НЕХРОМОСОМНЫЕ МУТАЦИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
НЕХРОМОСОМНЫЕ МУТАЦИИ
ПОДСОЛНЕЧНИКА
2-е издание, дополненное
Ростов-на-Дону
Издательство Южного федерального университета
2011
УДК 581.15, 581.167
ББК Е592-3
Н58
Работа подготовлена и издана при финансовой поддержке
Министерства образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программы
«Научные и научно-педагогические кадры иновационной России (2009-2013)»
(госконтракты № 16.740.11.0485, № 16.552.11.7024.)
и тематического плана ЮФУ (НИР №. 6.8.11).
Монография рекомендована к печати Ученым советом НИИ биологии ЮФУ,
протокол №6 от 22 августа 2011 г.
Авторы:
А.В. Усатов, Г.М. Федоренко, А.А. Устенко, М.А. Тихонова,
Е.В. Машкина, К.В. Азарин, Н.В. Маркин, О.Ф. Горбаченко,
Н.С. Колоколова, Ю.В. Денисенко
Рецензенты:
доктор биологических наук, профессор Московского государственного
университета им. М.В. Ломоносова М.М. Асланян
доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник
Южного научного центра РАН В.А. Тарасов
Научный редактор
доктор биологических наук, профессор А.В. Усатов
Н58 Нехромосомные мутации подсолнечника / Науч. ред. А.В. Усатов. –
2-е изд., доп. – Ростов н/Д: Изд-во ЮФУ, 2011. – 360 с.
ISBN 978-5-9275-0906-5
Монография посвящена нехромосомным мутациям высших растений. В ней
проанализированы и обобщены результаты авторского коллектива многолетних
исследований особенностей наследования и фенотипического выражения пластидных и
митохондриальных мутаций подсолнечника. Приведены каталог внеядерных
хлорофильных мутантов НИИ биологии ЮФУ и цветные фотоиллюстрации
декоративных форм подсолнечника из коллекции ВНИИР им. Н.И. Вавилова.
Адресуется исследователям в области генетики, биохимии, физиологии и селекции
растений, студентам и аспирантам биологических и сельскохозяйственных
специальностей.
ISBN 978-5-9275-0906-5
УДК 581.15, 581.167
ББК Е592-3
© Коллектив авторов, 2011
© Издательство Южного федерального
университета, 2011
11 Памяти наших учителей
Ю.Д. Белецкого и Е.П. Гуськова
посвящаем
ВВЕДЕНИЕ
Феномен цитоплазматической наследственности впервые был экспериментально продемонстрирован при изучении наследования
спонтанных хлорофильных мутаций у высших растений в 1909 г.
К. Корренсом и Э. Бауром. В 1934 г. О. Реннер выделил пластиды в самостоятельную наследственную систему растительной клетки. Примерно
в это же время М. Роудс и М. Хаджинов открыли на кукурузе феномен
цитоплазматической мужской стерильности, который сразу же был
реализован в практических целях для получения гибридных гетерозисных семян этой сельскохозяйственной культуры, а также стимулировал
исследования митохондрий растений, как носителей генетической информации. Тем не менее, развитие генетики пластид и митохондрий,
в отличие от классической ядерной генетики, развивалось недостаточно интенсивно. Это отставание в развитии было вызвано тем, что методология формальной генетики, базирующаяся на законах Менделя,
не могла быть применима для анализа изменчивости и наследования
цитогенов. В отличие от ядерных генов, локализованных в аутосомах
эукариотической клетки, гены органелл перманентно полиплоидны,
в зиготу при скрещивании попадают не в равных пропорциях и относительно случайно распределяются в дочерние клетки при митотических
делениях (Даниленко, Давыденко, 2003).
Бурное развитие нехромосомной наследственности растений началось только в начале 60-х годов прошлого века после открытия ДНК в
митохондриях и хлоропластах. Широкое внедрение в биологию молекулярно-генетических методов способствовало прогрессу в этой
области генетики. Сегодня уже не вызывает сомнений, что пластиды
и митохондрии, в отличие от других компартментов эукариотических
клеток, имеют собственные геномы и белок-синтезирующие системы,
которые чрезвычайно сложно взаимодействуют в единой информационной клеточной системе как между собой, так и с ядерным геномом.
Несмотря на то, что геномы клеточных органелл, в отличие от ядерного генома, имеют незначительную информационную емкость, они непосредственно связаны с ключевыми энергетическими процессами –
фотосинтезом и дыханием. В связи с этим их вклад в формирование
структурно-функциональных признаков, в том числе в устойчивость
и продуктивность растений, практически сопоставим с вкладом ядер5
ных генов. В настоящее время цитоплазматическая изменчивость, рассматривается как значимый фактор в эволюции и селекции растительных организмов.
Мутанты для генетиков всегда представляли прекрасную модель
для изучения проблемы «ген-признак». В этом плане не составляют
исключение и внеядерные мутации. Однако их ценность возрастает
в связи с тем, что биогенез и функционирование хлоропластов и митохондрий, их фотосинтетическая и дыхательная активности находятся
под двойным ядерно-органелльным контролем. Поэтому генетический анализ таких наследственных изменений дает возможность выявлять не только структурные компоненты органелл, детерминированные цитогенами, но и закономерности ядерно-цитоплазматических
взаимоотношений.
Как правило, в естественных условиях мутации в пластидной
ДНК возникают с частотой не выше 0,02–0,06 % (Белецкий, 1989).
Долгое время четких и воспроизводимых способов получения мутаций пластид у высших растений не существовало, несмотря на неоднократные попытки, предпринимавшиеся в этом направлении (Сэджер,
1975). Для искусственного получения внеядерных мутантов были исследованы различные химические мутагены. Однако по причине низкой эффективности и отсутствия специфичности от большинства
из них пришлось довольно быстро отказаться (Даниленко, Давыденко,
2003). В 1969 г. основателями нашей лаборатории Ю.Д. Белецким
и Е.К. Разорителевой впервые была доказана возможность индукции мутаций пластид у подсолнечника при помощи N-нитрозо-Nметилмочевины (НММ) (Белецкий и др., 1969; Разорителева и др.,
1970 а; 1970 б). Позже свойство НММ как наиболее эффективного пластидного мутагена для высших растений было подтверждено на других
культурах немецкими исследователями (Pohlheim, 1974; Hagemann,
1976). Это открытие явилось стимулом к глубокому изучению закономерностей мутационного процесса в хлоропластах и генетико-физиологического анализа внеядерных мутантов высших растений. Результат
многолетних исследований в данной области оформился в виде уникальной коллекции внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника (Разорителева и др., 1995; Usatov et al., 2001; Усатов и др., 2003а;
2003б; 2004; 2005; Машкина и др., 2010). Всесторонний анализ этих мутантных форм стал содержанием первых двух глав настоящей работы.
6
Цитоплазматическая мужская стерильность (ЦМС), или формирование нежизнеспособной или стерильной пыльцы у растений, обусловлена изменениями в структуре митохондриального генома.
На сегодняшний день это наиболее коммерчески востребованные
нехромосомные мутации, успешно используемые в гибридном производстве сельскохозяйственных культур. Хорошо известно, что главным направлением селекции подсолнечника (Helianthus annuus) является получение гетерозисных гибридов (Гаврилова, Рожкова, 2005;
Бочковой, Юрков, 2007; Hladni et al., 2007; Силкова и др., 2008). Для их
промышленного производства используют материнские линии на основе ЦМС и отцовские формы, несущие гены-восстановители фертильности пыльцы (Rf) (Serieys, 1996; Venkanna et al., 2008).
Сегодня в коммерческом производстве семян подсолнечника доминируют гетерозисные гибриды, полученные на основе ЦМС типа РЕТ1,
открытой у межвидового гибрида H. petiolaris × H. annuus П. Леклерком
еще в 1966 г. (Leclerq, 1969). Такое унифицированное использование
ЦМС РЕТ1, безусловно, уменьшает генетическую изменчивость цитоплазмы этой сельскохозяйственной культуры, что может привести к негативным явлениями, например к массовым эпифитотиям.
Аналогичный случай уже имел место при широкомасштабном поражении гельминтоспориозом гибридов кукурузы с техасским типом ЦМС,
тогда как другие типы ЦМС оказались менее восприимчивы к данному
заболеванию (Levings, 1990). Следовательно, для создания новых систем ЦМС-Rf с целью увеличения генетического разнообразия и уменьшения опасной унификации семенного материала актуальны поиск
и внедрение в гетерозисную селекцию новых источников ЦМС и, соответственно, восстановителей фертильности пыльцы (Анисимова и др.,
2009; Маркин и др., 2009). В связи с этим на базе мировой коллекции
ВИР были изучены новый тип ЦМС – RIG0 (на генетической основе
цитоплазмы подсолнечника H. rigidus) и его вклад в формирование хозяйственно-ценных признаков у гибридов F1 и их материнских форм.
В качестве объекта сравнения использовали фертильный и стерильный
на основе ЦМС РЕТ1 аналоги линий. Полученные нами результаты совместно с сотрудниками Кубанской опытной станции ВИР им. Н.И.
Вавилова по этой теме были включены в третью главу коллективной
монографии.
7
Не вызывает сомнений, что сорт растений как основа технологии
возделывания любой сельскохозяйственной культуры является результатом сложного взаимодействия генотип-среда, поскольку может реализовать свой продукционный потенциал и технологические свойства
только в конкретных условиях среды. Создание сорта включает не только получение и отбор новых генотипов, но и поиск экологической
ниши, в которой эти генотипы реализуют высокую продуктивность,
физиологическую стабильность и качество продукции, как основной вектор селекции растений. Селекционеры отбирают не генотипы как таковые, поскольку отбор, в том числе и искусственный, непосредственно направлен на фенотипы, а изучают их нормы реакции
в зависимости от абиотических, биотических и антропогенных факторов (Кильчевский, 2008). Исходя из этого на базе Донской опытной
станции масличных культур им. Л.А. Жданова ВНИИМК мы провели
анализ многолетних исследований влияния климатических факторов
на формирование селекционно-ценных признаков у сортов и гибридов
подсолнечника, районированных в Ростовской области. Полученные
результаты совместно с сотрудниками ДОС ВНИИМК суммированы
в четвертой главе монографии.
Авторы считают приятным долгом выразить искреннюю благодарность и признательность нашим старшим товарищам, исследования
которых мы продолжаем в настоящее время – Е.К. Разорителевой,
Л.И. Сизовой, Т.Б. Карнауховой, Т.А. Вилор, И.И. Улитчевой,
С.Ф. Тарану, Э.Я. Прихоженко, Б.В. Дубине; коллегам из Института генетики и цитологии НАН Беларуси – О.Г. Давыденко, Н.Г. Даниленко,
С.О. Трибуш за помощь в проведении молекулярно-генетического
анализа внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника; сотрудникам ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова – В.А. Гавриловой, В.Т. Рожковой, Т.Т. Толстой, Донской опытной станции
им. Л.А. Жданова ВНИИМК – Ф.И. Горбаченко, Т.В. Усатенко за многолетний, кропотливый труд на селекционных участках по созданию
и поддержанию уникальных генетических линий, сортов и гибридов
подсолнечника.
8
Глава 1. ВНЕЯДЕРНЫЕ ХЛОРОФИЛЬНЫЕ МУТАЦИИ
ПОДСОЛНЕЧНИКА, ИНДУЦИРОВАННЫЕ
N-НИТРОЗО-N-МЕТИЛМОЧЕВИНОЙ,
И ОСОБЕННОСТИ ИХ НАСЛЕДОВАНИЯ
В результате многолетних исследований НММ-мутагенеза подсолнечника были выявлены закономерности эффективной индукции внеядерных хлорофильных мутаций при воздействии мутагеном в малых
дозах. Установлено, что генетический и цитогенетический эффекты
у подсолнечника зависят от времени обработки прорастающих семян
и концентрации НММ (Машкина, Усатов, 2003). У подсолнечника
НММ в концентрациях (0,01 и 0,015 %; 3 ч.) индуцирует в основном
внеядерные хлорофильные мутации (Усатов и др., 1995). Повышение
концентрации до 0,02 % приводит к индукции не только пластидных,
но и ядерных хлорофильных мутаций (Белецкий 1989). Мутаген в концентрации 0,03 % вызывает крупные структурные перестройки ядерного генетического материала, которые регистрируются как аберрации
хромосом (Гуськов и др., 2001).
В настоящее время в НИИ биологии Южного федерального университета создана уникальная генетическая коллекция внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника (Разорителева и др., 1995; Usatov et al.,
2001; Усатов и др., 2003а) список которых приведен в конце монографии
(см. приложение). Уникальность коллекции заключается в том, что все
внеядерные мутанты получены на единой генетической основе инбредной линии 3629. Семена линии 3629 были любезно предоставлены
нам А.И. Гундаевым в 1966 г. (получена автором из среднеспелой высокомасличной популяции подсолнечника ВНИИМК № 20044 в 1959 г.).
Анализ данных литературы (Hagemann, 1982; Hostica, Hanson, 1984;
Davidson et al., 1987; Walters et al., 1990) и результатов, полученных в нашей лаборатории, позволяет сделать вывод, что среди видов высших
растений, у которых были индуцированны внеядерные хлорофильные
мутации, наиболее чувствительным к действию НММ является подсолнечник. Высокая чувствительность хлоропластов подсолнечника
к НММ в основном определяется не особенностями объекта, а воздействующим фактором, так как, используя такие мощные химические
9
мутагены как этиленимин и диэтилсульфат, были получены только
ядерные хлорофильные мутанты (Белецкий 1989; Усатов и др., 2002).
Эффективность НММ как пластидного мутагена была подтверждена
нами и на другом виде масличных культур – Brassica junceae L. (Усатов
и др., 2003б). Очевидно, что НММ как химический агент обладает
свойствами, которые при определенных, контролируемых условиях,
как показано в работе (Усатов, 2004), обеспечивают ее преимущественное взаимодействие с внеядерными генетическими детерминантами.
Не вызывает сомнений, что на уровне химии нуклеиновых кислот
молекулярные механизмы возникновения первичных повреждений
ДНК и их причины, как в ядерном геноме, так и в геномах клеточных органелл, являются общими. Однако при их реализации на уровне фенотипа возникают существенные различия. Специфические трудности в выделении цитоплазматических мутаций обусловлены, в первую очередь,
множественностью копий цитоплазматических ДНК, длительной рассортировкой органелл, многоуровневым механизмом их отбора (Albert
et al., 1996). Для проявления цитоплазматической мутации на уровне
фенотипа организма необходима серия последовательных событий: сначала должна возникнуть органелла, содержащая только мутантные ДНК,
затем клетка, имеющая только мутантные органеллы, затем участок ткани, состоящий только из таких клеток, и, наконец, организм, состоящий
из таких тканей (Давыденко, 2001). Безусловно, что это более сложный
и многоступенчатый процесс, по сравнению с реализацией моногенных
ядерных мутаций. Вероятно, по этой причине индукция пластидных мутаций у водорослей, зачастую имеющих один – два хроматофора, не вызывала особых затруднений (Сэджер, 1975).
Специфичность НММ как пластидного мутагена проявляется и в
ее особенности изменять структуру хлоропластов растений уже в М1.
Было доказано, что пестролистность, которая возникает с высокой частотой (в некоторых экспериментах до 80 %) у подсолнечника, после
воздействия на прорастающие семена НММ, начиная с 3–5-й пары листьев, в основном является следствием индуцированной мутационной
изменчивости пластид (Белецкий, 1989). Следовательно, рассортировка мутантных и исходных копий хпДНК и, соответственно, пластид
и клеток, фенотипически проявляется после митотических делений
в первом поколении растений после воздействия НММ.
10
Жизнеспособные внеядерные хлорофильные мутанты, возникающие
после воздействия НММ на семена инбредной лини 3629 (рис. 1.1), были
представлены только двумя типами – пестролистные химеры variegated
(рис. 1.2; 1.3) и желто-зеленые формы chlorinа (рис. 1.4). Несомненно, что
эти два фенотипических типа мутаций далеко не исчерпывают
внушительного разнообразия наследственных изменений, возникающих у
подсолнечника. Для иллюстрации, в конце монографии (см. приложение
№2)
приведены
фотографии
некоторых
декоративных
форм
подсолнечника, сделанные авторами на Кубанской опытной станции
ВНИИР им. Н.И. Вавилова.
Анализ
генетической
природы
хлорофильных
мутаций,
рассмотренный ниже, проведен на базе коллекционных линий НИИ
биологии ЮФУ, растения которых в течение нескольких десятилетий
устойчиво сохраняют мутантные фенотипы.
1.1. Пестролистные мутанты variegated (var)
Фенотипически пестролистные мутанты подсолнечника variegated
(var) выделенные после НММ – мутагенеза в М2 и последующих
поколениях не отличаются от пестролистных растений в М1. Иногда
пестролистность можно наблюдать уже на стадии семядолей, но чаще у
настоящих листьев, где она сохраняется до их естественного отмирания,
при этом граница между измененной и зеленой тканью листа четко
выражена. В таблице 1.1 приведены результаты расщепления в потомстве
после самоопылении пестролистных растений мутантных линий var.
Видно, что пестролистные растения всех изучаемых линий расщепляются
в потомстве на три типа проростков: зелёные, пёстрые и летальные (белые
или жёлтые). Хотя числовые отношения при расщеплении непостоянны,
однако они носят устойчивый, регулярно повторяющийся (на протяжении
более 40 лет) характер, подтверждая генетическую непрерывность
пластид в ряду клеточных поколений (табл. 1.2).
Сам факт, что после однократной обработки семени мутагеном,
мутантные пластиды сохраняют свою индивидуальность, при
прохождении через тысячи делений в соматических клетках и
цитоплазматический мейотический отбор, воспроизводясь в последующих
поколениях, свидетельствует о возможности адаптивного пути
цитоплазматической
эволюции,
основанной
на
сохранении
гетерогенности геномов клеточных органелл.
11 Рис. 1.1. Растение инбредной линии 3629
12
13
Рис. 1.2. Внеядерный хлорофильный мутант variegated-11
14
Рис. 1.3. Внеядерный хлорофильный мутант variegated-10
15
Рис. 1.4. Внеядерный хлорофильный мутант en:chlorina-5
Таблица 1.1
Расщепление в потомстве пестролистных растений мутантых линий var
Линия
Количество растений в потомстве
Количество мутантных
растений, %
зеленых
пестрых
белых, желтых
Var-1
27
8
5
32,5
Var-2
24
14
9
48,9
Var-3
30
4
0
11,8
Var-4
19
17
7
55,8
Var-6
17
5
4
34,6
Var-7
24
7
0
22,6
Var-8
18
10
1
37,9
Var-9
25
6
8
35,9
Var-10
69
6
14
22,5
Var-11
32
40
25
67,0
Var-12
23
26
42
74,7
Var-13
14
4
0
22,2
Var-14
56
29
8
39,8
Var-15
14
12
8
58,8
Var-17
33
4
9
28,3
Var-20
33
6
3
21,4
Var-23
25
14
12
51,0
Var-24
10
10
8
64,3
Var-25
32
27
13
55,6
Var-27
16
12
5
51,5
Var-28
22
8
4
35,3
Var-29
11
13
5
62,1
Var-30
29
6
0
17,1
Var-32
54
6
6
18,2
Var-33
22
10
8
45,0
Var-35
9
12
5
65,4
Всего
688
316
209
%
56,7 %
16
43,3 %
Таблица 1.2
Расщепление в потомстве пестролистных растений мутантых линий var
после самоопыления
Количество
Год
изученных
наблюдения
семей
1967
1968
1969
1970
1972
1973
1974
1976
1977
2000*
2001*
2003*
2004*
50
60
53
59
69
61
72
51
66
15
15
15
15
Количество растений в потомстве
белых
зеленых
пестрых
(желтых)
432
199
88
1128
536
491
1404
584
537
1126
457
310
1006
385
347
1145
325
268
1154
428
259
1404
431
778
927
261
772
556
267
192
547
227
162
461
283
126
395
201
179
Количество
мутантных
растений, %
39,9
47,7
44,4
40,5
42,1
34,1
37,3
46,2
52,7
45,2
41,6
47,0
49,0
Примечание: * – приведены результаты только по тем линиям пестролистных растений, которые были получены в 1967 году.
Безусловно, появление пестролистности еще не является свидетельством пластидной природы этого признака. В основе появления бесхлорофильных секторов на зеленом растении могут лежать различные
причины.
Во-первых, пестролистность может быть менделирующим признаком. В этом случае она чаще всего детерминируется рецессивной
аллелью одного ядерного гена. Примеры мозаичности такого рода отмечены у овса (Nishiyra, et al., 1966), кукурузы (Ullstrup et al., 1972),
сорго (Miller, 1968) и др. Достаточно указать на то, что еще в 1929 г.
Х. Матсура перечислил 45 различных родов высших растений, у которых были найдены случаи менделирующей пестролистности.
Хотя, как правило, факторы пестролистности бывают рецессивны
по отношению к зеленой окраске, однако в редких случаях мутантные гены могут проявляться фенотипически уже в первом поколении.
Например, у Dieffenbachia обнаружена пестролистность, которая контролируется одним доминантным геном (Henny, 1982). Причиной воз17
никновения соматической мозаичности могут являться хромосомные
аберрации. Было показано, что пестролистность у некоторых растений
связана с фрагментацией хромосом (Gupta, 1968). Кроме того, некоторые химические агенты, воздействуя на ахроматиновое веретено, вызывают явление анеуплоидии, которое может индуцировать появление
измененных клеток. Например, при анализе химеры типа albina у хризантемы обнаружено, что бесхлорофильный сектор образован клетками с 2n = 16 хромосомами, тогда как клетки зеленой ткани имели
2n = 18 (Rana, 1964).
Пестролистность может возникать вследствие парамутаций.
Парамутация – это прямое наследуемое изменение экспрессии парамутабельного аллеля в гетерозиготной ассоциации с другим (парамутабельным) аллелем. Этот феномен иногда называют соматической
конверсией или наследованием конверсионного типа. Парамутации –
это вариант нестабильности гена, действующего на гетерохроматин
рядом с локусом, который осуществляет метастабильную репрессию
активности гена. Известны многочисленные примеры подобного
рода, особенно парамутации в локусе sulfurea у томатов (Hagemann,
Berg, 1977). Однако в нашем случае они могут быть исключены,
так как основным условием появления парамутации является наличие
гетерозиготности.
Пестролистность может быть вызвана ген-индуцированными пластидными мутациями. Они известны у кукурузы (Thompson et al., 1983),
арабидопсиса (Redei, Plurad, 1973), ячменя (Prina et al., 1992) и многих
других видов растений. И, наконец, пестролистность могут детерминировать мутации в пластоме.
Для доказательства однородительского материнского наследования
мутантного признака были проведены реципрокные скрещивания пестролистных форм с растениями инбредной линии. В том случае, когда
пестролистные растения опыляли пыльцой зеленых растений, гибридное потомство расщеплялось в F1, как и при самоопылении. При обратном направлении скрещивания, т. е. когда в качестве материнского
растения использовали зеленое, а отцовским растением служила пестролистная форма, все потомство было зеленым и не расщеплялось
в последующих поколениях (табл. 1.3). Следует отметить, что константными оставалось и потомство зеленых растений, выщепляющихся в потомстве пестролистных форм.
18
Таблица 1.3
Расщепление в потомстве реципрокных гибридов,
полученных в результате скрещиваний пестролистных форм
с растениями исходной линии 3629
Год опытов
2008
2009
Направление
скрещивания
пестрое х зеленое
зеленое х пестрое
пестрое х зеленое
зеленое х пестрое
Кол-во растений в F1
белых
зеленых пестрых
(желтых)
688
373
188
763
0
0
1329
598
345
602
0
0
Кол-во
мутантных
растений, %
44,9
0
41,5
0
Имитация материнской наследственности может наблюдаться
при апомиксисе. Поскольку апомиксис иногда встречается у подсолнечника (Хохлов, 1967), был поставлен эксперимент по определению
возможности к апомиктическому способу размножения растений исходной материнской линии и пестролистных форм. Для этого у цветков 10 зеленых растений 3629 и 10 пестролистных растений из различных линий var удаляли тычинки, а затем растения инцухтировали.
Было обнаружено, что как у растений исходной линии, так и у пестролистных мутантов, только в единичных случаях, апомиктично может
образовываться незначительное количество плодов (не более 1–2 штук
на корзинку).
Поскольку фенотипически мутантные растения отличаются от исходных зеленых, прежде всего окраской листьев (от белой до желтозеленой), было проведено сравнительное исследование содержания
хлорофиллов и каротиноидов. Визуально по окраске мутантной ткани
пестролистные формы можно разбить на три группы (табл. 1.4).
Зеленые растения с белыми участками содержат в белых секторах
фактически следы хлорофиллов (0,2–3,0 % от контроля) и каротиноидов (6,5–9,2 % от контроля). Чуть больше пигментов у растений
с желтыми секторами (хлорофиллов – до 9 %, каротиноидов – до 40 %
от контроля). В растениях с желто-зелеными пятнами содержание зеленых пигментов и каротиноидов в мутантной ткани достигает 36,7
и 87,6 % от контроля, соответственно. Зеленые участки по содержанию
хлорофиллов приближаются к контрольным показателям или даже
превышают их. Мы предполагаем, что, поскольку мутантная ткань
фотосинтетически не активна и поддерживается за счет зеленой части,
19
Таблица 1.4
Содержание хлорофиллов а+b и каротиноидов в листовой ткани
пестролистных растений подсолнечника в фазу бутонизации
Линия
3629
Var 9, 10, 17, 32
Фенотип
ткани
зеленый
зеленый
белый
Var 1–2, 4, 6, 7,
11, 13–15, 20,
желтый
23, 25, 27–30,
33, 35
Var 3, 8, 12, 24 желто-зеленый
Хлорофиллы a+b
Каротиноиды
мг/г абс.
%
мг/г абс.
%
сухого веса от контр. сухого веса от контр.
7,9±0,5
100
2,17±0,7
100
7,60–8,80 96,2–111,3 2,01–3,12 92,6–143,8
0,02–0,24
0,2–3,0
0,14–0,20
6,5–9,2
0,19–0,74
2,4–9,4
0,45–0,86
20,7–39,6
1,10–2,90
14,0–36,7
0,95–1,90
43,8–87,6
снабжающей ее продуктами фотосинтеза, функциональная активность
последней может повышаться, что мы часто, и наблюдаем в зеленых
тканях пестролистных растений.
Для пластид в мутантных тканях характерны глубокие изменения
ультраструктуры. В норме хлоропласты подсолнечника зеленой линии 3629 имеют ультраструктуру, характерную для хлоропластов многих высших растений (рис. 1.5). Овальные или линзообразные хлоропласты окружены хорошо выраженной двойной мембраной и имеют
развитую ламеллярную систему, представленную ламеллами гран
и ламеллами стромы. В довольно плотном мелкозернистом матриксе
пластид имеются электронно-прозрачные участки, в которых видны
рибосомоподобные частицы и короткие ДНК-содержащие фибриллы.
На срезах хлоропластов подсолнечника видны зерна крахмала, которые локализованы внутри электронно-прозрачных участков матрикса.
Осмиофильные глобулы немногочисленны.
Анализ электроннограмм пластид из желтых участков листа показал, что только немногие из них содержат мембранный комплекс,
представленный лишь слабо развитыми тилакоидами стромы, граны отсутствуют (рис. 1.6). Строма пластид мелкозернистая, но менее
плотная для электронов, чем у исходной линии 3629. В матриксе видны
прозрачные для электронов участки с ДНК-содержащими фибрилами.
Зерна крахмала отсутствуют. Много осмиофильных глобул, которые
отражают нарушения образования мембранной системы.
20
Рис. 1.5. Ультраструктура хлоропластов на срезах листьев подсолнечника
инбредной линии 3629:
К – крахмальное зерно; М – митохондрии; ПГ – пластоглобулы;
ТГ – тилакоидные мембраны гран
Для белых мутантных тканей характерны пластиды с еще большими изменениями внутренней структуры (рис. 1.7). Пластиды не содержат тилакоидной системы, их матрикс представлен мелкодисперсным
содержимым с рассеянными в нем электронно-светлыми вакуолями.
Пластоглобулы наблюдаются в виде значительных скоплений мелких
электронно-плотных частиц.
21
22
Рис. 1.6. Ультраструктура пластид на срезах клеток,
взятых из желтой мутантной листовой ткани
(линия var-11):
ПГ – пластоглобулы; ТС – тилакоидные мембраны
стромы
Рис. 1.7. Ультраструктура пластид на срезах клеток,
взятых из белой мутантной листовой ткани
(линия var-10):
ВП – вакуоли пластид; ПГ – пластоглобулы
Таким образом, тонкое строение мутантных пластид значительно
отличается от контрольных. У них, прежде всего, частично или полностью отсутствует тилакоидная система в желтых и белых участках,
соответственно, а также изменены размеры и число пластоглобул.
Отмеченные изменения ультраструктуры пластид, очевидно, связаны
с ингибированием процесса образования ламеллярной системы в желто-белых секторах. Эти изменения коррелируют с вышеприведенными
данными по содержанию пигментов. О наличии тесной связи между
развитостью тилакоидной системы и содержанием пигментов известно
из работ других исследователей (Уоддингтон, 1964).
Тест на соматическое расщепление потомства еще со времен Э. Баура
и К. Корренса является одним из четких критериев пластомной обусловленности дефекта пластид. У высших растений этот тест широко
применяется для анализа пластомно обусловленной пестролистности (Давыденко, 1984). Тест основан на явлении сортировки мутантных и нормальных наследственных цитоплазматических детерминант
или несущих их органелл. Ядерные гены, расположенные в хромосомах, передаются в митозах потомству всех клеток в равной мере, и все
клетки организма обладают равными наследственными потенциями
по этим генам. Цитоплазматические же гены по причине множественности копий, в которых они представлены, и отсутствия механизма,
аналогичного митозу, для точного удвоения и распределения нормальных и мутантных органелл могут распределяться между дочерними
клетками асимметрично. Вследствие этого различные части растений
могут быть гетерогенными по цитоплазматическим генам и содержать
два их типа (нормальный и мутантный) в разных пропорциях.
При электронно-микроскопическом исследовании пестролистных
растений из различных линий var на границе между зеленой и мутантной тканями были обнаружены гетеропластидные клетки (рис. 1.8).
На снимке хорошо видно наличие в одной клетке пластид двух типов.
Мутантная пластида, расположенная на снимке слева, значительно отличается от нормальной. Ее ультраструктура типична для пластид белой
мутантной формы, т. е., наряду с присутствием органельных рибосом
внутренние мембранные структуры практически полностью отсутствуют. Внутренняя структура нормальной пластиды сходна с ультраструктурой хлоропластов исходной зеленой линии, имеющей развитую мембранную систему, состоящую из тилакоидов стромы и тилакоидов гран.
23
Рис.1.8. Гетеропластидная клетка (линия var-10):
НП – нормальная пластида; МП – мутантная пластида; Р – рибосомы;
ТГ – тилакоидные мембраны гран; ТС – тилакоидные мембраны стромы
Таким образом, на основании приведенных результатов (постоянное соматическое расщепление, однородительское материнское наследование мутантного признака, изменения внутренней структуры пластид, наличие на границе между нормальными и мутантными тканями
гетеропластидных клеток) сделан вывод о пластидной природе мутаций у внеядерных пестролистных форм подсолнечника.
24
1.2. Мутанты chlorinа
Второй по частоте индукции НММ группой жизнеспособных хлорофильных мутантов после пестролистных химер являются желто-зеленые
формы, или chlorina, по классификации А. Густафсона (Gustafsson, 1940).
Несмотря на сходство в окраске листьев, хлорофильные мутанты этого
типа являются неоднородной группой. Были выделены семьи с мутантными
растениями, сохраняющими желто-зеленую окраску в течение всего периода
вегетации. Формы из других мутантных семей зеленели к началу цветения,
почти не отличаясь в это время по окраске от зеленых растений исходной линии. У некоторых растений chlorina проявление мутантного признака наблюдается на более поздней, чем первая пара листьев, фазе развития.
В таблице 1.5 приведены результаты реципрокных скрещиваний
семи линий chlorina с зелеными растениями, свидетельствующие
о строго внеядерном характере наследования данных мутаций. Когда
в скрещиваниях с мутантами материнским растением является исходная линия 3629, в F1 всегда появляются только зеленые растения.
При реципрокных скрещиваниях в F1 представлен исключительно
мутантный фенотип. В последующих поколениях F2, F3 ни зеленые,
ни мутантные формы не расщепляются. Этот тип мутаций получил
обозначение как en:chlorina (extranuclear chlorina).
Таблица 1.5
Реципрокные скрещивания мутантов en:chlorina с зелеными растениями
исходной линии 3629
Вид скрещивания
en:chlorina-1 x 3629
3629 x en:chlorina-1
en:chlorina-2 x 3629
3629 x en:chlorina-2
en:chlorina-3 x 3629
3629 x en:chlorina-3
en:chlorina-5 x 3629
3629 x en:chlorina-5
en:chlorina-6 x 3629
3629 x en:chlorina-6
en:chlorina-7 x 3629
3629 x en:chlorina-7
en:chlorina-8 x 3629
3629 x en:chlorina-8
Фенотип растенй F1
зеленые
0
42
0
37
0
54
0
57
0
52
0
41
0
35
сhlorina
51
0
41
0
59
0
33
0
31
0
44
0
56
0
Фенотип растенй F2
зеленые
0
996
0
583
0
861
0
712
0
691
0
786
0
403
сhlorina
568
0
373
0
601
0
395
0
443
0
412
0
312
0
25
Однако не все мутанты chlorina проявляют «классические» различия
при реципрокных скрещиваниях. Об этом свидетельствуют данные,
приведенные в таблице 1.6. На основании анализа потомства гибридов
F1 растения этих линий были отнесены к мутантам, имеющим сложный
тип наследования хлорофильного дефекта, обусловленный взаимодействием ядра и цитоплазмы.
Таблица 1.6
Расщепление гибридов от скрещивания мутантов chlorina
с зелеными растениями исходной линии 3629
Количество растений F1
Вид скрещивания
en:chlorina-4 x 3629
3629 x en:chlorina-4
en:chlorina-9 x 3629
3629 x en:chlorina-9
en:chlorina-10 x 3629
3629 x en:chlorina-10
en:chlorina-11 x 3629
3629 x en:chlorina-11
en:chlorina-12 x 3629
en:3629 x chlorina-12
зеленые
7
33
62
99
46
83
38
44
51
46
chlorina
15
0
21
0
76
0
12
0
39
0
хantha
0
0
0
0
34
0
0
0
0
0
Мутанты chlorina различаются между собой, и в первую очередь, отличаются от зеленых растений количеством зеленых пигментов, габитусом и продуктивностью. В таблице 1.7 приведены некоторые морфофизиологические показатели, а также степень снижения хлорофиллов
у растений chlorina. Видно, что все рассматриваемые мутанты это относительно низкорослые, малопродуктивные и мелкосемянные формы
с пониженным содержанием хлорофиллов (54,6–91,6 %) по сравнению
с контрольными растениями 3629.
Для пестролистных химер подсолнечника было показано, что между
количеством хлорофиллов и степенью сформированности внутренней
структуры хлоропластов имеется высокая корреляция. Эта закономерность наблюдается и у мутантов chlorina. Так, наименьшее количество
хлорофиллов содержат растения en:chlorina-11 (табл. 1.7). Структурная
организация пластид у данного мутанта также имеет наибольшие отклонения от нормы среди других линий chlorina. К таким различиям относятся набухание отдельных тилакоидов и менее выраженная структура тилакоидов гран (рис. 1.9).
26
Таблица 1.7
Морфофизиологическая характеристика внеядерных мутантов chlorina
подсолнечника
Линия
3629
en:chlorina-1
en:chlorina-2
en:chlorina-3
en:chlorina-4
en:chlorina-5
en:chlorina-6
en:chlorina-7
en:chlorina-8
en:chlorina-9
en:chlorina-10
en:chlorina-11
en:chlorina-12
ПродуктивДиаметр
ность
Высота, см корзинки,
одного рассм
тения, г
145,5±1,5
10,9±0,3
34,6±1,6
102,4±1,7
6,9±0,5
21,0±1,2
117,9±1,6
7,7±0,4
26,2±2,7
99,0±2,2
6,1±0,3
14,5±1,9
112,3±3,6
7,6±0,6
19,7±1,4
115,9±2,1
8,7±0,4
23,3±3,1
97,7±1,9
7,2±0,4
20,5±1,5
110,3±1,5
7,1±0,4
21,5±1,2
82,4±2,2
4,7±0,6
10,3±2,2
90,6±2,0
5,1±0,5
12,7±3,1
109,9±2,4
7,8±0,5
23,7±1,8
105,1±2,9
7,4±0,3
18,6±2,4
131,7±2,3
8,1±0,3
25,7±3,2
Вес 1 000
семян, г
42,7±1,4
24,7±1,8
37,4±2,1
21,2±2,4
29,9±3,0
26,1±1,5
35,2±0,9
30,7±1,2
17,2±2,6
22,4±2,3
33,2±1,5
30,7±1,9
38,0±2,1
Кол-во
хлорофиллов
а + b, мг/г
сух. веса
7,52±0,17
6,13±0,23
6,02±0,33
6,19±0,31
4,86±0,18
5,51±0,11
6,91±0,31
5,78±0,16
5,75±0,56
5,51±0,25
4,51±0,38
4,11±0,37
5,44±0,36
Методом электронного микроскопирования был проведен сравнительный анализ формы и размеров хпДНК линии 3 629 и мутантов
en:chlorina-5 и en:chlorina-12. Показано, что хпДНК у трех исследуемых
линий кольцевой формы и находятся в сверхспирализованном и релаксированном состояниях (рис. 1.10) с контурной длиной 49,2±0,9 ммк,
50,6±1,2 и 49,7±0,6 ммк, соответственно.
Для выявления изменений в последовательности нуклеотидов ДНК органелл у мутантов en:chlorina в лаборатории чл.-кор.
НАН Беларуси О.Г. Давыденко (ИциГ НАН Беларуси) был проведен
сравнительный электрофоретический анализ рестрикцированной эндонуклеазами пластидной и митохондриальной ДНК, позволяющий
проводить исследования на уровне фрагментов (Трибуш и др., 1998;
Triboush et al., 1999).
Сравнительный электрофоретический анализ рестрицированной
13-ю эндонуклеазными ферментами (BamH I, Bgl II, Bgl III, Bsp 681,
EcoR I, Hind III, Hpa I, Pst I, Sac I, Sal I, Sma I, Xba I, Xho I) хпДНК му27
тантных линий en:chlorina и исходной родительской формы 3629 выявил
полиморфизм хпДНК только у одного фермента – Hind III (рис. 1.11).
В электрофоретическом спектре хпДНК у линии en:chlorina-6 исчез
фрагмент размером 8,9 т.п.н. и появлялись два дополнительных, более легких фрагмента длиной – 5,2 и 3,7 т.п.н. Сумма размеров вновь
появившихся фрагментов была приблизительно равна размеру исчезнувшего – 8,9 т.п.н. Это означает, что в 8,9 т.п.н./HindIII-фрагменте
хпДНК линии en:chlorina-6 возникла мутация, в результате которой появился новый сайт узнавания (A↓ЇAGCTT) для эндонуклеазы Hind III.
Новый сайт для фермента Hind III был обнаружен в рестрикционных спектрах хпДНК еще двух мутантов: en:chlorina-2 и en:сhlorina-7
(рис. 1.11). В хпДНК этих линий возник аналогичный тип перестройки нуклеотидной последовательности: исчез один фрагмент размером
6,7 т.п.н. и появились два дополнительных более легких фрагмента 3,2
и 3,5 т.п.н. Сравнение суммарного размера вновь появившихся фрагментов с исчезнувшим позволяет предположить возникновение мутантного сайта для эндонуклеазы Hind III в нуклеотидной последовательности фрагмента размером 6,7 т.п.н.
Сравнительный анализ локализации мутаций en:chlorina-2,
en:chlorina-6, en:chlorina-7 с результатами многочисленных филогенетических исследований хпДНК высших растений свидетельствует,
что область локализации индуцированых НММ-мутаций en:chlorina
у подсолнечника находится в так называемых «горячих» точках эволюции, т.е. участках хпДНК, наиболее часто подверженных эволюционным изменениям в результате делеций, инсерций и замен нуклеотидов
(Tassopulu, Kung, 1984; Hipkins et al., 1995).
Изменений в последовательности нуклеотидов митохондриальной
ДНК у мутантов en:chlorina не обнаружено. Однако полностью исключить наличие точечных мутаций в мтДНК у исследованных мутантных
линий нельзя, так как они могут лежать за пределами разрешающей
способности использованного метода.
Таким образом, результаты данного исследования убедительно подтверждают пластомную природу мутаций en:chlorina у внеядерных мутантов подсолнечника. Следует подчеркнуть, что сходный фенотипический эффект – желто-зеленая окраска листьев – вызывают мутации,
28
Рис. 1.9. Ультраструктура пластид мутанта en:chlorina-11:
K – крахмальное зерно; ПГ – пластоглобулы; ТГ – тилакоидные мембраны гран
29
Рис. 1.10. Электронная микрофотография кольцевой молекулы хпДНК
подсолнечника (инбредная линия 3629)
30
31
Рис. 1.11. Электрофоретический спектр хпДНК мутантов en:chlorinа подсолнечника,
рестрицированной эндонуклеазой Hind III:
1 – λ/Pst I; 2 – λ/Hind III; 3 – en:chlorinа-1; 4 – en:chlorinа-2; 5 – en:chlorinа-3; 6 – en:chlorinа-5;
7 – en:chlorinа-6; 8 – en:chlorinа-7; 9 – 3629; 10 – en:chlorinа-8; 11 – en:chlorinа-9; 12 – en:chlorinа-10;
13 – en:chlorinа-11; 14 – en:chlorinа-12; 15 – 3629
локализованные в разных местах хлоропластного генома (Даниленко,
Давыденко, 2003). Дальнейшие исследования более высокоразрешающими методами анализа структуры геномов клеточных органелл позволят локализовать мутации и в остальных линиях en:chlorina.
1.3. Реверсионные мутанты
Реверсионный анализ является классическим методом изучения
мутационного процесса. В литературе широко освещены исследования по возвратному мутированию ядерных и митохондриальных генов
высших растений (Boguta et al., 1992; Bellaoui et al., 1998; Greene et al.,
1998; Janska et al., 1998). Однако пока крайне редко используются тесты на ревертирование мутантных признаков, контролируемых пластогенами. Тем не менее, применение реверсионного анализа актуально
не только для глубокого исследования природы мутаций в хпДНК, но и
для понимания функциональных особенностей пластид, механизмов
их взаимодействия с ядерным геномом. В связи с этим были изучены
особенности ревертирования мутантных признаков подсолнечника,
контролируемых пластогенами, а также проведен генетический и морфофизиологический анализы спонтанных и индуцированных НММревертантов из коллекции пластидных хлорофильных мутантов подсолнечника НИИ биологии ЮФУ.
В серии экспериментов использовали модель, основанную на анализе возникающих в потомстве (на протяжении семи генераций) пластомных мутантов en:chlorina фенотипически однородных ревертантных растений. В связи с тем, что реверсии пластидных хлорофильных
мутаций возникают спонтанно только в единичных случаях, для повышения частоты ревертирования использовали НММ. При этом
действие НММ как цитоплазматического мутагена модифицировали
кофеином.
Семянки пластомных en:chlorina-1, en:chlorina-7 и ядерного
n:chlorina-9 (монофакториальный, рецессивный тип наследования) мутантов обрабатывали НММ (0,02 %). Контрольные семена помещали
в воду. Часть семян, обработанных НММ, дополнительно обрабатывали 5·10–3М раствором кофеина. В М1 в каждом варианте опыта отбирали растения, фенотипически сходные с исходными мутантами chlorinа.
Все растения стали родоначальниками линий, потомство которых изучали на протяжении семи генераций. В М2 и последующих поколени32
ях, до М7 включительно, высевали по 100 семянок от одного растения
из каждой изучаемой семьи, фенотипически сходного с соответствующими мутантами chlorinа. Семьей мы обозначили потомство от самоопыления одного исходного растения М1. Такая схема опыта позволила
регистрировать возникновение новых реверсионных мутантов в каждом поколении по исходным семьям М1 раздельно.
При проведении гибридологического анализа ревертанты реципрокно скрещивали с соответствующими мутантами chlorina, а также
с растениями исходной линии 3629. Изучали поколения F1 и F2. В контроле у всех мутантов chlorinа наследуемых изменений не обнаружено,
хотя у каждого мутанта было исследовано потомство 20 растений М1.
В М1 и М2 после обработки семянок мутантов chlorina, как НММ,
так и совместно НММ с кофеином, реверсионных форм не обнаружено. Ревертанты в потомстве ядерного и пластомных мутантов впервые
возникли только в М3. При этом возникновение ядерных реверсий
в последующих поколениях не наблюдали, а внеядерные реверсии
у пластомных мутантов продолжали выщепляться до М7 включительно
(табл. 1.8).
Внеядерные реверсионные мутанты, выделенные в М3–М7, были
разделены на два типа: полные ревертанты (r-en:chlorina), у которых
полностью восстанавливались цвет листьев и габитус до нормальных
зеленых растений 3629, и частичные ревертанты (pr-en:chlorina), у которых восстанавливался только габитус, а цвет листьев и, соответственно, содержание пигментов не отличались от исходных растений chlorina (табл. 1.9). Результаты гибридологического анализа, содержания
хлорофиллов в листовой ткани и показателей габитуса прямых потомков, являющихся 15-м и 12-м поколением полного и частичных ревертантов, выделенных в М3 и М6 соответственно, приведены ниже.
Анализируя результаты, приведенные в таблицах 1.8 и 1.9, можно
сделать несколько обобщений. Все зеленые ревертанты (8 семей), выделенные в потомстве ядерного мутанта n:chlorina-9, имели только ядерную природу реверсий. Полные ревертанты, выделенные в потомстве
пластомных мутантов, имели как ядерный (2 семьи), так и внеядерный
тип наследования, а частичные – только внеядерный тип наследования. Постобработка кофеином у всех трех мутантов chlorina увеличивала в различной степени частоту как ядерных, так и внеядерных (полных
и частичных) реверсий, по отношению к действию одной НММ. Тем не
33
34
18
27
НММ
НММ+
кофеин
14
16
НММ
НММ+
кофеин
12
19
НММ
НММ+
кофеин
Общее
число изученных
семей М1
Вариант
опыта
М4
М5
М6
М7
Примечание: * – в числителе абсолютная величина, в знаменателе – %; ** – в трех вариантах опыта общее количество внеядерных ревертантов меньше, чем их арифметическая сумма в связи с тем, что в потомстве трех растений М1 возникли и полные и частичные реверсии, а именно: en:chlorina-1 (НММ + кофеин) – М4 (r-en:chlorina) и М6 (pr-en:chlorina); en:chlorina-7
(НММ) – М3 (r-en:chlorina) и М6 (pr-en:chlorina); en:chlorina-7 (НММ+кофеин)–М3 (r-en:chlorina) и М5 (pr-en:chlorina).
n:chlorina-9
еn:chlorina-7
еn:chlorina-1
Мутанты
chlorinа
М3
Общее
количество
семей М1
с реверсиями
вневневневневневнеядерядерядерядерядерядерядерядерядерядерядерядерные
ные
ные
ные
ные
ные
ные
ные
ные
ные
ные
ные
1
1
2
1
2
7
–
–
–
–
–
5,3
5,3
10,5
5,3
10,5
36,8
1*
1
1
1
4
1
6**
–
–
–
–
–
8,3
8,3
8,3
8,3
33,3
8,3
50,0
1
2
5
7**
–
–
–
–
–
–
–
–
6,3
12,5
31,3
43,8
1
2
1
4
2
1
8**
–
–
–
–
–
7,1
14,3
7,1
28,6
14,3
7,1
57,1
3
3
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
11,1
11,1
5
5
–
–
–
–
–
–
–
–
–
–
27,8
27,8
Таблица 1.8
Количество семей с ядерными и внеядерными реверсиями, возникшими в М3–М7-генерациях после
однократного воздействия НММ на мутанты chlorina
35
14
16
НММ
НММ+
кофеин
12
19
НММ+
кофеин
НММ
Число
Вариант
семей
опыта
М1
М4
М5
М6
М7
rprrprrprrprrpren:chl en:chl en:chl en:chl en:chl en:chl en:chl en:chl en:chl en:chl
1*
1
1
1
1
2
–
–
–
–
5,3
5,3
5,3
5,3
5,3
10,5
1
1
1
1
3
–
–
–
–
–
8,3
8,3
8,3
8,3
25,0
1
1
1
2
3
–
–
–
–
–
6,3
6,3
6,3
12,5
18,8
2
1
2
2
2
–
–
–
–
–
14,3
7,1
14,3
14,3
14,3
М3
Примечание: * – в числителе абсолютное значение, в знаменателе – %.
