На правах рукописи - Воронежский государственный университет

На правах рукописи
Горбенко Марина Владимировна
ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИН - КОРРИГИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ – МЕЛАКСЕНА И
ВАЛЬДОКСАНА НА СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЙ ГОМЕОСТАЗ ПРИ СИНДРОМЕ
ТИРЕОТОКСИКОЗА
Специальность 03.01.04. - Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Воронеж - 2013
2
Работа
выполнена
в
Федеральном
государственном
бюджетном
образовательном учреждении высшего профессионального образования
«Воронежский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «ВГУ»)
Научный руководитель
доктор биологических наук, профессор
Попова Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты:
Наквасина Марина Александровна
доктор биологических наук, доцент,
ФГБОУ
ВПО
«Воронежский
государственный университет», биологопочвенный факультет, кафедра биофизики
и биотехнологии, профессор
Земченкова Ольга Владимировна
кандидат биологических наук,
ГБОУ ВПО «Воронежская государственная
медицинская
академия
имени
Н.Н.
Бурденко», кафедра биохимии, ассистент
Ведущая организация
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита диссертации состоится «23» декабря 2013 года в 15 часов на заседании
диссертационного совета Д.212.038.03 при Воронежском государственном
университете по адресу: 390006, Воронеж, Университетская пл., 1, ауд. 59.
Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Минобрнауки
Российской Федерации и на сайте Воронежского государственного
университета www.vsu.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке
Воронежского госуниверситета
Автореферат разослан «21» ноября 2013 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук
Грабович М.Ю.
3
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы. Одной из наиболее актуальных проблем
современной медицины являются заболевания щитовидной железы. Синдром
тиреотоксикоза, обусловленный гиперпродукцией гормонов щитовидной
железы, относится к одной из часто встречаемых эндокринопатий. При данном
заболевании из-за избытка тиреоидных гормонов (ТГ) происходят нарушения
функционирования сердечно-сосудистой, пищеварительной, центральной
нервной систем. Имеются данные, что ТГ в больших концентрациях
индуцируют окислительный стресс в печени, сердце и скелетной мускулатуре
крыс, что приводит к увеличению образования активных форм кислорода
(АФК) и интенсификации пероксидного окисления липидов (ПОЛ) (Vinditti P.,
2006). Избыточная генерация свободных радикалов (СР) ведет к повреждению
мембран, нарушению жизнедеятельности клеток и их апоптотической гибели
(Чеснокова Н.П., 2007). При этом важную роль играет активация
многоуровневой антиоксидантной системы (АОС) организма, включающей два
звена: ферментативное и неферментативное. Очевидно, актуальной задачей
является поиск лекарственных средств, способных влиять на процесс развития
оксидативного стресса при тиреотоксикозе.
В настоящее время повышается интерес к исследованию биологически
активных препаратов, способных активировать АОС и обладающих самих по
себе антиоксидантными свойствами. В связи с этим приобретает значение
исследование антиоксидантной активности мелаксена и вальдоксана. Мелаксен
является препаратом, имеющим в своем составе мелатонин. Это адаптогенный
препарат, синтезированный из аминокислот растительного происхождения.
Известно, что мелатонин – нейрогормон, продуцируемый у человека и других
позвоночных эпифизом, а также клетками диффузной эндокринной системы.
Этот гормон играет роль регулятора многих физиологических функций:
участвует в формировании суточных биоритмов, торможении некоторых
функций гипофиза, регуляции иммунных реакций, оказывает анальгезирующий
и седативный эффекты. Мелатонин можно рассматривать как наиболее
универсальный из биологических антиоксидантов, реализующий свою
активность путем различных механизмов: гормон обладает выраженной
способностью связывать СР, а также стимулировать определенные компоненты
АОС (Reiter R.J., 2007; Левин Я.И., 2012; Paulis L., 2007). Кроме того,
существуют препараты с мелатонинергическим типом действия. К ним
относится вальдоксан, действующим веществом которого является агомелатин.
Он является мощным лигандом мелатониновых рецепторов, а также относится
к антидепрессантам с инновационным механизмом действия (Kennedy S.H.,
2007; Dubovsky S.L., 2009; Kasper S., 2009). Данные препараты применяются с
профилактической и лечебной целью. Однако их влияние на
свободнорадикальный гомеостаз при синдроме тиреотоксикоза остается
невыясненным.
Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было
исследование воздействия мелатонин – корригирующих препаратов –
мелаксена и вальдоксана, на свободнорадикальный гомеостаз при
4
тиреотоксикозе в эксперименте на животных, а также при применении
мелаксена на фоне базисного лечения пациентов в клинических условиях.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследование влияния мелаксена и вальдоксана на показатели,
отражающие интенсивность свободнорадикальных процессов (СРП) в печени,
сердце и сыворотке крови крыс с экспериментальным гипертиреозом (ЭГ).
2. Оценка
активности
глутатионового
звена
АОС
(активности
глутатионредуктазы (ГР), глутатионпероксидазы (ГП), глутатионтрансферазы
(ГТ) и уровня восстановленного глутатиона (GSH)) и активности NADPHгенерирующих ферментов – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и
NADP-изоцитратдегидрогеназы (NADP – ИДГ) при действии мелаксена и
вальдоксана на фоне развития гипертиреоза;
3. Исследование действия мелаксена и вальдоксана на содержание цитрата и
активность аконитатгидратазы (АГ), являющейся критической мишенью
действия АФК.
4. Изучение влияния мелаксена и вальдоксана на активности каталазы и
супероксиддисмутазы (СОД) при ЭГ у крыс.
5. Определение параметров биохемилюминесценции (БХЛ) и исследование
фрагментации ДНК в сыворотке крови пациентов с тиреотоксикозом при
проведении базисной терапии и комбинированного лечения с мелаксеном.
6. Изучение функционирования глутатионовой АОС при комбинированной
терапии с мелаксеном на фоне развития тиреотоксикоза.
7. Оценка воздействия мелаксена на активности NADPH - генерирующих
ферментов
–
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы
и
NADPизоцитратдегидрогеназы, при синдроме тиреотоксикоза.
8. Определение активности аконитазы и содержания цитрата в сыворотке
крови больных с тиреотоксикозом после проведения традиционного лечения и
комбинированной терапии, включающей мелаксен.
9. Создание гипотетической модели участия мелатонин – корригирующих
препаратов в регуляции свободнорадикального гомеостаза при тиреотоксикозе.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование
воздействия мелатонин – корригирующих препаратов на интенсивность СО
биомолекул, активности ферментативных и неферментативных компонентов
АОС и ряда ферментов окислительного метаболизма, при гипертиреозе как в
эксперименте на животных, так и у пациентов с синдромом тиреотоксикоза в
клинических условиях. Установлено, что введение мелаксена и вальдоксана
при ЭГ приводит к снижению интенсивности СРП и степени мобилизации
ферментов АОС во все исследуемых тканях крыс. Показана эффективность
применения для торможения развития окислительного стресса мелаксена на
фоне базисной терапии больных с синдромом тиреотоксикоза. Исследовано
воздействие мелатонин – корригирующих препаратов на функционирование
ферментов, генерирующих NADPH, необходимого для работы глутатионовой
АОС. Предложена гипотетическая схема участия мелатонин – корригирующих
препаратов в регуляции свободнорадикального гомеостаза при тиреотоксикозе.
