Трийодтиронин, тироидный гормон, циркулирует в крови почти

Свободный Трийодтиронин (fТ3)
Хемилюминесцентные тесты CIA
Код товара: 1375-300
Назначение:
Количественное определение концентрации свободного трийодтиронина
(fТ3) в человеческой сыворотке или плазме при помощи
иммунолюминометрического теста. Считается, что fT3 отражает уровень
Т3, поступающего в клетки, поэтому по его концентрации можно
определить клиническое состояние обмена Т3 в организме.
ОБЩАЯ ИНФОРМАЦИЯ И ОПИСАНИЕ ТЕСТА
Трийодтиронин, тироидный гормон, циркулирует в крови почти полностью (>99.5%)
привязанным к белкам-переносчикам (1, 2). Главным транспортным белком является
тироксинсвязывающий глобулин (TBG). Однако считается, что только свободная
(несвязанная) часть трийодтиронина отвечает за биологическую функцию.
Концентрация белков-переносчиков изменяется при различных клинических
состояниях, например, при беременности. Если щитовидная железа функционирует
нормально, то при изменении концентрации белков-переносчиков, уровень общего
трийодтиронина становится таким, что концентрация свободного трийодтиронина
остается прежней. Поэтому концентрация свободного трийодтиронина более точно
отражает клиническое состояние, чем уровень общего трийодтиронина.
Например, увеличение уровня общего трийодтиронина может быть вызвано
беременностью, приемом оральных контрацептивов и терапией эстрогенами, хотя
при этом уровень свободного Т3 остается неизменным.
Данная методология иммуноферментного анализа обеспечивает оптимальную
чувствительность при минимуме действий оператора. Сначала в лунку вносят
калибраторы сыворотки, препарат пациента или контроли. Добавляют конъюгат
ферментов и Т3 (аналоговый метод) и смешивают реагенты. Происходит реакция
конкуренции между конъюгатом ферментов и свободным трийодтиронином за
ограниченное количество антитело-комбинирующих участков, иммобилизованных на
поверхности лунки.
После окончания указанного периода инкубации связанный антителами конъюгат Т3
и ферментов отделяют от несвязанного конъюгата Т3-ферментов при помощи
аспирации или декантации. Добавляют субстрат для определения активности
ферментов на поверхности лунки.
Используя несколько известных различных контрольных показателей концентрации
трийодтиронина, можно построить кривую дозовой зависимости и найти с ее
помощью неизвестную концентрацию Т3.
ПРИНЦИП
Конкурентный иммуноферментный тест:
Необходимые реагенты для иммуноферментного теста включают иммобилизованное
антитело к Т3, конъюгат антигена Т3 -ферментов и нативный антиген свободного Т3.
Конъюгат Т3-ферментов не должен иметь связки с белками сыворотки, особенно с
TBG и альбумином. При использовании настоящего метода это условие
выполняется.
После смешивания иммобилизованного антитела, конъюгата ферментов и антигена
и сыворотки с нативным антигеном, происходит реакция конкуренции между
нативным антигеном и конъюгатом ферментов и антигена за ограниченное
количество нерастворимых связывающих участков.
Взаимодействие описывается следующим уравнением:
- моноспецифичное иммобилизованное антитело (постоянное количество)
- нативный антиген (любое количество)
- конъюгат ферментов и антигенов (постоянно количество)
- комплекс антиген-антитело
- комплекс конъюгата антигена-ферментов и антител
- постоянная скорость ассоциации
- постоянная скорость диссоциации
- равновесная постоянная
После достижения равновесия, фракцию связанных антител отделяют от
несвязанных антигенов при помощи декантации или аспирации. Активность
ферментов во фракции связанных антител обратно пропорциональна концентрации
нативного антигена. Используя несколько различных известных контрольных
показателей концентрации антигена, можно построить кривую дозовой зависимости и
найти с ее помощью неизвестную концентрацию антигена.
РЕАГЕНТЫ:
A. Калибраторы человеческой сыворотки (1.0 ml/пробирка) [Обозначения A – F]
Шесть (6) пробирок для сравнения со значением свободного трийодтиронина для
концентрации 0(A), 0.4(B), 1.2(C), 4.5(D), 8.0(E), и 18.0(F) ng/ml. Хранить при
температуре 2-8°C.
Консервирующее вещество добавлено.
