]. Эффективность метода в этом случае составила 7%. Позднее была проведена аналогичная работа, в которой было показано наследование ретровирусных конструкций по закону Менделя, по крайней мере, до третьего поколения [543]. Были получены трансгенные мыши, содержащие экспрессирующий ген β-глобина человека [578].
Несмотря на всю перспективность ретровирусной технологии трансгенеза, уровень ее современного развития характеризуется следующими существенными недостатками: клетки и эмбрионы могут быть устойчивы к вирусной инфекции, и в этом случае перенос генов не произойдет; ретровирусы
производят инфекционные вирионы, часто онкогенные, возможна активация
клеточных онкогенов; теоретически вероятна рекомбинация интегрированного, потерявшего способность размножаться ретровирусного вектора с вирусом дикого типа, с восстановлением способности производить инфекционные вирионы; размер генной конструкции, которая может быть вставлена с
использованием ретровирусных векторов, ограничен примерно 8 тысячами
пар нуклеотидов [316]. Кроме того, в результате сплайсинга из ретровирусов
вырезаются интронные последовательности, которые, как и дистальные или
21
проксимальные элементы, играют важную роль в эффективной экспрессии
генов у трансгенных животных [504].
В последнее время в области создания ретровирусных векторов наблюдаются определенные успехи. Создаются ретровирусные вектора, способные
интегрировать большое количество чужеродного генетического материала и
при этом теоретически утратившие способность к репликации. Разрабатываются многочисленные методы с целью преодоления потенциальной проблемы инфекционной и онкогенной способности ретровирусных векторов,
включая получение дефектных вирусов с дефицитом в собственном геноме,
приводящем к неспособности синтеза новых вирионов [348; 475]. Благодаря
этому достигнуты положительные результаты в получении сельскохозяйственных животных с помощью ретровирусных векторов [200; 266].
Эмбриональные химеры
Еще одним методом получения трансгенных животных является использование эмбриональных химер. Суть этого метода в том, что имеется
возможность получать и культивировать ранние эмбриональные клетки. Если
в дальнейшем подсадить эти клетки в эмбрион, то из такого эмбриона развивается соматическая химера. Часть клеток этого организма имеет культуральное происхождение. Если трансформировать культивируемые эмбриональные клетки до подсадки их в другой эмбрион, то можно получить трансгенную химеру. С определенной степенью вероятности среди потомства такой химеры будут полностью трансгенные особи. Впервые на возможность
использования эмбриональных стволовых клеток как векторов для переноса
генов показал Mintz [466; 467].
Дальнейшее развитие и совершенствование методов культивирования
стволовых эмбриональных клеток сделало возможным получение таким путем трансгенных животных. Были получены трансгенные соматически химерные мыши. Была показана экспрессия генных конструкций в тканях этих
мышей. Доля химерных мышей была очень высокой, причем часть из них передавала трансген потомству [534; 587].
22
Работы по использованию этого метода для получения трансгенных
животных активно ведутся. Показана возможность культивировать стволовые эмбриональные клетки свиньи и крупного рогатого скота [487].
Преимущества метода подсадки в эмбрионы трансформированных эмбриональных стволовых клеток для получения сельскохозяйственных животных связаны с тем, что тестирование интеграции и экспрессии трансгена может быть выполнено на клеточных линиях, до получения трансгенного животного; манипуляции с эмбрионами животного выполняются на стадии морулы или бластоцисты, и поэтому могут быть получены без вскрытия брюшной полости животного. Ввиду относительно высокой стоимости отдельного
сельскохозяйственного животного, например коровы, – это существенные
преимущества.
Прочие методы трансгенеза
Использование сперматозоидов в качестве вектора для введения чужеродной ДНК в ооцит, с целью получения трансгенных животных, является
одновременно привлекательным, и наиболее противоречивым методом. Способность сперматозоидов связывать чужеродную ДНК впервые была показана в работе Brackett и др. в 1971 г. [243]. В 1989 году Lavitrano с сотрудниками сообщили о получении трансгенных мышей при использовании сперматозоидов в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК в яйцеклетку при
ее оплодотворении. Около 30% мышей, полученных из оплодотворенных обработанной спермой яйцеклеток, были трансгенными и передавали трансген
потомству [408]. Первые попытки других исследователей воспроизвести этот
метод не дали положительных результатов [248]. Позже были опубликованы
как положительные, так и отрицательные результаты. С целью тестирования
воспроизводимости метода, в экспериментах, выполненных в двух лабораториях, было получено 1755 эмбрионов мышей. Были получены трансгенные
особи (п=130, 7%), но они пришлись на 13 экспериментов из проведенных
75. [446]. Проведенные эксперименты доказали, что этим методом трансгенные животные могут быть получены, но атипичное распределение таких жи-
23
вотных в экспериментах не поддавалось объяснению. В экспериментах на
свиньях проводили отмывку сперматозоидов от семенной жидкости тройным
центрифугированием и инкубировали их с генной конструкцией в течение 2
часов. Провели 7 экспериментов. В 4 экспериментах получили отрицательный результат. А по 3 опытам были получены следующие показатели: трансгенных зародышей на стадии бластоцисты выявлено методом ПЦР 18%
(48/265), методом блот-гибридизации – 24% (64/265). Среди родившихся поросят в 2-х опытах трансгенных поросят не обнаружили, а в 2-х опытах из 23
поросят трансгенных было 12, т.е. > 50% (по блот-гибридизации). Положительный результат дали пробы ДНК различных органов и тканей: хвост, уши,
печень. Экспрессия выявлена в печени у 9 из 12 исследованных поросят. Полученные результаты показали, что перенос гена посредством сперматозоидов может быть успешно применен для получения трансгенных свиней. Однако наблюдалась высокая вариабельность результатов, полученных в разных опытах: от 0% до 62% [410].
Для увеличения эффективности переноса гена с помощью сперматозоидов предложено несколько различных подходов. В лаборатории Sirard
[317; 530] было показано, что в результате применения электропорации
сперматозоидов осуществлялся перенос гена сперматозоидами, но не было
получено точных доказательств об интеграции чужеродного гена в геном полученных эмбрионов.
При использовании моноклональных антител для связывания генной
конструкции со сперматозоидами перед хирургическим осеменением свиней
около 20% родившихся поросят оказались трансгенными. При этом была
подтверждена интеграция чужеродного гена в геном полученных животных,
его экспрессия и передача потомкам [269].
Сперматозоиды крупного рогатого скота были трансфецированы липофекцией плазмидной ДНК, содержащей ген GFP (зелёный флуоресцирующий
протеин), линеаризованной рестриктазой NotI. С использованием меченой
ДНК было показано, что около 80% радиоактивной ДНК находилось в спер-
24
матозоидах. Кроме того, было показано, что ген GFP интегрирует в геномную ДНК сперматозоида в сайтах рестрикции NotI. У 30% полученных таким
путем эмбрионов показана экспрессия GFP. Было получено 2 трансгенных
теленка. В двухмесячном возрасте у 60% лимфоцитов этих телят выявлялось
специфическое зеленое свечение. [567].
В дальнейшем на основании изучения механизма взаимодействия
сперматозоидов с генными конструкциями была подтверждена возможность
использования сперматозоидов в качестве переносчика чужеродного гена в
яйцеклетку [446; 581; 644].
ДНК связывается со сперматозоидами не случайным образом, но представляет собой процесс, регулируемый специфическими факторами. Показано, что у большинства видов животных преимущественное место связывания
ДНК локализовано в постакросомальной области головки сперматозоида.
Для связывания необходим отрицательный заряд молекулы. Например, отрицательно заряженные молекулы гепарина или протеины с изоэлектрической
точкой ниже 7 связываются с этой областью головки сперматозоида аналогично ДНК. Было идентифицировано три больших класса протеинов, связывающих ДНК, как потенциальных субстратов для взаимодействия ДНК с головкой сперматозоида [409; 623].
Эксперименты, проведенные на млекопитающих, ясно показали, что
сперматозоиды эякулята не проницаемы для чужеродной ДНК, если не удалена семенная жидкость. Из семенной жидкости млекопитающих выделен
фактор ингибирования (IF-I), гликопротеин размером 37 килодальтон (кДа).
В его присутствии ДНК-связывающие протеины на поверхности сперматозоидов теряют способность связывать экзогенную ДНК. На основании этих и
других экспериментальных данных предложена модель взаимодействия ДНК
со сперматозоидами. Ее суть заключается в том, что при отсутствии естественного ингибитора семенной жидкости чужеродная ДНК связывается на поверхности сперматозоидов с протеинами размером 30–35 кДа. После связывания, интернализация (проникновение) ДНК в ядро происходит в пределах
25
нескольких минут. Посредником этого процесса являются специальные молекулы, присутствующие на мембране сперматозоидов. В комплексе с ДНК
они проникают в ядро через поры головки сперматозоида, достигают ядерного матрикса, где ДНК отделяется от комплекса [320]. Ядро сперматозоида не
является безопасным местом для экзогенной ДНК, так как ее интернализация
активирует метаболические процессы, сходные с апоптозом, который устраняет и ДНК, и сам сперматозоид [445]. Доля экзогенной ДНК, которая связывается с ядром, колеблется от 6 до 29% от общего числа ДНК, связавшейся со
сперматозоидом [315]. Имеются данные, что плазмидная ДНК, проникшая в
сперматозоиды, тесно связывается с ядерным каркасом, основательно перестраивается и подвергается рекомбинации с ДНК генома сперматозоида
[644].
Ввиду большой практической значимости этого метода, он продолжает
активно разрабатываться. Успешный перенос экзогенной ДНК с помощью
сперматозоидов был показан на нескольких видах животных, включая крупный рогатый скот [567], цыплят [478], свиней [410–412], кроликов [87; 88],
различных видов рыб [396]. Однако мало работ, показавших при этом наличие экспрессии чужеродного гена. Более того, если ДНК не проникла в ядро
сперматозоида, а только переносится сперматозоидом в цитоплазму яйцеклетки, копии ДНК плазмиды могут быть обнаружены на ранних стадиях
развития эмбриона, но не выявляться у взрослых животных.
Таким образом, основываясь на имеющихся литературных данных,
можно заключить о перспективности применения сперматозоидов в качестве
векторов для генетической трансформации.
Еще одним способом получения трансгенеза у животных является инъекция в многоклеточные эмбрионы животных генных конструкций, упакованных в липосомы. Таким способом были получены трансгенные мыши с
геном поверхностного антигена вируса гепатита B [540]. Из 80 инъецированных в этой работе эмбрионов развилось 24 животных, из которых 5 были
трансгенными. Также с использованием липосом получены трансгенные ку-
26
ры с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека
[157].
Несмотря на очевидные успехи в создании трансгенных организмов и
перспективности работ по генной инженерии животных, существует необходимость поиска более эффективных способов трансгенеза. Особенно это актуально в свете имеющихся данных, свидетельствующих о подавлении и
сбоях в экспрессии трансгенов [308; 460; 507], что указывает на сложность
внутриклеточных механизмов, разрешающих транскрипцию и трансляцию
чужеродных последовательностей ДНК. Можно сказать, что в настоящее
время так называемая РНК-интерференция представляет собой весьма острую проблему на пути развития трансгенеза. Успех ее решения обещает прорыв в науке и практике современного животноводства [191].
Современные направления использования трансгенеза
В настоящее время ведутся активные исследования с трансгенными
животными в области роста, новых путей обмена веществ и качества животноводческой продукции, резистентности к болезням, создания «животныхферментеров» и доноров внутренних органов для пересадки человеку [56;
195; 201; 203].
Регуляция роста и обмена веществ
С накоплением знаний в области генетической обусловленности и регуляции скорости роста и развития животных, в том числе трансгенных,
можно ожидать успехов в этом направлении. Представляется очень перспективной пересадка генных конструкций, связанных с механизмами регулирования обмена веществ животных и важнейших хозяйственно-полезных признаков (удой, рост, шерстность, яйценоскость и др.). Уже накоплен определенный объем научной информации, особенно по пересадке генов так называемого соматотропинового цикла (соматотропин, рилизинг-фактор соматотропина и инсулиноподобный фактор роста).
27
Важнейшей проблемой животноводства является относительно низкий
коэффициент конверсии растительного белка в белок животного происхождения. В процессе селекции и совершенствования систем кормления этот показатель был улучшен, однако он может быть существенно увеличен биотехнологическими методами. Получение трансгенных с.-х. животных с генами
соматотропинового цикла позволит резко увеличить эффективность усвоения
животными кормового белка. Это показали опыты по влиянию рекомбинантного экзогенного соматотропина на ростовые показатели свиней [159].
Первые трансгенные свиньи с геном соматотропина человека и мышиным металлотиониновым промотором (mMT I-hGH) были получены 1985 году [344]. Они показали более высокую усвояемость корма – до 18%. У потомства трансгенных свиней наблюдались на 16,5% более высокие среднесуточные приросты [525]. Однако не все виды животных одинаково реагируют
на повышение уровня соматотропина. Так трансгенные по гену гомона роста
овцы не обладали повышенной скоростью роста, но имели более низкое содержание жира [529]. В то же время трансгенные рыбы имели опережающий
рост [50]. Методом микроинъекций в ядерный материал зигот была получена
крольчиха, полностью трансгенная по гену гормона роста крупного рогатого
скота, отличающаяся высокой энергией роста [194].
Другой важнейшей проблемой свиноводства, мясного скотоводства и
птицеводства является то, что животные в процессе роста и откорма тратят
большое количество питательных веществ на синтез не белка, а жира, расходуя при этом огромное количество энергии корма. Между тем пищевая ценность жира является невысокой. Поэтому перед животноводами встала задача получать животных, в туше которых значительно больше мускульной ткани, а значит и белка, чем жировых отложений. Здесь традиционная селекция
также добилась определенных успехов, но по-прежнему огромное количество питательных веществ корма расходуется на синтез жира. Исследования
показали, что инъекция соматотропина тормозит процессы синтеза жира.
Следовательно, получение трансгенных животных такого типа может суще-
28
ственно продвинуть селекцию сельскохозяйственных животных в направлении усиления синтеза белка и снижения синтеза жира. Это резко повысит
эффективность мясного животноводства и коренным образом улучшит качество продукции. Из опытов по инъекциям гормонов известно, что для ускорения роста необходимо скармливать животным корма с повышенным содержанием протеина (18% сырого протеина) и с дополнительным количеством лизина. У потомства трансгенных свиней, получавшего соответствующий кормовой рацион, наблюдались на 16% более высокие среднесуточные
приросты [522; 523]. Также важным изменением у трансгенных по гену гормона роста свиней явилось более чем двукратное уменьшение толщины шпика с 18–20 мм у контрольных свиней, до 7–8 мм у трансгенных [525]. В кормлении сельскохозяйственных животных существует мнение, что генетическая
способность в сочетании с существующим стандартом кормления уже себя
исчерпала. К этому направлению примыкает и возможность пересадки генов,
обусловливающих функционирование регуляторных механизмов воспроизводства животных, создаются предпосылки создания генетически более плодовитых животных. Это повышает интерес к изучению животных – трансгенов. Под руководством академика Россельхозакадемии Л.К. Эрнста во Всероссийском НИИ животноводства (ВИЖ) проводятся исследования по трансгенезу свиней [19–21; 90; 196; 199]. Испытывались различные конструкции, в
том числе с геном рилизинг-фактора гормона роста человека. Была проведена
оценка ее влияния на биологические и хозяйственные качества в 12 поколениях животных. По мнению автора, полученные результаты позволяют начать работу по созданию нового заводского типа свиней, превосходящего
существующие породы по ряду важнейших признаков [204].
Повышение устойчивости к заболеваниям
Второе направление – получение промышленных линий животных как
с повышенной общей резистенсностью, так и с наследственной устойчивостью к конкретным инфекционным заболеваниям. Добиться этого можно
встраиванием в геном животного генов «антисмысловых» вирусных РНК.
29
Продукт этих генов взаимодействует с матричной РНК вируса, попавшего в
организм, мешая его воспроизводству. Реальность такого подхода была продемонстрирована на трансгенных кроликах, устойчивых к аденовирусу [193].
Известно, какой огромный ущерб животноводству наносят болезни,
особенно вирусные. При этом следует отметить, что попытки создания устойчивых к болезням популяций животных традиционными методами селекции не дали хороших результатов. Разумеется, еще долгое время главным
направлением борьбы с инфекционными заболеваниями животных будет ветеринарная медицина, где генная инженерия также позволяет ускорить получение эффективных методов диагностики, профилактики и лечения болезней.
Но по мере развития генной инженерии сельскохозяйственных животных,
часть этих проблем будет решаться созданием генетически устойчивых животных [197].
Примером гена резистентности может служить ген Mx мышей. Мыши,
имеющие генотип Mx+ устойчивы к заражению вирусом гриппа А [342; 582;
584]. Этот ген был выделен, клонирован и использован для получения трансгенных животных [583].
Сравнительное изучение иммунного статуса обычных и трансгенных
по Мх-гену поросят трехмесячного возраста в норме и при заражении вирусом гриппа свиней, штамм Меротин (Hsw 1N1), включало определение количественных и функциональных параметров, соответствующих первому и
второму уровням исследования иммунного статуса человека, принятым в медицинской практике. По большинству параметров обе группы свиней не
имели существенных отличий. В группе трансгенных поросят выявлено относительно большее количество Т-лимфоцитов и фагоцитов и меньшее количество В-лимфоцитов. Поросята обеих групп были интраназально заражены
вирусом гриппа свиней (титр в РГА 1:1024) в объемной дозе 5 мл. Динамические изменения параметров иммунного статуса у животных обеих групп были практически идентичными и заключались в резком уменьшении фагоцитарной активности нейтрофилов (в группе обычных поросят до нулевых зна-
30
чений), снижении пропорции палочкоядерных нейтрофилов и соответствующем увеличении доли сегментоядерных нейтрофилов. Кроме того, начиная с
шестого дня, наблюдали увеличение относительных и абсолютных количеств
Т- и В-лимфоцитов, абсолютных количеств Tm- и Tg- клеток. На протяжении
всего срока наблюдения у трансгенных поросят было снижено соотношение
субпопуляций Т-лимфоцитов, чего не наблюдали у обычных поросят. С другой стороны, количество фагоцитов у трансгенных животных к 13 дню опыта
практически восстановилось до исходных значений, у обычных поросят количество фагоцитов к этому сроку оставалось достоверно сниженным относительно исходного значения [104].
Повышение резистентности животных возможно и при создании в организме постоянного фона интерферонов путем пересадки интерфероновых
генов с соответствующими промоторами. Были получены трансгенные кролики [17; 188], свиньи [34] и куры [411].
Для сравнительного исследования устойчивости трансгенных и обычных кроликов к вирусу миксоматоза проводили титрование вируса миксоматоза, штамм «B-82». Последовательные десятикратные разведения вируса в
четырех повторностях вводили кроликам внутрикожно-подкожно и на протяжении последующих десяти дней учитывали развитие поражений кожи. В
качестве активатора МТ-промотора кроликам орально вводили сульфат цинка, который начинали давать в виде 5% раствора в разовых дневных дозах
100, 10 и 1 мг за три дня до введения вируса и в последующие семь дней.
Первые признаки поражение кожи отмечены на 5-е сутки у всех групп кроликов, вне зависимости от генетического статуса и обработки сульфатом
цинка. Результаты титрования учитывали ежедневно в течение шести-девяти
дней после заражения. Титр вируса рассчитывали по Риду и Менчу. У кроликов, трансгенных по гену β-интерферона, при всех трех дозах сульфата цинка
титр вируса был на 0,75–1,050/0,1 мл ниже, чем у таких же кроликов, не получавших сульфат цинка, или же у трансгенных по гену γ-интерферона и обычных кроликов. Вероятно, кролики, трансгенные по гену β-интерферона, более
31
устойчивы к миксоматозу по сравнению с обычными и трансгенными по
γ-интерферону [105].
Клиническую и иммунологическую реакцию обычных и трансгенных
кроликов на заражение лапинизированным вирусом КЧС исследовали на фоне ежедневного орального введения сульфата цинка (за три дня до введения
вируса и в последующие семь дней). После введения вируса КЧС динамика
исследуемых показателей (количество лейкоцитов и нейтрофильных фагоцитов, концентрация IgG, бласттрансформация лимфоцитов крови) изменялись
одинаково у животных всех групп. Гематологические параметры изменялись
на третий день после введения вируса КЧС у всех исследуемых животных,
восстанавливались к седьмому дню и оставались без существенных изменений до конца опыта (25 дней). Повышение температуры отмечено у всех
обычных и трансгенных по гену γ-интерферона кроликов, а также у всех
трансгенных кроликов, не получавших сульфат цинка. У кроликов, трансгенных по гену β-интерферона и получавших сульфат цинка в дозах 100 и 10 мг,
температурная реакция отсутствовала или по длительности не превышала
одного дня. Таким образом, по клинической реакции трансгенные по гену
β-интерферона кролики относительно более устойчивы к лапинизированному
вирусу КЧС [106].
Принципиально возможно создание и других генных конструкций, которые будут обеспечивать генетическую невосприимчивость животных к определенным болезням [641]. В селекции ближайшего будущего это направление будет занимать все возрастающее место.
Создание «животных-ферментеров»
Одним из направлений трансгенеза является использование животных
в качестве продуцентов заданных белков. Уже получены животные с измененным белковым составом молока, синтезирующие в молочной железе чужеродные белки [152; 513].
Развитие этого направления связано с возможностью создания таких
генных конструкций, которые при интеграции способны экспрессировать
32
только в определенных органах и тканях, например, в секреторных клетках
вымени. Производство биологически-активных веществ уже нашло широкое
применение
после
получения
трансгенных
микроорганизмов
(E.coli,
B.subtilis). При наличии таких микроорганизмов в системе микробиологического производства возможно получение большого количества различных
биологически-активных веществ, в том числе медицинского назначения. Однако микробиологический синтез невозможен, если производимые белковые
молекулы гликозилированы, так как прокариоты лишены механизмов гликозилирования. В этом случае активный продукт может производиться только
эукариотическими клетками. Это возможно при использовании культур клеток животных, но эти производства очень сложны и не всегда экономически
эффективны. В связи с этим возникла идея создания трансгенных животных,
которые с молоком выделяли бы определенные биологически-активные вещества. Генная конструкция из некоторого структурного гена, связанного с
промотором гена какого-либо молочного белка (казеина, лактальбумина), в
основном должна экспрессировать в клетках молочной железы. В результате
синтезированный этим геном пептид будет выделяться в молоко. Подходящим объектом для создания трансгенных форм являются кролики. Эффективность переноса генов у кролика достаточно высока [38; 264].
Использование млекопитающих для производства важных в медицинском и ином отношении белков имеет рад преимуществ по сравнению с микроорганизмами и культурами эукариотических клеток. Так, многие протеины
для обретения биологической активности должны претерпеть посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, карбоксилирование. В
микробных рекомбинантных продуктивных системах это, как правило, невозможно. Синтез чужеродного белка в молоко позволяет получать его
обычным способом – выдаиванием животного. Синтетическая продуктивность молочной железы очень велика. Концентрация собственных молочных
белков в молоке составляет 4–6%, то есть теоретически возможно получать
до 60 грамм трансгенного продукта на литр молока. Молоко является чистым
33
и гигиеническим продуктом, поэтому при выделении и очистки из молока
чужеродных протеинов не должно возникать неразрешимых проблем. В особенности это касается загрязнения выделенных протеинов прокариотическими остатками и побочными продуктами [22].
Для использования молочной железы в качестве биореактора необходимо наличие соответствующих регуляторных элементов для изготовления
генных конструкций [277; 638]. Уже выделены гены и промоторы αS1-казеина
[458], β-казеина, α-лактальбумина, β-лактоглобулина [569] и других молочных протеинов. Изучение полученных трансгенных животных показано, что
у всех животных экспрессия трансгенов происходит тканеспецифически, то
есть в молочной железе [216].
Аналогичные работы ведутся на разных видах сельскохозяйственных
животных. Получены овцы, в молоке которых содержится фактор свертываемости крови, который необходим для нормального существования больных гемофилией. Расчеты показывают, что десятка таких овец было бы достаточно для обеспечения человечества этим препаратом.
Была произведена трансгенная овца [278], у которой последовательности ДНК кодировали или человеческий фактор IX (FIX) или человеческий
α1-антитрипсин (α1-AT), вставленные в единицу транскрипции гена
β-лактоглобулина (белка молока овцы). Человеческий FIX используется при
лечении гемофилии; α1-AT используется при лечении эмфиземы. Трансгенная овца, выделяющая биологически активные белки в молоке, была не только получена, но и успешно разводилась. Однако уровни экспрессии этих белков в молоке, были не достаточно высокими для клинического применения.
Для увеличения уровней экспрессии этих генов в молоко на мышах были испытаны разнообразные генные конструкции. Было показано, что сам
β-глобулиновый ген овцы эффективно и тканеспецифично регулировался в
этом удобном экспериментальном виде животных – лабораторных мышах. В
частности, исследовалась необходимость наличия интронных последовательностей для эффективной экспрессии, так как ДНК сегменты кодируют разно-
34
образные потенциальные продукты доступные только в форме безинтронных
кДНК клонов. Гибридные гены, включающие кодирующие белок последовательности кДНК, присоединенные к 5' и 3' сегментам β-глобулинового гена,
экспрессировались очень неэффективно в трансгенных мышах. Как оказалось
это не было простым требованием сплайсинга, так как включение первого
β-глобулинового интрона в тестируемую конструкцию не улучшало эффективность экспрессии. По контрасту для α1-AT, гибридный ген, включающий
геномный миниген (содержащий три из четырех естественных интронов
α1-AT) экспрессировал эффективно в грудной железе. Семь из тринадцати
линий мышей экспрессировали этот ген в грудной железе, и четыре из них
произвели больше чем 0,5 мг/мл человеческого α1-AT в молоке. Самая высоко экспрессирующая линия производила приблизительно 7 мг/мл человеческого белка. У этой линии белок ясно визуализировался окрашиванием SDSполиакриломидных гелей Кумасси синим, и показал электрофоретическую
подвижность, очень близкую к полученному из человеческой плазмы α1-AT.
Биологическая проба, разработанная для измерения трипсин подавляющей
активности, показала что α1-AT, полученный из молока мыши, был так же
биологически активен как его человеческий аналог, полученный из плазмы.
Затем генная конструкция AATB была введена в овцу. Было получено
пять трансгенных животных, четыре из которых были женского пола. Все четыре овцы экспрессировали AATB, и все производили в молоке более чем
1 мг/мл α1-AT. Самое высоко экспрессирующее животное, по кличке Трейси,
производило приблизительно 35 мг/мл этого полностью нормального человеческого белка в своем молоке. Полученный белок был биологически активен
и соответствующе гликозилирован. Овца может производить свыше 250 литров молока за лактацию, было оценено, что литр молока Трейси стоил приблизительно $ 7000. Это была первая овца в мире стоящая миллионы американских долларов [278].
Есть и другие примеры «живых ферментеров» Например, получены
овцы, синтезирующие в молочной железе сычужный фермент химозин, ис-
35
пользуемый в сыроделии [32; 33; 152]. Получены положительные результаты
о возможности использования трансгенных кроликов для получения фармацевтических препаратов. Например, выявленная концентрация человеческого
гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в молоке трансгенных
крольчих составила от 8,80 до 22,3 мг/л, что, по мнению авторов, достаточно
для использования этих животных в фармацевтическом производстве [120].
Несмотря на имеющиеся успехи, совершенно очевидно, что процесс получения лекарственных белков и белков технологического направления с молоком животных весьма сложен и трудоемок. К тому же, молочные железы животных зачастую не способны правильно гликозилировать экзогенные белки,
что побуждает к поиску других источников получения трансгенных белков.
Для производства лекарственных белков потенциально можно использовать
экспрессию трансгенов в других тканях и органах, в таких как семенная жидкость [302; 488], кровь личинок насекомых [452], жировые железы [542], белок птичьего яйца [643]. О направленной экспрессии рекомбинантных белков
в определенные ткани или тканевые жидкости, среди которых чаще других
используется молоко, написаны обзоры наших ведущих ученых в области
создания и изучения трансгенных животных [55; 200].
Трансгенная птица
Создание линий трансгенных сельскохозяйственных животных трудоемко из-за достаточно длительного периода их полового созревания, относительно низкой плодовитости и высокой стоимости отдельного животного. С
этой точки зрения трансгенная птица обладает большими преимуществами, и
многие лаборатории мира работают над проблемой получения трансгенной
птицы. Однако особенности ее размножения создают серьезные проблемы
для исследователей. Курица образует в сутки одну оплодотворенную яйцеклетку, которая очень велика и нежна для каких-либо манипуляций с ней, как
это делается с яйцеклетками млекопитающих при их инъецировании чужеродной ДНК. Для нормального эмбрионального развития птичьей яйцеклетке
необходимы третичные оболочки – белковая, подскорлупная и скорлупа.
36
Дробление куриной яйцеклетки начинается уже в белковом отделе яйцевода,
а в свежеснесенном яйце имеется уже 50–60 тысяч клеток. Поэтому первая
трансгенная птица была получена с помощью ретровирусных векторов. Ретровирусы были главными претендентами на роль векторов для переноса генов, потому что в нормальных условиях они сами включаются в геномную
ДНК хозяина и реплицируются [316]. Поэтому многие исследователи пытались внести чужеродные гены в зародышевую линию, инфицируя эмбрионы
как способными к репликации, так и утратившими способность к репликации
ретровирусными векторами [241; 286]. Успешное встраивание трансгена в
этих опытах составило от 0,8 до 5%. Введение рекомбинантного вектора лейкоза птиц в бластодерму, инкубируемых куриных эмбрионов, дало положительный результат по переносу генетического материала в зародышевую линию [548–550]. С рекомбинантным вирусом были получены полные трансгены [236; 287; 515; 552]. Исследования по дальнейшей разработке технологии
использования ретровирусов с целью получения трансгенеза у птиц представляются важными и продолжаются по настоящее время [398; 403; 608].
Существуют два методических подхода получения безвирусного трансгенеза у птиц. Один из них – получение химер подсадкой в эмбрионы чужих
клеток. Клетки ранней бластодермы или примордиальные клетки выделяют и
инъецируют в их ядра чужеродную ДНК. Затем эти инъецированные клетки
имплантируют в эмбрионы, где они приживаются и делятся. Таким путем
были получены соматические химеры и химеры зародышевой линии [245;
475; 514]. Полученных химерных особей выращивают и отводят от них потомство. Некоторая часть потомков, происходящих из трансгенных зародышевых клеток, оказываются трансгенными. Главным недостатком этого подхода является малая эффективность клеточных пересадок [245; 514].
Клетки были получены из эмбрионов на стадии X цыплят линии Barred
Plymouth Rock (которые имеют черный пигмент в их перьях из-за рецессивного аллеля в I локусе) и введены в подзародышевую полость эмбрионов от
имбредной линии Dwarf White Leghorns (которые имеют белые перья из-за
37
доминантного аллеля в I локусе). Из 53 эмбрионов Dwarf White Leghorn, которым были введены бластодермальные клетки Barred Plymouth Rock, 6 эмбрионов (11,3%) были фенотипическими химерами относительно цвета пера
и один из них (петушок) дожил до вылупления. Распределение черных перьев в реципиентах было переменно и не ограничивалось какой-либо специфической областью, хотя в одном случае донорское происхождение клетки было выражено на голове. Этот соматически химерный петух был скрещен с
несколькими курицами Barred Plymouth Rock, чтобы определить степень, с
которой донорские клетки были включены в семенники. Из 719 цыплят, полученных от этих спариваний, два были фенотипически Barred Plymouth
Rocks. Это означало, что клетки способные к превращению в клетки зародышевой линии были переданы реципиентам. Фингенпринт (метод генных отпечатков) ДНК из крови и спермы зародышевых химер показал, что обе эти
ткани отличаются от тканей имбредной линии Dwarf White Leghorns [514].
Впоследствии было показано, что клетки зародышевой линии могут
быть эффективно перенесены и интегрированы в эмбрион [245]. Эти и аналогичные работы других исследователей [305; 557] показывают, что выделение,
перенос и внедрение примордиальных зародышевых клеток может иметь
применение для получения трансгенов в птицеводстве. Методические приемы применения эмбриональных клеток в качестве переносчиков чужеродной
ДНК с целью получения трансгенной птицы продолжает разрабатываться в
России [153–155; 158]. Технология получения трансгенных эмбриональных
химер активно развивается и в таких странах, как США и Япония, и на сегодняшний день является основным претендентом на создание коммерчески
значимых трансгенных линий птицы. Технология эта весьма сложная и дорогостоящая, включает такие стадии, как выделение и культивирование первичных половых клеток, их последующую трансфекцию чужеродной ДНК и
подсадку в ранние эмбрионы [418; 476].
Получение трансгенной птицы с использованием искусственного осеменения, традиционно и широко используемого в птицеводстве приема, вы-
38
глядит очень перспективно. Все большее число птицеводов-селекционеров
говорит о грядущем генно-инженерном конструировании новых промышленных линий и кроссов с использованием, в том числе генофонда редких и
исчезающих пород птицы. Были проведены исследование по использованию
спермиев в качестве вектора переноса чужеродной ДНК в яйцеклетки кур. С
использованием меченой ДНК было показано, что около 80% радиоактивной
ДНК находилось в сперматозоидах. Кроме того, было показано, что ген GFP
(зелёный флуоресцирующий протеин) интегрирует в геномную ДНК сперматозоида в сайтах рестрикции NotI. Как сообщают авторы, при использовании
данной технологии на курах, 90% (17/19) цыплят экспрессировали GFP, и
80% (25/30) их потомков проявляли тот же эффект [567].
Липофектин
взаимодействует
с
ДНК,
формируя
липид-ДНК-
комплексы, которые могут слиться с плазматической мембраной клетки,
обеспечивая проникновение ДНК внутрь клетки. При использовании липофектина 51,6% сперматозоидов петуха содержали экзогенную ДНК. В результате искусственного осеменения кур семенем, трансфецированным с помощью липофектина, экзогенная ДНК выявлялась в бластодерме 67% оплодотворенных яиц. Однако включение чужеродной ДНК в геном вылупившихся цыплят не наблюдалось, хотя у этих цыплят была отмечена эписомальная интеграция чужеродной ДНК [478].
Для увеличения эффективности переноса гена с помощью сперматозоидов (sperm-mediated gene transfer, SMGT) предложено дополнить метод
использованием рестрикционных ферментов (restriction enzyme mediated
integration, REMI). Линейная ДНК, вместе с рестриктазой вводится в клеткумишень путем липофекции или электропорации. Предполагается, что рестриктаза затем разрезает геномную ДНК для облегчения интеграции экзогенной ДНК с соответствующими «липкими» концами [346].
Получены трансгенные куры с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека методом искусственного осеменения трансфе-
39
цированной спермой с применением липосом. Выход полученных трансгенных цыплят составил 33,3% [128].
С использованием сперматозоидов петуха, в качестве вектора трансформации,
получены
трансгенные
куриные
эмбрионы
с
генами
β-галактозидазы. Эффективность трансформации яйцеклеток составила 23%
от числа оплодотворенных яиц [68; 178].
Применение технологии микроинъекций ДНК к птице чрезвычайно затруднительно из-за феноменально большого размера ооцита. Тем не менее
некоторые исследовательские коллективы изучали возможность такого подхода. Была предпринята попытка инкубировать in vitro оплодотворенные куриные яйцеклетки, извлеченные из верхней части белкового отдела яйцевода.
На этой стадии куриный эмбрион находится на одноклеточной стадии развития, поэтому существует теоретическая возможность проведения микроинъекции чужеродной ДНК. Было показано, что существует возможность культивировать оплодотворенную куриную яйцеклетку в скорлупе с белком от
другой курицы [541].
Эта система культивирования эмбрионов цыпленка была в дальнейшем
усовершенствована. Оказалось возможным получить in vitro эмбриональное
развитие извлеченной оплодотворенной яйцеклетки курицы вплоть до вылупившихся цыплят [212; 510; 554]. Метод включает три стадии, с учетом различных потребностей эмбриона в течение развития, и предполагает использование яичной скорлупы как сосуда для культивирования. Первоначальный
вариант предусматривал культивирование эмбрионов в стеклянных банках в
течение первых 24 часов с последующим перемещением яйцеклеток из сосуда в сосуд (скорлупы) для культивирования между стадией I и стадией II и
между стадией II и стадией III. Позже метод был упрощен культивированием
на первой стадии развития в скорлупе, и поэтому исключена необходимость
перемещения эмбриона из стеклянного контейнера в скорлупу. В результате
количество вылупившихся жизнеспособных цыплят, полученных из культивированных яйцеклеток, достигло 20%. Такое культивирование может ис-
40
пользоваться для различных экспериментальных целей, поскольку обеспечивает доступ к развивающемуся эмбриону от одноклеточной стадии до стадии
вылупления. Различные стадии системы культивирования могут использоваться по отдельности, в зависимости от экспериментальных требований.
Была исследована возможность инъекции чужеродной ДНК с последующим культивированием эмбриона, как метод для производства трансгенной птицы. Для инъекций использовали генную конструкцию с репортерным
геном β-галактозидазы. Экспрессия генной конструкции в течение первых
семи дней развития была исследована гистохимическим анализом на
β-галактозидазную активность в тканях эмбрионов. Окрашенные клетки сначала наблюдались в середине дробления (250–500 клеток) в центре бластодиска. На второй день они были видны в больших долях бластодермы и в более
поздних стадиях в пропорционально меньших долях внезародышевых оболочек. В эмбриональных областях β-галактозидаза-позитивные клетки были
рассеяны около примитивной полосы большинства культур, но после гаструляции они присутствовали в эмбриональной ткани только у 7% выживших
эмбрионов. Эти наблюдения свидетельствовали о транскрипциональной активности в течение стадий дробления развития птицы и подтверждали предыдущие результаты этих исследователей о потере экзогенной ДНК в течение раннего развития цыпленка.
Результаты инъекции чужеродной ДНК на стадии единственной клетки, с последующим укороченным культивированием эмбриона, показали, что
включение введенной ДНК в хромосомы цыпленка сравнительно редкое событие. Такая интеграция может быть замаскирована присутствием внехромосомных копий введенных плазмид [554].
Этот подход, разработанный в институте Roslin (Шотландия), был успешно использован при создании трансгенной птицы [431; 455; 456]. Метод
включает прямую инъекцию генной конструкции в цитоплазму свежеоплодотворенной яйцеклетки курицы, с последующей его инкубацией до вылупления. Яйцеклетки для инъекции извлекали из белковой области яйцевода ку-
41
рицы, где они уже покрыты тонким слоем белка, но без скорлупы. Комплексная система культивирования была усовершенствована, с целью оптимизации выживания извлеченной и инъецированной яйцеклетки. Система попрежнему включает три стадии и основана на использовании яичной скорлупы как сосуда для культивирования, и жидкий белок, разбавленный раствором соли – как питательную среду. На первой стадии культивирования, которая продолжается в течение 24 часов, инъецированная яйцеклетка помещена
в скорлупу с окошком, содержащую небольшое количество питательной среды, так, чтобы зародышевый диск не был закрыт. В течение этой стадии, эмбрион развивается на желтке от одной клетки до бластодермы с 60000 клетками, характерной для снесенного яйца. Скорлупа затем заполняется разбавленным белком, чтобы полностью погрузить эмбрион, и окошко в скорлупе
закрывается липкой лентой. Вторая стадия продолжается 65 часов и за это
время должен развиться эмбрион с функционирующим сердцем и внезародышевым кровообращением. Для третьей и самой длинной стадии, которая
продолжается до вылупления, эмбрион с его желтком и питательной средой,
перемещают во вторую, бóльшую по размеру скорлупу. Это обеспечивает
искусственное воздушное пространство, необходимое в течение парафетального периода, когда эмбрион начинает дышать атмосферным воздухом своими легкими и готовится к вылуплению. Когда начинается легочная вентиляция, за 1–2 дня до вылупления, заклеивающая пленка перфорируется для
пропуска воздуха в воздушную камеру яйца. В заключение, заклеивающая
пленка ослабляется так, чтобы вылупляющийся цыпленок мог выйти из
скорлупы.
Яйцеклетка для инъекции должна быть получена сразу после оплодотворения и, следовательно, её движение вниз по яйцеводу прерывается. Инкубация в течение стадии I имеет место как бы в суррогате яйцевода – инкубаторе с 42°C (температура тела птицы), высокой относительной влажностью
и высоким уровнем углекислого газа (со связанной гипоксией). В конце первой стадии имеется короткий период при температуре комнаты, чтобы ими-
42
тировать яйцекладку (снесение яйца). Инкубационные условия в течение стадий II и III, эквивалентные периоду искусственной инкубации нормальных
куриных яиц, изменены по сравнению с традиционно используемыми в птицеводстве. Относительная влажность поднята примерно до 75% вплоть до 18
дня инкубации, затем ее уменьшают примерно до 65% до стадии вылупления. Во второй стадии, частота поворотов увеличена, и культуры поворачивают четыре раза в час. В третьей стадии поворачивающийся угол уменьшен,
чтобы предотвратить эмбрион от касания липкой пленки, которая закрывает
окно в скорлупе.
Производство трансгенных цыплят этим методом – достаточно сложная задача. Только 50% инъецированных яйцеклеток доживает до III стадии,
и уровень вылупления низок – в пределах 15%. Однако анализ на трансгенность эмбрионов и цыплят, полученных в этих экспериментах, обнадеживает.
При использовании чувствительной методики – полимеразной цепной реакции (ПЦР) – было показано, что образцы ДНК от почти половины эмбрионов
и цыплят, проживших последние 12 дней культивирования, содержат трансген. Двое из вылупившихся цыплят содержали трансген в хориоаллантоисной мембране, крови и пульпе ребра. У одного петушка количество трансгена
сохранялось до его половой зрелости. Его сперма также содержала трансген
(конструкцию репортерного гена), который был успешно передан к 3,4% его
потомства, то есть 14 из 412 полученных от него цыплят. Этим методом были
получены трансгенные куры и показано наследование трансгена. Все первичные трансгенные особи были мозаичными. В дальнейшем наследование
трансгена происходило в соответствии с законом Менделя. По сообщениям
авторов, до стадии вылупления при культивировании достигало около 60%
эмбрионов. Однако, при воспроизведении этой методики в других лабораториях, этот показатель не превышал 3–10% [304].
Другой вариант микроинъекций ДНК в яйцеклетки птиц, разработанный во ВНИТИП, предусматривает образование третичных оболочек яйцеклетки естественным образом, в половых путях птицы. В основе метода ле-
43
жит хирургическая операция, которая обеспечивает доступ к яйцеклетке,
проведение в нее инъекции ДНК, и имплантацию обратно в яйцевод для
формирования полноценного инкубационного яйца [62; 63; 172; 173; 192].
Дальнейшее совершенствование этого методического подхода позволило
проводить инъекции ДНК в яйцеклетки без их извлечения из половых путей
птицы, вследствие чего существенно возросла эффективность метода [67; 77;
310; 388]. Этим методом были получены трансгенные куры с геном гормона
роста человека [65], геном β-галактозадазы [64], геном человеческого
β-интерферона [79] и перепела, трансгенные по гену гормона роста быка [66;
76; 176]. Основное достоинство этого метода заключается в отсутствии необходимости использования сложной аппаратуры и сред для культивирования
эмбрионов in vitro, выделения и пересадки бластодермальных или примордиальных клеток.
Таким образом, основываясь на литературных данных, показано, что
трансгенная птица может быть получена без помощи ретровирусов и что создание трансгенных популяций является выполнимой задачей.
Для достижения успеха и практического использования, трансгенная
птица должна иметь фенотип, который превосходил бы уровень, уже достигнутый в птицеводстве. Например, увеличением скорости роста, улучшением
конверсии корма, яйценоскостью, уменьшением ожиренности тушки, увеличением устойчивости к заболеваниям и т.д.
Трансгенная птица с генами, обеспечивающими производство полезных фармацевтических белков, накапливающихся в яйце, также может иметь
широкое практическое использование [156; 347; 365; 366; 421; 422; 551]. Что
касается птицеводства, то использование трансгенеза для переноса полезного
гена даже от одной линии птицы к другой (что достижимо обычными селекционными методами) дает минимум 7–8 летний выигрыш и возможно экономию денежных средств за счет исключения возвратных скрещиваний, необходимых для удаления ненужных генов, передающихся при естественной половой гибридизации. Однако истинные выгоды от переноса генов будут по-
44
нятны со временем после создания и полного изучения полученной трансгенной птицы [202–204; 348; 553; 631].
1.2. Экспрессия вителлогенинового гена и биосинтез
вителлогенина в печени кур
Экспрессия гена – это процесс реализации информации, закодированной в структуре ДНК, на уровне РНК и белков. В настоящее время в понятие
гена кроме кодирующей области ДНК входят также сигнальные и регуляторные последовательности ДНК, обеспечивающие экспрессию. Знание регулирующей и кодирующей области гена, отвечающей за определенную биологическую функцию, позволит сократить время, трудовые и материальные ресурсы для достижения экономического результата селекционной работы.
В последние годы одним из ведущих направлений в науке о наследственности стала молекулярная генетика. Чем глубже удается ученым изучить
организм, тем больше выявляется глубоких причинных связей, лежащих в
основе всех признаков жизнедеятельности организма. Это открывает новые
горизонты перед селекционерами: объектом отбора становится не конечный
продукт онтогенеза (признак), а те или другие промежуточные звенья метаболизма, от которых зависит формирование конкретного признака. В настоящее время накоплен большой объем знаний об отдельных аспектах регуляции активности генома, что открывает возможности для уточнения, расширения и приложения научных данных к конкретным задачам научного
птицеводства.
Одним из факторов регуляции активности генома у высших эукариотов
являются стероидные гормоны. С наступлением яйцекладки в печени кур,
играющей доминирующую роль в липидном обмене, значительно усиливается функциональная активность, в частности начинается синтез белковых и
липидных компонентов желтка, которые поступают в кровь и затем поглощаются желточными фолликулами. Регуляция этих процессов находится под
контролем эстрогенов, следовательно, имеется возможность их моделирования введением эстрогенов цыплятам. Ввиду отсутствия у цыплят фолликулов
45
белковые и липидные предшественники будут накапливаться в крови, и их
концентрация позволит судить об изменении синтетической активности печени, связанной со становлением ее вителлогенной функции. С использованием экзогенного эстрогена диэтилстильбэстрола была проведена функциональная оценка репродуктивной системы кур в раннем возрасте [127; 169],
что определило научный интерес детального изучения эстрогениндуцированного вителлогенеза печени у цыплят на уровне макромолекул.
Становление вителлогенной функции в печени цыплят под влиянием
экзогенного эстрогена сопровождается значительным усилением биосинтетических процессов. Происходит экспрессия до этого «молчащих» генов. В
реализации генетической информации ведущее значение принадлежит рибосомам, так как на них осуществляется перевод заложенной в генах информации в аминокислотные последовательности синтезируемых белков. Содержание рибосом в клетках определяет потенциальный уровень белкового синтеза, поэтому одной из задач исследований было выявить связь биогенеза рибосом с рядом других факторов, лежащих в основе становления вителлогенной функции печени кур.
Эстрогениндуцированный вителлогенез как модель для изучения
экспрессии генов
Гормональная индукция является очень удобным приемом в молекулярной биологии для анализа различных молекулярных механизмов регулировки экспрессии генов. Главной проблемой большинства гормониндуцированных систем является сложность ответа ткани-мишени после гормональной стимуляции. Например, такая система как индуцированный тироксином
метаморфоз у амфибий, трудна для изучения непосредственно молекулярных
механизмов действия гормона на уровне генома, так как в ней имеет место
клеточная пролиферация, гибель клеток, индукция и ингибирование многочисленных биохимических параметров. В отличие от множества гормониндуцируемых систем эстрогенстимулированный вителлогенез обладает целым
рядом преимуществ:
46
1. Вителлогенин представляет собой довольно уникальный по своим
свойствам белок, что способствует его легкой идентификации и количественному определению. Эстроген вызывает синтез большого количества вителлогенина и поэтому есть возможность выделения вителлогениновой
мРНК с высокой чистотой и большим выходом.
2. Индукцию синтеза вителлогенина вызывает 17-β-эстрадиол (или его
синтетические аналоги), хорошо изученная молекула, регулирующая экспрессию генов, поэтому этот гормон может быть использован для выделения
и характеристики рецептора, участвующего в регуляции генома.
3. Тканью-мишенью эстрадиола является печень – относительно гомогенная популяция клеток, которая не пролиферирует после обработки гормоном [378]. К тому же все гепатоциты одинаково реагируют на гормон. Это
отличает данную модель от других гормониндуцируемых систем, где значительная клеточная пролиферация предшествует синтезу специфического
продукта в большом количестве. Особенно это относится к хорошо известной овальбуминовой системе, где экстенсивная клеточная пролиферация и
дифференцировка эпителиальной ткани после первичной стимуляции эстрогеном предшествует синтезу овальбумина.
4. Индукция синтеза вителлогенина происходит также и у самцов, которые в норме не продуцируют этот белок. Эстрадиол активирует гены, которые полностью «безмолвны» при нормальном развитии гепатоцитов самцов. Эта необычная особенность отсутствует у большинства других изученных гормониндуцируемых систем.
5. Гормональная индукция полностью обратима, то есть синтез вителлогенина прекращается после удаления гормона, в то время как гепатоциты
остаются способными к последующим индукциям.
6. Индукция эстрогеном синтеза вителлогенина может происходить в
органных культурах печени [262; 296]. Модель in vitro особенно удобна для
47
изучения раннего эффекта действия гормона, так как позволяет метить макромолекулы с высокой удельной активностью.
Местом синтеза большинства желточных белков у яйцекладущих позвоночных является печень. Белки желтка в основном происходят из вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП), синтез которых
начинается в печени самок по достижении ими репродуктивного периода.
Вителлогенез наиболее изучен у африканской шпорцевой лягушки ксенопуса
и у кур.
С наступлением яйценоскости печень курицы приобретает новую репродуктивную функцию без утраты предсуществующих. Эта дальнейшая
дифференцировка уже специализированной ткани находится под контролем
эстрогенов. Синтез вителлогенина может быть вызван также у самцов и неполовозрелых животных введением им эстрадиола. Этот феномен позволяет
изучать гормониндуцированную экспрессию до этого «молчащих» генов.
Действие эстрадиола на печень, приводящее к включению определенных генов, заключается в том, что эстрадиол в комплексе с цитоплазматическим
рецептором переносится на хроматин, где он и действует на генном уровне.
Печень цыпленка приобретает способность отвечать синтезом вителлогенина на введение гормона, начиная с 18–20 дня эмбриогенеза [378]. После
введения гормона в течение первых 48 часов отмечается увеличение массы
печени, содержания ДНК, РНК и печеночного белка в ней [52]. Печень приобретает бледный оттенок и «ожиревший» вид, клетки увеличиваются в объеме, гипертрофируется эндоплазматический ретикулум, увеличивается содержание мембранных компонентов, гипертрофируются ядрышки гепатоцитов [420]. Значительно увеличивается в печени общее содержание липидов,
особенно триглицеридов. После эстрогенизации цыплят и петухов, их печень
начинает секретировать не только вителлогенин, но и значительное количество липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП). У цыплят они представлены в основном двумя видами: ЛОНП I и ЛОНП II. Апопротеин ЛОНП
I представляет собой полипептидную цепь массой около 350000 дальтон
48
[637]. ЛОНП II представляет собой субъединицу белка массой 12000. После
синтеза и секреции ЛОНП I и ЛОНП II находится в крови в виде сложной
структуры с очень низкой плавучей плотностью, содержащей другие белки,
триглицериды, фосфолипиды и холестерин. Липиды составляют до 90% массы этого комплекса [267; 270; 637]. Также как и вителлогенин, эта сложная
структура поступает в желток и служит питанием для развивающегося эмбриона.
После индукции эстрадиолом в печени цыплят появляются полисомы,
синтезирующие вителлогенин, число которых в течение трех дней увеличивается линейно. На максимуме ответа вителлогениновые полисомы составляют 10% от общих и 17% от мембраносвязанных полисом [240]. Наряду с
вителлогениновыми имеются полисомы большего размера, которые, повидимому, синтезируют полипептид с массой значительно больше вителлогенина [537]. Индукция вителлогенина увеличивает содержание рибосом в
печени, содержание которых на максимуме ответа примерно в два раза превышает начальный уровень [443]. Увеличение содержания рибосом коррелирует с изменением активности ядрышковой РНК полимеразы, которая через
24 часа после эстрогенизации увеличивается в 2,5–4 раза [226; 233; 624]. После эстрогенизации изменяется рибонуклеазная активность в печени. Было
показано, что рибонуклеазная активность печени эстрогенизированных цыплят составляет 60% от контрольного уровня на четвертые сутки после эстрогенизации [624]. Такое падение активности рибонуклеаз связывают с появлением в печени эндогенного ингибитора рибонуклеаз, синтез которого также
индуцируется эстрадиолом. Использование п-хлормеркурибензоата показало,
что этот ингибитор содержит SH-группы, подобно ингибитору рибонуклеаз
печени крыс. Печень эстрогенизированных петухов содержит избыток ингибитора, который локализуется в растворимой фракции цитоплазмы, и добавление цитозольной фракции печени эстрогенизированных цыплят предотвращает распад РНК эндогенными нуклеазами в гомогенатах печени контрольных петухов. Следует отметить, что ингибитор из печени крыс в этих
49
условиях эффективен лишь частично; это показывает определенную степень
видовой специфичности ингибитора [297]. Изменение активности рибонуклеаз является важным фактором внутриклеточного метаболизма РНК. Снижение рибонуклеазной активности в цитоплазме приводит к увеличению
жизни полисом, и, следовательно, к увеличению эффективности использования тРНК, мРНК и рибосом при биосинтезе белка. Эстрогенизация приводит
также к изменению эндонуклеазной активности в ядрах печени. Было отмечено изменение отдельных стадий процессинга рибосом. Так, у неэстрогенизированных петухов пул 3,6×106 пре-рРНК составляет 25% от пула 1,9×106
пре-рРНК, а через 26 часов после эстрогенизации это значение составляет
40% [227].
Эстрогенизация вызывает изменения активности некоторых ферментов
липогенеза. После эстрогенизации неполовозрелых цыплят в их печени увеличивается активность АТФ-цитрат лиазы на 30%-40% и малатдегидрогеназы на 10–20%. Было также показано, что эстрадиол не влияет на активность
ферментов гликолиза, глюконеогенеза и метаболизма аминокислот. Эти результаты говорят о том, что индуцируемое эстрадиолом увеличение липогенеза в печени является результатом специфического действия, а не только
общего увеличения метаболизма в печени [509]. Эстрогенизация приводит к
изменению синтеза некоторых белков печенью петухов. Введение эстрадиола
снижает синтез сывороточного альбумина, что обусловлено уменьшением
содержания альбуминовой мРНК в печени. Если у контрольных петухов активность альбуминовой мРНК составляет 10% от общей матричной активности, то после эстрогенизации содержание ее падает и на 12 день составляет
5% [636].
Интерес представляют изменения в метаболизме транспортных РНК,
вызываемые эстрадиолом. Печень петухов обладает способностью деаминоацилировать определенную часть сериновых тРНК. После введения гормона
эта способность модифицируется и лишь очень небольшая часть сериновых
тРНК подвергается деаминоацилированию [335]. Отмечены изменения во
50
времени жизни некоторых видов сериновых тРНК. После эстрогенизации
время жизни сериновых тРНК с кодоном АГУ(Ц) увеличивается с 3,1 суток
до 6,2; а тРНК с кодоном УЦУ(Ц, А) не изменяется (2,6 суток). Деградация
тРНК, по-видимому, связана с частотой их использования при белковом синтезе. Изменения времени жизни тРНК помогают понять, каким образом популяция тРНК адаптируется к аминокислотному составу синтезируемого
белка [387]. Кроме того, изменения времени жизни отдельных тРНК может
играть регуляторную роль в синтезе белка на уровне трансляции. Возможно,
что более эффективное «использование» вителлогениновой мРНК на поздних
этапах эстрогенстимулированного вителлогенеза [238; 546] обусловлено
также адаптацией по составу пула тРНК к аминокислотному составу вителлогенина.
Все имеющиеся данные показывают, что индукция синтеза вителлогенина основывается на накоплении вителлогениновой мРНК в цитоплазме.
Это означает, что действие эстрадиола на печень является действием его на
ядра клеток печени; эстрадиол включает или ускоряет транскрипцию генов.
Первым подходом к изучению действия эстрадиола на транскрипционном
уровне было изучение активности ферментов, участвующих в синтезе РНК.
Активность ядрышковой РНК полимеразы, выделенной хроматографией на
ДЭАЭ-сефадексе из печени эстрогенизированных петухов на 26 часу после
введения эстрадиола, была в 4 раза выше, по сравнению с контролем [226].
Активность РНК полимераз I и II увеличивается довольно быстро после эстрогенизации. Так, уже через 1 час активность полимераз I и II увеличивалась
на 85% [576]. Ядра клеток печени, выделенные у эстрогенизированных цыплят в 2 раза активнее синтезируют РНК, причем α-аманитин ингибирует синтез на 50%. В этой же работе ядра клеток печени инкубировали в присутствии меченого ртутью УТФ, и вновь синтезированная РНК отделялась на колонке с сульфгидрил-сефарозой. Гибридизация с вителлогениновой кДНК
показала, что вителлогениновых мРНК-последовательностей в 10 раз больше
во вновь синтезированной РНК у эстрогенизированных цыплят по сравнению
51
с контрольными [505]. Усилению синтеза РНК предшествует появление в ядрах клеток печени эстрадиолового рецептора. Во многих работах было показано, что добавление эстрадиолового рецептора к хроматину увеличивает активность РНК полимераз [233; 574; 624]. Была показана положительная корреляция между активностью РНК-полимеразы I и содержанием эстрадиолового рецептора в ядрах клеток печени. Следует отметить, что для стимуляции
активности РНК-полимераз необходим некий белковый фактор, содержащийся в хроматине, т. к. добавление эстрадиолового рецептора к очищенной
ДНК эффекта стимуляции не дает [233]. Введение диэтилстильбэстрола, синтетического аналога эстрадиола, цыплятам приводит к значительному увеличению высокоспецифичных участков связывания эстрадиола в ядрах клеток
печени. Увеличение наблюдается через 1 час, на 4 часу достигает максимального значения (в 7 раз выше контроля), а к 48 часу опускается до уровня контроля [576]. Циклогексимид, ингибитор белкового синтеза на стадии трансляции, введенный за 90 минут до эстрадиола, ингибирует способность ядер
связывать эстрадиол. Ингибирование наблюдалось в течение 12 часов, но через 24–48 часов уровень связывания эстрадиола у цыплят, получавших циклогексимид, становился таким же, как у не получавших его. Задержка появления рецептора эстрадиола в ядрах сопровождалась задержкой появления
фосфопротеидов в крови [414]. Эти данные говорят о том, что появление эстрадиолового рецептора в ядре является необходимым условием экспрессии
вителлогенинового гена. Эстрадиоловый рецептор появляется в ядрах чрезвычайно быстро. В работе, где для изучения начальных стадий эстрадиоловой индукции вителлогенеза эстрадиол вводили в вену, было отмечено появление рецептора в ядрах уже через минуту после введения гормона, причем
его количество составляло 50% от максимального. Через 10 минут содержание рецептора в ядрах уже приближалось к максимальному значению [377].
Такое быстрое появление рецептора не означает только транслокацию рецептора из цитоплазмы в ядро, но, так как циклогексимид подавляет этот про-
52
цесс, свидетельствует об очень быстром синтезе рецептора или его субъединицы de novo.
Вышесказанное позволяет сделать заключение, что первым и необходимым условием ответа на введение эстрадиола является появление в ядрах
клеток эстрадиолового рецептора, который является пусковым механизмом
процессов, направленных на синтез вителлогенина.
Вителлогенин, характеристика и биологическая роль
Желточные белки куриного яйца фосвитин и липовителлин синтезируются печенью кур в виде одного общего предшественника, вителлогенина
[229]. В крови вителлогенин присутствует в виде димера с молекулярной
массой 450000–500000 дальтон [292]. Вителлогенин представляет собой гликофосфопротеид, фосфатные группы которого расположены в основном на
фосвитиновой части молекулы. Вителлогенин содержит 2,2% фосфора [228].
Кроме того, молекула вителлогенина связана с липидами. Таким образом, вителлогенин представляет собой липогликопротеид, и эта его особенность затрудняет точное определение молекулярной массы вителлогенинового мономера, поэтому имеется некоторое расхождение в данных, полученных ведущими группами ученых, изучающими вителлогенин: 200000 дальтон [207] и
240000 [326; 379; 380]. Фосвитины представляют собой белковые молекулы с
молекулярной массой 32000–35000 дальтон, содержащие 55% серина. Фосфатными группами представлено 30% молекулярной массы фосвитина. Он
содержит 80% вителлогенинового фосфора и совсем не содержит лейцина
[279]. Липовителлины представляют собой липогликопротеины с молекулярной массой от 30000 до 135000 дальтон. Так α-липовителлин состоит из трех
полипептидов с молекулярной массами 40000, 105000 и 135000, а
β-липовителлин из двух – 30000 и 135000 [229]. Липовителлин и фосвитин
происходит из вителлогенина. Этот липогликофосфопротеин транспортируется кровью из печени, где он синтезируется, в яичник, и захватывается растущими ооцитами, в которых эта длинная молекула специфически расщепляется [275; 493].
53
Расщепление вителлогенина в яичнике стимулируется низкими дозами
трипсина. По-видимому, участки специфической «нарезки» вителлогенина
столь доступны действию протеаз, что расщепление происходит преимущественно по ним. Однако нарезка трипсином не столь специфична, как энзимами яичника in vivo, так как кроме специфических связей атаке подвергаются и прочие пептидные связи [336]. О высокой чувствительности определенных участков молекулы вителлогенина к протезам, свидетельствует и тот
факт, что в печеночных экстрактах удавалось обнаружить липовителлин, а в
плазме крови он не обнаруживался [380]. По-видимому, в печеночных экстрактах авторам не удавалось предотвратить неспецифическое расщепление
вителлогенина печеночными протеазами. Еще одним свидетельством о вителлогениновом происхождении липовителлина является их иммунологическая идентичность. Антитела, выработанные против липовителлина, реагируют с вителлогенином [380; 381; 537; 609]. Из вышеизложенного следует
что, молекула вителлогенина является предшественником фосвитина и липовителлина, которые соединены в ней пептидной связью; и большая часть вителлогенина входит в состав своих конечных продуктов, при этом практически нет «отходов».
Ранее представлялось, что вителлогенин состоит из полипептидных
цепей только одного вида. Однако позже было сообщено, что есть, по крайней мере, два различных полипептида, как было показано анализом с ограниченным протеолизом [621]. Возможно, что у кур имеется не один ген вителлогенина, а, по меньшей мере, два. У ксенопуса, гетерогенность вителлогенина связана с четырьмя различными вителлогениновыми генами, и все они
экспрессируются во время гормональной индукции [268; 613; 633; 634].
Согласно имеющимся данным, в крови кур и эстрогенизированных петухов имеются два вителлогенина (I и II), которые различаются по антигенным
свойствам и пептидным картам после ограниченного протеолиза. По электрофоретической подвижности в системах с додецилсульфатом натрия они различаются
незначительно.
Их
внутриклеточные
предшественники
пре-
54
вителлогенин I и пре-вителлогенин II представляют собой гликозилированные, но не фосфорилированные полипептиды с молекулярной массой 200000 и
190000 дальтон соответственно, что определено по электрофоретической подвижности. Молекулярные массы вителлогенинов, определенные методом гельфильтрации в 7М гуанидинхлориде составляют 170 000–190 000 дальтон [622].
Это значение на 70000–80000 дальтон ниже определенного другими авторами
во многих работах [275; 292; 415; 621]. Такая большая разница объясняется
аномальной электрофоретической подвижностью сильно фосфорилированного
вителлогенина, что было показано в работе по дефосфорилированию его щелочной фосфатазой [622]. Электрофоретическая подвижность полипептида,
синтезированного в бесклеточной системе с высокоочищенной вителлогениновой мРНК, выше, чем у вителлогенина плазмы крови [207; 632], что можно
объяснить отсутствием посттрансляцонных модификаций: фосфорилирования
и гликозилирования. Тот факт, что в гепатоцитах фосфорилированный вителлогенин присутствует в очень ничтожных количествах, говорит о том, что по
окончании фосфорилирования он немедленно и быстро секретируется [622].
Таким образом, порядок стадий биосинтеза вителлогенина следующий: синтез
полипептида, гликозилирование, фосфорилирование, секреция.
Биологическая роль фосвитина и липовителлина заключается в том,
что они служат питанием для развивающегося эмбриона. Фосвитин является
хранилищем фосфора и некоторых связанных с ним ионов металлов [330;
599], а липовителлин источником аминокислот. Возможно, что объединение
фосвитина и липовителлина в одну молекулу является эволюционным решением для транспорта высокорастворимого фосвитина с использованием липовителлина как переносчика. Расщепление вителлогенина в яичниках может
быть необходимым условием для независимого их использования в процессе
эмбрионального развития [336].
55
Синтез вителлогенина и кинетика его индукции
Все основные сведения о синтезе вителлогенина и кинетики его индукции были получены в модельных опытах с использованием эстрогенизации
самцов или неполовозрелых особей ксенопуса и кур.
Вителлогенин не храниться в печени эстрогенизированных петухов в
течение измеримого периода времени, а сразу же секретируется в кровь [232;
622]. В синтезе вителлогенина принимают участие в равной мере все паренхимные клетки печени [609]. У петухов и неполовозрелых цыплят вителлогенин не поглощается яичниками, поэтому по содержанию его в крови можно
судить об интенсивности его синтеза. Более того, скорость синтеза вителлогенина можно установить из динамики его накопления, так как скорость его
выхода из крови подчиняется кинетике первого порядка с постоянной константой скорости в течение всего периода индукции. Время полужизни вителлогенина составляет 8,4 часа [228]. Динамика содержания вителлогенина
в крови эстрогенизированных петухов и неполовозрелых цыплят характеризуется максимумом на 4–5 сутки, и на 9–10 сутки содержание его падает до
нуля [228; 378; 443]. Относительно начального времени появление вителлогенина после эстрогенизации имеются некоторые противоречия. Так, наличие лаг периода отмечается во многих работах, однако, величина его для однократного и повторного введения гормона в одних работах определяется как
3 часа [228], а в других как 12 часов и 6 часов соответственно [378]. Причина
лаг-периода не связана с действием гормона на печень, так как активность
эстрадиолового рецептора проявляется уже через 6 минут [337]. Различия в
определении продолжительности лаг-периодов разными авторами повидимому обусловлены чувствительностью использованных ими методов
определения содержания вителлогенина.
