Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет»
advertisement
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Ишонина Оксана Георгиевна ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В КРОВИ ПАЦИЕНТОК С САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВОЗРАСТА И СТЕПЕНИ КОМПЕНСАЦИИ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА 03.01.04 – биохимия Диссертация на соискание учѐной степени кандидата биологических наук Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор З.И. Микашинович Ростов-на-Дону 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………........... 5 Глава 1. ЭТИОПАТОГЕНЕЗ И ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)………………………………………….. 13 1.1. Эпидемиология сахарного диабета 2 типа………………… 13 1.2. Критерии диагностики и состояния компенсаторных механизмов при сахарном диабете 2 типа…………............ 16 1.3. Патогенез и возрастные особенности течения СД 2 типа…………………………………………………………. 1.4. Роль гипергликемии в развитии окислительного стресса и старении организма………………………………………… Глава 2. Глава 3. 19 28 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ………………… 38 2.1. Характеристика объекта исследования……………………. 38 2.2. Получение биологического материала…………….............. 41 2.3. Лабораторно-биохимические методы исследования……... 42 2.4. Статистическая обработка результатов…………………… 50 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ................................................. 52 3.1. Состояние углеводно-энергетического обмена у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена……………………….. 52 3.1.1. Содержание глюкозы ……………………………… 53 3.1.2. Содержание С-пептида ………………………......... 55 3.1.3. Активность гексокиназы………………………….. 3.1.4. Содержание 2,3-дифосфоглицерата ……………… 60 3.1.5. Активность фосфогексокиназы …………………... 62 3.1.6. Содержание пировиноградной и молочной 58 кислот………………………………………….......... 64 3 3.2. 3.1.7. Коэффициент лактат/пируват……………………... 67 3.1.8. Активность гликогенфосфорилазы ………………. 70 3.1.9. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы…… 72 Состояние газотранспортной системы крови у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена………………………. 3.3. 77 3.2.1 Уровень гемоглобина………………………………. 77 3.2.2. Содержание эритроцитов………………………….. 79 3.2.3. Уровень гликозилированного гемоглобина….. …. 80 Антиоксидантная ферментативная система крови у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена……………………….. 85 3.3.1. Активность Cu,Zn-супероксиддисмутазы ……….. 85 3.3.2. Активность каталазы …………………………....... 88 3.3.3. Состояние глутатионзависимого ферментного комплекса…………………………………………… 91 3.4. Оценка стабильности мембран эритроцитов, уровня вторичных продуктов ПОЛ у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена ……………………………………….. 103 3.4.1. Содержание внеэритроцитарного гемоглобина … 103 3.4.2. Содержание малонового диальдегида……………... 105 3.4.3. Оценка степени деструкции компонентов мембран эритроцитов (ФРПМ)………………………………. 108 4 3.5. Статистический анализ связей между изучаемыми параметрами у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена … 112 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ…….……….. 123 ВЫВОДЫ………………………………………………………….... 146 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ…. 148 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………….............. 149 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования Проблема сахарного диабета 2 типа (СД 2 типа) привлекает к себе врачей разных специальностей, так как распространѐнность его во всѐм мире растѐт и приобретает характер пандемии, которая охватила практически все государства, в том числе и Россию (Дедов И.И. и др., 2011; Diabetes atlas, 2009). По данным Международной ассоциации диабета (IDF), в 2011 г. численность больных СД уже достигла 366 млн., а по прогнозам экспертов ВОЗ, к 2030 г. число больных СД 2 типа составит 552 млн. человек (Сунцов Ю.И., 2012). Сахарный диабет 2 типа в пожилом возрасте - проблема современной медицины, так как ставит перед врачами задачу коррекции не только углеводного обмена, но и всех систем организма (Nathan D.M. et al., 2009). Старение населения – характерное демографическое явление современной эпохи. По мере старения увеличивается патологическая поражѐнность организма, число заболеваний растет, определенная часть их переходит в хронические формы (Шабалин В.Н. Васильчиков В.М.., 2005). В патогенезе СД 2 типа участвуют несколько компонентов: генетические, внешнесредовые, и конечно, возраст. Основным патогенетическим механизмом развития СД 2 типа является возрастное снижение толерантности к глюкозе, причѐм наибольшие изменения претерпевает постпрандиальная гликемия, в то время как гликемия натощак изменяется незначительно. Вопрос о том, что может лежать в основе этих нарушений толерантности остаѐтся открытым. С возрастом изменяются основные механизмы, которые отвечают за обмен глюкозы. Это и инсулинорезистентность тканей, снижение секреции инсулина, снижение чувствительности поджелудочной железы к инсулиностимулирующему действию инкретинов (Дедов И.И. и др., 2011, Annette M., 2003). 6 Огромное количество публикаций посвящѐно диагностике, лечению и профилактике СД 2 типа, но, на сегодняшний день, он всѐ ещѐ остаѐтся неизлечимым заболеванием (ADA. Standarts of Medical Care in Diebetes, 2010; Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., 2006). Так как заболевание может протекать без классических симптомов декомпенсации углеводного обмена, то трудности возникают, начиная с прогностики и диагностики, т.е. выбор информативных маркеров степени компенсации углеводного обмена является актуальным на сегодняшний день. Отчасти это можно объяснить всѐ ещѐ не ясными особенностями течения СД 2 типа в пожилом возрасте: клиническими, лабораторными, психосоциальными, которые формируют патогенез заболевания (И.И. Дедов, М.В. Шестакова, 2009). Несмотря на очевидные успехи последних десятилетий в области изучения патогенеза СД 2 типа, механизмов, вызывающих инсулинорезистентность, накопление обширного клинико-биохимического материала о ведущей роли свободнорадикальных процессов в патогенезе СД 2 типа, комплексных данных о состоянии углеводно-энергетического обмена, газотранспортной, про- и антиоксидантной систем в зависимости от возрастных особенностей компенсации углеводного обмена в доступной литературе нет. Таким образом, существует очевидная незавершѐнность исследований молекулярных основ СД 2 типа в возрастном аспекте. В этой связи актуальным и перспективным направлением в науке является анализ особенностей метаболических изменений в крови пациенток с СД 2 типа разных возрастных групп с определением превалирующей роли возраста и/или степени компенсации углеводного обмена в патогенезе СД 2 типа. Этой важной проблеме посвящено данное диссертационное исследование. 7 Цель работы В зависимости от возраста пациенток и стадии компенсации углеводного обмена определить характер метаболических изменений в эритроцитах и плазме крови, оценить их информативность и разработать способ лабораторной диагностики уровня компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа. Задачи исследования 1. Проанализировать характер изменений показателей углеводного обмена в эритроцитах в зависимости от возраста пациенток и стадии компенсации углеводного обмена. 2. Определить состояние основных параметров газотранспортной системы эритроцитов у пациенток разных возрастных групп при суб- и декомпенсированном течении СД 2 типа для оценки степени выраженности гипоксии. 3. Определить активность ферментативных антиоксидантов в крови, стабильность мембран эритроцитов, содержание вторичных продуктов перекисного окисления липидов у пациенток с СД 2 типа в зависимости от их возраста и степени компенсации заболевания. 4. Провести статистический анализ связей между параметрами углеводно-энергетического обмена, газотранспортной, антиоксидантной систем крови, стабильности мембран эритроцитов и вторичных продуктов перекисного окисления липидов для определения их роли в формировании компенсаторноадаптивных механизмов в условиях различной толерантности к гипергликемии у пациенток с СД 2 типа в зависимости от их возраста. 8 Научная новизна результатов Впервые показано, что развитие гипоксии на фоне СД 2 типа сопровождается активацией модуляционных и количественных показателей адаптации и зависят от возраста пациенток, а уровни общего гемоглобина (HbА) и гликозилированного гемоглобина (HbA1C) зависят от стадии углеводного обмена. Впервые установлено, что изменения углеводно-энергетического обмена в эритроцитах при СД 2 типа имеют возрастные особенности. Установлено, что у пожилых пациенток при суб- и декомпенсации происходит снижение скорости включения глюкозы в гликолитические процессы, в то время как у пациенток более молодого возраста выявляется иная закономерность: в стадии субкомпенсации происходит активация начальных этапов пентозо-фосфатного пути (ПФП), а в стадии декомпенсации - выраженная активация гликогенолиза. В модельном эксперименте на изолированных фракциях эритроцитов пациенток с СД 2 типа с добавлением в среду гликогена установлено, что активность фосфорилазы прогрессивно возрастает с увеличением возраста пациенток и степени тяжести заболевания. Эти данные указывают на приспособительный характер клеточных реакций, направленных на поддержание структурно-функциональной целостности эритроцитов. Впервые получены сведения об активации ферментов антиоксидантоной защиты (АОЗ) в эритроцитах на фоне роста содержания внеэритроцитарного гемоглобина (ВЭГ) и малонового диальдегида (МДА) в плазме крови, зависящие от возраста и отражающие включение внутриклеточных механизмов защиты от накопления токсических продуктов в «окружающей среде» по мере роста гипергликемии. Впервые на основании анализа содержания восстановленного глутатиона (GSH) и МДА в крови рассчитан фактор риска пероксидации мембран эритроцитов (ФРПМ), указывающий на то, что у пациенток разных возрастных групп в стадии декомпенсации наиболее выражено усиление дезинтеграционных 9 процессов, снижающих устойчивость эритроцитов к внутренним повреждающим факторам. Впервые методом корреляционного анализа определены метаболические блоки, свидетельствующие о функциональной взаимосвязи между углеводноэнергетическим обменом, газотранспортной, антиоксидантной систем крови и структурным состоянием мембран эритроцитов. На этом основании определена роль эритроцитов в формировании общего адаптационного синдрома в условиях различной толерантности к гипергликемии у пациенток с СД 2 типа в зависимости от их возраста. Теоретическая и практическая значимость работы В теоретическом плане полученные результаты, основывающиеся на характере изменений параметров углеводно-энергетического обмена, газотранспортной и антиоксидантной систем крови и структурного состояния мембран эритроцитов, вносят вклад в понимание роли метаболических изменений в эритроцитах, приводящих к изменению их биологических свойств, степень выраженности которых отражает приспособительные возможности организма в условиях гипергликемии в разных возрастных группах при СД 2 типа. Научный интерес представляют данные, свидетельствующие об особенностях молекулярных перестроек у пациенток более молодого возраста, направленных на активацию ПФП или включение альтернативных путей поддержания пула углеводов, например, за счѐт усиления гликогенолиза, а также усиление образования фруктозо-6-фосфата в фосфогексокиназной реакции (ФГИреакции), возникающее в ответ на снижение активности гексокиназы, для поддержания гликолиза и предотвращения осмотического лизиса. Результаты работы вносят вклад в понимание патогенетической роли метаболических сдвигов в эритроцитах в условиях формирования тканевой гипоксии на фоне гипергликемии, зависящих от степени тяжести патологического процесса и возраста пациенток. Выявленное нарастание гипоксии с возрастом и снижение 10 компенсаторных возможностей организма указывают на необходимость применения антигипоксантов и антиоксидантов в комплексной терапии СД 2 типа. На основании супероксиддисмутазы изменений активности (Cu,Zn-СОД), ферментов глутатионпероксидазы Cu,Zn(ГПО), фосфогексокиназы (ФГИ), глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (гл-6-ФДГ) на разных стадиях развития СД 2 типа разработан способ лабораторной диагностики уровня компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа (заявка на изобретение № 2012153040/15(084445), приоритет от 07.12.2012). Материалы исследования используются в учебном процессе на кафедре общей и клинической биохимии №1 ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. Основные положения, выносимые на защиту 1. Изменения активности ключевых ферментов углеводного обмена в эритроцитах имеют возрастные отличия и отражают степень тяжести заболевания. У пациенток более молодого возраста в стадии субкомпенсации углеводного обмена в эритроцитах выявлена активация начальных этапов пентозо-фосфатного пути. У пожилых пациенток при стадии декомпенсации происходит тотальное снижение скорости включения глюкозы в окислительные процессы на фоне выраженной активации гликогенолиза и гипергликемии. 2. Течение СД 2 типа характеризуется развитием хронической гипоксии у пациенток разных возрастных групп, что подтверждается активацией в эритроцитах модуляционных и количественных показателей адаптации, достигающих максимальной выраженности у пожилых пациенток в стадии декомпенсации углеводного обмена. 3. С увеличением возраста пациенток регистрируется усиление ферментативной антиокислительной защиты эритроцитов, что подтверждается корреляционными связями между ростом активности ферментов первой и второй линии защиты у пациенток пожилого возраста. В стадии декомпенсации СД 2 11 типа в разных возрастных группах регистрируется усиление процессов деструкции мембран эритроцитов. 4. Рассчитанные нами коэффициенты эффективности ферментной антиоксидантной защиты эритроцитов (К1 = Cu,Zn-СОД/ГПО) и интенсивности гликолиза (К2=ФГИ/гл-6-ФДГ) отображают уровень компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа. Апробация работы Основные результаты исследования доложены на VI, VII, IX межвузовских конференциях с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (Ростов-на-Дону, 2007, 2008, 2010), международной научной конференции «Социально-политические проблемы в условиях глобализации» кафедры политической социологии ЮФУ (Ростов-на-Дону, 2009), V Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (Томск, 2011), VII научно-практической конференции молодых учѐных с международным участием (Ростов-на-Дону, 2012), на I Международной открытой научнопрактической женщины конференции как «Предупреждение инновационная система преждевременного здоровьесбережения в старения условиях информационного общества» (Киев, 2013), X Международной заочной научнопрактической конференции «Научная дискуссия: инновации в современном мире» (Москва, 2013). Автор лично принимала участие в сборе материала, лабораторном исследовании, статистическом анализе, в обработке материала и написании глав диссертации. Публикации По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 7 – в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ. Подана заявка на изобретение «Способ лабораторной диагностики уровня компенсации углеводного обмена при СД 2 типа» (заявка № 2012153040/15(084445), приоритет от 07.12.2012). Общий объем публикаций составил 2,36 п.л., личный вклад - 88 %. 12 Структура и объѐм работы Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 224 источников, из них 147 – отечественных и 77 зарубежных. Диссертационная работа иллюстрирована 17 рисунками и содержит 19 таблиц. 13 Глава 1. ЭТИОПАТОГЕНЕЗ И ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ САХАРНОГО ДИАБЕТА 2 ТИПА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1. Эпидемиология сахарного диабета 2 типа Сахарный диабет (СД) является одним из наиболее распространѐнных заболеваний среди населения. СД – это хроническое, потенциально инвалидизирующее заболевание, разработка эффективного лечения которого требует усилий как теоретических так и практических. По определению Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (1999), сахарный диабет – это группа метаболических (обменных) заболеваний, характеризующихся гипергликемией, которая является результатом дефектов секреции инсулина, действия инсулина или обоих этих факторов (WHO/NCD/NCS/1999; Дедов И.И., Шестакова М.В., 2006). Согласно классификации ВОЗ (1999) сахарный диабет типа 2 (СД 2 типа) сопровождается преимущественной инсулинорезистентностью и относительной инсулиновой недостаточностью или преимущественным дефектом секреции инсулина с инсулинорезистентностью или без неѐ. В последние десятилетия распространѐнность СД приобрела характер пандемии, которая охватила практически все государства, в том числе и Россию (Маколина Н.П. и др.2008; Сунцов Ю.И., 2008, 2012). Согласно оценкам ВОЗ, Китай, Индия и Российская Федерация могут затратить в следующие 10 лет (2006–2015 гг.) до 550 млрд. долларов национального дохода на лечение больных сердечно-сосудистыми заболеваниями и сахарным диабетом (Каменева Е.А. и др., 2008). В 2007г. количество больных СД во всем мире составило 246 млн. человек, что составляет 6% населения в возрасте от 20 до 79 лет, а по данным Международной ассоциации диабета (IDF), в 2011 г. численность больных СД уже достигла 366 млн. (Сунцов Ю.И. и др., 2011; Недосугова Л.В., 2013). К 2025г. ожидается, что количество заболевших достигнет 380 миллионов (Крутько В.Н., Смирнова Т.М., 2002). В ближайшие два десятилетия число зарегистрированных 14 больных в России достигнет 5,81 млн. человек. Диабетом типа 2 страдают 85-90% больных диабетом в России (Голованова Е.Д. и др., 2005). Рост распространѐнности СД обусловлен высокой частотой встречаемости СД типа 2 среди взрослого населения. Довольно актуальным для России в настоящее время является показатель роста темпа преждевременного старения населения (Лазебник Л.Б., 2005). Темп старения, в свою очередь, характеризует индивидуальную программу скорости изменения физиологических и патологических детерминант организма (Анисимов В.Н., 2005). Существует зависимость распространѐнности СД 2 типа от возраста больного. Например, в возрасте 45-54 года СД типа 2 встречается с частотой 8,2%, а в возрасте 65-74 года – 17,9% (Дедов И.И., 2008). Сахарный диабет типа 2 называют «болезнью зрелого и пожилого возраста» или «ассоциированной с возрастом» болезнью (Дедов И.И. и др., 2002). Средняя продолжительность жизни женщин, больных СД типа 2 составляет 73,4 года, мужчин – 67,6 лет (Дедов И.И., Шестакова М.В., 2006). Помимо высокой распространѐнности, СД является одной из частых причин инвалидизации и летальности, что обусловлено его сосудистыми осложнениями, к которым относятся микроангиопатия (ретинопатия и нефропатия) и макроангиопатия (инфаркт миокарда, инсульт, гангрена нижних конечностей) и невропатия. СД является одним из основных факторов риска ишемического инсульта (Гусев Е.И. и др., 2002). Несмотря на сложность патогенеза поздних осложнений СД, основную роль в их инициации и прогрессировании играет хроническая гипергликемия или отсутствие компенсации основного заболевания (Балаболкин М.И. и др., 2005). Сахарный диабет создает большую угрозу для здоровья населения семей, государств и всего мира, и серьѐзно осложняет достижение согласованных на международном уровне целей развития, включая цели, сформулированные в «Декларации тысячелетия» (Резолюция № A/RES/61/225 «Всемирный день борьбы с диабетом» 61-й сессии Генеральной Ассамблеи ООН от 20 декабря 15 2006г. [Электронный ресурс]. Женева, 2006-2007. URL: http://www.un.org/ru/ga/61/docs/61res_nocte.shtml). Актуальность проблемы диабетических ангиопатий наглядно подтверждается тем, что среди больных СД в возрасте до 20 лет смертность в 7 раз превышает таковую среди населения в целом, а после достижения 20-летного возраста среднегодовой риск смертности в 20 раз выше по сравнению с общей популяцией (Молитвословова Н.А., Никононова Т.В., 2009; Дедов И.И. и др. 2008). Также в качестве факторов, лимитирующих качество и продолжительность жизни больных СД, на первый план ставят поздние сосудистые осложнения. Диабетический кетоацидоз также является серьѐзным проявлением декомпенсации СД типа 2 (IDF Diabetes atlas. Forth edition, 2009. [Электронный ресурс]. URL: http://www.idf.org/diabetesatlas). Приведѐнные данные наглядно показывают медицинскую, социальную и экономическую важность данной проблемы. Уменьшить текущие расходы на оказание медицинской помощи таким пациентам, значительно снизить заболеваемость и частоту поздних осложнений СД 2 типа, а также повысить длительность и качество жизни больных возможно лишь при рациональной и согласованной организации всех звеньев диабетологической службы. Современный уровень научных исследований позволяет приступить к обоснованной разработке методов ранней диагностики заболевания и широкому проведению профилактических мероприятий. Решению этих вопросов была посвящена Федеральная целевая программа «Сахарный диабет» (2002), в которой предусмотрено проведение организационных, диагностических, лечебных и профилактических распространенности мероприятий, сахарного направленных диабета, на уменьшение летальности среди таких пациентов (Дедов И.И. и др., 2002). снижение частоты инвалидизации и 16 1.2. Критерии диагностики и состояния компенсаторных механизмов при сахарном диабете 2 типа На сегодняшний день при скрининге нарушений углеводного обмена могут использоваться два подхода – ВОЗ и Американской диабетической ассоциации (АДА) (Balkau B. еt al.,2005; Dekker J.M., Balkau B.,2006). В соответствии с рекомендациями ВОЗ (1999, 2006) диагностическое значение имеют следующие уровни глюкозы плазмы крови натощак (Дедов И.И., Шестакова М.В.) (таблица 1.1.). Таблица 1.1 Диагностические критерии сахарного диабета Концентрация глюкозы в ммоль/л (мг/дл) Цельная кровь Плазма венозная капиллярная венозная капиллярная > 6,1 (>110) > 6,1 (>110) > 7,0 (>126) > 7,0 (>126) Натощак Через 2 ч после > 10,0 (>180) > 11,1 (>200) нагрузки глюкозой или оба показателя > 11,1 (>200) > 12,2 (>220) АДА предложила использовать в скрининге только исследование глюкозы плазмы натощак (ГПН), но при этом, снизив верхнюю границу нормы с 6,0 ммоль/л до 5,5 ммоль/л. Снижение границ нормы ГПН, предложенное АДА, связано с тем, что риск развития СД 2 типа увеличивается уже при уровне ГПН выше 5,5 ммоль/л (Древаль А.В. и др., 2010; Sountsov, Yu. I, Dedov, I. I. and Shestakova, M. V., 2008). Проведено исследование, в ходе которого было установлено, что отказ от выполнения орального глюкозотолерантного теста (ОГТТ) при скрининге ведет к снижению выявляемости ранних нарушений углеводного обмена на 28,8% по данным ВОЗ и на 6,1% – по АДА (Van Den Ouweland J. et al., 1992). Если 17 скрининг направлен на выявление только СД 2 типа, то от проведения ОГТТ можно отказаться у лиц с глюкозой плазмы натощак менее 4,7 ммоль/л. Если цель скрининга – не только выявление СД 2 типа, но и нарушенной толерантности к глюкозе (НТГ), то ОГТТ можно не проводить лицам с уровнем глюкозы плазмы натощак менее 4,2 ммоль/л. Использование «комбинированных» критериев диагностики, то есть оценки в ОГТТ уровня глюкозы плазмы натощак не по ВОЗ, а по АДА, достоверно увеличивает распространѐнность нарушений углеводного обмена с 24,9% до 48,8% обследованных (Van Den Ouweland J. et al., 1992), что значительно повышает актуальность данного диссертационного исследования. Известно, что главными критериями компенсации СД 2 типа, являются показатели концентрации гликозилированного гемоглобина (НbА1с), гликемия натощак, постпрандиальная гликемия и гликемия перед сном (Viinamaki H. et al.,1995). В таблице 1.2. представлены критерии уровня компенсации СД 2 типа, сформулированные в Федеральной целевой программе «Сахарный диабет» (Дедов И.И. и соавт., 2002). 18 Таблица 1.2. Критерии компенсации углеводного обмена при СД 2 типа Показатель Компенсация Субкомпенсация Декомпенсация НbА1с, (%) 6,0 – 6,5 6,6 – 7,0 > 7,0 5,0-5,5 (90 – 99) 5,6 – 6,5 (100 – 117) > 6,5 (> 117) <7,5 (<135) 7,5 – 9.0 (135 – 162) > 9,0 (> 162) 6,0-7,0 (110 – 126) 7,1 – 7,5 (127 – 135) > 7,5 (> 135) Самоконтроль глюкозы в капиллярной крови, ммоль/л (мг%) Гликемия натощак Постпрандиальная гликемия (2 часа после еды) Гликемия перед сном Риск развития ангиопатий определяют по показателям углеводного обмена (European Diabetes Policy Group, 1998-99) (табл. 1.3). Таблица 1.3. Показатели углеводного обмена Показатель HbA1c (%) Натощак / перед едой ммоль/л мг/дл Низкий Риск риск макроангиопатии ангиопатии < 6,5 > 6,5 Глюкоза плазмы венозной крови Риск микроангиопатии > 7,5 < 6,1 > 6,1 > 7,0 < 110 > 110 >126 Глюкоза капиллярной крови (самоконтроль) Натощак / перед едой ммоль/л < 5,5 > 5,5 > 6,1 мг/дл < 100 > 100 > 110 Постпрандиальная гликемия (в плазме венозной крови и в капиллярной крови) ммоль/л < 7,5 > 7,5 > 9,0 мг/дл < 135 > 135 > 160 19 Соответственно, если отсутствуют микро- и макрососудистые осложнения СД 2 типа, заболевание относится к степени лѐгкого течения. Если присутствуют диабетическая ретинопатия, нефропатия на стадии микроальбуминурии, полинейропатия, то заболевание оценивается средней степенью тяжести. И, наконец, если отмечается ИБС, сердечная недостаточность, периферическая ангиопатия, то заболевание оценивается средней степенью тяжести. В то же время широко распространено мнение, что у лиц пожилого возраста критерии компенсации могут быть менее жѐсткими, поэтому при анализе уровня сахара в крови необходимо учитывать возраст больного. Возрастные изменения толерантности к глюкозе характеризуются следующими тенденциями: после 50 лет и далее за каждые последующие 10 лет гликемия натощак увеличивается на 0,055 ммоль/л (1 мг%) и гликемия через 2 часа после еды увеличивается на 0,5 ммоль/л (10 мг%). Так же лицам в возрасте старше 60 лет следует проводить скрининг на выявление СД 2 типа: измерение гликемии натощак и гликемии через 2 часа после еды или тест толерантности к глюкозе (Kuusisto J. et al., 1994). 1.3. Патогенез и возрастные особенности течения СД 2 типа В патогенезе СД 2 типа немалую роль играют возрастные физиологические изменения, заболевания, ассоциированные со старением, стиль и образ жизни, экологическая и социальная среда (Дедов И.И., 2008). Развитие диабета этого типа также обусловлено генетической предрасположенностью, неправильным питанием и отсутствием физической активности (Barrett T.G. et al., 1995). В роли генетических факторов выступают митохондриальные мутации, которые наследуются по материнской линии. Несмотря на выявление ряда мутаций и делеций, наиболее важной причиной возникновения митохондриальных форм диабета СД 2 являются точечные мутации в паре нуклеотидов в положении 3243 в гене митохондриальной транспортной РНК (Maassen J.A. et al., 1996). Этот синдром называется MIDD — maternally inherited diabetes and deafness, для которого характерно наличие СД 2 типа у матери и в 20 основе его патогенеза лежит недостаточность β-клеток с очевидной сниженной секрецией инсулина при нормальной чувствительности к инсулину (Демидова И.Ю. и др., 2000; Diabetes Care, 2000). Эта мутация была описана в семье с мягкой формой СД 2 типа с дебютом заболевания во взрослом возрасте, сопровождающегося нейросенсорной тугоухостью. Диабет, вызванный мутацией в паре нуклеотидов 3243, обычно диагностируется в 3–5-м десятилетиях жизни, но может манифестировать от конца юношеского возраста до середины 80летнего возраста. Гипергликемия в момент диагностики обычно умеренная, легко компенсируется диетой, но в дальнейшем имеет тенденцию к прогрессированию. Многолетние исследования наследственной предрасположенности показали, что у монозиготных близнецов конкордантность для СД 2 типа приближается к 100% (Fagot-Campanga A. et al., 2000). От 50 до 75% пациентов имеют больного родителя и до 90% пациентов имеют, по крайней мере, одного родственника первой или второй степени родства с СД 2 типа (Pinhas-Hamiel O., Zeitler P., 2005; Северин Е.С., 2004; Кураева Т.Л. и др., 2011). По мнению М.И. Балаболкина с соавт. (2005) эссенциальный СД 2 типа является гетерогенным и полигенным заболеванием, в патогенезе которого участвуют несколько генетических и внешнесредовых компонентов. Взаимодействие как генетических, так и внешнесредовых компонентов является комплексным. Гены, определяющие предрасположенность к СД 2 типа, оперируют уже на самых ранних (эмбриональных) стадиях развития поджелудочной железы и вовлечены в процессы секреции инсулина, а также обмена глюкозы в β-клетке, печени и других тканях. Наследование этого диабета полигенное, и в качестве генов-кандидатов рассматриваются следующие гены: ген инсулина, ген рецептора к глюкогону, ген белка, связывающего свободные фратаксины, гены глюкозных транспортеров (ГЛЮТ-2 и ГЛЮТ-4), ген β3адренорецептора, ген гексокиназы типа II, ген фосфатидилинозитол-3-киназы, ген прогормональной конвертазы и карбоксипептидазы Е, ген амилина, ген рецептора желудочного ингибитороного полипептида, ген островка-1, ген рецептора глюкагонподобного пептида типа 1, ген RAD, ген рецептора витамина D, ген 21 промотора глюкозы-6-фосфатазы, ген промотора фосфоенолпируваткарбоксилазы и ген инсулинорезистентного сахарного диабета 2 типа, локализованный на длинном плече 20-й хромосомы – локус 20q13.1-13.2. (Дедов И.И. др., 2005). Несмотря на гетерогенность сахарного диабета 2 типа, главными механизмами в патогенезе заболевания остаются инсулиновая резистентность и различной степени выраженности недостаточность функции β-клеток поджелудочной железы, однако нет единодушного мнения о том, какой из перечисленных факторов является первичным. На сегодняшний день развитие сахарного диабета 2 типа можно представить в виде процесса, который проходит ряд стадий (Балаболкин М.И. и др., 2005): 1-я стадия – наличие первичной инсулинорезистентности и других генетически обусловленных нарушений, способствующих снижению биологического действия инсулина; 2-я стадия – адаптация островкового аппарата поджелудочной железы к повышенной потребности в инсулине, которая позволяет обеспечить синтез инсулина в таком количестве, которое необходимо для преодоления имеющейся инсулиновой состоянием резистентности. углеводного Этот обмена процесс и сопровождается гиперплазией нормальным β-клеток островка островкового аппарата поджелудочной железы; 3-я стадия – умеренная декомпенсация поджелудочной железы, которая проявляется нарушением гликемии натощак и/или нарушенной толерантностью к углеводам; 4-я стадия – выраженная декомпенсация β-клеток островков поджелудочной железы, которая сопровождается клинической манифестацией сахарного диабета (имеется возможность компенсации диабета применением диетотерапии и пероральных сахароснижающих препаратов); 5-я стадия – декомпенсация, которая сопровождается структурными изменениями β-клеток и недостаточностью секреции инсулина (лечением пероральными сахароснижающими препаратами невозможно достигнуть 22 компенсации сахарного диабета, что диктует необходимость применения инсулинотерапии), то есть инсулинопотребный подтип сахарного диабета 2 типа. Вследствие дефицита инсулина в организме понижается проницаемость клеточной мембраны для глюкозы в мышечной и жировой ткани, наблюдаются торможение процесса фосфорилирования глюкозы и еѐ окисления (Потемкин В.В., 1986). Функциональный дефицит инсулина и инсулинорезистентность при СД 2 типа могут быть обусловлены повреждением любого из звеньев цепи реализации его биологического действия, а именно: 1) нарушениями в системах его синтеза и секреции; 2) частичным блокированием активности секретированного гормона или его рецепторов гуморальными агентами различной природы; 3) дефектами молекул рецепторов инсулина; 4) нарушениями пострецепторных процессов в клетках-мишенях. Наиболее характерными при СД 2 типа являются следующие типы нарушений секреции инсулина: 1) кинетический, т. е. нарушение периодичности ритма базальной секреции и отсутствие отсроченность I фазы секреции при ответе на глюкозу; 2) количественный, т. е. существенное (до 50%) снижение уровня стимулированной секреции; 3) качественный, т. е. снижение уровня продукции биологически активного гормона при том, что в сумме уровень секреции двух его форм (активной и неактивной), а также уровень секреции проинсулина могут быть нормальными или даже повышенными (Benkimoun P., 1991). Наиболее значимыми причинами этих нарушений могут быть морфологические и/или функциональные аномалии β–клеток поджелудочной железы. Однако, общепризнанно, что даже если при ИНСД β -клетки не мельче, чем в норме, то их функциональный объем все-таки может быть существенно снижен в силу того, что у большинства (до 90%) больных СД 2 типа они либо имеют включения, либо частично покрыты отложениями амилоида (Westermark P. et al., 1978; Clark A. et al., 1988), впервые описанными Е. Opie (1901) (Bell G. I., 1991). Действительно, есть данные, что у больных СД 2 типа объем β-клеток снижен в 2 раза в сравнении с таковым у здоровых людей того же возраста, пола и 23 телосложения, но это единичное наблюдение подтверждают не все цитоморфологи (Kloppel G. et al., 1985; Johnson K. H. et al., 1991). Как правило, при сахарном диабете соотношение инсулин/глюкагон снижено. При этом ослабевает стимуляция процессов депонирования гликогена и жиров, и усиливается мобилизация запасов энергоносителей. Печень, мышцы и жировая ткань даже после приѐма пищи функционирует в режиме постабсорбтивного состояния (Северин Е.