прикладная молекулярная биология
advertisement
Министерство образования Республики Беларусь УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ ЯНКИ КУПАЛЫ» В.И. Резяпкин ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Пособие по курсам «Молекулярная биология», «Основы молекулярной биологии», для студентов специальностей: 1-31 01 01 – Биология, 1-33 01 01 – Биоэкология Гродно 2011 УДК 54(075.8) ББК 24.1 Р34 Рекомендовано Советом факультета биологии и экологии ГрГУ им. Я. Купалы. Рецензенты: Заводник И.Б., доктор биологических наук, доцент; Буко В.У., доктор биологических наук, профессор. Резяпкин, В.И. Р34 Прикладная молекулярная биология : пособие / В.И. Резяпкин. – Гродно : ГрГУ, 2011. – 167 с. ISBN 978-985-515-430-4 В книге рассмотрены основные области практического применения достижений молекулярной биологии: ДНК-диагностика, ферменты и методы, используемые в генетической инженерии, способы получения рекомбинантных векторов, генетическая инженерия прокариот, эукариотические системы экспрессии чужеродных генов, способы получения и практическая значимость трансгенных растений и животных, достижения и перспективы генотерапии. Адресовано студентам специальностей: «Биология», «Биоэкология». УДК 54(075.8) ББК 24.1 ISBN 978-985-515-430-4 © Резяпкин В.И., 2011 © Учреждение образования «Гродненский государственный университет» имени Янки Купалы, 2011 ВВЕДЕНИЕ Знания, полученные при изучении фундаментальных основ хранения, передачи и реализации генетической информации, на современном этапе развития науки нашли широкое применение в различных областях практической деятельности человека. С помощью методов, разработанных молекулярными биологами, созданы многочисленные живые организмы с измененным генетическим материалом, обладающие разнообразными полезными характеристиками. Разработаны многочисленные средства диагностики, широко применяемые в медицине, сельском хозяйстве, криминалистике и других сферах. Особый интерес представляют современные, основанные на принципах генотерапии, подходы профилактики и корректировки генетических заболеваний. В предлагаемой книге рассмотрены основные области практического применения достижений молекулярной биологии: ДНК-диагностика, ферменты и методы, используемые в генетической инженерии, способы получения рекомбинантных векторов, генетическая инженерия прокариот, эукариотические системы экспрессии чужеродных генов, способы получения и практическая значимость трансгенных растений и животных, достижения и перспективы генотерапии. Пособие написано в соответствии с учебной программой по курсу «Молекулярная биология» для студентов специальностей: «Биология», «Биоэкология» и является продолжением ранее изданного пособия: «Основы молекулярной биологии» / В.И. Резяпкин. – Гродно: ГрГУ, 2010. – 220 с. СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ А – аденин АМФ – аденозинмонофосфат АДФ – аденозиндифосфат АТФ – аденозинтрифосфат Г – гуанин ГДФ – гуанозиндифосфат ГМФ – гуанозинмонофосфат ГТФ – гуанозинтрифосфат дАДФ – дезоксиаденозиндифосфат дАМФ – дезоксиаденозинмонофосфат дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат дГДФ – дезоксигуанозиндифосфат дГМФ – дезоксигуанозинмонофосфат дГТФ – дезоксигуанозинтрифосфат дНДФ – дезоксинуклеозиддифосфат ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота дНМФ – дезоксинуклеозидмонофосфат дНТФ – дезоксинуклеозидтрифосфат дТДФ – дезокситимидиндифосфат дТМФ – дезокситимидинмонофосфат дТТФ – дезокситимидинтрифосфат дЦДФ – дезоксицитидиндифосфат дЦМФ – дезоксицитидинмонофосфат дЦТФ – дезоксицитидинтрифосфат иРНК – информационная РНК МГЭ – мобильные генетические элементы мРНК – матричная РНК НДФ – нуклеозиддифосфат НК – нуклеиновые кислоты НМФ – нуклеозидмонофосфат НТФ – нуклеозидтрифосфат П.н. – пара нуклеотидов РНК – рибонуклеиновая кислота рРНК – рибосомная РНК Т – тимин тРНК – транспортная РНК У – урацил УДФ – уридиндифосфат УМФ – уридинмонофосфат УТФ – уридинтрифосфат Ц – цитозин цАМФ – циклическая АМФ ЦМФ – цитидинмонофосфат ЦДФ – цитидиндифосфат ЦТФ – цитидинтрифосфат А – аденин АМФ – аденозинмонофосфат АДФ – аденозиндифосфат АТФ – аденозинтрифосфат Г – гуанин ГДФ – гуанозиндифосфат ГМФ – гуанозинмонофосфат ГТФ – гуанозинтрифосфат дАДФ – дезоксиаденозиндифосфат дАМФ – дезоксиаденозинмонофосфат дАТФ – дезоксиаденозинтрифосфат дГДФ – дезоксигуанозиндифосфат дГМФ – дезоксигуанозинмонофосфат дГТФ – дезоксигуанозинтрифосфат дНДФ – дезоксинуклеозиддифосфат ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота дНМФ – дезоксинуклеозидмонофосфат дНТФ – дезоксинуклеозидтрифосфат дТДФ – дезокситимидиндифосфат дТМФ – дезокситимидинмонофосфат дТТФ – дезокситимидинтрифосфат дЦДФ – дезоксицитидиндифосфат дЦМФ – дезоксицитидинмонофосфат дЦТФ – дезоксицитидинтрифосфат иРНК – информационная РНК МГЭ – мобильные генетические элементы мРНК – матричная РНК НДФ – нуклеозиддифосфат НК – нуклеиновые кислоты НМФ – нуклеозидмонофосфат НТФ – нуклеозидтрифосфат П.н. – пара нуклеотидов РНК – рибонуклеиновая кислота рРНК – рибосомная РНК Т – тимин тРНК – транспортная РНК У – урацил УДФ – уридиндифосфат УМФ – уридинмонофосфат УТФ – уридинтрифосфат Ц – цитозин цАМФ – циклическая АМФ ЦМФ – цитидинмонофосфат ЦДФ – цитидиндифосфат ЦТФ – цитидинтрифосфат Глава 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК Определение первичной структуры (секвенирование) ДНК является сложнейшей процедурой, так как эта молекула имеет громаднейшие размеры. Например, у цветковых растений размер гаплоидного генома может достигать до 1011 п.н. Несмотря на это исследователи придают большое значение установлению последовательности нуклеотидов ДНК, поскольку информация о первичной структуре ее молекулы или ее фрагмента позволяет судить о ее непосредственной функции в живом организме. Определение первичной структуры ДНК осуществляют в несколько этапов. Этап 1. Фрагментация ДНК с помощью рестриктаз. В связи с тем, что в одном эксперименте можно определить последовательность ДНК, состоящую только из нескольких сотен пар нуклеотидов, ее молекулу предварительно фрагментируют. Для фрагментации ДНК обычно используют рестриктазы. Эти ферменты обладают специфичностью к первичной структуре ДНК и разрезают эту молекулу в строго определенных участках. При этом одна рестриктаза разрывает цепь ДНК в одних участках, другая – в других местах. Для фрагментации используют, как минимум, две различные рестриктазы. В результате их действия образуются перекрывающиеся фрагменты (рис. 1.1). Этап 2. Определение нуклеотидных последовательностей перекрывающихся фрагментов. Существуют два принципиально отличающихся друг от друга подхода определения первичной структуры ДНК: химический метод, разработанный А.Максомом и В.Гилбертом, и ферментативный метод, предложенный Ф.Сангером. Последний метод наиболее распространен. Оба метода в настоящее время полностью автоматизированы, что значительно повысило эффективность определения первичной структуры ДНК. Прикладная молекулярная биология Метод А.Максома и В.Гилберта (химический метод) Данный метод основан на специфическом химическом расщеплении полинуклеотидной цепи. В этом случае используются подходы, обеспечивающие выщепление определенного нуклеотида (либо по А, либо по Г, либо по Т, либо по Ц) и как следствие этого разрыв цепи ДНК. Определение первичной структуры ДНК осуществляют в 4 стадии. Рис. 1.1. Схема, иллюстрирующая фрагментацию ДНК с помощью рестриктаз Стадии 1. На этой стадии двухцепочечные ДНК разделяют с помощью денатурации. Затем в 5’-конец цепи ДНК вносят метку (рис. 1.2). Стадии 2. Анализируемый образец делят на 4 порции. Каждую порцию подвергают химической обработке, в результате ДНК распадается на фрагменты различной длины Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК (рис. 1.2) за счет статистического выщепления остатков Ц (порция 1), Т (порция 2), Г (порция 3), А (порция 4). В результате фрагментации образуются фрагменты как несущие метку, так и не несущие. В каждой порции образуется несколько меченых фрагментов, отличающихся друг от друга размером. Число таких меченых фрагментов будет равно числу нуклеотидов, по которым осуществлялось расщепление. Если в первой порции расщепление проводили по Ц, а таких нуклеотидов в анализируемой цепи два, то и меченых фрагментов образовалось также 2 (рис. 1.2). Стадии 3. На этой стадии проводят электрофорез полученных фрагментов (рис. 1.2). Скорость перемещения фрагментов обратно пропорциональна их длине. Чем короче фрагмент, тем с большей скоростью он перемещается. С помощью электрофореза можно разделить фрагменты, отличающиеся друг от друга на один нуклеотид. По окончанию электрофореза по длине перемещения определяют размер в данном эксперименте только меченных с 5’-конца фрагментов. Стадии 4. По результатам электрофореза меченых фрагментов определяют первичную структуру ДНК. В первой порции, где расщепление проводили по Ц, выявлено два меченных фрагмента, состоящих из трех и шести нуклеотидов. Поскольку расщепление цепи осуществляли за счет статистического выщепления Ц, то этот нуклеотид в анализируемой цепи будет занимать положение 4 и 7. Аналогично, по длине фрагментов, образующихся во 2-й порции, определяем положение Т в анализируемой цепи ДНК. Этот нуклеотид занимает 3 и 8 позиции. Подобным образом устанавливаем положения Г (6 и 10) и А (2, 5 и 9). Таким образом, устанавливается первичная структура неизвестной нуклеотидной последовательности ДНК. Прикладная молекулярная биология Рис. 1.2. Установление первичной структуры ДНК с помощью метода А.Максома и В.Гилберта (химический метод). Для удобства на рисунке приведена первичная структура определяемого фрагмента. 1 – стадия 1, 2 – стадия 2, 3 – стадия 3, 4 – стадия 4 Метод Ф.Сангера (энзиматический метод) В его основе лежит принцип копирования анализируемой цепи ДНК с помощью ДНК-полимеразы. Этот фермент осуществляет наращивание цепи ДНК в результате присоединения очередного дезоксинуклеотида к 3’-гидро Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК ксильной группе последнего дезоксинуклеотида. ДНКполимераза может использовать в качестве субстратов не только дезоксинуклеозидтрифосфаты, но и дидезоксинукл еозидтрифосфаты. У последних отсутствует гидроксильная группа в 3’-положении (рис. 1.3). Если в растущую цепь ДНК-полимераза включит дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК обрывается, потому что в 3’-положении отсутствует гидроксильная группа, если же дезоксинуклеотид, то синтез ДНК может быть продолжен (рис. 1.4). Рис.1.3. У дидезоксинуклеозидтрифосфата в отличие от дезоксинуклеозидтрифосфата гидроксильная группа в 3’-положении При определении первичной структуры ДНК по данному методу образец ДНК разделяют на четыре порции. Во все порции добавляют: • ДНК-полимеразу; •дНТФ (дАТФ, дТТФ, дЦТФ, дГТФ); •меченую затравку – олигонуклеотид, комплементарный 3’-концу анализируемой цепи ДНК. Затем в первую порцию добавляют ддАТФ, во вторую – ддТТФ, в третью – ддЦТФ, в четвертую – ддГТФ. Рассмотрим события, происходящие в первой пробе (рис. 1.5). Затравка гибридизуется с участком ДНК анализируемой цепи в области ее 3’-конца. После этого ДНКполимераза будет включать в растущую цепь нуклеотиды в соответствии с принципом комплементарности. Напротив Т она может включить либо дАМФ, либо ддАМФ. Процесс включения является вероятностным. Если в растущую цепь ДНК включится ддАМФ, то синтез ДНК оборвется. Если же в растущую цепь ДНК включится дАМФ, то синтез ДНК будет продолжен. В результате в пробе будут содержаться Прикладная молекулярная биология фрагменты вновь синтезированной цепи ДНК различной длины. При этом все они будут заканчиваться ддАМФ. После денатурации двухцепочечной ДНК с помощью электрофореза определяют длину вновь синтезированных фрагментов. Если длина фрагментов ДНК равна 13, 18 и 23 нуклеотидам, следовательно, в 13, 18 и 23 положении фрагмента будет находится А, а в анализируемой цепи Т. Аналогично определяют положение других нуклеотидов в анализируемой цепи ДНК. Таким образом, устанавливается первичная структура ДНК. Рис. 1.4. Если в растущую цепь ДНК-полимераза включит дидезоксинуклеотид, то синтез ДНК обрывется, если же дезоксинуклеотид, то синтез ДНК может быть продолжен 10 Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Рис. 1.5. Установление первичной структуры ДНК с помощью метода Ф. Сангера и Д. Коулсона (энзиматический метод). Для удобства на рисунке приведена первичная структура определяемого фрагмента. Этап 3. Установление первичной структуры ДНК посредством сопоставления перекрывающихся нуклеотидных последовательностей. После определения последовательности нуклеотидов фрагментов ДНК необходимо определить их очередность в интактной молекуле ДНК. Порядок их чередования устанав11 Прикладная молекулярная биология ливают на основании того, что фрагменты, полученные в результате разрезания разными рестриктазами, имеют идентичные фрагменты нуклеотидных последовательностей (рис. 1.6). Рис. 1.6. Установление первичной структуры ДНК посредством сопоставления перекрывающихся нуклеотидных последовательностей 12 Глава 2. СИНТЕЗ ДНК Химический синтез ДНК В настоящее время разработаны методы химического синтеза как одноцепочечных олигонуклеотидов, так и двухцепочечных ДНК. Синтез двухцепочечных ДНК осуществляют в два этапа. На первом этапе синтезируют одноцепочечные олигонуклеотиды с заданной последовательностью нуклеотидов. На втором этапе синтезированные олигонуклеотиды используются для конструирования протяженных двухцепочечных ДНК. Используя данный подход, можно синтезировать гены или другие последовательности ДНК, применяемые в генетической инженерии, биотехнологии, в ДНК-диагностике инфекционных и генетических заболеваниях, для идентификации личности и др. В настоящее время процедура химического синтеза ДНК автоматизирована. Приборы, в которых осуществляется синтез ДНК, называются ДНК-синтезаторами. Рассмотрим принцип метода, используемого для синтеза олигонуклеотидов (рис. 2.1). В начале этой процедуры первый мономер присоединяют к твердой фазе (нерастворимому носителю), который затем помещают в колонку-реактор. Далее через колонку пропускают второй мономер и другие химические реагенты. В результате второй мономер присоединяется к первому, образуя димер. Потом колонку промывают, с целью удаления непрореагировавших реагентов и побочных продуктов реакции. На этом завершается первый цикл. Затем осуществляют следующий цикл, пропуская через колонку очередной мономер. Циклы многократно повторяют до завершения синтеза олигонуклеотида с заданной первичной структурой. После завершения синтеза олигонуклеотид отделяют от твердой фазы и подвергают очистке. Полученные олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве зондов при ДНКдиагностике, в качестве праймеров при секвенировании ДНК, а также для синтеза генов и др. 13 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.1. Схема синтеза олигонуклеотида. N – азотистое основание, 1 – присоединение первого мономера к твердой фазе, 2 – присоединение второго мономера, 3 – присоединение третьего мономера, 4 – отделение олигонуклеотида от твердой фазы Олигонуклеотиды могут быть использованы для синтеза двухцепочечных ДНК. Стратегии синтеза коротких и протяженных двухцепочечных ДНК отличаются. Для получения коротких двухцепочечных молекул (60 – 80 п.н.) вначале синтезируют комплементарные цепи, которые затем подвергают гибридизации (рис. 2.2). Рис. 2.2. Схема синтеза коротких двухцепочечных молекул ДНК 14 Глава 2. Синтез ДНК В случае синтеза более протяженных двухцепочечных ДНК (более 300 п.н.) применяют другие подходы. Необходимость их использования связана с тем, что при химическом синтезе олигонуклеотидов происходят ошибки, в результате которых синтез протяженного олигонуклеотида сопровождается крайне низким выходом. В связи с этим длинные двухцепочечные ДНК собирают из коротких одноцепочечных фрагментов, размер которых составляет 20 – 100 нуклеотидов. Сборку двухцепочечных молекул ДНК из одноцепочечных фрагментов можно осуществлять разными способами. Один из способов подразумевает получение набора фрагментов с перекрывающимися концами (рис. 2.3). Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК. Имеющиеся в ее молекуле одноцепочечные разрывы далее сшивают с помощью ДНК-лигазы. Другой подход, используемый для синтеза протяженных двухцепочечных ДНК, также подразумевает синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами (рис. 2.4). Однако после гибридизации таких фрагментов в молекуле ДНК образуются большие бреши. Последние ликвидируются с помощью ДНК-полимеразы. Оставшиеся после работы ДНК-полимеразы разрывы сшиваются с помощью ДНКлигазы. 15 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.3. Схема получения протяженных двухцепочечных ДНК, включающего синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК с разрывами, которые сшивают с помощью ДНК-лигазы Рис. 2.4. Схема получения протяженных двухцепочечных ДНК, включающего синтез набора фрагментов с перекрывающимися концами. Нуклеотидные последовательности фрагментов подобраны таким образом, что после их гибридизации образуется двухцепоченая ДНК с брешами. Последние ликвидируются с помощью ДНК-полимеразы. Оставшиеся после работы ДНКполимеразы разрывы сшиваются с помощью ДНК-лигазы 16 Глава 2. Синтез ДНК Полимеразная цепная реакция (ПЦР) Суть метода ПЦР заключается в многократном копировании определенного участка ДНК. В течение нескольких часов с помощью этого метода можно получить более 50 млрд. копий специфических нуклеотидных последовательностей (рис. 2.5). Этот метод широко используют для синтеза генов. Однако только этим применение ПЦР не ограничивается. Рис. 2.5. В результате ПЦР можно получить множество копий специфических последовательностей ДНК При проведении ПЦР в реакционную смесь добавляют следующие компоненты: •ДНК-матрицу, содержащую тот участок ДНК (ДНКмишень), который требуется амплифицировать; •праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды (15 – 30 нуклеотидов), комплементарные концевым участкам ДНК-мишени и способные с ними образовывать гибриды (рис. 2.6); •Tag-полимераза – термостабильная ДНК-полимераза, катализирующая реакцию полимеризации ДНК и выдерживающая нагревание до 95 °С; •дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) – субстраты для синтеза ДНК. 17 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.6. Праймеры – олигонуклеотиды, комплементарные концевым участкам ДНК-мишени. После плавления ДНК и последующего отжига они способны с последними образовывать гибриды. Р1 и Р2 – праймеры При проведении ПЦР осуществляют многократное повторение циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурация, отжиг и элонгация. Рассмотрим подробнее эти стадии. •Денатурация. На этой стадии реакционную смесь, содержащую все компоненты, необходимые для ПЦР, нагревают до 92 – 95 °С, в результате происходит плавление ДНК и ее цепи расходятся (рис. 2.7). •Отжиг. Реакционную смесь охлаждают приблизительно до 55 °С, при этом праймеры гибридизуются с комплементарными последовательностями ДНК (рис. 2.7). •Элонгация. Температуру реакционной смеси на этой стадии повышают приблизительно до 75 °С, поскольку активность Tag-полимеразы в таких условиях оптимальна. ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, осуществляет синтез комплементарной цепи ДНК (рис. 2.7). На рис. 2.7 показаны события, происходящие на первом цикле ПЦР. Как видно из рисунка после первого 18 Глава 2. Синтез ДНК цикла длина каждой из синтезированных цепей ДНК больше длины нуклеотидной последовательности ДНК-мишени. Таким образом, на этой стадии не происходит образования первой копии фрагмента ДНК, который требуется получить в результате амплификации. Рис. 2.7. События, происходящие на первом цикле ПЦР. Р1 и Р2 – праймеры Первая же копия фрагмента амплификации образуется только после третьего цикла ПЦР (рис. 2.8). Для получения большого количества копий фрагмента амплификации цикл повторяется 30 – 35 раз. На рис. 2.9 показаны события, осуществляющиеся при протекании поздних циклов ПЦР. В это время в реакционной смеси содержатся главным образом фрагменты ДНК, являющиеся копиями ДНК-мишени. Каждый цикл длится около 3 – 5 мин. К концу 30 цикла число копий превышает 106. ПЦР является высокочувствительным методом, позволяющим при наличии ничтожного количества ДНК в пробе получить огромное число копий интересующих исследователя фрагментов ДНК. 19 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.8. Первая копия фрагмента амплификации образуется после третьего цикла ПЦР. Р1 и Р2 – праймеры ПЦР в настоящее время широко используют для проведения различных видов анализа. Во многих случаях в анализируемых образцах требуется выявить наличие определенных последовательностей ДНК. Например, при идентификации патогенных микроорганизмов в биологических объектах достаточным является выявление ДНК этого возбудителя в исследованных образцах. С этой целью может быть использован ПЦР-анализ. ПЦР-анализ проводят в три стадии. На первой стадии осуществляют подготовку образцов ДНК. Они могут быть выделены из любого биологического объекта. На второй стадии осуществляют амплификацию специфических нуклеотидных последовательностей. В этом случае необходимо использовать праймеры, комплементарные к искомой ДНК. Если в исследуемом образце присутствует искомая ДНК, то праймеры в процессе отжига будут с 20 Глава 2. Синтез ДНК ней гибридизоваться и Tag-полимераза сможет начать синтез ДНК. Тогда в результате ПЦР будут синтезированы многочисленные копии фрагмента амплификации. При отсутствии искомой ДНК в исследуемых образцах праймеры не будут гибридизоваться с ДНК и не смогут выступать в качестве затравки для полимеразы. Синтез ДНК не будет осуществляться. На третьей стадии посредством электрофореза в агарозном геле выявляют наличие или отсутствие в реакционной смеси продукта амплификации (рис. 2.10). При наличии продукта амплификации делается заключение о том, что в исследуем образце присутствует искомая ДНК. Рис. 2.9. При протекании поздних циклов ПЦР в реакционной смеси содержатся главным образом фрагменты ДНК, являющиеся копиями ДНК-мишени. Р1 и Р2 – праймеры 21 Прикладная молекулярная биология Рис. 2.10. Выявление наличия или отсутствия в реакционной смеси продукта амплификации посредством электрофореза в агарозном геле. Стрелкой указано направление электрофореза. 1 – положительный контроль, 2 – отрицательный контроль, 3 – отрицательный образец, 4 – положительный образец ПЦР-анализ нашел и находит применение в различных областях: при диагностике инфекционных, генетических и онкологических заболеваний, диагностике патогенов в пищевых продуктах, диагностике генетически модифицированных продуктов, идентификации личности и т.д. При диагностике инфекционных заболеваний используются праймеры, специфичные к участкам ДНК потенциального возбудителя, но не пациентов. При наличии ДНК возбудителя в биологических образцах, полученных от больного, ПЦР-анализ даст положительный результат, при отсутствии такой ДНК – отрицательный. Таким образом, на основании ПЦР-анализа можно сделать вывод о причине заболевания. ПЦР-анализ позволяет выявить возбудителя заболевания в очень низкой концентрации. Соответственно, при диагностике генетических и онкологических болезней используются праймеры, специфичные к генам, обуславливающим данные заболевания. А при диагностике патогенов в пище используются праймеры, специфичные к ДНК патогенов. 22 Глава 2. Синтез ДНК ПЦР с обратной транскрипцией Геномы многих вирусов представлены РНК. В их жизненных циклах может отсутствовать промежуточная фаза превращения РНК в ДНК. В связи с этим при выявлении РНК таких вирусов ее необходимо перевести в форму ДНК. Для этого используют термостабильную обратную транскриптазу (ревертазу) – фермент, использующий в качестве матрицы одноцепочечную РНК для синтеза двухцепочечной ДНК. При проведении обратной транскрипции в реакционной среде должны присутствовать праймеры и дНТФ. После обратной транскрипции полученная комплементарная ДНК (кДНК) может быть амплифицирована с помощью ПЦР (рис. 2.11). Рис. 2.11. ПЦР с обратной транскрипцией Рассмотренный выше метод может быть применен также для синтеза кДНК при использовании в качестве матрицы иРНК или других типов РНК. 23 Прикладная молекулярная биология ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени позволяет осуществлять детекцию продуктов амплификации во время проведения эксперимента. Этот метод исключает стадию электрофореза, что способствует существенному сокращению продолжительности эксперимента. Накопление продуктов ПЦР пропорционально числу копий исследуемой ДНК (или РНК) в анализируемом образце. В связи с этим возможно количественное определение ДНК или РНК. Существует множество подходов регистрации продуктов амплификации в процессе ПЦР. Рассмотрим один из таковых, получивший название «Выщепление 5’-концевой метки» (рис. 2.12). При использовании этой методики в реак-ционную смесь добавляют ДНК-зонды, содержащие на 5’-конце флуоресцентную метку (флуорофор), а на 3’-конце – гаситель флуоресценции. ДНК-зонды комплементарны участку амплификации. В ходе ПЦР на стадии отжига ДНКзонды присоединяются к участку амплификации. В таком состоянии гаситель поглощает излучение, испускаемое флуоресцентной меткой. На стадии элонгации ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, начинает синтез комплементарной цепи ДНК в направлении ДНКзонда. При его достижении благодаря 5’-экзонуклеазной активности этот фермент выщепляет флуорофор. В результате происходит разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что сопровождается свечением. Интенсивность свечения с каждым циклом ПЦР будет усиливаться. В то же время интенсивность свечения будет зависеть и от числа копий анализируемых ДНК в образце. Чем интенсивнее свечение, тем больше число копий. Таким образом, по интенсивности свечения можно судить о количественном содержании анализируемой ДНК в исследуемых пробах. 24 Глава 2. Синтез ДНК Рис. 2.12. Регистрация продуктов амплификации в процессе ПЦР в реальном времени при использовании методики «Выщепление 5’-концевой метки» 25 Глава 3. ДНК-ДИАГНОСТИКА Первичная структура ДНК индивидуумов, относящихся к одному или различным видам живых существ, в определенной степени уникальна. На этой особенности основана ДНК-диагностика. Последняя включает группу методов, позволяющих установить истину в результате исследования ДНК. Сегодня ДНК-диагностика нашла широкое применение при выявлении возбудителей инфекционных заболеваний, обнаружения генетических заболеваний, установлении биологического родства, идентификации личности и т.д. Образцы ДНК для исследования могут быть выделены из любого биологического материала: из крови, волоса, мочи, мокроты, соскоба с внутренней стороны щеки или мочеиспускательного канала и т. п. Оказываются пригодными для ДНК-диагностики биологические образцы, сохраняющиеся в течение сотен и тысяч лет. Количество ДНК, необходимое для проведения анализа может быть ничтожно малым. Возможно успешная диагностика, даже если в образце имеется только одна молекула ДНК. ДНК-диагностика является не только чрезвычайно чувствительным методом, но высокоточным. Ее точность приближается к 100 %. При ДНК-диагностике широко используется метод ПЦР. Его принцип и применение были рассмотрены в предыдущей главе. ПЦР может быть применен при анализе ДНК в сочетании с другими подходами. Об этом поговорим подробнее в следующих разделах. В то же время многие диагностические методы основаны на использовании меченых гибридизационных зондов, комплементарных к искомой молекуле ДНК. ДНК-диагностика с использованием меченых гибридизационных зондов Этот метод основан на использовании гибридизационных зондов, комплементарных к искомым последовательностям ДНК. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК. Они 26 Глава 3. ДНК-диагностика могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов). Они могут представлять собой продукт химического синтеза или являться клонированными копиями интактных генов или их фрагментов. Гибридизационный зонд должен быть высокоспецифичным, т.