019967 B1 019967 B1 (11) 019967

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
019967
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2014.07.30
(21)
Номер заявки
201101664
(22)
(51) Int. Cl. C07K 14/61 (2006.01)
C08G 73/00 (2006.01)
A61K 31/25 (2006.01)
A61K 38/27 (2006.01)
Дата подачи заявки
2011.12.21
(54)
КОВАЛЕНТНЫЙ КОНЪЮГАТ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ С ГОРМОНОМ РОСТА
ЧЕЛОВЕКА
B1
(72)
Изобретатель:
(57)
Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата
полиэтиленгликоля с гормоном роста человека (соматотропином), в котором полимер присоединен
к тирозиновым и/или гистидиновым фрагментам соматотропина посредством азогруппы, общей
структуры (I)
Шереметьев Сергей Викторович,
Коровкин Сергей Анатольевич,
Катлинский Антон Викентьевич,
Семченко Андрей Викторович,
Катлинский Владимир Антонович
(RU)
где А - аминокислотный фрагмент гистидина; В - аминокислотный фрагмент тирозина; hGH соматотропин; n - целое число от 10 до 1200; m принимает значения от 0 до 3; k принимает
значения от 0 до 8, причем m≠k, если m или k равны 0. Конъюгат hGH обладает большим временем
циркуляции в кровотоке по сравнению с немодифицированным соматотропином при сохранении
существенной доли его активности.
B1
019967
(56) RU-C2-2385879
WO-A2-2003044056
US-A1-20020004483
019967
(43) 2012.11.30
(96) 2011000181 (RU) 2011.12.21
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ
ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ
"ФОРТ" (ООО "ФОРТ") (RU)
019967
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине и биотехнологии и касается ковалентного конъюгата полиэтиленгликоля с гормоном роста человека (соматотропином), в котором полимер присоединен к полипептиду посредством азогруппы.
Сведения о предшествующем уровне техники
Гормон роста человека (соматотропин, соматропин, hGH) является одним из гормонов, продуцируемых передней долей гипофиза, и относится к пептидным гормонам. Соматотропин состоит из 191
аминокислот и имеет молекулярную массу 22124 Да [Daniels M.E. Lilly's Humatrope Experience. Nature
Biotechnol, vol. 10, No. 7 (1992), p. 812].
Соматотропин стимулирует скелетный и соматический рост, а также оказывает выраженное влияние на метаболические процессы. Основа механизма его действия состоит в стимуляции роста костей
скелета путем воздействия на пластинки эпифиза трубчатых костей, в частности на костный метаболизм
у детей. Кроме того, соматотропин способствует нормализации структуры тела посредством увеличения
мышечной массы и снижения жировой массы тела. При этом увеличивается число и размер клеток
мышц, а также печени, вилочковой железы, половых желез, надпочечников, щитовидной железы. Стимуляция транспорта аминокислот в клетку и синтеза белков снижает уровень холестерина, воздействуя на
профиль липидов и липопротеидов. Помимо этого, соматотропин подавляет высвобождение инсулина,
способствует задержке натрия, калия и фосфора в организме, что положительно влияет на мышечную
активность и физическую выносливость.
У пациентов с дефицитом гормона роста и остеопорозом заместительная терапия приводит к нормализации минерального состава и плотности костей.
Показаниями к применению hGH у детей являются задержка роста вследствие недостаточной секреции гормона роста, синдром Шерешевского-Тернера, хроническая почечная недостаточность (снижение функции почек более чем на 50%) в препубертатном периоде. У взрослых применение hGH показано
при подтвержденном врожденном или приобретенном выраженном дефиците гормона роста в качестве
заместительной терапии.
Тем не менее, медицинское применение существующих препаратов hGH, таких как "Растан", ограничено рядом факторов, среди которых наиболее существенным является недостаточная энзиматическая
стабильность в организме, которая приводит к необходимости увеличения частоты введения препарата,
что в ряде случаев сопряжено с побочными эффектами, например аллергией.
Так, после подкожного введения абсорбция соматропина составляет 80%, Cmax в плазме крови достигается через 3-6 ч, время полувыведения составляет всего 3-5 ч. В связи с этим возникает необходимость в химическом модифицировании молекулы hGH с целью преодоления указанных недостатков.
Для модифицирования различных полипептидов известно применение монометоксиполиэтиленгликоля (мПЭГ), который представляет собой нейтральный полиэфир с различной молекулярной массой
[Никитин И.Г., Сторожаков Т.Н. Пегилированные лекарственные препараты: современное состояние,
проблемы и перспективы, в сб.: "Вирусные гепатиты: достижения перспективы", № 3 (13) (2001), с. 3-8].