Для перевода в единицы СИ: 1pg/ml x 1.536 = pmol/L
B. Меченый реагент свободного Т3 —13 ml/пробирка
Одна (1) пробирка конъюгата пероксидазы из хрена на бычьей альбуминностабилизованной матрице. Хранить при температуре 2-8°C.
Консервирующее вещество добавлено.
С. Лунки с антителами - 96 лунок - Значок
Белый микропланшет с 96 лунками, покрытыми овечьей антисывороткой и
упакованные в алюминиевую оболочку с осушающим реагентом. Хранить при
температуре 2-8°C.
D. Концентрат промывающего раствора -- 20ml – значок
Одна (1) пробирка, содержащая сурфактант в забуференном растворе. Добавлен
консервант. Хранить при температуре 2-30°C (см. Раздел по подготовке реагентов).
E. Сигнальный реагент А – 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль с люминалом в буфере. Хранить при температуре 2-8°C. (см. Раздел
по подготовке реагентов).
F. Сигнальный реагент B – 7мл/пробирка - Обозначение
Одна (1) бутыль, содержащая перекись водорода (H2O2) в буфере.
Хранить при температуре 2-8°C (см. Раздел по подготовке реагентов).
I.Вкладыш в упаковку.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ [НЕ ПОСТАВЛЯЕМЫЕ]:
1. Пипетка для раскапывания объема 50µl с точностью выше 1.5%.
2. Диспенсер(ы) для многократного распределения объемов в 0.100ml и 0.300ml с
точностью выше 1.5%.
3. Диспенсеры с регулируемым объемом (200-1000µl) для растворов конъюгата и
субстрата.
4. Промывающее устройство для микропланшетов или пластиковая бутыль
(дополнительно).
5. Микропланшетный люминометр.
6. Пробирки для растворения субстратов А и В.
7. Абсорбирующая бумага для декантации лунок микропланшета.
8. Пластиковая оболочка или крышка микропланшета для проведения инкубации.
9. Вакуумный аспиратор (дополнительно) для промывания.
10. Таймер.
11. Материалы для контроля качества.
Примечание 1: Не используйте реагенты, у которых истек срок годности.
Примечание 2: Открытые реагенты стабильны в течение 60 дней при температуре 28°C.
Примечание 3: Реагенты предназначены для использования вместе с планшетом с
96-ю лунками.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Для диагностики In Vitro
Не предназначен для внутреннего или наружного употребление животными
или человеком.
Реагенты, содержащие сыворотку крови человека, тестировались на наличие
антител к ВИЧ 1 и 2, вирусу гепатита С, поверхностному антигену вируса гепатита В.
Были получены отрицательные результаты. Однако поскольку ни один тест не может
дать полной гарантии отсутствия инфекционных агентов, всю человеческую
сыворотку следует считать потенциально опасной и инфекционной и обращаться с
ней в соответствии с государственными нормами для биологически опасных веществ
2 группы. Подходящие лабораторные правила обращения с препаратами крови
можно найти в "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," 2-я редакция,
1988, HHS
СБОР И ПОДГОТОВКА ПРЕПАРАТОВ
Забор крови из вены руки следует производить согласно стандартной процедуре, с
соблюдением соответствующих мер предосторожности. Чтобы обеспечить
возможность сравнения с контрольными значениями, нужно собирать сыворотку у
пациента утром натощак. Для сбора крови используются простые пробирки с красной
крышкой без геля или добавок.
Дайте крови свернуться. Центрифугируйте препарат, чтобы отделить сыворотку от
клеток.
Для анализа можно использовать как свежеполученные образцы сыворотки крови,
так и образцы, хранившиеся при температуре от 2 до 8°С не более 48 часов или при
температуре минус 20°С не более 30 дней. Не допускается повторное
замораживание-размораживание, приводящее к искажению результатов. Перед
тестом подождите, пока реагенты не нагреются до комнатной температуры (20-27С)
При тестировании с дубликатами требуется 0.10 мл препарата.
ПОДГОТОВКА И ХРАНЕНИЕ РЕАГЕНТОВ:
1. Промывной Буфер
Растворите концентрат промывающего раствора в подходящем контейнере в
дистиллированной или деионизированной воде, так чтобы его объем составлял 1000
мл. Храните при комнатной температуре (20-27°C) в течение 60 дней.