Комбинацией радиоиммунопреципитации и электрофореза преципитата в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия было показано, что
существует базовый уровень синтеза, который составляет примерно 30 моле-
56
кул в минуту на клетку. На четвертый день после эстрогенизации уровень
синтеза составил 48000 молекул в минуту на клетку [379].
Для объяснения кинетики синтеза вителлогенина были сделаны три
предположения. Первое, эстрадиол увеличивает скорость элонгации растущей
цепи вителлогенина, за счет этого увеличивается и скорость инициации. Скорость элонгации может контролироваться некоторыми специфическими факторами, например потребностью в специальной тРНК [441]. Второе, гормон
увеличивает частоту инициации на одну молекулу вителлогениновой мРНК,
из чего следует увеличение размеров вителлогениновых полисом. Третье, число инициаций возрастает за счет увеличения числа вителлогениновых мРНК.
Скорость элонгации пропорциональна скорости синтеза вителлогенина, деленной на число рибосом занятых в синтезе вителлогенина. Эта скорость была
экспериментально определена [240] и составила примерно 7 аминокислот в
секунду, причем она оказалась постоянной на протяжении всего периода индукции. Полисомы, синтезирующие вителлогенин, содержат 30–40 рибосом
[537] в течение всего периода индукции. Анализируя эти данные [336] авторы
приходят к выводу, что эстрадиол регулирует синтез вителлогенина, контролируя концентрацию вителлогениновых мРНК в цитоплазме.
Сделанный вывод основан на данных, полученных при определении
вителлогениновых полисом и мРНК по трансляционной активности. Эти результаты не могли исключить возможность наличия вителлогениновой мРНК
в цитоплазме в неактивной для трансляции форме. Нельзя было исключить
возможности, что введение эстрадиола может привести к модификации
имеющейся мРНК, приводящей к ее активности.
Методическим подходом, позволившим проверить это предположение,
стала гибридизация комплементарной ДНК (кДНК), полученной в реакции
обратной транскрипции с предварительно выделенной вителлогениновой
информационной (мРНК), с цитоплазматическими РНК печени эстрогенизированных животных.
57
Вителлогениновая мРНК и регуляция синтеза вителлогенина
Многими исследованиями было показано, что после эстрогенизации
петухов и неполовозрелых цыплят в их печени появляется новая популяция
тяжелых полисом [381; 443; 474; 537], которая реагирует с антителами к вителлогенину. Появление вителлогенин-синтезирующих полисом ставит фундаментальный вопрос: или индукция синтеза вителлогенина является следствием накопления соответствующей мРНК, или трансляцией хранящейся ранее синтезированной мРНК. Для ответа на этот вопрос различные группы исследователей изучали содержание вителлогениновой мРНК трансляцией
in vitro в бесклеточных системах синтеза белка суммарной цитоплазматической мРНК. Полученные данные показали появление трансляционноактивной вителлогениновой мРНК в цитоплазме после эстрогенизации [474].
Была предложена схема индукции синтеза вителлогенина, согласно которой
происходит накопление в цитоплазме долгоживущей вителлогениновой
мРНК и ее многократная трансляция [336]. Выделение интактных полисом
синтезирующих вителлогенин, позволило экстрагировать из них вителлогениновую мРНК и исследовать ее свойства. Достаточная стабильность вителлогениновой мРНК, относительно большое содержание в печени эстрогенизированных животных и ее большие размеры (исходя из размеров вителлогенинового мономера, ее минимальная молекулярная масса должна быть
2,2×106 дальтон) облегчили ее выделение и очистку. Было показано, что вителлогениновая мРНК кур моноцистронна, содержит поли (А) последовательность на 3'-конце длиной в 220 нуклеотидов [380; 381], ее молекулярная
масса, определенная электрофорезом в 99% формамиде составила 2,4–
2,5×106 дальтон и она кодирует полипептид массой 220000 дальтон в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика. Константа седиментации ее 30S, а
молекулярная масса, определенная по длине контура в электронном микроскопе 2,5×106 дальтон [336]. У ксенопуса константа седиментации мРНК 28S.
Масса, определенная под электронным микроскопом 2,35×106, а по электрофоретической подвижности 2,0×106 дальтон [565].
58
С очищенной вителлогениновой мРНК в реакции обратной транскрипции приготовлялась кДНК [293; 294; 380; 381], которую использовали в экспериментах по гибридизации для определения содержания вителлогениновой
мРНК в печени эстрогенстимулированных животных. Хотя в большинстве
экспериментов молекула кДНК состояла из 300–2000 нуклеотидов и представляла в основном копию 3'-конца мРНК, она все же достаточно длинна
для специфического титрования вителлогениновой мРНК. Эксперименты на
ксенопусе и цыплятах показали, что вителлогениновая мРНК отсутствует у
не стимулированных особей. Однако из-за технических ограничений реакции
гибридизации нельзя исключать наличия 2–10 молекул мРНК на клетку.
Данные, полученные разными группами исследователей, показывают, что
ответ на введение гормона у цыплят более резкий и мРНК может быть замечена уже через 1–6 часов после стимуляции. Этот период у ксенопуса составил 4,5–12 часов. Другое различие заключается в том, что после однократной
стимуляции цыплят максимальное содержание мРНК наблюдается на 2–3
день и составляет 5000–7500 молекул на клетку, а у ксенопуса максимум наблюдается на 7–12 сутки и содержание мРНК составляет 25000–35000 молекул на клетку. Сравнение динамики накопления мРНК и увеличения синтеза
вителлогенина показало положительную корреляцию между этими величинами. Однако связь не строго линейна в течение всего периода индукции.
Так, было найдено, что между 3 и 7 сутками содержание вителлогениновой
мРНК ксенопуса увеличивается в два раза, а секреция вителлогенина в 5–10
раз. Это может означать, что вителлогениновая мРНК эффективнее транслируется в поздние сроки введения гормона [307; 547]. Эти данные подтверждаются в работе по изучению синтеза вителлогенина и накоплению мРНК у
уток, где также отмечено более эффективное использование мРНК в поздние
сроки индукции [238]. Одним из механизмов такой регуляции синтеза вителлогенина на трансляционном уровне может быть или потребность в специальной сериновой тРНК, или изменение скорости активации сериновых тРНК
[335; 387; 442].
59
Большой интерес представляет следующий факт. После первой инъекции эстрадиола, когда синтез вителлогенина прекращается и его содержание
в крови падает до нуля, повторная доза гормона вызывает более резкое нарастание его содержания в крови [228; 378], и максимальное значение концентрации вителлогенина в 2,5–3 раза превышает максимальную концентрацию после первичной индукции [443]. Этот, так называемый «эффект памяти», наблюдается в течение 35 дней после прекращения первичного ответа.
Ранее для объяснения этого явления предполагали, что после первичной стимуляции в цитоплазме остаются значительные количества мРНК в неактивной для трансляции форме. Но многие независимые исследования показали,
что этого не наблюдается. Для ксенопуса было показано, что через 40 суток
после первичной стимуляции в цитоплазме нет значимого количества вителлогениновой мРНК. Однако повторная стимуляция приводит к более резкому
накоплению вителлогениновой мРНК по сравнению с первичной [546]. В печени цыплят после первичной или вторичной стимуляции вителлогениновая
мРНК начинает накапливаться через 30 минут, достигая максимума на 3 сутки и с этого момента начинает разрушаться с периодом полураспада в 30 часов. В течение первичной индукции накопление вителлогениновой мРНК начинается с низкого уровня (50 нуклеотидов/сек/на клетку) и через 4 часа достигает высокого уровня (340 нуклеотидов/сек/ клетку). Во время вторичной
индукции накопление вителлогениновой мРНК начинается с 350 нукл/сек/кл.
и впоследствии увеличивается еще на 40%. Такая скорость накопления приводит к максимальному содержанию, которое в 1,5 раза превышает содержание мРНК после первичного ответа. Этого различия достаточно для объяснения более высокого содержания вителлогенина в плазме крови после вторичной гормональной стимуляции [293]. Гибридизация с вителлогениновой
кДНК была использована для характеристики предшественника вителлогениновой мРНК. В этой работе крупные молекулы общей клеточной РНК
фракционировали в сильно денатурирующих условиях (градиент плотности
на 85% формамиде). Фракции гибридизовали с вителлогениновой кДНК. Бы-
60
ло показано, что кроме зрелой вителлогениновой мРНК (32S, 7000 нуклеотидов) комплементарные последовательности были найдены в диапазоне 28–
50S с максимумом 45–50S (12000–15000 нуклеотидов). Только 5–10% от всей
38–50S РНК полиаденилированы. Авторы вычислили, что время полужизни
вителлогениновой пре-мРНК составляет 3–4 минуты [382].
Рибосомы, строение и функция
В реализации генетической информации центральную роль играют рибосомы, поскольку они осуществляют перевод заложенной в генах информации в аминокислотные последовательности синтезируемых белков. Рибосомы являются органеллами, которые присутствуют во всех живых клетках.
Впервые рибосомы наблюдали в цитоплазме и на поверхности мембран эндоплазматической сети. Впоследствии, в опытах с бесклеточными системами
синтеза белка было показано, что эти рибонуклеопротеидные частицы являются местом включения меченых аминокислот.
Химически рибосома представляет собой рибонуклеопротеид, состоящий из специальной рибосомной РНК и специальных рибосомных белков,
находящихся в комплексе друг с другом. Физически – это компактная частица специфической формы, лишенная внутренней и внешней симметрии, грубо аппроксимируемая сферой с диаметром около 30 нм.
Функционально рибосома – молекулярная машина, протягивающая
вдоль себя цепь мРНК, считывающая закодированную в мРНК генетическую
информацию и параллельно, в соответствии с кодом, синтезирующая полипептидную цепь белка из поступающих в нее аминокислотных остатков.
Электронно-микроскопические изображения рибосом показывает, что
они состоят из двух субъединиц: большей и меньшей. Действительно, если в
среде, окружающей рибосомы, понизить концентрацию ионов магния или
каким-либо еще способом увеличить электростатическое отталкивание фосфатных групп рибосомной РНК, то рибосомная частица диссоциирует на две
неравные субчастицы с соотношением их масс около 2:1 (рис. 1).
61
Малая субъединица
Большая субъединица
Рисунок 1. Структура рибосомы (цит. www.sinauer.com;
(www.whfreeman.com)
В природе имеется два основных класса рибосом: рибосомы с константой седиментации 70S у прокариотов и рибосомы с константой седиментации
80S у эукариотов. Между ними имеются значительные различия, причем как
в рибосомных РНК, так и в белковой компоненте. 70S рибосомы прокариотов
имеют массу примерно 2,8×106 дальтон; 80S рибосомы эукариотов крупнее,
масса их 4,0×106 дальтон. Рибосомы прокариотов состоят из частиц с константами седиментации 30S и 50S; у эукариотов соответственно 40S и 60S.
Меньшая частица рибосом прокариотов состоит из одной молекулы РНК с
константой седиментации 16S, массой 0,6×106 дальтон, длиной в 1600 нуклеотидов и 21 молекулы белка. Большая частица рибосом прокариотов содержит две молекулы РНК: 23S и 5S, длиной в 3200 и 120 нуклеотидов, и 34
молекулы белка. У эукариотов меньшая рибосомная частица имеет в своем
составе одну молекулу РНК с константой седиментации 17–18S, длиной
примерно 2000 нуклеотидов и 30 молекул белка. Большая рибосомная частица эукариотов состоит их трех молекул РНК (25–28S; 5,8S и 5S, длиной в
4000–5000; 158 и 120 нуклеотидов соответственно) и 40 молекул белка. Рибосомы эукариотов в среднем содержат равные количества РНК и белка. У
62
прокариотов содержание РНК составляет примерно 65%. Для клеток печени
высших эукариотов характерно следующее распределение РНК: около 11%
приходится на ядро (в основном это мРНК), около 15% – на митохондрии
(рРНК и тРНК), свыше 50% – на цитоплазматические рибосомы (в основном
рРНК) и около 24% – на цитозоль (в основном тРНК). [92; 149; 167].
На структурном уровне между рибосомами прокариотических и эукариотических микроорганизмов существует гораздо больше отличий, чем между рибосомами сильно дивергировавшихся в ходе эволюции эукариотов. В
чем причина этих отличий и почему они закрепились в ходе эволюции, не
совсем ясно, так как молекулярные механизмы синтеза белка у прокариотов
и эукариотов практически одинаковы. Примечательно, что размер РНК
меньшей субъединицы рибосом эукариотов (0,7×106) остается практически
постоянным в эволюции, а РНК большей частицы варьирует в небольших
пределах, от 1,3×106 у дрожжей и растений до 1,7×106 у млекопитающих
[151; 167]. Когда впервые было выяснено, что рибосомы играют важную роль
в синтезе белка, предполагалось, что рибосомная РНК служит матрицей. И
только в 1960 году было однозначно показано, что рибосомная РНК матричными свойствами не обладает. Матричную функцию выполняет особая РНК
(мРНК), на долю которой приходится не более нескольких процентов от общего содержания РНК в клетке [167]. Все молекулы РНК представляют собой цепи с неодинаковым числом оснований способных спариваться друг с
другом, образуя двухцепочечные шпильки. В частности для большей рибосомной РНК (28S рРНК) точно установлено наличие нескольких последовательностей в 100–500 нуклеотидов, содержащих до 78% гуанина (Г) + цитозина (Ц), и образующих характерные двухцепочечные петли [340]. Эти богатые Г+Ц участки представляются более поздним приобретением эволюции,
поскольку они лучше выражены в рРНК животных. Физические исследования пространственного распределения РНК и белка в рибосомных субчастицах, проведенные с помощью рассеяния нейтронов, показали, что рибосомная РНК концентрируется в основном ближе к центру частиц, тогда как масса
63
рибосомных белков занимает в среднем более периферическое положение.
Из этого делается вывод, что свернутая молекула высокополимерной рибосомной РНК – это структурное ядро рибосомной субчастицы, определяющее
и ее компактность, и ее форму, и организацию на ней рибосомных белков.
Можно сказать, что молекулы рибосомных РНК служат каркасом для сборки
рибосомных субчастиц, так как имеют определенную трехмерную структуру
и участки для специфического связывания рибосомных белков, что способствует образованию совершенно определенной трехмерной конфигурации
рибосомы.
Главная функция рибосом заключается в том, чтобы правильно ориентировать поступающие аминоацилтранспортные РНК (АА-тРНК) относительно матричных РНК и таким образом обеспечивать точное считывание
генетического кода. На поверхности рибосом имеются особые участки, связывающие надлежащим образом мРНК, АА-тРНК и растущую полипептидную цепь. Матричные РНК прокариотов имеют один или несколько участков
связывания; у эукариотов только один. В пределах каждого такого участка
связывания имеются нуклеотидные последовательности, единственная функция которых заключается в том, чтобы обеспечить правильное расположение
молекул мРНК на поверхности рибосом перед началом синтеза белка. Стадия
инициации синтеза белка начинается с образования комплекса между меньшей субъединицей рибосомы, мРНК и формилметионин-тРНК (у эукариотов
метионин-тРНК не формилируется). Затем к этому комплексу присоединяется большая субъединица и образуется функционально активная рибосома. В
процессе присоединения АА-тРНК и роста полипептидной цепи (фермент
осуществляющий образование пептидной связи является неотъемлемой составной частью большей субъединицы) молекула мРНК движется относительно рибосомы, и ее освободившийся участок связывания может присоединить следующую рибосому и так далее. Таким образом, образуются полирибосомы или полисомы – структуры, состоящие из нескольких рибосом,
«нанизанных» на молекулу мРНК (рис. 2). Количество рибосом в полисоме
64
зависит от длины мРНК. При этом каждая рибосома участвует в синтезе одной полипептидной цепи, по завершению ее отделяется от мРНК и распадается на субъединицы, которые затем опять могут участвовать в инициации
белкового синтеза [136; 137; 167].
Рисунок 2. Рибосомы и полирибосомы клеток печени
(цит. www.DennisKunkel.com)
Рибосомные гены эукариотов
Поскольку рибосомные РНК выполняют при биосинтезе белка совершенно особую роль, существовало предположение, что молекулы рРНК не
синтезируются на матрицах ДНК, а подобно одноцепочным вирусным РНК
обладают способностью к самовоспроизведению. Опыты по молекулярной
гибридизации рибосомных РНК и ДНК не подтвердили это предположение.
Особый интерес вызывает тот факт, что хотя рРНК и тРНК составляют в
сумме около 98% всей РНК клетки, для синтеза их используется в качестве
матриц менее одного процента всей клеточной ДНК. Гены, кодирующие
65
рРНК у эукариотов, организованы в виде кластеров содержащих сотни и даже тысячи копий. В частности, участок генома дрожжей, кодирующих рРНК,
состоит более чем из сотни тандемно повторяющихся единиц, разделенных
нетранскрибируемой спейсерной последовательностью. Каждая повторяющаяся единица кодирует большой предшественник рРНК (пре-рРНК), содержащий последовательности 18S, 5,8S и 28S рибосомных РНК, а также последовательности не входящие в дальнейшем в состав рибосомных РНК, которые деградируют в процессе созревания рибосом [289; 301]. Примечательно,
что 5S РНК синтезируется независимо. У большинства эукариотов ген 5S
РНК не связан с рибосомными генами и имеет различную хромосомную локализацию, однако у дрожжей он физически связан с рибосомными генами,
то есть его копии расположены на тех же участках хромосом, что и рибосомные гены. Но и в этом случае 5S ген транскрибируется РНК полимеразой III,
тогда как транскрипция рибосомных генов осуществляется РНК полимеразой I [528; 544]. Гены всех рибосомных РНК в геноме эукариотов в значительной степени повторены. Структура рибосомных РНК чрезвычайно стабильна в эволюционном плане, однако она все же претерпела определенную
эволюцию. Изменялась также степень множественности генов в геноме организмов. В настоящее время лишь у микоплазм рибосомный цистрон содержится в одном экземпляре на геном, у остальных организмов имеются множественные копии рибосомных генов, число которых на гаплоидный геном
изменяется от 4–6 у кишечной палочки до сотен тысяч у растений [151]. В течение жизненного цикла организмов, стоящих на разных эволюционных ступенях, происходит избирательное изменение числа рибосомных генов, не
связанное с изменением числа других генов. Это явление получило название
амплификации или в некоторых случаях, магнификации. Амплификация, то
есть многократное, даже тысячекратное, увеличение содержания рибосомных
генов (рДНК) на ядро с образованием экстрахромосомных копий, наблюдается в ооцитах. Магнификацией называется наследуемое увеличение рДНК у
мутантов с дефицитом по этому гену. Селективное увеличение генов (рДНК)
66
было показано для ооцитов амфибий [251] (Brown D. Igor B., 1968), зародышей пшеницы [272], у дрозофилы [531]. Амплификация специфического гена
рассматривается многими исследователями как механизм, позволяющий достигать очень высоких скоростей белкового синтеза в определенные критические стадии развития. То, что количество рибосомных генов может быть
ключевым фактором ограничения функционирования организмов, показано
на мутантах, дефицитных по рДНК. Например, дефицитный по рибосомным
генам мутант дрозофилы, называемый «bobbed», имеет пониженную жизнеспособность, низкую плодовитость, низкую скорость роста и развития, укороченное время жизни и много анатомических дефектов [334; 532]. Время
жизни этих мутантов снижается как функция от степени недостатка этих генов [590]. У некоторых высших эукариотов были также обнаружены мутации
с недостатком рибосомных генов. У африканской шпорцевой лягушки ксенопуса получены индивиды, которые имеют только 35% рДНК от нормального диплоидного генома. Скорость синтеза рДНК у таких мутантов снижена
в два раза по сравнению с нормальной [463]. Такое снижение приводит к тому, что эти мутанты погибают до завершения ранних стадий развития.
Снижение числа рибосомных генов было показано для постмитотических тканей стареющих организмов. При исследовании числа рибосомных
генов в возрастном аспекте гибридизацией меченой радиоизотопом рРНК с
ДНК печени и мозга собаки, селезенки, мозга, миокарда и скелетных мышц
козы было показано, что снижение дозы ДНК гибридизуемой с рРНК наблюдается только в постмитотических тканях – миокарде, скелетных мышцах,
мозге [375]. Для человеческого миокарда скорость снижения гибридизуемой
рДНК составила 0,5% в год, мозга – 0,9% [374; 590; 591]. Приведенные данные указывают, что в процессе онтогенеза, старения, происходит снижение
содержания этих ключевых генов или гибридизуемости рДНК в постмитотических тканях долгоживущих млекопитающих.
67
Биогенез рибосом
Рибосомы эукариотических клеток состоят из четырех видов рибосомных РНК: 5S, 5,8S, 17–18S, 25–28S, а также из 70 различных белков. Поэтому
образование рибосом является очень сложным процессом, для которого необходимо: синхронная продукция всех рибосомных составных элементов и
координированная экспрессия большого числа различных генов; сборка всех
компонентов в так называемые прерибосомные частицы в определенной последовательности; дальнейший строго контролируемый процессинг прерибосомных частиц в зрелые рибосомные субъединицы.
Первые экспериментальные свидетельства об определенной локализации рибосомных генов были получены при разрушении ядрышка клетки Hela
микролучом ультрафиолетового света [511]. Другим свидетельством было
отсутствие синтеза рРНК у зародышей ксенопуса, гомозиготных по безъядрышковой мутации [250]. Эта мутация связана с полной делецией рДНК
[463]. Однако прямые доказательства о локализации рДНК и месте синтеза
рибосом были получены при использовании гибридизации высокомеченной
рРНК непосредственно на препаратах ядер [318] и окрашивании последних
серебром [349; 350; 361]. Было показано, что серебром окрашиваются только
активные ядрышки и степень окрашивания зависит от функциональной активности ядрышек [357]. Значительно меньше известно о генах, кодирующих
рибосомные белки у эукариот. Получены доказательства, что дрожжевые
мРНК для рибосомных белков транскрибируются с транскрипционной единицы, которая в 12 раз длиннее, чем можно было предполагать [444]. Возможно, что гены рибосомных белков, как и гены рРНК образуют кластерные
структуры. Такая генетическая организация генов рибосомных белков может
объяснить строгую координированность синтеза рибосомных белков, как это
было показано, по меньшей мере, для сорока белков мутантных дрожжей, неспособных синтезировать рибосомы при повышенной температуре [329]. Подобная кластерная организация известна не только для генов рРНК и тРНК.
Известны повторяющиеся гены с конечным белковым продуктом, например,
68
гены гистонов [284; 393]. Большой размер генома эукариот обусловлен тем,
что некоторые гены встречаются в геноме много раз, а также наличием в нем
множества повторяющихся последовательностей ДНК с до конца не ясными
функциями. На их долю приходится обычно 10%, а в некоторых случаях до
50% генома. Свой вклад в «избыточную» ДНК вносят также нефункциональные копии генов, так называемые «псевдогены» [137].
Биогенез рибосом у эукариот начинается с транскрипции генов рРНК
высокоселективной РНК полимеразой I. Этот большой транскрипт содержит
последовательности для 18S, 5,8S и 28S рРНК, а также значительные участки
траскрибируемого спейсерного материала, которые элиминируются в процессе созревания этого предшественника (пре-рРНК) [290]. У клеток HeLa
эта молекула содержит 13000 нуклеотидов и имеет константу седиментации
45S. Длина предшественника варьирует у разных видов эукариотов в основном за счет длины транскрибируемого спейсера и, в меньшей мере за счет
длины большей рРНК (25–28S). Для простоты термин 45S РНК применяется
для обозначения первичного траскрипта у всех эукариотов. Поскольку у всех
изученных эукариотов имеется пул 45S пре-рРНК, следует, что образование
рибосомы может начаться только после полного завершения транскрипции и
образования молекулы 45S РНК с правильной структурой. Более того, точно
установлено, что растущая пре-рРНК связывается с белками [464]. Таким образом, наличие дискретного рибонуклеопротеинового комплекса (пре-рРНК)
является важной начальной стадией биогенеза рибосом.
Применение электронного микроскопа для прямого наблюдения вторичной структуры пре-рРНК и рРНК [628], явилось важным инструментом
для изучения структурной организации молекулы пре-рРНК. Было показано,
что большая и меньшая молекулы рРНК в составе предшественника разделены внутренним транскрибируемым спейсером, а относительно большой
внешний транскрибируемый спейсер находится на 5'-конце. Этот принцип
организации является общим для всех эукариотов, хотя внешний транскрибируемый спейсер у некоторых низших эукариотов отсутствует [341]. Транс-
69
крипция начинается с промотора, расположенного на внешнем транскрибируемом спейсере и заканчивается на участке, соответствующем 3'-концу 28S
рРНК. Особенностью молекулы пре-рРНК является их характерная первичная и вторичная структура. Участки 28S и 18S рРНК в предшественнике полностью структурированы уже на ранних стадиях биогенеза и в дальнейшем
подвергаются лишь незначительным модификациям при процессинге. Последовательности рРНК в предшественнике претерпевают интенсивное посттрансктипционное метилирование и псевдоуридилирование, которое завершается на стадии пре-рРНК. Так, для клеток HeLa, из 116 метильных
групп предшественника, 110 групп найдены в специфических местах 18S и
28S рРНК [440]. Двухцепочечные богатые гуанином и цитозином петли, которые находятся в пре-рРНК в процессинге не изменяются и входят в состав
зрелых рРНК.
Сложный механизм процессинга рибосом может быть разделен на три
основные стадии: начальный разрыв цепи молекулы 45S пре-рРНК в таком
месте, чтобы убрать внешний транскрибируемый спейсер; внутренний разрыв, приводящий к образованию двух молекул пре-28S рРНК и пре-18S РНК;
конечная «отделка» промежуточного пре-рРНК, приводящая к зрелым молекулам рРНК. На третьей стадии образуется 5,8S РНК, которая остается связанной водородными связями с 28S рРНК в составе большей субъединицы
рибосом. В частности, существует предположение, что поскольку внешний
транскрибируемый спейсер находится на 5'-конце 45S РНК, возможен начальный разрыв еще до окончания транскрипции, что, наверное, имеет место
у некоторых низших эукариотов [341]. Специфическая нарезка молекул предшественника требует точного узнавания эндонуклеазой по меньшей мере пяти из нескольких тысяч фосфодиэфирных связей. Это говорит о том, что в
молекуле предшественника имеются специфические маркерные участки, служащие для точной локализации эндонуклеазной атаки. Исследование терминальных нуклеотидов в зрелых 28S и 18S рРНК показало, что у разных организмов в этой позиции находятся одни и те же нуклеотиды [341]. Предпола-
70
гается, что метилирование и псевдоуридилирование нуклеотидов в специфических местах вдоль цепи пре-рРНК служит для обозначения маркерных сайтов (участков). Около 80% метильных групп в молекуле пре-рРНК связаны с
рибозой в 2`-0- положении и, следовательно, защищают фосфодиэфирные
связи от эндонуклеазной атаки. Маркерами могут служить и высокоспирализованные и богатые Г+Ц участки молекулы предшественника. Возможность
образования 16S и 23S молекул из пре-рРНК E. coli при воздействии на него
рибонуклеазы III показало, что селективность эндонуклеазной атаки определяется первичной и вторичной структурой пре-рРНК. Но попытки процессинга in vitro депротеинизированной эукариорической пре-рРНК успеха не
имели. Некоторые авторы полагают, что в образовании маркерных сайтов
для эндонуклеазы участвуют белки первичной пре-рРНК частицы. Это подтверждается наблюдениями, что различные рибосомные белки добавляются в
процессе биогенеза рибосомы [400].
В клетках млекопитающих разных видов было показано, что скорость
продукции рибосом тесно связана со скоростью роста [433; 489]. Среди регулирующих биогенез рибосом факторов наиболее предпочтительными представлялись белковый синтез [577; 635] и метилирование пре-рРНК [625]. Было показано, что в клетках, не получающих метионин, происходит блок синтеза рибосом [606], хотя 45S предшественник продолжает синтезироваться.
Однако подавление синтеза рибосом, полученное в этой работе, может быть
отнесено не за счет недометилирования пре-рРНК, а за счет подавления синтеза белка из-за недостатка метионина. Позднее [255] в работе с циклолейцином, специфическим и обратимым ингибитором метилирования нуклеиновых
кислот, было показано, что нет прочной связи между метилированием и
транскрипцией. Во время интенсивного (95%) блока метилирования синтез
45S предшественника продолжается почти с прежней скоростью. Недометилированная пре-рРНК подвергается точно такому же процессингу, как и в
контроле. Однако было отмечено значительное влияние недометилирования
на последней стадии созревания рибосом. Выход 28S РНК в цитоплазму зна-
71
чительно замедляется (85–90% ингибирования). Нормальный уровень метилирования пре-рРНК представляется не строго необходимым для полного созревания рРНК. Существует точка зрения, что контроль биогенеза рибосом у
прокариотов осуществляется на стадии транскрипции, а у эукариотов главные контролируемые стадии биогенеза рибосом посттранскрипционные
[341]. Эксперименты на различных эукариотах с ингибиторами белкового
синтеза циклогексимидом и пуромицином показали, что ингибирование белкового синтеза блокирует образование зрелых рибосом, в то время, как транскрипция 45S РНК практически не меняется [325; 589]. Однако существенно изменяется при этом последовательность отдельных этапов процессинга и
содержание различных промежуточных продуктов. Так в результате действия циклогексимида снижается образование 18S и 28S рРНК, а также наблюдается блокирование образования 41S и 21S пре-рРНК. Хотя образование 36S
и 32S пре-рРНК происходит с нормальной скоростью в присутствии циклогексимида, их превращение в ядрышковую 28S рРНК замедляются. [589].
Полученные данные о влиянии ингибиторов биосинтеза белка на биогенез
рибосом подтверждают вывод, что для нормального процессинга пре-рРНК
необходимо постоянное поступление одного или нескольких белков. Этими
белками могут быть рибосомные белки, модифицирующие пре-рРНК. Ограниченная доставка одного или нескольких белков может препятствовать правильному процессу созревания и приводить к деградации или избыточному
количеству промежуточных пре-рРНК частиц. Тогда как начальные стадии
процессинга характеризуются большой гибкостью. Изменение структуры
пре-рРНК включением in vivo 5-фтороротата или тойокамицина не влияет на
транскрипцию и начальный процессинг, в то же время образование зрелых
рибосом полностью останавливалось [627]. Блокирование именно последних
стадий созревания рибосом характерно и для действия ингибиторов белкового синтеза – циклогексимида и пуромицина [341].
Большой вклад в изучение молекулярных механизмов трансляции,
структуры белоксинтезирующего аппарата клетки и прежде всего его основ-
72
ного компонента – рибосомы внесли отечественные исследователи в 80-х годах XX века. Была исследована топография функциональных центров в рибосоме [189; 205], локализация факторов элонгации на рибосомах [28]. Изучены крупноблочные изменения рибосомы при транслокации, непосредственные РНК-белковые взаимодействия в рибосомных комплексах [1; 72; 93;
132]. Показано, что скорость элонгации у эукариотов может зависеть от активности рибосом, особенностей структуры мРНК и ассоциированных с ней
белков информосом, концентрации разных тРНК, а также активности факторов элонгации и аминоацил-тРНК-синтетаз [107].
Итак, рибосомы играют важную роль в экспрессии генов. Они являются тем механизмом клетки, который осуществляет перевод информации, закодированной последовательностью нуклеотидов матричных РНК в последовательность аминокислот белковой молекулы. Структурную основу рибосом
составляют РНК. Размер и вторичная структура рибосомных РНК несмотря
на высокую стабильность, претерпели в ходе эволюции определенные изменения. Изменялась в ходе эволюции и степень множественности рибосомных
генов. У эукариотов рибосомные гены в геноме образуют блоки с тандемной
структурой. Принципиальным отличием рибосомных генов является то, что
их число может сильно варьировать как в филогенезе, так и онтогенезе. Число рибосомных генов определяет скорость синтеза рРНК, то есть определяет
потенциальный уровень содержания рибосом в клетке. Количество рибосом в
клетке определяет потенциальный уровень белкового синтеза и, в свою очередь, зависит от белкового синтеза.
1.3. Роль митохондрий в становлении вителлогенной функции
печени у кур
Становление вителлогенной функции печени при половом созревании
кур или эстрогениндуцированном вителлогенезе у цыплят сопряжено с началом синтеза компонентов яичного желтка. С каждым желтком при снесении
яйца из организма курицы выделяется около шести граммов липидов и трех
граммов протеина. Столь значительное усиление биосинтеза в печени обу-
73
славливает увеличение энерготрат и должно быть интегрировано с биогенезом и увеличением функциональной активности митохондрий, органелл эукариотических клеток, осуществляющих аэробное дыхание клетки и синтез
аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) – основной энергетической единицы
практически любого живого организма [141; 186].
Показано, что регуляция энергетического обмена в митохондриях печени кур влияет на их продуктивность [170], установлены изменения цитохромоксидазной и фосфорилирующей активности печени в зависимости от
содержания витаминов в рационе, определены дозы витаминов, стимулирующие энергетический обмен [171; 174]. В данном контексте представлялось важным определение взаимосвязи и соотношения между активностью
процессов становления вителлогенной функции печени и основными биоэнергетическими функциями митохондрий на модели индуцированного эстрогеном вителлогенеза у цыплят.
Митохондрии – строение и функции
С тех пор, как интактные митохондрии были выделены из клеток [358]
и получены первые электронно-микроскопические фотографии их структуры
[570], накопились данные о морфологии и функциональной специфике митохондрий.
Известно, что их число относительно постоянно для данного типа клеток, но число это может значительно меняться в зависимости от её функционального состояния [237; 252]. Размер и форма митохондрий могут широко
варьировать в разных клетках, а также в зависимости от метаболического состояния клетки. Показано также, что существует определенные различия в
строении митохондрий клеток печени, почек, мозга, мышц и других тканей.
Эти различия касаются расположения и количества крист, формы крист и
матрикса, формы и размеров митохондрий [134]. Все это свидетельствует об
определенной тканевой специфичности митохондрий. Однако в одной и той
же ткани встречаются митохондрии различного размера и строения [11; 131;
134; 147; 164]. Гетерогенность митохондрий ткани была продемонстрирована
74
в работах с выделением различных субфракций митохондрий. Так, в сердце
кролика обнаружено несколько субфракций митохондрий, которые отличаются по ультраструктуре и свойствам [101; 102]. Из тканей мозга выделено
60 субфракций митохондрий, отличающихся по размеру. Гетерогенность митохондрий показана для клеток слизистой оболочки кишечника, которые отличаются высокой скоростью пролиферации [234]. Электронно-микроскопические наблюдения ультраструктур клеток млекопитающих позволяют
считать образование митохондрий из плотных, сильно осмированных телец.
Плотные тельца, размером 0,2 мкМ, вначале не имеют какой-либо дифференцированной внутренней структуры, затем они несколько увеличиваются в
размерах, а их плотное содержимое расслаивается, образуя пачку плотно
прилежащих мембран. В дальнейшем это тельце увеличивается в размерах,
расстояние между внутренними мембранами расширяется, плотность матрикса увеличивается, все образование приобретает вид мелкой митохондрии
[100].
Исследования по перераспределению меченой in vivo ДНК по фракциям митохондрий энтероцитов слизистой тонкого кишечника крыс позволили
авторам сделать вывод о том, что наблюдаемая гетерогенность митохондрий
связана с биогенезом, и «тяжелые», «средние» и «легкие» митохондрии находятся на разных этапах жизненного цикла [2]. Исследование дыхательной
активности их митохондрий показало, что имеются четкие различия по скорости потребления кислорода, по величине дыхательного контроля и отношения АДФ/0 между «тяжелыми», «средними» и «легкими» митохондриями
[3]. Обнаружена также гетерогенность популяции митохондрий, выделенных
из печени [596]. И таких работ много. В частности, А. Сатев и другие [556]
выделили из печени митохондрии, которые они обозначали как «легкие»,
«тяжелые» и «пенистые». Авторы показали, что ДНК всех фракций не различаются по количеству и плотности. РНК содержится в «легкой» фракции в
три раза больше, чем в «тяжелой». Биосинтез белка интенсивнее происходит
в «легкой» фракции. Фракции различаются по ультраструктуре. В «тяжелых»
75
митохондриях хорошо развиты кристы. В «легких» митохондриях крист мало. «Пенистые» митохондрии состоят из хорошо развитых, но деградирующих митохондрий. Авторы считают, что «легкие» митохондрии являются
предшественниками «тяжелых». По-видимому, гетерогенность митохондрий
обусловлена их биогенезом – образованием, увеличением их числа, усложнением организации и специализацией. Качественные изменения митохондрий
могут происходить при их деградации и апоптозе [129; 130; 164]. Проблема
биогенеза митохондрий привлекала к себе и продолжает притягивать большое число исследователей [10; 434; 571; 572].
Обычно митохондрии имеют удлиненную или сферическую форму,
однако, их форма и объем могут претерпевать быстрые и резкие изменения.
Часто они агрегируют, соединяясь концами и образуя длинные нитевидные
структуры. Средний размер митохондрий в клетках печени равен 3×0,5/1,0
мкм; эндокринных клеток поджелудочной железы – около 10 мкм; летательной мышцы стрекоз – 8×8 мкм [91]. Методом прямого измерения размеров
митохондрий в растворах было показано, что средний диаметр митохондрий
печени равен 0,93 мкм, средний объем одной митохондрии составляет
0,42 мкм3, коры почек – 0,23 мкм3 [321].
Хондриом клетки (совокупность митохондрий) может иметь различную композицию в зависимости от энергетических потребностей клетки.
Чаще всего он представлен множеством разрозненных небольших митохондрий, функционирующих независимо друг от друга и снабжающих АТФ небольшие участки цитоплазмы. В других случаях длинные и разветвленные
митохондрии могут обеспечивать энергией отдаленные друг от друга участки
клетки. Как, например хондриом типа митохондриального ретикулума, который встречается как у одноклеточных, так и у многоклеточных организмов.
Особенно сложно этот тип хондриома выражен в скелетных мышцах, где
группы гигантских разветвленных митохондрий связаны друг с другом с помощью специальных межмитохондриальных контактов (ММК). Наличие
ММК характерно для хондриомов сократимых структур. Особенно обильно
76
они представлены в клетках сердечных мышц, где они функционально связывают множественные отдельные митохондрии в единую разветвленную
цепь [186; 517].
Несмотря на то, что количество и морфология митохондрий в клетках
различны, все они имеют четыре основных компонента: наружную и внутреннею мембраны, межмембранное пространство и матрикс (рис. 3).
Молекулы
АТФ-синтетазы
Межмембранное
пространство
Матрикс
Кристы
Рибосомы
Гранулы
ДНК
Мембрана внутренняя
Мембрана наружная
Рисунок 3. Структура митохондрии (цит. www.sinauer.com;
www.whfreeman.com)
Внутренняя мембрана имеет форму мешка и разделяет пространство,
ограниченное внешней мембраной на два отсека, так, что один оказывается
внутри другого. Наружная мембрана сохраняет свою форму при физиологическом изменении осмотического давления; внутренняя – западает, образуя
кристы, и изменяет свою форму в соответствии с изменением осмотического
давления. Толщина наружной мембраны составляет приблизительно 70 ангстрем. Наружная мембрана проницаема для всех молекул с молекулярной
массой до 10000 дальтон. Внутренняя мембрана обладает избирательной
проницаемостью, исключая молекулы с молекулярной массой до 150 дальтон. Активный транспорт молекул, включая двухвалентные катионы [562]
аминокислоты и жирные кислоты [405; 406; 471; 506] локализован на внут-
77
ренней мембране. Транспорт белков осуществляется в комплексе с фосфолипидами [384] и это очень важный процесс, так как множество функциональных белков внутренней мембраны митохондрий и матрикса синтезируются
на рибосомах цитоплазмы и транспортируются через митохондриальные
мембраны. Внутренняя мембрана митохондрий формируется структурными и
функциональными белками (молекулы-переносчики электронов дыхательной
цепи, связанные с окислительным фосфорилированием). Толщина внутренней мембраны 50–55 ангстрем. При увеличении функциональной нагрузки
площадь ее поверхности увеличивается, образуя больше крист для аккомодации увеличенного количества функциональных белков.
Межмембранное пространство содержит различные гидрофильные
ферменты [402; 575], включая аденилаткиназу, конверсирующую АМФ до
АДФ, которая в свою очередь фосфорилируется до АТФ через окислительное
фосфорилирование на внутренней мембране [595].
Окислительное фосфорилирование играет важнейшую роль в жизнедеятельности аэробных организмов, так как его вклад в синтез АТФ составляет
более 95%. Окислительное фосфорилирование было открыто В.А. Энгельгартом в 1930 году при работе с эритроцитами птиц. В 1939 году В.А. Белицер и
Е.Т. Цыбакова показали что, оно сопряжено с переносом электронов в дыхательной цепи. Существовало несколько гипотез механизма энергетического
сопряжения. Наибольшее признание и последующее развитие получил хемиосмотический принцип, предложенный в 1961 году английским биохимиком
Питером Митчелом (Нобелевская премия по химии за 1978 г.).
Позднее заключение о том, что в митохондриях перенос электронов в
дыхательной цепи и фосфорилирование находятся в сопряженном состоянии,
было подтверждено многими исследованиями, в том числе отечественных
ученых. Большой вклад в изучение механизмов энергетических превращений
в сопрягающих мембранах митохондрий внесли ученые под руководством
В.П.Скулачева [138; 139; 141]. Ими получен обширный материал, позволивший сделать вывод, что сопрягающие мембраны митохондрий способны
78
трансформировать химическую энергию в электрическую форму, создавая
мембранный потенциал. Степень сопряжения характеризуется показателями
отношения Р/О, АДФ/О и дыхательным контролем. При повреждении митохондриальной мембраны происходит разобщение окисления и фосфорилирования [75; 86].
Матрикс представляет собой студнеобразную массу, состоящую на
50% из белка; содержит многообразие ферментов плюс их субстраты и продукты, анионы, катионы [575].
С 1958 года, с работы Мак Линна, стали появляться данные о существовании в митохондриях собственной системы белкового синтеза. В 1963 году М. Насс обнаружила в митохондриях ДНК [480; 485]. В следующем году
было осуществлено выделение митохондриальной ДНК. В последующих работах было продемонстрировано наличие в митохондриях автономного аппарата репликации, транскрипции и трансляции [481–484]. Идея автономности
митохондрии не нова, впервые она высказывалась в 1890 году Альтманом, но
тогда эта идея была чисто умозрительной. На сегодняшний день признание
получила симбиотическая теория происхождения митохондрий [448–451]. В
соответствии с теорией симбиогенеза, митохондрии появились в результате
того, что примитивные клетки (уркариоты), содержащие ядро, не могли сами
использовать кислород, для получения энергии, и захватывали бактерии
(прогеноты), которые могли это делать. В процессе развития симбиоза прогеноты передали значительную часть своих генов в ядро уркариот. Эта теория объясняет, почему современные митохондрии в генетическом плане не
являются самостоятельными органеллами. Эукариотическая клетка, по сути,
является симбиозом двух жизненных форм: ядра с цитозолью и митохондриона. Первая – определяет структуру клетки, и ее гены имеют «менделевское» наследование, тогда как митохондрион, имеет гены, наследующиеся по
материнской линии. Это определяется тем фактом, что в яйцеклетке имеются
митохондрии, тогда как сперматозоиды практически их лишены.
79
ДНК митохондрий отличается от ядерной ДНК по составу нуклеотидов, плавучей плотности и строению. В основном митохондриальная ДНК
представлена циркулярными молекулами с длиной контура 5 мкм и молекулярной массой 10×106 дальтон [481] в виде мономеров. Существование димерной формы митохондриальной ДНК связывают с репликацией. Репликация митохондриальной ДНК зависит от синтеза ядерной ДНК и идет полуконсервативным способом [559].
Митохондрии содержат три класса РНК, необходимых для генной
трансляции: рибосомальную, транспортную и матричную. Каждый класс
РНК характеризуется определенной константой седиментации [206; 598].
Изолированные митохондрии способны к белковому синтезу. В основном митохондриальный белковый синтез составляет небольшую долю белкового синтеза клетки, но в определенных условиях он может значительно увеличиваться. Например, клофибрат, известный как гипохолестерический
агент, способен на 10–15% увеличить в печени белок за счет увеличения митохондриального белка, при увеличении количества митохондрий на 50–
100% [401]. Хотя не весь белок синтезируется в митохондриях, но определенная доля его приходиться на митохондриальный синтез.
Митохондриальный геном традиционно и давно является центром
большинства исследований древней ДНК вследствие ее высокого числа копий. Но, несмотря на давний интерес к митохондриальной ДНК, только в
2001 году были получены полные последовательности древнего митохондриального генома. За последние несколько лет, благодаря новым техническим
возможностям и методическим приемам, быстро растет количество данных
по расшифровке митохондриальных геномов. Это открывает широкие перспективы для исследований по генетике митохондрий [353].
Биогенез митохондрий
Биогенез митохондрий зависит от кооперации митохондриальной и
ядерной генетических информаций. Эта взаимосвязь наиболее изучена на
дрожжах. Кодирующая способность митохондриальной ДНК лимитирована
80
[494]. Из этого следует, что внемитохондриальная система должна всесторонне контролировать функциональную дифференциацию митохондрий. Цитохром C кодируется на ядерной ДНК и транслируется на цитоплазматических рибосомах, это справедливо как для дрожжей, так и для клеток млекопитающих [383; 384; 465; 566]. Часть митохондриальных белков является результатом митохондриального и цитоплазматического синтеза. Это относиться к трем комплексам, связанным с внутренней мембраной митохондрий:
цитохром-C-оксидазе, цитохрому B и олигомицин-чувствительной АТФазе
[313; 314; 454; 579; 604].
Важные данные получены при изучении митохондрий развивающейся
летательной мышцы саранчи [249], заключающиеся в том, что с многократным увеличением размеров митохондрий наблюдается увеличение активности цитратсинтетазы, малатдегидрогеназы, НАД-Н-дегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы, цитохрома C. Однако, активность этих ферментов практически не менялась при пересчете на активность α-глицерофосфатоксидазы. Отсюда следует, что увеличение уровня ферментов во время роста митохондрий
происходит синхронно.
Аналогичные результаты были получены в работе Кистлера и Вебера
[397]. Эти авторы, изучая активность митохондриальных ферментов во время
роста печени шпорцевой лягушки, показали постоянство активности большинства изученных ферментов матрикса и мембран митохондрий, если эти
активности пересчитать на содержание цитохромов A+A3. Во время развития
летательных мышц колорадского жука изменение активности сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы происходят параллельно изменению содержания цитохромов B, C, A+A3 [223].
Эти данные подтверждают гипотезу координированного синтеза ферментов [516], согласно которой ферменты, принадлежащие к одному метаболическому пути, синтезируются синхронно. Синхронные изменения количества ферментов являются, очевидно, важной предпосылкой надежности
функционирования данного метаболического пути, так как дефицит даже од-
81
ного из компонентов привел бы к прекращению работы всей метаболической
системы.
Гипотеза координированного синтеза ферментов получила дальнейшее
развитие в работах по изучению полупериода существования ряда митохондриальных белков. Показано, что цитохромы B, C, A+A3 из митохондрий печени и сердца крысы имеют одинаковый полупериод существования, равный
5,5–6,2 дня [219; 230]. Следовательно, синхронность синтеза цитохромов определяется их одинаковым полупериодом существования.
Параллельно с дифференциацией клетки идет дифференциация митохондрий согласно с функциональной специализацией данных клеток. Так,
например, митохондрии надпочечников активно включаются в биосинтез
стероидов. В клетках мышц митохондрии приспособлены к максимальной
продукции
АТФ,
для
обеспечения
энергией
процесса
сокращения-
расслабления. Митохондрии печени обладают широким набором транспортных систем, например, для сукцината, малата, кетоглутарата, пирувара, цитрата. Одни из транспортных систем обеспечивают быстрое проникновение
«горючего» в митохондрии, другие – обмен специфических промежуточных
продуктов цикла трикарбоновых кислот с цитоплазмой. Так, в результате выхода цитрата из митохондрий происходит образование ацилкофермента-А,
необходимого для синтеза жирных кислот и стеринов в цитоплазме.
Под влиянием экзогенного гонадотропина наблюдается увеличение
удельной цитохромоксидазной активности и падение отношения АДФ/О митохондрий яичников неполовозрелых крыс. Одновременно с этим изменяется
электронно-микроскопическая картина митохондрий и их способность превращать холестерол в прегненолон. Эти данные позволили авторам считать,
что гонадотропины влияют на биогенез митохондрий яичников. В результате
чего происходит становление функциональной детерминации митохондрий
яичников крыс [298; 299].
К числу митохондрий, выполняющих специализированные функции,
следует отнести митохондрии слизистой желудка. Показано, что эти мито-
82
хондрии имеют особенности в организации дыхательных цепей, которые связаны с особенностью выполняемых функций [118].
Синтез инсулина в поджелудочной железе является эндотермическим
процессом и необходимая для него энергия мобилизуется за счет окислительных процессов в митохондриях. Показаны четкие возрастные изменения
окислительной и энергообразовательной активности митохондрий поджелудочной железы. Предполагается, что снижение метаболической активности
митохондрий поджелудочной железы в старости может быть лимитирующим
звеном синтеза инсулина в этом возрасте [35].
В митохондриях молочной железы мышей такие параметры, как количество митохондриального белка, активность цитохромоксидазы, сукцинатоксидазы, ферментов окислительного фосфорилирования резко изменялись
при наступлении периода лактации [376].
Кислород также играет определенную роль в контроле митохондриального белкового синтеза [130]. Фибробласты человека содержат редуцированный уровень цитохромов A+A3, B, C+C1 при культивировании в условиях гипоксии. Содержание цитохромов возвращается к нормальному уровню при
нормальном уровне кислорода [465].
Введение стероидкортизола крысам с удаленными надпочечниками и
гонадами приводит к быстрому увеличению синтеза мтРНК в печени, что
предшествует синтезу цитоплазматической РНК. При блокировании митохондриального синтеза РНК селективными игибиторами, ответ ядра на кортизонстимуляцию блокируется на 50% [447]. Авторы полагают, что синтез
ядерной РНК находиться под влиянием митохондриальной РНК. Предположения о том, что митохондриальная генетическая система может распространять свое влияние за пределы митохондрий, высказывались и ранее [220].
Динамическое состояние митохондрий и их способность делиться в
клетках цыпленка была продемонстрировано еще в 1928 году [465]. Считается, что митохондрии эукариотов растут и делятся [311; 486] подобно тому,
как это продемонстрировано для митохондрий Neurospora crassa [432].
83
В ходе индивидуального развития животных можно условно выделить
периоды, когда происходят изменения биогенеза митохондрий: 1 – оогенез,
2 – зародышевое развитие, 3 – постэмбриональное развитие, 4 – ткань сформировавшегося организма в обычных условиях существования, 5 – ткани животных после различных воздействий или изменения физиологической нагрузки (при гипоксии, беременности, наступлении яйцекладки у птиц, усиленной физической нагрузке). По-видимому, общий план биогенеза митохондрий для каждого этапа сходен, однако возможно, что имеется и определенная специфика этого процесса. Возможно, что на одних этапах преобладает процесс образования митохондрий, их сборки или деления, на других –
качественные изменения и дифференцировка [130].
Во время роста ооцитов происходят существенные изменения в структуре митохондрий: увеличиваются их размеры и протяженность крист. В
ооцитах ранних стадий червей [161], рыб [110], амфибий [4], млекопитающих
[213] содержаться в основном мелкие митохондрии с единичными кристами,
а по мере их роста размер митохондрий и протяженность крист значительно
возрастают.
К началу вителлогенеза структура митохондрий (форма, количество
крист) близка к таковой у закончивших рост ооцитов. Однако объем митохондрий в течение вителлогенеза продолжает увеличиваться. Так от начала малого роста до начала отложения белка объем митохондрий увеличивается почти
в 4 раза, а во время вителлогенеза эта величина возрастает в 3,3 раза [110].
Параллельно с увеличением размеров митохондрий в процессе оогенеза наблюдается увеличение содержания митохондриального белка в ооцитах,
а также активности маркерного фермента митохондрий – цитохромоксидазы
[108].
Известно, что на определенных стадиях оогенеза митохондрии находятся в тесном контакте с гранулярным эндоплазматическим ретикулумом [109;
395]. Возможно, что контакты необходимы для эффективного обеспечения
энергией процесса трансляции на цитоплазматических рибосомах [100]. Одна-
84
ко, существует и другая точка зрения, что близость цитоплазматических рибосом, сидящих на мембранах эндоплазматического ретикулума, к митохондриям ооцитов необходима для осуществления транспорта в митохондрии белков,
синтезированных на рибосомах цитоплазмы [110].
Процесс переноса в митохондрии белков, синтезирующихся в цитоплазме, был изучен на примере ооцитов вьюна в системе in vitro [111]. Было
показано, что наиболее эффективными являются условия, когда в опыте одновременно происходит синтез белка в микросомной и митохондриальной
фракциях.
Значительное увеличение размеров митохондрий и протяженности
крист отмечено во время сперматогенеза [214]. Показано, что на заключительных этапах сперматогенеза митохондрии достигают максимальных размеров, затем сливаются и образуют плотно упакованную спиральную структуру вокруг хвостовой нити сперматозоида. Предполагается, что это эффективно с целью энергообеспечения движения хвоста сперматозоида.
Одной из моделей для изучения биогенеза митохондрий служит зародышевое развитие. Изучая активность цитохромоксидазы зародышей амфибий Болл и Вебер [235] пришли к выводу, что во время зародышевого развития происходит рост и дифференцировка митохондрий.
Увеличение размеров митохондрий и протяженности крист происходит
как на стадиях бластулы и гаструлы, так и позднее в период роста и дифференцировки различных органов и тканей. Так увеличение размеров митохондрий и протяженности крист отмечено во время развития летательной мышцы саранчи [249], сердца лягушки [351], печени крысы [271], печени цыпленка [586]. Показано, что в течение семи дней развития печени цыпленка размер митохондрий увеличивается почти в 5 раз. За 13 дней развития летательной мышцы саранчи размер митохондрий увеличивается в 30 раз [249].
Рост размеров митохондрий сопровождается увеличением активности
митохондриальных ферментов и компонентов дыхательной цепи. Исследования проводились на разных стадиях развития органов, а изучаемые ферменты
85
принадлежат к разным метаболическим звеньям. В развивающейся печени
цыпленка увеличивается активность малатдегидрогеназы и цитохромоксидазы [518]. Каталазная активность митохондрий печени цыпленка в период выклева на 65% выше по сравнению с активностью 14–18 дневных эмбрионов, а
в постэмбриогенезе она снижается [30].
Показано, что в ходе эмбриогенеза кур наблюдается постепенное увеличение размеров митохондрий, выделенных из мозговой ткани, а также изменение их внутренней структуры, сопровождающееся увеличением количества и протяженности крист. Увеличение размеров митохондрий происходит
при постоянстве отношения длины к ширине. Увеличение общей поверхности внутримитохондриальных мембран соответствует активации процессов
дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях мозга в течение эмбрионального развития кур [134].
В сердце эмбриона крысы на десятый день развития митохондрии –
мелкие со слабо выраженными кристами. К 14-ому дню они имеют вид, характерный для митохондрий молодых животных: они становятся крупнее,
кристы хорошо выражены. В этот же период активность дыхательных ферментов, АТФазы – возрастают почти в три раза [439].
Изучение биогенеза митохондрий животной клетки расширило понимание роли митохондриальной ДНК в таких фенотипических проявлениях
организма, как старение и патологические изменения [500; 614]. Митохондриальные нарушения обычно сопровождаются ухудшением клеточной энергетики из-за снижения уровня окислительного фосфорилирования. Начиная с
выявления первых патологий митохондриальной ДНК, были приложены значительные усилия исследователей в этом направлении [254; 274; 303; 360;
469; 470]. В настоящее время идентифицировано более чем 250 патогенных
мутаций митохондриальной ДНК человека. Однако понимание фенотипического разнообразия и объяснение молекулярных механизмов лежащих в основе этих патологий порой весьма затруднительно. Прежде всего, это связано
со спецификой митохондриальной генетики и неспособностью управлять ми-
86
тохондриальным геномом в эксперименте. Тем не менее, многие функциональные последствия мутаций митохондриальной ДНК уже имеют свои объяснения, и в будущем решение этих вопросов ждет безусловный успех [273;
399; 603].
Сегодня уже ясно, что множество клинических проявлений различных
патологий связано с митохондриальными дефектами и способностью митохондрий к самоликвидации. И обусловлено это, прежде всего центральной
ролью митохондрий в энергопродукции, в окислении биополимеров активными формами кислорода (АФК), поскольку именно митохондрии являются
источником большей части АФК в клетках организма [573], а также тем, что
митохондриальный геном распределен между митохондриальной и ядерной
ДНК. Например, митохондриальный геном человека состоит приблизительно
из 1500 генов. Из них 37 генов закодированы в митохондриальной ДНК, остальные – в ядерной ДНК. Механизм взаимодействия митохондриальной и
ядерной ДНК, в которой закодированы митохондриальные гены, а также их
роль в митохондриальных нарушениях все еще в значительной степени не
ясна. К тому же митохондриальная ДНК присутствует в тысячах копий на
клетку и кодирует белки, которые являются важнейшими компонентами митохондриальной дыхательной цепи и системы окислительного фосфорилирования. Предполагается, что накопление мутаций митохондриальной ДНК в
клетке может являться часовым механизмом старения [285; 428; 545; 616].
Сравнительное изучение окислительного фосфорилирования митохондрий различных видов показало, что комплексы I, III, IV, V системы окислительного фосфорилирования закодированы в 39 генах ядерной ДНК и семи –
митохондриальной ДНК [468; 618]. Немногие белки, которые кодируются
собственным геномом митохондрий, расположены в основном во внутренней
мембране. Одни субъединицы митохондриальных белковых комплексов кодируются митохондриальной ДНК, другие компоненты кодируются ядерными генами и поступают из цитозоля. Образование гибридных комплексов
требует сбалансированности синтеза. Каким образом координируется синтез
87
белка на рибосомах разных типов, разделенных двумя мембранами, пока не
до конца понятно [386].
Механизм турновера митохондриальных РНК до настоящего времени
находится на стадии изучения и активного обсуждения [386; 597]. Предприняты многочисленные исследования структурной организации митохондриального генома эукариот [496; 498; 499]. В этой связи информативно изучение мутаций митохондриальной ДНК. Изучены и показаны последствия митохондриальных генных мутаций для клеточной пролиферации и физиологии
клетки. Оценены и интерпретированы в функциональном контексте мутации,
которые приводят к изменению аминокислот в белках дыхательной цепи митохондрий [288]. Показано увеличение частоты мутаций митохондриальной
ДНК с возрастом. Например, в печени крыс около 95% мутаций митохондриальной ДНК связано с заменой нуклеотидов AT на GC. Полученные данные
подтверждают гипотезу ассиметричности митохондриального пула динуклеотидов в норме, что приводит к уменьшению связи с ДНК полимеразой, способствуя соматическому мутагенезу митохондриальной ДНК [539].
Мутации митохондриальной ДНК, которые вызывают изменение буферной емкости Ca+2 и его гомеостаза, приводят к потере мембранного потенциала, уменьшению активности ферментов дыхательной цепи митохондрий, что говорит о центральной роли митохондриального генома в некоторых
функциональных нарушениях, которые передаются по наследству [291].
Изучение митохондриальных болезней в модельных опытах на мышах
показало, что серьезные нарушения митохондриальной ДНК наследуются по
материнской линии. Как правило, следствием большинства мутаций митохондриальной ДНК являются тяжелые заболевания и болезни средней тяжести. Эксперименты показали, что тяжелая мутация митохондриальной ДНК
(ND6) была избирательно элиминирована (устранена) в оогенезе за четыре
поколения. В то время как умеренная мутация (COI) сохранялась в многократных поколениях даже при том, что в потомстве развивались наследственные миопатия и кардиомиопатия. Таким образом, авторы приходят к вы-
88
воду, что идет селекция тяжелых мутаций митохондриальной ДНК по материнской линии, которая минимизирует их отрицательные воздействия на
жизнеспособность популяции [306; 619].
Генетическая инактивация закодированной в ядре аденин нуклетид
транслоказы I, ответственной за экспорт АТФ из митохондрии в цитозоль как
у мышей, так и у человека приводит к митохондриальной кардиомиопатии. С
последующей гиперпролиферацией митохондрий, индукцией ферментов дыхательной цепи и серьезным повреждением митохондриальной ДНК. Проведенные авторами исследования с использованием программы MITOCHIP на
сердечной мышце мышей по измерению экспрессии 1087 генов показали, что
энергетический обмен, антиоксидантная защита и апоптоз митохондрий
формируют интегрированную метаболическую сеть [416; 593].
Все более актуальным становится вопрос создания алгоритмов для эффективного хранения митохондриального банка генов [244]. Создаются и пополняются базы данных для митохондриальных геномов. Например, изучена
последовательность и структура митохондриального генома грибов и показана его линейность [564]. Характеристика структурной организации митохондриального генома насекомых семейства мухи Muscidae демонстрирует пластичность митохондриальной ДНК [497].
Рассматривая жизнь как взаимодействие структуры и энергии, можно
отметить все еще недостаточную степень изученности роли дефицита энергии в развитии патологии клетки, органа и организма в целом. Многие исследователи разделяют мнение, что митохондриальные нарушения играют центральную роль в широком диапазоне патологий и возрастных изменений. Поскольку митохондриальная ДНК представлена тысячами копий на клетку и
кодирует важные для энергопродукции гены, возрастные патологии могут
быть результатом накопления соматических мутаций в митохондриальной
ДНК постмитотических тканей. Тканеспецифичность проявления этих патологий может зависеть от потребности различных тканей в энергии. Индивидуальные предрасположения к болезням могут быть результатом несоответ-
89
ствия современного уровня потребления энергии и полиморфизма древнего
митохондриального генетического аппарата [594; 615; 617].
Механизм окислительного фосфорилирования, контролируя энергетический гомеостаз тканей и органов, интегрирован с биогенезом митохондрий
[211; 217], который в свою очередь обеспечивается работой двух геномов
ядерным и митохондриальным. Показано, что нарушения функционирования
дыхательной цепи митохондрий увеличиваются с ростом нарушений как в
ядерном геноме, так и в митохондриальном геноме [538; 630].
Имеющиеся в литературе и представленные в обзоре данные убедительно показывают, что в морфогенезе и функциональной специализации органов важное место занимает биогенез митохондрий. На сегодняшний день
не изучена связь и соотношение процессов биосинтеза с биогенезом митохондрий в связи с индукцией вителлогенной функции печени цыплят.
Функционирование митохондрий при различных физиологических
состояниях ткани
Митохондриальная энергетика является ключевым фактором, обеспечивающим взаимодействие митохондриального и ядерного генома с окружающей средой [620]. Образующаяся в результате окислительного фосфорилирования в митохондриях АТФ обеспечивает сложные энергоемкие процессы в клетке. Эксперименты на изолированных митохондриях дают возможность изучения с последующей интерпретацией результатов на целостный
организм многих вопросов прикладного значения [125; 242; 605].
Широкое развитие получило направление, изучающее ответные реакции изолированных интактных митохондрий при различных воздействиях на
организм. Важным свойством выделенных митохондрий является их способность сохранять и активно удерживать определенные метаболические состояния. Благодаря этому изучение кинетики изменений, происходящих в
изолированных митохондриях, может дать объективную информацию для
понимания физиологических процессов и функционального состояния тканей
и органов.
90
Большая часть работ по изучению состояния системы окислительного
фосфорилирования при изменении физиологического состояния ткани выполнена на регенерирующей печени. В результате значительной гепатэктомии клетки зрелой печени приступают к делению, активность биосинтетических процессов резко возрастает. Изучено дыхание гомогената регенерирующей печени эмбрионов морской свинки. Показано, что параметры, характеризующие состояние системы окислительного фосфорилирования (АДФ/О,
Н/О, ДК), ниже по сравнению с таковыми во взрослой печени. Данное снижение перечисленных параметров автор объясняет за счет отвлечения богатых энергией соединений для осуществления биосинтезов [86]. Изучены отличия митохондрий нормальной и регенерирующей печени крысы при обработке животных хлорамфениколом. АТФазная активность регенерирующей
печени после обработки крыс хлорамфениколом резко падала, понижалась
дыхательная активность. У митохондрий, выделенных из нормальной печени
после обработки хлорамфениколом дыхание на сукцинате было увеличено,
на α-оксиглутарате, изоцитрате и малате – не изменялось. В результате действия хлорамфеникола количество цитохромов и дыхательных ферментов
понижалось в регенерирующей и увеличивалось в нормальной печени [309].
В митохондриях интенсивно растущей ткани значительно снижен коэффициент фосфорилирования – Р/О. Например, на ранней стадии развития
скорость окисления сукцината митохондриями эмбриональной печени крысы
почти равна скорости окисления сукцината в митохондриях печени взрослого
животного. А в период, предшествующий рождению, происходит ее снижение почти вдвое при значительном уменьшении величины отношения Р/О.
Снижение Р/О наблюдалось в митохондриях скелетной мышцы цыплят [138].
Продемонстрировано изменение АДФ/О и дыхания митохондрий печени
крыс во время эмбрионального развития [519]. Было показано, что в процессе
роста и развития зародышей, новорожденных и взрослых кроликов, происходит изменение дыхательных параметров митохондрий мышц [139]. Значительное снижение Р/О было обнаружено в митохондриях мышц голубя при
91
повторном охлаждении его в период холодовой адаптации [140]. Изменение
дыхательных параметров митохондрий и снижение отношения Р/О было показано для митохондрий печени, сердца, мозга в процессе развития куриного
эмбриона [134; 135].