е. он должен спариваться только с искомой нуклеотидной последовательностью. Кроме того зонд должен содержать радиоактивную (или нерадиоактивную) метку. Последовательность действий при данном методе диагностики следующая (рис. 3.1): • получение образца ДНК из биологического объекта; • денатурация ДНК; • фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре; • нанесение на фильтр меченого одноцепочечного ДНКзонда, который при определенных условиях гибридизуется с ДНК-мишенью; • промывание фильтра для удаления избытка не связавшейся меченой ДНК-зонда; • детекция гибридных молекул зонд/мишень. Рис. 3.1. ДНК-диагностика с использованием меченых гибридизационных зондов 27 Прикладная молекулярная биология Выявление на последней стадии эксперимента гибридных молекул зонд/мишень свидетельствует о наличии искомой ДНК в исследуемой пробе. Об отсутствии таковой ДНК в анализируемой пробе позволяет судить отрицательный результат детекции. Таким образом, с помощью меченого зонда можно выявить (или не выявить) определенные последовательности ДНК в образце и на основании этого сделать соответствующий вывод. В качестве гибридизационных зондов часто используют зонды, меченные радиоактивным изотопом 32Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и в связи с этим легко детектируются. Радиоактивную метку на фильтре после удаления несвязавшегося зонда выявляют с помощью радиоавтографии. Однако, радиоактивно меченые зонды несут определенную экологическую опасность. По этой причине в настоящее время все чаще используют зонды, меченные другим способом. Нашли широкое применение зонды, меченые биотином. Последовательность действий при использовании таких зондов следующая (рис. 3.2): • гибридизация зонда, меченного биотином, с ДНКмишенью; • удаление промыванием избытка несвязавшегося зонда; • добавление авидина (белка куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог авидина), эти белки имеют несколько центров сродства к биотину, и благодаря им связываются с биотинилированным зондом; • добавление связанного с биотином фермента. Обычно для этих целей используют щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена. Биотинилированный фермент связывается с сайтом связывания биотина, расположенном в молекуле стрептавидина (или авидина); • добавление субстрата, который под действием используемого фермента превращается в окрашенный или хемилюминесцентный продукт; • регистрация изменения окраски либо люминесценции. Нерадиоактивные зонды не только более экологичны, чем радиоактивные, но и более стабильны. Долговечность 28 Глава 3. ДНК-диагностика зондов меченных Р ограничена быстрым распадом радиоактивного изотопа, период полураспада 32Р составляет 14,3 суток. Биотинилированные же зонды стабильны не менее чем год. В то же время нерадиоактивные зонды по чувствительности не уступают радиоактивным. 32 Рис. 3.2. ДНК-диагностика с использованием гибридизационного зонда, меченого биотином. Б – биотин, С – стрептавидин, ЩФ – щелочная фосфатаза Еще одним методом нерадиоактивной детекции является подход, основанный на использовании зонда – «молекулярного маяка» (рис. 3.3). Этот зонд состоит из нескольких десятков нуклеотидов. Нуклеотиды, расположенные во внутренней части зонда, комплементарны ДНК-мишени. Нуклеотиды же, находящиеся на концах зонда, взаимно комплементарны и образуют шпильку. К 5’-концу зонда присоединен флуорофор, испускающий излучение, а к 3’-концу – тушитель, поглощающий испускаемое флуорофором излучение. После гибридизации зонда – «молекулярного маяка» с ДНК-мишенью, происходит пространственное разобщение флуорофора и тушителя, и зонд начинает испускать свет. Испускаемое свечение свидетельствует о том, что между зондом и ДНК-мишенью произошла гибридизация (рис. 3.3). 29 Прикладная молекулярная биология Рис. 3.3. В результате гибридизации зонда – «молекулярного маяка» с ДНК-мишенью наблюдается флуоресценция ДНК-фингерпринтинг ДНК-фингерпринтинг (или геномная дактилоскопия) применяется для генетической идентификации личности, установления отцовства и в криминалистике. Последовательность процедур при использовании метода ДНК-фингерпринтинга следующая: •подготовка образца крови или ткани; •выделение ДНК из образца; •фрагментация ДНК рестриктазой; •электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле; •перенос ДНК из геля на мембрану; •гибридизация на мембране ДНК с одним или несколькими зондами, комплементарными определенным нуклеотидным последовательностям. В качестве зондов обычно используют минисателлитные ДНК; •отмывка избытка меченого зонда; •выявление полос гибридизации; •анализ полученного результата. 30 Глава 3. ДНК-диагностика Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, у различных индивидуумов различно (рис. 3.4), но для разных тканей одного и того же индивидуума, оно остается постоянным и не зависит от возраста. В связи с этим данный метод может быть использован для создания ДНК-паспортов, которые представляют собой спектр распределения гибридизационных полос, полученный рассмотренным выше методом. Этот спектр остается постоянным на протяжении всей жизни, поэтому ДНК-паспорт нельзя потерять и его нельзя подделать. Рис. 3.4. Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, у различных индивидуумов, 1, 2, 3 – образцы ДНК, полученные от различных индивидуумов ДНК-фингерпринтинг используется в судебной медицине для идентификации личности. Сравнивая полученные методом ДНК-фингерпринтинга результаты анализа ДНК подозреваемого и ДНК, выделенной из биологических образцов (крови, спермы, кусочка кожи, волос и т.д.) с места преступления, можно сделать вывод о причастности подозреваемого к преступлению (рис. 3.5). Если спектры гибридизационных полос при анализе ДНК подозреваемого 31 Прикладная молекулярная биология и ДНК образцов с места преступления совпадают, то можно с высокой долей вероятности судить о причастности подозреваемого к преступлению. Если же спектры не совпадают, то эти данные свидетельствуют о непричастности подозреваемого к преступлению. Рис. 3.5. Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, при анализе ДНК, выделенной из биологического образца с места преступления (БО) и из тканей подозреваемого 1 (П1) и подозреваемого 2 (П2). Совпадение спектра гибридизационных полос, выявленных при анализе ДНК из образца с места преступления, с таковым подозреваемого 2 свидетельствует о причастности его к преступлению. Отличие спектра гибридизационных полос, выявленных при анализе ДНК из образца с места преступления, от такового подозреваемого 1 свидетельствует о его непричастности к преступлению ДНК-фингерпринтинг может быть применен для установления отцовства. Поскольку распределение полос гибридизации наследуется по законам Менделя, то потомки от матери и отца наследуют по половине полос. Сравнивая полученные результаты ДНК-анализа предполагаемого отца, матери и ребенка можно определить является ли предполагаемый отец биологическим отцом или нет (рис. 3.6). 32 Глава 3. ДНК-диагностика Рис. 3.6. Распределение гибридизационных полос, полученных с использованием метода ДНК-фингерпринтинга, при анализе ДНК матери (М), ребенка (Р) и двух предполагаемых отцов. Из анализа результатов следует, что ребенок унаследовал половину полос от матери и половину полос от П1. Следовательно, он и является биологическим отцом Диагностика инфекционных заболеваний В настоящее время зонды широко используются для диагностирования инфекционных заболеваний. В качестве зондов, используются нуклеотидные последовательности, комплементарные к ДНК возбудителя, но не к ДНК человека или к ДНК организмов, которые могут присутствовать в биообразцах взятых для ДНК-диагностики. При этом предпочтительно использовать зонды, комплементарные к высокоповторяющимся последовательностям ДНК возбудителя, что значительно повышает чувствительность метода диагностирования. Получены и охарактеризованы более сотни ДНК-зондов, позволяющих идентифицировать патогенные штаммы различных бактерий, вирусов и паразитических простейших. ДНК-диагностика генетических заболеваний ДНК-диагностика генетических болезней позволяет на уровне ДНК идентифицировать ту или иную патологию. На основании ДНК-теста можно сделать вывод о том, 33 Прикладная молекулярная биология что причиной заболевания являются или не являются нарушения в организации ДНК. Многие наследственные заболевания проявляются не сразу, а по прошествии довольно продолжительного времени. ДНК-диагностика же позволяет выявить болезнь, когда еще признаки заболевания не проявились. В связи с этим ДНК-диагностика в раннем возрасте позволит заблаговременно предпринять определенные меры при лечении данного заболевания. Кроме того, используя ДНК-диагностику, можно выявить носителей «дефектных» генов, и в последствие на основании диагноза планировать семью. Возможна ДНК-диагностика до рождения. В этом случае ДНК плода выделяют из хориона, пуповины или омниотической жидкости. Более того, возможна преимплантационная ДНК-диагностика. В этом случае яйцеклетки оплодотворяют in vitro. Из зародыша на стадии 8 клеток извлекают 1 или 2 клетки и анализируют их ДНК на наличие поврежденного гена. Зародыш, содержащий неповрежденный ген, имплантируют в матку. Гены, вызывающие генетические заболевания, отличаются от нормальных генов первичной структурой. Причиной генетического заболевания может являться также и нарушение в регуляции экспрессии генов или же отсутствие самих генов. Обнаружить такие заболевания можно, выявив отличия в организации дефектного гена от нормального. ДНК-диагностика генетических заболеваний с использованием гибридизационных зондов Диагностировать генетические заболевания можно с помощью гибридизационных зондов. С этой целью из клеток больного выделяют ДНК. Затем ее фрагментируют, используя рестриктазу. Полученные фрагменты разделяют с помощью электрофореза. Далее фрагменты переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На фильтр наносят зонд, несущий радиоактивную метку. В качестве зонда могут быть использованы последовательности ДНК, комплементарные дефектному или нормальному гену. Зонд при наличии комплементарных последовательностей в исследуемой ДНК, 34 Глава 3. ДНК-диагностика гибридизуется с ней, при отсутствии – не гибридизуется. После отмывки не связавшегося зонда методом авторадиографии выявляют наличие полосы гибридизации. Если при использовании зонда, комплементарного к дефектному гену, полоса гибридизации не выявляется (рис. 3.7), это свидетельствует об отсутствии дефектного гена в исследуемом образце ДНК пациента. На основании этих результатов, можно сделать вывод о том, что у пациента не обнаружено диагностируемое генетическое заболевание. Если же гибридизационная полоса выявляется, то делается вывод о том, что пациент является носителем дефектного гена. Рис. 3.7. Идентификация генетического заболевания с помощью гибридизационного зонда, комплементарного дефектному (но не нормальному) гену. Наличие полосы гибридизации при анализе образца ДНК свидетельствует о том, что пациент, у которого был взят образец ДНК (1), является носителем дефектного гена. Отсутствие полосы гибридизации свидетельствует о том, что пациент, у которого был взят образец ДНК (2), не является носителем дефектного гена Гибридизацию меченого зонда с ДНК можно проводить на хромосомных препаратах. В этом случае меченый зонд наносят на препараты специально приготовленных метафазных хромосом. После отмывки не связавшегося зонда выявляют места локализации последовательностей ДНК, комплементарных используемому зонду. Выявление таких мест осуществляют в случае использования радиоактивной 35 Прикладная молекулярная биология метки, посредством нанесения светочувствительной эмульсии на препараты хромосом, при использовании же биотинмеченных или флюоресцирующих ДНК-зондов посредством проведения соответствующей обработки препаратов. ДНК-диагностика серповидноклеточной анемии Серповидноклеточная анемия – генетическое заболевание, причиной которого является замена одного нуклеотида в β-глобиновом гене (А заменяется на Т). В результате такой замены мутантный гемоглобин перестает эффективно транспортировать кислород. С заменой одного нуклеотида в β-глобиновом гене связано исчезновение сайта узнавания для рестриктазы Cvn1. Этот фермент распознает нуклеотидную последовательность CCTGAGG, которая в результате мутации превращается в последовательность ССТGTGG. Последнюю указанная рестриктаза не способна узнавать, и соответственно, не способна разрезать ДНК в этом участке. В процессе ДНК-анализа на наличие мутантных генов с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент β-глобинового гена (рис. 3.8). Такой фрагмент нормального гена содержит 3 сайта узнавания рестриктазы Cvn1, мутантного же – на один меньше, т.е. 2 сайта. Амплифицированные фрагменты на следующей стадии обрабатывают рестриктазой Cvn1, в результате фрагмент, амплифицированный с нормального гена, расщепляется на 4 более мелких фрагмента ДНК, а фрагмент, амплифицированный с мутантного гена, – на 3 (рис. 3.8). Продукты рестрикции далее разделяют с помощью электрофореза. На электрофореграмме после окраски ДНК определяют число полос. Если анализировалась ДНК индивидуума, гомозиготного по нормальному гену (АА), то на электрофореграмме будут выявлены 4 полосы. При анализе ДНК индивидуума, гомозиготного по мутантному гену (SS), на электрофореграмме будут обнаружены 3 полосы. В случае же анализа ДНК индивидуумов, гетерозиготных по данному гену (АS), на электрофореграмме будут выявлены 5 полос (рис. 3.8). 36 Глава 3. ДНК-диагностика Рис. 3.8. ДНК-анализ, направленный на выявление мутантного β-глобинового гена. АА – гомозиготность по нормальному β-глобиновому гену, SS – гомозиготность по мутантному β-глобиновому гену, АS – гетерозиготность 37 Прикладная молекулярная биология Обнаружение однонуклеотидных замен с использованием методов ПЦР и лигирования олигонуклеотидных зондов (ПЦР/ЛОЗ) Метод ПЦР/ЛОЗ используется для идентификации мутантного гена, отличающегося от нормального гена заменой одной пары нуклеотидов. Предположим, что нормальный ген отличается от мутантного тем, что в определенном участке вместо пары АТ в нормальном гене в мутантном гене находится ГЦ-пара. При анализе методом ПЦР/ЛОЗ с помощью ПЦР амплифицируют фрагмент исследуемого гена, содержащий пару нуклеотидов, по кото-рой отличается нормальный и мутантный ген (рис. 3.9). Рис. 3.9. Амплификация методом ПЦР фрагментов нормального и мутантного генов, отличающихся одной парой нуклеотидов Полученные в результате амплификации фрагменты гибридизуют с двумя зондами (рис. 3.10). При отжиге этих зондов с фрагментом нормального гена происходит их полная гибридизация. При этом 3’-конец зонда-1 гибридизуется с нуклеотидом (Т), который в мутантном гене заменен на Ц. А 5’-конец зонда-2 образует комплементарное взаимодействие с нуклеотидом, примыкающим к Т. В случае фрагмента мутантного гена 3’-концевой нуклеотид зонда-1 оказывается не комплементарным нуклеотиду Ц (рис. 3.10). К зонду-1 присоединен биотин, а к зонду-2 – диго38 Глава 3. ДНК-диагностика ксигенин. При добавлении ДНК-лигазы в пробу, содержащую фрагмент нормального гена, зонды-1 и 2 ковалентно сшиваются. В то время как при добавлении ДНК-лигазы в пробу, содержащую фрагмент мутантного гена, этого не происходит, т.к. 3’-концевой нуклеотид зонда-1 оказывается не комплементарным соответствующему нуклеотиду (рис. 3.10). После обработки лигазой проводят денатурацию ДНК, в результате которой происходит высвобождение зондов. Затем содержимое проб переносят в пластиковые лунки, покрытые стрептавидином. С последним связываются меченные биотином зонды (рис. 3.10). После связывания лунки промывают с целью удаления не связавшегося материала. Затем в них добавляют соединенные со щелочной фосфатазой антитела к дигоксигенину. Антитела при наличии дигоксигенина взаимодействуют с ним, образуя комплекс, содержащий в своем составе щелочную фосфатазу (рис. 3.10). Для удаления не связавшегося материала лунки снова промывают. После этой процедуры в них добавляют субстрат. При наличии щелочной фосфатазы субстрат превращается в окрашенный продукт (рис. 3.10). Появление окраски в лунке свидетельствует о связывании антитела с зондом, меченным дигоксигенином, и, следовательно, о том, что произошло лигирование зонда-1 и зонда-2. На основании этих данных можно сделать вывод о том, что анализу в этом случае подвергся нормальный ген. Если же окрашивания не произошло (рис. 3.10), значит, лигирования не было. Анализу в этом случае подвергся мутантный ген. Метод ПЦР/ЛОЗ является высокоэффективным и высокоспецифичным методом. Все его стадии автоматизированы. 39 Прикладная молекулярная биология Рис. 3.10. Идентификации мутантного гена, отличающегося от нормального гена заменой одной пары нуклеотидов метод ПЦР/ЛОЗ. Б – биотин, Д – дигоксигенин, АТ – антитело, ЩФ – щелочная фосфатаза 40 Глава 3. ДНК-диагностика Идентификация мутаций в разных участках одного гена с помощью нескольких гибридизационных зондов Многие генетические заболевания связаны с мутациями в разных участках одного и того же гена. Такие мутантные гены отличаются от нормального гена и между собой нуклеотидными заменами в определенных сайтах. В свою очередь от комбинации мутантных и нормальных генов в геноме индивидуумов зависит проявление генетического заболевания. В связи с этим крайне важным для коррекции патологии является установление генетического статуса больного. С целью идентификации в разных сайтах гена мутаций синтезируют набор специфических зондов, каждый из которых комплементарен фрагменту гена, несущему известную мутацию. К 3’-концу каждого зонда присоединяют poly(dT) (около 400 нуклеотидов), с помощью которых ДНКзонды связываются с определёнными точками на мембране (рис. 3.11). Далее амплифицированные с помощью ПЦР и помеченные биотином фрагменты анализируемого гена (каждый из которых содержит по одному мутантному сайту) гибридизуют с зондами, пришитыми к мембране (рис. 3.11). Затем добавляют стрептавидин, связанный с ферментом (щелочной фосфатазой или пероксидазой хрена). Там, где произошла гибридизация фрагмента мутантного гена с зондом, стрептавидин связывается с биотином, образуя комплекс, состоящий из зонда, фрагмента мутантного гена, биотина, стрептавидина и фермента (рис. 3.11). Мембрану промывают, и добавляют неокрашенный субстрат, который под действием фермента превращается в окрашенный продукт (рис. 3.11). На точке фильтра, где наблюдается окрашивание, имеет место соответствие между амплифицированным фрагментом мутантного гена и специфическим зондом. Что свидетельствует о наличии соответствующего мутантного сайта в анализируемом гене. Таким образом, проанализировав результаты эксперимента, можно идентифицировать наличие мутантных сайтов в гене. 41 Прикладная молекулярная биология Рис. 3.11. Идентификация мутаций в разных участках одного гена. Б – биотин, С – стрептаведин, ЩФ – щелочная фосфатаза Идентификация биологических останков с использованием молекулярно-генетического анализа с целью выявления их принадлежности к определенной семье Идентификацию костных останков с целью установления их принадлежности к определенной семье можно проводить в 3 этапа: •установление половой принадлежности останков; •выявление генетического родства между индивидуумами, останки которых исследуются; 42 Глава 3. ДНК-диагностика •установление принадлежности выявленных генетически родственных индивидуумов к определенной семье. Рассмотрим подробнее все эти этапы. Предположим, что поставлена задача проанализировать костные останки десяти человек: выявить их половую пренадлежность, установить или опровергнуть генетическое родство между индивидуумами, останки которых обнаружены, и установить принадлежность выявленных генетически родственных индивидуумов к определенной семье. Определение половой принадлежности останков может быть осуществлено по анализу организации гена амелогенина – белка зубной эмали. Этот ген локализован в половых хромосомах X и Y. Ген амелогенина в Y-хромосоме оказывается на 6 п.н. длиннее, чем в X-хромосоме. После выделения ДНК из костных останков получают с помощью ПЦР фрагменты генов амелогенина. При этом фрагмент гена Y-хромосомы состовляет 112 п.н., а Х-хромосомы – 106 п.н. Поскольку у мужчин присутствуют X и Y хромосомы, то в результате ПЦР образуются оба фрагмента. У женщин присутствует только X хромосома, поэтому у них образуется только один фрагмент, размером 106 п.н. Длину фрагментов определяют с помощью электрофореза. Результаты исследования десяти гипотетических останков представлены на рис. 3.12. Они свидетельствуют о том, что останки принадлежат четырем мужчинам и шести женщинам. Рис. 3.12. Установление половой принадлежности костных останков на основе определения длины фрагмента гена амелогенина 43 Прикладная молекулярная биология Для выявления генетического родства обычно используют локусы ДНК, находящиеся в 5 и более аллельных состояниях. С этой целью может быть использован локус (ТН01), имеющий 5 аллельных состояний, в которых динуклеотид ЦА повторяется от 6 до 10 раз: (ЦА)6, (ЦА)7, (ЦА)8, (ЦА)9, (ЦА)10. В составе генома каждого человека могут присутствовать из всех возможных только 1 или 2 аллельных локуса. Аллели легко различить по размерам ПЦР-фрагментов, определяемых с помощью электрофореза (рис. 3.13). Наличие двух полос на электрофореграмме указывает на гетерозиготное состояние локуса, одной – гомозиготного. Сравнивая распределение фрагментов ДНК на электрофореграмме, можно сделать вывод о возможном родстве (или опровергнуть его) по вертикали (родитель – ребенок). У ребенка размер одного фрагмента должен совпадать с размером одного из фрагментов матери, а размер другого – с одним из фрагментов отца. Если у индивидуумов отсутствуют одинаковые полосы, то они родственниками по вертикали не являются, а если таковые присутствуют, то родство по вертикали возможно. Об отсутствии родства по вертикали (если отсутствуют одинаковые аллели локуса) можно судить со 100 %-й вероятностью. О наличие же родства по вертикали (при наличии одинаковых аллелей локусов) можно говорить с определенной вероятностью. Поэтому для установления родства по вертикали с высокой долей вероятности, как правило, анализируют картины распределения аллелей нескольких полиморфных локусов. На рис. 3.13 представлен анализ аллельного состояния локуса ТН01 в составе ДНК десяти гипотетических останков. Внимательно рассмотрев электрофореграмму, можно сделать вывод о том, что индивидуумы 3 и 7 по отдельности являются возможными родственниками по вертикали индивидуумам 4, 5 и 6. В то же время индивидуумы 3 и 7 между собой не являются родственниками по вертикали. На основании этих результатов с определенной долей вероятности можно полагать, что индивидуум 3 является отцом, индивидуум 7 – матерью, а индивидуумы 4, 5 и 44 Глава 3. ДНК-диагностика 6 – дочерьми. Таким образом, результаты анализа позволили выявить семейную группу. На следующем этапе необходимо идентифицировать ее. С этой целью нужно сравнить ДНК представителей этой семейной группы с ДНК предполагаемых родственников. Для этого можно использовать различные подходы. Одним из таких подходов является исследование митохондриальной ДНК. Известно, что митохондриальная ДНК передается потомкам по материнской линии. В связи с этим сравнение первичной структуры митохондриальной ДНК членов семейной группы с таковой предполагаемых родственников по материнской линии позволит идентифицировать семейную группу. Рис. 3.13. Анализ аллельного состояния локуса ТН01 в составе ДНК десяти гипотетических останков. Внизу показана идентифицированная на основе анализа семейная группа. П – отец, М – мать, Д – дочь 45 Глава 4. ФЕРМЕНТЫ И МЕТОДЫ В ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ Генетическая инженерия представляет собой отрасль молекулярной биологии, целью которой является получение организмов с новыми комбинациями генов с помощью направленного манипулирования фрагментами НК. Посредством экспериментальных процедур, используемых в генетической инженерии, возможен перенос генетического материала из одного организма в другой. Конечным результатом деятельности генетических инженеров является получение генетически модифицированных организмов (ГМО). В настоящие время под ГМО понимают организм, генотип которого был искусственно изменён при помощи приемов генетической инженерии. Последовательность приемов генетической инженерии, используемая при создании ГМО в общем виде следующая: •получение изолированного гена (или другого генетического материала); • введение гена (или другого генетического материала) в вектор, обеспечивающий его доставку в клетки трансформируемого организма. Результатом этого этапа является получение рекомбинантного (химерного) вектора, содержащего чужеродную ДНК; • введение рекомбинантного вектора в клетки модифицируемого организма; • получение ГМО. На рис. 4.1 представлена схема получения генетически модифицированных бактерий. Для достижения поставленных целей в генетической инженерии используются разнообразные ферменты и методы. Информация о них представлена ниже. 46 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.1. Получение генетически модифицированных бактерий Ферменты в генетической инженерии В экспериментах по генетической инженерии ферменты являются инструментами молекулярного манипулирования. Ферменты, применяемые в генетической инженерии, можно разделить на четыре основные группы: •ферменты, фрагментирующие НК; •ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК; •ферменты, лигирующие фрагменты ДНК; •ферменты, модифицирующие концы НК. Следует отметить, что все эти ферменты не обладают видовой специфичностью, и поэтому могут быть использованы в экспериментах по генетической инженерии как прокариот, так эукариот. 47 Прикладная молекулярная биология Ферменты, фрагментирующие ДНК Нуклеазы Нуклеазы катализируют гидролитическое расщепление фосфодиэфирных связей в молекулах нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Они могут разрезать НК с образованием 3’- гидроксильной или 5’- гидроксильной группы. 48 Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Нуклеазы в зависимости от типа НК, которую они расщепляют, могут быть разделены на две группы: НУКЛЕАЗЫ ДНКазы РНКазы ДНКазы катализируют расщепление ДНК, а РНКазы – РНК. Нуклеазы могут быть специфичными к одноцепочечным или двухцепочечным НК (ДНК или РНК). Существуют нуклеазы, способные гидролизовать как ДНК, так и РНК. По месту расщепления НК нуклеазы могут быть разделены на две группы эндонуклеазы и экзонуклеазы: НУКЛЕАЗЫ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ Эндонуклеазы гидролизуют фосфодиэфирные связи внутри молекулы НК. Они могут расщеплять также кольцевые молекулы. В результате действия эндонуклеаз образуются полинуклеотидные фрагменты различной длины. Экзонуклеазы в отличии от эндонуклеаз расщепляют НК с концов цепей. Различают 5’3’-экзонуклеазы и 3’5’-экзонуклеазы. 5’3’-экзонуклеазы расщепляют полинуклеотидную цепь, начиная с 5’-конца, а 3’5’экзонуклеазы – в обратном направлении. При этом одни экзонуклеазы отщепляют по одному нуклеотиду, другие – олигонуклеотиды. Существуют экзонуклеазы, действующие в двух направлениях. Известна ДНКаза, которая является эндонуклеазой по отношению одноцепочечной ДНК и экзонуклеазой по отношению двухцепочечной ДНК. Существуют ферменты, способные расщеплять РНК в составе гибрида ДНК-РНК. Такие ферменты получили название РНКазы Н. Среди них различают эндонуклеазы и 3’5’-экзонуклеазы. Активностью РНКазы Н обладает обратная транскриптаза. 49 Прикладная молекулярная биология Среди эндонуклеаз выделяют особую группу ферментов – рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции). Они входят в состав системы рестрикции-модификации, которая присуща бактериям. Основная задача системы – разрушение чужеродного генетического материала, проникшего в клетку (фагов и плазмид). В ее состав входят ферменты метилаза и рестриктаза. Система способна распознавать определённые полинуклеотидные последовательности, называемые сайтами рестрикции. Если ДНК не метилирована, то рестриктаза вносит в ДНК двуцепочечный разрыв, что приводит к нарушению ее биологической функции. Если же метилированы одна или обе цепи ДНК, рестриктаза не способна ее разрезать. Поскольку ДНК в бактериальной клетке либо полностью метилирована, либо метилирована только одна из ее цепей (сразу после репликации), рестрикции она не подвергается. Образовавшаяся после репликации полуметилированная ДНК метилируется при участии метилтрансферазы, в результате обе цепи ДНК оказываются метилированными. Чужеродная же ДНК, проникшая в клетку, не метилирована, и поэтому подвергается рестрикции. Так система рестрикции-модификации обезвреживает чужеродную ДНК, не разрушая собственную. Различают несколько типов рестриктаз: •рестриктазы первого типа узнают определённую последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочную молекулу ДНК неподалёку от нее в произвольной точке; •рестриктазы второго типа узнают определённую последовательность и разрезают ДНК в фиксированной точке внутри этой последовательности. Рестриктазы этого класса распознают в большинстве случаев палиндромные последовательности, состоящие обычно из 4-8 нуклеотидов; •рестриктазы третьего типа узнают асимметричные последовательности и разрезают ДНК, отступив определённое число нуклеотидных пар от её конца (или в нескольких точках на разном удалении от сайта узнавания). В экспериментах по молекулярной биологии и генетической инженерии обычно используются рестриктазы второго класса. 