Insider KRAS

Insider KRAS
Набор реагентов для обнаружения мутаций в «горячих точках»
2-го экзона гена KRAS человека в биологических пробах методом мутационно-специфической полимеразной цепной реакции
в режиме реального времени
Номера по каталогу
GK021, GK023, GK027
Инструкция по применению
Набор реагентов Insider KRAS предназначен только для исследовательских работ,
выполняемых профессионально подготовленными пользователями.
Содержание
I.
II.
Назначение набора . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Описание набора . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
II.1. Cостав набора . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
II.2. Принцип действия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
II.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) . . . . . .
II.2.2. Мутационно-специфическая ПЦР (мсПЦР) . . .
II.2.3. ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) . .
II.3. Возможные применения . . . . . . . . . . . . . . . . . .
III. Аналитические характеристики . . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV. Меры предосторожности . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
V. Оборудование, материалы и реагенты . . . . . . . . . . . . . .
VI. Исследуемые биологические пробы . . . . . . . . . . . . . . .
VII. Контрольные образцы ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
VIII. Проведение исследования . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
VIII.1. Получение ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
VIII.2. Контроль качества полученной ДНК . . . . . . . . . . .
VIII.2.1. Анализ концентрации и качества полученной
ДНК методом ПЦР-РВ . . . . . . . . . . . . . . .
VIII.2.2. Анализ концентрации полученной ДНК спектрофлуориметрическим методом . . . . . . . .
VIII.3. Проведение мсПЦР-РВ . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
VIII.3.1. Работа в чистой зоне для приготовления премиксов (зона, изолированная от источника
матрицы) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
VIII.3.2. Работа в зоне для внесения матрицы . . . . . .
VIII.3.3. Работа вне изолированных зон для пробоподготовки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
IX. Анализ результатов исследования . . . . . . . . . . . . . . . .
IX.1. Первичный анализ результатов . . . . . . . . . . . . . .
IX.2. Контроль качества результатов . . . . . . . . . . . . . .
IX.3. Финальный анализ результатов . . . . . . . . . . . . . .
X. Идентификация мутаций с помощью секвенирования по Сэнгеру . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
2
2
3
3
3
4
4
6
7
7
9
9
10
10
12
12
13
14
15
15
18
18
19
19
21
22
XI. Условия транспортировки, хранения и эксплуатации набора . 24
Приложение 1. Типичные кривые изменения флуоресценции
для контрольных образцов . . . . . . . . . . . . . 25
Приложение 2. Рекомендуемые протоколы первичной
обработки некоторых типов биологических проб 26
Приложение 3. Таблица учета результатов . . . . . . . . . . . . . . 29
Приложение 4. Список используемых сокращений . . . . . . . . . 30
I Назначение набора
I. Назначение набора
Набор реагентов Insider KRAS предназначен для выявления мутаций
в «горячих точках» 2-го экзона гена KRAS человека в ДНК, выделенной из различного биологического материала (культуры клеток,
ткани, мазки, соскобы, биологические жидкости).
Набор рассчитан на анализ 24 образцов, включая контрольные.
I Используемая методика подразумевает анализ 3-х контрольных образцов
в каждом исследовании (т.е. для каждого запуска прибора ПЦР-РВ). Та­
ким образом, максимальное количество образцов ДНК, которое можно
проанализировать с использованием одного набора, составляет 21.
www.evrogen.ru
1
II Описание набора
II. Описание набора
II.1. Cостав набора
Набор поставляется в двух упаковках.
Таблица 1. Cостав набора реагентов Insider KRAS
N
Компонент
Insider KRAS
Упаковка № 1 (транспортировка при комнатной температуре, хранение при +4°C )
1
ПЦР-смесь
в соответствии с табл. 2
Упаковка № 2 (транспортировка и хранение при -20°C )
2
ПЦР-растворитель
1 050 мкл
3
ДНК-полимераза
60 мкл
4
Положительный контрольный образец ДНК (ПКО)
400 мкл
5
Отрицательный контрольный образец ДНК (ОКО)
400 мкл
6
Праймер для секвенирования, 5мкМ
600 мкл
Упаковка №1 представляет собой серебристый пластиковый пакет с замком zip-lock.
Следите, чтобы при хранении замок всегда оставался плотно закрытым. Упаковка
содержит тонкостенные пробирки для ПЦР (в стрипах или микропланшетах), содержащие высушенную реакционную смесь. Пробирки должны храниться в закрытом виде.
В пакет вложены пакеты с осушителем воздуха, которые следует сохранять при хранении. Тип пробирок зависит от прибора для ПЦР-РВ.
Упаковка №2 представляет собой картонную коробку с пробирками (5 шт). Упаковку №2 сразу после доставки следует поместить на –20°C.
Таблица 2. Формат ПЦР-смеси
Номер набора
по каталогу
Формат ПЦР-смеси
Совместимость с
приборами для ПЦР-РВ
GK021
12 стрипов по 8 пробирок (0.2 мл)
ABI 7500, CFX 96
GK023
12 низкопрофильных стрипов
по 8 пробирок (0.1 мл)
StepOne Plus
GK027
24 стрипа для Rotor-Gene Q
по 4 пробирки (0.1 мл)
Rotor-Gene Q
Полный список совместимого оборудования можно найти на сайте www.evrogen.ru
Возможна адаптация набора к другим моделям приборов для проведения ПЦР-РВ по
запросу.
2
Insider KRAS
II Описание набора
II.2. Принцип действия
Для анализа мутаций в наборах серии Insider используется мутационно-специфическая полимеразная цепная реакция с детекцией в
режиме реального времени (мсПЦР-РВ).
II.2.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
ПЦР позволяет с помощью циклической амплификации in vitro избирательно размножить определенную последовательность ДНК,
изначально присутствующую в биологической пробе, до количества,
превышающего исходное более чем в 108 раз. Избирательность ПЦР
обеспечивается тем, что в реакционной смеси присутствуют два
олигонуклеотидных праймера – затравки, комплементарные последовательностям, фланкирующим исследуемый фрагмент ДНК.
При проведении анализа с использованием набора реагентов Insider
KRAS в каждой реакции амплифицируются два фрагмента ДНК: целевой фрагмент (2-й экзон гена KRAS; ЦФ) и экзогенный внутренний
контроль (ЭВК). Одновременная амплификация ЦФ и ЭВК позволяет
оценивать степень ингибирования ПЦР и отличать истинно отрицательные результаты ПЦР-анализа от ложноотрицательных:
• Если ЦФ отсутствует в пробе, мы видим отсутствие амплификации
ЦФ и успешную амплификацию ЭВК (истинно отрицательный результат).