2. Рабочий раствор индикаторного реагента – готовить ежедневно
Смешайте равные объемы раствора ‘A’ и раствора ‘B’ в чистом контейнере.
Используйте в течение 60 минут после этого. Например, добавьте 1 мл А и 1 мл В в
два стрипа с восьмью лунками (получится небольшой избыток раствора. Выбросьте
неиспользованную долю раствора).
ПРОЦЕДУРА ТЕСТА
Перед проведением теста, доведите все реагенты, контроли и калибраторы
сыворотки до комнатной температуры (20 - 27° C).
1. Подготовьте лунки микропланшета для калибраторов, контрольных проб и
препаратов пациента в дубликатах.
Поместите неиспользованные микрострипы обратно в алюминиевую упаковку,
закройте ее и храните при температуре 2-8°C.
2. Внесите 0.050 ml (50µl) калибраторов, контрольных проб и препаратов в
соответствующие лунки.
3. Добавьте 0.100 ml (100µl) меченого реагента Т3 в каждую лунку.
4. Осторожно поворачивайте планшет в течение 20-30 секунд, чтобы реагенты
перемешались. Закройте планшет пластиковой пленкой.
5. Инкубируйте в течение 45 минут при комнатной температуре.
6. Удалите содержимое лунок микропланшета при помощи декантирования или
аспирации. При декантировании тщательно удалите остатки жидкости из лунок при
использовании абсорбирующей бумаги.
7. Добавьте 300µl промывающего раствора (см. раздел о подготовке реагентов),
декантируйте или аспирируйте. Повторите еще два (2) раза (общее число
промываний – три (3)). Можно использовать автоматическое или ручное
устройство для промывания планшетов. В таком случае следуйте инструкциям
производителя по эксплуатации. При использовании бутыли, наполняйте
каждую лунку доверху, сжимая контейнер. Избегайте появления пузырьков.
Декантируйте и повторите еще два (2) раза.
8. Добавьте 0.100 ml (100µl) раствора субстрата во все лунки.
(см. раздел о подготовке реагентов). Всегда добавляйте реагенты в одном и
том же порядке, чтобы минимизировать разницу времени реакции у различных
лунок.
9. Инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти (5) минут в темноте.
10. Считайте RLU (относительные световые единицы) при помощи люминометра на
96 лунок (0.2-1.0 секунды на лунку). Измерение должно проводиться в течение
тридцати (30) минут после остановки реакции.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Каждая лаборатория должна проверять контроли в низком, среднем и высоком
диапазоне для мониторинга проведения теста. Значение этих контролей следует
определять во время каждой процедуры теста. Необходимо составлять графики
контроля качества для проверки поставляемых реагентов и выявлять тренды при
помощи подходящих статистических методов. Значительное отклонение от обычных
показателей указывает на незамеченное изменение в условиях проведения теста
или на деградацию реагентов в наборе. В этом случае используйте свежие реагенты,
чтобы определить причину отклонений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для нахождения неизвестной концентрации свободного трийодтиронина в
препаратах используется кривая дозовой зависимости.
1. Запишите RLU (интенсивность сигнала люминесценции), указанную в распечатке
микропланшетного анализатора (Образец 1).
2. Постройте на миллиметровой бумаге график зависимости RLU каждого дупликата
калибраторов от концентрации свободного Т3 в pg/ml. (не усредняйте значения
калибраторов перед построением графика).
3. Проведите через точки на графике наиболее подходящую кривую.
4. Чтобы определить неизвестную концентрацию свободного Т3, отложите среднее
RLU каждого препарата на вертикальной оси графика, найдите точку пересечения с
кривой и по горизонтальной оси графика определите концентрацию (в pg/ml) (можно
найти среднее для дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией). В
приведенном ниже примере, среднее RLU (52178) пересекает калибровочную кривую
при концентрации Т3 5.32 pg/ml. (См. рисунок 1).
Примечание 1: Для обработки данных можно использовать программное
обеспечение для иммунолюминометрических тестов. (найдите среднее для
дубликатов препаратов с неизвестной концентрацией) (см. рис. 1).
Примечание 2: Monobind может оказать помощь в покупке и установке
оборудования/программ
для
расчета
и
интерпретации
результатов
иммунолюминометрического теста.