С., 2004). Глюкозотоксичность сопровождается снижением инсулиностимулированного транспорта глюкозы в жировую и мышечную ткани, что было показано в исследованиях in vitro в работе Garvey W.T. (1988). Помимо этого, глюкозотоксичность способствует десенситизации β-клеток поджелудочной железы, что проявляется ухудшением их секреторной активности (Garvey W.T. et al, 1988). Считается, что в процессах десенситизации глюкозной транспортной системы ведущую роль играет незначительный путь утилизации глюкозы в клетке, так называемый гексозоаминовый шунт (Балаболкин М.И. и др., 2005). Уже на ранних стадиях этого процесса наблюдается ухудшение транслокации глюкозных транспортѐров, главным образом ГЛЮТ-4, в ответ на действие инсулина, а затем и на экспрессию генов глюкозных транспортѐров, что в первую очередь сопровождается снижением количества мРНК ГЛЮТ-4. Увеличение внутриклеточного (гексозфосфатов) количества по продуктов принципу обратной гексозоаминового связи регулирует шунта механизмы поглощения глюкозы в клетку, снижая еѐ поступление (Garvey W.T. et al, 1988). Таким образом, при СД 2 типа способность организма утилизировать глюкозу ослаблена. Чтобы компенсировать дефицит инсулина, поджелудочная железа начинает продуцировать его всѐ больше и больше, однако со временем клетки поджелудочной железы истощаются и теряют способность вырабатывать необходимое количество инсулина. Это хроническое гетерогенное заболевание, обусловленное приводящее относительным к поражению дефицитом всех инсулина, функциональных в конечном систем итоге организма. 24 Гиперинсулинемия в данном случае может быть компенсаторной, или же может стать патологической, приводящей в итоге к развитию ИБС, атеросклерозу (МоскалѐвА.А., 2009). Сегодня значительное внимание отводится изучению возрастных предпосылок и механизмов инсулинорезистентности, ассоциирующейся с высоким риском развития патологии и ускоренного старения человека. Не вызывает сомнения тот факт, что декомпенсация СД 2 типа у лиц старческого возраста активизирует катаболические процессы и тем самым предрасполагает к развитию острых и ускоряет прогрессирование поздних осложнений СД. Наблюдение за пожилыми больными, страдающими СД 2 типа, показало, что при декомпенсации заболевания частота инсультов и сердечнососудистых заболеваний резко возрастает, независимо от длительности заболевания (Kiiusisto J. еt al., 1994). Выявлена корреляционная зависимость показателей смертности от уровня HbA1С при его возрастании с 8,7% до 9,1% смертность прогрессивно увеличивается (ВОЗ, 1999; Мисникова И.В. и др., 2011). С. Парк (2009 г.) установила, что старение организма сопряжено с резистентностью к инсулину и подавлением инсулиновой сигнализации, повидимому, обусловленной увеличением доли жировой ткани (следовательно, уровня свободных жирных кислот, блокирующих инсулиновую сигнализацию) и снижением доли мышечной ткани (участвующей в утилизации избытков глюкозы) (Пишак В.П., 2009; Овчаренко В.А. и др., 2008). Гиподинамия и избыточное питание приводят к развитию ожирения, усугубляя тем самым генетически детерминированную инсулинорезистентность и способствуя реализации генетических дефектов, которые непосредственно ответственны за развитие СД 2 типа (Сунцов Ю.И., 2008) Древнейшие периодизации онтогенеза восходят к античности. Пифагор (VI в. до Р.Х.) выделял четыре периода человеческой жизни: весну (от рождения до 20 лет), лето (20-40 лет), осень (40-60 лет) и зиму (60-80 лет). Эти периоды соответствуют становлению, молодости, расцвету сил и их угасанию. Гиппократ 25 (V-IV вв. до Р.Х.) разделил весь жизненный путь человека с момента рождения на 10 равных семилетних циклов-этапов. Наиболее широкое применение в отечественной науке нашла схема, принятая на VII Всесоюзной конференции по проблемам возрастной морфологии, физиологии и биохимии, в которой чѐтко выделены данные возрастные группы: новорождѐнные, грудной возраст, раннее детство, первое детство, второе детство, подростковый возраст, юношеский возраст, первый зрелый возраст, второй зрелый возраст, пожилой возраст, старческий возраст и долгожители (Хрисанфова Е.Н., Перевозчиков И.В., 2002). Поскольку в данной работе наблюдались женщины второго периода зрелости и пожилого возраста, поэтому на этих возрастных группах остановимся подробнее. «Возраст второго периода зрелости» или «собственно зрелость» (36-55 лет) – это относительная стабильность дифинитивных параметров организма, завершение формирования половых черт строения и психики. В конце возрастного периода наблюдается окончание женского репродуктивного цикла – менопауза и комплекс психо-физиологических изменений (климакс) (Баранов В.С. и др., 2000). Возрастной период (56-74 года) - «пожилой возраст» - характеризуется продолжением оптимальной социальной активности. Наблюдается начало и развитие инволютивных изменений организма. Также отмечается падение адаптационных возможностей, дезинтеграция функций организма на всех уровнях организации. Характерны структурные и функциональные изменения центральной нервной системы (Баранов В.С. и др., 2000). Вместе с тем, учитывая сложность и многообразие молекулярных, биохимических, физиологических процессов в этом возрасте, вполне оправданным представляется определение физиологического старения как процесса, связанного с прогрессивным замедлением всех физиологических функций организма (Джанашия П.Х., Мирина Е.Ю. 2008). 26 По Номенклатуре Комитета Международной федерации гинекологии и акушерства, менопауза - время последней менструации. Физиологическая менопауза наступает в возрасте 45-55 лет, в среднем - в 51 год (Чазова И.Е. и др., 2008). Как известно, до наступления менопаузы женщины значительно реже страдают СД 2 типа – их защищает женский половой гормон эстрадиол. Однако, после того, как происходит угасание функции яичников и уровень эстрадиола значительно снижается, частота встречаемости СД 2 типа у мужчин и у женщин выравнивается (Сметник В.П., Л.М. Ильина, 2010). Этап климакса, следующий за менопаузой, называется постменопаузой - это закономерный физиологический процесс, однако и критический для женского организма, связанный с перестройкой множественных эстроген-зависимых регулирующих систем головного мозга, направленный на восстановление физиологического равновесия и адаптацию к новым условиям эстрогенного дефицита. Женщины в этом периоде своей жизни представляют собой группу высокого риска развития различных заболеваний (Черных С.И., 2003). Эстроген и прогестерон являются маркѐрами старения у женщин, причѐм начало угасания их активности наблюдается в районе 40 лет (Genazzani A., Gambacciani M., 2006). У многих женщин уже в перименопаузе выявляются неблагоприятные метаболические изменения, такие как повышение веса, нарушение липидного, углеводного обмена, а также эндотелиальная дисфункция, в развитии которых определѐнную роль может играть дефицит половых гормонов (Дедов И.И., Шестакова М.В, 2003). Хорошо известно, что лидирующее место в структуре заболеваемости и смертности пациентов с СД 2 типа занимают именно макрососудистые осложнения (Аметов А.С. и др., 2009). Инсулинорезистентность в постменопаузе также нередко может быть ведущим фактором риска сердечнососудистых заболеваний, так как приводит к атерогенным изменениям в эндотелии сосудов, что, в свою очередь, ведѐт к развитию гипертонической болезни и изменению эластичности сосудов (Сметник В.П., Ильина Л.М., 2010). В разных возрастных группах больных СД 2 типа, было отмечено повышение интенсивности 27 десквамации (слущивание клеток) эндотелия сосудистой стенки, которая зависит от состояния микроциркуляции, от продолжительности заболевания и от возраста больных (Андреева Н.В., 2006). В постменопаузе, в независимости от возраста, происходит снижение образования инсулина в поджелудочной железе, что компенсируется замедлением его метаболизма. Постепенно снижается чувствительность тканей к инсулину, т.е. возникает инсулинорезистентность, способствующая появлению компенсаторной гиперинсулинемии, увеличению уровня глюкозы в плазме натощак, нарушению толерантности к глюкозе и, в конечном счете, развитию СД 2 типа (Endocr. Pract., 2006). Изменение уровня инсулинорезистентности в процессе эволюции СД 2 типа носит вторичный характер, связанный с глюкозотоксичностью, липотоксичностью, увеличением массы тела, проводимой сахароснижающей терапией (Майоров А.Ю., 2011). В сущности, и сам сахарный диабет 2 типа у женщин приводит к ранней менопаузе и к более тяжѐлому климактерическому синдрому, который может сопровождаться урогенитальными расстройствами, инфекционно- воспалительными процессами мочеполового тракта (Манушарова Р.А., Черкезова Э.И., 2006). Кроме этого, у женщин с СД 2 типа наблюдаются более выраженные проявления климактерического периода за счѐт психоэмоциональных симптомов (Зеленина Т.А. и др., 2007). Наблюдается стойкая взаимосвязь между СД 2 типа и депрессиями (Lustman P.J., Clouse R.E., 2005). В связи с этим, применение заместительной гормональной терапии в постменопаузе, оказывает положительное влияние на улучшение качества и продолжительности жизни женщины (Манушарова Р.А., Черкезова Э.И., 2006). Показано, что применение заместительной эстроген-гестагенной тенденцией нормализации к антиоксидантной системы, терапии показателей улучшением (ЗЭГТ) липидного состояния сопровождается обмена крови, микроциркуляторного кровотока и сосудистой реактивности (Зеленина Т.А. и др., 2007). Повышенный уровень андрогенов у женщин в постменопаузальный период на фоне понижения уровня эстрогенов, избыточный абдоминальный жир, 28 гипертензия и повышенный инсулинорезистентностью, уровень так катехоламинов, же являются связанный факторами с риска сердечнососудистых заболеваний в менопаузе (Atsma F. et al., 2006). С биологической точки зрения климакс является необходимым и неизбежным механизмом, позволяющим вывести стареющие особи из процесса воспроизводства, что целесообразно для сохранения вида. Общность проявлений климакса у мужчин и женщин доказана клинически. Это позволяет считать его по своей сущности физиологическим синдромом, обусловленным возрастными сдвигами в гормональном и общем обмене и, прежде всего, возрастным угасанием функции половых желез. У мужчин он наступает позже, чем у женщин, протекает менее заметно и сливается с признаками старости (Пальцев М. А. и др., 2009). Именно эти причины обусловливают патогенетических механизмов СД 2 типа комплексное исследование разной степени компенсации углеводного обмена у женщин в процессе старения организма. Роль гипергликемии в развитии окислительного стресса и старения 1.4. организма На сегодняшний день не существует единой теории старения. Поэтому многие авторы признают трудности в определении этого термина и дают менее строгое определение биологического старения, которое сводится к несостоятельности гомеостатических систем, приводящих к увеличению риска смертности (Adelman R.C.,1980). Л.Б. Лазебник (2005) связывает старение организма с 4 основными критериями: возрастные физиологические изменения; заболевания, ассоциированные со старением; стиль и образ жизни; экологическая и социальная среда. В основе старения лежит внутренняя нестабильность биологических молекул, молекулярных нарушений, которая при является этом фундаментальной снижается надѐжность причиной механизмов саморегуляции, ограничение приспособительных возможностей стареющего организма становятся основой развития заболеваний (Hayflick L.J., 2004). 29 Под нормальным старением можно понимать сумму и переплетение десяти главных болезней, порождаемых онтогенетическими и аккумуляционными механизмами. Ожирение и предиабет относятся к таким основным заболеваниям (Дильман В.М.; 1987). Признаки нормального физиологического старения – это уменьшение мышечной массы, увеличение доли жира в организме, повышение чувствительности к глюкозе, снижение чувствительности рецепторов, уменьшение плотности костей и т.д. (Лазебник Л.Б., 2005). Однако, заболевание сахарный диабет и развитие на его фоне сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний, взятые вместе, могут претендовать на универсальность, так как могут являться причиной смерти у всех без исключения старых индивидов. При старении снижаются адаптационные возможности организма так, что экзогенные и эндогенные раздражители вызывают на этом фоне стресс-синдром, который оказывает неоднозначное влияние на темп возрастных изменений, продолжительность жизни. При стресс-возрастном синдроме наблюдаются нейрогуморальные сдвиги, которые способствуют развитию возрастной патологии, в частности сахарного диабета. Повышение или понижение концентрации отдельных компонентов гуморальной системы может иметь неодинаковое значение для организма. Гормональный сдвиг может влиять на один метаболический путь, способствуя адаптации организма, а на другой метаболический путь - способствуя дезадаптации организма (Фролькис В.В., 1991). При СД 2 типа у больных развивается комплекс метаболических нарушений, патологически воздействующий на морфофункциональное состояние периферических клеток, циркулирующих в крови, а углеводный обмен определяет основной энергетический гомеостаз организма и в нормальных условиях жизнедеятельности глюкоза является основным энергетическим субстратом. (Лисовский В.А. и др., 1986; Кендыш И.И., 1985). С возрастом в организме человека происходит снижение утилизации глюкозы и понижение рецепторной чувствительности к инсулину. Причѐм 30 снижение утилизации является следствием понижения чувствительности тканей организма. Развитие инсулинорезистентности тканей стареющего организма является метаболическим дефектом и основной причиной угнетения гликолиза и синтеза гликогена, вызывая СД 2 типа. Установлено, что синтез гликогена в мышцах больных СД 2 типа снижен на 50% по сравнению со здоровыми людьми (Дедов И.И. и др., 2005). Известно, что от величины и длительности гипергликемии зависит и скорость образования конечных продуктов гликозилирования (КПГ) (Николаев А.Я., 2004), а изменение активности ферментов, в частности уменьшение активности гексокиназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в эритроцитах является чувствительным индикатором их повреждения и развития гипоксии (Рябов Г.А., 1988; Пицура Н.И., 1998). Так же, к числу характерных изменений при деструкции и физиологическом старении эритроцитов следует отнести уменьшение уровня 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ), что сопровождается ухудшением отдачи кислорода тканям. Кроме того, при старении эритроцита изменяется структура и химический состав мембраны: уменьшается содержание липидов, воды, нарушается проницаемость мембраны для ионов. Наряду с уменьшением осмотической и механической устойчивостью изменения поверхности эритроцита выражаются в увеличении их чувствительности к гемолизу, вследствие уменьшения содержания восстановленного глутатиона (Гаврилов О.К., и др., 1985). По данным Ф.Ф. Северина (2008) и В.П. Скулачѐва (2009) существует две противоположные точки зрения на механизм старения организма (Fedor F. Severin еt al., 2008; Скулачѐв В.П., 2009). Согласно классической точке зрения, старение – это пассивный процесс, являющийся следствием накопления случайных «поломок». Однако появляются данные в пользу альтернативной концепции, утверждающей, что старение запрограммировано в геноме, будучи заключительным этапом онтогенеза. Учѐные полагают, что различие между старыми и молодыми многоклеточными организмами состоит, прежде всего, в количестве функционирующих клеток в органе или ткани: с возрастом это 31 количество в большинстве органов уменьшается из-за стимуляции митохондриального пути апоптоза. В частности, прослеживается положительная корреляция между устойчивостью клеток к апоптогенному действию активных форм кислорода (АФК) и продолжительностью жизни организма. Другим подходом и теорией старения является гликирование (Cerami A., 1985). Комплекс реакций гликирования - «реакция Мэйяра» (РМ) начинается с образования соединений глюкозы с аминогруппами аминокислот, пептидов, белков, нуклеиновых кислот. В результате этого происходит повреждение белков или нуклеиновых кислот. В свою очередь, дефектные молекулы откладываются на стенках сосудов, в тканях, в частности, в телах нервных клеток, что приводит к функциональным нарушениям. Многие осложнения диабета сходны с теми, что наблюдаются у людей преклонного возраста, вероятно за счѐт более быстрого образования токсических специфических продуктов продуктов РМ в РМ. тканях Считается, человека что содержание коррелирует с его «биологическим возрастом», который может существенно отличаться у людей одного и того же календарного возраста (Sell D.R. et al., 1996). Известно, что многие продукты РМ генерируют активные формы кислорода. Это навело ряд исследователей на мысль, что появление свободных радикалов и гликирование – это элементы единой более сложной биохимической цепи и что многие ассоциированные со старением процессы, в частности, схарный диабет, так или иначе связаны с РМ и генерацией свободных радикалов (Kristal B.S., Yu B.P. 1992). Основные направления исследований процессов старения и ассоциированных с ними «функциональных нарушений» с позиции «синтетической» теории связаны с выявлением конечных продуктов реакций гликирования/генерации АФК (Николаев А.Я., 2004). Известно, что гликозилирование белков с образованием АФК при активации аутоокисления глюкозы с образованием реактивных дикарбонильных сахаров, напрмер, метилглиоксаля, ведѐт к апоптозу клетки, что, в свою очередь, подтверждает наличие причинно-следственной связи окислительного и карбонильного стрессов (Недосугова Л.В., 2006). 32 В исследованиях последних лет выдвигается гипотеза, что локальное развитие окислительного стресса в области поджелудочной железы вызывает снижение секреции инсулина и может индуцировать повреждение β-клеток. Как следствие, повышается уровень глюкозы крови, что является предпосылкой усиления свободнорадикальных окислительных процессов как внутриклеточно, так и внеклеточно (Rossen P. et al., 1992). Следует подчеркнуть, что окислительный стресс ассоциирован с инсулинорезистентностью и у пациентов с риском развития СД 2 типа еще до дебюта заболевания (Бондарь Т.П., Козинец Г.И. 2003). Таким образом, гипергликемия за счет активации «стресс» чувствительных путей, не только играет роль в развитии осложнений сахарного диабета, но и в инсулинорезистентности, и в нарушении инсулиновой секреции при СД 2 типа (Антонова К.В. и др., 2003). В работе М.И. Балаболкина (2004) показано, что окислительный стресс при СД может быть следствием различных механизмов (Балаболкин М.Н., 2004): 1) повышенного образования высокореактивных оксидантов, образующихся при окислении как самих углеводов, так и углеводов, образующих комплексы с различными белками, а также в результате аутоокисления жирных кислот в триглицеридах, фосфолипидах и эфирах холестерина; 2) снижение активности антиоксидантной системы в организме; 3) нарушение ферментов полиолового обмена глюкозы с повышенным накоплением в нервной ткани продуктов этого обмена - сорбитола и фруктозы, которые слабо проникают через клеточную мембрану и накапливаются внутри клетки, что приводит к внутриклеточной гиперосмолярности; 4) нарушение ферментов митохондриального окисления, обмена простагландинов и лейкотриенов, снижения активности глиоксилазы; 5) нарушение концентрации или обмена глутатиона и некоторых металлов; 6) выход в межклеточное пространство ионов металлов с переменной валентностью (Fe2+, Cu2+), свободнорадикальных реакций. которые становятся катализаторами 33 Несмотря на всеобщее признание свободнорадикальной теории, большинство геронтологов и биохимиков считают, что старение, как и любая биологическая функция, обусловлена многофакторным действием молекулярных механизмов. В.П. Скулачев (1997) указывает на три таких основных механизма: 1) укорочение теломер вследствие выключения теломеразы на ранних стадиях эмбриогенеза; 2) выключение с возрастом механизма, индуцирующего синтез белков теплового шока в ответ на денатурирующие воздействия; 3) неполное подавление генерации активных форм кислорода и неполное обезвреживание образовавшихся АФК. Эти причины не могут привести к немедленной гибели организма, но ослабляют его резистентность к окислительным повреждениям (Хавинсон В.Х. и др., 2003). АФК имеют очень короткий период жизни: супероксидный анион-радикал кислорода и алкоксильный радикал - 10–6 с, гидроксильный радикал - 10–9 с, пероксильный - 10–12 с (Фадеева Н.И., 2000).Супероксидный анион является первым продуктом активации молекулы кислорода и родоначальником всех АФК in vivo (Зиятдинова Г.К., 2005), сравнительно малоактивен. Гидроперекисный радикал (HO2•) обладает более выраженной повреждающей способностью, чем супероксидный анион-радикал. Основным повреждающим агентом в клетке является гидроксил-радикал (OH•) (Болдырев А.А., 2001; Болевич С.Б., 2006), который может разрывать любую С-Н и С-С связь (Владимиров Ю.А., 2000). Основнымисточником OH• в большинстве биологических систем служит реакция Фентона с участием металлов переменной валентности, главным образом железа (Смирнова О.М., Никонова Т.В., 2003): H2O2+Fe2+ = HO•+OH–+Fe3+. Эндогенными источниками активных форм кислорода (АФК) в организме являются митохондрии, различные водорастворимые мембранносвязанные ферменты клеточных органелл: пероксисомы, в которых генерируется перекись водорода как побочный продукт деградации жирных кислот; эндоплазматический ретикулум (в нѐм АФК генерируются ферментами цитохрома Р-450 как побочные продукты); лизосомы - в них происходит дыхательный взрыв; цитоплазма, в которой свободные радикалы генерируются ксантиноксидазой, гемоглобином, 34 рибофлавином, катехоламинами (Lander H.M., 1997). АФК генерируют также недавно обнаруженные гомологи NAD(P)H-оксидазы при их стимуляции (Dupuy C. et al., 1999). Экзогенными источниками АФК являются УФ-радиация, хемотерапевтические агенты, противоспалительные цитокины, факторы роста, а также инфекционные агенты (вирусы, бактерии и паразиты) (Lo Y.Y. and Cruz T.F., 1995). Свободнорадикальные процессы находятся под контролем антиоксидантной защиты организма и по изменению активности ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ) и низкомолекулярных антиоксидантов крови можно косвенно судить о степени выраженности свободнорадикальных процессов при патологических состояниях. Особая роль в защите клеток организма от окислительного стресса принадлежит основным антиоксидантным ферментам: супероксиддисмутазе (СОД) (СuСu,Zn-СОД, Mn-СОД), глутатиопероксидазе (ГПО) и каталазе (КАТ) (Dhaunsi G.S. et al., 1993; Evans J.L., Goldfine I.D. at al., 2002; Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е. и др., 2000). Известно, что Cu,Zn-СОД в эритроцитах восстанавливает анион-радикал кислорода (O2•) до перекиси водорода (Н2О2), которая, в свою очередь, восстанавливается КАТ до воды и молекулярного кислорода, либо ГПО до воды при непосредственном участии восстановленного глутатиона (GSH) в качестве донора водорода (Шаповал Г. С. и соавт., 2003; Evans J.L., Goldfine I.D. at al., 2002): 2GSH+H2O2=GSSG+2H2O. ГПО, обладая псевдокаталазной активностью, разрушает Н2О2, как и КАТ, а также различного рода гидроперекиси. Сродство ГПО к перекиси водорода выше, чем у КАТ, поэтому первая более эффективно работает при низких концентрациях субстрата, в то же время в защите клеток от окислительного стресса, вызванного высокими концентрациями перекиси водорода, ключевая роль принадлежит каталазе (Чеснокова Н.П. и соавт., 2006). В работе А.В. Арутюнян и Л.С. Козиной (2009) показано, что суммарная активность ферментативных антиоксидантов в пересчѐте на белок ткани хорошо коррелирует с величиной средней продолжительности жизни млекопитающих. В 35 многочисленных исследованиях установлено, что при физиологическом старении у человека и животных снижается активность ферментов СОД и ГПО в крови, органах и тканях. Наиболее значимым считается возрастное снижение активности СОД (Камышников В.С., 2000). В то же время показано, что если старение организма сопровождается какой-нибудь патологией, то активность СОД не только не снижается, а даже повышается, что свидетельствует об интенсификации свободнорадикальных процессов в соответствующих органах и тканях. В литературных источниках приводятся противоречивые данные об активности СОД у больных сахарным диабетом. По мнению одних авторов, значимых различий в значениях СОД в группе исследования и в контрольной группе не существует (Memisogullari R., Taysi S., 2003), по мнению других активность СОД хоть мало, но снижена (p>0,05) (Pasaoglu H., Sancak B., 2004). О.М. Смирнова и Т.В. Никонова (2003) указывают, что активность СОД и ГПО в эритроцитах убольных СД 2 типа соответственно в 1,40 и 1,33 раза ниже, чем у здоровых. Недавно проведенные исследования свидетельствуют о том, что у пациентов с СД 2 типа наблюдается значительное снижение СОД (на 45,7%) при сохраненной активности каталазы, что может сопровождаться недостаточной дисмутацией супероксидного анион-радикала, участвующего в образованиидругих АФК, и инициацией реакций свободно-радикально окисления, приводящих в дальнейшем к выраженному окислительному стрессу. При достижении компенсации наблюдалось частичное восстановление активности СОД (на 39,9%) и каталазы (на 24,1%) (Басов А.А., 2007). К противоположному выводу пришла другая группа ученых - у больных СД 2 типа наблюдается повышение активности СОД и снижение каталазы, однако после 3 месяцев лечения соотношение меняется (Aydin A., Orhan H., 2001). Свободнорадикальное механизмов модификации окисление липидного является состава одним из естественных клеточных мембран, обусловливающим изменения их функциональных характеристик. На основе многочисленных исследований установлена ведущая роль процессов липидной пероксидации в процессах структурно-функциональной дестабилизации многих 36 органов и систем, а также служит молекулярной причиной развития осложнений при СД 2 типа, в частности макро- и микроангиопатий, атеросклероза и атероматоза сосудистой стенки, эндотелиальной дисфункции (Балаболкин М.И. и др., 2008). Важная роль в защите организма от окислительного повреждения, связанного со старением, принадлежит системе глутатиона (Калинина Е.В., 2009). Трипептид глутатион, в состав которого также входит цистеин, является коферментом глутатионпероксидаз и играет важную роль в окислительновосстановительных процессах в живых организмах. В большинстве клеток на его долю приходится до 90% всех тиоловых соединений. Уникальные химические свойства этот трипептида наделяют его высокой антиокислительной активностью, способностью проявлять как антирадикальное, так и антиперекисное действие. Известно, что митохондрии не способны синтезировать GSH, поскольку они лишены активности γ-глутамилцистеинсинтетазы и глутатионсинтетазы, вследствие чего транспортируют его из цитозоля (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 2007). Полагают, что нарушение баланса системы глутатиона в митохондриях в сторону окисленной формы может быть одним из ранних признаков окислительного стресса, связанного со старением. Обеспечение необходимого уровня восстановленного глутатиона предохраняет клетки от окислительного разрушения таких важнейших биомолекул, как белки, ДНК и препятствует процессу старения (Хавинсон В.Х. и соавт., 2003). В настоящее время установлена зависимость некоторых биохимических показателей от степени компенсации СД 2 типа и длительности заболевания: при небольшой длительности заболевания имеет место развитие окислительного стресса, которое проявляется усилением окислительной модификации белков и ростом перекисного окисления липидов (Nuttall S.L., et al. 1998). Такие изменения являются результатом метаболической активности избыточной продукции АФК и свободных радикалов (De Haan J. B. et al., 1995; Harman D., 1991). Генерация супероксидного анион-радикала приводит к окислению аскорбиновой кислоты и тиоловых соединений (Lustman P.J., Clouse R.E., 2005). Имеются сведения, что у 37 больных СД 2 типа уменьшается содержание аскорбиновой кислоты и токоферола в крови, что значительно снижает активность неферментативной антиоксидантной защиты и повышает прооксидантную активность организма (Зенков Н.К. 2001). Несмотря на многочисленные исследования в области изучения СД 2 типа остаѐтся неясным вопрос как изменяется состояние углеводно-энергетического обмена, газотранспортной и антиоксидантной систем, а стабильности мембран эритроцитов и содержания вторичных продуктов ПОЛ у пациенток с СД 2 типа в зависимости от возраста и степени компенсации заболевания. 38 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на базе кафедры общей и клинической биохимии №1 с курсом органической и неорганической химии (зав. кафедрой - д.б.н., профессор, Микашинович З.И.) и кафедры эндокринологии с курсом детской эндокринологии факультета постдимпломного образования РостГМУ (зав. кафедрой профессор, д.м.н. Воробьѐв С.В.) ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. Анализ клинического течения СД 2 типа проводился у 86 женщин в возрастной группе от 36 до 74 лет, госпитализированных в эндокринологическое отделение РостГМУ. Верификация диагноза заболевания и степени компенсации углеводного обмена осуществлялась квалифицированными врачами эндокринологического отделения клиники РостГМУ согласно рекомендациям ВОЗ (1999) и «Национальным стандартам оказания медицинской помощи больным сахарным диабетом» (Дедов И.И., 2002) (табл.1.1, табл.1.2, гл.1.2.) . Автор благодарит коллектив кафедры эндокринологии с курсом детской эндокринологии факультета постдимпломного образования РостГМУ под руководством профессора Воробьѐва С.В. за помощь и содействие в подготовке материала (сбор биологического материала, клиническая верификация диагноза, консультации). 2.1. Характеристика объекта исследования Критериями включения пациенток в исследования явились: женский пол; возраст от 36 до 74 лет; наличие документированного СД 2 типа в стадии субкомпенсации или декомпенсации углеводного обмена; наличие информированного согласия на участие в исследовании. 39 Критериями исключения явились: сахарный диабет 1 типа; сопутствующие онкологические и гематологические заболевания, терминальная почечная и печеночная недостаточность, соматические и неврологические заболевания. Все пациентки были разделены на 2 группы в зависимости от возраста: 1 возрастнаягруппа - второй период зрелости: от 40 до 55 лет (n=44, средний возраст 49,9 0,76 лет), длительность заболевания 5,14 ± 0,45 лет; 2 возрастная группа - пожилой возраст: от 60 до 74 лет (n=42, средний возраст 67,4 ± 0,6 лет), длительность заболевания 11,9 ± 1,22 лет. Обе возрастные группы пациенток были рандомизированы на подгруппы по степени компенсации углеводного обмена сахарного диабета 2 типа (рис. 2.1.) 1 подгруппа - пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации (n = 22, средний возраст 51,09 0,95 лет) – 25,6%; 2 подгруппа - пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии декомпенсации (n =22, средний возраст 48,7 1,17 лет) – 25,6%; 3 подгруппа - пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии субкомпенсации (n =21, средний возраст 67,14 1,13 лет) – 24,4%; 4 подгруппа - пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии декомпенсации (n = 21, средний возраст 67,6 0,48 лет) – 24,4%. Для каждой возрастной группы формировалась своя контрольная группа из женщин без признаков СД 2 типа и других сопутствующих заболеваний: 1 группа - 25 женщин в возрасте 52,82 ±0 ,36, 2 группа - 25 женщин в возрасте 67,72 ± 0,75 года. 40 Сахарный диабет 2 типа Пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа (40-55 лет, n=44) средний возраст 49,9 ± 0,76 лет 1 подгруппа Женщины с СД 2 типа в стадии субкомпенсации (средний возраст 51,09 0,95 лет) 2 подгруппа Женщины СД 2 типа в стадии декомпенсации (средний возраст 48,7 1,17 лет) Дизайн исследования Пациентки пожилого возраста с СД 2 типа (60-74 года, n=42) средний возраст 67,4 ± 0,6 лет 3 подгруппа Женщины с СД 2 типа в стадии субкомпенсации (средний возраст 67,14 1,13 лет) 4 подгруппа Женщины СД 2 типа в стадии декомпенсации (средний возраст 67,6 0,48 лет) Кровь (эритроциты, плазма) Углеводно-энергетический обмен Газотранспортная функция крови глюкоза, С-пептид, гексокиназа, фосфогексоизмераза, лактат, пируват, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, фосфорилаза общий гемоглобин, гликозилированный гемоглобин, количество эритроцитов, 2,3-дифосфоглицерат Рис. 2.1. Дизайн исследования АОС и состояние мембран эритроцитов Cu,Zn-супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, восстановленный глутатион, малоновый диальдегид, внеэритроцитарный гемоглобин 2.2. Получение биологического материала Получение плазмы крови Кровь у пациенток брали утром натощак путѐм венепункции локтевой вены. Первые капли венозной крови выпускали на ватный тампон. Плазму получали из венозной крови, стабилизированной гепарином (в соотношении 1:10) с последующим центрифугированием (320g, 15 минут). Получение суспензии эритроцитов Эритроциты получали из венозной крови, стабилизированной гепарином (10 ед/мл), отделяли от лейкоцитов и тромбоцитов в 3% желатиновом растворе с последующим центрифугированием (320g, 15 минут). После отделения плазмы и верхнего слоя клеток эритроциты отмывали охлаждѐнным физиологическим раствором (2-3 раза). Для получения плотного осадка при определении субстратов отмытые эритроциты центрифугировали при 640g в течение 30 минут. Получение гемолизата Для определения активности ферментов антиоксидантной защиты использовали гемолизат эритроцитов, приготовленный на бидистиллированной воде путѐм гипотонического лизиса. Для определения активности Cu,Zn-СОД использовали гемолизат, полученный разведением цельных эритроцитов в соотношении 1:14. Для определения активности фосфорилазы использовали гемолизат, полученный разведением цельных эритроцитов в соотношении 1:20. Для определения активности глутатионзависимых ферментов использовали гемолизат, полученный разведением цельных эритроцитов в соотношении 1:40. Для определения активности каталазы использовали гемолизат, полученный разведением цельных эритроцитов в соотношении 1:200. 