еn:chlorina-7
еn:chlorina-1
Мутанты
chlorinа
Число семей М1 с внеядерными реверсиями
Общее количество семей
М1 с внеядерными
реверсиями
rpren:chl en:chl
4
3
21,1
15,8
3
4
25,0
33,3
4
4
25,0
25,0
4
5
28,6
35,7
Таблица 1.9
Количество семей с полными (r-en:chlorina) и частичными (pr-en:chlorina) реверсиями внеядерной природы,
возникшими в М3–М7 генерациях после однократного воздействия НММ на мутанты en:chlorina
менее, это не привело к принципиальному изменению характера динамики ревертирования после индуцированного НММ-мутагенеза.
Учитывая, что у пластомных мутантов в потомстве трех растений М1
в разных поколениях возникли и полные и частичные реверсии (см.
примечание к табл. 1.8), можно определить долю семян М1, в потомстве
которых за семь поколений возникли реверсии внеядерной природы.
Для мутантов en:chlorina-1 и en:chlorina-7 (в двух вариантах) она составила 41,9 и 50,0 %, соответственно. Это означает, что в потомстве практически каждого второго семени пластомных мутантов, обработанных
НММ, за 7 генераций возникли фенотипически четко регистрируемые
ревертантные формы внеядерной природы. Полученные результаты
могут свидетельствовать о значительном объеме скрытой генетической
изменчивости, локализованной в геномах пластид и митохондрий растений, несмотря на их ограниченную информационную емкость.
На протяжении ряда лет воспроизводства коллекции пластомных
мутантов подсолнечника у мутантов en:chlorina-3 и en:chlorina-5 мы наблюдали возникновение реверсий. Результаты гибридологического
анализа спонтанных ревертантов сведены в таблице 1.10.
Таблица 1.10
Генетический анализ спонтанных реверсий r-en:chlorina-3
и r-en:chlorina-5
Вид скрещивания
Фенотип растений F1
Фенотип растений F2
зеленые сhlorina зеленые сhlorina
еn:сhlorina-3 x r-еn:сhlorina-3
108
0
63
20
r-еn:сhlorina-3 х еn:сhlorina-3
87
0
126
39
еn:сhlorina-5 x r-еn:сhlorina-3
112
0
59
19
еn:сhlorina -3 x r-еn:сhlorina-5
76
0
142
45
еn:сhlorina-2 x r-еn:сhlorina-3
76
0
96
29
r-еn:сhlorina-3 х еn:сhlorina-2
119
0
153
48
еn:сhlorina-5 x r-еn:сhlorina-5
r-еn:сhlorina-5 x еn:сhlorina-5
r-еn:сhlorina-5 x линия 3629
0
61
15
47
0
0
0
137
130
178
0
0
36
Х2, Р
0,037;
0,9>Р>0,75
0,164;
0,75>P>0,5
0,017;
0,95>Р>0,9
0,087;
0,9>Р>0,75
0,205;
0,75>Р>0,5
0,134;
0,75>Р>0,5
–
–
–
Ревертантные растения r-en:chlorina-3 возникли в потомстве мутанта en:chlorinа-3 через 20 лет его культивировании в строгом инцухте. В потомстве появившихся зеленых растений (у 7 из 12 изученных)
наблюдали расщепление в соотношениях 116 зеленых: 34 chlorina, которое было близко к соотношению 3:1 (Х2=0,439; Р<0,5). Потомство
остальных ревертантов оставалось константным и не расщеплялось.
При скрещивании мутанта en:chlorina-3 с нерасщепляющимися ревертантами все растения F1 имели зеленую окраску, а в F2 (в потомстве трех
растений) наблюдали расщепление, также очень близкое к отношению 3:1 (см. табл. 1.10). На основании полученных результатов можно
сделать вывод о возникновении у мутанта en:chlorinа-3 ядерной доминантной мутации, супрессирующей проявление пластомного хлорофильного дефекта. Интересно, что эта мутация подавляет также и фенотипическое проявление пластидных мутаций у растений en:chlorinа-2
и en:chlorinа-5 (см. табл. 1.10). Так, после реципрокных скрещиваний
мутантов en:chlorina-2 и en:chlorina-5 с r-en:chlorina-3, все растения F1,
независимо от направлений скрещиваний, имели зеленую окраску, а в
F2 наблюдали расщепление после прямых скрещиваний – 96 зеленых:
29 chlorina и 59 зеленых: 19 chlorina, и обратных – 153 зеленых: 48 chlorina и 142 зеленых: 45 chlorina, соответственно. Полученные соотношения также подтверждают ядерную доминантную природу супрессии
данных хлорофильных мутаций.
Примеры генетической комплементации при совмещении различных наследственных систем в литературе известны. Так, еще в 60-х
годах ХХ в. Дж. Эдвардсон показал, что при скрещивании растений
табака с внеядерной пестролистностью в качестве женского родителя
с семью разновидностями этой культуры в двух скрещиваниях происходило устранение пестролистности в F1 (Edwarson, 1966). Однако в нашем случае ядерная супрессорная мутация ревертанта r-en:chlorina-3
возникла на единой ядерной генетической основе исходной линии
3629, а не при совмещении генетически чужеродного ядра с мутантными пластомами.
Ревертантные растений r-en:chlorina-5 возникли в потомстве мутанта en:chlorinа-5 через 11 лет его культивирования в строгом инцухте.
Было показано, что возврат к зеленой окраске в данном случае определяется супрессорной мутацией, вызывающей в пластидах усиленное
гранообразование (Белецкий и др., 1981). На основании результатов
37
приведенных в таблице 1.10, был сделан вывод, что ген-супрессор
в пластоме обусловил возникновение реверсии r-en:chlorina-5.
В коллекцию были включены полный ревертант r-en:chlorina-7, выделенный в М3 и частичные ревертанты рr(1–9)-en:chlorina-7, выделенные в М6, после обработки семянок мутанта en:chlorina-7 мутагеном
(см. выше). Результаты генетического анализа этих ревертантов свидетельствуют о строго материнском наследовании выделенных реверсий
(табл. 1.11).
Таблица 1.11
Генетический анализ ревертантов r-en:chlorina-7 и pr(1–9)-en:chlorina-7
Вид скрещивания
еn:chlorina-7 x r-en:chlorina-7
r-en:chlorina-7 x еn:chlorina-7
r-en:chlorina-7 x 3629
еn:chlorina-7 x
pr1-en:chlorina-7
pr1-en:chlorina-7 x
еn:chlorina-7
рr1-en:chlorina-7 x 3629
еn:chlorina-7 x
pr2-en:chlorina-7
pr2-en:chlorina-7 x
еn:chlorina-7
рr2-en:chlorina-7 x 3629
еn:chlorina-7 x
pr4-en:chlorina-7
pr4-en:chlorina-7 x
еn:chlorina-7
рr4-en:chlorina-7 x 3629
еn:chlorina-7 x
pr5-en:chlorina-7
pr5-en:chlorina-7 x
еn:chlorina-7
рr5-en:chlorina-7 x 3629
еn:chlorina-7 x
pr6-en:chlorina-7
pr6-en:chlorina-7
x еn:chlorina-7
38
Фенотип растений F1
Фенотип растений F2
зеленые
0
126
181
pr
–
–
–
pr
–
–
–
сlorina
195
0
0
–
0
56
–
0
93
–
83
0
–
111
0
0
72
–
0
129
–
–
0
61
–
0
104
–
70
0
–
116
0
0
91
–
0
131
–
–
0
47
–
0
89
–
61
0
–
104
0
0
82
–
0
112
–
–
0
63
–
0
107
–
89
0
–
123
0
0
96
–
0
143
–
–
0
59
–
0
118
–
79
0
–
117
0
chlorina зеленые
87
0
0
271
0
312
Окончание табл. 1.11
Вид скрещивания
Фенотип растений F1
Фенотип растений F2
pr
83
0
58
73
pr
131
0
119
107
сlorina
–
97
0
–
зеленые
рr6-en:chlorina-7 x 3629
0
еn:chlorina-7 x pr7-en:chlorina-7
–
pr7-en:chlorina-7 x еn:chlorina-7
–
рr7-en:chlorina-7 x 3629
0
еn:chlorina-7 x
–
pr8-en:chlorina-7
pr8-en:chlorina-7 x
–
еn:chlorina-7
рr8-en:chlorina-7 x 3629
0
еn:chlorina-7 x
–
pr9-en:chlorina-7
pr9-en:chlorina-7 x
–
еn:chlorina-7
рr9-en:chlorina-7 x 3629
0
chlorina зеленые
–
0
36
–
0
–
–
0
0
103
–
0
167
119
0
–
175
0
132
–
0
203
–
0
92
–
0
139
84
0
–
151
0
111
–
0
163
–
Мы полагаем, что мутационные изменения в пластоме приводят
к полным реверсиям, а возникновение частичных ревертантов обусловлено мутациями в мтДНК, имеющими супрессивный или компенсаторный характер (Усатов и др., 2004). Это предположение подтвердили
результаты сравнительного молекулярно-генетического исследования
хпДНК и мтДНК ревертантов и их исходных форм (3629 и en:chlorina-7),
проведенные в лаборатории О.Г. Давыденко (ИциГ НАН Беларуси).
Оказалось, что у полного ревертанта r-en:chlorina-7 в хлоропластном
геноме возникла истинная реверсия, а у всех частичных ревертантов
рr(1–9)-en:chlorina-7 сохраняется измененная первичная структура
хпДНК мутанта en:chlorina-7 по сравнению с таковой у линии 3629
(Triboush et al., 1999). Однако при этом у всех частичных ревертантов
обнаружены перестройки в последовательности нуклеотидов мтДНК
(Трибуш, и др., 1998).
В таблице 1.12 приведены результаты морфофизиологических измерений ревертантов и их исходных форм. У пластомных мутантов
en:chlorina-3, en:chlorina-5, en:chlorina-7 содержание хлорофиллов a+b
достоверно ниже по сравнению с исходной линией 3629. У ревертантов
r-en:chlorina-3, r-en:chlorina-5, r-en:chlorina-7 полностью восстанавливается содержание зеленых пигментов и по данному показателю они не
39
отличаются от растений линии 3629. У всех частичных ревертантов
рr(1–9)-en:chlorina-7 с желто-зеленой окраской листьев, количество
хлорофиллов остается на уровне мутантных растений en:chlorina-7.
Таблица 1.12
Морфофизиологическая характеристика реверсионных мутантов
подсолнечника и их исходных форм
Линия
Высота растений, см
ПродуктивДиаметр
ность
корзинки,
одного рассм
тения, г
3629
еn:chlorina-3
r-en:chlorina-3
еn:chlorina-5
r-en:chlorina-5
еn:chlorina-7
r-en:chlorina-7
рr1-en:chlorina-7
рr2-en:chlorina-7
рr4-en:chlorina-7
рr5-en:chlorina-7
рr6-en:chlorina-7
рr7-en:chlorina-7
рr8-en:chlorina-7
рr9-en:chlorina-7
145,5±1,5
109,0±2,2***
156,7±3,4**
115,9±2,1***
112,6±2,7***
110,3±1,5***
155,9±3,2**
133,2±2,7***
123,5±1,7***
108,6±2,0***
135,3±3,1**
124,2±2,4***
127,6±2,8***
148,8±3,5
122,9±2,6***
10,9±0,3
6,1±0,3***
12,8±0,4***
8,7±0,4***
10,5±0,5
7,1±0,4***
13,6±0,7***
10,1±0,6
9,2±0,9
8,8±0,3***
10,7±0,4
10,0±0,6
9,9±0,5
11,2±0,4
9,9±0,5
34,6±1,6
14,5±1,9***
41,7±2,0*
23,3±3,1***
29,3±2,1*
21,5±1,2***
44,4±2,7**
26,5±2,1**
27,4±3,2*
22,2±2,8***
28,1±1,2**
26,3±2,0**
25,9±1,8***
35,1±3,0
32,2±1,7
Вес 1000
семян, г
42,7±1,4
21,2±2,4***
40,9±1,5
26,1±1,5***
35,1±1,7***
30,7±1,2***
51,3±2,6**
38,0±1,8*
43,9±1,4
40,8±1,9
36,3±2,0*
37,7±1,8*
36,1±2,2*
41,4±2,3
40,1±1,8
Содержание
хлорофиллов a+b,
мг/г сух.
веса
7,52±0,17
6,19±0,31***
7,68±0,19
5,51±0,11***
7,81±0,24
5,78±0,16***
7,61±0,14
5,56±0,11***
5,39±0,32***
5,43±0,23***
6,08±0,19***
5,80±0,40***
5,31±0,33***
5,72±0,17***
5,60±0,19***
Примечание: * – достоверные отличия по сравнению с линией 3629 при P<0,05;
** – достоверные отличия по сравнению с линией 3629 при P<0,01; *** – достоверные отличия по сравнению с линией 3629 при P<0,001
Высота, диаметр корзинки и масса семян у пластомных мутантов
en:chlorina-3, en:chlorina-5, en:chlorina-7 достоверно ниже по сравнению
с линией 3629 (при P<0,001). Пластидная супрессия хлорофильной
мутации влияет на габитус и продуктивность растений r-en:chlorina-5
неоднозначно. Если высота растений остается на уровне мутанта
en:chlorina-5, то диаметр корзинки у ревертантов r-en:chlorina-5 увеличивается до исходного размера (линия 3629) и превышает таковой показатель для en:chlorina-5 на 20,7 %. По продуктивности и весу семянок
ревертант имеет промежуточные показатели, достоверно отличающиеся, как от мутанта en:chlorina-5, так и линии 3629.
40
Ядерная супрессия пластидной мутации (линия r-en:chlorina-3)
также приводит к нормализации процессов роста растений и формирования семян. Более того, показатели высоты растений и диаметра
корзинки у данного ревертанта не только значительно выше, чем у
исходного мутанта en:chlorina-3, но и достоверно превышают таковые
для линии 3629.
У растений линии r-en:chlorina-7 происходит увеличение изучаемых
показателей по сравнению не только с линией en:chlorina-7, но и с исходной линией 3629. Особенно значимым является увеличения диаметра корзинки (на 24 % по сравнению с линией 3629) и урожайности
растений. Вес семян одного растения увеличивается на 28 %, а масса
1000 семян – на 20 % по сравнению с растениями линии 3629.
У частичных ревертантов рr(1–9)-en:chlorina-7 степень восстановления изучаемых признаков различна. У всех частичных ревертантов,
за исключением рr4-en:chlorina-7 высота растений достоверно выше
(Р<0,001) по сравнению с растениями линии en:chlorina-7. Однако
все они, за исключением рr8-en:chlorina-7, по данному признаку уступают растениям исходной инбредной линии 3629 и зеленому ревертанту
r-en:chlorina-7. Таким образом, у частичных ревертантов рr(1,2,5,6,7,9)en:chlorina-7 наблюдается частичная реверсия признака «высота растений». У ревертанта рr8-en:chlorina-7 происходит полное восстановление высоты растений до высоты контрольной линии 3629, а у линии
рr4-en:chlorina-7 реверсия по данному признаку отсутствует. По показателю «диаметр корзинки» частичные ревертанты превосходят исходный пластомный мутант en:chlorina-7, но уровня, соответствующего
полному ревертанту не достигают.
Продуктивность всех частичных ревертантов, за исключением
рr8-en:chlorina-7, рr9-en:chlorina-7 значительно ниже, как по сравнению
с линией 3629, так и по сравнению с полным ревертантом r-en:chlorina-7.
У частичных ревертантов рr8-en:chlorina-7 и рr9-en:chlorina-7 данный
показатель восстанавливается до уровня линии 3629, однако остается
статистически ниже (при Р<0,05 и Р<0,001 соответственно) по сравнению с r-en:chlorina-7.
По размеру семян, косвенно оцениваемому как вес 1000 семянок, наблюдается полная реверсия у четырех линий – рr(2,4,8,9)-en:chlorina-7.
У других – рr(1,5,6,7)-en:chlorina-7 – происходит частичная реверсия.
Показатели веса 1000 семянок в данном случае превзошли таковой показатель для линии en:chlorina-7, однако остались ниже контроля 3629.
41
Как было отмечено выше, восстановление мутантного фенотипа
может происходить либо за счет истинной реверсии, либо за счет вторичных мутаций, носящих супрессивный или компенсаторный характер. В связи с тем, что биогенез хлоропластов находится под двойным
генетическим контролем, к восстановлению мутантных признаков,
обусловленных пластидными мутациями, до исходного фенотипа могут приводить вторичные мутации, как в ядре, так и непосредственно
в органеллах.
Опираясь на приведенные выше результаты, можно заключить,
что степень восстановления признаков зависит от типа реверсии.
Восстановление первичной структуры хлоропластной ДНК при истинной реверсии (r-en:chlorina-7) не только снимает негативные последствия пластидной мутации, но и, вероятно, за счет сформировавшегося
компенсаторного комплекса генов обеспечивает более мощное выражение морфофизиологических признаков.
Ядерная супрессорная мутация (r-en:chlorina-3) полностью снимает
негативные последствия мутации, возникшей в хлоропластной ДНК.
У ревертантов восстанавливается нормальное содержание хлорофиллов a+b. Показатели габитуса и продуктивность растений не только
восстанавливаются, а даже превышают таковые, у исходных растений 3629. Однако у ревертанта сохраняется повышенная устойчивость
к сульфатному засолению, присущая мутанту en:chlorina-3 (см. главу 2).
Наличие пластидной (r-en:chlorina-5) или митохондриальной
(рr(1–9)-en:chlorina-7) супрессорных мутаций приводит к реверсии
по отдельным признакам. Пластидный ген-супрессор восстанавливает
содержание хлорофилла в листьях растений. Хотя сравнительный ультраструктурный анализ хлоропластов листовой ткани растений линий
3629, en:chlorina-5, r-en:chlorina-5 показал, что реверсия окраски листьев у ревертанта r-en:chlorina-5 не связана с полным восстановлением тонкой структуры пластид до нормы (Белецкий и др., 1981). Так же
как и у мутанта en:chlorina-5, в хлоропластах ревертантных растений
r-en:chlorina-5 сохраняется, хотя и в меньшей степени, вакуолизация
внутритилакоидного пространства. Однако при этом в них наблюдается мощно развитая система гран, иногда превышающая таковую даже
у пластид растений исходной линии 3629. Возможно, что это является
основой для восстановления зеленой окраски у растений ревертантов.
Так же следует отметить, что у ревертанта r-en:chlorina-5 исчезает по42
вышенная устойчивость к засухе, присущая исходному мутанту (см.
главу 2).
Наличие митохондриальной супрессии не влияет на уровень хлорофиллов и структуру хлоропластов. Показано, что в клетках частичных
ревертантов рr(1–9)-en:chlorina-7 сохраняются все нарушения внутренней структуры хлоропластов, отмеченные для мутанта en:chlorina-7.
В то же время у частичных ревертантов увеличивается число митохондрий на клетку (Трибуш и др., 1998), что может быть основой для некоторого восстановления габитуса растений и повышения их продуктивности по сравнению с мутантом en:chlorina-7.
Таким образом, представленные результаты свидетельствуют,
что ревертирование хлорофильных пластидных мутаций может происходить различными путями, приводя к полному (истинная реверсия)
или частичному (ядерная, митохондриальная и пластидная супрессии)
восстановлению мутантного фенотипа. Характер реверсии определяет
степень восстановления морфологических и физиологических признаков пластидных мутантов.
Литература
Анисимова И.Н., Гаврилова В.А., Рожкова В.Т. и др. Молекулярные
маркеры в идентификации генов восстановления фертильности пыльцы у подсолнечника // Доклады РАСХН. 2009. № 6. С. 6–9.
Белецкий Ю.Д. Искусственные мутации хлоропластов у высших растений. Ростов н/Д: Изд-во Рост. гос. ун-та, 1989. 80 с.
Белецкий Ю.Д., Разорителева Е.К., Жданов Ю.А. Цитоплазматические
мутации подсолнечника, индуцированные действием N-нитрозо-Nметилмочевины // Доклады АН СССР. 1969. Т. 166. С. 1425–1426.
Белецкий Ю.Д., Федоренко Г.М., Разорителева Е.К., Степанова Л.Б.
Реверсия у пластомного мутанта подсолнечника типа chlorina //
Цитология и генетика. 1981. Т. 15. С. 34–37.
Бочковой А.Д., Юрков П.И. Урожайные свойства семян первого поколения гибридов подсолнечника различных лет репродуцирования //
Масличные культуры. 2007. Т. 136. № 1. С. 14–16.
Гаврилова В.А., Рожкова В.Т. Доноры восстановления фертильности пыльцы линий ЦМС подсолнечника для гетерозисной селекции
// Идентифицированный генофонд растений и селекция / Под ред.
Б.В. Ригина, Е.И. Гаевской. СПб.: ВИР, 2005. 896 с. С. 377–389.
43
Гуськов Е.П., Маркин Н.В., Усатов А.В., Машкина Е.В. Модификация
действия нирозометилмочевины на проростки подсолнечника тепловым шоком // Генетика. 2001. Т. 37. С. 336–343.
Давыденко О.Г. Нехромосомные мутации. Минск: Наука и техника.
1984. 164 с.
Давыденко О.Г. Нехромосомная наследственность. Минск: БГУ,
2001. 188 с.
Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл. Минск:
Тэхналогiя, 2003. 494 с.
Кильчевский А.В. Генетико-экологические аспекты селекции
растений // Генетические основы селекции растений / Под. ред.
А.В. Кильчевского, Л.В. Хотылева: В 4 т. Т. 1.: Общая генетика растений. Минск: Беларус. навука, 2008. 552 с. С. 6–49.
Маркин Н.В., Тихонова М.А., Анисимова И.Н. и др. Scar-маркер гена
rf1 подсолнечника у линий восстановителей фертильности пыльцы
растений с различными типами ЦМС // Масличные культуры. 2009.
Вып. 2 (141). С. 3–5.
Машкина Е.В., Скорина М.В., Усатов А.В. Сравнительный анализ термотолерантности хлорофильных мутантов подсолнечника //
Генетика. 2010. Т. 46. № 2. С. 178–184.
Машкина Е.В., Усатов А.В. Пластидный мутагенез у подсолнечника,
индуцированный нитрозометилмочевиной // Генетика и селекция растений на Дону. Вып. 3 / Под ред. В.Г. Картамышева. Ростов н/Д: АКРА,
2003. С. 284–289.
Разорителева Е.К., Белецкий Ю.Д., Жданов Ю.А. Генетическая
природа мутаций подсолнечника, индуцированных N-нитрозометилмочевиной. Сообщение I. Пестролистные формы // Генетика.
1970а. Т. 6. № 8. С. 102–107.
Разорителева Е.К., Белецкий Ю.Д., Жданов Ю.А. Генетическая
природа мутаций подсолнечника, индуцированных N-нитрозометилмочевиной. Сообщение II. Мутации chlorina // Генетика. 1970б.
Т. 6. № 10. С. 43–44.
Разорителева Е.К., Таран С.Ф., Усатов А.В. Генетическая коллекция
пластомных мутантов подсолнечника // Генетические коллекции растений. Вып. 3 / Под ред. С.Ф. Коваля. Новосибирск: ИЦиГ СОРАН,
1995. С. 197–216.
44
Силкова Т.А., Фомченко Н.С., Давыденко О.Г. Основные результаты
селекции гибридного подсолнечника Helianthus annuus L. в республике
Беларусь // Молекулярная и прикладная генетика. 2008. Т. 8. С. 52–57.
Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органеллы. М.: Мир, 1975.
424 с.
Трибуш С.О., Даниленко Н.Г., Маврищева Е.Б. и др. Индуцированные
реверсии пластомных мутантов Helianthus annuus: полиморфизм ДНК и
ультраструктура органелл // Сельскохозяйственная биология: Мат-лы
межд. науч.-практ. конф. Горки, 1998. С. 161–165.
Уоддингтон К. Морфогенез и генетика. М.: Мир, 1964. 260 с.
Усатов А.В. Внеядерные хлорофильные мутации высших растений,
индуцированных N-нитрозо-N-метилмочевиной и особенности их наследования: Автореф. дис. … д-ра биол. наук. М., 2004. 48 с.
Усатов А.В., Машкина Е.В., Гуськов Е.П. Влияние окислительного
стресса на мутагенез у подсолнечника Helianthus annuus L., индуцированный нитрозометилмочевиной // Генетика. 2005. Т. 41. № 1. С. 63–70.
Усатов А.В., Машкина Е.В., Колоколова Н.С. Развитие генетических исследований хлорофильных мутантов подсолнечника в НИИ
Биологии РГУ // Генетика и селекция растений на Дону. Вып. 3 /
Под ред. В.Г. Картамышева. Ростов н/Д: АКРА, 2003. С. 277–283.
Усатов А.В., Разорителева Е.К., Машкина Е.В., Улитчева И.И.
Спонтанные и индуцированные нитрозометилмочевиной реверсии
пластомных хлорофильных мутантов подсолнечника Helianthus annuus
// Генетика. 2004. Т. 40. С. 248–255.
Усатов А.В., Разорителева Е.К., Федоренко Г.М. Специфичность
мутагенного действия N-нитрозо-N-метилмочевины на пластом подсолнечника Helianthus annuus // Известия высших учебных заведений.
Северо-Кавказкий регион. Естественные науки. 2002. № 4. С. 64–67.
Усатов А.В., Разорителева Е.К., Федоренко Г.М. и др. Хлорофильные
мутанты горчицы Brassica junceae, индуцированные N-нитрозо-Nметилмочевиной // Известия высших учебных заведений. СевероКавказкий регион. Естественные науки. 2003б. № 4. С. 63–66.
Усатов А.В., Таран С.Ф., Гуськов Е.П. Зависимость пластидного мутагенеза, индуцированного N-нитрозо-N-метилмочевиной, от возраста прорастающих семянок подсолнечника в момент обработки //
Генетика. 1995. Т. 31. С. 222–227.
Albert B., Godelle B., Atlan A. et al. Dynamics of plant mitochondrial genome:
model of a three selection process // Genetics. 1996. Vol. 144. P. 369–382.
45
Bellaoui M., Martin-Canadell A., Pelletier G., Budar F. Low-copy-number
molecules are produced by recombination, actively maintained and can be
amplified in the mitochondrial genome of Brassicaceae: relationship to reversion of the male sterile phenotype in some cybrids // Mol. Gen. Genet. 1998.
Vol. 257. P. 177–185.
Boguta M., Dmochowska A., Borsuk P. et al. NAM9 nuclear suppressor of
mitochondrial ochre mutations in Saccharomyces cerevisiae codes for a protein homologous to S4 ribosomal proteins from chloroplasts, bacteria, and
eucaryotes // Mol. Cell Biol. 1992. Vol. 12. P. 402–412.
Davidson D., Fartens E., Armstrong S.W. Changes in frequencies of variegated leaves in NMU treated tobacco: evidence for a differential response to
NMU // Theor. Appl. Genet. 1987. Vol. 82. P. 900–915.
Edwarson J.R. Gene control of non Mendelian variegation in Nicotiana
tabacum L. // Genetics. 1966. Vol. 52. P. 365–371.
Greene T., Kavakli I., Kahn M., Okita T. Generation of up-regulated allosteric variants of potato ADP-glucose pyrophosphorylase by reversion genetics // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1998. Vol. 95. P. 10322–10327.
Gupta S.B. Chlorophyll variegation caused by somatic elimination of an
alien chromosomal fragment on Nicotiana tabacum // Canad. J. Genet. and
Cytol. 1968. Vol. 10. P. 106–111.
Gustafsson A. The mutation system of the chlorophyll apparatus // Lunds
Univ. Arssktift. N. F. Adv. 2. 1940. Vol. 36. P. 1–40.
Hagemann R. Plastid distribution and plastid competition in higher
plants and the induction of plastome mutations by nitrosourea-compounds
// Genetics and biogenesis of chloroplasts and mitochondria / Eds. by
T. Bücher, W. Neupert, W. Sebald, S. Werner. Amsterdam: North–Holland,
1976. P. 331–338.
Hagemann R. Induction of plastome mutations by nitrosourea-compounds // Methods in Chloroplast Molecular Biology / Eds. by M. Edelman,
R.B. Hallick, N.H. Chua. Amsterdam: Elsevier, 1982. P. 119–127.
Hagemann R., Berg W. Vergleichende Analyse der Paramutationssysteme
bei hoherer Pflanzen // Biol. Zbl. 1977. Bd. 96. S. 257–301.
Henny R.J. Inheritance of foliar variegation in two Dieffenbachia cultivars
// J. Heredity. 1982. Vol. 73. P. 384.
Hipkins V., Marshall K., Neale D. et al. A mutation hotspot in the chloroplast genome of a conifer (Douglas–fir:Pseudotsuga) is caused by variability in
the number of direct repeats derived from a partially duplicated tRNA gene //
Curr. Genet. 1995. Vol. 27. P. 572–579.
46
Hladni N., Skoric D., Kraljevic-Balalic M. et al. Heterosis for agronomically important traits in sunflower // Helia. 2007. Vol. 30. № 47. P. 191–198.
Hostica J.G., Hanson M.N. Induction of plastid mutations in tomato by
Nitrosomethylurea // Heredity. 1984. Vol. 75. P. 242–246.
Janska H., Sarria R., Woloszynska M. et al. Stoichiometric shifts in the
common bean mitochondrial genome leading to male sterility and spontaneous reversion to fertility // The Plant Cell. 1998. Vol. 10. P. 1163–1180.
Leclerq P. Une sterilite cytoplasmique chez le tournesol // Ann. Amelior.
Plant. 1969. Vol. 19. S. 99–106.
Levings С.S. The Texas cytoplasm of maize: cytoplasmic male sterility and
disease susceptibility // Science. 1990. Vol. 250. № 4983. P. 942–947.
Miller F.R. Inheritance of white stripe and rolledleaf characterictics in
Sorghum bicolor // Moench. Crop. Sci. 1968. Vol. 8. P. 769–771.
Nishiyra I., Ikushima T., Ichikawa S. Radiobiological studies in plants. II.
Further studies on somatic mutations induced by X-rays at the al locus of diploid oats // Radiat. Bot. 1966. Vol. 6. P. 211–218.
Pohlheim von F. Nachweis von Michzellen in vatigaten Adventisprossen von
Saintpaula, entstanden nach Behandlung isolierter Bl×tter mit N-Nitroso-NMethylharnsoff // Biol. Zbl. 1974. Bd. 93. S. 141–148.
Prina A. A mutator nuclear gene inducing a wide spectrum of cytoplasmically inhereted chlorophyll deficiencies in barley // Theor. Appl. Genet. 1992.
Vol. 85. P. 245–251.
Rana R.S. A radiation-induced chimera in annual Chrisanthemum //
Naturwiss. 1964. B. 51. S. 642–643.
Redei G., Plurad S. Hereditary structural alterations of plastids induced by
a nuclear gene in Arabidopsis // Protoplasma. 1973. Vol. 77. P. 361–380.
Serieys H. Identification, study and utilization in breeding programs of
new CMS sources // Helia. 1996. Vol. 19. P. 144–158.
Tassopulu D., Kung S. Nicotiana chloroplast genome. Deletion and
hotspot – a proposed origin of the inverted repeats // Theor. Appl. Genet.
1984. Vol. 67. P. 85–193.
Thompson D., Walbot V., Coe E.H. Plastid development in iojap and mutator – affected maize plants // Am. J. Bot. 1983. Vol. 70. P. 940–950.
Triboush S.O., Danilenko N.G., Ulitcheva I.I., Davydenko O.G. Location
of induced mutations and reversions in the chloroplast genome of Helianthus
annuus // Plant Growth Regulation. 1999. Vol. 27. Р. 75–81.
47
Ullstrup A.J., Troyer A., Forrest R. A lethall leaf spot of maize //
Phytobiology. 1972. Vol. 57. P. 1282–1283.
Usatov A.V., Razoriteleva E.K., Kolokolova N.S., Taran S.F. Genetic
collection of sunflower chlorophyll mutant Helianthus annuus // Proc. Int.
Conf. «Genetic Collections, Isogenenic and alloplasmic lines». Novosibirsk,
Jul. 30 – Aug. 3. 2001. P. 108–111.
Venkanna V., Reddy Lokanadha D., Ranganatha A.R.G. Identification of
restorers and maintainers for different cms sources in sunflower using new
inbreds // Helia. 2008. Vol. 31. № 49. P. 65–69.
Walters T., Maynthan M.R., Mutachler M.A., Earle E.D. Cytoplasmic mutants from seed of Brassica campestris with NMU // Can. J. Plant. Sci. 1990.
Vol. 81. P. 214–216.
48
Глава 2. УСТОЙЧИВОСТЬ ВНЕЯДЕРНЫХ
ХЛОРОФИЛЬНЫХ МУТАНТОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА
К ЭКСТРЕМАЛЬНЫМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ
Растения в процессе вегетации часто подвергаются действию неблагоприятных абиотических факторов. Наиболее распространенные
из них – засуха, высокие и низкие температуры, избыток солей в почве, присутствие в атмосфере токсических веществ, ультрафиолетовая
радиация, ионы тяжелых металлов. Общим проявлением действия экстремальных факторов является подавление роста и развития растений,
а на уровне фитоценозов – снижение продуктивности.
Способность растения переносить действия неблагоприятных факторов и формировать в таких условиях жизнеспособное потомство
называют устойчивостью, или стресс-толерантностью. Изучение механизмов устойчивости растений, знание физиолого-биохимических
реакций актуально, как с теоретической, так и с практической стороны.
В большинстве современных отечественных и зарубежных публикаций проблема вклада цитоплазмона и ядерно-цитоплазматических
комбинаций в формирование устойчивости высших растений к экстремальным факторам рассмотрена недостаточно. Однако сегодня понятие взаимодействия генотипа и среды несколько усложнилось и заставляет нас учитывать взаимодействия генетических компартментов
клетки, как между собой, так и с внешней средой.
Ниже обсуждены результаты исследований полученных на генетической коллекции внеядерных мутантов подсолнечника (см. главу 1),
касающихся устойчивости растений к ряду экстремальных факторов
среды.
2.1. Окислительный стресс
Общим следствием действия подавляющего большинства внешних
факторов среды на организмы является повышение внутриклеточной
концентрации активных форм кислорода (АФК), что изменяет динамическое равновесие в системе прооксиданты-антиоксиданты и приводит к активации процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ)
(Loggini et al., 1999: Mittler, 2002; Blokhina et al., 2003: Khanna-Chopra,
Sabarinath, 2004). С другой стороны, свободные радикалы и иницииру49
емые ими контролируемые процессы перекисного окисления липидов
выполняют жизненно важные функции: они необходимы для экспрессии генов, запуска клеточных делений и дифференцировки клеток,
формирования новых и разрушения «старых» мембранных структур
клетки, защиты от патогенов и других стрессовых воздействий (Yeh et
al., 1999; Hancock et al., 2001; Mittler, 2002; Coster et al., 2002; Neill et al.,
2002). Однако некоторая часть пула свободно-радикальных процессов
индуцирует стохастические неконтролируемые реакции окисления,
возможность развития которых определяется активностью антиоксидантной системы.
Окислительный стресс входит как ключевой компонент в большинство других видов стресса. У растений окислительный стресс развивается при действии засухи, почвенного засоления, загрязнения воздуха
токсическими соединениями, такими, как озон, оксиды серы и азота,
тяжелые металлы, низких и высоких температур, света высокой интенсивности, ультрафиолетового излучения, недостатка элементов минерального питания, некоторых гербицидов, в частности параквата (метил-виологен), патогенов различной природы и др.
Такая универсальность в индукции окислительного стресса при действии на организмы самых разнообразных факторов внешней среды
указывает на принципиально важную роль изучения всех аспектов
участия свободнорадикального окисления в формировании толерантности растений.
К АФК относят анион-радикал, перекись водорода, гидроперекисный радикал, гидроксил-радикал, а также синглетный кислород
и озон. Принятие молекулярным кислородом одного электрона приводит к образованию супероксид анион-радикала. У растений супероксидный анион-радикал образуется в норме в электрон-транспортной
цепи дыхания и фотосинтеза. Присоединение второго электрона приводит к образованию пероксид-иона, протонирующегося до перекиси
водорода. Если восстановление молекулярного кислорода происходит
совместно со спиновым переворотом, то образуется синглентный кислород 1О2. Синглетный кислород образуется в реакциях фотоокисления, при дисмутации супероксидных радикалов. Мишенью синглетного кислорода являются практически все биосубстраты, в особенности
молекулы с двойной связью; конечным итогом таких реакций обычно
является образование гидроперекисей органических молекул. В отно50
шении ДНК, синглетный кислород вызывает однонитевые разрывы
путем модификации гуанина.
Из перекиси водорода в присутствии ионов переходных металлов
образуется гидроксильный радикал (Н2O2 + Fe2+ → Fe3+ + ОН– + ОН·),
обладающий наиболее высокой реакционной способностью. При взаимодействии с молекулой ДНК гидроксильный радикал приводит
к потере азотистых оснований, возникновению АР-сайтов, вызывает
сшивки ДНК-ДНК, ДНК-белок (Gutteridge, Halliwel, 1990).
Возрастание внутриклеточных концентраций АФК при стрессах,
и особенно гидроксил-радикала, ведет к повреждениям молекул липидов, нуклеиновых кислот и белков. Взаимодействуя с ними, АФК вызывают образование органических гидропероксидов типа ROOH.
Изменения макромолекул под действием АФК называются окислительными модификациями макромолекул.
Клетки защищаются от активных форм кислорода с помощью антиоксидантов. Существуют как минимум два протекторных механизма:
ферментативный и неферментативный. К антиоксидантным ферментам относятся супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидазы. Их синтез индуцируется в ответ на повышение уровня свободных радикалов.
Важная роль принадлежит также аскорбатспецифической пероксидазе, функционирующей в одном цикле с дигидроаскорбатредуктазой
и глутатионредуктазой.
Супероксиддисмутаза (СОД) является важнейшим элементом антиоксидантной защиты организма. Этот фермент представлен во всех аэробных организмах и во всех субцеллюлярных компартментах клетки,
чувствительных к окислительному стрессу (Tsang et al., 1991). Уровень
активности СОД чувствителен к стрессу, вызванному негативным воздействием окружающей среды, вероятно, вследствие увеличения формирования АФК. Это было подтверждено экспериментально на Zea
mays, где семидневное проращивание в избытке воды привело к значительному увеличению проницаемости мембран, продукции супероксид-радикала и перекиси водорода в листьях. Также было показано,
что чрезмерное накопление супероксида происходит при уменьшении
активности СОД в результате стресса, вызванного избыточным количеством воды. Увеличение активности СОД было обнаружено в корнях пшеницы под воздействием аноксии, но не гипоксии. Индукция
активности СОД на 40–60 % под воздействием гипоксии обнаружена
у корней и листьев Hordeum vulgare.
51
В группу неферментативных антиоксидантов входят каротиноиды,
флавоноиды, витамины, аскорбат, фенольные соединения, полиамины, аминокислоты и многие другие органические низкомолекулярные
соединения, способные инактивировать активные формы кислорода.
Как ядерные, так и цитоплазматические мутации способны изменять норму реакции организма (Даниленко, Давыденко, 2003). В литературе описаны пластидные мутанты хламидомонады, устойчивые
к антибиотикам, а также температурно-чувствительные и солеустойчивые мутанты высших растений (Шевякова, 1982; Atak et al., 2004). Так,
митохондриальный мутант Nicotiana sylvestris характеризуется низким
содержанием активных форм кислорода в тканях листьев, измененным
характером экспрессии некоторых антиоксидантных ферментов и повышенной резистентностью к стрессовым воздействиям (Dutilleue et
al., 2003; Noctor et al., 2004).
Данные по действию кислорода на растения в литературе немногочисленны. На Tradescancia palludosa был обнаружен мутагенный эффект
повышенного давления кислорода (Conger, Fairchald, 1951). Сходное
влияние гипербарической оксигенации было показано на прорастающих семенах ячменя и бобов (Erenberg et. al., 1958). В единичных работах проиллюстрировано действие повышенного давления кислорода
на нефотосинтезирующие ткани растений. В то же время хлоропласты,
как и митохондрии, являются местом постоянного образования активных интермедиатов кислорода. Более того, участие пластид и митохондрий в контроле окислительно-восстановительного гомеостаза во многом формирует резистентность растений к действию факторов среды.
В таблице 2.1 суммированы данные о цитогенетическом эффекте гипербарической оксигенации на корневой меристеме проростков
подсолнечника инбредной линии 3629.
Ранее на ячмене, луке, пшенице было показано, что наиболее эффективным режимом гипербарической оксигенации, вызывающим
перестройки хромосом, является обработка кислородом под давлением
0,7 МПа в течение 3 ч (Гуськов, 1975). Воздействие повышенного давления кислорода (0,4 МПа или 0,7 МПа) в течение 3 ч не индуцирует увеличения уровня хромосомных перестроек у подсолнечника (табл. 2.1).
Устойчивость подсолнечника, по сравнению с другими видами растений, может быть связана с липидным составом семян, который имеет
повышенную антиоксидантную емкость по сравнению с культурами,
семена которых в качестве основных запасных питательных веществ
содержат белки или крахмал.
52
Таблица 2.1
Цитогенетический эффект гипербарической оксигенации
на корневой меристеме проростков подсолнечника линии 3629
Вариант
Контроль
ГБО
0,7 МПа-3 ч
ГБО
0,7 МПа-9 ч
Время роста, ч
Всего анафаз
27
39
51
63
27
39
51
63
27
39
51
63
598
899
880
821
458
517
657
687
106
1216
1041
1009
Анафаз с аберрациями, %±m
1,5±0,50
2,2±0,49
1,7±0,44
1,6±0,44
1,1±0,49
2,1±0,63
2,6±0,62
1,9±0,52
4,7±2,06
5,3±0,64
7,1±0,79
4,1±0,62
Р
<0,001
<0,001
<0,001
Цитогенетический эффект на подсолнечнике обнаружен только
после действия ГБО в режиме 0,7 МПа-9 ч; максимальное количество
аберраций хромосом, зафиксированное после действия ГБО, приходится на 51-й ч роста (см. табл. 2.1). Это еще раз подтверждает, что повреждения в ядерном генетическом материале индуцирует не сам кислород и его свободные радикалы, а вторичные продукты – эндогенные
метаболиты активных форм кислорода.
Результаты цитогенетического анализа свидетельствуют, что линии
подсолнечника, различающиеся по геному пластид (инбредная линия
3629 и внеядерный хлорофильный мутант en:chlorinа-5), обладают различной устойчивостью к ГБО (рис. 2.1).
Как видно из риснука, ГБО в режиме 0,7 МПа-3 ч не индуцирует
аберраций хромосом в корневой меристеме проростков линии 3629
и пластомного мутанта. При увеличении времени экспозиции ГБО до
9 ч зафиксирован повышенный уровень аберраций хромосом в клетках
корневой меристемы проростков подсолнечника. Однако у исходной
линии генотоксичный эффект ГБО более длителен и постоянно повышается на протяжении 48 ч после окончания воздействия, тогда как у
пластомного мутанта уровень перестроек хромосом к третьей фиксации нормализуется.
53
Рис. 2.1. Уровень аберраций хромосом в клетках корневой меристемы
проростков подсолнечника линии 3629 (А) и пластомного мутанта
en:chlorinа-5 (Б) после действия ГБО: *** – достоверные отличия
по сравнению с контролем при Р < 0,001
54
ГБО помимо индукции аберраций хромосом, так же как и у других
видов цветковых растений, резко снижает пролиферативную активность меристематических клеток сразу после окончания воздействия
у двух линий подсолнечника (3629 и en:chlorinа-5) (Гуськов, 1975;
Гуськов и др. 1986; 1989). Однако восстановление интенсивности митотических делений у исходной линии происходит через 48 ч, а у пластомного мутанта – уже через 24 ч после окончания обработки.
Обработка ГБО в течение 9 ч ингибирует пролиферативную активность клеток обеих исследуемых линий (рис. 2.2). Но если для линии
3629 митотический индекс (МИ) снижается на 72 %, то в корневой меристеме проростков мутанта en:chlorinа-5 он уменьшился только на 35 %.
У данного пластомного мутанта не обнаружено и значительного подъема
МИ во втором клеточном цикле после воздействия, как это было показано для линии 3629. Этим вероятно можно объяснить продленный выход
аберраций хромосом после воздействия ГБО у линии 3629 и появление
высокого уровня АХр у en:chlorinа-5 на ранних сроках фиксации.
Кислород при повышенном давлении вызывает цитогенетические
последствия опосредованно, через изменение клеточного метаболизма. Самым общим эффектом ГБО является активация процессов ПОЛ,
что приводит к увеличению содержания свободных радикалов в растительных тканях. Первичной мишенью повреждений могут быть клеточные мембраны. Жирнокислотный состав липидов мембран, определяемый генотипом, детерминирует степень резистентности организма.
Известно, что мембраны зародышевых корешков засухоустойчивых
растений менее восприимчивы к действию активных форм кислорода (Leprince et al., 1990). Производные липидов в качестве вторичных
мессенджеров участвуют в передаче сигналов, необходимых для роста
и развития растений, формирования ответной реакции при действии
факторов окружающей среды (Munnik et al., 1998; Laxalt, Munnik, 2002).
Особенности реакции меристематических клеток пластомного мутанта на действие ГБО могут быть обусловлены изменениями в жирнокислотном составе липидов данного мутанта. Ранее было показано, что некоторые пластомные мутанты подсолнечника отличаются
от инбредной линии 3629 повышением уровня линоленовой кислоты,
понижением содержания линолевой кислоты. При этом уровень пальмитиновой кислоты во фракции свободных полярных липидов листьев
у мутантов выше по сравнению с линией 3629 (Лысенко, 1993).
55
Рис. 2.2. Пролиферативная активность клеток корневой меристемы
проростков подсолнечника линии 3629 (А) и пластомного мутанта
en:chlorinа-5 (Б) после действия ГБО: *** – достоверные отличия
по сравнению с контролем при Р < 0,001
56
Неоднозначность реакции двух линий подсолнечника с одинаковым
ядерным генетическим материалом на действие ГБО свидетельствует
об участии цитогенов в формировании ответной реакции. Для определения роли ядра и цитоплазматических геномов в устойчивости растений к повышенному давлению кислорода из коллекционного материала
хлорофильных мутантов подсолнечника Helianthus annuus L. НИИ биологии ЮФУ были отобраны следующие линии: исходная инбредная линия 3629 и полученные на ее основе мутантные линии: ядерный мутант
n:chlorina-1; пластомные мутанты en:chlorina-3, en:chlorina-5, en:chlorinа-6,
en:chlorinа-7; частичный ревертант pr6-en:chlorina-7 и полный ревертант
r-en:chlorinа-7. В качестве внешнего контроля был выбран сорт Донской
99. Окислительный стресс моделировали гипербарической оксигенацией
в режиме 0,7 МПа в течение первых 4 ч прорастания семян. Модельные
эксперименты проводили на корневой апикальной меристеме проростков.
В контрольных условиях уровень активности СОД в тканях проростков исходной линии 3629 и частичного ревертанта pr6-en:chlorina-7
с измененными митохондриями наибольший среди изученных линий.
У пластомных мутантов уровень активности СОД достоверно ниже
по сравнению с линией 3629. В то же время активность каталазы у пластомных мутантов en:chlorina находится на одном уровне с показателем
исходной зеленой линии. Ядерный мутант n:chlorina-1 характеризуется
повышенной активностью каталазы (табл. 2.2).