Есть данные, свидетельствующие, что при отсутствии функциональной
нагрузки митохондрии мышц претерпевают ряд изменений. Уже через сутки
после обездвиживания крыс в митохондриях мышц утрачивается дыхательный контроль [457].
Еще одним примером влияния функциональной нагрузки органа на митохондрии может служить наследственная дистрофия мышц. При этом заболевании скорость дыхания и окислительное фосфорилирование в митохондриях мышц и печени снижены. Дыхательная цепь, по-видимому, не нарушена, так как НАДН2 и янтарная кислота окисляются с высокой скоростью, и
количество переносчиков в митохондриях не изменяется по сравнению с
нормой. Авторы высказали предположение, что либо повреждены каким-то
образом ферменты цикла трикарбоновых кислот, либо механизмы сопряжения дыхательной цепи [368], или, может быть, нарушена проницаемость
мембран митохондрий для ионов Н+ [362].
Показано, что эстрогены влияют на экспрессию митохондриальных генов и активность ферментов дыхательной цепи митохондрий [208; 215; 218].
Транспорт ионов кальция в митохондриях и регуляция клеточных
функций
Одной из эндергонических реакций митохондрий, конкурирующей за
промежуточные богатые энергией соединения с синтезом АТФ является
транспорт ионов кальция. Кальций играет фундаментальную роль в регуляции многих аспектов клеточного метаболизма – от активации или ингибирования ключевых ферментов, или различных сократительных систем до самых
важных аспектов гормональной регуляции или биосинтеза. Ионизированный
Са2+ влияет на различные мембранные функции, среди них: передача нервного возбуждения, проницаемость, контакт клеток. В течение длительного вре-
92
мени господствовало мнение, что митохондрии не могут быть столь активными регуляторами клеточных функций, так как существовало представление о необратимости процесса загрузки матрикса кальцием. Демонстрация
обратимости транспорта Са2+ митохондриями явилась стимулом исследований в этой области.
Первым косвенным указанием на существование активного транспорта
кальция в митохондриях in vivo явились результаты по распределению этого
иона между субклеточными фракциями печени [333] и сердца [629]. Наибольшее количество кальция в пересчете на мг белка приходилось на митохондриальную фракцию. В последующем на целом ряде тканей, таких как
мозг [602], почки [354–356], слизистая кишечника [263], слизистая оболочка
матки [359] было показано, что значительная часть кальция связана с митохондриями. В грудной мышце цыплят большая часть введенного
45
Са очень
быстро обнаруживается в митохондриях [281]. Карафоли [256] показал, что
более половины поступившего в орган 45Са (печень, сердце) обнаруживается
в митохондриях. Из полученных данных [253; 459] можно было заключить,
что митохондрии являются главной буферной системой, поддерживающей
необходимую концентрацию ионного кальция в цитозоле.
Были получены препараты, содержащие кальций-связывающие белки.
Выделен низкомолекулярный гликопротеид (м.м. 5000), ответственный за
связывание кальция митохондриальной мембраной [600]. Получены гликопротеидные комплексы, в состав которых входят фосфолипиды, представляющие собой набор компонентов, ответственных за транспорт Са2+ через
митохондриальную мембрану [257; 258; 417; 580].
Митохондриальный транспорт кальция принимает деятельное участие
в регуляции активности ряда ферментов: α-глицерофосфатдегидрогеназы
[345],
сукцинатоксидазы
[492],
пируватдегидрогеназофосфатфосфатазы
[295]. Последний фермент локализован в митохондриальном матриксе, остальные два прочно связаны с внутренней мембраной, один – с внутренней,
другой – с наружной стороны. Деятельность митохондриальной дыхательной
93
цепи и/или цикла трикарбоновых кислот может находиться под контролем
кальция. Возможно, что митохондриальная Са-транспортная система регулирует эти ферментные активности исключением Са2+ из селективных зон
внутренней мембраны или внутримитохондриального матрикса, или путем
его концентрации в определенных зонах. Регуляция кальцием может быть
сопоставлена с той, которую осуществляет АДФ, а в некоторых тканях кальций может быть значительно более важным регулятором окисления, чем
АДФ.
Показана роль Са2+ в контроле гликолиза. Изучая пируваткиназу, фермент, который активируется и ингибируется Са2+, было показано, что фермент может быть легко переключен («включен» и «выключен») индукцией
или ингибированием поглощения кальция митохондриями [253; 459]. Селективным изменением отношения Mg+2 / Са2+ во внемитохондриальной среде,
митохондрии могут влиять на ферментативные системы, которые чувствительны к этому отношению, среди них – синтез фосфолипидов [520].
Связь между митохондриальным транспортом ионов и изменениями в
обмене веществ на сегодня не до конца изучена. Однако, есть данные, что
митохондриальный транспорт ионов кальция играет определяющую роль в
нарушениях обмена веществ [261].
Показано, что Ca2+ цитозоля играет стратегическую роль в регенерации
АТФ митохондриями. Механизм регуляции действует как митохондриальная
«газовая педаль», обеспечивая окислительное фосфорилирование субстратом
по требованию [323], а существующие на поверхности митохондрий кальций
связывающие участки способствуют обеспечению гомеостаза энергии в
клетке [280; 453].
В третьей части выполненных нами работ были изучены биогенез, основные показатели окислительного фосфорилирования и активного транспорта ионов кальция митохондрий печени кур и цыплят на модели эстрогениндуцированного вителлогенеза, что позволило охарактеризовать их роль в
вителлогенезе.
94
2.
Материал и методы исследований
Исследования выполнены по трем разделам (рис. 4): 1 – получение и
фенотип трансгенных перепелов по гену гормона роста быка; 2 – эстрогениндуцированный вителлогенез и биогенез рибосом печени цыплят; 3 – роль митохондрий в вителлогенезе печени.
Направления исследований
Трансгенез
Гормональная экспрессия генов
Получение перепелов, трансгенных по
гену гормона роста
быка
Фенотип трансгенных перепелов
Эстрогениндуцированный Роль митохондрий
вителлогенез и биогенез
в вителлогенезе
рибосом печени цыплят
печени
Метод получения
трансгенной птицы.
Идентификация
трансгенных перепелов методом полимеразной цепной
реакции и блот-гибридизационным анализом ДНК.
Оценка экспрессии
трансгена иммуноферментным методом по содержанию
бычьего соматотропина в крови трансгенных перепелов.
Биологические и
продуктивные качества трансгенных перепелов:
масса суточного
молодняка, динамика роста, гормональный статус
крови, иммунный
статус, яичная
продуктивность;
морфологические
показатели и биохимический состав перепелиных
яиц.
Влияние однократного и
повторного введения
17-β-эстрадиола на массу,
состав, содержание рибосом и функциональную
активность печени цыплят.
Влияние дозы 17-β-эстрадиола на вителлогенез и
биогенез рибосом. Действие α-аманитина, актиномицина Д, 5-бромдезоксиуридина и тиоацетамида
на вителлогенез и биогенез рибосом.
Окислительное
фосфорилирование, транспорт
кальция, метаболическая активность и биогенез
митохондрий печени кур и цыплят
после введения
17-β-эстрадиола.
Действие клофибрата на вителлогенез и биоэнергетику митохондрий.
Выводы и практические предложения
Рисунок 4. Общая схема исследований
2.1. Методы получения и исследования трансгенных перепелов
Исследования по изучению биологических и продуктивных качеств перепелов, трансгенных по гену бычьего соматотропина проведены в 1994–
2010 годах на перепелах эстонской породы в условиях вивария ГУП «Загорское» ЭПХ ВНИТИП Россельхозакадемии (Московская обл.) Птицу содержали в индивидуальных клетках при свободном доступе к воде и корму. Тех-
95
нологические параметры содержания и питательность комбикормов соответствовали принятым нормам.
Трансгенную птицу получали методом микроинъекции экзогенной
ДНК в зародышевые диски яйцеклеток [176]. Инъецированная генная конструкция pMTbGH(2×att) [51] была предоставлена Институтом молекулярной
биологии РАН (г. Москва).
Для идентификации трансгенных перепелов использовали блотгибридизационный анализ ДНК и метод полимеразной цепной реакции
(ПЦР). Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле с
добавлением бромистого этидия (0,5–1,0 мкг/мл) и просматривали гели в УФ
освещении (310 нм). При наличии в анализируемой ДНК нуклеотидных последовательностей гена бычьего гормона роста, наблюдался синтезированный в реакции фрагмент размером 634 п.н. Анализ экспрессии трансгенов
был выполнен на уровне белка: исследование плазмы крови на содержание
бычьего соматотропина иммуноферментным методом [66].
В исследованиях было две группы перепелов – опытная и контрольная.
В опытную группу входили потомки (33 поколения) трансгенных особей,
контрольную – эстонские перепела 33 генераций, не подвергшиеся генетической модификации. Отвод потомства в опытной и контрольной группах проводили естественным спариванием определенных особей. Каждая особь из
опытной группы имела шифр в компьютерной базе данных, позволяющий
проследить ее родословную, начиная от первичных трансгенных особей. Родословную для перепелов контрольной группы не отслеживали. Для получения очередного поколения птицы яйца инкубировали в лабораторных условиях. Выведенных перепелов из опытной и контрольной групп взвешивали
индивидуально в суточном, 1-, 7-, и 20-недельном возрасте (с разделением по
полу). Были проведены выборочные исследования ростовых показателей перепелов опытной и контрольной групп (взвешивали индивидуально в суточном возрасте, а затем еженедельно, в течение 20 недель). В течение 10 мес.
продуктивного периода проводили индивидуальный учет яйценоскости и
96
оценивали массу снесенных яиц. Исследования также были распространены
на особей опытной группы, не получивших по наследству копию чужеродного гена. Яйца для морфологического и биохимического анализа отбирали в
течение 5 смежных суток в начале продуктивного периода, а также у птицы в
возрасте 3, 6 и 10 мес. Проанализировали по 80 яиц из опытной и контрольной групп. Для учета массы составных частей яйца взвешивали с точностью
до 20 мг яйцо, скорлупу, желток; количество белка определяли по разности
между массой яйца и скорлупы с желтком. Форму яиц определяли, измеряя
продольный (большой) и поперечный (малый) диаметры при помощи штангенциркуля в см, с точностью до 0,01 см. Индекс формы вычисляли отношением малого диаметра к большому, выраженным в процентах [43]. Биохимический анализ яиц выполнен по принятым методикам [177]. Полученные результаты были пересчитаны с воздушно-сухого вещества в нативное вещество белка и желтка и в таком виде представлены в диссертации. Содержание
жирных кислот в липидах желтка определяли методом газожидкостной хроматографии («Fractovap-2450», «Carbo Erba», Италия). Использовали производные жирных кислот – метиловые эфиры, что обеспечило высокую эффективность разделения при более низких температурах, а также меньшее время
анализа [7]. В плазме крови определяли содержание инсулина, тетрайодтиронина (тироксин или Т4), трийодтиронина (Т3) радиоиммунологическим анализом (РИА). Анализы выполнены с использованием стандартных наборов
реактивов производства Республики Беларусь, по прилагаемым к ним методикам. Наборы реактивов предназначены для медицины, но поскольку тироксин, трийодтиронин и инсулин не имеют видовой специфичности, то используются в исследовательских целях на разных видах животных [121]. Радиоактивность проб измеряли на гамма счетчике (Ultrogamma-1280, LKB,
Швеция). Иммунный статус перепелов оценивали по нарастанию титров антител в крови и желтках яиц в ответ на введение антигена [15; 16]. В качестве
антигена использовали вакцинный вирус ньюкаслской болезни штамм НВ
«Ла-Сота», в дозе 300000–500000 ЭИД50/мл (эмбрион инфицирующая ак-
97
тивность), в зависимости от живой массы перепелов. Антитела в сыворотке
крови определяли в реакции задержки гемагглютинации (РЗГА). Вакцина
была предоставлена отделом вирусологии ВНИВИП. Перед вакцинацией
кровь перепелов обеих групп проверяли на наличие антител. Исследования
показали отсутствие антител в крови птиц. Перепелов опытной и контрольной групп (по 10 гол. в каждой) вакцинировали интраназально. Спустя 2 и 4
нед. у них брали кровь и контролировали степень иммунного ответа. Через 4
нед. после иммунизации в желтке яиц определяли уровень гемагглютининов.
Для анализа были взяты все яйца вакцинированных перепелов опытной и
контрольной групп снесенные за два дня.
С целью подтверждения полученных данных по высокой массе яиц
была проведена производственная проверка на 200 головах птицы в условиях
ГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП». В качестве нового варианта использовали
трансгенных перепелок, в качестве базового – перепелок эстонской породы.
2.2. Методы исследования эстрогениндуцированного
вителлогенеза и биогенеза рибосом печени цыплят
Эксперименты по изучению эстрогениндуцированного вителлогенеза
проводили на птице породы белый леггорн. Выполнено три исследования.
Использовали цыплят в возрасте 75–90 дней, кур и петухов – 240–280 дней.
Исследования выполнены на 400 цыплятах и 15 головах взрослой птицы.
В первом исследовании изучали динамику ответа печени цыплят на
однократное введение эстрадиола и действие разных доз гормона. Использовали дозы: 10, 30, 50 и 70 мг/кг. Подробная динамика исследована для дозы
30 мг/кг. Цыплят декапитировали через 4, 12, 18 часов и 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
суток после введения гормона.
Во втором исследовании изучали динамику ответа печени цыплят на
однократное и повторное введение эстрадиола. Были сформированы две
опытные группы цыплят. Цыплятам одной группы ввели эстрадиол в дозе
20 мг/кг. Через 16 суток эстрадиол в той же дозе ввели цыплятам обеих
98
групп и цыплят декапитировали через 3, 6, 9, 12 часов и 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10 суток.
В третьем исследовании изучали влияние α-аманитина, актиномицина Д, бромдезоксиуридина и тиоацетамида на эстрогениндуцированный вителлогенез у цыплят. Цыплятам вводили эстрадиол в дозе 30 мг/кг.
α-аманитин, актиномицин Д, бромдезоксиуриндин и тиоацетамид вводили в
дозах 20 мкг/кг, 50 мкг/кг, 20 мг/кг и 50 мг/кг соответственно. Цыплят декапитировали на 2, 4 и 6 сутки после введения эстрадиола. За 2 часа до убоя
цыплятам внутрибрюшинно вводили 3H-уридин в количестве 70 МБк.
17-β-Эстрадиол (Сигма, США) растворяли в пропиленгликоле в разных
концентрациях и вводили внутримышечно из расчета 1мл/кг живой массы.
Актиномицин Д и α-аманитин (Серва, ФРГ), а также 5-бромдезксиуридин и
тиоацетамид (BDH, Англия) использовали в виде раствора в 0,85% хлористом натрии и вводили внутрибрюшинно по 1мл/кг живой массы. При получении плазмы крови в качестве антикоагулянта использовали гепарин. Для
ингибирования протеаз использовали фенилметилсульфонилфторид и бензамидин [326; 425]. Фенилметилсульфонилфторид и бензамидин растворяли на
этаноле в концентрации 0,25 М. Конечная концентрация ингибиторов в крови
1 мМ. Плазму получали центрифугированием гепаринизированной крови 15
минут при 700g. Плазму отсасывали и добавляли к ней в качестве бактериостатического агента азид натрия до конечной концентрации 0,02%. Хранили
плазму при 2°C или замораживали и хранили при –80°C.
После взятия крови цыплят декапитировали, вскрывали грудную и
брюшную полости и извлекали печень. Печень немедленно взвешивали, а затем охлаждали в стаканчике с ледяным физиологическим раствором или замораживали и хранили при –80°C. Навески печени гомогенизировали в соответствующих средах в стеклянном гомогенизаторе с вращающимся тефлоновым пестиком типа Поттера-Эленгейма с контролируемой частотой вращения пестика (фирма Браун, ФРГ).
99
В плазме крови цыплят определяли содержание общего белка [276],
триглицеридов [601], неорганического и фосфопротеидного фосфора [39],
общего кальция [555]. Электрофорез белков крови цыплят проводили в трисглициновом буфере, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН). Гели окрашивали кумасси R-250 и на фосфопротеиды. Молекулярные массы белков
определяли по электрофоретической подвижности. Количественную обработку электрофореграмм проводили денситометрированием.
Гомогенаты печени цыплят готовили, и выделение рибосом проводили
в боксе при температуре 0–4°C. В гомогенатах печени определяли РНКазную активность по скорости расщепления очищенного препарата дрожжевой РНК и содержание общего белка, РНК, ДНК [165]. Концентрацию продуктов реакции оценивали по поглощению при 260 нм. Рибосомы выделяли
преципитацией 0,2 М MgCI2 [502]. Количество рибосом определяли по поглощению их растворов в ДСН при 260 нм. Радиоактивность РНК, меченой
3
H-уридином, определяли в жидкостном сцинтилляционном спектрометре
Ультрабета; для вычисления абсолютной активности использовали метод
внешней стандартизации. [37]. Внешним стандартом служил препарат радия,
встроенный в счетчик. Для калибровки использовали методику, описанную в
руководстве к счетчику Ультрабета. Зависимость эффективности счета от отношения счета в каналах стандарта выражали уравнением:
Е=a0+a1r+a2r2+a3r3,
где: Е – эффективность счета в %;
r – отношение счета в каналах стандарта;
a0,…,a3 – коэффициенты.
Коэффициенты вычисляли методом наименьших квадратов. Эффективность счета составляла примерно 20%; качество счета (E2/фон) – 25% и
больше.
100
2.3. Методы исследования роли митохондрий печени
в становлении ее вителлогенной функции
По разделу 3 – роль митохондрий в вителлогенезе печени, выполнено
2 исследования на птице породы белый леггорн: цыплятах в возрасте 75–90
дней (в этот период у них происходит координированное развитие репродуктивной системы), курах в возрасте 240–280 дней (в период интенсивной яйцекладки – 80%) и петухах того же возраста. Использованное поголовье составило 330 цыплят, 30 кур и 15 петухов.
В первом исследовании изучали биоэнергетические параметры, активный транспорт ионов кальция и биогенез митохондрий печени цыплят. Для
этого были сформированы одна контрольная две опытных группы. Индукцию вителлогенной функции печени у цыплят опытных групп вызывали однократным подкожным введением раствора 17--эстрадиола на пропиленгликоле в дозе 30 мг/кг живой массы. При отсутствии растущих фолликулов в
яичниках цыплят, концентрация фосфопротеидов и триглицеридов в плазме
крови после введения эстрадиола служит показателем активности генов, контролирующих их синтез. Второй опытной группе одновременно с 17--эстрадиолом внутрибрюшинно вводили спиртовой раствор актиномицина Д в дозе
100 мкг/кг живой массы. Актиномицин Д являясь ингибитором транскрипции
и биосинтеза белка в клетке, не блокирует синтез РНК в митохондриях [392].
Контрольной группе цыплят вводили пропиленгликоль. Убой цыплят контрольной и двух опытных групп осуществляли декапитацией (по 5 гол.) через
4, 12, 24, 36, 48, 72 и 96 ч после инъекций.
Во втором исследовании изучали связь между основными биоэнергетическими функциями митохондрий и активностью индуцированного
17-β-эстрадиолом липогенеза в печени цыплят. Для этого был использован
клофибрат (n-этилхлорофеноксиизобутират), который вызывает снижение
содержания холестерина и триглицеридов в плазме крови. Есть данные о
причастности митохондрий к его гиполипемическому действию [322; 437;
438]. Было сформировано две группы цыплят: контрольная и опытная. Цып-
101
лят опытной группы в течение семи дней принудительно кормили клофибратом в форме желатиновых капсул, по одной капсуле в сутки. Одна капсула
содержала 250 мг препарата. Длительность кормления и доза были определены, основываясь на результатах исследований других авторов [322; 413]. Затем цыплятам вводили 17-β-эстрадиол в дозе 30 мг/кг живой массы. Убой
цыплят осуществляли декапитацией (по 5 гол.): через семь дней кормления
клофибратом, через 1 и 2 дня после прекращения скармливания клофибрата,
через 1 и 2 дня после инъекции.
В первом и втором исследованиях печень быстро извлекали и готовили
гомогенат. Для этого к 1 г сырой ткани добавляли 9 мл среды выделения следующего состава: сахароза – 250 мМ, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) –
1мМ, Трис-HCl – 10mM, pH (7,6). Использовали стеклянный шариковый гомогенизатор (10–15 фрикций). Митохондриальную фракцию выделяли методом дифференциального центрифугирования. Ядра, клеточный дебрис, неразрушенные клетки и эритроциты удаляли центрифугированием при 700 g
в течение 10 мин, митохондриальную фракцию отделяли при 5000 g в течение 10 мин, затем при 10000 g в течение 2 мин. Полученный осадок митохондрий промывали, для чего ресуспендировали в первоначальном объеме среды
выделения, не содержащей ЭДТА, и осаждали в том же режиме: 10 мин при
5000 g и 2 мин при 10000 g (всю процедуру выполняли дважды). Митохондриальную фракцию ресуспендировали в той же среде (конечная концентрация по белку – 60–80 мг/мл).
Все манипуляции с гомогенатами печени и митохондриальной фракцией проводили в боксе при температуре 0–4 С. Для исследования митохондрий печени были использованы следующие методы и методики: полярографический метод определения основных биоэнергетических параметров и
транспорта кальция [44; 73; 75], определение цитохромоксидазной активности [95], определение РНК, ДНК белка [165], определение свободных аминокислот на автоматическом аминокислотном анализаторе.
102
Скорость дыхания в митохондриях определяли полярографическим методом в присутствии 10 мМ сукцината натрия при последовательном добавлении 200–500 мкМ АДФ, 40 мкМ 2,4-динитрофенола (ДНФ), 2мМ KCN (конечные концентрации). Среда инкубации содержала 250 мМ сахарозы, 20 мМ
KH2PO4, 0,5 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6). Цитохромоксидазную активность оценивали по максимальной скорости дыхания митохондрий в присутствии насыщающих концентраций аскорбата натрия (2 мМ) с тетраметилпарафенилендиамидом (ТМФД, 2 мМ) и цитохромом С (15 мкМ). Активность транспорта ионов кальция в митохондриях определяли по потреблению
кислорода в присутствии 10 мМ сукцината после добавления CaCl2 (от 50 до
100 мкМ/мг белка митохондрий). Среда инкубации состояла из 250 мМ сахарозы, 20 мМ KH2PO4 и 20 мМ Трис-HCl (pH 7,6).
Теми же способами выделяли митохондрии из печени кур и петухов и
оценивали основные биоэнергетические параметры: активность дыхания и
транспорта ионов кальция. Сравнивали полученные показатели с целью доказательства того, что различия между митохондриями из печени цыплят и
кур обусловлены не возрастом, а функциональными особенностями, обусловленными вителлогенезом.
У всех цыплят перед декапитацией брали из яремной вены образцы
крови, добавляли гепарин в качестве антикоагулянта и получали плазму. В
плазме крови измеряли содержание общего белка [276], триглицеридов [601],
неорганического и фосфопротеидного фосфора [39], общего кальция [555].
Результаты статистически обработаны общепринятыми методами [29] с
использованием программы Microsoft Excel.
По всем проведенным исследованиям в диссертации представлены
данные, статистически обработанные общепринятыми методами вариационной статистики [29]. Статистическая обработка была выполнена на компьютере с использованием программы Microsoft Excel. На диаграммах и таблицах
указаны ошибки выборочного среднего. Достоверность различий показателей
опытной и контрольной групп в таблицах отмечены следующим образом:
* – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001.
103
3.
Результаты исследований
3.1. Получение и изучение трансгенных перепелов с геном
гормона роста быка
Изучение оптимальных режимов и условий проведения полимеразной
цепной реакции (ПЦР)
С целью скрининга экспериментальных перепелов на трансгенность
методом ПЦР были подобраны условия проведения реакции.
Анализом нуклеотидной последовательности гена гормона роста быка
плазмиды pMTbGH(2×att) с использованием компьютерной программы
«Oligo», была подобрана пара олигонуклеотидных последовательностей
(праймеров). Это – ctttcgccctgctctgcctgccct (прямой) и cctgccaccaccgcccaccatc
(обратный), комплементарные последовательности природного гена гормона
роста быка, лежащей между двумя сайтами рестриктазы Pst I (фрагмент длиной 1150 п.н. (рис. 5).
На основе термодинамических расчетов был выбран температурный
режим и интервалы времени циклов ПЦР:
1 цикл
– денатурация 94ºС 5 мин., отжиг 60ºС 2 мин., синтез 74°С 3 мин.
2–34 циклы – денатурация 94ºС 1,5 мин., отжиг 60°С 2 мин., синтез 74°С 3 мин.
35 цикл
– денатурация 94°С 1,5 мин., отжиг 60°С 2 мин., синтез 74°С 10 мин.
Плазмиду обрабатывали рестриктазами Hind III и Nde I. Фрагмент для
инъекций выделяли электрофорезом в агарозном геле.
Использование в качестве матрицы бычьей или плазмидной ДНК приводило к синтезу теоретически ожидаемых продуктов для обеих пар праймеров. Если матрицей служила ДНК интактных перепелов, синтез специфических продуктов не регистрировался. Добавление к контрольной перепелиной
ДНК плазмиды в количестве нескольких копий на перепелиный геном, приводило к синтезу специфических фрагментов гена гормона роста быка. При
наличии в анализируемой ДНК нуклеотидных последовательностей гена
бычьего гормона роста, наблюдался синтезированный в реакции фрагмент
размером 634 п.н.
104
Получение трансгенных по гену гормона роста быка перепелов
Перепела, трансгенные по гену гормона роста быка, получены хирургическим методом микроинъекции экзогенной ДНК яйцеклеток, как овулировавших, так и находившихся на поздних стадиях созревания (крупные
фолликулы) [176]. Основной элемент конструкции pMTbGH(2×att) – содержащий интроны природный ген бычьего соматотропина (bGH gene), находящийся под контролем металлотионинового промотора мыши (MT prom)
(рис. 5). Последний активируется ионами цинка и других тяжелых металлов,
содержащихся в организме птицы. Активный промотор заставляет экспрессироваться ген бычьего гормона роста. У трансгенных по этой конструкции
перепелов происходит синтез указанного гормона.
PstI
5'
103
SacI
1619
att
460 210
MT prom.
PstI
60
PstI
1150
1150
bGH gene
EcoRI
PstI
786
3'-poly(A)
103
EcoRI
3'
1619
att
217
HindIII
NdeI
pUC19
Рисунок 5. Физическая карта плазмиды pMTbGH(2×att) (указаны сайты
рестрикции эндонуклеазами), использованной в качестве генной конструкции при получении генетически модифицированных перепелов
Для инъекции гена в перепелиные яйцеклетки проводили хирургическую операцию по вскрытию брюшной полости под местной новокаиновой
анестезией. Инъекции ДНК (в объеме 150–300 пл) производили стеклянной
микропипеткой (диаметр острия составлял 2–4 мкм) в зародышевые диски
крупных фолликулов яичника и овулировавших яйцеклеток в воронке яйцевода через стенку воронки.
Было прооперировано 93 перепелки, у которых инъецировано 280 яйцеклеток, как овулировавших, так и находившихся в крупных фолликулах. В
среднем у каждой особи было инъецировано по 3 яйцеклетки. От перепелок
было собрано 375 яиц, из которых 360 – были заложены на инкубацию. Вывелось 122 перепеленка.
105
Методом ПЦР анализа было исследовано 180 препаратов ДНК выделенных из эмбрионов и различных органов и тканей экспериментальных перепелов. Нуклеотидные последовательности гена гормона роста быка были
обнаружены в 33 препаратах (14 особей и 10 эмбрионов). В итоге из анализированных 122 особей трансгенными оказались 14. Трансгенность полученных
экспериментально перепелов проявилась в ряду поколений (табл. 1).
Таблица 1
Распределение трансгена в тканях опытных перепелов в ряду поколений
№
перепелов
Поколение
контроль
контроль+
ген
Результат
ПЦР
Результат блотгибридизации
♂, ♀
печень,
мышцы,
сердце,
кровь,
эмбрион
–
–
♂, ♀
печень,
мышцы,
сердце,
кровь,
эмбрион
+
+
Пол
Источник
ДНК
1
0
♀
эмбрион
+
7
0
♂
эмбрион
+
12
0
♂
эмбрион
+
14
0
♂
кровь
+
16
0
♂
мышцы
+
17
0
♀
эмбрион
+
19
0
♂
эмбрион
+
22
0
♂
сердце,
мышцы
+
25
0
♂
мышцы
+
26
0
♂
эмбрион
+
27
0
♂
эмбрион
+
28
0
♀
эмбрион
+
32
0
♂
кровь
+
33
0
♂
эмбрион
+
34
0
♀
эмбрион
+
♀
мышцы,
сердце,
печень,
кровь
+
37
0
+
+
+
+
+
+
106
№
перепелов
Поколение
Пол
47
1
♀
49
1
76
Источник
ДНК
Результат
ПЦР
Результат блотгибридизации
кровь
+
+
♀
кровь
+
2
♂
кровь
+
79
2
♂
кровь
+
95
3
♂
кровь
+
96
2
♀
кровь
+
103
2
♀
кровь
+
104
2
♂
кровь
+
105
2
♀
кровь
+
107
0
♂
мышцы,
сердце
+
108
0
♀
мышцы
+
110
0
♀
мышцы
+
+
111
0
♀
мышцы
+
+
112
0
♀
мышцы,
печень
+
115
0
♂
мышцы
+
+
+
+
+
116
0
♀
сердце,
печень,
мышцы,
кровь
130
0
♀
кровь
+
+
+
+
Результаты анализа ДНК перепелов развившихся из инъецированных
яйцеклеток, и их потомков методом блот-гибридизации выявили последовательности, комплементарные гену гормона роста быка. Характерный радиоавтограф ДНК перепелов представлен на рисунке 6.
Следует отметить, что на радиоавтографе блот-анализа ДНК мышечных тканей птицы № 116 выявлялся фрагмент размером не 1000 пар нуклеотидов, как теоретически ожидалось, а существенно большего размера. Такое
расположение полос, вероятнее всего, связано с перестройками трансгена
при интеграции с утратой сайтов рестрикции. Полученные данные позволяют
предположить химерность трансгенных особей.
107
1
2
3
4
5
6
7
8
п.н.
23130
9416
6557
4361
2322
2027
564
Рисунок 6. Блот-гибридизационный анализ ДНК из различных тканей
перепелов. 1 – птица 116, грудная мышца; 2 – птица 116, печень;
3 – птица 116, ножная мышца; 4 – птица 22, миокард; 5 – птица 22,
грудная мышца; 6 – птица 107, грудная мышца; 7 – птица 107, миокард;
8 – кровь контрольного перепела плюс плазмида в количестве
1–2 копии на гаплоидный геном
Экспрессия гена гормона роста быка (bGH) в крови трансгенных
перепелов
Трансгенные перепела были исследованы на содержание в крови соматотропина быка. В трех образцах крови (№76, №95, №104,) был обнаружен
бычий соматотропин в количестве 1,0–3,0 нг/мл. Таким образом, экспрессия
трансгена в крови полученных трансгенных перепелов составила от 1,0 до 3,0
нг/мл бычьего соматотропина. Тогда как в крови перепелов контрольной
группы искомый белок отсутствовал.
Наследование bGH-гена в поколениях опытных перепелов
В процессе выращивания экспериментально полученных перепелов и
отвода от них потомства было замечено, что некоторые самки (№№ 47, 49,
96, 103, 105) сносили крупные яйца (14,0–21,0 г), а из яиц с обычной массой
вылуплялись перепелята с живой массой, на 15–25% выше обычной. Вскрытие яиц показало, что они не были двухжелтковыми и были покрыты нормально пигментированной прочной скорлупой. Это послужило основанием
для размножения экспериментальных особей и изучения фенотипа полученной птицы. Трансгенные особи были использованы с целью получения потомства для формирования и дальнейшего исследования опытной группы перепелов (табл. 2). Потомство получали скрещиванием перепелов внутри
опытной группы.
108
Таблица 2
Результаты ПЦР анализа ДНК потомков трансгенных перепелов
на ген гормона роста быка
№№
перепелов
Поколение
14
0
14
22
0
29
Получено Проанализировано
потомков
потомков, %
Получено трансгенных потомков
Кол-во
%
100
2
14
4
100
1
25
0
4
100
1
25
32
0
4
100
1
25
47
1
8
100
4
50
49
1
14
100
2
14
76
2
2
100
1
50
79
2
8
100
1
12,5
95
3
1
100
–
0
96
2
5
100
1
20
103
2
1
100
–
0
104
2
2
100
1
50
105
2
3
100
1
33
111
0
3
100
1
33
130
0
5
100
1
20
Установлена связь признака «крупнояичности» с трансгенностью особей, а также наследуемость этого признака (рис. 7).
F0:
22
самец
F1:
47
самка,
крупные
яйца
F2:
76
самец,
СТГб
2,6 нг/мл
103
самка,
крупные
яйца
104
самец,
СТГб
1,2 нг/мл
105
самка,
крупные
яйца
Рисунок 7. Пример фенотипического проявления трансгенности
в потомстве перепелов
109
В настоящее время получено 33 поколения экспериментальных перепелов.
Зависимость массы выведенного молодняка перепелов от массы
инкубационных яиц
Масса суточного молодняка перепелов как опытной, так и контрольной
групп первых трех генераций была в пределах 6–9 г, и зависела от массы инкубационных яиц. В последующих поколениях потомков трансгенных перепелов также с увеличением массы яиц пропорционально увеличивалась масса
суточных перепелят опытной группы (табл. 3). Масса суточных перепелят
приведена в зависимости от весовой категории инкубационных яиц.
Таблица 3
Масса суточных перепелят опытной группы в зависимости
от массы инкубационных яиц (10–11 генерация)
Весовая
категория яиц,
граммы
Живая масса
суточных перепелят,
граммы
Относительная масса
суточных перепелят,
%
9–10,9
7,5±0,23
74,5±1,40
11–12,9
8,7±0,07
71,0±0,70
13–14,9
9,4±0,08
69,6±0,50
Живая масса суточных перепелят опытной группы была от 7,45 до 9,41
грамм. При этом масса суточных перепелят по отношению к массе яиц до
инкубации составила от 74,5 до 69,6%. На рис. 8 представлены кривые зависимости массы выведенных перепелят разных поколений потомков трансгенных перепелов от массы инкубационных яиц, полученные с помощью регрессионного анализа экспериментальных данных. Анализ показал, что эта зависимость имеет практически линейный характер, коэффициент корреляции
r = +0,810.
Имеющиеся различия относительной массы суточных перепелят связаны с их истинным возрастом на момент взвешивания, который в наших опытах составлял от нескольких часов до одних суток.
110
П околения 1 и 2
живая масс а, грамм
11
y = 0,6512x
R 2 = 0,6558
10
9
8
7
6
5
8
9
10
11
12
13
14
15
13
14
15
13
14
15
масс а яйца, грамм
П околение 3
11
живая масс а, грамм
y = 0,6967x
10
R 2 = 0,715
9
8
7
6
5
8
9
10
11
12
масс а яйца, грамм
П околения 10 и 11
11
y = 0,7045x
живая масс а, грамм
10
R 2 = 0,4378
9
8
7
6
5
8
9
10
11
12
масс а яйца, грамм
Рисунок 8. Зависимость массы выведшихся перепелят
от массы инкубационных яиц
111
Динамика роста перепелов
Активный рост перепелов происходил в течение 7 недель жизни, причем в первые три недели они росли особенно быстро, далее рост замедлялся
и стабилизировался в возрасте 8–9 недель. Достоверные различия в живой
массе опытных и контрольных перепелов проявлялись с 2-х недельного возраста, далее различия увеличивались и сохранялись на протяжении всей жизни (рис. 9).
Самцы
250
Живая масса, г
200
150
100
Опыт
Контроль
50
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Возраст, недель
Самки
250
Живая масса, г
200
150
100
Опыт
Контроль
50
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Возраст, недель
Рисунок 9. Динамика средней живой массы перепелов опытной
(трансгенных 1–3 поколений) и контрольной групп
112
Половозрелые самцы как опытной, так и контрольной групп весили
меньше одновозрастных самок, которые начинали обгонять в росте самцов с
3-недельного возраста. В 5–6 недельном возрасте различия в живой массе
были уже более значительными. В обобщенном виде разница по живой массе
составила 3–10% в контроле, 11–18% – в опыте. Средняя живая масса самцов
опытной и контрольной групп в 8–20-недельном возрасте составила соответственно 156 и 148 г (+5,4%), у самок различия были заметнее – 205 и 177 г
(+15,8%). Наблюдаемые различия сохранились и в последующих поколениях
перепелов (табл. 4).
Таблица 4
Живая масса перепелов в 9-недельном возрасте, г
Самцы
Поколение
Самки
опыт
контроль
опыт
контроль
9
154,4±1,88**
145,3±1,94
198,2±3,70***
176,3±3,36
10
153,3±2,36
147,7±2,10
188,7±3,19**
175,6±2,78
11
155,7±2,32
148,9±3,36
189,1±3,63**
175,0±3,02
У трансгенных особей в 15 смежных поколениях сохранилось превосходство над контрольными по живой массе (рис. 10), причем у самок различия оказались более существенными. В суточном и 1-недельном возрасте
птица в опыте была крупнее контрольной соответственно на 21 и 13%. Средняя масса суточных перепелят в опытной группе составляла 9,1, в контрольной 7,4 г. В 7- и 20-недельном возрасте достоверные различия наблюдались
только у самок – соответственно 8 и 6% (p < 0,001). Данные по динамике живой массы 11-ти поколений перепелов контрольной и опытной групп с разделением по полу приведены в табл. 41 (приложение).
Живая масса трансгенных перепелов варьировала от поколения к поколению, но линия тренда для этого показателя в 20-недельном возрасте свидетельствовала об отсутствии тенденции к снижению (наклон незначительный,
R2 = 0,019) (рис. 11).
113
250
Опыт, самки
Опыт, самцы
Контроль, самки
Контроль, самцы
Живая масса, г
200
150
100
50
0
1 сут.
1 нед.
7 нед.
20 нед.
Возраст
Рисунок 10. Живая масса перепелов опытной и контрольной групп,
в среднем по 15 поколениям
250
y = -0,1933x + 207,27
2
R = 0,019
Живая масса, г
200
150
1 сут.
1 нед.
7 нед.
20 нед.
Линейный (20 нед.)
100
50
0
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
Поколения
Рисунок 11. Живая масса перепелок опытной группы,
в разных поколениях в зависимости от возраста
114
Гормональный статус крови перепелов
Данные о содержании инсулина, трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4)
в плазме крови перепелов представлены в таблице 5.
Таблица 5
Содержание гормонов в крови перепелов опытной
и контрольной групп
Группа
Показатель
контрольная
опытная
самцы
самки
самцы
самки
Инсулин, мкед/мл
16,5±1,79
10,7±1,54
16,4±1,15
15,8±2,24
Т3, нМ
1,6±0,15
0,8±0,16
1,6±0,10
0,7±0,10
Т4, нМ
5,7±1,39
4,7±1,30
6,1±0,88
4,2±0,85
инсулин/Т3
10,5±1,25
20,3±6,01
10,3±0,68
27,3±4,29
Из представленных данных видно, что концентрация инсулина и тиреоидных гормонов в крови птиц обеих групп была практически одинаковой.
Однако разброс этих показателей в группах был значительным.
Индивидуальные колебания инсулина были значительно шире у перепелов опытной группы. Они изменялись от 6,7 до 30,9 мкед/мл, против 7,8–
18,1 мкед/мл в контрольной группе. У самцов как контрольной, так и опытной групп колебания в содержании инсулина в крови были меньше, чем у
самок.
Минимальные концентрации тироксина были порядка 1–2 нМ, максимальные: 10–12 нМ. Большие колебания концентрации трийодтиронина наблюдали у самок (от 0,2 до 2,1 нМ).
Иммунный статус перепелов
С целью оценки иммунного статуса трансгенных перепелов был изучен
поствакцинальный иммунитет перепелов опытной и контрольной групп. В
качестве антигена использовали вакцинный вирус ньюкаслской болезни
штамм НВ «Ла-Сота». Предварительное изучение эпизоотического фона показало, что в крови перепелов обеих групп отсутствовали антигемагглютинины к вирусу ньюкаслской болезни (птицу ранее не вакцинировали). Это
115
позволило провести исследование скорости образования антител на введенный антиген.
Результаты исследования титров антител в крови перепелов в цифровом виде приведены в табл. 6. Как следует из приведенных данных, различия
в иммунном ответе становятся заметны уже через 2 недели после вакцинации. А через 4 недели титры антител у трансгенных перепелов значительно
выше, чем в контроле. Аналогичные результаты получены и для экстрактов
желтков яиц трансгенных и контрольных перепелов, снесенных через 4 недели после вакцинации. Через 4 недели различия в титрах антител сыворотки
крови и желтка яиц между контрольными и опытными перепелами высоко
достоверны (p < 0,001). Фотографии плашек с реакцией задержки гемагглютинации сывороткой крови перепелов контрольной и опытной групп через 2 и
4 недели после вакцинации представлены на рис 25 и рис. 26 (приложение).
Таблица 6
Показатели поствакцинального иммунитета перепелов
Показатель
Через 2 нед.
титр
Через 4 нед.
log2
титр
log2
Контрольная группа
Сыворотка крови
Экстракт яичного желтка
1:4–1:16
3,2±0,28
1:8–1:32
4,0±0,24
–
–
1:4–1:8
2,9±0,09
Напряженность иммунитета, %
80%
100%
Опытная группа
Сыворотка крови
Экстракт яичного желтка
1:8–1:32
3,8±0,23
1:32–1:128
6,0±0,23*
–
–
1:8–1:64
4,9±0,23*
Напряженность иммунитета, %
100%
100%
Яичная продуктивность перепелов
У самок трансгенных перепелов масса снесенных яиц была больше,
чем в контроле (табл. 7). Полученные данные показывают, что средняя масса
перепелиных яиц первого месяца продуктивности была меньше, чем на третий. Это одинаково справедливо как для контрольной группы перепелов, так
и для опытной.
116
Таблица 7
Средняя масса перепелиных яиц, г
Первый месяц
яйценоскости
Поколение
перепелов
На пике яйценоскости
(3-й месяц)
контрольная
группа
опытная
группа
контрольная
группа
опытная
группа
1
10,1±0,1
12,7±0,1***
12,4±0,1
14,3±0,1***
2
10,3±0,2
13,0±0,2***
12,2±0,1
14,0±0,1***
3
10,0±0,1
12,4±0,2***
12,0±0,1
14,1±0,1***
9
9,1±0,1
12,5±0,2***
11,1±0,2
13,5±0,1***
10
10,6±0,2
11,9±0,1***
11,1±0,1
12,3±0,1***
11
11,0±0,2
11,7±0,2*
12,0±0,2
13,1±0,1***
На рис. 12 представлена динамика массы яиц перепелов трансгенной и
контрольной групп по месяцам продуктивности (9 поколение). За весь учетный период средняя масса яиц контрольных перепелов составила 10,66 г,
трансгенных – 13,03 г (122%). В целом по группе опытных перепелов в ряде
поколений яичная продуктивность была выше, чем в контроле.
14
13
Масса яиц, г
12
11
10
9
8
1
Транс генные
2
3
4
5
6
7
8
Месяц продуктивности
Контрольные
Рисунок 12. Динамика средней массы яиц перепелок опытной
и контрольной групп по месяцам продуктивности (9 поколение)
117
Яйценоскость перепелок в опытной группе в поколениях колебалась от
200 до 235 яиц, в контроле – от 193 до 227 яиц за 10 месяцев продуктивного
периода (рис. 13). Средняя яйцемасса за этот период в опытной группе составила 2749,4 г, что на 11% больше, чем в контрольной группе. Эта закономерность сохранялась во всех исследованных поколениях. Результаты динамики
средней массы яиц, количества и яйцемассы контрольной и опытной групп
11 смежных поколений перепелок представлены в табл. 42, 43, 44 (приложение).
15
30
25
14
Масса яиц, г
13
15
12
Количество яиц, шт.
20
Опыт, масса
Контроль, масса
Опыт, количество
Контроль, количество
10
11
5
10
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Месяц продуктивности
Рисунок 13. Масса и число яиц в среднем по 19–33 поколениям
По яйценоскости у опытных перепелок наблюдались большие индивидуальные различия, поэтому была изучена зависимость интенсивности
яйценоскости от массы сносимых яиц. Перепелок опытной группы разделили на две подгруппы: 1 – снесшие на пике яйценоскости яйца массой 13,0 г
и более; 2 – менее 13,0 г. Перепелки 2-й подгруппы, снесшие яйца обычной
массы, имели кривую яйценоскости выше, а снесшие крупные яйца – ниже
(рис. 14).
118
28
26
яйца, шт./мес.
24
22
20
18
16
14
1
2
3
несущие крупные яйца
4
5
6
7
месяц яйценоскости
несущие нормальные яйца
Рисунок 14. Интенсивность яйценоскости трансгенных перепелок
в зависимости от массы сносимых яиц
Тем не менее, среди перепелок, снесших крупные яйца, были особи и с
высокой яйценоскостью: 26–29 шт./мес. Они имели длинные циклы яйценоскости (8–15 яиц) и короткие интервалы между циклами (1–2 дня). Опытные
перепелки с низкой и неустойчивой яйценоскостью имели короткие циклы
(4–5 яиц) или длинные – с длинными интервалами, или имели нарушение
цикла в целом: сносили яйца через день, или два дня подряд потом день-два
пауза, встречались и другие нарушения цикла яйценоскости.
В таблице 8 приведены примеры несушек с высокой массой яиц с различными циклами и устойчивостью яйценоскости. Лучшие несушки с длинными циклами яйцекладки и устойчивой яйценоскостью за 7 месяцев продуктивности сносили от 2167,2 г до 2514,6 г яичной массы, что на 10,0–
27,7 % превышает средний выход яичной массы для несушек с высокой массой яиц.
119
Таблица 8
Связь яичной продуктивности трансгенных перепелок с циклами
яйценоскости
Яичная продуктивность за 3-й месяц яйценоскости
Номер
несушки
Количество яиц,
шт./мес.
Масса яйца,
г
Яйцемасса,
г
Яйцемасса
за 7 месяцев
яйценоскости,
г
Несушки с длинными и устойчивыми циклами яйценоскости
550101
29
12,6±0,10
364,4
2195,6
8781
27
13,3±0,08
359,4
2303,1
7892
27
14,2±0,17
382,9
2514,6
551102
26
13,6±0,09
352,7
2267,7
550104
26
13,7±0,14
355,5
2167,2
Несушки с длинными и неустойчивыми циклами яйценоскости
9761
24
13,9±0,13
334,3
2111,3
2482
19
13,2±0,12
251,5
1693,1
2474
20
13,3±0,15
265,4
1948,6
2498
24
13,3±0,12
318,8
1853,7
Несушки с короткими устойчивыми циклами яйценоскости
2470
24
13,2±0,11
316,5
2224,7
9961
24
13,6±0,07
326,9
2118,7
9761
24
13,9±0,09
334,1
2066,6
8793
25
13,0±0,10
325,5
2229,8
Несушки с короткими неустойчивыми циклами яйценоскости
7886
22
14,0±0,17
308,0
1362,2
0886
15
13,0±0,10
195,0
1782,6
9771
22
13,3±0,11
292,6
1820,4
7881
22
13,9±0,08
304,8
1885,0
Морфологические показатели перепелиных яиц
Были изучены морфологические показатели перепелиных яиц всех весовых категорий, встречавшихся в наших опытах. Чтобы получить динамику
морфологических показателей, проанализированные яйца были разделены на
десять весовых категорий с интервалом в 1 грамм (табл. 9)
120
Таблица 9
Морфологические показатели перепелиных яиц
в зависимости от их массы
Показатель
Масса яйца, г
Группа
перепелов
Весовая категория яиц, г
8,0– 9,1– 10,1– 11,1– 12,1– 13,1– 14,1–
9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 18,0
опытная
8,90 9,39 10,49 11,62 12,57 13,74 17,90
контрольная
8,74 9,73 10,50 11,65 12,54 13,61
опытная
9,5
9,8
9,8
9,4
9,0
9,5
контрольная
10,3 9,9
9,6
9,6
9,4
9,0
опытная
30,8 30,7 31,7
33,0
32,2
31,3
контрольная
29,0 30,0 31,7
30,6
31,5
30,6
опытная
59,7 59,5 58,4
57,7
58,8
59,2
контрольная
60,8 60,6 58,7
59,8
59,1
60,3
опытная
1,94 1,91 1,88
1,75
1,83
1,89
контрольная
2,09 2,01 1,86
1,94
1,89
1,97
опытная
83,6 79,7 78,5
75,6
76,6
75,4
контрольная
80,4 76,0 77,4
78,0
77,7
78,4
Доля в яйце, %:
скорлупы
желтка
белка
Отношение белок/желток
Индекс формы, d/D·100 %
8,1
39,6
52,3
1,32
67,5
Изучение морфологии яиц показало, что увеличение массы яиц от 8,0
до 14,0 граммов в опытной и контрольной группах было обусловлено пропорциональным увеличением его составных частей: скорлупы, белка и желтка (рис. 15). Доля желтка в контроле составляла 29,0–31,7%, белка – 58,7–
60,8%, скорлупы – 9,0–10,3%. Наблюдаемые колебания этих показателей не
имели прямой зависимости от массы яиц. В опытной группе доля желтка составила 30,7–39,6%, белка – 52,3–59,5%, скорлупы – 8,1–9,5%. Особо крупные (больше 14,0 г) яйца имели достоверно большую долю желтка и меньшую – белка. Доля желтка и белка в опытных яйцах нормальной массы имела
лишь тенденцию соответствующих изменений.
Соотношение белок/желток (рис. 16) для яиц контрольной группы было 1,9–2,1; в опытной группе, для яиц нормальной массы, несколько ниже –
1,8–2,0; и существенно меньше для крупных яиц – 1,8–1,3.
Индекс формы перепелиных яиц обеих групп массой 8,0–15,0 г практически был одинаковым и составил 84%–75%. При дальнейшем увеличении
121
массы яиц в опытной группе происходило снижение индекса формы до
67,5% (рис. 17).
70
– скорлупа
– желток
– белок
60
Доля в яйце, %
50
40
30
20
10
0
8,9
9,4
10,5
11,6
12,6
13,7
14,3
15,6
16,5
17,9
Средняя масса яйца, г
Рисунок 15. Компонентный состав перепелиного яйца в зависимости
от его массы
2,2
Отношение белок / желток
2,0
1,8
1,6
1,4
опыт
контроль
1,2
1,0
8,9
9,4
10,5
11,6
12,6
13,7
14,3
15,6
16,5
Средняя масса яйца, г
Рисунок 16. Соотношение белок/желток в зависимости от массы
перепелиного яйца
17,9
122
90,0
Индекс формы, %
85,0
80,0
75,0
70,0
опыт
контроль
65,0
60,0
8,9
9,4
10,5
11,6
12,6
13,7
14,3
15,6
16,5
17,9
Средняя масса яйца, г
Рисунок 17. Индекс формы перепелиного яйца в зависимости
от его массы
Цвет и пигментация яичной скорлупы в опытной и в контрольной
группе различий не имели. Как правило, яйца имела характерную пеструю
окраску с коричневыми пятнами.
Биохимический состав яиц
В табл. 10 представлены данные по биохимическому составу желтка и
белка перепелиных яиц различной массы, полученных от птицы опытных и
контрольных групп. Результаты анализов указывают на некоторые колебания
содержания химических веществ перепелиных яиц. Желток перепелиных яиц
содержит в среднем 46,5% воды. Колебания в ту или другую сторону составили от 0,5 до 0,9%. Разницы между яйцами трансгенных и контрольных перепелок не было. Не обнаружено также закономерной разницы по этому показателю в зависимости от массы яйца. Большая часть сухих веществ желтка
26–29% приходится на долю липидов. Колебания в этих пределах характерны
для трансгенных и контрольных яиц в равной степени. Содержание протеи-
123
нов составило от 15 до 17% для всех проанализированных желтков, независимо от их массы и принадлежности к группе. Белок перепелиных яиц обоих
групп на 85,0–87,9% состоял из воды. На долю протеинов приходилось от
8,86 до 10,88%. Было определено содержание основных витаминов и других
показателей желтка и белка, которые также вошли в табл. 10.
Таблица 10
Биохимический состав перепелиных яиц различной массы
Масса яиц перепелов, г
трансгенных
Показатель
Исследовано яиц, шт.
контрольных
12,5
±0,3
13,2
±0,1
13,5
±0,2
14,1
±0,3
14,3
±0,2
10,8
±0,1
12,5
±0,1
13,1
±0,2
27
24
20
22
18
20
20
20
Желток
Вода, %
45,8
46,7
47,2
46,0
45,9
46,3
47,5
45,9
Сухие вещества, %
54,2
53,3
52,8
54,0
54,1
53,7
52,5
54,1
Протеин, %
17,0
15,6
14,6
15,2
15,1
15,7
15,7
16,0
Липиды, %
26,1
28,5
27,8
28,3
29,3
28,6
27,8
29,2
Фосфор, %
0,56
0,55
0,52
0,54
0,54
0,56
0,57
0,58
рН
5,96
5,96
5,99
5,97
5,94
6,00
5,97
5,93
Кислотное число, мг KOH/г
4,99
5,12
5,38
5,15
5,21
5,13
4,92
4,92
Каротиноиды, мкг/г
9,2
10,3
13,9
13,8
16,6
12,2
16,7
20,7
Витамин А, мкг/г
15,2
12,8
16,8
13,4
16,0
14,2
15,2
19,7
Витамин Е, мкг/г
67,2
61,5
56,7
60,6
80,5
75,4
89,1
90,5
Витамин В2, мкг/г
4,10
3,68
4,05
4,23
3,93
3,82
4,11
4,19
Белок
Вода, %
87,0
86,6
87,3
87,2
87,0
87,5
85,0
87,9
Сухие вещества, %
13,0
13,4
12,7
12,8
13,0
12,5
15,0
12,1
Протеин, %
9,47
9,95
9,19
9,58
9,91
9,33
10,8
8,86
рН
9,13
9,10
9,12
9,13
9,03
9,06
9,07
9,06
Витамин В2, мкг/г
1,68
1,81
1,79
1,87
1,91
1,95
2,16
2,07
Изучение содержания некоторых микроэлементов в желтке и белке яиц
(табл. 11) также не выявило закономерных различий между группами.
124
Таблица 11
Содержание микроэлементов в перепелиных яйцах, мг %
Масса яиц перепелов, г
Показатель
трансгенных
13,2±0,1
контрольных
14,1±0,3
10,8±0,1
12,5±0,1
13,1±0,2
Желток
Цинк
3,10
2,85
2,15
2,09
2,58
Медь
0,30
0,33
0,35
0,29
0,31
Марганец
0,12
0,09
0,09
0,07
0,09
Железо
5,34
4,30
3,71
4,46
4,87
Белок
Цинк
0,07
0,06
0,10
0,08
0,06
Медь
0,06
0,04
0,10
0,06
0,07
Железо
0,32
0,25
0,31
0,31
0,31
Был изучен и представлен в табл. 12 аминокислотный состав протеинов
белка. Как следует из полученных результатов, аминокислотный состав яичного белка трансгенных перепелок не отличался от такового у контрольных
особей.
Таблица 12
Содержание аминокислот в белке перепелиных яиц, % от протеина
Масса яиц перепелов, г
Показатель
трансгенных
контрольных
13,5±0,2
14,3±0,2
13,1±0,2
Лизин
6,52
6,37
6,62
Гистидин
3,59
3,54
3,42
Аргинин
5,62
5,45
5,88
Аспарагиновая к-та
8,89
8,78
8,92
Треонин
5,52
5,54
5,46
Серин
5,95
5,81
5,87
Глутаминовая к-та
14,6
14,5
14,4
Пролин
4,17
3,93
4,23
Глицин
3,59
3,42
3,73
Аланин
5,35
5,27
5,33
125
Масса яиц перепелов, г
Показатель
трансгенных
контрольных
13,5±0,2
14,3±0,2
13,1±0,2
Цистин
2,72
2,56
2,54
Валин
7,07
6,47
6,55
Метионин
3,52
3,44
3,54
Изолейцин
4,57
4,72
4,84
Лейцин
8,68
8,57
8,68
Тирозин
3,73
3,77
3,83
Фенилаланин
5,71
5,56
5,76
Содержание жирных кислот в липидах желтка перепелиных яиц представлено в табл. 13. В яйцах у контрольных перепелов на долю насыщенных
жирных кислот приходилось 41,35, мононенасыщенных – 41,08, полиненасыщенных – 17,59%. Сумма насыщенных и полиненасыщенных жирных кислот в липидах желтка у птиц в опытной группе была соответственно на 1,77
и 10,35% больше, сумма мононенасыщенных жирных кислот – на 6,26%
меньше, чем в контрольной. Выявленные различия обусловлены в основном
увеличением содержания стеариновой (на 12,3%) и линолевой (на 10,70%) и
уменьшением количества олеиновой (на 6,40%) кислоты в яйцах у перепелов
из опытной группы. При этом массовая доля олеиновой кислоты изменялась
от 31,40 до 37,00%, линолевой – от 19,90 до 17,30% Содержание жирных кислот в яйце не зависело от возраста несушек (табл. 14). В опытной группе количество стеариновой кислоты в яйцах у несушек 3- и 6-месячного возраста
было соответственно на 13,61 и 20,75%, линолевой кислоты – на 13,21 и
9,83% выше контроля. Доля олеиновой кислоты в яйцах у 6-месячных несушек из опытной группы оказалась на 12,14% ниже, чем в контроле (рис. 18).
При изменении массы яиц и у опытных, и у контрольных перепелов наблюдались изменения в содержании отдельных жирных кислот в липидах желтка
(табл. 15, 16) Главным образом это относилось к жирным кислотам с 18 атомами углерода: стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой. Так, при
изменении массы яиц с шагом в 0,5 г, сумма насыщенных жирных кислот
126
изменялась в рамках 40,27%–43,56%, мононенасыщенных – от 37,74% до
43,47%, полиненасыщенных – от 16,18% до 19,44%. С увеличением массы
яиц от 9,1 г до 11,5 г в контрольной группе в них увеличилось содержание
стеариновой (на 9,8%), линолевой (на 15,1%) кислот, но уменьшилось олеиновой (на 6,9%) и линоленовой (на 35,3%) жирных кислот. Подтверждая более высокий уровень стеариновой кислоты в липидах желтка опытной группы в сравнении с контролем, следует отметить его постоянное содержание и
практическую независимость от весовой категории яиц опытной группы массой от 11,5 до 14,5 граммов. Массовая доля олеиновой кислоты менялась от
31,4% до 37,0%, линолевой – от 19,9% до 17,3% (рис. 19).
Таблица 13
Содержание жирных кислот в желтке перепелиных яиц, % от суммы
Показатель
Контрольная группа
Опытная группа
Сумма насыщенных жирных кислот
41,35±0,64
42,08±0,37
С14:0 (миристиновая)
0,35±0,03
0,31±0,02
С15:0 (пентадекановая)
0,11±0,02
0,11±0,01
С16:0 (пальмитиновая)
25,54±0,45
24,12±0,32
С17:0гептадекановая)
0,50±0,07
0,87±0,09
С18:0 (стеариновая)
14,85±0,51
16,68±0,25
41,06±0,92
38,51±0,54
С16:1 (пальмитоолеиновая)
4,39±0,20
3,87±0,13
С17:1 (гептадеценовая)
0,32±0,07
0,60±0,11
С18:1 (олеиновая)
36,37±0,84
34,05±0,61
17,59±0,54
19,41±0,49
С18:2 (линолевая)
17,19±0,56
19,03±0,46
С18:3 (линоленовая)
0,40±0,05
0,38±0,06
в том числе:
Сумма мононенасыщенных жирных
кислот
в том числе:
Сумма полиненасыщенных жирных
кислот
в том числе:
127
Таблица 14
Содержание жирных кислот в желтке перепелиных яиц (% от суммы) в
зависимости от возраста перепелов
Показатель
Контрольная группа
Опытная группа
11–12 нед.
Насыщенные (сумма)
41,67±1,03
39,47±3,95
С14:0 (миристиновая)
0,36±0,03
0,18±0,02
С15:0 (пентадекановая)
0,10±0,02
0,03±0,00
С16:0 (пальмитиновая)
25,69±0,64
21,30±2,13
(С17:0гептадекановая)
0,54±0,11
0,93±0,09
С18:0 (стеариновая)
14,99±0,85
17,03±1,70
41,94±1,43
42,46±4,25
С16:1 (пальмитоолеиновая)
4,34±0,35
3,36±0,34
С17:1 (гептадеценовая)
0,41±0,11
0,55±0,06
С18:1 (олеиновая)
37,19±1,17
38,55±3,86
16,39±0,48
18,08±1,81
С18:2 (линолевая)
15,97±0,52
18,08±1,81
С18:3 (линоленовая)
0,43±0,08
0,00±0,00
в том числе:
Мононенасыщенные (сумма)
в том числе:
Полиненасыщенные (сумма)
в том числе:
24–25 нед.
Насыщенные (сумма)
39,37±0,15
42,23±0,38
С14:0 (миристиновая)
0,38±0,06
0,32±0,03
С15:0 (пентадекановая)
0,12±0,02
0,12±0,02
С16:0 (пальмитиновая)
24,74±0,30
24,17±0,25
(С17:0гептадекановая)
0,25±0,13
0,87±0,11
С18:0 (стеариновая)
13,88±0,39
16,76±0,32
42,50±0,96
38,04±0,61
С16:1 (пальмитоолеиновая)
4,10±0,20
3,82±0,15
С17:1 (гептадеценовая)
0,18±0,05
0,63±0,14
С18:1 (олеиновая)
38,23±0,81
33,59±0,70
в том числе:
Мононенасыщенные (сумма)
в том числе:
128
Показатель
Контрольная группа
Опытная группа
18,14±0,82
19,73±0,57
С18:2 (линолевая)
17,60±0,86
19,33±0,54
С18:3 (линоленовая)
0,54±0,05
0,40±0,07
Полиненасыщенные (сумма)
в том числе:
44–45 нед.
Насыщенные (сумма)
42,02±0,73
42,32±0,96
С14:0 (миристиновая)
0,29±0,06
0,32±0,02
С15:0 (пентадекановая)
0,12±0,05
0,08±0,02
С16:0 (пальмитиновая)
25,79±1,14
24,83±1,11
(С17:0гептадекановая)
0,59±0,07
0,85±0,05
С18:0 (стеариновая)
15,22±0,78
16,24±0,37
38,41±0,31
39,10±0,37
С16:1 (пальмитоолеиновая)
4,68±0,09
4,21±0,31
С17:1 (гептадеценовая)
0,25±0,08
0,49±0,07
С18:1 (олеиновая)
33,48±0,17
34,40±0,20
19,64±0,50
18,57±1,29
С18:2 (линолевая)
19,37±0,42
18,17±1,18
С18:3 (линоленовая)
0,28±0,09
0,40±0,16
в том числе:
Мононенасыщенные (сумма)
в том числе:
Полиненасыщенные (сумма)
в том числе:
Таблица 15
Содержание жирных кислот (% от суммы) в желтке перепелиных яиц
различных весовых категорий. Контрольная группа перепелов
Показатель
Весовая категория яиц, г
9,1–9,5
9,6–10,0
10,1–10,5
11,1–11,5
41,86
40,35
43,56
40,27
С14:0 (миристиновая)
0,46
0,35
0,33
0,3
С15:0 (пентадекановая)
0,05
0,10
0,13
0,105
С16:0 (пальмитиновая)
27,42
24,83
27,15
23,98
(С17:0гептадекановая)
0,36
0,55
0,44
0,55
С18:0 (стеариновая)
13,57
14,52
15,51
15,34
Насыщенные (сумма)
в том числе:
129
Показатель
Весовая категория яиц, г
9,1–9,5
9,6–10,0
10,1–10,5
11,1–11,5
40,71
43,47
37,74
40,29
С16:1 (пальмитоолеиновая)
4,97
4,43
4,14
4,36
С17:1 (гептадеценовая)
0,21
0,44
0,16
0,315
С18:1 (олеиновая)
35,53
38,60
33,44
35,61
17,43
16,18
18,78
19,44
С18:2 (линолевая)
16,98
15,68
18,52
19,08
С18:3 (линоленовая)
0,45
0,50
0,26
0,355
Мононенасыщенные (сумма)
в том числе:
Полиненасыщенные (сумма)
в том числе:
Таблица 16
Содержание жирных кислот (% от суммы) в желтке перепелиных яиц
различных весовых категорий. Опытная группа перепелов
Весовая категория яиц, г
Показатель
11,5–
12,0
12,1–
12,5
13,0–
13,5
13,6–
14,0
14,1–
14,5
43,04
41,30
43,14
41,21
41,3
С14:0 (миристиновая)
0,35
0,28
0,31
0,32
0,37
С15:0 (пентадекановая)
0,16
0,07
0,14
0,08
0,09
С16:0 (пальмитиновая)
24,14
23,35
25,80
24,01
24,42
С17:0 (гептадекановая)
1,11
0,78
0,99
0,85
0,17
С18:0 (стеариновая)
17,29
16,82
15,91
15,95
16,25
36,58
39,13
38,95
38,43
40,75
С16:1 (пальмитоолеиновая)
4,23
3,57
4,22
3,78
3,54
С17:1 (гептадеценовая)
0,95
0,52
0,45
0,63
0,2
С18:1 (олеиновая)
31,40
35,04
34,29
34,02
37,01
20,38
19,57
17,90
20,35
17,95
С18:2 (линолевая)
19,92
19,32
17,54
19,63
17,32
С18:3 (линоленовая)
0,47
0,25
0,36
0,72
0,63
Насыщенные (сумма)
в том числе:
Мононенасыщенные (сумма)
в том числе:
Полиненасыщенные (сумма)
в том числе:
130
Контрольная группа
45
40
35
% о т сум м ы
30
насыщенные
25
мононенасыщенные
полиненасыщенные
20
15
10
5
0
11–12
24–25
44–45
Возраст, нед.
Опытная группа
45
40
35
% о т сум м ы
30
насыщенные
мононенасыщенные
25
20
полиненасыщенные
15
10
5
0
11–12
24–25
44–45
Возраст, нед.