42 2.3. Лабораторно-биохимические методы исследования Уровень HbА1С определяли на биохимическом экспресс анализаторе DCA 2000+ (Bayer Corp., USA). Уровень HbA определяли на гематологическом анализаторе PCE-210 (Erma Inc., Japan). Результат выражали в у.е. Количество эритроцитов в крови определяли путѐм подсчѐта в камере Горяева по методу, описанному в руководстве под редакцией Базарова М.А. 12 (Базаров М.А., 1988), результат выражали в ед×10 /л. Активность гексокиназы (КФ 2.7.1.1.) определяли спектрофотометрическим методом, описанном Лугановой И.С. и др. (1964). К 0,2 мл цельных эритроцитов исследуемой крови (опыт) последовательно добавляли 1,0 мл буферного раствора трис-НСl с рН=7,5;0,2 мл окисленного НАДФ+; 0,2 мл 1 М раствора MgSO4; 0,2 мл раствора D-глюкозы (2,4 мг на 1 мл дистиллированной воды); 0,4 мл натриевой соли аденозинтрифосфата. Объѐм проб доводили до 3,0 мл дистиллированной водой. Инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, затем реакцию останавливали добавлением 1,0 мл раствора 1,2N NaOH. Центрифугировали в течение 10 минут при 3000 об/минуту. Полученный центрифугат спектрофотометрировали против контрольной пробы на СФ-46 (ЛОМО, Ленинград) при длине волны 340 нм. Контрольная проба отличалась тем, что реакцию останавливали сразу добавлением раствора NaOH. Результаты выражали в мкмоль на грамм Hb. Активность фосфогексоизомеразы (ФГИ) (КФ 5.3.1.9.) определяли по методу, описанному Езерским Р.Ф. (1960), в модификации Микашинович З.И. (1989). Метод основан на колориметричском измерении фруктозофосфата, образовавшегося при инкубировании глюкозофосфата с цельными эритроцитами и последующим окрашиванием фруктозофосфата в реакции Селиванова. По количеству фруктозофосфата судили об активности ФГИ. Для определения активности фосфогексоизомеразы в опытную пробу вносили 1,0 мл буферно-субстратной смеси, содержащей глюкозо-6-фосфат и 43 веронал-ацетатный буфер рН=7,4. К нему добавляли 0,2 мл цельной крови и помещали в термостат инкубировать на 30 минут при температуре 37ºС. По истечении указанного времени останавливали реакцию добавлением 1,2 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. В контрольную пробу раствор ТХУ добавляли сразу вместе с гомогенатом. Центрифугировали 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Затем к 1,0 мл полученного центрифугата приливали 1,0 мл 1% спиртового раствора резорцина и 3,0 мл 10 N НСl, помещали в полукипящую водяную баню на 10 минут. Количество полученного фруктозофосфата определяли фотометрически на ФЭК КФК 2-МП при длине волны 540 нм против контрольной пробы. Результат выражали в мкмоль/мг Нв за час инкубации. Содержание молочной кислоты (лактат) определяли в безбелковом экстракте эритроцитов, полученном добавлением 5% ТХУ по методу, описанному Меньшиковым В.В. (1987). Принцип метода: лактат при кипячении с концентрированной серной и ортофосфорной кислотами в присутствии ионов меди разлагается до ацетальдегида, который при взаимодействии с параоксидифенилом образует продукт фенольной конденсации, окрашивающий раствор в фиолетовый цвет. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству ацетальдегида, а, следовательно, и количеству молочной кислоты. Ход определения: для определения содержания лактата в центрифужную пробирку вносили 0,2 мл осадка эритроцитов и 1,0 мл 5% раствора ТХУ, центрифугировали в течение 10 минут при 3000 g. Затем к 0,2 мл центрифугата добавляли 0,1 мл сульфата меди (в ортофосфорной кислоте) и 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Пробы кипятили на водяной бане в течение 3 минут при температуре 1000C. Далее в пробы вносили пипеткой по 2 капли 1,5% раствора параоксидифенила и инкубировали в термостате 10 минут при температуре 37ºС, затем снова кипятили в течение 90 секунд. Затем охлаждали до комнатной температуры и фотометрировали на ФЭК КФК 2-МП при длине волны λ=590 нм против дистиллированной воды в кювете с длиной оптического пути 0,5 см. Количество молочной кислоты выражали в ммоль/л. 44 Содержание пировиноградной кислоты (ПВК) проводили по методу Freedman и Haugen (1943) в модификации П.А. Бабаскина (А.С. СССР №877436, 1981). Принцип метода заключается в том, что ПВК при взаимодействии с 2,4динитрофенилгидразоном (ДНФГ) образует гидразон, который в содовом экстракте (щелочная среда) даѐт окраску, интенсивность которой прямо пропорциональна концентрации ПВК. ПВК осаждали в виде 2,4-динитрофенилгидразона красно-коричневого цвета. Осадок гидразона очищали от примесей экстракцией 12% NaOH. В надосадочной жидкости определяли ПВК колориметрическим методом на ФЭК КФК 2-МП при длине волны λ=440 нм в кювете с длиной оптического пути 0,5 см. Ход определения: в центрифужную пробирку помещали 0,1 мл эритроцитов, 0,9 мл дистиллированной воды и 1,0 мл 10% раствора ТХУ. Для осаждения белков ставили на холод (+40С) на 2 мин. После осаждения белков пробы центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут, затем отбирали 2,0 мл надосадочной жидкости и добавляли 0,4 мл 0,1% раствора динитрофенилгидразина. Пробы инкубировали 20 мин. в темноте, после чего реакцию останавливали добавлением 1,0 мл 12% раствора NaOH. Оставляли при комнатной температуре для развития окраски на 5 мин., а затем проводили измерение против контрольной пробы. В контрольную пробу вместо эритроцитов вносили равное количество дистиллированной воды. Количество пировиноградной кислоты выражали в мкмоль/мл. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (гл-6-ФДГ) (КФ 1.1.1.49) определяли по методу Корнберга Л. в модификации Захарьина Ю.Л. (1967) спектрофотометрически по степени восстановления НАДФ в ферментативной реакции с глюкозо-6-фосфатом в присутствии ионов магния. В опытную и контрольную пробирки последовательно добавляли растворы трис-буфера по 1,0 мл; 1 М МgSO4 по 0,2 мл; 0,02 М НАДФ по 0,2 мл; лизат эритроцитов по 0,4 мл; 1,2 М NaOH 1,0 (только в контроль); 0,4 мл глюкозо-6фосфата (только в опытную пробирку) и воды (1,0 мл в опытную пробирку и 1,4 45 мл в контрольную). Смесь инкубировали в термостате при t=37 в течение 15 минут. Затем добавляли в опытную пробирку 1,0 мл 1,2 М NaOH и центрифугировали при 3000g в течение 10 минут. Далее регистрировали оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Ленинград) против контроля при длине волны λ= 340 нм. Активность фермента выражали в мкмоль/г Hb в час. Активность фосфорилазы (КФ 2.4.1.1.) определяли по методу Hers, описанному Поповой И.А. и др. (1992), основанному на определении неорганического фосфора. Инкубационная смесь содержала 2% гликогена 0,1 М глюкозо-6-фосфата, 3мМ 5-МИФ, 0,2 М NaF, pH 6,1. Инкубировали 10 мин. при 370С. Реакцию останавливали 10% ТХУ, затем приливали 3,7 мл холодной H2O, центрифугировали 10 мин при 3000g. В надосадочной жидкости определяли pH. Активность ферментов выражали в мкмоль/мг Hb. Содержание 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) определяли по неферментативному методу, предложенному B.F. Dyсe, S.P. Bessman (1973) в модификации Лугановой И.С., Блинова М.Н. (1975), основанным на колориметрическом измерении содержания фосфатов в хлорнокислом экстракте после удаления кислоторастворимых нуклеотидов абсорбцией на активированном угле «Норит». Ход определения. Для опытной пробы отбирали 1,0 мл плотного осадка эритроцитов, смешивали на холоду (t=+4°С) с 2,0 мл дистиллированной воды и 6,0 мл 1N раствора HClO4. Через 20 минут центрифугировали при 3000 g в течение 10 минут, затем отбирали 3,0 мл надосадочной жидкости и добавляли 100 мг активированного угля. Оставляли на 20 минут при комнатной температуре. По истечении указанного времени добавляли 0,1 мл центрифугировали в том же режиме. В полученной 95% этанола снова надосадочной жидкости определяли концентрацию общего и неорганического фосфора. Определение общего фосфора осуществляли следующим образом: к 0,25 мл центрифугата добавляли 1,25 мл спиртового раствора Mg(NO3)2, выжигали на песчаной бане до получения сухого остатка. Затем к полученному сухому остатку 46 приливали 4,75 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 1% раствора молибдата аммония для образования фосфорномолибденовой кислоты. Реакцию образования фосфорно-молибденового комплекса синего цвета инициировали добавлением 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты. Через 10 минут пробы фотометрировали на ФЭК КФК 2-МП при длине волны λ=670 нм в кювете с длиной оптического пути 1см против контрольной пробы. Контрольная проба вместо центрифугата содержит дистиллированную воду в равном количестве. Определение неорганического фосфора проводили путѐм смешивания 0,25 мл центрифугата с 4,75 мл дистиллированной воды и 0,5 мл 1% раствора молибдата аммония для образования фосфорномолибденовой кислоты. Реакцию образования фосфорно-молибденового комплекса синего цвета инициировали добавлением 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты. Через 10 минут пробы фотометрировали на ФЭК КФК 2-МП при длине волны λ=670 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против контрольной пробы. Содержание 2,3-ДФГ расчитывали по разнице величины общего и неорганического фосфата. Результаты выражали в мкмоль/мл плотного осадка эритроцитов. Активность Cu,Zn-супероксиддисмутаза (Cu,Zn-СОД) в гемолизате определяли для оценки ферментативной антиоксидантой системы защиты. Метод основан на способности Cu,Zn-СОД тормозить аутоокисление адреналина в щелочной среде при pH - 10,2. Определение активности Cu,Zn-СОД в гемолизате эритроцитов крови проводили по методу Misra H.P. и Fridovich J. (1972), описанному Саркисяном О.Г. (2000). За единицу активности Cu,Zn-СОД принимали такое количество фермента, которое при добавлении к реакционной смеси изменяет на 50% скорость аутоокисления адреналина в стандартных условиях. К 0,1 мл выделенных эритроцитов добавляли 0,9 мл дистиллированной воды и 0,4 мл хлороформ-этанольной смеси (3:5), интенсивно перемешивали и центрифугировали в течение 15 минут при 3000g. Затем 0,1 мл супернатанта вносили в среду, содержащую 3,5 мл Na-карбонатного буфера (рН=10,2) и 0,2 мл 47 нитросинего тетразолия (НСТ). Инициировали реакцию добавлением 0,05 мл 0,1% раствора адреналина. В контрольную пробу вместо супернатанта вносили 0,1 мл дистиллированной воды, 3,5 мл Na-карбонатного буфера (рН=10,2), 0,2 мл НСТ. После чего инициировали реакцию адреналином. Пробы фотометрировали на ФЭК КФК 2-МП через 5 минут при длине волны λ=540 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против контрольной пробы. Результат выражали в условных единицах на 1 г Нв. Определение активности каталазы проводили (КАТ) по методу Королюка М.А. и соавт. (1988). Метод основан на том, что неразложившаяся перекись водорода образует с молибдатом аммония (NH4)6Мо7O24 комплексное соединение, окрашенное в жѐлтый цвет, интенсивность которого определяли колориметрически на ФЭК КФК 2-МП при длине волны =410 нм. Реакция запускается добавлением 0,1 мл гемолизата эритроцитов (в разведении 1:200) к 2 мл 0,03% раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо гемолизата эритроцитов вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением 1 мл 4% раствора молибдата аммония. Активность каталазы выражали в мкат/г Нв. Активность глутатионпероксидазы (ГПО) (КФ1.11.1.9) определяли по скорости окисления восстановленного глутатиона в присутствии гидроперекиси третичного бутила по методу Моина В.М. (1986). В качестве субстрата использовали гидроперекись трет-бутила, что по данным Ланкина В.В. и соавторов (1991) позволяет определять глутатионпероксидазную активность, включающую липопероксидазную активность глутатион-S-трансфераз. Ход определения. 100 мкл гемолизата эритроцитов (разведение 1:40) опытной пробы преинкубировали с 830 мкл трис-НСl-буфера (рН=8,5), содержащего 6 мМ ЭДТА и 12 мМ азида натрия в течение 10 минут при температуре 37ºС. Затем добавляли 70 мкл 20мМ раствора гидроперекиси третбутила. Через 5 минут реакцию останавливали 400 мкл холодной ТХУ, осажденные белки удаляли центрифугированием при 3000g в течение 10 минут. Затем 100 мкл супернатанта вносили в 5 мл трис-НСl-буфера (рН=8,5) и 48 добавляли 50 мкл реактива Эллмана. Через 5 минут пробы фотометрировали. Контрольная проба отличается тем, что гемолизат вносят непосредственно перед осаждением белков. Концентрацию восстановленного глутатиона до и после инкубации определяли спектрофотометрически на СФ-46 (ЛОМО, Ленинград) при длине волны =412 нм. В ходе реакции SH-группы глутатиона с 5,5-ДТНБК образуют окрашенный продукт реакции – тионитрофенильный анион. Количество последнего пропорционально количеству SH-групп, прореагировавших с ДТНБК. Активность ГПО рассчитывали исходя из коэффициента миллимолярной экстинции тионитрофенильного аниона =11400. Активность данного фермента выражали в международных единицах (МЕ) – расчѐт по количеству микромолей израсходованного в реакции субстрата мкмоль/ г Нв. Активность глутатионредуктазы (ГР) определяли спектрофотометрически по методу Юсуповой Л.Б. (1989). Принцип метода заключается в скорости окисления НАДФ при длине волны λ=340 нм на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Ленинград). Ход определения. К 0,2 мл гемолизата эритроцитов опытной пробы (разведение 1:40) добавляли 2,5 мл К+-Na+-фосфатного буфера с ЭДТА и КСl (рН=7,4); 0,1 мл 8×10-3М раствора GSSG. Реакцию инициировали добавлением 0,1 мл 2×10-3М раствора НАДФ·Н+. В контрольную пробу вместо гемолизата эритроцитов добавляли такое же количество дистиллированной воды. Реакцию проводили в термостатируемых кюветах при температуре 37ºС в течении 10 минут, в кинетическом режиме регистрировали уменьшение поглощения НАДФ×Н. Активность фермента выражали в микромолях превращения НАДФ в 1 минуту на 1 г Нв. Определение содержания восстановленного глутатиона (GSH) проводили по методу Ellman G.L. (1959). В основу метода положена реакция 5,5дитиобис (2-нитробензойной) глутатионом, в ходе кислоты которой (5,5-ДТНБК) образуется с окрашенное восстановленным соединение – тионитрофенильный анион жѐлтого цвета с максимумом поглощения при длине 49 волны =412 нм. Количество последнего прямо пропорционально количеству SHгрупп, прореагировавших с ДТНБК. Ход определения. В опытную пробу вносили 0,2 мл гемолизата эритроцитов (в разведении 1:40), 0,2 мл дистиллированной воды и 0,2 мл 10% раствора ТХУ. После осаждения белков, пробы центрифугировали 10 минут при 3000 g. Затем отбирали 0,3 мл супернатанта , вносили его в 2,5 мл трис-НСL-буфера (рН=8,8) и добавляли 25 мкл реактива Эллмана. Через 5 минут пробы фотометрировали на ФЭК КФК 2-МП. Контрольная проба вместо гемолизата эритроцитов содержала 0,2 мл дистиллированной воды. Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах выражали в микромолях на 1 грамм гемоглобина (мкмоль/г Нв). Определение малонового диальдегида (МДА). Вторичный продукт ПОЛ малоновый диальдегид, который является высокореакционным бифункциональным поперечносшивающим реагентом, принимающим участие в образовании конечных продуктов ПОЛ. Содержание МДА определяли по методу Стальной И.Д. (1977). Метод основан на образовании в кислой среде триметинового комплекса, состоящего из одной молекулы МДА и двух молекул 2-тиобарбитуровой кислоты (2-ТБК), который имеет розовый цвет, оптическую плотность которого определяли колориметрически на ФЭК КФК 2-МП при длине волны λ=540 нм. Ход определения. В центрифужные пробирки помещали 0,5 мл исследуемой плазмы и добавляли 2,5 мл 20% раствора ТХУ и 1,0 мл 0,67% водного раствора ТБК. Затем пробы помещали на 30 минут в кипящую водяную баню. В качестве контроля использовали пробы, содержащие вместо плазмы дистиллированную воду. Затем пробы охлаждали до комнатной температуры и центрифугировали в течение 10 минут при 3000 g. Отбирали супернатант и фотометрировали против контрольной пробы. Расчѐт концентрации МДА осуществляют с использованием коэффициента молярной экстинции для продукта реакции МДА/ТБК, равным 1,56105 см-1 М-1.Содержание ТБКАП в сыворотке выражали в нмоль/мг Hb. 50 Внеэритроцитарный гемоглобин (ВЭГ) плазмы крови определяли спектрофотометрическим методом по Каракашову А.В., Вичеву В.П. (1973). В опытную пробу вносили 0,4 мл плазмы и 1,6 мл реактива Драпкина (50 мг KCN + 200 мг K3 [FeCCN6] + 140 мг KH2PO4 на 1 л H2O). В контрольную пробу вместо плазмы помещали равное количество дистиллированной воды. Через 5 минут пробы фотометрировали на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Ленинград) при длинах волн λ=540 и λ=680 нм против контроля в кювете с длиной оптического пути 1 см. Расчѐт осуществляли по формуле: [E540 - E680] 373 = мг %, где E 540 интенсивность поглощения на длине волны = 540 нм; E 680 - интенсивность поглощения на длине волны = 680 нм; 373 - коэффициент для расчета. Для перевода результатов в систему СИ (мМоль/л) полученную величину необходимо умножить на переводной коэффициент 620,6 (согласно методике). Результат выражали в ммоль/л. 2.4. Статистическая обработка результатов Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoft Inc., США). В работе исследованные величины были представлены в виде выборочного среднего значения и стандартной ошибки средней величины. Достоверность различий средних величин независимых выборок оценивали с помощью параметрического критерия Стьюдента при нормальном законе распределения и непараметрического критерия Манна-Уитни при отличии распределения показателей от нормального. Проверку на нормальность распределения оценивали с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. При проведении статистического анализа рассчитывали достигнутый уровень значимости (р), при этом критический уровень значимости принимался равным 0,05. Оценка осуществлялась статистических с помощью связей между различными показателями корреляционно-регрессионного анализа. 51 Коэффициент корреляции Пирсона (r) оценивали на достоверность с помощью t критерия Стьюдента и доверительной вероятности p. При уровне значимости p более 0,05 связь считали недостоверной. Использовалась следующая классификация силы корреляции в зависимости от значения коэффициента корреляции r: при величине r < 0 - 0,29 – слабая корреляция, при r < 0,3 - 0,49 – умеренная корреляция, при r < 0,5 - 0,69 – заметная корреляция, при r < 0,7 - 0,89 – тесная корреляция, при r < 0,9 - 1,0 – очень тесная корреляция (Гурман В.Е., 2004). 52 Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Состояние углеводно-энергетического обмена у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена Красные клетки крови вовлекаются в патологический процесс не только при гематологических заболеваниях, но и претерпевают серьезные структурнофункциональные изменения при острых и хронических заболеваниях разного генеза, в том числе и при сахарном диабете, поэтому выбор их в качестве объекта (материала) исследования определяется тем, что им присущи общие принципы организации плазматических мембран (Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., 2004). Эритроциты являются наиболее удобной моделью, на которой можно наблюдать процессы деструкции, так как в них не происходит синтеза белка, и следовательно, восстановления структур, необходимых для поддержания целостности и жизнедеятельности клетки (Щербаченко И.М., 2008). Эритроциты лишены митохондрий, поэтому в качестве энергетического материала они могут использовать только глюкозу. В норме около 90% поступающей глюкозы используется в анаэробном гликолизе, а остальные 10% - в пентозофосфатном пути. Углеводный обмен определяет основной энергетический гомеостаз организма (Кендыш И.И., 1985). Гликоген и глюкоза являются одними из основных источников энергии, необходимых клеткам и тканям для осуществления их жизненных функций. При их аэробном и анаэробном превращении образуются макроэргические соединения, обеспечивающие энергетические и пластические потребности клетки (Северин А.В., 2011). Нарушения обмена углеводов при сахарном диабете, в том числе при диабете 2 типа, проявляются гиперлактатацидемии. в виде гипергликемии, глюкозурии и 53 В связи с этим, перед нами были поставлены две задачи: оценить состояние энергетического обмена в условиях выраженной гипергликемии и выявить наличие синдрома гипоксии у пациенток больных сахарным диабетом 2 типа в зависимости от их возраста и стадии заболевания. В данной главе изложены результаты исследования некоторых параметров углеводно-энергетического обмена: содержание глюкозы, С пептида в крови, содержание 2,3- дифосфоглицерата, уровень пировиноградной и молочной кислот, активность ферментов: гексокиназы, фосфогексокиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, фосфорилазы. 3.1.1. Содержание глюкозы В нормальных условиях жизнедеятельности организма глюкоза является основным энергетическим субстратом. Сохранение постоянства концентрации глюкозы в крови обеспечивается результатом протекания двух процессов: скоростью образования глюкозы путѐм гликогенеза или глюконеогенеза и скоростью утилизации глюкозы в тканях и клетках организма. Естественно, что на эти процессы существенное влияние оказывает концентрация глюкозы в крови. Глюкоза в эритроцитах используется и в пентозофосфатном пути, окислительный этап которого обеспечивает образование кофермента НАДФ, необходимого для восстановления глутатиона. В таблице 3.1. представлены данные о содержании глюкозы в крови у женщин обеих контрольных группы и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы этот показатель составил 4,89 ± 0,1 ммоль/л, а во второй контрольной группе - 5,24 ± 0,03 ммоль/л. В ходе исследования нами установлено повышение содержания глюкозы в крови пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа как в стадии суб-, так и декомпенсации углеводного обмена и имеет свои особенности в исследуемых группах. 54 Таблица 3.1. Содержание глюкозы в крови у пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Глюкоза, ммоль/л Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 6,39 ± 0,35 7,95 ± 0,48 p1< 0,05 p1< 0,05 4,89 ± 0,1 5,24 ± 0,03 6,28 ± 0,07 p2< 0,05 7,09 ±0,08 p2< 0,05 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 Так, у пациенток второго периода зрелости отмечается рост содержания глюкозы в крови при суб- и декомпенсации углеводного обмена (1 и 2 подгруппы) соответственно на 30,48% и 62,24% (p<0,05) относительно показателей в контрольной группе женщин. У пожилых пациенток с СД 2 типа как в стадии суб-, так и в стадии декомпенсации углеводного обмена (3 и 4 подгруппы) наблюдается аналогичное увеличение уровня глюкозы в крови на 19,85% и на 35,31% (p<0,05) соответственно по сравнению с показателями контрольной группы. При сравнении содержания глюкозы в крови в пределах каждой возрастной группы пациенток в зависимости от степени компенсации углеводного обмена нами выявлено, что у пациенток первой возрастной группы в стадии декомпенсации заболевания (2 подгруппа) отмечается более выраженное увеличение содержания глюкозы в крови (на 24,34%, p<0,05) по сравнению с пациентками, находящимися в стадии субкомпенсации углеводного обмена (1 подгруппа). 55 Сопоставимые данные были получены и у пациенток пожилого возраста, у которых также в стадии декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа) отмечается увеличение содержания глюкозы в крови (на 12,9%, p<0,05) относительно этого показателя у пациенток, находящихся в стадии субкомпенсации углеводного обмена (3 подгруппа) (табл. 3.1.1.). Таким образом, нами были подтверждены достоверные изменения уровня глюкозы в крови, адекватные стадиям компенсации углеводного обмена, подтверждающие диагноз заболевания. 3.1.2. Содержание С-пептида Инсулин регулирует уровень глюкозы двумя способами: вызывает снижение продукции глюкозы печенью и повышение синтеза гликогена; повышает транспорт и метаболизм глюкозы в периферических тканях, в частности, в жировых и мышечных клетках (Аметов А.С., Грановская-Цветкова А.М. и др. 1995). Синтез гликогена в мышцах больных СД 2 типа снижен на 50% по сравнению с людьми без СД 2 типа (Дедов И.И., Балаболкин М.И. и др., 2005). В таблице 3.2. указано содержание С-пептида в сыворотке крови у женщин контрольных групп и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. Содержание С-пептида в сыворотке у женщин первой контрольной группы составило 523,08 ± 34,38 ед., а во второй - 517,12 ± 27,5 (табл. 3.2.). В ходе исследования установлено, что у пациенток 1 и 2 возрастных групп отмечается достоверный рост концентрации С-пептида в крови. 56 Таблица 3.2. Содержание С-пептида в сыворотке крови у пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m С-пептид, ед. Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 523,08 ± 1540,52 ± 978,72 ± 793,71 ± 833,72 ± 34,38 4,92 8,31 9,77 4,00 p1< 0,05 p1< 0,05 517,12 ± 27,5 p2< 0,001 p2< 0,001 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 Из полученных данных следует, что у пациенток второго периода зрелости, больных СД 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена (1 и 2 подгруппы) содержание С-пептида в крови значительно увеличивается соответственно на 194,51% и 87,11% (p<0,05) по сравнению с показателями контрольной группы. У пожилых пациенток с СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации также наблюдается увеличение содержания С-пептида относительно показателей контрольной группы женщин – соответственно на 53,49% и 61,22% (p<0,05). При сравнении содержания С-пептида в пределах каждой возрастной группы в зависимости от степени компенсации углеводного обмена выявлены следующие закономерности. У пациенток второго периода зрелости в стадии декомпенсации заболевания (2 подгруппа) содержание С-пептида значительно ниже (на 36,47%, p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации углеводного обмена (1 подгруппа). У пожилых пациенток не отмечается различий в 57 показателях С-пептида в зависимости от степени компенсации основного заболевания. Как при суб-, так и при декомпенсации углеводного обмена (3 и 4 подгруппы) отмечается почти равнозначное повышение содержания С-пептида в крови. У пациенток второго периода зрелости происходит наиболее значимая интенсификация процессов синтеза С-пептида в стадии суб- и декомпенсации углеводного обмена (1, 2 подгруппы), что отражает усиление синтеза инсулина в ответ на гипергликемию на этой стадии заболевания. По мере увеличения возраста пациенток и степени тяжести заболевания, увеличение уровня С-пептида выражено в меньшей степени, может быть вызвано изменением темпа трансдукции инсулинового сигнала (Николаев А.Я. 2004) и являться возрастной особенностью течения СД 2 типа. Повышение концентрации глюкозы в крови влечѐт за собой повышение секреции инсулина, но с возрастом в организме человека происходит снижение утилизации глюкозы и понижение рецепторной чувствительности к инсулину. Причѐм снижение утилизации глюкозы является следствием понижения чувствительности тканей организма. Развитие инсулинорезистентности тканей стареющего организма является метаболическим дефектом и основной причиной угнетения гликолиза и синтеза гликогена, вызывая СД 2 типа (Bailey C.F., Flatt P.R.,1982). Таким образом, повышение содержания С-пептида в крови у пациенток с СД 2 типа 3 и 4 подгрупп адекватно увеличению содержания глюкозы в крови (рис.3.1). А у пациенток 1 и 2 подгрупп происходит «стрессовый» ответ в синтезе инсулина на повышение уровня глюкозы в этом возрастном периоде и в начальной стадии заболевания, так называемый «овершут», который может привести к декомпенсации заболевания рис.3.1. 58 % 250 * глюкоза 200 С пептид 150 *,** 100 *,** 50 *,** * * *,** * 0 1 подгруппа 2 подгруппа 3 подгруппа 4 подгруппа Рис. 3.1. Изменение содержания С-пептида и глюкозы в крови у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль) Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05) 3.1.3. Активность гексокиназы Известно, что развитие инсулинорезистентности тканей организма, приводящее к гипергликемии является основной причиной угнетения гликолиза и гликогенеза (Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., 2006). Основным энергетическим процессом и единственным путем ресинтеза АТФ в зрелых эритроцитах является гликолиз. В свою очередь эффективность этого метаболического пути зависит от самого «медленного» участка. Ключевым регуляторным ферментом гликолиза в эритроцитах является гексокиназа, катализирующая образование глюкозо-6фосфата – исходного продукта анаэробного гликолиза или гексозомнофосфатного цикла (Северин С.Е., 2011). 59 В таблице 3.3. представлены данные об активности гексокиназы у женщин первой контрольной группы - 1,19 ± 0,02 мкмоль/г Hb и второй контрольной группы - 1,2 ± 0,02 мкмоль/г Hb. Таблица 3.3. Активность гексокиназы в крови у пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Гексокиназа, мкмоль/г Hb Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 подгруппа 2 подгруппа группа 2 3 подгруппа 4 n=25 n=22 n=22 n=25 n=21 подгруппа n=21 1,19 ± 0,02 0,11 ± 0,01 0,03 ± 0,002 p1< 0,05 p1< 0,05 1,2 ± 0,02 0,015 ± 0,001 0,028 ± 0,01 p2< 0,001 p2< 0,001 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 У пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации углеводного обмена активность гексокиназы снижается соответственно на 91,15% и на 97,58% (p<0,05) относительно контрольных значений. Причѐм у пациенток этой возрастной группы при декомпенсированной форме СД 2 типа отмечается более значительное снижение активности этого фермента (на 72,64%, p<0,05) относительно пациенток с СД 2 типа в стадии субкомпенсации углеводного обмена (табл. 3.3.). Что касается пожилых пациенток (2 возрастная группа), то у них отмечается ещѐ более значительное снижение активности гексокиназы в стадии субкомпенсации (на 98,75%, p<0,05) и декомпенсации (на 97,66%, p<0,05) относительно значений в контрольной группе. При сравнении активности гексокиназы в пределах этой возрастной группы в зависимости от степени компенсации углеводного обмена нами обнаружено, что при стадии 60 декомпенсации (4 подгруппа) отмечается увеличение активности гексокиназы на 95,16% (p<0,05) относительно стадии субкомпенсации углеводного обмена (табл. 3.3.). Таким образом, у пациенток второго периода зрелости в стадии декомпенсации активность гексокиназы значительно снижается относительно стадии субкомпенсации углеводного обмена, в то время как у пожилых пациенток в стадии декомпенсации углеводного обмена активность гексокиназы преобладает над активностью этого фермента в стадии субкомпенсации углеводного обмена. Обнаруженные нами в пределах каждой возрастной группы разнонаправленные изменения активности гексокиназы в стадиях декомпенсации по сравнению со стадиями субкомпенсации углеводного обмена свидетельствуют о возрастных особенностях активности гексокиназы при СД 2 типа. Существенное снижение активности этого фермента относительно контрольных значений, выявленное нами у пациенток всех подгрупп, несмотря на увеличенное содержание глюкозы в крови, свидетельствует, вероятно, о снижении скорости включения глюкозы в гликолитические процессы при СД 2 типа. 3.1.4. Содержание 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) Гликолиз в эритроцитах имеет особое значение, заключающееся в том, что 1,3-дифосфоглицерат, образующийся в реакции, катализируемой глицеральдегид3-фосфатдегидрогеназой, может катализироваться не только 3- фосфоглицераткиназой с образованием АТФ и 3-фосфоглицерата, но и 2,3дифосфоглицератмутазой с образованием 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ), который является промежуточным продуктом гликолиза в эритроцитах и уменьшает сродство гемоглобина к кислороду, вызывая большую отдачу кислорода тканям (Олемпиева Е.В., 2004, 2009). Поэтому о признаках тканевой гипоксии можно судить по увеличению уровня 2,3-ДФГ. 61 В таблице 3.4 представлено содержание 2,3-ДФГ у женщин обеих контрольных групп и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы содержание 2,3 –ДФГ составило 4,73 ± 0,06 мкмоль/мл, а у женщин второй контрольной группы – 4,8 ± 0,04 мкмоль/мл. Таблица 3.4. Содержание 2,3-ДФГ в крови у пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m 2,3-дифосфоглицерат, мкмоль/мл Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 6,25 ± 0,09 6,99 ± 0,08 8,19 ± 0,18 8,87 ± 0,13 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2< 0,05 4,73 ± 0,06 4,8 ± 0,04 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 У пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа отмечается рост содержания 2,3-ДФГ как в стадии суб-, так и в стадии декомпенсации углеводного обмена (1 и 2 подгруппы) на 32,26% и на 47,82% (p<0,05) соответственно по сравнению с контрольной группой. У пожилых пациенток также отмечается рост содержания 2,3-ДФГ при суби декомпенсации углеводного обмена (3 и 4 подгруппы) соответственно на 70,63% и 84,8% (p<0,05). При оценке содержания 2,3-ДФГ в обеих возрастных группах пациенток в зависимости от стадий компенсации углеводного обмена, нами обнаружено, что у 62 пациенток обеих возрастных групп в стадиях декомпенсации углеводного обмена происходит увеличение содержания 2,3-ДФГ по сравнению со стадией субкомпенсации: у пациенток второго периода зрелости на 11,76% (p<0,05), у пожилых пациенток - на 8,31% (p<0,05) (табл. 3.4.). Известно, что направленность изменений содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах зависит от потребности организма в кислороде и носит адаптивный характер (Duhm J., Gerlach E., 1971; Torrance J.D., Lenfant C. et al., 1970/71). В целом, наблюдаемое нами выраженное увеличение содержания 2,3-ДФГ у всех подгрупп пациенток, по сравнению с контролем, но более выраженное у пожилых однозначно имеет возрастной аспект и указывает на значительное изменение кислородного режима и включение внутриклеточных компенсаторных процессов, направленных на улучшение обеспечения тканей кислородом у пациенток данных возрастных категорий. 