Проведенные исследования способствуют расширению и углублению
5
фундаментальных представлений о механизмах регуляции образования АФК
при патологиях, сопряженных с оксидативным стрессом.
Практическая
значимость.
Результаты
работы
углубляют
фундаментальные представления о путях реализации протекторного действия
мелатонин – корригирующих веществ, обладающих антиоксидантным
потенциалом. Полученные экспериментальные данные вносят вклад в решение
проблемы по выявлению нарушений метаболизма при тиреотоксикозе и
способствуют поиску оптимальных путей их коррекции. Данные о позитивном
воздействии мелатонин – корригирующих препаратов на свободнорадикальный
гомеостаз в тканях млекопитающих свидетельствуют о возможности
применения мелаксена и вальдоксана в антиоксидантной терапии, при лечении
тиреотоксикоза. Результаты исследований с использованием мелаксена в ходе
лечения пациентов с тиреотоксикозом указывают на целесообразность
применения антиоксидантной терапии при данной патологии.
Материалы работы используются в учебном процессе на биологопочвенном факультете Воронежского государственного университета при
чтении курсов «Интеграция процессов обмена веществ в организме»,
«Свободнорадикальные
процессы
в
биосистемах»,
спецкурсов
по
аналитической и клинической биохимии, энзимологии. Кроме того, они
используются при проведении практикумов, выполнении курсовых, дипломных
работ и магистерских диссертаций студентами Воронежского государственного
университета.
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении
диссертационной работы, представлены на Всероссийском с международным
участием конгрессе студентов и аспирантов – биологов «Симбиоз Россия 2011"
(Воронеж, 2011), на IV международной научно – практической конференции
«Актуальные проблемы биологии, нанотехнологии и медицины» (Ростов – на –
Дону, 2011), в материалах IV Всероссийской научно – практической
конференции с международным участием «Биомедицинская инженерия и
биотехнология» (Курск, 2011), в материалах XVIII, XIV межгородской
конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии»
(Санкт Петербург, 2011,2012,2013), на V Международной научно-практической
конференции «Современное состояние естественных и технических наук»
(Москва, 2011), на III Международной научно-практической конференции
«Проблемы современной биологии» (Москва, 2012), в материалах
Всероссийской конференции с международным участием, посвящённой 75летию со дня рождения В.В. Кормачева (Чебоксары, 2012), на I и II
Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным
участием (Воронеж, 2012, 2013), в материалах V Всероссийского с
международным участием медико-биологического конгресса молодых ученых
(Тверь, 2012), а также на Всероссийской научно-практической конференции
студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы медицинской науки»,
(Ярославль, 2012)
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены
в 16 публикациях – в 4 статьях и 12 тезисах.
6
На защиту выносятся следующие положения:
1.
Мелатонин – корригирующие препараты – мелаксен и вальдоксан, могут
выступать в качестве протектров при развитии оксидативного стресса при ЭГ.
2.
Введение мелаксена и вальдоксана животным с ЭГ приводит к снижению
степени мобилизации АОС и приближению ряда показателей антиоксидантной
защиты к контрольным значениям.
3.
Под воздействием мелатонин – корригирующих препаратов происходит
изменение в сторону нормы активности ряда ферментов окислительного
метаболизма, способных оказывать лимитирующие действие на интенсивность
СО биосубстратов.
4.
Включение мелаксена в базисное лечение приводит к существенному
уменьшению параметров БХЛ, отражающих интенсивность СРП, и снижению
степени мобилизации ряда ферментативных и неферментативных компонентов
АОС в организме больных с тиреотоксикозом.
5.
На основе полученных данных предложена гипотетическая схема,
отражающая воздействие мелатонин – корригирующих препаратов на
свободнорадикальный гомеостаз организма при тиреотоксикозе.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 168 страницах текста и
состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения
результатов (4 главы), заключения, выводов, списка литературы (232
источника). Иллюстрационный материал включает 31 рисунок и 6 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект и материалы исследования. В ходе экспериментальных
исследований использовали сыворотку крови и гомогенаты печени и сердца
белых лабораторных крыс-самцов массой 200-250 г. Материалом исследований
служила также сыворотка крови здоровых доноров и крови больных с
синдромом тиреотоксикоза. Животные были разделены на шесть
экспериментальных групп: в 1-й группе (n=19) животных содержали на
стандартном режиме вивария; во 2-й группе (n=9) у животных индуцировали
гипертиреоз; в 3-й и 4-й группах (n=18) животным после индуцирования
гипертиреоза вводили внутрибрюшинно мелаксен («Юнифарм», США) в дозе 5
и 10 мг/кг веса животного ежедневно в течение 3-х дней в утренние часы; в 5-й
и 6-й группах (n=18) крысам с ЭГ вводили внутрибрюшинно вальдоксан
(«Лаборатория Сервье Индастри», Франция) в дозах 5 и 10 мг/кг веса
животного.
Больные с гипертиреозом были разделены на две группы. Первая группа
пациентов находилась на традиционном лечении. Вторая группа пациентов
дополнительно к антитиреоидным препаратам и β - адреноблокаторам получала
мелаксен (Юнифарм, США) по 1 таблетке, содержащей 3 мг мелатонина, 1 раз
в день за 30-40 минут перед сном в течение 10 дней. Контрольную группу
составили 65 практически здоровых лиц с нормальными показателями общего,
биохимического анализов крови и содержания ТТГ и Т4 свободного.
Создание экспериментальной модели гипертиреоза у крыс.
Гипертиреоз вызывали внутрибрюшинным введением трийодтиронина. Гормон
вводили здоровым животным в дозе 100 мкг на 100 г массы тела в виде
7
раствора в 0,9% NaCl. Инъекции осуществляли трижды через день в течение
шести дней (Fernandez, 1991 ). В качестве протекторов использовали мелаксен и
вальдоксан, введение которых осуществляли троекратно. Все процедуры
эксперимента соответствовали требованиям международных правил гуманного
отношения к животным, отраженных в санитарных правилах по отбору и
содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев). (УК РФ ст.
245). Образцы для анализа забирали на 7-е сутки после начала эксперимента.
Клиническое исследование больных с синдромом тиреотоксикоза. В
клиническое исследование было включено 33 человека c синдромом
тиреотоксикоза, в том числе 12 мужчин (43%) и 21 женщина (57%). Возраст
пациентов составлял от 27 до 69 лет: средний возраст – 49,6±3,8 лет. Диагнозы
были поставлены на основании клинических признаков заболевания,
гормонального исследования крови, данных ультразвукового исследования
щитовидной железы. Средняя продолжительность заболевания составляла
4,2±0,7 месяца.
Подготовка материала для исследования. Сердце и печень после
многократного
перфузирования
ледяным
изотоническим
раствором
измельчали, гомогенизировали в охлажденной среде выделения следующего
состава: 0,1 М трис-НСl-буфер (рН 7,8), содержащий 1 мМ ЭДТА, 1% βмеркаптоэтанол и центрифугировали при 10000 g в течение 12 мин.
Полученный гомогенат использовали для дальнейших исследований. Забор
крови осуществляли из сердца. Кровь помещали на 0,5 часа в термостат при
температуре 370С и центрифугировали при 3000g в течение 10 мин.
Полученную сыворотку использовали для дальнейших исследований.