50 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Названия рестриктаз (эндонуклеаз рестрикции) образуются от названия их продуцента. Первая буква названия рестриктазы совпадает с первой буквой названия рода, а следующие две – с первыми двумя буквами вида организма, в котором фермент был обнаружен. Дополнительные буквы (могут отсутствовать в названиях) обозначают конкретный штамм или серотип. Римские цифры в конце названия указывают порядковый номер обнаружения фермента у конкретного организма. Например: BsuI – первый фермент, обнаруженный у Bacillus subtilis, EcoRV – пятый фермент, выделенный из Escherichia coli штамма RY13. Рестриктазы, расщепляя ДНК, вносят разрывы в обе цепи. В результате разрезания ДНК могут образовываться липкие и тупые концы (рис. 4.2). Липкие концы имеют выступающие одноцепочечные участки. Могут образовываться липкие концы с 5’-выступающими или 3’-выступающими нуклеотидными последовательностями. Тупые концы образуются тогда, когда рестриктаза вносит разрывы в цепи ДНК строго друг напротив друга. Тупые концы не имеют выступающих нуклеотидных последовательностей. В таблице 1 представлены данные о некоторых рестриктазах, об их сайтах узнавания и о характере расщепления ДНК. Рис. 4.2. Рестриктазы расщепляют ДНК с образованием липких концов (с 5’-выступающими (А) или 3’-выступающими (Б) нуклеотидными последовательностями) и тупых концов 51 Прикладная молекулярная биология Таблица 4.1 Характеристика некоторых рестриктаз Рестриктаза Сайт узнавания Организация образующихся в результате рестрикции концов EcoRI Липкие концы с 5’-выступающими нуклеотидными последовательностями PstI Липкие концы с 3’-выступающими нуклеотидными последовательностями PvuII Тупые концы Рестриктазы используются для фрагментации ДНК. С их помощью возможно расщепление протяженных молекул ДНК на фрагменты длиной от нескольких сотен до нескольких тысяч оснований. Полученные после рестрикции фрагменты ДНК можно разделить с помощью электрофореза в агарозном геле. Скорость перемещения фрагментов при электрофорезе обратно пропорциональна их размерам. Чем меньше размер фрагмента, тем больше его скорость перемещения, тем большее расстояние он пройдет. Сравнивая расстояние, пройденное фрагментом в процессе электрофореза, с расстояниями, пройденными фрагментами ДНК с известными размерами, можно определить размер каждого из фрагментов ДНК, образовавшегося в результате рестрикции. После разделения фрагменты можно элюировать из геля и затем использовать в дальнейших исследованиях. В результате расщепления образца ДНК определенной рестриктазой всегда образуется один и тот же набор фрагментов. Различные рестриктазы, имеющие неодинаковые сайты узнавания, расщепляя один и тот же образец ДНК, будут образовывать наборы фрагментов, отличающиеся по размеру. Сравнение размеров фрагментов ДНК, полученных после обработки определенного образца ДНК несколькими рестриктазами (по отдельности и со52 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии вместно), позволяет построить рестрикционную карту, на которой указано расположение каждого сайта рестрикции на исследуемой молекуле ДНК. Рестриктазы используют для построения рестрикционных карт. Рассмотрим, как это делается. Предположим, что ДНК, размер молекул которой составляет 3300 п.н., обработали по отдельности рестриктазой 1 и рестриктазой 2 (рис. 4.3). В результате расщепления рестриктазой 1 получили три фрагмента длиной 1 700, 1 000 и 600 п.н., а при расщеплении рестриктазой 2 получили также три фрагмента, но их длина соответственно составила 1 900, 1 200 и 200 п.н. При расщеплении этого же образца ДНК смесью рестриктаз 1 и 2 получили пять фрагментов, размеры которых соответственно равны 1 200, 800, 600, 500 и 200 п.н. На основании установленных размеров фрагментов ДНК необходимо далее определить их очередность расположения в исследуемой молекуле ДНК и определить расположение сайтов рестрикции для рестриктазы 1 и рестриктазы 2. Образование трех фрагментов при действии каждой из рестриктаз свидетельствует о том, что в исследуемой ДНК имеется по два сайта узнавания для каждой из рестриктаз. Образующийся в результате действия рестриктазы 1 фрагмент размером 600 п.н. не расщепляется при гидролизе смесью обеих рестриктаз (рис. 4.3), следовательно, он не будет содержать сайт рестрикции для рестриктазы 2. Фрагменты размером 1 700 и 1 000 п.н. расщепляются смесью рестриктаз, следовательно, каждый из них имеет по сайту узнавания для рестриктазы 2. При этом фрагмент размером 1 700 п.н. распадается на куски по 500 и 1 200 п.н., а фрагмент 1000 п.н. на куски по 200 и 800 п.н. (рис. 4.3). Образующийся в результате действия рестриктазы 2 фрагмент размером 1 900 п.н. при гидролизе смесью рестриктаз распадается (рис. 4.3) на три фрагмента (500+600+800 = 1 900), следовательно, он будет иметь два сайта узнавания для рестриктазы 1. Соответствие между положением сайтов рестрикции и размером фрагментов, образующихся в результате действия рестриктаз (по отдельности и совместно), представлено на рестрикционной карте (рис. 4.3). 53 Прикладная молекулярная биология Рис. 4.3. Построение рестрикционной карты. Р1 – рестриктаза 1, Р2 – рестриктаза 2 На практике при построении рестрикционных карт могут быть применены и другие подходы. Например, может быть использовано более двух рестриктаз, в этом случае этот процесс становится довольно непростой процедурой. Также может быть осуществлено неполное расщепление ДНК 54 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии рестриктазами, что в определенной степени может упростить решение поставленной задачи. Еще один прием, который используется при составлении карт рестрикции – введение радиоактивной концевой метки. В этом случае определяют размеры полученных в результате рестрикции меченых фрагментов. Кроме того, перекрывающиеся фрагменты могут быть установены благодаря способности комплементарных последовательностей ДНК гибридизоваться. Рестрикционные карты нашли широкое применение в молекулярной биологии и генетической инженерии. Сравнение карт рестрикции родственных генов позволяет оценить степень гомологии между ними. Идентичность рестрикционных карт свидетельствует о высокой степени гомологии или может быть об идентичности исследуемых генов. Напротив, различие рестрикционных карт родственных генов позволяет предположить наличие значительных отличий в их нуклеотидных последовательностях. Поскольку рестрикционная карта отражает расположение определенных нуклеотидных последовательностей в образце ДНК, она может быть использована для определения первичной структуры данной ДНК. С этой целью вначале исследуемая ДНК разрезается с помощью рестриктаз. Затем полученные ее фрагменты разделяются с помощью электрофореза. Далее определяется первичная структура каждого фрагмента. На заключительном этапе, используя рестрикционную карту, расшифрованные нуклеотидные последовательности фрагментов располагают в очередности в соответствии с картой рестрикции. И так первичная структура ДНК определена. Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК ДНК-полимераза Широко в генной инженерии используется ДНКполимераза I E. coli (Pol I). Этот фермент обладает 55 Прикладная молекулярная биология тремя активностями: полимеразной и 5’3’- и 3’5’-экзонуклеазными активностями. Благодаря полимеразной активности ДНК-полимераза I способна заполнять бреши в ДНК и превращать липкие концы в тупые (рис. 4.4). Рис. 4.4. ДНК-полимераза I способна заполнять бреши в ДНК (А) и превращать липкие концы в тупые (Б) В результате совместного действия полимеразной и 5’3’- экзонуклеазной активностей ДНК-полимеразы I в присутствии a-32Р-меченых дНТФ одноцепочечный разрыв в одной из цепей ДНК способен перемещаться вдоль ДНК, при этом синтезируется радиоактивно меченая ДНК (рис. 4.5). Этот процесс называется ник-трансляция. Рис. 4.5. В результате совместного действия полимеразной и 5’ 3’экзонуклеазной активностей ДНК-полимеразы I в присутствии a-32Р-меченых дНТФ одноцепочечный разрыв в одной из цепей ДНК способен перемещаться вдоль ДНК, при этом синтезируется радиоактивно меченая ДНК 56 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии ДНК-полимераза 1 состоит из одной полипептидной цепи, которая образует три домена. N-концевой домен легко отделяется с помощью протеолитических ферментов. Оставшаяся часть получила название (по фамилии одного из авторов, описавших ее) – фрагмент Кленова (Pol IK). Последний обладает полимеразной и 3’ 5’-экзонуклеазной активностями. Фрагмент Кленова обычно используют для достройки одноцепочечных 5’-концов до тупых, для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК и для гидролиза одноцепочечных 3’-концов на двухцепочечных молекулах ДНК. При проведении ПЦР используются термостабильные ДНК-полимеразы: Tag ДНК-полимераза и Vent ДНК-полимераза. Обратная транскриптаза Обратная транскриптаза (ревертаза) обладает ДНКполимеразной активностью, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК, и активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК – ДНК. Для инициации синтеза ревертазе необходима затравка (праймер). Роль праймера может выполнять как РНК, так и ДНК. Ревертазу главным образом используют для обратной транскрипции иРНК (рис. 4.6) в комплементарную ДНК (кДНК). В качестве затравки при обратной транскрипции иРНК, содержащих на 3’-конце полиА-последовательность, используют поли-дT-последовательность. После синтеза цепи ДНК комплементарной иРНК образуется гибрид ДНКРНК. РНК в составе гибрида разрушают. Обычно для этой цели применяют щелочь. Далее осуществляют синтез второй цепи ДНК. В качестве матрицы при ее синтезе выступает первая цепь кДНК. В этом случае используют способность ревертазы образовывать на 3’-концах одноцепочечных кДНК шпильку, которая выполняет функцию праймера. Синтез второй цепи может катализировать как обратная транскриптаза, так и ДНК-полимераза I E.coli. По окончании синтеза цепи кДНК остаются ковалентно связанными. Петлю, связывающую цепи, разрезают с помощью эндонуклеазы 57 Прикладная молекулярная биология S1, специфически гидролизующей одноцепочечные последовательности. Концы ДНК, образующиеся при расщеплении, могут оказаться выступающими. Превратить их в тупые можно с помощью фрагмента Кленова ДНКполимеразы I E.coli. Полученную кДНК можно использовать для дальнейших исследований. Рис. 4.6. Синтез кДНК с использованием ревертазы Ферменты, лигирующие фрагменты ДНК ДНК-лигаза ДНК-лигазы катализируют образование фосфодиэфирных связей между 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной группами соседних дезоксинуклеотидов. В генетической инженерии и молекулярной биологии часто используются ДНК-лигаза фага Т4. Этот фермент способен катализировать 58 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии лигирование одноцепочечных разрывов, липких концов и двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами (рис. 4.7). Рис. 4.7. ДНК-лигаза фага Т4 катализирует лигирование одноцепочечных разрывов (А), липких концов (Б) двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами (В) Ферменты, модифицирующие концы НК Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза не нуждается в матрице, но требует затравку для своей работы. Этот фермент катализирует присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-концу ДНК. При использовании в качестве субстрата одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 3’-концы. Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза может быть использована для конструирования липких концов в молекулах ДНК с целью их объединения (рис. 4.8). С этой целью образец ДНК инкубируют с ферментом в присутствии одного дезоксинуклеотида (например, дТТФ). В результате в молекуле ДНК на 3’-концах образуются поли-дТ-последовательности. Другой образец ДНК инкубируют с ферментом в присутствии комплементарного дезоксинуклеотида (дАТФ). В этом случае на 3’-концах образуются комплементарные поли-дА-последовательности. Смешивание таких молекул ДНК при определенных условиях приведет к образованию за счет липких концов гибридных молекул ДНК (рис. 4.8). 59 Прикладная молекулярная биология При гибридизации липких концов возможно образование брешей. Для их ликвидации применяют ДНК-полимеразы (рис. 4.8). Оставшиеся разрывы в цепях ДНК сшивают при помощи ДНК-лигазы (рис. 4.8). Рис. 4.8. Объединение молекул ДНК с помощью терминальной нуклеотидилтрансферазы Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза может использоваться для введения в 3’-концы ДНК радиоактивной метки в составе меченых дезоксинуклеотидов. ПолиА-полимераза ПолиА-полимераза использует в качестве субстрата АТФ (но не другие НТФ и дАТФ), катализирует присоединение к 3’- концу одноцепочечных молекул РНК полиА-последовательностей (рис. 4.9). Применяется для присоединения полиА-последовательности к РНК при подготовке их молекул к копированию с помощью ревертазы 60 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии с целью получение кДНК. ПолиА-полимераза применяется также для введения в 3’-конец РНК радиоактивной метки. Рис. 4.9. ПолиА-полимераза катализирует присоединение к 3’-концу РНК полиА-последовательности Фосфатазы Фосфатазы (фосфомоноэстеразы) катализируют гидролитическое расщепление 5’- фосфомоноэфиров или 3’- фосфомоноэфиров. Фосфатаза используется для удаления 5’-концевого фосфата с целью предотвращения лигирования двух соседних дезоксинуклеотидов с помощью ДНК-лигазы. 61 Прикладная молекулярная биология Последняя, как указано выше, может катализировать образование фосфодиэфирных связей меж-ду 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной группами, но не между 5’- и 3’-гидроксильными группами. Полинуклеотидкиназа Полинуклеотидкиназа катализирует фосфорилирование 5’-концевых (но не 3’-концевых) гидроксильных групп ДНК и РНК. Этот фермент используется для мечения 5’- конца полинуклеотидной цепи с помощью радиоактивного Р-32 в составе АТФ: Полинуклеотидкиназа Введение меченого фосфата осуществляют после удаления немеченого 5’-фосфата с помощью фосфатазы. Методы в генетической инженерии Получение генов Гены для генно-инженерных экспериментов могут быть получены в результате их синтеза или выделены из природных источников. Синтез гена может быть осуществлен химическим способом или с помощью ПЦР. Эти подходы рассмотрены в главе «Синтез ДНК». Химический синтез гена возможен при условии, что известна его первичная структура или первичная структура полипептида, закодированного в нем. Для осуществления синтеза гена с использованием ПЦР требуется в качестве матрицы наличие самого гена и праймеров, комплементарных к его флангам. Кроме того, возможен синтез гена с помощью обратной транскриптазы на матрице иРНК, выделенной из клеток. Синтезированная таким образом ДНК будет отличаться от реального гена отсутствием регуляторных последовательностей и интронов. 62 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Ген может быть выделен из библиотеки генома. Прежде чем выделить ген из библиотеки генома, необходимо ее создать. Далее рассмотрим, каким образом создается библиотека генома (рис. 4.10). Вначале очищенную ДНК, выделенную из какого-либо организма, фрагментируют обычно с помощью рестриктаз. Далее фрагменты ДНК встраивают в вектор, например, плазмиду. Полученные химерные векторы вводят в бактериальные клетки. Затем клетки высевают на питательную среду и получают колонии, каждая из которых представляет собой клон, клетки которого являются потомками одной клетки. Все клетки одного клона имеют рекомбинантные плазмиды с идентичными фрагментами встроенной чужеродной ДНК. Совокупность клонированных фрагментов и называют библиотекой генома. При создании библиотеки генома с вероятностью 99 % попадания в нее всей ДНК необходимо получить число клонов для E.coli – 1 500, дрожжей – 4 600, дрозофил – 48 000, млекопитающих – 800 000. Такие библиотеки созданы. При создании библиотеки генома могут быть использованы и вирусные векторы. Рис. 4.10. Схема получения библиотеки генома 63 Прикладная молекулярная биология Из библиотеки генома можно выделить искомый ген. В этом случае поступают следующим образом (рис. 4.11). На чашки Петри с клонами бактерий, содержащие определенные фрагменты чужеродной ДНК, накладывается нитроцеллюлозный фильтр. В результате на фильтре получается слепок колоний. Затем осуществляют лизис клеток, денатурацию и фиксацию ДНК на фильтре. Далее проводят гибридизацию с зондом, комплементарным искомому гену. После анализа результатов гибридизации выявляют колонии, содержащие рекомбинантную плазмиду с искомым геном. Клетки этой колонии отбирают и культивируют в питательной среде с целью увеличения их биомассы. Затем из бактериальных клеток выделяют рекомбинантную плазмиду, и из нее вырезают искомый ген с помощью той рестриктазы, которую использовали для получения библиотеки генома. Недостатком использования библиотек генома для выделения генов является то, что в результате дробления ДНК образуется огромное число фрагментов, и для их клонирования необходимо использовать большое количество клонов. Последнее обстоятельство затрудняет поиск нужного фрагмента ДНК в библиотеке. Кроме того, фрагменты ДНК обычно не полностью соответствуют искомому гену. Фрагмент может содержать нуклеотидные последовательности, не входящие в состав гена. А также, поскольку разрезание ДНК носит случайный характер, фрагменты могут содержать только часть гена. Рис. 4.11. Выделение гена из библиотеки генома. 1 – перенос колоний на фильтр, 2 – лизис клеток, денатурация ДНК и ее фиксация на фильтре, 3 – гибридизация ДНК с зондом и выявление результата гибридизации, 4 – культивирование клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду с искомым геном, 5 – выделение рекомбинантной плазмиды из культуры клеток, 6 – вырезание с помощью рестриктазы из рекомбинантной плазмиды ДНК, содержащей искомый ген 64 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Кроме библиотеки генома может быть создана библиотека кДНК (рис. 4.12). При создании такой библиотеки необходимо из клеток живого организма выделить содержащиеся в них иРНК. Потом при использовании их в качестве матрицы с помощью ревертазы осуществляют синтез кДНК. Затем кДНК встраивают в плазмиды и рекомбинантные плазмиды вводят в бактериальные клетки. Далее, размножая клетки, получают клоны бактерий, содержащих рекомбинантные плазмиды со строго определенной кДНК. Поиск и выделение кДНК из библиотеки кДНК осуществляют аналогичным образом, как и в случае с библиотекой генома. Преимущество библиотеки кДНК перед библиотекой генома заключается в том, что нуклеотидные последовательности кДНК полностью соответствуют кодирующим последовательностям гена. кДНК в отличие от реального гена не содержит интроны, поэтому ее можно использовать в генетической инженерии прокариот. Последние не способны осуществлять сплайсинг эукариотических РНК. Рис. 4.12. Схема получения библиотеки кДНК 65 Прикладная молекулярная биология Определенный ген можно выделить из геномной ДНК. С этой целью вначале из клеток организма выделяют ДНК. Затем ее подвергают рестрикционному расщеплению. Полученные фрагменты подвергают электрофоретическому разделению в агарозном геле. После электрофореза на гель накладывают мембрану. В результате на ней образуется слепок, на котором фрагменты ДНК занимают те же положения, что и на электрофореграмме. Затем мембрану обрабатывают радиоактивно меченым зондом, комплементарным искомому гену. После гибридизации зонда на мембрану накладывают рентгеновскую пленку. После экспозиции на пленке проявляются засвеченные места, соответствующие расположению фрагмента ДНК, комплементарному зонду. Данный метод получил название Саузерн-блоттинг в честь ученого, разработавшего его – Э.Саузерна. По расположению полосы гибридизации на фильтре устанавливают нахождение на электрофореграмме фрагмента ДНК, содержащего искомый ген. Извлекают его из геля и затем используют в дальнейших экспериментах. Введение гена в вектор и получение рекомбинантного вектора Под вектором понимают небольшую молекулу ДНК, способную автономно реплицироваться и обеспечивать размножение и функционирование встроенных в них генов. Вектор должен обладать следующими характеристиками: • иметь точку начала репликации (ori) и автономно реплицироваться; • содержаться в многочисленных копиях в клеткехозяине; • сохраняться в дочерних клетках при делении материнской; • обладать достаточной емкостью, позволяющей встраивать в них гены; •содержать сайты рестрикции, используемые для встраивания гена в вектор; •иметь маркеры, позволяющие осуществлять отбор клеток, содержащих рекомбинантный вектор. 66 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Для доставки чужеродных генов в клетки используют векторы, созданные на основе плазмид, вирусов и др. С этой целью в структуру вектора интегрируют чужеродную ДНК. Вектор, содержащий чужеродный ген, называется рембинантный или химерный вектор. Существует несколько способов введения генов в вектор. Рассмотрим их. Рекомбинантный вектор можно получить с использованием рестриктаз (рис. 4.13). В этом случае вектор и чужеродную ДНК, из которой получают ДНК-вставку, встраиваемую в вектор, разрезают с помощью одной и той же рестриктазы. В результате этого образовавшиеся липкие концы вектора и ДНК-вставки оказываются комплементарными. При их смешивании в присутствии ДНКлигазы происходит объединение вектора и ДНК-вставки с образованием рекомбинантного вектора. Рис. 4.13. Получение рекомбинантного вектора на основе плазмиды с использованием рестриктазы Помимо образования рекомбинантного вектора возможно внутримолекулярное лигирование вектора и ДНКвставки. В результате этого может произойти восстановление структуры исходного вектора или замыкание в кольцо ДНКвставки. Для увеличения выхода рекомбинантного вектора 67 Прикладная молекулярная биология его после рестрикции обрабатывают фосфатазой с целью удаления 5’-фосфомоноэфирных групп. При отсутствии последних ДНК-лигаза не может осуществлять лигирование, поскольку для образования фосфодиэфирных связей необходимо наличие 5’-фосфатной и 3’-гидроксильной групп соседних нуклеотидов. Таким образом, после обработки фосфатазой становится невозможным восстановление исходной структуры вектора, что приводит к увеличению выхода рекомбинантного вектора. Рекомбинантные векторы могут быть получены после их разрезания с образованием тупых концов и последующим лигированием с помощью ДНК-лигазы фага Т4 с чужеродной ДНК по тупым концам (рис. 4.14). Рис. 4.14. Получение рекомбинантного вектора на основе плазмид с использованием ДНК-лигазы фага Т4, сшивающей ДНК по тупым концам Для создания рекомбинантного вектора может быть использована терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза. С ее участием можно нарастить липкие концы, с помощью которых можно объединить молекулы ДНК. Особенности этого подхода описаны выше в теме «Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза» и представлены на рис. 4.8 и 4.15. 68 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.15. Получение рекомбинантного вектора с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы Плазмидные векторы Плазмиды представляют собой автономно реплицирующиеся внехромосомные обычно кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК. Природные плазмиды могут быть использованы в качестве вектора для переноса чужеродной ДНК. Однако они не всегда высокоэффективны. В связи с этим для достижения высокой эффективности функционирования плазмидные векторы создаются с помощью методов генетической инженерии. Плазмидные векторы должны: 69 Прикладная молекулярная биология •иметь небольшой размер, с увеличением размера вектора снижается размер встраиваемой в него чужеродной ДНК; •иметь в своем составе сайт рестрикции, по которому может быть осуществлено встраивание чужеродной ДНК; •иметь в своем составе селективные маркеры, необходимые для идентификации клеток, захвативших рекомбинантную ДНК. В настоящее время сконструировано множество плазмидных векторов, используемых в генетической инженерии. Широкое применение нашел плазмидный вектор pBR322 (p – от англ. plasmid, BR – инициалы создателей – Ф.Боливара и Р.Радригиса, 322 – число, взятое из исследовательских протоколов). Его размер составляет 4361 п.н. Эта плазмида (рис. 4.16) несет ori, обеспечивающий репликацию плазмиды только в клетках E.coli, два селективных маркера – гены устойчивости к антибиотикам ампициллину и тетрациклину, по одному сайту рестрикции для нескольких рестриктаз (среди них в гене устойчивости к тетрациклину для Hind III, BamH I и Sal I, а в гене устойчивости к ампициллину – для Pvu I и Pst I). Плазмида в клетках может реплицироваться с образованием большого числа копий, что обеспечивает присутствие в бактериальной клетке чужеродной ДНК в составе рекомбинантной pBR322 также в большом числе копий. Рис. 4.16. Плазмида pBR322. ГУТ – ген устойчивости к тетрациклину, ГУА – ген устойчивости к ампициллину. Указаны сайты узнавания для рестриктаз 70 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Клетки E.coli, содержащие pBR322, способны расти в среде, содержащей как ампициллин, так и тетрациклин, или оба эти антибиотика. Напротив, бактериальные клетки, в которых данная плазмида отсутствует, не растут в среде, содержащей любой из этих антибиотиков или оба антибиотика. В то же время бактериальные клетки, содержащие плазмиду, в области гена устойчивости к тетрациклину которой осуществлена вставка чужеродной ДНК, будут устойчивы к ампициллину, но не будут расти в присутствии тетрациклина (рис. 4.17). Если же ввести чужеродную ДНК в состав гена устойчивости к ампициллину, то наблюдается обратная картина (рис. 4.17). Таким образом, чувствительность клеток E.coli к указанным антибиотикам позволяет идентифицировать в них наличие или отсутствие рекомбинантной или интактной pBR322. Рис. 4.17. Вставка чужеродной ДНК в область генов устойчивости к антибиотикам плазмиды pBR322 влияет на чувствительность бактериальных клеток к соответствующим антибиотикам. ГУТ – ген устойчивости к тетрациклину, ГУА – ген устойчивости к ампициллину 71 Прикладная молекулярная биология Находят свое применение плазмидные векторы, содержащие в своем составе в качестве селективного маркера ген lac-Z, кодирующего фермент β-галактозидазу. Этот фермент катализирует расщепление субстрата X-gal с образованием окрашенного в голубой цвет продукта. В качестве примера рассмотрим организацию вектора pUC 18 (рис. 4.18). Эта плазмида имеет размер 27 000 п.н. и содержит в своем составе помимо гена lac-Z, ген устойчивости к ампициллину. В гене lac-Z расположен участок, называемый полилинкер, в котором находятся сайты узнавания для рестриктаз. Именно в него осуществляют вставку чужеродной ДНК. В результате такой вставки нарушается организация гена lac-Z и он теряет способность экспрессироваться с образованием функционально активной β-галактозидазы. Рис. 4.18. Плазмида pUC 18. ГУА – ген устойчивости к ампициллину Бактериальные клетки, содержащие как рекомбинантный со вставкой чужеродной ДНК, так и нерекомбинантный векторы pUC 18, в отличие от бесплазмидных клеток способны расти в среде с ампициллином. При этом колонии клеток с нерекомбинантном вектором окрашены в голубой цвет, а колонии с рекомбинантной плазмидой будут белыми (рис. 4.19). Так селективные маркеры позволяют идентифицировать наличие вектора в бактериальных клетках. 72 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.19. Вставка чужеродной ДНК в область гена lac-Z плазмиды pUC 18 нарушает его экспрессию. ГУА – ген устойчивости к ампициллину Фаговые векторы Фаговые векторы предпочтительнее использовать, чем плазмидные векторы, при клонировании более крупных фрагментов чужеродной ДНК. Наиболее распространенными фаговыми векторами для E.coli являются векторы, созданные на основе фагов λ и М13. Для фага λ характерно два альтернативных пути развития: литический и лизогенный. В случае литического пути развития после проникновения фага в клетку его гены начинают экспрессироваться в определенной последовательности. Результатом их экспрессии является образование порядка 100 фаговых частиц на клетку. Затем происходит лизис клетки и фаговые частицы оказываются в окружающей среде. При лизогенном пути развития ДНК фага встраивается в ДНК бактерии и реплицируется вместе с ней. Спонтанно или под действием каких-либо факторов фаг λ может перейти на литический путь развития. Геном фага λ может быть представлен множественными формами (рис. 4.20). Внутри фаговой частицы геном фага λ находится в линейной форме. При попадании фага λ в клетку, его ДНК замыкается в кольцо за счет липких концов. Во время репликации ДНК фага λ образует длинные конкатемеры, которые затем разрезаются на индивидуальные геномные ДНК фага λ. И четвертая форма – интегрированная форма ДНК фага λ в клеточном геноме. 