3.1.5. Активность фосфогексокиназы (ФГИ) ФГИ - фермент, катализирующий обратимую реакцию изомеризации глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат, который в ходе дальнейшего каскада реакций гликолиза в конечном итоге даѐт либо пируват (аэробные условия) либо лактат (анаэробные условия) (Северин С.Е., 2011). В таблице 3.5 представлены данные об активности ФГИ у женщин обеих контрольных групп и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы активность ФГИ составила 8,02 ± 0,14 мкмоль/мг Hb в час, а у женщин второй контрольной группы – 8,06 ± 0,13 мкмоль/мг Hb в час. 63 Таблица 3.5. Содержание фосфогексоизомеразы в крови у пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Фосфогексоизомераза, мкмоль/мг Hb в час Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 6,83 ± 0,05 9,14 ± 0,06 6,6 ± 0,66 5,91± 0,38 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2< 0,05 8,02 ± 0,14 8,06 ± 0,13 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 У пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа активность ФГИ в стадии субкомпенсации заболевания (1 подгруппа) на 14,91% (p<0,05) ниже по сравнению с контролем, в то время как в стадии декомпенсации углеводного обмена у пациенток этой же возрастной группы (2 подгруппа) активность ФГИ на 13,92% (p<0,05) выше, чем в контрольной группе женщин. У пожилых пациенток с СД 2 типа в обеих стадиях суб- и декомпенсации заболевания (3 и 4 подгруппы) обнаружено снижение активности ФГИ соответственно на 17,80% и на 26,40% (p<0,05) по сравнению с контролем. При исследовании активности ФГИ в обеих возрастных группах пациенток в зависимости от стадии компенсации углеводного обмена, нами обнаружено, что у пациенток второго периода зрелости при декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) активность ФГИ увеличивается на 33,88% по сравнению со стадией субкомпенсации (1 подгруппа). У пожилых пациенток при декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа) отмечается недостоверное снижение активности ФГИ на 10,47% (p>0,1) по сравнению со стадией субкомпенсации. 64 Снижение активности ФГИ, по сравнению с контролем, у пациенток с СД 2 типа 1, 3 и 4 подгрупп может свидетельствовать о снижении включения глюкозы в окислительные процессы. В то же время, рост активности ФГИ у пациенток более молодого возраста при декомпенсации углеводного обмена может являться компенсаторным механизмом, обеспечивающим, вероятно, активацию галактозного пути утилизации углеводов и последующего образования глюкозо-6фосфата из глюкозо-1-фосфата. 3.1.6. Содержание пировиноградной кислоты (ПВК) и молочной кислоты (лактат) При изучении гликолиза с целью оценки состояния энергетических процессов и наличия гипоксии в эритроцитах нами были определены показатели содержания ПВК и лактата у пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации . В таблице 3.6. указано содержание этих показателей в крови у женщин контрольных групп и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. В первой контрольной группе женщин содержание пирувата составило 0,22 ± 0,003 мкмоль/мл, лактата 3,85 ± 0,06 ммоль/л. Во второй контрольной группе – пирувата 0,23 ± 0,004 мкмоль/мл, лактата - 3,76 ± 0,05 ммоль/л (табл.3.6.). 65 Таблица 3.6. Содержание пировиноградной кислоты в крови у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Пировиноградная кислота, мкмоль/мл Контрольная 1 возрастная группа группа 1 1 2 n=25 подгруппа n=22 0,22 ± 0,003 2 возрастная группа группа 2 3 4 подгруппа подгруппа подгруппа n=22 n=21 n=21 0,16 ± 0,004 0,28 ± 0,01 p2< 0,05 p2< 0,05 0,19 ± 0,001 0,16 ± 0,003 p1< 0,05 Контрольная p1< 0,05 0,23 ± 0,004 Молочная кислота, ммоль/л Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 4,65 ± 0,05 4,29 ± 0,07 5,12 ± 0,04 8,94 ±0,12 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2 < 0,05 3,85 ± 0,06 3,76 ± 0,05 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 Как видно из таблицы 3.6., у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации углеводного обмена отмечается снижение содержания ПВК соответственно на 12,78% и на 26,99% (p<0,05) на фоне достоверного роста содержания лактата (соответственно 22,66% и на 13,17%, p<0,05) относительно контрольных значений. При этом, у пациенток с СД 2 типа в стадии декомпенсации отмечается снижение содержания ПВК на 16,29% 66 (p<0,05) и снижение содержания лактата на 7,73% (p<0,05) относительно пациенток с СД 2 типа в стадии субкомпенсации углеводного обмена (1 подгруппа). У пожилых пациенток с СД 2 типа отмечается понижение содержания ПВК в стадии субкомпенсации углеводного обмена на 30,43%, и повышение содержания ПВК в стадии декомпенсации на 21,74% (p<0,05) относительно контрольных показателей. При этом, при декомпенсированной стадии СД 2 типа (4 подгруппа) отмечается повышение содержания ПВК на 78,85% (p<0,05) относительно стадии субкомпенсации углеводного обмена (3 подгруппа) (табл.6). Так же у этих пациенток отмечается повышение содержания лактата как при суб-, так и при декомпенсированной форме заболевания относительно контрольных значений (соответственно декомпенсированной форме на 36,17% заболевания и 137,76%, наблюдается p<0,05). При превалирование содержания лактата на 74,58% (p<0,05) относительно стадии субкомпенсации. Таким образом, у пациенток 1 2 и 3 подгрупп наблюдается активация анаэробного гликолиза, так как известно, что пируват является промежуточным продуктом анаэробного гликолиза и снижение его содержания в эритроцитах у пациенток можно объяснить усилением превращения этого субстрата в лактат при помощи лактатдегидрогеназы, что и было нами зарегистрировано, вызывая при этом метаболический лактатацидоз. Так же, наблюдаемый нами рост содержания лактата у всех пациенток обеих возрастных групп, но более выраженный у пожилых в стадии декомпенсации СД 2 типа, является результатом активации гликолитической оксидоредукции, которая обеспечивает протекание первой реакции окисления в ходе гликолиза при участии NAD-зависимой глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназы, а также последующее превращение 1,3-бифосфоглицерата в 2,3-бифосфоглицерат при участии дифосфоглицератмутазы. С другой стороны рост содержания лактата можно связать с процессом регуляции диссоциации оксигемоглобина, с так называемым эффектом ВеригоБора, который сочетается с вазодилатирующим эффектом молочной кислоты. 67 Отмеченный нами синхронный рост содержания ПВК и лактата у пожилых пациенток с СД 2 типа в стадии декомпенсации углеводного обмена относительно контроля, может свидетельствовать о возрастной компенсаторно- приспособительной реакции в условиях выраженной гипоксии, направленной на изменение процессов микроциркуляции, что может быть использовано в практике для оценки степени выраженности диабетической ангиопатии. 3.1.7. Коэффициент лактат/пируват С целью оценки интенсивности гликолитических процессов и степени выраженности тканевой гипоксии нами был рассчитан коэффициент лактат/пируват (Федорова М.В. и др., 1980). В таблице 3.7. представлены данные о значении этого показателя у женщин обеих контрольных групп и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы значение коэффициента составило 17,62 ± 0,41 усл.ед., у женщин второй контрольной группы - 16,35± 0,6 усл.ед. Как видно из таблицы 3.7. у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа при суб- и декомпенсации углеводного обмена (1 и 2 подгруппы) отмечается рост этого коэффициента относительно показателей в контрольной группе на 47,33% и на 55,11% соответственно. При этом, в стадии декомпенсации заболевания, достоверного роста этого коэффициента по сравнению со стадией субкомпенсации заболевания выявлено не было. У пожилых пациенток с СД 2 типа наблюдается значительное увеличение коэффициента лактат/ПВК как при суб-, так и при декомпенсации углеводного обмена (3 и 4 подгруппы) соответственно на 101,5% и на 97,98% (p<0,05) относительно значений контрольной группы. При декомпенсации углеводного обмена у пациенток этого возраста было отмечено незначительное снижение этого показателя относительно стадии субкомпенсации. 68 Таблица 3.7. Значения коэффициента лактат/пируват в крови у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Коэффициент Лактат/ПВК, ед. Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 подгруппа 2 подгруппа группа 2 3 подгруппа 4 подгруппа n=25 n=22 n=22 n=25 n=21 n=21 25,96 ± 1,65 27,33 ± 0,6 32,95 ± 0,9 32,37 ± 1,08 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2< 0,05 17,62 ± 0,41 16,35 ± 0,6 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 На рисунке 3.2. представлено изменение содержания пировиноградной и молочной кислот, коэффициента лактат/пируват у пациенток с СД 2 типа в зависимости от возраста и стадий компенсации углеводного обмена, по сравнению с контрольными значениями. 160 % ПВК *,** 140 120 Лактат 100 * *,** Лактат/ПВК 80 60 *,** * 40 * * 20 * *,** 0 -20 * *,** -40 -60 1 подгруппа 2 подгруппа * 3 подгруппа 4 подгруппа 69 Рис. 3.2. Изменение содержания пировиноградной и молочной кислот, коэффициента лактат/пируват у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации углеводного обмена (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль) Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p 1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05) Полученные результаты относительно значений коэффициента лактат/пируват у всех пациенток с СД 2 типа свидетельствуют об активации анаэробного гликолиза, который имеет возрастные особенности. Более значимое усиление гликолитических процессов имеет место в эритроцитах пожилых пациенток, что отражается существенным ростом содержания лактата, снижением роста ПВК у пациенток с субкомпенсированной формой, а при декомпенсации углеводного обмена рост содержания лактата сопровождается ростом содержания ПВК, а также значительным ростом значения коэффициента лактат/пируват (рис. 3.2.). Выявленное угнетение активности гексокиназно-лимитирующего звена гликолиза поставило вопрос об исследовании возможных путей поддержания гликолитических процессов в эритроцитах в зависимости от возраста пациенток и стадий компенсации диабета. 3.1.8. Активность гликогенфосфорилазы (фосфорилаза) Известно, что в зрелых эритроцитах сохраняется целый ряд ферментов, характерных для метаболизма ретикулоцитов и молодых популяций клеток. Так, несмотря на отсутствие дыхательной цепи, в эритроцитах сохраняются ферменты, катализирующие соответствующие метаболические процессы. При формировании патологических состояний изменение активности этих ферментов может служить индикаторами степени тяжести заболевания в эритроцитах и отражать 70 потенциальные приспособительские возможности организма (Smith E., Morowitz H., 2004). При добавлении конструирование в инкубационную модельной системы) среду гликогена выявляется (т.е. активность гликогенфосфорилазы, о чѐм свидетельствует убыль неорганического фосфата в среде инкубации. АТФ является донором фосфата для процесса активации фосфорилазы. При снижении уровня АТФ происходит превращение дискоцитов в эхиноциты, что приводит к изменению вязкоэластичных свойств и соответственно – невозможность образования гл-6-фосфата, что формирует «порочный» круг, ведущий к деградации структурно-функциональноцй целостности эритроцита (Липунова Е.А., Скоркина М.Ю., 2004.). Гликогенфосфорилаза инициирует гликогенолиз, расщепляя α-1,4- гликозидные связи. Продукт действия данного фермента – гл-1-фосфат изомеризуется в гл-6-фосфат фосфоглюкомутазой (Deb A.C., 2004; Северин Е.С., 2004). В таблице 3.8. представлены данные об активности фосфорилазы у женщин контрольных групп и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. В первой контрольной группе содержание фосфорилазы составило 1,4± 0,06 мкмоль/мг Hb, во второй 1,45 ± 0,06 мкмоль/мг Hb. Таблица 3.8. Активность гликогенфосфорилазы в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Фосфорилаза, мкМоль/мг Hb Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 2,88 ± 0,01 2,97 ± 0,02 3,35 ±0,05 5,0 ±0,03 1,4± 0,06 1,45 ± 0,06 71 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2< 0,05 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 Как видно из таблицы 3.8. отмечается достоверный рост активности этого фермента у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации (1 и 2 подгруппы) соответственно на 105,04% и на 111,26% (p<0,05) относительно значений в контрольной группе. У пожилых пациенток с СД 2 типа также отмечается значительный рост активности фосфорилазы при суб- и декомпенсации углеводного обмена (3 и 4 подгруппы) соответственно на 131,03% и на 244,83% (p<0,05) относительно показателей в контрольной группе. При этом в стадии декомпенсации углеводного обмена отмечается рост еѐ активности (на 49,15%, p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации (табл. 3.8.). Повышение активности общей фосфорилазы в модельных опытах свидетельствует об активации гликогенолиза, имеющей по всей вероятности, компенсаторную направленность. Значительная активация фосфорилазы у пациенток пожилого возраста свидетельствует об усилении процессов распада гликогена и направлена на образование глюкозо-6-фосфата. Эти данные способствуют пониманию сущности приспособительных механизмов в ситуации, характеризующейся угнетением активности гексокиназы. Так же, активация фосфорилазы может быть связана с изменением популяционного состава эритроцитов за счѐт гемолиза зрелых клеток и превалирования молодых форм. 3.1.9. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Гл-6-ФДГ) Анализ углеводно-энергетического обмена в эритроцитах связан с оценкой вовлечения глюкозо-6-фосфата в гексомонофосфтаный шунт (ПФШ). Начальные его реакции, в частности, окислительная ветвь, является необходимым для выработки НАДФ+Н+. Ключевым ферментом пентозного цикла окисления 72 глюкозы является гл-6-ФДГ. В ходе первой реакции дегидрирования окислительного этапа ПФП гл-6-фосфат превращается в глюконолактон-6-фосфат под действием гл-6-ФДГ. В таблице 3.9. представлена активность гл-6-ФДГ у женщин контрольной группы и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы активность гл-6-ФДГ составила 0,17 ± 0,01 мкмоль/г Hb, активность во второй кнтрольной группе составила 0,16 ± 0,003 мкмоль/г Hb. При исследовании активности гл-6-ФДГ у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации углеводного обмена (1 подгруппа) наблюдается повышение активности на 25,18% (p<0,05), а при декомпенсации (2 подгруппа) отмечается снижение активности этого фермента на 13,13% (p<0,05) по сравнению с контролем (табл. 3.9.). Таблица 3.9. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, мкмоль/г Hb в час Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 0,22 ±0,01 0,15 ± 0,01 0,1± 0,001 0,11 ± 0,002 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2< 0,05 0,17 ± 0,01 Примечание: 0,16 ± 0,003 73 p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 При этом, в стадии декомпенсации углеводного обмена у пациенток этого возраста имеет место снижение использования глюкозы в ПФП, так как отмечается снижение активности гл-6-ФДГ на 30,61% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации углеводного обмена. У пожилых пациенток наблюдается значительное снижение активности фермента гл-6-ФДГ при суб- и декомпенсации углеводного обмена (3 и 4 подгруппы) соответственно на 37,5% и на 31,25% (p<0,05) по сравнению с контролем, что указывает на угнетение активности пентозофосфатного пути окисления глюкозы. Оценка изменений активности гл-6-ФДГ у пациенток этого возраста в зависимости от степени компенсации углеводного обмена установила, что при стадии декомпенсации СД 2 типа отмечается повышение активности гл-6ФДГ по сравнению со стадией субкомпенсацией СД 2 типа на 12,25% (p<0,05). Таким образом, у пациенток с СД 2 типа выявлены возрастные особенности изменения активности гл-6-ФДГ в зависимости от степени тяжести заболевания, выражающиеся в росте активности этого фермента только у пациенток первой возрастной группы с СД 2 типа в стадии субкомпенсации. Полученные данные могут свидетельствовать об использовании НАДФ+ в синтезе пентоз (рибулозо-5-фосфат) для нуклеотидов, или могут быть компенсаторно-приспособительным механизмом компенсации гипергликемии (Гаврилов О.К. и др., 1985). Выявленное нами снижение активности гл-6-ФДГ у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии декомпенсации (2 подгруппа) и у пожилых пациенток с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации (3 и 4 подгруппы) сопровождается уменьшением выхода НАДФН+, что в итоге приводит к уменьшению активности гликолиза и уменьшению «выхода» энергии АТФ. В результате недостатка энергии в виде АТФ происходит гемолиз эритроцитов, что является отражением формирования гипоксии (Клиорин А.И. и соавт., 1974). 74 Таким образом, в ходе исследования нами были установлены особенности углеводно-энергетического обмена у пациенток разных возрастных групп, свидетельствующие о разном состоянии компенсаторных механизмов, связанных с нарушением метаболизма глюкозы и имеющих возрастные особенности и зависящие от стадии углеводного обмена (рис. 3.3.). В частности, на фоне повышенного содержания глюкозы в крови, о снижении скорости гликолиза у пациенток обеих возрастных групп свидетельствует низкая активность гексокиназы. А повышенное содержание 2,3ДФГ в крови, имеющее тенденцию к росту с увеличением возраста пациенток свидетельствует о развитии гипоксии у пациенток обеих возрастных групп, что, в свою очередь является компенсаторным механизмом. Так как нами обнаружена низкая активность гексокиназы, то обнаруженное нами снижение активности ФГИ у пациенток 1,3 и 4 подгрупп (табл. 3.5.) можно объяснить отсутствием в достаточном количестве субстрата (Г-6-Ф). А повышение активности ФГИ у пациенток зрелого возраста с СД 2 типа в стадии декомпенсации может отражать особенности перестроек у данного контингента больных (рис. 3.3.). Состояние углеводно-энергетического обмена у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации ЭРИТРОЦИТ Пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации Снижение активности гексокиназы * Рост содержания 2,3-ДФГ* Снижение активности ФГИ* Снижение содержания ПВК* Рост содержания лактата** Рост коэф. лактат/ПВК* Рост активности фосфорилазы* Рост активности гл-6-ФДГ Пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии декомпенсации Снижение активности гексокиназы ** Рост содержания 2,3-ДФГ** Рост активности ФГИ Снижение содержания ПВК** Рост содержания лактата* Рост коэф. лактат/ПВК** Рост активности фосфорилазы** Снижение активности гл-6-ФДГ* 1.Признаки тканевой гипоксии. 2.Рост выхода НАДФ+ как компенсаторно адаптационный механизм защиты от гемолиза эритроцитов. 3. Активация ПФП. 4.Усиление катаболизма гликогена и уменьшение образования Г-6-Ф – показатель клеточного дефицита глюкозы Пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии субкомпенсации Снижение активности гексокиназы**** Рост содержания 2,3-ДФГ*** Снижение активности ФГИ** Снижение содержания ПВК*** Рост содержания лактата*** Рост коэф. лактат/ПВК**** Рост активности фосфорилазы*** Снижение активности гл-6-ФДГ*** 1.Снижение выхода НАДФ+ → угроза гемолиза эритроцитов. 2. Нарастание признаков тканевой гипоксии. 3.Усиление признаков клеточного дефицита глюкозы.4. Торможение вовлечения глюкозы в реакции гликолиза и ПФП. Пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии декомпенсации Снижение активности гексокиназы*** Рост содержания 2,3-ДФГ****. Снижение активности ФГИ*** Рост содержания ПВК Рост содержания лактата**** Рост коэф. лактат/ПВК*** Рост активности фосфорилазы**** Снижение активности гл-6-ФДГ** 1.Рост содержания ПВК и лактата как компенсаторный механизм в условиях гипоксии. 2.Снижение выхода НАДФ+ → угроза гемолиза эритроцитов. 3. Манифестация модуляционного механизма компенсации гликогена. 4. Блок на уровне вовлечения глюкозы в реакции гликолиза и ПФП. Гипоксия. Лактатацидоз. Торможение фосфорилирования глюкозы и активация гликогенолиза как показатель клеточного дефицита глюкозы – клеточное «голодание», достигающее наибольших значений при декомпенсации заболевания у пожилых пациенток. и глюконеогенеза. Рис. 3.3. Состояние углеводно-энергетического обмена при СД 2 типа в зависимости от возраста пациенток и степени компенсации углеводного обмена. Примечание: знак «*» отражает тенденцию изменений указанных параметров Снижение содержания ПВК и накопление лактата в крови у пациенток 1,2 и 3 подгрупп, прежде всего, свидетельствует об активации анаэробного гликолиза и о наличии лактатацидоза, что объясняется отставанием скорости окисления пирувата на фоне гипоксии, а рост содержания ПВК на фоне роста содержания лактата у пожилых пациенток в условиях более тяжѐлого течения заболевания является компенсаторной реакцией и имеет возрастные особенности. На фоне активированного заключительного этапа анаэробного гликолиза наблюдается повышение активности фосфорилазы во всех исследуемых подгруппах пациенток. Обращает на себя внимание тот факт, что у пожилых пациенток в стадии декомпенсации этот рост составил 244,83% (p<0,05) по сравнению с контролем. Полученные данные позволяют полагать, что пути метаболической коррекции при СД 2 типа могут быть связаны с восполнением в клетках крови гомеостатического внутриклеточных уровня глюкозо-6-фосфата ферментативных процессов в за обход счѐт активации блока на этапе фосфорилирования глюкозы. Точное выявление нарушений внутриклеточного метаболизма глюкозы, установление возможностей корригирующей метаболической терапии с привлечением методов генной инженерии позволит в дальнейшем установить практическую значимость проведенных исследований. 77 3.2. Состояние газотранспортной системы крови у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена Гипоксия запускает ряд компенсаторно-приспособительных механизмов, которые направлены на компенсацию нехватки кислорода (Wood S.C., 1995). Вследствие развития гипоксии в организме происходят сложные изменения на всех этапах транспорта кислорода. При развитии гипоксии на начальном этапе начинают работать механизмы адаптации к недостатку кислорода, одними из которых являются снижение сродства гемоглобина к кислороду, изменение количества эритроцитов и концентрации гемоглобина (Микашинович З.И. и др. 2008; Шлык С.В., 1992; Терентьев В.П., 1997). Для выяснения особенностей состояния газотранспортной системы крови у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в зависимости от возраста и стадии компенсации углеводного обмена нами были изучены наиболее значимые показатели этой системы. 3.2.1. Уровень гемоглобина Необходимую информацию о состоянии газотранспортной функции эритроцитов даѐт изучение состояния гемоглобина, составляющего молекулярную основу дыхательной функции крови (Тихонов Е.Г. и соавт., 1985; Северин Е.С., 2004). В таблице 3.10. представлен уровень гемоглобина в капиллярной крови женщин обеих контрольных групп и пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы уровень гемоглобина в крови составил 126,6 ± 0,98 г/л, а у женщин второй контрольной группы - 126,08 ± 1,11 г/л. 78 Таблица 3.10. Уровень гемоглобина в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Гемоглобин, г/л Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 138 ± 1,61 145,5 ± 2,33 p1< 0,05 p1< 0,05 126,6 ± 0,98 126,08 ±1,11 131,95±2,76 140,14±2,69 p2< 0,05 p2< 0,05 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 Из таблицы 3.10. видно, что в первой возрастной группе происходит увеличение содержания гемоглобина при субкомпенсации углеводного обмена на 9% (p1<0,05), а при декомпенсации на 14,93% (p<0,05) (2 подгруппа) по сравнению с показателями контрольной группы. При этом, у пациенток этой возрастной группы в стадии декомпенсации заболевания отмечается повышение содержания гемоглобина на 5,43% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации у пациенток этой же возрастной группы. У пожилых пациенток также наблюдается повышение содержания гемоглобина в крови по сравнению с данными контрольной группы у пациенток с СД 2 типа при суб- и декомпенсации углеводного обмена (3 и 4 подгруппы) на 4,65% и на 11,15% (p<0,05) соответственно. У пациенток этой возрастной группы при декомпенсации заболевания повышается рост содержания гемоглобина на 6,21% по сравнению со стадией субкомпенсации углеводного обмена (табл.3.10.). 79 Таким образом, уровень гемоглобина в крови характеризуется достоверным ростом этого показателя у пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена, при этом прослеживается чѐткая связь между степенью тяжести СД, возрастом пациенток и «включением» количественного механизма адаптации к гипоксии. 3.2.2. Содержание эритроцитов В таблице 3.11. представлено содержание эритроцитов в крови женщин контрольных групп и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы этот показатель составил 4,46 ± 0,09 на 1012/л, у второй группы - 4,37 ± 0,07 на 1012/л. Таблица 3.11. Содержание эритроцитов крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Эритроциты х 1012/л Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 4,84 ± 0,05 4,99 ± 0,01 5,21 ± 0,04 5,29 ± 0,02 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2< 0,05 4,46±0,09 4,37 ± 0,07 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 80 У пациенток второго периода зрелости при суб- и декомпенсации углеводного обмена (1 и 2 подгруппы) отмечается повышение содержания эритроцитов на 8,49% и на 11,79% (p<0,05) соответственно по сравнению с данными контрольной группы женщин. Наибольшее повышение содержания эритроцитов отмечается у пожилых пациенток в обеих подгруппах. В частности, у пожилых пациенток при суб- и декомпенсации заболевания (3 и 4 подгруппы) рост содержания эритроцитов составил 19,22% и 21,05% (p<0,05) соответственно по сравнению с показателями в контрольной группе. Значительных изменений при декомпенсированных формах заболевания по сравнению со стадиями субкомпенсации заболевания не наблюдалось. Данные, приведѐнные в таблице 3.11 свидетельствуют о повышении содержания эритроцитов у пациенток обеих возрастных групп, которое постепенно нарастает с увеличением возраста и степени тяжести заболевания, что подтверждает «включение» количественного механизма адаптации. 3.2.3. Уровень гликозилированного гемоглобина В таблице 3.12. представлен уровень гликозилированного гемоглобина (HbA1C) в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой и второй контрольных групп уровень HbA1C составил соответственно 4,77 ± 0,01 усл.ед. и 4,8 ± 0,01 усл.ед. При исследовании этого показателя у пациенток второго периода зрелости, отмечается повышение уровня HbA1C в стадии суб- и декомпенсации на 38,67% и 55,89% соответственно (1 и 2 подгруппы), по сравнению с контролем (табл. 3.12.). При этом, у пациенток с заболеванием в стадии декомпенсации отмечается рост уровня HbA1C на 12,42% (p<0,05) по сравнению с показателями пациенток в стадии субкомпенсации заболевания. 81 Таблица 3.12. Уровень гликозилированного гемоглобина в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Гликозилированный гемоглобин, усл.ед. Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 6,61 ±0,19 7,44 ±0,27 7,03 ± 0,14 7,62 ± 0,1 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2< 0,05 4,77 ± 0,01 4,8 ± 0,01 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 У пожилых пациенток, по сравнению с контролем, также отмечается рост этого показателя в стадиях суб- и декомпенсации заболевания (3 и 4 подгруппы) (соответственно на 46,46% и 58,75%, p<0,05). В стадии декомпенсации заболевания существенного роста содержания HbA1C обнаружено не было. Повышение уровня глюкозы крови значительно ускоряет реакцию Майяра что, в свою очередь, приводит к повышению уровня HbA1C в крови. Таким образом, в табл. 3.12. представлена адекватная картина повышения содержания гликозилированного гемоглобина в ответ на повышенный уровень глюкозы в крови (см. п. 3.1.) у исследуемых подгрупп пациенток. Оценивая параметры газотранспортной системы крови, такие как уровень гемоглобина, содержание эритроцитов и уровень гликозилированного гемоглобина, отражающие особенности количественной адаптации к гипоксии нами обнаружено, что у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста при СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена имеет место увеличение кислородной ѐмкости крови. 82 Характерное повышение содержания гемоглобина, эритроцитов и гликозилированного гемоглобина свидетельствует о стимуляции количественного механизма адаптации к гипоксии, возникающей в ответ на изменения функциональных метаболических характеристик гемоглобина (рис.3.4). % 70 *,** *,** 60 * 50 Hb * 40 HbA1C Эритроциты 30 20 10 *,** * *,** * * *,** *,** * 0 1 подгруппа 2 подгруппа 3 подгруппа 4 подгруппа Рис. 3.4. Изменение некоторых показателей газотранспортной функции крови у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации обмена (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль) Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05) Необходимо заметить, что с увеличением возраста пациенток и степени тяжести заболевания (декомпенсация) гипоксия более выражена, о чѐм свидетельствует увеличивающийся рост уровня гликозилированного гемоглобина у пожилых пациенток. Ранее (см.п. 3.1.4, 3.1.6. ), нами уже были описаны изменения содержания 2,3-ДФГ, ПВК и лактата в эритроцитах пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации углеводного обмена, которые 83 характеризуется ростом значений этих показателей (табл. 3.4., 3.6.) Установленное нами увеличение содержания 2,3-ДФГ как аллостерического регулятора функции гемоглобина на фоне роста содержания эритроцитов, свидетельствует об оптимизации процессов доставки кислорода к органам и тканям пациенток обеих возрастных групп, но более выраженное у пациенток пожилого возраста с СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации углеводного обмена. Снижение содержания ПВК с накоплением конечного продукта гликолиза – лактата у пациенток 1,2 и 3 подгрупп (табл.3.6.), свидетельствует об уменьшении рН крови и развитии метаболического лактатацидоза, который можно считать компенсаторной реакцией организма, направленной с одной стороны на стимуляцию процессов глюконеогенеза в условиях относительной инсулярной недостаточности, а с другой стороны. влияет на сродство Hb к О2 за счѐт включения эффекта Вериго-Бора, который имеет отношение к вазодилатирующим свойствам молочной кислоты. Повышение содержания ПВК у пациенток 4 подгруппы на фоне роста содержания лактата может отражать повышение уровня функционирования эритроцитов, как ответ на гипоксию и отражать включение адаптационных механизмов. Таким образом, можно заключить, что с увеличением возраста пациенток и степени тяжести СД 2 типа формируется недостаточность кислородтранспортного обеспечения организма, количественных и отражением модуляционных чего является показателей рост адаптации, наибольшей выраженности в 1, 2 и 3 группах пациенток (рис. 3.5.). и активация достигающих Состояние газотранспортной системы у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации ЭРИТРОЦИТ Пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации Рост уровня гемоглобина**** Рост содержания эритроцитов* Рост уровня HbA1C* Рост содержания 2,3-ДФГ* Снижение содержания ПВК* Рост содержания лактата** Рост коэф. лактат/ПВК* Пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии декомпенсации Рост уровня гемоглобина** Рост содержания эритроцитов ** Рост уровня HbA1C *** Рост содержания 2,3-ДФГ** Снижение содержания ПВК** Рост содержания лактата* Рост коэф. лактат/ПВК** Пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии субкомпенсации Рост уровня гемоглобина* Рост содержания эритроцитов *** Рост уровня HbA1C ** Рост содержания 2,3-ДФГ*** Снижение содержания ПВК*** Рост содержания лактата*** Рост коэф. лактат/ПВК**** Пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии декомпенсации Рост уровня гемоглобина*** Рост содержания эритроцитов **** Рост уровня HbA1C **** Рост содержания 2,3-ДФГ****. Рост содержания ПВК Рост содержания лактата**** Рост коэф. лактат/ПВК*** Гипоксия. Увеличение кислородной ѐмкости крови. Активация количественных и модуляционных показателей механизма адаптации к гипоксии. Уменьшение рН крови. Лактатацидоз. Рис.3.5. Параметры газотранспортной системы при СД 2 типа в зависимости от возраста пациенток и степени компенсации углеводного обмена Примечание: знак «*» отражает тенденцию изменений указанных параметров 3.3. Антиоксидантная ферментативная система крови у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена Наличие восстановленного НАДФ+ и его использование в работе антиоксидантной системы клетки является необходимым условием поддержания структурно-функциональной целостности эритроцитов. С этих позиций представляется целесообразным проанализировать состояние ферментов АОЗ в исследуемых группах пациенток. Изменение газотранспортной функции крови у пациенток с сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа), описанные в главе 4, свидетельствует о наличии гипоксии, более выраженной у пациенток старшей возрастной группы. Согласно литературным данным, гипоксические проявления неизбежно приводят к запуску процессов свободнорадикального окисления и развитию выраженного окислительного стресса в организме человека (Зенков Н.К., 2001, Baynes J.W. et al., 1999). В связи с этим, в данном фрагменте работы была поставлена задача выявить состояние про- и антиоксидантного баланса, установить наличие и степень выраженности окислительного стресса в крови пациенток с СД 2 типа с учѐтом возрастных особенностей и степени компенсации углеводного обмена (суб- и декомпенсация). 