• Если в реакции присутствуют ингибиторы (неправильно подготовлена проба) или отсутствует какой-либо необходимый компонент
(допущена техническая ошибка), мы видим отсутствие амплификации как ЦФ, так и ЭВК (ложноотрицательный результат).
II.2.2. Мутационно-специфическая ПЦР (мсПЦР)
Анализ каждой биологической пробы методом мутационно-специфической ПЦР предполагает постановку с этой пробой двух реакций
ПЦР (далее – реакция О и реакция М). В обеих реакциях присутствуют все компоненты, необходимые для амплификации ЦФ и ЭВК.
Реакция М отличается от реакции О присутствием дополнительного
реагента, который блокирует амплификацию копий ЦФ «дикого типа»
(без мутаций), но при этом практически не влияет на амплификацию
www.evrogen.ru
3
II Описание набора
мутантных копий ЦФ. Поэтому в реакции О специфически амплифицируются присутствующие в пробе копии гена KRAS вне зависимости
от их мутационного статуса, а в реакции М – копии гена KRAS с мутацией в какой-либо из «горячих точек» 2-го экзона.
II.2.3. ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ)
Набор реагентов Insider KRAS предполагает детекцию результатов
ПЦР в режиме реального времени. Для этой цели в реакционные смеси введены олигонуклеотидные зонды, комплементарные внутренним участкам последовательностей ЦФ и ЭВК и меченные флуоресцентными красителями. Уровень флуоресценции таких олигонуклеотидных зондов резко меняется при их связывании с комплементарной последовательностью ДНК (в случае ЦФ – падает, в случае ЭВК
– возрастает). В процессе ПЦР-амплификации ЦФ и ЭВК число таких
последовательностей увеличивается, поэтому в случае успешной амплификации уровень флуоресценции реакционной смеси изменяется
с каждым циклом ПЦР. Это позволяет проводить мониторинг ПЦР в
режиме реального времени путем детекции флуоресценции соответствующего красителя.
В наборе реагентов Insider KRAS амплификацию ЦФ детектируют по
каналу Green (SYBR, FAM), а амплификацию ЭВК – по каналу Yellow
(VIC, HEX, JOE, TET).
Наборы реагентов серии Insider в стандартной комплектации содержат пассивный референсный краситель ROX. Это позволяет использовать их на большинстве приборов для проведения ПЦР-РВ,
включая приборы, требующие пассивного референсного красителя
ROX (например, ABI 7500), и приборы, не требующие пассивного референсного красителя вообще (например, CFX96 и Rotor-Gene Q).
Комплектации с высокой концентрацией пассивного референсного
красителя ROX и без пассивного ререфенсного красителя доступны
по запросу.
II.3. Возможные применения
Ген KRAS – один из ключевых клеточных протоонкогенов, активирующийся более чем в 30% случаев злокачественных опухолей человека.
4
Insider KRAS
II Описание набора
Основным механизмом активации гена KRAS являются точечные мутации, большая часть которых (более 90%) приходится на «горячие
точки» 2-го экзона гена – 12-й и 13-й кодоны. Мутации в этом регионе гена KRAS отличаются высокой функциональной однородностью;
все они приводят к активации сигнальных каскадов, в которые включен белок KRAS, прежде всего, каскада Ras-Raf-Mek-ERK и каскада
PIK3-Akt.
Набор реагентов Insider KRAS позволяет выявлять любые мутации в
12-м и 13-м кодоне гена KRAS.
Подавляющее большинство мутаций в 12-м и 13-м кодоне гена
KRAS – это соматические мутации при злокачественных опухолях, т.е.
они присутствуют только в опухолевых клетках.
I Наследственные мутации в гене KRAS встречаются достаточно редко.
В частности, они обнаруживаются у части пациентов с синдромом Ну­
нана (вариант 3, OMIM #609942), сердечно-кожно-лицевым синдромом
(OMIM #115150) и синдромом Костелло (OMIM #218140). Как правило,
такие мутации не затрагивают 12-й и 13-й кодоне, хотя в отдельных слу­
чаях встречаются в непосредственной близости от них (например, в 14-м
кодоне) и поэтому могут быть обнаружены с помощью набора реагентов
Insider KRAS.
Возможные применения набора включают молекулярное профилирование опухолевых клеток и поиск мутаций в ДНК биологических
жидкостей.
Молекулярное профилирование опухолевых клеток в современной
онкологии используется для дифференциации морфологически сходных типов опухолей, а также для выявления прогностических и предиктивных факторов. Набор реагентов Insider KRAS может быть использован для всех этих целей, поскольку мутации в «горячих точках»
гена KRAS могут быть ассоциированы с определенным гистологическим типом опухоли, выступать в качестве важного прогностического
фактора и определять изначальную или приобретенную чувствительность или устойчивость опухолевых клеток к определенным видам
лечения. В частности, эти мутации ассоциированы с устойчивостью
к ингибиторам белка EGFR (включая цетуксимаб, панитумумаб, геwww.evrogen.ru
5
III Аналитические характеристики
фитиниб, эрлотиниб и лапатиниб) и других рецепторов ростовых
факторов, а также с чувствительностью опухолевых клеток к специфическим ингибиторам белков RAF (таким как сорафениб) и MEK
(таким как селуметиниб и траметиниб) в монотерапии или в комбинации с ингибиторами PIK3/Akt/mTOR.
Анализ мутационного статуса гена KRAS в биологических жидкостях –
перспективный метод для оценки эффективности (радикальности)
проведенного хирургического или консервативного лечения, для динамического мониторинга течения заболевания, для раннего выявления приобретенной лекарственной устойчивости и для скрининга
лиц из групп высокого онкологического риска.
III. Аналитические характеристики
Специфичность анализа:
Специфичность определяется олигонуклеотидными праймерами и
зондами, комплементарными определенным участкам гена KRAS с
мутациями или без мутаций. Специфичность обнаружения в образце
фрагментов гена KRAS составляет 100%, специфичность обнаружения в образце фрагментов гена KRAS с мутациями – 99,5%.
Чувствительность анализа:
Набор реагентов Insider KRAS позволяет выявлять 45 и более копий
гена KRAS в исследуемом объеме образца. Методика, описываемая
в настоящей инструкции, предполагает внесение в каждую реакцию
по 15 мкл образца. В этом случае предел чувствительности набора
реагентов составляет 3 копии гена KRAS (≈ 10 пг геномной ДНК) на
1 мкл образца.
Избирательность анализа:
Набор реагентов Insider KRAS позволяет выявлять копии гена KRAS
с мутациями на фоне 100-кратного избытка копий гена KRAS «дикого
типа» (без мутаций), т. е. избирательность анализа при соблюдении
настоящей инструкции (Изб) составляет 1:100. Однако предел чувствительности набора составляет 45 копий гена KRAS в образце;
поэтому в случае, если в реакцию внесено менее 15 нг геномной ДНК,
т.е. менее 4500 (4500 = 45 Х 100) копий гена KRAS, избирательность
6
Insider KRAS
IV Меры предосторожности
анализа (Изб*) будет ниже:
Изб* = 45 / [количество копий гена KRAS в реакции]
В этом случае мутация, присутствующая в образце в относительной
концентрации ниже Изб*, может остаться невыявленной.