73 Прикладная молекулярная биология Рис. 4.20. Геном фага λ может быть представлен линейной (1), кольцевой (2), конкатемерной (3) и интегрированной (4) в клеточный геном формами Геном фага λ полностью расшифрован и его размер составляет 48502 п.н. (рис. 4.21). ДНК фага содержит область начала репликации (ori), гены структурных белков, участвующих в формировании вирусной частицы, гены ферментов, принимающих участие в репликации, гены, обеспечивающие лизис инфицированных клеток, и гены, ответственные за установление лизогении. Около 1/3 части генома между точками 20 – 38 т.п.н. являются необязательной для установления литической инфекции. В этом участке генома представлены гены, необходимые для установления лизогенного состояния. Несущественной является также область ДНК вблизи точки 43 т.п.н. При конструировании векторов на основе ДНК фага λ, все гены или часть генов, необходимых для лизогении, удаляются. Поэтому инфицирование всегда сопровождаются лизисом клеток. Для успешной упаковки ДНК фага λ в вирионе ее длина должна составлять 38 – 52 т.п.н. В связи с этим все 74 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии удаленные последовательности ДНК при конструировании рекомбинантного вектора могут быть заменены сегментом чужеродной ДНК соответствующей длины. Рис. 4.21. Линейный геном фага λ. Необязательные для литической инфекции участки генома показаны широкими линиями На основе фага λ создано множество λ-векторов. Эти векторы подобно фагу могут размножаться посредством литической инфекции. Наличие сайтов рестрикции в их геноме позволяет осуществить удаление несущественной области и обеспечить встраивание чужеродной ДНК (рис. 4.22). Размер встраиваемого фрагмента может составлять до 24 т.п.н. Рис. 4.22. Схема встраивания чужеродной ДНК в l-вектор. СР – сайт рестрикции 75 Прикладная молекулярная биология Некоторые λ-векторы содержат ген β-галактозидазы. При создании рекомбинантного λ-вектора вместе с несущественной областью удаляется и ген β-галактозидазы. При инфицировании бактериальных клеток, выращиваемых на среде с X-gal, нерекомбинантным λ-вектором, на их колониях будут формироваться голубые бляшки. При инфицировании же бактериальных клеток рекомбинантным λ-вектором – будут формироваться бесцветные бляшки. Так можно различить рекомбинантный и нерекомбинантный λ-векторы. Широкое применение в генетической инженерии нашли векторы, сконструированные на основе фага М13. Геном фага представлен кольцевой одноцепочечной ДНК, размер которой составляет около 6 400 нуклеотидов. После инфицирования клеток E.coli одноцепочечная ДНК превращается в двухцепочечную кольцевую форму. Затем происходит репликация таких молекул с образованием приблизительно 300 копий, которые впоследствии используются в качестве матриц для синтеза одноцепочечных фаговых ДНК. Одновременно с синтезом ДНК происходит экспрессия фаговых генов. Одноцепочечные фаговые ДНК совместно с белками капсида формируют зрелые фаговые частицы, которые покидают клетки, образуя на бактериальной колонии мутные бляшки. Бактериальные клетки при этом не погибают, хотя их рост замедляется. При создании рекомбинантной ДНК используют двухцепочные репликативные формы ДНК фага М13. Одноцепочечные же ДНК фага не применяются в качестве векторов, поскольку не могут быть разрезаны с помощью рестриктаз. В геноме фага М13 имеется некодирующая область, длина которой составляет 507 нуклеотидов. В этот сайт может быть встроена вставка, не приводящая к нарушению репликации ДНК фага. Часто в эту область при создании векторов встраивают фрагмент lac-оперона E.coli, содержащий часть гена β-галактозидазы, и так называемый полилинкер (рис. 4.23). Полилинкер содержит сайты узнавания для нескольких рестриктаз. Именно в полилинкер при создании 76 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии рекомбинантного вектора встраивают чужеродную ДНК. В отсутствии в составе полилинкера вставки чужеродной ДНК векторный геном детерминирует синтез β-галактозидазы. При наличии в среде субстрата Xgal, бляшки окрашиваются в голубой цвет. При наличии же вставки чужеродной ДНК в составе полилинкера синтез β-галактозидазы нарушается и формируются бесцветные бляшки (рис. 4.23). Таким образом, можно различить бляшки, содержащие рекомбинантный и нерекомбинантный векторы. Рис. 4.23. Схема получения рекомбинантного вектора на основе фага М13. 1 – введение в некодирующую область генома фага фрагмента lac-оперона E.coli, содержащего часть гена β-галактозидазы, и так называемый полилинкер. 2 – введение в область полилинкера чужеродной ДНК Космиды Космиды являются гибридными векторами, состоящими из плазмидной ДНК и фрагментов ДНК фага λ (рис. 4.24). Плазмидная составляющая содержит уникальные сайты рестрикции и селективные маркеры, а фаговая – соединенные липкие концы (cos-сайт). Космиды реплицируются по плазмидному типу репликации и способны упаковываться в оболочки фага λ. В состав космидного вектора может быть включена вставка чужеродной ДНК до 45 т.п.н. 77 Прикладная молекулярная биология Рис. 4.24. Космида Клонирование чужеродной ДНК при использовании космид осуществляют следующим образом (рис. 4.25). Вначале космиду разрезают с помощью рестриктазы. Далее линейную космиду смешивают с чужеродной ДНК, липкие концы которой комплементарны липким концам космиды. После отжига и лигирования образуются конкатемеры. Обработка конкатемеров белками, осуществляющими упаковку ДНК фага λ, приводит к вырезанию из конкатемеров по cos-сайтам фагового генома, содержащего ДНК-вставку. Наличие cos-сайтов является единственным необходимым требованием для упаковки ДНК в фаговые частицы. Таким образом, последовательность нуклеотидов ДНК, расположенная между двумя cos-сайтами, может быть упакована в фаговые частицы. Фаговая частица, содержащая между cos-сайтами только чужеродную ДНК, будет нежизнеспособной. В то же время после адсорбции такой фаговой частицы на поверхности клетки, заключенная в ней ДНК поступает внутрь бактерии, где она начинает реплицироваться как плазмида. Поскольку плазмида (космида) содержит в своем составе селективные маркеры – генов устойчивости к антибиотикам – бактериальные клетки выращивают на среде с соответствующими антибиотиками. С одной стороны, наличие плазмиды обеспечивает выживание бактериальных клеток, а выращивание бактерий на среде с антибиотиками, с другой стороны, – обеспечивает сохранение таких плазмид в клетках. 78 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Упаковка ДНК космид в фаговые частицы необходима только для облегчения процесса введения рекомбинантных ДНК большого размера внутрь бактериальных клеток. Проникшая внутрь клетки рекомбинантная космида может в ней существовать как плазмида и не может быть упакована в фаговую частицу. Рис. 4.25. Схема клонирования чужеродной ДНК при использовании космид 79 Прикладная молекулярная биология Фазмиды Фазмиды, также как и космиды, являются гибридами плазмид и фага, однако в отличие от космид, в них сохранены функции репликации как плазмиды, так и фага. Фазмиды представляют собой линейные молекулы ДНК, на концах которой находятся сегменты ДНК фага λ, содержащие гены, необходимые для литической инфекции, а в центральной части – плазмидный сегмент, обычно состоящий из нескольких повторов последовательностей плазмидной ДНК. В процессе получения рекомбинантной фазмиды, один или несколько повторов плазмидной ДНК заменяется чужеродной ДНК. Попадая в клетку, фазмида в зависимости от ее конструкции и от условий выращивания бактерий может реплицироваться либо как фаговая ДНК, либо как плазмида. Таким образом, фазмиды в одних условиях могут размножаться как плазмиды, а в других – как фаги. Размножение фазмиды как фага, заканчивается лизисом клеток и выходом фаговых частиц из клетки. Челночные векторы Особенностью челночных векторов является способность их реплицироваться в двух разных видах организмов. Такие векторы содержат две области начала репликации, соответствующие каждому из обоих видов хозяев. Существуют челночные векторы, способные существовать как в клетках двух видов прокариот, так и в клетках прокариот (обычно в E.coli) и эукариот (дрожжи, растения, животные). Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки животных Для введения чужеродной ДНК в клетки животных часто используют векторы, сконструированные на основе вирусов. Широкое применение нашли векторы, созданные на основе SV40. Геном этого вируса представлен кольцевой двухцепочечной ДНК, размер которой составляет 5243 пн. В геноме имеется ori и закодировано 5 белков: малый Т антиген, большой Т антиген и три белка капсида VP1, VP2 и VP3. Большой Т антиген необходим для репликации ДНК 80 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии вируса. В инфицированной клетке образуется около 100 000 вирусных частиц, которые покидая клетку, вызывают её гибель. При создании векторов на основе SV40 удаляют определенные нуклеотидные последовательности ДНК-вируса и вместо них в геном встраивают другие фрагменты ДНК. Существуют три типа векторов, созданных на основе SV40: •трансдуцирующие SV40-векторы. Такие векторы способны реплицироваться в клетках-хозяинах и упаковываться в вирионы. При их создании осуществляют замену кодирующих последовательностей ДНК вируса на фрагмент чужеродной ДНК эквивалентного размера. В результате такой замены вектор теряет способность формировать вирусные частицы, из-за утраты способности обеспечивать синтез белка(ов), ген(ы) которого(ых) был(и) удалены из генома. Компенсировать утраченный синтез белка(ов) может вирус-помощник дикого типа. Последний, находясь в клетке совместно с трансдуцирующим вектором, способен обеспечить синтез всех белков, необходимых для удовлетворения как своих потребностей, так и потребностей трансдуцирующего SV-вектора. Таким образом, в присутствии вируса-помощника трансдуцирующий вектор будет упакован в вирион; •плазмидные SV40-векторы. В их составе присутствует ori и ген большого Т антигена, в то же время гены белков капсида VP1, VP2 и VP3 отсутствуют. В связи с этим плазмидные векторы способны реплицироваться, но не упаковываться в вирионы. Плазмидные векторы могут быть челночными и содержать последовательности ДНК, позволяющие им реплицироваться как в клетках прокариот, так и клетках эукариот; •пассивные трансформирующие векторы. Они не способны ни реплицироваться, ни упаковываться в вирионы. Такие векторы представляют собой молекулы ДНК, которые содержат сегменты генома SV40, ответственные за экспрессию генов. Пассивные векторы способны осуществить доставку чужеродной ДНК и внедрить ее в клеточную ДНК. 81 Прикладная молекулярная биология Широкое применение в генетической инженерии нашли векторы, созданные на основе ретровируса. Геномной НК ретровирусов является РНК. Их жизненный цикл следующий. После адсорбции вириона на поверхности клетки и проникновения в нее происходит копирование РНК в результате обратной транскрипции с образованием двухцепочечной ДНК, которая затем интегрирует в клеточный геном. Интегрированная ДНК транскрибируется с образованием геномных и субгеномных РНК. Оба типа РНК служат матрицами для синтеза белка. После накопления вирус-специфических белков происходит формирование вирусных частиц и высвобождение их из клетки (рис. 4.26). Рис. 4.26. Жизненный цикл ретровирусов При конструировании векторов на основе ретровирусов обычно часть ретровирусных генов удаляют. При этом определенные нуклеотидные последовательности, необходимые для обратной транскрипции, экспрессии генов, упаковки генома в вирионы должны быть сохранены. При получении рекомбинантного ретровирусного вектора чужеродные 82 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии нуклеотидные последовательности встраивают, замещая удаленные области генома. Далее рекомбинантный вектор с помощью различных ухищрений упаковывается в вирион, который способен обеспечить доставку генетического материала в клетку и его интеграцию в клеточный геном. Таким образом, векторы, созданные на основе ретровирусов, способны не только доставлять чужеродный генетический материал в клетку, но и интегрировать его в ДНК клетки хозяина. Интегрированная чужеродная ДНК будет реплицироваться вместе с клеточной ДНК, и передаваться при делении материнской клетки потомкам. Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки растений В генетической инженерии растений для трансформации растительных клеток используют векторы, созданные на основе вирусов. Например, вируса мозаики цветной капусты и др. Преимущество вирусов, используемых в качестве векторов, заключаются в том, что они легко проникают в клетку и в ней размножаются. При этом число копий вирусного генома в клетке может достигать десятков тысяч. Следовательно, число копий чужеродного гена в клетке достигает такого же значения. Наличие большого числа копий генов может обеспечить сверхсинтез белкового продукта. К недостаткам вирусных векторов относится ограниченный размер вводимых в них чужеродной ДНК и то, что вирусы имеют ограниченный круг хозяев. В настоящее время считается, что для доставки генетического материала в растительные клетки наиболее перспективно применение векторов, сконструированных на основе Ti- плазмиды Agrobackteria tumefaciens. Эти почвенные бактерии способны вызывать образование опухолей (корончатых галлов) у растений. Клетки корончатых галлов так же, как и раковые клетки животных, способны к неограниченному росту. Опухолеродным агентом у Agrobackteria tumefaciens является ее Ti-плазмида. После того как бактерии попадают в пораженные ткани растений, 83 Прикладная молекулярная биология Ti-плазмида проникает в растительные клетки. Затем часть ДНК плазмиды, так называемая Т-ДНК, интегрирует в геном растения. В результате экспрессии интегрированной Т-ДНК образуются белки, которые обеспечивают трансформацию растительных клеток в клетки корончатых галлов. Ti-плазмида представляет собой кольцевую двухцепочечную молекулу ДНК, длина которой составляет 150 – 250 т.п.н. В ее состав входят: •T-ДНК (12 – 20 т.п.н.). T-ДНК встраивается в геном растений и кодирует ферменты биосинтеза фитогормонов и опинов (производных аминокислот). Продукты генов Т-ДНК вызывают образование корончатых галлов; •vir-область, содержит гены, ответственные за перенос Т-ДНК в геном растений; •tra-область, включает гены, контролирующие конъюгацию бактерий; •ori-область, содержит последовательности ДНК, ответственные за репликацию Ti-плазмиды. Ti-плазмида содержит два набора генов: один из которых экспрессируется в клетках бактерий, другой – в клетках растений. Регуляция экспрессии генов в составе Т-ДНК осуществляется посредством элементов, функционирующих в клетках растений, в то время как остальные гены находятся под контролем бактериальных промоторов. Необходимо обратить внимание, что для образования корончатых галлов необходимы гены обеих групп. Возможность использования Ti-плазмид в качестве вектора обусловлена тем, что •круг хозяев агробактерий широк; •они способны трансформировать практически все двудольные растения, кроме того можно добиться трансформации однодольных растений, в том числе злаков; •интегрированная в геном Т-ДНК наследуется как доминантный признак. При создании рекомбинантных векторов на основе Ti-плазмиды чужеродную ДНК встраивают в состав Т-ДНК. Способность последней интегрировать в геном растений обеспечивает внедрение и чужеродной ДНК. 84 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Векторная система, созданная на основе Ti-плазмид, должна: •содержать сигналы для переноса и интеграции Т-ДНК в ядерный геном растений; •содержать промотор, обеспечивающий экспрессию чужеродных генов. Промотор должен обладать достаточной силой и узнаваться РНК-полимеразой растений. Может использоваться регулируемый промотор. Например, промотор генов белков теплового шока. Гены с таким промотором будут экспрессироваться при повышенной температуре. Другой регулируемый промотор – промотор гена малой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазы (фермент, участвующий в фотосинтезе) активен только в фотосинтезирующих тканях. Часто в генетической инженерии используется промотор гена вируса мозаики цветной капусты. Гены с таким промотором активно экспрессируются во всех тканях; •содержать маркер, необходимый для селекции трансформированных клеток. В качестве маркеров могут быть использованы гены lux A и lux B, выделенные из ДНК светлячков, и контролирующие синтез люциферазы. Этот белок обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в восстановленную форму. Такой переход сопровождается свечением. Также в качестве маркера применяется ген pgfp, выделенный из медузы Acquorea victoria, контролирует синтез GFP-белка. Трансгенные растения с этим геном светятся зеленым светом в ультрафиолете; •не содержать онкогенов, подавляющих дифференцировку растительных клеток. Рекомбинантные Ti-плазмиды используют для получения трансгенных растений. С этой целью растительные клетки обрабатывают бактериями, содержащими рекомбинантную плазмиду. Последняя обеспечивает доставку чужеродных генов в составе Т-ДНК в растительный геном. Затем из отдельных клеток выращивают трансгенные растения. Следует отметить, что в результате эксперимента не все растительные клетки подвергаются трансформации. Отбор трансгенных растений от нетрансформированных 85 Прикладная молекулярная биология можно осуществить с помощью маркеров. Если в качестве маркера использовался ген pgfp, то трансгенные растения в отличие от нетрансгенных растений будут светиться в ультрафиолете. Введение рекомбинантного вектора в клетки модифицируемого организма Гены как в прокариотические, так и экариотические клетки могут быть введены с использованием векторов, сконструированных на основе вирусов. Вирусы способны обеспечить проникновение рекомбинантного вектора внутрь клетки. При этом каждая клетка может получить большое число копий чужеродного гена. Более того, в некоторых случаях вирусы обеспечивают встраивание чужеродного гена в состав клеточного генома. Возможна доставка чужеродной ДНК в клетки и без участия вирусов. Этот процесс называется трансфекция. Существуют несколько методов доставки чужеродной ДНК в клетки на основе трансфекции: кальций-фосфатная трансфекция; микроинъекция; электропорация; биобаллистическая трансформация, липофекция и др. Кальций-фосфатная трансфекция является одним из самых простейших методов доставки чужеродной ДНК в клетки. В этом случае к раствору, содержащему ДНК и фосфат, добавляют хлорид кальция. В результате образуются частицы кальциевого преципитата, состоящего из фосфата кальция и ДНК. Преципитатом обрабатывают клетки, которые путем фагоцитоза поглощают частицы. В составе преципитата внутрь клеток проникает и ДНК. Эффективность трансформации клеток таким способом невелика. Ее можно несколько увеличить, используя какиелибо вещества, например, глицерин, или этиленгликоль. Метод микроиньекций широко используется при переносе генов в процессе получения трансгенных животных. Определенное количество копий генетического материала инъецируется при помощи микропипетки в клеточное ядро (рис. 4.27). Чужеродную ДНК обычно вводят в одноклеточный эмбрион – зиготу. 86 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Рис. 4.27. Метод микроинъекций. С помощью микропипетки в ядро клетки вводится раствор ДНК Метод электропорации основан на способности клеточной мембраны становиться проницаемой для молекул ДНК под действием импульсов тока высокого напряжения. В результате воздействия тока, в мембранах клеток формируются поры, через которые способны проходить молекулы ДНК. При проведении эксперимента (рис. 4.28) в среду вносят клетки и чужеродную ДНК, которую необходимо ввести в эти клетки. Через среду пропускают высоковольтные импульсы электрического тока, приводящие к образованию пор в мембране. Через эти поры ДНК проникает в клетку. Электропорация успешно используется для введения молекул ДНК в клетки животных, простейших, растений, дрожжей, бактерий. Рис. 4.28. Электропорация 87 Прикладная молекулярная биология Принцип метода биобаллистической трансформации (рис. 4.29) основан на том, что на мельчайшие частички металла (вольфрама, платины или золота) наносится чужеродная ДНК. Металлические частички, покрытые ДНК, помещаются внутрь биобаллистической пушки. В пушке уменьшается давление до 0,1 атм. В этот момент частички металла с огромной скоростью выстреливаются из пушки и, пробивая мембраны, попадают в цитоплазму и ядра клеток. Так чужеродная ДНК проникает внутрь клеток. Рис. 4.29. Биобаллистическая трансформация Метод липофекции основан на использовании липосом для доставки ДНК в клетки. Липосомы представляют собой сферические структуры, оболочки которых образованы бислоем фосфолипидов (рис. 4.30). Их получают в результате обработки ультразвуком или резкого встряхивания водных эмульсий фосфолипидов. При осуществлении липофекции ДНК помещают в липосомы. Таким образом, генетический материал защищается от действия нуклеаз. Липосомы способны сливаться с клеточной мембраной, после чего их содержимое проникает в клетки. Так ДНК доставляется внутрь клеток. Рис. 4.30. Липосома 88 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии Судьба чужеродной ДНК, внесенной в клетку в результате трансфекции, может быть двоякой. В связи с этим различают стабильную трансфекцию и транзиентную трансфекцию. В случае транзиентной трансфекции переносимая ДНК не включается в ядерный геном и не реплицируется. В связи с этим она быстро теряется по мере размножения клеток. При стабильной трансфекции чужеродная ДНК интегрирует в клеточный геном, реплицируется вместе с ним и не теряется в процессе деления клеток. Получение ГМО Конечной задачей генетической инженерии является получение ГМО. Для решения этой задачи после трансформации клеток чужеродным генетическим материалом, необходимо отобрать клетки с приобретенными генетическими свойствами. С этой целью могут быть использованы, как указывалось ранее, различные подходы. На следующем этапе трансформированные клетки являются основой для получения ГМО. Так из отдельной трансформированной растительной клетки можно получить фертильное трансгенное растение. При получении же трансгенных животных необходимо предварительно трансформировать половые клетки или зиготу, поскольку из соматических клеток животных нельзя вырастить животное. 89 Глава 5. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ПРОКАРИОТ Генетическая инженерия прокариот зародилась в 70-х годах XX века. Наиболее излюбленным объектом ее исследования с тех пор является E.coli. К настоящему времени получены и другие генетически модифицированные бактерии: Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus brevis, Acremonium chrysogenum, Zymomonas mobilis, Erwinia herbicola, Corynebacterium glutamicum и др. Конечной целью генетической инженерии бактерий обычно является получение продуцентов каких-либо белков, например, инсулина, гормона роста и др., а также получение генетически модифицированных микроорганизмов, созданных для решения определенных задач, например, были генетически модифицированы некоторые штаммы Corynebacterium glutamicum с целью повышения продукции определенных аминокислот. Получены также штаммы бактерий, которые эффективно разрушают токсичные отходы, деградируют целлюлозу до низкомолекулярных соединений и т.д. Кроме того генетически модифицированные бактерии широко используются в научных исследованиях. Получение генетически модифицированных бактерий включает следующие этапы: •получение гена; •введение чужеродного гена в вектор; •введение рекомбинантного вектора в бактериальную клетку; •идентификация клеток, содержащих рекомбинантный вектор; •размножение генетически модифицированных бактерий. Гены могут быть синтезированы или выделены из биологических объектов. Синтез гена возможен, если известна его нуклеотидная последовательность или же первичная структура в нем закодированного белка. В последнем случае первичная структура синтезированного гена может отличаться от первичной структуры природного гена. Это определяется тем, что генетический код вырожден. 90 Глава 5. Генная инженерия прокариот В связи с этим по первичной структуре белка практически невозможно воссоздать первичную структуру природного гена. Также возможен синтез гена с использованием ПЦР или с помощью обратной транскрипции иРНК. Кроме того гены могут быть выделены из библиотеки генома или из препаратов ДНК того или иного живого организма. С целью успешной экспрессии, гены должны содержать кроме кодирующих последовательностей и регуляторные области: промоторы, участки, кодирующие последовательность Шайна-Дальгарно и др. При использовании эукариотических генов последние не должны содержать интронов, поскольку у прокариот отсутствует эукариотическая система сплайсинга. Исключение интронов из состава генов возможно в процессе их химического синтеза, когда синтезируются нуклеотидные последовательности, соответствующие только экзонам. кДНК, синтезированная в результате обратной транскрипции иРНК, также будет соответствовать кодирующим последовательностям и отличаться от природного гена отсутствием в своем составе интронов. Таким образом, кДНК может быть использована для синтеза эукариотических белков в бактериальных клетках. Для доставки чужеродных генов в прокариотические клетки используются векторы, созданные на основе плазмид или вирусов. Разработаны различные подходы введения чужеродного гена в вектор с целью получения рекомбинантного (химерного) вектора. Для решения этой задачи могут быть использованы рестриктазы, полинуклетидполимераза, лигазы. Более подробно вопрос об организации векторов и способах введения в их состав чужеродной ДНК рассмотрен ранее в теме «Введение гена в вектор и получение рекомбинантного вектора». Рекомбинантный вектор на следующем этапе необходимо доставить в бактериальную клетку. Векторы, созданные на основе вирусов, проникают внутрь клетки, используя способность вирусов инфицировать бактерии. Для введения химерных векторов на основе плазмид в бактериальные клетки могут быть использованы метод электропорации или высокотемпературное воздействие в сочетании с обработкой клеток хлоридом кальция. Следует отметить, что эффективность трансформации при этом 91 Прикладная молекулярная биология невысока. В связи с этим на следующем этапе возникает необходимость отбора бактериальных клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду. При трансформации бактериальных клеток с помощью pBR322 чужеродный ген в этот вектор встраивают в один из двух генов устойчивости к антибиотику. Тогда бактерии, захватившие рекомбинантную плазмиду, приобретут устойчивость только к одному антибиотику, ген которого остался интактным. Поскольку при создании рекомбинантного вектора не все молекулы pBR322 подвергаются рекомбинации, поэтому в среде, в которой обрабатывают бактериальные клетки при их трансформации, будут присутствовать молекулы и нерекомбинантного вектора pBR322. Такие векторы могут быть также захвачены бактериями. По завершению процедуры трансформации в среде будут присутствовать три вида клеток: клетки, не захватившие плазмиду pBR322, клетки, захватившие рекомбинантную плазмиду pBR322, и клетки, захватившие нерекомбинантную плазмиду pBR322. Из этой смеси необходимо отобрать клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду. С этой целью бактерии высевают на среду, содержащую тот антибиотик, ген устойчивости к которому интактен в обеих плазмидах. В этих условиях бесплазмидные клетки не способны расти. Клетки же бактерий, содержащие как рекомбинантную, так и нерекомбинантную плазмиду, образуют колонии. На основании чувствительности к антибиотику, ген устойчивости к которому нарушен в рекомбинантной плазмиде, можно различить колонии клеток с рекомбинантной и нерекомбинантной плазмидами. Для этого часть клеток каждой колонии тестируют на их чувствительность к данному антибиотику. Клетки бактерий, содержащих нерекомбинантную плазмиду, будут расти в присутствии данного антибиотика, в то время как клетки с рекомбинантной плазмидой в этих условиях не растут. В генетической инженерии широко используют векторы, несущие одновременно ген устойчивости к антибиотику и ген бета-галактозидазы, например вектор pUC 18. Бета-галактозидаза катализирует расщепление субстрата X-gal с образованием окрашенного в голубой цвет продукта. Последний придает колониям клеток 92 Глава 5. Генная инженерия прокариот голубую окраску. При использовании таких векторов встраивание чужеродной ДНК осуществляют в ген бетагалактозидазы. Бактерии, содержащие рекомбинантную плазмиду, будут расти в присутствии соответствующего антибиотика, и будут при этом бесцветными. В то время как бактерии, содержащие нерекомбинантную плазмиду, будут также расти в присутствии антибиотика и будут при этом голубыми. При этом бесплазмидные бактериальные клетки в присутствии антибиотика погибнут. Используя вышеописанную особенность, можно после трансформации бактериальных клеток из смеси клеток (бесплазмидных клеток, клеток, содержащих рекомбинантную плазмиду, и клеток, содержащих нерекомбинантную плазмиды) выделить клетки с рекомбинантной плазмидой. Экспрессия генов, клонированных в клетках прокариот Интеграция гена в состав вектора не гарантирует того, что он будет экспрессироваться с образованием функционально активного продукта. Чтобы обеспечить экспрессию чужеродного гена, необходимо перед ним поместить бактериальный промотор и регуляторные участки (рис. 5.1). Рис. 5.1. Для успешной экспрессии перед чужеродным геном должен располагаться промотор и последовательность ДНК, кодирующая участок связывания с рибосомой в составе иРНК 93 Прикладная молекулярная биология С целью повышения эффективности транскрипции чужеродных генов перед ними размещают сильные промоторы. Такие промоторы благодаря высокому сродству к РНК-полимеразе обеспечивают высокую скорость синтеза иРНК. Предпочтительнее использовать регулируемые промоторы. Экспрессию генов с таким промоторами можно регулировать. При определенных условиях гены будут молчать, при других – эффективно транскрибироваться. В генной инженерии прокариот широко используются промоторы lac- и trp-оперонов E.coli и др. Промотор lacоперона обеспечивает эффективную транскрипцию при высокой концентрации лактозы (или изопропил--D-тиогалактопиранозида) и цАМФ и при низкой концентрации глюкозы. В других условиях он обуславливает низкий уровень транскрипции. Иным способом регулируется промотор trp-оперона. Он выключается при наличии в среде высокой концентрации триптофана. При удалении триптофана или добавлении в среду 3-индолакриловой кислоты происходит активация данного промотора. Часто стоит задача перед исследователями – получение большого количества белка. Для достижения этой цели необходимо соблюсти следующие условия: поместить перед геном сильный промотор и добиться наличия большого числа копий молекул вектора в клетке. Для получения большого количества белкового продукта была создана плазмида рСР3. В ее состав входят сильный промотор, ген устойчивости к ампицилину, сайт инициации репликации, обеспечивающий при повышении температуры увеличение на порядок числа копий плазмиды в клетке, полилинкер с несколькими сайтами узнавания для рестриктаз, по которым встраивают чужеродный ген. Бактерии, содержащие такие плазмиды, вначале выращивают при 28 °С, а затем – при 42 °С. При низкой температуре клетки делятся, при этом промотор не функционирует, и в клетке содержится обычное число копий плазмиды. Повышении температуры до 42 °С приводит к увеличению на порядок числа копий плазмиды и активации промотора. В результате в клетке происходит сверхсинтез белкового продукта. Его выход может составлять около 20 % от общего количества белка. 