Рисунок 18. Жирнокислотный состав липидов желтка перепелиных яиц
в зависимости от возраста перепелов
131
Контрольная группа
50
45
40
% от суммы
35
30
насыщенные
25
мононенасыщенные
20
полиненасыщенные
15
10
5
0
9,1–9,5
9,6–10,0
10,1–10,5
11,1–11,5
Весовая категория яиц, г
Опытная группа
50
45
40
% от суммы
35
30
насыщенные
25
мононенасыщенные
полиненасыщенные
20
15
10
5
0
11,5–12
12,1–12,5
13,0–13,5
13,6–14,0
14,1–14,5
Весовая категория яиц, г
Рисунок 19. Жирнокислотный состав липидов желтка перепелиных яиц
различных весовых категорий
Результаты производственной проверки
В производственной проверке подтвердились результаты исследований
о высокой массе яиц трансгенных перепелов: масса яиц группы перепелок
нового варианта была на 18,7% выше массы яиц перепелов базового варианта
в возрасте 11-12 недель. Материалы еженедельных взвешиваний яиц перепелок, отличающихся по средним показателям, с 7- до 50- недельного возраста,
позволили определить целесообразный возраст проведения оценки перепелок
132
по этому признаку (11-12 недель). Именно в этом возрасте масса яйца соответствует средним показателям за весь период яйценоскости. На данный способ оценки получен Патент РФ на изобретение №2402209 «Способ отбора
перепелок по массе яиц» (2009).
3.2. Изучение эстрогениндуцированного вителлогенеза и
биогенеза рибосом печени цыплят
Влияние 17-β-эстрадиола на массу печени, ее состав и функцию
Введение 17-β-эстрадиола в дозе 30 мг/кг цыплятам вызывало увеличение массы печени (табл. 17): через 24 часа после эстрогенизации показатель
достоверно отличался от контроля (p<0,001), (соответственно 33,6 и 23,1 г/кг
живой массы), через 96 ч – увеличился более чем в 2 раза. Максимальное
значение массы печени регистрировали на 4–5 сутки, затем происходило
снижение, и на 8–9 сутки она возвращалась к контрольному значению. Содержание белка, ДНК и РНК в расчете на 1 г сырой печеночной ткани было
практически одинаковым или несколько выше в контроле, чем в опыте, за
исключением концентрации ДНК через 12 ч и РНК через 72 ч., а общее повышение регистрируемых значений соответствовало росту массы органа.
Таблица 17
Влияние 17-β-эстрадиола на массу печени цыплят и содержание в ней
белка, РНК, ДНК
Показатель
Экспозиция, часы
0
4
12
24
36
48
72
96
Масса печени
г/кг живой массы
23,1
±1,6
23,6
±0,8
24,2
±0,9
33,6
±1,7
38,2
±4,9
42,6
±2,5
42,8
±2,8
51,5
±1,5
% от контроля
100
102
105
145
165
184
185
222
Белок мг/г печени
176
±11
159
±18
155
±7
172
±12
153
±7
154
±11
145
±11
140
±10
% от контроля ×
печень
100
92
92
142
144
162
152
178
ДНК мг/г печени
2,47
±0,07
2,31
±0,12
2,79
±0,18
1,91
±0,09
2,15
±0,06
1,91
±0,1
2,23
±0,14
1,83
±0,13
% от контроля ×
печень
100
96
119
112
144
166
167
164
133
Экспозиция, часы
Показатель
0
4
12
24
36
48
72
96
РНК мг/г печени
6,64
±0,24
5,10
±0,25
6,79
±0,16
5,67
±0,23
6,64
±0,27
6,35
±0,24
8,08
±0,40
6,92
±0,28
% от контроля ×
печень
100
79
106
123
165
177
226
231
Отношение
РНК/ДНК
2,68
2,20
2,41
2,96
3,08
3,32
3,62
3,78
Возросшая величина соотношения РНК/ДНК (с 2,68 в контроле до 3,78
через 96 ч) может свидетельствовать об усилении транскрипционной активности или снижении скорости деградации РНК, либо того и другого. Уменьшение количества ДНК через 24, 36 и 96 ч было обусловлено гипертрофией
гепатоцитов.
Содержание рибосом в печени цыплят повысилось на вторые сутки,
оставаясь на этом уровне и на 4 сутки после введения эстрадиола. В это же
время содержание рибосом на 25% превосходило контрольное значение в пересчете на грамм печени, и на 49% в пересчете на мг ДНК (табл. 18).
Таблица 18
Рибонуклеазная активность и содержание рибосом в печени цыплят
после однократного введения эстрадиола
Время после введения
эстрадиола, сутки
Рибосомы А260/г
печени
Рибосомы А260/мг
ДНК
Рибонуклеаза
А260/мин г печени
контроль
209±7
1/6
183±4
1/2
197±4
60,9±3,0
1,24±0,07
1
207±5
57,3±1,8
1,32±0,10
2
257±14
3
238±12
4
262±3
5
225±21
6
246±2
7
220±3
8
209±5
9
176±8
63,2±2,3
*
*
52,4±1,5
81,6±3,2
1,33±0,06
*
**
68,8±1,8
***
94,0±2,4
*
0,95±0,07
*
**
1,24±0,14
***
1,12±0,01
*
1,88±0,11
**
2,05±0,08
***
70,5±2,0
1,73±0,08
*
63,3±2,1
1,73±0,05
**
1,72±0,08
*
71,6±4,2
**
1,79±0,10
79,6±1,2
42,8±1,0
**
***
134
Увеличение содержания рибосом в печени в ответ на эстрогенизацию
цыплят свидетельствует об увеличении белоксинтезирующего аппарата гепатоцитов, необходимом для значительного увеличения синтеза белка на экспорт.
Изменение рибонуклеазной активности согласуется с динамикой содержания РНК и рибосом. Через 48–96 часов, когда происходило увеличение
количества рибосом, РНК-азная активность была ниже контрольного значения. Снижение содержания РНК и рибосом (р < 0,05) через 4 часа после введения эстрадиола сопровождалось увеличением рибонуклеазной активности
(р < 0,02). Через 12 часов – она находилась на уровне контроля.
Введение эстрадиола цыплятам вызывало увеличение содержания общего белка в плазме крови. На вторые сутки после эстрогенизации концентрация белка уже достоверно отличалась от контрольного значения (p <0,05)
и составила 53,9 мг/мл против 44,5мг/мл в контроле. Максимальная концентрация белка наблюдалась на 5–6 сутки, когда она на 74–68% превышала
контрольный уровень и составила 77,4–74,9 мг/мл соответственно при дозе
гормона 30 мг/кг. Фосфопротеидный фосфор, который в плазме крови цыплят из контрольной группы практически отсутствовал, появлялся в регистрируемых количествах через 4 ч после введения гормона, а через 12 ч его содержание составило 2,2 мкг/мл и достоверно отличалось от контроля
(p<0,001). Максимум в содержании фосфопротеидного фосфора наблюдался
на 5-е сутки, и составил 159,0 мкг/мл. Электрофорез белков плазмы крови
показал, что введение 17-β-эстрадиола привело к появлению двух крупных
белков, характерных для крови кур-несушек (рис. 20).
135
Рисунок 20. Электрофореграмма белков плазмы крови цыплят в разное
время после введения им 17-β-эстрадиола, 1,2,3,4, – стандарты м.м.,
5,6, – контроль, 7,8, – 1 сутки, 9,10 – 2 суток, 11,12 – 5 суток, 13,14 –
6 суток, 15,16 – 9 суток, 17,18 – 10 суток, 19,20 – белки плазмы крови
курицы-несушки
Определение молекулярной массы (м.м.) и окрашивание на фосфор выявило только одну фракцию с м.м. 205 килодальтон (кД), представленную
мономером вителлогенина, что согласуется с данными других авторов – 200
кД [3]и 190 кД [4]. Это означает, что весь фосфопротеидный фосфор плазмы
крови эстрогенизированных цыплят связан с вителлогенином. Другой индуцируемый эстрадиолом крупный белок с м.м. 405 кД представляет собой
апопротеин липопротеида очень низкой плотности I (ЛОНП I). По данным
других авторов – 350 кД [5]. Кроме вителлогенина и ЛОНП I под влиянием
17-β-эстрадиола заметно увеличилась фракция с м.м. 11,5 кД, представляющая собой ЛОНП II.
Для количественной обработки денситограммы были разделены на 6
фракций (рис. 21).
136
Рисунок 21. Денситограммы электрофоретического разделения белков
плазмы крови цыплят; а – контроль, б – на 6-е сутки после введения
17-β эстрадиола
Поскольку на гели наносили равные объемы плазмы крови, количество
белка в отдельных фракциях выражали в процентах по отношению к общему
белку плазмы крови контрольных цыплят (табл. 19).
137
Таблица 19
Количественный состав белковых фракций плазмы крови цыплят
после введения 17-β-эстрадиола (%)
Белковая фракция
(рис.21)
Время после введения гормона, сутки
Контроль
0,5
1
2
5
6
9
10
1(ЛОНП I)
–
0,8
2,3
9,2
20,0
20,8
9,2
1,5
2(вителлогенин)
–
–
0,8
6,2
20,0
23,0
9,2
–
3
3,1
2,7
2,3
3,1
5,4
5,4
6,2
3,8
4
88,5
77,4
76,9
87,7
102,3
100,2
113,8
108,5
5
6,9
4,7
3,1
4,6
6,2
9,2
10,8
12,3
6(ЛОНП II)
1,5
2,2
3,1
3,1
10,8
9,2
4,6
–
100,0
87,8
88,5
113,8
164,6
167,8
153,8
126,2
Общий белок
Количественная обработка электрофореграмм показывает, что индукция 17-β-эстрадиолом синтеза ЛОНП I(фракция 1) и вителлогенина (фракция
2) имела разную динамику. ЛОНП I появлялся в крови раньше вителлогенина, а исчезал позже. На максимуме, а это 5–6 сутки после введения 17-βэстрадиола, их содержание было одинаковым и составило 20% от общего
белка в контроле.
Содержание ЛОНП II (фракция 6) на максимуме ответа было в два раза
ниже, чем вителлогенина, что составило 10%. Но с учетом их м.м., молекул
ЛОНП II содержалось в крови примерно в 9 раз больше. Это означает, что
индукция 17-β-эстрадиолом синтеза ЛОНП II во много эффективнее, чем индукция синтеза вителлогенина.
Из 70%, на которые увеличилось содержание белка в плазме крови цыплят после эстрогенизации, в среднем по 20% приходилось на долю ЛОНП I
и вителлогенина, и 10% – на долю ЛОНП II. То есть увеличение содержания
белка на 3/4 обусловлено появлением в крови главных протеинов – предшественников яичного желтка. Оставшаяся доля (1/4) обусловлена возрастанием концентрации белков, являющихся обычными компонентами плазмы крови цыплят (фракции 3–5).
138
Влияние дозы 17-β-эстрадиола на вителлогенез
Результаты действия разных доз эстрадиола на эстрогениндуцированный вителлогенез у цыплят приведены в табл.20. Все использованные дозы
эстрадиола приводили к достоверному (р < 0,05÷0,01) увеличению общего
белка плазмы крови цыплят на 2-е сутки экспозиции. Содержание белка продолжало увеличиваться. На 6-е сутки оно имело наибольшее значение для
всех использованных доз эстрадиола кроме 10 мг/кг. Большие дозы эстрадиола (50 и 70 мг/кг) вызывали большую скорость накопления белка в плазме
крови по сравнению с дозами 10 и 30 мг/кг и на 4-е сутки различия достоверны (р < 0,05). На 6-е сутки экспозиции эстрадиола действие его в дозах 30 и
50 мг/кг на содержание белка в плазме крови одинаково, в то время как при
дозе 10мг/кг содержание белка ниже, а при 70 мг/кг выше этого значения.
Действие разных доз эстрадиола на содержание фосфопротеидов в
плазме крови несколько отлично от действия на общий белок. Максимальная
скорость накопления фосфопротеидов в крови наблюдалась для доз 30 и
50 мг/кг. Доза эстрадиола 10 мг/кг вызывала низкую скорость накопления
фосфопротеидов, максимум содержания наблюдался на 4-е сутки, а на 6-е сутки содержание фосфопротеидов было близко к контрольному уровню. Доза
эстрадиола 70 мг/кг вызывала несколько большую индукцию синтеза фосфопротеидов по сравнению с 10 мг/кг, и содержание их в крови продолжало непрерывно расти вплоть до 6-х суток. Наибольшее содержание фосфопротеидов для всех использованных доз эстрадиола и экспозиции наблюдалось 6-е
сутки при дозе 30 мг/кг.
Масса печени цыплят, как и содержание общего белка в плазме крови,
интенсивнее увеличивалась при дозах гормона 50 и 70 мг/кг, причем масса печени для этих доз на 6-е сутки выше, чем на 4-е, а для доз 10 и 30 мг/кг – ниже.
Большие дозы эстрадиола (50 и 70 мг/кг) в целом приводили к большему содержанию РНК в печени. Однако содержание рибосом для всех экспозиций больше при дозе 30мг/кг и наибольшее содержание рибосом наблюдалось на 4-е сутки. Доза 10 мг/кг на 6-е сутки экспозиции вызывала снижение
139
содержания рибосом ниже контрольного уровня (р < 0,02), что совпадало с
увеличением содержания ДНК выше контрольного значения (р < 0,05).
Таблица 20
Влияние дозы эстрадиола на эстрогениндуцированный вителлогенез у цыплят
Показатель
Общий белок
плазмы крови
мг/мл
Фосфор
белковый
плазмы крови
мкг/мл
Масса печени,
г/кг
РНК печени
мг/г
ДНК печени
мг/г
Белок печени,
мг/г
Рибосомы
печени, А260/г
Доза мг/кг
Время после введения эстрадиола, сутки
Контроль
2
4
6
44,5±2,2
60,9±2,8
62,4±1,0
55,7±3,2
30
53,9±1,7
62,5±1,3
74,9±1,7
50
61,5±3,8
68,6±1,7
74,7±2,3
70
61,9±1,5
70,3±2,2
79,4±2,5
45,8±5,7
105±17
16,0±10,0
30
77,4±4,9
158±4
296±30
50
71,1±6,9
190±15
225±20
70
58,8±3,7
157±19
201±36
33,4±1,7
35,2±0,2
28,5±1,9
30
33,8±0,6
40,8±0,8
35,9±1,1
50
37,7±1,3
38,4±1,3
40,1±1,8
70
37,1±1,6
40,8±1,2
44,1±2,7
11,2±1,2
11,8±0,4
12,1±0,5
30
12,3±0,8
11,8±0,2
11,2±0,5
50
11,9±0,6
12,9±0,4
13,2±0,2
70
11,3±0,2
13,4±0,5
12,6±0,6
3,31±0,31
2,99±0,28
4,10±0,14
30
3,16±0,23
2,80±0,14
3,10±0,15
50
3,18±0,15
3,31±0,06
3,26±0,12
70
3,06±0,11
3,44±0,09
2,89±0,18
204±3
211±23
221±2
30
201±6
203±8
195±1
50
200±9
197±2
202±9
70
209±7
193±4
197±6
233±25
244±34
158±10
30
257±10
262±30
246±20
50
245±12
228±11
209±13
70
223±12
211±10
238±14
10
10
10
10
10
10
10
0,0
26,0±0,5
10,2±0,7
3,37±0,21
212±10
209±14
140
Влияние повторного введения 17-β-эстрадиола на массу, состав и
функциональную активность печени цыплят
Динамика изменения массы печени цыплят после однократной и повторной эстрогенизации приведена в табл. 21. Как следует из этих данных,
максимальная масса печени при дозе эстрадиола 20 мг/кг живой массы наблюдалась на 3–4 сутки. После повторной эстрогенизации масса печени цыплят была несколько больше, однако, достоверных различий не обнаружено.
Повторное введение эстрадиола цыплятам через 16 суток после предыдущего введения, когда действие ранее введенного гормона уже закончилось,
вызывает большую стимуляцию синтеза вителлогенина. Динамика содержания фосфопротеидного фосфора в плазме крови цыплят после однократного
и повторного введения 17-β-эстрадиола приведена на рис. 22.
300
мкг/мл
200
2
100
1
0
1
2
3
4
5
6
сутки
7
8
9
10
Рисунок 22. Динамика содержания фосфопротеидов в крови цыплят:
1 – однократное, 2 – повторное введение 17-β-эстрадиола
Скорость накопления фосфопротеидов в крови после повторного введения гормона значительно больше. Уже через 9 часов (табл. 21) различия в
содержании белковосвязанного фосфора в плазме крови после однократного
и повторного введения эстрадиола становится достоверными (р < 0,01). На
141
максимуме содержания фосфопротеидов в крови, наблюдаемого в обоих случаях на 5 сутки, содержание фосфопротеидов после повторного введения эстрадиола в 1,72 раза выше, по сравнению с однократным.
Таблица 21
Масса печени и содержание в плазме крови белковосвязанного фосфора и
триглицеридов после однократного и повторного введения 17-β-эстрадиола
цыплятам в дозе 20 мг/кг
Время после
введения эстрадиола
Масса печени,
г/кг
Плазма крови
Фосфор белковый,
мкг/мл
Триглицериды,
мг/мл
однократное
повторное
однократное
повторное
однократное
повторное
28,1±2,7
28,5±2,2
0,5±0,4
0,1±0,0
4,0±0,6
3,1±0,2
3
24,6±0,7
31,6±2,0
0,1±0,0
0,2±0,0
5,0±0,2
3,5±0,6
6
29,5±2,4
35,4±1,4
1,9±0,1
2,1±0,7
5,8±0,1
6,0±0,1
9
29,9±2,6
33,1±0,8
1,1±0,3
3,9±0,4
5,4±0,3
5,5±0,2
1
32,8±1,6
33,8±1,1
15,6±3,1
64,0±1,1
18,5±0,9
19,5±0,5
2
36,1±1,3
38,2±2,1
79,0±7,9
157±1,7
29,5±1,3
37,0±2,3
3
39,0±1,5
38,5±1,5
95,1±19
194±2,0
34,5±5,2
41,8±3,7
4
37,6±1,1
41,1±1,1
81,0±19,
216±7,0
27,0±5,4
49,4±6,6
5
32,5±1,2
33,5±1,5
159±32
274±10
47,9±2,0
65,4±1,7
6
37,0±1,4
32,7±4,2
35,2±22
199±24
8,5±3,3
38,3±10
7
38,2±1,4
36,5±1,6
40,8±19
30,6±1,4
25,6±9,6
13,2±4,3
8
28,7±1,8
29,2±1,9
–
0,9±0,2
–
3,7±0,3
9
30,5±1,9
34,9±5,3
3,3±0,2
1,6±0,3
2,6±0,3
2,9±0,9
10
30,7±1,8
26,9±0,5
0,1±0,0
1,1±0,0
2,5±0,5
4,1±0,5
Контроль
Час
Сутки
Динамика содержания триглицеридов в плазме крови цыплят схожа с
динамикой содержания фосфопротеидов. Максимальное содержание триглицеридов, как и фосфопротеидов, наблюдалось на 5-е сутки как после однократной, так и после повторной эстрогенизации. Различия в содержании
триглицеридов на максимуме ответа несколько меньше, чем в содержании
фосфопротеидов. После повторной эстрогенизации триглицеридов больше
142
всего в 1,36 раз. Скорость накопления триглицеридов в крови после однократной и повторной эстрогенизации также мало различима. Достоверные
различия в содержании триглицеридов появились только на 2-е сутки после
введения гормона (р < 0,05).
Таблица 22
Содержание общего белка, неорганического фосфора и общего кальция
в плазме крови цыплят после однократного и повторного введения
17-β-эстрадиола в дозе 20 мг/кг
Время после
введения
эстрадиола
Общий белок,
мг/мл
Фосфор неорганический, мкг/мл
Общий кальций,
мкг/мл
однократное
повторное
однократное
повторное
однократное
повторное
36,8±2,5
37,0±2,5
61,5±3,9
54,8±3,5
73,9±3,5
69,0±2,5
3
35,9±2,1
41,9±2,0
56,5±1,2
57,4±2,4
71,1±2,4
72,6±1,3
6
43,5±2,0
37,5±2,6
64,5±2,6
61,2±2,5
75,3±0,5
70,6±2,1
9
36,6±2,4
38,8±1,4
61,5±1,9
61,5±2,9
80,6±5,4
90,1±1,6
1
47,9±2,8
51,7±1,4
73,5±3,8
84,7±0,9
94,0±2,7
172±4
2
52,3±2,3
56,4±1,7
96,6±4,5
113±4
239±13
393±11
3
49,3±2,6
58,7±1,4
95,5±7,8
134±1
247±37
454±12
4
55,0±2,5
60,6±0,4
93,6±9,9
129±13
254±44
498±23
5
58,0±1,9
61,6±2,5
137±5
167±3
386±60
675±10
6
50,7±1,6
61,9±2,5
65,3±6,6
140±10
129±34
493±35
7
43,3±1,8
52,8±0,4
53,1±1,2
69,6±12
83,0±2,1
142±31
8
-
51,4±3,5
-
58,4±4,2
-
86,1±1,6
9
44,4±1,4
43,3±3,1
56,8±1,8
56,7±4,5
82,4±1,0
85,8±3,4
10
43,2±0,3
45,8±2,9
50,4±1,7
57,6±3,1
80,9±1,0
86,2±3,1
Контроль
Час
Сутки
Еще меньше различия были в содержании общего белка в плазме крови
цыплят (табл. 22). Различия становились достоверными только на 3-е сутки.
Содержание неорганического фосфора плазмы крови цыплят (табл. 22)
также увеличивалось после введения эстрадиола. Максимальное содержание
неорганического фосфора наблюдалось на 5-е сутки после однократного и
повторного введения эстрадиола, причем после повторного введения содер-
143
жание неорганического фосфора было на 20% выше. Различия в содержании
неорганического фосфора становилось достоверными через 1 сутки после эстрогенизации (р < 0,02).
Динамика содержания общего кальция в крови цыплят после однократной и повторной эстрогенизации цыплят хорошо совпадает с динамикой
содержания фосфопротеидов. На максимуме ответа, наблюдаемого на 5 сутки, содержание общего кальция плазмы крови в 1,75 раз выше после повторного введения эстрадиола, что хорошо совпадает со значением, полученным для фосфопротеидов.
Таким образом, введение эстрадиола цыплятам приводило к увеличению содержания в их крови фосфора белкового и неорганического, триглицеридов, общего белка и общего кальция. Максимальное их содержание наблюдалось на 5-е сутки после эстрогенизации. После повторной эстрогенизации содержание перечисленных метаболитов выше, чем после однократной.
Динамика изменения этих показателей очень похожа. Для выяснения степени
связи между этими показателями в ходе ответа организма цыплят на однократное и повторное введение эстрадиола, были посчитаны коэффициенты
корреляции, которые приведены в табл. 23.
Таблица 23
Коэффициенты корреляции между показателями
плазмы крови цыплят
Общий
белок
Фосфор
неорганич.
Фосфор
белковый
Триглицериды
–
0,76
0,79
0,78
Фосфор
неорганич.
0,76
–
0,96
0,95
Фосфор
белковый
0,79
0,96
–
0,93
Триглицериды
0,78
0,95
0,93
–
Общий
кальций
0,80
0,96
0,99
0,95
Показатель
Общий
белок
Общий
кальций
0,80
0,96
0,99
0,95
–
144
Как следует из данных табл. 23, указанные биохимические показатели
хорошо коррелируют между собой. Наименее тесная корреляционная связь
отмечена между общим белком и другими показателями. Наиболее высокий
коэффициент корреляции был между белковосвязанным фосфором и общим
кальцием (0,99), что говорит о функциональной связи между ними. Для этих
показателей было построено методом наименьших квадратов линейное уравнение регрессии:
Са = 2,0155×P+76,4500;
r = 0,9894,
где: Са, Р – концентрация соответственно кальция и белкового фосфора, мкг/мл.
Коэффициент 76,45 этого уравнения хорошо совпадает с концентрацией общего кальция в плазме крови контрольных цыплят (73,94), разница составила около 3%. Отсюда следует, что прибавка общего кальция в плазме
крови цыплят после введения им эстрадиола, обусловлена долей его, связанной с фосфопротеидами, то есть с вителлогенином. Если сделать перерасчет
с учетом атомных масс кальция и фосфора, то на 1 атом белкового фосфора
приходится 1,56 атомов кальция, за вычетом исходного уровня кальция в
плазме крови, то есть тогда, когда содержание белкового фосфора практически равно нулю. Отсюда следует, что 2 атома фосфора вителлогенина, то есть
две фосфатные группы, связывают в среднем три атома кальция.
На рис. 23 приведены электрофореграммы белков плазмы крови цыплят в разные сроки после однократного и повторного введения эстрадиола, а
также белков плазмы петуха и несушки. Электрофорез проводили в денатурирующих условиях, то есть разделение белков происходило по их молекулярной массе. Окраску проводили на белок (рис. 23а) и на фосфопротеиды
(рис. 23б). Как следует из результатов электрофоретического разделения, нет
качественных различий между белками плазмы крови цыплят после однократной и повторной эстрогенизации. В обоих случаях появляются два крупных полипептида, идентифицированных как вителлогенин и ЛОНП 1.
145
Рисунок 23. Электрофореграмма белков плазмы крови цыплят в разное
время после однократного и повторного введения эстрадиола
а – окраска на белок, б – окраска на фосфор.
Однократное введение
Повторное введение.
Номера Экспозиция, Номера Экспозиция,
образцов
сутки
образцов
сутки
3
0
12
0
4
1
13
1
5
2
14
2
6
3
15
3
7
5
16
5
8
6
17
6
9
7
18
7
10
8
19
8
11
10
20
10
Образец № 1 – плазма крови петуха, № 2 – плазма крови курицы-несушки.
Эти белки имеются в крови несушки и отсутствуют у интактного петуха. После повторного введения эстрадиола эти белки содержаться в крови в
большем количестве. Соотношение их количества (по массе) на максимуме
146
ответа как после однократного, так и после повторного введения эстрадиола
близко к 1. Различия имеются в скорости появления этих белков. Если после
однократного введения эстрадиола ЛОНП 1 появляется раньше вителлогенина и скорость его накопления в крови на первых стадиях ответа на гормон
выше, а исчезает он позже, то после повторного введения гормона оба эти
белка появляются и исчезают из крови почти одновременно.
В табл. 24 приведены данные по содержанию в печени цыплят общего
белка, РНК, ДНК, и рибосом после однократного и повторного введения эстрадиола.
Таблица 24
Содержание общего белка, РНК, ДНК и рибосом в печени цыплят после
однократного и повторного введения им 17-эстрадиола в дозе 20 мг/кг
повторное
6,81±0,37 7,08±0,37 2,11±0,24 2,17±0,10
152±8
145±5
3
173±5
166±2
6,77±0,40 7,04±0,16 2,40±0,18 2,64±0,08
108±3
146±10
6
162±3
168±1
7,48±0,29 6,82±0,40 2,41±0,09 2,54±0,15
173±4
166±10
9
178±3
177±4
7,85±0,23 7,78±0,37 2,32±0,04 2,45±0,12
117±3
128±5
12
175±2
167±4
7,48±0,06 6,57±0,16 2,45±0,13 2,16±0,09
150±8
171±4
1
169±3
169±4
6,77±0,23 6,83±0,16 1,94±0,04 1,98±0,13
199±9
187±4
2
169±3
162±4
8,51±0,13 8,39±0,29 2,19±0,02 1,79±0,11
167±7
179±7
3
165±2
170±3
8,68±0,18 8,44±0,20 1,93±0,07 2,07±0,07
184±4
213±2
4
166±3
168±2
8,41±0,21 8,50±0,05 2,04±0,07 1,76±0,07
207±8
204±5
5
180±4
179±1
9,21±0,28 9,21±0,24 2,34±0,14 2,17±0,06
191±7
193±4
6
189±4 191±10 8,87±0,24 8,84±0,47 2,17±0,10 2,36±0,11
183±6
215±2
7
181±1
176±4
8,41±0,43 8,55±0,23 2,13±0,15 2,12±0,04
217±8
218±7
8
187±5
197±2
7,85±0,25 9,15±0,33 2,37±0,08 2,80±0,19
185±3
206±14
9
186±3 186±12 8,45±0,47 8,60±0,16 3,20±0,09 2,57±0,17 148±13
168±5
10
186±6
153±4
повторное
однократное
Рибосомы
А 260/г
189±4
повторное
однократное
ДНК
мг/г
195±2
контроль
однократное
РНК
мг/г
повторное
Белок
мг/г
однократное
Время
после
введения
эстрадиола
Час
Сутки
198±5
8,57±0,17 8,56±0,11 2,93±0,07 2,89±0,15
163±8
147
Содержание РНК в печени цыплят увеличивалось в обоих случаях, и
максимум содержания наблюдался на 5-е сутки. В содержании ДНК в печени
имеются некоторые различия после однократной и повторной эстрогенизацией. Так, на 2-е и 4-е сутки содержание ДНК достоверно ниже при повторном
введении эстрадиола, что свидетельствует о более высокой степени гипертрофии гепатоцитов. На 9-е сутки после однократного введения эстрадиола
содержание ДНК резко возрастает и превышает даже контрольный уровень
(р < 0,01), что, по-видимому, говорит о распаде клеток гипертрофированной
печени, начинающемся с цитоплазмы. При повторном введении эстрадиола
на последних стадиях ответа повышение ДНК наблюдалось на 8–10-е сутки.
Не было различий в содержании общего белка в печени при ответе на однократную и повторную эстрогенизацию. В обоих случаях происходило
уменьшение содержания белка с минимум на 3–4-е сутки и последующим
возвратом к контрольному уровню на 8–10-е сутки. Снижение содержания
белка происходит вследствие «ожирения» печени, вызываемого эстрадиолом.
В динамиках содержания рибосом в печени после однократного и повторного введения цыплятам эстрадиола (табл. 24) имеются некоторые различия. На 3-ем часу после однократного введения гормона наблюдалось
снижение содержания рибосом ниже уровня контроля (p < 0,05), которого не
было при повторной эстрогенизации цыплят. На 12-ом часу после повторного введения эстрадиола, а также на 3-е и 6-е сутки содержание рибосом было
достоверно выше (p < 0,05) по сравнению с ответом на однократное введение. На прочих экспозициях достоверных различий в содержании рибосом
после однократного и повторного введения гормона не обнаружено.
Наличие значительных разбросов, обусловленных индивидуальной
чувствительностью цыплят к гормону, затрудняет непосредственное сравнение динамики содержания рибосом после однократного и повторного введения эстрадиола. Методом наименьших квадратов для этих динамик были построены уравнения регрессии третьей степени. Для однократного введения
гормона:
148
2
А= 137,5835 + 28,2720·t – 3,6805·t + 0,1028·t
3
r2 = 0,7407
Для повторного введения гормона:
А=147,9495 + 22,4840·t – 1,5227·t2 + 0,0679·t3
r2 = 0,7861
где: А – содержание рибосом, А260/г печени,
t – время после введения гормона, сутки.
Графики этих функций представлены на рис. 24
220
200
2
A260/г
180
1
160
140
120
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
сутки
10
Рисунок 24. Динамика содержания фосфопротеидов в крови цыплят:
1 – однократное, 2 – повторное введение 17-β-эстрадиола
При сравнении этих двух кривых видно, что содержание рибосом в печени цыплят после повторной эстрогенизации в целом несколько выше. Использование t – критерия Стьюдента для двух зависимых выборок с неизвестными дисперсиями показывает, что это различие достоверно (p < 0,05).
Итак, повторное введение эстрадиола цыплятам вызывает более сильную
индукцию синтеза вителлогенина в их печени. При этом содержание рибосом в
печени повторно эстрогенизированных цыплят несколько выше, по сравнению
с ответом на однократную эстрогенизацию. Изменения в печени после однократного и повторного введения 17-β-эстрадиола носили обратимый характер.
149
Действие α-аманитина, актиномицина Д, 5-бромдезоксиуридина
и тиоацетамида на эстрогениндуцированный вителлогенез
у цыплят
С целью выяснения роли метаболизма отдельных классов РНК в становлении вителлогенной функции печени нами использовались: тиоацетамид – стимулирующий синтез некоторых классов РНК [419; 533], α-аманитин – высокоспецифичный ингибитор РНК полимеразы II, ответственной за
синтез мРНК [99; 312], актиномицин Д – антибиотик в малых дозах преимущественно ингибирующий синтез РНК [187; 324], 5-бромдезоксиуридин –
стерический аналог тимидина, включающийся вместо него в ДНК и необратимо нарушающий дифференцировку клеток, а также нормальную репликацию и транскрипцию ДНК [435].
Однократное введение тиоацетамида (ТАА) интактным цыплятам через
24 часа не оказало заметного влияния на массу печени и содержание в плазме
крови цыплят общего белка, фосфопротеидов и триглицеридов (табл. 25). На
4-е сутки после однократного введения ТАА содержание общего белка в
плазме крови цыплят увеличивалось (р < 0,01) однако ежедневное введение
ТАА такого действия не оказало. Введение эстрадиола приводило к увеличению массы цыплят, появлению в плазме крови фосфопротеидов, увеличению
содержания общего белка и триглицеридов. Введение ТАА на фоне действия
эстрадиола оказало ингибирующее действие на индуцированный гормоном
вителлогенез. Так, через сутки после совместного введения эстрадиола и
ТАА содержание фосфопротеидов в плазме крови составило 25%, а триглицеридов 35% от значений, наблюдаемых при введении только эстрадиола. На
4-е сутки после однократного введения ТАА на фоне эстрадиола масса печени цыплят и содержание триглицеридов в крови достоверно (р < 0,05) снижалось, по сравнению с действием только эстрадиола. Ежедневное введение
ТАА, по сравнению с однократным, приводило к большему ингибирующему
действию на эстрогениндуцированный вителлогенез; на 42% снижалось содержание фосфопротеидов, на 27% – триглицеридов, снижалось также содержание общего белка (р < 0,05).
150
Таблица 25
Влияние 17-β-эстрадиола и тиоацетамида на массу печени и некоторые
показатели крови цыплят
Экспозиция,
сутки
Введенное
вещество
Масса
печени,
г/кг
Контроль
–
1
Плазма крови
Общий
белок,
мг/мл
Фосфор
белковый,
мкг/мл
Триглицериды,
мг/мл
22,6±1,2
46,4±1,3
0,0
2,8±0,4
эстрадиол
26,6±0,8
45,2±2,1
15,7±1,8
17,2±1,2
1
ТАА
23,1±0,6
43,1±3,5
0,0
4,7±1,0
1
эстрадиол+ТАА
27,8±1,3
40,2±3,4
4,0±1,2
6,0±1,6
4
эстрадиол
38,9±1,7
64,0±2,0
162±24
45,5±3,7
4
ТАА
23,7±0,7
56,5±1,4
0,0
4,3±1,3
4
ТАА ежед.
25,7±1,1
44,7±1,8
0,0
2,9±0,6
4
эстрадиол+ТАА
35,0±0,5
69,9±2,2
161±15
32,1±3,3
4
эстрадиол+ТАА
ежед.
37,8±1,5
58,7±3,3
93±2
33,2±2,8
Несмотря на то, что ТАА, по литературным данным, значительно увеличивает синтез РНК, в том числе и рРНК, в ядрах клеток печени, введение
его цыплятам в нашем опыте не приводило к увеличению содержания РНК и
рибосом в печени (табл. 26). Более того, ежедневное введение ТАА на четвертые сутки экспозиции снижало содержание суммарной клеточной РНК
печени по сравнению с контролем (р < 0,05). Действие ежедневного введения
ТАА на фоне эстрадиола приводило к снижению содержания РНК до уровня
контроля (р < 0,01), а также увеличивало удельное содержание ДНК в печени
по сравнению с уровнем, который наблюдался при действии одного гормона
на 4-е сутки экспозиции. То есть ТАА ингибировал также гипертрофию гепатоцитов, которая происходит под влиянием эстрадиола.
ТАА не только не увеличивал содержание РНК в печени, но и оказывал
ингибирующее действие на вызываемое эстрадиолом увеличение содержания
РНК и рибосом в печени цыплят, а также на вызываемое им усиление биосинтетических процессов. Такой характер действия ТАА, когда, несмотря на
усиление синтеза РНК не происходит увеличения ее содержания, можно объ-
151
яснить тем, что параллельно увеличению синтеза увеличивается и распад
РНК. Увеличение содержания общего белка в плазме крови цыплят на 4-е сутки после однократного введения ТАА можно объяснить его специфическим
действием на синтез сывороточного альбумина. В работах на крысах было
показано, что введение ТАА приводит к тому, что более 75% белков, синтезируемых печенью, имеют форму альбумина [588], а содержание альбуминовой мРНК в печени увеличивается в 5–6 раз [265].
Таблица 26
Влияние 17-β-эстрадиола и тиоацетамида на макромолекулярный
состав печени цыплят
Экспозиция,
сутки
Введенное
вещество
Контроль
–
1
РНК,
мг/г
ДНК,
мг/г
Белок,
мг/г
Рибосомы,
А260/г
11,3±0,2 3,13±0,12
201±6
167±15
эстрадиол
10,6±0,2 3,10±0,10
187±8
172±9
1
ТАА
11,0±0,1 3,06±0,09
203±6
192±15
1
эстрадиол+ТАА
10,3±0,3 2,89±0,02
181±9
191±5
4
эстрадиол
12,6±0,3 2,62±0,16
193±4
224±6
4
ТАА
11,6±1,4 2,74±0,11 203±10
208±16
4
ТАА ежедн.
9,9±0,5
4
4
2,80±0,12
197±5
190±4
эстрадиол+ТАА
12,6±0,3 2,72±0,18
204±3
210±6
эстрадиол+ТАА
ежедн.
10,7±0,4 2,85±0,15
200±3
212±5
В табл. 27 представлены данные о действии ингибиторов на содержание
в крови цыплят общего белка и кальция, триглицеридов и белковосвязанного
фосфора на 2, 4, и 6-е сутки после введения цыплятам эстрадиола. Нулевой
точкой отсчета времени для введения ингибиторов служит введение цыплятам
гормона. Наряду с абсолютной концентрацией метаболита в крови приводится
его содержание в процентах по следующей шкале, где за 0% принято содержание в контрольной группе цыплят, а за 100% – содержание на данной временной точке в группе, получавшей только гормон. Если различия с контрольной группой или группой, получавшей только гормон, были недостоверны, то содержание метаболитов обозначалось 0% и 100% соответственно.
152
Таблица 27
Биохимические показатели плазмы крови цыплят в разное время
после введения 17-β-эстрадиола и ингибиторов
Введенное
вещество
Контроль
Время
введения,
часы
–
Общий
белок,
мг/мл; %
38,5
±2,7
0
Триглицериды,
мг/мл; %
Общий
кальций
мкг/мл; %
Фосфор
белковый
мкг/мл; %
5,6
±1,7
73
±2
0
0,9
±0,2
0
0
а) вторые сутки после введения гормона
Эстрадиол
0
53,3
±1,8
100
57,9
±3,2
100
181
±5
100
55,4
±5,8
100
Эстрадиол
+ α-аманитин
0
0
24,2
±1,1
0
7,6
±0,2
0
59
±6
0
1,1
±0,1
0
Эстрадиол
+ α-аманитин
0
24
30,5
±3,7
0
48,5
±0,2
82
99
±2
24
10,1
±1,0
17
Эстрадиол
+ актиномицин Д
0
0
37,8
±6,0
0
40,2
±2,8
66
144
±5
66
38,9
±3,7
70
Эстрадиол
+актиномицин Д
0
24
25,1
±1,5
0
26,8
±6,2
41
96
±13
21
16,3
±0,5
28
0
0, 12, 24, 36
45,6
±2,9
48
50,1
±4,7
100
152
±14
100
52,7
±1,7
100
Эстрадиол
+ тиоацетамид
0
0, 24
38,1
±4,5
0
38,0
±3,5
62
106
±5
31
17,8
±1,1
31
Тиоацетамид
0, 24
36,0
±2,2
0
10,8
±0,5
10
60
±2
0
1,4
±0,1
1
Эстрадиол
+ БУДР
б) четвертые сутки после введения гормона
Эстрадиол
0
57,2
±1,2
100
82,2
±9,4
100
337
±11
100
129,0
±12,3
100
Эстрадиол
+БУДР
0
12
49,1
±1,8
57
131,4
±3,7
164
373
±9
114
129,3
±11,2
100
Эстрадиол
+БУДР
0
48, 60
62,4
±0,8
128
91,8
±6,9
100
356
±18
100
125,7
±10,7
100
Эстрадиол
+БУДР
0
0, 12, 24,
36, 48, 60
66,0
±1,1
147
77,1
±1,9
100
297
±27
100
100,6
±10,4
100
в) шестые сутки после введения гормона
Эстрадиол
Эстрадиол
+ α-аманитин
Эстрадиол
+БУДР
0
63,3
±2,1
100
146,2
±8,8
100
455
±50
100
168,7
±23,1
100
0
96, 108, 120
44,6
±4,0
0
76,7
±10,1
51
194
±4
32
35,1
±4,5
20
0
0, 12, 24,
36, 48, 60
61,5
±1,3
100
116,2
±16,6
100
398
±50
100
152,9
±21,5
100
153
Как следует из данных табл. 27, действие α-аманитина зависело от времени его введения. Будучи введенным одновременно с эстрадиолом,
α-аманитин полностью подавлял ответ на эстрогенизацию, увеличения содержания фосфопротеидов и триглицеридов не происходило, а содержание
общего белка в плазме крови снижалось на 37% по сравнению с уровнем контроля. Незначительное, но достоверное снижение отмечено также для общего
кальция плазмы крови. Если же α-аманитин вводился через сутки после эстрадиола, то на вторые сутки после введения гормона он значительно подавлял синтез вителлогенина и в гораздо меньшей степени синтез триглицеридов. Введение α-аманитина на 24-ом часу и на 4–5 сутки снижало также содержание общего белка и общего кальция в плазме крови до уровня контроля.
Действие актиномицина Д носило другой характер и в меньшей степени зависело от времени его введения. В отличие от α-аманитина, актиномицин Д оказывал примерно равное воздействие на содержание в крови триглицеридов, кальция и белкового фосфора, причем введенный через 24 часа после гормона, он оказал большее ингибирующее действие, по сравнению с
введенным одновременно с гормоном.
Бромдезоксиуридин не оказал какого-либо ярко выраженного воздействия на эстрогениндуцированный вителлогенез. Введение его дважды в сутки с 12-и часовым интервалом на вторые сутки подавляло увеличение содержания общего белка, но не оказало влияния на содержание фосфопротеидов, триглицеридов и кальция. Имевшее место снижение незначительно и
недостоверно. Но на 4-е сутки снижалось содержание белка и увеличивалось
содержание триглицеридов. Введение бромдезоксиуридина на 3-и и на 1–3-и
сутки приводило к увеличению содержания общего белка в крови на 4-е сутки по сравнению с группой, получавшей только эстрадиол, и не оказало
влияние на содержание вителлогенина, триглицеридов и кальция на 4-е и 6-е
сутки, и общего белка на 6-е сутки.
Введение эстрогенизированным цыплятам тиоацетамида снижало содержание общего белка в плазме крови до контрольного уровня (табл. 27).
154
ТАА ингибировал вызываемое гормоном увеличение содержания в крови
триглицеридов, вителлогенина и общего кальция. Причем общий кальций и
вителлогенин снижались значительно и в равной степени, а действие ТАА на
содержание триглицеридов было заметно меньшим.
В табл. 28 представлены данные о действие эстрадиола и ингибиторов
на макромолекулярный состав печени. Введение α-аманитина одновременно
с гормоном подавляло увеличение массы печени, содержания рибосом и
снижало содержание общего белка в печени ниже уровня контроля. Введение
α-аманитина через 24 часа после эстрадиола не препятствовало росту массы
печени, однако подавляло увеличение числа рибосом. При этом, как следует
из содержания в печени ДНК, гипертрофия гепатоцитов была даже большей,
чем в группе цыплят, получавших только гормон.
Таблица 28
Масса и биохимические показатели печени цыплят на вторые сутки после
введения эстрадиола и влияние на них ингибиторов
Время
введения,
часы
Масса
печени
г/кг
Белок,
мг/г
Контроль
–
19,9±0,9
201±7
Эстрадиол
0
30,4±2,9
Эстрадиол
+α-аманитин
0
0
21,2±1,1
Эстрадиол
+α-аманитин
Рибосомы,
А260/г
РНК-азная
активность,
А260/мин.г
8,91±0,07 4,24±0,04
142±5
17,8±2,4
181±7
9,19±0,57 3,10±0,03
174±8
12,9±0,6
144±4
8,66±0,41 3,03±0,23
145±4
–
0
24
28,2±1,1 179±11 8,30±0,60 2,78±0,09
143±2
–
Эстрадиол
+актиномицин Д
0
0
24,3±0,5 183±11 9,52±1,04 3,51±0,49
156±6
–
Эстрадиол
+актиномицин Д
0
24
29,9±0,4
177±3
9,84±0,59 2,80±0,19
159±8
–
Эстрадиол
+тиоацетамид
0
0, 24
30,0±2,3
178±6
6,04±0,47 3,10±0,26
153±4
16,7±2,7
Тиоацетамид
0, 24
21,6±1,3
206±2
8,36±0,28 3,32±0,27
127±4
28,9±1,4
Введенное
вещество
РНК,
мг/г
ДНК,
мг/г
Актиномицин Д при обоих способах введения также, как и α-аманитин,
ингибировал увеличение числа рибосом в печени.
155
3
В табл. 29 приведены данные по включению 5- Н-уридина в общую
клеточную РНК и полирибосомную фракцию печени цыплят. Из приведенных данных видно, что на 2-е сутки после введения эстрадиола цыплятам
скорость включения меченого предшественника в РНК на 35% выше, чем в
контроле. Тиоацетамид также увеличивал синтез РНК в печени по сравнению
с контрольной группой. После окончания блокирования синтеза РНК
α-аманитином, которое длится примерно 12 часов [378] после его введения,
происходил интенсивный синтез РНК, во много раз превышающий контрольный уровень. Увеличение синтеза РНК, но в меньшей степени, наблюдалось и после введения актиномицина Д одновременно с гормоном, а при
введении его через 24 часа скорость синтеза РНК была такой же, как в контрольной группе. Таким образом, через 48 часов после введения гормона
происходило восстановление синтеза РНК, блокированного α-аманитином и
актиномицином Д. При этом значительно возрастал пул 3Н-уридина в печени.
Таблица 29
Радиоактивность (3Н) общей клеточной РНК и полирибосомной фракции
печени цыплят на вторые сутки эстрогениндуцированного вителлогенеза
и действия на него α-аманитина, актиномицина Д и тиоацетамида
Время
введения,
часы
Пул
Н-уридина,
расп/мин×мкг печени
РНК,
расп/мин×мкг
печени
Полирибосомы,
расп/мин×мкг
печени
Контроль
–
13,39±0,54
2413±36
774±46
Эстадиол
0
14,52±1,32
3226±40***
794±49
Эстрадиол
+ α-аманитин
0
0
18,39±2,78**
10201±89***
3069±39***
Эстрадиол
+ α-аманитин
0
24
26,32±4,87**
7607±155***
2259±252***
Эстрадиол
+актиномицин Д
0
0
18,15±0,49***
4526±179***
1101±75**
Эстрадиол
+ актиномицин Д
0
24
14,94±0,72
2461±155
750±66
Эстрадиол
+ тиоцетамид
0
0, 24
15,88±3,98
3452±191***
984±208
Тиоцетамид
0, 24
14,02±3,12
3106±67**
579±32
Введенное
вещество
3
156
3.3. Изучение роли митохондрий в вителлогенезе печени
Регуляция биогенеза митохондрий печени цыплят 17-β-эстрадиолом
В нашем опыте 17--эстрадиол оказывал заметное влияние и на функциональную активность митохондрий печени (табл. 30). Так, если содержание ДНК в митохондриях (мтДНК) в контроле составило 0,69 мкг/мг белка,
то через 4 и 12 ч оно возросло соответственно до 0,88 и 0,74 мкг/мг. Еще более высокие значения зафиксировали через 72 и 96 ч: увеличение было соответственно 1,8- и 2,5-кратным (p < 0,001).
Таблица 30
Динамика показателей метаболической активности митохондрий печени у
цыплят в зависимости от периода после введения 17-β-эстрадиола (M±m)
Показатель
Экспозиция гормона, час
0
4
12
24
36
48
72
96
Содержание мтДНК,
мкг/мг белка митохондрий
0,69 0,88 0,74 0,57 0,65 0,63 1,23 1,70
±0,03 ±0,04 ±0,03 ±0,03 ±0,04 ±0,02 ±0,07 ±0,08
Содержание мтРНК,
мкг/мг белка митохондрий
5,2
±0,4
6,0
±0,3
6,8
±0,4
8,1
±0,5
10,8
±0,6
9,7
±0,8
13,6
±0,9
14,9
±1,0
Коэффициент РНК/ДНК в митохондриях
7,5
6,8
9,2
14,2
16,7
15,4
11,0
8,8
Цитохромоксидазная активность, нмоль О2/мин·мг белка
253
±15
217
±20
185
±9
183
±10
165
±11
147
±9
437
±32
437
±29
Коэффициент Са/О
4,0
±0,1
4,0
±0,2
4,3
±0,2
4,8
±0,2
4,8
±0,2
5,8
±0,3
6,6
±0,2
–
Содержание РНК в митохондриях (мтРНК) в опыте оказалось больше,
чем в контроле. Наибольший рост показателя (в 1,6–2,9 раза) происходил в
период с 24 до 96 ч после введения эстрадиола (p<0,001). Величина отношения мтРНК/мтДНК возросла, достигая через 36 ч максимального значения –
16,7, после чего несколько снизилась, оставаясь, тем не менее, выше, чем в
контроле. Цитохромоксидазная активность через 4–48 ч была несколько ниже, через 72–96 ч – в 1,7 раза выше контрольного значения (p<0,001).
Введение цыплятам актиномицина Д одновременно с 17-β-эстрадиолом
полностью ингибировало как падение активности цитохромоксидазы, так и
ее последующее повышение, оставляя ее на уровне контроля. Это предпола-
157
гает изменение активности цитохромоксидазы в зависимости от синтеза РНК
в ядре, так как актиномицин Д, являясь ингибитором транскрипции и биосинтеза белка в клетке, не блокирует синтез РНК в митохондриях. Известно,
что в малых дозах, 50–100 мкг/кг живой массы, он предпочтительно ингибирует синтез рибосомных РНК [391].
Под влиянием эстрадиола в митохондриях печени цыплят происходило
снижение пула свободных аминокислот (табл. 31).
Таблица 31
Содержание свободных аминокислот в митохондриальной фракции печени
цыплят в зависимости от периода после введения 17-β-эстрадиола
Аминокислота,
нМ/мг белка
Экспозиция гормона, час
0
4
12
24
36
48
72
Лизин
6,0±0,5
9,2±0,7
8,9±0,8
10,3±0,6
15,0±1,0
14,7±1,0
9,8±0,7
Гистидин
6,3±0,4
7,5±0,5
5,7±0,4
8,5±0,5
6,0±0,5
6,5±0,4
1,9±1,0
Аргинин
5,6±0,4
6,1±0,5
7,5±0,5
7,5±0,5
14,0±1,0
11,8±0,7
6,9±0,4
Аспарагиновая
кислота
21,6±1,5
21,3±1,2
13,4±0,8
27,1±1,9
22,6±2,0
17,2±1,0
7,2±0,5
Треонин
31,5±1,7
29,6±2,0
20,9±1,2
31,1±2,1
20,4±1,5
19,3±1,2
7,1±0,6
Серин
36,5±1,8
34,6±2,3
25,0±1,7
35,8±3,0
25,8±1,7
23,3±1,5
13,2±1,0
Глутаминовая
кислота
35,0±2,0
34,2±2,1
23,7±1,6
36,4±3,0
21,4±2,0
19,9±1,3
7,9±0,7
Глицин
30,3±2,1
32,1±2,0
22,8±1,2
35,4±2,8
20,5±1,5
20,4±1,7
9,9±0,8
Аланин
49,5±3,0
51,3±3,1
37,6±2,0
53,1±4,5
26,5±1,2
32,5±2,1
8,7±0,6
Валин
39,9±3,5
34,8±2,6
28,9±2,1
42,9±3,7
32,2±2,0
22,9±1,8
17,5±1,0
Метионин
13,2±0,5
12,1±0,8
8,7±0,6
14,5±0,9
9,4±0,9
8,0±0,6
4,7±0,5
Изолейцин
22,2±1,5
20,4±1,2
14,1±0,9
22,9±1,1
13,6±1,0
13,3±0,8
3,1±0,5
Лейцин
26,7±1,7
33,0±2,1
25,6±1,8
37,6±2,7
25,2±1,2
25,0±1,5
7,7±0,6
Тирозин
11,2±0,8
9,9±0,7
7,8±0,5
13,2±0,9
7,7±0,5
7,2±0,5
3,5±0,5
Фенилаланин
9,2±0,7
12,3±0,9
10,1±0,7
15,7±1,1
8,4±0,6
9,4±0,5
3,2±0,6
Сумма
344,7±6,7 348,4±6,7 260,7±4,9 392,0±8,9 268,7±5,2 251,4±4,7 112,3±2,7
Если в контрольной группе сумма свободных аминокислот составила
0,345 мкмоль/мг белка, то через 36 ч она составила 0,269, а через 72 ч 32,6%
от контрольной величины. Характер изменения содержания отдельных ами-
158
нокислот различен. Концентрация большинства аминокислот уже через 12 ч
после введения гормона уменьшилась на 25–40%. Через 24 ч концентрация
увеличилась до уровня контроля, а затем вновь снизилась и через 72 ч составила 20–30% от контрольной величины (p < 0,001).
Концентрация аргинина и лизина в контроле была 5,6 и 6,0 нМ/мг белка, соответственно, затем она увеличивалась и через 36–48 ч была в 2–2,5
раза больше, чем в контроле (p < 0,001). Такое увеличение может быть связано с усилением биогенеза митохондрий под влиянием 17-β-эстрадиола. Изменение концентрации лейцина и фенилаланина, которая в контроле была
27,0 и 9,0 нМ/мг белка, соответственно, носило более сложный характер. Так,
через 4 и 24 ч после введения гормона их концентрация была выше, чем в
контроле, через 12, 36, и 48 ч находилась на уровне контроля, а через 72 ч
понизилась.
Влияние 17-β-эстрадиола на окислительное фосфорилирование
митохондрий печени цыплят
Митохондрии обеспечивают энергией всю жизнедеятельность клетки,
поэтому изменение функциональной нагрузки на клетку сопряжено с изменением активности митохондрий. В табл. 32 приведены результаты влияния
17-β-эстрадиола на функциональное состояние дыхательной цепи митохондрий печени цыплят. Измерение скорости дыхания митохондрий показало, что
в течение 24 часов после введения гормон не оказывал какого-либо заметного влияния на окисление субстратов в присутствии АДФ, в ее отсутствии, и
не изменял скорость переноса электронов в разобщенной дыхательной цепи
(в присутствии 2,4-ДНФ). Это наблюдалось при использовании в качестве
субстратов дыхания сукцината, глутамата+малата и α-кетоглутарата. Через
36–48 часов после введения эстрадиола в митохондриях наблюдалось заметное снижение скорости контролируемого (V4о) и активного дыхания (V3), а
также скорости дыхания в разобщенном состоянии дыхательной цепи (Vднф).
Степень снижения была приблизительно одинаковой во всех состояниях митохондрий. Окисление НАД-зависимых субстратов ингибировалось значи-
159
тельно сильнее, чем окисление сукцината. Так, если скорость окисления сукцината падала на 32–35%, глутамата+малата – на 37–39%, то α-кетоглутарата
– на 50–52%. Скорость фосфорилирования АДФ в это время также уменьшилась практически в 2 раза, с 2,20 в контрольной группе цыплят до 1,06 и 1,14
мкМ/сек×мг белка через 36–48 ч после эстрогенизации соответственно. После 72 ч у цыплят происходило увеличение скорости дыхания как в присутствии акцепторов фосфата (V3), так и после использования всего добавленного АДФ (V4о), а через 96 ч – заметное уменьшение V3 при относительно высоком значении V4о, при этом скорость фосфорилирования составила 1,32
мкМ/сек×мг белка.
Таблица 32
Влияние 17-β-эстрадиола на скорость потребления кислорода митохондриями
печени цыплят (нмольО2/мин·мг белка) при окислении различных субстратов
Экспозиция гормона, час
Показатель
0
4
12
24
36
48
72
96
При окислении сукцината
В присутствии АДФ (V3)
28,5
±1,0
29,0
±1,5
31,0
±2,0
30,0
±1,5
19,5
±1,0
19,5
±1,0
30,5
±1,5
21,1
±0,5
После исчерпания АДФ (V4о)
8,5
±1,0
7,5
±0,5
7,5
±1,0
7,0
±0,5
5,5
±0,2
5,5
±0,3
15,0
±1,5
14,5
±1,0
В присутствии ДНФ (Vднф)
25,0
±1,0
21,0
±2,5
24,5
±1,5
24,5
±2,0
17,5
±1,5
15,0
±1,0
31,5
±2,0
26,0
±1,0
При окислении глутамата+малата
V3
19,0
±1,5
20,0
±1,0
16,0
±2,0
20,0
±1,5
11,5
±1,0
11,5
±0,5
17,0
±1,0
17,5
±1,5
V4о
4,0
±1,0
3,5
±0,5
2,5
±0,5
3,0
±0,5
2,5
±0,5
2,5
±1,0
2,5
±1,0
7,0
±1,5
Vднф
16,0
±1,0
17,0
±1,5
13,0
±1,0
14,0
±1,0
10,0
±1,0
11,0
±0,5
19,0
±1,5
18,0
±1,0
При окислении α-кетоглутарата
V3
10,5
±1,5
10,5
±1,5
10,0
±1,0
10,5
±1,0
5,5
±0,5
5,0
±0,5
10,0
±1,0
9,0
±1,5
V4о
4,0
±1,0
3,5
±1,0
4,0
±1,0
3,5
±0,5
2,5
±0,5
2,0
±0,5
3,5
±1,0
6,0
±1,0
Vднф
12,0
±1,5
8,5
±0,5
7,0
±1,0
11,0
±1,5
7,0
±1,0
5,0
±0,5
12,0
±1,0
11,0
±1,5
160
Характер окислительного фосфорилирования и активного транспорта в
митохондриях печени у кур-несушек и эстрогенизированных цыплят был
аналогичен (табл. 33). У кур-несушек АДФ практически необратимо стимулировал дыхание, отмечалось низкое значение коэффициента АДФ/О. Снижение показателей энергетического сопряжения дыхания и фосфорилирования наблюдали при использовании среды инкубации, содержащей ионы магния, повышение – в их отсутствие. При этом величина отношения АДФ/О
возросла с 0,50 до 1,50, а скорость дыхания после использования всего добавленного АДФ уменьшилась до 9,0 и практически равнялась таковой у цыплят и взрослых петухов. У кур добавление аденозинмонофосфата (АМФ) не
влияло на скорость дыхания в отсутствие Mg2+, но стимулировало его в присутствии этого иона. Исключение ионов магния из среды инкубации практически не влияло на дыхание митохондрий печени у цыплят и взрослых петухов. Полученные результаты позволили заключить, что у кур в митохондриях
печени происходит включение аденилаткиназной реакции, которая активируется ионами магния и служит связующим звеном между окислительным
фосфорилированием и процессами биосинтеза. Для митохондрий эстрогенизированных цыплят также было характерно ухудшение сопряженности дыхания и фосфорилирования в присутствии ионов магния и повышение степени
сопряженности в их отсутствие.
Активный транспорт ионов кальция – одна из эндэргонических реакций в митохондриях, которая успешно конкурирует за промежуточные макроэргические соединения с процессом синтеза АТФ. Коэффициент Са/О для
митохондрий печени у кур-несушек был выше, чем у цыплят и петухов, и составил 11,0 и 4,0 соответственно (табл. 33). Это предполагает, что поглощение ионов кальция митохондриями у кур-несушек происходит с меньшей затратой кислорода, чем у цыплят и петухов. Под влиянием эстрадиола у цыплят коэффициент Са/О возрастал от 4,3 до 6,6 при экспозиции соответственно от 12 ч до 72 ч (табл. 30).
161
Таблица 33
Окислительное фосфорилирование и коэффициент Са/О
митохондрий печени цыплят и взрослой птицы
Показатель
Цыплята
(контроль)
эстрогенизированные
цыплята (72 ч)
куры-несушки
петухи
Скорость потребления кислорода в присутствии АДФ, нмольО2/мин·мг белка
+Mg
28,5±2,0
30,0±1,5
25,0±1,0
30,0±2,0
–Mg
28,0±2,0
29,0±1,5
26,0±2,0
28,0±2,0
Скорость потребления кислорода после исчерпания добавленного АДФ,
нмольО2/мин·мг белка
+Mg
8,5±1,5
15,0±1,5***
22,3±1,7
7,5±1,5
–Mg
7,0±1,0
7,0±0,5
9,0±1,2
7,0±1,5
Коэффициент АДФ/О
+Mg
1,85±0,10
1,20±0,01**
0,50±0,20
1,85±0,10
–Mg
1,85±0,09
1,90±0,02
1,50±0,10
1,85±0,10
4,0±0,1
6,6±0,2**
11,0±3,0
4,0±0,1
Коэффициент Са/О
Влияние 17-β-эстрадиола на печень цыплят на фоне действия
клофибрата
Данные по изменению массы печени, содержания РНК и ДНК в ней
после семи суток ежедневного принудительного кормления цыплят клофибратом с последующей инъекцией 17-β-эстрадиола представлены в табл. 34.
Клофибрат не влиял на массу печени. Можно отметить тенденцию к ее увеличению. Под влиянием 17-β-эстрадиола масса печени увеличивалась как на
фоне клофибрата, так и без него (p < 0,05).
Клофибрат не изменял удельного содержания РНК в печени. Увеличение общего содержания РНК под влиянием гормона на фоне клофибрата и
без него происходило синхронно с ростом массы печени. Под влиянием клофибрата в печени снижалась концентрация ДНК (p < 0,05). Достоверного различия в концентрации ДНК после введения гормона на фоне клофибрата и
без него не обнаружено.
162
Таблица 34
Влияние клофибрата и 17-β-эстрадиола на массу печени цыплят
и содержание ДНК и РНК в ней
Масса печени,
г/кг
РНК,
мг/г
ДНК,
мг/г
РНК/ДНК
Контроль
21,0±1,7
6,20±0,28
2,86±0,10
2,17±0,12
7 сут. кормления клофибратом
24,0±1,8
5,70±0,50
3,03±0,15
1,88±0,19
1 сут. после клофибрата
28,4±1,8
6,14±0,30
2,31±0,10
2,66±0,17
2 сут. после клофибрата
24,3±1,7
7,07±0,52
2,27±0,13
3,11±0,29
7 сут. клофибрат + эстрадиол (1 сут.)
34,7±4,2*
7,04±0,58
2,25±0,20
3,13±0,38
7 сут. клофибрат + эстрадиол (2 сут.)
34,5±3,0*
8,46±0,65* 2,23±0,18
3,79±0,42
Эстрадиол (1 сут.)
28,5±0,5*
5,67±0,23
1,91±0,09
2,97±0,18
Эстрадиол (2 сут.)
38,1±5,0
6,35±0,24
1,91±0,07
3,32±0,18
Группа
Клофибрат, не влияя на базовый уровень триглицеридов в плазме крови, снижал вызванное эстрадиолом увеличение концентрации триглицеридов
(табл. 35). Содержание кальция увеличилось на 23% через один день после
отмены клофибрата и на 40% – через 2 дня. Значительное увеличение кальция в крови наблюдалось через 2 дня после введения гормона, а на фоне клофибрата уже через 1 день концентрация кальция увеличилась на 70%.
Таблица 35
Влияние клофибрата и 17-β-эстрадиола на содержание триглицеридов
и кальция в плазме крови цыплят
Группа
Триглицериды, мг/мл
Кальций, мг%
Контроль
3.3±0,7
7,53±0,28
7 сут. кормления клофибратом
3,5±0,7
7,83±0,26
1 сут. после клофибрата
3,4±0,7
9,24±0,57
2 сут. после клофибрата
3,3±1,0
10,63±1,14
7 сут. клофибрат + эстрадиол (1 сут.)
8,6±1,6
12,83±6,00
7 сут. клофибрат + эстрадиол (2 сут.)
26,4±1,3***
24,34±13,64
Эстрадиол (1 сут.)
12,2±2,0***
7,32±0,75
Эстрадиол (2 сут.)
36,7±7,9***
24,5±0,90***
163
В митохондриях печени цыплят, получавших клофибрат, наблюдалось
увеличение скорости окисления сукцината в присутствии АДФ (V3), в его отсутствие, и в разобщенной 2,4-динитрофенолом дыхательной цепи. Этот эффект продолжал усиливаться, и через 1–2 дня после отмены клофибрата V3
составила 193% к контрольному значению. Скорости окисления глутамата+малата в дыхательной цепи митохондрий увеличивались в меньшей степени, в среднем на 20%.
Под влиянием клофибрата произошло увеличение удельной цитохромоксидазной активности митохондрий на 67% (табл. 36).
Таблица 36
Влияние клофибрата и 17-β-эстрадиола на цитохромоксидазную активность и
скорость потребления кислорода (нмоль О2/мин х мг белка) митохондриями
печени цыплят
Группа
Контроль
Цитохромоксидаза
22,8±1,5
Vднф (глютамат+малат
)
18,0±1,0
V3
(сукцинат)
Vднф
(сукцинат)
V3 (глютамат +малат)
32,4±1,2
30,3±1,0
191±20
7 сут. кормления
клофибратом
57,0±2,1*** 53,8±1,9***
27,8±2,0
22,0±1,5
319±31***
1 сут. после
клофибрата
59,1±2,5*** 57,4±2,3***
26,4±1,7
22,1±1,8
287±25**
2 сут. после
клофибрата
62,5±3,0*** 60,5±2,8***
25,8±1,9
21,9+1,8
304±27**
7 сут. клофибрат
+ эстрадиол (1 сут.)
38,0±2,0*
38,2±1,8**
29,9±1,8
26,7±1,6
244±20
7 сут. клофибрат
+ эстрадиол (2 сут.)