Определение интенсивности свободнорадикальных процессов. Для
определения интенсивности СРП применяли метод индуцированной
биохемилюминесценции. Использовали биохемилюминометр БХЛ-06М с
программным обеспечением. Кинетическую кривую биохемилюминесценции
регистрировали в течении 30 секунд и определяли следующие параметры БХЛ:
светосумму (S), интенсивность вспышки (Imax) и величину тангенса угла
наклона касательной к нисходящей ветви кривой (tgα2) (Любитский О.Б., 1996).
Содержание ДК определяли спектрофотометрически при 233 нм. (Стальная
И.Д., 1977). Степень спонтанной ОМБ крови и гомогената печени и сердца
определяли при 370 нм (Дубинина Е.Е., 2000).
Определение интенсивности апоптоза осуществляли по степени
фрагментации ДНК. ДНК выделяли фенольно-хлороформным методом
(Маниатис, 1984). Степень фрагментации ДНК определяли методом
электрофореза.
Определение активности ферментов. Активность ферментов
определяли на спектрофотометре Hitachi U – 1900. Активность СОД
определяли по ингибированию скорости восстановления нитросинего
тетразолия в неэнзиматической системе феназинметасульфата и NADH при 540
нм (Матюшин Б.Н., 1991). Определение активности каталазы проводили
методом, основанным на способности пероксида водорода образовывать с
молибдатом аммония стойкий окрашенный комплекс с максимумом
8
поглощения при 410 нм. (Королюк М.А., 1988). Активность NADP-зависимых
ферментов определяли при 340 нм. О скорости реакций, катализируемых
Г6ФДГ и NADP-ИДГ, судили по возрастанию оптической плотности в
результате восстановления NADPH. О скорости ГР-реакции судили по
уменьшению оптической плотности в результате окисления NADPH,
протекающего за счет реакции восстановления глутатиона. О скорости ГПреакции судили по уменьшению оптической плотности в результате окисления
NADPH, протекающего за счет осуществления сопряженных ферментативных
реакций: образования окисленного глутатиона под действием ГП и его
последующего восстановления, взаимосвязанного с окислением NADPH, под
действием ГР. Aктивность AГ определяли при 233 нм. За единицу активности
принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ
продукта за 1 мин при 25˚С. Активность ферментов выражали в
ферментативных единицах (Е) на 1 мг белка или Е в расчете на 1 г сырой массы
материала (мл сыворотки). Общий белок определяли с помощью биуретовой
реакции.
Определение содержания низкомолекулярных антиоксидантов.
Концентрацию GSH определяли с помощью реакции с 5,5–дитио–бис–(2–
нитробензойной)
кислотой,
в
результате
которой
образуется
тионитрофенильный анион, имеющий максимум поглощения при 412 нм
(Бузлама В.С., 1997). Количество цитрата определяли по методу Нательсона
(Афанасьев В.Г., 1973).
Экстракция тотальной РНК. Для оценки уровня экспрессии Gpx1 и
Gsr выделяли тотальную РНК с использованием набора Yellow Solve.
Электрофорез РНК и ДНК. Электрофорез РНК и ДНК проводили в
агарозном геле. Для окрашивания использовали бромистый этидий.
Обратная транскрипция. На матрице выделенной РНК с помощью
обратной транскрипции получали кДНК, используемую для ПЦРамплификации в режиме реального времени.
ПЦР-амплификация
в
режиме
реального
времени.
ПЦРамплификацию в режиме реального времени проводили на приборе АНК-32. В
ходе работы использовали праймеры для определения уровня транскриптов
исследуемого гена и референсного гена. В ходе эксперимента использовали
набор, содержащий интеркалирующий краситель SYBR GreenI.
Определение уровня экспрессии генов осуществляли с применением
сравнительного метода пороговых циклов и программного обеспечения «REST
2008» (Pfaffl M.W., 2002).
Статистическая обработка экспериментальных данных. Опыты
проводили в 8-9-ти кратных повторностях, аналитические определения для
каждой пробы осуществляли в двух повторностях. Результаты опытов сравнивали
с контролем. В таблицах и на рисунках приводятся средние арифметические
значения активностей данного фермента и их стандартные ошибки. Полученные
данные обрабатывали с использованием t-критерия Стьюдента с вычислением
среднего значения, стандартного отклонения, различия считали достоверными
при р≤0,05 (Ллойд, Ледерман, 1990).
9
ВОЗДЕЙСТВИЕ МЕЛАТОНИН – КОРРИГИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ
НА ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ПРИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРТИРЕОЗЕ У КРЫС
С целью исследования влияния мелатонин – корригирующих препаратов
на уровень СРП в тканях крыс с ЭГ был использован метод
биохемилюминесценции, а также оценка содержания ДК и степени ОМБ. При
введении мелаксена и вальдоксана животным с ЭГ происходило снижение
параметров БХЛ в печени, сердце и сыворотке крови крыс, отражающих
степень протекания СО и возрастающих при патологии (табл. 1).
Таблица 1.
Параметры биохемилюминесценции в печени, сердце и сыворотке крови крыс в
контроле, при ЭГ и введении мелаксена и вальдоксана.
печень
сердце
сыворотка
крови
6
сыворотка
крови
5
сердце
4
печень
3
Сыворотка
крови
2
Тангенс угла падения
кинетической кривой (tgα2)
сердце
1
Интенсивность
максимальной вспышки
(Imax), mV
печень
Группы
животных
Светосумма вспышки
хемилюминесценции
(S), mV x c
23,7±1,1
05
30,79±1,
445*
25,917±0
,967*
25,743±1
,08**
25,671±0
,861**
25±0,594
**
14,54±
0,637
20,7±0,
973
15,85±
1,137*
15,847
±0,97*
15,34±
0,645*
15,62±
0,644*
31,71±
1,425
47,34±
1,978
35,11±
1,654*
33,290
±1,66*
33,757
±1,56*
33,31±
1,623*
4,3±0,1
89
6,13±0,
279
5,236±
0,262*
4,817±
0,210*
4,956±
0,231*
4,685±
0,341*
2,43±0,
115
4,38±0,
206
3,370±
0,157*
3,153±
0,290*
3,070±
0,135*
3,032±
0,143*
5,99±0,
189
7,37±0,
268
6,479±
0,312*
6,123±
0,298*
6,545±
0,301*
6,239±
0,254*
1,5±0,0
75
1,82±0,
085
1,610±
0,078*
1,621±
0,02*
1,589±
0,064*
1,602±
0,078*
1,8±0,0
87
1,96±0,
089
1,83±0,
0406*
1,864±
0,05*
1,84±0,
0211*
1,853±
0,047*
0,99±0,0
35
2,21±0,1
05
1,507±0,
065*
1,332±0,
054*
1,423±0,
0653*
1,342±0,
0623*
Примечания: 1 – группа контрольных животных, 2 – крысы с ЭГ, 3 –
введение мелаксена в дозе 5 мг/кг после индукции экспериментального
гипертиреоза; 4 - введение мелаксена в дозе 10 мг/кг после индукции ЭГ, 5 –
введение вальдоксана в дозе 5 мг/кг после индукции ЭГ; 6 - введение
вальдоксана в дозе 10 мг/кг при развитии патологии.