Рис. 1
RLU
пациент
Значения свободного Т3 в ng/ml
* Данные на образце 1 и на рисунке 1 представлены только для демонстрации и не
должны использоваться вместо кривой дозовой зависимости, составляемой при
проведении каждого теста. Кроме того, RLU калибраторов нормализованы до
@100,000 RLU для калибратора ‘A’ (самый интенсивный сигнал). Такое
преобразование ликвидирует разницу в способности различных приборов
определять интенсивность света.
ОБРАЗЕЦ 1
ПАРАМЕТРЫ QC (КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА)
Результаты анализа считаются достоверными при выполнении следующих
условий:
1. Кривая дозового ответа (пересечения в 80%; 50% и 20%) должна находиться в
установленных пределах.
2. Четыре из шести контролей должны находиться в установленном диапазоне.
ОГРАНИЧЕНИЯ ПРОЦЕДУРЫ
A. Проведение теста
1. Время реакции во всех лунках должно быть одинаковым, чтобы обеспечить
воспроизводимость результатов.
2. Пипетирование проб не должно занимать более десяти (10) минут во избежание
смещения результатов теста.
3. При использовании более одного (1) планшета, рекомендуется повторять
построение кривой дозового ответа.
4. Недостаточное промывание лунок планшета при аспирации или декантации
может привести к получению искаженных результатов.
5. Используйте компоненты из одного набора. Не смешивайте реагенты из разных
наборов.
6. Не допускается использование препаратов с сильной микробной контаминацией, с
повышенным содержанием липидов и гемолизированных препаратов.
В. Интерпретация
1. При использовании компьютерной программы для интерпретации результатов
теста, требуется, чтобы прогнозируемые значения калибраторов оказывались в
пределах 10% от соответствующих концентраций.
2. Если концентрация, по какой-либо причине, окажется выше, чем у последнего
калибратора (например > 20pg/ml), не пытайтесь разбавить препарат. Вариации TBG
в различных матрицах не позволяют серийно разбавлять свободный Т3 гормон.
3. Некоторые лекарства влияют на связывание трийодтиронина и белковпереносчиков тироидного гормона и на выделение свободного трийодтиронина из Т3,
что усложняет интерпретацию результатов (3).
4. На результаты может повлиять количество циркулирующих антител к Т3 и
гормонсвязывающих ингибиторов (4).
4. Гепарин оказывает влияние in vivo и in vitro на концентрацию свободного Т3 (5).
Поэтому не проводите анализ препаратов, в которые был добавлен этот
антикоагулянт.
5. При наличии у пациента тяжелых нетиреоидальных заболеваний, оценить
состояние щитовидной железы очень сложно. Рекомендуется найти еще и
концентрацию тиреотропного гормона (TSH) для диагностики тироидной дисфункции
(6).
6. Семейные дизальбуминемические патологии могут привести к искажению
результатов теста на свободный Т3 (7).
"НЕ ПРЕДНАЗНАЧЕН ДЛЯ МОНИТОРИНГА НОВОРОЖДЕННЫХ"
Для определение ожидаемых результатов теста свободного T3 CIA было проведено
изучение населения с нормальной функцией щитовидной железы. Полученные
среднее (R), стандратное отклонение (σ) и примерные ожидаемые значение (±2 σ)
указаны в таблице 1.
ТАБЛИЦА I
Ожидаемые результаты теста свободного Т3 CIA
(в pg/ml)
Среднее (Х)
Стандартное отклонение (s)
Ожидаемые результаты теста (±2 s)
Взрослые (110
препаратов)
2.8
0.7
1.4 – 4.2
Беременные (75
препаратов)
3.0
0.6
1.8 – 4.2
Помните, что нахождение диапазона нормальных значений для популяции зависит от
множества факторов: специфичности метода, тестируемой популяции и точности
метода, используемого лаборантом.
Поэтому любая лаборатория должна
использовать указанный производителем диапазон только до тех пор, пока
выработает собственные пределы нормальных значений, основываясь на
результатах анализов людей, живущих там же, где расположена лаборатория.
ХАРАКТЕРИСТИКИ АНАЛИЗА
A. Сходимость
Внутри- и межаналитическая точность метода оценивалась при помощи анализов на
трех различных уровнях смешанной контрольной сыворотки. Номер, среднее
значение, стандартное отклонение и коэффициент вариации для каждой пробы
контрольной сыворотки приведены в таблицах 2 и 3.