Как правило, в ковалентных конъюгатах полимерный фрагмент присоединен к полипептиду через
одну из свободных аминогрупп последнего [Kozlowski A., Charles S.A., Harris J.М. Development of Pegylated Interferons for the Treatment of Chronic Hepatitis С. BioDrugs.; vol. 15(7) (2001), p. 419-429], а препарат представляет собой смесь позиционных изомеров, химическая структура которых друг от друга отличается местом прикрепления полимера к полипептиду. Теоретически число позиционных изомеров в
данном случае равно количеству свободных аминогрупп в полипептиде [Блохин Н.П., Никитин И.Г.
Особенности фармакологической динамики и кинетики пегилированного α-интерферона (40 кДа) "Пегасис": новые возможности терапии хронического гепатита С, в сб.: "Материалы VII Российской конференции "Гепатология сегодня", РЖГГК, 2002, с. 6].
Например, в международной заявке WO 2009/133137 (опубл. 05.11.2009) раскрыта фармацевтическая композиция, содержащая подходящие фармацевтические эксципиенты, а также содержащая пролекарственный конъюгат гормона роста человека (hGH) формулы hGH-NH-La-S°, в которой hGH-NH представляет остаток hGH; La представляет функциональную группу, способную к аутогидролизу; a S° является полимерной цепью, имеющей молекулярную массу по меньшей мере 5 кДа.
Одним из способов снижения числа позиционных изомеров является присоединение ПЕГ преимущественно к N-терминальной аминогруппе полипептида, используя разность значений pKa для Nконцевой α-аминогруппы и ε-аминогруппы лизиновых фрагментов белка.
Так, в международной заявке WO 2006/024953 (опубл. 09.03.2006) предложен ковалентный конъюгат hGH структуры
-1-
019967
где n - целое число от 60 до 75;
m - целое число от 450 до 460;
R - человеческий гормон роста, в котором ПЕГ присоединен по α-аминогруппе N-терминального
фенилаланина.
В международной заявке WO 2005/079838 (опубл. 01.09.2005) предложены ковалентные конъюгаты
соматотропина, в которых ПЕГ присоединен к N-терминальной аминогруппе полипептида, имеющие
следующие структуры:
и
где n - целое число от 1 до 10;
m - целое число от 1 до 10;
R - человеческий гормон роста или метионилированный гормон роста.
Однако условия конъюгации в данных патентах полностью не исключают вероятность присоединения ПЕГ к ε-аминогруппам лизиновых фрагментов, часть которых, несмотря на высокое значение pKa,
даже при кислых рН депротонирована, а их молярное соотношение к N-терминальной α-аминогруппе в
молекуле hGH как 9:1 соответственно.
Известно, что позиционные изомеры полипептидов имеют различную биологическую активность
(US 2004/0223950, опубл. 11.11. 2004). Это создает предпосылки для расширения арсенала таких средств
за счет различных вариантов модифицирования молекул протеинов. Например, изменение положений и
способов присоединения ПЭГ к протеину позволяет изменить соотношения позиционных изомеров, а
также получить новые типы конъюгатов, в которых, например, не затронуты аминогруппы полипептидов.
Наиболее близкими по технической сущности рассматриваются физиологически активные конъюгаты, в частности, инсулина, раскрытые в US 4179337 (опубл. 18.12.1979), содержащие в молекуле фрагмент парафенилендиазония и имеющие строение аминоазопроизводного формулы
где R представляет PEG-O-CH2-, PEG-O-CH2-CH(ОН)-СН2-О- или PEG-O-C(=O)-; а
представляет пептидную цепь.
Недостатками таких производных являются относительно большое количество возможных вариантов позиционных изомеров вследствие присоединения полимерной части к аминогруппам полипептидов
и их невысокая стабильность в организме и, как следствие, связанные с этим возможности неконтролируемого изменения структуры и отщепления реакционноспособных частиц, в частности диазосоединений.
Таким образом, существует потребность в новых конъюгатах hGH.