94 Глава 5. Генная инженерия прокариот Увеличить количество копий гена в клетке можно не только за счет увеличения копийности плазмид, но и в результате встраивания в состав вектора нескольких копий генов. Очевидно, увеличение числа генов в клетке обычно сопровождается усилением экспрессии генов и повышением синтеза чужеродного белка. Эффективность экспрессии чужеродных генов зависит не только от силы промотора и числа копий гена в клетке, но и от первичной структуры участка связывания с рибосомой (последовательность Шайна-Дальгарно), расположенной перед инициирующим кодоном в иРНК. Этот участок закодирован в составе вектора и находится сразу же за промотором. Последовательность ШайнаДальгарно состоит из 6 – 8 нуклеотидов, которые спариваются с комплементарной последовательностью рРНК малой субъединицы рибосомы. Прочность связывания между мРНК и рРНК определяет эффективность трансляции. Чем прочнее связывание между иРНК и рРНК, тем эффективнее трансляция. Кроме того, для успешной трансляции необходимо, чтобы инициирующий кодон находился на определенном расстоянии от последовательности ШайнаДальгарно. Экспрессию генов в прокариотических клетках можно оптимизировать с помощью подбора при их синтезе таких кодонов, которые наиболее эффективно транслируются. Одна и та же аминокислота в силу вырожденности кода может быть закодирована разными кодонами, которые прочитываются соответственно разными тРНК. Концентрации последних в клетках прокариот могут значительно отличаться. Если в гене преобладают кодоны, которым соответствуют тРНК, присутствующие в клетке в больших концентрациях, то в этом случае синтез белка будет осуществляться эффективно. Если же в гене преобладают кодоны, которым соответствуют тРНК, присутствующие в низких концентрациях, то синтез белка будет осуществляться не эффективно. Т.е. концентрация тРНК может определять скорость синтеза белка. Чужеродные белки в прокариотических клетках могут подвергаться деградации. В этом случае получить их 95 Прикладная молекулярная биология в ощутимых количествах не удается. Решить эту проблему можно путем интеграции чужеродного гена в экспрессирующийся ген вектора. Тогда будет синтезироваться гибридный белок, содержащий полипептидные фрагменты чужеродного (маркерного) и бактериального белков (рис. 5.2). Такие гибридные белки устойчивы в бактериальных клетках. При интеграции чужеродного гена в экспрессирующийся ген вектора существует опасность попадания не в рамку считывания. Синтезированный белок с такой ДНК не будет иметь ничего общего с чужеродным белком. В связи с этим при встраивании чужеродного гена необходимо убедиться, чтобы он попал в рамку считывания. Рис. 5.2. Интеграция чужеродного гена в экспрессирующийся ген вектора обуславливает синтез гибридного белка Гибридные белки часто не обладают биологической активностью чужеродных белков, поэтому существует необходимость выщепления последних из гибридных белков. Эту проблему можно разрешить, если к белку клетки-хозяина присоединить короткий пептид, узнаваемой протеазой небактериального происхождения. Такое присоединение программируется на уровне ДНК. После синтеза и очистки гибридного белка фрагмент белка клетки-хозяина и пептид отделяется с помощью специфической протеазы (рис. 5.3). Так можно выщепить чужеродный белок из гибридного. 96 Глава 5. Генная инженерия прокариот Рис. 5.3. Схема, иллюстрирующая кодирование гибридного белка, экспрессию сконструированной генетической конструкции с последующим выщеплением чужеродного белка с помощью специфической протеазы В некоторых случаях гибридные белки сохраняют активность чужеродного белка. Тогда возможно их использование без удаления маркерного пептида. В процессе роста популяции часть клеток может утратить рекомбинантную плазмиду. Бесплазмидные клетки, как правило, растут быстрее и постепенно вытесняют клетки, содержащие рекомбинантную плазмиду. Через какое-то время количество продукта клонированного гена в культуре постепенно снижается. И в конечном итоге он вообще перестает синтезироваться. Для решения проблемы утраты рекомбинантной плазмиды в вектор можно встроить ген устойчивости к антибиотику, и выращивать бактерии в среде с антибиотиком. Тогда рекомбинантная плазмида в культуре клеток будет сохраняться. В то время как клетки, утратившие ее, погибнут из-за наличия антибиотика в среде. Использование антибиотиков в промышленных условиях 97 Прикладная молекулярная биология сильно увеличивает стоимость конечного продукта. С целью удешевления используют другие селективные среды, на которых бактерии без рекомбинантной плазмиды расти не могут, или встраивают ген в хромосому. Интеграция чужеродного гена в хромосому бактериальной клетки позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты клонированных генов. Для интеграции в хромосому вводимый чужеродный ген должен иметь полинуклеотидную последовательность (приблизительно 50 нуклеотидов) сходную с полинуклеотидной последовательностью участка хромосомы, в пределах которого планируется его встраивание. Интеграция гена в хромосому осуществляется в результате гомологичной рекомбинации. После встраивания чужеродного гена трансформированные клетки отбирают и далее используют. Можно добиться секреции чужеродных белков бактериальными клетками в окружающую среду. Секретируемые белки часто оказываются более стабильными, чем не секретируемые. Кроме того, для выделения и очистки чужеродных белков не нужно разрушать клетки, что значительно упрощает эти процедуры. Для получения секретируемых белков нужно присоединить к чужеродному гену участок ДНК, кодирующий сигнальную последовательность. Эта последовательность обеспечивает секрецию белков. В процессе секреции белков сигнальная последовательность отщепляется, а чужеродный белок выходит из клетки. Следует отметить, что наличие сигнальной последовательности не всегда определяет эффективную секрецию чужеродных белков. Особенно сложно добиться секреции чужеродных белков грамотрицательными бактериями, к ним относится и E.coli. Грамотрицательные бактерии окружены двумя мембранами: внутренней и внешней. Между ними находится периплазматическое пространство, заполненное периплазмой. Для получения секретируемого интерлейкина-2 поступили следующим образом. Ген интерлейкина-2 соединили с геном полноразмерного предшественника мальтозосвязывающего белка, содержащего сигнальную последовательность. 98 Глава 5. Генная инженерия прокариот Между этими генами поместили сегмент ДНК, кодирующий сайт узнавания для протеазы Ха. Такой химерный ген интегрировали в вектор. Затем им трансформировали E.coli. В периплазме трансформированных клеток был выявлен химерный белок. После его обработки специфической протеазой был получен функционально активный интерлейкин-2. Интересен еще один подход, позволяющий добиться секреции чужеродных белков грамотрицательными бактериями. Известно, что белок грамотрицательных бактерий – бактериоцин – активирует локализованную во внутренней мембране фосфолипазу А. В результат такой активации наружная и внутренняя мембраны становятся более проницаемы для белков. Если ген бактериоцина встроить в вектор и им трансформировать клетки E.coli, то мембраны последних станут более проницаемыми. Можно также в состав того же самого (или другого вектора) ввести ген чужеродного белка с присоединенной нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид. Бактерии, содержащие активно транскрибирующие гены бактериоцина и чужеродного белка, будут секретировать последний в окружающую среду. Наличие в клетке чужеродных генов и их экспрессия часто приводят к метаболической перегрузке и ухудшению роста клеточной культуры. Что в конечном итоге может привести к снижению выхода чужеродного белка. В случае метаболической перегрузки возрастает вероятность трансляционных ошибок, что может сказаться на качестве белка. Метаболическую перегрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмиды или встроить чужеродные гены в хромосому. Уменьшить метаболическую перегрузку можно и используя регулируемые промоторы. В этом случае во время роста клеточной культуры промотор находится в выключенном состоянии. После наращивания клеточной массы промотор включается в результате воздействия какого-либо фактора. Таким образом, процесс получения генетически модифицированных бактерий, обладающих полезными 99 Прикладная молекулярная биология характеристиками, является сложнейшей процедурой, требующей огромных затрат интеллектуального труда. Практическое применение генетически модифицированных бактерий Генетически модифицированные бактерии находят широкое применение во многих областях деятельности человека. Их используют для получения лекарственных препаратов, создания вакцин, для синтеза витаминов, аминокислот, антибиотиков и многих других веществ. Они оказывают неоценимую услугу при деградации токсических соединений и утилизации биомассы, в сельском хозяйстве. Генетически модифицированные бактерии на службе медицины Лекарственные препараты В настоящее время с помощью ДНК-технологий удается получать лекарственные препараты на основе белков человека в ощутимых количествах, достаточных для полного удовлетворения в их потребности. В то время как до эры ДНК-технологий были серьезные ограничения при лечении некоторых заболеваний человека, связанные с недостатком такого рода лекарств. В настоящее время клонировано сотни генов белков человека, которые потенциально могут быть использованы в медицине. Для десятков белков уже получено одобрение на их применение в качестве лекарственных препаратов (таблица 5.1). Надо отметить, что прежде чем какой-либо белок будет использован для лечения человека, он подвергается тщательной проверке. Вначале проводят ее на животных, и только потом осуществляются продолжительные клинические испытания. Пройдет не один год с тех пор, как белок, полученный с помощью генетически модифицированных бактерий, после интенсивных исследований будет использован для лечения человека. 100 Глава 5. Генная инженерия прокариот Таблица 5.1 Белки, разрешенные для использования в качестве лекарственных препаратов для лечения человека Белок Заболевание Инсулин Сахарный диабет Гормон роста Дефицит гормона роста у детей Антигемофильный фактор Гемофилия А Интерлейкин-2 Рак почки Интерферон 2a Волосистая лейкоплакия, саркома Капоши Интерферон 2b Волосистая лейкоплакия, саркома Капоши, остроконечная кондилома, гепатиты В и С Интерферон 1b Рецидивирующий рассеянный склероз Интерферон 1b Хронический гранулематоз Тканевой активатор плазминогена Острый инфаркт миокарда, острая обширная эмболия легочной артерии Глюкоцереброзидаза Болезнь Гоше ДНКаза 1 Муковисцидоз Эритропоэтин Анемия, заболевание почек Рассмотрим в качестве примера биотехнологические способы получения инсулина и гормона роста. Инсулин Инсулин является гормоном поджелудочной железы. Он регулирует углеводный обмен и поддерживает нормальный уровень глюкозы в крови. Его недостаток в организме приводит к тяжелому заболеванию сахарному диабету, который является широко распространенным недугом и как причина смерти стоит на третьем месте после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. В настоящее время более 100 млн. человек болеют диабетом. Простое введение инсулина в организм человека позволяет 101 Прикладная молекулярная биология нивелировать данное заболевание. В связи с широкой распространенностью сахарного диабета, существует необходимость в получении инсулина в больших количествах. Эту проблему позволяет решить биотехнологический синтез гормона. Молекула инсулина образована 51 аминокислотным остатком и состоит из двух полипептидных цепей А и В, связанных между собой двумя дисульфидными мостиками. Цепь А содержит 21 аминокислотный остаток, цепь В – 30 остатков. Синтезируется он в клетках островков Лангерганса в виде одноцепочечного предшественника препроинсулина. В процессе созревания (рис. 5.4) вначале отщепляется N-концевой сигнальный пептид (24 аминокислотных остатка) и образуется проинсулин (86 остатков), в котором А- и В-цепи соединены С-пептидом. Затем происходит удаление С-пептида, в результате проинсулин превращается в инсулин. Рис. 5.4. Процессинг инсулина 102 Глава 5. Генная инженерия прокариот Инсулин является первым белком, полученным для коммерческих целей с использованием генетически модифицированных бактерий. Существует две основные стратегии для получения инсулина человека с помощью ДНК-технологий. В соответствии с первой стратегией в различные штаммы-продуценты вводятся по отдельности последовательности ДНК, кодирующие соответственно А- и В-цепи инсулина. В результате одни продуценты синтезируют только А-цепи, другие – В-цепи. Далее синтезированные А- и В-цепи выделяют и из них собирают функционально активный гормон. При этом между цепями также как и в природном гормоне формируются дисульфидные мостики. Согласно второй стратегии с помощью генетически модифицированных бактерий получают проинсулин (рис. 5.5), из которого с помощью протеаз вычленяют инсулин. Более предпочтительной является вторая стратегия, обес0печивающая более эффективный синтез гормона. При использовании обеих стратегий возможно как индивидуальное получение исходных полипептидов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. При использовании определенных подходов из гибридного белка вырезают инсулин (рис. 5.5). В составе гибридных белков могут содержаться также последовательности, обеспечивающие его транспорт в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду. 103 Прикладная молекулярная биология Рис. 5.5. Схема получения инсулина согласно второй стратегии. Амп – ген устойчивости к ампицилину. -гал – ген -галоктазидазы 104 Глава 5. Генная инженерия прокариот Гормон роста (соматотропин) Гормон роста синтезируется клетками гипофиза в виде предшественника с относительной молекулярной массой 28 000. В процессе созревания от предшественника отщепляются полипептидные последовательности. Гормон роста состоит из 191 аминокислотного остатка и имеет относительную молекулярную массу около 22 000. Его недостаток приводит к заболеванию – гипофизарной карликовости, которое встречается с частотой 1 случай на 5 000 человек. Поскольку гормон обладает видовой специфичностью, указанное заболевание можно лечить, используя лишь человеческий гормон. Раньше его получали из гипофиза трупов. Гормона хватало лишь для лечения трети случаев гипофизарной карликовости в развитых странах. Больному требуется для лечения в течение года гормон роста в количестве, полученном из гипофизов 60 умерших. В настоящее время гормон роста синтезируют с помощью ДНК-технологий. Одна из многочисленных схем получения гормона роста с помощью ДНК-технологий представлена на рис. 5.6. На первом этапе из клеток гипофиза выделяли мРНК предшественника гормона. Далее, используя метод обратной транскрипции, синтезировали кДНК, из которой на следующем этапе удаляли область, кодирующую сигнальный пептид. Полученный ген, кодирующий полипептидную последовательность гормона, интегрировали в вектор, так чтобы перед геном находились промотор и последовательность Шайна-Дальгарно. Затем рекомбинантным вектором трансформировали клетки E.coli. Трансформированные клетки осуществляли синтез гормона роста. Так с помощью методов генетической инженерии удалось получить гормон роста. 105 Прикладная молекулярная биология Рис. 5.6. Схема получения гормона роста человека с помощью ДНК технологий Рекомбинантные вакцины Генетически модифицированные бактерии можно использовать и для получения вакцин. Последние применяются для формирования иммунитета к патогенным микроорганизмам. В ответ на введение вакцины в организме вырабатываются антитела к патогенным микроорганизмам, которые впоследствии защищают его (организм) от инфекционного заболевания, обеспечивая обезвреживание патогенных микроорганизмов. С появлением вакцин многие инфекционные заболевания удалось взять под контроль и многократно снизить число заболевших. В настоящее время большинство вакцин создаются на основе либо инактивированных, либо невирулентных штаммов. 106 Глава 5. Генная инженерия прокариот Существуют еще так называемые химические вакцины. Они представляют собой извлеченные из микроорганизмов отдельные компоненты, которые и определяют иммуногенные свойства микроорганизма. Несмотря на огромное значение вакцин в подавлении инфекционных заболеваний, их использование сдерживается некоторыми ограничениями: •при нарушении технологического процесса в вакцины могут попасть живые или недостаточно ослабленные вирулентные микроорганизмы, которые способны вызвать тяжелые заболевания и привести к распространению инфекции; • невирулентные штаммы могут ревертировать к исходному штамму; •не все патогенные микроорганизмы удается культивировать, поэтому для заболеваний, вызванных такими микроорганизмами, вакцины не созданы; •для некоторых заболеваний нельзя создавать традиционные вакцины (СПИД). С помощью ДНК-технологий можно получить новое поколение вакцин. Для достижения этой цели используют методы генной инженерии. Существует разные подходы для получения таких вакцин: •из генома патогенного микроорганизма удаляется ген, ответственный за вирулентность. Такой микроорганизм можно использовать в качестве живой вакцины, потому что он не вызывает заболевание, но сохраняет способность вызывать иммунный ответ. Кроме того он не может ревертировать к исходному штамму, потому что у него удален целый ген, определяющий заболевание; •можно создать непатогенные системы, обеспечивающие перенос отдельных антигенных детерминант какого-либо патогенного микроорганизма. Такие системы могут обеспечить развитие иммунного ответа на патогенный микроорганизм, при этом являться безопасными; •можно поступить и следующим образом: выделить ген, кодирующий белок патогенного микроорганизма. Клонировать его (ген) в альтернативном хозяине (например, в E.coli) и добиться его экспрессии с образованием 107 Прикладная молекулярная биология микроорганизменного белка. Последний после выделения и очистки можно использовать в качестве вакцины. В этом случае необходимо работать с генами белков, определяющих антигенные свойства микроорганизма. Только такие белки могут вызвать стойкий иммунитет. Такие вакцины безопасны, поскольку в них отсутствуют дополнительные белки и НК, которые могли бы являться причиной нежелательных побочных явлений у вакцинируемых. •в качестве вакцин перспективны пептидные вакцины. Определенные домены белковой молекулы могут выступать в качестве антигенной детерминанты и вызывать образование антител. В связи с этим возможно вакцинирование не полномерной молекулой белка, а лишь ее частью – доменом. Выработанные на него антитела будут обезвреживать патогенный микроорганизм, домен белка которого был использован в качестве вакцины. При получении пептидных вакцин с помощью ДНК-технологий клонируется не целый ген, а лишь последовательности ДНК, кодирующие его домен. Очевидна безопасность таких вакцин и их перспективность. Роль генетически модифицированных бактерий при создании диагностических средств в медицине Важную роль генетически модифицированные бактерии играют при создании диагностических средств в медицине. Широкое применение для выявления возбудителей инфекционных заболеваний имеет так называемый иммуноферментный анализ (сокращённо ИФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). О наличии того или иного возбудителя в организме человека можно судить по наличию антител в крови к этому возбудителю, потому что после проникновения патогенного микроорганизма в организм человека его иммунная система вырабатывает антитела, специфичные к данному возбудителю. В случае наличия антител можно говорить об инфицировании человека соответствующим микроорганизмом. 108 Глава 5. Генная инженерия прокариот В основе метода ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом. Существует несколько способов постановки ИФА. Рассмотрим наиболее часто используемый подход для выявления специфических антител в крови, включающий следующие этапы (рис. 5.7). •Антиген возбудителя фиксируется на твердой подложке, обычно в лунке тест-планшета. •В лунку добавляется тестируемая сыворотка или плазма крови. При наличии в них специфических антител (первых антител) к антигену возбудителя происходит их связывание с образованием двойного комплекса «антиген – первое антитело». Затем лунку промывают, чтобы удалить не связавшийся материал. •В лунку добавляют вторые антитела, к которым присоединен фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт. Вторые антитела специфичны к первым. Происходит образование тройного комплекса «антиген – первое антитело – второе антитело-фермент». Затем лунку промывают, чтобы удалить не связавшийся материал. •В лунку добавляют неокрашенный субстрат. При наличии тройного комплекса «антиген – первое антитело – второе антитело – фермент» происходит превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт. •Осуществляют качественное или количественное определение продукта реакции. Количество окрашенного продукта пропорционально количеству антител к антигену возбудителя. Чем выше концентрация антител в крови, тем будет большим образование продукта. При отсутствии антител в исследуемой сыворотке или плазме двойной и тем более тройной комплексы образовываться не будут. Следовательно, окрашенный продукт в лунке не будет образовываться. Так по наличию или отсутствию окраски можно судить о присутствии или отсутствии в крови антител к возбудителю. И в конечном итоге о присутствии или наличии возбудителя в организме человека. 109 Прикладная молекулярная биология Рис. 5.7. Принципиальная схема ИФА. АГ – антиген, АТ 1 – первые антитела, АТ 2 – вторые антитела, ЩФ – щелочная фосфатаза В качестве антигенов при ИФА могут быть использованы нативные антигены, полученные при разрушении возбудителя инфекции, рекомбинантные белки, полученные генно-инженерным способом, и являющиеся белками-аналогами определенных антигенов возбудителя, и химически синтезированные фрагменты белков возбудителя. В настоящее время в качестве антигена все больше и больше используются рекомбинантные белки, потому что технология их получения позволяет их синтезировать в чистом виде и достаточном количестве. Специфичность некоторых рекомбинантных тест-систем приближается к 100 %. С помощью ИФА осуществляется диагностика различных инфекций: ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты, цитомегаловирусная, герпесная, токсоплазменная и другие инфекции. С помощью генетически модифицированных бактерий также получают ДНК-зонды, используемые в ДНКдиагностике. С целью получения зонда, специфичного 110 Глава 5. Генная инженерия прокариот к ДНК какого-либо возбудителя поступают следующим образом. ДНК патогенного микроорганизма с помощью рестриктазы расщепляют на фрагменты. Фрагменты вводят в вектор, которым трансформируют бактериальные клетки. Затем бактерии, содержащие рекомбинантный вектор, размножают. С увеличением числа клеток увеличивается также число молекул рекомбинантного вектора, а следовательно, и число фрагментов ДНК патогенных бактерий. Далее из бактериальных клеток выделяют рекомбинантный вектор и из него с помощью той рестриктазы, которая использовалась для фрагментации ДНК, вырезают фрагмент ДНК патогенного микроорганизма, который в последствие используют в качестве зонда. Использование генетически модифицированных бактерий для получения продуктов немедицинского назначения Генетически модифицированные бактерии можно использовать и для получения продуктов немедицинского назначения. С их помощью могут быть синтезированы продукты как белкового происхождения, так и небелкового (витамины, аминокислоты, красители, антибиотики и т.д.). С целью получение рекомбинантных ДНК исследователи в своей работе применяют сотни различных рестриктаз. Многие из них синтезируют с помощью ДНКтехнологий. Однако такой способ получения рестриктаз сталкивается с определенными проблемами. Введение гена рестриктазы в составе рекомбинантного вектора в бактерию может оказаться губительным для нее, потому что в ее геномной молекуле ДНК будут присутствовать сайты рестрикции, узнаваемые рестриктазой, экспрессирующейся с чужеродного гена. Тогда хозяйская ДНК будет расщепляться ею. Одним из подходов, позволяющих защитить бактериальную ДНК от деградации рестриктазой, является введение в бактериальную клетку гена гомологичной 111 Прикладная молекулярная биология метилазы – фермента метилирующего ДНК в области сайтов рестрикции. Метилированная ДНК не расщепляется рестриктазой. Таким образом, наличие соответствующего гена метилазы защитит клетку. Аминокислоты имеют широкое применение в различных отраслях промышленности. Они используются в качестве усилителей вкуса и аромата, пищевых и кормовых добавок, в медицине, в химической промышленности при синтезе полимеров и т.