40,6±2,5*
36,7±2,1*
24,8±1,9
21,1±1,0
266±23
Эстрадиол (1 сут.)
30,0±1,9
24,4±1,8
20,2±1,7
14,1±0,8
143±15
Эстрадиол (2 сут.)
19,5±1,0**
15,0±0,9
11,5±0,8
11,0±0,5
115±10**
Этот эффект сохранился в течение последующих 2 дней после прекращения кормления клофибратом. На фоне клофибрата гормон снижал удельную цитохромоксидазную активность в среднем на 25%, в то время как без
клофибрата она падала на 40%.
Клофибрат вызвал снижение общего содержания аминокислот в плазме
крови (табл. 37).
164
Таблица 37
Влияние клофибрата и 17-β-эстрадиола на содержание свободных
аминокислот в плазме крови
Аминокислоты
(мкм/мл)
Контроль
Клофибрат
Клофибрат
1 сут. после 2 сут. после
Эстрадиол
+эстрадиол
клофибрата клофибрата
(1 сут.)
(1 сут.)
Лизин
0,43±0,05 0,28±0,03
0,31±0,05
0,29±0,02
0,29±0,01
0,21±0,02
Гистидин
0,17±0,01 0,15±0,01
0,15±0,01
0,15±0,01
0,19±0,04
0,22±0,03
Аргинин
0,43±0,02 0,24±0,03
0,35±0,02
0,26±0,02
0,29±0,03
0,33±0,02
Аспарагиновая к-та
0,16±0,01 0,08±0,01
0,10±0,02
0,08±0,02
0,14±0,02
0,11±0,02
Треонин
0,75±0,07 0,66±0,03
0,87±0,05
0,83±,05
0,84±0,08
0,71±0,03
Серин
0,72±0,02 0,58±0,02
0,63±0,04
0,59±0,03
0,70±0,06
0,76±0,05
Глутаминовая
к-та
0,42±0,09 0,35±0,03
0,35±0,03
0,34±0,03
0,40±0,02
0,35±0,03
Пролин
0,51±0,07 0,31±0,02
0,41±0,03
0,36±0,02
0,43±0,03
0,84±0,04
Глицин
0,73±0,05 0,45±0,04
0,51±0,03
0,44±0,02
0,63±0,02
0,71±0,06
Аланин
0,72±0,02 0,48±0,07
0,56±0,04
0,46±0,04
0,60±0,03
0,74±0,03
Цистин
0,12±0,02 0,13±0,02
0,15±0,02
0,13±0,01
0,16±0,01
0,15±0,01
Валин
0,23±0,02 0,25±0,02
0,28±0,02
0,23±0,01
0,31±0,01
0,28±0,02
Метионин
0,12±0,01 0,08±0,01
0,09±0,01
0,09±0,01
0,11±0,01
0,10±0,004
Изолейцин
0,11±0,01 0,11±0,02
0,10±0,01
0,09±0,00
0,11±0,01
0,25±0,01
Лейцин
0,24±0,02 0,18±0,01
0,24±0,02
0,21±0,01
0,24±0,01
0,25±0,01
Тирозин
0,1±0,01
0,10±0,01
0,09±0,00
0,011±0,00
0,14±0,01
0,13±0,01
Фенилаланин
0,12±0,00 0,11±0,01
0,11±0,01
0,10±0,01
0,14±0,00
0,11±0,01
Сумма
аминокислот
6,11±0,16 4,54±0,11
5,30±0,13
4,76±0,09
5,72±0,13
6,25±0,12
После введения 17-β-эстрадиола наблюдалось изменение концентрации отдельных аминокислот, но их общее содержание не менялось. Эстрадиол на фоне клофибрата увеличивал концентрацию аминокислот до уровня
близкого к контролю. Снижение триглицеридемии под влиянием клофибрата
происходит на фоне стимуляции дыхательной и цитохромоксидазной активностей митохондрий, что определяет важную роль митохондрий в регуляции
липогенеза.
165
4.
Обсуждение результатов
4.1. Получение трансгенных перепелов, экспрессия
и наследование гена гормона роста быка
Интеграция генных конструкций в геном животного или растительного
организма носит вероятностный характер. На сегодняшний день не всегда
возможно интегрировать генную конструкцию в определенную точку генома,
прогнозировать функционирование генов, расположенных рядом с интегрированной конструкцией и, соответственно, предвидеть точную реакцию генома в целом на введение чужеродного генетического материала. При современных технологиях трансгенез во многом напоминает мутацию, в значительной степени направленную, но в то же время, сохраняющую множество
неопределенностей. Изменения охватывают многие органы и ткани, меняется
их взаимозависимость, меняются признаки, которые, казалось бы, выходят за
сферу воздействия определенной генной конструкции. Это с одной стороны
усложняет картину, но с другой – расширяет возможности получения животных со многими измененными признаками, многие из которых могут оказаться интересными для селекционера. Особенно эта задача усложняется в
том случае, когда в геном интегрируются генные конструкции, связанные с
экспрессией биологически-активных веществ регуляторного характера, которые оказывают мощное воздействие на многие процессы обмена веществ.
Например, в экспериментах Л.К. Эрнста [198] были получены свиньи, трансгенные по гену рилизинг-фактора гормона роста. Известно, что продукт этого гена активизирует синтез и выделение гормона роста. Это было подтверждено исследованием уровня содержания соматотропина в крови трансгенных свиней. Но более того, у трансгенных свинок в определенном возрасте
отмечена значительно меньшая толщина шпика, в сравнении с сибсами. Найдены определенные различия в соотношении важнейших органов. Так у
трансгенных свинок относительная масса сердца к массе тела после убоя была на 11,7%, легких – на 14,2%, почек – на 5% ниже, чем у контрольных сибсов. Отмечены существенные различия в величине и направлении корреля-
166
ционных связей между массой различных внутренних органов и тканей.
Приведенный пример демонстрирует как при интеграции чужеродных генных конструкций в геном животных, особенно позвоночных, у которых развиты авторегуляторные системы, картина изменений организма оказывается
более сложной и многообразной.
В нашей работе представлены результаты экспериментов по интеграции конструкции из гена соматотропина быка с металлотиониновым промотором в геном перепелов и оценке влияния на их биологические и продуктивные качества. Исследования выполнены на 33 поколениях перепелов.
Полученные первичные трансгенные перепела были в разной степени
химерными. Это подтверждалось расположением полос на радиоавтографе
блот-гибридизационного анализа ДНК. У особей №37 и №116 выявлен фрагмент размером не 1000 п.н., как теоретически ожидалось, а существенно
большего размера. Наиболее характерный радиоавтограф перепелов представлен на рис. 6. Вероятнее всего, такое распределение полос связано с перестройками трансгена при интеграции с утратой сайтов рестрикции. Предположение о неполном расщеплении ДНК не подтвердилось, так как были
использованы другие препараты и концентрации рестриктазы, а также время
расщепления ДНК. Методом блот-гибридизации ДНК, выделенной из мышечной ткани перепелки №111, выявлены последовательности гена бычьего
гормона роста в количестве, меньшем одной копии на геном, что свидетельствует о химерности особи. Ген бычьего гормона роста интегрировал и в
клетки зародышевой линии: из трех эмбрионов, полученных от перепелки
№111, один был трансгенным. В ДНК разных тканей перепелки №29 трансген не был обнаружен, но из четырех исследованных ее потомков один оказался трансгенным. От самца №22, развившегося из инъецированной яйцеклетки, было получено четыре потомка. Гибридизационный анализ ДНК этого перепела, представленный на рис. 6 (дорожки 4 и 5), показал слабый сигнал. Из его потомков одна перепелка оказалась трансгенной (№ 47), и она же
сносила крупные яйца. Трансгенные перепела и их потомки первого и второ-
167
го поколения были проанализированы на содержание в крови бычьего соматотропина. У трех из них (№№ 76, 95, 104) было обнаружено достоверное
содержание в крови бычьего соматотропина. Все они были самцами. Возможно, наличие гормона в крови самцов и отсутствия его у самок может
быть обусловлено активной «утилизацией» бычьего соматотропина у самок в
связи с высоким уровнем биосинтетических процессов в яйцеводе и печени,
связанных с синтезом компонентов яйца.
Изучение фенотипа трансгенных перепелов и их потомков в ряду поколений показало, что интегрированный ген гормона роста быка повлиял на их
биологические и продуктивные показатели.
В процессе выращивания трансгенных перепелов и отвода от них потомства было установлено, что некоторые перепелки сносят значительно более крупные яйца. Если для эстонских перепелов характерна средняя масса
яйца 11,0–12,4 г, то в группе экспериментальной птицы, развившейся из инъецированных яйцеклеток, довольно часто наблюдались яйца массой 14–21 г.
Вскрытие их показало, что они не были двухжелтковыми и имели нормально
пигментированную скорлупу. Эффект повышенной массы перепелиных яиц
явился наследуемым признаком и был получен у особей, происходящих от
разных первичных трансгенов.
Масса суточного молодняка птицы в значительной степени обусловлена массой инкубационных яиц. В наших опытах с увеличением массы яиц
пропорционально увеличивалась масса трансгенных суточных перепелят
(r = +0,810). Аналогичные данные были получены по японским перепелам
[60]. Авторы установили высокую положительную коррелятивную связь
(0,842–0,924) между массой яйца и массой перепела в суточном возрасте. В
10-суточном возрасте корреляция значительно снижалась, особенно у самок.
А во взрослом состоянии она практически отсутствовала.
Наблюдаемые в наших опытах различия значений относительной массы перепелят для разных весовых категорий инкубационных яиц возможно в
первую очередь связаны с истинным возрастом перепелят, который на мо-
168
мент взвешивания мог составлять от нескольких часов до одних суток. Указанную неоднородность молодняка обычно связывают с неодинаковой продолжительностью эмбрионального развития и разным физиологическим состоянием особи [53]. Так, крупное яйцо находится в яйцеводе дольше мелкого, первые яйца цикла формируются быстрее, чем последующие, плохие несушки формируют яйцо дольше, чем хорошие [46]. Известно, что живая масса перепелят за 24 часа после вылупления уменьшается в среднем на 9,7%.
При этом относительная масса уменьшается с 72,4% до 65,4% [126].
Следовательно, сравнивая полученные результаты с работами других
авторов, можно сделать вывод, что изучаемая генетическая модификация перепелов не привела к заметным изменениям такого показателя, как относительная масса суточных перепелят. При этом перепелята проявляли подвижность, активно реагировали на звук, имели мягкий подобранный живот, чистую клоаку. Пух был мягким, ровным, блестящим, правильно пигментированным (коричневого цвета с двумя полосками на спинке), ноги и клюв –
крепкими, глаза блестящими. Таким образом, полученные в опытах перепелята по визуальной оценке экстерьера соответствовали требованиям, которые
предъявляются к качеству суточных перепелят [43]. Взрослые особи опытной
группы также внешне не отличались от контрольной группы.
Рост – сложный процесс, зависящий как от генотипа, так и условий
жизни особи. С генетической точки зрения особенно интересны гены, кодирующие протеины каскада гормона роста, который начинается в гипоталамусе и гипофизе, проходит через печень и заканчивается в периферических органах. Известно, что гормон роста распространяется в организме гуморальным путем и связывается с рецепторами в печени, жировой ткани, мышцах,
почках, сердце и в ростовых полостях костей. Действие его зависит от энергетического баланса организма. При положительном балансе энергии гормон
роста способствует анаболическим процессам, при отрицательном – доминирует липидокатаболический эффект [22].
169
Первые трансгенные по гену гормона роста мыши имели четырехкратное увеличение скорости роста и удвоенную живую массу во взрослом состоянии [503]. Несколько позднее были получены трансгенные мыши с другими генами из каскада гормона роста – релизинг-фактора гормона роста, инсулин подобного фактора роста I. На сегодня имеется целый ряд публикаций
о сельскохозяйственных животных, трансгенных по генам семейства гормона
роста [19–21].
В противоположность результатам, полученным на мышах, у трансгенных по гену гормона роста свиней не наблюдалось соответствующего ускорения роста. Более того, при использовании обычного откормочного комбикорма с 16% сырого протеина туши трансгенных свиней были хуже обычных. Однако, при скармливании корма с более высоким содержанием протеина (18%) и лизина, наблюдалось на 16,5% повышение среднесуточных
приростов [522; 524]. Важным изменением у трансгенных свиней является
существенное уменьшение толщины шпика. Из чего можно сделать вывод
что, трансгенные по гену гормона роста свиньи имели более высокие потребности в питательных веществах необходимые для реализации измененного
генетического потенциала [525]. Конечно, некоторые результаты неоднозначны. Например, при зоотехнической оценке трансгенных свиней с геном
рилизинг-фактора соматотропного гормона отмечалось увеличение содержания сала в туше у боровков [196]. Трансгенные по гормону роста овцы имели
повышенный уровень его в крови, но не обладали повышенной скоростью
роста [196] или имели снижение жира до 5–7% по сравнению с 25–30% у
контрольных животных [479].
Значительные различия результатов, скорее всего, связаны с тем, что
если на мышах не велась селекция по росту, то на сельскохозяйственных животных велась селекция по оптимизации параметров роста. В подтверждение
этого говорят следующие результаты. Проводилась селекция мышей по массе
в 8-недельном возрасте в течение 30 поколений. В результате получили удвоение их живой массы. Отселекционированные мыши лишь незначительно
170
уступали по массе мышам, трансгенным по гену человеческого гормона роста [639; 640].
Таким образом, можно сделать вывод, что интеграция и экспрессия
чужеродных генов гормона роста делает возможным скачок на более высокое
ростовое плато у тех особей, которые не принадлежат к видам или породам, с
которыми проводилась селекция на ростовые способности. Там где генетический потенциал роста находится недалеко от плато, можно добиться лишь
сравнительно незначительного эффекта.
Одним из основных показателей, характеризующих рост птицы, является живая масса. Анализ данных по живой массе перепелов показал, что
разница в динамике роста всех исследованных поколений была в пользу
трансгенной птицы (на 5–15%). Разница в живой массе перепелов опытной и
контрольной групп сохранилась на протяжении всего периода роста и последующего содержания птицы, причем у самок различия оказались более существенными и зависили от возраста и поколения птицы. Для 9-го поколения
перепелов средняя масса самок опытной группы в 8–20-недельном возрасте
была на 16% выше массы самок контрольной группы. В то время как у самцов прибавка составила 5%. Для потомков 18–33 поколений в 7– и 20-нед.
возрасте – только у самок (+8 и 6%). Возможно, что в основном большее увеличение живой массы самок опытной группы по сравнению с самцами происходит за счет увеличения массы репродуктивных органов самок.
В процессе работы мы отмечали, что живая масса перепелов варьировала от поколения к поколению. Однако линия тренда для этого показателя
в 20-недельном возрасте свидетельствовала об отсутствии тенденции к
снижению (наклон незначительный, R2 =0.019), результаты представлены на
рис. 11. Изменение средней живой массы у некоторых выводов, скорее всего, было связано с условиями содержания птицы, а не с особенностями их
генотипа.
Таким образом, не наблюдалось изменения массы перепелов со сменой
поколений. Ни увеличения в опыте, ни уменьшения в контроле на протяже-
171
нии 33 изученных генераций. Это связано с тем, что нами не велась селекция
перепелов. За исключением того что, в опытной группе перепелов 18–20 генераций после проведенного скрининга птицы полимеразной цепной реакцией на ген бычьего соматотропина, для дальнейшего размножения были отобраны трансгенные особи из семей с высокими показателями яичной продуктивности. По-видимому, это явилось причиной увеличения массы перепелов
суточного возраста в последующих генерациях в среднем на 21% (табл. 41).
Активный рост перепелов обеих групп наблюдался в течение семи недель жизни, причем в первые три недели перепела росли особенно быстро.
Начиная с 8–9 недели, происходила относительная стабилизация их живой
массы.
Половозрелые самцы как опытной, так и контрольной групп весили
меньше одновозрастных самок. Такая половая дифференциация по живой
массе у перепелов обусловлена в основном органами яйцеобразования у самок (яичник, яйцевод) и наличием в них фолликулов и яиц на разной стадии
формирования. Это общепризнанная точка зрения исследователей, занимающихся перепеловодством. По данным М.Д. Пигаревой и Г.Д. Афанасьева
подтверждением этого может быть большая изменчивость живой массы у самок (коэффициент вариации – 14,8%, у самцов – 10,4%). В то же время в
промерах тела нет значительных различий между самками и самцами. Лишь
по глубине груди и длине плюсны самки превосходят самцов на 6–7%, по некоторым же промерам (длина спины, шеи) самцы превосходят самок [117].
Аналогичные результаты роста и развития перепелов при изучении различных технологических приемов содержания приводятся и другими авторами
[12; 83; 84].
Интегрированная в геном перепелов генная конструкция определенным
образом влияет на генетический потенциал птицы. В реализации генетических возможностей важная роль принадлежит эндокринной системе, которая
наряду с нервной системой осуществляет регуляцию метаболизма, определяющего рост и продуктивность особи. Показано изменение гормонального
172
статуса трансгенных свиней в 12-м поколении под влиянием интеграции гена
рилизинг-фактора гормона роста человека [203; 204].
Функциональная деятельность эндокринной системы проявляется в постоянной секреции в кровь гормонов. Тиреоидные гормоны и инсулин в основном являются гормонами «метаболического действия» и обладают выраженным влиянием на обмен веществ. Эндокринные железы синтезируют и
секретируют в кровь гормоны в свободной или биологически активной форме, часть которых в последующем, преимущественно в печени, связывается с
белками плазмы крови. Таким образом, в организме поддерживается определенный уровень гормонов, которые циркулируют в крови в свободной и связанной форме. Это относится, например к инсулину. Связанный инсулин, в
отличие от свободного, иммунологическим методом не определяется. Для его
выявления требуется предварительное разделение комплекса на гормон и
связанный с ним белок.
Известно, что содержание тиреоидных гормонов в крови перепелов зависит от возраста, пола и уровня их продуктивности [372; 560]. Полученные
нами данные свидетельствуют об отсутствии достоверного влияния изученного трансгена на содержание гормонов Т3, Т4 и инсулина в крови перепелов
(табл. 5). Показатель отношения концентрации инсулина к трийодтиронину,
по которому можно судить о сдвиге метаболизма в организме, был выше у
самок, чем у самцов, а также у самок опытной группы по сравнению с контрольной. Это подтверждает более высокий уровень анаболизма у подопытных самок, выраженный в повышенном синтезе компонентов яйца.
Известно, что действие инсулина преимущественно анаболическое, он
активизирует транспорт аминокислот и глюкозы в клетки тканей и органов,
обеспечивая их пластическим материалом для синтеза белка и гликогена.
Возможно, что именно этим объясняется тенденция его более высокого содержания в крови самок опытных перепелов. Поскольку опытные перепела
сносили яйца большей массы, чем контрольные, постольку и уровень синтеза
у них выше.
173
Разброс показателей, как в контрольной так и опытной группах был
значительным, при этом у самок больше, чем у самцов. Более значительные
индивидуальные различия в содержании гормонов были характерны для перепелов опытной группы. В целом содержание гормонов у самцов было выше, чем у самок.
Таким образом, гормональный статус трансгенных перепелов по изученным показателям не претерпел существенных изменений по сравнению с
обычными перепелами. Возможно, лишь отметить более высокий уровень
анаболизма у подопытных самок, выраженный в повышенном синтезе компонентов яйца.
Наряду с признанием относительной автономии и саморегуляции иммунной системы известно также о взаимосвязи между иммунной и гормональной системой. Так, функциональная активность иммунной системы птиц
находится под гормональным контролем передней доли гипофиза, в частности соматотропного гормона [36; 113]. Это, прежде всего, относится к активности тимуса. На лимфоцитах имеются рецепторы к инсулину, гормону роста, тестостерону, АКТГ, глюкокортикоидам [36; 222]. Естественно было
предположить, что введение гена гормона роста в геном перепелов может
повлечь за собой изменения в иммунитете птиц. Известно, например, что у
трансгенных свиней проявлялась повышенная иммуногенность. Следует отметить, что эти изменения проявлялись неустойчиво. И только в 11-м и 12-м
поколениях наметились устойчивые различия по важнейшим показателям.
По мнению автора, в организме трансгенных животных продолжалась перестройка ряда параметров, в том числе в ходе стабилизационного отбора [204].
Иммунная система птиц имеет сложную организацию со своими особенностями. У птиц нет четко выраженной системы лимфатических узлов и
сосудов – она состоит из лимфоидных тканей и клеток, которые пронизывают все ткани организма и первыми выступают на защиту гомеостаза. Только
у птиц имеется фабрициева сумка, контролирующая гуморальный ответ организма на вводимые антитела и отслеживающая созревание β-лимфоцитов, а
174
также сама синтезирующая антитела. Формирование иммунной системы
птиц заканчивается в течение первой недели жизни, после чего ее можно
считать физиологически полноценной. К центральным органам иммунитета у
птиц относятся эмбриональный желточный мешок, костный мозг, тимус и
фабрициева сумка. К периферическим (вторичным) лимфоидным органам
относят селезенку, скопления лимфоидной ткани и гардерову (слезную) железу. В отличие от млекопитающих селезенка у птиц не выполняет функцию
депо крови, а с момента вылупления цыпленка в ней происходит разрушение
эритроцитов и образование лимфоцитов [16].
В широком смысле иммунную систему можно разделить на врожденную и приобретенную. В нормальных условиях врожденная иммунная система птицы функционирует эффективно. При массированной атаке извне
врожденный иммунитет оказывается либо подавленным, либо действует
медленно и не успевает воспрепятствовать внедрению в организм болезнетворных агентов. На этот случай существует приобретенная иммунная система. Приобретенный иммунитет характеризуется специфичностью, гетерогенностью и памятью. Выработка антител зависит от взаимодействия макрофагов (врожденная система), вспомогательных Т-клеток (клеточная система)
и специфических B-клеток. Все звенья должны быть связаны друг с другом
через химических агентов, чтобы вызвать специфическую реакцию на внедряющиеся в организм чужеродные тела [15; 113].
Таким образом, реакция иммунной системы на проникновение чужеродных тел – сложный процесс, зависящий от интегрированной цепи событий, в результате которых происходит разрушение инородного белка.
Практически все знания об иммунитете птиц базируются на данных,
полученных на курах. Однако, нет оснований предполагать, что основные
процессы у других видов птицы существенно отличаются от иммунных процессов у кур, тем не менее, определенная индивидуальность может иметь место, и для перепелов в частности [209; 221; 222; 224; 319; 373; 385; 472].
175
Нами был оценен иммунный статус перепелов по нарастанию титров
антител в крови и желтке яиц в ответ на введение антигена. У перепелов
опытной группы поствакцинальный иммунитет отличался от контрольной
группы уже через две недели после вакцинации. Через четыре недели титры
антител у опытных перепелов были достоверно выше, чем в контроле (табл. 6).
Аналогичные результаты были получены и для экстрактов желтков яиц перепелов контрольной и опытной групп, снесенных через 4 недели после вакцинации.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о повышении
иммунного статуса перепелов опытной группы, выраженного в ускоренной
выработке антител к вводимому антигену.
У трансгенных перепелов масса снесенных яиц оказалась больше, чем
в контроле. Эта закономерность сохранялась во всех исследованных поколениях. Кроме того, в опытной группе число яиц снесенных самками было
больше, чем в контроле. Масса яйца – один из основных показателей яичной
продуктивности. В первую очередь, он определяется видовой принадлежностью птицы и зависит от размеров самок. Внутри вида она различается по
породам, но даже в пределах одной породы колебания достигают 20% и более. Подобная вариабельность признака дает большие возможности для селекции.
Для трансгенных животных характерна еще большая вариабельность
по различным признакам по сравнению с контрольными животными. Сравнение коэффициентов изменчивости ряда признаков свиней трансгенных по
гену релизинг-фактора гормона роста с данными показателями их сибсов и
полусибсов показало, что вариабельность по темпам роста у трансгенов была
в 2,4 раза, по толщине шпика – в 1,7 раза и по удельным затратам корма – в
3,1 раза выше [198].
В наших опытах также наблюдалась большая вариабельность по массе
яиц в группе трансгенных перепелов. Например, масса яиц перепелов опытной группы первых трех и последующих 9–11 поколений на пике продуктивности в среднем составила 13,1–14,3 г. Разброс показателя по отдельным
176
особям был от 11,3 до 21,0 г. Отличием опытной группы от контрольной являлось и то, что, в опытной группе наблюдались особи, несущие крупные яйца с начала и до конца яйцекладки. В тоже время были особи, не отличающиеся по массе яиц от контрольных перепелов.
В течение опытов не всегда имелась возможность поддерживать оптимальные условия содержания и необходимое качество кормов, и это в большей степени отрицательно влияло на продуктивность лучших несушек в
опытной группе, чем в контрольной. Связано это, скорее всего с тем, что для
реализации высоких потенциальных возможностей, появившихся у генетически модифицированной птицы нужны лучшие условия и уровень кормления.
Очевидно, что при анализе показателя массы яиц надо иметь в виду такой фактор, как возраст несушек. Известно, что с возрастом масса яиц у птиц
увеличивается. Достигнув определенного уровня, масса яиц некоторое время
сохраняется на этом уровне, до тех пор, пока яйценоскость остается высокой.
При снижении яйценоскости возможно дальнейшее повышение массы яиц.
Логично было бы предположить, что динамика изменения массы яиц у
перепелов с возрастом не отступает от общих закономерностей для птиц. Хотя возможно и имеет свои особенности. Так, у перепелов не отмечается резкого повышения массы яиц с возрастом [126]. По данным автора, выход яиц
массой выше 14 г повышался с 2,4% в 2-месячном возрасте до 3,6% в
7-месячном возрасте несушек. Количество яиц массой ниже 10 г с 4,1% в
2-месячном возрасте снизился к 5 месяцам до 2,9%, а в возрасте 7–8 месяцев
таких яиц уже не было. Имеются данные, что яйца перепелов 3- и
7-месячного возраста по массе не различаются [61].
Для ответа на вопрос, как меняется масса яиц в связи с возрастом, нами
был проведен расширенный анализ полученных результатов. Поскольку в своих опытах мы вели индивидуальный учет и взвешивание яиц, то для анализа
имели возможность объединить несушек в подгруппы в зависимости от массы
снесенных ими яиц на пике продуктивности и на этой основе выстроить возрастную динамику их массы яиц. Результаты анализа представлены в табл. 38.
177
Таблица 38
Динамика массы перепелиных яиц несушек опытной группы
в зависимости от массы яйца на пике продуктивности
Месяц
продуктивности
Весовая категория яиц на пике продуктивности, г
10–10,99
11–11,99
12–12,99
13–13,99
1
10,01±0,15
11,00±0,12
11,88±0,16
12,51±0,15
2
10,35±0,13
11,47±0,09
12,33±0,12
13,28±0,15
3
10,45±0,11
11,54±0,07
12,53±0,07
13,49±0,09
4
10,70±0,14
11,57±0,11
12,41±0,10
13,32±0,18
5
10,58±0,19
11,69±0,14
12,23±0,17
13,17±0,20
6
10,83±0,23
12,18±0,17***
12,55±0,36
13,09±0,27
7
11,00±0,21*
12,30±0,19***
12,70±0,31
13,11±0,57
Различия с 3-им месяцем продуктивности:
* – p < 0,05
*** – p < 0,001
Из представленных данных видно, что масса перепелиных яиц первого
месяца продуктивности была меньше, чем в последующие месяцы. Уже на
втором месяце яйценоскости масса яиц увеличивалась на 3,4–6,2% для несушек разных подгрупп опытной группы. Дальнейшее увеличение массы яиц с
возрастом происходило только у несушек, несущих относительно небольшие
яйца (10–11 г). На седьмой месяц продуктивности масса их яиц увеличивалась на 10–12% по сравнению с массой на начало яйценоскости. У перепелов,
несущих яйца массой 12–14 г и более, максимальное значение достигалось на
третий месяц продуктивности, когда масса яиц увеличивалась на 5,5–7,8% и
дальнейшего роста массы яиц с возрастом перепелов практически не происходило.
Для перепелов контрольной группы характерна та же закономерность
(табл. 39). Масса яиц первого месяца продуктивности была на 8,8–10,6%
меньше, чем в последующие месяцы продуктивного периода. Средняя масса
яиц за 50 недель жизни составила 11,34 г (табл. 42). Именно такая масса яиц
была характерна для 11–12-недельного возраста перепелок, что может быть
использовано в племенной работе для своевременного селекционного отбора
поголовья.
178
Таблица 39
Динамика массы перепелиных яиц несушек контрольной группы
в зависимости от массы яйца на пике продуктивности
Весовая категория яиц на пике продуктивности, г
Месяц
продуктивности
10–10,99
11–11,99
12–12,99
1
9,78±0,03
10,31±0,11
10,98±0,16
2
10,32±0,09
10,95±0,15
11,75±0,12
3
10,80±0,04
11,43±0,13
12,35±0,07
4
10,42±0,05
11,20±0,16
11,81±0,15
5
10,98±0,09
11,41±0,18
12,20±0,27
6
10,83±0,13
11,11±0,18
11,42±0,16
Таким образом, средняя масса яиц перепелов опытной группы была
выше на протяжении всего продуктивного периода. Различия по массе яиц в
разных поколениях составили от 10 до 20%. Отмечены большие индивидуальные различия по массе яиц в опытной группе перепелов.
Размеры и форма птичьего яйца, прежде всего, зависят от вида, породы
и возраста птицы, в меньшей мере от кормления и содержания. Причем, если
масса яиц изменяется с возрастом несушек, с интенсивностью яйцекладки, в
зависимости времени года, уровня кормления и условий содержания, то форма яйца – это видовой признак, мало зависящий от перечисленных факторов.
Практически неизменно и строение яйца. В яйцах сельскохозяйственной
птицы содержится примерно 6 весовых частей белка, 3 части желтка и 1
часть скорлупы. По нашим данным, в перепелиных яйцах массой от 8,0 до
15,0 граммов как обычной, так и трансгенной птицы на одну весовую часть
скорлупы приходилось 6,2 частей белка и 3,3 части желтка. Для крупных яиц
трансгенных перепелов характерна следующая пропорция: 6,5 частей белка,
4,9 части желтка на 1 часть скорлупы.
По данным разных авторов, морфологические показатели перепелиных
яиц несколько отличаются от яиц других видов птиц. У перепелов в яйце
больше белка, чем у других выводковых птиц. Например, у кур в яйце содержится 55,8% белка, у перепелов – 60%. Количество желтка в яйцах пере-
179
пелов такое же, как у кур и индеек, – соответственно 31,9; 31,9; 32,3%. У
большинства выводковых птиц скорлупа составляет более 10% от массы яйца, у перепелов 7,2% [117]. Хотя встречаются и другие пропорции в строении
перепелиного яйца, например 55,9% белка, 34,2% желтка, 9,9% скорлупы
[112]. По данным других авторов, относительная масса желтка может составлять 30–34%, белка – 52–58% от массы яйца в течение всего периода продуктивности перепелов [126].
В настоящее время в результате интенсивной селекции на повышение
продуктивности сельскохозяйственной птицы масса яйца увеличилась, что
привело к снижению доли желтка до 26–29%. Только 10–25% кур несут яйцо
с крупным (31-34%) желтком. Белок составляет от 58 до 64% массы куриного
яйца. Это предполагает необходимость ведения целенаправленной селекции
на увеличение массы желтка до 30–31% [150].
Морфологические показатели яиц перепелов 7– и 3-месячного возраста, массой 10,2±0,2 г по данным [61] следующие: относительная масса белка
составила 60,4–60,8%, желтка – 31,4–30,9%.
По нашим данным в опытной группе увеличение массы яйца до 15,0 г
было обусловлено пропорциональным возрастанием его составных частей –
скорлупы, белка и желтка. При этом доля желтка составляла 29,0–33,0%,
белка – 58,0–61,0%, скорлупы – 9,0–10,0%. Доля желтка яиц контрольной
группы составляла 29,0–31,7%, белка – от 58,7 до 60,8%, скорлупы – от 9,0 до
10,3%. Крупные яйца (больше 15,0 г) имели достоверно большую долю
желтка и меньшую долю белка. При этом соотношение белок/желток для яиц
контрольной группы практически оставалось постоянным: 1,9–2,1, для крупных яиц в опытной группе оно было меньше: 1,8–1,3 (рис. 16).
По массе скорлупы данные разных авторов также имеют некоторые
расхождения. Если по результатам наших исследований на долю скорлупы
(вместе с подскорлупной оболочкой) приходилось в среднем 9–10%, то по
данным других авторов на долю скорлупы приходится от 7% до 13% [61;
117; 126]. Масса скорлупы зависит не только от массы яйца, но и от ее тол-
180
щины. Толщина скорлупы может зависеть от уровня питания, обменных процессов в организме, меняться с возрастом, не говоря уже о субъективном
«вкладе» исполнителя. Так у нас масса белка находилась по разности между
массой яйца и массой желтка плюс скорлупы. При такой методике морфологического анализа возможны заниженные данные по массе белка в случае
недостаточного его удаления с поверхности желтка и скорлупы. И наоборот,
данные по массе желтка и скорлупы в этом случае завышаются.
Форму яйца принято характеризовать соотношением поперечного и
продольного диаметров, выраженным в процентах – «индексом формы». При
колебании массы перепелиных яиц от 10,3 до 11,8 г индекс формы в среднем
составляет 78,5% и колеблется незначительно [23].
По результатам нашим исследований, индекс формы перепелиных яиц
массой от 8,0 до 15,0 г контрольной и опытной групп менялся от 83,6% до
75,4%. При дальнейшем увеличении массы яиц опытной группы происходило снижение индекса формы до 67,5% (рис. 17). Следовательно, крупные перепелиные яйца имели более вытянутую форму по сравнению с яйцами нормальной массы. Параллельно с ростом массы яйца увеличивался его продольный и поперечный диаметры. Преобладание роста продольного диаметра над поперечным появлялось при увеличении массы яиц больше 16 г. Напротив, для мелких яиц массой 8–9 г характерен более высокий индекс формы, из-за относительно большего размера поперечного диаметра, зависящего
главным образом от диаметра желтка.
Наблюдаемые морфологические изменения яиц с увеличением их размеров мы связываем с тем что, повышенный фон ростовых факторов в организме птицы вызывает увеличение биосинтетических процессов. Созревание
фолликулов яичника, будущих желтков, происходит достаточно длительное
время. Основные компоненты желтка синтезируются в печени и транспортируются кровью в растущий фолликул. За счет увеличения синтеза компонентов у трансгенных особей их желтки за время активного роста (около 10 сут.)
успевают приобрести бóльшие размеры. Формирование белковой оболочки
181
яйцеклетки происходит в течение нескольких часов (5–6 час) в белковом отделе яйцевода, куда желток попадает после овуляции. Причем пусковым механизмом начала синтеза белковой оболочки является механическое раздражение желтком стенок белкового отдела яйцевода [477]. По-видимому, за ограниченное время нахождения в белковом отделе желток не «успевает» покрыться пропорциональным его массе количеством белка. Что касается индекса формы яйца, то ясно, что малый диаметр яйца в бóльшей степени лимитируется диаметром скорлупного отдела яйцевода, чем большой диаметр
яйца. Вследствие этого крупные яйца имеют более удлиненную форму.
Известно, что содержание основных компонентов птичьего яйца (протеинов, липидов, углеводов, воды, кальция, фосфора, железа, натрия, калия,
хлора, магния, меди, серы) мало зависит от кормления и других внешних
факторов. Однако другие биохимические показатели (количество витаминов,
фтора, марганца, йода, олеиновой, линолевой, линоленовой кислот) в определенной степени вариабельны. Вполне возможно, что содержание отдельных компонентов яйца может определяться наследственностью, особенно для
птицы с измененным генотипом, каковыми являются трансгенные перепела.
Наиболее важной частью птичьего яйца с биологической точки зрения
является желток. Хотя относительная масса желтка составляет лишь 29–32%,
более 50% сухих веществ яйца, в основном органических находятся в желтке.
Большая часть сухих веществ желтка перепелиных яиц 26,1–29,3% приходится на долю липидов, которые обеспечивают запасы энергии для развития
эмбриона. Липиды желтка главным образом состоят из триглицеридов и
фосфолипидов. Триглицериды выполняют в основном энергетическую функцию. Кроме этого, запасы триглицеридов выполняют защитную функцию
при изменении температуры внешней среды. Из жирных кислот в триглицеридах яйца на долю олеиновой приходится 50%, пальмитиновой – 27, линолевой – 11, стеариновой – 6, на прочие – около 6%. Фосфоглицериды, или
фосфолипиды, являются неотъемлемыми структурными компонентами плазматических и внутриклеточных мембран. Названия различным типам фос-
182
фоглицеридов дают в соответствии с названием спирта. Исходным соединением для всех фосфоглицеридов служит фосфатидная кислота, в которой
спирт отсутствует. Фосфолипиды составляют 27–30% от всех липидов яйца.
В них содержатся жирные кислоты: олеиновая – 43%, пальмитиновая – 32%,
линоленовая – 8%, стеариновая – 4%. Благодаря наличию гидрофобных участков жирных кислот и полярных остатков фосфорной кислоты со спиртами
фосфолипиды служат идеальным структурным материалом для полупроницаемых плазматических, ядерных и других внутриклеточных мембран. Миллионы клеток, образующиеся в ходе пролиферации, «строят» свои клеточные
мембраны из запасов предшественников, депонированных в желтке яйца.
Кроме триглицеридов и фосфолипидов, в яйце содержатся стиролы в количестве 3,7–7,7%. Они представлены главным образом холестерином – структурным компонентом клеточных мембран. Все клетки позвоночных способны синтезировать холестерин, тем не менее, практически весь холестерин,
необходимый для организма сверх поступающего алиментарным путем, синтезируют клетки печени и слизистой кишечника. У позвоночных холестерин
служит предшественником обширного семейства стероидных гормонов, играющих незаменимую роль в регуляции метаболизма, роста, репродукции,
поведения животных. В яйце холестерин на 84% находится в этерифицированной форме с длинноцепочечными жирными кислотами. В птичьем яйце
содержится 61,51% незаменимых ненасыщенных жирных кислот, в говяжьем
жире – 43, в молочном жире еще меньше – 32%. Линолевая и арахидоновая
жирные кислоты являются предшественниками синтеза важных биологически активных веществ, обладающих действием, схожим с действием гормонов, но, как правило, влияющих локально и часто моделирующих действие
истинных гормонов: простагландинов, простациклинов, тромбоксанов. Особую роль играют простагландины, простациклины в функционировании кровеносной системы эмбриона [8; 9; 175].
По результатам наших исследований, в желтке яиц опытной группы
содержание липидов составило от 26,1 до 29,3% для яиц разной массы. Со-
183
держание липидов в желтке яиц контрольной группы менялось в интервале
27,8–29,2%. При этом, содержание жирных кислот в яйце не зависело от возраста несушек (рис. 18). Это справедливо как для опытной, так и контрольной групп. Сравнение состава жирных кислот яиц опытной и контрольной
групп одновозрастной птицы выявило некоторые различия по отдельным
жирным кислотам. А именно, в яйцах опытной группы было выше содержание стеариновой кислоты на 13,61% и 20,75%, у несушек 3 и 6 месячного
возраста соответственно Содержание олеиновой кислоты было ниже на
12,14% у 6 месячных несушек опытной группы. При этом линолевой кислоты
было больше в яйцах опытной группы на 13,21% и 9,83% у несушек 3 и 6 месячного возраста соответственно.
Представляло интерес, выяснить меняется ли, и если да, то как, жирнокислотный состав липидов желтка яиц различных весовых категорий. Из
представленных в табл. 15 и 16 данных видны некоторые различия жирнокислотного состава липидов желтка яиц контрольной и опытной групп. Анализ полученных результатов показал (рис. 19), что с изменением массы перепелиных яиц контрольной и опытной групп наблюдались изменения в содержании отдельных важных жирных кислот, как насыщенных, так и ненасыщенных, в липидах желтка. Главным образом это относилось к жирным кислотам с 18 атомами углерода: стеариновой, олеиновой, линолевой и линоленовой – наиболее распространенными в природе. Выявленные изменения
жирнокислотного состава липидов желтка – экспериментальный факт, однако чем они обусловлены и, в частности, связаны ли с трансгенностью, определить затруднительно, поскольку количество этих кислот в птичьем яйце
может зависеть от многих факторов – питания, содержания, состояния здоровья и проч. [8; 9]. С определенной долей вероятности можно предполагать
влияние трансгена. Например, у трансгенных свиней изменения коснулись
жирнокислотного состава сала [204].
Белок перепелиных яиц на 85,0–87,9% состоит из воды. На долю протеинов приходится от 8,86 до 10,88%. Несмотря на то, что в птичьем белке, в
184
данном случае в перепелином, протеинов меньше чем в желтке приблизительно в 1,5 раза, воды в белке напротив почти в 2 раза больше, чем в желтке.
Хотя известно, что относительное обилие воды связано с наличием протеинов, с их гидрофильными свойствами. Белковая оболочка яйца богата водой в
силу того, что ее органическое вещество практически полностью состоит из
протеинов, в то время как в желтке липиды, содержащиеся в больших количествах, препятствуют полному обводнению протеинов.
Содержание протеинов для всех проанализированных нами желтков
опытной и контрольной групп составило от 15,1 до 17,0%, независимо от их
массы. При этом в желтке перепелиных яиц содержалось от 45,8 до 47,2%
воды. Нами не было обнаружено достоверных различий по этим показателям
для яиц разной массы, как в опытной, так и в контрольной группах.
В составе протеинов яйца содержатся запасы аминокислот, обеспечивающие будущие потребности эмбриона на всех этапах его развития. Как
следует из полученных результатов, количество и аминокислотный состав
яичного белка трансгенных перепелов не отличался от такового у контрольных особей и не зависел от массы яиц. Аминокислоты необходимы для синтеза разнообразных клеточных и внеклеточных белков тела развивающегося
эмбриона птиц. Аминокислоты служат предшественниками пуриновых и пиримидиновых оснований, входящих в нуклеиновые кислоты. Производные
аминокислот играют роль химических сигнальных молекул: гормонов, нейропередатчиков. Протеины яйца являются истинно запасными, но в силу им
присущих физико-химических свойств они выполняют также защитные
функции, предохраняя зародыш от вредных воздействий внешней среды.
Содержание каротиноидов в желтке яиц опытной группы было от 9,2
до 16,6 мкг/г. В контрольной группе содержание каротиноидов в желтке менялось от 12,2 до 20,7 мкг/г. По полученным данным прослеживается тенденция увеличения содержания каротиноидов с увеличением массы яйца.
Содержание витамина А в желтке яиц опытной группы изменялось от 12,8 до
16,8мкг/г, в контрольной – от 14,2 до 19,7 мкг/г. Содержание витамина Е в
185
желтке яиц опытной группы менялось от 56,7 до 80,5 мкг/г, в контроле – от
75,4 до 90,5 мкг/г. По результатам нашего опыта получается, что в целом содержание витамина Е выше в желтках яиц контрольной группы, чем опытной. Содержание витамина В2 в желтке опытной группы составило 3,68–4,10
мкг/г, в контрольной – от 3,82 до 4,19 мкг/г, то есть содержание витамина В2
в желтке не зависело от массы яиц и было практически одинаковым в опытной и контрольной группах. Содержание витамина В2 белке яиц опытной
группы менялось от 1,68 до 1,91 мкг/г, тогда как в контроле – от 1,95 до
2,16 мкг/г.
Для кур свойственны индивидуальные различия содержания витаминов
в яйце. Яйца, снесенные последовательно одной и той же несушкой, могут
значительно различаться по содержанию витаминов в них. Есть данные, что в
яйцах интенсивно несущихся кур содержание витамина А, Д меньше, чем в
яйцах плохих несушек. Возможно, что это справедливо и для перепелиных
яиц, во всяком случае, разброс полученных результатов свидетельствует в
пользу этого мнения.
Таким образом, живая масса, число и средняя масса яиц у перепелов,
трансгенных по гену бычьего соматотропина, превышали аналогичные показатели у птицы, которая не была генетически модифицирована. При этом
гормональный статус трансгенных перепелов по изученным показателям не
претерпел существенных изменений по сравнению с обычными перепелами.
Выявлено повышение иммунного статуса перепелов опытной группы, выраженного в ускоренной выработке антител к вводимому антигену. Перепелиные яйца опытной группы с массой больше 15,0 г имели достоверно большую долю желтка и меньшую долю белка. При этом соотношение белок/желток для этих яиц опытной группы было меньше: 1,8–1,3 по сравнению с контрольной группой: 1,9–2,1. Морфологический и биохимический
анализ яиц трансгенных перепелов не выявил закономерных отличий их состава от такового у не трансгенной птицы. Наблюдаемые модификации жирнокислотного состава яиц трансгенных перепелов лишь с некоторой долей
186
вероятности можно отнести на счет влияния трансгена. Следовательно, можно заключить, что у трансгенных по гену бычьего гормона роста перепелов
не произошло изменений в биологических закономерностях, определяющих
процессы формирования яйца, а полученные данные свидетельствуют о возможном практическом использовании методов трансгенеза в селекционной
работе на повышение продуктивных показателей птицы.
4.2. Экспрессия вителлогенинового гена и биогенез рибосом
печени цыплят
Одним из факторов регуляции активности генов являются стероидные
гормоны. Известно, что стероидные гормоны избирательно накапливаются в
определенных тканях организма, где они влияют на процессы жизнедеятельности клеток. В подавляющем большинстве случаев при их действии наблюдается усиление биосинтеза нуклеиновых кислот и белков, происходит индукция синтеза новых, до этого не синтезируемых, матричных РНК. Таким
образом, действие стероидных гормонов на метаболизм клеток заключается в
дерепрессии определенных генов и общем усилении биосинтетических процессов.
Изучение распределения меченого эстрадиола в клетках компетентных
тканей показало, что он локализуется в ядрах и цитозольной фракции. В цитозоле и ядрах клеток удалось выявить особые белки, связывающие эстрадиол с рецепторами. Белки-рецепторы высокоспецифичны и не образуют комплексов с другими гормонами и со многими аналогами своего гормона. Рецептор представляет собой аллостерический регуляторный белок, который,
взаимодействуя с белками акцепторной зоны хроматина, способен изменять
процессы транскрипции. Этот комплекс активирует в каждой компетентной
ткани не случайные, а строго определенные наборы генов и дерепрессия их
происходит в определенной временной последовательности [136; 137]. Рецепторные белки появляются в клетках в процессе их дифференцировки, а
также под влиянием других или тех же самых гормонов. Например, в клетках
яйцевода цыплят количество рецептора к прогестерону значительно возрас-
187
тает после введения цыплятам эстрадиола [103]. В цитоплазме клеток разных
органов млекопитающих обнаружены, по крайней мере, три вида эстрадиолрецепторных белков – I, II и особый белок, отличающийся по размерам и некоторым другим физико-химическим свойствам. В печени самцов крыс содержатся все три формы, в печени самок только I и II, в матке только I, а в
почках только II [74; 143; 146]. При изучении взаимодействия комплексов эстрадиол-рецептор с ядрами клеток in vitro было показано, что он не связывается с ядрами печени самцов крыс [98]. Таким образом, одним из факторов,
обуславливающих специфичность реакции ткани на гормон, а также множественность гормональных эффектов, обусловлены гетерогенностью рецепторов [144].
По всей видимости, нет различий в эстрадиоловых рецепторах печени
петухов и кур, поскольку печень неполовозрелых цыплят обоего пола, а также взрослых петухов одинаково отвечает на эстрадиол [331; 332; 371].
Введение эстрадиола цыплятам в наших экспериментах приводило к
увеличению массы печени, обусловленное как гиперплазией, так и гипертрофией органа. Характер изменения массы печени становится более наглядным, если сделать пересчет на содержание в ней ДНК. Представленные в
таблице 40 данные по числу клеток печени, массе клеток и содержанию в них
рибосом в разные сроки после однократного введения цыплятам 17-βэстрадиола в дозе 30 мг/кг мы получили расчетным путем. Расчеты сделаны
исходя из того, что 1 мг рибосом соответствует 11 единиц оптической плотности при 260 нм [97; 502], клетка печени цыпленка содержит 2,3 пг ДНК на
диплоидный геном [293], рибосома цыплят содержит 2,3×106 дальтон РНК,
которая составляет 40% ее массы [429].
Из данных табл. 40 следует, что увеличение массы печени под влиянием эстрадиола происходило как за счет увеличения числа клеток в печени, так и за счет увеличения их массы, которые заметно увеличивались через 48 часов после введения эстрадиола. При этом на 2–6 сутки имела место
некоторая периодичность по числу клеток и их массе с периодом в 48 часов.
188
Причем эти две кривые сдвинуты относительно друг друга по фазе на полпериода (24 часа) – увеличение числа клеток сопровождалось уменьшением
их массы, и наоборот. Число рибосом в клетках изменялось синхронно с их
массой.
Таблица 40
Динамика действия однократного введения 17-β-эстрадиола
в дозе 30 мг/кг на печень цыплят
Время после введения эстрадиола
Число клеток
на орган, млрд.
Масса клетки,
пг
Число рибосом
на клетку, млн.
0
38,1±2,5
683±41
1,38±0,05
1/6
35,3±2,3
658±23
1,15±0,03
1/2
39,7±3,9
697±64
1,33±0,07
1
39,6±1,7
637±9
1,25±0,04
2
46,4±3,5
727±53
1,79±0,07
3
56,6±3,6
660±37
1,51±0,04
4
49,7±2,7
821±41
2,06±0,05
5
55,6±2,7
729±9
1,57±0,09
6
48,4±2,8
743±37
1,74±0,03
7
47,9±4,7
731±30
1,54±0,04
8
44,6±2,0
697±9
1,39±0,05
9
36,4±8,7
559±39
0,94±0,02
Подобный характер изменения массы печени может быть объяснен частичной синхронизацией гепатоцитов по митотическому циклу. После 7–8-х
суток наблюдалось снижение массы печени, причем на 9-е сутки масса клеток была даже ниже уровня контроля. По-видимому, по окончании действия
эстрадиола, возвращение массы печени к контрольному уровню осуществляется за счет распада клеток, начинающемуся с цитоплазмы, что и обуславливает уменьшение массы гепатоцитов. Подтверждает это предположение и характер изменения рибонуклеазной активности в печени, которая на 2–4 сутки
ниже уровня контроля, а на 5–8 – выше.
Параллельно росту числа гепатоцитов увеличивался и их белоксинтезирующий аппарат. На четвертые сутки после введения эстрадиола содержа-
189
ние рибосом на гепатоцит было в 1,5 раза выше, чем в контроле. В конечном
итоге, на максимуме, содержание рибосом на орган увеличивается более чем
в 2 раза, что «позволяет» печени осуществление новой, вителлогенной функции, не затрагивая коренным образом других имеющихся функций.
Эффективность биосинтеза белка в клетках зависит от времени жизни
РНК, то есть от числа циклов их использования. Одним из главных факторов,
определяющих время жизни РНК, является активность внутриклеточных рибонуклеаз. Изучение активности рибонуклеазы печени цыплят после введения им эстрадиола в наших экспериментах показало, что динамика рибонуклеазной активности имеет двухфазный характер. В первой фазе ответа печени на эстрогенизацию, когда увеличивалось число гепатоцитов и содержание
в них рибосом, рибонуклеазная активность была ниже контрольного уровня,
а во второй фазе, когда действие гормона прекращалось, и возникала необходимость распада гипертрофированного белоксинтезирующего аппарата, она
была выше уровня контроля. На 9-е сутки после эстрогенизации содержание
рибосом в клетках печени было на 30% ниже уровня контроля, что объясняется, по-видимому, не только снижением биосинтеза рибосом, но и их усиленным распадом.
Интерес представляет резкое и кратковременное повышение рибонуклеазной активности в первые часы после введения эстрадиола, которое сопровождалось достоверным снижением числа рибосом в гепатоцитах. Возможно, что это увеличение отражает необходимость распада определенной
части РНК перед перестройкой метаболизма гепатоцитов. Увеличение активности рибонуклеаз по продолжительности совпадает с лаг-периодом, наблюдаемым после эстрогенизации, до начала синтеза вителлогенина. Именно в
это время происходили изменения в электрофоретических спектрах ядерных
РНК. Эти данные свидетельствуют о том, что наиболее ответственными для
становления вителлогенной функции у цыплят являются первые часы после
эстрогенизации. Это подтверждают и результаты, полученные с использованием ингибиторов синтеза РНК.
190
Тиоацетамид (ТАА) является специфическим гепатоканцерогеном, вызывая опухоль только после продолжительного воздействия. Его раннее цитотоксическое действие невелико [265]. Было показано, что in vivo ТАА вызывает значительную ядрышковую гипертрофию и сильное увеличение синтеза 45S предшественника рибосомных РНК [585; 607]. ТАА после введения
in vivo проникает в ядрышки клеток печени, где находится в связанном с белком состоянии [526].
В наших опытах однократное введение ТАА цыплятам не приводило к
достоверному изменению содержания РНК и рибосом в печени. Ежесуточное
введение ТАА достоверно (р < 0,05) снижало содержание рибосом на 2-е сутки и общей клеточной РНК на 4-е сутки. Таким образом, несмотря на то, что
согласно литературным данным ТАА увеличивает синтез РНК, увеличение
количества РНК в печени не происходило. Кроме того, ТАА на фоне введенного эстрадиола ингибирует вызываемое эстрадиолом увеличение содержания в печени РНК и рибосом, а также синтез вителлогенина и триглицеридов,
причем синтез вителлогенина ингибируется сильнее. Естественным объяснением тому обстоятельству, что, не смотря на возрастание синтеза РНК, количество ее в клетке не увеличивается, может быть, предположение, что параллельно увеличивается и ее распад. Исследование рибонуклеазной активности
в печени цыплят после введения им ТАА показало, что она увеличивается на
60% по сравнению с контролем. В этом же эксперименте скорость включения
меченого уридина в суммарною РНК печени цыплят была на 30% выше, чем
в контроле. Итак, ТАА не только увеличивает скорость синтеза РНК, но увеличивает рибонуклеазную активность в печени. В литературе имеются данные, что ТАА в печени крыс увеличивает активность ядерной рибонуклеазы
Н более чем в 3 раза [495; 558]). Рибонуклеазы Н, или гибридазы, это ферменты, избирательно расщепляющие цепь РНК в составе ДНК-РНК гибрида.
Нейтральная рибонуклеаза, активность которой измерялась в нашей работе,
при рН 7,4 и с дрожжевой РНК в качестве субстрата, по своему «удельному
весу» главная рибонуклеаза клеток печени, локализуется она в основном в
191
лизосомной фракции [225] и, по-видимому, играет главную роль в распаде
цитопразматической РНК. Принято считать, что рибонуклеазы Н участвуют в
репликации ДНК. Их роль заключается в выщеплении коротких последовательностей РНК-затравок в цепи вновь синтезируемой ДНК до того как ДНК
полимеразы и лигазы заполнят освободившиеся участки дезоксирибонуклеотидами и соединят их в единую цепь вновь синтезированной ДНК. Увеличение активности рибонуклеаз Н может свидетельствовать об усилении синтеза
ДНК и пролиферации клеток печени. Действительно, есть данные, что ТАА
вызывает у крыс гепатоцеллюлярную пролиферацию, похожую на регенерацию печени после частичной гепатоэктомии. Скорость включения меченого
тимидина в ДНК при этом очень сильно возрастает (в 30 раз) [473]. Увеличение же активности нейтральной рибонуклеазы в первую очередь говорит об
усилении распада РНК в клетках.
Увеличение рибонуклеазной активности под влиянием ТАА может
быть одним из объяснений его ингибирующего действия на эстрогениндуцированный вителлогенез. Введение цыплятам 17-β-эстрадиола приводило к
снижению в их печени активности рибонуклеаз. ТАА препятствовал этому
снижению, и активность оставалась на прежнем уровне. Высокая рибонуклеазная активность снижала время жизни РНК, в первую очередь мРНК, что
приводило к снижению эффективности белкового синтеза. Поскольку для
синтеза вителлогенина необходимо постоянное наличие вителлогениновой
мРНК и нативных рибосом, синтез вителогенина ингибировался сильнее синтеза триглицеридов, который в меньшей степени зависит от метаболизма
РНК.
5-Бромдезоксиуридин (БУРД) является стерическим аналогом тимидина и включается вместо него при репликации ДНК. БУДР оказывает необратимое действие на дифференцировку клеток, растущих в культуре [592].
Скорость включения меченого аденозина в поли(А)-РНК эмбриональных
клеток цыпленка, выросших в присутствии БУДР, ниже, чем в РНК контрольных клеток [508]. Однако, подавление транскрипции поли(А)-РНК не
192
является его основным действием [521]. Импульсная обработка клеток, растущих в культуре, в S-фазу подавляет активность некоторых ферментов.
Причем, какие из ферментов будут подавлены, зависит от времени введения
БУДР в S-фазе, и показывает временную последовательность репликации
фрагментов ДНК, кодирующих тот или иной белок [389; 390].
Введение БУДР эстрогенизированным цыплятам не оказало какоголибо заметного влияния на синтез в их печени вителлогенина и триглицеридов. Действие БУДР не зависело от времени и продолжительности его введения. Некоторые различия по содержанию общего белка в плазме крови цыплят на четвертые сутки после эстрогенизации на наш взгляд трудно как-либо
интерпретировать. Если принять, что при введении in vivo БУДР действует
так же, как, будучи введенным в среду культуры клеток, то можно сделать
вывод, что приобретение печенью под влиянием эстрадиола вителлогенной
функции не является классической дифференцировкой, и что для биосинтеза
вителлогенина пролиферация гепатоцитов не является необходимым условием. Действительно, не наблюдается увеличения числа клеток до начала синтеза вителлогенина в печени цыплят. Кроме того, как ранее было показано,
все гепатоциты после эстрогенизации сразу же начинают синтезировать вителлогенин, не прекращая синтез других «экспортных» белков, в частности,
сывороточного альбумина [609]. Индукция эстрадиолом синтеза вителлогенина обратима, после удаления гормона синтез вителлогенина прекращается,
и масса печени возвращается к контрольному уровню, причем происходит
уменьшение числа гепатоцитов, пролиферация которых была вызвана эстрадиолом.
В ядрах клеток эукариотов имеются три ДНК зависимые РНК полимеразы I, II и III, которые были названы по порядку их элюирования с колонки
ДЭАЭ-сефадекса [535]. Было показано, что РНК полимераза I локализуется
преимущественно в ядрышках, а полимеразы II и III находятся в нуклеоплазме [536]. То что, РНК полимераза II осуществляет синтез мРНК, было выяснено после того, как обнаружили, что этот энзим ингибируется α-аманитином
193
[367; 394; 424]. Нуклеоплазматическая РНК полимераза III также ингибируется α-аманитином, но в гораздо больших дозах [210; 563].
α-Аманитин, пептидный токсин некоторых видов грибов, является высокоспецифичным ингибитором ДНК зависимых РНК полимераз II и III у
самых разных видов эукариотов. Ингибирующее действие α-аманитина на
РНК полимеразы наступает быстро, через несколько минут, и продолжается
примерно 12 часов. Токсическое действие α-аманитина развивается медленно: независимо от дозы, летальный исход у мыши наступает не раньше, чем
через 15 часов. Полулетальная доза α-аманитина для мыши составляет 0,3
мг/кг [99]. В малых дозах, десятки микрограмм на килограмм, α-аманитин
избирательно ингибирует РНК полимеразу II, ответственную за синтез мРНК
[424], а в больших дозах, сотни микрограмм, он ингибирует кроме полимеразы II также и РНК полимеразу III, осуществляющую синтез тРНК и 5s рибосомной РНК [626]. В системах in vitro α-аманитин не влияет на активность
РНК полимеразы I.
В нашей работе использовалась малая доза – α-аманитина (20 мкг/кг),
которая избирательно блокирует активность РНК полимеразы II. Введение
α-аманитина одновременно с эстрадиолом полностью подавляла ответ печени на эстрогенизацию.
Первой реакцией печени цыплят на введение эстрадиола является появление эстрадиолового рецептора в ядрах клеток печени. Уже через несколько минут после введения эстрадиола в ядрах гепатоцитов появляется
рецептор, причем концентрация его в это время уже близка к максимальной
[377]. Введение цыплятам циклогексимида вызывает задержку в появлении
рецептора и задержку в появлении вителлогенина в крови [414]. Циклогексимид является специфическим ингибитором белкового синтеза. Механизм
его действия заключается в блокировании траслокации рибосом вдоль цепи
мРНК, тем самым циклогексимид ингибирует элонгацию полипептидной цепи. Действие его обратимо [6; 14; 160] То, что циклогексимид вызывает задержку в появлении эстрадиолового рецептора в ядрах, означает, что рецеп-
194
тор синтезируется de novo. В отличие от циклогексимида, α-аманитин вызывает не задержку, а полное подавление ответа на эстрогенизацию. Таким образом, первой реакцией печени на гормон является синтез мРНК эстрадиолового рецептора или его субъединицы, что служит спусковым механизмом ответа печени на эстрогенизацию. Подавление α-аманитином синтеза мРНК в
это время полностью подавляет ответ печени. Если же в то же время блокировать синтез белка циклогексимидом, то появление эстрадиолового рецептора и синтез вителлогенина задерживаются до удаления циклогексимида и
возобновления белкового синтеза, когда мРНК рецептора получает возможность транслироваться, а затем последовательность биохимических событий
приводит к синтезу вителлогенина.
Результат действия α-аманитина, введенного цыплятам через 24 часа
после эстрадиола, оказался иным. В этом случае, на вторые сутки после введения гормона и через сутки после α-аманитина, вителлогенин в крови цыплят содержался, но его количество составляло 17% от нормы. Синтез триглицеридов подавлялся значительно слабее, содержание их составляло 82% от
уровня, характерного для крови цыплят на вторые сутки введения им эстрадиола. Такое различие в ингибирующем действии α-аманитина на содержание триглицеридов и вителлогенина заключается в природе их биосинтеза. В
первые сутки после введения эстрадиола в печени происходит перестройка
метаболизма, возрастает активность ферментов липогенеза, появляются новые вителлогениновые мРНК. Введение α-аманитина приводит к блоку синтеза мРНК, что через некоторое время вызывает остановку синтеза вителлогенина из-за отсутствия матриц. А синтез триглицеридов за это время не ингибируется, поскольку он в меньшей степени зависит от метаболизма РНК, и
уже образовавшиеся ферменты их синтеза продолжают работать в присутствии α-аманитина.
α-Аманитин, введенный одновременно с гормоном и через 24 часа после него, в обоих случаях подавлял вызываемое эстрадиолом увеличение рибосом в гепатоцитах. Ранее было показано, что синтез рРНК зависит от бел-
195
кового фактора с коротким временем жизни, необходимого для инициативы
РНК полимеразой I синтеза рРНК на ДНК-матрице [404]. Под влиянием эстрогенов в матке неполовозрелых крыс синтезируется особый белок, который
стимулирует активность РНК полимеразы I [527]. Естественно, эти белки кодируются мРНК, синтез которых чувствителен к α-аманитину. Аналогичные
данные были получены и на матке кролика [239] Кроме того, показано, что
эстрогены способны индуцировать в яйцеводе цыплят синтез РНК полимеразы I de novo [283]. Также показано, что увеличение активности РНК полимеразы I в печени петуха связано с увеличением частоты инициации [226], что
также говорит об увеличении числа молекул РНК полимеразы, а не только о
возрастании ее удельной активности. Для нормального процессинга предшественников рибосомных РНК и образования рибосом необходимо также постоянное поступление в ядрышки структурных рибосомных белков. Все эти
процессы связаны с синтезом белка de novo, а потому чувствительны к
α-аманитину.
Таким образом, ингибирующее действие α-аманитина, введенного через 24 часа после эстрадиола, на синтез вителлогенина заключалось не только в подавлении синтеза вителлогениновой мРНК, но и в подавлении биогенеза рибосом.
Актиномицин Д, высокотоксичный антибиотик, широко используется в
исследованиях для подавления с высокой специфичностью активность РНК
полимераз. В низких дозах (0,001–0,1 мкг/мл) актиномицин Д ингибирует
синтез РНК в культурах клеток [512]. Большие дозы актиномицина (5 мкг/мл)
ингибируют синтез ДНК, блокируя инициацию репликации [339]. Средние
дозы актиномицина применяют для ингибирования РНК полимеразы III [5].
Изучение действия актиномицина Д в модельных опытах показало, что
низкие дозы актиномицина, эффективно подавляющие синтез рРНК in vivo, в
системах синтеза РНК in vitro не эффективны. Малые дозы актиномицина Д
не влияют на синтез рРНК в выделенных ядрах и ядрышках [426]. Эти данные позволяют сделать вывод, что действие актиномицина Д на ядрышковую
196
РНК полимеразу I, ответственную за синтез предшественника рРНК, не прямое. Действительно, было показано, что актиномицин в малых дозах, которые in vivo подавляют активность РНК полимеразы I, а in vitro на нее не влияют, ингибируют активность РНК полимеразы II в выделенных ядрах и степень ингибирования зависит от концентрации актиномицина. Причем максимальное подавление составляло около 20% [426]. Это показывает, что актиномицин Д имеет большее сродство к некоему нуклеоплазматическому локусу; чем к рДНК. Исследования на клетках Hela показали, что низкая доза актиномицина Д (0,04 мкг/мл) ингибирует синтез группы быстро метящихся
белков, которые включаются в 40S субъединицу рибосом [407]. В другой работе было показано, что низкая доза актиномицина, ингибируя частично активность РНК полимеразы II, ингибирует РНК полимеразу I, причем степень
ингибирования РНК полимеразы I зависит от времени, Т1/2 = 20 минут. В
этом же диапазоне концентраций актиномицин Д ингибировал синтез быстрометящихся ядерных белков, который также зависел от концентрации актиномицина [427]. Эти данные означают, что транскрипция рРНК находится
под контролем транскрипции некоторой части мРНК, которая составялет от 5
до 50% от суммарной в зависимости от вида клеток [423; 512], и что синтез
этой мРНК ингибируется низкими дозами актиномицина Д. Быстрое действие актиномицина Д на РНК полимеразу I означает, что эти специфические
мРНК очень короткоживущие. Однако, имеются данные, то действие малых
доз актиномицина Д на РНК полимеразу I более быстрое, чем на ингибирование быстрометящихся белков. Отсюда делается вывод, что актиномицин Д
действует также непосредственно на РНК полимеразу I [364]. Но, так или
иначе, достоверно установлено, что актиномицин в малых дозах избирательно ингибирует продукцию рибосом, не влияя на синтез большей части мРНК
и ее транспорт в цитоплазму.