-2-
019967
Сущность изобретения
Авторы изобретения неожиданно установили, что конъюгаты ПЕГ с hGH, в которых полимер присоединен к тирозиновым и/или гистидиновым фрагментам соматотропина посредством азогруппы, имеющие общую структуру (I), приобретают способность длительной циркуляции в крови и сохраняют значительную часть биологической активности немодифицированного соматотропина
где А - аминокислотный фрагмент гистидина;
В - аминокислотный фрагмент тирозина;
hGH - соматотропин;
n - целое число от 10 до 1200;
m принимает значения от 0 до 3;
k принимает значения от 0 до 8, причем m≠k, если m или k равны 0.
Для доказательства строения конъюгата как азосоединения применяют, в частности, электронную
спектроскопию поглощения (ЭСП), сравнивают спектральные характеристики (интенсивность, ширину и
положение максимумов полос поглощения) растворов монопегилированного, дипегилированного и немодифицированного hGH и интерпретируют полученные закономерности с позиций теории цветности
органических соединений, необязательно, с привлечением адекватных методов квантово-химического
моделирования. Характеристики максимумов полос поглощения приведены в табл. 1.
Таблица 1
Характеристики максимумов полос поглощения hGH и его моно- и
дипегилированных производных (вода, рН 4,5, 11,0 см)
- поглощение 1% (мас./об.) раствора при 11 см;
* - проявляется в виде плеча.
Появление полос поглощения у моно- и дипегилированного hGH с максимумами при 333 и 404 нм
может быть объяснено, например, с позиций теории цветности органических соединений, локальными
электронными переходами в хромофорных системах, не связанных сопряжением диарилазогрупп, образовавшихся в результате ковалентного присоединения ПЭГ-агента к тирозиновым и гистидиновым звеньям hGH. Уширение полос обусловлено наличием нескольких позиционных изомеров с близкими энергиями электронно-колебательных переходов.
Достижение технического результата, заключающегося в увеличении времени циркуляции в кровотоке моно- и дипегилированного hGH, подтверждают в сериях исследований на мышиной модели. Результаты сравнительных исследований in vivo приведены в табл. 2.
Таблица 2
Время достижения максимальной концентрации (Tmax) и период полупревращения (Т1/2) hGH и
его конъюгатов в соответствии с изобретением в крови мышей после п/к инъекции
Приведенные данные показывают, что конъюгаты hGH в соответствии с изобретением обладают
большим временем циркуляции в кровотоке по сравнению с немодифицированным соматотропином.
-3-
019967
Результаты исследования биологической активности конъюгатов в соответствии с настоящим изобретением приведены в табл. 3.
Таблица 3
Биологическая активность моно- и дипегилированного соматотропина
относительно немодифицированного hGH
Таким образом, конъюгаты в соответствии с настоящим изобретением сохраняют существенную
часть биологической активности немодифицированного гормона роста человека.
В соответствии с изобретением конъюгаты соматотропина с высокой степенью чистоты могут быть
получены способом, включающим стадии, на которых:
а) метоксиполиэтиленгликолевый эфир аминобензойной кислоты
где n принимает значения от 10 до 1200,
диазотируют нитритом щелочного или щелочно-земельного металла в водной или водно-органической
среде при температуре от -2 до 30°С или органическим нитритом в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40 до 30°С, молярном соотношении нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от 1,1:1 до 1000:1 и
молярном соотношении кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты от
3:1 до 10000:1 с последующим удалением избытка нитрита и получением активированного пегилирующего агента - ([метоксиполиэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония
где n принимает вышеуказанные значения;
б) активированный пегилирующий агент без выделения из реакционной смеси вводят в реакцию
азосочетания с hGH в молярном соотношении ПЕГ-агента к hGH от 1 до 100 к 1 соответственно, в водной или водно-органической среде с рН от 7,0 до 10,0 при температуре от 0 до 30°С; по достижении степени превращения по меньшей мере 70% реакцию останавливают добавлением к реакционной массе
низкомолекулярной азосоставляющей с получением смеси конъюгатов разной степени пегилирования,
немодифицированного соматотропина и блокированного ПЭГ-агента;
в) полученную смесь разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов с выделением hGH необходимой степени пегилирования.
При реализации заявленного способа обеспечивается повышение выхода пегилированного hGH,
увеличение времени его циркуляции в кровотоке.
Повышение выхода пегилированного hGH достигается за счет количественного переведения ПЕГагента в активную форму непосредственно перед конъюгацией, исключая деградацию активной группировки - диазогруппы при транспортировке и хранении.
Увеличение времени циркуляции пегилированного hGH в кровотоке возможно за счет способности
тирозиновых и гистидиновых звеньев hGH вступать в реакцию азосочетания с активными диазосоединениями с образованием биологически активных азопроизводных соматотропина.