Таблица 2.2
Активность антиоксидантных ферментов – СОД и каталазы – в корневой
меристеме проростков подсолнечника, ед/мг белка
Линия
3629
n:chlorina-1
en:chlorina-3
en:chlorina-5
en:chlorina-6
en:chlorina-7
pr6-en:chlorina-7
r-en:chlorina-7
Сорт Донской 99
Контроль
каталаза
СОД
4,8±0,6
30,1±6,9
8,1±0,2+++
15,3±3,1
3,3±0,1+
12,6±1,8+
4,0±0,8
13,5±2,5+
5,1±0,3
15,5±6,3
4,7±0,3
12,6±1,9+
6,9±0,4
35,6±4,8
3,2±0,5+
14,8±2,1+
6,6±1,0
17,3±2,1
ГБО 0,7 МПа (0–4 ч)
каталаза
СОД
11,3±2,5*
7,9±0,4***
9,9±0,5***++
23,1±4,6 +
3,6±0,4+++
12,0±2,1
7,9±0,1***
16,6±2,6
10,2±2,5
6,0±0,1*+++
6,6±0,5***+
9,9±1,9
8,2±3,6***
2,7±0,5***+++
5,9±0,5***++
7,4±1,4**
8,3±0,4
33,7±7,9*+
Примечание: знаком * отмечены достоверные отличия от контроля; знаком + – достоверные отличия от линии 3629; * и + – при Р < 0,05; ** и ++ – при Р < 0,01; *** и +++ –
при Р < 0,001.
57
После действия повышенного давления кислорода активность
СОД была снижена у растений трех линий: 3629, pr6-en:chlorina-7,
r-en:chlorina-7 (на 63, 77 и 50 %, соответственно), а у внеядерных хлорофильных мутантов оставалась на уровне контрольных значений.
Активность каталазы у всех линий, за исключением частичного ревертанта pr6-en:chlorina-7, после действия повышенного давления кислорода достоверно увеличилась (см. табл. 2.2).
Одной из неспецифических реакций на стрессовое воздействие является изменение пролиферативной активности клеток. Стрессовые факторы, как правило, вызывают реакцию защитного торможения метаболизма, в том числе подавление деления и линейного роста клеток (Lepoivre
et al., 1991; Alves, Setter, 2004; Gimener-Abian et al., 2004). Степень и длительность ингибирования пролиферативной активности коррелируют
с уровнем толерантности растений к стрессовому фактору. Анализ МИ в
корневой апикальной меристеме проростков подсолнечника, обработанных ГБО, свидетельствует, что гипербарическая оксигенация подавляет
митотическую активность клеток всех линий. Однако у пластомного мутанта en:chlorinа-5 МИ через 56 ч роста после действия ГБО превышает
контрольный уровень в 2 раза. Высокую пролиферативную активность
после действия ГБО проявил и частичный ревертант pr6-en:chlorina-7.
Анализ ростовых показателей контрольных растений и растений,
обработанных ГБО на ранних стадиях прорастания семян, свидетельствует, что повышенное давление кислорода снижает интенсивность
роста проростков исходной линии 3629, ядерного мутанта n:chlorina-1
и сортовых растений. Высота хлорофильных пластомных мутантов, обработанных ГБО, на стадии формирования 3–4-й пары листьев не отличалась от контроля, а у мутанта en:chlorina-5 даже достоверно превышала контрольные значения (табл. 2.3).
Таким образом, данные полевых наблюдений согласуются с результатами цитогенетического анализа. Степень активации клеточных делений в отдаленные сроки после действия ГБО коррелирует с ростом растений на стадии формирования 3–4-й пары листьев. Восстановление
МИ после действия ГБО до контрольных значений у частичного ревертанта и сортовых растений подтверждает данные сходной высоты
контрольных и обработанных ГБО растений. Снижение МИ у ядерного
мутанта приводит к отставанию в росте растений. Двукратное повышение МИ у пластомного мутанта en:chlorina-5 согласуется с увеличением
высоты растений относительно контроля.
58
Таблица 2.3
Всхожесть семян и высота проростков подсолнечника на стадии развития
3–4-й пары листьев, обработанных на ранних этапах прорастания
повышенным давлением кислорода (0,7 МПа-4 ч)
Линия
3629
n:chlorina-1
en:chlorina-3
en:chlorina-5
en:chlorina-6
en:chlorina-7
pr6-en:chlorina-7
r-en:chlorina-7
Сорт Донской-99
Всхожесть, %
контроль
85,3
73,3
78,7
78,7
56,0
74,7
62,7
80,0
89,3
ГБО
69,3 *
57,3
84,0
69,3
34,0
56,0
61,3
56,0 *
78,7
Высота на стадии 3–4-й
пары листьев, см
контроль
ГБО
12,2±0,35
10,1±0,35***
8,9±0,29 +
7,6±0,30 + **
+
7,5±0,22
7,0±0,20 +
+
7,15±0,18
7,9±0,20 +***
8,5±0,33 +
7,7±0,50 +
8,1±0,30 +
7,5±0,36 +
9,7±0,37 +
8,7±0,28 +
10,8±0,40
10,7±0,45
14,4±0,41 + ***
16,5±0,36 +
Примечание: знаком * отмечены достоверные отличия от контроля; знаком + – достоверные отличия от линии 3629; * и + – при Р < 0,05; ** и ++ – при Р < 0,01; *** и +++ –
при Р < 0,001.
Обобщая полученные данные, можно заключить, что реакция растений подсолнечника на действие повышенного давления кислорода
неоднозначна. Выявлены отличия между линиями различной генетической природы. Повышенная чувствительность исходной инцухтлинии 3629, вероятно, вызвана высокой степенью гомозиготности
ядерных аллелей, что, как известно, снижает адаптивный потенциал
организма в изменившихся условиях среды. В то же время высокая
степень гетерозиготности генетического материала растений сорта
Донской-99 обеспечивает их высокую устойчивость к повышенному
давлению кислорода.
Наиболее устойчивыми формами оказались пластомный мутант
en:chlorina-5 и частичный ревертант pr6-en:chlorina-7 с измененной
структурой, как хлоропластной, так и митохондриальной ДНК.
У пластомного мутанта en:chlorina-5 после стрессового воздействия
активность СОД не изменяется при одновременном повышении активности каталазы. Реакция на клеточном уровне проявляется в активации
деления клеток корневой апикальной меристемы в отдаленные сроки
после действия ГБО. На уровне целого организма было зафиксировано
увеличение высоты растений по сравнению с контролем. Особый инте59
рес вызывает частичный ревертант pr6-en:chlorina-7. Несмотря на снижение активности антиоксидантных ферментов после воздействия
ГБО, всхожесть семян данной линии наибольшая среди мутантных
форм, а высота растений после действия ГБО не отличается от контроля. Из данных литературы известно, что устойчивость к стрессовому
фактору не всегда коррелирует с повышенной активностью антиоксидантных ферментов. На Arabidopsis показано, что устойчивые к окислительному стрессу мутанты ore 1, ore 3, ore 9 характеризуются сниженной по сравнению с диким типом активностью антиоксидантов (Woo
et al., 2004). В нашем случае у частичного ревертанта pr6-en:chlorina-7
исходный уровень активности СОД и каталазы не отличается от исходной линии 3629. Однако после действия ГБО происходит ингибирование как СОД, так и каталазы. Возможно, что в данном случае активно
функционируют другие звенья защитной системы, в том числе и низкомолекулярные антиоксиданты.
Для оценки адаптивного потенциала исследуемых линий подсолнечника была проведена повторная обработка семян растений М1 гипербарической оксигенацией в режиме 0,7 МПа-10 ч. Анализ всхожести
семян показал, что первичное воздействие ГБО в режиме 0,7 МПа-10 ч
не снижает всхожести семян пластомного мутанта en:chlorinа-5 и частичного ревертанта pr6-en:chlorinа-7. У всех остальных исследуемых
линий всхожесть достоверно ниже по сравнению с контрольными показателями. Количество взошедших семян М2 у пластомных мутантов
не отличалось от контроля, а у частичного ревертанта всхожесть была
максимальной, достоверно превышая показатель для необработанных
семян. Вторичная обработка семян М2 гипербарической оксигенацией
в режиме 0,7 МПа-10 ч у линии 3629 и n:chlorinа-1 достоверно снизила
всхожесть семян не только относительно контроля, но и по сравнению
с первичным воздействием ГБО. У пластомного мутанта en:chlorina-5
показатель всхожести не отличается от контроля, а у en:chlorinа-7
он ниже контрольных значений, но превышает показатель для М1.
Повторное воздействие ГБО увеличило показатель всхожести семян
частичного ревертанта pr6-en:chlorinа-7.
Можно предположить, что первичное воздействие ГБО (0,7 МПа-4 ч)
в первые часы прорастания семян стимулировало отбор наиболее резистентных к увеличению концентрации кислорода во внешней среде
клеток и/или клеточных органелл, что обеспечило интенсивный рост
60
растений М1, высокую всхожесть семян М2, а также резистентность
к повторным воздействиям ГБО в более «сильном» режиме.
Гетерогенность и многокопийность цитоплазматических ДНК приводят к тому, что в клетке могут одновременно находиться несколько
типов органелл с различной адаптационной емкостью. При действии
стресса, возможно, интенсифицируется фенотипическое выражение
вариабельности их генетических систем (Fender, O`Connell, 1990; Joshi
et al., 1997; Kumar et al., 1999; Burke, 2001), т.е. стрессовое воздействие
может индуцировать более эффективную рассортировку органелл и более быстрое формирование тканей, органов и организмов с измененной
нормой реакции. При действии экстремальных факторов получают преимущества те клетки, в которых пластиды и митохондрии адаптированы
к более высоким концентрациям свободно-радикальных продуктов.
Таким образом, мутации в цитогенах могут изменять норму реакции
растительного организма, что является предпосылкой для повышения
уровня резистентности к действию стрессовых факторов. Механизмом
изменения нормы реакции может служить модифицирующее влияние
цитоплазматических органелл на экспрессию как собственных, так и
ядерных генов, формирование нового «компенсационного комплекса генов», обеспечивающего жизнедеятельность организма на фоне
инбредной депрессии и цитоплазматической мутации. Если это предположение, верно, то восстановление структуры ДНК цитоплазматических органелл при неизменном ядерном генетическом материале может повысить уровень резистентности растительного организма.
Для проверки данного предположения мы использовали генетическую модель из трех линий подсолнечника: исходная инбредная линия
3629, пластомный мутант en:chlorina-7, полученный на ее основе, и его
ревертант r-en:chlorina-7 (см. главу 1). Молекулярно-генетическое исследование хпДНК данных линий доказало наличие мутации в хлоропластном геноме en:chlorina-7 и восстановление структуры хлоропластной ДНК у ревертанта r-en:chlorina-7 (Triboush et al., 1999).
Анализировали уровень резистентности проростков данных форм
к повышенным давлениям чистого кислорода. Окислительный стресс
моделировали гипербарической оксигенацией в режиме 0,4 МПа с 3-го
по 6-й и с 12-го по 15-й ч прорастания семян подсолнечника.
Анализ уровня хемилюминесценции показал, что в контроле интенсивность свободно-радикальных реакций в клетках корневой меристемы проростков трех линий находится на одном уровне (табл. 2.4).
61
Таблица 2.4
Уровень быстрой вспышки (мм) хемилюминесценции в системе
люминол-Н2О2 в корневой меристеме проростков подсолнечника
Вариант
Линия
3629
Контроль еn-chlorina-7
r-еn:сhlorina-7
3629
ГБО
0,4 МПа еn-chlorina-7
(3–6 ч)
r-еn:сhlorina-7
6
70,5±7,43
77,8±6,3
88,7±6,72
78,8±7,20
87,5±4,25
98,7±7,09
Время роста, ч
15
80±4,89
79,1±4,52
79,4±4,78
86,5±7,29
87,0±6,11
85,8±7,38
30
80,2±2,36
83,1±2,82
72,2±7,11
83,2±9,88
119±8,67***
104,3±10,85
Примечание: *** – достоверные отличия по сравнению с контролем при Р < 0,001.
Стабильность уровня свободно-радикальных продуктов в тканях
корня проростков подсолнечника трех линий поддерживается за счет
активации первичного ферментативного звена антиоксидантной защиты. Так, в клетках корневой меристемы проростков всех трех линий
с 6-го по 39-й час роста активность каталазы достоверно повышается
(табл. 2.5).
Таблица 2.5
Активность каталазы и СОД в корневой меристеме проростков
подсолнечника при нормальных условиях прорастания, ед/мг белка
Линия
Фермент
СОД
3629
Каталаза
СОД
еn:chlorina-7
Каталаза
СОД
r-en:chlorina-7
Каталаза
6
30,1±6,94
4,8±0,62
12,6±1,92 *
4,7±0,27
14,8±2,06 *
3,25±0,49 *
Время роста, ч
15
30
50,7±9,42
31,1±3,36
6,6±0,51
8,4±1,18
34,7±4,55
28,0±5,58
5,5±0,49
5,8±0,82
55,5±10,8
25,3±3,62
5,8±0,87
6,9±0,43
39
25,8±4,06
9,6±0,82
40,0±7,99
6,9±0,52 *
17,9±1,87
8,8±0,8
Примечание: * – достоверные отличия по сравнению с линией 3629.
Необходимо отметить, что у мутанта en:chlorina-7 активность каталазы через 6 ч роста не отличается от таковой для линии 3629. Однако
в дальнейшем увеличение активности данного фермента у пластомного мутанта происходит в меньшей степени и к 39 часам роста этот показатель достоверно ниже по сравнению с линией 3629. У ревертанта
62
r-en:chlorina-7 отмечена обратная тенденция: в первые 6 ч роста активность каталазы ниже, чем у линии 3629 и en:chlorina-7, но уже к 15му часу роста ревертант не отличается от линии 3629, а к 39 ч прорастания активность каталазы у ревертанта достоверно выше по сравнению
с линией en:chlorina-7 и не отличается от 3629. Таким образом, реверсия
в хпДНК у ревертанта коррелирует с восстановлением активности данного антиоксидантного фермента.
Воздействие ГБО на проростки подсолнечника с 3-го по 6-й ч прорастания не изменяет уровень быстрой вспышки хемилюминесценции
в корневой апикальной меристеме проростков исходной линии 3629
и ревертанта r-en:chlorinа-7 в течение 30 ч роста (см. табл. 2.4). Однако
при этом активность СОД в проростках обеих линий достоверно снижается, а активность каталазы повышается по сравнению с контролем
(рис. 2.3, А, Б). У пластомного мутанта en:chlorinа-7 действие повышенного давления кислорода индуцирует чрезмерное повышение активности каталазы, что не предотвращает активации свободно-радикальных
реакций. В результате высота быстрой вспышки хемилюминесценции через сутки после воздействия достоверно превышает контрольные значения. Активность СОД в этот же период времени снижена
(рис. 2.3, В).
Таким образом, в данном модельном эксперименте показано,
что уже в клетках корневой меристемы проростков наличие мутации
в хпДНК может оказывать влияние на особенности ответной реакции
растительных клеток на внешние стрессовые воздействия, в данном
случае – увеличение концентрации и давления кислорода во внешней
среде.
Следующий модельный эксперимент был проведен для оценки
реакции тканей листа на действие ГБО. В эксперименте использовали проростки на стадии развития первой пары настоящих листьев.
Обработку ГБО проводили в режиме 0,7 МПа-8 ч. Воздействие ГБО на
проростки линии 3629 индуцирует снижение активности СОД и каталазы, которое сохраняется на протяжении суток после окончания обработки. Следствием этого является повышение светосуммы хемилюминесценции (что отражает истощение антиоксидантной емкости),
а также накопление МДА в тканях листа через 24 ч после воздействия
(рис. 2.4, А). Те же самые закономерности ответной реакции выявлены
и для пластомного мутанта en:chlorinа-7 (рис. 2.4, Б).
63
А
Б
В
Рис. 2.3. Динамика изменения активности СОД и каталазы
(в % от контроля) в клетках корневой меристемы проростков
подсолнечника линий 3629(А), r-en:chlorinа-7 (Б) и en:chlorinа-7 (В)
после действия ГБО в режиме 0,4 МПа-3 ч (с 3-го по 6-й ч прорастания).
Знаком * отмечены достоверные отличия по сравнению с контролем:
* – Р < 0,05; ** – P < 0,01; *** – P < 0,001.
64
А
Б
В
Рис. 2.4. Изменение показателей хемилюминесценции, уровня МДА
и активности антиоксидантных ферментов (в % от контроля) в тканях
листа проростков подсолнечника линий 3629 (А), en:chlorina-7 (Б)
и r-en:chlorina-7 (В) после действия ГБО в режиме 0,7 МПа-8 ч.
Знаком * отмечены достоверные отличия по сравнению с контролем:
* – Р < 0,05; ** – P < 0,01; *** – P < 0,001.
65
Первичная стрессовая реакция ревертанта на действие ГБО сходна
с другими линиями – сразу после действия гипербарической оксигенации происходит снижение активности каталазы и СОД. Однако через 24 ч после воздействия активность СОД повышается, а каталазы
не отличается от контроля. Показатели хемилюминесценции и уровень МДА при этом не отличаются от контроля (см. рис. 2.4, В). Таким
образом, установлено, что восстановление структуры хлоропластной
ДНК сопровождается повышением резистентности растений к окислительному стрессу.
Долговременная адаптация растений к действию ГБО связана с изменениями метаболизма, происходящими на субклеточном, клеточном
и тканевом уровнях. Нами был проведен анализ цитологических параметров клеток листовой ткани инбредной линии и внеядерных хлорофильных мутантов en:chlorina-3, частичного реверсионного мутанта
pr6-en:chlorina-7 и полного ревертанта с восстановленным содержанием хлорофиллов до уровня зеленых растений линии 3629 r-en:chlorina-7,
в норме и сразу после воздействия окислительного стресса на проростки подсолнечника в более жестком режиме (0,7 МПа-14 ч).
В физиологически нормальных условиях ультраструктура клеток
мезофилла первой пары настоящих листьев инбредной линии 3629
типична для высших растений (рис. 2.5): преобладают хлоропласты
удлиненной овальной формы и одинаковой электронной плотности,
почти полностью занимающие пространство по периметру клетки.
Диаметр клеток достигает свыше 20 мкм, а средняя длина продольной
оси органелл составляет около 3–4 мкм. Органеллы окружены двойной мембраной, а их матрикс имеет значительную электронную плотность за счет высокой концентрации органельных рибосом, которые
несколько маскируют мембранные структуры (рис. 2.6). Внутри органеллы видна хорошо развитая система мембран, представленная одиночными тилакоидами стромы и тилакоидами гран. Для гран характерна большая протяженность, а число тилакоидов в них может достигать
30 ед. и более. Встречаются многочисленные осмиофильные глобулы,
которые имеют липидную природу и являются неотъемлемой частью
внутренней структуры пластид. Часто наблюдаются крахмальные зерна
(рис. 2.6). Такая ультраструктура отражает довольно высокую функциональную активность хлоропластов линии 3629.
66
Рис. 2.5. Ультраструктура фрагмента поперечного среза первого
настоящего листа подсолнечника инбредной линии 3629 в норме:
В – вакуоль; КС – клеточная стенка; Пл – пластида; Я – ядро
67
Рис. 2.6. Ультраструктура участка клетки первого настоящего листа
подсолнечника инбредной линии 3629 в норме:
К – крахмальное зерно; М – митохондрии; ПГ – пластоглобула;
ТГ – тилакоидные мембраны гран
68
Ядерный хроматин локализован преимущественно в многочисленных глыбках, относительно равномерно рассеянных в гиалоплазме
(см. рис. 2.5). В узком участке цитоплазмы между пластидами, тесно
прилегая к ним, расположены митохондрии (рис. 2.7). Они имеют эллипсовидную или бобовидную форму и выглядят умеренно набухшими, при этом степень их набухания различна. Матрикс митохондрий
имеет несколько меньшую электронную плотность, чем у пластид,
внутри органелл расположены удлиненные кристы. Средние размеры ширины и длины органеллы составляют около 0,45 и 0,9 мкм,
соответственно.
Анализ электроннограмм клеток листьев линии 3629 после действия ГБО показал существенные различия тонкого строения клеточных органелл по сравнению с контролем. Для хлоропластов характерна
высокая степень гетерогенности, как по форме, так и по электронной
плотности (рис. 2.8, 2.9). Их большая часть представлена органеллами округлой формы и светлым матриксом. Хлоропласты удлиненной
овальной формы представлены в меньшем числе и имеют повышенную
электронную плотность. Органеллы выглядят набухшими, а их диаметры составляют около 2 и 3 мкм для округлых и удлиненных хлоропластов, соответственно. Диаметр клеток увеличен по сравнению с контрольными образцами и достигает 30 мкм (рис. 2.8).
В набухших хлоропластах округлой формы отмечено нарушение
целостности наружной мембраны, а снижение электронной плотности
матрикса пластид произошло, вероятно, за счет снижения количества
рибосом (рис. 2.9). Тилакоиды представлены главным образом небольшими гранами (с числом ламелл до 6 единиц) и локализованы преимущественно ассиметрично по периметру органеллы.
В темных хлоропластах сохранилась целостность внешней мембраны и отмечена высокая концентрация рибосом (рис. 2.9). Мембраннотилакоидная система в них представлена в основном гранами с числом
ламелл до 10 ед. Отдельные тилакоиды, как в гранах, так и в строме, значительно расширены, а мелкие пластоглобулы размером до 0,08 мкм
немногочисленны.
Для цитоплазмы клеток характерно наличие крупных, до 0,9 мкм,
округлых образований повышенной электронной плотности, очевидно,
липидной природы (рис. 2.10, 2.11). Митохондрии округлой формы немногочисленны и содержат слегка набухшие кристы, их диаметр больше, чем в контроле и достигает величины 1,5 мкм (рис. 2.11).
69
Рис. 2.7. Ультраструктура участка клетки первого настоящего листа
подсолнечника инбредной линии 3629 в норме:
М – митохондрии; ТГ – тилакоидные мембраны гран
70
Рис. 2.8. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа подсолнечника инбредной линии 3629
после действия ГБО:
В – вакуоль; КС – клеточная стенка; Пл – пластиды
71
Рис. 2.9. Ультраструктура хлоропластов подсолнечника
инбредной линии 3629 после действия ГБО:
ТГ – тилакоидные мембраны гран
72
Рис. 2.10. Ультраструктура фрагмента поперечного среза мезофила
первого настоящего листа подсолнечника инбредной линии 3629
после действия ГБО:
ЛК – липидная капля; Я – ядро
73
Рис. 2.11. Ультраструктура фрагмента поперечного среза мезофила
первого настоящего листа подсолнечника инбредной линии 3629
после действия ГБО:
ЛК – липидная капля; М – митохондрия; П – пероксисома;
ТГ – талакоидные мембраны гран
74
Ядра значительно уменьшены в размерах, а ядерный хроматин
сконцентрирован в крупные агрегаты, которые занимают практически
всю площадь среза органеллы (см. рис. 2.10).
В физиологически нормальных условиях ультраструктура клеток
мезофила листьев внеядерного хлорофильного мутанта en:chlorina-3
во многом схожа с таковой у исходной линии 3629. Преобладают хлоропласты удлиненной овальной формы и одинаковой электронной
плотности, занимающие пространство по периметру клетки (рис. 2.12).
Однако хлоропласты выглядят более крупными, чем у инбредной линии 3629, а их число (на ед. площади среза клетки) значительно меньше. Диаметр клеток достигает 30 мкм, а средняя длина продольной
оси органелл составляет около 4 мкм.
Внутреннее строение пластид en:chlorina-3 и состояние его мембранно-тилакоидной системы в целом напоминает растения линии
3629 (рис. 2.13). Цитоплазматические рибосомы немногочисленны,
а тесно прилегающие к пластидам митохондрии с уплощенными и каплевидными кристами и умеренно плотным матриксом имеют размеры в среднем до 0,5 мкм в диаметре, что меньше, чем у линии 3629.
Отмечено наличие значительного числа пероксисом овальной формы
и размером 0,5–1,0 мкм (рис. 2.13).
Окислительный стресс вызвал существенные изменения, как в пространственной организации клеточных органелл, так и в их внутреннем строении. В некоторых клетках выявлены единичные пластиды,
не плотно прилегающие к клеточной оболочке, в других клетках отмечены неравномерно локализованные агрегаты, составленные из плотно-прилегающих друг к другу органелл (рис. 2.14).
По внутренней структуре пластиды можно разделить на две неравномерные по численности группы. В большей части пластид целостность наружных мембран нарушена, вероятно, поэтому трудно
различить содержимое их матрикса от цитоплазмы (рис. 2.15, 2.16).
Внутренние мембраны собраны в граны, число ламелл, в которых достигает 10 единиц, а тилакоды в поверхностном слое гран, как правило, находятся в набухшем состоянии. Между тилакоидами стромы
расположены немногочисленные (по сравнению с контролем) пластоглобулы. В клеточной цитоплазме отмечена локализация округлых
тел с однородным мелкозернистым содержимым (предположительно
пероксисомы) (рис. 2.15) и митохондрий с просветленным матриксом
и многочисленными набухшими кристами (рис. 2.15). В отдельных
75
клетках отмечены крупные вакуоли, содержащие небольшие участки
цитоплазмы и округлые ламелярные образования. Ядерный хроматин,
как и в предыдущем случае (линия 3629 после ГБО), имеет высокую
степень конденсации (рис. 2.16).
В некоторых клетках (они немногочисленны) наблюдали пластиды
с электронно-светлым матриксом (вследствие концентрации слипшихся между собой рибосом) и с многочисленными тилакоидами, организованными преимущественно в граны (см. рис. 2.14). Цитоплазма
в таких клетках практически отсутствует.
Анализ электроннограмм внеядерного хлорофильного мутанта
pr6-en:chlorina-7 в контрольных экспериментах показал крайне неравномерное распределение пластид в клетках листовой паренхимы:
одинаково часто наблюдаются как одиночные органеллы, так и агрегированные, состоящие из 2–4 единиц. Их форма более округлая, а по
величине и электронной плотности пластиды в общих чертах схожи
с таковыми у внеядерного мутанта en:chlorina-3 (рис. 2.17).
Митохондрии округлой формы с хорошо развитыми и умеренно
набухшими кристами. Участки цитоплазмы с высокой концентрацией
одиночных и собранных в полисомы рибосом обширны (рис. 2.18).
Для внутреннего строения пластид характерно большое количество
в матриксе вдоль наружной мембраны мелких электронно-светлых
пузырьков размером 50 нм – так называемого периферического ретикулума. Мембранный комплекс, состоящий из одиночных тилакоидов, рассеянных в строме и собранных в граны различной величины
(от 2 до 10 ед.), равномерно распределен в пространстве (рис. 2.18).
Существенных отличий структуры ядра сравнительно с контрольной
линией 3629 не наблюдали (рис. 2.17).
Анализ электроннограмм частичного ревертанта pr6-en:chlorina-7
после действия ГБО показал, прежде всего, резкое увеличение размеров клеток, при этом значительно снизились размеры клеточных вакуолей (рис. 2.19). Очевидно, это произошло в результате набухания
их цитоплазмы. Степень сохранности пластид различная, однако, преобладают органеллы с хорошо сохранившейся наружной мембраной.
Их внутренняя мембранная система представлена небольшими гранами с набухшими тилакоидами (до 5–8 единиц) (рис. 2.20). Матрикс
пластид с сохранившейся наружной мембраной более электронносветлый, чем у органелл с ее нарушенной целостностью, между тилакоидами рассеяно значительное количество мелких пластоглобул.
76
Рис. 2.12. Ультраструктура фрагмента поперечного среза первого
настоящего листа хлорофильного мутанта en:chlorina-3 в норме:
В – вакуоль; КС – клеточная стенка; Пл – пластида; Я – ядро
77
П
П
Рис. 2.13. Ультраструктура фрагмента поперечного среза листа
хлорофильного мутанта en:chlorina-3 в норме:
М – митохондрии; ПГ – пластоглобулы; ТГ – тилакоидные мембраны гран;
П – пероксисомы
78
Рис. 2.14. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа хлорофильного мутанта en:chlorina-3
после действия ГБО:
В – вакуоль; КС – клеточная стенка; Пл – пластида
79
Рис. 2.15. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа хлорофильного мутанта en:chlorina-3
после действия ГБО:
М – митохондрия; П – пероксисомы; ТГ – тилакоидные мембраны гран
80
Рис. 2.16. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа хлорофильного мутанта
en:chlorina-3 после действия ГБО:
ТГ – тилакоидные мембраны гран; Я – ядро
81
Рис. 2.17. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа частичного ревертанта pr6-en:chlorina-7
в норме:
В – вакуоль; КС – клеточная стенка; Пл – пластиды; Я – ядро
82
Рис. 2.18. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа частичного ревертанта
pr6-en:chlorina-7 в норме:
М – митохондрия; ПР – периферический ретикулум;
ТГ – тилакоидные мембраны гран
83
Рис. 2.19. Ультраструктура поперечного среза первого настоящего листа
частичного ревертанта pr6-en:chlorina-7 после действия ГБО:
КС – клеточная стенка; ПГ – пластоглобулы; Пл – пластиды
84
Рис. 2.20. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа частичного ревертанта pr6-en:chlorina-7
после действия ГБО:
М – митохондрии; ТГ – тилакоидные мембраны гран
85
Светлые вакуоли, локализованные преимущественно по периферии органеллы, вероятно, появляются в результате сильного набухания одиночных тилакоидов. Довольно часто встречаются митохондрии
с неравномерной локализацией многочисленных шарообразных крист.
В клеточной цитоплазме рассеяны одиночные и слипшиеся между собой рибосомы, концентрация, которых значительно выше, чем у предыдущего мутанта. Сморщенное ядро с хорошо сохранившейся оболочкой содержит слипшийся в отдельный агрегат ядерный хроматин.
Характер пространственного распределения пластид полного ревертанта r-en:chlorina-7, их форма и электронная плотность в общих
чертах схожи с растениями инбредной зеленой линии 3629, хотя концентрация самих пластид в клетке несколько меньшая (рис. 2.21).
Их внутреннее строение, в целом, несколько отличается от 3629
меньшим числом ламелл в гранах, хотя в отдельных гранах оно может
достигать 20 единиц и выше (рис. 2.22). Матрикс пластид и клеточной
цитоплазмы содержит высокую концентрацию органельных рибосом,
вследствие чего и обладает высокой электронной плотностью. На их
фоне четко выделяются более светлые митохондрии и пероксисомы
(рис. 2.22, 2.23). Существенных различий в ультраструктуре митохондрий, пластид и ядерного аппарата отмечено не было.
После действия ГБО направленность ультраструктурных изменений полного ревертанта r-en:chlorina-7 схожа с таковой у частичного
реверсионного мутанта pr6-en:chlorina-7 (рис. 2.24).
В отличие от линии 3629, значительная часть органелл сохранила
способность к гранообразованию, что проявляется в наличии большого числа гран с числом мембран в них более 10 единиц (рис. 2.25).
Мембранная система другой части пластид представлена тилакоидами
с расширенным и частично вакуолизированным внутри тилакоидным
пространством (рис. 2.26).
Таким образом, резюмируя вышеизложенное, можно заключить,
что действие ГБО (0,7 МПа-14 ч) вызвало глубокие изменения ультраструктуры клеточных органелл исследуемых линий подсолнечника.
Их направленность в целом схожа для всех растений. Отмечено в различной степени набухание митохондрий (в результате диаметр органелл увеличился в среднем в полтора раза), просветление их матрикса,
деструкция внутренних мембран – крист. Пластиды после воздействия
ГБО, напротив, значительно уменьшились в размерах. Их форма стала
86
Рис. 2.21. Ультраструктура поперечного среза
первого настоящего листа полного ревертанта r-en:chlorina-7 в норме:
В – вакуоли; КС – клеточная стенка; Пл – пластида; Я – ядро
87
Рис. 2.22. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа полного ревертанта r-en:chlorina-7 в норме:
П – пероксисома; ТГ – тилакоидные мембраны гран
88
Рис. 2.23. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа полного ревертанта r-en:chlorina-7 в норме:
М – митохондрия; П – пероксисома; ТГ – тилакоидные мембраны гран
89
Рис. 2.24. Ультраструктура фрагмента поперечного среза первого
настоящего листа полного ревертанта r-en:chlorina-7 после действия ГБО:
В – вакуоль; КС – клеточная стенка; Пл – пластиды
90
Рис. 2.25. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа полного ревертанта r-en:chlorina-7
после действия ГБО:
ТГ – тилакоидные мембраны гран; ТС – тилакоидные мембраны стромы
91
Рис. 2.26. Ультраструктура фрагмента поперечного среза
первого настоящего листа полного ревертанта r-en:chlorina-7
после действия ГБО:
ЛК – липидная капля
92
более округлой. У многих органелл произошло нарушение целостности
наружной мембраны, а также набухание и вакуолизация тилакоидов
гран и стромы хлоропластов и в конечном итоге уменьшение площади внутренних мембран органелл. При этом степень и характер этих
изменений у исследуемых линий оказались различными. Наибольшую
стабильность ультраструктуры пластид и митохондрий проявили внеядерные мутанты, по сравнению с таковой исходной инбредной линии 3629. Причем это относится как к мутантам с хлорофильной
недостаточностью (en:chlorina-3, частичный реверсионный мутант
pr6-en:chlorina-7), так и к ревертанту с восстановленным содержанием
хлорофиллов до уровня зеленых растений линии 3629 – r-en:chlorina-7.
2.2. Высокие температуры и засухоустойчивость
На протяжении более 40 лет культивирования внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника мы обнаружили, что растения некоторых генетических линий обладают повышенным потенциалом адаптивности к различным внешним воздействиям. Так, например, один
из коллекционных мутантов en:chlorina-5 вследствие плейотропного
эффекта хлорофильной мутации оказался устойчивым к водной депривации. В условиях действия жесткой засухи, которая часто наблюдается
во время вегетации подсолнечника на юге Ростовской области, у растений en:chlorina-5 содержание зеленых пигментов и продуктивность
практически не изменяются, в отличие от исходной линии 3629 и других мутантов, у которых эти показатели уменьшаются вплоть до 50 %
от контрольных значений в физиологически нормальных условиях вегетации (Белецкий, 1989).
Проведенное электронно-микроскопическое исследование листовой ткани растений en:chlorina-5 показало, что в норме в мутантных пластидах имеются очень крупные вакуоли, возникающие из тилакоидных структур. Однако они охватывают не всю тилакоидную
систему хлоропластов. Оставшаяся часть тилакоидов в дифференцированной пластиде остается функционально активной, что и обеспечивает жизнеспособность мутантного растения (Федоренко и др.,
1988). Обезвоживание, проведенное в контролируемых условиях эксперимента, уменьшает в пластидах растений en:chlorina-5 количество
и размер вакуолей, тем самым, увеличивая долю активных тилакоидов
и повышая содержание зеленых пигментов в листьях.
93
Очевидно, что своеобразная реакция на засуху мутанта en:chlorina-5
определяется мутационными изменениями хлоропластов у данной
формы. В связи с чем этот мутант может вовлекаться в гибридизацию
с различными инбредными линиями и сортами, передавая при этом
по материнской линии мутантные пластиды. Так, на основе мутанта en:chlorina-5 и районированного в Ростовской области сорта Маяк
были получены гибриды (F1: en:chlorina-5 x Маяк), сочетающие повышенную резистентность к засухе с комплексом хозяйственно-ценных
свойств сорта. В засушливые годы урожайность гибрида F1 в среднем
была на 20–25 % выше, чем у сортовых растений. Например, в исключительно засушливый 1986 год на площади 2,5 га она составила 24,5 ц/га
против 14 га у сорта. В то же время гибрид между растениями исходной
линии 3629 и растениями сорта Маяк (F1: 3629 x Маяк) по этому показателю оставался на уровне сортовых растений.
Также был проведен сравнительный анализ устойчивости растений
исходной линии 3629, мутанта en:chlorina-5 и ревертанта r-en:chlorina-5
(см. главу 1). Оценку засухоустойчивости проводили в полевых условиях. В качестве критериев устойчивости использовали рост, продуктивность и содержание хлорофиллов в листовой ткани растений в физиологически нормальных условиях вегетации (показатели 1995 года)
и при действии засухи (показатели 1993 года) (табл. 2.6).
Таблица 2.6
Сравнительная морфофизиологическая характеристика растений
подсолнечника линии 3629, en:chlorina-5 и r-en:chlorina-5
в физиологически нормальных условиях и при действии засухи
Линия
3629
en:chlorina-5
r-en:chlorina-5
Условия
вегетации
Норма
Засуха
Норма
Засуха
Норма
Засуха
Высота
Продуктивность
растения,
одного растения, г
см
109,8±1,4
24,2±0,2
92,2±0,9***
16,1±0,4***
69,1±1,1
14,0±0,2
63,7±1,4**
14,7±0,6
71,3±2,2
20,4±0,3
60,8±1,4***
11,9±0,7***
Содержание хлорофиллов а+b, мг/г
сухого веса
8,47±0,31
6,81±0,24***
5,06±0,20
5,72±0,18
8,91±0,11
7,01±0,38***
Примечание: ** – достоверные отличия по сравнению с соответствующим контролем при P<0,01; *** – достоверные отличия по сравнению с соответствующим контролем при P<0,001.
94
В условиях засухи у всех растений, независимо от генетической природы, снижается рост. Однако степень этого снижения у мутанта en:chlorina-5
наименьшая. Продуктивность растений линии 3629 и r-en:chlorina-5 в условиях засухи снижается на 33 и 42 %, соответственно, в то время как продуктивность растений линии en:chlorina-5 не изменяется. Такая же закономерность отмечена у трех изученных линий и в содержании пигментов.
Таким образом, можно сделать вывод, что вторичная мутация (или мутации) в пластоме, восстанавливающая содержание хлорофиллов в листьях
ревертантных растений r-en:chlorina-5, также восстанавливает их чувствительность к водному дефициту при высоких температурах.
Высокие температуры являются неспецифическим стрессовым
фактором, способным модифицировать метаболизм любого живого
объекта. Последствия температурного стресса (ТС) будут определяться режимом температурной обработки, генетическими особенностями
объекта и стадией его развития на момент воздействия повышенной
температуры. Развитие температурного стресса связано с нарушением
динамического равновесия в системе прооксиданты–антиоксиданты,
приводящим к активации процессов перекисного окисления липидов
(Курганова и др., 1999). Таким образом, воздействие повышенной температуры связано с развитием окислительного стресса.
Нами был проведен сравнительный анализ интенсивности процессов ПОЛ и активности антиоксидантных ферментов после ТС у растений подсолнечника различных мутантных линий, как ядерной, так и
неядерной природы. Растения подвергали температурному стрессу
при 40 °С в течение 1 ч. Исследовали корневую меристему и изолированные из первой пары настоящих листьев хлоропласты.
В хлоропластах листьев подсолнечника инбредной линии 3629
контрольный уровень конечного продукта ПОЛ – МДА наибольший
по сравнению с мутантными линиями. Характерно, что у ядерного мутанта n:chlorina-1 уровень МДА в хлоропластах после ТС превышает
контроль на 30–37 %. В то же время все пластомные мутанты реагируют
на ТС в данном режиме воздействия снижением уровня конечного продукта ПОЛ (Машкина и др., 2001). Таким образом, действие повышенной температуры (40 °С-1 ч) на подсолнечник не активирует процессы
ПОЛ и даже приводит у пластомных мутантов к снижению уровня МДА.
Полученные нами данные позволяют предположить, что ТС в данном
режиме снижает «нецелевой» расход свободных радикалов и стимулируют процессы, направленные на активацию защитных систем.
95
При увеличении времени экспозиции до 6 ч и температуры до 45 °С
выявлены различия между линиями подсолнечника различной генетической природы. После ТС активность СОД в клетках пластомных
мутантов en:chlorina-3, en:chlorina-5, en:chlorina-6 практически не изменялась. При этом активность каталазы в клетках данных линий либо
не изменялась, либо повышалась по сравнению с контролем (табл. 2.7).
У ядерного мутанта n:chlorina-1 происходило снижение активности
как СОД, так и каталазы (на 40 и 50 %, соответственно), а у полного ревертанта r-en:chlorina-7 после действия ТС активность СОД снижалась
на 54 %, а активность каталазы повышалась на 234 %. Таким образом,
анализ активности СОД и каталазы в корневой меристеме проростков
подсолнечника выявил различия между изучаемыми линиями, которые позволили предположить, что наиболее устойчивыми к действию
ТС являются пластомные мутанты, у которых сохраняется скоординированное функционирование важнейших антиоксидантных ферментов, а наименее устойчив – ядерный мутант.
Таблица 2.7
Активность антиоксидантных ферментов – СОД и каталазы – в корневой
меристеме проростков подсолнечника, ед./мг белка
Линия
3629
n:chlorina-1
en:chlorina-3
en:chlorina-5
en:chlorina-6
en:chlorina-7
pr6-en:chlorina-7
r-en:chlorina-7
Сорт Донской
Контроль
каталаза
СОД
4,8 ± 0,6
30,1 ± 6,9
15,3 ± 3,1
8,1 ± 0,2+++
3,3 ± 0,1+
12,6 ± 1,8+
4,0 ± 0,8
13,5 ± 2,5+
5,1 ± 0,3
15,5 ± 6,3
4,7 ± 0,3
12,6 ± 1,9 +
6,9 ± 0,4
35,6 ± 4,8
3,2 ± 0,5+
14,8 ± 2,1+
6,6 ± 1,0
17,3 ± 2,1
ТС, 45 °С (0–6 ч)
каталаза
СОД
4,9 ± 0,9
20,1 ± 2,8
3,9 ± 0,6***
9,1 ± 1,3+++
3,3 ± 0,2
11,0 ± 1,4++
5,6 ± 0,2*
10,8 ± 2,9+
,
+++
9,3 ± 0,1***
12,6 ± 2,8
6,1 ± 1,3
9,4 ± 2,0++
6,4 ± 0,2
8,2 ± 1,4***, +++
10,7 ± 0,2***,+++ 6,9 ± 0,4***,+++
6,5 ± 0,3
14,2 ± 4,4
Примечание: в скобках − период воздействия стрессовым фактором от начала прорастания; знаком * отмечены достоверные отличия от контроля, знаком + – достоверные отличия от линии 3629; * и + – при P < 0,05; ** и ++ – при P < 0,01; *** и +++ –
при P < 0,001.
Данные полевых экспериментов подтвердили это предположение.
После действия повышенной температуры в первые часы прорастания у всех исследованных линий, за исключением сорта Донской-99,
96
снизилась всхожесть семян. Однако степень этого снижения оказалась
различной. ТС в режиме 40 °С-6 ч практически не снижает всхожести
семян линии 3629 и пластомных мутантов; при этом всхожесть семян
ядерного мутанта достоверно снижена. При повышении температуры
до 45 °С показатели всхожести семян у всех линий резко падают. Однако
степень этого снижения оказалась также различной. Наибольшие значения получены для частичного ревертанта pr6-en:chlorina-7 (всхожесть
после ТС составила 51 % по сравнению с контролем) и пластомных
мутантов – en:chlorina-3, en:chlorina-5 (35 и 29 %, соответственно).
Ядерный мутант n:chlorina-1 оказался наиболее чувствительным к температурному воздействию – единичные взошедшие растения были
представлены только летальными формами и погибали на самых ранних этапах вегетации. Температура 50 °С (в течение 6 ч) полностью ингибирует прорастание семян подсолнечника.
Анализ ростовых характеристик контрольных растений и растений,
обработанных на ранних стадиях прорастания семян, показал, что после воздействия повышенной температурой рост растений был подавлен вплоть до стадии развития 3–4-й пары листьев. Высота растений
линии 3629 составила только 25 % от контроля, а высота пластомных
мутантов – 61–78 %. Если в контроле растения линии 3629 были достоверно выше хлорофильных мутантов, то после ТС высота пластомных
мутантов на стадии 3–4-й пары листьев превышала таковую у растений
исходной линии 3629 (табл. 2.8).
Таблица 2.8
Высота растений подсолнечника на стадии развития 3–4-й пары листьев, см
Линия
3629
n:chlorina-1
en:chlorina-3
en:chlorina-5
en:chlorina-6
en:chlorina-7
pr6-en:chlorina-7
r-en:chlorina-7
Сорт Донской-99
Контроль
12,2 ± 0,3
8,9 ± 0,3+
7,5 ± 0,2+
7,2 ± 0,2+
8,5 ± 0,3+
8,1 ± 0,3+
9,7 ± 0,4+
10,8 ± 0,4+
16,5 ± 0,4+
ТС, 45 °С (0−6 ч)
3,0 ± 0,5***
–
4,6 ± 0,5***
5,6 ± 0,5+, ***
–
5,2 ± 0,2+, ***
6,4 ± 0,6+, ***
5,6 ± 0,6+, ***
12,7 ± 0,4+, ***
Примечание: в скобках – период воздействия стрессовым фактором от начала прорастания; *** – достоверные отличия от контроля при P < 0,001; + – достоверные
отличия от линии 3629 при P < 0,05.
97
Таким образом, данные полевых наблюдений согласуются с результатами цитогенетического анализа. Полное и длительное ингибирование пролиферативной активности клеток зародышей после ТС привело к снижению количества взошедших растений и отставанию их в
росте вплоть до стадии формирования 3–4-й пары листьев.
На основании результатов, полученных в модельных и полевых
экспериментах, можно заключить, что среди хлорофильных мутантов подсолнечника наиболее устойчивыми формами к действию ТС,
также как и к окислительному стрессу, являются пластомный мутант
en:chlorina-5 и частичный ревертант pr6-en:chlorinа-7.
Одним из ключевых источников активных форм кислорода в растительной клетке является фотосинтетический аппарат пластид.
Содержание фотосинтетических пигментов на ранних этапах дифференцировки хлоропластов может отражать степень толерантности
растительных клеток к действию стрессового фактора. Анализ уровня
фотосинтетических пигментов у двух линий пшеницы Triticum durum
Desf показал, что в условиях засухи растения линии Adamello характеризуются сниженным уровнем хлорофилла а, снижением отношением хлорофиллов а/b и пониженным содержанием каротиноидов. В то
же время в тканях растений засухоустойчивой линии Ofanto не обнаружено изменений в количественных и качественных показателях пигментов (Loggini et al., 1999).
Мы провели сравнительный анализ содержания и накопления фотосинтетических пигментов в этиолированных семядольных листьях
трех различающихся по терморезистентности линий – исходной линии
3629, ядерного n:chlorina-1 и внеядерного en:chlorina-5 хлорофильных
мутантов (рис. 2.27).
В течение 72 ч роста на свету в семядолях проростков линии 3629
происходит постепенное накопление хлорофиллов (см. рис. 2.27, А).
Содержание пигментов в семядолях ядерного мутанта n:chlorina-1 после
48 ч роста на свету снижено по сравнению с линией 3629 (см. рис. 2.27, Б).
Семядоли проростков пластомного мутанта en:chlorina-5, выращенных
при искусственном освещении, по контрольному содержанию хлорофиллов превосходят другие линии (см. рис. 2.27, В).
Воздействие ТС (47 °С-2 ч) на этиолированные проростки линии
3629 не влияет на последующее накопление фотосинтетических пигментов (см. рис. 2.27, А). ТС в режиме 50 °С-2 ч достоверно снижает
98
А
Б
В
Рис. 2.27. Динамика накопления хлорофиллов в семядольных листьях
проростков подсолнечника линии 3629 (А), ядерного мутанта
n:chlorina-1 (Б) и пластомного мутанта еn:chlorina-5 (В)
после воздействия повышенной температуры:
1 – контроль; 2 – 47 °С; 3 – 50 °С; 4 – 53 °С; 5 – 56 °С
99
суммарное содержание хлорофиллов а+b; воздействие более высокой
температуры (53 и 56 °С) вызывает сходный эффект. Таким образом,
можно заключить, что для проростков подсолнечника линии 3629 температура 50 °С является пороговой, нарушающей нормальное формирование фотосинтетического аппарата.
Изменения в накоплении пигментов в этиолированных семядолях
мутанта n-chlorina-1 также как и для линии 3629, отмечены при температуре не ниже 50 °С (см. рис. 2.27, Б). Но после действия температур
53 и 56 °С до 30 % проростков линии n:chlorina-1 погибли в течение 48 ч
после окончания обработки. В целом, сравнивая действие ТС на этиолированные проростки линий 3629 и n:chlorina-1, можно отметить одинаковую направленность изменений в содержании пигментов. Однако
у данного мутанта эти изменения носят более глубокий характер.