ТАБЛИЦА 2
Внутрианалитическая сходимость (ед.изм. - pg/ml)
ПРОБА
низкий
средний
высокий
N
20
20
20
X
1.45
4.55
8.24
σ
0.14
0.22
0.46
C.V.
9.7%
4.8%
2.4%
ТАБЛИЦА 3
Межаналитическая сходимость (ед.изм. - pg/ml)
ПРОБА
N X
C.V.
σ
низкий
10 1.51 0.15 9.9%
средний
10 4.73 0.34 7.3%
высокий
10 7.81 0.52 6.6%
*данные получены в течение 10 дней в 10 экспериментах
дубликатов.
с использованием
B. Точность
Было проведено сравнение Monobind T3 CIA™ со стандартным имунноферментным
методом (ИФА) путем анализа препаратов с нормальной, гипо и гиперфункцией
поджелудочной железы (диапазон значений от 0.1pg/ml до 14pg/ml).
Общее количество исследованных препаратов - 181. Уравнение регрессии методом
наименьших квадратов и коэффициент корреляции были рассчитаны для свободного
трийодтиронина CIA по сравнению с обычным методом. Полученные данные
представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Метод
Этот метод
Метод для
сравнения
Среднее (х)
Регрессия
методом
наименьших
квадратов
Коэффициент
корреляции
3.4
3.5
y=0.15+0.925(x)
0.955
Есть лишь небольшая разница в средних значениях, полученных по данному методу
(свободный Т3 CIA™) и стандартному методу. Метод наименьших квадратов и
коэффициент корреляции показывают отличную согласованность методов.
С. Чувствительность
Чувствительность теста на Трийодтиронин равна 0.05 pg/ml.
Чувствительность
(предел обнаружения) оценивается при определении
вариабельности калибратора сыворотки с концентрацией 0 pg/ml при использовании
статистики 2σ (95% точности) для расчета минимальной дозы.
D. Специфичность
Перекрестная реактивность антител трийодтиронина на выбранные вещества
оценивалась путем добавления дополнительных веществ в матрицу сыворотки в
указанных ниже концентрациях. Для определения перекрестной чувствительности
рассчитывается отношение между дозой дополнительного вещества и дозой
трийодтиронина, необходимых для вытеснения одного и того же объема меченого
реагента.
Вещество
I-Трийодтиронин
I-Тироксин
Йодотирозин
Дийодотирозин
Дийодотиронин
Фенилбутазон
Салицилат натрия
Перекрестная
реактивность
1.0000
< 0.0002
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
Концентрация
10 mg/ml
10 mg/ml
10 mg/ml
10 mg/ml
10 mg/ml
10 mg/ml
СПИСОК СПРАВОЧНОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Pederson, K.O, Scand. J. Clin. Lab Invest, 34, 247 (1974)
Wild, D., Immunoassay Handbook, Stockton Press, p339 (1994).
Wenzel, K.W., Metabolism, 30, 717 (1981)
Bhagat, C., et.al, Clin Chem, 29, 1324 (1983-).
Lundberg, P.R., et.al, Clin Chem, 28, 1241 (1982).
Melmed, S. et.al, J Clin Endocrinol Metab, 54, 300 (1982).
Lalloz M.R., et al, Clin Endocrinol, 18, 11 (1983).
Verheecke P,”Free triiodothyronine concentrations in serum of 1050 euthyroid
children is inversely related to their age.’ Clin Chem., 43:6; 963-967 (1997).
9. Mak YT, Chen EL, Chan A, Woo J and Swaminathan R, “Free triiodothyronine in
sera of acutely ill general medical patients: a prognostic indicator ”, Clin Chem, 38
(3) :414 (1992).
10. John R, Henley R and Shankland D,”Concentrations of free thyroxine and free
triiodothyronine in sera of patients with thyroxine and triiodothyroninine-binding
autoantibodies”, Clin Chem, 36:470-473 (1990).
Редакция: 3.
Date: 05.25.04
Cat# 1375-300.
Monobind Inc.
729 West 16th Street
Costa Mesa. CA 92627
Tel: 949-642-4830
Fax: 949-650-8459
Email: info@monobind.com
Вебсайт: www.monobind.com
Пожалуйста, посетите наш вебсайт, чтобы узнать больше о предоставляемых
нами товарах и услугах.