IV. Меры предосторожности
• Все компоненты набора в используемых концентрациях являются
нетоксичными.
• Ключевой мерой предосторожности при работе с набором является соблюдение требований «Правил устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях,
отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (М., 1981).
V. Оборудование, материалы и реагенты
Для проведения исследований необходимо следующее оборудование, расходные материалы и реагенты, не входящие в комплектацию
набора:
1) Прибор для проведения ПЦР в режиме реального времени (таблица 2 на стр. 2);
2) Вытяжной шкаф (для первичной обработки биологических проб);
3) ПЦР-бокс или ламинарный шкаф (для подготовки ПЦР);
4) Ледяная баня;
5) Дозаторы (автоматические лабораторные пипетки) одноканальные и 8-канальные на 20, 200 и 1000 мкл;
6) Микроцентрифуга;
7) Центирифуга с ротором для микропланшетов;
8) Вортекс;
9) Суховоздушный термостат с диапазоном температур от +37°C до
+100°C;
10) Холодильники бытовые с температурой +4 и -20°C – 2 шт.;
www.evrogen.ru
7
V Оборудование, материалы и реагенты
11) Штативы для пробирок объемом 1,5, 0,5 и 0,2 мл;
12) Штативы для микропланшетов;
13) Емкость для сброса использованных наконечников;
14) Наконечники для дозаторов разовые с фильтром на 20, 200 и
1000 мкл;
15) Пробирки лабораторные объемом 1,5 мл;
16) Пробирки лабораторные объемом 0,2 мл с крышками;
17) Перчатки медицинские одноразовые;
18) Этанол 96%;
19) Вода бидистиллированная деионизованная;
20) Дополнительное оборудование, расходные материалы и реагенты,
необходимые для первичной обработки биологических проб (в соответствии с протоколами лаборатории пользователя);
21) Протеиназа К (фирма Amresco, США, кат. N O706, или фирма
Sigma-Aldrich, США, кат. N 82452);
22) Компоненты буфера для протеиназы К (Tris-HCl, K3 EDTA, SDS);
23) Набор для выделения ДНК из биологического материала;
24) Набор реагентов для определения концентрации и качества двухцепочечной ДНК:
• При использовании спектрофлуориметрического метода –
Qubit® (Quant-IT) HS dsDNA Kit (фирма Life Technologies, США,
кат. N Q32854 или Q33120) или аналогичный;
• При использовании метода ПЦР-РВ – QuantiFiler (фирма Life
Technologies, США, кат. N 4343895 или 4387746), «aXY-Детект»
(ЗАО «Синтол», Россия, кат. N HG-402) или аналогичный;
25) Стандартный образец геномной ДНК человека для изготовления
калибраторов (например, фирма Qiagen, Германия, кат. N 59568,
или фирма Sigma-Aldrich, США, кат. N HRC5-1EA);
26) Набор реагентов для очистки продуктов ПЦР перед секвенированием:
• При использовании колоночного метода – Cleanup Mini (ЗАО
«Евроген», кат. N BC023) или аналогичный;
8
Insider KRAS
VI Исследуемые биологические пробы
• При использовании фильтрационного метода – Montage Gel
Extraction Kit (фирма EMD Millipore, США, кат. N LSKGEL50) или
аналогичный;
• При использовании ферментативного метода – ExoSAP-IT (фирма Affymetrix, США, кат. N 78250) или аналогичный.
27) Наборы реагентов для проведения секвенирования по Сэнгеру
(включая реагенты для проведения сиквенсной реакции, реагенты для очистки продуктов сиквенсной реакции и реагенты для
проведения капиллярного электрофореза; рекомендуется использовать реагенты производства фирмы Life Technologies, США);
28) Дополнительное оборудование, расходные материалы и реагенты,
необходимые для выделения ДНК, определения ее концентрации и качества, очистки продуктов ПЦР перед секвенированием
и проведения секвенирования по Сэнгеру (в соответствии с инструкциями производителей соответствующих наборов);
29) Программное обеспечение для анализа результатов секвенирования - программа SeqScape (фирма Life Technologies, США),
Chromas (фирма TechnElysium, Австралия) или аналогичная.
VI. Исследуемые биологические пробы
Для исследования может быть использован следующий биологический материал:
• Клеточные культуры;
• Ткани (свежезамороженные и фиксированные фрагменты тканей,
срезы с парафиновых блоков);
• Мазки и соскобы;
• Биологические жидкости (кровь, моча, слюна и др.).
VII. Контрольные образцы ДНК
В набор включены контрольные образцы геномной ДНК человека.
Положительный контрольный образец ДНК (ПКО) включает в себя
смесь двух образцов геномной ДНК человека – без мутации в гене
KRAS и с мутацией c. 34 G->A (p. Gly12Ser); конечная концентрация
www.evrogen.ru
9
VIII Проведение исследования
ДНК в ПКО – 1,0 нг/мкл (≈ 3 х 102 геном-эквивалентов/мкл), соотношение количества копий гена KRAS с мутацией и без мутации –
1 : 100.
Отрицательный контрольный образец ДНК (ОКО) включает в себя
образец геномной ДНК человека без мутаций в гене KRAS; конечная
концентрация ДНК в ОКО – 1,0 нг/мкл (≈ 3 х 102 геном-эквивалентов/мкл).
VIII. Проведение исследования
Исследование биологических проб с помощью набора реагентов
Insider KRAS включает в себя следующие этапы:
А) Получение ДНК;
Б) Контроль качества полученной ДНК;
В) Проведение мсПЦР-РВ.
VIII.1. Получение ДНК
I Реагенты для получения ДНК не входят в комплектацию набора реаген­
тов Insider KRAS.
I Процедура получения ДНК включает в себя три этапа: (I) первичная об­
работка проб; (II) инкубация с протеиназой К; (III) выделение ДНК.
I Процедуру получения ДНК рекомендуется проводить в вытяжном шкафу.
Для избежания кросс-контаминации рекомендуется использовать нако­
нечники для дозаторов с фильтрами.
1) Осуществить первичную обработку биологических проб в соответствии со стандартными протоколами лаборатории пользователя.
Рекомендуемые протоколы для первичной обработки двух типов
биологических проб (цельной крови и парафиновых блоков) приведены в приложении Приложение 2 к настоящей инструкции.