3.3.1. Активность Cu,Zn- супероксиддисмутазы (Cu,Zn-СОД) В таблице 3.13. представлены данные активности Cu,Zn-СОД в эритроцитах крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы активность Cu,Zn-СОД составила 573,98 5,85 усл.ед./г Hb, у женщин второй контрольной группы – 577,38 5,5 усл.ед./г Hb 86 Таблица 3.13. Активность Cu,Zn-СОД в эритроцитах крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Cu,Zn-супероксиддисмутаза, усл.ед./гHb Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 подгруппа 2 подгруппа группа 2 3 подгруппа 4 подгруппа n=25 n=22 n=22 n=25 n=21 n=21 1038,78 1029,96 1051,43 688,33 5,84 26,44 0,18 p1< 0,05 p1< 0,05 573,98 5,85 577,38 5,5 22,4 p2< 0,05 p2< 0,05 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 У пациенток обеих возрастных групп в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена отмечается рост активности Cu,Zn-СОД в крови. Активность Cu,Zn-СОД в крови у пациенток второго периода зрелости, больных СД 2 типа в стадии субкомпенсации (1 подгруппа) и декомпенсации (2 подгруппа) увеличивается соответственно на 80,98% и 79,44% (p<0,05) по сравнению с показателями контрольной группы. Что касается пожилых пациенток, то у них в стадии субкомпенсации (3 подгруппа) наблюдается увеличение активности Cu,Zn-СОД на 82,10% (p<0,05) по сравнению со значениями в контрольной группе. В то же время, при декомпенсации заболевания (4 подгруппа) у пожилых пациенток активность Cu,Zn-СОД повышается незначительно по сравнению со значениями контрольной группы - всего на 19,22% (p<0,05). При сравнении активности Cu,Zn-СОД в крови у пациенток с СД 2 типа в пределах каждой возрастной группы в зависимости от степени компенсации углеводного обмена выявлены следующие закономерности. У пациенток первой 87 возрастной группы как в стадии субкомпенсации, так и декомпенсации заболевания (1 и 2 подгруппы) активность данного фермента колеблется примерно в одинаковых пределах. В то же время, у пациенток второй возрастной группы при декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа) активность Cu,ZnСОД значительно ниже (на 34,53%, p<0,05) чем в стадии субкомпенсации (3 подгруппа) (табл. 3.13.). Из литературных данных известно, что Cu,Zn-СОД восстанавливает супероксиданионрадикал в реакции дисмутации О2∙- до Н2О2 и, удаляя О2•, исключает его взаимодействие с NO•, тем самым предотвращая образование пероксинитрита – гораздо более опасного прооксиданта и окислителя, чем перекись водорода (Munday R. et al., 1989). Значительное снижение активности Cu,Zn-СОД в крови у пациенток пожилого возраста в стадии декомпенсации углеводного обмена, по сравнению со стадией субкомпенсации, служит косвенным свидетельством избыточной продукции О2∙- и пероксида водорода, которая способствует образованию в реакциях Фентона и Хабера-Вейса самой агрессивной активной формы кислорода – гидроксильного радикала (OH∙) – за счет наличия в эритроцитах ионов железа Fe2+: Н2О2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + OH•. Данная реакция катализируется ионами металлов с переменной валентностью, преимущественно Fe2+ и Cu2+, которые высвобождаются из белковых структур и становятся доступными только в условиях ацидоза (Федорова Т.Н., 2004). Анализируя полученные факты можно придти к заключению, что степень изменения активности Cu,Zn-СОД отражает нарастание изменений параметров гомеостаза по мере углубления патологического процесса. Так, несмотря на наличие общей адаптивной реакции активации Cu,ZnСОД, способность к устранению активных форм кислорода при некомпенсированном диабете у пожилых пациенток снижается. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что у пациенток пожилого возраста при декомпенсированном СД 2 типа активность 88 фермента Cu,Zn-СОД активируется в меньшей степени относительно остальных подгрупп пациенток и свидетельствуют о снижении способности эритроцитов к устранению свободных радикалов, что может указывать на превалирование прооксидантных реакций. В этой связи представляет интерес характер изменений активности КАТ в исследуемых группах. 3.3.2. Активность каталазы Согласно современным представлениям, каталаза (КАТ) препятствует накоплению H2O2, которая оказывает неоднозначное действие на клеточные компоненты (Меньщикова Е.Б. и др., 2006). В таблице 3.14. представлены данные активности КАТ в крови женщин контрольных групп и пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. Активность КАТ у женщин первой контрольной группы составила 2,450,05 мкат/г Hb, у второй группы 2,44 0,05 мкат/г Hb. Таблица 3.14. Активность каталазы в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Каталаза, мкат/г Hb Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 2,84 0,02 3,58 0,03 6,43 0,27 3,81 0,08 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2< 0,05 2,45 0,05 2,44 0,05 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 89 При изучении активности КАТ в крови пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации углеводного обмена (1 подгруппа) отмечается незначительное (на 16,12%, p<0,001) повышение активности данного фермента по сравнению с показателями в контрольной группе. При этом, в стадии декомпенсации диабета (2 подгруппа) у пациенток этой же возрастной группы происходит значительное повышение активности каталазы (на 46,41%, p<0,05) по сравнению с показателями в контрольной группе. По сравнению с показателями в контрольной группе у пациенток пожилого возраста с СД 2 типа в стадии субкомпенсации (3 подгруппа) отмечается значительный рост активности КАТ (на 163,52%, p<0,05), а при декомпенсации СД 2 типа (4 подгруппа) рост активности КАТ увеличивается на 65,15% (p<0,05) (табл. 3.14., рис. 3.6.). 200 * 180 % Cu,Zn-СОД 160 140 Каталаза 120 100 * * *,** 80 *,** 60 *,** 40 20 *,** * 0 1 подгруппа 2 подгруппа 3 подгруппа 4 подгруппа Рис. 3.6. Изменение активности Cu,Zn-СОД и КАТ в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль) Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p 1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05) 90 При сравнении активности КАТ у пациенток с СД 2 типа в пределах каждой возрастной группы в зависимости от степени компенсации углеводного обмена нами обнаружено, что у пациенток второго периода зрелости при стадии декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) активность каталазы значительно повышена (на 26,08%, p<0,05), относительно стадии субкомпенсации заболевания (1 подгруппа). Следует отметить, что у пациенток пожилого возраста при декомпенсированном СД 2 типа (4 подгруппа) отмечается значительное снижение активности каталазы (на 40,82%, p<0,05) по сравнению с показателями пациенток в стадии субкомпенсации СД 2 типа этой же возрастной группе (табл. 3.13.), хотя эти значения превышают контрольные величины. Так как, одним из способов предотвращения активации СРО является адекватное усиление работы ферментативных антиоксидантных систем (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Меерсон Ф.З., 1981), то наблюдаемое нами повышение активности Cu,Zn-СОД и КАТ у пациенток обеих возрастных групп при суб- и декомпенсированном СД 2 типа по сравнению с показателями контрольной группы свидетельствует о сохранении способности эритроцитов к антиокислительной защите и предотвращать образование супероксидного анионрадикала и пероксида водорода. Учитывая, что от активности КАТ напрямую зависит активность Cu,ZnСОД, т.е. накопление в среде перекиси водорода при сниженной активности каталазы ведет к инактивации Cu,Zn-СОД (Гусев В.А., 2000), полученные нами данные об активности Cu,Zn-СОД и КАТ у пожилых пациенток с СД 2 типа в стадии декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа) согласуются с данными литературы и свидетельствуют о прямой зависимости активности ферментов 1 линии АОЗ от возраста пациенток и степени тяжести течения СД 2 типа. Таким образом, выявленная взаимосвязь между возрастными особенностями изменения активности Cu,Zn-СОД и каталазы у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в зависимости от степени компенсации углеводного обмена, может иметь патогенетическое значение и служить маркером 91 оценки состояния адаптивно-компенсаторных возможностей организма при СД 2 типа (Gurdol, F., et al., 1997). 3.3.3. Состояние глутатионзависимого ферментного комплекса Компонентам АОС крови, как низкомолекулярным, так и ферментативным, участвующим в метаболизме глутатиона, принадлежит ключевая роль в ограничении процессов СРО (Козлова Н.М., Катосова Н.М., 2001; Fuchs J.U., 1998; Arrigo A-P., 1999). Для представления более полной картины состояния АОС крови у пациенток с СД 2 типа в зависимости от возраста и стадии компенсации углеводного обмена, был проведен анализ важной составной части АОЗ - ферментативной активности глутатионового звена. Известно, что восстановленный глутатион (GSH) необходим для эффективной работы ГПО. Восстановленный глутатион образуется путѐм восстановления окисленного глутатиона с помощью глутатионредуктазы (ГР). В свою очередь, для функционирования ГР необходим восстановленный НАДФ, реакцию восстановления которого в окислительной ветви глюкозомонофосфатного шунта катализирует глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (Гл-6-ФДГ). В таблице 3.15. представлены данные о содержании восстановленного глутатиона и глутатионредуктазы, об активности ферментов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы глутатионпероксидазы, (гл-6-ФДГ) в крови женщин контрольной группы и пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. В ходе исследования у женщин контрольных групп получены данные о количестве GSH: в первой группе - 7,28 ± 0,08 мкмоль/гHb, во второй группе 7,37 0,05 мкмоль/гHb. 92 Таблица 3.15. Содержание восстановленного глутатиона и активность ферментов глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Восстановленный глутатион, мкмоль/гHb Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 7,28 0,08 5,86 0,07 p1< 0,05 4,38 0,06 7,37 0,05 p1< 0,05 5,58 0,19 p2< 0,05 5,88 0,07 p2< 0,05 Глутатионпероксидаза, мкмоль/г Hb 2,88 ±0,03 4,45 0,04 6,13 0,10 2,16 0,06 2,09 0,06 5,45 0,34 p2< 0,05 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 Глутатионредуктаза, мкмоль/г Hb 8,05 0,13 11,61 0,07 p1< 0,05 p1< 0,05 12,7 0,07 12,4 0,07 10,95 0,28 9,69 0,11 p2< 0,05 p2< 0,05 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 Исследование динамики изменений содержания GSH в крови пациенток с СД 2 типа по сравнению с контролем выявило снижение содержания данного 93 показателя у пациенток второго периода зрелости при суб- и декомпенсации СД 2 типа (1 и 2 подгруппы) на 19,57% и 39,86% (p<0,05) соответственно (табл. 3.15.). У пациенток старшей возрастной группы также отмечается снижение содержания GSH как при субкомпенсации (3 подгруппа), так и при декомпенсации (4 подгруппа) СД 2 типа (на 24,29% и на 20,22% соответственно, (p<0,05) по сравнению со значениями контрольной группы. При сравнении содержания GSH в пределах каждой возрастной группы пациенток в зависимости от степени компенсации углеводного обмена нами было отмечено, что при декомпенсации углеводного обмена у пациенток второго периода зрелости (2 подгруппа) происходит снижение этого показателя на 25,23% (p<0,05) по сравнению с субкомпенсацией СД 2 типа. У пациенток старшей возрастной группы при декомпенсации углеводного обмена происходит недостоверное увеличение содержания GSH на 5,54% (p>0,1). По данным литературы известно, что соотношение восстановленных и окисленных форм глутатиона является критерием неспецифической резистентности организма и может быть использовано в качестве показателя развития окислительного стресса (Абрамченко В.В., 2001). Резкое снижение концентрации GSH у пациенток всех исследуемых подгрупп отражает снижение защитной функции эритроцитарных мембран и, в сочетании с дефицитом активности гл-6-ФДГ (см. п. 3.1.) свидетельствует об усилении процессов СРО. В целом, это является неблагоприятным признаком, указывающим на возникающую угрозу гемолиза эритроцитов и отражающим степень тяжести патологического процесса (декомпенсацию углеводного обмена). У пациенток первой подгруппы достоверное снижение концентрации GSH на 19,57% (p<0,05) на фоне повышенного содержания гл-6-ФДГ (на 25,18%, p<0,05) по сравнению с контролем, может отражать включение адаптационных механизмов, направленных на сохранность целостности мембран эритроцитов. 94 30 % * GSH 20 гл-6-ФДГ 10 0 -10 *,** -20 * *,** * -30 *,** -40 -50 1 подгруппа *,** 2 подгруппа * 3 подгруппа 4 подгруппа Рис. 3.7 Изменение содержания GSH и активности гл-6-ФДГ в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль) Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p 1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05) При исследовании активности глутатионпероксидазы (ГПО) в первой контрольной группе женщин получены данные об активности ГПО - 2,09 0,06 мкмоль/гHb, во второй - 2,16 0,06 мкмоль/гHb (табл. 3.15). У пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа по сравнению с контрольной группой женщин нами был отмечен рост активности ГПО на 37,31%, (p<0,05) при субкомпенсации углеводного обмена (1 подгруппа), а при декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) отмечался ещѐ более значительный рост активности ГПО (на 112,56%, p<0,05). У пациенток пожилого возраста по сравнению с контрольной группой было зарегистрировано значительное увеличение активности этого фермента как при 95 субкомпенсации (3 подгруппа), так и при декомпенсации (4 подгруппа) углеводного обмена на 152,31% и 183,8% соответственно (p<0,05) (табл. 3.15.). При сравнении активности ГПО в пределах каждой возрастной группы в зависимости от степени компенсации углеводного обмена нами было обнаружено, что у пациенток второго периода зрелости в стадии декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) отмечается более выраженный подъѐм активности этого фермента - на 54,8%, p<0,05 по сравнению с субкомпенсированной формой СД 2 типа. В тоже время у пациенток пожилого возраста при декомпенсации (4 подгруппа) рост активности ГПО составил 12,42% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации, т.е. заметного роста активности этого фермента не наблюдается. Таким образом, повышенная активность ГПО по сравнению с контролем обнаружена нами во всех подгруппах пациенток. В тоже время, нами выявлены возрастные особенности активности этого фермента в зависимости от степени компенсации углеводного обмена, что характеризуется ростом глутатионпероксидазной активности активности у пациенток второго периода зрелости, начиная со стадии субкомпенсации (1 подгруппа). Максимальной активности ГПО достигает в стадии декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа) у пациенток пожилого возраста. Полученные нами данные о прогрессивном возрастании активности ГПО в эритроцитах могут отражать тяжесть заболевания. Снижение уровня глутатиона и антиоксидантных ферментов в крови является одним из ведущих факторов формирования окислительного стресса при СД 2 типа и может указывать на патологическое старение (Пескин А.В., 1997; Furling D. еt al., 2000; Crack P.J. еt al., 2003; Furling D. еt al., 2000). В то время как при физиологическом (естественном) старении клеток крови имеет место снижение эффективности функционирования глутатионовых ферментов, в частности ГПО (Кудряшов А.М., 2002). Поскольку глутатион принимает участие в реализации механизмов программируемой клеточной гибели (Кулинский В.И., 2007; Liu Н. еt al., 2004), то выявленные нами возраст- 96 зависимые изменения активности ГПО позволяют сделать вывод об усилении с возрастом окислительного стресса на фоне гипергликемии. В качестве показателя защитной эффективности антиоксидантных ферментов можно использовать соотношение активности Cu,Zn-СОД/ГПО, которое характеризует системную взаимосвязь в действии антиоксидантов и отражает изменение равновесия в ферментативной антиоксидантной защите (Меньщикова Е.Б. и др., 2006; Вашанов Г. А., Каверин Н. Н., 2009). По результатам исследования, в первой контрольной группе значение коэффициента Cu,Zn-СОД/ГПО составило 280,18 ± 8,72 усл.ед., во второй – 270,13 ± 7,17 усл. ед. (табл.3.16). Таблица 3.16. Коэффициент Cu,Zn-СОД /ГПО у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации, M±m Коэффициент Cu,Zn-СОД /ГПО, усл.ед. Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 подгруппа 2 подгруппа группа 2 3 подгруппа 4 подгруппа n=25 n=22 n=22 n=25 n=21 n=21 361,62±9,13 231,6±2,65 270,13 ± 213,46±17,2 113±2,44 p1< 0,05 p1< 0,05 7,17 p2< 0,05 p2< 0,05 280,18±8,72 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 У пациенток второго периода зрелости, по сравнению с контрольной группой, нами выявлено увеличение коэффициента Cu,Zn-СОД /ГПО в стадии субкомпенсации углеводного обмена (1 подгруппа) на 29,07% (p<0,05) на фоне снижения этого показателя на 17,34% (p<0,05) у пациенток при декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа). 97 По сравнению с контрольной группой, у пациенток пожилого возраста отмечается снижение коэффициента Cu,Zn-СОД/ГПО на 20,98% и 58,17% (p<0,05) соответственно в стадиях субкомпенсации (3 подгруппа) и декомпенсации (4 подгруппа) углеводного обмена (табл.3.16.). Таким образом, повышение коэффициента Cu,Zn-СОД/ГПО, по сравнению с контролем отмечается только у пациенток более молодого возраста в стадии субкомпенсации (рис. 3.8.). 250 % Cu,Zn-СОД 200 *,** ГПО *,** 150 *,** 100 50 * Cu,Zn-СОД/ГПО *,** *.** * * *,** 0 *,** -50 *,** *,** -100 1 подгруппа 2 подгруппа 3 подгруппа 4 подгруппа Рис. 3.8. Изменение активности ферментов Cu,Zn-СОД и ГПО, коэффициента Cu,Zn-СОД/ГПО у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль) Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p 1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05) 98 При анализе коэффициента Cu,Zn-СОД/ГПО в пределах каждой возрастной группы пациенток с СД 2 типа нужно отметить, что у пациенток обеих возрастных групп в стадиях декомпенсации углеводного обмена происходит снижение коэффициента Cu,Zn-СОД/ГПО по сравнению со стадиями субкомпенсации. В частности, у пациенток второго периода зрелости в стадии декомпенсации (2 подгруппа) отмечается снижение данного коэффициента на 35,95% (p<0,05), у пожилых пациенток (4 подгруппа) - на 47,06% (p<0,05). Таким образом, динамика коэффициента Cu,Zn-СОД /ГПО у пациенток второго периода зрелости с СД 2 в стадии субкомпенсации углеводного обмена свидетельствует о том, что равновесие в антиоксидантной защите сдвинуто в сторону активности Cu,Zn-СОД. Что же касается всех остальных подгрупп пациенток (2,3,4 подгруппы), то возраст-зависимое постепенное снижение коэффициента Cu,Zn-СОД/ГПО свидетельствует о сдвиге этого равновесия в сторону ферментов глутатионового звена. В таблице 3.15. содержатся данные об активности ГР у женщин контрольной группы и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы данный показатель составил 12,7 0,07 мкмоль/г Hb, у женщин второй группы – 12,4 0,07 мкмоль/г Hb. При определении активности ГР у пациенток второго периода зрелости при субкомпенсации (1 подгруппа) и декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) нами было отмечено снижение активности этого фермента на 36,66% и на 8,55% (p<0,05) соответственно по сравнению с контрольными показателями. У пожилых пациенток наблюдается также снижение активности ГР при суби декомпенсации углеводного обмена (3 и 4 подгруппы) на 11,7% и на 21,85% (p<0,05) соответственно относительно контроля (рис.3.9.). При сравнении этого показателя в пределах каждой возрастной группы у пациенток с СД 2 типа при суб- и декомпенсации углеводного обмена следует отметить, что у пациенток второго периода зрелости при декомпенсации СД 2 99 типа (2 подгруппа) активность ГР выше на 44,37% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации СД 2 типа (1 подгруппа). У пожилых пациенток, в противоположность этому, с увеличением степени компенсации углеводного обмена отмечается снижение активности ГР. Так, при декомпенсированной форме диабета (4 подгруппа) активность ГР снижена на 11,48% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации углеводного обмена (3 подгруппа) (табл. 3.15.). 0 -5 % -10 *,** * -15 -20 * *,** -25 *,** * -30 GSH -35 -40 ГР * *,** -45 1 подгруппа 2 подгруппа 3 подгруппа 4 подгруппа Рис. 3.9. Изменение содержания GSH и активности ГР в крови пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль) Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05) 100 Таким образом, полученные нами результаты подтверждают предположения о том, что снижение содержания GSH у пациенток обеих возрастных групп в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена, может быть вызвано двумя причинами. Либо переходом GSH в окисленную форму (из-за повышенной активации ГПО и отставанием в работе глутатионредуктазы, обеспечивающей восстановление глутатиона), либо может свидетельствовать об образовании смешанных дисульфидов гемоглобина и глутатиона (Олемпиева, Е.В., 2004; Kumar, A. et al. 1995; Jadhav, G. еt al. 1998). Наблюдаемые нами возрастные изменения активности ГР у пациенток с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена, могут быть связаны с наличием восстановленного НАДФ, который генерируется в окислительной ветви глюкозомонофосфатного шунта во 2 и 4 реакциях: Mg2+ / Ca2+ Глюкозо-6-фосфат+НАДФ+ → глюконолактон-6-фосфат + НАДФН+Н+. При этом, эту реакцию катализирует глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа (гл-6ФДГ). 6-фосфоглюконат + НАДФ+ → СО2 + НАДФН+Н+ + рибулезо-5-фосфат (фермент - 6-фосфоглюконат-дегидрогеназа). В разделе 3.1.9. нами уже было описано измиенение активности гл-6-ФДГ у пациенток всех исследуемых подгрупп. У пациенток второго периода зрелости с заболеванием в стадии субкомпенсации (1 подгруппа) наблюдается повышение активности гл-6-ФДГ 25,18% (p<0,05) по сравнению с контролем, в то время как у остальных пациенток (2,3 и 4 подгруппы) наблюдалось снижение активности этого фермента (см. таб. 3.9). На рис. 3.10. изображено изменение активности гл6-ФДГ и ГР по сравнению с контрольными значениями. 101 30 % * ГР 20 гл-6-ФДГ 10 0 -10 *,** -20 *,** * *,** -30 *,** -40 -50 * * 1 подгруппа 2 подгруппа 3 подгруппа 4 подгруппа Рис. 3.10. Изменение активности ферментов ГР, гл-6-ФДГ в крови пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль) Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05) Таким образом, у пациенток с СД 2 типа нами выявлены возрастные особенности в активности гл-6-ФДГ в зависимости от степени тяжести заболевания, связанные с изменениями значений таких параметров как GSH и ГР. В частности, у пациенток второго периода зрелости при субкомпенсации СД 2 типа (2 подгруппа) повышение активности гл-6-ФДГ на фоне снижения активности ГР и снижения содержания GSH свидетельствует, вероятно, об использовании НАДФ+ в синтезе пентоз (рибулозо-5-фосфат) для нуклеотидов, что может говорить о депрессии участков генома, вызванной избыточным накоплением в клетках супероксидного анион-радикала или перекисью водорода (Чеснокова Н.П., и соавт, 2006) или может быть расценено как компенсаторно- 102 приспособительный механизм компенсации гипергликемии условиях начинающейся гипоксии. В свою очередь, снижение активности гл-6-ФДГ у пациенток 2, 3 и 4 подгрупп сопровождается уменьшением выхода НАДФН+, снижением активности ГР, уменьшением уровня GSH, что в итоге приводит к уменьшению активности гликолиза и уменьшению «выхода» энергии АТФ, которая необходима для функционирования «К+ - Na+ насоса» в эритроците. В результате недостатка энергии в виде АТФ происходит утрата клеткой ионов калия, в эритроциты проникает натрий и вода, развивается потеря ионного равновесия, происходит гемолиз эритроцитов, развивается гипоксия (Клиорин А.И. и соавт., 1974), ускоряется старение эритроцитов. 103 3.4. Оценка стабильности мембран эритроцитов, уровня вторичных продуктов ПОЛ у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена 3.4.1. Содержание ВЭГ Нарушение согласованной работы ферментов АОЗ организма приводит к усилению свободнорадикальных процессов, являющихся регуляторным механизмом состояния клеточных мембран и участвующих в поддержании гомеостаза клетки (Крыжановский Г.Н., 2002). Как известно, внеэритроцитарный гемоглобин (ВЭГ) является показателем дестабилизации мембран эритроцитов (Шперлинг И. и соавт., 2006), а поступление больших количеств ВЭГ в плазму поддерживает каскад перекисного окисления липидов (ПОЛ) (Внуков В.В., Милютина Н.П. и соавт., 1995). В таблице 3.17. содержатся результаты исследования содержания ВЭГ в плазме крови женщин контрольной группы и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена. У женщин первой контрольной группы нами обнаружено содержание ВЭГ в плазме крови равное 29,45 ± 0,14ммоль/л, у женщин второй контрольной группы - 29,08± 0,17 ммоль/л. 104 Таблица 3.17. Содержание внеэритроцитарного гемоглобина в плазме пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена, M±m Внеэритроцитарный гемоглобин, мМоль/л Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 34,72±0,19 49,32 ± 0,13 p2< 0,05 p2< 0,05 29,45± 0,14 37,41 ±0,14 46,12 ±0,12 p1< 0,05 p1< 0,05 29,08± 0,17 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1; p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2. Содержание ВЭГ в плазме у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации (1 подгруппа) и декомпенсации (2 подгруппа) увеличивается соответственно на 27,05% и 56,61% (p<0,05) по сравнению с показателями контрольной группы. Что касается пожилых пациенток с СД 2 типа, то у них также отмечается повышение содержания ВЭГ при суб- и декомпенсации углеводного обмена (3 и 4 подгруппы) на 19,4% и 69,6% (p<0,05) соответственно по сравнению с показателями контроля. При сравнении содержания ВЭГ у пациенток с СД 2 типа в пределах каждой возрастной группы в зависимости от степени компенсации углеводного обмена выявлены следующие закономерности. У пациенток первой возрастной группы при стадии декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) отмечается повышение содержания ВЭГ на 23,26% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации (1 подгруппа). У пожилых пациенток отмечается значительное повышение содержания ВЭГ - на 105 42,03 % (p<0,05) в стадии декомпенсации заболевания (4 подгруппа) по сравнению со стадией субкомпенсации (3 подгруппа). Необходимо обратить внимание на прогрессивный рост уровня ВЭГ по мере снижения компенсаторных возможностей компенсации нарушений с увеличением возраста пациенток и степени тяжести заболевания. Можно полагать, что резкое увеличение содержания ВЭГ в плазме крови у пожилых пациенток с СД 2 типа в стадии декомпенсации заболевания обусловлено тем, что в условиях гипергликемии и возраста пациенток глюкоза способна взаимодействовать не только с гемоглобином, но и с белками эритроцитарной мембраны (Бондарь Т.П., Козинец Т.И., 2003). Неферментативное гликирование белков клеточных мембран – один из путей реализации глюкозотоксичности – приводит к их необратимой структурнофункциональной модификации, кислородтранспортную функцию снижает крови. их устойчивость Таким образом, и нарушает степень роста содержания ВЭГ отражает выраженность деструктивных процессов и может иметь диагностическое значение для оценки степени декомпенсации при СД 2 типа. 3.4.2. Содержание малонового диальдегида Для углубления сведений о механизмах развития СРО у пациенток с СД 2 типа в зависимости от возраста и степени компенсации углеводного обмена мы исследовали содержание ТБК-реактивного продукта – малонового диальдегида (МДА) в плазме крови. В таблице 3.18. представлены результаты о содержании МДА в плазме крови у женщин контрольной группы, а также у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации. В первой контрольной группе женщин содержание МДА составило в среднем 14,02 ± 0,04 нмоль/мг Hb, а во второй группе - 14,2 ± 0,06 нмоль/мг Hb. 106 Таблица 3.18. Содержание малонового диальдегида в плазме у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях субкомпенсации и декомпенсации, M±m Малоновый диальдегид, нмоль/мг Hb Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 16,88±0,13 28,55±0,10 p1< 0,05 p1< 0,05 14,02 ± 0,04 14,2 ± 0,06 17,85 ±0,19 58,14±0,18 p2< 0,05 p2< 0,05 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 В сравнении с контрольной группой, у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа при стадии субкомпенсации заболевания (1 подгруппа) отмечался рост содержания МДА на 20,39% (p<0,05). При декомпенсации углеводного обмена у пациенток этой же возрастной группы (2 подгруппа) был отмечен рост содержания МДА на 103,6% (p<0,05). Также, у пожилых пациенток с СД 2 типа по сравнению с показателями в группе контроля наблюдался рост содержания МДА на 25,7% (p<0,05) при стадии субкомпенсации заболевания (3 подгруппа). При стадии декомпенсации заболевания (4 подгруппа) у пациенток этого же возраста отмечалось повышение содержания МДА на 309,4% (p<0,05) по сравнению с контрольными значениями (рис. 3.11.). 107 350 *,** % 300 ВЭГ 250 МДА 200 150 *,** 100 *,** *,** 50 * * * * 0 1 подгруппа 2 подгруппа 3 подгруппа 4 подгруппа Рис. 3.11. Изменение содержания ВЭГ и МДА в плазме пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль). Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05). При сравнении этого показателя у пациенток с СД 2 типа в пределах каждой возрастной группы в зависимости от степени компенсации углеводного обмена выявлены следующие закономерности. У пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа при декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) происходит увеличение содержания МДА на 69,11% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации заболевания (1 подгруппа) (табл. 3.18.). У пожилых пациенток с СД 2 типа в стадии декомпенсации заболевания (4 подгруппа) также происходит существенный рост содержания МДА - на 225,81% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации углеводного обмена (3подгруппа). Полученные данные указывают на усиление процессов свободнорадикального окисления липидов в плазме крови у пациенток с СД 2 108 типа в зависимости от возраста (пожилые пациентки) и степени тяжести заболевания (декомпенсация). Таким образом, в результате исследования активности ферментов АОЗ, а также содержания ВЭГ и МДА крови пациенток с СД 2 типа, выявлена более выраженная активация ПОЛ у пожилых пациенток с диабетом в стадии декомпенсации углеводного обмена. 3.4.3. Оценка степени деструкции компонентов мембран эритроцитов (ФРПМ) Для оценки эритроцитов нами степени был деструкции расчитан компонентов фактор риска клеточных мембран пероксидации мембран эритроцитов (ФРПМ) – отношение содержания малонового диальдегида (нмоль/мг Hb) к содержанию восстановленного глутатиона (мкмоль/г Hb). В таблице 3.19. представлены значения данного фактора у женщин контрольной группы и у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации. В первой контрольной группе женщин этот показатель составил 1,93 ± 0,079 усл.ед., а во второй 1,95 ± 0,014 усл. ед. Рассчитав данный показатель у пациенток с СД 2 типа разных возрастных групп, мы обнаружили рост этого коэффициента с учѐтом возраста и стадии заболевания (табл. 3.19.). В частности, у пациенток второго периода зрелости при стадии субкомпенсации диабета (1 подгруппа) обнаружено повышение ФРПМ на 48,2% (p<0,05) по сравнению с контрольными показателями. У пациенток этого же возраста с СД 2 типа в стадии декомпенсации углеводного обмена (2-я подгруппа) обнаружен рост этого показателя на 236,3% (p<0,05) по сравнению с контролем. 109 Таблица 3.19. Фактор риска пероксидации мембран эритроцитов у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации, M±m Фактор риска пероксидации мембран, усл.ед. Контрольная 1 возрастная группа Контрольная 2 возрастная группа группа 1 1 2 группа 2 3 4 n=25 подгруппа подгруппа n=25 подгруппа подгруппа n=22 n=22 n=21 n=21 2,86 ± 0,06 6,49 ± 1,47 3,17 ± 0,97 9,87 ± 1,75 p1< 0,05 p1< 0,05 p2< 0,05 p2< 0,05 1,93 ± 0,079 1,95 ± 0,014 Примечание: p1 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 1 p2 - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой 2 У пожилых пациенток наблюдается увеличение этого показателя. При стадии субкомпенсации (3 подгруппа) и декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа) по сравнению со значением в контрольной группе происходит рост ФРПМ на 62,56% и 406,1% (p<0,05) (рис. 3.12.). При сравнении этого показателя у пациенток с СД 2 типа в пределах каждой возрастной группы в зависимости от степени компенсации углеводного обмена обнаружены следующие закономерности. У пациенток второго периода зрелости в стадии декомпенсации СД 2 типа (2 подгруппа) происходит рост этого показателя на 126,9% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации заболевания (1 подгруппа). 