д. В промышленности, главным образом, аминокислоты получают из белковых гидролизатов или как продукты метаболизма Corynebacterium или Brevibacterium. С целью повышения продуктивности этих бактерий, целесообразно введение в них модифицированных генов ферментов биосинтеза аминокислот. Направленная модификация генов может обеспечить повышенный синтез соответственной аминокислоты. Широкое применение в фармацевтической, перерабатывающей и пищевой промышленности имеют биополимеры. Некоторые из них получают с помощью микроорганизмов. С использованием ДНК-технологий существует возможность создания генетически модифицированных бактерий, продуцирующих биополимеры с улучшенными характеристиками и в больших количествах. Бактерия Xanthomonas campestris продуцирует биополимер ксантановую слизь (полисахарид). Ее можно использовать в качестве стабилизирующего, загущающего, эмульгирующего или суспендирующего вещества. С целью удешевления производства ксантановой слизи бактерии целесообразно выращивать на дешевой питательной среде – молочной сыворотке – побочном продукте, образующемся при производстве сыра и содержащем лактозу. Однако X. campestris не могут в качестве источника углерода эффективно использовать этот дисахарид. Проблему можно разрешить, если в бактериальные клетки ввести в составе рекомбинантного вектора гены ферментов, участвующих в метаболизме лактозы, -галактозидазы и 112 Глава 5. Генная инженерия прокариот лактозопермиазы. Таким образом трансформированные бактерии приобретают способность расти на сыворотке и продуцировать ксантановую слизь в больших количествах. Еще один полимер, значение которого трудно переоценить, это каучук, также может быть получен с помощью трансгенных бактерий. Его биосинтез включает 17 ферментативных стадий. В связи с этим очевидно, какую сложную задачу нужно решить, чтобы получить микроорганизмы, продуцирующие этот полимер. Можно создать с помощью ДНК-технологий микроорганизмы, синтезирующие другие полимеры и низкомолекулярные вещества (витамины, антибиотики). Для достижения этой цели в микроорганизмы необходимо ввести все или часть генов ферментов, ответственных за синтез вещества, которое исследователь хочет получить с помощью трансгенного микроорганизма. Биодеградация токсических веществ с помощью генетически модифицированных бактерий Некоторые микроорганизмы обладают природной способностью к деградации различных токсических веществ. Например, бактерии рода Pseudomonas содержат плазмиды, кодирующие ферменты, разрушающие ароматические и галогенсодержащие органические соединения. Природную способность таких бактерий можно усилить, используя приемы генной инженерии. Так Чакрабарти и его сотрудники создали бактериальный штамм, расщепляющий большинство углеводородов нефти, и получивший название «супербациллы». Штамм был получен благодаря манипуляциям с плазмидами, кодирующими ферменты деградации определенных углеводородов. Результатом таких манипуляций явилось объединение нескольких плазмид в одной клетке. Созданный штамм растет на нефти лучше, чем исходные штаммы, послужившие донорами плазмид. 113 Прикладная молекулярная биология Большинство бактерий, разрушающих токсические вещества, хорошо растут при температуре 20 – 40 °С. В природных условиях обезвреживание токсических веществ приходится осуществлять при более низких температурах – 0 – 20°С. С целью создания бактерий, способных расти при низких температурах, плазмиду TOL, ответственную за разрушение толуола мезофильного (хорошо растущего при средних температурах) штамма Pseudomonas putida, перенесли с помощью конъюгации в психрофильный (хорошо растущий при низких температурах) штамм. Трансформированный штамм обладал способностью утилизировать толуол при низкой температуре. Усилить природную способность микроорганизмов к деградации токсических веществ можно также в результате модификации генов, кодирующих ферменты какого-либо метаболического пути. 114 Глава 6. ЭУКАРИОТИЧЕСКИЕ СИСТЕМЫ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ Не всегда удается в прокариотических клетках получить рекомбинантные эукариотические белки, обладающие биологической активностью. В связи с этим были разработаны эукариотические системы эксп-рессии чужеродных генов. В качестве эукариотических систем синтеза чужеродных белков используются дрожжи и культуры клеток животных. Отсутствие биологической активности эукариотических белков, синтезированных в клетках прокариот, определяется отсутствием у них систем, обеспечивающих посттрансляционные модификации белков (гликозилирование, образование дисульфидных мостиков, ограниченный протеолиз, фосфорилирование, ацетилирование и др.). К эукариотическим векторам предъявляются следующие требования. Они должны иметь эукариотический селективный маркер, эукариотический промотор, эукариотические сайты терминации трансляции и транскрипции, сигнал полиаденилирования иРНК. В качестве векторов могут быть использованы плазмиды. Они должны нести сайт инициации репликации, функционирующей в эукариотической клетке. Вектор может быть также предназначен для встраивания в геномную ДНК эукариот. В этом случае он должен иметь нуклеотидную последовательность, гомологичную таковой участку ДНК, в который планируется встраивание вектора. Интеграция вектора в геном будет происходить по механизму гомологичной рекомбинации. Часто используют челночные векторы, способные существовать как в клетках прокариот, так и в клетках эукариот (рис. 6.1). 115 Прикладная молекулярная биология Рис. 6.1. Схема организации челночного вектора. ГУА – ген устойчивости к антибиотику (селективный маркер E.coli), ori Euk – эукариотический сайт инициации репликации, ori E.coli – сайт инициации репликации E.coli Для введения вектора в клетки эукариот используют различные подходы. При трансформации дрожжей в одних случаях векторную ДНК добавляют к их протопластам – клеткам, у которых удалена клеточная стенка химическим или ферментативным способом. В других случаях клетки дрожжей предварительно (перед добавлением экзогенной ДНК) обрабатывают ацетатом лития или используют метод электропорации. В клеточные культуры животных введение чужеродной ДНК осуществляют посредством инкубации клеток с ДНК, осажденной фосфатом кальция или ДЕ-АЕ-декстраном, а также с помощью электропорации. Для доставки ДНК в эукариотические клетки могут быть также использованы вирусы. Генная инженерия дрожжей Широко используются в генной инженерии обычные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Это обусловлено рядом причин: •они хорошо изучены; •содержат 2 мкм-плазмиды, которые можно использовать для создания экспрессирующихся векторов; •в клетках дрожжей осуществляются различные посттрансляционные модификации. Некоторые белки, полученные с помощью трансгенных дрожжей, нашли практическое применение. 116 Глава 6. Эукаритические системы экспрессии чужеродных генов В качестве вакцин используются поверхностный антиген вируса гепатита В, белок малярийного плазмодия, белок HIV-1. Как лекарственные препараты применяются инсулин, тромбоцитарный фактор роста, фактор XIIIа системы свертываемости крови, 1-антитрипсин, колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов и др. В молекулярной диагностики используются белок вируса гепатита С и антигены HIV-1. В генной инженерии дрожжей для доставки чужеродной ДНК используют плазмидные векторы, векторы, интегрирующие в геномную ДНК, и искусственные дрожжевые хромосомы (YAC). Последние применяются для клонирования больших фрагментов ДНК (порядка 100 т.п.н.). YAC-вектор содержит сайт инициации репликации, центромерную область и теломеры, может нести селективный маркер. В клетках дрожжей удаление интронов происходит не эффективно, в связи с этим при клонировании генов целесообразно использовать кДНК или химически синтезированные гены. Чужеродные белки, синтезируемые в клетках дрожжей, могут аккумулироваться в них или секретироваться в окружающую среду. Гликозилированию в дрожжевых клетках подвергаются только секретируемые белки. С целью получения секретируемых белков перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей чужеродный белок, нужно расположить нуклеотидную последовательность, кодирующую сигнальную последовательность. Последняя способна обеспечить транспорт рекомбинантного белка через клеточную мембрану. В процессе транспорта через мембрану в молекуле белка образуются дисульфидные связи, осуществляются другие посттрансляционные модификации, а также отщепляется сигнальная последовательность. Кроме Saccharomyces cerevisiae могут использоваться и другие дрожжевые системы экспрессии чужеродных генов. Так, в генной инженерии нашли применение дрожжи Kluyveromes lactis, Schizosaccharomyces pombe и др. 117 Прикладная молекулярная биология Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток насекомых В клетках насекомых могут развиваться бакуловирусы. Они способны существовать в двух формах. Первая форма представлена отдельными вирионами, вторая – множеством вирионов, объединенных белковым матриксом. Матрикс образован белком полиэдрином. Сразу после инфекции формируются отдельные вирионы, которые, высвобождаясь из инфицированных клеток, заражают другие клетки насекомого. По прошествии определенного времени начинается синтез полиэдрина. После лизиса клеток вирионы высвобождаются и оказываются заключенными в белковый матрикс, защищающий их от гибели. Если другое насекомое поглотит такую частицу, то после солюбилизации полиэдрина высвободившиеся вирионы способны начать новый цикл инфекции. Ген полиэдрина находится под контролем чрезвычайно сильного промотора. При этом цикл развития бакуловирусов не зависит от присутствия в его геноме гена полиэдрина. В связи с этим инфицирование культуры клеток насекомого рекомбинантным вирусом, в геноме которого ген полиэдрина заменен чужеродным эукариотическим геном, может привести к синтезу большого количества рекомбинантного белка. Поскольку системы посттрансляционных модификаций насекомых и млекопитающих сходны, то рекомбинантный белок, синтезированный в клетках насекомых, может оказаться по своей организации близким или идентичным природному белку, образующемуся в естественных условиях. Опираясь на вышеизложенную стратегию, в настоящее время на основе бакуловирусов разработаны векторы для экспрессии генов млекопитающих. При использовании векторов, созданных на основе бакуловирусов, получены сотни различных белков, более 95 % из которых имели правильные посттрансляционные модификации. 118 Глава 6. Эукаритические системы экспрессии чужеродных генов В генной инженерии нашел широкое применение вирус множественного ядерного полиэдроза Autographa californica (AcMNPV). Одна из стратегий создания рекомбинантного AcMNPV следующая. Вначале на основе плазмиды E.coli создается так называемый транспортный вектор. В составе транспортного вектора (рис. 6.2) содержатся промотор бакуловируса, сайт клонирования, в который встраивается чужеродный ген, сайт терминацииполиаденилирования, обеспечивающий терминацию транскрипции и полиаденилирование иРНК. Перед промотором и за сайтом терминации-полиаденилирования встраивают фрагменты ДНК бакуловируса AcMNPV, прилегающие к гену полиэдрина. На следующем этапе в сайт клонирования транспортного вектора встраивают чужеродный ген (рис. 6.2). Рис. 6.2. Схема организации транспортного вектора и встраивания в него чужеродного гена 119 Прикладная молекулярная биология Транспортный вектор с чужеродным геном используют для введения последнего в состав ДНК бакуловируса (рис. 6.3). Между ДНК AcMNPV и транспортным вектором возможна гомологичная рекомбинация, поскольку их молекулы имеют гомологичные последовательности нуклеотидов. В результате такой рекомбинации ген полиэдрина замещается чужеродным геном. При этом рекомбинантный вирус приобретает способность обеспечивать синтез чужеродного белка и в то же время становится не способным продуцировать полиэдрин. Рис. 6.3. В результате гомологичной рекомбинации между транспортным вектором и AcMNPV ген полиэдрина замещается чужеродным геном В настоящее время разработаны и другие методики получения рекомбинантных бакуловирусов. Созданы челночные векторы, позволяющие осуществлять все манипуляции с генами в клетках Е.coli, а синтез белка проводить в клетках насекомых. 120 Глава 6. Эукаритические системы экспрессии чужеродных генов Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток млекопитающих В настоящее время созданы внехромосомные векторы млекопитающих. Основное их назначение: получение рекомбинантных белков в медицинских целях и использование для исследования функций и регуляции генов млекопитающих. По своей организации они сходны с другими экспрессирующимися эукариотическими векторами (рис. 6.1). Они могут быть челночными и содержать два сайта инициации репликации, один из которых ответственен за репликацию вектора в клетках прокариот, другой – эукариот, два селективных маркера (прокариотический и эукариотический), полилинкер, в состав которого встраивается чужеродный ген, эукариотический промотор и сайт терминации-полиаденилирования. В качестве регуляторных последовательностей эукариотических генов (промоторы, сайт терминации-полиаденилирования) обычно применяют таковые млекопитающих или вирусов животных. При этом предпочтительнее используются сильные промоторы и эффективные сигналы полиаденилирования. В качестве селективного прокариотического маркера часто используются гены устойчивости к антибиотикам. В качестве эукариотических селективных маркеров могут использоваться различные гены, например, гены неомицинфосфотрансферазы (НФТ), глутаминсинтетазы (ГС), дигидрофолатредуктазы (ДГФР) и др. НФТ способна фосфорилировать токсичное вещество генетицин, которое в результате этой процедуры теряет свою токсичность. В связи с этим клетки, продуцирующие НФТ, способны расти в среде, содержащий генетицин, в то время как клетки, не синтезирующие этот фермент, гибнут в присутствии данного токсина. Эту особенность можно использовать для отбора клеток, содержащих рекомбинантный вектор с селективным геном НФТ, от клеток, не содержащих соответствующий вектор. 121 Прикладная молекулярная биология Другой селективный маркер ген ГС обуславливает устойчивость к токсическому действию метионинсульфоксимина. Используя способность клеток, содержащих этот маркерный ген в составе рекомбинантного вектора, выживать в среде с указанным токсином, можно их отделить от клеток, не содержащих рекомбинантную плазмиду. С помощью клеточных культур удалось получить разнообразные рекомбинантные белки. Синтезированы белки, состоящие из нескольких субъединиц. Для того чтобы клетки животных культур продуцировали белки, образованные двумя полипептидными цепями, необходимо в них ввести два вектора, которые содержали по одному гену каждой полипептидной цепи или один вектор, в составе которого представлены оба гена. Второй вариант предпочтительнее, потому что в этом случае легче достичь образования полипептидных цепей в одинаковых количествах. 122 Глава 7. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ Одной из важнейших особенностей растительной клетки является ее тотипотентность, благодаря которой из соматической клетки возможна регенерация фертильного растения. Поэтому, трансформировав одну отдельную клетку, можно из нее получить трансгенное растение, которое далее может размножаться и передавать трансген своим потомкам. Введение новых генов в геном растений осуществляют с различными целями: •для улучшения сельскохозяйственных или декоративных характеристик культурных растений; •для получения чужеродных белков или других важных веществ; •для научных исследований. Первое в мире трансгенное растение санбин было получено Д.Кемпом и Т.Холлом в 1983 г в результате переноса гена запасного белка бобовых (фазеолина) в геном подсолнечника. К настоящему моменту времени получены тысячи различных трансгенных растений. Некоторыми из них засеяны сотни миллионов гектаров. Для конструирования трансгенного растения нужно: •выделить или синтезировать ген; •разработать методы введения гена в клетки растения; •регенерировать из единичных клеток растение с измененным генотипом. Весьма сложной задачей является поиск генов, позволяющих придать растению какой-либо полезный признак. Например, устойчивость к гербицидам, насекомым, болезням и др. Обнаружив такие гены, необходимо получить их в достаточном количестве. Подробнее способы получения генов рассмотрены в теме «Получение генов». На следующем этапе необходимо ввести ген в растительную клетку. С этой целью широко применяются векторы, созданные на основе Ti-плазмиды Agrobackteria tumefaciens (см. тему «Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки растений»). Наиболее простым вариантом создания рекомбинантного вектора на основе Ti-плазмиды является 123 Прикладная молекулярная биология встраивание чужеродного гена в состав Т-ДНК. Обработка клетками Agrobackteria tumefaciens, содержащими такую рекомбинантную плазмиду, растительных клеток приведет к встраиванию в растительный геном Т-ДНК и вместе с ней чужеродного гена. Однако такие векторы имеют ряд недостатков. В составе Т-ДНК в клеточный геном интегрируют наряду с чужеродным геном и гены, ответственные за синтез фитогормонов. Последние затрудняют регенерацию зрелых растений из трансформированных клеток. Кроме того, Ti-плазмиды имеют значительные размеры, что вносит определенные неудобства при работе с ними. При создании более эффективных векторов на основе Ti-плазмиды из нее удаляют гены фитогормонов и другие несущественные последовательности ДНК. С целью придания способности таким векторам реплицироваться в клетках E.coli, в их состав вводится сайт инициации репликации E.coli. Также в состав вектора вводятся селективные маркеры, позволяющие отобрать клетки, содержащие вектор, и в пределах Т-ДНК полилинкер, необходимый для встраивания чужеродных генов (рис. 7.1). Такие векторы способны существовать как в клетках E. coli, так и в клетках Agrobackteria tumefaciens. Все операции по клонированию проводят в клетках E.coli, а затем вектор вводят в Agrobackteria tumefaciens. Рис. 7.1. Схема организации вектора на основе Ti-плазмиды 124 Глава 7. Генная инженерия растений Рассмотренные выше векторы на основе Ti-плазмиды не содержат vir-область, поэтому не способны самостоятельно обеспечивать транспорт и интеграцию ТДНК в растительный геном. Чтобы решить эту проблему, разработано два подхода. В первом случае рекомбинантный вектор вводят в клетки Agrobackteria tumefaciens, содержащие модифицированную неонкогенную Ti-плазмиду, в которой сохранена vir-область, но удалена часть ее Т-ДНК, в результате последняя (Т-ДНК) не может быть транспортирована и интегрирована в геном растения. Неонкогенная плазмида, обеспечивая синтез всех белков, необходимых для транспорта Т-ДНК, выступает в качестве помощника, способствуя интеграции Т-ДНК рекомбинантного вектора в геном растения. При использовании второго подхода после введение рекомбинантного вектора в клетки Agrobackteria tumefaciens, содержащие неонкогенную Ti-плазмиду, происходит гомологичная рекомбинация, в результате которой обе плазмиды объединяются. Вновь образованная плазмида несет чужеродный ген. В то же время она способна обеспечить транспорт и интеграцию Т-ДНК, содержащую чужеродный ген, в растительный геном. Перенос генов с использованием Agrobackteria tumefaciens эффективны в случае работы с двухдольными растениями. Что касается однодольных растений, то использование этих бактерий для их трансформации ограничено. В связи с этим применяются и другие методы переноса генов в растительные клетки. Наиболее широко используется метод биобаллистической трансформации. Также применяются векторы на основе вирусов, методы электропорации, микроинъекции, слияния липосом. Попав в клетку, чужеродная ДНК может интегрировать в растительный геном. Для идентификации и отбора трансформированных клеток необходимы маркерные гены. Их продуктами являются легко идентифицируемые белки. В трансформированных клетках в отличие от нетрансформированных будет присутствовать маркерный ген, а следовательно, и синтезироваться легко тестируемый белок. Учитывая эту особенность можно отличить трансформированные клетки от нетрансформированных. В качестве маркеров используются, как отмечалось ранее, гены люциферазы и GFP-белка. Могут для 125 Прикладная молекулярная биология этой цели применяться гены ферментов. Наличие ферментов легко выявить по их каталитической активности. Перед чужеродным геном должен располагаться промотор, узнаваемый растительной РНК-полимеразой. В генной инженерии растений применяются конститутивные (постоянно функционирующие в клетке) или регулируемые (функционирующие на определенных стадиях развития растения, или в определенных тканях, или под действием некоторых факторов) промоторы. С целью усиления экспрессии чужеродных генов в вектор могут быть интегрированы энхансер, а также последовательности ДНК, кодирующие участки иРНК, обеспечивающие более эффективную трансляцию. Чужеродные гены могут быть интегрированы в хлоропластную ДНК растений. С этой целью конструируется плазмидный вектор, содержащий чужеродный ген и селективный маркер, фланкированные нуклеотидными сегментами хлоропластной ДНК (рис. 7.2). Затем с использованием метода биобаллистической трансформации плазмидный вектор вводят в хлоропласты. Где посредством гомологичной рекомбинации между хлоропластной ДНК и сегментами хлоропластной ДНК плазмиды происходит интеграция чужеродного гена и селективного маркера в геном хлоропластов. Так чужеродный ген может быть включен в состав хлоропластной ДНК. Поскольку промоторы хлоропластных генов сходны с прокариотическими, но не с ядерными, перед чужеродным и маркерным генами необходимо поместить соответствующие нуклеотидные последовательности, обеспечивающие их транскрипцию. Рис. 7.2. Схема организации плазмидного вектора, используемого для введения чужеродного гена в хлоропластную ДНК. ЧГ – чужеродный ген, СМ – селективный маркер, схДНК – сегменты хлоропластной ДНК 126 Глава 7. Генная инженерия растений Практическое применение трансгенных растений Если первое трансгенное растение было получено в 1983, то в продаже первые трансгенные продукты появились в 1994 г. Ими были гербицид-устойчивая соя и томаты Flavr Savr с замедленным созреванием. В настоящее время на сельскохозяйственных полях выращиваются генетически модифицированные кукуруза, соя, томаты, хлопчатник, картофель, табак, рапс, кабачки, редис и др. Общая площадь, занимаемая трансгенными растениями, составляет более 100 млн. га. С каждым годом происходит увеличение площадей, засеваемых генетически модифицированными растениями. Распределение выращиваемых культур следующее: соя – около 52 %, кукуруза – около 30 %, хлопок – около 13 %, рапс – около 5 %. Одни трансгенные растения содержат дополнительные гены, улучающие их качества (гены устойчивости к гербицидам, вредителям, болезням, неблагоприятным условиям окружающей среды и др.). Другие выступают в качестве «биореакторов», производящих вещества, используемые в различных отраслях народного хозяйства. К таким веществам могут относиться белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, жирные кислоты, модифицированные полисахариды, вакцины, антитела, интерфероны и др. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам Гербициды в сельском хозяйстве применяются для борьбы с сорняками. Следует отметить, что гербициды способны подавлять рост не только сорных растений, но и культурных. Создание растений, устойчивых к гербицидам, позволяет решить проблему борьбы с сорняками. При обработке гербицидами посевов культур, устойчивых к ним (гербицидам), сорняки будут избирательно подавляться, а культурные растения будут нормально развиваться. 127 Прикладная молекулярная биология Устойчивость к гербицидам можно достичь за счет: • снижения проникновения гербицида в растение; •инактивации гербицида в растении; •изменения структуры белка (или фермента), на который гербицид оказывает повреждающее действие. В результате такого изменения белок (или фермент) оказывается полностью или в значительной степени не чувствительным к гербициду; •усиленного синтеза белка (или фермента), чувствительного к гербициду. В этом случае повышенное содержание белка (или фермента) нивелирует действие гербицида. При создании растений, устойчивых к определенному гербициду, необходимо: •идентифицировать мишень (белок или фермент), на которую воздействует гербицид; •выявить организмы, устойчивые к гербициду; •выделить ген из организмов, не чувствительных к гербициду, продукт которого определяет устойчивость к гербициду; •создать вектор, содержащий ген, определяющий устойчивость к гербициду; •ввести с помощью вектора в геном растения ген, определяющий устойчивость к гербициду. В сельском хозяйстве нашел широкое применение гербицид глифосат. Он ингибирует фермент 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (ЕПШФ), и тем самым подавляет синтез ароматических аминокислот. Гербицид воздействует только на растения, грибы и бакте-рии. Кроме того, он быстро разрушается после попадания в почву. В связи с этим считается, он не опасен для человека. Выявленные случаи устойчивости к глифосату связаны либо с повышением уровня синтеза ЕПШФ, либо с наличием в клетках растений мутантного фермента, нечувствительного к гербициду. Для создания трансгенных растений, устойчивых к этому гербициду, используют мутантные гены ЕПШФ. С этой целью из организмов, устойчивых к глифосфату, 128 Глава 7. Генная инженерия растений выделяют ген, который используют для создания рекомбинантного вектора. С помощью рекомбинантного вектора в геном растения встраивают мутантный ген ЕПШФ, который и определяет у трансгенных растений устойчивость к глифосату. Трансгенные растения, устойчивые к глифосату, были получены также в результате сверхпродукции в их клетках фермента ЕПШФ или введения гена глифосфатокси доредуктазы, разрушающей гербицид. Примером еще одного гербицида, устойчивость к которому достигается в результате его деградации, является бромоксинил. Бромоксинил подавляет фотосинтез. Устойчивость трансгенных растений к этому гербициду может быть достигнута в результате интеграции в их геном гена нитрилазы. Нитрилаза осуществляет разрушение бромоксинила. Трансгенные растения, устойчивые к насекомым-вредителям Бактерия Bacillus thuringiensis продуцирует протоксин (Bt-протеин), являющийся токсичным белком для насекомых, в то же время для млекопитающих он безопасен. Попав в пищеварительный тракт насекомого, молекула протоксина подвергается модификации (от нее отщепляется часть полипептидной цепи) и превращается в токсин. Токсин образует поры в клетках кишечника насекомых, что приводит к их лизису. Насекомое при этом погибает. В природе найдены различные штаммы В. thuringiensis. Интересно, что они синтезируют разные токсины, каждый из которых действует только на определенный вид насекомых. Гены Bt-протеина были выделены из различных штаммов, в некоторых случаях они были существенно модифицированы, и использованы для создания трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям. Наиболее широко в сельском хозяйстве используются устойчивые к насекомым кукуруза и соя. При создании трансгенной кукурузы был использован промотор гена фосфоенол129 Прикладная молекулярная биология пируваткарбоксилазы, обеспечивающий экспрессию генов Bt-протеина только в зеленых тканях растения. Получен также устойчивый к колорадскому жуку картофель. При создании трансгенного картофеля перед геном Bt-протеина поместили фоточувствительный промотор малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы, обеспечивающий синтез Bt-протеина на свету в 100 более эффективно, чем в темноте. В связи с этим в клубнях картофеля содержание Bt-протеина приблизительно в 100 раз меньше, чем в листьях. Для получения трансгенных растений, устойчивых к насекомым-вредителям, могут быть использованы гены ингибиторов амилаз и протеаз. Насекомые, поедающие трансгенные растения, продуцирующие такие ингибиторы, не способны переваривать пищу, потому что ингибиторы будут подавлять пищеварительные ферменты и тем самым препятствовать гидролизу крахмала и растительных белков. Трансгенные растения, устойчивые к вирусам Вирусы, также как насекомые и сорняки, существенно снижают урожайность культурных растений. В связи с этим создание трансгенных растений, устойчивых к вирусам, позволяет сохранить значительную часть урожая. Устойчивость растениям к вирусам можно придать за счет введения в их геном генов, кодирующих белки оболочки вируса или других вирусных генов, а также антисмысловых последовательностей генома вирусов. Трансгенное растение, продуцирующие белок оболочки какого-либо вируса, оказывается защищенным от этого вируса. Способность вируса инфицировать такие растения часто значительно ослаблена. Механизм защиты точно не установлен. Посредством введения генов белков оболочки вирусов получены многочисленные трансгенные растения, устойчивые к вирусам. Некоторые из них нашли промышленное применение. 