ТС, независимо от режима, не оказал влияния на интенсивность
накопления пигментов в этиолированных семядолях проростков пластомного мутанта en:chlorina-5 (см. рис. 2.27, В). Следовательно, внеядерный мутант по интенсивности синтеза и накопления пигментов
фотосинтеза продемонстрировал устойчивость к ТС. Стабильный после ТС уровень хлорофиллов а+b в семядольных листьях предполагает и устойчивость ферментативных систем, участвующих в биосинтезе
хлорофилла и его предшественников.
Известно, что уровень термотолерантности является видовым признаком. На Rhamnaceae показаны видовые различия в экспрессии низкомолекулярных хлоропластных БТШ после теплового шока (45 °С)
(Knight, Ackerly, 2001). ТС в режиме 55 °С-1,5 ч оказался летальным
для 80 % проростков Sinapis alba L. (Dat et al., 1998). Авторы объясняют гибель проростков активацией процессов перекисного окисления
липидов. Синтез и накопление пигментов в этиолированных проростках подсолнечника могут осуществляться при температурах, которые
значительно превышают пороговые значения для других видов. Так,
на этиолированных проростках арабидопсиса показано, что воздействие температур 48 или 50 °С в течение 30 мин. полностью блокирует накопление хлорофилла и приводит к гибели проростков (Burke
et al., 2000). В то же время установлено, что предварительный нагрев
при 38 °С индуцирует формирование «приобретенной термотолерантности» к последующему воздействию более высокой температуры.
100
Воздействие повышенной температуры, изменяющее концентрацию активных форм кислорода в клетке, способно оказывать влияние
на уровень повреждений как ядерного, так и цитоплазматического
генетического материала. В связи с этим мы провели сравнительный
анализ цитогенетического эффекта действия повышенной температуры на инбредную линию 3629, ядерный n:chlorina-1 и пластомный
en:chlorina-5 хлорофильные мутанты. Прорастающие семена подвергали действию повышенной температуры в режиме 47 °С-4 ч. Воздействие
температуры в данном режиме достоверно увеличивает уровень перестроек хромосом в клетках как исходной инбредной линии 3629, так и
полученных на ее основе пластомного и ядерного хлорофильных мутантов (табл. 2.9). Повышенный уровень аберраций хромосом сохраняется в течение 48 ч после окончания обработки.
Таблица 2.9
Уровень аберраций хромосом и пролиферативной активности
в корневой меристеме проростков подсолнечника
после температурного воздействия
Вариант
Время роста, ч
Всего анафаз
АХр±m
МИ±m
2,8±0,45
3,2±0,5
6,2±0,65***
7,3±0,7***
7,4±0,67
9,5±0,75
3,2±0,45***
7,4±0,63*
1,7±0,35
1,95±0,35
5,8±0,51***
6,2±0,65***
10,9±0,8
10,0±0,77
7,5±0,69**
8,2±0,71
2,3±0,4
2,7±0,45
6,4±0,65***
6,8±0,65***
6,5±0,64
9,1±0,74
1,5±,03***
3,2±0,46***
линия 3629
Контроль
47 °С-4 ч
24
48
24
48
603
598
593
608
еn:chlorina-5
Контроль
47 °С-4 ч
24
48
24
48
613
629
583
600
n:chlorina-1
Контроль
47 °С-4 ч
24
48
24
48
623
615
631
627
Примечание: знаком * обозначены достоверные отличия по сравнению с контролем,
* – при P < 0,05; ** – при P < 0,01; *** – при P < 0,001.
101
Однако между линиями выявлены различия по интенсивности пролиферации меристематических клеток после стрессового воздействия.
ТС практически полностью блокирует деление клеток корневой меристемы ядерного мутанта на протяжении 48 ч после окончания обработки. У исходной линии 3629 через 48 ч после воздействия интенсивность
деления клеток восстанавливается, хотя и не достигает контрольного
уровня. Пролиферативная активность клеток пластомного мутанта en:chlorina-5 через 48 ч после окончания обработки не отличается
от контрольных значений (см. табл. 2.9). Таким образом, пластомный
мутант en:chlorina-5 даже на стадии проростка имеет более стабильный
клеточный цикл.
В качестве следующего критерия устойчивости клеток подсолнечника к действию ТС мы использовали уровень безъядерных клеток
эпидермиса этиолированных семядольных листьев. Как видно из таблицы 2.10, в контроле в эпидермисе семядольных листьев линии 3629
уровень эпидермальных клеток без ядра составил 8,7 %, а среди устьичных клеток только 1,8 % лишены ядра. Сходные результаты получены
для пластомного мутанта en:chlorinа-5. У ядерного мутанта n:chlorina-1
уровень клеток с поврежденным ядром или без ядра в устьицах в 5 раз
выше по сравнению с исходной линией 3629.
После воздействия ТС у всех линий подсолнечника повреждение
ядер в большей степени происходит в эпидермальных клетках, содержащих только митохондрии, в то время как устьичные клетки с хлоропластами и митохондриями проявили большую устойчивость к действию данного фактора. У клеток линии 3629 и пластомного мутанта
реакция на действие ТС сходна. Однако устьичные клетки с функционально активными хлоропластами у пластомного мутанта в меньшей
степени подвержены действию повреждающего фактора по сравнению с линией 3629 (см. табл. 2.10). У ядерного мутанта n:chlorina-1
уровень как эпидермальных, так и устьичных клеток, лишенных ядра,
достоверно повышен уже после воздействия 47 °С. Таким образом,
действие ТС индуцирует увеличение количества клеток с поврежденным ядром в семядольных листьях. Однако если у исходной линии
и ядерного мутанта пороговой является температура в 47 °С, то у пластомного мутанта увеличение доли безъядерных клеток наблюдается
после действия 53 °С.
102
Таблица 2.10
Уровень клеток без ядра в эпидермисе семядольных листьев
подсолнечника после температурного воздействия
Вариант
Контроль
47 °С-6 ч
53 °С-6 ч
Контроль
47 °С-6 ч
53 °С-6 ч
Контроль
47 °С-6 ч
53 °С-6 ч
Кол-во клеток без ядра, % ± m
эпидермальных
устьичных
линия 3629
8,7 ± 1,1
1,8 ± 1,2
14,0 ± 1,3 **
5,0 ±1,9
20,8 ± 1,5 ***
14,5 ± 3,1 ***
en:chlorina-5
6,7 ± 0,9
2,5 ± 1,4
9,2 ± 1,1
5,8 ± 2,5
19,8 ± 1,4 ***
11,6 ± 2,9 *
n:chlorina-1
7,3 ± 0,9
8,8 ± 2,4 +
+++
23,4 ±1,6 ***
17,5 ± 3,3 * +++
+++
29,4 ± 1,4 ***
23,8 ±3,7 ***
Примечание: знаком * обозначены достоверные отличия по сравнению с контролем,
знаком + – достоверные отличия по сравнению с линией 3629, * и + – при P < 0,05;
** и ++ – при P < 0,01; *** и +++ – при P < 0,001.
Воздействие ТС на ранних этапах вегетации подсолнечника индуцирует хлорофильные мутации. Результаты анализа мутагенного эффекта ТС (40 °С) представлены в таблице 2.11. Действие ТС в первые
часы прорастания семян подсолнечника индуцирует у всех трех линий
в М1 растения с измененным содержанием пигментов. У ядерного мутанта n:chlorinа-1 помимо пестролистных растений наблюдали большое
количество летальных форм (до 50 % от общего числа растений с измененным содержанием пигментов). В то же время у пластомного мутанта en:chlorinа-5 не зафиксировано ни одной летальной формы.
Анализ растений М2 линии 3629 свидетельствует, что воздействие
ТС в течение первого часа прорастания не индуцирует хлорофильные
мутации (табл. 2.11). Все пестролистные формы М1 оказались морфозами и в М2 формировали нормальное зеленое потомство. Более длительное температурное воздействие (3 или 6 ч) вызывает появление
в М2 хлорофильных мутантов типа variegated и chlorinа. Необходимо отметить, что ТС не индуцирует возникновение летальных форм у линии
3629. Летали в М2 в варианте 3-часового ТС возникли в потомстве после
103
самоопыления пестролистной формы М1. Все мутантны типа chlorinа,
возникшие в М2, принадлежат одной семье и являются потомством
пестролистной формы М1. В данной семье растения типа chlorina в М3
не расщеплялись и давали только желто-зеленое потомство, что свидетельствует о ядерной природе мутации. После самоопыления пестролистных растений М2 в потомстве наблюдали расщепление на три
типа проростков: зеленые, пестролистные и летальные. При этом никаких менделевских закономерностей в расщеплении не обнаружено,
что указывает на внеядерную природу пестролистности. Таким образом, воздействие повышенной температуры в первые часы прорастания семян подсолнечника линии 3629 индуцирует изменения как ядерного генетического материала, так и цитоплазматических органелл.
Таблица 2.11
Частота хлорофильных аномалий у растений М1 и М2
после действия повышенной температуры (40 °С), %
Вариант
Растения
Растения М2 с измененным содержанием пигментов
с измененным
содержанием пестролистлетали
chlorina
зеленые
ные
пигментов М1
Контроль
ТС (0–1 ч)
ТС (0–3 ч)
ТС (0–6 ч)
0
3,7
1,5
0,8
Контроль
ТС (0–1 ч)
ТС (0–3 ч)
ТС (0–6 ч)
0
2,6
0,8
3,8
Контроль
ТС (0–1 ч)
ТС (0–3 ч)
ТС (0–6 ч)
0
7,0
4,0
7,2
линия 3629
0
0
0
0
0,64±0,45
0,32±0,31
2,8±1,37
0
еn:chlorinа-5
0
0
0,45±0,45
0
0,9±0,87
0
0
0
n:chlorinа-1
0
0
1,9±1,09
3,8±1,52
1,5±1,04
0
0
0
0
0
35,2±2,70
0
–
–
–
–
–
–
–
–
0
0
0,9±0,87
0
–
–
–
–
0
0
0
0
У пластомного мутанта en:chlorinа-5 большая часть возникших в М1
пестролистных форм оказались морфозами. В М2 выявлены единичные
104
пестролистные хлорины и растения-ревертанты с зеленой окраской
листьев (см. табл. 2.11). Пестролистные хлорины после самоопыления
расщеплялись в потомстве (М3 и М4) на растения типа chlorinа и variegated chlorinа. Зеленые ревертантные формы также расщеплялись в потомстве на chlorinа и зеленые растения.
Наибольшее число хлорофильных мутантов в М2 выявлено у ядерной n:chlorinа-1 (см. табл. 2.11). Данные мутации представлены пестролистными и летальными формами. При этом отмечено, что с увеличением продолжительности температурного воздействия уменьшается
частота возникновения хлорофильных аномалий в М1 и мутаций в М2.
Обобщая полученные результаты, можно заключить, что пластомный мутант en:chlorinа-5 проявляет большую толерантность к воздействию ТС по сравнению с другими линиями подсолнечника. Данный
мутант характеризуется изменением жирнокислотного состава липидов, активности антиоксидантных ферментов и уровня продуктов
ПОЛ, как в корневой меристеме, так и в тканях листа. Это служит основой для повышения стабильности клеточного цикла в апикальных
клетках корня и ферментативных комплексов, формирующих фотосинтетический аппарат растительной клетки, а также резистентности
клеток эпидермиса семядолей к действию ТС.
Возможно мутация в хлоропластной ДНК, повышая генетическую гетерогенность плазмона, расширяет адаптивную зону организма за счет отбора органелл, способных эффективно функционировать при отклонении условий среды от физиологической нормы.
Стрессовое воздействие индуцирует в процессе митотических делений
повышение скорости рассортировки органелл, в данном случае хлоропластов, и возникновение тканей, органов и организмов с измененной
нормой реакции. При действии экстремальных факторов среды получают преимущества те организмы, в которых пластиды и митохондрии
адаптированы к более высоким концентрациям свободно-радикальных продуктов.
2.3. Почвенное засоление
Проблеме устойчивости растений к засолению всегда придавали
большое теоретическое и практическое значение. Это объясняется широким распространением засоленных почв и необходимостью их хо105
зяйственного использования. Селекция на создание высокоустойчивых к засолению сортов и гибридов сельскохозяйственных растений
представляет один из основных путей эффективного освоения засоленных земель.
Было обнаружено, что фенотипически однородная по окраске листьев группа мутантов en:chlorina (см. главу 1) гетерогенна по чувствительности к хлоридному засолению (Белецкий и др., 1990). В таблице 2.12 приведены результаты всхожести семянок мутантов chlorina
при различных концентрациях NaCl.
Таблица 2.12
Действие различных концентраций NaCl на всхожесть
семян мутантов еn:chlorina подсолнечника, %
Линия
3629
еn:chlorina-1
еn:chlorina-2
еn:chlorina-3
еn:chlorina-5
еn:chlorina-6
еn:chlorina-7
еn:chlorina-8
0
97,4±1,6
96,1±2,9
95,0±1.2
96,8±1,5
98,3±2,7
97,1±2,1
97,2±1,4
94,6±1,9
0,5
95,2±1,8
81,9±3,3
79,8±2,0
82,3±3,1
72,2±3,6
88,4±3,1
77,3±2,7
69,3±2,9
Концентрация NaCl, %
1,0
1,5
2,0
2,9
5,8
74,1±1,2 58,2±1,9 22,2±2,3
0
0
69,4±2,7 41,4±3,6 9,7±2,5
0
0
61,7±3,9 37,9±2,1 14,9±1,9
0
0
55,4±2,5 51,1±3,2 30,5±2,4
0
0
66,4±3,1 32,2±2,4
0
0
0
41,3±2,2 44,1±2,0 38,3±2,7 22,1±1,6 27,3±2,4
58,2±3,3 33,3±3,5 12,8±1,1
0
0
61,2±2,3 35,4±2,5 18,8±3,1
0
0
Видно, что за исключением мутанта en:chlorina-6 хлоридное засоление приводит к снижению всхожести семян исследуемых линий
пропорционально концентрации NaCl в среде. Высокая устойчивость
мутанта en:chlorina-6 к хлоридному засолению проявляется в его способности развиваться при высоких концентрациях NaCl (2,9 и 5,8 %),
при которых семена остальных линий, включая и исходную 3629,
не прорастают. Повышенная галорезистентность мутанта en:chlorina-6
была подтверждена в вегетационных опытах. Так, высота растений
en:chlorina-6 через 14 суток после появления всходов на 0,4 %-ном растворе NaCl составила 8,3±0,7 см, в то время как растения исходной линии 3629 достигли всего 5,8±1,1 см. Остальные мутанты chlorina имели
размеры в пределах 4,0–5,0 см.
106
Изменения в скорости роста проростков подсолнечника могут
быть связаны с нарушением метаболизма и развитием стресс-реакции
на фоне почвенного засоления. В условиях стресса происходит увеличение скорости свободно-радикальных реакций и активация процессов перекисного окисления липидов. Увеличение продукции свободных радикалов можно зафиксировать по изменению интенсивности
хемилюминесценции в растительных тканях. Анализ высоты быстрой
вспышки хемилюминесценции показал, что в тканях листьев мутантных форм подсолнечника, выросших при засолении NaCl, интенсивность хемилюминесценции достоверно превышает контрольные значения (табл. 2.13). Высота быстрой вспышки хемилюминесценции
отражает уровень накопленных в тканях свободно-радикальных продуктов. Однако достоверное снижение другого показателя хемилюминесценции – светосуммы за 500 секунд – указывает на эффективное
функционирование антиоксидантов, что препятствует развитию цепного процесса ПОЛ.
Таблица 2.13
Показатели хемилюминесценции в тканях листьев растений
в условиях хлоридного засоления (вегетационный опыт)
Контроль
1,25 % NaCl
высота
светосумма
высота
Линия
светосумма за 500 с,
быстрой
за 500 с, усл.
быстрой
усл. ед.
вспышки, мм
ед.
вспышки, мм
3629
81,5±5,9
6437±89,7
75,7±6,33
5654,1±34,71***
n:chlorina-1
84,7±0,9
6663,1±36,7 115,3±4,7***
5922,5±18,5***
en:chlorina-3
82,7±4,6
6239,5±38,9 116,3±1,5***
5406,3±38,15***
en:chlorina-7
85,0±2,6
6725,3±4,4 115,0±0,6***
5607,3±50,98***
r-en:chlorinа-7
86,7±1,8
6669,5±39,0 116,7±1,2***
5637,2±45,63***
Примечание: *** – достоверные отличия по сравнению с контролем при Р<0,001.
Резистентность к действию внешних экстремальных факторов,
как правило, коррелирует с повышенной активностью антиоксидантных ферментов. По данным литературы, известно, что солерезистентные формы растений характеризуются повышенным уровнем активности антиоксидантных ферментов. Так, у солерезистентного мутанта
pst1 Arabidopsis thaliana активность СОД и аскорбат-пероксидазы пре107
вышала значение активности ферментов по сравнению с контрольной
линией (Tsuganea et al., 1999).
В контрольных условиях роста растения линии r-en:chlorinа-7 характеризуются высокой активностью как СОД, так и каталазы, что предполагает устойчивость данных растений к действию экстремальных
факторов. Высокая активность СОД также отмечена для пластомного
мутанта en:chlorinа-3, а мутант en:chlorinа-7 характеризуется высокой
активностью каталазы (табл. 2.14, 2.15). В условиях дробного хлоридного засоления активность СОД в листовой ткани растений исходной
линии 3629 повышается. У ядерного мутанта n:chlorinа-1 и пластомного
мутанта en:chlorinа-3 повышение концентрации хлоридов в почве несколько снижает активность СОД (табл. 2.15). У пластомного мутанта
en:сhlorina-7 и его ревертанта отмечена тенденция к повышению активности фермента.
Таблица 2.14
Активность СОД (ед/мг белка) в клетках листьев растений
в условиях засоления в вегетационном опыте
Линия
3629
n:chlorina-1
еn:chlorina-3
еn:chlorina-7
r-en:chlorinа-7
Контроль
33,9±7,03
32,1±3,87
71,9±14,94
22,8±5,83
57,0±11,67
0,75 % NaCl
95,6±10,84***
24,3±6,74
21,6±3,82**
44,9±8,34*
19,3±2,18**
1,25 % NaCl
85,9±24,7*
21,2±8,96
57,3±8,53
35,4±6,76
68,7±8,25
Примечание: знаком * обозначены достоверные отличия по сравнению с контролем,
* – при Р < 0,05; ** – при Р < 0,01; *** – при Р < 0,001.
Таблица 2.15
Активность каталазы в клетках листьев растений в условиях засоления
в вегетационном опыте, ед/мг белка
Линия
3629
n:chlorina-1
еn:chlorina-3
еn:chlorina-7
r-en:chlorinа-7
Контроль
6,4±0,93
6,4±0,53
3,2±0,36
8,9±0,51
11,5±1,26
0,75 % NaCl
12,2±0,82***
8,5±0,72***
8,9±0,57***
20,7±1,04***
10,4±1,05
1,25 % NaCl
18,7±0,78***
16,3±0,86***
14,8±0,68***
29,3±3,22***
24,3±2,97***
Примечание: *** – достоверные отличия по сравнению с контролем при Р<0,001.
108
На фоне хлоридного засоления происходит повышение активности каталазы в листовой ткани всех исследуемых линий подсолнечника (см. табл. 2.15). Повышение активности СОД и каталазы может
иметь адаптивное значение, поскольку препятствует зарождению цепного процесса и развитию реакций перекисного окисления липидов.
Однако не менее важно сохранение сопряженного функционирования
ферментов. У ядерного мутанта n:chlorinа-1 и пластомного мутанта
en:chlorinа-3 выявлен дисбаланс в работе СОД и каталазы. Снижение
активности СОД предполагает увеличение в тканях концентрации супероксидного радикала, что влечет за собой развитие ПОЛ, нарушение
структурных и функциональных свойств клеточных мембран.
У пластомного мутанта en:chlorinа-7 и его ревертанта повышение
активности СОД сопровождается повышением активности каталазы.
Ферменты функционируют согласованно, что предполагает устойчивость данных линий к хлоридному засолению.
В качестве другого показателя устойчивости или чувствительности
растений к действию стрессового фактора мы использовали уровень
хлорофиллов и каротиноидов. По данным литературы, известно, что в
условиях засоления происходит перестройка структурной организации
фотосинтетического аппарата листа, снижается фотосинтетическая
активность (Tsuganea et al., 1999; Fukushima et al., 2001). Под влиянием
избыточных концентраций солей у солечувствительных форм наблюдается хлороз листьев, выражающийся в деградации зеленых пигментов.
Одновременно изменяется состав пигментного фонда хлоропластов:
увеличивается доля «слабых» форм хлорофилла а и b, которые могут стать
дополнительными источниками синглетного кислорода. А он, в свою
очередь, индуцирует повышение уровня других свободных радикалов.
В контрольных условиях вегетационного опыта пластомный мутант
en:chlorinа-3 не отличается от исходной линии 3629 по уровню хлорофиллов a и b. У ядерного мутанта n:chlorinа-1 и пластомного мутанта
en:chlorinа-7 содержание как хлорофиллов, так и каротиноидов достоверно ниже по сравнению с исходной инбредной линией 3629. У ревертанта r-en:chlorinа-7 содержание пигментов превышает таковой показатель исходной мутантной линии en:chlorinа-7, однако не достигает
значений линии 3629.
Формирование первой пары настоящих листьев на фоне засоления
NaCl не влияет на уровень пигментов у ядерного мутанта n:chlorinа-1.
В листьях зеленой инбредной линии 3629 отмечено повышение уров109
ня хлорофилла а и b при 0,75 %-ном хлоридном засолении. При более
высокой концентрации хлоридов в почве уровень фотосинтетических
пигментов не отличается от контрольных значений.
У пластомных мутантов подсолнечника в условиях засоления (0,75
и 1,25 % NaCl) происходит увеличение содержания как хлорофиллов,
так и каротиноидов. Увеличение концентрации каротиноидов имеет
большое адаптивное значение, поскольку они выполняют функцию
«ловушек» активных форм кислорода и «обрывают» свободно-радикальные реакции на стадии зарождения цепного процесса.
Также среди мутантов en:chlorina были выделены линии, в первую
очередь en:chlorina-3, характеризующиеся повышенной устойчивостью
к сульфатам. В условиях вегетационного опыта мутант en:chlorina-3
при 1 %-ном засолении Na2SO4 формировал более чем в 3 раза высокий урожай по сравнению с исходной линией 3629. Н.И. Шевяковой
было показано, что мутация в пластоме en:chlorina-3 привела к изменению механизмов, регулирующих поступление в растение натрия и серы
(Шевякова, 1982).
Для оценки солеустойчивости ядерного ревертанта r-en:chlorina-3
(см. главу 1), мутанта en:chlorina-3 и исходной линии 3629 растения
выращивали в сосудах с почвой (вес почвы 22,6 кг) на вегетационной
площадке в естественных условиях. Влажность почвы поддерживали
на уровне 60 % влагоемкости при помощи ежедневного полива сосудов
по весу. Засоление почвы проводили дробно по 0,2 % Na2SO4 от веса
сухой почвы в несколько приемов (Строгонов, 1962). В качестве критериев устойчивости использовали рост и продуктивность растений
в условиях действия стрессового фактора. Результаты свидетельствуют,
что у ревертанта r-en:chlorina-3 сохраняется повышенная устойчивость
к сульфатному засолению, присущая мутанту en:chlorina-3 (табл. 2.16).
Таблица 2.16
Продуктивность и высота растений 3629, en:chlorina-3, r-en:chlorina-3
в условиях сульфатного засоления (вегетационный опыт)
Линия
3629
еn:chlorina-3
r-еn:chlorina-3
Высота растений, см
контроль
1%
2%
123,0±1,3 87,3±1,5 52,0±0,8
77,9±2,2+++ 81,9±1,5 63,0±1,0+++
129,7±2,0 94,5±1,3+++ 68,1±1,2+++
Вес семянок одного растения, г
контроль
1%
2%
12,3±0,2
4,2±0,1
2,5±0,1
10,7±0,2+++ 12,8±0,3+++ 3,4±0,1+++
14,1±0,3+++ 11,9±0,3+++ 4,0±0,1+++
Примечание: +++ – достоверные отличия по сравнению с линией 3629 при P<0,001.
110
Поскольку хлоропласты растений тонко реагируют на различные
изменения внешней среды, для более глубокого изучения действия солевого стресса на растения изучаемых линий была исследована их ультраструктура. В контрольных условиях выращивания растений степень
развитости внутренней мембранной системы пластид находится в полном соответствии с содержанием зеленых пигментов (рис. 2.28–2.30).
Так, уменьшение количества хлорофиллов у мутанта en:chlorina-3
по сравнению с зелеными растениями 3629 приводит к заметным изменениям ультраструктуры хлоропластов, проявляющихся в основном
в степени выраженности тилакоидной системы, которая у мутанта развита менее интенсивно (рис. 2.29). Повышение содержания зеленых
пигментов у ревертанта r-en:chlorina-3 до соответствующих показателей зеленых растений 3629 сопровождается и восстановлением тонкой
структуры хлоропластов. Видны хорошо развитая система тилакоидов и крупные крахмальные зерна, что является отражением высокой
функциональной активности пластид (рис. 2.30).
В условиях засоления в клетках растений линии 3629 обнаружены
электронноплотные образования, локализованные в зонах клеточных
и пластидных оболочек. Эти образования выявляются в виде характерных микрокристаллов, игольчатой формы (рис. 2.31). Структура
хлоропластов имеет заметные изменения. Явно выраженных тилакоидных структур не наблюдается. Вместо них отмечено чередование плохо разрешаемых электронноплотных зон матрикса пластид,
весьма отдаленно сходных со структурой значительно трасформированных тилакоидных систем. Однако при этом, пластиды содержат крахмальные зерна. Вдоль крахмальных зерен обнаружены такие
же электронноплотные отложения, как и в зонах клеточных и пластидных оболочек.
В условиях засоления в клетках мутанта en:chlorina-3 и ревертанта r-en:chlorina-3 включений, отмеченных для линии 3629, не наблюдали. Явных изменений ультраструктуры пластид не обнаружено
(рис. 2.32, 2.33). Таким образом, на организменном и субклеточном
уровнях подтверждена повышенная галорезистентность мутанта
en:chlorina-3 и ревертанта r-en:chlorina-3 по сравнению с растениями
исходной линии 3629.
111
Рис. 2.28. Ультраструктура хлоропласта зеленого растения
линии 3629, выращенного на пресном фоне:
К – крахмальное зерно; ПГ – пластоглобула;
ТГ – тилакоидные мембраны гран
112
Рис. 2.29. Ультраструктура хлоропласта мутанта en:chlorinа-3,
выращенного на пресном фоне:
М – митохондрия; ТГ – тилакоидные мембраны гран
113
Рис. 2.30. Ультраструктура хлоропласта ревертанта r-en:chlorinа-3,
выращенного на пресном фоне:
К – крахмальное зерно; ТГ – тилакоидные мембраны гран
114
Рис. 2.31. Ультраструктура хлоропласта зеленого растения линии 3629,
выращенного на солевом фоне (2 %-ный Na2SO4):
МКР – микрокристаллы
115
Рис. 2.32. Ультраструктура хлоропласта мутанта en:chlorinа-3,
выращенного на солевом фоне (2 %-ный Na2SO4):
М – митохондрия; ПГ – пластоглобулы; ТГ – тилакоидные мебраны гран
116
Рис. 2.33. Ультраструктура хлоропласта ревертанта r-en:chlorinа-3,
выращенного на солевом фоне (2 %-ный Na2SO4):
К – крахмальное зерно; ТГ – тилакоидные мембраны гран
117
Полученные данные свидетельствуют, что мутации в хпДНК могут изменять чувствительность растений подсолнечника к действию
повышенных концентраций солей. Толерантность к засолению определяется комплексом биохимических процессов, направленных, прежде всего, на удержание воды в клетке, защиту функций хлоропластов
и поддержание ионного гомеостаза. Одним из ключевых моментов является способность растений к детоксикации активных форм кислорода. По данным литературы, известно, что многие солеустойчивые виды
накапливают метилированные метаболиты, которые выполняют двойную роль – осмопротекторов и ловушек свободных радикалов (Parida,
Das, 2005).
2.4. Тяжелые металлы
Тяжелые металлы – один из наиболее распространенных классов антропогенных поллютантов. Они оказывают отрицательное
действие на растения и другие организмы при концентрации 10–5 М
и выше. Однако у некоторых растений сформировались конститутивные механизмы, защищающие клеточный метаболизм от присутствия
в окружающей среде тяжелых металлов. Степень устойчивости растений к действию этих токсикантов во многом определяется их генетическим потенциалом. Многочисленные эксперименты на различных
модельных объектах, в том числе и полученные в нашей лаборатории
на подсолнечнике, свидетельствуют, что вклад цитоплазматической
изменчивости и ядерно-цитоплазматических взаимодействий в формирование резистентности растений к действию факторов среды достаточно весом.
В связи с этим был проведен сравнительный анализ устойчивости
растений инбредной линии 3629 подсолнечника и полученных на ее
основе внеядерных мутантов en:chlorina-3, en:chlorina-5, en:chlorina-7,
r-en:chlorina-7 к воздействию солей тяжелых металлов. Изучали всхожесть и скорость прорастания семян, интенсивность H2O2-люминолиндуцированной хемилюминесценции после проращивания семян
подсолнечника в водных растворах солей тяжелых металлов (CuSO4
и CdSO4). Определение хемилюминесценции проводили на корневой
меристеме проростков растений.
Анализ длины корешков через 72 ч прорастания семян подсолнечника показал, что воздействие тяжелых металлов сильнее подавляет
118
скорость корневого роста зеленых растений линии 3629 и ревертанта
r-en:chlorina-7 по сравнению с соответствующими контролями,
чем хлорофильных пластидных мутантов. Всхожесть и длина корней
растений лини 3629 и r-en:chlorina-7 при воздействии тяжелых металлов снижена по сравнению с контролем на 50 и 30 %, соответственно
(рис. 2.34). Сходные результаты получены при действии на исследуемые линии подсолнечника сульфата железа и свинца.
Рис. 2.34. Всхожесть и длина корешков через 72 ч прорастания
семян подсолнечника в % от контроля
после воздействия сульфата меди и сульфата кадмия
в концентрации 50 мкМ:
1 – 3629; 2 – en:chlorina-3; 3 – en:chlorina-5; 4 – en:chlorina-7;
5 – r-en:chlorina-7.
Хлорофильные мутанты проявили большую устойчивость по сравнению с исходной линией 3629.
Эффект действия тяжелых металлов на всхожесть связан с инактивацией многих ферментов, в том числе и тех, которые участвуют в деградации запасных питательных веществ и обеспечивают синтез белка
и мРНК в проростках. Поэтому эффект воздействия тяжелых металлов
в одних и тех же условиях на разные растения будет зависеть от особенностей генотипа.
Устойчивость или чувствительность мутантов к стрессорному воздействию могут определяться и спецификой активности ферментов
защитной системы. Мутантный пластом как составная часть окис119
лительной системы клетки может оказывать существенное влияние
на изоферментный состав и активность ферментов, кодируемых ядром,
в том числе и пероксидазы (Белецкий, 1989). Различия между мутантными и контрольными растениями по активности ферментов и их изоферментному составу могут быть вызваны генетическими причинами
или влиянием внутриклеточных условий на формирование пространственной структуры белков.
Как показали многочисленные исследования, тяжелые металлы
участвуют в реакциях окисления/восстановления, а некоторые из них,
в частности, кадмий, ртуть, никель, свинец, железо, медь, ванадий
и другие, способны вызывать окисление глутатиона и сульфгидрильных групп белков. Изменения в гомеостазе сульфгидрильных групп
мембранных белков ведут к нарушениям в обмене веществ между
внутри- и внеклеточным пространством, проведении межклеточных
сигналов. Эти процессы протекают за счет генерации активных форм
кислорода, которые параллельно провоцируют перекисное окисление
липидов и повреждение ДНК (Stohs, Bagchi, 1995). Показано, что катализируемое металлами окисление хинонов и хиноноподобных соединений также сопровождается генерацией АФК (Stohs, Bagchi, 1995).
Таким образом, токсические эффекты целого ряда металлов опосредованы индукцией окислительного стресса. В связи с этим мы исследовали на модели внеядерных мутантов подсолнечника способность
природных антиоксидантов – аллантоина и урата – модифицировать
действие тяжелых металлов.
Скорость прорастания семян в контроле убывает в следующем порядке: ревертант r-en:chlorina-7, инбредная линия 3629, пластомный хлорофильный мутант en:chlorina-7. Параметры H2O2люминол-индуцированной хемилюминесценции имеют обратно
пропорциональный характер. Наивысший показатель максимальной
интенсивности быстрой вспышки (Imax) зафиксирован в проростках
пластомного хлорофильного мутанта en:chlorina-7 (10,867×104), более
низкие значения максимальной интенсивности быстрой вспышки выявлены у ревертанта r-en:chlorina-7 (9,79×104) и инбредной линии 3629
(9,17×104). По величине светосуммы хемилюминесценции пластомный
хлорофильный мутант en:chlorina-7 (10325,5×104) значительно отличается от двух других форм (r-en:chlorina-7 – 7633,4×104, линия 3629 –
7560,5×104) (табл. 2.17).
120
121
34**
79 ++
57 +
25**
72++
54++
0,6 ± 0,15**
2,6 ± 0,19* ++
2,5 ± 0,07* ++
0,94± 0,29**
1,4 ± 0,09** ++
1,5 ± 0,09** +
CuSO4 (50 мкM)
CuSO4 + аллантоин (10–3 М)
CuSO4 + урат (10–3 М)
CdSO4 (50 мкM)
CdSO4 + аллантоин (10–3М)
CdSO4 + урат (10–3 М)
86
77
92+
80
2,1 ± 0,16
1,1 ± 0,22**
1,8 ± 0,34 ++
1,6 ± 0,05* ++
Контроль
CuSO4 (50 мкM)
CuSO4 + аллантоин (10–3 М)
CuSO4 + урат (10–3 М)
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
12,43×10 ± 0,10 ×10 ** +
11,35×10 ± 0,24 ×10 ** ++
4
12,75×10 ± 0,075 ×10 **
4
10,867×10 ± 0,07 ×10
5,44×10 ± 0,08 ×10 ** +
6,15×10 ± 0,55 ×10 ** ++
4
5,13×10 ± 0,29 ×10 **
4
6,78×10 ± 0,15 ×10 ** ++
8,72×10 ± 0,21 ×10 ** ++
4
5,57×10 ± 0,61 ×10 **
4
9,17 ×10 ± 0,03 ×10
Максимальная быстрая
вспышка, у.е.
en:chlorina-7
69
линия 3629
Всхожесть, %
3,5 ± 0,41
Длина корешков, см
Контроль
Вариант
4
4
4
10217,8×10 ± 397 ×10
4
4
++
11080,0×10 ± 451 ×10 **
4
4
11145,7×10 ± 131 ×10 **
4
4
10325,5×10 ± 199 ×10
4
4
4599,9×10 ± 171 ×10 ** ++
4
4
5371,3×10 ± 319 ×10 ** ++
4
4
++
4113,6×10 ± 645 ×10 **
4
4
5420,9×10 ± 512×10 ** ++
4
4
7515,9×10 ± 334 ×10
4
4
4338,7×10 ± 329 ×10 **
4
7560,5×10 ± 126 ×10
Светосумма, у.е.
Таблица 2.17
Влияние аллантоина и урата на скорость роста,
всхожесть и интенсивность H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции в тест-системе
корешков подсолнечника при индуцированном сульфатом меди и кадмия окислительном стрессе
122
69
93
83
58*
85 +
80 +
75
69
1,4 ± 0,23**
1,4 ± 0,09**
3,7 ± 0,12
1,2 ± 0,22**
2,1 ± 0,03** ++
1,5 ± 0,08**
1,4 ± 0,72**
2,3 ± 0,10** ++
2,1± 0,10** ++
CdSO4 + аллантоин (10–3М)
CdSO4 + урат (10–3 М)
Контроль
CuSO4 (50 мкM)
CuSO4 + урат (10–3 М)
CdSO4 (50 мкM)
CdSO4 + аллантоин (10–3М)
CdSO4 + урат (10–3 М)
88
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
9359,7×10 ± 622 ×10 ** ++
4
4
11,88×10 ± 0,39 ×10 ** ++
4
4
4
9250,3×10 ± 701 ×10 ** ++
4
4
12861,0×10 ± 544 ×10 **
4
4
9258,6×10 ± 101 ×10 ** ++
4
4
6717,1×10 ± 646 × 10 ** ++
4
4
9746,3×10 ± 413 × 10 **
4
4
7633,4×10 ± 146 ×10
4
4
11438,7×10 ± 490 ×10 ** ++
4
4
4
4
4
9778,9×10 ± 514 ×10 ** ++
4
15328,9×10 ± 731 ×10 **
11,25×10 ± 0,28 ×10 ** ++
13,92×10 ± 0,33 ×10 **
4
11,14×10 ± 0,24 ×10 ** ++
8,60×10 ± 0,71 ×10 ** ++
4
11,47×10 ± 0,14 ×10 **
4
4
9,79×10 ± 0,05 ×10
14,61×10 ± 0,22 ×10 ** ++
12,48×10 ± 0,69 ×10 ** ++
4
16,03×10 ± 0,91 ×10 **
Светосумма, у.е.
Примечание: знаком * обозначены статистически достоверные отличия по сравнению с контролем; знаком + – по сравнению
с сульфатом металла; * и + – при P < 0,05; ** и ++ P < 0,001.
CuSO4 + аллантоин (10–3 М)
72
1,2 ± 0,16**
CdSO4 (50 мкM)
Максимальная быстрая
вспышка, у.е.
r-en:chlorina-7
Всхожесть, %
Длина корешков, см
Вариант
Окончание табл. 2.17
Сульфат меди на 15 % меньше подавляет скорость прорастания семян ревертанта r-en:chlorina-7 по сравнению с линией 3629. Так, если
у линии 3629 после воздействия меди скорость прорастания семян составляет 16 % по сравнению с контролем, то у r-en:chlorina-7 – 32 % относительно соответствующего контроля. Однако степень защиты проростков аллантоином и уратом, от действия ионов меди на скорость
прорастания, проявляется у ревертанта в меньшей степени. Так, если
у линии 3629 восстановление скорости прорастания семян происходит
до 72 % по сравнению с контролем, то у r-en:chlorina-7 только до 55 %,
относительно контроля (см. табл. 2.17).
При исследовании показателей интенсивности H2O2-люминолиндуцированной хемилюминесценции семян подсолнечника выявлены следующие закономерности. В корешках ревертанта r-en:chlorina-7
отмечены более высокие значения максимальной интенсивности быстрой вспышки (Imax) и светосуммы хемилюминесценции по сравнению
с инбредной линией 3629 (см. табл. 2.17), что коррелирует со скоростью
корневого роста. Основные различия интенсивности H2O2-люминолиндуцированной хемилюминесценции между r-en:chlorina-7 и 3629
наблюдаются при действии сульфата меди. Так, в результате действия
меди на проростки подсолнечника линии 3629 происходит значительное снижение значений максимальной интенсивности быстрой
вспышки и светосуммы хемилюминесценции. При воздействии меди
на ревертант r-en:chlorina-7 эти показатели повышаются. Исследуемые
азотистые катаболиты приближают к контрольным значениям параметры хемилюминесценции, изменение которых произошло вследствие
действия тяжелых металлов.
Хлорофильный мутант en:chlorina-7 характеризуется наименьшей
скоростью корневого роста по сравнению с линией 3629 и ревертантом r-en:chlorina-7, что хорошо согласуется с показателями габитуса
для этих форм, описанными ранее (см. главу 1). Подавление скорости
прорастания семян en:chlorina-7 относительно контроля под воздействие сульфата меди происходит всего на 52 %. По показателям интенсивности H2O2-люминол-индуцированной хемилюминесценции хлорофильный мутант en:chlorina-7 проявил наивысшие значения среди
трех форм подсолнечника, исследуемых в данной генетической модели
(см. табл. 2.17). Урат в меньшей степени, чем аллантоин, снижает показатели интенсивности H2O2-люминол-индуцированной хемилю123
минесценции, вызванной действием меди на хлорофильный мутант
en:chlorina-7, что кореллирует с данными по скорости корневого роста.
В тоже время en:chlorina-7 оказался наименее чувствительным к протекторным свойствам аллантоина и мочевой кислоты (см. табл. 2.17).
Наибольший протекторный эффект аллантоин и урат оказали на линию 3629 (см. табл. 2.17), повысив скорость корневого роста под действием кадмия более чем на 30 %. Подобные факты указывают на то,
что устойчивость к стрессовым воздействиям может зависеть от способности организма контролировать интенсивность свободно-радикальных реакций и процессов перекисного окисления липидов.
Таким образом, растения инбредной линии 3629, пластомного мутанта en:chlorina-7 и зеленого ревертанта r-en:chlorina-7 подсолнечника
Helianthus annuus L. неодинаково восприимчивы как к воздействию тяжелых металлов, так и к протекторам – аллантоину и урату. При воздействии как Cu2+, так и Cd2+ наибольшую устойчивость продемонстрировал внеядерный мутант en:chlorina-7, а наименьшую – инбредная
линия 3629.
Эффект воздействия тяжелых металлов на растения неоднозначен
и зависит как от дозы воздействия, так и от объекта. Воздействие таких экологических токсикантов на растения как тяжелые металлы может приводить к значительным изменениям метаболизма – изменяются количественный и качественный состав синтезируемых белков,
активируются процессы перекисного окисления липидов, что может
приводить к деструкции генетического аппарата (Гуськов и др. 1989).
В клетках могут так же активироваться протеолитические ферменты, нуклеазы и неспецифические метаболиты. Уровень контролируемых реакций клеточного метаболизма – один из основных факторов,
определяющих наличие или отсутствие адаптивного ответа. Очевидно,
что реакции организма на стрессорные воздействия определяются
его генотипом. Важная роль в определении толерантности принадлежит внеядерной наследственной системе (Машкина и др. 2001).
Особенности структуры и функционирования хлоропластов могут существенно влиять на сохранения или нарушения равновесия в системе
прооксиданты-антиоксиданты.
Таким образом, внеядерные мутанты подсолнечника явились эффективной моделью для исследования генетических аспектов резистентности к экстремальным факторам. Показано, что мутации в ДНК
124
хлоропластов приводят к увеличению устойчивости прорастающих
семян подсолнечника Helianthus annuus L. к действию окислительного стресса, повышенной температуры, засоления, тяжелых металлов.
Возможно, что мутации в хлоропластной ДНК повышают гетерогенность генетической системы клетки, что служит основой для увеличения адаптивных возможностей за счет отбора ДНК-содержащих
цитоплазматических органелл, способных не только эффективно
функционировать при отклонении условий, но и обеспечивать жизнедеятельность всей сложной системы растительной клетки в целом.
В данном аспекте способность пластид и митохондрий контролировать окислительно-восстановительный гомеостаз является одной
из определяющих характеристик в формировании резистентности
растений к действию экстремальных факторов среды. Можно предположить, что растительный организм будет одинаково устойчив или не
устойчив ко всем факторам, изменяющим, прежде всего, окислительно-восстановительный баланс в растительной клетке.
Приведенный выше материал свидетельствует, что внеядерные мутации, модулируя устойчивость растений к экстремальным воздействиям среды, представляют определенный интерес для селекции.
Литература
Белецкий Ю.Д. Искусственные мутации хлоропластов у высших растений. Ростов н/Д: Изд-во Рост. гос. ун-та, 1989. 80 с.
Белецкий Ю.Д., Шевякова Н.И., Карнаухова Т.Б. Пластиды и адаптауия ра стений к засолению. Ростов н/Д: Изд-во Рост. гос. ун-та, 1990. 48 с.
Гуськов Е.П. Цитогенетический эффект повышенного давления кислорода на клетках корешков лука // Генетика. 1975. Т. 9. № 5.
С. 147–149.
Гуськов Е.П., Дворкина Р.М., Беличенко Н.И. Модификация цитогенетического действия гипербароксигенации С-фенил-N-третбутилнитроном
// Цитология и генетика. 1986. Т. 20. № 4. С. 257–261.
Гуськов Е.П., Дворкина Р.М., Беличенко Н.И. Эндогенные механизмы
защиты клеток меристемы растений от генотоксичности гипербароксигенации // Цитология и генетика. 1989. Т. 24. № 3. С. 20–24.
Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл. Мн.:
«Тэхналогiя», 2003. 494 с.
125
Кузнецов В.В., Хыдыров Б.Т., Рощупкин Б.В., Борисова Н.Н. Общие
системы устойчивости хлопчатника к засолению и высокой температуре: факты и гипотезы // Физиология растений. 1990. Т. 37. Вып. 5.
С. 987–996.
Курганова Л.Н., Веселов А.П., Синицына Ю.В., Еликова Е.А. Продукты
перекисного окисления липидов как возможные посредники между
воздействием повышенной температуры и развитием стресс-реакции
у растений // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 2. С. 218–222.
Лысенко В.С. Биохимические особенности формирования хлоридно-натриевой солеустойчивости у подсолнечника: Автореф. дис. …
канд. биол. наук. Ростов н/Д, 1993. 24 с.
Машкина Е.В., Маркин Н.В., Усатов А.В., Гуськов Е.П. Реакция мутантных линий подсолнечника на тепловой шок // Физиология растений. 2001. Т. 48. № 6. С. 788–792.
Строгонов Б.П. Физиологические основы солеустойчивости растений при разнокачественном засолении. М.: Наука, 1962. 366 с.
Федоренко Г.М., Белецкий Ю.Д., Щербакова Л.Б. Влияние водного
дефицита на ультраструктуру пластид пластомного мутанта подсолнечника типа chlorina // Цитология и генетика. 1988. Т. 22. № 3. С. 53–57.
Шевякова Н.И. Солеустойчивость пластомных хлорофильных мутантов подсолнечника // Физиология растений. 1982. № 2. С. 317–324.
Alves A.A., Setter T.L. Response of cassava leaf area expansion to water
deficit: cell proliferation, cell expansion and delayed development // Ann.
Bot. 2004. Vol. 94(4). P. 605–613.
Atak C., Alikamanoglu S., Acik L., Canbolat Y. Induced of Plastid Mutations
in Soybean Plant (Glycine max L., Merrill) with Gamma Radiation and
Determination with RAPD // Mutat. Res. 2004. Vol. 556. № 1–2. P. 35–44.
Blokhina O., Virolainen E., Fagerstedt K. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review // Ann. Bot. (Lond). 2003. Spec.
No. P. 179–194.
Burke J.J. Identification of genetic diversity and mutations in higher plant
acquired thermotolerance // Physiol. Plantarum. 2001. Vol. 112. P. 167–170.
Burke J., O,Mahony P., Oliver M. Isolation of Arabidopsis mutants lacking components of acquired termotolerancel // Plant Physiol. 2000. Vol. 123.
P. 575–588.
Conger A., Fairchald L. Breakage of chromosomes by oxygen // Records
Genet. Soc. Am. 1951. Vol. 21. P. 19.
126
Coster L., Dorey S., Fritig B., Kauffmann S. A pharmacological approach
to test the diffusible signal activity of reactive oxygen intermediates in elicitortreated tobacco leaves // Plant Cell Physiol. 2002. Vol. 43. P. 91–98.
Dat J., Lopez-Delgado H., Foyer C., Scott I. Parallel changes in H2O2 and
catalase during thermotolerance induced by salicylic acid or heat acclimation
in mustard seedlings // Plant Physiol. 1998. Vol. 116. P. 1351–1357.
Dutilleul C., Garmier M., Noctor G. et al. Leaf Mitochondria Modulate
Whole Cell Redox Homeostasis, Set Antioxidant Capacity, and Determine
Stress Resistance through Altered Signaling and Diurnal Regulation // Plant
Cell. 2003. Vol. 15. P. 1212–1226.
Erenberg L., Gustafsson A., Lunqvist U. Chemically induced mutation and
sterility in barley // Acta Chem. Scand. 1958. Vol. 10. P. 492.