* - отличия от значений при ЭГ достоверны (уровень значимости р≤0,05)
Установлено, что светосумма БХЛ при воздействии мелаксена и
вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг уменьшалась в сердце крыс в 1,3 раза, в печени
в 1,2 раза, т.е. наблюдалось изменение в сторону контроля. Сходные изменения
S были отмечены и для сыворотки крови животных, которым вводили мелаксен
и вальдоксан. При введении мелаксена в исследуемых дозах на фоне развития
патологии, происходило снижение Imax в печени на 1,2 и 1,3 раза, в сердце в
1,3 и 1,4 раза (p<0,05) по сравнению с животными с патологией. Величина Imax
в сыворотке крови крыс при воздействии мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг,
уменьшалась на 14% и 20 % соответственно. Введение вальдоксана на фоне
развития ЭГ также приводило к снижению Imax в сторону нормы. Выявленное
10
снижение значений S и Imax, по-видимому, может быть связано с проявлением
меласеном и вальдоксаном антиоксидантных свойств, направленных на
подавление чрезмерного образования СР при гипертиреозе. Данное
предположение подтверждается уменьшением степени мобилизации АОС
организма, что проявляется в снижении tg α2 при введении исследуемых
препаратов.
Внутрибрюшинное введение мелаксена и вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг
веса животного при гипертиреозе приводило к снижению уровня ДК по
сравнению с их содержанием при патологии.
Содержание ДК в печени крыс, снижалось при введении мелаксена в
дозах 5 и 10 мг/кг на 9% и 8%, а при введении вальдоксана в 1,2 и 1,4 раза
соответственно, по сравнению с патологией (рис. 1). Воздействие исследуемых
препаратов в дозах 5 и 10 мг/кг приводило к уменьшению содержания ДК в
сыворотке крови крыс в 1,2 раза. Концентрация ДК в сердце животных при
введении мелаксана и вальдоксана изменялась в сторону контрольных
значений.
Рис. 1. Содержание ДК в печени , в сердце
и сыворотке крови
крыс в
норме (1), при экспериментальном гипертиреозе (2), при введении мелаксена в
дозах 5 и 10 мг/кг (3,4), при введении вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг (5,6).
Выявлено, что при развитии ЭГ наблюдалась увеличение степени ОМБ.
Установлено, что при ЭГ содержане карбонильных соединений в печени крыс
увеличивается в 1,4 раза по сравнению с контрольной группой. Возрастание
ОМБ было выявлено и в сердце, и в сыворотке крови крыс. Считается, что в
состоянии окислительного стресса, атаке АФК подвергаются в первую очередь,
белки плазматических мембран, а не липиды (Dean R.T., 1991). Известно, что в
качестве основных индукторов ОМБ, рассматриваются АФК, увеличение
свободного железа, продукты ПОЛ. Высокие концентрации ТГ могут
приводить к возрастанию потребления кислорода и стимулируют выработку
СР. При действии АФК происходит нарушение нативной конформации белков
с образованием крупных белковых агрегатов или фрагментация белковой
молекулы (Davies K.J., 1987).
Установлено, что содержание карбонильных групп при воздействии
мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг уменьшалось в сердце крыс в 1,2 раза, в печени в
1,3 раза (рис.2). Аналогичные изменения в содержании карбонильных
соединений были выявлены в сыворотке крови подопытных животных,
11
которым вводили мелаксен и вальдоксан. При действии вальдоксана при ЭГ
содержание карбонильных групп также изменялось в сторону нормы.
Рис. 2 Содержание карбонильных групп в печени , в сердце
и сыворотке
крыс в норме (1), при экспериментальном гипертиреозе (2), при
крови
введении мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг (3,4), при введении вальдоксана в дозах
5 и 10 мг/кг (5,6).
Выявленное снижение значений S и Imax, содержания ДК и
карбонильных соединений, по-видимому, может быть связано со способностью
данных препаратов оказывать влияние на содержание мелатонина и
чувствительность его рецепторов, что приводит к проявлению гормоном
антиоксидантных свойств, способствующих нормализации уровня СО
биомолекул.
При введении мелатонин – корригирующих препаратов активность
аконитазы – чувствительной мишени действия СР, снижающаяся в тканях крыс
при ЭГ, изменялась в сторону контроля. Так, при действии мелаксена в дозах 5
и 10 мг/кг на фоне ЭГ активность АГ в печени увеличивалась в 1,4 и 1,5 раза, в
сердце – в 1,6 и 1,8 раза и в сыворотке крови – в 1,2 раза. Введение вальдоксана
животным с гипертиреозом приводило к повышению данного параметра в
ткани печени в 1,5 раза, сердца – в 1,8 и 1,9 раза, в сыворотке крови – в 1,2 раза
по сравнению со значениями при патологии. Данная тенденция прослеживалась
и при расчете удельной активности АГ в различных тканях крыс.
Вероятно, нормализация активности АГ при введении мелатонин –
корригирующих препаратов на фоне развития патологических процессов
происходила вследствие снижения уровня СО и реконструкции железо-серного
кластера данного фермента.
ВЛИЯНИЕ МЕЛАКСЕНА И ВАЛЬДОКСАНА НА АКТИВНОСТЬ
АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ
ГИПЕРТИРЕОЗЕ
К важнейшим компонентам АОС организма относятся ферменты СОД,
каталаза, ГП, ГР и ГТ, в связи с чем было проведено исследование влияние
мелаксена и вальдоксана на изменение активности этих антиоксидантных
ферментов. В условиях развития ЭГ имело место увеличение их активности по
сравнению с контролем, что, по-видимому, является признаком
функциональных изменений, вызванных избыточной генерацией СР и
12
увеличением биосинтеза антиоксидантных ферментов в процессе развития
окислительного стресса.
Под воздействием мелаксена и вальдоксана на фоне развития патологии в
исследуемых дозах наблюдалось снижение активности каталазы и СОД в
печени, сердце и сыворотке крови крыс по сравнению с животными с ЭГ. Так,
при действии мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг на фоне развития гипертиреоза
происходило уменьшение удельной активности СОД в печени в 1,3, а в сердце
1,2 раза по сравнению со второй группой животных (рис.3). Наблюдалась также
тенденция изменения активности фермента в сыворотке крови в сторону
нормы. При введении вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг крысам с ЭГ отмечалось
снижение данного параметра в печени в 1,2 раза, в сердце - в 1,3 и 1,2 раза, в
сыворотке крови - в 1,2 раза относительно значений при гипертиреозе (рис. 3).
При введении мелатонин – корригирующих препаратов животным с ЭГ
было отмечено также снижение активности каталазы в тканях и сыворотке
крови крыс по сравнению с животными с патологией. Вероятно, наблюдаемые
изменения активности СОД и каталазы под влиянием мелаксена и вальдоксана
могут быть объяснены их воздействием на уровень и эффективность действия
мелатонина в организме, который благодаря антиоксидантным свойствам,
способен уменьшать степень протекания СО, и как следствие снижать
функциональную нагрузку на СОД и каталазу.
Рис.
и сыворотке крови
3. Активность супероксиддисмутазы в печени , сердце
крыс в норме (1), при патологии (2), при введении мелаксена в дозах 5 и 10
мг/кг на фоне гипертиреоза (3,4), при введении вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг
при развитии патологии (5,6).