2) После первичной обработки провести инкубацию биологических
проб с протеиназой К (25 ЕА/мл) в стандартном буфере (10 mM
Tris-HCl; 5 mM K3 EDTA; 0,5% SDS; pH = 8,0) при температуре 56°C
(в термостате): для жидкостей – в течение 8 ч; для клеток и тканей
– до полного растворения осадка (в течение 12-48 ч).
10
Insider KRAS
VIII Проведение исследования
Рекомендуется:
• В качестве рабочих растворов использовать 5-кратный буфер
для протеиназы К и раствор протеиназы K (1500 ЕА/мл) в бидистиллированной деионизированной воде;
• Перед обработкой клеток и тканей разбавлять 1 объем 5-кратного буфера 4-мя объемами воды бидистиллированной деионизованной;
• При обработке биологических жидкостей добавлять 1 объем
5-кратного буфера к 4-м объемам обрабатываемой жидкости;
• Вносить протеиназу К в буфер непосредственно перед добавлением пробы.
I Инкубация проб с протеиназой К существенно повышает эффектив­
ность большинства стандартных протоколов выделения ДНК (увели­
чивается выход ДНК, пригодной для ПЦР-анализа).
3) Осуществить выделение ДНК с помощью набора серии DiaTom
или MagNA (ООО «Лаборатория Изоген», Россия) или серии DNEasy
(фирма Qiagen, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.
I В случае использования наборов серии DNEasy процедуру выделения
ДНК необходимо начинать с этапа 3 (Qiagen DNEasy Blood & Tissue
Handbook. 2006. P. 26, 29).
I Выделение ДНК с помощью других наборов может потребовать до­
полнительной оптимизации процедуры.
I Если в исследуемых биологических образцах высока вероятность хи­
мического повреждения ДНК (например, если ДНК выделяется из
фиксированных формалином тканей), рекомендуется произвести фер­
ментативную обработку выделенной ДНК с помощью специальных
наборов реагентов для устранения повреждений в ДНК (например,
PreCR Repair Mix, фирма New England Biolabs, США, кат. № M0309,
или аналогичный). Такая обработка позволит избежать ложнополо­
жительных результатов мутационного анализа.
Выделенная ДНК может храниться при температуре -20℃ в течение 6 ме­
сяцев.
www.evrogen.ru
11
VIII Проведение исследования
VIII.2. Контроль качества полученной ДНК
(Рекомендуется) Провести оценку концентрации и качества полученной ДНК методом ПЦР-РВ или спектрофлуориметрическим методом.
I Предварительная оценка концентрации и качества полученной ДНК и
последующая нормализация (выравнивание) концентрации ДНК в иссле­
дуемых образцах при постановке мсПЦР-РВ обеспечивает достоверность
и воспроизводимость получаемых результатов.
I Реагенты для оценки концентрации и качества полученной ДНК не вхо­
дят в комплектацию набора реагентов Insider KRAS.
I Метод ПЦР-РВ является более точным и информативным, чем спек­
′
трофлуориметрический метод, но требует относительно больших затрат
времени и сил лабораторных работников.
I Оценку концентрации и качества ДНК, выделенной из срезов с парафи­
новых блоков, рекомендуется осуществлять только методом ПЦР-РВ.
I Не рекомендуется проводить оценку концентрации и качества полученной
ДНК спектрофотометрическим методом, включая спектрофотометрию в
нанообъемах.
VIII.2.1. Анализ концентрации и качества полученной ДНК
методом ПЦР-РВ
Анализ концентрации и качества ДНК методом ПЦР-РВ проводят с помощью наборов реагентов QuantiFiler (фирма Life Technologies, США,
кат. N 4343895 или 4387746), «aXY-Детект» (ЗАО «Синтол», Россия, кат.
N HG-402) или аналогичных в соответствии с инструкцией производителя.
Для надежного определения концентрации ДНК необходимо использовать дополнительные контрольные образцы с заранее известной
концентрацией ДНК – калибраторы (не менее трех, например, 100,
10 и 1 нг/мкл). Калибраторы можно приготовить путем серийных разведений стандартного образца геномной ДНК человека (например,
фирма Qiagen, Германия, кат. N 59568, или фирма Sigma-Aldrich, США,
кат. N HRC5-1EA). Каждый исследуемый образец, включая калибраторы, рекомендуется анализировать не менее чем в двух «повторах»
(т.е. ставить с каждым образцом по две реакции). Для последующего
12
Insider KRAS
VIII Проведение исследования
анализа рекомендуется использовать среднее арифметическое результатов этих двух «повторов».
Метод ПЦР-РВ позволяет точно измерить концентрацию ДНК и сделать выводы о ее качестве, т.е. определить, какая часть выделенной
ДНК пригодна для последующего ПЦР-анализа.
VIII.2.2. Анализ концентрации полученной ДНК
спектрофлуориметрическим методом
При измерении концентрации ДНК спектрофлуориметрическим методом используется спектрофлуориметр (например, Qubit® , фирма
Life Technologies, США) и набор для определения концентрации двухцепочечной ДНК (например, Qubit® (Quant-IT) HS dsDNA Kit, фирма
Life Technologies, США, кат. N Q32854 или Q33120) в соответствии с
инструкцией производителя.
Для надежного определения концентрации ДНК необходимо, помимо контрольных образцов, входящих в состав набора реагентов для
определения концентрации двухцепочечной ДНК, использовать также дополнительные контрольные образцы с заранее известной концентрацией ДНК – калибраторы (не менее трех, например, 100, 10
и 1 нг/мкл). Калибраторы можно приготовить путем серийных разведений стандартного образца геномной ДНК человека (например,
фирма Qiagen, Германия, кат. N 59568, или фирма Sigma-Aldrich, США,
кат. N HRC5-1EA).
Рекомендуется проводить не менее трех измерений с каждым исследуемым образцом, включая калибровочные стандарты. Интервал
между повторными измерениями одного и того же образца должен составлять не менее 1 мин (при несоблюдении этого условия
возможно искажение результатов из-за нагревания образца в
спектрофлуориметре). Для последующего анализа рекомендуется
использовать среднее арифметическое результатов трех измерений.
Спектрофлуориметрический метод позволяет быстро и довольно точно измерить концентрацию ДНК, но не позволяет сделать выводы о
ее качестве, т.е. определить, какая часть выделенной ДНК пригодна
для последующего ПЦР-анализа.
www.evrogen.ru
13
VIII Проведение исследования
Концентрация выделенной ДНК должна быть не менее 1,0 нг/мкл.
В случае выявления низкой концентрации ДНК необходимо повторить
процедуру выделения ДНК.
VIII.3. Проведение мсПЦР-РВ
I В одном эксперименте можно проанализировать от 1 до 21 исследуемого
образца. Вне зависимости от количества исследуемых образцов, каждый
эксперимент должен также включать анализ трёх стандартных контроль­
ных образцов – ОКО, ПКО и NTC (контроль ПЦР без матрицы).