Fender S.E., O`Connell M.A. Expression of the heat shock response in a
tomato interspecific hybrid is not intermediate between the two parental responses // Plant Physiol. 1990. Vol. 93. P. 1140–1146.
Fukushima E., Arata Y., Endo T. et al. Improved salt tolerance of transgenic tobacco expressing apoplastic yeast-derived invertase // Plant Cell. Physiol.
2001. Vol. 42(2). P. 245–249.
Gimener-Abian M., Rozalen A., Carballo J. et al. HSP90 and CheckpointDependent Lengthening of the G2 Phase Observed in Plant Cells under
Hypoxia and Cold // Protoplasma. 2004. Vol. 223. № 2–4. P. 191–196.
Hancock J., Desikan R., Neill S. Role of reactive oxygen species in cell
signaling pathways // Biochem. Soc. Trans. 2001. Vol. 29. P. 345–350.
Gutteridge J.M., Halliwell B. Reoxygenation Injury and Antioxidant
Protection: A Tale of Two Paradoxes // Arch. Biochem. Biophys. 1990.
Vol. 283. № 2. P. 223-226.
Joshi C.P., Kluveva N.Y., Morrow K.J., Nguyen H.T. Expression of a unique
plastid localized heat shock protein is genetically linked to acquired thermotolerance in wheat // Theor. Appl. Genet. 1997. Vol. 95. P. 834–841.
Khanna-Chopra R., Sabarinath S. Heat-Stable Chloroplastic Cu/Zn
Superoxide Dismutase in Chenopodium murale // Bioch. Biophys. Res.
Comm. 2004. Vol. 320. № 4. P. 1187–1192.
Knight C., Ackerly D. Correlated evolution of chloroplast heat shock protein
expression in closely related plant species // Amer. J. Bot. 2001. Vol. 88 (3).
P. 411–418.
Kumar G., Krishnaprasad B., Savitha M. et al. Enhanced expression of heat
shock proteins in termotolerant lines of sunflower and their progenies selected on the basis of temperature induction response // Theor. Appl. Genetics.
1999. Vol. 99. P. 359–367.
127
Laxalt A.M., Munnik T. Phospholipid signalling in plant defence // Curr.
Opin. Plant. Biol. 2002. Vol. 5(4). P. 332–388.
Lepoivre M., Raddassi K., Oswald I. et al. Antiproliferative effects of NO
synthase products // Res. Immunol. 1991. Vol. 142. P. 580–583.
Leprince O., Deltour R., Thorpe P. et al. The role of free radicals and radical
processing systems in loss of desiccation tolerance in germinating maize (Zea
mays L.) // New Phytologist. 1990. Vol. 116. P. 573–580.
Loggini B., Scartazza A., Brugnoli E., Navari-Izzo F. Antioxidative defense
system, pigment composition, and photosynthetic efficiency in two wheat
cultivars subjected to drought // Plant Physiol. 1999. Vol. 119. P. 1091–1100.
Mittler R. Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance // Trends
Plant Sci. 2002. Vol. 9. P. 405–410.
Munnik T., Irvine R.F., Musgrave A. Phospholipid signalling in plants //
Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 389. P. 222–272.
Neill S., Desikan R., Hancock J. Hydrogen peroxide signaling // Curr.
Opin. Plant Biol. 2002. Vol. 5. P. 388–395.
Noctor G., Dutilleul C., De Paepe R., Foyer C. Use of Mitochondrial Electron
Transport Mutants to Evaluate the Effects of Redox State on Photosynthesis,
Stress Tolerance and the Integration of Carbon/Nitrogen Metabolism //
Journal of Experimental Botany. 2004. Vol. 55. № 394. P. 49–57.
Parida A.K., Das A.B. Salt tolerance and salinity effects on plants: a review
// Ecotoxicol Environ Saf. 2005. Vol. 60(3). P. 324–349.
Stohs S.J., Bagchi D. Oxidative mechanisms in the toxicity of metal ions //
Free Radic. Biol. Med. 1995. Vol. 2. № 18 (2). P. 321–336.
Triboush S., Danilenko N., Ulitcheva I., Davydenko O. Location of Induced
Mutations and Reversions in the Chloroplast Genome of Helianthus annuus L. // Plant Growth Regulation. 1999. Vol. 27. Р. 75–81.
Tsang E.W., Bowler C., Hérouart D. et al. Differential regulation of superoxide dismutases in plants exposed to environmental stress // Plant Cell.
1991. Vol. 3. P. 783–792.
Tsuganea K., Kobayashia K., Niwaa Y., Ohbab Y. A recessive Arabidopsis
mutant that grows photoautotrophically under salt stress shouws enhanced
active oxygen detoxification // Plant Cell. 1999. Vol. 11. P. 1195–1206.
Yeh L., Park Y., Hansalia R. et al. Shear-induced tyrosine phosphorylation in endothelial cells requires Rac1-dependent production of ROS //
Am. J. Physiol. 1999. Vol. 276. P. 838–847.
Woo H., Kim J., Hong Gil Nam, Pyung Ok Lim. The Delayed Leaf Senescence
Mutants of Arabidopsis, ore1, ore3 and ore9 are Tolerant to Oxidative Stress
// Plant and Cell Physiol. 2004. Vol. 45. P. 923–932.
128
Глава 3. ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКАЯ
МУЖСКАЯ СТЕРИЛЬНОСТЬ ПОДСОЛНЕЧНИКА (ЦМС)
КАК РЕЗУЛЬТАТ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
ЯДЕРНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ
Основным направлением современной селекции подсолнечника
является получение гетерозисных гибридов. По сравнению с сортамипопуляциями они имеют ряд преимуществ. Во-первых, гетерозисный
эффект гибридов при соблюдении всех правил агротехники дает существенную прибавку семенной продукции. Растения F1 достаточно
выровнены по всем признакам, в том числе по длине вегетационного
периода и высоте. Это уменьшает вероятность заражения болезнями
в период цветения и сокращает потери при уборке урожая. Гибриды,
как правило, автофертильны, что важно для завязывания семян в условиях дефицита насекомых-опылителей. Использование гибридов
позволяет гарантировать защиту прав селекционера и экономически
выгодно селекционным фирмам, так как вынуждает производителей
товарного подсолнечника закупать семена ежегодно (Гаврилова, 2003).
Для получения гетерозисных гибридов используют материнские формы
с цитоплазматической мужской стерильностью и отцовские, содержащие
гены восстановления фертильности пыльцы (Rf-гены). Следовательно,
ЦМС – это феномен ядерно-плазматического взаимодействия, в котором
участвуют гены органелл (митохондрий) и ядра (Rf-гены).
Пыльники мужских стерильных растений подсолнечника обычно
достигают только половины длины фертильных форм и не выступают
из венчика (Leclercq, 1969), пыльцы они лишены. У некоторых линий
пыльники нормальных размеров, однако пыльца в них также отсутствует. При этом женский гаметофит мужских стерильных растений
фертилен (Sunflower technology and production, 1997).
Впервые ЦМС у подсолнечника (обозначенная как PET1) была открыта П. Леклерком (Leclercq, 1969) у межвидового гибрида H. petiolaris Nutt с культурным подсолнечником. К настоящему времени этот
тип ЦМС довольно хорошо изучен. Митохондриальная ДНК, контролирующая ЦМС у потомков при скрещивании с H. annuus, отличается
от мтДНК фертильного H. annuus наличием инверсии размером 11 т.п.н.
и вставки 5 т.п.н., несущей ген orfH522 с 3’-конца гена atpА, кодирующего α-субъединицу митохондриальной F1-АТФ синтазы (рис. 3.1).
129
Рис. 3.1. Структура ЦМС-локуса у подсолнечника
(Даниленко, Давыденко, 2003):
F – фертильная линия; S – стерильная линия; реорганизованная область
фланкирована инвертированными повторами (черные треугольники)
размером 261 н. Стрелки указывают направление транскрипции.
Ген orfH522 состоит из 57 п.н. гена orfВ (orfH873) и другой неизвестной части. Область реорганизации ограничена инвертированными повторами размером 261 п.н. (Siculella, Palmer, 1988; Kohler et al., 1991;
Laver et al., 1991; Budar, Pelletier, 2001). Интересно, что ген orfH522 и вся
5 т.п.н. инсерция включают фрагменты не только митохондриальных,
но и ядерных ДНК, а также фрагменты неизвестного происхождения
(Даниленко, Давыденко, 2003).
Новая orf котранскрибируется с геном atpA как полицистронная
мРНК. Использование специфических антител к продукту гена orfH522
показало, что orfH522 кодирует белок размером 16 кДа (Moneger et al.,
1994; Horn et al., 1996), представляющий единственное различие между
продуктами транскрипции органелл фертильных и ЦМС-линий (Horn
et al., 1991). Белок размером 16 кДа синтезируется во всех тканях растения. Он встраивается в митохондриальные мембраны и, как предполагают, нарушает цепь транспорта электронов (Horn et al., 1996;
Эльконин, Тырнов, 2000).
При формировании пыльцы растению необходимы большие энергетические затраты. Видимо, именно этим объясняется многократное
130
увеличение числа митохондрий на клетку в тапетальной ткани и материнских клетках пыльцы при развитии пыльников. В этих же тканях
происходит накопление альтернативной оксидазы, кодируемой ядром
(Lee, Warmke, 1979; Smart et al., 1994; Fujii, Toriyama, 2008). Развитие
ЦМС-фенотипа сопровождается специфичным повышением в генеративных тканях экспрессии ЦМС-ассоциированных локусов, кодирующих компоненты системы окислительного фосфорилирования,
понижением потребления кислорода, синтеза АТФ и активности альтернативной оксидазы (Иванов, Дымшиц, 2007). При развитии данного типа ЦМС у подсолнечника клетки тапетума подвергаются преждевременному апоптозу, который затем распространяется и на другие
ткани пыльника. Это связано с высвобождением из митохондрий цитохрома «с», который активирует протеолитический ферментный каскад, что приводит к деградации ядерной ДНК и гибели клеток.
Иммуноцитохимическим анализом обнаружено, что снижение содержания цитохрома «с» в митохондриях предшествует нарушению
целостности наружной митохондриальной мембраны и дыхательной
функции. Как и на многих других стадиях развития мужских и женских
половых клеток у растений, апотоз протекает в тапетальных тканях
и при нормальном развитии пыльников (как результат истощения питающих клеток повышенными энергетическими затратами при развитии микроспор). Вероятно, ранний апоптоз в тапетуме ЦМС растений
вызван более быстрым наступлением дисбаланса между энергетическими потребностями спорообразующей ткани и пониженным, в результате экспрессии митохондриальных ЦМС-индуцирующих факторов, энергетическим уровнем питающих клеток (Balk, Leaver, 2001;
Horn, 2006; Иванов, Дымшиц, 2007). Активация апоптоза может быть
вызвана уменьшением количества АТФ в клетках, так как локус orfH522
кодирует белок, предположительно связывающийся с субъединицей
8 АФТ-синтазы, а АТФ-синтазный комплекс у стерильных форм функционирует менее эффективно, чем у фертильных (Sabar et. al., 2003;
Chase, 2006; Carlsson et al., 2008).
Для идентификации ЦМС Э. Серьи (Serieys, 1996) предложил
присваивать им специальные коды. ЦМС Леклерка была обозначена
как РЕТ1. Всего на сегодняшний день идентифицировано около 70
различных источников ЦМС. Большинство из них получено в результате скрещивания дикорастущего подсолнечника (преимущественно
131
однолетних видов) с культурными формами (Serieys, 2002), но некоторые возникли в результате индуцированных или спонтанных мутаций
внутри вида H. annuus (Christov, 1999, 2003).
Классическим методом дифференциации источников ЦМС является восстановление мужской фертильности у различных инбредных линий, скрещенных с предполагаемыми новыми источниками
ЦМС (Leclercq, 1983, 1984). Следовательно, восстановители фертильности пыльцы и служат тестерами на определенный тип цитоплазмы
(Попов, Кириченко, 2007). Другим методом дифференциации источников ЦМС является изучение цитоплазматических геномов. Структура
митохондриальной ДНК некоторых источников ЦМС подсолнечника
изучена. Пять из шести линий, описанных М.М. Спассовой с соавторами (Spassova et al., 1992), продемонстрировали идентичность рестрикционных сайтов митохондриальной ДНК с ЦМС РЕТ1. В то же время
только 3 из 15 ЦМС-линий, исследованных Д. Крузилла с соавторами
(Crouzillat et al., 1991), имели сходную структуру atpA локуса с ЦМС
РЕТ1. Однако даже эти три линии отличались от ЦМС РЕТ1 по другим
локусам митохондриальной ДНК. Последние работы по изучению митохондриального генома различных источников ЦМС подсолнечника
демонстрируют сходство многих из них (Horn, Friedt, 1999; Canal et al.,
2001; Horn, 2002; Horn et al., 2002; Ardila et al., 2010). Изучение различных областей митохондриального генома (девяти митохондриальных
генов atp6, atp9, cob, cox1, cox2, cox3, 18S, 5S, nd5 и трех открытых рамок
считывания – orfH522, orfH708, orfH873) с помощью блот-гибридизации
позволило выделить 10 основных митохондриальных типов. В каждый
выделенный тип включены от 2 до 4 ЦМС-источников. При этом некоторые источники ЦМС не вошли ни в одну из представленных групп,
показав уникальные гибридизационные сигналы по определенным
митохондриальным генам. Эти результаты указывают на уникальность строения некоторых цитоплазмонов подсолнечника и сложность
их организации (Попов, Кириченко, 2007).
3.1. Сравнительная характеристика линий
с различными типами ЦМС
Генетический полиморфизм цитоплазмонов в роде Helianthus открывает множество направлений в изучении особенностей формирования и выраженности хозяйственно ценных признаков. Включение
132
различных митотипов в селекционный процесс с целью создания коммерческих материнских линий, а на их основе гетерозисных гибридов
подсолнечника, стимулирует исследование вызывающих ими эффектов
на проявление агрономических признаков. Например, при сравнительном анализе классического митотипа PET1 с PET4 и ARG3 обнаружено,
что продуктивность растений выше у форм с PET1, чем у образцов, созданных на основе двух других митотипов. У растений с ЦМС типа ANN1,
ANN2, PET2 и PEF1 больше высота растений; с ЦМС типа ANL2, ANN1,
ANN4, ANO1, BOL1, MAX1 и PEF1 начало цветения сдвинуто на более поздние сроки, а некоторые цитоплазмоны (ANL2, PET2 и PEF1)
снижают масличность семян и т.д. (Baldini et al., 1991; Marinkovic et al.,
2000; Patil et al., 2003; Tavoljanskiy et al., 2004; Гаврилова, Рожкова, 2005).
Все эти факты необходимо учитывать в гетерозисной селекции подсолнечника, особенно при создании исходного материала для межвидовой
гибридизации (Попов, Кириченко, 2007).
На Кубанской опытной станции ВНИИР им. Н.И. Вавилова методом многократного беккроссирования были созданы линии-аналоги
подсолнечника со сходными ядерными геномами и различными типами цитоплазмонов. Линии ВИР 116 и ВИР 471 представлены двумя аналогами: фертильным и стерильным на основе ЦМС типа РЕТ1.
Линии ВИР 109 и ВИР 151 – тремя аналогами: двумя – с различными типами ЦМС РЕТ1 и RIG0 (на основе цитоплазмы подсолнечника
H. rigidus) и одним фертильным. Внешний вид растений однолетних
видов подсолнечника H. annuus и H. petiolaris, а также многолетнего
H. rigidus приведен на рисунках 3.2 – 3.4.
Результаты амплификации с праймером, маркирующим митохондриальный ген orfH522 (Schnabel et al., 2008), контролирующий развитие ЦМС типа РЕТ1 (рис. 3.5), подтвердили наличие трех типов
цитоплазмонов у аналогов линий ВИР 109 и ВИР 151 и двух у линий
ВИР 116 и ВИР 471.
Амплификация ДНК линий ВИР 109 и ВИР 151 с восемью SSRмаркерами ядерной ДНК не выявила различий в структуре ДНК между
их фертильным и ЦМС типа РЕТ1 и RIG0 аналогами (рис. 3.6).
На данной модели мы исследовали влияние различных типов цитоплазмонов на формирование морфофизиологических признаков растений. Измерения проводили по стандартной методике (Анащенко,
1976; Усатов и др., 2010а). Достоверность результатов определяли
по t-критерию Стьюдента (Гланц, 1999).
133
Рис. 3.2. Однолетний вид Helianthus annuus L.
134
Рис. 3.3. Однолетний вид H. petiolaris Nutt.
135
Рис. 3.4. Многолетний вид H. rigdus Desf.
136
Рис. 3.5. Амплификация ДНК ЦМС-линий и их фертильных аналогов
с маркером гена orfH522:
1–3 – ВИР 109 ферт.; 4–6 – ВИР 109 РЕТ1; 7–9 – ВИР 109 RIG0;
10–12 – ВИР 116 ферт.; 13–18 – ВИР 116 РЕТ1; 19–21 – ВИР 151 ферт.;
22–24 – ВИР 151 РЕТ1; 25–27 – ВИР 151 RIG0; 28–30 – ВИР 471 ферт.;
31–36 – ВИР 471 РЕТ1; М – маркер молекулярной массы
По результатам 3-летних измерений высоты растений и согласно среднему за три года показателю линии ВИР 109 и ВИР 151 можно отнести к средненизким, а ВИР 116 и ВИР 471 – к низкорослым
(Descriptiors for cultivated and wild sunflower, 1985). Наименьшая высота
растений у всех исследованных линий была отмечена в 2007 г., а наибольшая – в 2008 г. (табл. 3.1). Это вызвано жаркой и сухой погодой
в середине лета 2007 г., и обильными осадками, выпавшими в тот же период 2008 г.
137
138
Праймеры:
1–6 – ORS 6; 7–12 – ORS 509; 13–18 – Ha 432; 19–24 – На 514; 25–30 – На 1442;
31–36 – На 1608; 37–42 – IUB 4; 43–48 – IUB 6
Линии:
1, 7, 13, 19, 25, 31, 37, 43 – ВИР 109 Б;
2, 8, 14, 20, 26, 32, 38, 44 – ВИР 109 А РЕТ1;
3, 9, 15, 21, 27, 33, 39, 45 – ВИР 109 А RIG0;
4, 10, 16, 22, 28, 34, 40, 46 – ВИР 151 Б;
5, 11, 17, 23, 29, 35, 41, 47 – ВИР 151 А РЕТ1;
6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 – ВИР 151 RIG0
Рис. 3.6. Результат амплификации ДНК ЦМС-линий ВИР 109 и ВИР 151 и их фертильных аналогов
с SSR-праймерами ядерной ДНК
Таблица 3.1
Высота растений ЦМС-линий и их фертильных аналогов
(КОС ВИР, 2007–2009 гг.), см
Год
Линия
ВИР 109
ВИР 151
ВИР 116
ВИР 471
Аналог
2007
А PET1
А RIG0
Б
А PET1
А RIG0
Б
А PET1
Б
А PET1
Б
Х±m
V, %
115,5±1,9 5,4
118,6±2,4 6,3
119,4±2,0 4,9
117,6±3,0 8,1
120,6±2,5 5,9
119,5±2,5 6,9
101,6±1,4 4,1
98,0±2,5 7,9
106,6±2,5 7,3
104,2±3,3 10,0
2008
Х±m
144,4±2,0
150,7±3,8
147,9±1,7
138,9±2,2
144,1±1,8
140,0±3,6
123,6±1,9
127,5±1,2
138,6±2,3
124,4±1,7
среднее
значение
2007–2009
V, %
Х±m
V, %
Х±m
6,6 136,4±1,9 3,1 132,1±1,1
7,9 139,1±1,9 5,1 136,1±1,6
2,4 140,8±1,5 6,0 136,0±1,0*
5,0 136,0±1,7 7,8 130,8±1,4
2,8 130,2±2,0 11,9 131,6±1,6
5,0 134,9±1,4 1,6 131,5±1,5
5,2 121,4±1,0 4,0 115,5±0,9
3,1 113,4±1,3* 5,6 113,0±1,0
6,1 122,7±0,8 4,6 122,6±1,2
4,3 113,1±1,6* 6,9 113,9±1,3*
2009
Примечание: А – стерильная форма; Б – фертильная форма; * – достоверные отличия при Р < 0,05 по сравнению с аналогом РЕТ1.
Достоверные различия по высоте растений между линиями аналогами с разными типами цитоплазмонов наблюдали только в 2009 г.
Фертильные аналоги линий ВИР 116 и ВИР 471 уступали по данному
показателю стерильным. Превосходство стерильной формы ВИР 471
над фертильным аналогом подтверждается и при рассмотрении среднего показателя за три года изучения. В то же время стерильная ВИР 109
с ЦМС типа РЕТ1 согласно трехгодичной средней уступает по высоте
растений фертильному аналогу.
Стерильные аналоги размножают путем их опыления пыльцой соответствующего фертильного аналога (Б-форма), поэтому высота растений А-формы за счет сестринского гетерозиса, как правило, выше.
Среди исследованных нами линий сестринский гетерозис по высоте
растений за три года изучения четко прослеживается только у ВИР 471.
Изменчивость по данному признаку за три года изучения была незначительна (V < 10 %), за исключением линии ВИР 151 A RIG0, которая в 2009 г. продемонстрировала среднюю изменчивость (V = 11,9 %).
Наибольший диаметр корзинки был определен у аналогов линии
ВИР 109 (в разные годы в среднем от 15,7 до 20,0 см), наименьший –
139
ВИР 151 (12,9 – 15,3 см) и ВИР 471 (11,1 – 15,5 см). Размер корзинок
ВИР 116 достигал средних значений относительно других линий (12,9 –
18,3 см) (табл. 3.2). В 2008 г. все линии продемонстрировали наименьшие
показатели размера корзинки, а в 2009 – наибольшие. Это может быть
связано с недостатком увлажнения в августе 2008 г., в период созревания
семян. В августе 2009 г., напротив, уровень осадков был близким к норме.
Таблица 3.2
Диаметр корзинки ЦМС линий и их фертильных аналогов
(КОС ВИР, 2007–2009 гг.), см
Год
Линия
ВИР 109
ВИР 151
ВИР 116
ВИР 471
Аналог
А PET1
А RIG0
Б
А PET1
А RIG0
Б
А PET1
Б
А PET1
Б
2007
Х±m
18,7±0,6
18,5±1,5
18,9±0,8
12,9±0,4
13,6±0,6
14,6±0,2*
15,3±0,6
16,6±0,4
13,2±0,5
14,4±0,8
2008
V, %
10,2
25,4
12,7
7,8
11,8
4,1
4,6
7,8
10,6
17,4
Х±m
17,8±0,6
15,7±0,6
16,0±0,7
11,8±0,4
14,4±0,4*
13,0±0,5
12,9 ±0,5
16,3±1,3*
11,3±0,4
11,1±0,5
2009
V, %
9,6
11,5
13,1
9,3
8,3
12,3
19,4
25,2
18,6
13,5
Х±m
18,4±0,5
20,0±0,6
19,6±0,5
15,2±0,3
15,0±0,2
15,3±0,4
17,6±0,3
18,3±0,4
15,5±0,3
13,9±0,5*
V, %
7,6
23,0
2,0
23,0
4,7
32,0
14,2
9,8
9,0
18,0
среднее
значение
2007–2009
Х±m
18,3±0,3
18,1±0,6
18,2±0,4
13,3±0,2
14,4±0,2*
14,3±0,2*
15,3±0,3
17,1±0,5*
13,3±0,2
13,1±0,4
Примечание: А – стерильная форма; Б – фертильная форма; * – достоверные отличия при Р < 0,05 по сравнению с РЕТ1-аналогом.
Достоверных различий по признаку диаметр корзинки за 3 года изучения не отмечено только для аналогов линии ВИР 109. Размер корзинки у ЦМС-аналога РЕТ1 линии ВИР 151 был достоверно меньше,
чем у фертильной формы в 2007 г. и чем у ЦМС RIG0 в 2008 г. По среднему за три года показателю как фертильный, так и ЦМС RIG0 аналоги превосходили форму РЕТ1. Корзинка линии ВИР 116 Б оказалась
больше, чем у стерильного аналога в 2008 г. и в среднем за три года изучения. В 2009 г. различия по диаметру корзинки были обнаружены
только у аналогов линии ВИР 471: стерильный превышал фертильный.
У стерильного аналога линии ВИР 471 по размеру корзинки наблюдается стабильный сестринский гетерозис.
140
Коэффициент вариации признака диаметр корзинки в разные годы
у изучаемых линий был различным. Незначительную изменчивость
продемонстрировали в 2007 г. ЦМС РЕТ1 и фертильный аналоги линии
ВИР 151 и оба аналоги ВИР 116; в 2008 г. РЕТ1-аналоги линий ВИР 109
и ВИР 151, а также ВИР 151 A RIG0; в 2009 г. фертильный и РЕТ1
аналогии линии ВИР 109, а также линии ВИР 151 A RIG0, ВИР 116 Б
и ВИР 471 A РЕТ1. Довольно высокая изменчивость (V > 20 %) была
отмечена у линии ВИР 109 A RIG0 в 2007 и 2009 гг., а также у ВИР 116 Б
в 2007 г. и у РЕТ1 и фертильного аналогов линии ВИР 151 в 2009 году.
Изменчивость диаметра корзинки остальных линий за три года изучения была средней. Наиболее выровненными по данному признаку
в результате 3-летних наблюдений оказались линии ВИР 109 А РЕТ1
и ВИР 151 А RIG0, наименее – ВИР 109 А RIG0.
По количеству листьев на стебле изученные линии распределились
следующим образом: самой облиственной определена ВИР 109 – в разные годы у ее аналогов отмечали в среднем от 38,1 до 46,2 листа; далее следуют ВИР 151 (33,0 – 39,8 листьев), ВИР 471 (28,8 – 34,9 листьев) и ВИР 116 (25,5 – 32,2 листа). Наибольшее количество листьев
было отмечено у всех линий в 2007 году, наименьшее – в 2008 (у линии
ВИР 109 – в 2009) (табл. 3.3).
Достоверные различия по количеству листьев отмечали в течение
2-х лет изучения для аналогов линии ВИР 151. Так, в 2008 г. у стерильного аналога с РЕТ1-цитоплазмоном количество листьев по сравнению
с фертильной формой и RIG0-аналогом было меньше. В 2009 году взаимодействие генов ядра и цитоплазмы привело к уменьшению количества листьев у обоих стерильных аналогов ВИР 151 по сравнению с фертильной формой на 2 – 3 листа. По среднему 3-летнему показателю
ВИР 151 А РЕТ1 была достоверно менее облиственной, чем Б-форма.
В 2007 г. у RIG0-аналога линии ВИР 109 количество листьев было
меньше, чем у фертильной и ЦМС РЕТ1-форм, также стерильная РЕТ1форма ВИР 116 была менее облиственной, чем фертильная. В 2009 году
отмечено достоверное увеличение количества листьев у ЦМС РЕТ1формы линии ВИР 471 по сравнению с фертильным аналогом. Однако
согласно средним трехгодичным показателям достоверных различий
между аналогами линий ВИР 109, ВИР 116 и ВИР 471 по признаку количество листьев не выявлено.
141
Таблица 3.3
Количество листьев у ЦМС-линий и их фертильных аналогов
(КОС ВИР, 2007–2009 гг.), шт.
Год
Линия
ВИР 109
ВИР 151
ВИР 116
ВИР 471
Аналог
2007
А PET1
А RIG0
Б
А PET1
А RIG0
Б
А PET1
Б
А PET1
Б
Х±m
43,9±0,8
38,9±1,5*
46,2±1,1^
38,4±1,2
39,0±1,4
39,8±0,7
30,6±0,5
32,2±0,5*
33,0±0,6
34,9±0,7
2008
V, %
6,2
12,3
7,4
9,6
10,5
5,8
11,4
5,0
6,4
6,3
Х±m
40,2±0,6
41,0±0,7
39,7±0,8
33,0±0,8
35,8±0,7*
36,3±0,8*
25,5±0,3
25,5±1,0
28,8±0,5
29,2±0,6
среднее
значение
2007–2009
V, %
Х±m
V, %
Х±m
4,5
39,7±0,5
1,9 41,3±0,7
4,6
38,6±0,8
5,4 39,5±0,6
6,3
38,1±0,6
3,7 41,3±0,5
20,3 35,5±0,5
2,0 35,6±0,5
6,4
36,3±0,4
5,8 37,0±0,5
6,9 38,3±0,4*^ 11,0 38,1±0,4*
8,2
30,0±0,3
9,3 28,7±0,2
11,7 29,5±0,3
4,7 29,1±0,4
4,9
31,1±0,2 11,3 31,0±0,3
10,6 29,1±0,5* 7,2 31,1±0,3
2009
Примечание: А – стерильная форма; Б – фертильная форма; * – достоверные отличия при Р < 0,05 по сравнению с РЕТ1-аналогом; ^ – достоверные отличия
при Р < 0,05 по сравнению с RIG0-аналогом.
Линии ВИР 109 А РЕТ1 и ВИР 109 Б продемонстрировали незначительную изменчивость в течение трех лет изучения по количеству листьев. У остальных линий изменчивость была средней
или незначительной.
Форма листа серединной формации у изученных линий типична
для культурного H. annuus: ширина превышает длину. Наибольший
размер листовой пластинки отмечен у линии ВИР 109 – ширина листа
варьировала в среднем от 21,1 до 26,5 см, а длина – от 18,9 до 22,8 см
в разные годы у разных аналогов (табл. 3.4). Размеры листа аналогов линии ВИР 151 за 3-летний период изучения варьировали от 17,4
до 22,5 см по ширине и от 15,6 до 20,4 см по длине; ВИР 116 – от 17,5
до 21,9 см и от 16,1 до 20,2 см, ВИР 471 – от 14,5 до 22,4 см и от 13,2
до 19,2 см, по ширине и длине, соответственно. Наименьшие размеры
листьев наблюдали у изучаемых линий в 2007 г., а наибольшие – в 2008 г.
(у ВИР 116 – в 2009).
142
143
Б
А PET1
Б
А PET1
Б
А RIG0
А PET1
Б
А RIG0
А PET1
Аналог
ширина
длина
ширина
длина
ширина
длина
ширина
длина
ширина
длина
ширина
длина
ширина
длина
ширина
длина
ширина
длина
ширина
длина
Х±m
22,7 ± 1,0
19,6 ± 0,3
21,2 ± 1,7
19,4 ± 1,0
22,7 ± 1,4
18,9 ± 0,7
17,5 ± 0,6
17,0 ± 0,5
17,4 ± 1,1
15,6 ± 0,5
17,9 ± 0,4
16,6 ± 0,4
17,7 ± 0,7
16,1 ± 0,5
17,5 ± 0,7
16,2 ± 0,6
15,8 ± 0,5
13,7 ± 0,4
14,5 ± 0,7
13,2 ± 0,6
2007
V, %
14,5
4,9
25,0
15,5
18,5
11,1
9,7
6,9
17,8
9,0
7,8
7,8
41,8
17,4
11,4
9,9
2,2
5,2
15,9
14,4
Х±m
26,4 ± 0,9
22,2 ± 0,8
25,7 ± 0,8
22,0 ± 0,8
26,5 ± 1,7
22,8 ± 0,8
20,7 ± 0,9
20,2 ± 0,4
22,5 ± 0,4
20,2 ± 0,2
21,3 ± 0,6
20,4 ± 0,6
21,3 ± 0,6
19,1 ± 0,4
20,6 ± 0,6
19,6 ± 1,0
22,4 ± 0,5
19,2 ± 0,5
21,4 ± 0,8
18,3 ± 0,6
2008
V, %
11,4
11,7
10,1
11,8
19,6
10,5
14,5
6,4
3,3
3,6
8,0
8,8
15,0
9,4
8,7
15,3
14,3
3,7
12,1
10,9
2009
Х±m
25,3 ± 0,8
21,5 ± 0,5
21,1 ± 0,5*
19,5 ± 0,4*
24,1 ± 0,8^
20,3 ± 0,4
21,1 ± 0,5
19,7 ± 0,5
19,6 ± 0,4
19,2 ± 0,4
20,4 ± 0,4
19,3 ± 0,3
21,9 ± 0,3
20,2 ± 0,2
21,6 ± 0,4
19,9 ± 0,3
22,0 ± 0,3
18,6 ± 0,2
18,6 ± 0,5*
16,1 ± 0,4*
Год
V, %
2,8
5,1
1,7
14,4
16,2
3,5
16,6
17,8
7,1
7,3
20,6
10,9
1,6
10,4
21,3
16,1
14,5
15,1
15,1
8,7
среднее значение
2007–2009
Х±m
24,8 ± 0,5
21,1 ± 0,3
22,7 ± 0,6*
20,3 ± 0,4
24,4 ± 0,8
20,7 ± 0,4
19,8 ± 0,4
19,0 ± 0,3
19,8 ± 0,4
18,3 ± 0,2
19,8 ± 0,3
18,8 ± 0,3
20,3 ± 0,3
18,5 ± 0,2
19,9 ± 0,3
18,6 ± 0,4
20,1 ± 0,3
17,2 ± 0,2
18,2 ± 0,4*
15,9 ± 0,3*
Таблица 3.4
Примечание: А – стерильная форма; Б – фертильная форма; * – достоверные отличия при Р < 0,05 по сравнению с РЕТ1аналогом; ^ – достоверные отличия при Р < 0,05 по сравнению с RIG0-аналогом.
ВИР 471
ВИР 116
ВИР 151
ВИР 109
Линия
Параметры
листа
Размеры листа ЦМС-линий и их фертильных аналогов (КОС ВИР, 2007–2009 гг.), см
Достоверные различия показателей длины и ширины листа серединной формации между растениями линий-аналогов с разными митотипами наблюдали только в 2009 г. В частности, фертильный и стерильный PET1-аналоги превысили по показателю ширины листа
ВИР 109 А RIG0. Длина листа фертильной формы ВИР 109 достигала
промежуточного значения относительно соответствующего показателя
у стерильных аналогов, при этом лист линии с ЦМС типа РЕТ1 был достоверно длиннее листа RIG0-аналога. Различие по ширине листа между стерильными аналогами ВИР 109 обнаружено и при рассмотрении
средней величины измерений за 3 года, оно составило 8,5 % с большим
показателем у ВИР 109 А РЕТ1. ЦМС РЕТ1 форма линии ВИР 471 превосходила фертильную по ширине и длине листа в 2009 г., и по среднему за 2007–2009 годы показателю.
Изменчивость по размерам листовой пластинки у большинства исследованных линий зависела от года исследования. Наибольшую изменчивость наблюдали в 2007 г. по ширине листа у линий ВИР 109 А RIG0
(V = 25,0 %) и у ВИР 116 А РЕТ1 (V = 41,8 %), а также в 2009 г. у линий
ВИР 151 Б (V = 20,6 %) и ВИР 116 Б (V = 21,3 %). В большинстве случаев коэффициент вариации по ширине листовой пластинки превосходил этот показатель, рассчитанный относительно длины листа.
В связи с тем, что при изоляции растений и свободном цветении
семена формируются в различных условиях, показатели массы 1000 семянок анализировали при контролируемом (2007–2008 гг.) и неконтролируемом (2009 г.) опылении раздельно (табл. 3.5).
Наибольшая масса 1000 семянок при контролируемом опылении отмечена у линии ВИР 109 (73,6 – 95,1 г в разные годы у разных
аналогов), при свободном – у ВИР 116 (70,6 – 74,3 г); наименьшая –
при контролируемом опылении у ВИР 116 (52,0 – 71,6 г), при свободном у ВИР 471 (51,9 – 52,7 г).
Достоверные различия по массе 1000 семянок в течение трех лет изучения наблюдали для линий-аналогов ВИР 109. В 2007 г. размер семянок растений с митотипом RIG0 превысил этот показатель у фертильной формы. В 2008 г., напротив, масса 1000 семянок ВИР 109 А RIG
оказалась меньше, как по сравнению с фертильным, так и с ЦМС РЕТ1аналогами. Однако при усреднении показателей за два года эти различия нивелируются. В 2009 г. размер семянок линии ВИР 109 А RIG0
увеличился на 16 – 27 %, а линии ВИР 109 А PET1 – уменьшился на 9 –
27 % по сравнению с двумя другими аналогами.
144
Таблица 3.5
Масса 1000 семянок ЦМС линий и их фертильных аналогов
(КОС ВИР, 2007–2009 гг.), г
Год
Линия
ВИР 109
ВИР 151
ВИР 116
ВИР 471
Аналог
2007
(контролир.
опыление)
2008
(контролир.
опыление)
Х±m
V, %
Х±m
А PET1 93,1±3,3 5,1 83,8±3,4
А RIG0 95,1±2,8 11,6 73,6±2,4*
Б
88,0±1,2^ 4,1 86,4±3,1^
А PET1 73,0±3,1 6,1 73,3±1,2
А RIG0 68,8±3,2 4,5 73,2±2,3
Б
67,2±1,3 9,2 69,1±0,4*
А PET1 52,0±2,7 27,3 57,9±2,6
Б
55,7±2,9 14,4 71,6±9,1
А PET1 60,0±2,9 7,2 61,9±1,0
Б
70,7±2,3* 5,0 76,0±2,4*
V, %
11,2
1,0
9,4
1,7
33,0
1,1
29,5
47,1
0,9
15,5
Среднее
значение
2007–
2008
(контролир.
опыление)
Х±m
88,5±2,4
84,4±1,8
87,2±1,7
73,2±1,7
71,0±2,0
68,2±0,7*
55,0±1,9
63,7±4,8
61,0±1,5
73,4±1,7*
2009
(неконтролир.
опыление)
Х±m
51,2±1,1
65,0±1,4*
56,3±0,9*^
61,3±0,7
61,8±2,2
65,4±1,4*
70,6±1,0
74,3±1,0*
52,7±1,1
51,9±1,2
V, %
19,2
6,5
13,8
8,1
16,8
18,4
5,7
1,0
28,7
1,8
Примечание: А – стерильная форма; Б – фертильная форма; * – достоверные отличия при Р < 0,05 по сравнению с РЕТ1 аналогом; ^ – достоверные отличия
при Р < 0,05 по сравнению с RIG0-аналогом.
В 2007, 2008 гг. и в среднем за два года изолированного цветения
масса 1000 семянок линии ВИР 471 А РЕТ1 была достоверно меньше
относительно Б-формы.
У линии ВИР 151 с ЦМС РЕТ1 масса 1000 семянок по сравнению
с фертильным аналогом оказалась достоверно больше в 2008 г. и в среднем за два года. В 2009 г. стерильные аналоги линии ВИР 151 по массе 1000 семянок не отличались друг от друга, но уступали фертильной форме. Также данный показатель у ЦМС РЕТ1-аналога ВИР 116
был меньше Б-формы.
Наибольшую стабильность массы 1000 семянок за три года изучения, как при изолированном, так и при свободном цветении, продемонстрировала линия ВИР 151 А РЕТ1. У остальных линий в разные
годы наблюдали незначительный или средний уровень изменчивости.
145
По продолжительности вегетационного периода наиболее позднеспелой оказалась линия ВИР 109, сроки созревания ее аналогов за три
года изучения варьировали от 95 до 114 дней. Это может быть связано
с наибольшим количеством листьев у этой линии по сравнению с другими исследованными, так как увеличение количества листьев удлиняет
период всходы-цветение, что может влиять на общую протяженность вегетационного периода (Ростова, Крылова, 1987; Гаврилова, Анисимова,
2003). Наиболее раннеспелой оказалась линия ВИР 471 с интервалом
сроков созревания за три года изучения от 89 до 102 дней (табл. 3.6).
Таблица 3.6
Продолжительность вегетационного периода ЦМС-линий
и их фертильных аналогов (КОС ВИР, 2007–2009 гг.)
Линия
ВИР 109
ВИР 151
ВИР 116
ВИР 471
Аналог
А PET1
А RIG0
Б
А PET1
А RIG0
Б
А PET1
Б
А PET1
Б
Период всходы-цветение/созревание, сутки
среднее
2007 г.
2008 г.
2009 г.
значение
2007–2009 гг.
57/114
68/108
59/96
61/106
57/113
67/103
57/96
60/104
57/114
68/108
59/96
61/106
59/99
64/108
59/99
61/102
55/98
63/105
59/99
59/101
58/98
63/108
58/97
60/101
52/93
58/103
59/96
56/97
53/94
60/103
58/96
57/98
49/90
56/102
нет данных
53/96*
49/89
58/101
нет данных
54/95*
Примечание: А – стерильная форма; Б – фертильная форма; * – среднее значение
за 2007–2008 гг.
В 2007 г. для аналогов линии ВИР 109 сроки созревания были самыми продолжительными, однако фаза всходы-цветение – самой короткой. Наиболее быстрым было созревание аналогов ВИР 109 в 2009 г.
В 2008 г. ЦМС RIG0-форма зацветала и созревала на 1 и 5 дней раньше чем ЦМС РЕТ1 и фертильный аналоги. В 2009 г. согласно среднему
значению за три года изучения продолжительность периода всходы-созревание у ВИР 109 A RIG была на 2 дня меньше двух других аналогов.
Для линии ВИР 151 сроки зацветания и созревания в 2007 и 2009
годах практически не отличались. В 2008 г. созревание длилось дольше.
146
По усредненным за три года показателям аналоги ВИР 151 можно отнести к группе среднеспелых.
Линии ВИР 116 и ВИР 471 по срокам созревания в 2007 г. попали
в группу раннеспелых, а в 2008, 2009 и в среднем за период изучения –
в группу среднеспелых. Фертильный и ЦМС РЕТ1-аналоги этих линий
по срокам зацветания и созревания практически не отличались друг
от друга.
Следующим изученным признаком приведена фертильность пыльцы (табл. 3.7). Фертильность пыльцы определяли ацетокарминовым
методом (Барыкина и др., 2004). Пыльца Б-форм четырех исследованных линий была высоко жизнеспособной, ее фертильность варьировала в пределах от 80,3 до 97,0 %, что является достаточно хорошим показателем для размножения стерильных и фертильных аналогов данных
линий.
Таблица 3.7
Фертильность пыльцы Б-форм (КОС ВИР, 2008–2009 гг.), %
Линия
ВИР 109
ВИР 151
ВИР 116
ВИР 471
Год
2008
2009
87,7 ± 2,8
80,3 ± 4,0
86,2 ± 2,2
нет данных
89,4 ± 1,1
97,0 ± 1,0
90,4 ± 5,3
84,2 ± 2,4
В связи с тем, что стерильные аналоги изучаемых линий служат в гетерозисной селекции подсолнечника материнскими формами для получения гибридов и для их более глубокого изучения, в 2009 году мы исследовали несколько дополнительных селекционно-ценных признаков
(табл. 3.8).
Продуктивность исследуемых линий при неконтролируемом опылении различается довольно существенно. Она варьировала в пределах
от 36,4 г у ВИР 471 Б и 38,9 г у ВИР 151 А RIG0 до 70,1 г у ВИР 109 А RIG0
и 73,7 г у ВИР 109 Б. По масличности и лузжистости различия не столь
велики: от 19,8 % у ВИР 151 А РЕТ1 до 29,8 % у ВИР 471 Б по второму показателю и от 36,5 % у ВИР 471 Б до 52,2 % у ВИР 151 А РЕТ1
по первому. В целом содержание масла в семенах исследуемых линий
довольно высокое.
147
Таблица 3.8
Продуктивность, лузжистость и масличность ЦМС (РЕТ1 и RIG0)
линий ВИР 109 и ВИР 151 и их фертильных аналогов
при неконтролируемом опылении (КОС ВИР, 2009)
Линия
ВИР 109
ВИР 151
ВИР 116
ВИР 471
Аналог
А РЕТ1
А RIG0
Б
А РЕТ1
А RIG0
Б
А PET1
Б
А PET1
Б
Продуктивность
Лузжистость, %
растения, г
Х±m
V, %
Х±m
V, %
68,9 ± 11,1 20,2 24,1 ± 0,4
0,3
70,1 ± 6,4 21,9 24,4 ± 0,5
5,2
73,7 ± 8,5 7,5 22,4 ± 0,4*^ 1,9
47,0 ± 3,5 7,4 19,8 ± 0,5^ 2,5
38,9 ± 6,8 32,5 22,3 ± 0,5* 7,6
60,4 ± 10,3 12,2 23,3 ± 0,9* 1,5
55,4 ± 5,1 0,8
21,6 ± 1,2 24,2
56,4 ± 3,0 15,5 21,7 ± 0,4
7,3
60,4 ± 5,1 44,3 23,5 ± 0,4
2,1
36,4 ± 6,1* 34,6 29,8 ± 1,6* 9,3
Масличность, %
Х±m
46,9 ± 1,0
47,1 ± 0,5
48,1 ± 0,9
52,2 ± 0,6
50,2 ± 0,8
48,3 ± 2,4
48,3 ± 0,9
44,2 ± 0,5*
47,5 ± 1,0
36,5 ± 1,2*
V, %
1,2
1,0
0,3
2,7
1,1
2,2
1,3
1,6
2,2
0,2
Примечание: достоверные отличия линий-аналогов при P < 0,05 * – по сравнению
с РЕТ1; ^ – по сравнению с RIG0; А – стерильная форма, Б – фертильная.
По продуктивности растений большие различия (почти в 2 раза) обнаружены между стерильным и фертильным аналогами линии ВИР 471
и ЦМС RIG0 и фертильным аналогом ВИР 151, но средняя и значительная изменчивость по данному признаку ставит под сомнение достоверность этих различий. Относительно содержания лузги в семянках
стерильные митотипы вызвали появление достоверных отличий по сравнению с фертильными формами линий ВИР 109, ВИР 151 и ВИР 471.
Стерильные аналоги линии ВИР 109 по лузжистости не отличались друг
от друга, но превышали фертильную форму. ЦМС РЕТ1-аналог линии
ВИР 151 показал значительное уменьшение процентного содержания
лузги в семенах как по сравнению с фертильной, так и со стерильной
RIG0-формами. Лузжистость стерильного РЕТ1-аналога ВИР 471 была
меньше, чем у фертильной формы. Масличность Б-форм линий ВИР 116
и ВИР 471 была достоверно меньше стерильных аналогов. У других линий различий по масличности семян между аналогами не обнаружено.
Средним и значительным было варьирование по признаку продуктивности растений у ЦМС РЕТ1 и RIG0-аналогов линии ВИР 109,
ЦМС RIG0 и фертильного аналога линии ВИР 151, фертильного аналога ВИР 116 и обоих аналогов ВИР 471, а также по признаку лузжисто148
сти у ВИР 116 А РЕТ1. Остальные аналоги по масличности и лузжистости семян были на одном уровне.
С целью определения влияния двух типов ЦМС РЕТ1 и RIG0
на жирнокислотный состав масла были проанализированы семена линий, представленных тремя аналогами – ВИР 109 и ВИР 151 (табл. 3.9).
Таблица 3.9
Содержание жирных кислот в семенах линий-аналогов ВИР 109
и ВИР 151 при свободном цветении (КОС ВИР, 2009), % от суммы
ВИР 109
Жирная кислота
ВИР 151
А РЕТ1
6,0
0,1
А RIG0
5,7
0,1
Б
7,4
0,2
А РЕТ1
5,4
0,1
А RIG0
5,4
0,1
Б
5,6
0,1
Стеариновая
4,2
4,0
5,4
5,9
5,7
5,9
Олеиновая
25,6
32,2
32,9
31,7
31,7
29,2
Линолевая
62,4
56,4
51,8
55,2
55,5
57,4
Арахиновая
0,3
0,3
0,3
0,3
0,3
0,4
Гондоиновая
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Бегеновая
0,8
0,8
1,0
0,9
0,9
0,8
Пальмитиновая
Пальмитолеиновая
Эруковая
0,2
0,2
0,5
0,1
0,1
0,1
Лигноцериновая
0,2
0,2
0,1
0,2
0,2
0,2
Наиболее высокое содержание в масле этих линий отмечено для линолевой кислоты – свыше 50 % у двух линий; олеиновой – около 30 %,
пальмитиновой и стеариновой – от 4 до 6 %. Содержание насыщенных кислот составило в среднем 12,6 %. Среднее содержание мононенасыщенных жирных кислот – 31,0 %, полиненасыщенных – 56,5 %.