В нашей работе применялась малая доза актиномицина Д (50 мкг/кг),
который вводился цыплятам внутрибрюшинно одновременно или через 24
часа после инъекции эстрадиола.
197
Действие актиномицина Д, введенного одновременно с гормоном, на
индуцированный эстрадиолом синтез вителлогенина и триглицеридов не было таким радикальным, как действие α-аманитина. Актиномицин Д не полностью подавлял ответ печени на эстрогенизацию, но примерно на 30% снижал
содержание как вителлогенина, так и триглицеридов в крови цыплят. Из этого следует вывод, что актиномицин Д не влияет на синтез мРНК эстрадиолового рецептора и возможно, других регуляторных белков, которые могли
транслироваться на уже имеющихся в клетках печени рибосомах. Равномерное снижение синтеза вителлогенина и триглицеридов, по-видимому, объясняется дефицитом рибосом, увеличению содержания которых препятствовал
актиномицин. Дефицит рибосом в клетках печени приводил к снижению синтеза белка, вследствие чего содержание эстрадиолового рецептора, возможно, не достигало нормального уровня, что в свою очередь приводило к общему снижению интенсивности ответа печени на эстрогенизацию. Кроме того,
дефицит рибосом непосредственно сказывался на уровне синтеза вителлогенина и ферментов липогенеза, активность которых возрастает под влиянием
эстрадиола.
Ингибирующее действие актиномицина Д, введенного через 24 часа
после эстрадиола, на вторые сутки после эстрогенизации оказывало большой
ингибирующий эффект, чем одновременное с гормоном введение. В этом
случае, синтез триглицеридов, как менее зависящих от метаболизма РНК, ингибировался несколько слабее, чем синтез вителлогенина.
Таким образом, ингибирующее действие малых доз актиномицина Д на
эстрогениндуцированный вителлогенез заключается в более или менее равномерном снижении биосинтетических процессов в печени цыплят за счет
дефицита рибосом в клетках. Полученные результаты говорят о том, что
наиболее ответственными для становления вителлогенной функции у цыплят
под влиянием экзогенного эстрадиола являются первые часы после эстрогенизации. Необходимым условием для этого является синтез мРНК, блокирование которого в это время полностью снимает в дальнейшем действие гомо-
198
на. Остановка белкового синтеза в первые часы после эстрогенизации (например, циклогексимидом) вызывает лишь задержку в ответе на все время
остановки им белкового синтеза, но не приводит к подавлению ответа. Это
означает, что если эти специфические мРНК не синтезируются в первые часы
после эстрогенизации, то потом, они уже не могут синтезироваться. Одной из
причин может быть утилизация экзогенного эстрадиола в печени цыплят за
время остановки синтеза мРНК. Биосинтез рибосом de novo на начальных
стадиях ответа на эстрогенизацию не является необходимым условием. Биогенез рибосом, который усиливается под влиянием эстрадиола, играет роль
исполнительного механизма, от мощности которого зависят количественные,
но не качественные характеристики ответа печени на гормон.
Повторное введение цыплятам эстрадиола после окончания ответа на
предыдущее введение вызывает более сильный ответ. Содержание вителлогенина в крови увеличивается с большей скоростью и на максимуме ответа
примерно в 2 раза превышает содержание при первичном ответе. Аналогично
изменяются и другие биохимические показатели плазмы крови – триглицериды, общий кальций, общий белок и неорганический фосфат. После повторного введения становиться больше и ЛОНП I. Более интенсивный синтез
вителлогенина при повторном введении эстрадиола, скорее всего, вызван перестройкой в регуляции генома клеток печени. Фактором, обеспечивающим
такую перестройку, возможно, являются особые негистоновые регуляторные
белки, узнающие определенные нуклеотидные последовательности ДНК.
Включение регуляторных белков вызывает деспирализацию определенных
участков ДНК, что обеспечивает связывание РНК полимеразы и инициацию
синтеза РНК. Это предположение подкрепляется данными о разной чувствительности к обработке ультразвуком транскрипционно активных и неактивных участков хроматина [352]. Имеются и прямые данные, показывающие
изменение фракционного состава негистоновых белков хроматина клеток печени цыплят после эстрогенизации [162]. Включение негистоновых белков
меняет также и пространственное распределение хроматина в интерфазном
199
ядре, организующим центром которого, возможно, являются рибосомные гены [151], что сказывается на транскрипционной активности отдельных групп
генов.
После повторного введения эстрадиола цыплятам в наших опытах содержание рибосом в печени, как на клетку, так и на орган в целом, было достоверно выше (p < 0,05). Интересно, что при повторном введении эстрадиола
отсутствовало снижение содержания рибосом ниже значения в контрольной
группе в первые часы после эстрогенизации, которое наблюдалось после однократного введения.
Результаты, показывающие, что после повторной эстрогенизации цыплят содержание рибосом в их печени выше, чем после однократной, хорошо
согласуются с результатами белкового синтеза. После эстрогенизации цыплят белковой синтез в их печени в целом значительно возрастает, кроме синтеза de novo вителлогенина и липопротеидов очень низкой плотности, возрастает синтез и ряда белков плазмы, обычных ее компонентов, что показано
при количественной обработке электрофореграмм белков плазмы крови цыплят. После повторной эстрогенизации интенсивность синтеза белка в печени
выше, чем после однократной, что требует большего количества рибосом.
Таким образом, больший уровень синтеза вителлогенина после повторной
эстрогенизации обусловлен большим содержанием вителлогениновой мРНК,
увеличение транскрипции которой происходит вследствие перестройки регуляции активности генома гепатоцитов, вызванной первоначальным введением эстрадиола. Более высокий уровень биогенеза рибосом и их большее содержание после повторной эстрогенизации обеспечивают трансляцию возросшего количества вителлогениновой и других мРНК.
Увеличение содержания рибосом в клетках печени после эстрогенизации, которое становится заметным, начиная со вторых суток, может быть одним из факторов, обеспечивающих возрастающую в процессе ответа на гормон эффективность трансляции вителлогениновой мРНК.
200
Интенсивность синтеза вителлогенина в печени цыплят зависела от дозы введенного эстрадиола. Все использованные дозы эстрадиола приводили к
достоверному (р < 0,05…0,01) росту общего белка плазмы крови цыплят на
вторые сутки экспозиции (табл. 20). Содержание белка продолжало увеличиваться. На шестые сутки оно имело наибольшее значение для всех использованных доз эстрадиола, кроме 10 мг/кг. Высокие дозы эстрадиола (50 и
70 мг/кг) вызывали бóльшую скорость накопления белка в плазме крови, по
сравнению с дозами 10 и 30 мг/кг, на четвертые сутки различия были достоверны (р < 0,05). На шестые сутки экспозиции действие его в дозах 30 и
50 мг/кг на содержание белка в плазме крови было одинаковым, в то время
как при дозе 10 мг/кг белка оказалось меньше, а при 70 мг/кг больше этого
значения.
Воздействие разных доз 17-β-эстрадиола на содержание фосфопротеидов в плазме несколько отличалась от влияния на общий белок. Максимальная скорость их накопления зафиксирована при дозах 30 и 50 мг/кг.
Введение эстрадиола в дозе 10 мг/кг вызывало низкую скорость накопления фосфопротеидов, максимум их содержания отмечен на четвертые сутки, а на шестые количество их было равным показателю аналогично содержанию на девятые сутки при дозе 30 мг/кг. На шестые сутки снизилась масса
печени до уровня контроля, увеличилось содержание ДНК (р < 0,05).
Доза эстрадиола 70 мг/кг вызывала большую индукцию синтеза фосфопротеидов, по сравнению с 10 мг/кг, и накопление их в крови продолжало
непрерывно расти вплоть до шестых суток. Но больше всего фосфопротеидов
наблюдалось на шестые сутки при дозе эстрадиола 30 мг/кг. Возможно, это
обусловлено тем, что разные дозы эстрадиола в различной степени влияют на
индукцию синтеза вителлогенина и некоторых других эстрогениндуцируемых белков, в частности, липопротеидов очень низкой плотности. Таким образом, скорость становления вителлогенной функции в печени цыплят возрастает с увеличением дозы вводимого эстрадиола, но до определенных пределов.
201
Печень – место синтеза многих белков плазмы крови, под действием
17-β-эстрадиола она увеличивалась в размерах, уже через двое суток достоверно отличалась от контроля (p < 0,001). Максимальное значение массы печени наблюдалось на четвертые-пятые сутки (в полтора раза, больше, чем в
контроле). Затем она снижалась, а на девятые сутки возвращалась к контрольному показателю. Масса печени цыплят, как и содержание общего белка в плазме крови, интенсивнее увеличивалась при дозах гормона 50 и
70 мг/кг, причем масса печени для этих доз на шестые сутки больше, чем на
четвертые, а для 10 и 30 мг/кг – меньше.
Желточные белки куриного яйца фосвитин и липовителлин синтезируются в печени кур в виде одного общего предшественника – вителлогенина
[229]. Половое созревание можно смоделировать, вводя цыплятам эстрогены
[52; 127]. При этом в крови цыплят появляется большое количество липидов и
фосфопротеидов, которые в норме содержатся только в крови несущихся кур.
У цыплят не поглощаются из крови предшественники желтка (ввиду отсутствия в яичнике растущих фолликулов), они накапливаются в крови. Содержание в плазме крови цыплят метаболитов, участвующих в образовании яйца,
отражает потенциальную активность соответствующих генов. Это позволяет
использовать данную модель с целью оценки потенциальной способности цыплят к синтезу интересующих метаболитов, тем самым обеспечивается принципиальная возможность ранней оценки яичной продуктивности кур.
Введение 17-β-эстрадиола цыплятам в наших опытах приводило к увеличению ряда биохимических показателей крови.
Содержание общего белка, триглицеридов и неорганического фосфора
уже на 2-е сутки после введения эстрадиола было достоверно выше контрольного значения (p < 0,05). Их максимальное содержание наблюдалось на
5-е сутки.
Содержание фосфопротеидов в контроле было на грани чувствительности использованного метода в течение всего периода исследования. В крови
опытных цыплят в регистрируемых количествах фосфопротеиды появлялись
202
через 3 часа, на вторые сутки их количество было значительным, а на 5-е –
максимальным. Затем содержание их резко снижалось. Динамика содержания общего кальция в крови цыплят после введения эстрадиола хорошо совпадала с динамикой содержания фосфопротеидов.
Для выяснения степени связи между этими показателями были посчитаны коэффициенты корреляции. Биохимические показатели хорошо коррелировали между собой. Наименее тесная корреляционная связь отмечена между общим белком и другими показателями. Следует отметить высокий коэффициент корреляции между белковосвязанным фосфором и общим кальцием (0,99), что говорит о функциональной связи между ними. Это подтверждают также результаты экспериментов с ингибиторами, в которых степень
ингибирования содержания общего кальция и фосфопротеидов была одинаковой. Анализ уравнения регрессии показывает, что приращение содержания
общего кальция в крови цыплят после эстрогенизации обусловлено кальцием, связанным с вителлогенином. При этом на две фосфатные группы вителлогенина приходится три атома кальция
Найденная линейная зависимость между содержанием фосфопротеидного фосфора и общего кальция в крови эстрогенизированных цыплят наводит на следующее практическое предложение. Колориметрическое определение белковосвязанного фосфора достаточно трудоемко, требует предварительного удаления неорганического фосфата, что обычно достигается неоднократной промывкой белков плазмы трихлоруксусной кислотой, а также
последующего щелочного гидролиза. Кроме того, интенсивность окраски
цветной реакции сильно меняется во времени, которое при фотометрировании необходимо строго контролировать. Колориметрическое определение
общего кальция с 8-оксихинолин-крезолфталеиновым реактивом одностадийное, не требует предварительной подготовки проб и интенсивность окраски, после ее развития, практически не меняется во времени. К тому же изменения концентрации общего кальция в 2 раза превышают изменения концентрации фосфопротеидов, что также является положительным обстоятель-
203
ством. Определив содержание общего кальция, с помощью несложных вычислений легко получить концентрацию белковосвязанного фосфора в плазме крови эстрогенизированных цыплят.
Таким образом, при прогнозировании яичной продуктивности кур с
помощью модели эстрогениндуцированного вителлогенеза нет необходимости использовать в качестве показателей фосфопротеидный фосфор и общий
кальций одновременно, достаточно одного из них. Использование в качестве
показателя общего кальция как более простого в методическом отношении
является предпочтительным.
4.3. Роль митохондрий в вителлогенезе печени кур
Гормональная экспрессия генов не может реализоваться без адекватного изменения митохондриальной энергетики клетки [620]. Известно, что многие гормоны, в том числе стероидные [461; 462], стимулируют или ингибируют процесс биогенеза митохондрий. Эстрогены влияют на экспрессию митохондриальных генов и активность ферментов дыхательной цепи митохондрий [208; 215; 218]. Электронно-микроскопические и биохимические исследования разных авторов показали, что под влиянием гормонов щитовидной
железы может происходить рост митохондрий [338], или изменение их функциональной активности [642]. Исследования митохондрий быстрорастущих
раковых клеток продемонстрировали их ключевую роль в развитии опухоли
[436; 568].
Однократное введение цыплятам 17--эстрадиола в дозе 30 мг/кг живой массы вызывало увеличение содержания митохондриальной ДНК и особенно мтРНК в печеночной ткани; через 12 ч (лаг-период) индуцировалась и
в дальнейшем усиливалась вителлогенная функция. При активации вителлогенной функции после введения 17--эстрадиола в печени цыплят наблюдалось два пика стимуляции биогенеза митохондрий. Первый по времени совпадал с синтезом ядерной ДНК (до 24 ч после введения эстрадиола), когда
характеристики процесса окислительного фосфорилирования не отличались
204
от таковых в контроле. Более интенсивный второй пик регистрировался через
72–96 ч после инъекции. Вероятно, что второй пик связан с биохимической
специализацией клеток в результате активации вителлогенной функции печени после введения 17--эстрадиола. Это подтверждается увеличением содержания мтРНК и цитохромоксидазной активности. Снижение цитохромоксидазы через 36–48 ч возможно обусловлено усилением деградации митохондрий перед их ростом. Актиномицин Д ингибировал как падение, так и
последующее повышение активности цитохромоксидазы, что свидетельствует о зависимости этих процессов от de novo синтеза РНК в ядрах гепатоцитов. Цитохром-C-оксидаза /к.ф.1.9.3.1./ – ферроцитохром-С-кислород-оксидоредуктаза – энзим, катализирующий процесс терминального окисления
молекулярным кислородом в ходе аэробного дыхания, состоит из семи полипептидных субъединиц, три из которых синтезируются в самих митохондриях и их первичная структура кодируется митохондриальным геномом. Остальные субъединицы синтезируются в цитоплазме под контролем ядерного
генома [94; 454]. Таким образом, этот фермент является продуктом интегрированной деятельности двух геномов – ядерного и митохондриального, чем
достигается координированный ответ клетки на те или иные алиментарные
или гормональные сигналы.
В митохондриях локализуются многие реакции обмена аминокислот,
синтеза креатина, полиаминов и другие. Это предполагает их участие в процессах белкового синтеза. Под влиянием 17-β-эстрадиола наблюдалось
уменьшение общего пула и изменение спектра свободных аминокислот в митохондриях печени цыплят. Снижение концентрации свободных аминокислот можно объяснить их отвлечением на анаболические нужды клетки. Так,
именно через 12 ч после введения 17-β-эстрадиола увеличивается синтез
ДНК, при этом обмен глицина тесно с ним связан. Глутаминовая и аспарагиновая кислоты играют исключительно важную роль в азотистом обмене.
Возможно, наблюдаемое снижение их концентрации в митохондриях связано
с увеличивающейся в них потребностью, вызванной индукцией синтеза бел-
205
ков в клетке. Эстрадиол индуцирует синтез фосфопротеидов, предшественников белков желтка куриного яйца, в частности фосвитина, содержание серина в котором достигает 50%. Кроме этого, обмен серина тесно связан с обменом глицина, поэтому падение концентрации серина можно объяснить его
отвлечением на синтез фосфопротеидов. Метионин, является основным донатором метильных групп в организме, используемых для метилирования
различных соединений, так что снижение концентрации метионина связано с
активацией процессов метилирования, в частности нуклеиновых кислот; метионин также участвует в синтезе полиаминов, который сопряжен с синтезом
нуклеиновых кислот. Кроме того, сложный характер изменения концентрации аминокислот, возможно, связан с эндогенными ритмами в активности
ферментов.
Таким образом, введение 17-β-эстрадиола стимулирует активность митохондриальных ферментов, увеличивает содержание мтДНК, мтРНК и синтеза белка в митохондриях печени цыплят. Проявление стимулирующего
влияния наблюдается через промежуток времени равный 36–48 часов. При
этом снижается содержание и изменяется спектр свободных аминокислот,
что согласуется со становлением вителлогенной функции и интегрировано с
биогенезом митохондрий печени.
Многие биохимические процессы в клетке связаны с энергетическим
обменом митохондрий, поэтому при изменении скоростей и направленности
реакций, участвующих в этих процессах, следует ожидать изменения метаболизма митохондрий.
Нами было исследовано состояние системы окислительного фосфорилирования митохондрий печени цыпленка, курицы-несушки и печени эстрогенизированного цыпленка. При этом были выявлены определенные различия. Так, в отличие от митохондрий печени цыплят, митохондрии печени курицы несушки имели параметры плохо сопряженных митохондрий: высокую
скорость дыхания в 4-ом состоянии, низкий дыхательный контроль по Чансу,
низкий коэффициент АДФ/О. Регистрируемое снижение не было следствием
206
разобщения в дыхательной цепи митохондрий, а было связано с аденилаткиназной реакцией. Это дало основание считать, что в митохондриях курицынесушки имеет место отвлечение промежуточных макроэргических соединений на специфические биосинтезы, что подтверждалось обращением эффекта
ионов магния на параметры сопряжения. Печень курицы-несушки является
органом с увеличенной активностью биосинтетических процессов, поскольку
в ней идет синтез предшественников яичного желтка: липопротеида вителлогенина, липопротеидов очень низкой плотности, богатых триглицеридами.
И с каждым желтком из организма курицы выделяется около 6 г липидов и
3 г белка. Такая активизация биосинтеза в печени связана с дополнительными энергозатратами, что предполагает значительное увеличение энергетической нагрузки на митохондриальный аппарат печени, обеспечивающий производство необходимого количества макроэргических соединений для анаболических процессов в тканях и органах. Эстрадиол, дерепрессируя гены,
приводит к синтезу этих компонентов в печени неполовозрелой птицы, следовательно, под его влиянием возможно изменение функционального состояния митохондрий печени. Это нашло подтверждение в эксперименте: активность окислительного фосфорилирования в митохондриях печени эстрогенизированных цыплят аналогична таковой у кур-несушек. Более низкие
показатели сопряжения дыхания и фосфорилирования у эстрогенизированных цыплят были обусловлены отвлечением промежуточных макроэргических соединений на специфические биосинтезы, что также подтверждалось
обращением эффекта ионов магния на параметры сопряжения.
Полученные результаты согласуются с имеющимися данными о снижении параметров сопряжения митохондрий регенерирующей печени крысы
и печени эмбрионов морской свинки [86]. Как и в нашем случае, снижение
параметров сопряжения было обусловлено конкуренцией системы образования АТФ и реакций, использующих энергию окисления субстратов для биосинтезов. Примером подобной конкуренции за промежуточные богатые энергией соединения могут быть реакции, связанные с образованием НАДФН,
207
используемого для синтеза жиров и образованием АТФ в митохондриях
[140]. Макроэргическое соединение, образующееся при окислении субстрата
в цитохромной цепи, может использоваться для образования АТФ или в реакции обратного транспорта электронов. И, если о степени сопряжения системы окисления с фосфорилированием судить только по величине АДФ/О и
дыхательному контролю, то можно придти к ошибочному заключению, что в
системе произошло разобщение. По-видимому, снижение эстерификации
фосфата будет иметь место, однако степень сопряжения с синтезом промежуточных богатых энергией соединений при этом не уменьшиться.
Другим, не менее важным фактом является то, что становление вителлогенной функции печени приводит к увеличению уровня обмена кальция.
Известно, что митохондрии являются главной буферной системой клетки,
поддерживающей необходимую концентрацию ионов кальция в цитозоле
[259; 260; 430]. В нашем опыте коэффициент Са/О для митохондрий печени у
кур-несушек был в 2,7 раза выше, чем у цыплят и петухов. Это предполагает,
что поглощение ионов кальция митохондриями у кур-несушек происходит с
меньшей затратой кислорода, чем у цыплят и петухов. Характер активного
транспорта в митохондриях печени эстрогенизированных цыплят и курнесушек был аналогичен. А именно, под влиянием эстрадиола у цыплят коэффициент Са/О возрастал до значений, близких к отмеченному кур-несушек
(через 72 ч – в 1,6 раза по сравнению с контролем).
Итак, функциональные изменения в печени цыплят, вызванные введением эстрадиола, и становление ее вителлогенной функции интегрированы с
биогенезом митохондрий, активностью окислительного фосфорилирования и
функциональной специализацией митохондрий.
Введение эстрогенов цыплятам приводит к увеличению в крови всех
фракций липидов, присутствующих у несушки. Действие эстрогенов не зависит от пола цыплят [331; 332]. Данная липимия отражает действие эстрогенов
на печень. Она приобретает способность отвечать на введение эстрогена продукцией фосфитина и липовителлина в период между 18–20 днями эмбрио-
208
генеза [371]. Определенная роль в регуляции липогенеза принадлежит митохондриям. Источником всех атомов углерода в молекуле жирной кислоты
служит цитоплазматический ацетил-КоА, который происходит от внутримитохондриального ацетил-КоА. В митохондриях ацетил-КоА образуется в результате окислительного декарбоксилирования пирувата и β-окисления жирных кислот с длинной цепью. Митохондриальная мембрана непроницаема
для ацетил-КоА, и его транспорт осуществляется в форме цитрата, который
образуется в митохондриях в результате конденсации ацетил-КоА с оксалоацетатом [343; 490; 491]. При интенсификации липогенеза усиливается синтез и транспорт цитрата из митохондрий в цитоплазму, который осуществляется благодаря наличию в митохондриальной мембране цитрат-транспортной
системы переноса [24; 561].
Таким образом, митохондрии осуществляют три важнейшие стадии
липогенеза: окислительное декарбоксилирование пирувата и β-окисление
жирных кислот, синтез цитрата, транспорт цитрата из митохондрий.
На
лабораторных
животных
показано,
что
клофибрат
(n-этилхлорфеноксиизобутират) – препарат вызывающий снижение в крови
холестерина и триглицеридов, модулирует активность митохондрий, изменяя
их количество и функциональное состояние [322; 401; 437; 501].
Учитывая ключевую роль митохондрий в липогенезе, было изучено
влияние клофибрата на биоэнергетические параметры митохондрий и связь с
содержанием триглицеридов и кальция в крови на фоне 17-β-эстрадиола и без
него.
Действие клофибрата на митохондрии печени цыплят проявилось в
двукратном увеличении скорости дыхания в третьем и четвертом состояниях
по Чансу, в случае использования сукцината в качестве субстрата. Если субстратами служили глутамат+малат, то скорость дыхания митохондрий, лишь
немного превышала контроль. Под влиянием клофибрата на 67% возрастала
цитохромоксидазная активность митохондрий. Эти данные согласуются с известными в литературе, где также наблюдалось увеличение скорости дыха-
209
ния митохондрий [401] и увеличение цитохромоксидазной активности [231] в
печени крыс под влиянием клофибрата. При этом [231] отмечали увеличение
массы печени крыс и количества митохондрий [401; 501]. В нашем опыте не
происходило увеличения массы печени цыплят под влиянием клофибрата.
Можно отметить небольшое, но достоверное увеличение массы через 2 дня
после прекращения кормления клофибратом. Вполне возможно, что указанные различия обусловлены видовой спецификой влияния клофибрата или необходимостью более длительного периода кормления им птицы.
Клофибрат снижал вызванное гормоном увеличение концентрации
триглицеридов и не влиял на базовый уровень триглицеридов в плазме крови
цыплят. Содержание кальция увеличилось через 1 день после отмены клофибрата на 23% и через 2 дня – на 40%. Значительное увеличение на 70%
кальция в крови наблюдалось через 1 день после введения гормона на фоне
клофибрата.
Исходя из имеющихся данных, можно предположить, что снижение
степени липогенеза у цыплят под влиянием клофибрата происходит благодаря стимуляции дыхательной и цитохромоксидазной активностей митохондрий, что должно быть связано с усилением мощности цикла Кребса, в результате чего снижается транспорт цитрата в цитоплазму.
Известно, что одной из причин развития синдрома жирной печени у
кур-несушек является избыточный липогенез. Учитывая, что клофибрат вызывает снижение уровня триглицеридов в плазме цыплят под действием гормона, возможно его использование для уменьшения содержания липидов у
кур-несушек с целью профилактики жировой дистрофии.
210
5.
Выводы
На основании проведенных исследований по оценке трансгенных пе-
репелов и изучению гормональной экспрессии генов у кур можно сделать
следующие выводы:
1. Методом микроинъекции генной конструкции с геном гормона роста
быка в зародышевые диски яйцеклеток перепелок эстонской породы была
получена трансгенная птица.
2. «Пересадка» гена гормона роста быка перепелам эстонской породы
повысила их живую массу на 5–15% и массу яиц на 10–20%. Высокие показатели наследовались в ряду поколений (p<0,001).
3. Яйценоскость перепелок в опытной группе колебалась по поколениям от 200 до 235 яиц за 50 недель их жизни, в контроле – от 193 до 227.
Средняя яйцемасса за этот период в опытной группе составила 2749,4 г, что
на 11% больше, чем в контрольной группе (p<0,001).
4. У потомков трансгенных перепелов установлено повышение иммунного статуса, выраженного в ускоренной выработке антител к вводимому антигену. Через четыре недели разность титров была высоко достоверна (p<0,001). В
сыворотке крови опытной группы log2 составил 6,0±0,23, в контрольной –
4,0±0,24; в желтке яиц опытной группы – 4,9±0,23, в контрольной – 2,9±0,09.
5. Введение 17-β-эстрадиола цыплятам в возрасте 2,5–3 месяцев вызывало экспрессию генов, приводящую к становлению вителлогенной функции
печени, при этом происходило увеличение ее массы в 1,3–2,2 раза и содержания рибосом в ней на 25–47%. Количество белка в плазме крови увеличивалось на 70 %, из которых в среднем по 20 % приходилось на долю вителлогенина и ЛОНП I, 10 % – ЛОНП II, являющихся предшественниками яичного
желтка; оставшиеся – составляли обычные белки плазмы крови цыплят. Изменения по всем изученным показателям носили обратимый характер и были
статистически достоверны (p<0,001–0,05).
211
6. Индукция 17-β-эстрадиолом синтеза ЛОНП I и вителлогенина имела
разную динамику. ЛОНП I появлялся в крови на 12 часов раньше, а исчезал
позже вителлогенина, который появлялся через 24 часа, а исчезал через 9 суток;
на 5 сутки – их содержание было одинаковым. Синтез ЛОНП II эффективнее,
чем синтез вителлогенина; при перерасчете их содержания в крови на молекулярную массу ЛОНП II было в 9 раз больше, чем молекул вителлогенина.
7. Скорость становления вителлогенной функции в печени цыплят зависела от дозы и кратности введения эстрадиола. Синтез фосфопротеидов
увеличивался с повышением дозы 17-β-эстрадиола с 10 до 30 мг/кг живой
массы. Дозы 50 и 70 мг/кг действовали угнетающе.
8. Максимум ответа на введение 17-β-эстрадиола приходился на пятые
сутки. Количество фосфопротеидов в плазме крови цыплят при повторном
введении 17-β-эстрадиола на максимуме ответа в 1,72 раза превышало этот
показатель при первичном ответе.
9. Введение 17-β-эстрадиола цыплятам приводило к изменению рибонуклеазной активности в печени; через 3–4 часа она кратковременно повышалась на 35%, на 2–4-е сутки была ниже контроля (71–84%), на 5–9-е сутки
после введения гормона она на 29–54% превышала значение в контрольной
группе (p<0,001–0,05).
10. Действие α-аманитина на гормональный вителлогенез у цыплят зависело от времени его введения. Введение α -аманитина одновременно с 17-βэстрадиолом полностью подавляло увеличение содержания фосфопротеидов и
триглицеридов и на 37% – содержание общего белка в плазме крови по сравнению с контролем. Если α-аманитин вводился на одни сутки позже 17-β- эстрадиола, то на вторые сутки после введения гормона происходило подавление
синтеза вителлогенина на 83%, синтеза триглицеридов – на 18% (p<0,001).
11. Введение тиоацетамида цыплятам на 62% увеличивало рибонуклеазную активность. Введение тиоацетамида одновременно с 17-β-эстрадиолом
подавляло вызываемое 17-β-эстрадиолом увеличение содержания РНК и ри-
212
босом в печени, при этом содержание фосфопротеидов в плазме крови составило 25%, триглицеридов 35% от значений, наблюдаемых через одни сутки
после введении цыплятам только 17-β-эстрадиола (p<0,01–0,05).
12. При активации вителлогенной функции после введения 17-эстрадиола в печени цыплят наблюдались два пика стимуляции биогенеза митохондрий. Первый по времени совпадал с синтезом ядерной ДНК (12–24 ч
после введения эстрадиола), в это время показатели окислительного фосфорилирования не отличались от таковых в контроле. Более интенсивный второй
пик регистрировался через 72–96 ч после инъекции. Это сопровождалось увеличением содержания мтРНК в 2,8 раза и увеличением цитохромоксидазной
активности в 1,7 раза по сравнению с контролем (p<0,001–0,01). Введение цыплятам 17-β-эстрадиола одновременно с актиномицином Д препятствовало
повышению активности цитохромоксидазы, что предполагает ее зависимость
от синтеза de novo рибосомных РНК в ядрах гепатоцитов.
13. Введение 17-β-эстрадиола цыплятам привело к снижению скорости
дыхания митохондрий через 36–48 ч.: скорость окисления сукцината падала на
32–35%, глутамата+малата – на 37–39%, α-кетоглутарата – на 50–52%. Под влиянием 17-β-эстрадиола через 72–96 ч. в митохондриях цыплят возрастал коэффициент Са/О в 1,9 раз, приближаясь к таковому у кур-несушек (p<0,001–0,01).
14. Митохондрии печени эстрогенизированных цыплят и кур-несушек
имеют более низкое сопряжение дыхания с фосфорилированием, чем в контроле.
Величина отношения АДФ/О в митохондриях у цыплят контрольной группы составила 1,85; у опытных цыплят – 1,20 (p<0,05); у кур-несушек – 0,50 (p<0,001).
15. Митохондрии печени цыплят, которым в течение семи суток давали
per os клофибрат, повысили на 67% цитохромоксидазную активность и на 20–
76% скорость дыхания; последующее введение 17-β-эстрадиола снизило этот
эффект, не снимая полностью. Клофибрат снизил вызванное 17-β-эстрадиолом
увеличение количества триглицеридов в плазме крови на 28–30%, не влияя на
их содержание в контроле (p<0,001–0,01).
213
6.
Сведения о практическом использовании результатов
исследований
1. Данные исследования апробированы в производственных условиях
ФГУП Загорское ЭПХ ВНИТИП Россельхозакадемии (Акт производственной
проверки от 20 марта 2009 г.). В производственной проверке подтвердились
результаты исследований о высокой массе яиц трансгенных перепелов: масса
яиц группы перепелок нового варианта была на 18,7% выше массы яиц перепелов базового варианта в возрасте 11–12 недель.
2. Результаты по цитохромоксидазной и фосфорилирующей активности
митохондрий печени были использованы при уточнении норм витаминов в
рационах кур (Фисинин В.И., Коршунова Л.Г., 1988; Байковская И.П., Коршунова Л.Г., 1989), а также в Методическом руководстве для зоотехнических
лабораторий «Оценка качества кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы»,
под общей редакцией академика РАСХН В.И. Фисинина и доктора биологических наук, профессора А.Н. Тишенкова, 1998 год, 116 с.
214
7.
Рекомендации по использованию научных выводов
1. Результаты о высокой массе яиц трансгенных по гену бычьего сома-
тотропина перепелов, подтвержденные данными производственной проверки, свидетельствуют о возможном практическом использовании методов
трансгенеза в селекционной работе и, в том числе, как эффективный прием
на повышение массы яиц.
2. Предложен способ отбора перепелок по массе яиц, позволяющий
дать объективную характеристику поголовья по этому показателю и провести целенаправленный отбор перепелок-дочерей с повышенной массой яиц
для комплектования промышленных и племенных стад без длительной оценки птицы. На данный способ оценки получен Патент РФ на изобретение
№2402209 «Способ отбора перепелок по массе яиц» (2009).
3. Разные динамики индукции синтеза вителлогенина и липопротеидов
очень низкой плотности в печени цыплят, свидетельствующие об относительно независимой экспрессии соответствующих генов, являются обоснованием возможности раздельной селекции кур по этим признакам.
4. Установлена линейная зависимость содержания фосфопротеидного
фосфора и общего кальция в крови эстрогенизированных цыплят, что позволяет использование каждого из них для прогнозирования яичной продуктивности кур. Из соображений методического характера показатель общего
кальция является предпочтительным.
215
Список литературы
1. Абдурашидова Г.Г., Цветкова Е.А., Будовский Э.И. Непосредственные РНК-белковые взаимодействия в рибосомных комплексах // Всесоюзный
биохимический съезд: тезисы. – Киев, 1986. – Т. 1. – С. 5.
2. Адрианов Н.В., Щуппе Н.Г. Биогенез и биохимическая гетерогенность митохондрий // Биохимия митохондрий. – Москва: Наука, 1976. – С.
120.
3. Адрианов Н.В., Спиричев В.Б., Щуппе Н.Г. Биохимическая гетерогенность митохондрий слизистой оболочки тонкого кишечника крыс // Вопросы медицинской химии. – 1977. – Т. 23. – № 3. – С. 398–403.
4. Айзенштадт Т.Б. Некоторые особенности ультраструктуры ооцитов в
связи с синтезом желтка // Журнал общей биологии. – 1965. – Т. 26. – № 2. –
С. 230–236.
5. Арбузов В.А. Метаболизм информационных РНК мембраносвязанных и свободных полирибосом в клетках печени крыс при ингибировании
белкового синтеза циклогексимидом // Биохимия. – 1977. – Т. 42. – № 2. – С.
338–349.
6. Арбузов В.А. Стабилизация мРНК полирибосом в клетках печени
крыс при ингибировании белкового синтеза циклогексимидом // Биохимия. –
1978. – Т. 43. – № 5. – С. 838–850.
7. Архипов А.В. Изучение липидов и липидного обмена у птиц с применением тонкослойной и газожидкостной хроматографии: Методические
рекомендации. – Москва: ВАСХНИЛ, 1973. – 36 с.
8. Архипов А.В., Топорова Л.В. Липидный и жирнокислотный состав
яиц в зависимости от возраста кур и характера рационов // Повышение качества пищевых яиц. – Москва: Колос, 1976. – С. 114–122.
216
9. Архипов А.В. Липидное питание, продуктивность птицы и качество
продуктов птицеводства. – Москва: Агробизнесцентр, 2007. – 436 с.
10. Бакеева Л.Е., Солодовникова И.М., Сапрунова В.Б. Митохондрия
внутри митохондрии (условия возникновения, динамика образования) // III
Съезд биофизиков России: тезисы. – Воронеж, 2004. – С. 396–397.
11. Бакеева Л.Е., Сапрунова В.Б., Пилипенко Д.И. Ультраструктура митохондрий в условиях эндогенного окислительного стресса, защитное действие митохондриального антиоксиданта SkQ1 // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов: тезисы докладов. – Новосибирск,
2008. – С. 329.
12. Белякова Л.С., Кочетова З.И. Оценка мясных качеств перепелят эстонской породы // Науч.-произв. опыт в птицеводстве: Экспресс-информ. /
Всерос. н.-и. и технол. ин-т птицеводства. – 2004. – № 1. – С. 14–16.
13. Боголюбский С.И. Селекция сельскохозяйственной птицы. – Москва: Агропромиздат, 1991. – 285 с.
14. Бойков Н.Я., Сидоренко Л.И., Тодоров И.Н. Биогенез хроматина в
клетках высших животных. Активация синтеза ядерных белков и ДНК гепатоцитов после импульсного торможения трансляции циклогексимидом //
Биохимия. – 1979. – Т. 44. – № 6. – С. 963–974.
15. Болотников И.А. Иммунопрофилактика инфекционных болезней
птиц. – Москва: Россельхозиздат, 1982. – 184 с.
16. Болотников И.А., Конопатов Ю.В. Практическая иммунология
сельскохозяйственной птицы. – С.-Петербург: Наука, 1993. – 205 с.
17. Бондарук В.В., Захарченко В.И., Беляева Р.Х. и др. Получение
трансгенных кроликов, содержащих ген фибробластного интерферона человека и анализ их ДНК с помощью цепной полимеразной реакции // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.: И.Я. Шихов, С.Г. Кадулин. – Москва: Миннауки,
РАСХН, 1995. – С. 138–153.
217
18. Братанов К. Изменение наследственности у кур с помощью переливания крови // Природа. – 1964. – № 13. – С. 10–15.
19. Брем Г., Эрнст Л.К., Васильева Э.Г., Акольников В.Е. Оценка роста
и развития первого поколения трансгенных свиней (MT-1/hGRF) в процессе
онтогенеза // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник
научных трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.: И.Я. Шихов, С.Г. Кадулин. – Москва: Миннауки, РАСХН, 1995. – С. 26–33.
20. Брем Г., Эрнст Л.К., Андропов Л.А., Васильева Э.Г. Оценка роста и
развития трансгенных поросят (MT-1/hGRF), полученных методом хирургического осеменения нетрансгенных свинок глубокозамороженным семенем
трансгенных хряков // Генноинженерные сельскохозяйственные животные.
Сборник научных трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.: И.Я. Шихов, С.Г. Кадулин. – Москва: Миннауки, РАСХН, 1995. – С. 34–40.
21. Брем Г., Эрнст Л.К., Андропов Л.А. и др. Трансгенные свиньи (MT1/hGRF): оценка качества туш и химического состава мяса при убое животных // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных
трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.: И.Я. Шихов, С.Г. Кадулин. – Москва:
Миннауки, РАСХН, 1995. – С. 41–47.
22. Брем Г., Кройслих Х., Штранцингер Г. Экспериментальная генетика
в животноводстве. – Москва: РАСХН, 1996. – 328 с.
23. Быстров А. Биофизические показатели перепелиных яиц // Всероссийская конференция молодых ученых и аспирантов по птицеводству. – Сергиев Посад, 1999. – С. 14–15.
24. Великий Н.Н., Пархомец П.К., Могилевич С.Е. Транспорт восстановительных эквивалентов из митохондрий в цитоплазму при интенсификации липогенеза // Биохимия митохондрий. – Москва: Наука, 1976. – С. 104.
25. Гальперн И.Л. Методы выведения и совершенствования специализированных линий кур и их кроссов // Методические рекомендации по выве-
218
дению специализированных яйценоских и бройлерных линий кур и их кроссов. – Ленинград, 1973. – С. 5–34.
26. Гальперн И.Л., Сергеев В.А., Иванова Н.Б. Генетические основы
селекции и разработка методов выведения линий и создания гибридов сельскохозяйственной птицы // Сборник научных трудов ВНИТИП. – Загорск:
ВНИТИП, 1977. – Т. 44. – С. 3–12.
27. Гальперн И.Л. Концепция развития исследований в области селекции, разведения и воспроизводства сельскохозяйственной птицы // Теория и
практика селекции яичных и мясных кур. Сборник научных трудов
ВНИИГРЖ. – Санкт-Петербург - Пушкин, 2002. – С. 6–15.
28. Гиршович А.С., Бочкарева Е.С., Васильев В.Д., Курцхалия Т.В. Локализация факторов элонгации на рибосоме E.coli // Всесоюзный биохимический съезд: тезисы. – Киев, 1986. – Т. 1. – С. 4.
29. Гмурман В.В. Теория вероятностей и математическая статистика. –
Москва: Высшая школа, 1972. – 368 с.
30. Головачев А.Ф., Надальяк Е.А. Дыхание и гликолиз печени куриных эмбрионов и цыплят в процессе роста // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. – 1975. – Т. II. – № 4. – С. 353–359.
31. Голубев А.К., Балукова В. Исследование изменений в окраске оперения кур при соматической гибридизации // Наследственность и изменчивость сельскохозяйственной птицы. – Москва: Колос, 1966. – С. 7–21.
32. Гольдман И.Л., Башкеев Е.Д., Гоголевский П.А. и др. Прогрессивная биотехнология получения трансгенных овец // Доклады РАСХН. – 1992.
– № 9/10. – С. 25–30.
33. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К., Брем Г. и др. Получение трансгенных
овец – продуцентов молока, содержащего физиологически активные белки, в
условиях племенной фермы // Сельскохозяйственная биология. – 1994. – № 6.
– С. 46–53.
219
34. Гольдман И.Л., Бабаянц А.А., Кузнецов В.П. и др. Противовирусная
активность в крови хряка, трансгенного по гену фибробластного интерферона человека // Доклады РАСХН. – 1995. – № 6. – С. 28–31.
35. Гончаренко М.С., Никитин В.Н. Возрастная характеристика функционирования митохондрий поджелудочной железы белых крыс // Митохондрия. – Москва: Наука, 1977. – С. 37–40.
36. Гордон Р.Ф., Джордан Т.У., Айткен И.Д. и др. Болезни птиц: монография. – Москва: Агропромиздат, 1985. – 349 с.
37. Гоулдинг К. Методы практической биохимии. – Москва: Мир, 1978.
– 272 с.
38. Грезина Н.М., Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. Молочная железа кроликов как объект биоинженерии. – Московская обл., Подольский район, п. Дубровицы: ВИЖ, 2004. – 60 с.
39. Грибанов Г.А., Сергеев С.А., Алексеенко А.С. Микротонкослойная
хроматография фосфолипидов сыворотки крови и их количественное определение с помощью малахитового зеленого // Лабораторное дело. – 1976. – №
12. – С. 724–727.
40. Громов А., Гусева Н., Воронцова Т., Андреева Г. Наследование окраски оперения у цесарок при гемогибридизации // Птицеводство. – 1974. –
№ 2. – С. 25–26.
41. Громов А.М., Феоктистов П.И. Изменение наследственности у кур
переливанием крови. – Москва: МСХ РСФСР, 1957. – 51 с.
42. Дуюнов Э.А., Пугачева А.И., Григорьев Н.Н., Дуюнова Р.Т. Гетерозис у самцов и самок при скрещивании отечественных и импортных индеек //
Пути дальнейшего улучшения селекции и технологии содержания индеек на
промышленной основе. – Обильное, 1978. – Т. 1. – С. 16–19.
43. Дядичкина Л.Ф., Позднякова Н.С. Руководство по биологическому
контролю при инкубации яиц сельскохозяйственной птицы. Методические
рекомендации. – Сергиев Посад: ВНИТИП, 2001. – 80 с.
220
44. Евдодиенко Ю.В., Гайнутдинов М.К., Кудзина Л.Ю. Транспорт
кальция в митохондриях // Биофизика живой клетки. – Пущино, 1974. – Т. 5.
– С. 84–95.
45. Евстратова А.М. Аутосексность в селекции птицы // Достижения
науки и передовой опыт в сельском хозяйстве. Животноводство и ветеринария. – Москва: ВНИИТЭИСХ, 1976. – Т. 1. – С. 12–17.
46. Евстратова А.М. Пути увеличения вывода суточного молодняка
птицы. – Москва: ВНИИТЭИСХ, 1986. – 51 с.
47. Егорова А.В. Методы и приемы племенной работы по повышению
эффективности использования мясных кур: Автореф. дис. ... докт. с.-х. наук.
– Сергиев Посад, 1999. – 28 с.
48. Егорова А.В., Шахнова Л.В., Елизаров Е.С. Селекция кур материнской формы бройлеров по яйценоскости // Достижения в современном птицеводстве. Исследования и инновации: материалы XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству. – Сергиев
Посад, 2009. – С. 27–29.
49. Егорова А.В., Устинова Е.С., Гофман А.Ю. Сохранение воспроизводительных качеств мясных кур-носителей маркерных генов "DW", "S",
"K", "k", отечественной селекции // Достижения в современном птицеводстве. Исследования и инновации: материалы XVI конференции Российского
отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству. – Сергиев Посад, 2009. – С. 24–27.
50. Ениколопов Г.Н., Бенюмов А.О., Барминцев В.А. и др. Опережающий рост трансгенных рыб, содержащих ген соматотропина человека // Доклады АН СССР. – 1988. – Т. 301. – № 3. – С. 724–727.
51. Жаданов А.Б. Получение векторов для экспрессии чужеродных генов в трансгенных животных: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. – Москва,
1991. – 23 с.
221
52. Журавлев И.В., Фисинин В.И., Толкачев П.С., Данилина В.А. Действие гормонов на содержание свободных аминокислот в печени цыплят //
Сельскохозяйственная биология. – 1980. – Т. 15. – № 6. – С. 949–950.
53. Забудский Ю.И., Григорьева Н.В. Адаптационные возможности организма цыплят в зависимости от продолжительности пребывания в инкубаторе // Сельскохозяйственная биология. – 2000. – № 4. – С. 87–92.
54. Звонова Л.Н., Карпенко Л.С. Программа работ с аутосексной материнской родительской формой мясных кур // Интенсификация птицеводства.
– Загорск: ВНИТИП, 1987. – С. 130–138.
55. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К., Брем Г. Трансгенные животные и возможности их использования: молекулярно-генетические аспекты трансгенеза
в животноводстве. – Московская обл., Подольский район, п. Дубровицы:
ВИЖ, 2000. – 128 с.
56. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. Проблемы биотехнологии и селекции
сельскохозяйственных животных. – Московская обл., Подольский район, п.
Дубровицы: ВГНИИ животноводства, 2006. – 343 с.
57. Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К. Соматические трансгенные животные продуценты рекомбинантных белков // Проблемы биотехнологии и селекции
сельскохозяйственных животных. / под общ. ред.: Н.А. Зиновьева, Л.К.
Эрнст. – Московская обл., Подольский район, п. Дубровицы: ВГНИИ животноводства, 2006. – С. 112–143.
58. Злочевская К.В. Методы создания линий и кроссов кур с низкой
живой массой: Автореф. дис. ... докт. с.-х. наук. – Л.-Пушкин, 1980. – 38 с.
59. Злочевская К.В. Новое в селекции яичных и мясных кур // Новое в
птицеводстве. – Москва: Колос, 1987. – С. 39–59.
60. Ишбулатова Р.М., Отрыганьев Г.К. Взаимосвязь веса яиц с живым
весом молодняка у японского перепела // Материалы 13 конференции аспирантов и молодых ученых. – Загорск, 1971. – Т. 4. – С. 58–62.
222
61. Ишбулатова Р.М., Отрыганьев Г.К. Некоторые морфологические и
физико-химические показатели инкубационных яиц в связи с возрастом перепелок // Материалы 13 конференции аспирантов и молодых ученых. – Загорск, 1971. – Т. 4. – С. 62–66.
62. Карапетян Р.В. Микроинъекции ДНК в яйцеклетки кур // Доклады
РАСХН. – 1995. – № 4. – С. 27–29.
63. Карапетян Р.В. Получение трансгенных кур методом микроинъекции ДНК в яйцеклетки // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.: И.Я. Шихов, С.Г.
Кадулин. – Москва: Миннауки, РАСХН, 1995. – С. 214–223.
64. Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г., Андреева Л.Е. и др. Инъекции гена бета-галактозидазы в яйцеклетки кур // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: тезисы докладов. –
Москва, 1996. – С. 35–35.
65. Карапетян Р.В. Получение трансгенных кур микроинъекцией ДНК в
яйцеклетки // Доклады РАСХН. – 1996. – № 2. – С. 19–20.
66. Карапетян Р.В. Фенотипические проявления трансгенности перепелов, развившихся из яйцеклеток, инъецированных чужеродной ДНК // Сельскохозяйственная биология. – 1997. – № 4. – С. 89–96.
67. Карапетян Р.В. Разработка метода микроинъекций ДНК в яйцеклетки кур // Сборник научных трудов ВНИТИП. – Сергиев Посад: ВНИТИП,
2000. – Т. 75. – С. 84–95.
68. Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г., Фисинин В.И. Использование
сперматозоидов в качестве вектора переноса чужеродной ДНК в яйцеклетки
сельскохозяйственной птицы // Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России: материалы конференции. – С.Петербург, 2008. – С. 55–56.
69. Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г. Яичная продуктивность потомков
перепелов, трансгенных по гену бычьего соматотропина // Достижения в со-
223
временном птицеводстве. Исследования и инновации: материалы XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству. – Сергиев Посад, 2009. – С. 34–35.
70. Карпенко Л.С. Признак пола у цыплят // Птицеводство. – 1987. – №
10. – С. 24–26.
71. Карпенко Л.С. Методика отбора суточных цыплят - носителей гена
медленной оперяемости K // Экономические и технологические аспекты
промышленного птицеводства. Сборник научных трудов ВНИТИП. – Загорск: ВНИТИП, 1991. – С. 145–152.
72. Кириллов С.В., Семенков Ю.П., Катунин В.И., Макаров Е.М. Взаимодействие транспортной РНК с рибосомами и синтез белка // Всесоюзный
биохимический съезд: тезисы. – Киев, 1986. – Т. 1. – С. 6.
73. Коваленко Е.А. Полярографическое определение кислорода в организме. – Москва: Медицина, 1975. – 231 с.
74. Кондратьев Я.Ю., Смирнов А.Н., Смирнова О.В. Многокомпанентная система эстрогенсвязывающих белков печени.Выделение и сравнительная характеристика 4–5 S и более крупномолекулярных белков печени крыс,
специфически связывающих эстрадиол // Биохимия. – 1980. – Т. 45. – № 11. –
С. 2065–2075.
75. Кондрашова М.Н., Евдодиенко Ю.В., Кудзина Л.Ю. Влияние обычных экспериментальных факторов на состояние митохондрий // Руководство
по изучению биологического окисления полярографическим методом. – Москва: Наука, 1973. – С. 93–106.
76. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации интегрированного в геном перепела гена
гормона роста быка // Молекулярная генетика и биотехнология в оценке и
изменении геномов с.-х. животных: материалы международн. симпозиума. –
С.-Петербург, Пушкин, 1994. – С. 18–19.
224
77. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В., Фисинин В.И. Трансформация генома птиц микроинъекцией ДНК в яйцеклетки на разных стадиях созревания
// 6-ая Конференция Балтийских стран по птицеводству. – Вильнюс, Литва,
1998. – С. 52–55.
78. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. Исследование экспрессии гена вгалактозидазы в трансгенных эмбрионах кур // Сборник научных трудов
ВНИТИП. – Сергиев Посад: ВНИТИП, 2000. – Т. 75. – С. 101–104.
79. Коршунова Л.Г., Серикова В.А., Зиадинова О.Ф., Карапетян Р.В.
Получение кур, трансгенных по гену в-интерферона // Сборник научных трудов ВНИТИП. – Сергиев Посад: ВНИТИП, 2000. – Т. 75. – С. 96–100.
80. Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В., Коршунов К.Р. и др. Сравнительная оценка яичной продуктивности потомков трансгенных и серых перепелов
эстонской породы // Сборник научных трудов ВНИТИП. – Сергиев Посад:
ВНИТИП, 2001. – Т. 76. – С. 78–85.
81. Косенко О.В. Ортотропная трансплантация донорского яичника в
качестве альтернативного метода искусственного воспроизводства птицы //
Докл. РАСХН. – 2007. – № 3. – С. 44–46.
82. Косенко О.В. Получение кур-реципиентов, фертильных за счет
функций трансплантанта донорского яичника: Автореф. дис. ... канд. биол.
наук. – Москва, 2009. – 22 с.
83. Кочетова З.И., Белякова Л.С., Макрушина Е. Особенности поведения и продуктивные качества перепелов эстонской и английской белой пород
при разной плотности посадки. // Сборник научных трудов ВНИТИП. – Сергиев Посад: ВНИТИП, 2005. – Т. 80. – С. 161–176.
84. Кочетова З.И., Белякова Л.С., Филоненко В.И., Чинцова А.И. Разведение и содержание перепелов. – Сергиев Посад: ВНИТИП, 2006. – 83 с.
85. Кочиш И.И., Петраш М.Г., Смирнов С.Б. Птицеводство. – Москва:
Колос, 2003. – 407 с.
225
86. Кудзина Л.Ю. Регуляция дыхания митохондрий эндэргоническими
реакциями: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. – Пущино, 1970. – 22 с.
87. Кузнецов А.В., Кузнецова И.В. Связывание экзогенной ДНК
pRK3lacZ сперматозоидами кролика, ее перенос в ооциты и экспрессия в доимплантационных эмбрионах // Онтогенез. – 1995. – Т. 26. – № 4. – С. 300–
309.
88. Кузнецова И.В., Щит И.Ю., Кузнецов А.В. Эффективность переноса сперматозоидами рекомбинантных ДНК в яйцеклетки кроликов // Сельскохозяйственная биология. – 1998. – № 6. – С. 40–44.
89. Кушнер Х.Ф. Наследование у кур изменений в окраске оперения,
возникающих под влиянием переливания чужеродной крови // Журнал общей
биологии. – 1958. – Т. 19. – № 5. – С. 357–368.
90. Лапшин С.А., Эрнст Л.К., Матяев В.И. Особенности жирнокислотного состава тканей трансгенных свиней // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.:
И.Я. Шихов, С.Г. Кадулин. – Москва: Миннауки, РАСХН, 1995. – С. 58–59.
91. Ленинджер А. Митохондрия. Молекулярные основы структуры и
функции. – Москва: Мир, 1966. – 315 с.
92. Ленинджер А.Л. Биохимия. – Москва: Мир, 1980. – Т. 3. – 487 с.
93. Лим В.И., Каява А.В., Спирин А.С. Стереохимический анализ
транспептидации, транслокации и сворачивания растущего пептида на рибосоме // Всесоюзный биохимический съезд: тезисы. – Киев, 1986. – Т. 1. – С. 7.
94. Малер Г.Р., Фан С.Г., Бастон Р.Н. Интеграция и регуляция сборки
митохондрий у дрожжей. // Молекулярная генетика митохондрий. – Ленинград: Наука, 1977. – С. 118–132.
95. Малюгин Э.Ф., Князева Т.А., Заринская С.А. и др. Динамика изменения активности кислородовосстанавливающих ферментов в ткани печени
при ишемии // Экспериментальная и клиническая хирургия печени. – Москва: Мир, 1973. – С. 67–76.
226
96. Марзанов Н.С., Девришов Д.А., Марзанова С.Н. и др. Генетическое
маркирование, сохранение биоразнообразия и проблемы разведения животных // Сельскохозяйственная биология. – 2011. – № 2. – С. 3–14.
97. Марибона Р., Корнева С.Б., Копылов А.М. Выделение рибосом с
интактной рРНК из дрожжей // Биохимия. – 1979. – Т. 44. – № 9. – С. 1701–
1705.
98. Матарадзе Г.Д., Гонтарь Е.В., Кондратьев Я.Ю., Розен В.Б. Сравнительный анализ изучения взаимодействия различных форм эстрогенных рецепторов с клеточным ядром // Биохимия. – 1982. – Т. 47. – № 5. – С. 869–
878.
99. Мецлер Д. Биохимия. – Москва: Мир, 1980. – Т. 3. – 487 с.
100. Митюшин В.М. К вопросу о биогенезе митохондрий в клетках
млекопитающих // Биохимия митохондрий. – Москва: Наука, 1976. – С. 125.
101. Монахов Н.К. О биохимических функциях митохондрий различного типа // Биохимия. – 1964. – Т. 5. – № 29. – С. 955–963.
102. Монахов Н.К. О функциональной гетерогенности митохондрий
нормальной и опухолевой клетки // Молекулярная биология. – 1967. – № 1. –
С. 114–122.
103. Нейфах А.А., Тимофеева М.Я. Проблемы регуляции в молекулярной биологии развития. – Москва: Наука, 1978. – 312 с.
104. Новиков Б.В., Дмитренко В.В., Сургучева Л.М. и др. Иммунный
статус трансгенных по МХ-гену и обычных свиней в норме и при заражении
вирусом гриппа // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве,
животноводстве и ветеринарии: тезисы докладов. – Москва, 1996. – С. 56.
105. Новиков Б.В., Дмитренко В.В., Шевченко А.А. и др. Реакция кроликов, трансгенных по генам гамма- и бета-интерферонов, на заражение вирусом миксоматоза // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: тезисы докладов. – Москва, 1996. – С. 56.
227
106. Новиков Б.В., Дмитренко В.В., Куриннов В.В. и др. Реакция кроликов, трансгенных по генам гамма- и бета-интерферонов, на заражение лапинизированным вирусом классической чумы свиней (КЧС) // Актуальные
проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии:
тезисы докладов. – Москва, 1996. – С. 55.
107. Овчинников Л.П. Регуляция элонгации у эукариот // Всесоюзный
биохимический съезд: тезисы. – Киев, 1986. – Т. 1. – С. 9–10.
108. Озернюк Н.Д. Изменение количества митохондрий в процессе
оогенеза вьюна // Докл.АН СССР. – 1972. – № 4. – С. 974–977.
109. Озернюк Н.Д., Пальмбах Л.П. Связь между митохондриями и эндоплазмотическим ретикулумом в ооцитах вьюна // Онтогенез. – 1974. – Т. 5.
– № 4. – С. 404–407.
110. Озернюк Н.Д., Пальмбах Л.П. Рост и воспроизведение митохондрий в ооцитах вьюна // Онтогенез. – 1975. – Т. 6. – № 5. – С. 442–449.
111. Озернюк Н.Д., Котомин А.В. Перенос в митохондрии белков, синтезированных в цитоплазме и стимуляция митохондриального белкового
синтеза фракцией микросом // Биохимия. – 1978. – Т. 43. – № 1. – С. 67–71.
112. Отрыганьев Г.К. Справочник по инкубации яиц. – Москва: Колос,
1983. – 176 с.
113. Оуэн Р.Л. Иммунная система птиц // Птицеводство. – 1996. – № 2.
– С. 39–41.
114. Пенионжкевич Э.Э., Шахнова Л.В. Эффективность прямых и обратных скрещиваний в птицеводстве // Метериалы конференции по наследственности и изменчивости растений, животных и микроорганизмов. – Москва,
1959. – С. 515–520.
115. Пенионжкевич Э.Э. Метода и план работы по выведению мясных
линий кур // Птицеводство. – 1963. – № 12. – С. 11–14.
116. Пенионжкевич Э.Э., Злочевская К.В., Шахнова Л.В. Разведение и
племенное дело в птицеводстве. – Москва: Колос, 1982. – 302 с.
228
117. Пигарева М.Д., Афанасьев Г.Д. Перепеловодство. – Москва: Росагропромиздат, 1989. – 103 с.
118. Покровский А.А., Мальцев Г.Ю., Гаппаров М.М. Особенности переноса электронов в митохондриях слизистой желудка // Митохондрия. –
Москва: Наука, 1977. – С. 143–147.
119. Прокофьев М.И., Захарченко В.И., Сураева Н.М., Лагутина И.С.
Методы получения биоинженерных сельскохозяйственных животных //
Сельскохозяйственная биология. – 1994. – № 4. – С. 12–25.
120. Прокофьев М.И., Городецкий С.И., Мезина М.Н. и др. Создание
трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор // Сельскохозяйственная биология. –
2003. – № 6. – С. 49–54.
121. Радченков В.П., Аверин В.С., Бутров Е.В. и др. Определение гормонов в крови крупного рогатого скота, свиней и их гормональный статус:
Методические указания. – Боровск: ВНИИФБиП, 1985. – 76 с.
122. Ройтер Я.С. Методы повышения племенных и продуктивных качеств цесарок: Автореф. дис. ... докт. с.-х. наук. – Сергиев Посад, 1992. – 30 с.
123. Ройтер Я.С. Племенная работа с гусями и утками // Птицеводство.
– 2007. – № 6. – С. 2–4.
124. Ройтер Я.С., Гусева Н.К., Коноплева А.П. Иммуногенетические
методы создания межвидовых гибридов птицы // Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России: материалы конференции. – Сергиев Посад, 2009. – С. 136–139.
125. Ротенберг Ю.С. Эксперименты на изолированных митохондриях и
возможность количественного переноса получаемых результатов на целостный организм // Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. – Москва: Наука, 1973. – С. 213–219.
126. Рыцарева А.Н. Технологические приемы инкубации перепелиных
яиц: Автореф. дис. ... канд. с.-х. наук. – Загорск, 1989. – 21 с.
229
127. Самоделкина С.Д. Функциональная оценка репродуктивной системы кур в раннем возрасте: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. – Краснодар,
1979. – 19 с.
128. Самойлов А.В. Разработка и совершенствование методов трансфекции экзогенной ДНК в эмбриональные клетки кур: Автореф. дис. ... канд.
биол. наук. – Москва, 2010. – 19 с.
129. Сапрунова В.Б., Бакеева Л.Е. Морфофункциональные изменения
митохондрий при митоптозе // Рецепция и внутриклеточная сигнализация:
материалы международной конференции. – Пущино, 2007. – С. 197–200.
130. Сапрунова В.Б., Солодовникова И.М., Бакеева Л.Е. Выявление цитохром-с-оксидазной активности в митохондриях кардиомицитов изолированной ткани миокарда при длительном действии гипоксии // Цитология. –
2008. – Т. 50. – № 3. – С. 268–274.
131. Сапрунова В.Б. Ультраструктура митохондрий в условиях окислительного стресса: Автореф. дис. ... докт. биол. наук. – Москва, 2008. – 46 с.
132. Сердюк И.Н., Спирин А.С. Крупноблочные изменения рибосомы
при транслокации // Всесоюзный биохимический съезд: тезисы. – Киев, 1986.
– Т. 1. – С. 4–5.
133. Серебровский А.С. Генетика домашней птицы // Труды Аниковской генетической станции наркомзема РСФСР. – Москва, 1926. – С. 3–74.
134. Симонян А.А., Абрамян К.С., Геворкян Г.А. и др. Ультраструктурные изменения митохондрий сердца и печени кур в онтогенезе // Биол.
журнал Армении. – 1977. – Т. 30. – № 5. – С. 18–22.
135. Симонян А.А., Геворкян Г.А., Степанян Р.А. Сравнительная характеристика дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях
сердечной мышцы кур в онтогенезе // Украинский биохимический журнал. –
1978. – Т. 50. – № 3. – С. 281–284.
136. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. – Москва: Мир, 1998. – Т. 1. –
373 с.
230
137. Сингер М., Берг П. Гены и геномы. – Москва: Мир, 1998. – Т. 2. –
394 с.
138. Скулачев В.П. Соотношение окисления и фосфорилирования в
дыхательной цепи. – Москва: АН СССР, 1962. – 156 с.
139. Скулачев В.П., Джунет Х., Брайнес А.С. Окисление и фосфорилирование в митохондриях эмбриональной мышцы // Биохимия. – 1964. – Т. 29.
– № 4. – С. 653–667.
140. Скулачев В.П. Аккумуляция энергии в клетке. – Москва: Наука,
1969. – 440 с.
141. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. – Москва:
Наука, 1989. – 564 с.
142. Сметнев С.И. Повышение яйценоскости кур мясо-яичных пород
для получения бройлеров // Доклады ТСХА. – 1963. – С. 24–28.
143. Смирнов А.Н., Смирнова О.В., Розен В.Б. Выявление и предварительная характеристика особого эстрогенсвязывающего белка в печени самцов крыс // Биохимия. – 1977. – Т. 42. – № 3. – С. 560–571.
144. Смирнов А.Н. Проблема гетерогенности рецепторов стероидных
гормонов // Проблемы эндокринологии. – 1978. – Т. 24. – № 6. – С. 98–107.
145. Смирнов Б.В. Биологические особенности гусей и использование
их при интенсификации гусеводства: Автореф. дис. ... докт. с.-х. наук. –
Краснодар, 1978. – 29 с.
146. Смирнова О.В., Смирнов А.Н., Фишер У.М., Розен В.Б. Изучение
некоторых структурных форм цитоплазматических рецепторов к эстрадиолу
матки, почек и печени крыс // Доклады АН СССР. – 1976. – Т. 226. – № 2. –
С. 474–477.
147. Солодовникова И.М., Сапрунова В.Б., Бакеева Л.Е., Л.С. Я. Динамика изменений ультраструктуры митохондрий кардиомицитов изолированного миокарда крысы при длительной инкубации в условиях аноксии // Цитология. – 2006. – Т. 48. – № 10. – С. 848–855.
231
148. Сопиков П.М. Методы направленной гемомолекулярной гибридизации животных // Соматическая гибридизация клеток и потомство животных. Научные труды Ленинградского ветеринарного института. – Ленинград,
1978. – Т. 54. – С. 91–98.
149. Спирин А.С. Молекулярная биология: Структура рибосомы и биосинтез белка. – Москва: Высшая школа, 1986. – 303 с.
150. Станишевская О.И. Режим инкубации должен учитывать качество
яйца // Животноводство России. – 2008. – № 6. – С. 17–18.
151. Стрелков Л.А., Кафиани К.А. Молекулярная биология генов, программирующих рибосомные РНК животных // Успехи биологической химии.
– 1978. – № 19. – С. 32–60.
152. Сураева Н.М., Кесян А.З., Прокофьев М.И., Эрнст Л.К. Выделение
химозина из молока трансгенных овец // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: тезисы докладов. –
Москва, 1996. – С. 77–77.
153. Сураева Н.М., Карапетян Р.В., Барышников А.Ю. Разработка и совершенствование методов инъекции репортерного гена в первичные половые
клетки кур // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: материалы
четвертой международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Шманенкова. – Боровск, 2006. – С. 276–277.