I Каждый образец, включая ОКО, ПКО и NTC, анализируется в четы­
рех лунках: в двух идет амплификация всех копий исследуемого гена, с
мутацией и без мутации (реакционная смесь «О»), а в двух амплифици­
руются только копии, содержащие мутацию (реакционная смесь «М»).
1) Включите амплификатор для проведения ПЦР в режиме реального времени и запустите программное обеспечение.
I На этом же этапе необходимо создать таблицу учета результатов
(см. Приложение 3. «Таблица учета результатов» на стр. 29) и внести
в нее данные об образцах (графы: «Название образца», «Расположе­
ние образца»).
2) Рассчитайте необходимый объём компонентов ПЦР, исходя из числа образцов, которые планируется проанализировать. Для расчета воспользуйтесь таблицей:
N исследуемых образцов + 3 контрольных образца
ПЦР-растворитель
(42,75 х N + 128,25) мкл
ДНК-полимераза
(2,25 х N + 6,75) мкл
Итого
(45 х N + 135) мкл
I Объёмы компонентов реакционной смеси, приведённые в таблице,
включают небольшой запас. Это позволяет избежать ошибок раска­
пывания, связанных с неточностью дозаторов.
После проведения расчётов округлите получившиеся значения до це­
лых чисел.
14
Insider KRAS
VIII Проведение исследования
VIII.3.1. Работа в чистой зоне для приготовления премиксов
(зона, изолированная от источника матрицы)
3) В чистом боксе подготовьте пробирки:
- одну пробирку объемом 1,5 мл для приготовления премикса (общей смеси);
- пробирки объемом 0,2 мл или 0,5 мл для смешивания премикса с
образцами ДНК – по количеству анализируемых образцов, включая контрольные.
Промаркируйте пробирки и расставьте их в рабочем штативе.
4) Достаньте из холодильника пробирку с ПЦР-растворителем из
набора Insider. Разморозьте смесь, тщательно перемешайте её
3-4-кратным встряхиванием и поместите её в рабочий штатив в
чистом боксе.
5) Достаньте из холодильника пробирку с ДНК-полимеразой и поместите её в специальный охлаждаемый штатив с температурой
+4°C . При отсутствии охлаждаемого штатива постарайтесь как
можно быстрее провести отбор фермента и вернуть пробирку
обратно в холодильник (фермент при нагревании теряет активность).
6) Приготовьте премикс, добавив в пробирку объёмом 1,5 мл сначала ПЦР-растворитель, а затем ДНК-полимеразу исходя из сделанного расчета.
7) Перемешайте содержимое пробирки аккуратным 10-кратным переворачиванием, не допуская образования пены.
8) Сбросьте капли путём центрифугирования пробирки с премиксом
в микроцентрифуге при комнатной температуре течение 5 сек.
9) Внесите по 44 мкл премикса в промаркированные пробирки. Закройте крышки.
10) Перенесите промаркированные пробирки с премиксом в зону для
внесения образцов ДНК.
VIII.3.2. Работа в зоне для внесения матрицы
11) Достаньте из холодильника один микропланшет или необходимое
количество стрипов с ПЦР-смесью, по одной пробирке с ОКО и
ПКО из набора Insider KRAS и пробирки с ДНК исследуемых образцов.
www.evrogen.ru
15
VIII Проведение исследования
I ПЦР-смесь в наборах Insider может поставляться в микропланшетах
или в стрипах (см. Таблицу 2. «Формат ПЦР-смеси» на стр. 2).
На анализ одного образца требуется 4 лунки.
12) Разморозьте пробирки с ПКО и ОКО и пробирки с ДНК исследуемых образцов и прогрейте их на 50°C в течение 1 мин.
Перемешайте содержимое пробирок на вортексе, сбросьте капли
на микроцентрифуге.
13) Внесите по 66 мкл исследуемых образцов в промаркированные
пробирки с премиксом. Закройте крышки пробирок.
14) Внесите по 66 мкл контрольных образцов ПКО и ОКО в предназначенные для них пробирки с премиксом. Закройте крышки
пробирок.
15) Внесите 66 мкл воды бидистиллированной деионизованной (той
же, что вы использовали для разведения образцов ДНК) в пробирку с премиксом, предназначенную для отрицательного контроля ПЦР (NTC). Закройте крышку пробирки.
16) Перемешайте содержимое пробирок аккуратным 3-4-кратным
встряхиванием, не допуская образования пены в реакционной
смеси.
17) Сбросьте капли путём центрифугирования пробирки с премиксом
в микроцентрифуге в при комнатной температуре течение 5 сек.
18) Перенесите пробирки с реакционной смесью в рабочий штатив.
19) Приготовьте для раскапывания микропланшет или с стрипы с
ПЦР-смесью, промаркируйте при необходимости, откройте пленку или крышки.
I Маркировку стрипов или микропланшента следует проводить в соот­
ветствии с рекомендациями производителей приборов для ПЦР-РВ.
Необходимо использовать маркеры, не дающие флуоресцентного сиг­
нала и не нарушающие работу детектирующей системы прибора.
I Лунки микропланшента маркировать не рекомендуется, образцы
должны наноситься в порядке, отраженном в Таблице учёта резуль­
татов в графе «Расположение образца – номера лунок».
I При работе со стрипами маркировку можно наносить на участки пла­
стика, не задействованные в детекции флуоресценции:
16
Insider KRAS
Образец 1
Образец 2
Образец 3
Образец 4
Образец 5
Образец 6
Образец 7
Образец 8
Образец 9
Образец 10
Образец 11
Образец 12
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
A
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
B
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
C
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
D
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
E
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
F
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
G
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
м
H
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
о
Образец 13
Образец 14
Образец 15
Образец 16
Образец 17
Образец 18
Образец 19
Образец 20
Образец 21
ОКО
ПКО
NTC
VIII Проведение исследования
Рис. 1. Расположение реакционных смесей в микропланшете или в стрипах набора реагентов Insider и порядок внесения анализируемых образцов. Реакционная
смесь О - зеленый цвет, реакционная смесь М - красный.
- в случае использования прибора Rotor-Gene Q – на крышки проби­
рок;
- в случае использования других приборов – на боковую поверхность
верхней трети пробирки.
20) Внесите по 25 мкл реакционной смеси в лунки микропланшета
или в стрипы строго в соответствии с приведенной на рис. 1 схемой.
I Во избежание контаминации пробирки следует закрывать сразу после
отбора смеси. После использования закрытые пробирки с остатками
смеси следует выбросить.
21) Тщательно закройте микропланшет или стрипы и перемешайте соwww.evrogen.ru
17
IX Анализ результатов исследования
держимое лунок аккуратным 5-10-кратным встряхиванием.