При сравнении жирнокислотного состава семян аналогов линий ВИР 109
и ВИР 151 наибольшие различия между фертильной и стерильными
формами отмечены для ВИР 109, у которой стерильные RIG0 и РЕТ1аналоги превосходили фертильный по содержанию линолевой кислоты на 6 и 10,6 %, соответственно (см. табл. 3.9). Содержание олеиновой
кислоты в масле семян линии ВИР 109 РЕТ1, напротив, было на 7,3 %
меньше фертильного аналога. Содержание насыщенных жирных кислот у фертильного аналога ВИР 109 составило 14,2 %, что превышает
этот показатель у RIG0 и PET1 аналогов на 3,2 и 2,7 %, соответственно. По содержанию мононенасыщенных жирных кислот фертильная
форма ВИР 109 (33,7 %) также превосходила стерильные формы – RIG0
149
на 1,1 %, а РЕТ1 на 7,7 %. Семена аналогов линии ВИР 151 по жирнокислотному составу масла практически не различались.
Фертильные и ЦМС-аналоги рассматриваемых линий по описанным
в таблице 3.10 качественным признакам практически не различаются (за
исключением наличия/отсутствия пыльцы), что свидетельствует об успешном создании методом многократного беккроссирования аналогов данных
линий с одинаковыми ядерными геномами и разными цитоплазмонами
(рис. 3.7 – 3.9). Однако по результатам трехлетних наблюдений стерильные
митотипы оказали достоверное влияние на выражение количественных
признаков, таких как продолжительность фенофаз, масса 1000 семянок,
лузжистость и масличность семян (по данным, полученным в 2009 году).
Таблица 3.10
Морфологические признаки линий ВИР 109, ВИР 151, ВИР 116
и ВИР 471 (КОС ВИР, 2007–2009 гг.)
Признак
Лист
Край листа
Черешок
Форма
корзинки
Наклон
корзинки
Антоциан
Цветки ложноязычковые
Цветы
трубчатые
Рыльца
Пыльники
Пыльца
150
ВИР 109
немного ассиметричный,
крупно бугорчатый, складчатый, средне
жесткий,
блестящий,
сердцевидный
пильчатый
длинный, тонкий, с широким основанием, отогнут
ВИР 151
ВИР 116
ВИР 471
слегка бугорчатый, слегка
вогнутый,
мягкий,
блестящий,
треугольный
гладкий,
вогнутый,
мягкий,
блестящий,
треугольный
бугорчатый,
выпуклый,
средне
жесткий,
блестящий,
сердцевидный
пильчатый
пильчатый
мелкопильчатый
длинный,
тонкий,
эректоидный
длинный, тонкий, отогнут
длинный, тонкий, отогнут
круглая, слегка круглая, слегка круглая,
выпуклая
выпуклая
выпуклая
круглая, плоская, слегка
сложена внутрь
90º
135°
180°
135°
нет
нет
нет
рыльца
желтые
желтые
желтые
желтые
желтые
желтые
желтые
желтые
желтые
серые
желтая
желтые
серые
желтая
желтые
серые
желтая
желтые
серые
желтая
Рис. 3.7. ЦМС RIG0-аналог линии ВИР 109
151
Рис. 3.8. Фертильный аналог линии ВИР 109
152
Рис. 3.9. ЦМС РЕТ1-аналог линии ВИР 109
153
Таким образом, исходя из полученных нами результатов и согласно данным литературы, можно заключить о неоднозначном влиянии ЦМС на выражение количественных признаков подсолнечника.
Причем при взаимодействии с одними ядерными геномами цитоплазматический эффект приводит к увеличению показателей исследуемых
признаков, с другими – к уменьшению. В то же время отмечены генотипы, у которых не выявлены изменения тех или иных признаков. Также
количественное выражение признаков у стерильных и фертильных аналогов зависит и от агрометеорологических условий культивирования.
Высокая продуктивность растений материнских форм является основой для получения стабильного урожая гибридных семян и, соответственно, уменьшение их себестоимости. Перевод линий ВИР 109
и ВИР 151 на стерильные типы цитоплазм РЕТ1 и RIG0 не оказал негативного влияния на их урожайность. В целом показатели исследованных признаков линий с новым типом ЦМС RIG0 не уступают таковым
у аналогов с ЦМС РЕТ1. Следовательно, стерильные аналоги линий
ВИР 109 и ВИР 151 на обоих источниках ЦМС можно рекомендовать
для использования в качестве материнских форм при производстве гетерозисных гибридов подсолнечника.
3.2. Структурные особенности микроспорогенеза
у линий с различными типами ЦМС
Исследования нарушения микроспорогенеза у растений подсолнечника с различными типами ЦМС достаточно актуальны, так как
их результаты могут стать основой для выявления причин и механизмов дегенерации или стерильности пыльцы, что имеет не только фундаментальное значение, но и большой практический интерес.
Ранее рядом авторов были изучены особенности микроспорогенеза у различных линий подсолнечника с ЦМС типа РЕТ1. Например,
Х.Т. Хорнером у линии HA 232 (Horner, 1977), В.К. Симоненко у линий АС-2009, АC-2007, K-077-S (Симоненко, 1975, 1981; Симоненко,
Карпович, 1978), Дж.Х. Лаво у линии HA 89 (Laveau et al., 1989)
и К Дж. Смартом у линии RPA842B (Smart et al., 1994) описаны особенности морфологии клеток пыльников, характерные при абортивном
развитии микроспор с ЦМС типа РЕТ1, по сравнению с фертильными аналогами. Однако ЦМС растений представляет собой феномен
ядерно-плазменного взаимодействия, в котором участвуют как гены
органелл (митохондрий), так и ядра. Поэтому, несмотря на один
154
тип мутации в митохондриальной ДНК, индуцирующей ЦМС РЕТ1,
микроспорогенез в зависимости от ядерного окружения должен иметь
особенности у линий с одинаковым цитоплазмоном, но разными ядерными геномами. В связи с этим мы провели сравнительный анализ микроспорогенеза у фертильной формы линии ВИР 109 подсолнечника
и ее стерильных аналогов (на основе изученного ранее на других линиях ЦМС типа РЕТ1 и нового типа RIG0).
С помощью световой и электронной микроскопии изучали пыльники
растений на разных стадиях развития: ранних (стадия спорогенных клеток и микроспороцитов) и более поздних (стадия формирования пыльцевых зерен у фертильной и полного абортирования пыльцы у стерильной
форм). Фиксацию пыльников и подготовку срезов для световой и электронной микроскопии проводили по стандартной методике (Усатов и др.,
2010б). Срезы анализировали в электронном Tecnai 12 (Phillips, Голландия)
и светооптическом Axioskop Zeiss (Германия) микроскопах.
Результаты сравнительного анализа светооптической микроскопии
свидетельствуют, что на ранней предмейотической стадии развития
пыльники ЦМС и фертильных форм линии ВИР 109 сходны. Они состоят из четырех микроспораниев (гнезд), стенки которых четырехслойные, представлены эпидермисом, эндотецием, промежуточным
слоем и тапетумом. Внутри гнезда пыльника находятся многочисленные спорогенные клетки (рис. 3.10, 3.11).
На уровне разрешения электронной микроскопии видно, что эпидермис, эндотеций и промежуточный слой представлены вакуолизированными клетками (рис. 3.12). В клетках тапетума и в спороцитах заметны немногочисленные вакуоли.
Тапетум имеет клеточное строение и локализован тонким слоем.
Клетки тапетума содержат крупные ядра с хорошо заметными под электронным микроскопом ядрышками (рис. 3.13, 3.14). В их цитоплазме
локализованы большое количество свободных рибосом, многочисленные митохондрии с плотным матриксом и хорошо развитыми кристами, аппарат Гольджи и пластиды (рис. 3.13–3.18). Эндоплазматический
ретикулюм (ЭПР) в тапетальных клетках имеет вид узких протяженных
канальцев, поверхность которых усеяна рибосомами и полисомами
(рис. 3.17). Также можно видеть концентрически расположенные каналы ЭПР (рис. 3.13). Однако в отличие от описаний фертильных форм
подсолнечника, сделанных В.К. Симоненко (1981), в тапетуме фертильной линии ВИР 109 пластиды не окружены концентрически расположенными каналами ЭПР.
155
Рис. 3.10. Строение гнезда пыльника фертильного аналога линии ВИР 109
на предмейотической стадии развития:
ПС – промежуточный слой клеток; С – спорогенные клетки; Т – тапетум;
ЭН – эндотеций; ЭП – эпидермис
156
Рис. 3.11. Строение гнезда пыльника ЦМС РЕТ1-аналога линии ВИР 109
на предмейотической стадии развития:
С – спорогенные клетки; Т – тапетум
157
Рис. 3.12. Структура клеток оболочки пыльника
фертильного аналога линии ВИР 109 на ранней стадии развития:
В – вакуоли; Я – ядра
158
Рис. 3.13. Клетка тапетума фертильной формы подсолнечника на ранней
стадии развития пыльника:
ЭПР – эндоплазматический ретикулум; Я – ядро; Яд – ядрышко
159
Рис. 3.14. Фрагмент клетки тапетума ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на ранней стадии развития пыльника:
М – митохондрии; Пл – пластида; Я – ядро; Яд – ядрышко
160
Рис. 3.15. Митохондрии в клетке тапетума фертильной формы
подсолнечника на ранней стадии развития пыльника:
АГ – аппарат Гольджи; М – митохондрии;
ЭПР – эндоплазматический ретикулум; Я – ядро
161
Рис. 3.16. Пластиды в клетке тапетума фертильной формы линии ВИР 109
на ранней стадии развития пыльника:
К – крахмальное зерно; КО – клеточная оболочка; Пд – плазмодесма;
Пл – пластиды
162
Рис. 3.17. Цитоплазма клетки тапетума ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на ранней стадии развития пыльника:
ЭПР – эндоплазматический ретикулум
163
Рис. 3.18. Аппарат Гольджи в клетке тапетума ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на ранней стадии развития пыльника:
АГ – аппарат Гольджи; Пл – пластида
164
С помощью электронной микроскопии обнаружено, что спорогенные клетки, локализованные в центре гнезда пыльника, соединены между собой и с тапетумом плазмодесмами (рис. 3.19). Ядра в этих
клетках крупные, с хорошо различимыми ядрышками и небольшим количеством электронно-плотного хроматина (рис. 3.20, 3.21).
Цитоплазма содержит множество пластид с крахмальными зернами
(рис. 3.19, 3.21) и митохондрий с большим количеством крист у фертильного аналога ВИР 109 (рис. 3.19). Наши наблюдения отличаются
от данных Дж.Х. Лаво (Laveau et al., 1989), который при изучении фертильной линии НА 89 обнаружил в спорогенных клетках митохондрии
с небольшим количеством крист. У ВИР 109 А РЕТ1 количество крист
в митохондриях также небольшое (рис. 3.22). Митохондрии локализованы вблизи ядерной мембраны, что согласуются с наблюдениями
В.К. Симоненко (1981) (рис. 3.22, 3.23). ЭПР представлен более узкими,
чем в клетках тапетума, уплощенными каналами (рис. 3.19). Мембраны
ЭПР и цитоплазма микроспороцитов содержат меньшее количество
рибосом, чем тапетум (рис. 3.19). Аппарат Гольджи не обнаружен.
Микроспоры у фертильных растений формируются в результате двух делений мейоза спороцита и располагаются в виде тетраэдра.
После выхода из тетрады микроспора приобретает сферическую форму, начинает увеличиваться в размерах, ее оболочка достраивается
и утолщается (рис. 3.24, 3.25).
На уровне электронной микроскопии обнаружено, что пыльцевое
зерно у фертильных форм содержит ядро, окруженное цитоплазмой
со множеством мелких вакуолей (рис. 3.25, 3.26). Подобную вакуолизацию цитоплазмы микроспор наблюдали Х.Т. Хорнер (Horner, 1977)
и Дж.Х. Лаво (Laveau et al., 1989). Ядро окружено многочисленными
митохондриями (рис. 3.26). Эту особенность отмечал и Дж.Х. Лаво
(Laveau et al., 1989). Ядрышки электронно-непрозрачные, хроматин
слабоконденсирован (рис. 3.27).
Наружный слой экзины (эктэкзина) имеет шипы и содержит следующие компоненты: тектум, столбики-бакули и подножный слой.
Внутренняя часть экзины (эндэкзина) состоит из многих отложений
и тяжей, параллельных поверхности протопласта. Между эктэкзиной
и эндэкзиной можно наблюдать пространство, которое Х.Т. Хорнер
(Horner, 1977) определил как spacer layer («промежуточный слой»)
(рис. 3.26).
165
Рис. 3.19. Участок цитоплазмы спорогенной клетки фертильной формы
подсолнечника на ранней стадии развития пыльника:
К – крахмальные зерна; М – митохондрии; Пл – пластиды;
Пд – плазмодесмы; ЭПР – эндоплазматический ретикулум
166
Рис. 3.20. Спорогенные клетки фертильной формы подсолнечника
на ранней стадии развития пыльника:
Я – ядро
167
Рис. 3.21. Спорогенные клетки ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на ранней стадии развития пыльника:
Пл – пластиды; Я – ядро; Яд – ядрышко
168
Рис. 3.22. Митохондрии в спорогенной клетке ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на ранней стадии развития пыльника:
М – митохондрии; Я – ядро
169
Рис. 3.23. Фрагмент спорогенной клетки фертильной формы
подсолнечника на ранней стадии развития пыльника:
М – митохондрии; КО – клеточная оболочка; Пд – плазмодесмы; Я – ядро
170
Рис. 3.24. Срез зрелого пыльника фертильного подсолнечника:
Пз – пыльцевые зерна; Т – тапетум
171
Рис. 3.25. Микроспора фертильного подсолнечника:
В – вакуоли; Эк – эктэкзина; Эн – эндэкзина; Я – ядро;
172
Рис. 3.26. Участок цитоплазмы и оболочки пыльцевого зерна
фертильного подсолнечника:
Б – бакули; В – вакуоли; М – митохондрии; ПрС – промежуточный слой;
ПС – подстилающий слой; Т – тектум; Эк – эктэкзина; Эн – эндэкзина;
Я – ядро
173
Рис. 3.27. Фрагмент цитоплазмы пыльцевого зерна
фертильного подсолнечника:
В – вакуоли; М – митохондрии; Я – ядро; Яд – ядрышко
174
На данной стадии развития пыльника фертильного подсолнечника
тапетальные клетки увеличиваются в размерах радиально, по направлению к центру гнезда пыльника. Стенки клеток тапетума лизируются
(рис. 3.28). Наблюдается пикноз ядер, они приобретают форму «тающих ядер» (Симоненко, 1975). В клетках видна обширная сеть ЭПР,
плеоморфные митохондрии (рис. 3.29) и гантелевидные пластиды
(рис. 3.28). Тапетальный плазмодий проникает между клетками спорогенного комплекса, но сохраняет контакты с пристенным слоем клеток
(см. рис. 3.24).
По мере роста микроспор вещество тапетального периплазмодия
расходуется на питание пыльцевых зерен и формирование экзины, и к
концу развития в гнездах зрелых пыльников находятся лишь трехъядерные пыльцевые зерна с характерными удлиненными спермиями
и шипиками на поверхности экзины (Симоненко, Карпович, 1978).
У аналогов линии ВИР 109 с цитоплазматической мужской
стерильностью пыльник развивается совершенно по-другому.
У ВИР 109 А RIG0 на стадии, когда спорогенные клетки начинают
округляться при развитии их в микроспороциты, на уровне световой
микроскопии наблюдается ярко выраженная гипертрофия тапетального слоя клеток (рис. 3.30). С помощью электронного микроскопа можно видеть, что клетки тапетума утрачивают свои оболочки (рис. 3.31),
их протопласты объединяются, образуя мощный пристенный периплазмодий с многочисленными ядрами. У стерильного РЕТ1-аналога
ВИР 109 радиальные стенки оболочек клеток тапетума начинают растворяться на стадии диад, и на их месте формируется новая тонкая
оболочка. Сразу после завершения мейотического деления, в момент
образования тетрады микроспор, тапетум ЦМС РЕТ1-формы линии
ВИР 109 начинает разрастаться (рис. 3.32, 3.33). Гомогенный тапетум,
как РЕТ1-, так и RIG0-аналогов, окружает спорогенный комплекс клеток, но не проникает между клетками, и последние на протяжении всего развития пыльника остаются в виде компактной массы. Постепенно
пространство, занимаемое спорогенным комплексом в гнезде пыльника, уменьшается, а тапетумом – увеличивается. Эти наблюдения согласуются с данными литературы по развитию пыльника у ЦМС РЕТ1
подсолнечника.
175
Рис. 3.28. Фрагмент клетки тапетума фертильного подсолнечника:
Пл – пластиды; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; Я – ядро
176
Рис. 3.29. Участок цитоплазмы клетки тапетума
фертильного подсолнечника:
М – митохондрии
177
Рис. 3.30. Гнездо пыльника ЦМС RIG0 подсолнечника:
Т – тапетум; С – спороциты
178
Рис. 3.31. Клетки тапетума ЦМС RIG0 подсолнечника
на стадии поздних микроспороцитов и диад:
М – митохондрия; ЭПР – эндоплазматический ретикулум; Я – ядро
179
Рис. 3.32. Тетрады микроспор и тапеталльные клетки
ЦМС РЕТ1 подсолнечника:
Т – тапетум; ТМ – тетрады микроспор
180
Рис. 3.33. Срез пыльника ЦМС РЕТ1 подсолнечника на стадии тетрад:
Т – тапетум; ТМ – тетрады микроспор
181
Первые аномалии ультраструктуры, наблюдаемые в пыльниках растений стерильных аналогов линии ВИР 109, мы обнаружили на стадии
поздних микроспороцитов и диад в многоядерных тапетальных клетках
(рис. 3.34). Под электронным микроскопом видно, что их цитоплазма
содержит расширенные каналы ЭПР (их профили представлены на срезах в виде замкнутых цистерн, усеянных рибосомами) (рис. 3.31, 3.35а).
В цитоплазме клеток тапетума ЦМС РЕТ1-аналога присутствует аппарат Гольджи (рис. 3.35б), у RIG0-аналога его не обнаружено. На этой
стадии в тапетальных клетках находятся митохондрии с хорошо выраженной и мощно развитой системой крист (см. рис. 3.31). Пластиды RIG0аналога имеют плотную строму с редкими ламеллами, форма их округлая, в отличие от овальных пластид ЦМС РЕТ1 растений, описанных
В.К. Симоненко (1981) (рис. 3.36). Чрезмерного отложения спорополленина в виде электронноплотных полусферических «бляшек», как это
наблюдал В.К. Симоненко (1981) в тапетуме растений изученных им линий с ЦМС РЕТ1, у ЦМС аналогов ВИР 109 не происходит.
Во время формирования тетрад микроспор и разрастания тапетума у линии ВИР 109 А РЕТ1 можно видеть повреждения внутренней
структуры клеток тапетума. Митохондрии со светлым матриксом лишены крист, исчезают диктиосомы, что согласуется с наблюдениями
Х.Т. Хорнера и Дж.Х. Лаво (Horner, 1977; Laveau et al., 1989), но в некоторой степени противоречит данным В.К. Симоненко (1981), который
описывал митохондрии с мощно развитой системой крист в клетках
тапетума ЦМС РЕТ1-форм на данной стадии развития. Шероховатый
ЭПР фрагментирован. Пластиды округлые, с плотной стромой и редкими ламеллами (рис. 3.37).
Кроме того, для клеток тапетума ЦМС РЕТ1 и RIG0 форм ВИР 109
характерно аномальное развитие ядер. В отличие от фертильного аналога, у которого клетки тапетума содержат по два крупных ядра, постепенно лизирующихся по мере превращения клеточного тапетума
в периплазмодий, количество и объем ядер в клетках тапетума стерильных линий увеличиваются (рис. 3.38). Ядра сильно хроматизированы,
и количество частиц плотного гетерохроматина на срезах чрезвычайно
велико. Форма ядер амебоидная, со многими выростами и инвагинациями (рис. 3.38, 3.39). Однако оболочка, в отличие от наблюдений
В.К. Симоненко (1981), не фрагментирована. В дальнейшем в цитоплазме клеток тапетума происходит резкое расширение каналов гладкого ЭПР и образование крупных лакун и вакуолей (рис. 3.36, 3.40).
182
Рис. 3.34. Срез пыльника ЦМС РЕТ1 подсолнечника на стадии диад:
Д – клетки диад микроспор; Т – тапетум
183
а
б
Рис. 3.35. Ультраструктура клеток тапетума ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на стадии диад и тетрад микроспор:
а – расширенные каналы ЭПР; б – АГ;
АГ – аппарат Гольджи; ЭПР – эндоплазматический ретикулум
184
Рис. 3.36. Клетки тапетума ЦМС RIG0 подсолнечника на стадии
поздних микроспороцитов и диад:
В – вакуоли; Пл – пластиды
185
Рис. 3.37. Участок цитоплазмы клетки тапетума ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на стадии тетрад:
М – митохондрии; Пл – пластиды; ЭПР – эндоплазматический ретикулум
186
Рис. 3.38. Многоядерная клетка тапетума ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на стадии диад:
Я – ядра
187
Рис. 3.39. Клетка тапетума ЦМС RIG0 подсолнечника на стадии
поздних микроспороцитов и диад:
Я – ядро
188
Рис. 3.40. Участок цитоплазмы клетки тапетума ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на стадии тетрад:
ЭПР – эндоплазматический ретикулум
189
В тапетуме ЦМС растений концентрически расположенных каналов ЭПР не обнаружено, однако в микроспороцитах пыльников
стерильных РЕТ1-форм они присутствуют (рис. 3.41). В микроспороцитах растений ВИР 109 с ЦМС РЕТ1 отдельные участки цитоплазмы изолируются каналами ЭПР. В таких сегрегированных участках
цитоплазма постепенно просветляется, формируя вакуоли (рис. 3.42).
У ЦМС RIG0-аналога вакуоли состоят из пузырьков разного диаметра
и липидных капель (рис. 3.43). Затем вся цитоплазма клетки вакуолизируется мелкими вакуолями.
Большинство органелл в цитоплазме микроспороцитов набухшие,
в отличие от фертильной формы почти лишенные внутренних мембран, пластиды округлые и гантелевидные с едва заметными ламеллами (рис. 3.42), у ЦМС RIG0-аналога, в отличие от РЕТ1, с крупными
крахмальными гранулами (рис. 3.43, 3.44), митохондрии со светлым
матриксом, малочисленными кристами (рис. 3.45, 3.46). Локализации
митохондрий вблизи ядерной мембраны, в отличие от фертильных растений, не наблюдается. Цитоплазма микроспороцитов ЦМС РЕТ1растений, в отличие от ЦМС RIG0, содержит многочисленные диктиосомы, что наблюдал и Дж.Х. Лаво (Laveau et al., 1989) (рис. 3.47).
На уровне световой микроскопии видно, что при дальнейшем развитии микроспороциты стерильных растений сжимаются агрессивно разросшимся тапетумом и образуют своеобразную плотную массу.
Клетки ее дегенерируют, затем разрушается и все остальное содержимое гнезда пыльника. Клетки промежуточного слоя, уплощенные
на предыдущих стадиях развития пыльника, сильно вакуолизируются,
пузыревидно вздуваются, их ранее плотная цитоплазма просветляется, располагаясь пристенно. Этот промежуточный слой сохраняется
до полной дегенерации тапетума и микроспороцитов стерильного подсолнечника (рис. 3.48, 49).
Таким образом, в целом структурные изменения клеток и органелл,
выявленные нами при абортивном микроспорогенезе у стерильных
растений линии ВИР 109, сходны с таковыми, описанными в литературе и для других линий с ЦМС типа РЕТ1. А именно, четко проявляется спорофитный характер действия ЦМС-факторов, выражающийся,
прежде всего, в абортивном развитии тапетальной ткани, ее гипертрофии уже на стадии спорогенных клеток, что приводит к постепенной
дегенерации последних.
190
Рис. 3.41. Набухшие митохондрии в цитоплазме микроспороцита
ЦМС РЕТ1 подсолнечника на стадии тетрад:
М – митохондрии
191
Рис. 3.42. Фрагмент клетки микроспороцита ЦМС РЕТ1 подсолнечника
на стадии тетрад:
В – вакуоли; Пл – пластиды; Я – ядро
192
Рис. 3.43. Фрагмент микроспороцита ЦМС RIG0 подсолнечника на стадии
поздних микроспороцитов и диад:
В – вакуоль; ЛК – липидные капли; Пл – пластиды; Я – ядро
193
Рис. 3.44. Участок цитоплазмы микросопороцита
ЦМС RIG0 подсолнечника на стадии поздних микроспороцитов и диад:
Пл – пластиды
194
Рис. 3.45. Концентрические каналы ЭПР в цитоплазме микроспороцита
ЦМС РЕТ1 подсолнечника на стадии тетрад:
ЭПР – эндоплазматический ретикулум
195
Рис. 3.46. Участок цитоплазмы микросопороцита
ЦМС RIG0 подсолнечника на стадии поздних микроспороцитов и диад:
М – митохондрия; Пл – пластиды
196
Рис. 3.47. Аппарат Гольджи в цитоплазме микроспороцита
ЦМС РЕТ1 подсолнечника на стадии тетрад:
АГ – аппарат Гольджи
197
Рис. 3.48. Прекратившие развитие гнезда пыльника
ЦМС РЕТ1 подсолнечника:
ПС – промежуточный слой клеток
198
Рис. 3.49. Прекратившие развитие гнезда пыльника
ЦМС RIG0 подсолнечника:
ПС – промежуточный слой клеток
199
Кроме того, наблюдаются изменения в структуре органелл клеток
тапетума и микроспороцитов (нарушение структуры митохондрий
и пластид, расширение каналов ЭПР, вакуолизация цитоплазмы, появление амебоидных ядер) стерильных форм по сравнению фертильной.
Однако у стерильной формы типа РЕТ1 линии ВИР 109 нами выявлен
и ряд отличий от стерильных растений других линий, приведенных
в литературе (Симоненко, 1981; Laveau et al., 1989). А именно, на ранней
стадии развития пыльников (стадия микроспороцитов) не происходит
чрезмерного отложения спорополленина в клетках тапетума, форма
тапетальных пластид округлая, а не овальная, оболочка гипертрофированных ядер тапетума не фрагментирована, ядерная оболочка микроспороцитов не образует инвагинаций и выростов. Кроме того, на более поздней стадии микроспорогенеза (стадия тетрад) клетки тапетума
растений ВИР 109, в отличие от других исследованных линий с ЦМС
типа РЕТ1, содержат диктиосомы, а митохондрии тапетума полностью
лишены крист. Возможно, эти особенности клеточной ультраструктуры могут свидетельствовать о влиянии ядерных генов на протекание
абортивного микроспорогенеза у ЦМС-форм подсолнечника.
Отличие ЦМС RIG0-аналога линии ВИР 109 от ЦМС РЕТ1 заключается в более ранней гипертрофии тапетума, а также в ультраструктуре:
на стадии диад форма ядер микроспороцитов изменяется, становится
неправильной, в их пластидах содержатся крахмальные зерна и в цитоплазме микроспороцитов и тапетума отсутствуют диктиосомы аппарата
Гольджи. Кроме того, в микроспороцитах линии ВИР 109 с ЦМС RIG0
не обнаружено концентрически расположенных каналов ЭПР.
3.3. Источники гена Rf1 среди однолетних
и многолетних видов подсолнечника
В природных популяциях разных видов рода Helianthus выделяют формы с ядерными генами Rf частично или полностью восстанавливающими фертильность пыльцы независимо от происхождения
ЦМС (Christov et al., 1996; Iouras et al., 2002). В случае доминантных
генов Rf фертильность восстанавливается уже у гибридов F1, что играет
решающую роль в их практическом использовании.
Первый источник восстановления фертильности ЦМС РЕТ1 обнаружен М. Кинманом (Kinman, 1970). Он полагал, что признак восстановления фертильности пыльцы у ЦМС типа РЕТ1 контролирует один
200
ядерный доминантный ген. На основе дальнейших исследований стали
предполагать участие от одного до четырех доминантных генов с различными типами взаимодействия (Гаврилова, Анисимова, 2003). Было показано, что в разных комбинациях генотипов в реакции восстановления
фертильности пыльцы принимает участие различное количество генов
(Анащенко, Кукош, 1985; Анащенко, Дука, 1985а, 1985б; Dominguez,
Fick, 1975; Sunflower technology and production, 1997; Jan, 2000; Jan et al.,
2002; Гаврилова, Анисимова, 2003; Попов, Кириченко, 2007).
На сегодняшний день наиболее распространена точка зрения, согласно которой для восстановления фертильности ЦМС типа PET1 у подсолнечника необходимы два гена – Rf1 и Rf2 (Serieys, 1996). Однако один
из генов, а именно Rf2, присутствует в геноме большинства ЦМС-линий
и закрепителей стерильности, следовательно только линия-восстановитель передает гибриду ген Rf1 (Leclercq, 1984; Horn, 2006).
Полученные данные о взаимодействии ядерных генов восстановления фертильности пыльцы (Rf) c митохондриальными генами, контролирующими формирование ЦМС, свидетельствуют, что гены Rf
блокируют активность белкового продукта митохондриального гена,
т.е. ядерные Rf гены подсолнечника действуют на посттранскрипционном уровне. Ф. Монегер с соавторами (Moneger et al., 1994) показали,
что количество молекул транскриптов химерного цистрона atpA-orfH522 остается постоянным в стерильных линиях, но происходит тканеспецифическое уменьшение их количества у восстановленных форм
подсолнечника: оно наблюдается только в пыльниках восстановленных
растений, а точнее, в предмейотических материнских клетках пыльцы.
Механизмом, приводящим к уменьшению количества молекул мРНК
atpA-orfH522 с участием гена-восстановителя, является полиаденилирование РНК-матриц, которое вызывает ускоренную деградацию молекул рибонуклеазами (Gagliardi, Leaver, 1999).
Несмотря на сложность и многогранность механизмов взаимодействия ядерных и цитоплазматических генетических компартментов
клетки в определении репродуктивной функции, создание новых генетических систем ЦМС-Rf на основе ядерно-цитоплазматических
комбинаций имеет большую практическую значимость. В то же время
процесс идентификации новых генотипов с генами Rf классическим
методом гибридологического анализа длителен и трудоемок, а пробле201
ма быстрого и точного определения доноров генов Rf в генофонде этой
сельскохозяйственной культуры чрезвычайно актуальна.
Одним из перспективных вспомогательных инструментов поиска растений, восстанавливающих фертильность пыльцы линий ЦМС,
является использование надежных ДНК-маркеров, сцепленных с генами Rf. В настоящее время генетическое маркирование гена Rf1 проведено с помощью маркеров RFLP, RAPD, AFLP, SSR, TRAP (Botstein
et al., 1980; Gentzbittel et al., 1995; Berry et al., 1995; Horn et al., 2003;
Kusterer et al., 2005; Yue et al., 2010). Многие из них тесно сцеплены с геном Rf1 и демонстрируют определенную надежность в идентификации
генотипов-восстановителей фертильности пыльцы ЦМС на основе
H. petiolaris.
Р. Хорн с соавторами (Horn et al., 2003) разработали SCAR-маркеры,
OPK13 и OPY10, сцепленные с геном восстановления фертильности
пыльцы наиболее широко используемой в селекции ЦМС типа РЕТ1 –
Rf1. Расстояние между локусами, амплифицируемыми с помощью
данных праймеров, и геном составило 0,9 и 2,2 сМ, соответственно.
Используя эти маркеры, мы провели скрининг однолетних и многолетних видов подсолнечника из коллекции ВНИИР им. Н.И. Вавилова.
Всего было исследовано 5 однолетних и 26 многолетних видов.
Однолетние виды были представлены образцами разных лет поступления (до пяти у одного вида). Многолетние виды – от 1 до 6 популяциями (с различными номерами интродукции). Амплификацию проводили согласно методикам, (Анисимова и др., 2009; Маркин и др., 2010).
Маркер HRG01/OPK13 был выявлен у всех представителей однолетних видов H. debilis, H. argophyllus и H. petiolaris (табл. 3.11). Однако
у вида H. debilis (и-560395) амплификацию четкого маркерного фрагмента размером 426 п.н. (характерного для культурных и многолетних
дикорастущих форм) удалось провести только при снижении температуры отжига праймера с 58 до 54 °С. Это уменьшило специфичность
связывания праймера с ДНК анализируемых растений. У видов H. praecox и H. annuus выявлена гетерогенность по наличию/отсутствию данного маркера, как среди разных образцов, так и внутри одного образца.
В частности, маркер был обнаружен у 75 % исследованных растений
образца H. praecox (и-560400) и образца H. annuus (и-441236), а также
у половины растений H. annuus (и-441245).
202
Таблица 3.11
Амплификация ДНК однолетних видов подсолнечника с маркерами
гена Rf1 HRG01/ОРК13 и HRG02/OPY10
Вид
Helianthus annuus L.
H. praecox Englem.& Gray
H. debilis Nutt.
H. petiolaris Nutt.
H. argophyllus T. & G.
Номер
интродукции
441183
441236
441245
560400
560388
560395
545666
440560
503232
б/№
1805
1000
Наличие
маркера
HRG01
+
+/–
+/–
+/–
+
+
+
+
+
+
+
+
Наличие маркера HRG02
+/–
+/–
+/–
–
–
–
–
+/–
–
–
–
–
С праймером HRG02/OPY10 амплификацию маркерного фрагмента ДНК (размером 738 п.н.) наблюдали у растений всех образцов только одного вида – H. annuus, с наличием полиморфизма внутри образцов: 25 % у образца и-441183 и по 50 % у образцов и-441236 и и-441245.
Кроме того, данный маркер был определен у 25 % исследованных растений образца H. petiolaris (и-440560) (табл. 3.11).
Результаты, демонстрирующие наличие маркерных последовательностей гена Rf1 у многолетних видов подсолнечника, суммированы
в таблице 3.12. Видно, что при использовании праймера HRG02/OPY10
у всех исследованных растений многолетних видов, как и у культурных
форм, амплифицируется специфическая последовательность (маркер) ожидаемого размера 738 п.н. Однако с праймером HRG01/OPK13
были получены неоднозначные результаты. Специфический фрагмент
размером 426 п.н. наблюдали только у 12 из 26 исследованных видов.
Кроме того, данный маркер оказался неоднородно представленным
в популяциях нескольких видов. Причем у видов H. mollis и H. rigidus
различия наблюдаются между популяциями, а у H. divaricatus, H. occidentalis, H. strumosus, H. californicus, H. maximilliani, H. angustifolius – внутри популяций.
203
Таблица 3.12
Результаты амплификации ДНК многолетних видов подсолнечника
с маркерами гена Rf1 HRG01/ОРК13 и HRG02/OPY10
Виды
Номер
интродукции
Helianthus ciliaris DC.
б/№
H. trachelifolius Mill.
б/№
H. tuberosus L.
б/№
H. multiflorus L.
б/№
H. tomentosus Michx.
б/№
H. nuttalii T. & G.
H. hirsutus Raf.
б/№
560389
H. laevigatus T. & G.
б/№
H. microcephalus T. & G.
б/№
H. floridanus A.Gray ex Chapm.
б/№
H. simulans E.Watson
H. salicifolius Dietr.
H. giganteus L.
H. grosseserratus М.Martens
H. decapetalus L.
+
б/№
440439
б/№
1889
б/№
545674
+
2099
+/–
2102
204
+/–
545698
H. eggertii Small
H. occidentalis Riddel subsp. occidentalis
+
2100
б/№
H. occidentalis Riddel subsp. plantagineus (Torr. &
A.Gray) Heiser
+
б/№
489253
H. smithii Heiser
H. mollis Lam.
+
440074
1886
H. divaricatus L.
–
545654
H. laetiflorus Heiser & D.M.Sm.
H. angustifolius L.
Наличие маркера
HRG01 HRG02
б/№
+
50/88
–
441062
б/№
(2 популяции)
611801
+
–
+/–
+
+
+
+
Окончание табл. 3.12
Виды
H. strumosus L.
H. rigidus Desf.
H. californicus DC.
H. maximilliani Schrad.
Номер
интродукции
440679 популяция 1
440679 популяция 2
440683
1886
2106
545658
545660
545646
б/№
441063
530447
2099
440553
Наличие маркера
HRG01 HRG02
+
–
+
+/–
–
+
–
+/–
–
+/–
+
+
+
Фертильность пыльцы 16 многолетних видов, сроки цветения которых, совпадали с цветением культурных форм, варьировала от 71,6
до 99,2 % с наименьшим показателем у растений H. floridanus и наибольшим у H. rigidus (табл. 3.13).
Высокие показатели жизнеспособности пыльцы растений многолетних видов и совпадающие с культурными линиями сроки цветения
позволяют проводить межвидовую гибридизацию. Особый интерес
представляют показатели фертильности пыльцы однолетних гибридов,
полученных в результате скрещиваний многолетних видов с культурными линиями на основе ЦМС типа РЕТ1.
Фертильность пыльцы F1 гибрида ВИР 114 × H. hirsutus составила
75,3 ± 3,7 % (см. табл. 3.13). Остальные исследованные комбинации
представляют собой интрогрессивные линии, которые были выделены
на Кубанской опытной станции ВНИИР В.А. Гавриловой и Т.Т. Толстой
методом самоопыления из межвидовых гибридов F2, полученных в результате скрещивания многолетних видов: H. hirsutus, H. occidentalis, H. giganteus, H. strumosus, H. mollis, H. californicus, H. maximalliani,
H. grosseserratus, H. angustifolius, H. laetiflorus, H. floridanus, H. trachelifolius
в качестве отцовских форм с четырьмя ЦМС РЕТ1-линиями: ВИР 114,
205
Таблица 3.13
Фертильность многолетних видов и однолетних межвидовых гибридов
подсолнечника (КОС ВИР, 2008)
Виды и межвидовые гибриды
Helianthus ciliaris
H. decapetalus
H. divaricatus
H. giganteus
H. hirsutus
H. maximiliani
H. mollis
H. strumosus
H. occidentalis
H. rigidus
H. californicus
H. nuttalii
H. laetiflorus
H. angustifolius
H. floridanus
H. grosseserratus
ВИР 114 × H. hirsutus
НА 232 × H. giganteus
НА 232 × H. grosseserratus
ВИР 151 × H. occidentalis
НА 232 × H. strumosus
HA 232 × H. mollis
HA 232 × H. californicus
HA 232 × H. maximalliani
НА 232 × H. angustifolius
НА 232 × H. laetiflorus
ВИР 129 × H. floridanus
ВИР 151 × H. trachelifolius
Фертильность пыльцы, %
96,5±1,3
89,7±7,4
90,6±3,4
96,6±1,1
91,9±3,8
94,0±2,4
87,0±1,5
95,8±3,2
98,7±0,4
99,2±0,3
94,5±0,5
92,2±3,9
87,6±0,4
84,9±2,6
71,6±3,1
95,7±1,3
75,3±3,7
93,3±0,9
76,7±1,8
95,2±2,3
97,8±0,6
92,4±3,2
92,3±2,2
84,0±3,7
90,6±5,3
87,5±3,5
96,2±1,1
94,7±1,3
ВИР 129, ВИР 151 и НА 232. На момент исследования интрогрессивные
линии были представлены, как минимум 10-м поколением инбридинга и имели высоко жизнеспособную пыльцу, фертильность которой варьировала от 75,3 до 97,8 %. В лаборатории И.Н. Анисимовой было показано, что у большинства изученных форм (производных межвидовых
206
гибридов) присутствует маркер HRG02. Все это может служить косвенным подтверждением факта интрогрессии фрагмента генома дикорастущего подсолнечника, несущего ген Rf1. Согласно ранее полученным
данным, линии, выделенные из межвидовых гибридов, являются восстановителями фертильности пыльцы для ЦМС РЕТ1. Они ветвисты
и могут быть оптимальными отцовскими формами при производстве
гибридных семян (Анисимова и др., 2009; Гаврилова, Рожкова, 2005).
Таким образом, молекулярно-генетическими методами установлено, что однолетние и многолетние виды подсолнечника могут быть
донорами гена Rf1, контролирующего восстановление фертильности
пыльцы. Следовательно, эти виды могут быть использованы для создания новых линий-восстановителей фертильности пыльцы ЦМС РЕТ1
и последующего получения нового селекционного материала. Однако
среди различных популяций однолетних видов оба маркера гена Rf1
в большинстве случаев представлены неоднородно, а среди многолетних – один из них (HRG01/OPК13). В связи с этим на этапе подбора
исходных форм для получения новых восстановителей фертильности
пыльцы необходима индивидуальная оценка растений на наличие этих
маркеров.
3.4. Кодоминантные маркеры гена Rf1
культурного подсолнечника
Описанные в литературе SCAR-маркеры гена Rf1 подсолнечника
демонстрируют доминантный тип наследования. Однако известно,
что кодоминантные маркеры, позволяющие определять аллельные варианты генов, ассоциированные с хозяйственно ценными признаками,
более информативны для маркер-вспомогательной селекции (Irish et
al., 2008).
В связи с этим была проведена амплификация кодоминантных маркеров гена Rf1 – восстановителя фертильности пыльцы ЦМС PET1
и определен их нуклеотидный полиморфизм.
Кодоминантные маркеры гена Rf1 определяли у родительских линий
культурного подсолнечника с известными генотипами, установленными гибридологическим анализом: доминантные гомозиготы (Rf1Rf1),
рецессивные гомозиготы (rf1rf1), и их гибридов F1 (Rf1rf1) (табл. 3.14).
Для подтверждения локализации в генотипе исследуемых форм доминантного гена Rf1 проведен молекулярно-генетический анализ геном207
ной ДНК на наличие локуса HRG01, сцепленного (0,8 сМ) с геном Rf1
методом энзиматической амплификации с SCAR-праймером OPK13.
Таблица 3.14
Характеристика родительских линий и гибридов F1 подсолнечника
Линия
Генотип
Фенотип
Н 981 А
Н 026 А
IS 1544 А
Восстановители J-8/RT 991 RF
фертильности
J-8/ХФ 4917 RF
пыльцы
ВД 114 RF
Н 981 А × J-8/RT 991 RF
Гибриды F1
Н 026 А × J-8/ХФ 4917 RF
IS 1544 А × ВД 114 RF
rf1rf1
rf1rf1
rf1rf1
Rf1Rf1
Rf1Rf1
Rf1Rf1
Rf1rf1
Rf1rf1
Rf1rf1
стерильная
стерильная
стерильная
фертильная
фертильная
фертильная
фертильный
фертильный
фертильный
ЦМС
Маркер
HRG01
–
–
–
+
+
+
+
+
+
Результаты ПЦР-анализа свидетельствуют, что маркер присутствует
у гомозиготных (Rf1Rf1) линий-восстановителей фертильности пыльцы – J-8/RT 991, J-8/ХФ 4917, ВД114 и гетерозиготных (Rf1rf1) гибридов – H 981A x J-8/RT 991, H 026A x J-8/ХФ 4917 и IS 1544A x ВД114.
У растений ЦМС-линий (rf1rf1) – Н 981A, H 026A, IS 1544A данный
маркер не выявлен. В случае определения SCAR-маркера на электрофореграмме четко визуализируется фрагмент около 450 п.н, что соответствует размеру искомого локуса (рис. 3.50).
Эти результаты полностью согласуются с данными гибридологического анализа, что служит подтверждением идентификационной ценности маркера HRG01 для маркер-вспомогательной селекции подсолнечника при создании родительских линий системы – ЦМС-Rf PET1.
Необходимо отметить, что амплифицируемый (температура отжига праймеров 58 °С) фрагмент является доминантным маркером,
позволяющим проводить сравнительный анализ исследуемых генотипов по принципу наличие-отсутствие (Horn et al., 2003). Однако известно, что SCAR маркеры, полученные на основании нуклеотидной
последовательности доминантных RAPD-фрагментов, могут быть
кодоминантны в случаях, когда сайты связывания праймеров у аллельных локусов отличаются инсерциями или делециями. Методические
особенности создания SCAR-праймеров подробно описаны в работе
208
Рис. 3.50. Электрофореграмма продуктов амплификации локуса HRG01,
сцепленного с геном Rf1 при температура отжига праймеров 58 °С:
1, 2, 6 – ЦМС-линии (rf1rf1): Н 981 А, Н 026 А и IS 1544 А, сответственно;
3, 4, 5 – линии-восстановители фертильности пыльцы (Rf1Rf1):
J-8/RT 991, J-8/ХФ 4917 и BД114, соответственно; 7, 8, 9 – гибриды F1
(Rf1rf1): H 981A x J-8/RT 991, H 026A x J-8/ХФ 4917 и IS 1544A x BД114,
соответственно; М – маркер (100 – 1000 bp)
(Ковеза, Гостимский, 2005). Эти же авторы показали, что некоторые
SCAR-маркеры генома гороха в зависимости от температуры отжига демонстрируют полиморфизм нуклеотидной последовательности
сайтов прайминга. Следовательно, единичные некомплементарные
нуклеотиды в системе праймер-матрица дестабилизируют начальные
этапы амплификации и уменьшают выход неспецифического продукта ПЦР, а температура отжига (Ta) праймеров как один из важнейших
параметров высокоспецифичной ПЦР-системы оказывает оптимизирующий (по специфичности) эффект. Таким образом, если различия
сайтов прайминга представлены однонуклеотидным полиморфизмом,
то, изменяя Ta, можно подобрать условия, при которых будет амплифицироваться и другой аллельный локус.
В результате снижения температуры отжига праймеров OPK13
с 58 до 54 °С (уменьшена специфичность ПЦР) в реакции амплификации геномной ДНК гомозиготных образцов (Rf1Rf1 и rf1rf1) синтезировались различающиеся по подвижности в агарозном геле фрагменты
(рис. 3.51).
Так, у всех трех ЦМС-линий (rf1rf1) получен единичный фрагмент
размером около 350 п.н. Однако в генотипах двух отцовских линий
209
(Rf1Rf1) – J-8/ХФ 4917 RF и ВД 114 RF определен один маркерный
фрагмент размером около 450 п.н., а у линии J-8/RT 991 RF – два фрагмента с размерами около 450 и 350 п.н. У всех гибридных растений
(Rf1rf1) инициируется амплификация также этих фрагментов (450
и 350 п.н.) (рис. 3.51).
Рис. 3.51. Электрофореграмма продуктов амплификации локуса HRG01
сцепленного с геном Rf1 при температуре отжига праймеров 54 °С
1, 2, 6 – ЦМС-линии (rf1rf1): Н 981 А, Н 026 А и IS 1544 А, сответственно;
3, 4, 5 – линии-восстановители фертильности пыльцы (Rf1Rf1): J-8/
RT 991, J-8/ХФ 4917 и BД114, соответственно; 7, 8, 9 – гибриды F1
(Rf1rf1): H 981A x J-8/RT 991, H 026A x J-8/ХФ 4917 и IS 1544A x BД114,
соответственно
Это означает, что снижение температуры отжига праймеров OPK13
вызвало амплификацию кодоминантных маркеров. Однако амплификация одновременно двух фрагментов у одной из трех линий-восстановителей фертильности пыльцы указывает, что сайты отжига SCARпраймеров при Ta = 54 °С полиморфны и, по-видимому, различаются
точковыми мутациями.
Известно, что однонуклеотидные перестройки (ОНП, single nucleotide polymorphisms, SNP) – лежат в основе возникновения новых аллелей. Высокая плотность и эволюционная стабильность ОНП предполагает их эффективность для молекулярно-генетического маркирования
признаков (Gupta et al., 2001). В этой связи с целью локализации полиморфных сайтов была исследована нуклеотидная последовательность
фрагментов геномной ДНК гомозиготных по гену Rf1 линий, ампли210
фицированных при различных температурах отжига праймеров (58 °С
(Rf1Rf1) и 54 °С (rf1rf1)) с помощью прямого секвенирования продуктов ПЦР, и выявлены гомологичные позиции сравниваемых последовательностей. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей
кодоминантных маркеров гена Rf1 гомозиготных линий подсолнечника по распределению полиморфных сайтов приведены в таблице 3.15.