К
важнейшим
компонентам
АОС
организма
относят
глутатионпероксидазную/
глутатионредуктазную
(ГП/ГР)
систему,
использующую для детоксикации пероксидов восстановленный глутатион. При
введении мелаксена на фоне развития тиреотоксикоза активность ГП и ГР,
возрастающая при патологии в печени крыс, снижалась в 1,4 раза. Действие
мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг в условиях гипертиреоза сопровождалось
уменьшением активности ГП и ГР в сердце, выраженной в Е/ г сырой массы, в
1,3 и 1,2 раза соответственно. При введении мелаксена и вальдоксана
активность данных ферментов в сыворотке крови также изменялась в сторону
контрольных значений. Изменения удельной активности ферментов сохраняли
ту же тенденцию.
13
Установлено, что развитие ЭГ сопровождалось увеличением активности
ГТ в печени в 1,9 раза, в сердце в 1,3 раза и в сыворотке крови крыс в 1,7 раза
по сравнению с контрольным уровнем (рис.4). Таким образом, наблюдаемое
изменение активности ГТ может быть защитной реакцией организма на
чрезмерное образование АФК при интенсификации СО в процессе развития
гипертиреоза. При введении мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг крысам с ЭГ было
выявлено снижение активности ГТ в сыворотке крови в 1,2 раза (рис. 4).
Активность ГТ в печени крыс, выраженная в Е на грамм сырой массы, при
введении мелаксена крысам с патологией снижалась в 1,3 и 1,6 раза.
Активность ГТ в сердце, при воздействии мелаксена падала на 14% и 17%
(p≤0,05) соответственно. При введении вальдоксана наблюдалась сходная
тенденция изменения активности фермента в тканях и сыворотке крови крыс.
Рис.4. Активность глутатионтрансферазы, выраженная в виде Е на грамм
крыс в норме
сырой массы печени , сердца , и Е на мл сыворотки крови
(1), при экспериментальном гипертиреозе (2), при введении мелаксена в дозах 5
и 10 мг/кг (3,4), при введении вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг (5,6)
По – видимому, снижение активности ГП, ГР и ГТ под действием
мелаксена и вальдоксана, в сторону контрольных значений, свидетельствует о
реализации мелатонином антиоксидантных свойств, благодаря которым он
эффективно взаимодействовует со СР с образованием малотоксичных или
нетоксичных, метаболизируемых в организме соединений. Такой механизм его
действия, приводит к снижению интенсивности процессов СО, и как следствие,
уменьшению функциональной нагрузки на ГП/ГР – систему.
Регенерация GSH в ходе ГР-реакции осуществляется при постоянном
притоке в систему восстановительных эквивалентов, основными поставщиками
которых в клетке являются дегидрогеназы пентозофосфатного пути. В качестве
альтернативного источника NADPH рассматривают NADP-ИДГ-реакцию.
Ранее было установлено, что при гипертиреозе активность Г6ФДГ в тканях
крыс возрастает в большей мере, чем активность NADP-ИДГ, что
свидетельствует о большей функциональной нагрузке на фермент
пентозофосфатного пути как поставщика NADPH для работы ГП/ГР-системы.
Внутрибрюшинное введение мелатонин – корригирующих препаратов при
развитии ЭГ приводило, к снижение активности Г6ФДГ и NADP-ИДГ в
исследуемых тканях, относительно второй группы животных. По-видимому,
снижение степени мобилизации ГР/ГП АОС, к которому приводит введение
14
мелатонин – корригирующих препаратов, способствует торможению процессов
СО, что проявляется и в уменьшении активности NADPH – генерирующих
ферментов.
ЭКСПРЕССИЯ ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ,
ГЛУТАТИОНПЕРОКСИДАЗЫ, СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ И КАТАЛАЗЫ
В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРТИРЕОЗЕ И
ДЕЙСТВИИ МЕЛАТОНИН – КОРРИГИРУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ
На первом этапе нами была успешно проведена экстракция тотальной
РНК из печени и сердца крысы с последующей обратной транскрипцией мРНК.
В результате была получена одноцепочечная кДНК. Для амплификации участка
гена в работе использовались праймеры, подобранные с помощью программы
Genamics Expression. ПЦР – РВ проводили на приборе АНК – 32. С
применением ПЦР в реальном времени выявлено изменение степени
экспрессии СОД, каталазы, ГП и ГР при ЭГ.
Таблица 2
Изменение уровня транскриптов генов ГП, ГР, СОД и каталазы в тканях крыс
при ЭГ и действии мелаксена и вальдоксана на фоне патологии
Группы животных Δ Сt = Сt (ГП) - Сt
(GAPDH)
Контроль печень
ЭГ печень
ЭГ + мелаксен
(5 мг/кг) печень
ЭГ + вальдоксан
(5 мг/кг) печень
Контроль сердце
ЭГ сердце
ЭГ + мелаксен
(5 мг/кг) сердце
ЭГ + вальдоксан
(5 мг/кг) печень
Δ Сt = Сt (ГР) Сt (GAPDH)
Δ Сt = Сt (СОД)
- Сt (GAPDH)
7,91±0,37
6,20±0,30*
7,6±0,33*
7,94±0,39
6,230±0,15*
7,24±0,34*
8,87±0,42
6,8±0,32*
7,49±0,35*
Δ Сt = Сt
(каталазы) - Сt
(GAPDH)
8,64±0,39
7,13±0,34*
8,31±0,39*
7,56±0,36*
7,56±0,31*
7,51±0,36*
8,51±0,37*
8,1±0,41
6,60±0,32*
7,6±0,38*
8,42±0,38
6,91±0,32*
7,85±0,36*
8,92±0,41*
7,26±0,34*
8,42±0,41*
7,92±0,38
6,21±0,30*
7,62±0,35*
7,56±0,37*
7,66±0,37*
8,66±0,42*
7,43±0,36*
Примечание: * - отличия от нормы достоверны (Р<0,05)
При введении мелатонин – корригирующих препаратов в дозе 5 мг/кг
животным с ЭГ происходило уменьшение экспрессии генов СОД, каталазы, ГР
и ГП по сравнению с уровнем при патологии (табл. 2). Вероятно изменения
активностей СОД, каталазы, ГР и ГП могут быть связаны с увеличением
скорости синтеза данных ферментов при патологии и её уменьшением при
введении мелаксена и вальдоксана, благодаря антиоксидантному действию
использованных препаратов, снижающих степень мобилизации ферментов
АОС.
ВЛИЯНИЕ МЕЛАКСЕНА И ВАЛЬДОКСАНА НА СОДЕРЖАНИЕ
НЕФЕРМЕНТАТИВНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ В ТКАНЯХ КРЫС ПРИ
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ГИПЕРТИРЕОЗЕ
При введении мелаксена и вальдоксана в дозах 5 и 10 мг/кг на фоне
развития гипертиреоза в тканях животных отмечается снижение содержания
цитрата по сравнению с данными при патологии. Введение мелаксена
15
приводило к уменьшению уровеня цитрата в сыворотке крови в 1,6 раза
(p<0,05), в печени в 1,3 и 1,4 и в сердце – в 1,4 и 1,5 раза (p<0,05). Уменьшение
данного параметра наблюдалось и в тканях крыс, которым вводили вальдоксан
по сравнению с группой с ЭГ (рис. 5). Изменение содержания цитрата в
сторону нормы при введении мелатонин – корригирующих препаратов, повидимому, было связано со снижением степени выраженности окислительного
стресса.
и сыворотке крови
Рис.5. Содержание цитрата в печени , сердце
крыс в норме (1), при экспериментальном гипертиреозе (2), при введении
мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг (3,4), при введении вальдоксана в дозах 5 и 10
мг/кг (5,6).