130 Глава 7. Генная инженерия растений Для получения трансгенных растений, устойчивых к вирусам, могут быть использованы антисмысловые РНК. Антисмысловая РНК комплементарна иРНК и способна с ней образовывать дуплекс, предотвращая тем самым трансляцию иРНК. В присутствии антисмысловой РНК синтез белка, закодированного в иРНК, подавляется. Если ввести в геном растений гены антисмысловых РНК, комплементарных к вирусным иРНК, то можно ожидать, что синтез вирусных белков ослабнет и, соответственно, развитие вирусов в клетках растений будет затруднено. Используя этот подход, можно защитить растения от вирусов. Устойчивость растений к вирусам может быть также достигнута за счет введения в их геном генов противовирусных белков, синтезируемых растениями. Так, в клеточной стенке фитолакки американской присутствуют три противовирусных белка. Гены этих белков можно использовать для получения устойчивых к вирусам растений. Трансгенные растения, устойчивые к патогенным грибам и бактериям Грибковые и бактериальные заболевания являются причиной существенных потерь урожая. С помощью методов генной инженерии возможно создание трансгенных растений, устойчивых к патогенным грибам и бактериям. После проникновения патогенных организмов в клетки растений в них (растениях) образуются специфические белки, воздействующие на патогены. К таким белкам относятся хитиназа (разрушает хитин – основной компонент грибов), -1,3-глюканаза (разрушает клеточную стенку грибов), тауматин (небольшой, сладкий на вкус белок, слаще сахарозы в 200 000 раз), ингибиторы протеаз. Гены этих белков можно использовать для создания трансгенных растений. Так, введение генов хитиназы и -1,3-глюканазы в геном растений придает последним устойчивость к патогенным грибам. 131 Прикладная молекулярная биология Большой ущерб приносит урожаю картофеля бактерия Erwinia carotovora. С целью защиты картофеля в его геном был введен ген лизоцима (разрушает клеточную оболочку бактерий) бактериофага Т4. К гену был пришит промотор вируса мозаики цветной капусты, сигналы терминации и полиаденилирования и сигнальный пептид -амилазы ячменя. Промотор обеспечивал транскрипцию, а сигнальный пептид – секрецию лизоцима в межклеточное пространство, в которое проникает патогенная бактерия. Трансгенный картофель оказался устойчивым к Erwinia carotovora. Такой принцип создания трансгенных растений можно распространить и на другие объекты. Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям В процессе жизненного цикла растения подвергаются воздействию различных неблагоприятных факторов окружающей среды: высоких и низких температур, засухи, засоления почв и т.д. Некоторые из растений приспособились преодолевать их негативное воздействие, другие – нет. Неблагоприятные факторы могут существенно снизить урожайность сельскохозяйственных культур. С использованием методов генной инженерии возможно повысить устойчивость у растений к стрессовым условиям. Можно повысить устойчивость растений к пониженным температурам. Бактерии Pseudomonas syringae сосуществуют с растениями и способствуют повреждению растений заморозками. В клетках этого микроорганизма синтезируется белок, молекулы которого находятся во внешней мембране и являются центром кристаллизации льда. Формирование кристаллов льда является фактором, определяющим повреждение тканей растений. Известны мутанты этих бактерий, потерявшие способность синтезировать этот белок. Растения с такой микрофлорой оказались более устойчивыми к заморозкам. Важно получить растения, устойчивые к засухам, поскольку они могут все усилия производителей свести 132 Глава 7. Генная инженерия растений на нет. Одним из веществ, способных защитить растения от засухи или при высокой засоленности, является бетаин. Он способствует поглощению и удерживанию воды растением. В одних растениях это вещество синтезируется в ощутимых количествах, в тоже время некоторые важные культурные растения (картофель, томаты, рис) не способны его накапливать. Придать растениям устойчивость к засухе и высокой засоленности почв можно введением в их геном генов ферментов, синтезирующих бетаин. Последний синтезируется из холина в две стадии. Первую стадию у растений катализирует фермент холинмонооксигеназа, вторую – бетаинальдегиддегидрогеназа. У E.coli обе стадии синтеза бетаина катализирует один фермент холиндегидрогеназа. Очевидно, что при создании трансгенных растений предпочтительнее использовать ген холиндегидрогеназы. Растения, в геном которых был перенесен ген холиндегидрогеназы, были более устойчивы к высоким концентрациям солей, чем нетрансгенные растения. Трансгенные растения с измененными пищевыми качествами Используя ДНК-технологии, можно повлиять на пищевую ценность растений: изменить аминокислотный состав пищевых белков, получить плоды с измененным жирнокислотным составом, создать сорта картофеля с улучшенным качеством крахмала, придать определенный вкус плодам. Растения являются продуцентами наиболее дешевых белков. Однако их пищевая ценность невысока, поскольку они не содержат все незаменимые аминокислоты. Для получения полноценных растительных белков необходимо изменить нуклеотидную последовательность их генов так, чтобы закодированные в них белки содержали все незаменимые аминокислоты. Полноценные растительные белки можно получить и другим способом. В этом случае в геном растения следует ввести гены других запасных белков. В результате 133 Прикладная молекулярная биология в растении будут синтезироваться свои собственные и трансгенные запасные белки, которые в совокупности будут содержать все незаменимые аминокислоты. Качество растительного масла зависит от содержания в его составе различных жирных кислот. При создании трансгенной сои в ее геном был введен ген десатуразы. В результате такого переноса ее собственный ген перестал экспрессироваться. Десатураза катализирует превращение одинарной связи между атомами углерода в двойную. Подавление собственного гена десатуразы привело к тому, что содержание полиненасыщенных жирных (линолевой и ленноленовой) кислот в соевом масле снизилось, а содержание мононенасыщенной кислоты (олеиновой) возросло. Потребительские свойства соевого масла с таким жирнокислотным составом оказались выше, чем масла нетрансгенных сортов сои. Получен трансгенный рапс с измененным составом растительного масла, содержащим до 45 % жирной кислоты (С12) лаурата. Это жирная кислота широко используется для производства стиральных порошков, шампуней, косметики. В геном трансгенного рапса был интегрирован ген тиоэстеразы из растения Umbellularia califomica. Выбор на это растение пал, потому что содержание лаурата в масле его семян достигает 70 %. Введение гена тиоэстеразы в геном рапса привело к увеличению содержания лаурата в составе и его масла. С помощью трансгенных растений возможно получение крахмала с заданными свойствами. Крахмал состоит из двух компонентов амиилопектина и амилозы. Раствор амилопектина менее вязкий и более прозрачный, чем раствор амилозы, и его предпочтительнее использовать в пищевой промышленности. В связи с этим перспективно создание крахмалнакапливающих культур, синтезирующих преимущественно амилопектин. Созревшие фрукты и овощи имеют более короткий срок хранения, чем несозревшие. С целью продления продолжительности хранения томатов были созданы трансгенные растения с замедленным сроком созревания. 134 Глава 7. Генная инженерия растений Таким томатам был введен ген, кодирующий антисмысловую РНК полигалактуроназы, фермента, разрушающего пектин и способствующего созреванию томатов. Трансген подавлял синтез полигалактуроназы за счет образования дуплекса между антисмысловой РНК и иРНК фермента. Ацетилен, активируя гены, ответственные за созревание, ускоряет этот процесс. Блокируя синтез ацетилена введением в томаты генов антисмысловых РНК ферментов, отвечающих за его (ацетилена) продукцию, были получены трансгенные растения с замедленным сроком созревания. Такие томаты были также получены в результате введения в их геном генов, ответственных за деградацию предшественника ацетилена. Принципиальные подходы, используемые для создания трансгенных томатов с замедленным сроком созревания, можно распространить и на другие растения. Методами генной инженерии можно улучшить внешний вид плодов, а также их вкус. Например, за счет введения генов сладких белков монеллина и тауматина. Земляника с геном тауматина оказалась более устойчива к болезням, чем нетрансгенная. С помощью ДНК-технологий можно ввести гены, ответственные за азотфиксацию, в геном культурных растений и добиться их экспрессии. Тем самым решить проблему нехватки азотных удобрений. Манипуляции с ДНК могут привести к повышению эффективности фотосинтеза, и, следовательно, к увеличению биоорганической продукции. Получены трансгенные растения, плоды которых являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Для партенокарпических плодов характерно либо полное отсутствие семян, либо наличие их незначительного количества. Созданы трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Например, петунии с разноцветными цветками или гвоздики с генами из других цветов, отвечающих за голубую и фиолетовую окраски. Получен генетически модифицированный рис, способный без ущерба провести под водой до двух недель. 135 Прикладная молекулярная биология Трансгенные растения «биореакторы» Перспективно использование растений в качестве «биореакторов» для синтеза каких-либо белков или других веществ, поскольку они (растения) быстро растут, и их выращивание не требует высококвалифицированного труда. В настоящее время получены трансгенные растения, синтезирующие чужеродные белки, использование которых возможно в различных областях народного хозяйства. Удалось достичь продукции в растениях человеческого β-интерферона. С помощью растений можно получать бактериальные антигены и использовать их в качестве вакцин. Создан трансгенный картофель, продуцирующий субъединицу β-токсина холеры, которую возможно использовать в качестве вакцины от холеры. В растениях получена продукция антител, специфичных для Streptococcus mutans – бактерий, вызывающих зубной кариес. Не исключено их использование в зубных пастах. В геном растений Arabidopsis thaliana и Brassica napus был встроен химерный ген, состоящего из части гена запасного белка арабидопсиса и кодирующей части гена нейропептида – энкефалина. В белковом продукте этого химерного гена два структурных домена были связаны последовательностью, узнаваемой трипсином. Действием этого протеолитического фермента на гибридный белок можно из него вычленить энкефалин. Российские ученые создали трансгенную морковь, способную стимулировать иммунитет. Морковь продуцирует иммуномодулирующие белки человека интерлейкины. 136 Глава 8. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ ЖИВОТНЫХ Генная инженерия животных позволяет преодолеть межвидовые барьеры. С помощью ДНК технологий можно животным переносить гены не только других видов животных, но и гены растений и прокариот. Если чужеродный ген интегрирован в геном животного, то такой ген называется трансгеном, а животное, содержащее в геноме трансген, – трансгенным. Белок, кодируемый трансгеном, носит название трансгенный белок. Трансгенных животных создают с целью: •изучения функций генов и особенностей их экспрессии; •получения животных с улучшенными характеристиками; •получения моделей для изучения генетических заболеваний и разработки способа их лечения; •получения трансгенных белков. При получении трансгенных животных для переноса генов в их геном используют следующие подходы: •микроиньекция чужеродной ДНК в пронуклеус зиготы; •введение чужеродной ДНК с помощью ретровирусных векторов в клетки эмбриона на его ранних стадиях развития перед имплантацией в самку-реципиента; •введение генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в эмбрион на его ранних стадиях развития перед имплантацией в самку-реципиента. Рассмотрим последовательность действий при создании трансгенных животных с использованием метода микроиньекции ДНК в пронуклеус зиготы (рис. 8.1). В начале из яйцевода самки извлекают зиготы. Затем под объективом микроскопа в микронуклеус зиготы с помощью микропипетки вводится генетическая конструкция, содержащая чужеродный ген. Мужской пронуклеус значительно крупнее женского, поэтому в него легче ввести препарат ДНК. В качестве генетической конструкции для доставки генов может использоваться плазмидный вектор, содержащий трансген и промотор, способный обеспечивать экспрессию чужеродного гена в клетках млекопитающих. В пронуклеус вводится до 100 и более копий гена. На следую137 Прикладная молекулярная биология щем этапе зиготу трансплантируют ложнобеременной самке другой генетической линии. В случае нормального течения беременности суррогатные матери рождают детенышей, развившихся из реконструированных зигот. Для подтверждения интеграции чужеродного гена в геном новорожденных животных, из них извлекают биологические образцы для ДНК-диагностики на наличие трансгена в их геноме. При использовании рассмотренного подхода, выход трансгенных животных, как правило, не превышает 5 % от исходного числа зигот. При этом не у всех животных трансгены экспрессируются с образованием функционально активного продукта. На заключительном этапе трансгенные животные с экспрессирующимся чужеродным геном используются для получения трансгенного потомства. Рис. 8.1. Схема получения трансгенных животных методом микроинъекций чужеродной ДНК в пронуклеус зиготы 138 Глава 8. Генная инженерия животных Метод введения чужеродной ДНК с помощью ретровирусных векторов в клетки эмбриона характеризуется высокой эффективностью. Однако размер встраиваемой чужеродной ДНК ограничен и составляет до 8 т.п.н. При использовании этого метода последовательность этапов получения трансгенных животных следующая. Эмбрион, как правило, на стадии 8 клеток инфицируют рекомбинантным ретровирусом, содержащим трансген. Ретровирусный вектор способен не только доставить чужеродные ген во все клетки эмбриона, но и обеспечить его встраивание в ДНК. После инфицирования эмбрион имплантируют суррогатной матери. При удачном стечении обстоятельств плод развивается и рождается трансгенное животное, которое затем используют для получения трансгенного потомства (рис. 8.2). Рис. 8.2. Схема получения трансгенных животных с использованием метода введения чужеродной ДНК с помощью ретровирусных векторов в клетки эмбриона 139 Прикладная молекулярная биология Метод получения трансгенных животных с использованием ЭСК нашел широкое применение. ЭСК являются полипотентными, так как могут дифференцироваться в клетки всех зародышевых листков. Если их (ЭСК) ввести в полость бластоцисты, то они могут дать начало любым органам и тканям химерных животных. ЭСК получены из различных животных: из мышей, золотистого хомячка, свиньи, овцы, коровы, обезьяны, человека и др. Рассмотрим этапы получения трансгенных животных с использованием ЭСК (рис. 8.3): •получение ЭСК; •введение в ЭСК генетической конструкции, содержащей трансген. Трансформацию ЭСК осуществляют с помощью электропорации или микроинъекций ДНК в ядро клетки; •получение от животных-доноров бластоцист для микроинъекции в них трансформированных ЭСК; •конструирование химерных эмбрионов, посредством микроинъекции трансформированных ЭСК в полость бластоцист; •имплантация химерных эмбрионов суррогатной матери; •получение химерного потомства от суррогатной матери; •генетический анализ родившихся животных на наличие в их геноме трансгена, выявление трансгенных животных, в ДНК половых клеток которых присутствует трансген; •получение гомозиготных трансгенных потомков в результате скрещивания химерных животных, в половых клетках которых выявлен трансген. 140 Глава 8. Генная инженерия животных Рис. 8.3. Схема получения трансгенных животных с использованием ЭСК ЭСК можно направлено модифицировать с помощью методов генной инженерии. Созданы векторы, которые способны обеспечивать встраивание трансгена в строго определенные участки генома (сайты-мишени) ЭСК. Такие сайт-мишени находятся в участке ДНК, которые не кодируют белков, необходимых для жизнеобеспечения ЭСК. В связи с этим встраивание трансгена в эти области не влияет на функционирование ЭСК. В состав таких векторов входят: •трансген; •два блока нуклеотидных последовательностей (НВ1 141 Прикладная молекулярная биология и НВ2), гомологичных участкам сайта-мишени. Эти блоки обеспечивают интеграцию трансгена в хромосому, за счет гомологичной рекомбинации; •ген Neor, обуславливающий устойчивость к соединению G-418; •два разных гена тимидинкиназы вируса простого герпеса типов 1 и 2 HSV-tk1 и HSV-tk2. Тимидинкиназа способна катализировать превращение ганцикловира в токсический для ЭСК продукт. Следовательно, добавление ганцикловира в культуру клеток, в которой синтезируется тимидинкиназа, приведет к гибели клеток. Трансген и ген Neor расположены между блоками НВ1 и НВ2, а гены HSV-tk1 и HSV-tk2 по обеим сторонам этой конструкции (рис. 8.4). Рис. 8.4. Схема интеграции трансгена в геном ЭСК. А – интеграция посредством гомологичной рекомбинации фрагмента вектора непосредственно в сайтмишень, Б – неспецифическая интеграция вектора в хромосому. ТГ – трансген 142 Глава 8. Генная инженерия животных После попадания вектора в ядро ЭСК возможна интеграция посредством гомологичной рекомбинации (рис. 8.4А) фрагмента вектора, расположенного между НВ1 и НВ2 и содержащего трансген и ген Neor, непосредственно в сайт-мишень. В этом случае гены HSV-tk1 и HSV-tk2 не будут интегрированы в хромосому. Возможна также и неспецифическая интеграция вектора в хромосому, приводящая к встраиванию в нее трансгена, гена Neor и генов тимидинкиназы (рис. 8.4Б). Следует отметить, что в некоторых ЭСК векторная ДНК вообще не интегрирует в хромосому. Следовательно, в их геноме будут отсутствовать и трансген, и гены Neor, HSV-tk1, HSV-tk2. С помощью G-418 и ганцикловира можно отобрать ЭСК, в которых произошла интеграция трансгена в сайт-мишень за счет гомологичной рекомбинации. Такие клетки растут в присутствии обоих этих веществ. Ген Neor обеспечивает их устойчивость к G-418, а отсутствие генов тимидинкиназы определяет устойчивость к ганцикловиру, поскольку последний в отсутствии тимидинкиназы не превращается в токсическое вещество. В то же время ЭСК со встроенным вектором за счет неспецифической интеграции при выращивании в среде с G-418 и ганцикловиром погибнут, поскольку в них присутствует ген тимидинкиназы и, соответственно, синтезируется тимидинкиназа, превращающая субстрат (ганцикловир) в токсическое соединение. ЭСК, не приобретшие ген Neor, погибнут при выращивании в присутствии G-418 из-за отсутствия устойчивости к этому веществу. Используя рассмотренный подход, можно получить ЭСК с сайтспецифической вставкой. В качестве сайта-мишени может выступать и функционально активный ген. И тогда встраивание в него какой-либо нуклеотидной последовательности приведет к его инактивации. Таким образом, можно направленно осуществлять подавление («нокаут») гена. Используя такой прием, можно изучать функции тех или иных генов. Созданы сотни линий мышей с «нокаутированными» генами, используемые в качестве моделей для изучения генетических болезней человека. 143 Прикладная молекулярная биология Перспективы использования трансгенных животных Несмотря на то, что трансгенные животные не имеют столь широкого практического применения как трансгенные растения, перспективы их использования многообразны. Трансгенные животные – биореакторы В качестве лекарственных препаратов в медицине широко используются белки человека. Эти белки могут быть получены из тканей человека. Очевидно, что при таком способе их получения возникают проблемы. Можно также получать белки с помощью генетически модифицированных бактерий. Однако часто такие белки не идентичны белкам, синтезируемым в клетках человека. Эти отличия могут определяться тем, что в клетках прокариот отсутствуют системы, обеспечивающие посттрансляционные модификации белков. Кроме того выделение и очистка белков, синтезированных в бактериальных клетках, является трудоемкой и дорогостоящей процедурой. С помощью методов генной инженерии можно создавать трансгенных животных, синтезирующих белки человека. Более того можно добиться выделения чужеродных белков с молоком животных. Это обстоятельство позволяет значительно упростить их получение. Для обеспечения экспрессии трансгена в молочной железе и выделение белка с молоком перед трансгеном следует поместить промотор гена одного из белков, секретируемых с молоком (например, промотор гена казеина). Наиболее перспективно с целью получения чужеродных белков создание трансгенных коз или коров, поскольку они дают достаточно много молока. Так, корова может ежегодно продуцировать до 10 000 и более литров молока. В течение одного года от одной коровы можно получить несколько десятков килограмм рекомбинантного белка. В настоящее время получены трансгенные животные, синтезирующие белки человека: антитрипсин, интерферон, 144 Глава 8. Генная инженерия животных фактор свертываемости крови IX, сывороточный аль-бумин, трофобластин, интерлейкин-2, некоторые иммуноглобулины, тканевой активатор плазминогена, урокиназа и многие другие. Использование всего нескольких трансгенных коров позволит решить проблему получения некоторых белков человека. Так, заболевание гемофилия связано с нарушением синтеза некоторых факторов свертываемости крови. Мировая потребность в факторе свертываемости крови VIII в год составляет около 7 кг. Эту потребность может обеспечить одна трансгенная корова. Годовая потребность в факторе свертываемости крови IX составляет около 85 кг. Для ее удовлетворения достаточно нескольких коров. Потребность в фибриногене (около 3 т в год) может обеспечить несколько сот трансгенных коров. Созданы трансгенные коровы, в молоке которых образуется человеческий белок лактоферрин. Этот белок обладает антивирусной, антибактериальной, антипаразитарной, различными каталитическими активностями, радиопротективными свойствами и противораковым, антиаллергическим, иммуномодулирующим действиями. Перспективно использование лактоферрина для профилактики гастроэнтерологических заболеваний у людей с низкой иммунорезистентностью: больных СПИДом, недоношенных младенцев, больных, прошедших радиотерапию. С помощью трансгенных коров можно получать содержащийся в молоке человеческий альбумин. Альбумин используется в медицине для поддержания осмотического давления крови. Трансгенные животные с улучшенными характеристиками Непереносимость молока у некоторых людей связана с нарушением синтеза фермента лактазы, расщепляющего молочный сахар лактозу на моносахариды глюкозу и галактозу. У таких людей после приема молока наблюдается 145 Прикладная молекулярная биология желудочное расстройство, сопровождающееся неприятными последствиями. У них поступающая с молоком лактоза не расщепляется, поскольку отсутствует гидролизующий ее фермент лактаза. В связи с этим микроорганизмы кишечника начинают ее использовать в качестве источника энергии и бурно расти, что сопровождается соответствующими симптомами. Если же в геном коровы ввести ген лактазы и заставить его экспрессироваться в молочной железе, то присутствующая в молоке лактоза будет расщеплена до глюкозы и галактозы. Такое молоко без всяких последствий смогут употреблять люди, у которых нарушен синтез лактазы. Перспективно создание трансгенных коров, продуцирующих молоко, по своему составу приближенное к молоку человека. С этой целью необходимо выключить некоторые гены коров и ввести несколько генов человека. В составе человеческого грудного молока содержится антибактериальный фермент лизоцим, в то время как в молоке животных его содержание значительно ниже. Так, в молоке козы лизоцима приблизительно в 3 тысячи раз меньше, чем в человеческом грудном молоке. Посредством введения гена лизоцима получены трансгенные козы, продуцирующие молоко, содержание лизоцима в котором близко к таковому в грудном человеческом молоке. Сыр является важнейшим продуктом питания. Его получают из молока. Количество получаемого сыра пропорционально содержанию казеина в молоке. Содержание казеина в молоке можно увеличить, увеличив число копий гена этого белка, и тем самым усилив его биосинтез. В начале 80-х годов ХХ века Р.Д.Пальмитером и сотрудниками были получены трансгенные мыши, в геном которых был введен ген гормона роста крысы с металлотиониновым промотором. Последний является регулируемым промотором и обеспечивает экспрессию генов при повышенной концентрации тяжелых металлов. Трансгенным мышатам давали корм с высоким содержанием цинка. В результате экспрессия гена гормона роста 146 Глава 8. Генная инженерия животных резко возрастала и, соответственно, возрастала концентрация гормона роста в крови. В связи с этим трансгенные мышата росли значительно быстрее, чем контрольные, у которых повышенная экспрессия гормона роста отсутствовала. После этих экспериментов были созданы трансгенные сельскохозяйственные животные с повышенной продукцией гормона роста. Однако они были обычных размеров, у некоторых из них наблюдались нарушения в росте, строении костей. Отсутствие увеличения размера у них очевидно связано с тем, что потенциал их роста выбран многовековой селекцией. В то же время были созданы быстрорастущие трансгенные лососи. Получена трансгенная мышь, способная выполнять повышенные физические нагрузки. Ей был введен ген PGC1B (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 beta), кодирующий белок (PGC1-beta). Этот белок активирует транскрипционные факторы, отвечающие за регуляцию жирового и углеводного обменов и состав мышечных волокон. Увеличение экспрессии гена PGC1B повлияло на физические возможности мышей. Трансгенные мыши способны пробегать более длинные дистанции и с более высокой скоростью, чем контрольные мыши. Выведены трансгенные комары, невосприимчивые к возбудителю малярии. Они оказались более жизнеспособными, чем обычные насекомые. Поэтому трансгенные комары могут постепенно вытеснить обычных комаров и помочь в борьбе с малярией. Кроме того комарам введен ген, придающий зеленый блеск глазам. Так можно отличить трансгенных комаров от нетрансгенных. В мире существует дефицит органов для пересадки их человеку. Перспективно создание трансгенных животных, являющихся донорами органов. Наиболее близки человеку по размеру, строению, биохимическим показателям органы свиньи. Очевидно, что пересаженные органы от обычной свиньи будут эффективно отторгаться иммунной системой человека, произойдет быстрая потеря органа. В связи с этим необходимо сконструировать трансгенную свинью, органы которой не отторгались бы иммунной системой человека. 147 Прикладная молекулярная биология Недостаток аминокислот цистеина и метионина в организме овцы задерживает рост шерсти. В связи с этим введение в геном овцы дополнительных генов ферментов, ответственных за синтез указанных аминокислот, возможно, повысит качество шерсти. Созданы трансгенные животные, которые светятся в темноте. Свиньям и цыплятам был введен ген медузы, продукт которого и определял их способность светиться в темноте. Трансгенные животные, устойчивые к заболеваниям Существуют породы сельскохозяйственных животных, устойчивых к определенным заболеваниям. Идентификация генов, определяющих такую устойчивость, а затем их использование в качестве трансгенов при создании генетически модифицированных животных позволит получить линии животных, не восприимчивые к заболеваниям. Такой подход окажется приемлемым только в том случае, когда устойчивость определяется одним или небольшим числом генов. Другой подход, позволяющий получить устойчивых к заболеваниям животных, заключается в интеграции в их геном генов иммуноглобулинов, специфичных к тем или иным возбудителям инфекционных заболеваний. Экспрессия этих генов защитит животных от болезнетворных микроорганизмов. К защитным белкам относятся интерфероны, они защищают организм от вирусных заболеваний. В связи с этим можно ожидать, что трансгенные животные с геном интерферона будут менее подвержены вирусным инфекциям, чем нетрансгенные. Еще одно направление, которое может повысить устойчивость животных к вирусным заболеваниям, заключается во введении в их геном генов, кодирующих антисмысловую РНК. Синтез последних приведет 148 Глава 8. Генная инженерия животных к блокированию иРНК возбудителя заболевания соответственно, понизит их жизнеспособность. и, Создание животных – генетических моделей заболеваний человека С целью изучения течения генетических болезней и разработки способов их лечения целесообразно создание животных, представляющих собой модели генетических заболеваний. Генетические болезни бывают моногенными и полигенными. Очевидно, что в настоящее время о создании трансгенных животных, моделирующих полигенные наследственные болезни, говорить еще преждевременно. Могут быть созданы два типа трансгенных животных, моделирующих моногенные генетические болезни: •животные с функционирующим «больным» трансгеном (животным вводится человеческий ген, ответственный за заболевание); •животные, у которых выключен ген, аналогичный тому, который вызывает данное заболевание у человека. Созданы модели многих наследственных болезней человека, а именно: болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, нейродегенеративные нарушения, сердечнососудистые заболевания и др. Несмотря на то, что результаты, полученные на модельных животных, нельзя однозначно экстраполировать на человека, тем не менее, полученные знания позволят выявить фундаментальные причины развития болезни и разработать подходы к их лечению. 