110 450 % *,** 400 350 *,** 300 МДА GSH ФРПМ *,** 250 200 150 *,** 100 50 * * * * 0 -50 -100 * 1 подгруппа *,** 2 подгруппа *,** * 3 подгруппа 4 подгруппа Рис. 3.12. Изменение содержания МДА, GSH и значения ФРПМ эритроцитов пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации (в % относительно контрольных значений, контроль принят за ноль) Примечание: * - достоверность различий показателей по сравнению с контрольной группой (p 1<0,05); ** - достоверность различий показателей в пределах каждой возрастной группы между стадиями суб- и декомпенсации диабета (p<0,05) У пожилых пациенток аналогичная картина. Наблюдается рост значений ФРПМ при декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа) на 211,3% (p<0,05) по сравнению со стадией субкомпенсации (3-я подгруппа). Необходимо указать, что в обеих возрастных группах пациенток при декомпенсированной форме СД 2 типа имеет место статистически достоверное увеличение ФРПМ относительно стадий субкомпенсации. Таким образом, ещѐ один информативный показатель указывает на то, что у пожилых пациенток, особенно в стадии декомпенсации СД 2 типа, происходит более выраженное усиление процессов свободнорадикального окисления на фоне дезинтеграции ферментов АОЗ, что снижает устойчивость эритроцитов к внутренним повреждающим факторам, нарушает работу кислородтранспортной функции крови, усиливает тканевую гипоксию и замыкает «порочный» круг (рис. 3.13.). Состояние антиоксидантной системы и мембран эритроцитов у пациенток разных возрастных групп с СД 2 типа в стадиях суб- и декомпенсации ЭРИТРОЦИТ Пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации Рост активности Cu,Zn-СОД*** Рост активности КАТ* Снижение содержания GSH*** Рост активности ГПО* Рост значения СОД/ГПО Снижение активности ГР* Рост активности гл-6-ФДГ Рост содержания ВЭГ** Рост содержания МДА* Пациентки второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии декомпенсации Рост активности Cu,Zn-СОД** Рост активности КАТ** Снижение содержания GSH* Рост активности ГПО** Снижение значения СОД/ГПО* Снижение активности ГР**** Снижение активности гл-6-ФДГ* Рост содержания ВЭГ*** Рост содержания МДА*** Активация продукции АФК, рост активности гл-6-ФДГ компенсаторно-приспособительный механизм компенсации гипергликемии. Снижение содержания GSH – угроза гемолиза эритроцитов. Пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии субкомпенсации Рост активности Cu,Zn-СОД**** Рост активности КАТ**** Снижение содержания GSH** Рост активности ГПО*** Снижение значения СОД/ГПО** Снижение активности ГР*** Снижение активности гл-6-ФДГ*** Рост содержания ВЭГ* Рост содержания МДА** Пациентки пожилого возраста с СД 2 типа в стадии декомпенсации Рост активности Cu,Zn-СОД* Рост активности КАТ*** Снижение содержания GSH**** Рост активности ГПО**** Снижение значения СОД/ГПО*** Снижение активности ГР** Снижение активности гл-6-ФДГ** Рост содержания ВЭГ**** Рост содержания МДА**** Избыточная продукция О2∙- и Н2О2 с образованием гидроксильного радикала (OH∙) Активация 1 линии АОЗ; активация ферментов глутатионого звена; усиление проницаемости мембран эритроцитов. Снижение содержания GSH, снижение активности гл-6-ФДГ → угроза гемолиза эритроцитов возрастает. Напряжение механизмов антиокислительной защиты к предотвращениию образования супероксидного анион-радикала и пероксида водорода на фоне гипергликемии, усиление проницаемости мембран, что свидетельствует об усилении с возрастом окислительного стресса. Рис.3.13. Примечание: знак «*» отражает тенденцию изменений указанных параметров. 3.5. Статистический анализ связей между изучаемыми параметрами у пациенток второго периода зрелости и пожилого возраста с сахарным диабетом 2 типа в стадии субкомпенсации и декомпенсации углеводного обмена С целью выявления статистических связей между исследуемыми параметрами нами был проведѐн корреляционный анализ с определением коэффициента корреляции Пирсона (r). Для нас представляло интерес получить ответ на следующие вопросы: коррелируют ли изменения показателей, отражающих состояние антиоксидантной углеводно-энергетического, систем? Изменения каких газотранспортной параметров и обнаруживают наибольшее число сильных корреляций с изменениями других? Будут ли зависеть закономерности, установленные при ответе на перечисленные вопросы, от тяжести течения СД 2 типа (суб- и декомпенсация) и возраста пациенток? Для ответа на сформулированные вопросы корреляционному анализу были подвергнуты все результаты исследования. Идея подобного подхода сводится к следующему: если изменения какоголибо критерия (маркера) углеводно-энергетического обмена, газотранспортной системы или АОС, обнаруживают большое число сильных корреляций с изменениями других показателей, то определение этого показателя позволяет косвенно судить и о состоянии других, с которыми данный показатель коррелирует. Именно такие маркеры будут наиболее полно отражать степень тяжести течения СД 2 типа в зависимости от возраста пациенток и стадии компенсации углеводного обмена. На рисунках 3.14 – 3.17 приведены статистически достоверные корреляционные связи между показателями углеводно-энергетического обмена, газо-транспортной и антиоксидантной систем, содержания ВЭГ и МДА у пациенток обеих возрастных групп. У пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации на фоне гипергликемии наблюдается процессы, направленные на 113 преодоление сложившейся гипоксии, о чѐм свидетельствует наличие заметных положительных корреляционных связей между ростом содержания глюкозы и HbA1C (r = 0,59, p<0,05), ростом содержания HbA1C и HbА (r = 0,6, p<0,05) (рис.3.14). О снижении развивающейся гликолитических гипоксии процессов свидетельствует в эритроцитах заметная на фоне отрицательная корреляционная связь между ростом уровня HbА и снижением содержания ПВК у этих пациенток ( r= -0,52, p<0,05), а снижение уровня ПВК коррелирует со снижением активности гексокиназы (r = 0,44, p<0,05). Снижение активности ФГИ в эритроцитах этих пациенток, свидетельствующее о снижении скорости гликолизав данной группе пациенток, коррелирует с повышением содержания 2,3-ДФГ в виде отрицательной заметной корреляционной связи (r = -0,61, p<0,05), при этом, активация модельного гликогенолиза и снижение скорости гликолиза связаны в виде прямой умеренной корреляционной связью между активностями фосфорилазы и ФГИ (r = 0,45, p<0,05). О включении в работу компенсаторных механизмов, направленных на преодоление гипоксии, вызванной гипергликемией, свидетельствует активация работы ферментов АОС, в частности у этих пациенток рост содержания 2,3-ДФГ сопровождается ростом активности Cu,Zn-СОД, что отражается в виде умеренной положительной корреляционной связи между этими показателями (r = 0,49, p<0,05). В свою очередь, между ростом активности Cu,Zn-СОД и снижением активности ГР наблюдается умеренная отрицательная корреляционная связь (r= 0,47, p<0,05), а снижение активности ГР связано со снижением содержания GSH в виде положительной умеренной корреляционно связи (r = -0,46, p<0,05). Снижение активности ГР в эритроцитах крови этих пациенток, свидетельствующее о накоплении в клетках супероксидного анион-радикала и о снижении скорости гликолиза, связано с ростом содержания МДА в сыворотке крови в виде кмеренной отрицательной умеренной корреляционной связи 114 (r = -0,44, p<0,05). Рост содержания МДА коррелирует с активацией модельного гликогенолиза, т.е. отмечена положительная умеренная корреляционная связь ( r= 0,5, p<0,05) между ростом МДА и ростом активности фосфорилазы. ↓GSH 0,46 -0,44 ↑МДА ↓ГР 0,5 0,49 -0,47 ↑Cu,ZnСОД -0,61 ↑2,3ДФГ ↓ФГИ 0,45 ↑Фосфорилаза 0,59 ↑Глюкоза 0,6 ↑HbA1C ↑HbА -0,52 0,44 ↓ПВК ↓Гексокиназа Рис. 3.14. Схема корреляционных связей показателей углеводно-энергетического обмена, газотранспортной и антиоксидантной систем, а также содержания ВЭГ и МДА в крови пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации углеводного обмена (1 подгруппа) Примечание: знак «↓» и «↑» - снижение и рост значений показателя (p<0,05) Таким образом, у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации обнаружены статистические связи между отдельными параметрами газотранспортной системы и углеводно-энергетического обмена; углеводно-энергетического и антиоксидантной системы; углеводно- энергетического обмена и параметрами, отражающие интенсивность процессов ПОЛ и АОС. Корреляционные связи максимальной силы обнаружены между такими параметрами как рост 2,3-ДФГ и снижение активности ФГИ, рост содержания глюкозы и HbA1C, рост содержания HbA1C и HbА (рис. 3.14). На рисунке 3.15 изображена схема корреляционных связей изучаемых параметров метаболических изменений в крови пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии декомпенсации (2 подгруппа). У этих пациенток рост глюкозы в крови сопровождается снижением активности ГР (r = -0,47, p<0,05), о чѐм свидетельствует обратная умеренная корреляционная связь. В то же время, снижение активности ГР связано отрицательной умеренной корреляционной связью с повышением активности ГПО (r = -0,45, p<0,05). При этом, отчѐтливо прослеживается связь параметров углеводного обмена и АОС, отражающая роль ферментативной АОС в поддержании оптимального уровня организма. В частности, рост активности ГПО связан с ростом активности КАТ в виде положительной заметной корреляционной связи (r = 05, p<0,05), рост активности КАТ связан с ростом активности Cu,Zn-СОД положительной заметной корреляционной связью (r = 0,64, p<0,05). Так же, рост активности ГПО коррелирует с увеличением содержания ВЭГ в плазме крови (r = 0,43, p<0,05). О связи деструктивных процессов мембран эритроцитов и преобладании анаэробного гликолиза свидетельствует наличие отрицательной корреляционной связи между ростом ВЭГ и снижением активности ПВК (r=-0,42, p<0,05) (рис.3.15). Таким образом, наличие сильной корреляционной связи между отдельными ферментами 1 и 2 линий защиты у пациенток этого возраста с СД 2 типа в стадии 117 декомпенсации заболевания, а также умеренных корреляционных связей между отдельными параметрами АОС и ВЭГ отражает адаптационных механизмов организма на фоне СД 2 типа. активацию мощных -0,42 ↓ПВК 0,5 0,43 ↑ВЭГ ↑ГПО ↑КАТ -0,45 0,64 -0,47 ↑Глюкоза ↓ГР ↑Cu,Zn-СОД Рис. 3.15. Схема корреляционных связей показателей углеводно-энергетического обмена, газотранспортной и антиоксидантной систем, а также содержания ВЭГ и МДА в крови пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) Примечание: знак «↓» и «↑» - снижение и рост значений показателя (p<0,05) У пациенток пожилого возраста с СД 2 типа в стадии субкомпенсации состояние гипергликемии сопровождается снижения одного из регуляторных ферментов углеводного обмена гл-6-ФДГ, что выражается в виде отрицательной умеренной корреляционной связи (r = -0,44, p<0,05) и свидетельствует о снижении ведущей роли пентозофосфатного пути обмена глюкозы (рис.3. 16). Наблюдаемый у этих пациенток рост содержания 2,3-ДФГ связан со снижением содержания корреляционной связью GSH в (r -0,51, = эритроцитах отрицательной И p<0,05). заметной вновь, ферментативная антиоксидантная система защиты крови «реагирует» на развитие гипоксии и выступает в роли «защитника» клеток крови от возможного гемолиза, что проявляется в виде ряда корреляционных связей: между снижением содержания в эритроцитах GSH и ростом активности КАТ ( r =-0,46, p<0,05), рост КАТ связан с ростом активности Cu,Zn-СОД (r = 0,57, p<0,05). В свою очередь, представленные данные о снижении включения глюкозы в окислительные процессы, выражающиеся в снижении активности ФГИ коррелируют с ростом активности Cu,Zn-СОД ( r= -0,47, p<0,05). У пациенток этой подгруппы роста содержания С-пептида в крови и фосфорилазы (r = 0,45, p<0,05), свидетельствует об усилении процессов распада гликогена. О связи деструктивных процессов мембран эритроцитов, усиления интенсивности процессов ПОЛ и как адаптационный механизм в ответ на это – рост числа эритроцитов - свидетельствует заметная положительная корреляционная связь между ростом содержания ВЭГ и ростом уровня МДА в крови этих пациенток (r = 0,57, p<0,05), умеренная связь между ростом МДА и количеством эритроцитов (r = 0,44, p<0,05), заметная связь между ростом содержания ВЭГ и количеством эритроцитов (r = 0,57, p<0,05) (рис.3. 16). -0,44 ↓Гл-6-ФДГ ↑Глюкоза 0,57 ↑Cu,Zn-СОД 0,45 ↑С пептид -0,46 ↑Фосфорилаз а -0,51 ↑КАТ ↓GSH ↑2,3-ДФГ -0,47 ↓ФГИ ↑МДА 0,44 0,57 0,57 ↑ВЭГ ↑Эритроциты Рис. 3.16. Схема корреляционных связей показателей углеводно-энергетического обмена, газотранспортной и антиоксидантной систем, а также содержания ВЭГ и МДА в крови пожилых пациенток с СД 2 типа в стадии субкомпенсации углеводного обмена (3 подгруппа) Примечание: знак «↓» и «↑» - снижение и рост значений показателя (p<0,05) У пациенток пожилого возраста с СД 2 типа в стадии декомпенсации заболевания гипергликемия (рост глюкозы в крови) сопровождается ростом содержания HbA1C, что находит своѐ отражение в виде положительной умеренной корреляционной связи (r = 0,46, p<0,05). HbA1C, в свою очередь, находится в положительной корреляционной зависимости с ростом С-пептида (r = 0,47, p<0,05). Рост HbA1C у этих пациенток сопровождается ростом уровня МДА в крови и снижением содержания GSH и находится с ними в корреляционных отношениях (рис. 3.17). Значительный рост активности фосфорилазы происходит на фоне снижения гл-6-ФДГ и свидетельствует об активации гликогенолиза у этой категории больных и эти параметры находятся в корреляционной зависимости между собой (r = 0,47, p<0,05) (рис.3. 17). Интенсификация анаэробного гликолиза (рост лактата и 2,3-ДФГ) сопровождается ростом активности антиоксидантных ферментов Cu,Zn-СОД и КАТ, что выражается в виде положительных корреляционных связей между этими показателями: лактат – 2,3-ДФГ (r = 0,46, p<0,05), лактат - Cu,Zn-СОД (r = 0,49, p<0,05), лактат – КАТ (r = 0,44, p<0,05) (рис. 3.17). Отрицательная заметная корреляционная связь между ростом активности КАТ и снижением активности ГР (r = -0,66, p<0,05), положительная корреляционная связь между ростом активности КАТ и ростом содержания ВЭГ в крови (r = 0,47, p<0,05) свидетельствуют о превалировании роли ферментов 1 линии защиты в развитии компенсаторно-адаптационных процессов у этих пациенток в ответ на деструктивные изменения мембран эритроцитов и «возможный» их гемолиз. Выявление такого рода корреляционных связей свидетельствует об активации патологических процессов с увеличением возраста пациенток и степени тяжести основного заболевания. ↑Cu,Zn-СОД ↓ГР -0,66 0,49 ↑Глюкоза 0,44 ↑Лактат ↑С пептид 0,46 ↑КАТ 0,46 0,47 0,45 ↓ФГИ ↑2,3-ДФГ ↑HbA1C 0,47 ↑МДА -0,49 ↑ВЭГ -0,44 -0,46 ↑Фосфорилаза 0,46 ↓GSH ↓Гл-6-ФДГ Рис. 3.17. Схема корреляционных связей показателей углеводно-энергетического обмена, газо-транспортной и антиоксидантной систем, а также содержания ВЭГ и МДА в крови пожилых пациенток с СД 2 типа в стадии декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа) Примечание: знак «↓» и «↑» - снижение и рост значений показателя (p<0,05) ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Красные клетки крови в полной мере отражают происходящие в организме биохимические и гемодинамические высокоспециализированными образованиями, потому сдвиги, что являясь вовлекаются в обменные процессы не только при гематологических заболеваниях, но и при острых и хронических заболеваниях разного генеза (Гаврилов О.К. и соавт., 1985; Павлюченко И.И., 2005; Bacus, 1981; Tasta et al., 1982). Многофункциональная роль эритроцитов в газотранспортных процессах и в осуществлении других жизненно важных функций объясняет высокую информативность результатов изучения функциональных изменений в этих клетках (Микашинович З.И. и др., 2004; Микашинович З.И., Черногубова Е.А., 2007; Саркисян О.Г., 2010; Сторожук А.П., 1993). Эритроциты, входящие в систему кислородного транспорта и определяющие еѐ состояние, являются наиболее доступным объектом для изучения метаболических процессов в норме и в условиях формирующихся патологических процессов и выбор их в качестве объекта исследования диктуется тем, что им присущи общие принципы организации плазматических мембран (Мельников А.П., 1989). Поэтому изменения в эритроцитах с определѐнной долей коррекции могут быть экстраполированы на иные клетки организма (Камышников В.С., 2000; Рязанцева Н.В., 2004). Изменение состава крови, а также сдвиги метаболических процессов в клетках крови отражают особенности индивидуальной реактивности, а комплексное изучение этих изменений может дать адекватное представление об уровне адаптивных реакций как самого эритрона, так и системы в целом (Микашинович З.И., 1989; Сарычева Т.Г, Козинец Г.И., 2001; Rapoport J. et al., 1977). В этом аспекте представляется актуальным изучение функционального состояния эритроцитарной системы практически здоровых лиц в сопоставлении с больными СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации углеводного обмена. 124 При обсуждении полученных нами результатов мы сосредоточили внимание на следующих аспектах работы: - в зависимости от возраста пациенток и степени компенсации углеводного обмена определить в метаболизме углеводов соотношение гликолиза или пентозофосфатного пути, роль субстратов для поддержания энергетического потенциала эритроцитов; - найти маркеры кислородного голодания и адаптационных механизмов, направленных на преодоление гипоксии у пациенток с СД 2 типа при разных уровнях компенсации сахарного диабета в зависимости от их возраста; - определить роль антиоксидантной системы и показателей стабильности мембран эритроцитов в зависимости от возраста пациенток и степени компенсации углеводного обмена; - выявить статистические связи между исследуемыми параметрами для определения патогенетических механизмов метаболических изменений в крови пациенток на фоне СД 2 типа в зависимости от их возраста и стадии компенсации углеводного обмена; - отоборать информативные параметры и разработать способ лабораторной диагностики уровня компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа. В ходе проведения исследования был установлен уровень гипергликемии в крови у пациенток обеих возрастных групп, соответствующий стадиям компенсации углеводного обмена (суб- и декомпенсации), однако, у пациенток второго периода зрелости при декомпенсации заболевания (2 подгруппа) уровень глюкозы в крови достигает максимально достоверного повышения по сравнению с контролем значений. На фоне гипергликемии у пациенток обеих возрастных групп зарегистрировано достоверное повышение содержания HbA1C по сравнению с контролем. В результате нарушения рецепторной чувствительности клеток к инсулину при СД 2 типа глюкоза не усваивается, что приводит к неферментативному гликозилированию белков крови, в частности гемоглобина 125 эритроцитов и в крови увеличивается концентрация гликозилированного гемоглобина (НbA1C) (Calisti L., Tognetti S., 2005). Этот неферменативный процесс протекает медленно, в течение всей жизни эритроцита (120 дней) и его скорость пропорциональна уровню гликемии (Gonen B.A., Rubinstein A.H., Rochman H. et al., 1977; Николаев А.Я., 2004). Гликозилирование осуществляется через стадию образования альдимина, который путем преобразования продуктов Амадори превращается в необратимое соединение кетоамин. Стабильная форма этого соединения, окисляясь превращается в реактивные дикарбониловые интермедиаты – 3-деоксиклюкозон и метилглиоксаль, которые гликозилирования (КПГ), метаболизируются которые в комплексируются конечные со продукты специфическими рецепторами, являющимися индукторами экспрессии генов, ответственных за синтез многочисленных транскрипционных факторов, способных связываться с ДНК в виде гомо- и гетеродимеров. Внеклеточное накопление КПГ изменяет структуру и функциональные свойства как матрикса, так и матрикс-клеточных взаимодействий. В этой связи можно полагать, что КПГ оказывают влияние на скорость метаболизма и продолжительность жизни пациенток с СД 2 типа. Максимальное содержание HbA1C у пожилых пациенток при декомпенсации заболевания (4 подгруппа) свидетельствует о превалирующей роли возраста пациенток и стадии компенсации нарушенного углеводного обмена и что, в свою очередь, является адекватным росту уровня глюкозы в крови. Заметим, что повышенный уровень HbA1C в крови и гипергликемия у пациенток 4 подгруппы связаны в виде положительной умеренной корреляционной связи (r = 0,46, p=0,037). На фоне роста уровня HbA1C, по сравнению с контролем, у всех пациенток обеих возрастных групп отмечается рост уровня гемоглобина и эритроцитов. Причѐм у пациенток второго периода зрелости при стадии декомпенсации заболевания (2 подгруппа) уровень HbA достигает максимальных значений, но не выходит за рамки референсных величин и находится в прямой корреляционной зависимости от повышения уровня HbA1C (r = 0,5; p<0,05). У пациенток этого 126 возраста в стадии субкомпенсации углеводного обмена (1 подгруппа) обнаружена аналогичная корреляционная связь (r = 0,6; p<0,05). Обращает внимание, что рост количества эритроцитов находится в прямой зависимости от возраста пациенток и стадии компенсации, т.е. максимальных значений достигает у пожилых пациенток в стадии декомпенсации заболевания, по сравнению с контролем. Мы полагаем, что длительная гипергликемия способствует формированию компенсаторно-приспособительной реакции эритроидного ростка в виде стимуляции синтеза гемоглобина, что отражает выраженность гипоксии и, соответственно, степень тяжести течения данного заболевания. Данные изменения свидетельствуют, с одной стороны, о стимуляции количественного механизма адаптации к возможной гипоксии, максимально выраженные у пациенток пожилого возраста в стадии декомпенсации углеводного обмена, а с другой стороны, являются документальным свидетельством нарушения утилизации старых форм красных клеток крови и могут служить критерием развития сосудистых осложнений вследствие развития «сладж» феномена. Исследование уровня С-пептида является «золотым» стандартом в эндокринологии для оценки выработки инсулина, так как уровень С-пептида является более стабильным индикатором секреции инсулина, чем быстро меняющийся уровень самого инсулина (Claire E. Hills and Nigel J. Brunskill, 2008; Brandenburg D., 2008). В физиологических концентрациях стимулирует потребление глюкозы клетками мышц здорового человека и больных СД примерно в такой же мере, как инсулин. В нашем исследовании у пациенток обеих возрастных групп, по сравнению с контрольными значениями, наблюдается увеличение содержания С-пептида, но, наибольшей интенсивности этот показатель достигает у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации. По мере увеличения возраста пациенток и соответственно степени тяжести заболевания, увеличение уровня С-пептида выражено в меньшей степени, что, вероятно, вызвано 127 изменением темпа трансдукции инсулинового сигнала (Николаев А.Я., 2004). По сравнению с контролем, максимальное увеличение содержания С-пептида у пациенток более молодого возраста при дебюте заболевания (субкомпенсация) свидетельствует о сохранности чувствительности β-клеток поджелудочной железы к гипергликемии. Однако с возрастом отмечается истощение функциональных резервов инсулин-продуцирующих клеток, что документируется менее значимым ростом уровня С-пептида у пожилых пациенток с заболеванием в стадии суб- и декомпенсации. У пожилых пациенток с СД 2 типа в стадии декомпенсации выявлена положительная умеренная корреляционная связь между ростом уровня С-пептида и ростом содержания HbA1C (r = 0,47, p<0,05). Как известно, эритроциты являются инсулиннезависимыми клетками и глюкоза в них проникает через мембрану по градиенту концентрации. Основными путями использования глюкозы в красных клетках крови являются гликолиз и пентозофосфатный путь (ПФП). В связи с этим мы исследовали активность некоторых регуляторных ферментов данных путей метаболизма. Так как реакция фосфорилирования глюкозы за счѐт АТФ является пусковой и идѐт в одном направлении, мы исследовали активность регуляторного фермента гликолиза – гексокиназы. Выявлено, что по сравнению с контролем, у пациенток обеих возрастных групп во всех подгруппах активность этого фермента снижена. Можно полагать, что у пациенток с СД 2 типа нарушаются основные пути утилизации глюкозы вследствие угнетения гексокиназной активности в условиях дефицита или нарушенной функциональной активности инсулина, что способствует увеличению глюкозотоксичности, более значимое у пациенток пожилого возраста. Необходимо субкомпенсированной указать, что гипергликемии (3 у пожилых подгруппа) пациенток имеет место при более выраженное угнетение активности гексокиназы, по сравнению с контролем. Обнаруженные нами изменения активности гексокиназы у всех обследуемых пациенток имеют возрастную особенность и связаны с уровнем 128 компенсации углеводного обмена. Очевидно, что течение СД 2 типа характеризуется снижением включения глюкозы в окислительные процессы, что можно считать важным патогенетическим механизмом в условиях нарушенной деятельности инсулярного аппарата. Известно, что направленность изменений содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах зависит от потребности организма в кислороде и носит адаптивный характер (Байшукурова А.К., 1983). В ходе исследования содержания 2,3-ДФГ установлено, что у пациенток второго периода зрелости и у пожилых пациенток при суб- и декомпенсации заболевания рост содержания 2,3-ДФГ значительно превышает контрольные значения. Значительный рост этого показателя наблюдается у пожилых пациенток при суб- и декомпенсации углеводного обмена. Как показали наши исследования, содержание 2,3-ДФГ значительно возрастает по мере увеличения возраста пациенток (пожилые) и стадии компенсации углеводного обмена (декомпенсация). Обращает на себя факт наличия положительной умеренной корреляции у пациенток второго периода зрелости в стадии декомпенсации (2 подгруппа) между ростом содержания 2,3ДФГ и уровнем HbA1C (r=0,44, p<0,05). Полученные данные являются документальным свидетельством наличия гипоксии, более выраженной у пожилых пациенток, что обеспечивает реализацию не только количественного, но и модуляционного механизма адаптации к гипоксии. Принимая во внимание данные о способности 2,3-ДФГ угнетать активность гексокиназы (Гаврилов О.К. и соавт., 1985), становится очевидным, что угнетение активности данного энзима у пациенток обеих возрастных групп происходит на фоне интенсификации процессов, направленных на обеспечение оксигенации тканей при низком pО2, что подтверждается увеличением содержания 2,3-ДФГ. Причѐм эта закономерность более выражена с возрастом, особенно в стадии декомпенсации углеводного обмена и имеет возрастные механизмы, связанные со степенью тяжести основного заболевания. 129 Из литературных источников известно, что в эритроцитах больных сахарным диабетом снижается содержание 2,3-ДФГ по сравнению со здоровыми людьми (Tuyoshi, Fujita et all. 1998). Полученные же в нашей работе данные, свидетельствующие о повышении содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах у пациенток обеих возрастных групп в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена, особенно у пожилых пациенток в стадии декомпенсации основного заболевания, свидетельствуют о том, что направленность изменений содержания 2,3-ДФГ в зрелых эритроцитах зависит от потребности организма в кислороде, носит адаптивный характер и является отражением количественного и модуляционного типа адаптации к гипоксии вызванной гипергликемией, что соответствует существующим представлениям о роли 2,3-ДФГ. Известно, что при дефиците кислорода синтез 2,3-ДФГ усиливается, что приводит к увеличению выхода кислорода из эритроцитов в ткани и улучшению снабжения клеток кислородом (Титова Н.М. и др., 2008), но выход АТФ (из расчѐта на моль глюкозы) при этом снижается (Гаврилов О.К. и соавт., 1985; Моисеева О.И., 1986; Рябов Г.А., 1988; Rapoport J. еt al., 1977). Высокая скорость протекания биохимических реакций и использование эритроцитом гликолиза для энергетического обмена, не исключают возможности относительно быстрого изменения содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах при гипоксии. Увеличение содержания 2,3-ДФГ в эритроцитах человека и животных при гипоксии является одним из адаптивных механизмов, который улучшает доставку кислорода к тканям (Duhm J., Gerlach E., 1971; . Torrance J.D. at al., 1970/71). Так как перед нами стояла задача определения превалирующей роли гликолиза или ПФП, а также роли субстратов для поддержания энергетического потенциала эритроцитов у пациенток с СД 2 типа в зависимости от их возраста и стадии компенсации заболевания, то нами была изучена активность ФГИ, определяющая (катализирующая) дальнейшую «судьбу» глюкозо-6-фосфата, а именно его превращение во фруктозо-6-фосфат. 130 Нами обнаружено, что максимальное снижение активности этого фермента, по сравнению с контролем, достигает у пожилых пациенток в стадии декомпенсации углеводного обмена (4 подгруппа). У пациенток более молодого возраста отмечен фазный характер изменения активности этого фермента в зависимости от стадий компенсации углеводного обмена, по сравнению с контролем, в частности, при стадии субкомпенсации заболевания было отмечено снижение активности, а при декомпенсации – повышение активности. У пациенток второго периода зрелости при субкоменсации заболевания (1 подгруппа), также как и у пожилых пациенток при суб- и декомпенсации (3 и 4 подгруппы) происходит снижение скорости начальных этапов гликолиза. У пациенток второго периода зрелости при стадии декомпенсации вероятно, срабатывают компенсаторные механизмы, направленные на активацию галактозного пути утилизации углеводов с последующим образованием гл-6фосфата из гл-1-фосфата, который в свою очередь может включаться в гликоген эритроцитов (Гаврилов О.К. и др., 1985). Можно полагать, что такая переориентация метаболизма углеводов обусловлена накоплением старой популяции клеток эритроидного ростка, что подтверждает наше предположение о нарушении процесса утилизации старых эритроцитов у пожилых женщин. Кроме того, необходимо отметить, что у пожилых пациенток с СД 2 типа независимо от степени компенсации нарушений углеводного обмена отмечается выраженный рост содержания 2,3-ДФГ, который ингибирует активность фосфоглюкомутазы и нарушает работу галактозного пути утилизации углеводов. В этой связи можно полагать, что выраженный рост аллостерического модулятора сродства эритроцитов к кислороду - 2,3-ДФГ служит не только критерием выраженности гипоксии, но и является биохимическим маркером превалирования старой популяции клеток красной крови. Наши предположения нахолят своѐ подтверждение наличием отрицательных корреляционных связей между ростом содержания 2,3-ДФГ и снижением активности ФГИ у пациенток второго периода зрелости в стадии 131 субкомпенсации (1 подгруппа) (r = -0,61, p<0,05) и у пожилых пациенток в стадии декомпенсации (4 подгруппа) (r = -0,5, p<0,05). Что касается особенностей функционирования ПФП, по которому утилизируется около 10% глюкозы, то нами был установлен рост активности регуляторного фермента ПФП гл-6-ФДГ, по сравнению с контролем, только у женщин второго периода зрелости с субкомпенсацией гипергликемии. Надо полагать, данные изменения при начальном проявлении заболевания являются компенсаторно-приспособительной реакцией клеток крови, направленной на усиление процессов утилизации галактозы в условиях дефицита гексокиназы. Повидимому, в данной возрастной группе в качестве поставщика глюкозо-6-фосфата для работы ПФП большее значение приобретает галактозный путь утилизации глюкозы. Следует учесть и тот факт, что нормальное функционирование ПФП имеет особое значение для эритроцитов. Так, образующийся НАДФН+, необходим для поддержания нормальной функциональной активности и целостности эритроцитов, а также он участвует в биосинтезе жирных кислот и холестерина. Промежуточные продукты гексозомонофосфатного шунта, такие как пентозы и триозы, используются для синтеза нуклеиновых кислот и 2,3-ДФГ. Кроме того, гексозомонофосфатный шунт может служить дополнительным путем образования энергии за счет включения глицеральдегидфосфата в цепь гликолитических превращений. Не менее значимым является то, что образующийся рибозо-5-фосфат в эритроцитах служит составной частью таких макроэргических соединений как АТФ, АДФ и АМФ синтез которых отсутствует. В этой связи, можно утверждать, что гл-6-ФДГ и промежуточные продукты ПФП выполняют роль «аварийного» пути, обеспечивающего нормальное функционирование гликолиза при начальной стадии заболевания у пациенток второго периода зрелости в обход гексокиназной и фосфогексоизомеразной реакций. В то же время, у пациенток этого же возраста, но при декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) происходит достоверное снижение активности 132 гл-6-ФДГ относительно контроля. Такая же тенденция снижения активности этого фермента, по сравнению с контрольным значением, наблюдается и у пациенток пожилого возраста, у которых при стадии субкомпенсации этот показатель достигает максимального значения. Причѐм у пациенток этой подгруппы снижение активности гл-6-ФДГ связано с повышением уровня глюкозы в крови в виде отрицательной умеренной корреляционной связи (r=-0,44, p=0,04). Таким образом, у пожилых пациенток низкая активность гл-6-ФДГ находится во взаимосвязи с ингибированием гексокиназной активности, что отражает внутриклеточный дефицит глюкозы. На это указывает и активация фосфорилазы, стимулирующая гликогенолиз в модельных экспериментах с добавлением гликогена в среду, содержащую эритроциты. Косвенным показателем утилизации молекулярного кислорода при внутриклеточном метаболизме являются субстраты или продукты общего пути катаболизма, в частности, пировиноградная и молочная кислоты. У пациенток с СД 2 типа второго периода зрелости в обеих подгруппах понижение содержания ПВК сопровождается ростом содержания лактата, что явно свидетельствует об активации заключительных этапов анаэробного гликолиза, наиболее выраженного при декомпенсации заболевания. Заметим, что у пациенток этого возраста в стадии субкомпенсации заболевания (1 подгруппа) снижение содержания ПВК сопровождается ростом уровня Hb, что выражается в виде отрицательной умеренной корреляционной связи (r = -0,52, p<0,05), а в стадии декомпенсации углеводного обмена (2 подгруппа) накопление лактата сопровождается ростом уровня Hb и выражается в виде положительной умеренной корреляционной связи (r = 0,48, p<0,05), что подтверждает формирование хронической гипоксии. Пируват является промежуточным продуктом анаэробного гликолиза и снижение его концентрации в эритроцитах объясняется усилением превращения этого субстрата в лактат. Метаболический лактоацидоз влияет на различные этапы энергетического обмена, а именно, блокирует тканевую утилизацию глюкозы и еѐ окисление в цикле Кребса, заменяя глюкозу в продукции энергии, а 133 также при его избытке изменяется pH крови. Нарастание интенсивности этого процесса наблюдается у пожилых пациенток в стадии субкомпенсации заболевания (3 подгруппа), что имеет и возрастные особенности. Таким образом, у пациенток этого возраста накопление лактата способствует снижению рН и изменению активности ферментов, в том числе и обеспечивающих протекание реакций глюконеогенеза и гликолиза (Северин Е.