VIII.3.3. Работа вне изолированных зон для пробоподготовки
22) Сбросьте капли путём центрифугирования микропланшета или
стрипов в микроцентрифуге при комнатной температуре течение
5 сек.
23) Аккуратно перенесите микропланшет или стрипы в блок амплификатора.
24) В управляющей программе прибора ПЦР-РВ задайте следующие
параметры:
• тип анализа – относительная квантификация с использованием
метода ΔΔCt;
• пассивный референсный краситель (если предусмотрен программным обеспечением амплификатора) – ROX;
• объем реакционной смеси – 25 мкл;
• программа амплификации:
1 цикл
95°C
2 мин
Считывание флуоресценции: нет
50 циклов
95°C
15 сек
Считывание флуоресценции: нет
55°C
40 сек
Считывание флуоресценции:
Green (FAM)
Yellow (VIC, HEX, JOE, TET)
72°C
1 мин
Считывание флуоресценции: нет
25) Проведите амплификацию.
IX. Анализ результатов исследования
Анализ результатов исследования, проведенного с использованием
набора реагентов Insider KRAS, включает в себя следующие этапы:
А) Первичный анализ результатов;
Б) Контроль качества результатов;
В) Финальный анализ результатов.
18
Insider KRAS
IX Анализ результатов исследования
IX.1. Первичный анализ результатов
1) Запустите программу анализа результатов, входящую в комплект
программного обеспечения амплификатора.
2) Выполните обсчет данных об амплификации ЦФ [по каналу Green
(FAM)] и ЭВК [по каналу Yellow (VIC, HEX, JOE, TET)] с помощью программного обеспечения амплификатора.
Необходимо выбрать следующие параметры:
• активный канал –
1) Green (FAM) – для детекции ЦФ;
2) Yellow (VIC, HEX, JOE, TET) – для детекции ЭВК;
• шкала отображения данных – линейная;
• режим отображения данных – ΔRn или ΔR;
• Baseline — с 13-го по 26-й цикл ПЦР для ЦФ и со 2-го по 6-й цикл
ПЦР для ЭВК;
• Threshold:
для приборов ABI 7500 и Rotor-Gene Q – (-0,05) RFU для ЦФ и
0,01 RFU для ЭВК;
для прибора CFX96 – (-100) RFU для ЦФ и 300 RFU для ЭВК.
В качестве результата программа сообщает значение CT (номера поро­
гового цикла) по каждому каналу для каждой лунки.
I Пороговый цикл – это цикл ПЦР-РВ, на котором уровень флуоресценции
в исследуемой лунке достиг определенного заранее заданного «порогово­
го» уровня (threshold), необходимого для сравнения с другими лунками.
IX.2. Контроль качества результатов
Проанализируйте данные, полученные для исследуемых и контрольных образцов.
Должны выполняться условия, приведенные в таблице 3 «Контроль
качества результатов ПЦР-РВ» на стр. 20.
Результаты контроля качества («+» или «–») внесите в таблицу учета результатов (см. Приложение 3 к настоящей инструкции) в графу
«Контроль качества».
www.evrogen.ru
19
IX Анализ результатов исследования
Таблица 3. Контроль качества результатов ПЦР-РВ
Условные обозначения в таблице:
«да» – в лунке зарегистрирована амплификация, т.е. на графике кривых амплификации (окно «Amplification Plot» в интерфейсе программы) этой лунке соответствует
характерная сигмообразная кривая и значение CT для этой лунки не превышает 48;
«нет» – амплификация не зарегистрирована;
«да/нет» – обязательных условий нет (амплификация может быть как зарегистрирована, так и не зарегистрирована);
CTM (Х), CTO (Х) – значение CT реакций М и О для образца Х;
|CTM (Х)|, |CTO (Х)| – среднее значение CT реакций М и О для образца Х;
ΔCT(Х) – разность средних значений CT реакций М и О для образца Х: ΔCT(Х) =
= |CTM (Х)| – |CTO (Х)|;
«–» – параметр не рассматривается.
a. Условия для контрольных образцов
ОКО
ПКО
NTC
Амплификация ЭВК
да
да
да
Амплификация ЦФ в реакции О
да
да
нет
Амплификация ЦФ в реакции М
да / нет
да
нет
Соотношение |CTM | и |CTO |
|CTM | > |CTO |
или
CTM отсутствует
|CTM | > |CTO |
–
Разброс значений CTO
≤ 0,5
≤ 0,5
–
Разброс значений CTM
–
≤ 0,5
–
Соотношение ΔCT(ОКО) и ΔCT(ПКО)
1,5 ≤ [ΔCT(ОКО) – ΔCT(ПКО)]
или CTM (ОКО) отсутствует
–
б. Условия для исследуемых образцов
Исследуемый образец X
Амплификация ЭВК
да
Амплификация ЦФ в реакции О
да
Амплификация ЦФ в реакции М
да/нет
Соотношение |CTM | и |CTO |
|CTM (X)| ≥ |CTO (X)| или CTM отсутствует
Разброс значений CTO
≤ 0,5
Разброс значений CTM при
|CTM (X)| ≤ |CTM (ПКО)|
≤ 0,5
20
Insider KRAS
IX Анализ результатов исследования
Таблица 4. Алгоритм финального анализа результатов мсПЦР-РВ
Условные обозначения в таблице:
CTM (Х), CTO (Х) – значение CT реакций М и О для образца Х;
|CTM (Х)|, |CTO (Х)| – среднее значение CT реакций М и О для образца Х;
ΔCT(Х) – разность средних значений CT реакций М и О для образца Х: ΔCT(Х) =
= |CTM (Х)| – |CTO (Х)|;
CTМ , CTО – CTM (ПКО), CTO (ПКО);
ΔCT – ΔCT(ПКО).
|CTO (X)| ≤ |CTO |
|CTM (X)| ≤ |CTM | и
|CTO | ≤ |CTO (X)| ≤ |CTM |
|CTO (X)| > |CTM |
МУТАЦИЯ
МУТАЦИЯ
[невозможно]
НОРМА
[невозможно]
[невозможно]
НОРМА
НОРМА*
МАЛО ДНК
ΔCT(X) ≤ ΔCT
|CTM (X)| ≤ |CTM | и
ΔCT(X) > ΔCT
|CTM (X)| > |CTM |
или CTM отсутствует
• При несоблюдении хотя бы одного из условий для какого-либо из
контрольных образцов результаты для всех образцов признаются
не прошедшими контроль качества. Необходима повторная постанов­
ка анализа всех образцов, начиная с этапа ПЦР-РВ.