В случае необходимости, повышение устойчивости пегилирующего агента при хранении достигается в результате применения для активации пегилирующего агента органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, что дополнительно позволяет расширить температурный диапазон проведения реакции диазотирования.
В предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят нитритом натрия
в среде водного раствора бромисто-водородной кислоты, а избыток нитрита удаляют сульфаминовой
кислотой.
В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии а) диазотирование проводят третбутилнитритом в присутствии HCl в тетрагидрофуране.
В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии б) для создания и поддержания
рН применяют боратно-карбонатный буферный раствор, степень превращения hGH составляет 75-100%,
-4-
019967
а в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют тирозин.
В следующем предпочтительном варианте изобретения на стадии в) смесь разделяют ионообменной
хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М NaCl.
На стадии а) диазотирование метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты осуществляют прибавлением нитрита щелочного или щелочно-земельного металла в кислой водной или
водно-органической среде при температуре от -2 до 30°С.
В первом варианте диазотирования применяют нитрит щелочного или щелочно-земельного металла
в кислой водной или водно-органической среде. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от 0 до 5°С. Кислую среду создают с помощью органических кислот, например с
помощью уксусной кислоты или ее галогенпроизводных, таких как хлоруксусная, трихлоруксусная, бромуксусная, трибромуксусная, трифторуксусная кислоты, а также лимонной или винной кислот, или неорганических кислот, например хлористо-водородной, бромисто-водородной, серной или фосфорной кислот, а также смесью органических и/или неорганических кислот. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. Молярное соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 3:1 до 10000:1. Реакцию предпочтительно проводят в присутствии катализатора диазотирования, в качестве которого используют бромид-ионы, вносимые в реакционную
смесь в виде бромоводородной кислоты или ее растворимых солей, например бромидов щелочных металлов. Наиболее предпочтительно создавать кислую среду раствором бромисто-водородной кислоты.
Во втором варианте диазотирование проводят с применением органического нитрита в среде полярного органического растворителя, неограниченно смешивающегося с водой, при температуре от -40
до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал температур диазотирования составляет от -20 до 0°С.
Предпочтительными органическими нитритами являются бутилнитриты или амилнитриты, более предпочтительно трет-бутилнитрит. Молярное соотношение нитрита к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от 1,1:1 до 1000:1, предпочтительно от 1,1:1 до 10:1. Кислую
среду в полярной органической среде создают растворами HCl или HBr в алифатическом эфире, например диэтиловом эфире, или циклическом эфире, например диоксане или тетрагидрофуране. Молярное
соотношение кислоты к метоксиполиэтиленгликолевому эфиру аминобензойной кислоты составляет от
3:1 до 10000:1.
По завершении диазотирования активированный ПЭГ-агент можно хранить при пониженной температуре в течение не более 2 ч в водной или водно-органической среде или не более 24 ч в полярной
органической среде без существенной потери его способности к азосочетанию. Термин "пониженная
температура" означает температуру от -2 до 5°С в случае применения водной или водно-органической
среды и от -40 до 0°С в случае применения полярной органической среды. Перед применением активированного ПЭГ-агента для пегилирования интерферона требуется удаление избытка нитрит-ионов, для
чего к его раствору добавляют мочевину или сульфаминовую кислоту. Альтернативно применяют азиды
щелочных или щелочно-земельных металлов.
На стадии б) пегилирование соматотропина достигается в результате протекания реакции азосочетания диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира аминобензойной кислоты с hGH в нейтральной или слабощелочной водной или водно-органической среде при температуре от 0 до 30°С. Наиболее предпочтительный интервал рН при пегилировании составляет от 9 до 10. Поддержание рН обеспечивают применением подходящего буферного раствора, например боратно-карбонатного буферного
раствора. Выбор раствора находится в рамках компетенции среднего специалиста в данной области. Молярное соотношение диазотированного метоксиполиэтиленгликолевого эфира 4-аминобензойной кислоты к hGH составляет от 1:1 до 100:1, наиболее предпочтительно от 3:1 до 8:1.
Контроль процесса пегилирования осуществляют эксклюзионной или обращено-фазовой ВЭЖХ.