154. Сураева Н.М., Барышников А.Ю., Самойлов А.В. Трансфекция in
vitro гонадных клеток кур бактериальным геном в-галактозидазы // Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – Т. 6. – № 1. – С. 7.
155. Сураева Н.М., Барышников А.Ю., Фисинин В.И. и др. Изучение
эффективности различных способов трансфекции репортерного гена в эмбриональные клетки кур // Известия РАН. – 2008. – № 1. – С. 18–23.
156. Сураева Н.М., Самойлов А.В. Получение фармацевтических белков с помощью трансгенной птицы // Вестник РОНЦ им.Блохина Н.Н.
РАМН. – 2009. – Т. 20. – № 4. – С. 19–25.
232
157. Сураева Н.М., Мартиросян В.В., Кесян А.З. и др. Получение
трансгенных кур с геном гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т. 9. – № 2.
– С. 60.
158. Сураева Н.М., Мартиросян В.В., Кесян А.З. и др. Трансфекция экзогенной ДНК эмбриональных клеток птицы // Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т. 9. – № 2. – С. 59.
159. Ткачев Е.З., Эрнст Л.К., Владимиров В.Л., Устин В.В. Продуктивность и физиолого-биохимические качества свиней инъецированных рекомбинантным свиным соматотропином // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.: И.Я.
Шихов, С.Г. Кадулин. – Москва: Миннауки, РАСХН, 1995. – С. 266–288.
160. Тодоров И.Н., Смалько Н.Я., Галкин А.П. Состояние полирибосом
как отражение функционального взаимодействия системы трансляции и
трвнскрипции в процессе восстановления биосинтеза белка, ингибированного циклогексимидом // Биохимия. – 1977. – Т. 42. – № 12. – С. 2149–2159.
161. Токин И.Б. Электронно-микроскопическое исследование половых
и соматических клеток аскариды. – Ленинград: ЛГУ, 1961. – 164 с.
162. Толкачев П.С., Журавлев И.В., Фисинин В.И. Спектр хроматиновых белков клеток печени при индукции эстрогеном вителлогенной функции
// Приемы профилактики болезней с.-х. птицы. Сб. науч. трудов ВНИТИП. –
Загорск: ВНИТИП, 1982. – Т. 54. – С. 3–9.
163. Толкачев П.С., Журавлев И.В., Косенко О.В. Межпородные трансплантации яичников, тимуса и кожи у кур // Промышленное производство
яиц и мяса птицы. Сборник научных трудов ВНИТИП. – Сергиев Посад:
ВНИТИП, 1993. – С. 132–140.
164. Тоньшин А.А., Сапрунова В.Б., Солодовникова И.М. и др. Функциональная активность и ультраструктура митохондрий, выделенных из
апоптозной ткани сердца // Биохимия. – 2003. – Т. 68. – № 8. – С. 1070–1078.
233
165. Трудолюбова М.Г. Количественное определение РНК и ДНК в
субклеточных фракциях клеток животных // Современные методы в биохимии. – Москва: Медицина, 1977. – С. 313–316.
166. Тучемский Л.И. Технология выращивания высокопродуктивных
цыплят-бройлеров. – Сергиев Посад, 1999. – 203 с.
167. Уотсон Д.Д. Молекулярная биология гена. – Москва: Мир, 1978. –
720 с.
168. Фатеев В. Создание гибридной птицы // Птицеводство. – 2002. – №
8. – С. 9–10.
169. Фисинин В.И. Методы совершенствования продуктивных качеств
яичных кур и организационно-технологические принципы племенной работы: Автореф. дис. ... докт. с.-х. наук. – Ленинград-Пушкин, 1979. – 36 с.
170. Фисинин В.И., Бирюков А.Г., Авдонин Б.Ф. Продуктивные качества кур, дыхание и окислительное фосфорилирование в митохондриях печени под влиянием янтарной и малоновой кислот // Сельскохозяйственная биология. – 1986. – № 12. – С. 3–7.
171. Фисинин В.И., Околелова Т.М., Коршунова Л.Г. и др. Биоэнергетика митохондрий печени ремонтных молодок в зависимости от уровня жиро- и водорастворимых витаминов в рационе // Научные основы витаминного
питания с.-х. животных: тезисы докладов 2-го Всесоюзного симпозиума. –
Юрмала, 1987. – С. 217–218.
172. Фисинин В.И., Эрнст Л.К., Карапетян Р.В. и др. Способ получения
трансгенной птицы: пат. 1550652 RU. № 4475436; заявл. 17.08.88; опубл.
23.07.93, Бюл. № 10.
173. Фисинин В.И., Эрнст Л.К., Карапетян Р.В. и др. Способ трансформации генома птицы: пат. 2022014 RU. № 4452202; заявл. 12.05.88; опубл.
30.10.94, Бюл. № 20.
174. Фисинин В.И., Околелова Т.М., Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В.
Цитохромоксидазная и фосфорилирующая активность печени ремонтных ку-
234
рочек в зависимости от их возраста и дозы витаминов в рационе // Сельскохозяйственная биология. – 1988. – № 3. – С. 43–45.
175. Фисинин В.И., Журавлев И.В., Айдинян Т.Г. Эмбриональное развитие птицы. – Москва: ВО Агропромиздат, 1990. – 240 с.
176. Фисинин В.И., Эрнст Л.К., Карапетян Р.В. и др. Способ повышения яичной продуктивности птицы: пат. 2061366 RU. № 93019970/15; заявл.
19.04.93; опубл. 10.06.96, Бюл. № 16.
177. Фисинин В.И., Тишенков А.Н., Егоров И.А., и др. Оценка качества
кормов, органов, тканей, яиц и мяса птицы. Методическое руководство для
зоотехнических лабораторий. – Сергиев Посад: ВНИТИП, 1998. – 116 с.
178. Фисинин В.И., Карапетян Р.В., Коршунова Л.Г. Использование
спермиев в качестве вектора переноса чужеродной ДНК в яйцеклетки кур //
Достижения в современном птицеводстве. Исследования и инновации: материалы XVI конференции Российского отделения Всемирной научной ассоциации по птицеводству. – Сергиев Посад, 2009. – С. 67–68.
179. Фисинин В.И. Племенное дело - генетика и селекция // Птицеводство России - стратегия инновационного развития. / под общ. ред.: В.И. Фисинин. – Москва: ГНУ ВНИТИП РАСХН, 2009. – С. 67–87.
180. Фисинин В.И. Птицеводство России - стратегия инновационного
развития. – Москва: ГНУ ВНИТИП РАСХН, 2009. – 148 с.
181. Фисинин В.И., Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А. и др. Разработка системы молекулярно-генетического анализа Gallus Gallus с целью оценки состояния и динамики изменения отечественного генофонда кур // Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России: материалы конференции. – Сергиев Посад, 2009. – С. 110–115.
182. Фисинин В.И., Коршунова Л.Г., Карапетян Р.В. и др. Способ отбора перепелок по массе яиц: пат. 2402209 RU. № 2009118061/13; заявл.
12.05.2009; опубл. 27.10.2010, Бюл. № 30.
235
183. Фоменко Г.Н., Косенко О.В., Толкачев П.С., Журавлев И.В. Эффективность некоторых приемов выполнения отдельных этапов операции ортотропной трансплантации яичников у цыплят // Экономические и технологические аспекты промышленного птицеводства. Сборник научных трудов
ВНИТИП. – Загорск: ВНИТИП, 1991. – С. 160–167.
184. Хатт Ф.Б. Генетика животных. – Москва: Колос, 1969. – 445 с.
185. Хмельницкая Т. Работаем с кроссом "Ломанн браун" // Птицеводство. – 1993. – № 3. – С. 27–31.
186. Ченцов Ю.С. Общая цитология. – Москва: Изд-во МГУ, 1995. –
384 с.
187. Черновская Т.В., Любимова Е.В., Лерман М.И. Метаболизм мРНК
в клетках регенерирующей печени: ускорение процессинга и распада мРНК //
Молекулярная биология. – 1976. – Т. 10. – № 6. – С. 1361–1368.
188. Чистяков Д.А., Захарченко В.И., Мезина М.Н. и др. Получение
трансгенных кроликов, содержащих ген гамма-интерферона быка и анализ
его интеграции в тканях кролика // Генноинженерные сельскохозяйственные
животные. Сборник научных трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.: И.Я. Шихов,
С.Г. Кадулин. – Москва: Миннауки, РАСХН, 1995. – С. 127–137.
189. Шатский И.Н. Топография РНК в рибосомах // Всесоюзный биохимический съезд: тезисы. – Киев, 1986. – Т. 1. – С. 3–4.
190. Шахнова Л. Основные направления в селекции мясных кур // Птицеводство. – 1991. – № 4. – С. 24–26.
191. Шихов И.Я. Интерференционная РНК как защита клетки от трансгенеза // Сельскохозяйственная биология. – 2009. – № 4. – С. 3–12.
192. Эрнст Л.К., Фисинин В.И., Журавлев И.В. и др. Способ трансплантации куриной яйцеклетки: пат. 1565025 SU. № 4396482; заявл. 23.03.88;
опубл. 15.01.90, Бюл. № 18.
236
193. Эрнст Л.К., Тихоненко Т.И., Сураева Н.М., Мирошниченко О.И.
Получение трансгенного потомства от кроликов с геном асРНК против E1A
области аденовируса Ad h5 // Доклады ВАСХНИЛ. – 1989. – № 6. – С. 40–42.
194. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Семенова В.А. и др. Фенотипический
эффект трансгенности по гену гормона роста крупного рогатого скота у кролика // Доклады ВАСХНИЛ. – 1990. – № 6. – С. 32–36.
195. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И. Биотехнология сельскохозяйственных животных. – Москва: Колос, 1995. – 192 с.
196. Эрнст Л.К., Брем Г., Устин В.В. Зоотехническая и физиологобиохимическая оценка трансгенных свиней с геном рилизинг-фактора соматотропного гормона // Генноинженерные сельскохозяйственные животные.
Сборник научных трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.: И.Я. Шихов, С.Г. Кадулин. – Москва: Миннауки, РАСХН, 1995. – С. 17–25.
197. Эрнст Л.К., Прокофьев М.И., Дьяконов Л.П. и др. Микроинъекции
чужеродных генов, ответственных за устойчивость организма к инфекционным заболеваниям // Вестник РАСХН. – 1995. – № 1. – С. 56–58.
198. Эрнст Л.К. Проблемы селекции и биотехнологии сельскохозяйственных животных. – Москва: РАСХН, 1995. – 359 с.
199. Эрнст Л.К., Брем Г., Махаев Е.А. Результаты выращивания и изучения обмена веществ трансгенных по гену рилизинг-фактора гормона роста
свиней первого поколения // Генноинженерные сельскохозяйственные животные. Сборник научных трудов. Выпуск 1. / под общ. ред.: И.Я. Шихов,
С.Г. Кадулин. – Москва: Миннауки, РАСХН, 1995. – С. 48–53.
200. Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А., Брем Г. Современное состояние и
перспективы использования трансгенных технологий в животноводстве. –
Москва: РАСХН, 2002. – 341 с.
201. Эрнст Л.К. Генетические основы селекции сельскохозяйственных
животных. – Москва: РАСХН, 2004. – 737 с.
237
202. Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в XXI веке. – Москва: РАСХН, 2008. – 508 с.
203. Эрнст Л.К., Волкова Н.А., Зиновьева Н.А. Некоторые аспекты использования трансгенных технологий в животноводстве // Сельскохозяйственная биология. – 2009. – № 2. – С. 4–9.
204. Эрнст Л.К. Методы биотехнологии в селекции животных: хозяйственные и биологические характеристики трансгенных свиней // Сельскохозяйственная биология. – 2010. – № 4. – С. 3–6.
205. Юсупов М.М., Спирин А.С. Исследование поверхности рибосом и
рибосомных субчастиц Escherichia coli методом тритиевой бомбардировки //
Всесоюзный биохимический съезд: тезисы. – Киев, 1986. – Т. 1. – С. 5–6.
206. Aaij C., Borst P. Mitochondrial RNA from rat liver // Biochim Biophys
Acta. – 1970. – V. 217. – N 2. – P. 560–562.
207. Ab G., Roskam W.G., Dijkstra J., et al. Estradiol-induced synthesis of
vitellogenin. III. The isolation and characterization of vitellogenin messenger RNA
from avian liver // Biochim Biophys Acta. – 1976. – V. 454. – N 1. – P. 67–78.
208. Acs P., Kipp M., Norkute A., et al. 17beta-estradiol and progesterone
prevent cuprizone provoked demyelination of corpus callosum in male mice //
Glia. – 2009. – V. 57. – N 8. – P. 807–814.
209. Adachi M., Yodoi J., Noro N., et al. Murine IgA binding factors produced by Fc alpha R(+) T cells: role of Fc gamma R(+) cells for the induction of
Fc alpha R and formation of IgA-binding factor in Con A-activated cells // J Immunol. – 1984. – V. 133. – N 1. – P. 65–71.
210. Amalric F., Nicoloso M., Zalta J. A comparative study of "soluble"
RNA polymerase activity of Zajdela hepatoma ascites cells and calf thymus //
FEBS Lett. – 1972. – V. 22. – N 1. – P. 67–72.
211. Amieux P.S., McKnight G.S. Cyclic nucleotides converge on brown
adipose tissue differentiation // Sci Signal. – 2010. – V. 3. – N 104. – P. 112–118.
238
212. Andacht T., Hu W., Ivarie R. Rapid and improved method for windowing eggs accessing the stage X chicken embryo // Mol Reprod Dev. – 2004. – V.
69. – N 1. – P. 31–34.
213. Anderson E., Condon W., Sharp D. A study of oogenesis and early embryogenesis in the rabbit, Oryctolagus cuniculus, with special reference to the
structural changes of mitochondria // J Morphol. – 1970. – V. 130. – N 1. – P. 67–
91.
214. Andre J. [Contribution to the knowledge of the chondriome. Study of
its ultrastructural changes during spermatogenesis] // J Ultrastruct Res. – 1962. –
V. Suppl 3. – P. 1–185.
215. Araujo G.W., Beyer C., Arnold S. Oestrogen influences on mitochondrial gene expression and respiratory chain activity in cortical and mesencephalic
astrocytes // J Neuroendocrinol. – 2008. – V. 20. – N 7. – P. 930–941.
216. Archibald A.L., McClenaghan M., Hornsey V., et al. High-level expression of biologically active human alpha 1-antitrypsin in the milk of transgenic
mice // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1990. – V. 87. – N 13. – P. 5178–5182.
217. Arning L., Haghikia A., Taherzadeh-Fard E., et al. Mitochondrial haplogroup H correlates with ATP levels and age at onset in Huntington disease // J
Mol Med (Berl). – 2010. – V. 88. – N 4. – P. 431–436.
218. Arnold S., Beyer C. Neuroprotection by estrogen in the brain: the mitochondrial compartment as presumed therapeutic target // J Neurochem. – 2009. –
V. 110. – N 1. – P. 1–11.
219. Aschenbrenner B., Druyan R., Albin R., Rabinowitz M. Haem a, cytochrome c and total protein turnover in mitochondria from rat heart and liver // Biochem J. – 1970. – V. 119. – N 2. – P. 157–160.
220. Attardi B., Attardi G. A membrane-associated RNA of cytoplasmic origin in HeLa cells // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1967. – V. 58. – N 3. – P. 1051–
1058.
239
221. Balthazart J., Foidart A., Sante P., Hendrick J.C. Effects of alphamethyl-para-tyrosine on monoamine levels in the Japanese quail: sex differences
and testosterone effects // Brain Res Bull. – 1992. – V. 28. – N 2. – P. 275–288.
222. Balthazart J., Foidart A., Wilson E.M., Ball G.F. Immunocytochemical
localization of androgen receptors in the male songbird and quail brain // J Comp
Neurol. – 1992. – V. 317. – N 4. – P. 407–420.
223. Bartelink A.K., de Kort C.A., Kroon A.M. Mitochondrial formation in
the developing flight muscles of the Colorado beetle // Dev Biol. – 1975. – V. 42. –
N 2. – P. 262–273.
224. Bartels H., Gourlet V., Perramon A., et al. Biological parameters in
Japanese quail genetically selected for resistance or sensitivity to an acute hypoxic
survival // Aviat Space Environ Med. – 1985. – V. 56. – N 10. – P. 976–984.
225. Bartholeyns J., Peeters-Joris C., Baudhuin P. Hepatic nucleases. Extrahepatic origin and association of neutral liver ribonuclease with lysosomes // Eur J
Biochem. – 1975. – V. 60. – N 2. – P. 385–393.
226. van den Berg J.A., Kooistra T., Geert A.B., Gruber M. Effect of estradiol on the RNA content and the activity of nucleolar RNA polymerase from
rooster liver // Biochem Biophys Res Commun. – 1974. – V. 61. – N 1. – P. 367–
374.
227. van den Berg J.A., Gruber M., Ab G. Estradiol-induced enhancement of
the processing of the 32S ribosomal precursor in rooster liver // FEBS Lett. – 1976.
– V. 63. – N 1. – P. 65–70.
228. Bergink E.W., Kloosterboer H.J., Gruber M., Ab G. Estrogen-induced
phosphoprotein synthesis in roosters. Kinetics of induction // Biochim Biophys
Acta. – 1973. – V. 294. – N 1. – P. 497–506.
229. Bergink E.W., Wallace R.A. Precursor-product relationship between
amfhibian vitellogenin and the yolk proteins, lipovitellin and phosvitin // J. Biol.
Chem. – 1974. – V. 249. – P. 2897–2903.
240
230. de Bernard B., Getz G.S., Rabinowitz M. The turnover of the protein of
the inner and outer mitochondrial membrane of rat liver // Biochim Biophys Acta.
– 1969. – V. 193. – N 1. – P. 58–63.
231. Best M.M., Duncan C.H. Hypolipemia and Hepatomegaly from Ethyl
Chlorophenoxyisobutyrate (Cpib) in the Rat // J Lab Clin Med. – 1964. – V. 64. –
P. 634–642.
232. Beuving G., Gruber M. Induction of phosvitin synthesis in roosters by
estradiol injection // Biochim Biophys Acta. – 1971. – V. 232. – N 3. – P. 529–
536.
233. Bieri-Bonniot F., Joss U., Dierks-Ventling C. Stimulation of RNA polymerase i activity by 17beta-estradiol-receptor complex on chick liver nucleolar
chromatin // FEBS Lett. – 1977. – V. 81. – N 1. – P. 91–96.
234. Blokhuis G.G., Veldstra H. Heterogeneity of mitochondria in rat brain
// FEBS Lett. – 1970. – V. 11. – N 3. – P. 197–199.
235. Boell E.J., Weber R. Cytochrome oxidase activity in mitochondria during amphibian development // Exp Cell Res. – 1955. – V. 9. – N 3. – P. 559–567.
236. de Boer G.F., van Woensel P.A. [Transgenic chickens] // Tijdschr
Diergeneeskd. – 1990. – V. 115. – N 10. – P. 451–462.
237. Bondi E.E., Devlin T.M., Ch'ih J.J. Distribution of two mitochondrial
populations in rabbit kidney cortex and medulla // Biochem Biophys Res Commun.
– 1972. – V. 47. – N 3. – P. 574–580.
238. van den Boogaart P., Mulder J., Halsema I., et al. Estradiol-induced
vitellogenin synthesis in duck liver // Biochim Biophys Acta. – 1981. – V. 654. –
N 1. – P. 1–10.
239. Borthwick N.M., Smellie R.M. The effects of oestradiol-17beta on the
ribonucleic acid polymerases of immature rabbit uterus // Biochem J. – 1975. – V.
147. – N 1. – P. 91–101.
241
240. Bos E.S., Vonk R.J., Gruber M., Ab G. Lipovitellin synthesizing polysomes: Specific and quantitative isolation // FEBS Lett. – 1972. – V. 24. – N 2. –
P. 197–200.
241. Bosselman R.A., Hsu R.Y., Briskin M.J., et al. Transmission of exogenous genes into the chicken // J Reprod Fertil Suppl. – 1990. – V. 41. – P. 183–
195.
242. Boveris A., Valdez L.B., Zaobornyj T., Bustamante J. Mitochondrial
metabolic states regulate nitric oxide and hydrogen peroxide diffusion to the cytosol // Biochim Biophys Acta. – 2006. – V. 1757. – N 5–6. – P. 535–542.
243. Brackett B.G., Baranska W., Sawicki W., Koprowski H. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1971. – V. 68. – N 2. – P. 353–357.
244. Brandon M.C., Wallace D.C., Baldi P. Data structures and compression
algorithms for genomic sequence data // Bioinformatics. – 2009. – V. 25. – N 14. –
P. 1731–1738.
245. Brazolot C.L., Petitte J.N., Etches R.J., Verrinder Gibbins A.M. Efficient transfection of chicken cells by lipofection, and introduction of transfected
blastodermal cells into the embryo // Mol Reprod Dev. – 1991. – V. 30. – N 4. – P.
304–312.
246. Breindl M., Doehmer J., Willecke K., et al. Germ line integration of
Moloney leukemia virus: identification of the chromosomal integration site // Proc
Natl Acad Sci U S A. – 1979. – V. 76. – N 4. – P. 1938–1942.
247. Brinster R.L., Allen J.M., Behringer R.R., et al. Introns increase transcriptional efficiency in transgenic mice // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1988. – V.
85. – N 3. – P. 836–840.
248. Brinster R.L., Sandgren E.P., Behringer R.R., Palmiter R.D. No simple
solution for making transgenic mice // Cell. – 1989. – V. 59. – N 2. – P. 239–241.
242
249. Brosemer R.W., Vogell W., Buecher T. [Morphological and Enzymatic
Patterns in the Development of the Indirect Flight Muscle of the Locust Migratoria] // Biochem Z. – 1963. – V. 338. – P. 854–910.
250. Brown D.D., Gurdon J.B. Absence of Ribosomal Rna Synthesis in the
Anucleolate Mutant of Xenopus Laevis // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1964. – V.
51. – P. 139–146.
251. Brown D.D., Dawid I.B. Specific gene amplification in oocytes. Oocyte
nuclei contain extrachromosomal replicas of the genes for ribosomal RNA // Science. – 1968. – V. 160. – N 825. – P. 272–280.
252. Bulos B., Shukla S., Sacktor B. Bioenergetic properties of mitochondria
from flight muscle of aging blowflies // Arch Biochem Biophys. – 1972. – V. 149.
– N 2. – P. 461–469.
253. Bygrave F.L. The ionic environment and metabolic control // Nature. –
1967. – V. 214. – N 5089. – P. 667–671.
254. Byrne E., Marzuki S., Dennett X. Current perspectives in the study of
human mitochondriopathies // Med J Aust. – 1988. – V. 149. – N 1. – P. 30–33.
255. Caboche M., Bachellerie J.P. RNA methylation and control of eukaryotic RNA biosynthesis. Effects of cycloleucine, a specific inhibitor of methylation, on ribosomal RNA maturation // Eur J Biochem. – 1977. – V. 74. – N 1. –
P. 19–29.
256. Carafoli E. In vivo effect of uncoupling agents on the incorporation of
calcium and strontium into mitochondria and other subcellular fractions of rat liver
// J Gen Physiol. – 1967. – V. 50. – N 7. – P. 1849–1864.
257. Carafoli E., Sacktor B. The effects of ruthenium red on reactions of
blowfly flight muscle mitochondria with calcium // Biochem Biophys Res Commun. – 1972. – V. 49. – N 6. – P. 1498–1503.
258. Carafoli E., Gazzotti P. The reaction of Ca ++ with the inner and outer
membrane of mitochondria // Experientia. – 1973. – V. 29. – N 4. – P. 408–409.
243
259. Carafoli E. The calcium cycle of mitochondria // FEBS Lett. – 1979. –
V. 104. – N 1. – P. 1–5.
260. Carafoli E. The fateful encounter of mitochondria with calcium: how
did it happen? // Biochim Biophys Acta. – 2010. – V. 1797. – N 6–7. – P. 595–606.
261. Cardoso A.R., Queliconi B.B., Kowaltowski A.J. Mitochondrial ion
transport pathways: role in metabolic diseases // Biochim Biophys Acta. – 2010. –
V. 1797. – N 6–7. – P. 832–838.
262. Carinci P., Caruso A., Evangelisti R., et al. Studies on the mechanism
of in vitro estradiol-17 beta induced synthesis of phosvitin in chick embryo liver
cells // Cell Differ. – 1976. – V. 4. – N 6. – P. 441–448.
263. Cassidy M.M., Golder A.M., Tiolboll C.S. Stadies on the localisation of
magnezium and calcium ions in mucosal tissue from canine small intestine // Fed.
Proc. – 1965. – V. 24. – P. 588–597.
264. Castro F.O., Limonta J., Rodriguez A., et al. Transgenic rabbits for the
production of biologically-active recombinant proteins in the milk // Genet Anal. –
1999. – V. 15. – N 3–5. – P. 179–187.
265. Chakrabartty P.K., Schneider W.C. Increased activity of rat liver messenger RNA and of albumin messenger RNA modulated by thioacetamide // Cancer Res. – 1978. – V. 38. – N 7. – P. 2043–2047.
266. Chan A.W., Homan E.J., Ballou L.U., et al. Transgenic cattle produced
by reverse-transcribed gene transfer in oocytes // Proc Natl Acad Sci U S A. –
1998. – V. 95. – N 24. – P. 14028–14033.
267. Chan L., Jackson R.L., O'Malley B.W., Means A.R. Synthesis of very
low density lipoproteins in the cockerel. Effects of estrogen // J Clin Invest. –
1976. – V. 58. – N 2. – P. 368–379.
268. Chan L., Bradley W.A., Jackson R.L., Means A.R. Lipoprotein synthesis in the cockerel liver: effects of estrogen on hepatic polysomal messenger ribonucleic acid activities for the major apoproteins in very loow and high density
244
lipoproteins and for albumin and evidence for precursors to these secretory proteins // Endocrinology. – 1980. – V. 106. – N 1. – P. 275–283.
269. Chang K., Qian J., Jiang M., et al. Effective generation of transgenic
pigs and mice by linker based sperm-mediated gene transfer // BMC Biotechnol. –
2002. – V. 2. – P. 5.
270. Chapman M.J., Goldstein S., Laudat M.H. Characterization and comparative aspects of the serum very low and low density lipoproteins and their apoproteins in the chicken (Gallus domesticus) // Biochemistry. – 1977. – V. 16. – N
13. – P. 3006–3015.
271. Chedid A., Nair V. Ontogenesis of cytoplasmic organelles in rat hepatocytes and the effects of prenatal phenobarbital on endoplasmic reticulum development // Dev Biol. – 1974. – V. 39. – N 1. – P. 49–62.
272. Chen D., Osborne D.J. Ribosomal genes and DNA replication in germinating wheat embryos // Nature. – 1970. – V. 225. – N 5230. – P. 336–340.
273. Choi W.S., Kruse S.E., Palmiter R.D., Xia Z. Mitochondrial complex I
inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone,
MPP+, or paraquat // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2008. – V. 105. – N 39. – P.
15136–15141.
274. Christianson T.W., Clayton D.A. A tridecamer DNA sequence supports
human mitochondrial RNA 3'-end formation in vitro // Mol Cell Biol. – 1988. – V.
8. – N 10. – P. 4502–4509.
275. Christmann J.L., Grayson M.J., Huang R.C. Comparative study of hen
yolk phosvitin and plasma vitellogenin // Biochemistry. – 1977. – V. 16. – N 14. –
P. 3250–3256.
276. Chromy V., Fischer J. Photometric determination of total protein in lipemic sera // Clin Chem. – 1977. – V. 23. – N 4. – P. 754–756.
277. Clark A.J., Ali S., Archibald A.L., et al. The molecular manipulation of
milk composition // Genome. – 1989. – V. 31. – N 2. – P. 950–955.
245
278. Clark A.J., Archibald A.L., McClenaghan M., et al. High level expression of biomedical proteins in the milk of transgenic animals // Report for 1990–
1991, Institute of animal physiology and genetics research. / Editors: R.B. Heap,
H.D. Griffin, G. Leng, et al. – Cambridge: Agricultural and food research council,
1992. – P. 53.
279. Clark R.C. The isolation and compsotion of two phosphoproteins from
hen's egg // Biochem J. – 1970. – V. 118. – N 3. – P. 537–542.
280. Contreras L., Satrustegui J. Calcium signaling in brain mitochondria:
interplay of malate aspartate NADH shuttle and calcium uniporter/mitochondrial
dehydrogenase pathways // J Biol Chem. – 2009. – V. 284. – N 11. – P. 7091–
7099.
281. Cosmos E. Intracellular Distribution of Calcium in Developing Breast
Muscle of Normal and Dystrophic Chickens // J Cell Biol. – 1964. – V. 23. – P.
241–252.
282. Costantini F., Lacy E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the
mouse germ line // Nature. – 1981. – V. 294. – N 5836. – P. 92–94.
283. Cox R.F., Haines M.E., Carey N.H. Modification of the template capacity of chick-oviduct chromatin for form-B RNA polymerase by estradiol // Eur J
Biochem. – 1973. – V. 32. – N 3. – P. 513–524.
284. Crawford R.J., Krieg P., Harvey R.P., et al. Histone genes are clustered
with a 15-kilobase repeat in the chicken genome // Nature. – 1979. – V. 279. – N
5709. – P. 132–136.
285. Crimi M., O'Hearn S.F., Wallace D.C., Comi G.P. Molecular research
technologies in mitochondrial diseases: the microarray approach // IUBMB Life. –
2005. – V. 57. – N 12. – P. 811–818.
286. Crittenden L.B. Retroviral elements in the genome of the chicken: implications for poultry genetics and breeding // Crit. Rev. Poultry Biol. – 1991. – V.
3. – P. 73–109.
246
287. Crittenden L.B., Salter D.W. A transgene, alv6, that expresses the envelope of subgroup A avian leukosis virus reduces the rate of congenital transmission
of a field strain of avian leukosis virus // Poult Sci. – 1992. – V. 71. – N 5. – P.
799–806.
288. Czarnecka A.M., Kukwa W., Krawczyk T., et al. Mitochondrial DNA
mutations in cancer--from bench to bedside // Front Biosci. – 2010. – V. 15. – P.
437–460.
289. Dabeva M.D., Petrov P.T., Stoykova A.S., Hadjiolov A.A. Contamination of detergent-purified rat liver nuclei by cytoplasmic ribosomes // Exp Cell
Res. – 1977. – V. 108. – N 2. – P. 467–471.
290. Dabeva M.D., Dudov K.P., Hadjiolov A.A., Stoykova A.S. Quantitative analysis of rat liver nucleolar and nucleoplasmic ribosomal ribonucleic acids //
Biochem J. – 1978. – V. 171. – N 2. – P. 367–374.
291. Damiano M., Galvan L., Deglon N., Brouillet E. Mitochondria in Huntington's disease // Biochim Biophys Acta. – 2010. – V. 1802. – N 1. – P. 52–61.
292. Deeley R.G., Mullinix D.P., Wetekam W., et al. Vitellogenin synthesis
in the avian liver. Vitellogenin is the precursor of the egg yolk phosphoproteins // J
Biol Chem. – 1975. – V. 250. – N 23. – P. 9060–9066.
293. Deeley R.G., Udell D.S., Burns A.T., et al. Kinetics of avian vitellogenin messenger RNA induction. Comparison between primary and secondary
response to estrogen // J Biol Chem. – 1977. – V. 252. – N 22. – P. 7913–7915.
294. Deeley R.G., Gordon J.I., Burns A.T., et al. Primary activation of the
vitellogenin gene in the rooster // J Biol Chem. – 1977. – V. 252. – N 22. – P.
8310–8319.
295. Denton R.M., Randle P.J., Martin B.R. Stimulation by calcium ions of
pyruvate dehydrogenase phosphate phosphatase // Biochem J. – 1972. – V. 128. –
N 1. – P. 161–163.
296. Dierks-Ventling C. Vitellogenin synthesis in isolated hepatocytes //
FEBS Lett. – 1978. – V. 92. – N 1. – P. 109–113.
247
297. Dijkstra J., Touw J., Halsema I., et al. Estradiol-induced synthesis of
vitellogenin. IV. The isolation of non-degraded polysomes from avian liver using
an endogenous ribonuclease inhibitor // Biochim Biophys Acta. – 1978. – V. 521.
– N 1. – P. 363–373.
298. Dimino M.J., Lloyd D.M., Elfont E.A., et al. Studies on oxidative
phosphorylation and steroidogenesis by ovarian mitochondria after gonadotropic
stimulation // Endocrinology. – 1976. – V. 99. – N 5. – P. 1377–1385.
299. Dimino M.J. Effect of hypophysectomy on the functions of ovarian mitochondria of mature rats // Proc Soc Exp Biol Med. – 1977. – V. 156. – N 2. – P.
330–333.
300. Duchler M., Pengg M., Schuller S., et al. Somatic gene transfer into the
lactating ovine mammary gland // J Gene Med. – 2002. – V. 4. – N 3. – P. 282–
291.
301. Dudov K.P., Dabeva M.D., Hadjiolov A.A., Todorov B.N. Processing
and migration of ribosomal ribonculeic acids in the nucleolus and nucleoplasm of
rat liver nuclei // Biochem J. – 1978. – V. 171. – N 2. – P. 375–383.
302. Dyck M.K., Lacroix D., Pothier F., Sirard M.A. Making recombinant
proteins in animals--different systems, different applications // Trends Biotechnol.
– 2003. – V. 21. – N 9. – P. 394–3999.
303. Eeg-Olofsson O., al-Zuhair A.G., Teebi A.S., al-Essa M.M. Abnormal
mitochondria in the Rett syndrome // Brain Dev. – 1988. – V. 10. – N 4. – P. 260–
262.
304. Ellendorff F., Gulyas N., Muhlbauer E., Klein S. Potential use of molecular sex recognition in layer birds // XX World's Poultry Congress. – India,
1996. – V. 4. – P. 3–4.
305. Etches R.J. Transgenic chickens // The poultry industry towards the
21st centry: 10th European Poultry Conference. – Jerusalem, Israel, 1998. – V. 1. –
P. 3–6.
248
306. Fan W., Waymire K.G., Narula N., et al. A mouse model of mitochondrial disease reveals germline selection against severe mtDNA mutations // Science. – 2008. – V. 319. – N 5865. – P. 958–962.
307. Felber B.K., Ryffel G.U., Weber R. Estradiol-induced accumulation of
vitellogenin mRNA and secretion of vitellogenin in liver cultures of Xenopus //
Mol Cell Endocrinol. – 1978. – V. 12. – N 2. – P. 151–166.
308. Fire A. Nucleic acid structure and intracellular immunity: some recent
ideas from the world of RNAi // Q Rev Biophys. – 2005. – V. 38. – N 4. – P. 303–
309.
309. Fisher R.J. Characterization of rat liver mitochondria depleted of inner
membrane components by chloramphenicol treatment of regenerating rat liver //
Arch Biochem Biophys. – 1976. – V. 172. – N 2. – P. 611–617.
310. Fisinin V.I., Karapetyan R.V., Korshunova L.G. Obtaining of transgenic chicken by DNA microinjection in ovum // Eight Baltic Poultry Conference.
– Turku, Finland, 2000. – P. 80.
311. Fletcher M.J., Sanadi D.R. Turnover of rat-liver mitochondria // Biochim Biophys Acta. – 1961. – V. 51. – P. 356–360.
312. Fong W.F., Fuchs M.S. The differential effect of RNA synthesis inhibitors on ecdysterone induced ovarian development in mosquitoes // J Insect Physiol.
– 1976. – V. 22. – N 11. – P. 1493–1499.
313. Fontanesi F., Soto I.C., Horn D., Barrientos A. Assembly of mitochondrial cytochrome c-oxidase, a complicated and highly regulated cellular process //
Am J Physiol Cell Physiol. – 2006. – V. 291. – N 6. – P. 1129–1147.
314. Fontanesi F., Soto I.C., Barrientos A. Cytochrome c oxidase biogenesis: new levels of regulation // IUBMB Life. – 2008. – V. 60. – N 9. – P. 557–568.
315. Francolini M., Lavitrano M., Lamia C.L., et al. Evidence for nuclear internalization of exogenous DNA into mammalian sperm cells // Mol Reprod Dev. –
1993. – V. 34. – N 2. – P. 133–139.
249
316. Freeman B.M., Bumstead N. Transgenic Poultry: theory and practice //
World's Poultry Science Journal. – 1987. – V. 43. – N 3. – P. 180–189.
317. Gagne M.B., Pothier F., Sirard M.A. Electroporation of bovine spermatozoa to carry foreign DNA in oocytes // Mol Reprod Dev. – 1991. – V. 29. – N
1. – P. 6–15.
318. Gall J.G., Pardue M.L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid
molecules in cytological preparations // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1969. – V.
63. – N 2. – P. 378–383.
319. Galvin M.J., McRee D.I., Hall C.A., et al. Humoral and cell-mediated
immune function in adult Japanese Quail following exposure to 2.45-GHz microwave radiation during embryogeny // Bioelectromagnetics. – 1981. – V. 2. – N 3. –
P. 269–278.
320. Gandolfi F. Sperm-mediated transgenesis // Theriogenology. – 2000. –
V. 53. – N 1. – P. 127–137.
321. Gear A.R., Bednarek J.M. Direct counting and sizing of mitochondria
in solution // J Cell Biol. – 1972. – V. 54. – N 2. – P. 325–345.
322. Gear A.R., Albert A.D., Bednarek J.M. The effect of the hypocholesterolemic drug clofibrate on liver mitochondrial biogenesis. A role for neutral mitochondrial proteases // J Biol Chem. – 1974. – V. 249. – N 20. – P. 6495–6504.
323. Gellerich F.N., Gizatullina Z., Trumbeckaite S., et al. The regulation of
OXPHOS by extramitochondrial calcium // Biochim Biophys Acta. – 2010. – V.
1797. – N 6–7. – P. 1018–1027.
324. Georgiev G.P., Ryskov A.P., Coutelle C., et al. On the structure of transcriptional unit in mammalian cells // Biochim Biophys Acta. – 1972. – V. 259. –
N 2. – P. 259–283.
325. Goldblatt P.J., Archer J., Eastwood C. The effect of high and low doses
of cycloheximide on nucleolar ribonucleic acid synthesis // Lab Invest. – 1975. –
V. 33. – N 2. – P. 117–124.
250
326. Gordon J.I., Deeley R.G., Burns A.T., et al. In vitro translation of avian
vitellogenin messenger RNA // J Biol Chem. – 1977. – V. 252. – N 22. – P. 8320–
8327.
327. Gordon J.W., Scangos G.A., Plotkin D.J., et al. Genetic transformation
of mouse embryos by microinjection of purified DNA // Proc Natl Acad Sci U S A.
– 1980. – V. 77. – N 12. – P. 7380–7384.
328. Gordon J.W., Ruddle F.H. Integration and stable germ line transmission
of genes injected into mouse pronuclei // Science. – 1981. – V. 214. – N 4526. – P.
1244–1246.
329. Gorenstein C., Warner J.R. Coordinate regulation of the synthesis of
eukaryotic ribosomal proteins // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1976. – V. 73. – N 5.
– P. 1547–1551.
330. Greengard O., Sentenac A., Mendelsohn N. Phosvitin, the Iron Carrier
of Egg Yolk // Biochim Biophys Acta. – 1964. – V. 90. – P. 406–407.
331. Greengard O., Gordon M., Smith M.A., Acs G. Studies on the Mechanism of Diethylstilbestrol-Induced Formation of Phosphoprotein in Male Chickens
// J Biol Chem. – 1964. – V. 239. – P. 2079–2082.
332. Greengard O., Sentenac A., Acs G. Induced Formation of Phosphoprotein in Tissues of Cockerels in Vivo and in Vitro // J Biol Chem. – 1965. – V. 240.
– P. 1687–1691.
333. Griswold R.L., Pace N. The intracellular distribution of metal ions in
rat liver // Exp Cell Res. – 1956. – V. 11. – N 2. – P. 362–367.
334. Grove D., Nair K.G., Zak R. Biochemical correlates of cardiac hypertrophy. 3. Changes in DNA content; the relative contributions of polyploidy and
mitotic activity // Circ Res. – 1969. – V. 25. – N 4. – P. 463–471.
335. Grover A., Sundharadas G., Talwar G.P. Estrogen action in rooster
liver. Modification of a tRNASer-inactivating activity // Eur J Biochem. – 1979. –
V. 100. – N 2. – P. 477–481.
251
336. Gruber M., Bos E.S., Ab G. Hormonal control of vitellogenin synthesis
in avian liver // Mol Cell Endocrinol. – 1976. – V. 5. – N 1–2. – P. 41–50.
337. Gschwendt M., Kittstein W. Specific binding of estradiol to the liver
chromatin of estrogenized roosters // Biochim Biophys Acta. – 1974. – V. 361. – N
1. – P. 84–96.
338. Gustafsson R., Tata J.R., Lindberg O., Ernster L. The relationship between the structure and activity of rat skeletal muscle mitochondria after thyroidectomy and thyroid hormone treatment // J Cell Biol. – 1965. – V. 26. – N 2. – P.
555–578.
339. Guy A.L., Taylor J.H. Actinomycin D inhibits initiation of DNA replication in mammalian cells // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1978. – V. 75. – N 12. –
P. 6088–6092.
340. Hadjiolov A.A., Cox R.A., Huvos P. The presence of a high-molecularweight (guanine-plus-cytosine)-rich segment at the 3' end of rabbit 28S ribosomal
ribonucleic acid // Biochem J. – 1975. – V. 147. – N 3. – P. 625–628.
341. Hadjiolov A.A., Nikolaev N. Maturation of ribosomal ribonucleic acids
and the biogenesis of ribosomes // Prog Biophys Mol Biol. – 1976. – V. 31. – N 2.
– P. 95–144.
342. Haller O., Acklin M., Staeheli P. Genetic resistance to influenza virus
in wild mice // Curr Top Microbiol Immunol. – 1986. – V. 127. – P. 331–337.
343. Halperin M.L., Robinson B.H., Fritz I.B. Effects of palmitoyl CoA on
citrate and malate transport by rat liver mitochondria // Proc Natl Acad Sci U S A.
– 1972. – V. 69. – N 4. – P. 1003–1007.
344. Hammer R.E., Pursel V.G., Rexroad C.E., Jr., et al. Production of
transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection // Nature. – 1985. – V. 315. –
N 6021. – P. 680–683.
345. Hansford R.G., Chappell J.B. The effect of Ca2+ on the oxidation of
glycerol phosphate by blowfly flight-muscle mitochondria // Biochem Biophys Res
Commun. – 1967. – V. 27. – N 6. – P. 686–692.
252
346. Harel-Markowitz E., Gurevich M., Shore L.S., et al. Use of sperm
plasmid DNA lipofection combined with REMI (restriction enzyme-mediated insertion) for production of transgenic chickens expressing eGFP (enhanced green
fluorescent protein) or human follicle-stimulating hormone // Biol Reprod. – 2009.
– V. 80. – N 5. – P. 1046–1052.
347. Harvey A.J., Ivarie R. Validating the hen as a bioreactor for the production of exogenous proteins in egg white // Poult Sci. – 2003. – V. 82. – N 6. – P.
927–930.
348. Havenstain G.B., Crittenden L.B., Petitte J.N., et al. Application of biotechnology in the poultry industry // Animal Biotechnology. – 1992. – V. 3. – N 1.
– P. 15–36.
349. Henderson A.S., Eicher E.M., Yu M.T., Atwood K.C. Variation in ribosomal RNA gene number in mouse chromosomes // Cytogenet Cell Genet. –
1976. – V. 17. – N 6. – P. 307–316.
350. Henderson L.M., Bruere A.N. Association of nucleolus organizer
chromosomes in domestic sheep (Ovis aries) shown by silver staining // Cytogenet
Cell Genet. – 1977. – V. 19. – N 6. – P. 326–334.
351. Hibbs R.G. Electron microscopy of developing cardiac muscle in chick
embryos // Am J Anat. – 1956. – V. 99. – N 1. – P. 17–51.
352. Higashi K., Hanasaki N., Nakanishi A., et al. Difference in susceptibility to sonication of chromatins containing transcriptionally active and inactive ribosomal genes // Biochim Biophys Acta. – 1978. – V. 520. – N 3. – P. 612–622.
353. Ho S.Y., Gilbert M.T. Ancient mitogenomics // Mitochondrion. – 2010.
– V. 10. – N 1. – P. 1–11.
354. Hoefer M., Kleinzeller A. Calcium Transport in Slices of Rabbit Kidney Cortex: The Loss of Calcium from Ca-Enriched Slices // Physiol Bohemoslov.
– 1963. – V. 12. – P. 425–434.
253
355. Hoefer M., Kleinzeller A. Calcium Transport in Slices of Rabbit Kidney Cortex: The Steady-State Compartmentation of Ca and Rate Constants of 45ca
Efflux // Physiol Bohemoslov. – 1963. – V. 12. – P. 417–424.
356. Hoefer M., Kleinzeller A. Calcium Transport in Slices of Rabbit Kidney Cortex: The Uptake and Distribution of Calcium // Physiol Bohemoslov. –
1963. – V. 12. – P. 405–416.
357. Hofgartner F.J., Krone W., Jain K. Correlated inhibition of ribosomal
RNA synthesis and silver staining by actinomycin D // Hum Genet. – 1979. – V.
47. – N 3. – P. 329–333.
358. Hogeboom G.H., Schneider W.C., Pallade G.E. Cytochemical studies
of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material // J
Biol Chem. – 1948. – V. 172. – N 2. – P. 619–635.
359. Hohman W., Schraer H. The intracellular distribution of calcium in the
mucosa of the avian shell gland // J Cell Biol. – 1966. – V. 30. – N 2. – P. 317–
331.
360. Holt I.J., Harding A.E., Morgan-Hughes J.A. Mitochondrial DNA
polymorphism in mitochondrial myopathy // Hum Genet. – 1988. – V. 79. – N 1. –
P. 53–57.
361. Howell W.M. Visualization of ribosomal gene activity: silver stains
proteins associated with rRNA transcribed from oocyte chromosomes // Chromosoma. – 1977. – V. 62. – N 4. – P. 361–367.
362. Howland J.L., Challberg M.D. Altered respiration and proton permeability in liver mitochondria from genetically dystrophic mice // Biochem Biophys
Res Commun. – 1973. – V. 50. – N 2. – P. 574–580.
363. Huszar D., Balling R., Kothary R., et al. Insertion of a bacterial gene
into the mouse germ line using an infectious retrovirus vector // Proc Natl Acad Sci
U S A. – 1985. – V. 82. – N 24. – P. 8587–8591.
254
364. Iapalucci-Espinoza S., Franze-Fernandez M.T. Effect of protein synthesis inhibitors and low concentrations of actinomycin D on ribosomal RNA synthesis // FEBS Lett. – 1979. – V. 107. – N 2. – P. 281–284.
365. Ivarie R. Avian transgenesis: progress towards the promise // Trends
Biotechnol. – 2003. – V. 21. – N 1. – P. 14–19.
366. Ivarie R. Competitive bioreactor hens on the horizon // Trends Biotechnol. – 2006. – V. 24. – N 3. – P. 99–101.
367. Jacob S.T., Sajdel E.M., Munro H.N. Specific action of alpha-amanitin
on mammalian RNA polymerase protein // Nature. – 1970. – V. 225. – N 5227. –
P. 60–62.
368. Jacobson B.E., Blanchaer M.C., Wrogemann K. Defective respiration
and oxidative phosphorylation in muscle mitochondria of hamsters in the late
stages of hereditary muscular dystrophy // Can J Biochem. – 1970. – V. 48. – N 9.
– P. 1037–1042.
369. Jaenisch R., Mintz B. Simian virus 40 DNA sequences in DNA of
healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral
DNA // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1974. – V. 71. – N 4. – P. 1250–1254.
370. Jaenisch R. Germ line integration and Mendelian transmission of the
exogenous Moloney leukemia virus // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1976. – V. 73.
– N 4. – P. 1260–1264.
371. Jailkhani B.L., Talwar G.P. The role of estrogens in differentiation and
growth of target tissues // Adv Sex Horm Res. – 1975. – V. 1. – P. 359–395.
372. Janan J., Rudas P., Bartha T., Ludrovszky F. Serum concentrations of
thyroid hormones during egg laying in two types of Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) // Arch Vet Pol. – 1994. – V. 34. – N 3–4. – P. 249–260.
373. Jeurissen S.H., Janse E.M. The use of chicken-specific antibodies in
veterinary research involving three other avian species // Vet Q. – 1998. – V. 20. –
N 4. – P. 140–143.
255
374. Johnson L.K., Johnson R.W., Strehler B.L. Cardiac hypertrophy, aging
and changes in cardiac ribosomal RNA gene dosage in man // J Mol Cell Cardiol. –
1975. – V. 7. – N 2. – P. 125–133.
375. Johnson R., Strehler B.L. Loss of genes coding for ribosomal RNA in
ageing brain cells // Nature. – 1972. – V. 240. – N 5381. – P. 412–414.
376. Jones D.H., Rosano T.G. Studies of mitochondrial development prior to
lactogenesis in the mouse mammary gland // Arch Biochem Biophys. – 1972. – V.
153. – N 1. – P. 130–138.
377. Joss U., Bassand C., Dierks-Ventling C. Rapid appearance of estrogen
receptor in chick liver nuclei: partial inhibition by cycloheximide // FEBS Lett. –
1976. – V. 66. – N 2. – P. 293–298.
378. Jost J.P., Keller R., Dierks-Ventling C. Deoxyribonucleic acid and ribonucleic acid synthesis during phosvitin induction by 17beta-estradiol in immature chicks // J Biol Chem. – 1973. – V. 248. – N 15. – P. 5262–5266.
379. Jost J.P., Pehling G., Baca O.G. Rate of synthesis of beta L-lipovitellin
in the liver of immature chicks treated with 17beta estradiol // Biochem Biophys
Res Commun. – 1975. – V. 62. – N 4. – P. 957–965.
380. Jost J.P., Pehling G. Immunochemical isolation and characterization of
vitellogenin mRNA from liver of estradiol-treated chicks // Eur J Biochem. – 1976.
– V. 66. – N 2. – P. 339–346.
381. Jost J.P., Pehling G. Organization of vitellogenin polysomes, size of the
mRNA and polyadenylate fragment // Eur J Biochem. – 1976. – V. 62. – N 2. – P.
299–306.
382. Jost J.P., Pehling G., Ohno T., Cozens P. Identification of a large precursor of vitellogenin mRNA in the liver of estradiol-treated chicks // Nucleic Acids Res. – 1978. – V. 5. – N 12. – P. 4781–4793.
383. Kadenbach B. Synthesis of mitochondrial proteins. The synthesis of cytochrome c in vitro // Biochim Biophys Acta. – 1967. – V. 138. – N 3. – P. 651–
654.
256
384. Kadenbach B. Incorporation of 32P-phosphate into phosphatides of rat
liver mitochondria in vivo and in vitro // FEBS Lett. – 1968. – V. 2. – N 2. – P.
118–120.
385. Kai C., Yoshikawa Y., Yamanouchi K., et al. Ontogeny of the third
component of complement of Japanese quails // Immunology. – 1985. – V. 54. – N
3. – P. 463–470.
386. Kamenski P., Smirnova E., Kolesnikova O., et al. tRNA mitochondrial
import in yeast: Mapping of the import determinants in the carrier protein, the precursor of mitochondrial lysyl-tRNA synthetase // Mitochondrion. – 2010. – V. 10.
– N 3. – P. 284–293.
387. Kanerva P.A., Maenpaa P.H. Codon-specific serine transfer ribonucleic
acid degradation in avian liver during vitellogenin induction // Acta Chem Scand
B. – 1981. – V. 35. – N 5. – P. 379–385.
388. Karapetyan R.V., Korshunova L.G., Fisinin V.I. Production of transgenic chicken by DNA microinjection in ovum // The poultry industry towards the
21st century: 10th European Poultry Conference. – Jerusalem, Israel, 1998. – V. 1.
– P. 227–229.
389. Kasupski G.J., Mukherjee B.B. Effects of controlled exposure of L
cells to bromodeoxyuridine (BUdR). I. Evidence for ordered gene replication during S phase // Exp Cell Res. – 1977. – V. 106. – N 2. – P. 327–338.
390. Kasupski G.J., Mukherjee B.B. Effects of controlled exposure of L
cells to bromodeoxyuridine. II. Turnover rates and activity profiles during cell cycle of bromodeoxyuridine-sensitive and -resistant enzymes // Exp Cell Res. – 1977.
– V. 108. – N 2. – P. 393–401.
391. Kay J.E., Cooper H.L. Differential inhibition of 28S and 18S ribosomal
RNA synthesis by actinomycin // Biochem Biophys Res Commun. – 1969. – V.
35. – N 4. – P. 526–530.
257
392. Kay J.E., Leventhal B.G., Cooper H.L. Effects of inhibition of ribosomal RNA synthesis on the stimulation of lymphocytes by phytohaemagglutinin //
Exp Cell Res. – 1969. – V. 54. – N 1. – P. 94–100.
393. Kedes L.H. Histone messengers and histone genes // Cell. – 1976. – V.
8. – N 3. – P. 321–331.
394. Kedinger C., Gniazdowski M., Mandel J.L.J., et al. Alpha-amanitin: a
specific inhibitor of one of two DNA-pendent RNA polymerase activities from calf
thymus // Biochem Biophys Res Commun. – 1970. – V. 38. – N 1. – P. 165–171.
395. Kessel R.G. Some observations on the ultrastructure of the oocyte of
Thyone briareus with special reference to the relationship of the Golgi complex
and endoplasmic reticulum in the formation of yolk // J Ultrastruct Res. – 1966. –
V. 16. – N 3. – P. 305–319.
396. Khoo H.W. Sperm-mediated gene transfer studies on zebrafish in Singapore // Mol Reprod Dev. – 2000. – V. 56. – N 2 Suppl. – P. 278–280.
397. Kistler A., Weber R. Enzyme patterns in mitochondria of eggs, liver,
and skeletal muscle during larval development of Xenopus // Dev Biol. – 1974. –
V. 37. – N 2. – P. 236–247.
398. Koo B.C., Kwon M.S., Choi B.R., et al. Production of germline transgenic chickens expressing enhanced green fluorescent protein using a MoMLVbased retrovirus vector // FASEB J. – 2006. – V. 20. – N 13. – P. 2251–2260.
399. Kruse S.E., Watt W.C., Marcinek D.J., et al. Mice with mitochondrial
complex I deficiency develop a fatal encephalomyopathy // Cell Metab. – 2008. –
V. 7. – N 4. – P. 312–320.
400. Kumar A., Subramanian A.R. Ribosome assembly in HeLa cells: labeling pattern of ribosomal proteins by two-dimensional resolution // J Mol Biol. –
1975. – V. 94. – N 3. – P. 409–423.
401. Kurup C.K., Aithal H.N., Ramasarma T. Increase of hepatic mitochondria on administration of ethyl alpha-p-chlorophenoxyisobutyrate to the rat // Biochem J. – 1970. – V. 116. – N 5. – P. 773–779.
258
402. Kuylenstierna B., Nicholls D.G., Hovmoller S., Ernster L. Effect of
trypsin on mitochondrial and microsomal enzymes // Eur J Biochem. – 1970. – V.
12. – N 3. – P. 419–426.
403. Kwon M.S., Koo B.C., Choi B.R., et al. Generation of transgenic
chickens that produce bioactive human granulocyte-colony stimulating factor //
Mol Reprod Dev. – 2008. – V. 75. – N 7. – P. 1120–1126.
404. Lampert A., Feigelson P. A short lived polypeptide component of one
of two discrete functional pools of hepatic nuclear alpha-amanitin resistant RNA
polymerases // Biochem Biophys Res Commun. – 1974. – V. 58. – N 4. – P. 1030–
1038.
405. LaNoue K.F., Tischler M.E. Electrogenic characteristics of the mitochondrial glutamate-aspartate antiporter // J Biol Chem. – 1974. – V. 249. – N 23.
– P. 7522–7528.
406. LaNoue K.F., Bryla J., Bassett D.J. Energy-driven aspartate efflux from
heart and liver mitochondria // J Biol Chem. – 1974. – V. 249. – N 23. – P. 7514–
7521.
407. Lastick S.M., McConkey E.H. Exchange and stability of HeLa ribosomal proteins in vivo // J Biol Chem. – 1976. – V. 251. – N 10. – P. 2867–2875.
408. Lavitrano M., Camaioni A., Fazio V.M., et al. Sperm cells as vectors
for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice // Cell. –
1989. – V. 57. – N 5. – P. 717–723.
409. Lavitrano M., French D., Zani M., et al. The interaction between exogenous DNA and sperm cells // Mol Reprod Dev. – 1992. – V. 31. – N 3. – P.
161–169.
410. Lavitrano M., Forni M., Varzi V., et al. Sperm-mediated gene transfer:
production of pigs transgenic for a human regulator of complement activation //
Transplant Proc. – 1997. – V. 29. – N 8. – P. 3508–3509.
411. Lavitrano M., Bacci M.L., Forni M., et al. Efficient production by
sperm-mediated gene transfer of human decay accelerating factor (hDAF) trans-
259
genic pigs for xenotransplantation // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2002. – V. 99. –
N 22. – P. 14230–14305.
412. Lavitrano M., Forni M., Bacci M.L., et al. Sperm mediated gene transfer in pig: Selection of donor boars and optimization of DNA uptake // Mol Reprod
Dev. – 2003. – V. 64. – N 3. – P. 284–291.
413. Lazarow P.B., De Duve C. A fatty acyl-CoA oxidizing system in rat
liver peroxisomes; enhancement by clofibrate, a hypolipidemic drug // Proc Natl
Acad Sci U S A. – 1976. – V. 73. – N 6. – P. 2043–2046.
414. Lazier C. (3H)-estradiol binding by chick liver nuclear extracts:
mechanism of increase in binding following estradiol injection // Steroids. – 1975.
– V. 26. – N 3. – P. 281–298.
415. Lazier C.B. Ontogeny of the vitellogenic response to oestradiol and of
the soluble nuclear oestrogen receptor in embryonic-chick liver // Biochem J. –
1978. – V. 174. – N 1. – P. 143–152.
416. Lee J., Schriner S.E., Wallace D.C. Adenine nucleotide translocator 1
deficiency increases resistance of mouse brain and neurons to excitotoxic insults //
Biochim Biophys Acta. – 2009. – V. 1787. – N 5. – P. 364–370.
417. Lehninger A.L. A soluble, heat-labile, high-affinity Ca2 plus-binding
factor extracted from rat liver mitochondria // Biochem Biophys Res Commun. –
1971. – V. 42. – N 2. – P. 312–318.
418. Leighton P.A., van de Lavoir M.C., Diamond J.H., et al. Genetic modification of primordial germ cells by gene trapping, gene targeting, and phiC31 integrase // Mol Reprod Dev. – 2008. – V. 75. – N 7. – P. 1163–1175.
419. Leonard T.B., Jacob S.T. Alterations in DNA-dependent RNA polymerase I and II from rat liver by thioacetamide: preferential increase in the level of
chromatin-associated nucleolar RNA polymerase IB // Biochemistry. – 1977. – V.
16. – N 20. – P. 4538–4544.
420. Lewis J.A., Clemens M.J., Tata J.R. Morphological and biochemical
changes in the hepatic endoplasmic reticulum and golgi apparatus of male Xenopus
260
laevis after induction of egg-yolk protein synthesis by oestradiol-17 beta // Mol
Cell Endocrinol. – 1976. – V. 4. – N 5. – P. 311–329.
421. Lillico S.G., McGrew M.J., Sherman A., Sang H.M. Transgenic chickens as bioreactors for protein-based drugs // Drug Discov Today. – 2005. – V. 10. –
N 3. – P. 191–196.
422. Lillico S.G., Sherman A., McGrew M.J., et al. Oviduct-specific expression of two therapeutic proteins in transgenic hens // Proc Natl Acad Sci U S A. –
2007. – V. 104. – N 6. – P. 1771–1776.
423. Lindberg U., Persson T. Isolation of mRNA from KB-cells by affinity
chromatography on polyuridylic acid covalently linked to Sepharose // Eur J Biochem. – 1972. – V. 31. – N 2. – P. 246–254.
424. Lindell T.J., Weinberg F., Morris P.W., et al. Specific inhibition of nuclear RNA polymerase II by alpha-amanitin // Science. – 1970. – V. 170. – N 956.
– P. 447–449.
425. Lindell T.J. Inhibition of eukaryotic DNA-dependent RNA polymerase
release from isolated nuclei and nucleoli by phenylmethylsulfonylfluoride // Arch
Biochem Biophys. – 1975. – V. 171. – N 1. – P. 268–275.
426. Lindell T.J. Evidence for an extranucleolar mechanism of actinomycin
D action // Nature. – 1976. – V. 263. – N 5575. – P. 347–350.
427. Lindell T.J., O'Malley A.F., Puglisi B. Inhibition of nucleoplasmic
transcription and the translation of rapidly labeled nuclear proteins by low concentrations of actinomycin D in vivo. Proposed role of messenger RNA in ribosomal
RNA transcription // Biochemistry. – 1978. – V. 17. – N 7. – P. 1154–1160.
428. Loeb L.A., Wallace D.C., Martin G.M. The mitochondrial theory of aging and its relationship to reactive oxygen species damage and somatic mtDNA
mutations // Proc Natl Acad Sci U S A. – 2005. – V. 102. – N 52. – P. 18769–
18770.
429. Loening U.E. Molecular weights of ribosomal RNA in relation to evolution // J Mol Biol. – 1968. – V. 38. – N 3. – P. 355–365.
261
430. Lotscher H.R., Winterhalter K.H., Carafoli E., Richter C. The energystate of mitochondria during the transport of Ca2+ // Eur J Biochem. – 1980. – V.
110. – N 1. – P. 211–216.
431. Love J., Gribbin C., Mather C., Sang H. Transgenic birds by DNA
microinjection // Biotechnology (N Y). – 1994. – V. 12. – N 1. – P. 60–63.
432. Luck D.J. Formation of mitochondria in Neurospora crassa. A quantitative radioautographic study // J Cell Biol. – 1963. – V. 16. – P. 483–499.
433. Luck D.N., Hamilton T.H. Early estrogen action: stimulation of the metabolism of high molecular weight and ribosomal RNAs (estradiol-17 -RNA isolation-uterus-ribosomal RNA precursors-actinomycin D) // Proc Natl Acad Sci U S
A. – 1972. – V. 69. – N 1. – P. 157–161.
434. Lyamzaev K.G., Pletjushkina O.Y., Saprunova V.B., et al. Selective
elimination of mitochondria from living cells induced by inhibitors of bioenergetic
functions // Biochem Soc Trans. – 2004. – V. 32. – N Pt 6. – P. 1070–1071.
435. Lykkesfeldt A.E., Andersen H.A. Preferential inhibition of rDNA transcription by 5-bromodeoxyuridine // J Cell Sci. – 1977. – V. 25. – P. 95–102.
436. Ma Y., Bai R.K., Trieu R., Wong L.J. Mitochondrial dysfunction in
human breast cancer cells and their transmitochondrial cybrids // Biochim Biophys
Acta. – 2010. – V. 1797. – N 1. – P. 29–37.
437. Mackerer C.R., Haettinger J.R. Further studies concerning the effects of
clofibrate on respiration and oxidative phosphorylation of rat liver mitochondria //
Biochem Pharmacol. – 1974. – V. 23. – N 23. – P. 3331–3345.
438. Mackerer C.R. Effect of sub-acute administration of clofibrate on the
oxidation of fatty acids by liver mitochondria // Biochem Pharmacol. – 1977. – V.
26. – N 23. – P. 2225–2230.
439. Mackler B., Grace R., Duncan H.M. Studies of mitochondrial development during embryogenesis in the rat // Arch Biochem Biophys. – 1971. – V.
144. – N 2. – P. 603–610.
262
440. Maden B.E., Salim M. The methylated nucleotide sequences in HELA
cell ribosomal RNA and its precursors // J Mol Biol. – 1974. – V. 88. – N 1. – P.
133–152.
441. Maenpaa P.H., Bernfield M.R. A specific hepatic transfer RNA for
phosphoserine // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1970. – V. 67. – N 2. – P. 688–695.
442. Maenpaa P.H. Seryl transfer RNA alterations during estrogen-induced
phosvitin synthesis. Quantitative assay of the hormone-responding species by ribosomal binding // Biochem Biophys Res Commun. – 1972. – V. 47. – N 4. – P.
971–974.
443. Maenpaa P.H. Vitellogenin synthesis in rooster liver: changes in liver
polyribosomes in relation to the activation of nucleolar RNA polymerase and vitellogenin synthesis // Biochem Biophys Res Commun. – 1976. – V. 72. – N 1. – P.
347–354.
444. Mager W.H., Retel J., Planta R.J., et al. Transcriptional units for ribosomal proteins in yeast // Eur J Biochem. – 1977. – V. 78. – N 2. – P. 575–583.
445. Maione B., Pittoggi C., Achene L., et al. Activation of endogenous nucleases in mature sperm cells upon interaction with exogenous DNA // DNA Cell
Biol. – 1997. – V. 16. – N 9. – P. 1087–1097.
446. Maione B., Lavitrano M., Spadafora C., Kiessling A.A. Spermmediated gene transfer in mice // Mol Reprod Dev. – 1998. – V. 50. – N 4. – P.
406–409.
447. Mansour A.M., Nass S. RNA synthesis in rat liver after cortisol treatment: a possible mitochondrial-nuclear relationship // Acta Endocrinol (Copenh). –
1974. – V. 77. – N 2. – P. 298–309.
448. Margulis L. Recombination of non-chromosomal genes in Chlamydomonas: assortment of mitochondria and chloroplasts? // J Theor Biol. – 1970. – V.
26. – N 2. – P. 337–342.
449. Margulis L. Symbiosis and evolution // Sci Am. – 1971. – V. 225. – N
2. – P. 48–57.
263
450. Margulis L. Symbiotic theory of the origin of eukaryotic organelles;
criteria for proof // Symp Soc Exp Biol. – 1975. – N 29. – P. 21–38.
451. Margulis L. Words as battle cries--symbiogenesis and the new field of
endocytobiology // Bioscience. – 1990. – V. 40. – N 9. – P. 673–677.