• При несоблюдении хотя бы одного из условий для какого-либо из
исследуемых образцов результаты для соответствующего образца
признаются не прошедшими контроль качества. Необходима повтор­
ная постановка анализа этого образца начиная с этапа ПЦР-РВ.
• При соблюдении всех условий для контрольных образцов перейдите к финальному анализу результатов для тех исследованных
образцов, которые прошли контроль качества.
IX.3. Финальный анализ результатов
1) На основании полученных значений CT для ЦФ проведите финальный анализ результатов ПЦР-РВ с помощью алгоритма, приведенного в таблице 4. Всего возможны 4 варианта интерпретации
результатов мсПЦР-РВ:
• обнаружена мутация (далее – МУТАЦИЯ);
• мутации не обнаружено (далее – НОРМА);
www.evrogen.ru
21
X Идентификация мутаций с помощью секвенирования по Сэнгеру
• мутации не обнаружено, но избирательность анализа снижена
из-за того, что в реакцию внесено менее 10 нг геномной ДНК,
пригодной для ПЦР-анализа (далее – НОРМА*);
• результат недостоверен из-за того, что в реакцию внесено менее 0,05 нг геномной ДНК, пригодной для ПЦР-анализа (далее –
МАЛО ДНК).
2) Соответствующие данные («МУТАЦИЯ», «НОРМА», «НОРМА*» или
«МАЛО ДНК») внести в таблицу учета результатов в графу «Результат» (см. Приложение 3 к настоящей инструкции).
X. Идентификация мутаций с помощью
секвенирования по Сэнгеру
Продукты ПЦР, полученные с помощью наборов реагентов Insider, могут быть использованы для прямого секвенирования по Сэнгеру.
Прямое секвенирование продуктов ПЦР, полученных с помощью наборов реагентов Insider, позволяет решить следующие задачи:
• Идентифицировать выявленные мутации;
• Выявить возможные мутации, расположенные на небольшом расстоянии от анализируемых «горячих точек», но не затрагивающие
сами эти «горячие точки».
Кроме того, секвенирование может быть использовано в случае,
если необходима верификация результатов мсПЦР-РВ с помощью
«ортогонального» метода. Однако для большинства случаев такая верификация не является необходимой.
Оптимальной представляется двухэтапная стратегия мутационного
анализа, при использовании которой на первом этапе производится
скрининг образцов на наличие мутаций в «горячих точках» с помощью
мсПЦР-РВ, а на втором этапе осуществляется секвенирование для
образцов с выявленными мутациями с целью идентификации этих
мутаций.
Для секвенирования рекомендуется использовать:
• С целью идентификации мутации (если по результатам мсПЦР-РВ в
образце была выявоена мутация) – одну повторность реакции О и
22
Insider KRAS
X Идентификация мутаций с помощью секвенирования по Сэнгеру
одну повторность реакции М;
• С целью поиска мутаций за пределами «горячих точек» (если по результатам мсПЦР-РВ в образце не было выявлено мутаций) - две
повторности реакции О.
Важно отметить, что в случае, если в исходном образце фрагменты
ДНК с мутациями в «горячих точках» присутствовали в концентрации
от 1% до 15%, эти мутации будут обнаружены при секвенировании
продукта реакции М, но не продукта реакции О.
Для получения достоверных результатов анализировать с помощью
секвенирования по Сэнгеру можно только продукты тех реакций, в
которых значение CT для ЦФ меньше или равно среднему значению
′
CTм (ПКО). Секвенирование продуктов реакций с большим значением
CT может с большой вероятностью привести к получению ложноположительных результатов (т. е. к визуализации артефактов ПЦР).
Поэтому с помощью секвенирования продуктов мсПЦР-РВ можно верифицировать ее положительные, но не отрицательные результаты.
Перед проведением секвенирования следует произвести очистку
продуктов мсПЦР-РВ от неиспользованных компонентов реакции.
Для этой цели можно использовать готовые наборы реагентов, в
основе которых лежит колоночный, фильтрационный или ферментативный метод. Длина целевого продукта ПЦР во всех наборах серии
Insider составляет от 180 до 220 п.о.
Для проведения сиквенсной реакции можно использовать любые
стандартные наборы реагентов в соответствии с инструкциями производителей, а также специфический праймер для секвенирования,
входящий в состав каждого набора реагентов серии Insider. Конечная коцентрация праймера в сиквенсной реакции должна составлять
0,5 мкМ.
Секвенирующий капиллярный электрофорез и первичная обработка
«сырых» данных секвенирования проводится в соответствии со стандартными протоколами.
Анализ результатов секвенирования можно проводить с помощью
программ SeqScape (фирма Life Technologies, США), Chromas (фирма
TechnElysium, Австралия) или аналогичных.
www.evrogen.ru
23
XI Условия транспортировки, хранения и эксплуатации набора
Анализ каждого файла с результатами секвенирования проводится в
два этапа:
1) Вначале визуализируется хроматограмма и осуществляется проверка прочитанной нуклеотидной последовательности (попозиционное сличение хроматограммы с прочитанной последовательностью и при необходимости - корректировка последней);
I На этом этапе выполняется оценка качества прочтения нуклеотидной
последовательности, отбраковываются артефакты секвенирования, а
также корректируются прочтения гетерозиготных позиций.
2) затем производится сравнение (выравнивание) проверенной
прочитанной последовательности и референсной последовательности из базы данных Ensembl (http://www.ensembl.org) или
Entrez Nucleotide (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide) с помощью алгоритма BLAST или ClustalW.
Полученные данные отличаются высокой достоверностью при условии строгого соблюдения требований надлежащей лабораторной
практики и инструкций к использованным приборам, наборам реагентов и программам.
XI. Условия транспортировки, хранения и
эксплуатации набора
• ПЦР-смесь следует транспортировать при комнатной температуре и
хранить при температуре +2 – +8°C в течение всего срока годности
в сухом, защищенном от света месте. Замораживание ПЦР-смеси
не допускается.
• Остальные компоненты набора следует транспортировать и хранить
при температуре -20°C в течение всего срока годности в сухом, защищенном от света месте.
Срок годности набора 12 месяцев с даты изготовления.
Для получения достоверных результатов необходимо строгое соблюдение настоящей инструкции.
24
Insider KRAS
Приложение 1
Приложение 1.
Типичные кривые изменения флуоресценции
для контрольных образцов
Delta Rn, RFU
Delta Rn vs Cycle
0.2
Baseline
0.1
0
NTCО NTCМ
Threshold
-0.1
ОКОМ
-0.2
ПКОМ
-0.3
ОКОО
ПКОО
-0.4
-0.5
-0.6
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50
Рис. 2. Целевой фрагмент (2-й экзон гена KRAS).