По достижении требуемой степени превращения полипептида реакцию пегилирования останавливают
добавлением к реакционной массе низкомолекулярной азосоставляющей. Для этого в качестве низкомолекулярной азосоставляющей применяют вещества фенольной природы или их эфиры, вещества, имеющие природу ароматических аминов, или вещества, имеющие гетероциклическую природу, у которых
гетероцикл способен выступать в качестве азосоставляющей в реакции азосочетания. Наиболее предпочтительными являются тирозин и гистидин, более предпочтительно тирозин. Предпочтительно степень
превращения hGH, вычисленная по результатам ВЭЖХ-анализа, составляет 75-100%.
Выделение пегилированного hGH из реакционной смеси осуществляют обычными методами ионообменной хроматографии, последовательно используя буферные растворы с возрастающей ионной силой. Концентрацию hGH определяют методом ВЭЖХ или спектрофотометрически, используя соответствующее значение А280 для раствора с концентрацией полипептида 1 мг/мл.
-5-
019967
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами, подтверждающими возможность его осуществления с достижением указанного в описании технического результата.
Пример 1. Получение пегилированного hGH.
К охлажденному до 1°С раствору 0,5 мкмоль hGH в боратно-карбонатном буфере с рН 9,5 приливают охлажденный раствор 2,0 мкмоль 4-([метоксиполиэтиленгликольокси]карбонил)бензолдиазония
(М.м. 30 кДа), поддерживая рН реакционной смеси 9,5±0,3. Реакционную смесь при охлаждении перемешивают приблизительно 3 ч, контролируя протекание превращений обращено-фазовой ВЭЖХ (колонка Kromasil 300-5C4, 250×4,6 мм, спектрофотометрическое детектирование при 220, 280, 340 и 400 нм,
градиентное элюирование: от 30% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ до 80% водн. ацетонитрил+0,2% ТФУ).
По достижении степени превращения hGH, равной 70-75% приливают раствор тирозина, перемешивают
10 мин и уксусной кислотой доводят рН до 5,0-6,5. Далее реакционную смесь, содержащую смесь дипегилированого, монопегилированного и немодифицированного hGH, а также блокированный пегилирующий агент, разделяют ионообменной хроматографией с увеличением ионной силы буферных элюирующих растворов от 0,02 до 1,0 М NaCl. Выход очищенного монопегилированного hGH 42% (считая на
hGH). ЭСП (вода, рН 4,5, 11,0 см), λмакс, нм
: 204 (213,8), 276 (7,8), 333 (7,5), 404 (4,3). Выход
очищенного дипегилированного hGH 23% (считая на hGH). ЭСП (вода, рН 4,5, 11,0 см), λмакс, нм
: 204 (333,2), 276 (11,6), 333 (11,7), 404 (6,6).
Пример 2. Определение времени циркуляции моно- и дипегилированного hGH в крови на мышиной
модели.
Самцам мышей линии СВА вводят подкожно по 5 мкг моно- и дипегилированного hGH в соответствии с изобретением, после чего собирают кровь в первый день через 2 ч после инъекции и далее через
каждые 24 ч в течение 10 дней. В качестве контроля используют немодифицированный hGH, который
вводят по той же схеме. Взятые пробы крови инкубируют в течение 45 мин при 37°С, после чего отделяют тромб и повторно инкубируют при 4°С, полученную сыворотку центрифугируют и сохраняют при
- 65°С до проведения тестов. Содержание в сыворотках крови (нг/мл) определяют с помощью ИФА набора "DRG Гормон роста человека", далее рассчитывают время достижения максимальной концентрации и период полупревращения.
Пример 3. Определение активности моно- и дипегилированного hGH.
Биологическую активность hGH определяют, используя стандартные методики, известные специалисту в данной области. В частности, биологическую активность, связанную с нативным или немодифицированным hGH, измеряют в соответствии со стандартными исследованиями in vitro пролиферации
клеток [Clark et al. J. Biol. Chem. Vol. 271, p. 21969-21977], а также любую из методик, указанных в примере 1 патента ЕР 2113256 А1. Специалисту в данной области также очевидны модификации указанных
методик, а также принципы выбора аналогичных методик и условий их выполнения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ковалентный конъюгат полиэтиленгликоля с гормоном роста человека, в котором полимер присоединен к тирозиновым и/или гистидиновым фрагментам соматотропина посредством азогруппы, имеющий общую структуру (I)
где А - аминокислотный фрагмент гистидина;
В - аминокислотный фрагмент тирозина;
hGH - соматотропин;
n - целое число от 10 до 1200;
m принимает значения от 0 до 3;
k принимает значения от 0 до 8, причем m≠k, если m или k равны 0.
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
-6-