452. Markaki M., Drabek D., Livadaras I., et al. Stable expression of human
growth hormone over 50 generations in transgenic insect larvae // Transgenic Res.
– 2007. – V. 16. – N 1. – P. 99–107.
453. Marmol P., Pardo B., Wiederkehr A., et al. Requirement for aralar and
its Ca2+-binding sites in Ca2+ signal transduction in mitochondria from INS-1
clonal beta-cells // J Biol Chem. – 2009. – V. 284. – N 1. – P. 515–524.
454. Mason T.L., Schatz G. Cytochrome c oxidase from bakers' yeast. II.
Site of translation of the protein components // J Biol Chem. – 1973. – V. 248. – N
4. – P. 1355–1360.
455. Mather C. Transgenic chicken by DNA microinjection // Poultry International. – 1994. – V. 33. – N 6. – P. 16–18.
456. Mather C., Love J., Gribbin C., Sang H.M. Transgenic chicken by
microinjected DNA // International Hatchery Practice. – 1994. – V. 8. – N 5. – P.
29–29.
457. Max S.R. Disuse atrophy of skeletal muscle: loss of functional activity
of mitochondria // Biochem Biophys Res Commun. – 1972. – V. 46. – N 3. – P.
1394–1398.
458. Meade H., Gates L., Lacy E., Lonberg N. Bovine alpha S1-casein gene
sequences direct high level expression of active human urokinase in mouse milk //
Biotechnology (N Y). – 1990. – V. 8. – N 5. – P. 443–446.
459. Meli J., Bygrave F.L. The role of mitochondria in modifying calciumsensitive cytoplasmic metabolic activities. Modification of pyruvate kinase activity
// Biochem J. – 1972. – V. 128. – N 2. – P. 415–420.
460. Mello C.C., Conte D.J. Revealing the world of RNA interference // Nature. – 2004. – V. 431. – N 7006. – P. 338–342.
264
461. Michel F., Pons M., Descomps B., Crastes de Paulet A. Affinity labelling of the estrogen binding site of glutamate dehydrogenase with iodoacetyldiethylstilbestrol. Selective alkylation of cysteine-89 // Eur J Biochem. – 1978. – V.
84. – N 1. – P. 267–274.
462. Michel F., Pons M., Julliard J., et al. Enzymic hydrolysis of 3-acetylestrogens or analogues by glutamate dehydrogenase with specific acylation of the
estrogen binding site // Eur J Biochem. – 1978. – V. 84. – N 1. – P. 275–283.
463. Miller L., Knowland J. The number and activity of ribosomal RNA
genes in Xenopus laevis embryos carrying partial deletions in both nucleolar organizers // Biochem Genet. – 1972. – V. 6. – N 1. – P. 65–73.
464. Miller O.L., Jr., Hamkalo B.A. Visualization of RNA synthesis on
chromosomes // Int Rev Cytol. – 1972. – V. 33. – P. 1–25.
465. Milner J. The functional development of mammalian mitochondria //
Biol Rev Camb Philos Soc. – 1976. – V. 51. – N 2. – P. 181–209.
466. Mintz B. Malignancy vs. normal differentiation of stem cells as analyzed in genetically mosaic animals // Adv Pathobiol. – 1977. – N 6. – P. 153–157.
467. Mintz B. Teratocarcinoma cells as vehicles for mutant and foreign
genes // Brookhaven Symp Biol. – 1977. – N 29. – P. 82–95.
468. Mishmar D., Ruiz-Pesini E., Mondragon-Palomino M., et al. Adaptive
selection of mitochondrial complex I subunits during primate radiation // Gene. –
2006. – V. 378. – P. 11–18.
469. Mita S., Monnat R.J.J., Loeb L.A. Direct selection of mutations in the
human mitochondrial tRNAThr gene: reversion of an 'uncloneable' phenotype //
Mutat Res. – 1988. – V. 199. – N 1. – P. 183–190.
470. Mita S., Monnat R.J., Jr., Loeb L.A. Resistance of HeLa cell mitochondrial DNA to mutagenesis by chemical carcinogens // Cancer Res. – 1988. – V. 48.
– N 16. – P. 4578–4583.
265
471. Mokhova E.N., Khailova L.S. Involvement of mitochondrial inner
membrane anion carriers in the uncoupling effect of fatty acids // Biochemistry
(Mosc). – 2005. – V. 70. – N 2. – P. 159–163.
472. Morgan G.W. Hemagglutinin responses in Japanese quail treated with
exogenous adrenocorticotrophin // Poult Sci. – 1981. – V. 60. – N 5. – P. 1071–
1074.
473. Morley C.G., Boyer J.L. Stimulation of hepatocellular proliferation by
a serum factor from thioacetamide-treated rats // Biochim Biophys Acta. – 1977. –
V. 477. – N 2. – P. 165–176.
474. Mullinix K.P., Wetekam W., Deeley R.G., et al. Induction of vitellogenin synthesis by estrogen in avian liver: relationship between level of vitellogenin mRNA and vitellogenin synthesis // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1976. –
V. 73. – N 5. – P. 1442–1446.
475. Naito M. Genetic improvement of chickens by direct gene transfer //
XX World's Poultry Congress. – India, 1996. – V. 1. – P. 341–353.
476. Naito M., Kuwana T. Production of chimeric chickens // Methods Mol
Biol. – 2004. – V. 254. – P. 245–254.
477. Nakada T., Koja Z., Tokashiki S. Influence of ovulation and gonadal
hormones on shell formation in the domestic fowl // Japanese Poultry Science. –
1976. – V. 13. – N 5. – P. 169–175.
478. Nakanishi A., Iritani A. Gene transfer in the chicken by spermmediated methods // Mol Reprod Dev. – 1993. – V. 36. – N 2. – P. 258–261.
479. Nancarrow C.D., Shanahan C.M., Dixon R.J., et al. Growth hormone
expression and effects in transgenic sheep // Biotechnology in growth regulation. /
Editors: R.B. Heap, C.G. Prosser, G.E. Lamming. – London: Butterworths, 1989. –
P. 265.
480. Nass M.M., Nass S. Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics. I. Fixation and Electron Staining Reactions // J Cell Biol. – 1963. – V. 19. – P.
593–611.
266
481. Nass M.M. The circularity of mitochondrial DNA // Proc Natl Acad Sci
U S A. – 1966. – V. 56. – N 4. – P. 1215–1222.
482. Nass M.M. Mitochondrial DNA. I. Intramitochondrial distribution and
structural relations of single- and double-length circular DNA // J Mol Biol. –
1969. – V. 42. – N 3. – P. 521–528.
483. Nass M.M. Mitochondrial DNA. II. Structure and physicochemical
properties of isolated DNA // J Mol Biol. – 1969. – V. 42. – N 3. – P. 529–545.
484. Nass M.M. Mitochondrial DNA: Advances, Problems, and Goals //
Science. – 1969. – V. 165. – N 3888. – P. 25–35.
485. Nass S., Nass M.M. Intramitochondrial Fibers with DNA Characteristics. Ii. Enzymatic and Other Hydrolytic Treatments // J Cell Biol. – 1963. – V. 19.
– P. 613–629.
486. Neubert D. [Comparative studies on the nucleic acid synthesis in cell
nuclei and mitochondria and their control by drugs] // Naunyn Schmiedebergs
Arch Exp Pathol Pharmakol. – 1966. – V. 253. – N 1. – P. 152–176.
487. Notarianni E., Laurie S., Moor R.M., Evans M.J. Maintenance and differentiation in culture of pluripotential embryonic cell lines from pig blastocysts //
J Reprod Fertil Suppl. – 1990. – V. 41. – P. 51–56.
488. Novak S., Smith T.A., Paradis F., et al. Biomarkers of in vivo fertility
in sperm and seminal plasma of fertile stallions // Theriogenology. – 2010. – V. 74.
– N 6. – P. 956–967.
489. Novi A.M., Baserga R. Correlation between synthesis of ribosomal
RNA and stimulation of DNA synthesis in mouse salivary glands // Lab Invest. –
1972. – V. 26. – N 5. – P. 540–547.
490. Numa S. Regulation of fatty-acid synthesis in higher animals // Ergeb
Physiol. – 1974. – V. 69. – N 0. – P. 54–96.
491. Numa S., Yamashita S. Regulation of lipogenesis in animal tissues //
Curr Top Cell Regul. – 1974. – V. 8. – N 0. – P. 197–246.
267
492. Ogata E., Kondo K., Kimura S., Yoshitoshi Y. Dependency on Ca++ of
ATP-stimulated uncoupled oxidation of succinate in rat lier mitochondria // Biochem Biophys Res Commun. – 1972. – V. 46. – N 2. – P. 640–645.
493. Ohlendorf D.H., Barbarash G.R., Trout A., et al. Lipid and polypeptide
components of the crystalline yolk system from Xenopus laevis // J Biol Chem. –
1977. – V. 252. – N 22. – P. 7992–8001.
494. Ojala D., Attardi G. Expression of the mitochondrial genome in HeLa
cells. XIX. Occurrence in mitochondria of polyadenylic acid sequences, "free" and
covalently linked to mitochondrial DNA-coded RNA // J Mol Biol. – 1974. – V.
82. – N 2. – P. 151–174.
495. Okada G., Sawai Y., Teraoka H., Tsukada K. Differential effects of dimethylsulfoxide on S-adenosylmethionine synthetase from rat liver and hepatoma
// FEBS Lett. – 1979. – V. 106. – N 1. – P. 25–28.
496. Oliveira M.T., Da Rosa A.C., Azeredo-Espin A.M., Lessinger A.C. Improving access to the control region and tRNA gene clusters of dipteran mitochondrial DNA // J Med Entomol. – 2006. – V. 43. – N 3. – P. 636–639.
497. Oliveira M.T., Azeredo-Espin A.M., Lessinger A.C. The mitochondrial
DNA control region of Muscidae flies: evolution and structural conservation in a
dipteran context // J Mol Evol. – 2007. – V. 64. – N 5. – P. 519–527.
498. Oliveira M.T., Barau J.G., Junqueira A.C., et al. Structure and evolution of the mitochondrial genomes of Haematobia irritans and Stomoxys calcitrans:
the Muscidae (Diptera: Calyptratae) perspective // Mol Phylogenet Evol. – 2008. –
V. 48. – N 3. – P. 850–857.
499. Oliveira M.T., Kaguni L.S. Comparative purification strategies for
Drosophila and human mitochondrial DNA replication proteins: DNA polymerase
gamma and mitochondrial single-stranded DNA-binding protein // Methods Mol
Biol. – 2009. – V. 554. – P. 37–58.
268
500. Oliveira M.T., Garesse R., Kaguni L.S. Animal models of mitochondrial DNA transactions in disease and ageing // Exp Gerontol. – 2010. – V. 45. – N
7–8. – P. 489–502.
501. Paget G.E. Experimental Studies of the Toxicity of Atromid with Particular Reference to Fine Structural Changes in the Livers of Rodents // J Atheroscler Res. – 1963. – V. 3. – P. 729–736.
502. Palmiter R.D. Magnesium precipitation of ribonucleoprotein complexes. Expedient techniques for the isolation of undergraded polysomes and messenger ribonucleic acid // Biochemistry. – 1974. – V. 13. – N 17. – P. 3606–3615.
503. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E., et al. Dramatic growth of
mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone
fusion genes // Nature. – 1982. – V. 300. – N 5893. – P. 611–615.
504. Palmiter R.D., Sandgren E.P., Avarbock M.R., et al. Heterologous introns can enhance expression of transgenes in mice // Proc Natl Acad Sci U S A. –
1991. – V. 88. – N 2. – P. 478–482.
505. Panyim S., Ohno T., Jost J.P. In vitro RNA synthesis and expression of
vitellogenin gene in isolated chicken liver nuclei // Nucleic Acids Res. – 1978. – V.
5. – N 4. – P. 1353–1370.
506. Papa S. Role of cooperative H(+)/e(-) linkage (redox bohr effect) at
heme a/Cu(A) and heme a(3)/Cu(B) in the proton pump of cytochrome c oxidase //
Biochemistry (Mosc). – 2005. – V. 70. – N 2. – P. 178–186.
507. Parrish S., Fleenor J., Xu S., et al. Functional anatomy of a dsRNA
trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference //
Mol Cell. – 2000. – V. 6. – N 5. – P. 1077–1087.
508. Pawlowski P.J. Effect of 5-bromodeoxyuridine on the appearance of
cytoplasmic poly-A containing RNA // J Cell Physiol. – 1976. – V. 89. – N 1. – P.
19–27.
269
509. Pearce J., Balnave D. The effects of estradiol administration of the hepatic activities of some enzymes of carbohydrate, amino acid and lipid metabolism
in the immature pullet // Horm Metab Res. – 1976. – V. 8. – N 3. – P. 181–183.
510. Perry M.M. A complete culture system for the chick embryo // Nature.
– 1988. – V. 331. – N 6151. – P. 70–72.
511. Perry R.P., Errera M. The role of the nucleolus in ribonucleic acid-and
protein synthesis. I. Incorporation of cytidine into normal and nucleolar inactivated
HeLa cells // Biochim Biophys Acta. – 1961. – V. 49. – P. 47–57.
512. Perry R.P., Kelley D.E. Inhibition of RNA synthesis by actinomycin D:
characteristic dose-response of different RNA species // J Cell Physiol. – 1970. –
V. 76. – N 2. – P. 127–139.
513. Peschon J.J., Behringer R.R., Brinster R.L., Palmiter R.D. Spermatidspecific expression of protamine 1 in transgenic mice // Proc Natl Acad Sci U S A.
– 1987. – V. 84. – N 15. – P. 5316–5319.
514. Petitte J.N., Clark M.E., Liu G., et al. Production of somatic and germline chimeras in the chicken by transfer of early blastodermal cells // Development.
– 1990. – V. 108. – N 1. – P. 185–189.
515. Petropoulos C.J., Payne W., Salter D.W., Hughes S.H. Appropriate in
vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for
gene transfer // J Virol. – 1992. – V. 66. – N 6. – P. 3391–3397.
516. Pette D., Klingenberg M., Buecher T. Comparable and specific proportions in the mitochondrial enzyme activity pattern // Biochem Biophys Res Commun. – 1962. – V. 7. – P. 425–429.
517. Pletjushkina O.Y., Lyamzaev K.G., Popova E.N., et al. Effect of oxidative stress on dynamics of mitochondrial reticulum // Biochim Biophys Acta. –
2006. – V. 1757. – N 5–6. – P. 518–524.
518. Pollak J.K., Woog M. Changes in the proportions of two mitochondrial
populations during the development of embryonic chick liver // Biochem J. – 1971.
– V. 123. – N 3. – P. 347–353.
270
519. Pollak J.K. The maturation of the inner membrane of foetal rat liver mitochondria // Biochem J. – 1975. – V. 150. – N 3. – P. 477–488.
520. Porcellati G., Biasion M.G., Arienti G. The incorporation of phosphorylethanolamine into the phospholipids of brain microsomes in vitro // Lipids. –
1970. – V. 5. – N 9. – P. 725–733.
521. Price P.M. The effect of 5-bromodeoxyuridine on messenger RNA production in cultured cells // Biochim Biophys Acta. – 1976. – V. 447. – N 3. – P.
304–311.
522. Pursel V.G., Campbell R.G., Miller K.F., et al. Growth potential of
transgenic pigs expressing a bovine growth hormone gene // Anim. Sci. – 1988. –
V. 66. – P. 267.
523. Pursel V.G., Pinkert C.A., Miller K.F., et al. Genetic engineering of
livestock // Science. – 1989. – V. 244. – N 4910. – P. 1281–1288.
524. Pursel V.G., Miller K.F., Bolt D.J., et al. Insertion of growth hormone
genes into pig embryos // Biotechnology in growth regulation. / Editors: R.B.
Heap, C.G. Prosser, G.E. Lamming. – London: Butterworths, 1989. – P. 181–188.
525. Pursel V.G., Bolt D.J., Miller K.F., et al. Expression and performance
in transgenic pigs // J Reprod Fertil Suppl. – 1990. – V. 40. – P. 235–245.
526. Raw I., Rockwell P. A protein-bound form of thioacetamide in liver
nucleoli // Biochem Biophys Res Commun. – 1979. – V. 90. – N 3. – P. 721–725.
527. Raynaud-Jammet C., Catelli M.G., Baulieu E.E. Inhibition by alphaamanitin of the oestradiol-induced increase in alpha-amanitin insensitive RNA polymerase in immature rat uterus // FEBS Lett. – 1972. – V. 22. – N 1. – P. 93–96.
528. Retel J., Planta R.J. Nuclear satellite DNAs of yeast // Biochim Biophys Acta. – 1972. – V. 281. – N 3. – P. 299–309.
529. Rexroad C.E., Jr., Hammer R.E., Behringer R.R., et al. Insertion, expression and physiology of growth-regulating genes in ruminants // J Reprod Fertil
Suppl. – 1990. – V. 41. – P. 119–124.
271
530. Rieth A., Pothier F., Sirard M.A. Electroporation of bovine spermatozoa to carry DNA containing highly repetitive sequences into oocytes and detection of homologous recombination events // Mol Reprod Dev. – 2000. – V. 57. – N
4. – P. 338–345.
531. Ritossa F., Malva C., Boncinelli E., et al. The first steps of magnification of DNA complementary to ribosomal RNA in Drosophila malanogaster // Proc
Natl Acad Sci U S A. – 1971. – V. 68. – N 7. – P. 1580–1584.
532. Ritossa F.M., Atwood K.C., Lindsley D.L., Spiegelman S. On the
chromosomal distribution of DNA complementary to ribosomal and soluble RNA
// Natl Cancer Inst Monogr. – 1966. – V. 23. – P. 449–472.
533. Ro-Choi T.S., Raj N.B., Pike L.M., Busch H. Effects of alpha-amanitin,
cycloheximide, and thioacetamide on low molecular weight nuclear RNA // Biochemistry. – 1976. – V. 15. – N 17. – P. 3823–3828.
534. Robertson E., Bradley A., Kuehn M., Evans M. Germ-line transmission
of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector // Nature.
– 1986. – V. 323. – N 6087. – P. 445–448.
535. Roeder R.G., Rutter W.J. Multiple forms of DNA-dependent RNA polymerase in eukaryotic organisms // Nature. – 1969. – V. 224. – N 5216. – P. 234–
237.
536. Roeder R.G., Rutter W.J. Specific nucleolar and nucleoplasmic RNA
polymerases // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1970. – V. 65. – N 3. – P. 675–682.
537. Roskam W.G., Gruber M., Ab G. Estradiol-induced synthesis of vitellogenin. II. Immunochemical characterization of vitellogenin polysomes // Biochim Biophys Acta. – 1976. – V. 435. – N 1. – P. 91–94.
538. Rotig A. Genetic bases of mitochondrial respiratory chain disorders //
Diabetes Metab. – 2010. – V. 36. – N 2. – P. 97–107.
539. Rotskaya U.N., Rogozin I.B., Vasyunina E.A., et al. High frequency of
somatic mutations in rat liver mitochondrial DNA // Mutat Res. – 2010. – V. 685.
– N 1–2. – P. 97–102.
272
540. Rottmann O.J., Stratowa C., Hornstein M., Hughes J. Tissue specific
expression of hepatitis B surface antigen in mice following liposome--mediated
gene transfer into blastocysts // Zentralbl Veterinarmed A. – 1985. – V. 32. – N 9.
– P. 676–682.
541. Rowlett K., Simkiss K. Explanted embryo culture: in vivo and in ovo
techniques for domestic fowl // Br Poult Sci. – 1987. – V. 28. – P. 91–101.
542. Royer C., Jalabert A., Da Rocha M., et al. Biosynthesis and cocoonexport of a recombinant globular protein in transgenic silkworms // Transgenic
Res. – 2005. – V. 14. – N 4. – P. 463–472.
543. Rubenstein J.L., Nicolas J.F., Jacob F. Introduction of genes into preimplantation mouse embryos by use of a defective recombinant retrovirus // Proc
Natl Acad Sci U S A. – 1986. – V. 83. – N 2. – P. 366–368.
544. Rubin G.M., Sulston J.E. Physical linkage of the 5 S cistrons to the 18
S and 28 S ribosomal RNA cistrons in Saccharomyces cerevisiae // J Mol Biol. –
1973. – V. 79. – N 3. – P. 521–530.
545. Ruiz-Pesini E., Wallace D.C. Evidence for adaptive selection acting on
the tRNA and rRNA genes of human mitochondrial DNA // Hum Mutat. – 2006. –
V. 27. – N 11. – P. 1072–1081.
546. Ryffel G.U., Wahli W., Weber R. Quantitation of vitellogenin messenger RNA in the liver of male Xenopus toads during primary and secondary stimulation by estrogen // Cell. – 1977. – V. 11. – N 1. – P. 213–221.
547. Ryffel G.U. Synthesis of vitellogenin, an attractive model for investigating hormone-induced gene activation // Mol Cell Endocrinol. – 1978. – V. 12. –
N 3. – P. 237–246.
548. Salter D.W., Smith E.J., Hughes S.H., et al. Gene insertion into the
chicken germ line by retroviruses // Poult Sci. – 1986. – V. 65. – N 8. – P. 1445–
1458.
273
549. Salter D.W., Crittenden L.B. Chickens transgenic for a defective recombinant avian leukosis proviral insert express subgroup A envelope glycoprotein
// Poult Sci Suppl. – 1987. – V. 66. – N 1. – P. 170.
550. Salter D.W., Smith E.J., Hughes S.H., et al. Transgenic chickens: insertion of retroviral genes into the chicken germ line // Virology. – 1987. – V. 157. –
N 1. – P. 236–240.
551. Salter D.W., Crittenden L.B. Gene insertion into the avian germ line //
Brit. soc. Anim. Product. – 1988. – N 12. – P. 32–57.
552. Salter D.W., Crittenden L.B. Artifical insertion of a dominant gene for
resistance to avian leukosis virus into the germ line of the chicken // Theor. and
Appl. Genetics. – 1989. – V. 77. – P. 457–461.
553. Sang H. Prospects for transgenesis in the chick // Mech Dev. – 2004. –
V. 121. – N 9. – P. 1179–1186.
554. Sang H.M., Perry M.M., Gribbin C., et al. Chick embryo culture and
gene transfer // Report for 1990–1991, Institute of animal physiology and genetics
research. / Editors: R.B. Heap, H.D. Griffin, G. Leng, et al. – Cambridge: Agricultural and food research council, 1992. – P. 52–53.
555. Sarkar B.C., Chauhan U.P. A new method for determining micro quantities of calcium in biological materials // Anal Biochem. – 1967. – V. 20. – N 1. –
P. 155–166.
556. Satav J.G., Rajwade M.S., Katyare S.S., et al. The significance of promitochondrial structures in rat liver for mitochondrial biogenesis // Biochem J. –
1973. – V. 134. – N 3. – P. 687–695.
557. Savva D., Page N., Vick L., Simkiss K. Detection of foreign DNA in
transgenic chicken embryos using the polymerase chain reaction // Res Vet Sci. –
1991. – V. 50. – N 2. – P. 131–133.
558. Sawai Y., Kitahara N., Thung W.L., et al. Nuclear location of ribonuclease H and increased level of magnesium-dependent ribonuclease H in rat liver
on thioacetamide treatment // J Biochem. – 1981. – V. 90. – N 1. – P. 11–16.
274
559. Schatz G. The biogenesis of mitochondria // Biochem J. – 1970. – V.
116. – N 4. – P. 8P.
560. Schew W.A., McNabb F.M., Scanes C.G. Comparison of the ontogenesis of thyroid hormones, growth hormone, and insulin-like growth factor-I in ad
libitum and food-restricted (altricial) European starlings and (precocial) Japanese
quail // Gen Comp Endocrinol. – 1996. – V. 101. – N 3. – P. 304–316.
561. Schiller C.M., Taylor W.M., Halperin M.L. Control of fatty acid synthesis in white adipose tissue by insulin: coordination between the mitochondrial
citrate transporter and pyruvate dehydrogenase // Can J Biochem. – 1974. – V. 52.
– N 10. – P. 814–821.
562. Schuster S.M., Olson M.S. Studies of the energy-dependent uptake of
divalent metal ions by beef heart mitochondria // J Biol Chem. – 1974. – V. 249. –
N 22. – P. 7151–7158.
563. Seifart K.H., Benecke B.J., Juhasz P.P. Multiple RNA polymerase species from rat liver tissue: possible existence of a cytoplasmic enzyme // Arch Biochem Biophys. – 1972. – V. 151. – N 2. – P. 519–532.
564. Sesterhenn T.M., Slaven B.E., Keely S.P., et al. Sequence and structure
of the linear mitochondrial genome of Pneumocystis carinii // Mol Genet Genomics. – 2010. – V. 283. – N 1. – P. 63–72.
565. Shapiro D.J., Baker H.J. Purification and characterization of Xenopus
laevis vitellogenin messenger RNA // J Biol Chem. – 1977. – V. 252. – N 15. – P.
5244–5250.
566. Sharonov G.V., Feofanov A.V., Bocharova O.V., et al. Comparative
analysis of proapoptotic activity of cytochrome c mutants in living cells // Apoptosis. – 2005. – V. 10. – N 4. – P. 797–808.
567. Shemesh M., Gurevich M., Harel-Markowitz E., et al. Gene integration
into bovine sperm genome and its expression in transgenic offspring // Mol Reprod
Dev. – 2000. – V. 56. – N S2. – P. 306–308.
275
568. Shen J., Platek M., Mahasneh A., et al. Mitochondrial copy number and
risk of breast cancer: a pilot study // Mitochondrion. – 2010. – V. 10. – N 1. – P.
62–68.
569. Simons J.P., McClenaghan M., Clark A.J. Alteration of the quality of
milk by expression of sheep beta- lactoglobulin in transgenic mice // Nature. –
1987. – V. 328. – N 6130. – P. 530–532.
570. Sjostrand F.S. A method to improve contrast in high resolution electron
microscopy of ultrathin tissue sections // Exp Cell Res. – 1956. – V. 10. – N 3. – P.
657–664.
571. Skulachev V.P., Bakeeva L.E., Chernyak B.V., et al. Thread-grain transition of mitochondrial reticulum as a step of mitoptosis and apoptosis // Mol Cell
Biochem. – 2004. – V. 256–257. – N 1–2. – P. 341–358.
572. Skulachev V.P., Longo V.D. Aging as a mitochondria-mediated atavistic program: can aging be switched off? // Ann N Y Acad Sci. – 2005. – V. 1057. –
P. 145–164.
573. Skulachev V.P. Bioenergetic aspects of apoptosis, necrosis and mitoptosis // Apoptosis. – 2006. – V. 11. – N 4. – P. 473–485.
574. Smith R.G., Schwartz R.J. Isolation and purification of a hen nuclear
oestrogen receptor and its effect on transcription of chick chromatin // Biochem J.
– 1979. – V. 184. – N 2. – P. 331–343.
575. Smoly J.M., Kuylenstierna B., Ernster L. Topological and functional
organization of the mitochondrion // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1970. – V. 66. –
N 1. – P. 125–131.
576. Snow L.D., Eriksson H., Hardin J.W., et al. Nuclear estrogen receptor
in the avian liver: correlation with biologic response // J Steroid Biochem. – 1978.
– V. 9. – N 11. – P. 1017–1026.
577. Soeiro R., Vaughan M.H., Darnell J.E. The effect of puromycin on intranuclear steps in ribosome biosynthesis // J Cell Biol. – 1968. – V. 36. – N 1. – P.
91–101.
276
578. Soriano P., Cone R.D., Mulligan R.C., Jaenisch R. Tissue-specific and
ectopic expression of genes introduced into transgenic mice by retroviruses // Science. – 1986. – V. 234. – N 4782. – P. 1409–1413.
579. Soto I.C., Fontanesi F., Valledor M., et al. Synthesis of cytochrome c
oxidase subunit 1 is translationally downregulated in the absence of functional
F1F0-ATP synthase // Biochim Biophys Acta. – 2009. – V. 1793. – N 11. – P.
1776–1786.
580. Sottocasa G., Sandri G., Panfili E., et al. Isolation of a soluble Ca 2+
binding glycoprotein from ox liver mitochondria // Biochem Biophys Res Commun. – 1972. – V. 47. – N 4. – P. 808–813.
581. Spadafora C. Sperm-mediated 'reverse' gene transfer: a role of reverse
transcriptase in the generation of new genetic information // Hum Reprod. – 2008.
– V. 23. – N 4. – P. 735–740.
582. Staeheli P., Pravtcheva D., Lundin L.G., et al. Interferon-regulated influenza virus resistance gene Mx is localized on mouse chromosome 16 // J Virol.
– 1986. – V. 58. – N 3. – P. 967–969.
583. Staeheli P., Haller O., Boll W., et al. Mx protein: constitutive expression in 3T3 cells transformed with cloned Mx cDNA confers selective resistance to
influenza virus // Cell. – 1986. – V. 44. – N 1. – P. 147–158.
584. Staeheli P., Danielson P., Haller O., Sutcliffe J.G. Transcriptional activation of the mouse Mx gene by type I interferon // Mol Cell Biol. – 1986. – V. 6.
– N 12. – P. 4770–4774.
585. Steele W.J., Okamura N., Busch H. Effects of Thioacetamide on the
Composition and Biosynthesis of Nucleolar and Nuclear Ribonucleic Acid in Rat
Liver // J Biol Chem. – 1965. – V. 240. – P. 1742–1749.
586. Stephens R.J., Bils R.F. Ultrastructural changes in the developing chick
liver. I. General cytology // J Ultrastruct Res. – 1967. – V. 18. – N 3. – P. 456–474.
277
587. Stewart C.L., Vanek M., Wagner E.F. Expression of foreign genes from
retroviral vectors in mouse teratocarcinoma chimaeras // EMBO J. – 1985. – V. 4.
– N 13B. – P. 3701–3709.
588. Stolf A.M., D'Abronzo F.H., Wang L., et al. Selection of albumin
mRNA by thioacetamide // Biochem Biophys Res Commun. – 1976. – V. 72. – N
4. – P. 1576–1584.
589. Stoyanova B.B., Hadjiolov A.A. Alterations in the processing of ratliver ribosomal RNA caused by cycloheximide inhibition of protein synthesis //
Eur J Biochem. – 1979. – V. 96. – N 2. – P. 349–356.
590. Strehler B.L., Chang M.P., Johnson L.K. Loss of hybridizable ribosomal DNA from human post-mitotic tissues during aging: I. Age-dependent loss
in human myocardium // Mech Ageing Dev. – 1979. – V. 11. – N 5–6. – P. 371–
378.
591. Strehler B.L., Chang M.P. Loss of hybridizable ribosomal DNA from
human post-mitotic tissues during aging: II. Age-dependent loss in human cerebral
cortex--hippocampal and somatosensory cortex comparison // Mech Ageing Dev. –
1979. – V. 11. – N 5–6. – P. 379–382.
592. Strom C.M., Dorfman A. Distribution of 5-bromodeoxyuridine and
thymidine in the DNA of developing chick cartilage // Proc Natl Acad Sci U S A. –
1976. – V. 73. – N 4. – P. 1019–1023.
593. Subramaniam V., Golik P., Murdock D.G., et al. MITOCHIP assessment of differential gene expression in the skeletal muscle of Ant1 knockout mice:
coordinate regulation of OXPHOS, antioxidant, and apoptotic genes // Biochim
Biophys Acta. – 2008. – V. 1777. – N 7–8. – P. 666–675.
594. Suissa S., Wang Z., Poole J., et al. Ancient mtDNA genetic variants
modulate mtDNA transcription and replication // PLoS Genet. – 2009. – V. 5. – N
5. – P. 101–110.
278
595. Swick R.W., Eiermann R.A., Rexroth A.K., et al. The distribution of
mitochondrial enzymes in rat liver after various treatments, in liver from other species, and in rat heart. ANL-7409 // ANL Rep. – 1967. – P. 57–60.
596. Swick R.W., Stange J.L., Nance S.L., Thomson J.F. The heterogeneous
distribution of mitochondrial enzymes in normal rat liver // Biochemistry. – 1967.
– V. 6. – N 3. – P. 737–744.
597. Szczesny R.J., Borowski L.S., Brzezniak L.K., et al. Human mitochondrial RNA turnover caught in flagranti: involvement of hSuv3p helicase in RNA
surveillance // Nucleic Acids Res. – 2010. – V. 38. – N 1. – P. 279–298.
598. Tabak H.F., Borst P. Erroneous transcription of mitochondrial DNA by
RNA polymerase from Escherichia coli // Biochim Biophys Acta. – 1970. – V.
217. – N 2. – P. 356–364.
599. Taborsky G. Interaction between phosvitin and iron and its effect on a
rearrangement of phosvitin structure // Biochemistry. – 1963. – V. 2. – P. 266–271.
600. Tashmukhamedov B.A., Gagelgans A.I., Mamatkulov K., Makhmudova E.M. Inhibition of Ca(2+) transport in mitochondria by selective blockade of
membrane mucopolysaccharides by hexamine cobaltichloride // FEBS Lett. –
1972. – V. 28. – N 2. – P. 239–242.
601. Tixier M., Claude J. [A simple and rapid technic for triglyceride determination] // Ann Biol Clin (Paris). – 1974. – V. 32. – N 1. – P. 53–57.
602. Tower D.B. Ouabain and the distribution of calcium and magnesium in
cerebral tissues in vitro // Exp Brain Res. – 1968. – V. 6. – N 4. – P. 273–283.
603. Tuppen H.A., Blakely E.L., Turnbull D.M., Taylor R.W. Mitochondrial
DNA mutations and human disease // Biochim Biophys Acta. – 2010. – V. 1797. –
N 2. – P. 113–128.
604. Tzagoloff A., Meagher P. Assesmbly of the mitochondrial membrane
system. VI. Mitochondrial synthesis of subunit proteins of the rutamycin-sensitive
adenosine triphosphatase // J Biol Chem. – 1972. – V. 247. – N 2. – P. 594–603.
279
605. Valdez L.B., Zaobornyj T., Boveris A. Mitochondrial metabolic states
and membrane potential modulate mtNOS activity // Biochim Biophys Acta. –
2006. – V. 1757. – N 3. – P. 166–172.
606. Vaughan M.H., Jr., Soeiro R., Warner J.R., Darnell J.E., Jr. The effects
of methionine deprivation on ribosome synthesis in HeLa cells // Proc Natl Acad
Sci U S A. – 1967. – V. 58. – N 4. – P. 1527–1534.
607. Villalobos J.G., Jr., Steele W.J., Busch H. Effects of Thioacetamide on
Labeling of Ribonucleic Acid of Isolated Nucleoli in Vitro // Biochim Biophys
Acta. – 1964. – V. 91. – P. 233–238.
608. Volkova N.A., Zinov'eva N.A., Volkova L.V., Ernst L.K. [Retroviralmediated gene transfer as an effective tool for the in vitro genetic transformation of
chicken embryonic cells and production of transgenic chickens] // Genetika. –
2006. – V. 42. – N 1. – P. 84–88.
609. Wachsmuth E.D., Jost J.P. Localization of vitellogenin and serum albumin in hepatic parenchymal cells of normal and estradiol-treated immature
chickens // Biochim Biophys Acta. – 1976. – V. 437. – N 2. – P. 454–461.
610. Wagner E.F., Stewart T.A., Mintz B. The human beta-globin gene and
a functional viral thymidine kinase gene in developing mice // Proc Natl Acad Sci
U S A. – 1981. – V. 78. – N 8. – P. 5016–5020.
611. Wagner E.F., Covarrubias L., Stewart T.A., Mintz B. Prenatal lethalities in mice homozygous for human growth hormone gene sequences integrated in
the germ line // Cell. – 1983. – V. 35. – N 3 Pt 2. – P. 647–655.
612. Wagner T.E., Hoppe P.C., Jollick J.D., et al. Microinjection of a rabbit
beta-globin gene into zygotes and its subsequent expression in adult mice and their
offspring // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1981. – V. 78. – N 10. – P. 6376–6380.
613. Wahli W., Dawid I.B., Wyler T., et al. Comparative analysis of the
structural organization of two closely related vitellogenin genes in X. laevis // Cell.
– 1980. – V. 20. – N 1. – P. 107–117.
280
614. Wallace D.C. Animal models for mitochondrial disease // Methods Mol
Biol. – 2002. – V. 197. – P. 3–54.
615. Wallace D.C. Mitochondria and cancer: Warburg addressed // Cold
Spring Harb Symp Quant Biol. – 2005. – V. 70. – P. 363–374.
616. Wallace D.C. The mitochondrial genome in human adaptive radiation
and disease: on the road to therapeutics and performance enhancement // Gene. –
2005. – V. 354. – P. 169–180.
617. Wallace D.C. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative
diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine // Annu Rev Genet.
– 2005. – V. 39. – P. 359–407.
618. Wallace D.C. Why do we still have a maternally inherited mitochondrial DNA? Insights from evolutionary medicine // Annu Rev Biochem. – 2007. –
V. 76. – P. 781–821.
619. Wallace D.C., Fan W. The pathophysiology of mitochondrial disease as
modeled in the mouse // Genes Dev. – 2009. – V. 23. – N 15. – P. 1714–1736.
620. Wallace D.C., Fan W. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics //
Mitochondrion. – 2010. – V. 10. – N 1. – P. 12–31.
621. Wang S.Y., Williams D.L. Identificiation, purification, and characterization of two distinct avian vitellogenins // Biochemistry. – 1980. – V. 19. – N 8. –
P. 1557–1563.
622. Wang S.Y., Williams D.L. Biosynthesis of the vitellogenins. Identification and characterization of nonphosphorylated precursors to avian vitellogenin I
and vitellogenin II // J Biol Chem. – 1982. – V. 257. – N 7. – P. 3837–3846.
623. Webster N.L., Forni M., Bacci M.L., et al. Multi-transgenic pigs expressing three fluorescent proteins produced with high efficiency by sperm mediated gene transfer // Mol Reprod Dev. – 2005. – V. 72. – N 1. – P. 68–76.
624. Weckler C., Gschwendt M. The effect of estradiol on the activity of the
nucleolar and nucleoplasmic RNA polymerases from chicken liver // FEBS Lett. –
1976. – V. 65. – N 2. – P. 220–224.
281
625. Weinberg R.A., Loening U., Willems M., Penman S. Acrylamide gel
electrophoresis of HeLa cell nucleolar RNA // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1967. –
V. 58. – N 3. – P. 1088–1095.
626. Weinmann R., Roeder R.G. Role of DNA-dependent RNA polymerase
3 in the transcription of the tRNA and 5S RNA genes // Proc Natl Acad Sci U S A.
– 1974. – V. 71. – N 5. – P. 1790–1794.
627. Weiss J.W., Pitot H.C. Inhibition of ribosomal RNA maturation in Novikoff hepatoma cells by toyocamycin, tubercidin, and 6-thioguanosine // Cancer
Res. – 1974. – V. 34. – N 3. – P. 581–587.
628. Wellauer P.K., Dawid I.B. Secondary structure maps of RNA: processing of HeLa ribosomal RNA // Proc Natl Acad Sci U S A. – 1973. – V. 70. – N 10.
– P. 2827–2831.
629. Wester P.O. Concentration of 17 elements in subcellular fractions of
beef heart tissue determined by neutron activation analysis // Biochim Biophys
Acta. – 1965. – V. 109. – N 1. – P. 268–283.
630. van der Westhuizen F.H., Smet J., Levanets O., et al. Aberrant synthesis of ATP synthase resulting from a novel deletion in mitochondrial DNA in an
African patient with progressive external ophthalmoplegia // J Inherit Metab Dis. –
2010. – P. 1–8.
631. Wicker T., Robertson J.S., Schulze S.R., et al. The repetitive landscape
of the chicken genome // Genome Res. – 2005. – V. 15. – N 1. – P. 126–136.
632. Wieringa B., Mulder J., van der Ende A., et al. Purification of vitellogenin mRNA and serum albumin mRNA from avian liver by preparative gel
electrophoresis // Eur J Biochem. – 1978. – V. 89. – N 1. – P. 67–79.
633. Wiley H.S., Wallace R.A. Three different molecular weight forms of
the vitellogenin peptide from Xenopus laevis // Biochem Biophys Res Commun. –
1978. – V. 85. – N 1. – P. 153–159.
282
634. Wiley H.S., Wallace R.A. The structure of vitellogenin. Multiple vitellogenins in Xenopus laevis give rise to multiple forms of the yolk proteins // J Biol
Chem. – 1981. – V. 256. – N 16. – P. 8626–8634.
635. Willems M., Penman M., Penman S. The regulation of RNA synthesis
and processing in the nucleolus during inhibition of protein synthesis // J Cell Biol.
– 1969. – V. 41. – N 1. – P. 177–187.
636. Williams D.L., Wang S.Y., Klett H. Decrease in functional albumin
mRNA during estrogen-induced vitellogenin biosynthesis in avian liver // Proc
Natl Acad Sci U S A. – 1978. – V. 75. – N 12. – P. 5974–5978.
637. Williams D.L. Apoproteins of avian very low density lipoprotein: demonstration of a single high molecular weight apoprotein // Biochemistry. – 1979. –
V. 18. – N 6. – P. 1056–1063.
638. Wilmut I., Archibald A.L., Harris S., et al. Modification of milk composition // J Reprod Fertil Suppl. – 1990. – V. 41. – P. 135–146.
639. Wolf E., Wanke R., Hermanns W., et al. Growth characteristics of metallothionein-human growth hormone transgenic mice as compared to mice selected
for high eight-week body weight and unselected controls. I. Body weight gain and
external body dimensions // Growth Dev Aging. – 1991. – V. 55. – N 4. – P. 225–
235.
640. Wolf E., Rapp K., Wanke R., et al. Growth characteristics of metallothionein-human growth hormone transgenic mice as compared to mice selected
for high eight-week body weight and unselected controls. II. Skeleton // Growth
Dev Aging. – 1991. – V. 55. – N 4. – P. 237–248.
641. Yazawa R., Hirono I., Aoki T. Transgenic zebrafish expressing chicken
lysozyme show resistance against bacterial diseases // Transgenic Res. – 2006. – V.
15. – N 3. – P. 385–391.
642. Yehuda-Shnaidman E., Kalderon B., Azazmeh N., Bar-Tana J. Gating
of the mitochondrial permeability transition pore by thyroid hormone // FASEB J.
– 2010. – V. 24. – N 1. – P. 93–104.
283
643. Zhu L., van de Lavoir M.C., Albanese J., et al. Production of human
monoclonal antibody in eggs of chimeric chickens // Nat Biotechnol. – 2005. – V.
23. – N 9. – P. 1159–1169.
644. Zoraqi G., Spadafora C. Integration of foreign DNA sequences into
mouse sperm genome // DNA Cell Biol. – 1997. – V. 16. – N 3. – P. 291–300.
Приложения
285
Таблица 41
Живая масса перепелов опытной и контрольной групп (19–30 поколения)
Опыт
♂
Возраст
1 сут.
1 нед.
♀
7 нед.
20 нед.
Поколение
1 сут.
1 нед.
7 нед.
20 нед.
19
M
8,47
26,58
150,06
166,82
8,40
27,54
189,66
203,00
m
0,07
0,94
2,39
2,37
0,08
0,94
3,46
3,30
n
37
37
36
33
32
32
29
25
Поколение
20
M
9,00
26,88
147,96
156,90
9,13
32,58
186,56
197,88
m
0,09
1,19
1,84
1,79
0,10
1,37
2,61
3,25
n
51
51
49
42
49
49
45
33
Поколение
21
M
8,83
24,18
149,47
162,45
8,79
24,95
180,87
209,39
m
0,08
0,72
1,57
1,60
0,09
0,84
3,18
3,63
n
58
58
57
47
52
52
52
33
Поколение
22
M
9,04
28,88
145,54
163,91
9,00
27,61
183,78
203,65
m
0,08
1,22
1,33
2,67
0,08
1,38
2,51
4,65
n
37
37
37
23
37
37
37
26
Поколение
23
M
9,17
26,31
147,14
163,18
9,27
26,19
186,92
197,91
m
0,09
1,00
1,47
2,60
0,07
0,82
2,29
2,78
n
35
35
35
22
61
61
60
43
Поколение
24
M
9,10
29,58
146,20
155,95
8,99
29,89
186,75
212,22
m
0,07
1,16
1,71
3,69
0,10
1,54
3,02
3,97
n
25
25
25
21
20
20
20
18
Поколение
25
M
9,01
25,46
148,44
159,13
8,89
26,68
191,33
208,86
m
0,11
1,16
2,20
2,47
0,09
1,19
2,89
3,65
n
32
32
32
23
30
30
30
22
286
Опыт
♂
Возраст
1 сут.
1 нед.
♀
7 нед.
20 нед.
Поколение
1 сут.
1 нед.
7 нед.
20 нед.
26
M
9,13
23,74
143,91
153,18
9,10
25,22
187,73
215,00
m
0,11
0,52
2,31
1,21
0,13
0,71
3,84
3,42
n
33
33
32
22
26
26
26
22
Поколение
27
M
8,99
23,95
146,86
153,59
8,93
26,11
187,22
209,83
m
0,11
0,51
1,44
1,61
0,12
0,68
2,92
2,60
n
44
44
43
32
37
37
36
30
Поколение
28
M
9,29
24,15
144,50
148,86
9,22
24,05
188,78
205,00
m
0,08
0,76
2,09
2,87
0,07
0,50
2,59
3,27
n
31
31
30
22
43
43
41
35
Поколение
29
M
9,02
23,78
144,52
151,54
9,18
24,22
187,08
205,00
m
0,08
0,58
1,89
1,70
0,07
0,58
2,83
2,69
n
31
31
31
26
36
36
36
32
Поколение
30
M
9,11
23,10
145,15
155,78
9,26
23,82
182,71
198,64
m
0,10
0,49
1,24
1,57
0,11
0,48
4,48
2,76
n
34
34
34
32
24
24
24
22
В среднем по всем поколениям
M
8,99
25,45
146,90
158,00
9,02
26,60
186,40
204,88
m
0,03
0,28
0,53
0,67
0,03
0,31
0,87
1,00
n
449
449
441
345
447
447
436
341
287
Контроль
♂
Возраст
1 сут.
1 нед.
♀
7 нед.
20 нед.
Поколение
1 сут.
1 нед.
7 нед.
20 нед.
19
M
7,08
24,18
136,67
153,27
7,23
24,67
163,59
194,02
m
0,13
0,80
3,16
2,74
0,06
0,58
3,18
2,45
n
27
27
27
26
46
46
46
41
Поколение
20
M
7,54
22,91
135,37
151,11
7,80
26,25
169,12
193,53
m
0,08
0,58
2,43
1,91
0,08
0,67
5,31
4,08
n
27
27
27
27
17
17
17
17
Поколение
21
M
6,79
23,89
144,33
162,00
7,57
26,99
178,57
194,82
m
0,08
0,95
3,96
3,68
0,08
0,50
2,25
2,97
n
15
15
15
15
28
28
28
28
Поколение
22
M
7,70
26,30
136,15
154,42
7,26
29,51
170,45
185,91
m
0,11
0,55
1,50
2,29
0,19
0,64
4,93
3,74
n
26
26
26
26
11
11
11
11
Поколение
23
M
7,24
18,42
142,50
153,75
7,41
20,82
176,39
196,52
m
0,08
0,54
1,40
1,79
0,06
0,44
2,93
2,74
n
34
34
34
28
36
36
36
33
Поколение
24
M
7,79
22,88
141,54
151,82
7,64
25,44
173,72
194,85
m
0,10
0,77
1,48
1,53
0,10
0,72
3,10
2,47
n
52
52
52
44
43
43
43
33
Поколение
25
M
7,34
23,08
148,38
158,89
7,51
23,80
174,10
196,00
m
0,07
0,69
1,67
2,41
0,08
0,47
2,42
3,32
n
34
34
34
18
39
39
39
25
288
Контроль
♂
Возраст
1 сут.
1 нед.
♀
7 нед.
20 нед.
Поколение
1 сут.
1 нед.
7 нед.
20 нед.
26
M
7,30
22,12
141,35
158,00
7,42
21,66
167,18
189,73
m
0,07
0,45
1,38
1,65
0,07
0,32
2,28
2,50
n
48
48
48
45
39
39
39
37
Поколение
27
M
7,52
21,81
141,58
151,47
7,47
20,39
175,69
195,38
m
0,08
0,43
1,53
2,05
0,08
0,57
3,88
3,19
n
19
19
19
17
29
29
29
26
Поколение
28
M
7,48
25,58
147,50
163,82
7,32
24,35
184,35
198,70
m
0,10
0,70
2,47
1,94
0,07
0,45
2,45
3,91
n
18
18
18
17
31
31
31
27
Поколение
29
M
7,03
19,10
143,85
158,40
7,14
18,41
174,56
197,22
m
0,06
0,86
1,78
2,56
0,06
0,59
2,20
3,21
n
26
26
26
25
34
34
34
27
Поколение
30
M
7,64
21,69
155,50
153,95
7,39
21,25
171,82
179,55
m
0,08
0,87
1,59
2,49
0,09
1,05
3,54
2,75
n
26
26
26
25
22
22
22
22
В среднем по всем поколениям
M
7,41
22,47
142,65
155,38
7,42
23,25
173,15
193,58
m
0,02
0,22
0,57
0,86
0,03
0,08
0,87
0,88
n
352
352
352
313
375
375
375
327
289
Таблица 42
Средняя масса яиц перепелок опытной и контрольной групп разных
поколений по месяцам продуктивности, г
Месяц продуктивности
Поколение
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Опытная группа
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
M 11,77 12,01 12,20 11,96 11,61 11,70 12,17 12,06 12,08 12,34
m
0,47
0,29
0,25
0,31
0,34
0,32
0,41
0,42
0,46
0,53
n
5
5
5
5
5
4
4
4
3
2
M 12,65 12,54 12,50 12,36 12,42 12,42 12,56 12,54 12,46 12,35
m
0,14
0,14
0,10
0,12
0,15
0,21
0,21
0,25
0,28
0,23
n
21
21
21
19
17
15
15
14
12
9
M 11,86 12,32 12,36 12,59 12,50 12,54 12,62 12,33 12,26 12,20
m
0,16
0,11
0,12
0,10
0,09
0,13
0,14
0,14
0,16
0,18
n
31
31
31
27
27
26
25
20
18
14
M 10,93 11,73 12,26 12,31 12,37 12,38 12,32 12,38 12,32 12,33
m
0,20
0,19
0,16
0,16
0,16
0,17
0,17
0,18
0,19
0,20
n
27
27
27
26
26
26
25
23
22
20
M 10,60 11,53 12,01 12,24 12,30 12,35 12,27 12,32 12,17 12,02
m
0,11
0,13
0,15
0,14
0,17
0,18
0,19
0,19
0,19
0,20
n
46
46
46
42
37
33
29
27
26
25
M 10,69 11,88 12,15 12,38 12,48 12,48 12,50 12,32 12,09 12,15
m
0,15
0,17
0,19
0,20
0,19
0,18
0,20
0,21
0,21
0,18
n
20
20
20
19
19
18
16
14
14
15
M 10,96 11,81 12,29 12,58 12,77 12,64 12,58 12,48 12,51 12,35
m
0,13
0,20
0,23
0,20
0,20
0,20
0,18
0,19
0,21
0,22
n
23
23
23
22
22
20
20
19
17
15
M 11,09 12,14 12,63 12,71 12,81 13,00 13,00 12,75 12,63 12,46
m
0,21
0,20
0,20
0,22
0,23
0,17
0,20
0,18
0,28
0,23
n
24
24
24
24
22
20
20
17
14
14
M 10,91 11,96 12,39 12,53 12,48 12,54 12,51 12,31 12,68 12,51
m
0,20
0,16
0,18
0,18
0,18
0,18
0,17
0,18
0,24
0,24
n
29
29
29
29
28
28
25
26
20
16
M 11,43 12,21 12,65 12,88 12,92 12,85 12,67 12,65 12,85 12,71
m
0,14
0,13
0,13
0,13
0,14
0,14
0,16
0,16
0,20
0,22
n
35
35
35
32
30
25
22
20
17
17
290
Месяц продуктивности
Поколение
29
30
В среднем
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M 11,74 12,39 12,78 12,75 12,89 13,56 12,90 12,88 12,81 12,91
m
0,13
0,10
0,11
0,11
0,13
0,60
0,17
0,17
0,19
0,13
n
34
34
34
33
30
26
23
21
19
17
M 11,37 12,35 12,81 12,82 12,92 12,99 12,97 12,69 12,63 12,49
m
0,14
0,16
0,17
0,20
0,18
0,21
0,21
0,22
0,22
0,25
n
22
22
22
22
22
21
21
19
18
16
M
11,3
12,1
12,4
12,5
12,6
12,7
12,6
12,5
12,5
12,4
m
0,16
0,15
0,16
0,16
0,17
0,22
0,18
0,19
0,21
0,21
n
317
317
317
300
285
262
245
224
200
180
Контрольная группа
25
26
27
28
29
30
В среднем
M 10,45 10,77 10,88 10,80 10,95 10,91 10,92 10,72 10,68 10,74
m
0,15
0,28
0,26
0,29
0,21
0,32
0,34
0,23
0,25
0,27
n
7
7
7
6
5
5
5
4
4
4
M 10,43 11,26 11,66 11,55 11,58 11,44 11,40 11,35 11,48 11,32
m
0,21
0,12
0,16
0,18
0,18
0,16
0,19
0,24
0,25
0,26
n
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
M 10,30 10,71 11,32 11,38 11,23 11,33 11,64 11,29 11,26 11,25
m
0,19
0,15
0,19
0,19
0,18
0,22
0,45
0,18
0,07
0,12
n
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
M
9,90
10,82 11,30 10,90 11,02 10,90 11,14 11,04 10,67 11,01
m
0,14
0,13
0,16
0,18
0,19
0,18
0,24
0,17
0,16
0,18
n
13
13
13
13
13
13
13
13
12
12
M
9,57
10,81 10,88 11,19 11,48 11,35 10,99 10,95 10,96 10,97
m
0,16
0,13
0,13
0,14
0,15
0,15
0,16
0,18
0,16
0,16
n
14
14
14
14
14
14
14
14
13
12
M 10,79 11,23 11,22 11,09 11,17 11,24 11,31 11,12 10,80 10,72
m
0,20
0,12
0,12
0,15
0,14
0,15
0,15
0,16
0,21
0,21
n
14
14
14
14
14
14
14
14
13
13
M 10,20 10,97 11,20 11,14 11,27 11,20 11,20 11,08 10,95 10,98
m
0,17
0,14
0,16
0,18
0,17
0,17
0,21
0,18
0,19
0,20
n
62
62
62
61
60
60
59
58
55
54
291
Таблица 43
Среднее количество яиц перепелок опытной и контрольной групп разных
поколений по месяцам продуктивности, шт.
Месяц продуктивности
Поколение
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Опытная группа
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
M 23,40 22,00 24,20 25,60 18,60 24,00 21,75 21,00 20,33 17,50
m
2,11
3,44
1,93
2,04
3,20
2,12
3,68
6,01
5,70
2,50
n
5
5
5
5
5
4
4
4
3
2
M 24,86 23,76 20,52 23,16 19,76 21,47 20,13 15,50 15,17 17,56
m
0,97
0,97
1,14
1,17
1,46
2,09
1,97
1,65
2,49
2,65
n
21
21
21
19
17
15
15
14
12
9
M 23,94 24,65 25,19 25,93 23,00 22,15 20,12 21,15 19,78 18,29
m
1,03
0,84
0,73
0,87
1,07
1,23
1,50
1,69
2,10
2,15
n
31
31
31
27
27
26
25
20
18
14
M 17,67 25,93 25,15 23,81 24,85 24,88 20,96 23,78 20,50 20,35
m
1,32
0,70
0,95
1,18
0,90
1,19
1,77
1,28
2,03
1,93
n
27
27
27
26
26
26
25
23
22
20
M 17,37 24,85 24,57 23,19 24,76 24,58 24,28 23,15 21,73 20,96
m
0,99
0,61
0,95
0,93
0,72
0,86
0,94
1,02
1,42
1,48
n
46
46
46
42
37
33
29
27
26
25
M 18,55 26,30 24,55 25,37 25,21 23,67 17,94 19,64 19,93 19,60
m
2,02
0,60
1,08
0,69
0,78
1,37
1,63
1,42
1,67
1,92
n
20
20
20
19
19
18
16
14
14
15
M 14,13 22,74 21,96 23,45 21,00 20,75 20,40 20,11 16,41 18,53
m
1,71
1,52
1,56
1,62
1,76
1,79
1,49
2,01
2,31
1,91
n
23
23
23
22
22
20
20
19
17
15
M 14,17 24,92 24,08 21,00 23,18 23,60 22,30 17,24 20,21 19,14
m
1,71
0,61
0,88
1,55
1,28
0,96
1,31
2,13
1,82
2,06
n
24
24
24
24
22
20
20
17
14
14
M 14,52 24,97 26,07 25,28 22,29 22,54 21,32 19,85 20,80 21,44
m
1,67
0,75
0,43
0,79
1,09
1,27
1,39
1,53
1,61
1,23
n
29
29
29
29
28
28
25
26
20
16
M 18,29 24,43 24,43 23,41 23,03 23,72 23,23 20,95 24,18 21,71
m
1,45
0,94
0,76
0,99
1,08
1,02
1,13
1,43
1,09
1,49
n
35
35
35
32
30
25
22
20
17
17
292
Месяц продуктивности
Поколение
29
30
В среднем
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M 18,65 25,76 25,38 23,15 23,30 22,31 20,96 20,57 21,37 17,53
m
1,47
0,54
0,72
1,03
1,09
1,07
1,30
1,72
1,49
1,57
n
34
34
34
33
30
26
23
21
19
17
M 17,73 26,14 25,41 25,41 24,41 24,24 24,43 25,16 23,17 18,81
m
1,21
0,59
0,80
0,82
1,25
1,28
1,19
0,55
1,22
2,13
n
22
22
22
22
22
21
21
19
18
16
M
18,2
24,9
24,4
23,9
23,2
23,2
21,6
20,9
20,5
19,6
m
1,39
0,81
0,9
1,06
1,14
1,25
1,43
1,55
1,78
1,81
n
317
317
317
300
285
262
245
224
200
180
Контрольная группа
25
26
27
28
29
30
В среднем
M 19,57 18,79 20,36 17,58 24,20 24,30 23,20 25,63 21,38 19,38
m
4,19
2,08
2,65
3,54
2,18
3,13
2,46
2,38
3,18
4,04
n
7
7
7
6
5
5
5
4
4
4
M 10,60 21,60 22,15 22,65 23,05 21,00 19,56 21,50 19,94 20,33
m
0,89
1,79
2,53
2,03
2,06
1,92
2,38
2,12
1,36
1,86
n
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
M 21,63 27,25 25,13 25,63 20,63 20,75 16,50 14,63 15,13 12,00
m
0,52
0,60
1,14
2,54
4,42
4,40
3,23
3,23
2,70
2,68
n
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
M
7,92
23,88 26,88 24,19 23,88 20,23 21,38 19,19 16,96 17,10
m
1,00
1,48
1,06
1,40
1,71
1,54
1,74
1,81
1,61
1,58
n
13
13
13
13
13
13
13
13
12
12
M
4,68
23,00 22,86 21,39 22,36 22,29 20,46 19,71 17,65 18,13
m
0,74
1,70
1,23
1,76
1,64
1,88
1,77
1,98
2,26
2,38
n
14
14
14
14
14
14
14
14
13
12
M 20,54 25,79 25,21 25,86 24,71 23,43 23,96 17,07 19,92 20,04
m
1,11
1,45
1,24
1,10
0,76
1,31
1,28
1,24
1,26
1,59
n
14
14
14
14
14
14
14
14
13
13
M 13,54 25,00 25,64 24,75 25,06 23,53 22,87 20,72 19,95 19,83
m
1,28
1,59
1,56
1,80
1,75
1,95
1,90
1,90
1,83
2,07
n
62
62
62
61
60
60
59
58
55
54
293
Таблица 44
Средняя яйцемасса опытной и контрольной групп перепелок разных
поколений по месяцам продуктивности, г
Месяц продуктивности
Поколение
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Опытная группа
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
M
277,94
264,30
296,24
305,98
214,12
278,78
264,63
253,83
245,87
217,20
m
32,81
42,31
26,91
25,36
36,17
17,95
44,73
73,02
69,35
40,10
n
5
5
5
5
5
4
4
4
3
2
M
313,44
297,51
256,24
286,45
244,11
266,97
251,93
195,44
186,96
215,74
m
11,65
12,12
14,16
14,55
17,47
26,05
24,97
22,14
29,32
31,73
n
21
21
21
19
17
15
15
14
12
9
M
286,60
303,18
312,83
326,96
288,16
278,45
253,98
263,06
244,32
222,44
m
14,02
10,26
10,60
11,76
13,87
16,12
19,29
21,94
26,65
25,96
n
31
31
31
27
27
26
25
20
18
14
M
197,30
304,19
306,66
293,30
305,77
307,22
257,81
292,12
250,28
250,41
m
17,57
9,44
11,13
15,27
10,35
14,69
21,99
15,10
24,46
24,26
n
27
27
27
26
26
26
25
23
22
20
M
186,23
287,04
293,32
283,23
303,15
301,14
296,50
283,15
263,57
253,20
m
11,32
7,92
11,48
11,32
8,55
9,71
11,38
11,72
17,57
18,37
n
46
46
46
42
37
33
29
27
26
25
M
197,96
312,52
298,52
313,94
314,17
294,82
221,31
240,19
242,26
238,75
m
21,76
8,57
13,74
9,76
10,53
17,14
18,50
16,25
21,18
23,61
n
20
20
20
19
19
18
16
14
14
15
M
157,11
268,97
273,56
295,17
266,70
262,29
256,66
249,48
206,19
230,05
m
19,46
19,00
21,11
20,79
22,23
23,48
19,10
24,82
30,11
24,51
n
23
23
23
22
22
20
20
19
17
15
M
160,45
302,05
303,82
266,96
297,48
305,99
289,74
219,97
258,32
239,21
m
20,41
8,30
11,74
20,26
17,70
12,55
17,54
27,10
24,26
26,47
n
24
24
24
24
22
20
20
17
14
14
M
164,28
298,91
323,19
317,14
278,70
285,27
268,48
245,84
262,83
267,41
m
20,34
9,99
7,41
11,01
14,38
17,56
17,92
19,78
20,69
15,24
n
29
29
29
29
28
28
25
26
20
16
M
211,41
297,26
308,43
301,24
296,30
303,97
294,99
265,17
310,26
274,42
m
17,22
11,39
9,84
13,00
13,21
12,94
14,58
18,02
15,03
17,91
n
35
35
35
32
30
25
22
20
17
17
M
221,85
319,79
323,85
295,28
300,61
293,35
272,40
265,94
275,38
227,62
m
18,27
7,66
9,16
13,54
14,61
12,68
18,01
22,57
19,96
20,96
n
34
34
34
33
30
26
23
21
19
17
294
Месяц продуктивности
Поколение
30
В среднем
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
M
202,07
322,64
324,43
324,92
314,10
313,21
314,59
318,09
290,93
232,90
m
13,92
8,21
9,73
10,84
15,91
16,48
14,73
5,95
14,07
26,09
n
22
22
22
22
22
21
21
19
18
16
M
209,2
300,0
303,5
299,7
291,8
292,9
272,5
261,4
256,3
243,0
m
16,82
10,54
11,72
13,81
14,4
15,66
18,11
19,31
22,42
22,71
n
317
317
317
300
285
262
245
224
200
180
Контрольная группа
25
26
27
28
29
30
В среднем
M
202,07
200,94
219,61
188,88
263,68
261,48
250,90
274,74
226,59
208,06
m
41,75
20,72
26,61
37,83
21,29
30,03
23,69
26,68
30,34
42,66
n
7
7
7
6
5
5
5
4
4
4
M
111,52
243,20
257,31
259,93
265,83
238,72
220,51
242,56
228,41
230,02
m
10,45
20,25
29,03
22,06
23,01
20,44
25,77
23,09
15,57
21,38
n
10
10
10
10
10
10
9
9
9
9
M
222,69
291,99
284,06
291,51
231,95
236,24
195,50
165,75
170,76
134,75
m
7,11
8,58
11,52
28,74
49,26
50,37
44,77
37,13
31,16
29,64
n
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
M
78,26
259,25
304,18
264,43
265,09
221,04
237,78
212,44
181,80
188,27
m
9,96
17,31
13,34
16,49
21,14
17,86
19,58
20,90
18,25
18,02
n
13
13
13
13
13
13
13
13
12
12
M
45,76
249,06
254,89
274,98
256,26
299,67
224,70
221,63
191,77
197,48
m
7,52
19,09
15,25
44,82
18,79
55,10
19,43
19,19
24,33
25,64
n
14,00
14,00
14,00
14,00
14,00
14,00
14,00
14,00
13,00
12,00
M
222,10
335,54
282,06
285,70
275,56
262,56
269,74
188,55
213,70
213,06
m
13,48
51,36
13,54
11,65
7,95
14,50
13,65
12,76
12,03
15,91
n
14
14
14
14
14
14
14
14
13
13
M
141,17
285,54
288,25
283,96
282,07
274,72
255,17
230,54
217,60
216,81
m
13,69
25,70
17,73
25,70
19,71
29,38
21,14
20,38
19,60
22,45
n
62
62
62
61
60
60
59
58
55
54
Итого за 10 месяцев продуктивности
Опытная группа
2749,4 г
111%
Контрольная группа
2481,6 г
100%
p < 0,001
295
Рисунок 25. Фотографии плашек с реакцией задержки гемагглютинации сывороткой крови перепелов через 2 недели после вакцинации;
1–10 – контрольные; 11–21 – опытные
296
Продолжение рисунка 25
297
4
2
1 0,5 0,25
1
2
3
5
6
7
8
9
Рисунок 26. Фотографии плашек с реакцией задержки гемагглютинации сывороткой крови перепелов через 4 недели после вакцинации;
1–10 – контрольные; 11–21 – опытные. Номера 22–26 – куры из
соседних боксов
298
10
11
12
13
14
15
16
17
19
20
21
22
23
24
25
26
Продолжение рисунка 26
299
300
301
302
303
304
305