Выявлено также увеличение содержания восстановленного глутатиона
при введении мелаксена и вальдоксана на фоне развития ЭГ. Так, было
показано, что воздействие мелаксена в дозах 5 и 10 мг/кг приводит к
возрастанию содержания GSH: в 1,2 и 1,3 раза в печени, в 1,5 и 1, 2 раза в
сердце и в 1,3 раза в сыворотке крови крыс по сравнению с животными с
патологией. Подобная тенденция наблюдается и при введении вальдоксана.
ВЛИЯНИЕ МЕЛАКСЕНА НА ИНТЕНСИВНОСТЬ
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ БИОСУБСТРАТОВ В
СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ С СИНДРОМ ТИРЕОТОКСИКОЗА
Согласно полученным данным, параметры БХЛ: S и Imax,
характеризующие
интенсивность
СРП,
возрастали
при
синдроме
тиреотоксикоза в сыворотке крови по сравнению со значением нормы. Причем
после проведения традиционного лечения происходило еще большее
увеличение S и Imax (в 1,3 и 1,2 раза соответственно) и снижение величины tgα2
(в 1,2 раза) по сравнению со значениями при тиреотоксикозе, что, очевидно,
было связано с усилением генерации АФК при приеме антитиреоидных
лекарственных препаратов. После проведения комбинированной терапии с
мелаксеном на фоне базисной терапии у 65 % больных наблюдалось
увеличение S, но в меньшей степени, чем в группе, не получавшей мелаксен (на
8%), а у 35% больных даже наблюдалось снижение данного параметра на 25%
по сравнению с результатами, полученными до лечения. Величина Imax у
больных принимающих мелаксен также возрастала в меньшей степени – на
15%, по сравнению с данными до лечения. Показатель tgα2 в сыворотке крови
увеличилась в 1,3 раза. Исходя из полученных данных, можно предположить,
что, под действием мелаксена происходило снижение интенсивности генерации
16
АФК, что сопровождалось снижением степени выраженности окислительного
стресса
Данные об изменениях параметров БХЛ у больных, принимающих
мелаксен, соотносятся с результатами оценки степени фрагментации ДНК
лейкоцитов крови. Выявлено, что при развитии тиреотоксикоза наблюдалась
фрагментация ДНК лейкоцитов крови больных. Причем полученные
фрагменты ДНК образовывали характерную «апоптозную лестницу». После
проведения стандартного лечения наблюдалось снижение степени
фрагментации ДНК. При исследовании образцов крови больных, принимавших
мелаксен на фоне базисной терапии, апоптозная лестница в большинстве проб
практически не визуализировалась, что может быть свидетельством
антиапоптотического действия исследуемого препарата (рис.6).
Рис.6. Электрофореграмма препаратов
ДНК из лейкоцитов крови: 1 –
маркеры молекулярной массы; 2 –
контроль, 3 –больные с синдромом
тиреотоксикоза до лечения; 4 – после
стандартного лечения; 5,6 - при
комбинированной
терапии
с
мелаксеном.
Установлено, что у больных, находящихся на традиционном лечении,
активность АГ, снижающаяся при патологии в 1,2 раза, еще больше
уменьшалась. По – видимому, это было связано с тем, что в процессе
биотрансформации ксенобиотиков, в том числе лекарственных веществ, при
функционировании цитохрома P – 450, часть активированных молекул не
реагирует с субстратом, а освобождается из комплекса с ферментом с
образованием СР (Буторова Л.И., 2010). Это сопровождается инактивацией
железо-серного кластера АГ, сопряженной с разборкой [4Fe-4S] кластера,
карбонилированием и деградацией фермента. После приема пациентами
мелаксена на фоне базисной терапии, активность АГ, выраженная в Е/мл
сыворотки, увеличивалась в среднем на 19,4%. Удельная активность АГ
повышалась на 23,7% по сравнению с соответствующими показателями до
лечения. По-видимому, применение мелаксена обеспечивало коррекцию уровня
мелатонина в организме больных с синдромом тиреотоксикоза. Известно, что
гормон, проявляя своё антиоксидантное действие, приводит к детоксикации СР,
что способствует уменьшению степени повреждения молекулы фермента и
изменению активности АГ в сторону контроля.
ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ В
СЫВОРТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ С СИНДРОМОМ ТИРЕОТОКСИКОЗА ПРИ
ПРИЕМЕ МЕЛАКСЕНА
После проведения стандартной терапии содержание глутатиона,
снижающееся при синдроме тиреотоксикоза, еще больше падало. Показано, что
после проведения терапии с мелаксеном наблюдалось повышение
17
концентрации GSH в сыворотке крови по сравнению с его уровнем до лечения
на 15%.
Было установлено, что развитие тиреотоксикоза сопровождается
увеличением активности ферментов ГП/ГР системы. После проведения
стандартной терапии наблюдалось возрастание активностей ГП/ГР-системы по
сравнению с данными до лечения. Во второй группе пациентов после
проведения базисной терапии, включающей мелаксен, активности ГП и ГР,
выраженные в Е на мл, снижались на 34,9% и 43,4 % соответственно (рис.8).
Удельные активности ГП и ГР уменьшались в 1,4 и 1,5 раза по сравнению с
данными до лечения.
А
Б
Рис. 8. Активность глутатионпероксидазы (А) и глутатионредуктазы (Б),
выраженная в Е/мл, в сыворотке крови в норме (1); у больных с
тиреотоксикозом (2); при традиционном лечении (3); применении мелаксена на
фоне стандартного лечения (4).
Установлено, что в 1–ой группе пациентов с тиреотоксикозом при
поступлении в стационар наблюдается уменьшение активности Г6ФДГ,
выраженной в Е на мл сыворотки, в то время как активность NADP-ИДГ
увеличивается по сравнению с контролем. После проведения базисной терапии,
активности NADP-ИДГ и Г6ФДГ, выраженные в Е на мл, увеличивались, по
сравнению с результатами до лечения.
Во второй группе пациентов после проведения стандартной терапии
включающей мелаксен, активность Г6ФДГ, выраженная в Е на мл сыворотки,
увеличивалась в 1,6 раза. Удельная активность Г6ФДГ увеличивалась на 52,9%.
При проведении базисной терапии, включающей мелаксен, происходило
снижение активности NADP-ИДГ, выраженной в Е на мл сыворотки, в среднем
на 15%, удельная активность уменьшалась на 23,4 % по сравнению с данными,
полученными до лечения.
Следует подчеркнуть, что выявленные изменения активности NADP-ИДГ
имели такую же тенденцию, как и изменения активности ГП/ГР системы.
Можно предполагать, что при данной патологии роль NADP-ИДГ как
поставщика NADPH для глутатионовой АОС возрастает в связи с
определенным торможением Г6ФДГ-активности.
Содержание цитрата в сыворотке крови у больных с синдромом
тиреотоксикоза снижалась в 1,7 раза по сравнению с контролем. После
проведения, традиционного лечения и комбинированной терапии с мелаксеном
существенных изменений содержания цитрата выявлено не было. В данном
18
случае не наблюдалось взаимосвязи между содержанием цитрата и
активностью АГ, катализирующей его превращение до изоцитрата. Возможно,
это связано с тем, что цитрат помимо превращений аконитазой, мог
утилизироваться в других процессах.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Ряд данных имеющихся в литературе, свидетельствуют о том, что
развитие тиреотоксикоза характеризуется усилением генерации АФК,
интенсификацией ПОЛ (Zarkovic M., 2012). При этом наблюдаются структурнофункциональные повреждения биомембран, нуклеиновых кислот и белков, то
есть важнейших компонентов клетки.