Таблица 3.15
Полиморфные сайты кодоминантных маркеров гена Rf1
G
G
G
A
A
A
A
A
A
C
C
C
G
G
G
T
T
T
G
G
G
A
A
A
332
C
C
C
T
T
T
291
C
C
G
C
C
C
328
A
A
A
G
G
G
277
A
A
A
G
G
G
230
G
G
G
A
A
A
242
A
A
A
T
T
T
229
G
G
G
A
A
A
209
T
T
T
C
C
C
223
A
A
A
G
G
G
199
T
T
T
A
A
A
208
A
A
A
T
T
T
196
173
T
T
T
C
C
C
178
170
T
T
T
G
G
G
183
169
T
T
T
C
C
C
167
A
A
A
C
C
C
128
C
C
C
T
T
T
153
Т
Т
T
A
A
A
110
109
1
2
3
4
5
6
114
108
Позиции нуклеотидов
№
C
C
C
A
A
A
G
G
G
G
G
G
A
A
A
Примечание: 1, 2, 3 – нуклеотидная последовательность SCAR-маркера гена Rf1,
амплифицированного на геномной ДНК ЦМС-линий (температура отжига праймеров 54 °С) – Н 981 А, Н 026 А и IS 1544 А, соответственно; 4, 5, 6 – нуклеотидная
последовательность SCAR-маркера гена Rf1, амплифицированного на геномной
ДНК линий восстановителей фертильности пыльцы (температура отжига праймеров 58 °С) – J-8/RT 991 RF, J-8/ХФ 4917 RF и ВД 114 RF, соответственно.
Прямое секвенирование фрагментов амплификации локуса HRG01
трех доминантных (температура отжига праймеров 58 °С) и трех рецессивных (температура отжига праймеров 54 °С) гомозиготных по гену
Rf1 образцов позволило определить последовательности нуклеотидов
участка размером 354 и 246 п.н., соответственно. Сравнительный анализ выровненных по длине всех шести нуклеотидных последовательностей показал, что степень сходства между маркерами одного аллельного
варианта составляет 99,6 – 100 %, а между различными – 90,7 – 91,1 %.
Выравнивание шести последовательностей нуклеотидов на участке размером 246 п.н. (со 108-го по 354-го сайт) позволило определить
223 гомологичных и 24 полиморфных позиции (табл. 3.15). В основном нуклеотидные замены были определены при сравнении сиквенсов
двух различных локусов. Исключением является 209-я позиция доминантного аллельного варианта, в которой обнаружена трансверсия пиримидинового основания на пуриновое (С × G). В остальных случаях
211
различия обусловлены следующими заменами: A/G (T/C) – 14 (61 %),
A/C (T/G) – 4 (17 %), A/T – 4 (17 %) и одна (4 %) – делеция.
Рассмотренный выше однонуклеотидный полиморфизм представляет практический интерес для разработки простых и эффективных
тест-систем на основе ПЦР, позволяющих выявлять гомозиготные
и гетерозиготные точковые мутации, ассоциированные с изучаемым
признаком.
Таким образом, путем снижения температуры отжига SCARпраймеров OPK13, фланкирующих локус HRG01, сцепленный с геном Rf1, инициирована амплификация двух кодоминантных маркеров.
При этом один – размером около 450 п.н. ассоциирован с доминантным
фенотипом восстановления фертильности пыльцы, а другой, размером
около 350 п.н. – с рецессивным. Исследование последовательности нуклеотидов этих маркеров позволили определить полиморфные сайты
сравниваемых участков, которые могут служить основой для разработки специфичной ПЦР тест-системы, позволяющей идентифицировать аллельные варианты гена-восстановителя фертильности пыльцы
Rf1 в целях ее использования для маркер-вспомогательной селекции
подсолнечника.
3.5. Новые системы ЦМС-Rf
В настоящее время уже не вызывает сомнений правильность выбранного гетерозисного направления в селекции подсолнечника
(Hladni et al., 2007; Skoric et al., 2007). Первые гетерозисные гибриды
были созданы на основе ядерной мужской стерильности, но настоящие
перспективы гетерозисной селекции селекционеры оценили после открытия ЦМС, генов автофертильности и эффекта восстановления
фертильности пыльцы.
Для получения перспективных гетерозисных гибридов подсолнечника большое значение имеет оценка родительских линий на общую
(ОКС) и специфическую (СКС) комбинационную способность по урожайности и масличности семян. С целью определения ОКС и СКС самоопыленных линий проводят скрещивания с соответствующими тестерами, которых, как правило, должно быть не менее двух (Биология,
селекция и возделывание подсолнечника, 1991; Волотович, 2005;
Sawargaonkar, Ghodke, 2008; Volotovich et al., 2008).
212
При характеристике линий учитывается их урожайность и масличность семян, устойчивость к болезням, длина вегетационного периода, совпадение фазы цветения родительских линий и высота растения.
Важным признаком является урожайность семян материнских форм,
поскольку именно на их основе формируются гибридные семена.
Отцовские формы у гибридов должны быть в высокой степени гомозиготными по всем генам, в том числе и по генам-восстановителям
фертильности пыльцы, и желательно ветвистыми. Последний признак
увеличивает период цветения и пыльцевую продуктивность. Но в такой схеме необходимо использовать рецессивные гены, контролирующие ветвление, так как они не должны фенотипически проявляться
у гибридов. Для селекционных целей используют линии с высокой
степенью автофертильности, однако при этом линия ЦМС и линиявосстановитель фертильности должны обладать хорошей перекрестной
совместимостью.
Одним из необходимых условий создания «хорошего» гибрида является гомозиготность родительских форм. Принято считать, что для
получения достаточного уровня гомозиготности необходимо 8–10 поколений инцухта, а для создания стерильного аналога 6–7 поколений
беккроссирования.
Следует напомнить, что все мировое гибридное семеноводство основано только на одном источнике ЦМС – РЕТ1 (Sunflower technology
and production, 1997). Это приводит к повсеместному распространению гибридов подсолнечника, несущих унифицированный тип цитоплазмы. Генетическая однородность возделываемых гибридов делает
их чрезвычайно уязвимыми к новым вирулентным расам патогенов
(Miller, 1996). Примером этому служит поражение южным гельминтоспориозом гибридов кукурузы на базе техасского типа ЦМС (Tatum,
1971; Levings, 1990). Данная проблема в свое время получила широкий
размах и принесла огромный экономический ущерб аграрной отрасли
в разных странах.
Для предотвращения таких отрицательных последствий у подсолнечника представители аграрной науки ведут активный поиск новых
источников ЦМС. Внедрение в производство гибридов различных типов цитоплазмона позволит повысить разнообразие исходного материала и избежать проблем, которые могут возникнуть при использовании
единственной цитоплазмы РЕТ1 (Чепурная, Першин, 2000).
213
214
РЕТ1
RIG0
РЕТ1
RIG0
РЕТ1
RIG0
РЕТ1
RIG0
РЕТ1
RIG0
РЕТ1
RIG0
РЕТ1
RIG0
РЕТ1
RIG0
ВИР 109 ×
RIL 130
ВИР 109 ×
ВИР 365
ВИР 151 ×
ВИР 365
199,8±0,9*
189,3±1,4
186,6±2,8*
196,7±2,4
166,8±2,7
167,9±3,6
161,1±2,5
165,7±3,0
181,6±2,3
179,1±2,9
173,0±2,1
177,5±1,5
162,9±2,0
162,9±1,7
146,4±2,6
143,3±2,8
Высота
растения, см
19,8±0,8
17,7±0,9
18,9±1,1
17,8±0,8
17,4±0,7
18,9±0,7
16,5±0,9
17,9±1,0
Диаметр
корзинки, см
34,8±0,3
35,0±0,8
18,8±0,4
19,6±0,6
36,7±0,9 17,1±0,6*
37,8±1,1 14,6±0,4
30,9±0,4* 17,4±0,6
32,4±0,5 17,5±0,6
27,8±0,6* 16,3±0,3*
25,8±0,5 13,8±0,5
40,7±0,9
40,1±0,9
41,7±1,0
41,7±0,7
36,3±0,8
37,1±1,1
28,3±0,4
29,8±0,5
Количество
листьев,
шт.
Период всходы-цветение/
созревание,
сутки
2007
54/95
54/95
53/94
53/95
50/87
50/87
51/88
51/88
2008
60/107
60/106
59/101
59/100
59/99
59/99
2009
55/101
53/102
25,1±0,5*
28,1±0,9
28,7±1,4
26,3±1,1
24,6±1,1*
27,6±0,7
29,7±1,1
29,1±0,9
23,3±1,1
22,3±1,7
20,5±1,2
18,4±0,8
20,3±1,1
21,3±1,1
19,4±1,6
20,6±1,1
Ширина
листа,
см
24,3±0,3*
30,3±0,8
26,2±0,9
24,8±0,8
23,6±1,1*
26,7±0,7
26,4±0,7
26,1±0,8
22,4±0,9
22,3±1,2
19,3±0,9
17,4±0,6
19,2±0,9
20,2±0,7
19,6±1,2
20,1±0,9
Длина
листа, см
37,5±0,7
–
37,9±1,3
39,4±0,6
33,2±0,3*
37,8±0,8
31,2±0,8*
35,3±0,7
34,0±0,5
33,1±0,3
35,6±1,5
35,0±0,9
33,2±1,6
31,5±1,4
30,8±0,5
32,0±0,7
Урожайность, ц/га
Примечание: * – достоверные отличия при Р < 0,05 по сравнению с гибридом-аналогом на основе ЦМС RIG0.
ВИР 151 ×
ВИР 160
ВИР 151 ×
ВИР 637
ВИР 151 ×
ВИР 160
ВИР 151 ×
ВИР 637
ВИР 109 ×
ВИР 365
Аналог
Гибрид
100
0
100
0
0
0
0
0
100
0
100
0
0
0
0
0
Фертильные растения, %
Таблица 3.16
Морфофизиологические признаки гибридов подсолнечника на основе разных типов ЦМС (КОС ВИР, 2007–2009)
Сравнительный анализ показателей морфофизиологических признаков гибридов-аналогов, полученных на Кубанской опытной станции ВНИИР им. Н.И. Вавилова на основе двух типов ЦМС РЕТ1
и RIG0, показал, что в 2007 году аналогичные гибриды по исследованным признакам достоверно не отличались друг от друга, за исключением наличия пыльцы (см. табл. 3.16).
Гибридные комбинации ВИР 109 × RIL 130 и ВИР 109 × ВИР 365
на основе ЦМС типа РЕТ1 оказались фертильными, а на основе RIG0 –
полностью стерильными. Гибриды, полученные в результате скрещивания обоих ЦМС аналогов линии ВИР 151 с ВИР 637 и ВИР 160, пыльцы не продуцировали. По высоте растения гибриды ВИР 109 × RIL 130,
ВИР 109 × ВИР 365 и ВИР 151 × ВИР 637 относятся к среднерослым,
а ВИР 151 × ВИР 160 – к средненизким. По срокам созревания все гибриды были отнесены к группе раннеспелых. Наибольшую урожайность продемонстрировали оба аналога гибрида ВИР 109 × ВИР 365
(35,0–35,6 ц/га).
В 2008 г. между гибридами-аналогами различных комбинаций скрещивания обнаружены различия по нескольким признакам. В частности, гибрид ВИР 109 × ВИР 365 на основе ЦМС типа RIG0 отличался
от своего аналога на основе РЕТ1 большей высотой растений (на 5,4 %)
и меньшим диаметром корзинки (на 17,1 %). Также диаметр корзинки и количество листьев на стебле у гибрида ВИР 151 RIG0 × ВИР 160
оказались меньше, чем у РЕТ1 аналога на 18,1 и 7,8 %, соответственно.
Лист серединной формации у гибрида ВИР 151 × ВИР 637 на основе
ЦМС типа RIG0 был больше листа РЕТ1 аналога на 12,2 % по ширине
и на 13,1 % по длине. Гибриды ВИР 151 × ВИР 637 и ВИР 151 × ВИР 160
митотипом RIG0 по урожайности растений превзошли РЕТ1-гибриды
на 13,9 и 13,1 %, соответственно. По срокам вегетации гибриды на основе ЦМС RIG0 не уступают своим аналогам на основе ЦМС РЕТ1.
Из всех гибридных комбинаций, высеянных в 2008 г., продуцировала
пыльцу только ВИР 109 × ВИР 365 на основе ЦМС типа РЕТ1, фертильность пыльцы составила 99,1 ± 0,3 %. По высоте растения все гибриды относились к среднерослым, а по продолжительности периода
всходы-созревание – к среднеспелым.
Исходя из вышеизложенного, можно отметить, что влияние цитоплазмонов на проявление большинства изученных морфофизиологических
признаков находится в зависимости от условий внешней среды.
215
Исключение составил признак наличие/отсутствие пыльцы, имеющий
одинаковое выражение у всех гибридов, как в 2007, так и в 2008 годах.
По срокам вегетации гибриды-аналоги в первый и второй год изучения
не отличались между собой, хотя в 2008 г. общая продолжительность
вегетационного периода у всех гибридов была больше.
В 2009 г. была высеяна новая гибридная комбинация
ВИР 151 × ВИР 365 и отмечены следующие достоверные отличия
между ее аналогами: у гибрида на основе ЦМС РЕТ1 высота растений
была больше по сравнению с гибридом на основе ЦМС RIG0 на 5,5 %,
но размеры листовой пластинки были меньше на 12,0 % по ширине и на
24,7 % по длине. По срокам вегетации гибриды-аналоги практически
не отличались друг от друга и были отнесены к группе среднеспелых.
Урожайность гибрида на основе ЦМС РЕТ1 была высокой – 37,5 ц/
га, урожайность гибрида на основе RIG0 не определяли. Комбинация
ВИР 151 РЕТ1 × ВИР 365 была фертильной по пыльце (96,5 ± 1,2 %),
а ВИР 151 RIG0 × ВИР 365 – стерильной.
Все
исследованные
гибриды-аналоги
демонстрировали
гипотетический гетерозис (ГРС) по высоте растений (табл. 3.17).
Истинный гетерозис (ГРЛ) по этому признаку не был обнаружен
только у гибрида ВИР 109 × ВИР 365 на основе ЦМС РЕТ1 в 2008 году.
Степень гетерозиса гибридов ВИР 109 × RIL 130, ВИР 151 × ВИР 637
и ВИР 151 × ВИР 160 на основе ЦМС RIG0 была несколько выше,
чем у их аналогов на основе РЕТ1. Гибрид ВИР 109 × ВИР 365 на основе
ЦМС RIG0 отличался более высокой степенью гетерозиса по высоте
растений относительно родительской средней и лучшего родителя
от своего аналога на основе ЦМС РЕТ1, как 2007, так и в 2008 годах.
Наибольшую степень ГРС продемонстрировал в 2007 г. у гибрида
ВИР 109 × RIL 130 с цитоплазмой РЕТ1 – 64,0 %, RIG0 – 59,5 %, степень
ГРЛ также была наибольшей у аналогов данного гибрида (РЕТ1 –
57,2 %, RIG0 – 51,0 %). Наименьшую степень ГРС продемонстрировал
гибрид ВИР 151 × ВИР 160 (RIG0 – 23,4 %, РЕТ1 – 27,7 %),
ГРЛ был наименьшим у комбинации ВИР 109 × ВИР 365 на основе
ЦМС РЕТ1 (16,3 %). В 2008 г. наибольший ГРС отмечен у комбинации
ВИР 151 × ВИР 637 (RIG0 – 29,8 %; РЕТ1 – 31,5 %), наименьший –
ВИР 109 × ВИР 365 (RIG0 – 14,1 %; РЕТ1 – 10,3 %). Самая большая
степень истинного гетерозиса по высоте растений отмечена у гибрида
ВИР 151 × ВИР 637 (RIG0 – 16,5 %; РЕТ1 – 20,1 %); наименьшая у –
216
ВИР 109 × ВИР 365 (RIG0 – 1,3 %; РЕТ1 – -3,9 %). Степень гетерозиса
у аналогов гибрида ВИР 151 × ВИР 365, исследованного в 2009 г., была
высокой: ГРС – более 30 %, ГРЛ – более 20 %.
Таблица 3.17
Гетерозис гибридов подсолнечника на основе двух типов ЦМС
(КОС ВИР, 2007–2009)
Гибрид
ВИР 109 × RIL 130
ВИР 109 × ВИР 365
ВИР 151 × ВИР 637
ВИР 151 × ВИР 160
ВИР 109 × ВИР 365
ВИР 151 × ВИР 637
ВИР 151 × ВИР 160
ВИР 151 × ВИР 365
Показатель гетерозиса по высоте растений, %
RIG0
РET1
ГРС
ГРЛ
ГРС
ГРЛ
2007
59,5
51,0
64,0
57,2
32,8
19,3
30,9
16,3
53,2
35,1
55,4
38,5
23,4
18,8
27,7
24,5
2008
14,1
1,3
10,3
-3,9
29,8
16,5
31,5
20,1
23,2
15,0
22,1
16,0
2009
20,3
36,2
27,0
31,7
Примечание: ГРС – гетерозис относительно родительской средней; ГРЛ – гетерозис
относительно лучшего родителя
Таким образом, несмотря на стерильность гибридов на основе
ЦМС RIG0, по комплексу хозяйственно ценных признаков они не
уступают гибридам с цитоплазмоном РЕТ1, а по многим показателям,
в том числе и по урожайности, превосходят их. Следовательно,
актуален поиск восстановителей для исследованного нами нового типа
ЦМС с целью получения мужских фертильных гибридов, что позволит
в дальнейшем использовать ЦМС RIG0 для коммерческого
производства семян подсолнечника наряду с классическим РЕТ1.
Литература
Анащенко А.В. Методические указания по изучению мировой коллекции масличных культур // Подсолнечник. Л.: ВИР, 1976. 38 с.
Анащенко А.В., Дука М.В. Изучение генетической системы ЦМС – Rf
у подсолнечника (Helianthus annuus L.). Сообщение II. Восстановление
217
мужской фертильности у гибридов на основе ЦМСp // Генетика. 1985а.
Т. 21. № 12. С. 1999–2004.
Анащенко А.В., Дука М.В. Изучение генетической системы ЦМС – Rf
у подсолнечника (Helianthus annuus L.). Сообщение III. Восстановление
мужской фертильности у гибридов на основе ЦМСI // Генетика. 1985б.
Т. 21. № 12. С. 2005–2010.
Анащенко А.В., Кукош М.В. Изучение генетической системы
ЦМС – Rf у подсолнечника (Helianthus annuus L.). Сообщение I.
Восстановительная способность образцов подсолнечника в разных типах ЦМС // Генетика. 1985. Т. 21. № 5. С. 803–808.
Анисимова И.Н., Гаврилова В.А., Рожкова В.Т. и др. Молекулярные
маркеры в идентификации генов восстановления фертильности пыльцы у подсолнечника // Доклады РАСХН. 2009. № 6. С. 6–9.
Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г. и др. Справочник по ботанической микротехнике. М.: Изд-во Московского ун-та, 2004. 312 с.
Биология, селекция и возделывание подсолнечника / Под ред.
В.М. Пенчукова. М.: Агропромиздат, 1991. 282 с.
Волотович А.А. Комбинационная способность и гетеро зис у подсолнечника (Helianthus annuus L.) // Вес. Нац. акад. навук Беларусi. Сер.
бiял. навук. 2005. № 2. С. 47–50.
Гаврилова В.А. Генетическая изменчивость видов рода Heliantus L.
и возможность ее использования в селекции: Дис. … д-ра биол. наук.
СПб., 2003. 300 с.
Гаврилова В.А., Анисимова И.Н. Генетика культурных растений.
Подсолнечник. СПб.: Изд-во ВИР, 2003. 210 с.
Гаврилова В.А., Рожкова В.Т. Доноры восстановления фертильности пыльцы линий ЦМС подсолнечника для гетерозисной селекции
// Идентифицированный генофонд растений и селекция / Под ред.
Б.В. Ригина, Е.И. Гаевской. СПб.: ВИР, 2005. С. 377–389.
Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999.
460 с.
Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл. Минск:
Тэхналогия, 2003. 494 с.
Иванов М.К., Дымшиц Г.М. Цитоплазматическая мужская стерильность и восстановление фертильности пыльцы у высших растений //
Генетика. 2007. Т. 43. № 4. С. 451–468.
218
Ковеза О.В., Гостимский С.А. Создание и изучение SCAR-маркеров
у гороха (Pisum sativum L.) // Генетика. 2005. Т. 41. № 11. С. 1522–1530.
Маркин Н.В., Тихобаева В.Е., Тихонова М.А. и др. Полиморфизм геномной ДНК однолетних видов подсолнечника // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. 2010. Вып. 2 (143).
С. 3–7.
Маркин Н.В., Тихонова М.А., Анисимова И.Н. и др. SCAR-маркер гена
Rf1 подсолнечника у линий восстановителей фертильности пыльцы
растений с различными типами ЦМС // Масличные культуры. 2009.
Вып. 2 (141). С. 3–5.
Попов В.Н., Кириченко В.В. Мужская стерильность подсолнечника. Теоретические и прикладные аспекты // Вiсник Харкiвського
нацiонального аграрного унiверситету. 2007. Вып. 2. № 11. С. 18–33.
Ростова Н.С., Крылова Е.Г. Строение листа однолетнего подсолнечника, его изменчивость и детерминированность // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1987. Т. 113. С. 34–40.
Симоненко В.К. Особенности развития пыльника и микроспор у фертильных форм и ЦМС-линии подсолнечника // Репродуктивный процесс и урожайность полевых культур. Сборник научных трудов ВСГИ.
1981. С. 83–90.
Симоненко В.К. Цитоэмбриологические причины мужской стерильности подсолнечника // Научно-технический бюллетень Всесоюзного
селекционно-генетического института. 1975. Вып. 24. С. 24–30.
Симоненко В.К., Карпович Е.В. Цитологическое проявление различных типов мужской стерильности у подсолнечника // Научнотехнический бюллетень Всесоюзного селекционно-генетического института. 1978. Вып. 31. С. 32–38.
Усатов А.В., Тихонова М.А., Гаврилова В.А. и др. Получение гетерозисных гибридов на основе новых ЦМС линий подсолнечника //
Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК.
2010а. Вып. 1 (142–143). С. 19–23.
Усатов А.В., Федоренко Г.М., Тихонова М.А. и др. Морфологические
особенности микроспорогенеза у фертильного и стерильного –
ЦМС РЕТ1 аналогов инбредных линий подсолнечника // Масличные
культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. 2010б.
Вып. 2 (143). С. 8–12.
219
Хантургаев А.Г., Вампилов С.С., Ширеротова В.Г. и др. Методические
указания по выполнению лабораторных работ по курсу «Технология
получения рапсового и облепихового масел». Улан-Удэ: ИПЦ ВСГТУ,
2006. 34 с.
Чепурная А.Л., Першин А.Ф. Мобилизация новых типов цитоплазматической мужской стерильности в селекции подсолнечника // Наук.техн. бюл. Ін-ту олійних культур. 2000. Вып. 5. С. 41–43.
Эльконин Л.А., Тырнов В.С. Генетический контроль ЦМС растений,
состояние проблемы и современные подходы для ее исследования //
Генетика. 2000. Т. 36. № 4. С. 437–450.
Ardila F., Echeverria M.M., Rios R., Rodriguez R.H. Structural features of
a cytoplasmic male sterility source from Helianthus resinosus, CMS RES1 //
J. Plant Breed. Crop Sci. 2010. Vol. 2. № 7. Р. 168–172.
Baldini M., Megale P., Benvenuti A. Stability analysis, cytoplasmatic effects and possible utilization on three male sterility sources in sunflower
(Helianthus) // Ann. Bot. 1991. Vol. 49. P. 27–36.
Balk J., Leaver C.J. The PET1-CMS mitochondrial mutation in sunflower
is associated with premature programmed cell death and cytochrome C release // Plant Cell. 2001. Vol. 13. P. 1803–1818.
Berry S.T., Leon A.J., Hanfrey C.C. et al. Molecular marker analysis of
Helianthus annuus L. 2. Construction of a RFLP linkage map for cultivated
sunflower // Theor. Appl. Genet. 1995. Vol. 91. P. 195–199.
Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polimorphisms //
Am. J. Hum. Genet. 1980. Vol. 32. P. 314–331.
Budar F., Pelletier G. Male sterility in plants: occurrence, determinism significance and use // C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie / Life Sciences.
2001. Vol. 324. P. 543–550.
de la Canal L., Crouzillat D., Quetier F., Ledoigt G. A transcriptional alteration on the atp9 gene is associated with a sunflower male-sterile cytoplasm //
Theor. Appl. Genet. 2001. Vol. 102. P. 1185–1189.
Carlsson J., Leino M., Sohlberg J. et al. Mitochondrial regulation of flower
development // Mitochondrion. 2008. Vol. 8. P. 74–86.
Chase C.D. Cytoplasmic male sterility: a window to the world of plant mitochondrial–nuclear interactions // TRENDS in Genetics. 2006. Vol. 23.
№ 2. Р. 81–90.
220
Christov M. New type of cytoplasmic male sterility in sunflower // Helia.
2003. Vol. 20. № 38. Р. 51–58.
Christov M. Ways of production of new CMS sources in sunflower //
Biotechnology and Biotechnological Equipment. 1999. Vol. 1. Р. 25–32.
Christov M., Shindrova P., Encheva V. et al. Development of fertility restorer lines originating from interspecific hybrids of genus Helianthus // Helia.
1996. Vol. 19. № 24. Р. 65–72.
Crouzillat D., de la Canal L., Perrault A. et al. Cytoplasmic male sterility
in sunflower: Comparison of molecular biology and genetics studies // Plant
Mol. Biol. 1991. Vol. 16. P. 415–426.
Descriptors for cultivated and wild sunflower IBPGR / Ed. by D. Scoric.
Roma, 1985. 34 p.
Dominguez J., Fick G. Fertility restoration of male-sterile cytoplasm in
wild sunflower // Crop Sci. 1975. Vol. 15. P. 724–726.
Fujii S., Toriyama K. Genome barriers between nuclei and mitochondria
exemplified by cytoplasmic male sterility // Plant Cell Physiol. 2008. Vol. 49.
№ 10. Р. 1484–1494.
Gagliardi D., Leaver C.J. Polyadenylation accelerates the degradation of
the mitochondrial mRNA associated with cytoplasmic male sterility in sunflower // EMBO J. 1999. Vol. 18. № 13. Р. 3757–3766.
Gentzbittel L., Vear F., Zhang Y.X., Berville A. Development of a consensus
linkage RFLP map of cultivated sunflower (Helianthus annuus L.) // Theor.
Appl. Genet. 1995. Vol. 90. P. 1079–1086.
Gupta P.K., Roy J.K., Prasad M. Single nucleotide polymorphisms: a new
paradigm for molecular marker technology and DNA polymorphism detection with emphasis on their use in plants // Curr. Sci. 2001. Vol. 80. P. 524–535.
Hladni N., Skoric D., Kraljevic-Balalic M. et al. Heterosis for agronomically important traits in sunflower // Helia. 2007. Vol. 30. № 47. P. 191–198.
Horn R. Molecular diversity of male sterility inducing and male-fertile
cytoplasms in the genus Helianthus // Theor. Appl. Genet. 2002. Vol. 104.
P. 562–570.
Horn R. Recombination: Cytoplasmic male sterility and fertility restoration in higher plants // Progress in Botany. 2006. Vol. 67. P. 31–52.
Horn R., Hustedt J.E.G., Horstmeyer A. et al. The CMS-associated 16 kDa
protein encoded by orfH522 is also present in other male sterile cytoplasms of
sunflower // Plant. Mol. Biol. 1996. Vol. 30. P. 523–538.
Horn R., Friedt W. CMS sources in sunflower: different origin but same
mechanism? // Theor. Appl. Genet. 1999. Vol. 98. P. 195–201.
221
Horn R.A, Kohler R.H., Zetsche K. Mitochondrial 16 kDa protein is associated with cytoplasmic male sterility in sunflower // Plant Mol. Biol. 1991.
Vol. 7. P. 29–36.
Horn R., Kusterer B., Lazarescu E. et al. Molecular diversity of CMS
sources and fertility restoration in the genus Helianthus // Helia. 2002. Vol. 25.
№ 36. P. 29–40.
Horn R., Kusterer B., Lazarescu E. et al. Molecular mapping of the Rf1 gene
restoring pollen fertility in PET1 – based F1 hybrids in sunflower (Helianthus
annuus L.) // Theor. Appl. Genet. 2003. Vol. 106. P. 599–606.
Horner H.T. A comparative light- and electron-microscopic study of
microsporogenesis in male-fertile and cytoplasmic male-sterile sunflower
(Helianthus annuus) // Amer. J. Bot. 1977. Vol. 64. P. 747–759.
Iouras M., Vranceanu A.V., Stanciu D., Sorega I. Sunflower inbred lines
derived from interspecific hybrids // Helia. 2002. Vol. 25. № 36. Р. 59–64.
Irish B.M., Correll J.C., Feng C. Characterization of a resistance locus (Pfs1) to the spinach downy mildew pathogen (Peronospora farinose f. sp. spinaciae) and development of a molecular marker linked to Pfs-1 // Phytopathology.
2008. Vol. 98. № 8. P. 894–900.
Jan C.C. Cytoplasmic male sterility in two wild Helianthus annuus L.
accessions and their fertility restoration // Crop Science. 2000. Vol. 40.
P. 1535–1538.
Jan C.C., Zhang T.X., Miller J.F., Fick G.N. Inheritance of fertility restoration for two cytoplasmic male sterility sources of Helianthus pauciflorus
(rigidus) Nutt. // Crop Science. 2002. Vol. 42. P. 1873–1875.
Kinman M.L. New developments in the USDA and state experiment station sunflower breeding programs // Proc. 4th Int. Sunflower Conf. Memphis,
1970. P. 181–183.
Kohler R.H., Horn R., Lossl R.A., Zetsche K. Cytoplasmic male sterility in
sunflower is correlated with the co-transcription of a new open reading frame
with the atpA gene // Mol. Gen. Gen. 1991. Vol. 227. P. 369–376.
Kusterer B., Horn R., Friedt W. Molecular mapping of the fertility restoration locus Rf1 in sunflower and development of diagnostic markers for the
restorer gene // Euphytica. 2005. Vol. 143. P. 35–43.
Laveau J.H., Schneider C., Berville A. Microsporogenesis abortion in cytoplasmic male sterile plants from H. petiolaris or H. petiolaris fallax crossed by
sunflower (Helianthus annuus) // Annals of Botany. 1989. Vol. 64. P. 137–148.
222
Laver H.K., Reynolds S.J., Moneger F., Leaver S.J. Mitochondrial genome
organization and expression associated with cytoplasmic male sterility in sunflower // Plant J. 1991. Vol. 1. P. 185–193.
Leclerq P. Une sterilite cytoplasmique chez le tournesol // Ann. Amelior.
Plant. 1969. Vol. 19. S. 99–106.
Leclerq P. Etude de divers cas de sterilite male cytoplasmique chez le
tournesol // Agronomie. 1983. Vol. 3. S. 185–187.
Leclerq P. Identification de genes de fertilite sur cytoplasms sterilisants
chez le tournesol // Agronomie. 1984. Vol. 4. S. 573–576.
Lee S.J., Warmke H.E. Organelle size and number in fertile and
T-cytoplasmic male-sterile corn // Am. J. Bot. 1979. Vol. 66. P. 141–148.
Levings С.S. The Texas cytoplasm of maize: cytoplasmic male sterility and
disease susceptibility // Science. 1990. Vol. 250. № 4983. P. 942–947.
Marinkovic R., Skoric D., Dozet B., Jovanovic D. Effect of PET1 and ANN5
cytoplasms on some quantitative traits in sunflower lines and hybrids // Helia.
2000. Vol. 23. № 32. P. 73–86.
Miller J.F. Inheritance of restoration of H. petiolaris ssp. fallax (PEF-1)
cytoplasmic male sterility // Crop Science. 1996. Vol. 36. № 1. Р. 83–86.
Moneger F., Smart C.J., Leaver C.J. Nuclear restoration of cytoplasmic
male sterility in sunflower is associated with tissue-specific regulation of a
novel mitochondrial gene // EMBO J. 1994. Vol. 13. P. 8–17.
Nakai S., Noda D., Kondo M., Terachi T. High-level expression of a mitochondrial orf-522 gene from the male-sterile sunflower is lethal to Escherichia
coli // Breed. Sci. 1995. Vol. 45. № 2. P. 233–236.
Patil S.A., Gafoor A., Ravikumar R.L. Impact of cytoplasmic male sterile sources on seed yield and yield components in sunflower // Helia. 2003.
Vol. 26. № 38. P. 67–72.
Sabar M., Gagliardi D., Balk J., Leaver C.J. ORFB is a subunit of F1F0ATP synthase: insight into the basis of cytoplasmic male sterility in sunflower
// EMBO Rep. 2003. Vol. 4. P. 381–386.
Sawargaonkar S.L., Ghodke M.K. Heterosis in relation to combining ability in restorer lines in sunflower // Helia. 2008. Vol. 31. № 48. Р. 95–100.
Schnabel U., Engelmann U., Horn R. Development of markers for the use
of the PEF1 cytoplasm in sunflower hybrid breeding // Plant Breed. 2008.
Vol. 127. P. 587–591.
Serieys H. Identification, study and utilization in breeding programs of
new CMS sources // Helia. 1996. Vol. 19. P. 144–158.
223
Serieys H. Report on the past activities of the FAO Working Group
«Identification study and utilization in breeding programs of new CMS sources». Rome: FAO. 2002. P. 1–54.
Siculella L., Palmer J.D. Physical and gene organization of mitochondrial DNA in fertile and male sterile sunflower. CMS-associated alterations in
structure and transcription of the atpA gene // Nucl. Acids. Res. 1988. Vol. 16.
P. 3787–3799.
Skoric D., Jocic S., Hladni N., Vannozzi G.P. An analysis of heterotic potential for agronomically important traits in sunflower (Helianthus annuus L.)
// Helia. 2007. Vol. 30. № 46. Р. 55–74.
Smart C.J., Moneger F., Leaver C.J. Cell-specific regulation of gene expression in mitochondria during anther development in sunflower // The
Plant Cell. 1994. Vol. 6. P. 811–825.
Spassova M.M., Christov M., Bohorova N. et al. Molecular analysis of new
cytoplasmic male sterile genotype in sunflower // FEBS Lett. 1992. Vol. 242.
P. 156–163.
Sunflower technology and production / Ed. by A.A. Schneiter. Madison,
USA: Agronomy Society of America, 1997. 766 p.
Tatum L.A. The southern corn leaf blight epidemic // Science. 1971.
Vol. 171. P. 1113–1116.
Tavoljanskiy N.P., Chepurnaya A.L., Scherstyuk S.V., Tikhomirov V.T.
Development of sunflower sterile CMS analogues on the base of different cytoplasmic backgrounds // Helia. 2004. Vol. 27. № 40. P. 251–256.
Volotovich A.A., Silkova T.A., Fomchenko N.S. et al. Combining ability and
heterosis effects in sunflower of Byelorussian origin // Helia. 2008. Vol. 31.
№ 48. P. 111–118.
Yue B., Vick B.A., Cai X., Hu J. Genetic mapping for the Rf1 (fertility restoration) gene in sunflower (Helianthus annuus L.) by SSR and TRAP markers
// Plant Breeding. 2010. Vol. 129. № 1. P. 24–28.
224
Глава 4. ВЛИЯНИЕ КЛИМАТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
НА ФОРМИРОВАНИЕ МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ
ПРИЗНАКОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА
Подсолнечник – одна из основных масличных сельскохозяйственных культур. Доля подсолнечного масла в общем объеме производства растительных масел в мире составляет 8 %, а мировое потребление за последние 20 лет увеличилось более, чем на 1/3 (Кривошлыков,
2009). Высокая рентабельность подсолнечника в нашей стране относительно других сельскохозяйственных культур привела к нарушению севооборота и как следствие, к развитию патогенов и падению урожайности. Ростовская область, имея наибольший объем производства семян
подсолнечника в России – более 20 %, по урожайности в 2010 г. достигла только 10 ц/га, что существенно уступает показателям, достигнутым
еще в 1990 г. (см. рис. 4.1, а, б) (Лысоченко, 2008). Для сравнения: средняя урожайность в 2010 г. в Украине составила 15,9 ц/га, в Молдове –
16,7 ц/га, в Аргентине и странах ЕС – около 17 ц/га (АПК-информ
online). Таким образом, проблема повышения урожайности, валового
сбора семян с высоким технологическим качеством в настоящее время
вновь актуальна для этой культуры.
Погодные условия, оказывающие существенное влияние на рост
и развитие подсолнечника, в Ростовской области неустойчивы. Для нашего региона характерны частые засухи, резкие смены температуры.
В связи с этим исследование влияния климатических факторов на формирование селекционно-ценных признаков, а также сравнительный
анализ агроэкологической приспособленности сортов и гибридов этой
сельскохозяйственной культуры вызывают определенный интерес.
4.1. Анализ изменчивости селекционно-ценных
признаков у сортов и гибридов подсолнечника
Не вызывает сомнений, что гибрид или сорт как основа технологии
возделывания любой сельскохозяйственной культуры является результатом сложного взаимодействия генотип-среда, поскольку может реализовать свой продукционный потенциал и технологические свойства
только в конкретных условиях среды (Кильчевский, 2008). Создание
сорта включает не только получение и отбор новых комбинаций ядра
225
а
б
226
Рис. 4.1. Посевные площади и урожайность подсолнечника
Рис. 4.1. Посевные площади и урожайность подсолнечника
в СССР за 1981–1989 (а) и в Ростовской области за 1990–2010 гг (б) в Ростовской области за 1981–1989 (а) и 1990–2010 гг (б)
и цитоплазмы, но и поиск экологической ниши, в которой эти генотипы реализуют высокую продуктивность, физиологическую стабильность и качество продукции, как основной вектор селекции растений.
Селекционеры отбирают не генотипы как таковые, поскольку отбор,
в том числе и искусственный, непосредственно направлен на фенотипы, а изучают их нормы реакции в зависимости от абиотических и биотических факторов.
Материалом исследования служили растения подсолнечника 17 сортов и гибридов отечественной селекции, проходивших в 2010 г. конкурсную оценку на семи сортоиспытательных участках: Шолоховском,
Тарасовском, Ростовском, Целинском, Орловском, Азовском,
Тацинском, Инспектуре по Ростовской области ФГУ «Госсорткомиссии»
Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ (рис. 4.2).
Рис. 4.2. Географическое расположение сортоиспытательных участков:
1 – Шолоховский; 2 – Тарасовский; 3 – Ростовский; 4 – Целинский,
5 – Орловский; 6 – Азовский; 7 – Тацинский;
8 – Инспектуры по Ростовской области ФГУ «Госсорткомиссии»
Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ
227
Шолоховский госсортоучасток расположен в северной зоне области на южных черноземах. Банитет почв для подсолнечника –
37 баллов (Состояние и использование земельного фонда…, 1997).
Гидротермический коэффициент (ГТК) в течение вегетационного периода подсолнечника в 2010 г. – 0,31 (Селянинов, 1937).
Тарасовский госсортоучасток расположен в северо-западной зоне
области на южных черноземах. Банитет почв для подсолнечника –
39 баллов. ГТК в течение вегетационного периода подсолнечника
в 2010 г. – 0,63.
Ростовский госсортоучасток расположен в приазовской зоне области на южных черноземах. Банитет почв для подсолнечника – 52 балла.
ГТК в течение вегетационного периода подсолнечника в 2010 г. – 0,58.
Целинский госсортоучасток расположен в южной зоне области
на предкавказских черноземах. Банитет почв для подсолнечника –
60 баллов. ГТК в течение вегетационного периода подсолнечника
в 2010 г. – 0,69.
Орловский госсортоучасток расположен в юго-восточной зоне области на стыке двух почвенных зон – южных черноземов и темно-каштановых почв на лёссовидных породах. Банитет почв для подсолнечника – 53 балла. ГТК в течение вегетационного периода подсолнечника
в 2010 г. – 0,67.
Азовский госсортоучасток расположен в приазовской зоне области
на южных черноземах. Банитет почв для подсолнечника – 42 балла.
ГТК в течение вегетационного периода подсолнечника в 2010 г. – 0,51.
Тацинский госсортоучасток расположен в северо-восточной зоне
области на южных черноземах. Банитет почв для подсолнечника –
37 баллов. ГТК в течение вегетационного периода подсолнечника
в 2010 г. – 0,33.
Конкурсное сортоиспытание проводили на делянках с учетной площадью 25–50 м2 при шестикратной повторности по следующей схеме.
Сорта и гибриды, различающиеся по вегетационному периоду, разбивали на соответствующие группы и высевали каждую из них со своим
стандартом при оптимальном количестве растений на гектаре для каждой группы в соответствии с рекомендованной в зоне индустриальной
технологией производства продуктов данной культуры. Группы сортов
и сорта внутри групп размещали методом рендомизации.
228
Способ посева пунктирный. Ширина междурядий 70 см. Расстояния
между растениями в ряду устанавливали с учетом рекомендованной
густоты стояния. Число рядов на делянке четыре–шесть. Крайние рядки делянок являются не учетными. Для уменьшения потерь урожая
от повреждений птицами за 1–2 дня до закладки опыта в качестве отвлекающих посевов засевали раннеспелым сортом защитные полосы
(2–3 прохода сеялки).
Согласно методике государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур анализировали продолжительность вегетационного периода, высоту растений, массу 1000 семянок и урожайность
(Методика сельскохозяйственной характеристики…, 1937).
На рисунке 4.3 представлены данные среднемесячной температуры
по Ростовской области за период 2004–2010 гг. Данные о температуре
и осадках получены на 19 метеостанциях государственного учреждения
«Ростовский центр по гидрометеорологии и мониторингу окружающей
среды», расположенных в различных географических районах области. Результаты свидетельствуют о повышение за период исследования
среднемесячной температуры примерно на 2 °C. Обратную картину
можно наблюдать на рисунке 4.4: тренд среднемесячного количества
осадков имеет тенденцию к понижению (более 12 мм).
С помощью двухфакторного дисперсионного анализа и непараметрического рангового критерия Фридмана определяли вклад внешних
(почвенно-климатических) и внутренних (генотип сорта или гибрида)
факторов в изменчивость показателей хозяйственно-ценных признаков у данной сельскохозяйственной культуры (Гланц, 1989).
Двухфакторный дисперсионный анализ. Обобщением методов отличия математического ожидания на три и более выборки является метод
дисперсионного анализа, или ANOVA (Analysis of Variance), который
влияет на устойчивость какого-либо показателя в зависимости от одного или нескольких величин, традиционно называемых факторами.
В нашем случае такими факторами являются сорт (или гибрид) и сортоиспытательный участок. С некоторыми допущениями можно интерпретировать эти факторы как отвечающие за генотип и фенотип,
соответственно.
229
°С
Годы
Рис. 4.3. Среднемесячная температура в Ростовской области 2004–2010 гг.:
––♦–– – температура; ––––– – тренд
°С
Годы
Рис. 4.4. Среднее (ежемесячное) количество осадков в Ростовской
области 2004–2010 гг.:
––♦–– – осадки; ––––– – тренд
230
Данная работа является примером обсервационного исследования. В отличие от экспериментального исследования, где исследователь сам формирует группы и сам выбирает то или иное воздействие,
в обсервационном исследовании он может лишь наблюдать течение
процесса. Кроме того, это исследование – ретроспективное, поскольку имеет дело с данными, уже полученными в прошлом (в отличие
от проспективного).
Очевидно, в таком исследовании мы не можем гарантировать,
что указанные факторы являются единственным отличием. Однако
это скорее философский вопрос, и он может зависеть от того, насколько широко мы трактуем фактор «сортоиспытательный участок».
Логика рассуждений при дисперсионном анализе следующая:
Пусть а1, а2…аn – математическое ожидание результативного признака (например, урожайности) при значении факторов Сорт и Участок
А1, А2….Аn и В1, В2….Вn, соответственно.
Возникает задача проверки нулевой гипотезы:
Н0: а1=а2=…=an.
Проверить такую гипотезу можно при соблюдении нескольких
условий:
– наблюдения проводятся независимо и в одинаковых условиях;
– результативный признак имеет нормальный закон распределения с постоянной для различных уровней факторов генеральной
дисперсией.
Существует большое количество методов проверки нормальности
распределения. По историческим причинам нами были выбраны критерии Саркади, Гупта и Д’Агостино. В качестве примера распишем более подробно критерий Д’Агостино.
Критерий Д’Агостино D (D’Agostino’s D test) построен на порядковых статистиках. Вычисление статистики критерия производится
по формуле
,
где xi – отсортированная в порядке возрастания выборка; n – численность выборки;
– смещенная оценка дисперсии.
231
Здесь
– выборочное среднее значение.
Практически значимость может вычисляться посредством нормальной аппроксимации критического значения критерия. При этом модифицированная статистика
,
где
ожидание,
– математическое
–
стандартное
отклонение,
распределена по стандартному нормальному закону. По этой причине критерий Д’Агостино полагается более удобным в вычислении,
чем критерии требующие для своего вычисления либо таблиц, либо довольно сложных трудоемких аппроксимаций, связанных с объемными
вычислениями.
Доказательство равенства дисперсий производилось с использованием критерия Кокрена.
. Через
обознаПусть дано k выборок равного объёма:
чим выборочную оценку дисперсии i-й выборки. Введем гипотезу H0
о том, что дисперсии всех выборок равны:
. Статистика
критерия имеет следующий вид:
Если
, то нулевая гипотеза отклоняется. Квантили распределения можно найти, пользуясь таблицами F-распределения,
по формуле:
232
,
где
– γ-квантиль F-распределения с
и
степенями
свободы.
Вслед за проверкой нормальности данных и равенства дисперсий
можно переходить непосредственно к двухфакторному анализу.
При двухфакторном анализе для генеральной дисперсии σ находятся 4 оценки s0, sА, sВ, sY. Проверка нулевой гипотезы и гипотез HA
основывается на сравнении дисперсий s0 и sА. Если гипотеза HA верна,
то соотношение
FA = (s0, sА/s0 )2
имеет F-распределение с числом степеней свободы k=(mA–1) и l=(mA–1)
(mB–1).
Аналогичным способом рассчитывается величина FB.
Проверка справедливости гипотезы состоит в нахождении правосторонних критических интервалов с последующим выявлением попадания в него FA и FВ Двухфакторный дисперсионный анализ имеет
модификации с повторениями и без повторений. В первом случае каждому уровню факторов соответствует более одной выборки. При этом
появляется возможность выявить взаимовлияние факторов. В нашем
случае каждому сочетанию факторов соответствует одна выборка (двухфакторный анализ без повторений).
Непараметрический критерий Фридмана. Чтобы использование дисперсионного анализа было правомерно, данные должны подчиняться
нормальному распределению. В нашем случае нормальность данных
была доказана. Однако этот этап расчета можно опустить, если использовать непараметрические критерии, например критерий Фридмана.
Логика критерия Фридмана очень проста. Каждый результат (например урожайность) получен ровно один раз для каждого набора
Сорт–Участок. Результаты наблюдений упорядочиваются. Мы отдельно упорядочиваем значения у каждого участка независимо от всех
остальных. Таким образом, получается столько упорядоченных рядов,
сколько участков участвует в исследовании.
233
Далее для каждого сорта вычислим сумму рангов. Если разброс сумм
велик, различия статистически значимы. Далее повторяем эту процедуру для транспонированного набора данных.
Порядок расчета критерия Фридмана:
– располагаем значения для каждого сорта по возрастанию, каждому значению присваиваем ранг;
– для каждого из участков подсчитываем сумму присвоенных
ему рангов;
– вычисляем значение χ2;
– определяем критическое значение χ2 (табличное значение) с числом степеней свободы ν = k – 1.
Если χ превышает критическое, различия статистически значимы.
Статистика критерия имеет вид
.
Гипотеза H0 принимается, если
. Критические значения
находятся при помощи интерполяции табличных данных.
При
применима аппроксимация
.
Анализ изменчивости хозяйственно-ценных признаков сортов и гибридов подсолнечника на сортоиспытательных участках Ростовской области
в 2010 г. Проведен ретроспективный обсервационный анализ по двум
факториальным (сорта, гибриды (генотип) и сортоучастки (внешние
условия)), и четырем результативным (урожайность, ц/га; вегетационный период, дни; масса 1000 семян, г; высота растений, см) признакам.