С. и др., 2004). Обращает на себя внимание значительный рост содержания ПВК и лактата у пациенток пожилого возраста в стадии декомпенсации заболевания (4 подгруппа), по сравнению с контролем, что может быть «борьбой за существование», т.е. борьбой за преодоление гипоксического состояния, вызванного гипергликемией и усугубляющегося возрастом пациенток и стадией «тяжести» нарушения углеводного обмена. При этом, у этих пациенток рост содержания ПВК происходит на фоне роста уровня 2,3-ДФГ и отражается в виде положительной умеренной корреляционной связи (r = 0,45, p<0,05), в свою очередь рост уровня 2,3-ДФГ наблюдается на фоне увеличением накопления лактата (r = 0,46, p<0,05). Надо полагать, что с возрастом значительное накопление лактата, сочетающееся с выраженным угнетением активности гексокиназы, ФГИ, а также накоплением 2,3-ДФГ, приводящего к нарушению работы фосфоглицератмутазы галактозного пути утилизации углеводов, обусловлено увеличением доли сорбитолового пути метаболизма глюкозы. Так, в литературе указывается, что в условиях гипергликемии имеет место увеличение утилизации глюкозы по полиоловому шунту (превращение внутриклеточной глюкозы в сорбитол) (Подачина С.В., Мкртумян А.М., 2008). Под влиянием ключевого фермента сорбитолового пути альдозоредуктазы нефосфорилированная глюкоза конвертируется в сорбитол, который под влиянием сорбитолдегидрогеназы метаболизируется во фруктозу. Активность сорбитолового пути регулируется внутриклеточной концентрацией глюкозы и не требует присутствия инсулина. Важно указать, что повышение активности 134 альдозоредуктазы приводит к истощению НАДФН+ и ухудшению синтеза глутатиона (Mercuri F. et all., 2000). В этой связи можно полагать, что с возрастом метаболические превращения глюкозы и включение ее в основные пути обмена в эритроцитах идут, вероятно, через галактозу и служат компенсаторноприспособительной реакцией («аварийный» механизм) уменьшения гипергликемии. Очевидно, что выраженный метаболический лактоацидоз у пожилых пациенток является компенсаторной реакцией организма, направленной на стимуляцию процессов глюконеогенеза в печени в условиях относительной инсулярной недостаточности. Так как ПВК является не только ключевым метаболитом углеводного обмена, но и центральным звеном общего пути катаболизма в преобразовании белков, жиров и углеводов, то обнаруженные изменения могут приводить к разбалансировке метаболизма, что, повлечѐт за собой нарушения адаптационных возможностей всего организма. Гипергликемия ускоряет процессы дезинтеграции эритроцитов, а лактоацидоз на фоне гипергликемии усиливает повреждающее действие гликирования за счет снижения сродства к кислороду и ускорения аутоокисления гемоглобина (Богатская Л.Н. и соавт.1986; Кленова Н.А., 2003). Таким образом, у пожилых пациенток с декомпенсацией углеводного обмена избыток молочной кислоты ускоряет дезинтеграционные процессы из-за развития энергодефицита, для которого стартовым механизмом служит снижение сродства гемоглобина к кислороду, уменьшение производства АТФ, что, в свою очередь, приводит к нарастанию денатурационных изменений, уменьшению фоновой активности ферментов, при увеличении активности ферментов деградации мембран, что является одним из механизмов апоптозной гибели клеток крови и отражает темпы старения организма. Метаболические изменения в эритроцитах при СД 2 типа проявляются в росте уровня 2,3-дифосфоглицерата, который взаимодействует с аллостерическим центром гемоглобина, понижая его сродство к О2 и улучшая доставку молекулярного кислорода к органам и тканям, угнетением окислительной ветви 135 ПФП превращения глюкозы и начальных этапов гликолиза, изменением функционирования транспортных систем эритроцитов за счѐт изменения проницаемости мембран, нарушением соотношения между прооксидантными и антиоксидантными системами, с активацией ферментов АОЗ. Степень и направленность таких изменений зависит как от возраста больного, так и от степени тяжести СД 2 типа (суб- или декомпенсация). Судя по полученным данным, изменения содержания субстратов и ферментов углеводноэнергетического обмена в клетках крови являются индикаторами повреждений и развития гипоксии, что подтверждает и углубляет информацию, имеющуюся в литературе (Рябов Г.А., 1988, Пицура Н.И., 1998). Таким образом, увеличение повреждения эритроцитов у пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа в стадии суб- и декомпенсации в условиях гипоксии, лактоацидоза, приводит к напряжению систем эритропоэза, что документируется ростом количества эритроцитов и Hb, усилением гликозилирования гемоглобина и чревато срывом адаптационных процессов, особенно выраженных у пожилых пациенток в стадии декомпенсации углеводного обмена. В модельных опытах с добавлением в среду гликогена с целью изучения процесса гликогенолиза как потенциального источника глюкозы у пациенток с СД 2 типа получены данные, свидетельствующие об активации гликогенфосфорилазы, по сравнению с контролем, у всех пациенток с СД 2 типа, особенно выраженного у пожилых пациенток в стадии декомпенсации. Таким образом, изменения активности фосфорилазы во всех исследуемых подгруппах пациенток имеют возрастную особенность. Эти данные объясняют феномен угнетения активности гексокиназы в результате дефицита глюкозы и активацию альтернативных путей использования промежуточных продуктов, а именно ПФП для поддержания энергетики и целостности эритроцитов на ранних этапах нарушения углеводного обмена. Наряду с активацией начальных этапов ПФП при стадии субкомпенсации заболевания, судя по накоплению лактата, 2,3-ДФГ на фоне угнетения 136 гексокиназы возможна активация в эритроцитах глиоксилатного шунта, позволяющего из ДГАФ и диоксиацетона образовывать лактат. Так как кислородный гомеостаз заключается в создании и поддержании оптимального уровня кислорода во всех клетках, которые осуществляют оксибиотические процессы, что, в свою очередь, обеспечивает физиологические условия функционирования окислительных ферментов и создаѐт энергетическую основу для поддержания на заданном уровне всех показателей жизнедеятельности (Шпектор И.И., 2007; Дементьева И.И., 2002), можно заключить, что у пациенток с СД 2 типа одной из причин изменения гомеостаза организма является нарушение кислородного статуса организма, которое направленно влияет на метаболизм эритроцита, и эти изменения особо отчѐтливо наблюдаются у пациенток при увеличении их возраста и степени тяжести заболевания (декомпенсация углеводного обмена). Обнаруженное нами изменение газотранспортной функции крови у пациенток с СД 2 типа свидетельствует о наличии гипоксии, более выраженной у пожилых при декомпенсированной форме. Активация гипоксического фактора неизбежно приводит к запуску процессов свободнорадикального окисления и развитию выраженного окислительного стресса. Такие изменения являются результатом возрастания метаболической активности и продукции активных кислородных метаболитов моноцитами и гранулоцитами крови (Зенков Н.К. и соавт., 2001; Baynes J.W. et al., 1999). Кроме того, имеются сведения, что у больных СД 2 типа уменьшается концентрация аскорбиновой кислоты и токоферола, что значительно снижает роль неферментативной антиоксидантной защиты и повышает прооксидантную активность сыворотки крови (Brounlee M., 2001). На сегодняшний день ведущей теорией старения организма признана теория свободных радикалов. Однако, несмотря на всеобщее признание этой теории, большинство геронтологов и биохимиков считают, что старение, как и любая биологическая функция, обусловлена действием многих молекулярных механизмов. Скулачев В.П. (1997) указывает на три таких основных механизма: 1) 137 укорочение теломер вследствие выключения теломеразы на ранних стадиях эмбриогенеза; 2) выключение с возрастом механизма, индуцирующего синтез белков теплового шока в ответ на денатурирующие воздействия; 3) неполное подавление генерации активных форм кислорода и неполное обезвреживание образовавшихся АФК. Эти причины не могут привести к немедленной гибели организма, но ослабляют его резистентность (Хавинсон В.Х. и соавт., 2003). Поскольку еще одной отличительной чертой метаболизма эритроцитов является высокая скорость образования свободных радикалов, обусловленная содержанием кислорода, то представлялось целесообразным изучить особенности функционирования системы «антиоксиданты-прооксиданты» у всех обследуемых пациенток. Такая необходимость была вызвана, прежде всего, тем, что нарушение процессов утилизации АФК служит важной причиной не только повреждения самой поджелудочной железы и обусловливает развитие осложнений, но и объясняет основные метаболические превращения, лежащие в основе процессов старения у данного контингента лиц на фоне СД 2 типа. Кроме того, изменение концентрации глюкозы во внутренней среде организма относят как к вероятным, так и к системным механизмам старения организма (Тодоров И.Н., Тодоров Г.И., 2003). Свободнорадикальное окисление – неотъемлемая часть многих жизненно важных процессов, таких как перенос электронов флавиновыми элементами, обновление липидов мембран, окислительное фосфорилирование в митохондриях, митогенеза, проведение нервного импульса и пр. (Гуськов Е.П., 2009). При СД недостаточность инсулина и гипергликемия повышают уровень окислительного стресса при относительном или абсолютном снижении активности антиоксидантной защиты. Так, в исследованиях последних лет выдвигается гипотеза, что локальное развитие окислительного стресса в области поджелудочной железы вызывает снижение секреции инсулина и может индуцировать повреждение β-клеток. Как следствие, повышается уровень глюкозы крови, что является предпосылкой усиления радикальных окислительных процессов как внутриклеточно, так и внеклеточно (Rossen P. et al., 138 1992). Увеличение продукции активных форм кислорода способствует окислению и повреждению ДНК, протеинов и липидов (Гуськов Е.П. 2009). При изучении механизмов обезвреживания активных форм кислорода в эритроцитах мы сосредоточили своѐ внимание на том факте, что постоянным источником активных кислородных форм в эритроцитах являются процессы неферментативного окисления гемоглобина в метгемоглобин, активация липооксигеназного пути в условиях гипергликемии, а также ингибирование активности мембраносвязанных ферментов в результате нековалентного взаимодействия глюкозы с белками-ферментами (Новицкий В.В. и соавт., 2006). Необходимо отметить, что инициация процессов свободно-радикальных реакций в качестве промоутеров способствует повышению уровня окислительных повреждений ДНК, белков и липидов в условиях сниженной активности антиоксидантных систем и служат одной из причин старения организма (Шарман А., Жумадилов Ж., 2011). Ферментативная система эритроцита, предотвращающая токсическое действие активных форм кислорода и последующее разрушение его мембран, представлена такими ферментами как Cu,Zn-СОД, КАТ, ГПО и ГР. Важным моментом эффективности функционирования ферментного звена антиоксидантной системы является кооперативность действия Cu,Zn-СОД, КАТ и ГПО. Подавление активности одного из ферментов антиоксидантной системы может привести к избыточному накоплению активных форм кислорода и деструкции клеток (Гусев В.А., 2000). В действительности, взаимодействия между данными ферментами могут быть значительно сложнее, и не только потому, что дисмутация O2• является не единственным источником образования перекиси водорода. Эти ключевые ферменты, по существу, управляют таким фундаментальным процессом, как регуляция основного потока активированных кислородных метаболитов в организме, и выступают стратегически важной мишенью для многих регуляторных факторов эндогенного и экзогенного происхождения (Федорова Т.Н., 2004; Зенков Н. К. и соавт., 2001; Сидоров И. В. и соавт., 2003). 139 В литературе имеются сведения, что суммарное увеличение активности антиоксидантной системы хорошо коррелирует с величиной средней продолжительности жизни млекопитающих (Арутюнян А.В., 2009). В ходе работы нами установлены взаимосвязи этих ферментов, которые лежат в основе их объединения в «функциональные» антиоксидантные системы, отдельные компоненты которых специализируются на поэтапном восстановлении активных форм кислорода и молекулярных продуктов свободнорадикального окисления липидов у пациенток с СД 2 типа обеих возрастных групп в стадиях суб- и декомпенсации углеводного обмена. При этом, величина «эффекта» связи Cu,Zn-СОД, КАТ и ГПО может быть соизмерима стимулирующему действию одного из ферментов (Мурадян Х. К., 2003; Соколовский В. В. и соавт., 1988). При оценке возрастных изменений активности антиоксидантных ферментов у пациенток обеих возрастных групп с СД 2 типа, мы отмечаем, что у всех наблюдается повышение активности Cu,Zn-СОД относительно контроля, максимально выраженное у пациенток второго периода зрелости (при суб- и декомпенсации заболевания) и у пожилых пациенток в стадии субкоменсации, что косвенно свидетельствует об избыточной продукции супероксидного анионрадикала и пероксида водорода. Однако не следует забывать, что интенсивное образование пероксида водорода приводит к нарушению межмолекулярных взаимодействий и повреждению мембран клеток, в том числе и внутренней мембраны митохондрий, что может служить основным механизмом «утечки» активных форм кислорода митохондриального происхождения и усиливать деструкцию. Кроме того есть сведения (Хавинсон В.Х. и соавт., 2003), что пероксид водорода взаимодействует с ДНК, приводит к хромосомным аберрациям, особенно еѐ цитотоксическое действие проявляется в условиях нарушения нормальной работы глутатионпероксидазы. Обращает на себя факт изменения активности Cu,Zn-СОД при стадии декомпенсации углеводного обмена у пожилых пациенток, так как происходит менее значимое повышение его активности относительно контрольной группы. Очевидно, что у пожилых пациенток при декомпенсации заболевания истощается 140 это ферментативное звено вследствие более длительного воздействия «стресс» лимитирующего фактора – гипергликемии, что может сопровождаться накоплением в крови этих пациенток прооксидантов и усугублять патогенез заболевания. Что касается ферментов КАТ и ГПО, то у всех пациенток обследуемых групп нами обнаружен «тандем» в повышении их активностей относительно контроля, более выраженные изменения отмечаются у пожилых пациенток в стадии субкомпенсации углеводного обмена. Таким образом, глутатионпероксидазной компенсаторное активности увеличение отражает не только каталазной и выраженность окислительного стресса и эндотоксемии, но и степень тяжести течения СД, особенно у пациенток пожилого возраста. Этот факт позволяет говорить о том, что изменение баланса между клеточными антиоксидантами Cu,Zn-СОД, ГПО и КАТ у пациенток с СД 2 типа с увеличением возраста (пожилой возраст) и степенью тяжести течения заболевания (суб- и декомпенсация) является ответственным за возрастное увеличение уровня токсичных продуктов пероксидного окисления липидов, накопление окислительных повреждений в организме и, таким образом, проявление негативных последствий окислительного стресса, усугубляющих состояние пациенток. Проведѐнный корреляционный анализ показал наличие положительной заметной корреляционной связи у пациенток второго периода зрелости с заболеванием в стадии декомпенсации между ростом активностей КАТ и Cu,ZnСОД (r = 0,64; p<0,05), КАТ и ГПО в виде положительной умеренной корреляции (r = 0,5; p<0,05). У пожилых пациенток при стадии субкомпенсации углеводного обмена рост активности КАТ коррелирует с ростом активности Cu,Zn-СОД в виде положительной умеренной связи (r = 0,57; p<0,05). Увеличение активности Cu,Zn-СОД является компенсаторно- приспособительной реакцией, направленной на предотвращение избыточного окисления гемоглобина в метгемоглобин. Данные изменения особенно значимы для пациентов с нарушенной толерантностью к углеводам, поскольку у них имеет 141 место дополнительное гликозилирование гемоглобина, что нарушает процессы транспорта и доставки молекулярного кислорода к органам и тканям. Положительная умеренная корреляционная связь между ростом уровня 2,3 - ДФГ и увеличением активности Cu,Zn-СОД (r = 0,49; p<0,05) у пациенток второго периода зрелости с СД 2 типа в стадии субкомпенсации является отражением этого процесса в так называемом «дебюте» заболевания. При изучении активности антиоксидантных ферментов нами выявлены характерные изменения глутатионовой антиперекисной системы (GSH, ГПО и ГР) у пациенток с СД 2 типа в зависимости от возраста и стадии компенсации углеводного обмена. Восстановленные коферменты НАДФН, образующиеся в ПФП необходимы для работы глутатионредуктазы (ГР), что обеспечивает поддержание уровня глутатиона в крови. Нами отмечено, что у пациенток с СД 2 типа в обеих возрастных группах происходит достоверное снижение ГР по сравнению с контрольными значениями, но более выраженное у пациенток второго периода зрелости с заболеванием в стадии субкомпенсациии. Наряду с этим у всех пациенток отмечается снижение концентрации GSH, причѐм у пациенток второго периода зрелости в стадии декомпенсации углеводного обмена отмечается максимальное снижение этого показателя. Заметим, что у пациенток этого возраста в стадии субкомпенсации углеводного обмена обнаружена положительная умеренная корреляционная связь между снижением активности ГР и количеством GSH (r = 0,46; p<0,05), а в стадии декомпенсации снижение активности ГР коррелирует с ростом ГПО в виде отрицательной умеренной связи (r = -0,45; p<0,04). Таким образом, нами наблюдается дестабилизации мембранной структуры эритроцита у всех пациенток, но более выраженна у пациенток второго периода зрелости в стадии декомпенсации. Снижение концентрации GSH и активности ГР - фермента, обеспечивающего регенерацию GSSG, на фоне увеличения активности ГПО может привести к истощению работы всей глутатион-зависимой антиоксидантной системы, способствующей денатурации гемоглобина и перекисному гемолизу 142 эритроцитов (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1990). Кроме того, истощение пула восстановленного глутатиона на сегодняшний день связывают с высоким риском генотоксичности, поскольку активируются процессы дисфункции митохондрий и хроматина, возникает фрагментация ДНК. Этот эффект увеличивается гидропероксидами полиненасыщенных жирных кислот, что приводит к некрозу и апоптозу. На основании полученных данных и данных литературы можно констатировать, что при СД 2 типа в стадии декомпенсации запускаются процессы апоптотической гибели, приводящие к активации программы старения и повышению риска сокращения жизни пациентов. Очевидно, что изменение концентрации тиоловых антиоксидантов может служить одним из критериев оценки биологического возраста пациентов и эффективности проводимого лечения. Таким образом, у пациенток второго периода зрелости в стадии декомпенсации и у пожилых пациенток в стадии суб- и декомпенсации отмечены возрастные изменения таких параметров как снижение активности гл-6-ФДГ, уменьшение выхода НАДФ, снижение активности ГР, снижение содержания GSH, которые приводят к нарушению координации начальных и конечных этапов гликолиза, что снижает энергетический потенциал клетки, развитию гипоксии, нарушению проницаемости мембран, в результате приводящие к гемолизу эритроцитов. При исследовании в возрастном аспекте процессов образования и накопления продуктов окислительного повреждения биомолекул наибольшее значение придается реакциям, протекающим с участием малонового диальдегида, оснований Шиффа, металлов переменной валентности, в результате чего образуются «сшивки» с белками, фосфолипидами, нуклеиновыми кислотами (Хавинсон В.Х. и соавт., 2003). О дестабилизации мембран эритроцитов и об усилении процессов свободнорадикального окисления ПНЖК в плазме крови у всех пациенток с СД 2 типа свидетельствует повышение содержания ВЭГ и МДА в изменении 143 содержания которых отмечены возрастные закономерности и зависимости от стадий компенсации заболевания. В частности в стадиях декомпенсации у пациенток второго периода зрелости и у пожилых пациенток отмечено максимальное повышение этих показателей относительно контрольных значений, что указывает на повреждение мембран эритроцитов и на увеличение содержания продуктов, реагирующих с ТБК – малонового диальдегида. Так же, в ходе корреляционного анализа обнаружена положительная умеренная корреляционная связь у пациенток пожилого возраста в стадии субкомпенсации углеводного обмена (3 подгруппа) между ростом содержания МДА и ВЭГ (r = 0,57; p<0,05). У пациенток этого возраста в стадии декомпенсации углеводного обмена рост содержания ВЭГ в плазме крови сопровождается ростом активности КАТ, что подтверждается наличием положительной умеренной корреляционной связи (r = 0,47; p<0,05) и ростом активности ГПО, что отражает положительная умеренная корреляционная связь между этими параметрами (r = 0,42; p<0,05). По-видимому, ПОЛ и его молекулярные продукты, выступая в роли «первичного медиатора» гипергликемического стресса, представляют один из молекулярных механизмов регуляции продолжительности жизни таких пациенток. Кроме того, не следует забывать о том, что значительные концентрации молекулярных продуктов ПОЛ вызывают эндотелиальную дисфункцию, принимают участие в вазоконстрикции и, тем самым, участвуют в формировании сосудистых осложнений. Разработанный нами показатель «Фактор риска пероксидации мембран» (ФРПМ), отражающий степень деструкции компонентов клеточных мембран показал, что у пожилых пациенток выраженное усиление процессов свободнорадикального окисления сопровождается дезинтеграцией ферментов АОЗ и имеет возрастную особенность. У пожилых пациенток в стадии декомпенсации основного заболевания выявлена отрицательная корреляционная связь между ростом содержания МДА и снижением количества GSH (r = -0,46; p<0,05). 144 Так как, интенсивность процессов свободно-радикального окисления определяет степень повреждения клеточных элементов (Камбачокова З.А., 2005) и может служить индикатором «молекулярного старения» организма на фоне СД 2 типа, можно заключить, что у пациенток пожилого возраста интенсивный рост МДА, ВЭГ и ФРПМ свидетельствует о развитии неблагоприятного прогноза заболевания. На основе полученного фактического материала нами был разработан «Способ лабораторной диагностики уровня компенсации углеводного обмена при сахарном диабете 2 типа» (заявка на изобретение № 2012153040/15(084445), приоритет от 07.12.2012). Технический результат способа достигается тем, что у больных исследуют венозную кровь, в эритроцитах которой определяют активность Cu,Zn-супероксиддисмутазы (Cu,Zn-СОД), глутатионпероксидазы (ГПО), активность фосфогексоизомеразы (ФГИ) и активность глюкозо-6фосфатдегидрогеназы (Гл-6-ФДГ). Затем рассчитывают коэффициент защитной эффективности антиоксидантных ферментов (К1) по формуле К1 = Cu,ZnСОД/ГПО и коэффициент интенсивности гликолиза (К2) по формуле К2=ФГИ/Гл6-ФДГ. При значениях К1 > 288,9 и К2 < 47,1 диагностируют стадию субкомпенсации углеводного обмена, при значениях К1 < 271,4 и К2 > 47,26 диагностируют стадию декомпенсации углеводного обмена. Таким образом, проведенное биохимическое исследование позволило в сопоставительном аспекте определить особенности изменения параметров углеводно-энергетического обмена, газотранспортной и антиоксидантной систем крови, состояние мембран эритроцитов у пациенток с СД 2 типа разных возрастных групп в стадии суб- и декомпенсации углеводного обмена. На основе выявленных закономерностей метаболического ответа эритроцитов на разных стадиях СД 2 типа определены новые критерии оценки компенсаторных возможностей организма в разных возрастных группах пациенток и разработан новый способ лабораторной диагностики уровня компенсации углеводного обмена при СД 2 типа. 145 Знание особенностей перестройки важнейших метаболических процессов в клетках крови позволит расширить прикладные аспекты исследования и обоснованно корригировать приспособительные реакции на разных этапах онтогенеза пациентов, повысить их эффективность у пожилых. Всѐ вышеизложенное позволяет подтвердить нашу гипотезу о важной роли метаболических изменений в эритроцитах в патогенезе СД 2 типа в зависимости от возраста больных и стадии компенсации углеводного обмена. Ъ 146 ВЫВОДЫ 1. Изменения активности ФГИ, гл-6-ФДГ и гексокиназы имеют возрастные отличия и отражают степень тяжести заболевания. В стадии субкомпенсации у пациенток второго периода зрелости повышение активности гл-6-ФДГ на фоне снижения активности ФГИ и гексокиназы свидетельствует об активации начальных этапов ПФП. В стадии декомпенсации углеводного обмена у пациенток обеих возрастных групп активность гексокиназы и гл-6-ФДГ снижена, тогда как изменение активности ФГИ имеет возрастные отличия и характеризуется максимальным снижением у пожилых и активацией у пациенток второго периода зрелости. 2. При СД 2 типа по мере увеличения возраста пациенток и углубления патологического качественные процесса в перестройки, эритроцитах наблюдаются характеризующиеся количественно- увеличением количества эритроцитов и содержанием HbА, прогрессирующим ростом 2,3-ДФГ и лактата, что отражает наличие гипоксии у всех пациенток, достигающей наибольшей выраженности у пожилых в стадии декомпенсации углеводного обмена. 3. С увеличением возраста пациенток отмечается синхронный рост активности КАТ и ГПО в эритроцитах, в то время как активность Cu,Zn-СОД зависит от стадии заболевания и имеет максимальную выраженность у пациенток обеих возрастных групп в стадии субкомпенсации углеводного обмена. 4. Выраженный рост содержания ВЭГ и МДА в плазме у пациенток обеих возрастных групп в стадии декомпенсации свидетельствует о нарушении стабильности мембран эритроцитов и отражает степень тяжести заболевания. 5. В исследуемых возрастных группах выявлены метаболические комплексы, характеризующиеся достоверными корреляционными связями между изучаемыми параметрами, определена их патогенетическая роль на разных стадиях СД 2 типа. 6. Разработан способ лабораторной диагностики уровня компенсации нарушения углеводного обмена у пациенток с СД 2 типа, позволяющий на основании расчѐта коэффициента эффективности антиоксидантных ферментов 147 (К1 = Cu,Zn-СОД/ГПО) и коэффициента интенсивности гликолиза (К2=ФГИ/гл-6ФДГ) повысить информативность и достоверность диагностики уровня компенсации углеводного обмена (суб- и декомпенсации) у больных СД 2 типа. 148 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2,3-ДФГ 2,3-дифосфоглицерат Cu,Zn-СОД Cu,Zn-супероксиддисмутаза GSH восстановленная форма глутатиона HbA1C гликозилированный гемоглобин HbA нормальный гемоглобин АОЗ антиоксидантная защита АОС антиоксидантная система АФК активные формы кислорода ВОЗ всемирная организация здравоохранения ВЭГ внеэритроцитарный гемоглобин Гл-6-ФДГ глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа ГПО глутатионпероксидаза ГПН глюкоза плазмы натощак ГР глутатионредуктаза ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота Лактат молочная кислота МДА малоновый диальдегид НАДФ никотинамиддинуклеотидфосфат ОГТТ оральный глюкозо-толерантный тест ПВК пировиноградная кислота ПОЛ перекисное окисление липидов ПФП пентозофосфатный путь ПФШ пентозофосфатный шунт СД 2 типа сахарный диабет 2 типа СД сахарный диабет СРО свободнорадикальное окисление ФГИ фосфогексоизомераза ФРПМ фактор риска пероксидации мембран 149 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Авторское свидетельтво СССР № 877436 МКИ G №33/52 Способ определения пировиноградной кислоты в крови / П.М. Бабаскин. - № 2877502/2813; Заяв. 13.02.80; Опубл. 30.10.81, Бюл. №10. - 21 с. 2. Абрамченко В.В. Антиоксиданты и антигипоксанты в акушерстве. СПб.: ДЕАН. – 2001. – 400 с. 3. Аметов А.С., Грановская-Цветкова А.М., Казей Н.С. Инсулиннезависимый сахарный диабет: основы патогенеза и терапии // Российская Медицинская Академия Минздрава РФ [Электронный ресурс]. – М. – 1995. – Режим доступа: http://medi.ru/doc/0517.htm 4. Аметов А.С., Карпова Е.В., Иванова Е.В. Современные подходы к управлению сахарным диабетом 2 типа (обзор) // Терапевтический архив. – 2009. – №10. – С. 20-27. 5. Андреева Н.В. Особенности патогенеза микроангиопатий у больных сахарным диабетом 2 типа разного возраста // Русский медицинский журнал. – 2006. – Т. 14, № 6. – С. 470-471. 6. Анисимов В.Н.. Старение и ассоциированные с возрастом болезни // Клиническая геронтология. - 2005. - №1. – С. 42-49. 7. Антонова К.В., Недосугова Л.В, Балаболкин М.Н. Влияние компенсации углеводного обмена на свободнорадикальное окисление липопротеидов низкой плотности и активность ферментативной антиоксидантной системы при сахарном диабете типа 2 // Проблемы эндокринологии. – 2003. – №2. - С. 1-4. 8. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободно- радикального окисления и антиоксидантной системы организма. СПб: Фолиант. – 2000. – 104 с. 9. Арутюнян А.В., Козина Л.С. Механизмы свободнорадикального окисления и его роль в старении // Успехи геронтологии. – 2009. – Т.22. – №1. – С. 104-116. 150 10. Байшукурова А.К. Образование 2,3-ДФГ в эритроцитах при экспериментальных воздействиях, изменяющих условия транспорта кислорода: дис. … канд. биол. наук. – Л., – 1983. – 137 с. 11. Балаболкин М.И., Кременская В.М., Клебанова Е.М. Роль дисфункции эндотелия и окислительного стресса в механизмах развития ангиопатий при сахарном диабете 2-го типа // Кардиология. – 2004. – №7. – С. 90-97. 12. Балаболкин М.И. Клебанова Е.М. Исулинотерапия сахарного диабета на современном этапе // Лечащий врач. – 2006. – №2. – С.24– 27. 13. Балаболкин, М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Дифференциальная диагностика и лечение эндокринных заболеваний. Руководство – М.: Медицинское информационное агентство . – 2008. – 752 с. 14. Балаболкин, М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. Лечение сахарного диабета и его осложнений (руководство для врачей) – М.: Медицина. – 2005. – 512 с. 15. Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены «предрасположенности». Введение в предиктивную медицину. – СПб.: Интермедика. – 2000. – 271c. 16. Басов А.А. Сравнительная характеристика антирадикальной активности различных классов антиоксидантных средств в условиях окислительного стресса: автореф. дис. … канд. мед. наук. – Ростов-на-Дону, – 2007. – 22 с. 17. Биологическая химия / под ред. С.Е. Северина. М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2011. – 642 с. 18. Биохимия / под ред. С.Е. Северина. М.: ГЭОТАР-Медиа. – 2004.– 784 с. 19. Богатская Л.Н., Коркушко О.В., Писарук А.В. Возрастные изменения гликолиза и содержания модуляторов кислородтранспортной функции гемоглобина в эритроцитах человека // Укр.биохим.журн. – 1986. – Т.58. – №2. С.41-44. 20. Болдырев А.А. Окислительный стресс и образовательный журнал – 2001. – № 4(7). – С. 21-28. мозг // Соросовский 151 21. Болевич С.Б. Бронхиальная астма и свободнорадикальные процессы: патогенетические, клинические и терапевтические аспекты. – М: Медицина. – 2006. – 243 с. 22. Бондарь Т.П., Козинец Г.И. Лабораторно-клиническая диагностика сахарного диабета и его осложнений. – М.: Медицинское информационное агентство. – 2003. – 88 с. 23. Вашанов Г.А., Каверин Н. Н. «Взаимосвязи между основными антиоксидантными системами крови телят разного возраста» // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: химия, биология, фармация – 2009. – № 1. – С.58-61. 24. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – № 6(12). – С. 13-19. 25. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. – М.: Наука. – 1972. – 52 с. 26. Внуков В.В., Милютина Н.П., Николаева Е.Е. и др. Влияние унитиола на интенсивность ПОЛ в крови и структурно-функциональные свойства эритроцитов эксперименте и у больных ИБС при ГБО-терапии. Ростов-на-Дону, 1995. – 24 с. 27. Гаврилов О.К. Клетки костного мозга и периферической крови / О.К. Гаврилов, Г.И. Козинец, Н.Б. Черняк – М. : Медицина. – 1985. – 288 с. 28. Голованова Е.Д., Осипова Т.В., Салаш О.Б.. Факторы риска сердечно- сосудистых заболеваний и темп старения в зрелом возрасте // Клиническая геронтология. – 2005. - №11. – С.26-30. 29. Гурман В.Е. Теория вероятностей и математическая статистика: Учебное пособие для вузов.- 10-е издание, стереотипное. – Москва: Высшая школа. – 2004. – 479 с. 30. Гусев В. А. Свободнорадикальная теория старения в парадигме геронтологии // Успехи геронтологии. – 2000. –Вып. 4. –С. 41–49. 31. Гусев Е.И., Шимригк Г., Хаас А., Гехт А.Б., Боголепова И.Н., Доржиева Н.Н., Галанов Д.В. Банк данных по ишемическому инсульту – основные результаты // Неврологический журнал. – 2002. – Т.7. – № 4. – С. 8-12. 152 32. Гуськов Е.П., Шкурат Т.П., Вардуни Т.В. и др. Генетика окислительного стресса. – Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВЩ ЮФУ. – 2009. – 156 с. 33. Дедов И.И. Алгоритмы специализрованной медицинской помощи больным сахарным диабетом. – изд. 4-ое доп., 4-й выпуск / под ред. И.И. Дедова, М.В. Шестаковой. – М.: Информполиграф. – 2009. – 103 с. 34. Дедов И.И. Новости IV Всероссийского Диабетологического конгресса. // Сахарный диабет. – 2008. - №2 (39). – С.93-96. 35. Дедов И.И. Сахарный диабет в пожилом возрасте: диагностика, клиника. Лечение. Практическое руководство для врачей / Под ред. И.И. Дедова, М.В. Шестаковой. – М.: Медицинское информационное агентство. – 2011. – 79 с. 36. Дедов И.И., М.И. Балаболкин, Г.Г. Мамаева Е.М. Клебанова, В.