Согласно полученным нами результатам у крыс с ЭГ активированы
процессы СО биосубстратов, что подтверждается возрастанием параметров
биохемилюминесценции, повышением содержания первичных продуктов ПОЛ
– ДК, и увеличением уровня карбонильных групп модифицированных белков.
Наряду с этим происходит мобилизация компонентов АОС.
При введении мелатонин – корригирующих препаратов происходило
снижение параметров, отражающих интенсивность СРП. Так, при действии
исследуемых препаратов на фоне развития ЭГ имело место снижение
параметров БХЛ – S, Imах и tgα2 в печени, сердце и сыворотке крови крыс.
Антиоксидантный эффект мелаксена и вальдоксана подтверждается и
изменением в сторону контроля уровня ДК при их введении животным с
патологией. Следует отметить, что при воздействии исследуемых препаратов на
фоне развития патологического состояния снижается также уровень
окислительной модификации белков.
Установлено, что под воздействием мелатонин – корригирующих
препаратов происходило снижение степени мобилизации компонентов АОС по
сравнению с патологией, что может объясняться проявлением ими
антиоксидантных свойств. Об этом свидетельствует уменьшение общего
антиоксидантного потенциала, оцениваемого по значениям такого параметра
БХЛ, как тангенс угла падения кинетической кривой Полученные данные
подтверждаются и измерением активности отдельных компонентов АОС. При
введении мелаксена и вальдоксана крысам с ЭГ наблюдалось снижение
удельной активности СОД и каталазы в печени, сердце и сыворотке крови крыс.
Воздействие мелатонин – корригирующих препаратов сопровождалось и
сдвигом активности ГП, ГР и ГТ в сторону контрольных значений. Можно
предположить, что мелаксен и вальдоксан, приводили к увеличению
эффективности действия мелатонина, который способен эффективно
обезвреживать СР, приводя к уменьшению степени протекания СО, и, тем
самым снижая нагрузку на основные антиоксидантные звенья организма. В
тканях экспериментальных животных с патологией, которым вводили мелаксен
и вальдоксан, в большинстве случаев происходило возрастание концентрации
восстановленного глутатиона по сравнению с группой с ЭГ. Полученные
результаты согласуются с имеющимися литературными данными, что
мелатонин увеличивает митохондриальной пул GSH и стимулирует активность
фермента,
участвующего
в
синтезе
глутатиона
гамма
19
глутамилцистеинсинтетазы, за счет которого может увеличиваться его
содержание (Acuna – Castroviejo D., 2001).
В этих условиях отмечено также возрастание активности АГ,
существенно снижающейся при патологии. При введении мелаксена и
вальдоксана на фоне развития гипертиреоза было выявлено изменение
концентрации цитрата в сторону контроля.
Положительное влияние мелаксена и вальдоксана на уровень СО в тканях
крыс с ЭГ, послужило основой для продолжения исследования действия
данных препаратов в условиях клиники. В этой связи, была осуществлена
сравнительная
характеристика
ряда
показателей
состояния
свободнорадикального гомеостаза у пациентов с тиреотоксикозом,
находящихся на базовой терапии и комбинированном лечении с применением
мелаксена.
Согласно результатам проведенного исследования, выявлено, что при
комбинированной терапии с мелаксеном у больных с синдромом
тиреотоксикоза происходит снижение интенсивности СО биомолекул, чего не
наблюдается у пациентов получавших только антитиреоидные препараты. Об
этом свидетельствовали показатели: параметры БХЛ, фрагментация ДНК, а
также более высокая активность АГ в сыворотке крови больных.
При применении мелаксена на фоне базисной терапии больными с
синдромом тиреотоксикоза происходило снижение активности ферментов
глутатионового звена АОС, возрастающих при патологии. По-видимому, при
терапии с мелаксеном имело место торможение СРП и снижение нагрузки на
АОС, что и приводило к меньшей степени активации ее глутатионового звена.
Резюмируя данные, полученные в настоящей работе, можно сделать
заключение о воздействии мелаксена и вальдоксана на содержание мелатонина
и чувствительность его рецепторов, что приводило к проявлению гормоном
антиоксидантных свойств,сопряженных непосредственно со способностью
связывать СР. Это обеспечивало уменьшениеинтенсивности СО биосубстратов
и, как следствие, снижение функциональной нагрузки на антиоксидантные
звенья организма.Результаты исследования свидетельствуют о положительном
воздействии мелатонин – корригирующих препаратов на состояние
свободнорадикального гомеостаза при тиреотоксикозе и возможности их
применения для коррекции патологического состояния.
20
21
ВЫВОДЫ
1.
Введение мелаксена и вальдоксана на фоне ЭГ сопровождается
снижением уровня СРП, что подтверждается уменьшением концентрации ДК,
содержания карбонильных групп и параметров БХЛ – S и Imax, в тканях
экспериментальных животных.
2.
Выявлено изменение активности СОД и каталазы при введении
мелатонин – корригирующих препаратов экспериментальным животным в
направлении контрольных значений, что может свидетельствовать о
реализации антиоксидантного эффекта исследуемых препаратов, снижающего
нагрузку на ферменты АОС.
3.
При введении мелаксена и вальдоксана на фоне развития патологии
в тканях печени, сердца и крови крыс отмечено изменение активности
ферментов глутатионового звена АОС, а также ферментов, генерирующих
NADPH, в сторону контрольных значений. Введение мелатонин –
корригирующих препаратов на фоне развития гипертиреоза, по всей
видимости, приводит к снижению интенсивности СО биосубстратов и, как
следствие, снижению функциональной нагрузки на глутатионовое звено АОС и
ферменты, поставляющие NADPH, необходимый для ее работы.
4.
При введении мелатонин – корригирующих препаратов
экспериментальным животным на фоне развития патологии происходило
увеличение содержание восстановленного глутатиона по сравнению с
соответствующим показателем в группе крыс с ЭГ.
5.
Установлено,
что
введение
мелаксена
и
вальдоксана
экспериментальным животным приводило к увеличению активности АГ,
существенно снижающейся при развитии ЭГ, и изменению концентрации
цитрата в сторону нормы. По-видимому, данные препараты оказывали влияние
на эффективность действия мелатонина, как антиоксиданта, что приводило к
уменьшению степени развития процессов СО биосубстратов, и к защите
молекулы фермента от повреждения СР.
6.
Комбинированная терапия с включением мелаксена приводила к
существенному снижению параметров БХЛ, отражающих уровень СРП, в
сыворотке крови пациентов с синдромом тиреотоксикоза, что свидетельствует
о способности мелатонина проявлять антиоксидантное действие, обеспечивая
снижение уровня генерации АФК.
7.
Результаты
исследования
степени
фрагментации
ДНК
свидетельствуют, что патологические изменения при синдроме тиреотоксикоза
сопровождаются апоптотическими процессами. Коррекция содержания
мелатонина в организме пациентов под действием мелаксена способствует
снижению степени выраженности оксидативного стресса и уменьшению
фрагментации ДНК.
8.
При включении мелаксена в базисную терапию больных с
синдромом тиреотоксикоза происходило снижение степени мобилизации АОС
организма по сравнению с патологией. Так, активность ГП и ГР уменьшалась
на 34,9% и 43,4% соответственно.