Cycle Number
Delta Rn, RFU
Delta Rn vs Cycle
0.2
Baseline
0.1
Threshold
0
-0.1
-0.2
-0.3
-0.4
-0.5
-0.6
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50
Рис. 3. Экзогенный внутренний контроль.
www.evrogen.ru
Cycle Number
25
Приложение 2
Приложение 2.
Рекомендуемые протоколы первичной обработки
некоторых типов биологических проб
Первичная обработка цельной крови
1) Отберите 9 мл крови в полипропиленовую пробирку объемом 10
или 15 мл, содержащую 1,1 мл антикоагулянта на основе K3 EDTA.
2) Осторожно перемешайте кровь с антикоагулянтом 10-кратным
аккуратным переворачиванием.
I После этапа 2 допускается хранение пробы при комнатной температу­
ре не более 1 ч.
3) Центрифугируйте пробирку с кровью с ускорением 500 g в течение 15 мин при температуре 4°C.
4) Отберите супернатант и перенесите его в полипропиленовую пробирку объемом 5 мл. Исходную пробирку выбросьте.
5) Центрифугируйте пробирку с супернатантом с ускорением 2000 g
в течение 15 мин при температуре 4°C.
6) Отберите супернатант и перенесите его в полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл, соблюдая при этом максимальную осторожность, чтобы не задеть осадок. Пометьте пробирку как «ПлН»
(плазма крови неочищенная).
7) Перенесите осадок в другую полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл. Пометьте пробирку как «Кл» (клетки крови).
8) Пробирку «ПлН» центрифугируйте с ускорением 5000 g в течение
15 мин при температуре 4°C.
9) Пробирку «Кл» центрифугируйте в микроцентрифуге с максимальным ускорением в течение 3 мин при комнатной температуре.
10) Из пробирки «ПлН» перенесите супернатант в новую полипропиленовую пробирку объемом 1,5 мл, не захватывая нижнюю часть
супернатанта. Новую пробирку пометьте как «ПлО» (плазма крови
очищенная). Пробирку «ПлН» выбросьте.
11) Из пробирки «Кл» отберите супернатант и выбросьте его.
Пробы «ПлО» и «Кл» представляют собой фракции плазмы и клеток
26
Insider KRAS
Приложение 2
крови, соответственно, и подлежат дальнейшему исследованию.
Допускается хранение проб при температуре -80℃ до 6 месяцев.
Первичная обработка парафиновых блоков с
фиксированной формалином тканью
1) Выберите парафиновый блок, подходящий для исследования, на
основании морфологического анализа гистологических стеклопрепаратов.
2) С помощью ротационного микротома сделайте 10-40 срезов толщиной 10 мкм или в 2 раза большее количество срезов толщиной
5 мкм.
I необходимое количество срезов зависит от набора, с помощью кото­
рого планируется выделение ДНК
I Желательно использовать одноразовые лезвия для микротома; при
использовании многоразового лезвия (ножа) необходимо дважды про­
тереть его 96% этанолом непосредственно перед началом работы с
каждым новым блоком.
I Перед изготовлением «целевых» срезов необходимо сделать 2 среза
толщиной 10 мкм (или 4 среза толщиной 5 мкм) и выбросить их.
3) Поместите срезы в полипропиленовую пробирку с завинчивающейся крышкой объемом 10 или 15 мл.
4) Инкубируйте пробирку со срезами в термостате при температуре
85°C до полного расплавления парафина (обычно расплавление
происходит за 1-2 мин).
5) Внесите в пробирку 9 мл О-ксилола и закройте пробирку крышкой
до конца.
6) Инкубируйте пробирку при комнатной температуре в течение
5 мин.
7) Перемешайте содержимое пробирки на вортексе в течение 1 мин.
8) Центрифугируйте пробирку с ускорением 4500 g в течение 15 мин
при температуре 25°C.
9) Осторожно удалите супернатант и выбросите его.
10) Повторите пп. 5-9.
www.evrogen.ru
27
Приложение 2
11) Внесите в пробирку 3 мл 96% этанола и закройте пробирку крышкой до конца.
12) Повторите пп. 7-9.
13) Внесите в пробирку 3 мл 70% этанола и закройте пробирку крышкой до конца.
14) Повторите пп. 7-9.
15) Внесите в пробирку 3 мл 50% этанола и закройте пробирку крышкой до конца.
16) Повторите пп. 7-9.
17) Внесите в пробирку 2 мл буфера TE (10 mM Tris-HCl; 5 mM K3 EDTA;
pH = 8,0) и закройте пробирку крышкой до конца.
18) Повторите пп. 7-9.
Полученная проба представляет собой депарафинизированную ткань и
подлежит дальнейшему исследованию.
После завершения процедуры депарафинизации рекомендуется как мож­
но скорее провести инкубацию пробы с протеиназой К (см. пункт VIII.2
основного текста настоящей инструкции).
Допускается хранение депарафинизированной пробы при температуре
-20℃ до 5 дней.
28
Insider KRAS
Приложение 3
Приложение 3. Таблица учета результатов
Номер
образца
Название
образца
Расположение образца –
номера лунок*
Контроль
качества
Результат
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
ОКО
–
23.
ПКО
–
24.
NTC
–
* Например, A1-D1.
www.evrogen.ru
29
Приложение 4
Приложение 4. Список используемых
сокращений
Сокращение
Расшифровка
ДНК
Дезоксирибонуклеиновая кислота
ПЦР
Полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ
Полимеразная цепная реакция в режиме
реального времени
мсПЦР-РВ
Мутационно-специфическая полимеразная
цепная реакция в режиме реального времени
ЦФ
Целевой фрагмент
ЭВК
Экзогенный внутренний контроль
RFU
Относительные флуоресцентные единицы
(relative fluorescent units)
CT
Пороговый цикл (cycle of the threshold)
ПКО
Положительный контрольный образец ДНК
ОКО
Отрицательный контрольный образец ДНК
NTC
Контроль без ДНК (no template control)
ЕА
Единицы активности
Tris-HCl
Трис-гидроксиметиламинометана гидрохлорид
EDTA
Этилендиаминтетрауксусная кислота
(ethylenediamintetraacetic acid)
SDS
Дуодецилсульфат натрия (sodium
duodecylsulfate)
Буфер TE
Буфер на основе
трис-гидроксиметиламинометана гидрохлорида
и этилендиаминтетрауксусной кислоты
OMIM
База данных о наследуемых (преимущественно
моногенных) заболеваниях человека (Online
Mendelian Inheritance in Man,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)
Кат. N
Каталожный номер
30
Insider KRAS
вер. 23 июля 2015 г.
ЗАО Евроген
Москва 117997
ул. Миклухо-Маклая 16/10, корпус
70 (Технопарк ИБХ)
Тел.: +7 (495) 988-4083
Факс: +7 (495) 988-4085
www.evrogen.ru
order@evrogen.ru