В таблице 4.1 приведены показатели урожайности 17 генотипов
подсолнечника на семи сортоиспытательных участках. Наибольшей
средней продуктивности достигли гибриды Донской 354 и Дон Ра –
18 ц/га, что на 3,8 ц/га превышает урожайность наименее продуктивного гибрида Мартын. В то же время урожайность гибрида Оливера
на Тацинском ГСУ в шесть раз меньше чем на Ростовском ГСУ.
Абсолютный максимум продуктивности зарегистрировали у гибрида
Мэлин на Ростовском ГСУ – 33,4 ц/га, а минимум – у гибридов Оливер
и Мартын на Тацинском ГСУ – 4,7 ц/га. Показатели средней урожайности всех исследованных форм подсолнечника в зависимости от сорто234
испытательного участка значительно варьировали. Так, максимальные
показатели продуктивности, достигнутые на Ростовском ГСУ, более
чем в 3,5 раза превышают аналогичные показатели Шолоховского ГСУ.
Интересно отметить, что к средней урожайности подсолнечника (около 10 ц/га) в сельхозпредприятиях Ростовской области в 2010 г. наиболее близки показатели Орловского ГСУ. Хотя средняя урожайность
всех 17 исследованных генотипов на семи сортоиспытательных участках на 60 % превышает этот показатель.
Шолоховский
Тарасовский
Ростовский
Азовский
Целинский
Среднее
значение
генотипа
Аврора
Добрыня
Крупняк
Святогор
Казачий
Патриот
Фермер
Дон Ра
Донской 354
Мартын
Мэлин
Надежда
Олигарх
Донской 342
Гарант
Оливер
Донской 1448
Среднее значение по участку
Тацинский
Сорта, гибриды
Орловский
Таблица 4.1
Урожайность сортов и гибридов подсолнечника на сортоиспытательных
участках Ростовской области в 2010 г., ц/га
13
8,4
10,8
9,0
8,2
10,0
10,3
13,1
16,7
10,9
12,1
11,4
10,2
12,5
14,3
14,1
13,4
6,8
13,5
11,3
8,9
10,8
6,0
7,8
8,6
6,1
4,7
7,8
9,2
5,3
6,2
6,3
4,7
7,3
6
6,2
6,0
5,5
7,4
8,5
7,7
8,8
8,6
6,8
7,1
7,6
6,5
8,8
7,8
8,4
8,6
19,2
14,5
21,3
20,5
16,8
19,1
12,4
16,5
17,2
8,1
10,8
11,3
9,3
13,4
18,1
16,3
10,8
21,2
26,7
23,9
22,3
18,8
22,7
24,8
28,9
27
27,7
33,4
29,9
31,1
25,0
30,2
29,6
26,6
18,6
21,6
23,6
21,2
20
19,4
19,6
24,5
24
18,8
18,6
19,1
21,2
18,8
19,1
20,2
21,2
26,8
24,5
26,2
23,6
23,3
27,3
21,2
25,6
26,2
22,6
16,6
27,5
18,9
20,9
24,9
22,5
18,6
15,9
16,5
17,6
15,8
15,0
16,1
14,8
18,0
18,0
14,2
15,2
16,6
14,6
15,1
17,2
16,5
15,2
11,7
7,7
7,4
15,0
26,5
20,6
23,4
16,0
В таблице 4.2 показано, что наиболее продолжительный период вегетации – 134 дня наблюдали на Орловском ГСУ у гибридов Аврора
и Донской 1448, а наименьший период от всходов до полного созревания – 79 дней – на Тарасовском ГСУ у гибрида Донской 354. Однако
235
отличия средних значений периода вегетации были не настолько существенны (103 дня у гибрида Донской 354 и 115 дней у гибрида Оливер).
Максимальную вариабельность срока вегетации среди различных форм
подсолнечника на одном участке – 23 дня, наблюдали на Шолоховском
и Тарасовском ГСУ. Средняя продолжительность вегетационного периода 17 сортов и гибридов подсолнечника на Орловском ГСУ превышает аналогичный показатель на остальных ГСУ от 8 дней (Ростовский
ГСУ) до 36 (Тарасовский СУ).
Орловский
Тацинский
Шолоховский
Тарасовский
Ростовский
Азовский
Целинский
Среднее
значение
генотипа
Таблица 4.2
Вегетационный период сортов и гибридов подсолнечника
на сортоиспытательных участках Ростовской области в 2010 г., дни
Аврора
134
95
93
93
117
101
108
105
Добрыня
131
102
94
100
126
101
114
109
Крупняк
130
103
94
100
126
112
116
111
Святогор
129
102
92
100
127
110
108
110
Сорта,
гибриды
Казачий
128
95
96
81
110
115
104
104
Патриот
133
107
98
104
127
105
108
111
Фермер
128
97
105
95
125
111
106
109
Дон Ра
126
95
102
84
119
113
108
106
Донской 354
125
95
107
79
108
109
103
103
Мартын
131
94
106
104
129
109
106
111
Мэлин
130
97
108
88
118
111
103
107
Надежда
132
99
108
88
127
111
116
111
Олигарх
129
98
107
97
128
113
115
112
Донской 342
128
104
112
86
117
112
104
109
Гарант
130
106
112
102
127
117
108
114
Оливер
130
102
114
101
130
113
116
115
Донской 1448
134
107
115
89
126
115
107
113
Среднее значение по участку
130
100
103
94
122
110
109
109
236
Из таблицы 4.3 видно, что максимальной высоты достиг сорт
Добрыня на Ростовском ГСУ – 224 см, а самым низкорослым оказался гибрид Мартын на Тацинском ГСУ – 96 см. Наибольший средний
показатель – 182 см, также отмечен у сорта Добрыня, а наименьший –
141 см – у гибрида Донской 354. Средняя высота растений на семи
ГСУ имеет максимальную амплитуду – 70 см (186 см на Ростовском
ГСУ и 116 см на Тацинском ГСУ). Отметим уменьшение высоты подсолнечника по мере продвижения сортоучастков на север области.
Максимальной показатели высоты (более 180 см) исследуемые сорта
и гибриды достигали в Приазовской и Южной зонах.
Шолоховский
Тарасовский
Ростовский
Азовский
Целинский
Среднее
значение
генотипа
Аврора
Добрыня
Крупняк
Святогор
Казачий
Патриот
Фермер
Дон Ра
Донской 354
Мартын
Мэлин
Надежда
Олигарх
Донской 342
Гарант
Оливер
Донской 1448
Среднее значение по участку
Тацинский
Сорта,
гибриды
Орловский
Таблица 4.3
Высота растений сортов и гибридов подсолнечника
на сортоиспытательных участках Ростовской области в 2010 г., см
188
180
182
196
174
187
181
173
167
169
171
193
177
171
184
196
180
98
141
136
125
111
123
118
109
97
96
123
120
117
113
121
100
132
147
168
149
161
154
151
155
156
150
152
127
146
112
148
150
137
145
142
174
168
176
165
155
154
135
139
158
153
179
156
152
168
163
161
156
224
194
208
183
205
162
144
149
185
168
200
187
164
197
177
186
165
200
192
210
175
205
175
165
150
185
170
176
198
198
190
205
206
138
187
180
188
151
172
145
137
135
147
134
178
170
154
165
163
180
147
182
171
180
159
171
155
145
141
156
149
170
159
157
167
163
170
180
116
147
159
182
186
160
161
В таблице 4.4 показано, что самой крупноплодной формой подсолнечника является сорт Крупняк, достигший показателя массы 1000 семянок
237
112,8 г на Азовском ГСУ и среднего показателя по семи сортоиспытательным участкам – 67,6 г. Наименьший размер семян отмечен у гибрида
Мартын на Тацинском ГСУ, а аналогичный средний показатель – у гибрида Мэлин. Анализ средней массы 1000 семянок по сортоиспытательным
участкам показал значительную вариабельность данного показателя – более 46 г, что почти в 2 раза превышает вариабельность средних значений
генотипов. Заметим, что также как и в случае высоты растений, минимальные и максимальные показатели продемонстрировали формы, культивируемые на Тацинском и Азовском ГСУ, соответственно.
Шолоховский
Тарасовский
Ростовский
Азовский
Целинский
Среднее
значение
генотипа
Аврора
Добрыня
Крупняк
Святогор
Казачий
Патриот
Фермер
Дон Ра
Донской 354
Мартын
Мэлин
Надежда
Олигарх
Донской 342
Гарант
Оливер
Донской 1448
Среднее значение по участку
Тацинский
Сорта,
гибриды
Орловский
Таблица 4.4
Масса 1000 семян сортов и гибридов подсолнечника
на сортоиспытательных участках Ростовской области в 2010 г., г
44,4
37,4
38,8
38,1
38,4
39,8
41,4
40,7
49
38,3
38,9
38,6
38
43,5
40,3
41,4
41,1
26,2
56,2
41,8
27,2
32,2
24,4
26,5
28,4
25,5
20,9
26,3
29,6
29,2
28
22,1
22,3
24,1
53,6
84,7
83,5
55,1
60,3
59
60,8
54,6
58,1
50,4
49,7
46,6
51,2
54,4
52,6
48,5
56,8
42,3
33,7
58,3
48,5
37,8
23,6
33
33,8
43,1
21,4
27,5
34,9
31,9
29,6
33,5
37
28,3
47,9
72,6
62,7
49,1
48
56,7
46,4
49,4
47,3
46,5
48
59,5
60,8
44,8
55
55,2
56,4
76,6
72,4
112,8
85,6
77,1
72,4
82,8
75,6
78
63,6
60,2
63,6
73,6
68,4
62,2
70,6
78,8
67
80,4
75
51,6
49
52
43
54,2
56,5
56
42
56
45
41,6
48
54
38,6
51,1
62,5
67,6
50,8
49,0
46,8
47,7
48,1
51,1
42,4
41,8
47,0
47,1
44,3
44,8
47,0
46,3
40,5
28,9
57,6
35,2
53,3
75,0
53,5
49
Таким образом, наименьший средний урожай был получен
на Тацинском и Шолоховском ГСУ. Это объясняется не только низ238
кими баллами банитета для подсолнечника на этих участках, но и минимальным ГТК. Средние показатели высоты и массы 1000 семянок
на Тацинском ГСУ также наименьшие.
Следует отметить, что урожайность выше 20 ц/га и масса 1000 семянок более 50 г., наблюдались на сортоиспытательных участках с баллом
банитета не меньше 42 и ГТК>0,5.
В таблице 4.5 приведены зависимости изменчивости хозяйственно-ценных признаков подсолнечника от внутренних (генотип сорта
или гибрида) и внешних (почвенно-климатические факторы сортоиспытательного участка) факторов, рассчитанные с помощью двухфакторного дисперсионного анализ без повторений и непараметрического
рангового критерия Фридмана.
Таблица 4.5
Зависимость изменчивости хозяйственно-ценных признаков
подсолнечника от внутренних (генотип сорта или гибрида)
и внешних (почвенно-климатические факторы
сортоиспытательного участка) факторов
p-значение
Признаки
Урожайность,
ц/га
Вегет. период,
дни
Масса 1000
семян, г
Высота растений, см
Степень влияния
Зависимости
парам.
метод
непарам.
метод
парам.
метод, %
непарам.
метод
По сортам
0,286049038
0,243657
Нет
Нет
По участкам 1,82917E-42
9,87E-18
86,28
Есть
0,000629152 0,000921094
6,22
Есть
По участкам 2,82888E-39 1,94831E-16
80,98
Есть
14,13
Есть
71,54
Есть
По сортам
По сортам
8,88511E-09 0,008283728
По участкам 4,16019E-35
6,554E-17
По сортам
1,49954E-11 3,08821E-07
17,79
Есть
По участкам
2,4369E-35 2,78857E-15
68,64
Есть
Показано, что подавляющий вклад в изменчивость исследованных
признаков у сортов и гибридов подсолнечника, проходящих конкурсное испытание в Ростовской области, вносят не генотип (сорта или гибрида), а внешняя среда, т.е. почвенно-климатические условия района
культивирования. Так, степень влияния внешних факторов в изменчивость урожайности, продолжительности вегетационного периода,
массы 1000 семянок и высоты растений составила 86,3 %, 81,0, 71,5
и 68,6 %, соответственно.
239
Отметим, что по логике дисперсионного анализа общая групповая
дисперсия складывается не только из дисперсий групповых средних
по рассматриваемым факторам, но и из средней групповой дисперсии
остаточных факторов. Это означает, что сумма влияний рассматриваемых факторов обычно меньше 100 %.
Непараметрические методы качественно подтвердили результаты,
полученные традиционным двухфакторным анализом без повторений.
Таким образом, вышеприведенные результаты убедительно демонстрируют, что создание сорта или гибрида включает не только получение и отбор новых генотипов, но и определение экологического ареала,
в котором эти генотипы реализуют свой репродукционный потенциал
и технологические свойства.
4.2. Выражение хозяйственно-ценных признаков
в зависимости от климатических факторов
в течение вегетации подсолнечника
В предыдущем разделе был продемонстрирован вклад почвенноклиматических условий семи сортоиспытательных участков в формирование количественных признаков у 17 генотипов (сортов и гибридов)
подсолнечника. Для анализа влияния только климатических факторов
на хозяйственно-ценные признаки исследование проводили c 2004
по 2010 годы на базе Донской опытной станции им. Л.А. Жданова
ВНИИМК в Азовском районе Ростовской области, расположенной
на черноземах обыкновенных карбонатных. В работе использовали
три группы сортов и гибридов подсолнечника: раннеспелые – Партнер,
Донской 151, Донской 22; среднеранние – Донской 60, Престиж,
Сигнал, Гарант; среднеспелые – Азовский, Донской 1448.
Анализировали нижеприведенные показатели согласно методике государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур
(Селянинов, 1937).
Продолжительность вегетационного периода рассчитывали от появления полных всходов (полные всходы – на поверхности почвы появилось около 75 % развернувшихся семядольных листьев) до цветения
более чем ¾ растений и до уборочной спелости (уборочная спелость –
у 75 % растений тыльные стороны корзинок приобрели бурый цвет).
Высоту растений измеряли от поверхности почвы до места прикрепления корзинки.
240
Массу 1000 семянок определяли в двух пробах по 500 семянок.
Расхождение между двумя параллельными определениями не должно
было превышать 1 г. Результаты приводили к влажности 12 % и регистрировали с точностью до 0,1 г. При расхождении в массе между двумя пробами более чем на 1 г отсчитывали и взвешивали третью пробу.
В этом случае массу 1000 семянок вычисляли по двум пробам, имеющим наименьшее весовое расхождение.
Урожайность растений рассчитывали на 1 га при влажности семян
12 %. Уборку урожая на делянках конкурсного сортоиспытания сортов
и гибридов проводили раздельно.
Диаметр корзинки измеряли со стороны семянок во время физиологической спелости.
Масличность семянок определяли методом ядерно-магнитного резонанса на приборе ЯМР – анализатор АМВ-1006М.
Лузжистость определяли в пяти пробах по 100 семянок, отделив
от ядра лузгу, вычисляли отношение массы лузги к общей массе 100
семянок.
Сбор масла рассчитывали по формуле С=У·М·(100 – В), где С – сбор
масла, (ц/га); У – урожайность семянок, (ц/га); М – масличность семянок, (%); В – стандартная влажность семянок.
Поражаемость заразихой (Orobanche cumana Wallr.) и ризопусом
(Rhzopus nigricians Ehr.) – это количество больных растений по отношению ко всем исследованным на единице площади участка, ( %).
Суммы температур и количество осадков были взяты для анализа
подекадно на метеостанции, расположенной в непосредственной близости от сортоиспытательного участка. В качестве величины, характеризующей степень увлажнения территории за вегетационный период,
использовали условный показатель увлажнения – ГТК (гидротермический коэффициент Селянинова). Он равен отношению суммы осадков
за период с t>10 °C к испаряемости. Величину испаряемости условно
выражают суммой температур воздуха за период с t>10 °C, уменьшенной в 10 раз.
Проведенные в работе статистические расчеты были выполнены
с использованием традиционных методов. Для вычисления ранговой
корреляции использовался коэффициент Спирмена (Дмитриев, 1995;
Сигел, 2002; Макарова, Трофимец, 2002; Рокицкий, 1973).
241
На рисунке 4.5 приведены данные средней подекадной температуры
за период 2004–2010 гг. на Донской опытной станции им. Л.А. Жданова
ВНИИМК в Азовском районе Ростовской области.
°С
Рис. 4.5. Среднедекадная температура за период 2004–2010 гг.:
––♦–– – температура; ––––– тренд
Интересно отметить, что средняя температура за рассматриваемый
временной отрезок возросла приблизительно на 4 °C, что в два раза
превышает тренд средне областной температуры. Разумеется, величина температуры изменялась сезонно. Среднее (подекадное) количество
осадков, напротив, имеет тенденцию к снижению, что видно из линии
тренда (рис. 4.6).
Среднее подекадное уменьшение количества осадков составило,
как и в целом по Ростовском области, около 12 мм/декаду, что является значительной величиной на фоне абсолютных показателей.
Помимо собственно данных и линии тренда на диаграмме представлена кривая, полученная посредством линейной фильтрации подекадных
данных по осадкам (по 6 точкам). Отметим, что среднее количество
осадков в рассматриваемый период в некоторой степени также было
подвержено сезонным колебаниям. Так, например, в период вегетации подсолнечника наименьшее количество осадков выпало в 2007 г.
Соответственно, показатель ГТК был также минимальным (рис. 4.7).
242
Рис. 4.6. Среднее (подекадное) количество осадков за период 2004–2010 гг.
• – осадки (подекадно, мм); –––––– – тренд;
– – – – – фильтрация (по 6 точкам)
Рис. 4.7. Динамика ГТК:
––♦–– – среднее; –––– – вегетационный
243
В этом году у всех форм подсолнечника была отмечена наименьшая
высота растений, продолжительность вегетации от всходов до цветения, за исключением среднеспелого сорта Азовский. Практически
все формы, кроме раннеспелых гибридов (Донской 151 и Партнер)
продемонстрировали максимальную масличность семян. Показатели
массы 1000 семянок, за исключением гибрида Донской 1448, за этот
период были также самыми высокими (см. табл. 4.6).
В таблице 4.7 приведены сорта и гибриды подсолнечника, выражение признаков которых зависело от динамики значений ГТК.
Так, в течение шести лет наблюдений (2004–2009 гг.) климатические факторы мая на опытном участке достоверно не влияли на продолжительность вегетационного периода всех исследуемых форм.
Так же не обнаружено достоверной зависимости продолжительности
вегетационного периода у всех форм, за исключением сорта Азовский
от ГТК июня. У форм среднеранней группы, раннеспелых гибридов
Донской 22, Партнер и у среднеспелого гибрида Донской 1448 обнаружена прямо пропорциональная зависимость между продолжительностью вегетационного периода от всходов до цветения и показателями
ГТК июля. Интересно отметить, что погодные условия не оказали достоверного влияния на продолжительность вегетационного периода
раннеспелого гибрида Донской 151.
Урожайность практически всех исследуемых форм не зависела от ГТК мая, июля (за исключение сорта Азовский) и августа.
Однако между ГТК июня и урожайностью сорта Донской 60, гибридов Донской 151, Донской 22 и Сигнал установлена положительная
корреляция.
Следует отметить, что от ГТК мая достоверную обратную зависимость наблюдали лишь с показателями масличности сорта Азовский,
гибридов Престиж, Гарант, Донской 1448 и массы 1000 семянок гибридов Престиж, Донской 1448. Для всех этих форм характерны довольно
продолжительные сроки вегетации.
Лузжистость семян практически всех исследуемых форм не зависела от показателей ГТК. Исключением являются гибриды Престиж,
Донской 151, Донской 1448.
На сбор масла обнаружено достоверное влияние динамики ГТК в
июне раннеспелых гибридов Партнер, Донской 151 и среднераннего
сорта Донской 60.
244
245
Партнер
Донской 151
Донской 60
Престиж
Сигнал
Гарант
Азовский
Донской 1448
Сорт,
гибрид
от
всходов
до
цветения
54
51
57
57
53
59
59
59
90
88
96
92
89
97
100
95
19,1
16,5
19,4
21,9
19,9
21,7
20,5
23,0
46,9
48,1
48,9
50,8
45,7
49,6
48,5
51,3
28,9
27,0
26,6
23,9
28,2
24,9
26,8
24,6
71,1
76,3
72,2
56,9
61,9
63,2
75,5
53,2
Масса
Урожай1000
Маслич- Лузжиность,
от всходов
сеность, % стость, %
ц/га
до
мян, г
созревания
Вегетационный период, дни
Поражаемость
болезнями, %
Таблица 4.6
108
112
151
134
123
130
146
143
14,3
14,5
15,0
15,3
14,6
14,9
15,2
14,7
0
0
0
0,1
1,0
12,2
0
0,4
7,3
1,5
4,8
4,9
2,8
4,7
3,6
1,7
Диаметр
Высота
растений, корзинки,
см.
см.
заразиха ризопус
Результаты испытания гибридов и сортов подсолнечника в 2007 г.
246
–
- Престиж, - Гарант,
- Азовский,
- Донской 1448
–
Высота растений, см
–
Примечание: «+» – положительная и «-» – отрицательная, ранговые корреляции по Спирмену.
+ Донской 151, + Дон+ Партнер, + Донской 60
ской 22, + Дон+ Сигнал, + Гарант,
ской 60 + Престиж,
+ Азовский
+ Донской 1448
–
- Престиж,
- Донской 1418
Масса 1000 семян, г
–
–
–
–
+ Партнер, + Донской 151, + Донской 60
–
Сбор масла, ц/га
- Донской 151
- Престиж,
- Донской 1448
–
–
+ Донской 1448
-
+ Донской 60
+ Гарант
–
августа
–
Лузжистость, %
Масличность семян, %
–
Урожайность, ц/га
+ Азовский
+ Донской 151,
+ Донской 22,
+ Донской 60,
+ Сигнал
–
–
Вегетационный период
от всходов до созревания, дни
+ Азовский
ГТК
июля
+ Партнер, + Донской 22,
+ Донской 60
+ Престиж, + Сигнал,
+ Гарант, + Донской 1448
+ Донской 22
июня
–
мая
Вегетационный период
от всходов до цветения, дни
Признаки растений
Таблица 4.7
Зависимость выражения признаков подсолнечника от динамики ГТК, согласно ранговой корреляции
по Спирмену (достоверность ≥ 95 %)
Высота растений всех исследуемых форм не зависела от показателей ГТК мая и августа. Однако высота сорта Донской 60 и гибридов
Донской 151, Донской 22, Престиж и Донской 1448 положительно коррелирует с ГТК июня. Также выявлена прямая зависимость с ГТК июля
у сортов Донской 60, Азовский и у гибридов Партнер, Сигнал, Гарант.
Показатели размера диаметра корзинки всех исследуемых форм
оказались стабильными и не зависели от динамики значений ГТК на
опытном участке.
Подсолнечник довольно чувствителен к воздействию многочисленных болезней (Устенко, Устатов, 2010). Наибольший ущерб его посевам
в нашем регионе наносят заразиха и ризопус.
Заразиха подсолнечниковая Orobanche cumana Wallr. относится
к высшим растениям из семейства Orobanhaceae. Многие представители этого семейства являются паразитами высших растений и особенно
вредоносны для сельскохозяйственных культур. В частности, заразиха
подсолнечная при сильном поражении растений способна уничтожить
весь урожай (Распространение и вирулентность..., 2009).
Другим опасным паразитом для подсолнечника является ризопус.
Виды рода ризопус Rhizopus nodosus Namysl и Rhizopus nigricans Ehrenb
вызывают серую, или головчатую плесень овощей и фруктов, нанося
значительный ущерб при хранении, а также являются возбудителями
сухой гнили корзинок подсолнечника, вызывая плесневение семян растений, как при их хранении, так и при высеве в грунт. Снижение масличности семян почти на 4 % и увеличение кислотного числа масла более
чем в два раза наблюдается при 50 % поражении поверхности корзинки
и проникновении мицелия гриба внутрь семянки. В зависимости от интенсивности поражения корзинки возбудителем сухой гнили изменяются и посевные качества семян – энергия прорастания может снижаться
до 40 %, а лабораторная всхожесть – до 37 % (Соснина, 2009).
В таблице 4.8 приведена корреляционная зависимость (по
Спирмену) между устойчивостью к заразихе и ризопусу исследуемых
форм подсолнечника и динамикой ГТК за период 2005–2009 гг.
Видно что, погодные условия мая и августа не влияют на уровень
поражаемости заразихой всех исследуемых форм подсолнечника.
Положительные корреляции с погодными условиями июня выявлены
только у неустойчивых гибридов. А погодные условия июля стимулируют поражаемость заразихой, за исключением гибрида Гарант, у всех
изучаемых генотипов.
247
Таблица 4.8
Зависимость поражаемости заразихой и ризопусом сортов и гибридов
подсолнечника от динамики гидротермического коэффициента
(согласно ранговой корреляции по Спирмену)
Месяц
Май
Поражаемость заразихой
–
+Донской 151
+Донской 22
Июнь
+Гарант
+Сигнал
Июль
Август
+Донской 151
+Партнер
+Донской 22
+Донской 60
+Престиж
+Сигнал
+Донской 1448
–
Поражаемость ризопусом
–
+Партнер
+Донской 22
+Донской 60
+Гарант
+Престиж
+Сигнал
+Азовский
+Донской 1448
+Донской 151
–
Примечание: «+» – положительная ранговая корреляция по Спирмену (достоверность ≥ 95 %). Не обнаружено достоверного влияния на поражаемость заразихой
и ризопусом ГТК мая и августа
Независимо от срока вегетации, за исключением раннеспелого сорта – стандарта Казачий с максимальной устойчивостью к патогену
и гибрида Донской 151 из этой группы, изученные формы продемонстрировали достоверную зависимость между действием климатических
факторов июня (показатель ГТК) и уровнем поражаемости ризопусом.
Однако у наиболее чувствительного к ризопусу гибрида Донской 151
обнаружена положительная зависимость не от ГТК июня, а от ГТК
июля. Устойчивость к ризопусу, также как и к заразихе, достоверно
не зависела от гидротермических показателей мая и августа.
Таким образом, раннеспелые и среднеспелые сорта и гибриды продемонстрировали высокую устойчивость к заразихе (за исключением
гибрида Донской 22) относительно среднеранних форм.
Высокую устойчивость к ризопусу продемонстрировали среднеранние и среднеспелые формы подсолнечника, а раннеспелая группа оказалась более чувствительной к этому патогену (гибриды Донской 151
и Партнер).
248
Таким образом, климатические факторы могут стимулировать развитие на подсолнечнике заразихи и ризопуса. Следовательно, селекционерам при создании новых сортов и гибридов с повышенной устойчивостью к этим патогенам следует учитывать эти закономерности.
Можно заключить, что климатические факторы Приазовской зоны
Ростовской области за период 2004–2009 гг. оказали влияние за исключением диаметра корзинки на показатели всех изученных признаков
подсолнечника. Однако это влияние избирательно и зависело как от
фазы вегетации, так и конкретного генотипа.
Литература
Антонова Т.С., Ситалов М., Арасланова Н.М. и др. Распространение
и вирулентность заразихи подсолнечной (Orobanche cumana Wallr.)
в Ростовской области / Т.С. Антонова [и др.] // Масличные культуры.
Научно-технический бюлл. ВНИИМК. 2009. Вып. 1.
АПК-информ online. URL: http://www.apk-inform.com.
Гланц С. Медико-биологическая статистика: пер с англ. М.:
Практика, 1989. 460 с.
Дмитриев Е.А. Математическая статистика в почвоведении. М.:
Изд-во Моск. гос. ун-та, 1995. 320 с. С 206–260.
Кильчевский А.В. Генетико-экологические аспекты селекции растений // Генетические основы селекции растений: В 4 т. Т. 1 / Под ред.
А.В. Кильчевского и Л.В. Хатылевой. Минск: Белорусская наука, 2008.
552 с. С. 6–49.
Кривошлыков К.М. Состояние и перспективы производства масличного сырья в России // Масла и жиры. 2009. № 6.
Лысоченко А.А. Продовольственная безопасность региона: воспроизводственная концепция. Ростов н/Д.: Изд-во ЮФУ, 2008. 464 с.
Макарова Н.В., Трофимец В.Я. Статистика в Excel. М.: Финансы
и статистика, 2002. 368 с. С. 46–102, 227–260.
Методика государственного сортоиспытания сельскохозяйственных культур. М.: Колос, 1983. Вып. 3. 184 с.
Рокицкий П.Ф. Биологическая статиcтика. Изд. 3-е. Минск:
«Вышайш. школа», 1973. 320 с.
Селянинов Г.Т. Методика сельскохозяйственной характеристики климата // Мировой агроклиматический справочник. Л.-М.:
Гидрометеоиздат, 1937. С. 5–27.
249
Сигел Э.Ф. Практическая бизнес-статистика. М.; СПб.; Киев:
Вильямс, 2002. 1052 с. С. 807–908.
Соснина Ю.М. Селекционный способ снижения вредоносности
сухой гнили на растениях подсолнечника // Мат-лы V Междунар.
конф. молодых ученых и специалистов. Краснодар: ВНИИМК, 2009.
С. 215–219.
Состояние и использование земельного фонда Ростовской области
/ В.М. Лобанов и др. Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ, 1997. 232 с.
Устенко А.А., Усатов А.В. Болезни и вредители подсолнечника.
Ростов н/Д.: Изд-во ЮФУ, 2010. 110 с.
250
ПРИЛОЖЕНИЕ
252
variegated-7
1967
variegated-8
1967
variegated-9
1967
variegated-10
1967
variegated-11
1967
variegated-6
1967
variegated-2
1967
variegated-3
1967
variegated-4
1967
variegated-1
1967
Мутантная
линия, год
получения
Генетическая природа мутации,
ее фенотипическое выражение
Пестролистные формы variegated
0,01 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
24 ч при 22 °С; соотношение объемов раствора
и желто-зелеными секторами на листьях.
НММ и семянок 2:1; посев в поле через 10 суток
после обработки.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
Условия обработки НММ как для линии variegated-1
и желто-зелеными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желто-зелеУсловия обработки НММ как для линии variegated-1
ными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
Условия обработки НММ как для линии variegated-1
и желто-зелеными секторами на листьях.
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
24 ч при 22 °С; соотношение объемов раствора
и желто-зелеными секторами на листьях.
НММ и семянок 2:1; посев в поле через 10 суток
после обработки.
Внеядерная хлорофильная химера с желто-зелеУсловия обработки НММ как для линии variegated-6
ными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желто-зелеУсловия обработки НММ как для линии variegated-6
ными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с белыми
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
и светло-зелеными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с белыми
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
и светло-зелеными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
и желто-зелеными секторами на листьях.
Условия обработки мутагеном
Каталог внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника
253
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
variegated-13
1967
variegated-14
1967
variegated-24
1975
variegated-23
1971
variegated-20
1971
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка 18 ч
при 15 °С; соотношение объемов раствора НММ и
семянок 2:1; посев в поле через 14 суток хранения
семянок при 15 °С после обработки.
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
18 ч при 25 °С; соотношение объемов раствора
НММ и семянок 2:1; посев в поле через 14 суток
хранения семянок при 25 °С после обработки.
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
18 ч при 25 °С; соотношение объемов раствора
НММ и семянок 9:1; посев в поле через 14 суток
хранения семянок при 25 °С после обработки.
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
variegated-12
1967
variegated-15
1967
variegated-17
1967
Условия обработки мутагеном
Мутантная
линия, год
получения
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
и желто-зелеными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
и желто-зелеными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтозелеными обесцвечивающимися секторами
на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
и желто-зелеными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
и желто-зелеными обесцвечивающимися секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
и желто-зелеными секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с белыми
и светло-зелеными секторами на листьях.
Генетическая природа мутации,
ее фенотипическое выражение
Продолжение табл.
254
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
секторами на листьях.
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
18 ч при 15 °С в аэробных условиях; посев в поле
через 14 суток хранения семянок при 15 °С после
обработки.
Условия обработки как для линии variegated-30
variegated-30
1977
variegated-32
1977
Внеядерная хлорофильная химера с белыми секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
секторами на листьях.
Генетическая природа мутации,
ее фенотипическое выражение
Условия обработки как для линии variegated-28
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
18 ч при 25 °С; соотношение объемов раствора
НММ и семянок 9:1; посев в поле через 14 суток
хранения семянок при 25 °С после обработки.
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
18 ч при 25 °С; соотношение объемов раствора
НММ и семянок 2:1; семянки отмывали от НММ
и дополнительно обрабатывали без доступа воздуха
2,4-динитрофенолом 10–5 М в течение 4 ч; посев
в поле через 14 суток хранения семянок при 25 °С
после обработки.
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
18 ч при 25 °С; соотношение объемов раствора
НММ и семянок 2:1; семянки отмывали от НММ
и дополнительно обрабатывали без доступа воздуха
рифампицином, 0,015 % в течение 4 ч; посев в поле
через 14 суток хранения семянок при 25 °С после
обработки.
Условия обработки мутагеном
variegated-29
1975
variegated-28
1975
variegated-27
1975
variegated-25
1975
Мутантная
линия, год
получения
Продолжение табл.
255
variegated-2еn:chlorina-7
2002
variegated-1еn:chlorina-7
2002
variegated-35
1978
variegated-33
1977
Мутантная
линия, год
получения
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
18 ч при 15 °С в аэробных условиях; посев в поле
через 10 суток хранения семянок при 15 °С и 5 суток
при 25 °С после обработки.
0,02 %-ный раствор НММ (pH 7,0); обработка
18 ч при 25 °С в анаэробных условиях; семянки
отмывали от НММ и проращивали на воде 6 ч при
25 °С; посев в поле через 12 суток подсушивания
и хранения семянок при 25 °С.
Семянки мутанта en:chlorina-7 замачивали
в воде без доступа воздуха 20 ч при 18 °С, затем
последовательно проращивали на воде 3 ч при 25 °С,
3 ч при 25 °С в барокамере в атмосфере чистого
кислорода (0,7 МПа), 6 ч при 25 °С, 3 ч в 0,015 %-ном
растворе НММ при 25 °С, после отмывания в проточной воде от мутагена вновь 6 ч на воде; посев в поле
через 12 ч после окончания обработок.
Семянки мутанта en:chlorina-7 замачивали
в воде без доступа воздуха 20 ч при 18 °С, затем
последовательно проращивали на воде 9 ч при 25 °С,
3 ч при 25 °С в барокамере в атмосфере чистого
кислорода (0,7 МПа), 3 ч в 0,015 %-ном растворе
НММ при 25 °С, после отмывания в проточной воде
от мутагена вновь 6 ч на воде; посев в поле через
12 ч после окончания обработок.
Условия обработки мутагеном
Внеядерная хлорофильная химера с двумя
типами мутантных пластид, растения с желтыми
секторами на желто-зеленых листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с двумя
типами мутантных пластид, растения с желтыми
секторами на желто-зеленых листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с белыми
секторами на листьях.
Внеядерная хлорофильная химера с желтыми
секторами на листьях.
Генетическая природа мутации,
ее фенотипическое выражение
Продолжение табл.
256
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
en:chlorina-5
1967
en:chlorina-6
1967
en:chlorina-9
1981
Выделен из М3 поколения химеры variegated-33
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
Условия обработки НММ как для линии variegated-6
en:chlorina-4
1967
en:chlorina-7
1967
en:chlorina-8
1967
Условия обработки НММ как для линии variegated-1
Условия обработки НММ как для линии variegated-1
Условия обработки НММ как для линии variegated-1
Мутанты en:chlorina
Условия обработки мутагеном
en:chlorina-3
1967
en:chlorina-1
1967
en:chlorina-2
1967
Мутантная
линия, год
получения
Внеядерный хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.
Внеядерный хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.
Внеядерный, устойчивый к сульфатному засолению хлорофильный мутант с желто-зеленой
окраской листьев.
Хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской
листьев сложной генетической природы, обусловленной взаимодействием ядра и цитоплазмона.
Внеядерный, засухоустойчивый хлорофильный
мутант с желто-зеленой окраской листьев.
Внеядерный, устойчивый к хлоридному засолению хлорофильный мутант с желто-зеленой
окраской листьев.
Внеядерный хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.
Внеядерный хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской листьев.
Хлорофильный мутант сложной генетической
природы, обусловленной взаимодействием
ядра и цитоплазмона с желто-зеленой окраской
листьев.
Генетическая природа мутации,
ее фенотипическое выражение
Продолжение табл.
257
en:chlorina-14
2000
en:chlorina-13
2000
en:chlorina-12
1985
en:chlorina-11
1989
en:chlorina-10
1987
Мутантная
линия, год
получения
Семянки замачивали в воде без доступа воздуха
24 ч при 2 °С, затем проращивали при 25 °С 12 ч на
воде и 6 ч на 0,015 %-ном растворе НММ; посев
в поле через 14 суток после окончания обработки
мутагеном.
Семянки замачивали в воде без доступа воздуха
18 ч при 18 °С, затем обрабатывали 3 ч 0,001 %-ной
НММ при 25 °С и проращивали 6 ч при 25 °С
на 0,015 %-ном растворе НММ; посев в поле через
14 суток после окончания обработки мутагеном.
Семянки замачивали в воде без доступа воздуха
24 ч при 18 °С, затем проращивали при 25 °С 6 ч на
0,01 %-ном растворе НММ и 0,3 % рифампицина;
посев в поле через 12 суток после окончания
обработки мутагеном.
Семянки замачивали в воде без доступа воздуха
20 ч при 18 °С, затем последовательно проращивали
на воде 1 ч при 40 °С, 11 ч при 25 °С, 3 ч в 0,015 %-ном
растворе НММ при 25 °С; посев в поле через
12 ч после окончания обработки мутагеном.
Семянки замачивали в воде без доступа воздуха
20 ч при 18 °С, затем последовательно проращивали
на воде 11 ч при 25 °С, 1 ч при 40 °С, 3 ч в 0,015 %-ном
растворе НММ при 25 °С; посев в поле через
12 ч после окончания обработки мутагеном.
Условия обработки мутагеном
Внеядерный хлорофильный мутант с желтозеленой окраской листьев.
Хлорофильный мутант с желто-зеленой
окраской листьев сложной генетической
природы, обусловленной взаимодействием ядра
и цитоплазмона.
Хлорофильный мутант с желто-зеленой
окраской листьев сложной генетической
природы, обусловленной взаимодействием ядра
и цитоплазмона.
Хлорофильный мутант с желто-зеленой
окраской листьев сложной генетической
природы, обусловленной взаимодействием ядра
и цитоплазмона.
Хлорофильный мутант с желто-зеленой
окраской листьев сложной генетической
природы, обусловленной взаимодействием ядра
и цитоплазмона.
Генетическая природа мутации,
ее фенотипическое выражение
Продолжение табл.
258
r-en:chlorina-7
1981
r-en:chlorina-5
1977
r-en:chlorina-3
1986
en:chlorina-15
2000
Мутантная
линия, год
получения
Генетическая природа мутации,
ее фенотипическое выражение
Условия обработки НММ как для линии
en:chlorina-14
Хлорофильный мутант с желто-зеленой окраской
листьев сложной генетической природы, обусловленной взаимодействием ядра и цитоплазмона.
Реверсионные мутанты
Ядерная доминантная мутация, супрессирующая
внеядерный хлорофильный дефект не только
у мутанта en:chlorina-3, но и у en:chlorina-2 и en:chlo
rina-5, тем самым восстанавливающая в пластидах
Спонтанная реверсия пластомного мутанта
содержание хлорофиллов. При этом у ревертанта
en:chlorina-3
сохраняется повышенная устойчивость
к сульфатному засолению, которая обнаружена
у мутанта en:chlorina-3.
Внеядерная мутация, супрессирующая
внеядерный хлорофильный дефект у мутанта
en:chlorina-5, тем самым восстанавливающая
Спонтанная реверсия пластомного мутанта
в пластидах содержание хлорофиллов. При этом
en:chlorina-5
у ревертанта исчезает повышенная устойчивость
к засухе, которая обнаружена у мутанта
en:chlorina-5
Выделен в М3, после обработки семянок мутанта
Внеядерная мутация, предположительно,
en:chlorina-7 0,02 %-ным раствором НММ (pH 7,0)
истинная реверсия, восстанавливающая
в течение 18 ч при 22 °С; соотношение объемов
в пластидах содержание хлорофиллов и все
изученные морфофизиологические признаки
раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через
растений.
10 суток после обработки.
Условия обработки мутагеном
Продолжение табл.
259
Условия обработки мутагеном
Выделен в М5, после обработки семянок мутанта
en:chlorina-7 0,02 %-ным раствором НММ (pH 7,0)
pr1-en:chlorina-7
в течение 18 ч при 22 °С; соотношение объемов
1983
раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через
10 суток после обработки.
Выделен в М5, после обработки семянок мутанта en:chlorina-7 0,02 %-ным раствором НММ (pH
pr2-en:chlorina-7 7,0) в течение 18 ч и последующей 2 ч обработкой
1983
5х10–3 М раствором кофеина при 22 °С; соотношение
объемов растворов и семянок 2:1; посев в поле через
10 суток после обработки.
Выделен в М5, после обработки семянок мутанта en:chlorina-7 0,02 %-ным раствором НММ (pH
pr4-en:chlorina-7 7,0) в течение 18 ч и последующей 2 ч обработкой
1983
5х10–3 М раствором кофеина при 22 °С; соотношение
объемов растворов и семянок 2:1; посев в поле через
10 суток после обработки.
Выделен в М6, после обработки семянок мутанта
en:chlorina-7 0,02 %-ным раствором НММ (pH 7,0)
pr5-en:chlorina-7
в течение 18 ч при 22 °С; соотношение объемов
1984
раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через
10 суток после обработки.
Мутантная
линия, год
получения
Внеядерная, предположительно,
митохондриальная мутация, приводящая
к частичной реверсии показателей габитуса
и продуктивности растений, не изменяя
содержание хлорофиллов в мутантных пластидах.
Внеядерная, предположительно,
митохондриальная мутация, приводящая
к частичной реверсии показателей габитуса
и продуктивности растений, не изменяя
содержание хлорофиллов в мутантных пластидах.
Внеядерная, предположительно,
митохондриальная мутация, приводящая
к частичной реверсии показателей габитуса
и продуктивности растений, не изменяя
содержание хлорофиллов в мутантных пластидах.
Внеядерная, предположительно,
митохондриальная мутация, приводящая
к частичной реверсии показателей габитуса
и продуктивности растений, не изменяя
содержание хлорофиллов в мутантных пластидах.
Генетическая природа мутации,
ее фенотипическое выражение
Продолжение табл.
260
Условия обработки мутагеном
Выделен в М6, после обработки семянок мутанта
en:chlorina-7 0,02 %-ным раствором НММ (pH 7,0)
pr6-en:chlorina-7
в течение 18 ч при 22 °С; соотношение объемов
1984
раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через
10 суток после обработки.
Выделен в М6, после обработки семянок мутанта
en:chlorina-7 0,02 %-ным раствором НММ (pH 7,0)
pr7-en:chlorina-7
в течение 18 ч при 22 °С; соотношение объемов
1984
раствора НММ и семянок 2:1; посев в поле через
10 суток после обработки.
Выделен в М6, после обработки семянок мутанта en:chlorina-7 0,02 %-ным раствором НММ (pH
pr8-en:chlorina-7 7,0) в течение 18 ч и последующей 2 ч обработкой
1984
5х10–3 М раствором кофеина при 22 °С; соотношение
объемов растворов и семянок 2:1; посев в поле через
10 суток после обработки.
Выделен в М6, после обработки семянок мутанта en:chlorina-7 0,02 %-ным раствором НММ (pH
pr9-en:chlorina-7 7,0) в течение 18 ч и последующей 2 ч обработкой
1984
5х10–3 М раствором кофеина при 22 °С; соотношение
объемов растворов и семянок 2:1; посев в поле через
10 суток после обработки.
Мутантная
линия, год
получения
Внеядерная, предположительно,
митохондриальная мутация, приводящая
к частичной реверсии показателей габитуса
и продуктивности растений, не изменяя
содержание хлорофиллов в мутантных пластидах.
Внеядерная, предположительно,
митохондриальная мутация, приводящая
к частичной реверсии показателей габитуса
и продуктивности растений, не изменяя
содержание хлорофиллов в мутантных пластидах.
Внеядерная, предположительно,
митохондриальная мутация, приводящая
к частичной реверсии показателей габитуса
и продуктивности растений, не изменяя
содержание хлорофиллов в мутантных пластидах.
Внеядерная, предположительно,
митохондриальная мутация, приводящая
к частичной реверсии показателей габитуса
и продуктивности растений, не изменяя
содержание хлорофиллов в мутантных пластидах.
Генетическая природа мутации,
ее фенотипическое выражение
Окончание табл.
261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287 288 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302 303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 СОДЕРЖАНИЕ
Введение .......................................................................................................................... 5
Глава 1. Внеядерные хлорофильные мутации подсолнечника,
индуцированные N-нитрозо-N-метилмочевиной, и особенности
их наследования .............................................................................................................9
1.1. Пестролистные мутанты variegated (var) ................................................11
1.2. Мутанты chlorinа .......................................................................................25
1.3. Реверсионные мутанты .............................................................................32
Литература .........................................................................................................43
Глава 2. Устойчивость внеядерных хлорофильных мутантов
подсолнечника к экстремальным факторам среды ..............................................49
2.1. Окислительный стресс ..............................................................................49
2.2. Высокие температуры и засухоустойчивость ……...………..................93
2.3. Почвенное засоление ...............................................................................105
2.4. Тяжелые металлы .....................................................................................118
Литература .......................................................................................................125
Глава 3. Цитоплазматическая мужская стерильность подсолнечника (ЦМС)
как результат взаимодействия ядерных и митохондриальных генов ……....129
3.1. Сравнительная характеристика линий с различными
типами ЦМС ....................................................................................................132
3.2. Структурные особенности микроспорогенеза у линий с различными
типами ЦМС ....................................................................................................154
3.3. Источники гена Rf1 среди однолетних и многолетних видов
подсолнечника .................................................................................................200
3.4. Кодоминантные маркеры гена Rf1 культурного подсолнечника ........207
3.5. Новые системы ЦМС-Rf ..........................................................................212
Литература .......................................................................................................217
Глава 4. Влияние климатических факторов на формирование
морфофизиологических признаков подсолнечника ...........................................225
4.1. Анализ изменчивости селекционно-ценных признаков у сортов и
гибридов подсолнечника ................................................................................225
4.2. Выражение хозяйственно-ценных признаков в зависимости от
климатических факторов в течение вегетации подсолнечника .................240
Литература .......................................................................................................249
Приложение №1. Каталог внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника
НИИ биологии ЮФУ. ..................................................................................................251
Приложение №2. Декоративные формы подсолнечника на Кубанской опытной
станции ВНИИР им. Н.И. Вавилова…………………………………………………261
11 Для заметок
Научное издание
НЕХРОМОСОМНЫЕ МУТАЦИИ ПОДСОЛНЕЧНИКА
Редактор Ю.А. Пехтерева
Корректор Ю.А. Пехтерева
Компьютерная верстка К.И. Ильченко
Сдано в набор 23.10.2010. Подписано в печать 24.05.2011.
Формат 60×84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.
Гарнитура Newton.
Сдано вв набор
набор 15.09.2010.
15.09.2011. Подписано
Подписано вв печать
печать 19.09.2011.
19.09.2011.
Сдано
1
Усл.Формат
печ. л.
15,75.
Уч.-изд.
л. 16,5.
Тираж
500Гарнитура
экз. Заказ
№ 1386.
1 /16. Бумага
60×84
офсетная.
Печать
офсетная.
Newton.
Формат 60×84 /16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура Newton.
Усл. печ.
печ. л.
л. 15,75.
15,75. Уч.-изд.
Уч.-изд. л.
л. 16,5.
16,5. Тираж
Тираж 200
200 экз.
экз.
Усл.
Отпечатано вв типографии
типографии ИП
ИП Гончаренко
Гончаренко
Отпечатано
Издательство Южного федерального университета
Отпечатано в типографии ЮФУ.
344090, г. Ростов-на-Дону, пр. Стачки, 200/1. Тел. 247-80-51.
11 11