9.
Выявлено возрастание активности АГ в сыворотке крови пациентов
22
с синдромом тиреотоксикоза на 19,4% после проведения комбинированной
терапии с мелаксеном, что, вероятно, связано с реконструкцией Fe-S кластера
молекулы фермента, обеспечивающей изменение активности АГ в сторону
контрольных значений.
10.
На
основании
результатов
исследования
предложена
гипотетическая схема регуляции свободнорадикального гомеостаза под
воздействием мелаксена и вальдоксана.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ РАБОТЫ
1. Горбенко М.В. Активность аконитатгидратазы и содержание
цитрата в крови больных с синдромом тиреотоксикоза при комбинированной
терапии с мелаксеном / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Н.А.
Текунова // Материалы IV Всероссийского с международным участием
конгресса студентов и аспирантов – биологов «Симбиоз Россия 2011". В двух
томах. Том 2. – Воронеж, 2011. – С. 18-21.
2. Горбенко М.В. Активность глутатионпероксидазы и концентрации
глутатиона в сыворотке крови больных с синдромом тиреотоксикоза при
комбинированной терапии с мелаксеном / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К.
Шульгин, Е.В. Ситникова // Материалы IV Международной научно –
практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий
и медицины». – Ростов – на- Дону, 2011. – С. 86.
3.
Душечкина
О.Ю.
Влияние
мелаксена
на
параметры
биохемилюминесценции в сыворотке крови больных с синдромом
тиреотоксикоза / О.Ю. Душечкина, С.С. Попов, М.В. Горбенко, А.В. Великий,
Н.В. Наумова, В.Н. Свариенко, Е.П. Чернышова, Г.Н. Купцова // Материалов IV
Всероссийской научно-практической конференции с международным участием
«Биомедицинская инженерия и биотехнология». – Курск, 2011. – С. 117-120.
4. Горбенко М.В., Активность глутатионовой антиоксидантной системы
в сердце крыс при гипертиреозе и действии вальдоксана / М.В. Горбенко, Т.Н.
Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов, Е.В. Ситникова, А.С. Хамлова //
Материалы
V
Международной
научно-практической
конференции
«Современное состояние естественных и технических наук». – Москва, 2011. –
С. 49-51
5.
Горбенко
М.В.
Воздействие
мелаксена
на
параметры
биохемилюминесценции в тканях крыс при развитии экспериментального
гипертиреоза / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов, Е.В.
Ситникова, О.Ю. Утицких // Материалы III Международной научнопрактической конференции «Проблемы современной биологии». – Москва,
2012. – С.13-15.
6.
Горбенко
М.В.
Влияние
вальдоксана
на
активность
супероксиддисмутазы и каталазы в сыворотке крови крыс при развитии
гипертиреоза / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Я.Г. Воронкова,
А.С. Хамлова // Сборник материалов Всероссийской конференции с
международным участием «Современные проблемы химической науки и
образования», посвящённой 75-летию со дня рождения В.В. Кормачева, В двух
томах. Том 2. – Чебоксары, 2012. – С. 126-128.
23
7. Горбенко М.В. Влияние мелаксена на активность глутатионовой
антиоксидантной системы в сердце крыс при гипертиреозе / М.В. Горбенко,
Т.Н. Попова // Материалы XVIII Межгородской конференции «Актуальные
проблемы патофизиологии». – Санкт – Петербург, 2012. – С.40-41.
8. Горбенко М.В. Активность аконитатгидратазы и содержание
цитрата в тканях крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии
мелаксена / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов, Е.В.
Ситникова, А.С. Хамлова, Я.Г. Воронкова // Сборник научных статей
Всероссийской заочной научно-практической конференции с международным
участием «Медико – биологические и педагогические основы адаптации,
спортивной деятельности и здорового образа жизни». – Воронеж, 2012. – С.
244-247.
9.
Горбенко
М.В.
Влияние
вальдоксана
на
параметры
биохемилюминесценции в тканях крыс при развитии экспериментального
гипертиреоза / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.В. Ситникова //
Материалы V Всероссийского с международным участием медикобиологического конгресса молодых ученых «Симбиоз – Россия 2012». – Тверь,
2012. – С. 148-149.
10. Горбенко М.В., Активность аконитатгидратазы и содержание
цитрата в сыворотке крови крыс с экспериментальным гипертиреозом при
введении мелаксена / М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.В.
Ситникова // Сборник научных работ студентов и молодых ученых
Всероссийской научно-практической конференции с международным участием
«Актуальные вопросы медицинской науки», посвященная 70-летию профессора
А.А. Чумакова. – Ярославль, 2012. – С. 56.
11. Горбенко М.В. Активность супероксиддисмутазы и каталазы в
тканях крыс при экспериментальном гипертиреозе и действии вальдоксана /
М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.В. Ситникова, А.С. Хамлова,
О.Ю. Утицких // Сборник научных статей II Всероссийской заочной научнопрактической конференции с международным участием «Медико –
биологические и педагогические основы адаптации, спортивной деятельности и
здорового образа жизни». – Воронеж, 2013. – С. 161-164.
12.
Горбенко
М.В.
Влияние
мелаксена
на
активность
супероксиддисмутазы и каталазы в тканях крыс при развитии гипертиреозава
/ М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, Е.В. Ситникова, А.С. Хамлова, //
XIX межгородская конференция молодых ученых «Актуальные проблемы
патофизиологии – 2013». – Санкт-Петербург, 2013. С 24-26.
13. Горбенко М.В. Активность глутатионовой антиоксидантной
системы при действии мелаксена и вальдоксана на фоне гипертиреоза у крыс /
М.В. Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов // Биомедицинская
химия. – 2013. - Т.59. - №5. - С. 541-548. (Gorbenko M. V. The Effect of melaxen
and valdoxan on the activity of the glutathione antioxidant system in rats with
experimental hyperthyroidism / M.V. Gorbenko, T.N. Popova, K.K. Shulgin, S.S.
Popov // Biochemistry ( Moscow) Supplement Series B : Biomedical Chemistry. –
2013. – Vol. 7, №1. – P. 27-31.
24
14. Горбенко М.В. Особенности функционирования глутатионовой
антиоксидантной системы крови больных с синдромом тиреотоксикоза при
комбинированной терапии с мелаксеном / М.В. Горбенко, С.С. Попов, К.К.
Шульгин, Т.Н. Попова, О.Ю. Душечкина // Вестник Воронежского
государственного университета Серия: Химия. Биология. Фармация. – 2013. –
№ 2. – C. 83 – 88.
15. Горбенко М.В. Влияние мелаксена и вальдоксана на активность
глутатионовой антиоксидантной системы и НАДФН – генерирующих
ферментов в сердце крыс при экспериментальном гипертиреозе / М.В.
Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов // Экспериментальная и
клиническая фармакология. – 2013. - № 10. – С. 12-15.
16. Горбенко М.В. Влияние мелаксена и вальдоксана на активность
супероксиддисмутазы и каталазы при экспериментальном гипертиреозе / М.В.
Горбенко, Т.Н. Попова, К.К. Шульгин, С.С. Попов // Химикофармацевтический журнал. - 2013. – № 12. - С.5-7.
Статьи № 13, 14, 15,16 опубликованы в печатных изданиях, состоящих в
списке журналов, рекомендованных ВАК РФ.