М. Креминская. Инсулиновая резистентность и роль гормонов жировой ткани в развитии сахарного диабета. Пособие для врачей. М.: Министерство здравоохранения и социального развития РФ, ГУ эндокринологический научный центр. – 2005. – 88 с. 37. Дедов И.И., Шестакова М.В. Алгоритмы специализированной медицинской помощи больным сахарным диабетом. М.: Министерство здравоохранения и социального развития РФ, ГУ эндокринологический научный центр. – 2013. –120 с. 38. Дедов И.И., Шестакова М.В. Сахарный диабет. Руководство для врачей. М.: Универсум Паблишинг. –2003. – 455 с. 39. Дедов И.И., Шестакова М.В., Максимова М.А. Федеральная целевая программа «Сахарный диабет». Методические рекомендации. М.: Медиа Сфера. – 2002. – 88 с. 40. Дедов И.И.. Шестакова М.В., Аметов А.С., Анциферов М.Б., Галстян Г.Р., Майоров А.Ю., Мкртумян А.М., Петунина Н.А., Сухарева О.Ю. Проект «Консенсус совета экспертов Российской ассоциации эндокринологов (РАЭ) по инициации и интенсификации сахароснижающей терапии сахарного диабета 2 типа» // Сахарный диабет. – №1. – 2011. – С.95-105. 153 41. Дементьева, И.И. Клинические аспекты состояния и регуляции кислотно- основного гомеостаза. М.: Юнимед. – 2002. – 80 с. 42. Демидова И.Ю., Глинкина И.В., Перфилова А.Н.. Сахарный диабет типа 2 (патогенез и лечение) // CONSILIUM-MEDICUM. – Том 2. –№ 5. – 2000. – С.25-32 43. Джанашия П.Х., Мирина Е.Ю. Нарушение липидного обмена при сахарном диабете 2 типа и варианты его коррекции. – Русский медицинский журнал. - 2008. - Т.16 - №11.- С.1156-1567. 44. Дильман В.М. Четыре модели медицины. М.: Медицина. –1987. – 288 с. 45. Древаль А.В., Мисникова И.В., Барсуков И.А., Пончакова Г.В., Кузнецов А.В. Распространенность сахарного диабета 2 типа и других нарушений углеводного обмена в зависимости от критериев диагностики/ Сахарный диабет. – №1. – 2010. –С.116-121. 46. Езерский Р.Ф. Активность сывороточной фосфогексокиназы – новый клинический тест // Лабораторное дело. – 1960. – №4. – С.15. 47. Захарьин Ю.Л. Метод определения активности глюкозо-6- фосфатдегидрогеназы // Лаб. дело. – 1967. – № 6. – С. 327-330. 48. Зеленина Т.А., Ворохобина Н.В., Малыгина О.Ф. Нарушение метаболических процессов у женщин, страдающих сахарным диабетом 2-го типа в постменопаузе // Эфферентная терапия. – 2007 г. – Том 13. – №1. – С.23-25. 49. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс. Биохимический и патофизиологический аспекты. М.: Наука/Интерпериодика. – 2001. – 340 с. 50. Зиятдинова Г.К., Будников В.М., Погорельцев В.И. Оценка интегральной антиоксидантной емкости плазмы крови по ее реакции с супероксидным анионрадикалом // Клиническая лабораторная диагностика. – 2005. – № 6. – С. 12-15. 51. Калинина Е.В. Роль окислительного стресса и глутатион-зависимых процессов в развитии клеточной лекарственной устойчивости и при терапии ряда заболеваний: дис. ... докт. биол. наук, Москва. – 2009. – 230 с. 52. Камбачокова З.А. Значение малонового диальдегида в плазме крови у больных пищевыми токсикоинфекциями. II конференция «Современные 154 медицинские технологии» (диагностика, терапия, реабилитация) // Фундаментальные исследования. – 2005. – №5. – С. 55-56 53. Каменева Е.А., Захарьина О.А., Бабаева А.Р. Сывороточные гликозамины и антитела к ним как маркеры сосудистых поражений при сахарном диабете //Вестник ВолГМУ. – 2008. – Т.26. – №2. – С. 50-53. 54. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. Минск: Беларусь. – 2000. – Т.2. – 462 с. 55. Каракашов А.В. Микрометоды в клинической лаборатории./А.В. Каракашов, Е.П. Вичев. София: медицина и физкультура. – 1968. – 256 с. 56. Кендыш И.И. Регуляция углеводного обмена. - М.: Медицина. – 1985 – 272 с. 57. Кленова Н.А. Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в различных условиях функционирования: дис. докт. биол. наук. – Самара. – 2003. – 271 с. 58. Клиорин А.И., Тиунов Л.А. Функциональная неравнозначность эритроцитов. Ленинград : Наука.– 1974. – 148 с. 59. Козлова Н.М., Катосова М.А. Эффект окисленного и восстановленного глутатиона на структуру мембраны эритроцитов // Биофизика.– 2001. –Т.46. – №3. – С.467-470. 60. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы /М.А. Королюк, Л.И. Иванова, И.Г. Майорова, В.Е. Токарев // Лаб. дело. – 1988. - № 1. – С. 16-19. 61. Крутько В.Н., Смирнова Т.М. Анализ тенденций смертности и продолжительности жизни населения России в конце XX века. Национальный геронтологический центр. М.:Едиториал УРСС. –2002. – 48 с. 62. Крыжановский Г.Н. Дизрегуляционная патология. М.: Медицина – 2002г. – 630 с. 63. Кулинский В.И. Биохимические аспекты воспаления // Биохимия. – 2007. – Т. 72. – С. 733-746; 64. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Биологическая роль глутатиона // Успехи соврем. биологии. – 1990. – Т. 110. – Вып. 1. – С. 20-33. 155 65. Кулинский В.И., Колесниченко Л.С. Глутатион митохондрий// Биохимия – 2007.– №7. – С.856– 859. 66. Кураева Т.Л., Зильберман Л.И., Титович Е.В., Петеркова В.А. Генетика моногенных форм сахарного диабета // Сахарный диабет. – 2011. – №1. – С. 20– 27. 67. Лазебник Л.Б. Полиморбидность и старение // Клиническая геронтология. – 2005. - №12. – С.16-22. 68. Ланкин, В.З. Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М.: Наука. – 1991. – С. 75-95. 69. Липунова Е.А., Скоркина М.Ю. Система красной крови: Сравнительная физиология. Белгород: Изд-во БелГУ, 2004. – 216 с. 70. Лисовский В.А., Кидалов В.Н., Гущ В.В. Трансформация эритроцитов как диагностический тест в клинической практике // Лабораторное дело. – 1986. – № 10. – С. 594– 598. 71. Луганова И.С., Розанова Л.М., Сейц И.Ф. Дыхание, гликолиз и синтез гликогена в костном мозгу человека // Биохимия. – 1964. – Т.22. – С.22-28. 72. Луганова, И.С. Определение 2,3-ДФГ неэнзиматическим методом и АТФ в эритроцитах больных хроническим лимфолейкозом / И.С. Луганова, М.Н. Блинов // Лаб. дело. – 1975. – № 7. – С. 652-654. 73. Майоров А.Ю. Инсулинорезистентность в патогенезе сахарного диабета 2 типа // Сахарный диабет. – 2011. – №1. – С. 35-43. 74. Маколина Н.П., И.И. Клефортова, М.Ш. Шамхалова, М.В. Шестакова. Экономические аспекты сахарного диабета и его осложнений // Сахарный диабет. – 2008. - №2 (39). – С.70-76. 75. Манушарова Р.А., Черкезова Э.И. Сахарный диабет 2 типа у женщин в постменопаузе // Русский медицинский журнал. – 2006. – Т.14. – №6. – С.464 – 467. 76. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука. – 1981. – 278 с. 156 77. Мельников, А.П. Диагностическое и прогностическое значение исследования параметров системы гемостаза у рожениц с пороками сердца и их плодов: дис….канд. мед. наук. – М. – 1998. – 163 с. 78. Меньшиков, В.В. Лабораторные методы исследования в клинике : справочник. М. : Медицина. – 1987. – С. 110 - 111. 79. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых Н.Ф., Труфакин В.А. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. – М.: «Слово». – 2006. – С. 576. 80. Микашинович З.И. Метаболические аспекты внутриутробной гипоксии плода при сердечно-сосудистой патологии у беременных. З.И. Микашинович, Е.В. Олемпиева, С.В. Шлык. – Ростов-на-Дону. – 2008. – 156 с. 81. Микашинович З.И. Динамика показателей углеводного, липидного обмена и транспорта кислорода кровью у больных ишемической болезнью сердца на фоне лечения бета-адреноблокаторами и антагонистами кальция / З.И. Микашинович Е.В. Порохня, С.В. Шлык // Труды IV научной сессии Ростовского государственного медицинского университета. – Ростов-на-Дону. – 2004. – С. 260261. 82. Микашинович З.И. Общие и частные закономерности изменений метаболизма в эндокринных органах и крови при разной тяжести травматического шока и острой кровопотери : дисс. … докт. биол. наук. Ростов н/Д. – 1989. – 404 с. 83. Микашинович З.И. Протеолитические системы крови при патологических состояниях разного генеза / З.И. Микашинович, Е.А. Черногубова. – Ростов-наДону, 2007. – 23 с. 84. Мисникова И.В., Древаль А.В., Барсуков И.А. Новый подход к проведению скрининга для выявления ранних нарушений углеводного обмена. Проблемы эндокринологии. №1. 2011. Стр. 80-85. [сайт]:URL: http://www.mediasphera.ru/uppic/Problems%20of%20endocrinology/2011/1/11/PEKR _2011_01_80.pdf. 85. Моин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах // Лаб. дело. – 1986. – № 12. – С. 724– 727. 157 86. Моисеева О.И. Транспорт кислорода кровью (роль эритроцитов) // Физиол. журн. СССР им. Сеченова. – 1986. – №1. – С. 93-103. 87. Молитвословова Н.А., Никононова Т.В./Сахарный диабет 2 типа, склонный к кетозу // Сахарный диабет. – №3. – 2009. – С.65-69. 88. Москалѐв А.А. XIX Всемирный геронтологический конгресс, 5-9 июля 2009. Париж. Франция. Вестн. геронтологического общества РАН. Информационный бюллетень №8 - 9 (131-132), июль-август, 2009 – С.1-4: [сайт]. URL:http://www.gerontology.ru/PDF_VGO/Vestnik_2009_8-9_131-132.pdf). 89. Мурадян Х. К. Коррелятивные связи между активностью супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионпероксидазы печени мышей // Укр. біохім. журн. - 2003. - Т. 75.– № 1. – С. 33-37. 90. Недосугова Л.В. Окислительный стресс при сахарном диабете типа 2 и возможности его медикаментозной коррекции. дис. … докт. мед. наук. М. – 2006. – 356 с. 91. Недосугова Л.В. Современная стратегия сахароснижающей терапии при сахарном диабете типа 2 роли и место комбинированной терапии // Российский медицинский журнал. – 2013. – №12. – с.668. 92. Николаев А.Я. Биологическая химия. М.: Медицинское информационное агентство. – 2004. – с. 566. 93. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. и др. Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при патологии разного генеза являются типовой реакцией организма: контуры проблемы // Бюллетень сибирской медицины. – 2006. – №6. – С. 42-69. 94. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. – Томск: изд-во Том. Ун-та. – 2004. – 202 с. 95. Овчаренко В.А., Лукьянова И.Е.. Антропология: учебное пособие. М: ИНФРА-М. – 2008. – 120с. 96. Олемпиева Е.В. Кислородзависимые процессы, спектр липопротеидов в пуповинной крови при внутриутробной гипоксии : дис. …канд. мед. наук. – Ростов-на-Дону. – 2004. – 146 с. 158 97. Олемпиева Е.В. Клинико-диагностическое значение биохимических маркеров в диагностике сердечно-сосудистых заболеваний у беременных женщин : дис. … докт. мед. наук. Ростов-на-Дону. – 2009. – 322 с. 98. Павлюченко И.И. Окислительный стресс, его мониторинг и критерии оценки антиокислительной активности лекарственных препаратов и БАД: дис. …докт. мед. наук. Ростов-на-Дону. – 2005. – 309 с. 99. Пальцев М. А., Кветной И. М., Полякова В. О., Кветная Т. В., Трофимов А. В. Нейроиммуноэндокринные механизмы старения // Успехи геронтологии. – 2009. – Т.22. – №1. –С.24-36. 100. Пескин A.B. Взаимодействие активного кислорода с ДНК // Биохимия. – 1997. – Т. 62. – Вып. 12. – С. 1571-1578. 101. Пицура Н.И. Психосоматический статус и метаболические изменения в крови под влиянием комплексной терапии у больных генитальным эндометриозом : дисс. …канд. мед. наук – Ростов-на-Дону. – 1998. – 159 с. 102. Пишак В.П. Ускоренное старение: механизмы, диагностика, профилактика // Вестник геронтологического общества РАН. Информационный бюллетень №1011 (133-134). – сентябрь-октябрь, 2009. – С.4-5. 103. Подачина С.В., Мкртумян А.М. Мильгамма композитум – препарат выбора в лечении диабетической нейропатии // Российский медицинский журнал. – №28. – 2008. – С. 1887. 104. Попова И.А., Преснова В.Н., Лавринова Г.П. Влияние биогенных аминов на деградацию гликогена в изолированных гепатоцитах крыс. // Вопросы медицинской химии –1992. –Т.38. – №2. – С. 30-32. 105. Потемкин В.В. Эндокринология. М.: Медицина. – 1986. – 432 с. 106. Применение методов статистического анализа для изучения общественного здоровья и здравоохранения / Под ред. чл.-корр. РАМН, проф. В.З. Кучеренко. М., "Гэотар-Медиа".– 2007. – 256 с. 107. Резолюция № A/RES/61/225 «Всемирный день борьбы с диабетом» 61-й сессии Генеральной Ассамблеи Организации Объединѐнных Наций от 20 декабря 159 2006г. [Электронный ресурс]. Женева, 2006-2007. URL: http://www.un.org/ru/ga/61/docs/61res_nocte.shtml. 108. Руководство к практическим занятиям по клинической лабораторной диагностике // Под ред. М.А. Базарова. — Киев. – 1988. – С. 22– 23. 109. Руководство к практическим занятиям по клинической лабораторной диагностике // Под ред. М.А. Базарова. – Киев. – 1988. – С. 22-23. 110. Рябов, Г.А. Гипоксия критических состояний. М. : Медицина. – 1988. – 288 с. 111. Рязанцева Н.В. Типовые нарушения молекулярной организации мембраны эритроцита при соматической и психической патологии // Успехи физиологических наук. – 2004. – Т.35, №1. – С. 53-65. 112. Саркисян, О.Г. Особенности изменений метаболических процессов при атрофических кольпитах и их коррекция : дисс. …канд. мед. наук . Ростов-наДону. – 2000. – 125 с. 113. Сарычева, Т.Г. Морфофункциональная характеристика эритрона в норме / Т.Г. Сарычева, Г.И. Козинец // Клиническая лабораторная диагностика. – 2001. – № 5. – С. 3-7. 114. Сахарный диабет: диагностика, лечение, профилактика. Под ред. И.И. Дедова, М.В. Шестаковой. М.: Медицинской информационное агентство МИА. – 2011. – С. 111-123. 115. Сидоров И. В. Активные формы кислорода в окислительных процессах у животных и защитная регуляторная роль биоантиоксидантов / И. В. Сидоров, Н. А. Костромитинов // Сельскохоз. биология. – 2003. – № 6. – С. 3-14. 116. Скулачѐв В.П. Запрограммированная клеточная смерть как мишень борьбы со старением организма // Успехи геронтологии. – 2009. – Т. 22. – №1. – С. 37-43. 117. Сметник В.П., Ильина Л.М.. Практические рекомендации: ведение женщин в пери- и постменопаузе . Ярославль: ИПК «Литера» – 2010. – С. 222. 118. Смирнова О.М., Никонова Т.В. Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита при сахарном диабете / Под ред. И.И. Дедова. М: Медицина. – 2003. – 40 с. 160 119. Смирнова О.М., Никонова Т.В. Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита при сахарном диабете / Под ред. И.И. Дедова. М: Медицина. – 2003. – 40 с. 120. Соколовский В. В. Возрастные и органотканевые особенности состояния антиоксидантной системы белых крыс / В. В. Соколовский, В. Г. Макаров, В. М. Тимофеева // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. – 1988. – Т. 24, № 5. – С. 771– 774. 121. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифической реакции организма на экстремальное воздействие / В.В. Соколовский // Вопросы медицинской химии. – 1988. – №6. – С. 2-11. 122. Стальная И.Д. Современные методы в биохимии / И.Д. Стальная, М.Г. Гаришвили. – М.: Медицина. – 1977. – С. 66-68. 123. Сторожук А.П. Биологическая роль активных форм кислорода при физиологически и патологически протекающей беременности: дис… докт. мед. наук . Краснодар.– 2004. –257 с. 124. Сунцов Ю.И. Диабет: скрытая пандемия и ее влияние на Россию// Международный форум «Объединимся для победы над диабетом». Москва, 27 ноября 2008 года. 125. Сунцов Ю.И. Современные сахароснижающие препараты, используемые в России при лечении сахарного диабета 2 типа // Сах. диабет. – 2012. – № 1. – С. 6– 10. 126. Сунцов Ю.И., Болотская Л.Л., Маслова О.В., Казаков И.В. Эпидемиология сахарного диабета и прогноз его распространенности в Российской Федерации // Сахарный диабет. – 2011. - №1. – С.15-18. 127. Терентьев В.П. Метаболические, гемореологические и функциональные адаптационные механизмы сердечно-сосудистой системы у больных повторным инфарктом миокарда: дисс….д-ра мед. наук – Ростов-на-Дону. – 1997. – 349 с. 128. Титова Н.М., Савченко А.А., Замай Т.Н и др. Биохимия и молекулярная биология. Версия 1.0 [Электронный ресурс]: http://files.lib.sfu-kras.ru/ebibl/umkd/175/u_lectures.pdf. конспект лекций URL: 161 129. Тихонов Е.Г. Содержание 2,3-дифосфоглицерата, АТФ, гемоглобина и его дериватов в эритроцитах крови женщин при физиологическом и осложненном поздним токсикозом течении беременности / Е.Г. Тихонов, Л.И. Мерекина, А.Н. Солуянов и др. // Вопросы охраны материнства и детства. – 1985. – Т. 30. – № 7. – С.13-16. 130. Тодоров И.Н., Тодоров Г.И. Стресс, старение и их биохимическая коррекция, М.: Наука, 2003. – 479 с. 131. Фадеева Н.И. Влияние состояния антиоксидантной защиты на частоту развития и течение диабетической ангиопатии. дис. … канд. мед. наук. М. – 2000. 132. Федорова М.В. Состояние углеводного обмена в системе мать-плод в норме и при гипоксии / М.В. Федорова, Г.Ф. Быкова, Г.Д. Дживелегова // Акушерство и гинекология. – 1980. –№8. – С. 7– 11. 133. Федорова Т.Н. Окислительный стресс и защита головного мозга от ишемического повреждения. дис. ... докт. биол. наук . Москва. – РАМН, НИИ неврологии. – 2004. – 298 с. 134. Фролькис В.В. Стресс-возраст синдром // Физиол. журнал. – 1991. – Т.37. – №3. – С.3-11. 135. Хавинсон В.Х., Баринов В.А., Арутюнян А.В., Малинин В.В. Свободнорадикальное окисление и старение. – СПб : Наука. – 2003. – 327 с. 136. Хрисанфова Е.Н., Перевозчиков И.В. Антропология. – М.: Высшая школа. – 2002. – 230 с. 137. Чазова И.Е., Сметник В.П., Балан В.Е. и соавт. Ведение женщин с сердечнососудистым риском у женщин в пери- и в постменопаузе: Консенсус российских кардиологов и гинекологов // Consilium Medicum 2008. – №10. – 18 С. 138. Черных С.И. Новые аспекты в изучении роли гормона роста человека в регуляции процессов роста и развития // Научн.–практ. журн. «Медичний Всесвіт». – 2003. – Т. III. – № 2. – С. 15–19. 139. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Молекулярно-клеточные механизмы инактивации свободных радикалов в биологических системах // Фундаментальные исследования. – 2006. – № 7 – С. 29-36. 162 140. Шабалин В.Н., Васильчиков В.М. Руководство по геронтологии (под редакцией В.Н. Шабалина). М.: Цитадель-трейд. – 2005. – с. 766-781. 141. Шаповал Г.С. Механизмы антиоксидантной защиты организма при действии активных форм кислорода/Г.С. Шаповал, В.Ф. Громовая//Укр. биохим. журн. – 2003. – Т.75. – №2. – С.5– 11. 142. Шарман А., Жумадилов Ж. Научные основы качественного долголетия и антистарение. Нью-Йорк: Mary Ann Liebert, Inc, liebertpub.com.. – 2011. – 200 с. 143. Шлык С.В. Функциональные взаимосвязи гемодинамики, обмена форм воды и транспорта кислорода в крови у больных с различным клиническим течением инфаркта миокарда: дис… канд. мед. наук. Ростов-на-Дону. – 1992. – 138 с. 144. Шпектор В.А. Гипоксия // Вестник интенсивной терапии. – 2007. – №2. – С. 49-51. 145. Шперлинг И.А., Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., Рогов О.А., Филиппова О.Н. «Новый подход к определению интенсивности внутрисосудистого гемолиза» // Сибирский медицинский журнал. – Том 21. – №1. – 2006 г. 146. Щербаченко И.М. Модифицированные окислением эритроциты как экспериментальная модель для оценки активности антиоксидантов: дис. ... канд. биол. наук. М.: РАМН, Гос. учреждение гематологический научный центр. – 2008. – 109 с. 147. Юсупова Л.Б. О повышении точности определения активности глутатионредуктазы эритроцитов // Лаб. дело. – 1989. – № 4. – С. 19-21. 148. AACE Menopause Guidelines Revision Task Force / American Association of Clinical Endocrinologists medical guidelines for clinical practice for the diagnosis and treatment of menopause // Endocr. Pract. – 2006; 12:315- 337. [сайт]. URL: https://www.aace.com/. 149. Adelman R. C. Definition of biological aging II Second Conference on the Epidemiology of Aging / Eds S. G. Haynes, M. Feinleib. Washington, DC: National Institute of Health; 1980. P. 9-13. NIH Publication 80-969. 163 150. American Diabetes Association. Standards of Medical Care in Diabetes. Diabetes Care 2005; 28 (Suppl 1): S4-S36. 151. American Diabetes Association. Standarts of Medical Care in Diebetes – 2010 // Diabetes Care. -2010. – Vol. 33, Suppl. 1. – P. S11-S61. 152. American Diabetes Association. Type 2 diabetes in children and adolescents. Diabetes Care, 2000; 23, Р. 381–389. 153. Annette M. Chang and Jaffrey B. Halter. Aging and insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol. Metab. - 2003; 284: E7-E12. 154. Arrigo A-P. Gene expression and thiol redox state / A-P. Arrigo // Free radic. Biol. Med. - 1999. - № 27. - P. 936-944. 155. Atsma F., Bartelink M.L., Grobbee D.E., Van der Schow Y.T.: Postmenopausal status and early menopause as independent risk factors for cardiovascular disease: a meta-analysis // Menopause. – 2006. – Vol. 13, N 2/ - P. 265-279. 156. Aydin A., Orhan H., Sayal A., Ozata M., Sahin G., Isimer A. Oxidative stress and nitric oxide related parameters in type II diabetes mellitus: effects of glycemic control // Clinical Biochemistry. – 2001; 34: 65-70. 157. Bacus J.W. Quantitative morphological analysis of red blood cells. / J.W. Bacus // Blood Cells. – 1981. – N 6. – P. 259-314. 158. Balkau B., Hillier T., Vierron E., D’Hour A., Lépinay P., Royer B., Born C. Comment to: Borch-Johnsen K., Colagiuri S., Balkau B., et al. (2004): Creating a pandemic of prediabetes: the proposed new diagnostic criteria for impaired fasting glycaemia // Diabetologia. – 2005. – Vol. 48. – Р. 801 – 802. 159. Barrett T.G., Bundey S.E., Macleod A.F. Neurodegeneration and diabetes: UK nationwide study of Wolfram (DIDMOAD) syndrome // Lancet. - 1995. - № 346. - P. 1458-1463. 160. Baynes J.W., Thorpe S.R. Role of oxidative stress in diabetic complications : a new perspective on an old paradigm. // Diabetes. – 1999. – Vol. 48, № 1. – P. 1-9. 161. Bell G. I. Molecular defects in diabetes mellitus // Diabetes. – 1991. - V. 40 - P. 413-422. 164 162. Benkimoun P. L'insulinosecretion dans le DNID. J. Int. Med., 1991, No 203, Р.12; 10. Porte D. B-Cells in Type II diabetes mellitus. Diabetes. - 1991 - V. 40, No2 - P. 166-180. 163. Brandenburg, Dietrich. History and Diagnostic Significance of C-Peptide //Hindawi Publishing Corporation - Experimental Diabetes Research - Volume 2008 Article ID 576862 - 7 pages. doi:10.1155/2008/576862. 164. Calisti L., Tognetti S., Measure of glycosylated hemoglobin. Acta Biomed Ateneo Parmense. - 76 Suppl 3:59-62 - 2005. 165. Cerami A. Hypothesis: glucose as a mediator of aging. //J. Am. Geriatr. Soc.1985.- V. 33. -P. 626-634. 166. Claire E. Hills and Nigel J. Brunskill. Intracellular Signalling by C-Peptide // Experimental Diabetes Research. - Volume 2008. - Article ID 635158, 8 pages. doi:10.1155/2008/635158. 167. Clark A., Wells С. А., Byley I. D., et al. Islet amyloid, increased A-celIs, reduced В-celIs and exocrine fibres is: quantitative changes in the pancreas in type 2 diabetes. Diabetes Res. – 1988 - No У, Р. 151-159. 168. Crack P.J. Glutathione peroxidase-1 contributes to the neuroprotection seen in the superoxide dismutase-1 transgenic mouse in response to ischemia/reperfiision injury / P.J. Crack, J.M. Taylor, J.B. Haan, I. Kola// J Cereb. Blood Flow Metab. 2003; 23(1): 19–22. 169. De Haan J. B., Cristiano F., Ianello R. C., Kola I. Cu/Zn-superoxide dismutase and glutathione peroxidase during aging // Biochem. Mol. Biol. Inter. 1995. Vol.35. P. 1281-1297. 170. Deb A.C. Fundamentals of biochemistry / A.C. Deb. – Kolkata (India): New central book agency (P) LTD, 2004. – 848 p. 171. Dekker J.M., Balkau B. Counterpoint: Impaired Fasting Glucose: The Case Against the New American Diabetes Association Guidelines // Diabetes Care. – 2006. – 29. – Р. 1173–1175. 165 172. Dhaunsi G.S., Hugou I., Hanevold C. Peroxisomal participation in the cellular response to oxidative stress of endotoxin // Molec.cell.biochem. – 1993 - vol.126. - p. 25-35. 173. Duhm J., Gerlach E. On the mechanisms of the hypoxia-induced increase 2,3diphosphoglycerate in erythrocytes. Studies on rat erythrocytes in vivo and human erythrocytes in vitro // Pfliigers Arch. – 1971 - v.326 - F.3, S.254. 174. Dupuy C., Ohayon R., Valent A., Noel-Hudson M.S., Deme D., and Virion A. Purification of a novel flavoprotein involved in the thyroid NADPH oxidase. Cloning of the porcine and human cDNAs // J. Biol. Chem. – 1999. - 274. - P. 37265 – 37269. 175. Dyce B.J., Bressman S.P. A rapid nonenzyraatic assay for 2,3 - DPG in muetiple specimens of blood // Arch. Environ. Health. – 1973. - V.27. - p. 112-116. 176. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. / G.L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. – 1959. – Vol.82. – P. 70-77. 177. European Diabetes Policy Group. Guidelines for a desktop guide to Тype 2 diabetes Мellitus, 1998-1999, International Diabetes Federation European Region. 1998 - 1999; 16:1-21: [Электронный ресурс]. URL: http://www.voed.ru/fcp_sd.htm). 178. Evans J.L., Goldfine I.D., Maddux B.A., Grodsky G.M. Oxidative stress and stress-activated signaling pathways: a unifying hypothesis of type 2 diabetes// Endocrine Reviews. – 2002; 23(5): 599-622. 179. Fagot-Campanga A., Pettitt D.J., Engelgau M.M. et al. Type 2 diabetes among North American children and adolescents: an epidemiological review and public health perspective // J. Pediatr. – 2000 - 136, Р. 664–672. 180. Fedor F. Severin, Margarita V. Meer, Ekaterina Smirnova, Dmitry Knorre and Vladimir P. Skulachev. 2008. Natural causes of programmed death of yeast Saccharomyces cerevisiae // Biochimica et biophysica acta. – 2008 – Vol. 1783, N 7. – P. 1350-1353. 181. Fuchs J.U. Potential and limitations of the natural antioxidants RRR-alphatocopherol, L-ascorbic acid and P-carotene in cutaneous photoprotection//Free Radic. Biology & Medicine.-1998.-Vol.25, N 7.-P. 848-873. 166 182. Furling D. Impairment of synaptic transport by transient hypoxia in hippocampal slices: Improved recovery in glutathione peroxidase transgenicmice / D.Furling, O.Ghribi, A.Lahsaini, M.Mirault, G.Massicotte // PNAS. - 2000. Vol.97, №8. - P.43514356. 183. Garvey W.T., Olefsky J.M., Matthaei S. Glucose and insulin co-regulare the glucose transport system in primarary cultured adipocytes: a new mechanism of insulin resistance // J. biol.Chem - 1988. - Vol. 262. - p. 189-194. 184. Genazzani A., Gambacciani M. Effect of climacteric transition and hormone replacement therapy on body weight and body fat distribution. Gynecol Endocrinol 2006; 22:145-50. 185. Gonen B.A., Rubinstein A.H., Rochman H. et al. Hemoglobin A1: An Indicator of the Metabolic Control of Diabetic Patients. // The Lancet 1977, Oct 8; 2(804): 734-7. 186. Gurdol F. Changes in enzymatic antioxidant defence system in blood and endometral tissues of women after menopause / F. Gurdol, Y. Oner-Yyidothan, O. Yalcyn, S. Genc, F. Buyru // Research Communications in Molecular Pathology and Pharmacology. – 1997. – Vol.97, №1. – P. 38-46.. 30. 187. Harman D. The aging process: major risk factor for disease and death // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. - P. 5360-5363. 188. Hayflick L. The not-so-close relationship between biological aging and ageassociated pathologies in humans //J. Gerontol. Biol.Sci.- 2004.- V.59A.- P.547-550. 189. Hemoglobin Alc as an Indicator of the Degree of Glucose Intolerance in Diabetes, Diabetes 25(3):230-2, 1976. 190. IDF Diabetes atlas. Forth edition, 2009 [Электронный ресурс]. URL: http://www.idf.org/diabetesatlas. 191. Jadhav G.K. Possible role of glutathione in predicting radiotherapy response of cervix cancer / G.K. Jadhav, P. Bhanumathi, P. Uma Devi, T. Seetharamaiah, M.S. Vidyasagar // International J. of Radiation Oncology, Biology, Physics. – 1998. – Vol.41, №1. – P. 3-5. 167 192. Johnson K. H., O.Brien T. D., Westermark P. Newly identified pancreatic protein islet amyloid polypeptide. What is its relationship to diabetes? Diabetes, 1991, V.40, No3, P. 310-314. 193. Kloppel G., Lohr M. Oberholzer M., Heitz P.I. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited // Surv. Synth. PathoL Res. - 1985 - No4, P.110-125. 194. Kristal B.S., Yu B.P. An emerging hypothesis: synergistic induction of aging by free radicals and Maillard reactions. // J. Gerontol.- 1992.- V.47.- N4. -Р. B107-В114. 195. Kumar, A. Decreased plasma glutathione in cancer of the uterine cervix / A. Kumar, S. Sharma, C.S. Pundir, A. Sharma // Cancer letters. – 1995. – Vol.94, №1. – P. 107-111. 196. Kuusisto J., Mykkanen L., Pyorala K., Laakso M. NIDDM and its metabolic control predict coronary heart disease in elderly subjects. Diabetes 1994; 43: 960-7. MEDLINE. 197. Kuusisto J., Mykkanen L., Pyorala K., Laakso M. Non-insulin-dependent diabetes and its metabolic control are important predictors of stroke in elderly subjects. Stroke 1994; 25: 1157-1164. MEDLINE. 198. Lander H.M. An essential role for free radicals and derived species in signal transduction//FASEB J. – 1997. - 11. – P. 118 – 124. 199. Liu H. Glutathione metabolism during aging and in Alzheimer disease / Liu H., Wang H., Shenvi S., Hagen T.M., Liu R.M. // Ann. N. Y. Acad. Ski. -2004. V.1019. P.346-349. 200. Lo Y.Y. and Cruz T.F. Involvement of reactive oxygen species in cytokine and growth faktor induction of c-fos expression in chondrocytes// J. Biol. Chem. - 1995. 270. – P. 11727 - 11730. 201. Lustman P.J., Clouse R.E. Depression in diabetic patients: the relationship between mood and glycemic control. J.Diabet. Complicat. 2005; 19(2): 113-122. 202. Maassen J.A., Kadowaki T. Maternally inherited diabetes and deafness: a new diabetes subtype // Diabetоlogia. - 1996. - P. 375-382. 168 203. Memisogullari R., Taysi S., Bakan E., Capoglu I. Antioxidant status and lipid peroxidation in type II diabetes mellitus // Cell Biochem Funct 2003; 21: 291-296. 204. Mercuri F., Quagliaro L., Ceriello A. Oxidative stress evaluation in diabetes // Diabetes Technol. Ther. – 2000. - vol. 2. - p. 589-600 205. Misra H.P. The univalent reduction of oxygen by reduced flavins and quinines / H.P. Misra, I. Fridovich // The J. of Biol. Chem. – 1972. – Vol. 247. № 1. – P. 188-192. 206. Munday R., Winterboume C.C. Reduced glutathione in combination with superoxide dismutase as an important biological antioxidant defense mechanism//Biochem. Pharmacol. - 1989. - Vol. 38. - p. 4349-4352. 207. Nathan D.M., Buse J.B., Davidson M.B., Ferranini E., Holman R.R., Sherwin R., Zinman B. American Diabetes Association; European Association for the Study of Diabetes. Medical management of hyperglycemia in type 2 diabetes: a consensus algorithm for the initiation and adjustment of therapy. A consensus statement of the American Diabetes Association and the European Association for the Study of Diabetes // Diabetes Care. - 2009. - № 32. - Р. 193-203. 208. Nuttall S.L., Martin U., Hutchin T. Increased oxidative stress in ageing and agerelated diseases // Age and ageing. - 1998. - Vol.27, Suppl.1. - P. 34. 209. Pasaoglu H., Sancak B., Bukan N. Lipid peroxidation and resistance to oxidation in patients with type 2 diabetes mellitus // Tohoku J Exp Med. - 2004; 203: 211-218. 210. Pinhas-Hamiel O., Zeitler P. The global spread of type 2 diabetes in children and adolescents // J. Pediat. - 2005. - 146 - Р. 693–700. 211. Rapopor J. PH-Dependent changes of 2,3-bisphosphoglucerate. / J. Rapoport, Н. Berger, R. Elsher, S.M. Rapoport // Acta. Biol. It med. Germ. – 1977. – Vol. 36, N 3-4. – P. 515-521. 212. Rossen P., Zink S., Tschope D. Vascular damage due to oxidative stress: a pathogenetic concept for diabetic macro- and microangiopathy // Structural and Functional Abnormalities in Subclinical Diabetic Angiopathy. - Basel. - 1992. - Vol. 22. – P.96. 169 213. Sell D.R., Lane M.A., Johnson W.A., et al. Longevity and the genetic determination of collagen glycoxidation kinetics in mammalian senescence. //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1996. - V. 93. -P. 485-490. 214. Smith E., Morowitz H.J. Universality in intermediary metabolism. Published online before print August 30, 2004, doi:10.1073/pnas.0404922101. - PNAS. September 7 – 2004. - vol. 101. - N. 36 – р. 13168 – 13173. [сайт]: http: //www.pnas.org/content/101/36/13168.full 215. Sountsov Y.I., Dedov I.I., Shestakova M.V. Screening of diabetes mellitus complication as a method to evaluate the quality of patient care / Ministry of Health and Social Development of the Russian Federation, FSE Research Centre of Endocrinology. — 2008. — P. 52. 216. Tasta V. Cellular and molecular mechanisma of haemoglobin swiching in man. / V. Tasta, W. Аirchenken, G. Saplio // Haematologica. – 1982. – Vol. 67. – N 1. – P. 64108. 217. Torrance J.D., Lenfant C Cruz J., Marticorena E. Oxygen transport mechanisms on residents at hich altitude. Respir. Physiol. - 1970/71 - V.11 - I 1, p. 1-15. 218. Tuyoshi Fujita. Human eiythrocyte bisphosphoglycerate mutase: Inactivation by glycation in vivo and vitro / Tuyoshi Fujita, Keiichiro Suzuki, Takakiyo Tada, et all. //J. Biochem. 1998. - Vol. 124, № 6. - P. 1237-1244. 219. Van Den Ouweland J., Lemkes H., Ruitenbeek W. et al. Mutation in mitochondrial tRNA(Leu)(UUR) gene in a large pedigree with maternally transmitted type II diabetes mellitus and deafness // Nat.Genet. - 1992. - № 1. - P. 368-371. 220. Viinamaki H., Niskanen L., Uusitupa M. Mental well-being in people with noninsulin-dependent diabetes // Acta Psychiatr Scand. - 1995. - № 92 (5). - P. 392-7. 221. Westermark P., Wernstedt C., Wilander E. The influence of amyloid deposits on the islet volume in maturity-onset diabetes mellitus. Diabetologia/ - 1978 - V.15. - P. 417-421. 222. Wood S.C. Intractions between hypoxia and hypothermia / S.C. Wood // Ann. Rev. Physiol. – 1995. – Vol. 53. – P. 71-85. 170 223. World Health Organization. Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications. Report of a WHO Consultation. Part 1: Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Geneva, Switzerland: WHO Department of Noncommunicable Disease Surveillance, WHO/NCD/NCS/99.2, 1999: 1-59 // WHO [Electronic Resource]. 2013. - URL:http://www.who.int. 224. World Health Organization. Screening for Type 2 Diabetes. Report of a World Health Organization and International Diabetes Federation meeting. WHO/NMH/MNC/03.1 Geneva: WHO Department of Noncommunicable Disease Management, 2003. [сайт]: URL:http://www.who.int.