149 Глава 9. ГЕНОТЕРАПИЯ К настоящему времени выявлены тысячи наследственных заболеваний. Для многих из них идентифицированы гены, определяющие данное заболевание. Разработаны методы их диагностики. Приблизительно каждый двадцатый ребенок рождается с наследственным заболеванием. При этом каждый сотый ребенок получает в наследство серьезный генетический дефект. Несмотря на то, что о наследственных заболеваниях известно много, достаточно эффективных методов их лечения с помощью традиционных методов медицины не найдено. Проблему таких заболеваний можно решить с помощью генотерапии. Под генотерапией понимают совокупность генноинженерных подходов, обеспечивающих внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека с целью лечения заболеваний. Задачами генотерапии являются исправление дефектов в структуре ДНК или придания клеткам новых характеристик. В современных условиях с помощью генотерапии удалось достигнуть успеха только при лечении моногенных наследственных заболеваний. Лечение же полигенных заболеваний и заболеваний, возникших в результате хромосомных аберраций (изменение числа и структуры хромосом), станет возможным при дальнейшем развитии науки. Лечебный эффект при лечении моногенных наследственных заболеваний может быть достигнут за счет следующих подходов: •введения неповрежденной копии гена; •подавления экспрессии или разрушения дефектного гена; •замены дефектного гена неповрежденным. Этого можно достичь в результате гомологичной рекомбинации «лечебного» и «больного» генов, с помощью которой поврежденный ген будет заменен на нормальный; •введения несвойственных организму генов, обуславливающих лечебный эффект. Так можно будет лечить онкологические, инфекционные, аутоиммунные заболевания. 150 Глава 9. Генотерапия В современных условиях реализован в основном только первый подход: лечение наследственного заболевания посредством введения в клетки неповрежденной копии гена. Для достижения лечебного эффекта с помощью такого подхода нужно: •идентифицировать ген, ответственный за заболевание; •создать генетическую конструкцию, содержащую неповрежденный ген и участки ДНК, обеспечивающие его экспрессию; •разработать методы введения генетической конструкции в клетки больного. Очевидно, прежде чем приступить к разработке метода лечения наследственного заболевания посредством генотерапии, необходимо идентифицировать ген, с нарушением организации которого связана патология. Для многих наиболее распространенных заболеваний такие гены уже установлены (таблица 9.1). Таблица 9.1 Наследственные заболевания и гены, нарушение в организации которых приводит к патологии Ген, с нарушением организации которого связано заболевание Симптомы заболевания Муковисцидоз Ген трансмембранного регулятора (CFTR) Нарушения функционирования органов дыхания и желудочнокишечного тракта Болезнь Гоше Ген глюкоцереброзидазы Накопление глюкоцереброзидов в макрофагах. Порожение печени, селезенки, костей Эмфизема Ген 1-антитрипсина Дефицит ингибитора сывороточных протеаз. Поражение легких, цирроз печени Фенилкетонурия Ген фенилаланингидроксилазы Нарушение метаболизма фенилаланина, нарушение умственного развития и различные психические расстройства Заболевание 151 Прикладная молекулярная биология Заболевание Ген, с нарушением организации которого связано заболевание Симптомы заболевания Несиндромальная нейросенсорная тугоухость Ген коннексина 26 (GJB2) Врожденная и ранняя детская глухота Нейрофиброматоз 1-го типа Ген нейрофибромина (NF1) Поражение эмбрионального нервного валика, нарушение миграции, роста и дифференцировки клеток. Вульгарный ихтиоз Ген филаггрина (FLG). Этот белок участвует в дифференцировке клеток эпидермиса и его барьерной функции. Поражение кожи, при котором нарушается процесс ее ороговения, приводя к образованию чешуек по всему телу. Мышечная дистрофия Дюшенна Ген дистрофина (DMD). Этот белок стабилизирует мембрану мышечных клеток Характеризуется прогрессирующей мышечной атрофией, приводя к полной деградации мышечной ткани к 20-30-ти годам. Гемофилия А Ген фактора свертываемости крови VIII Нарушение свертываемости крови Гемофилии Б Ген фактора свертываемости крови IХ Нарушение свертываемости крови Тяжелый комбинорованный иммунодефицит Ген аденозиндезаминазы Утрата Т- и В-лимфоцитов Семейная гиперхолестеролемия Ген рецептора липротеина низкой плотности Повышенный уровень холестерина в крови. Ишемическая болезнь сердца На основании сведений об организации генов, определяющих наследственное заболевание, необходимо создать генетическую конструкцию, в состав которой входят неповрежденный ген и нуклеотидные последовательности, обеспечивающие его экспрессию в клетках человека. Эта конструкция также должна обеспечивать доставку генов в клетки. Такие генетические конструкции созданы. С использованием их в принципе «лечебные» гены можно 152 Глава 9. Генотерапия вводить и в половые клетки. Методы переноса генов в половые клетки широко используются при создании трансгенных животных. При таком переносе приобретенные гены будут передаваться потомству. Этот подход вполне оправдан при работе с животными. При лечении же человека на современном этапе развития науки такой подход неприемлем. Неизвестно как поведет себя перенесенный ген. Может произойти гиперэкспрессия гена, или же он может нарушить работу других генов. В настоящее время при лечении человека с использованием методов генотерапии, гены вводят в соматические клетки. Поскольку при этом не трансформируются половые клетки, приобретенные гены не могут передаваться по наследству. Потомство, таким образом, оказывается защищенным от ошибки. Введение генетической конструкции в соматические клетки осуществляется двумя способами: •в предварительно выделенные и культивируемые клетки пациента, которые после трансформации возвращают в организм (генотерапия ex vivo); •«лечебный» ген может быть введен в клетки непосредственно в организме больного (генотерапия in vivo). Последовательность этапов генотерапии ex vivo следующая: 1) извлечение клеток из организма больного; 2) введение генетической конструкции в изолированные клетки; 3) отбор и наращивание «вылеченных» клеток; 4) возвращение генетически исправленных клеток в организм пациента. Использование собственных клеток больного при проведении генно-терапевтических процедур не приводит к их отторжению иммунной системой после возвращения в организм. Удобным объектом для проведения генотерапии ex vivo являются клетки костного мозга. В костном мозге присутствуют стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток: В- и Т-лимфоциты, эритроциты, 153 Прикладная молекулярная биология макрофаги, тромбоциты, остеокласты. Если патология связана с нарушением генетических функций вышеуказанных клеток, то введение в стволовые клетки соответствующих конструкций может оказать лечебное действие. Проведение терапии включает следующие этапы: извлечение костного мозга из организма больного, выделение из него стволовых клеток, введение в них конструкции с «лечебным» геном, возвращение трансформированных стволовых клеток на прежнее место. «Вылеченные» стволовые клетки дадут начало клеткам, в которых исходный генетический дефект отсутствует. Так может быть достигнут лечебный эффект. Еще одним объектом для генотерапии ex vivo могут являться клетки печени. При проведении генно-терапевтических процедур у пациента отсекают 10 – 15 % печени. Затем из нее выделяют гепатоциты. На следующем этапе в культивируемые гепатоциты вводится генетическая конструкция. На заключительной стадии трансформированные гепатоциты возвращают в печень через кровеносные сосуды. В случае генотерапии in vivo введение генетической конструкции осуществляется в клетки пациента непосредственно в составе ткани без их выделения из органа. Генетическая конструкция должна содержать «лечебный» ген и промотор, обеспечивающий его экспрессию. Разработаны разнообразные методы доставки чужеродной ДНК в клетки тканей различных органов (мышцу, легкие, селезенку, печень, мозг, кожу, кишечник и др.). Способы доставки «лечебных генов» в клетки пациентов Введение «лечебных генов» в клетки пациентов может быть осуществлено с использованием рекомбинантных вирусов. На основе генетического материала вирусов создано множество генно-инженерных конструкций, используемых для доставки генов в клетки. Наибольшее распространение имеют векторы, полученные на основе ретровирусов. Эти векторы обеспечивают высокую эффективность доставки ДНК в клетки и ее интеграцию в клеточный геном. Они при этом не наносят ощутимых повреждений клетке. При создании ретровирусных векторов удаляют нуклеотидные последовательности, кодирующие вирусные белки, обес154 Глава 9. Генотерапия печивающие формирование инфекционных вирусных частиц и лизис клеток. Взамен удаленного материала вводится «лечебный» ген. В составе ретровирусного вектора сохраняют элементы генома вирусов, обеспечивающие перенос и экспрессию трансгена. Сконструированный ретровирусный вектор дефектен. Он способен обеспечить доставку трансгенов, но не способен самостоятельно размножаться. Размножаться же он может только в присутствии недефектного вируса-помошника. Еще к недостаткам ретровирусного вектора относится и то, что ретровирусы эффективно инфицируют только активно делящиеся клетки, и то, что ретровирусная ДНК интегрирует в геном клеток беспорядочно. Беспорядочное включение ретровирусной ДНК может привести к ее интеграции в функционирующий клеточный ген и подавить его активность. С целью получения рекомбинантных ретровирусов, свободных от недефектных вирусов-помощников, были созданы «упаковывающие клетки». Они содержат гены ретровирусов, удаленные при создании ретровирусных векторов и, соответственно синтезируют ретровирусные белки, необходимые для формирования ретровирусной частицы. После введения в «упаковывающие клетки» ДНК ретровирусного рекомбинантного вектора она встраивается в хромосому и транскрибируется с образованием рекомбинантной векторной ретровирусной РНК. Последняя, взаимодействуя с ретровирусными белками, синтезируемыми «упаковывающими клетками», формирует вирусные частицы. Такие вирусные частицы способны заражать клетки-мишени и их можно использовать для доставки «лечебных» генов в геном клетки-мишени. Следует отметить, что «упаковывающие клетки» не способны продуцировать вирусные частицы дикого типа. Что является весьма важной особенностью, потому что они (вирусные частицы дикого типа) могут нанести вред клеткам пациента. Для доставки «лечебных» генов могут быть также использованы векторы, созданные на основе аденовирусов. Аденовирусы способны инфицировать неделящиеся клетки. Кроме того, они обладают широкой видовой и тканевой 155 Прикладная молекулярная биология специфичностью. При создании векторов, из генома аденовирусов удаляют часть генетического материала, и вместо него вводится «лечебный» ген. Аденовирусные векторы в отличие от ретровирусных в геном не интегрируют, они присутствуют в ядре клеток, где осуществляется их транскрипция. Получены векторы, используемые для доставки «лечебных» генов, и на основе других вирусов, например, на основе аденоассоциированных вирусов и вируса простого герпеса. Наряду с вирусными векторами разработаны невирусные методы доставки «лечебных генов». К таким методам относится обычная инъекция генетической конструкции (например, плазмидного вектора) в ткань какого-либо органа. Чужеродная ДНК при этом проникает только в часть клеток. Использование липосом, заполненных раствором векторной ДНК, может облегчить проникновение трансгена внутрь клеток. Это определяется тем, что липосомы способны сливаться с клеточной мембраной. Можно использовать также метод биобаллистики для доставки трансгена в клетки тех или иных тканей. Введенные таким образом «лечебные» гены в тканях-мишенях могут экспрессироваться. Для доставки «лечебного» гена в культивируемые клетки может использоваться также кальцийфосфатная трансфекция или метод электропорации. Введение трансгена можно осуществлять с использованием комплекса ДНК с белками, для которых на поверхности клеток имеются соответствующие рецепторы. После связывания белка с рецептором чужеродная ДНК проникает в клетку-мишень. Следует отметить, что невирусные системы доставки трансгенов характеризуются низкой частотой трансформации и короткой продолжительностью экспрессии «лечебного» гена. Эти два серьезных недостатка существенно влияют на перспективность их использования в генотерапии. 156 Глава 9. Генотерапия Достижения и перспективы генотерапии Первый пациентом генетических терапевтов (14.09.90) была четырехлетняя девочка с наследственным иммунодефицитом, обусловленным мутацией в гене аденозиндезаминазы. Ей были пересажены ее собственные лимфоциты, трансформированные ex vivo геном аденозиндезаминазы в составе ретровирусного вектора. Терапевтический эффект наблюдался несколько месяцев, поэтому терапевтическая процедура повторялась через 3 – 5 месяцев. За три года терапии ей были проведены 23 процедуры. Девочка, благодаря лечению, смогла вести нормальный образ жизни. В последствие проводилось лечение и других пациентов с наследственным иммунодефицитом. Им «лечебный» ген вводили в Т-лимфоциты или в стволовые клетки костного мозга, которые предварительно извлекали и культивировали в пробирке. Неповрежденный ген аденозиндезаминазы в клетки вводили при помощи ретровирусного вектора. После трансформации клетки возвращали в организм больных. После такой процедуры наблюдался лечебный эффект. Болезнь Гоше или глюкозилцерамидный липидоз является одной из лизосомных болезней накопления. В лизосомах содержится около 40 ферментов, ответственных за внутриклеточное расщепление различных макромолекул. Мутации генов, кодирующих эти ферменты, приводят к тому, что субстраты этих ферментов накапливаются в лизосомах. Болезнь Гоше связана с недостаточностью фермента глюкоцереброзидазы. Глюкоцереброзидаза катализирует в макрофагах расщепление глюкоцеребрози-да, поэтому при недостаточности этого фермента в клетках накапливается глюкоцереброзид, а клетки в свою очередь постепенно оседают в печени, селезенке, костном мозге и иногда в легких. Происходит поражение органов. Возможно лечение данного заболевания с помощью методов генотерапии. С этой целью в культивируемые клетки костного мозга необходимо ввести ген глюкоцереброзидазы и затем генетически скорректированные клетки доставить в организм больного. 157 Прикладная молекулярная биология Семейная гиперхолестеринемия является наследственным заболеванием. У больных на мембранах клеток печени отсутствует рецептор липопротенов низкой плотности (ЛПНП-рецептор). Как известно ЛПНП являются переносчиками холестерина в крови. ЛПНП-рецептор связывает ЛПНП и обеспечивает поглощение холестерина клетками печени посредством эндоцитоза. При отсутствии или недостатке рецептора в крови повышается содержание ЛПНП, что значительно увеличивает риск возникновения атеросклероза. Радикальное лечение семейной гиперхолестеринемии возможно с помощью генотерапии. В этом случае лечение осуществляется следующим образом. У больных отсекают около 15 % печени (200 – 300 г). Отсеченную часть промывают раствором коллагеназы для разделения гепатоцитов, которые затем выращивают на питательной среде. В процессе роста в культуре, в клетки вводят в составе ретровирусного вектора недефектный ген ЛПНП-рецептора. После трансформации модифицированные гепатоциты через воротную вену возвращают в печень. После описанной процедуры, часть клеток печени больного начинают продукцию ЛПНП-рецептора, что обеспечивает снижение холестерина в крови пациентов. Муковисцидоз – наследственное заболевание, обусловленное мутацией гена муковисцидозного трансмембранного регулятора, приводящее к тяжёлым нарушениям функций органов дыхания и желудочно-кишечного тракта. При лечении муковисцидоза методами генотерапии in vivo неповрежденную копию гена, включенную в аденовирусный вектор или липосому, вводят в виде аэрозоля в дыхательные пути больного. Прогрессирующая мышечная дистрофия Дюшенна – заболевание мальчиков, определяется дефектом гена дистрофина, находящегося в Х-хромосоме. Дети с этим заболеванием испытывают прогрессирующую слабость мышц, обычно приводящую к их гибели от дыхательной или сердечной недостаточности в возрасте до 30 лет. При геннотерапевтическом лечении данного заболевания использовали два похода: 158 Глава 9. Генотерапия •недефектный ген дистрофина вводили in vivo с помощью инъекций в мышечные волокна, используя либо «голую» ДНК, либо в составе аденовирусного вектора; •недефектный ген дистрофина в составе ретровирусного вектора вводили ex vivo в миобласты, которые после генетической коррекции трансплантировали больному. В обоих случаях удавалось получить временный лечебный эффект. После лечения дети могли двигаться, однако терапевтическая процедура должна неоднократно повторяться. Смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире после сердечно-сосудистых заболеваний. Причиной онкологических заболеваний являются мутации, затрагивающие генетический аппарат клетки, и приводящие к трансформации нормальных клеток в злокачественные. Последние, с одной стороны, теряют способность к апоптозу, а с другой стороны – приобретают способность к бесконтрольному делению. Если иммунная система организма не распознает злокачественные клетки вовремя, то они начинают размножаться и метастазировать, образуя многочисленные опухоли. Онкологические заболевания часто заканчиваются летальным исходом. В настоящее время используют различные приемы для их лечения. Также разрабатываются приемы их генотерапии. Для достижения лечебного эффекта можно генетически модифицировать как опухолевые клетки опухоли, так и нормальные клетки, например, клетки иммунной системы с целью активации иммунного ответа, направленного против опухоли. Возможны следующие приемы генетической коррекции лечения онкологических заболеваний: •предотвращение экспрессии онкогенов в опухолевых клетках. Онкогены кодируют онкобелки, участвующие в трансформации нормальных клеток в опухолевые. Экспрессию онкогенов можно блокировать, если ввести гены, кодирующие антисмысловые РНК, комплементарные иРНК онкобелков. Для подавления экспрессии онкогенов в геном опухолевых клеток можно также ввести гены, продукты которых будут связывать онкобелки и таким образом их инактивировать; 159 Прикладная молекулярная биология •введение в опухолевые клетки генов-супрессоров опухолевого роста. В опухолевых клетках часто гены-супрессоры повреждены. Поэтому замена дефектной копии гена на нормальную может оказать терапевтический эффект. Значительная часть онкологических заболеваний связана с нарушением экспрессии гена p53. Его важнейшей функцией является запуск апоптоза в клетках с измененным геномом. Оказалось, что восстановление экспрессии гена p53 может привести к уменьшению или исчезновению злокачественных опухолей; •введение в опухолевые клетки «генов-убийц», продукты которых обеспечивают гибель опухолевых клеток. Тимидинкиназа вируса простого герпеса модифицирует субстрат ганцикловир в токсический для клетки продукт. Введение гена тимидинкиназы в опухолевые клетки делает их чувствительными к ганцикловиру. Они погибают в присутствии этого вещества; •активация клеток иммунной системы. В этом случае подразумевается введение в клетки иммунной системы геновстимуляторов иммунного ответа (интерферонов, интерлейкинов); •повышение иммунореактивности опухолевых клеток за счет введения в них таких чужеродных генов, продукты которых, оказавшись на поверхности опухолевых клеток, позволят вызвать или усилить на них (опухолевые клетки) иммунный ответ; •защита стволовых клеток от токсического действия химиотерапии. Для достижения этой цели в геном стволовых клеток вводят гены, определяющие устойчивость к лекарствам. При использовании этого подхода можно проводить химиотерапию более интенсивно. Амавроз Лебера (врожденная слепота) – наследственное заболевание сетчатки глаза, проявляющееся уже в младенчестве. Причиной заболевания является наличие дефектного гена RPE65 (Retinal Pigment Epithelium, 65 kDa). Дефект гена RPE65 приводит к нарушению синтеза ферментов, участвующих в образовании светочувствительного пигмента, и гибели светочувствительных клеток. Лечение 160 Глава 9. Генотерапия этого заболевания возможно с помощью генотерапии. Положительный результат был получен после инъекции вирусного вектора, содержащего исправленный ген в эпителий пигментного слоя сетчатки пациентов. У некоторых пациентов зрение восстановилось до такой степени, что они могли нормально учиться в школе и заниматься спортом. Гемофилия является наследственным заболеванием, при котором нарушен процесс свёртывания крови. При этом заболевании могут происходить кровоизлияния в различных органах человека. Причиной гемофилии является мутация в генах свертываемости крови. Различают гемофилию А и гемофилию В. Гемофилия А связана с мутацией в гене фактора свертываемости крови VIII и, соответственно, с отсутствием этого белка в крови больного. Причиной гемофилии В является мутация в гене фактора свертываемости крови IX. Лечение гемофилии в настоящее время осуществляют с помощью инъекций факторов свёртываемости крови, обычно выделенных из донорской крови. При генотерапии гемофилии В трансформации подвергали клетки кожи фибробласты. В норме эти клетки не производят фактор свертываемости крови IX. После введения гена фактора IX фибробласты имплантировали в кожу. Трансформированные фибробласты осуществляли синтез фактора IX. Гемоглобин состоит из четырех субъединиц (двух альфа-глобинов и двух бета-глобинов) и гема. У больных бета-талассемией нарушен синтез бета-глобин, из-за мутации в его гене. Для генетической коррекции необходимо ввести ген бета-глобина и добиться, чтобы белок синтезировался в равных количествах с альфа-глобином. Болезнь Паркинсона – нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прогрессирующим разрушением и гибелью дофаминовых нейронов в центральной нервной системе. В развитии болезни Паркинсона определенную роль играют генетическая предрасположенность и воздействие нейротоксинов, образующихся в самих дофаминовых нейронах. Причинами проявлений этого заболевания могут быть и факторы воздействия окружающей среды, хрони161 Прикладная молекулярная биология ческая цереброваскулярная недостаточность, употребление некоторых лекарств. Инъекции гамма-аминомасляной кислоты (нейромедиатора, оказывающего тормозящее действие, ГАМК) в мозг приводят к подавлению симптомов болезни Паркинсона (скованности движений, нарушений координации движений, дрожи и т.д.). Эффект такого лечения непродолжителен, так как нейромедиатор быстро выводится. Синтез ГАМК осуществляет глутаматдекарбоксилаза. В связи с этим введение дополнительных копий генов этого фермента в клетки должно привести к продолжительному увеличению продукции ГАМК. Алкоголизм имеет огромное негативное влияние на все человечество. Общество испокон веков ведет борьбу с ним, но по большей части безуспешно. Возможно, в этой борьбе окажут помощь ДНК-технологии. В организме человека этанол при действии фермента алкогольдегидрогеназы превращается в ацетальдегид, который далее метаболизирует в уксусную кислоту. Последнюю реакцию катализирует фермент альдегиддегидрогеназа. Ацетальдегид значительнее токсичнее этанола и уксусной кислоты. Его накопление в организме приводит к тяжелому отравлению, сопровождающемуся головокружением, тошнотой, рвотой и другими неприятными симптомами. Если снизить скорость утилизации ацетальдегида, то при приеме алкоголя он будет накапливаться в большем количестве, чем обычно, что приведет к резкому ухудшению самочувствия. Снизить скорость утилизации ацетальдегида можно за счет понижения выроботки альдегиддегидрогеназы. Можно ожидать, что увеличение содержания ацетальдегида в организме приведет к формированию стойкого отвращения к алкоголю. Синтез альдегиддегидрогеназы можно подавить, если в клетки ввести генетические конструкции, кодирующие антисмысловые РНК, комплементарные иРНК альдегиддегидрогеназы. Такие эксперименты были проведены на животных. Ученым удалось у крыс с врожденной склонностью к алкоголизму снизить потребление алкоголя на 50 %. С целью иммунизации человека и животных является перспективным создание ДНК-вакцин. ДНК162 Глава 9. Генотерапия вакцины представляют собой генетические конструкции, кодирующие антигены возбудителей инфекционных заболеваний. При иммунизации конструкции должны быть доставлены в ядра клеток in vivo. В качестве клеток-мишеней при ДНК-вакцинации предпочтительнее использовать мышечные или эпителиальные клетки. Доставка может осуществляться методом биобаллистики или с помощью липосом, содержащих вакцину. Внутри клеток генетические конструкции обеспечивают синтез чужеродного белка, на который иммунная система способна вырабатывать антитела. Эти антитела и будут обеспечивать иммунитет к соответствующим возбудителям инфекционного заболевания. Возможна разработка многокомпонентных вакцин, генетические конструкции которых содержат гены, кодирующие антигены нескольких возбудителей инфекционных заболеваний. 163 Рекомендуемая литература* 1.Баранов, В.С. Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней в России. Реальность и перспективы / В.С. Баранов // Соровский образовательный журнал. – 1998. – № 10. – С. 32 – 36. 2.Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами / под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева. – М.: Гэотар-Мед. 2001. – 448 с. 3.Бокуть, С.Б. Молекулярная биология / С.Б. Бокуть, Н.В. Герасимович, А.А. Милютин. – Минск: Выш. шк., 2005. – 463 с. 4.Глазер, В.М. Конверсия гена / В.М. Глазер // Соросовский образовательный журнал. – 2000. – № 1. – С. 23 − 31. 5.Г лик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М., 2002. – 585 с. 6.Гончаренко, Г.Г. Основы генетической инженерии / Г.Г. Гончаренко. – Минск: Выш. шк., 2005. – 183 с. 7.Ермишин, А.П. Генетически модифицированные организмы / А.П. Ермишин. – Минск: Тэхналогiя, 2004. – 118 с. 8.Инге-Вечтомов, С.Г. Введение в молекулярную генетику / С.Г. Инге-Вечтомов. – М.: Высшая школа. 1983. – 343 с. 9.Коничев, А.С. Молекулярная биология / А.С. Коничев, Г.А. Севастьянова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 400 с. 10. Кухта, В.К. Биологическая химия / В.К. Кухта, Т.С. Морозкина, Э.И. Олецкий, А.Д. Таганович. – М., Минск: Бином. 2008. – 688 с. 11. Ленинджер, Л. Основы биохимии / Л. Ленинджер. – М.: Мир, 1985. – Т. 1 – 3. 12. Льюин, В. Гены / В. Льюин. – М.: Мир, 1987. – 544 с. 13. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс [и др.]. – М.: Мир, 1986 – 1987. – Т. 1 – 5. 14. Молекулярная биология: структура и биосинтез нуклеиновых кислот / В.И. Агол; под ред. А.С. Спирина. – М.: Высшая школа. 1990. – 352 с. 15. Сингер, М. Гены и Геномы / М. Сингер, П. Берг. – М.: Мир, 1998. 16. Халимская, Л.М. Химический синтез белков и нуклеиновых кислот с использованием автоматических синтезаторов / Л.М. Халимская // Соровский образовательный журнал. – 2000. – № 10. – С. 37 – 42. 17. Шелкунов, С.Н. Генетическая инженерия / С.Н. Шелкунов. – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2008. – 514 с. 18. Жимулев, И. Ф. Общая и молекулярная генетика / И.Ф. Жимулев. – Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2002. – 458 с. 19. Янковский, Н.К. Молекулярно-генетические методы в руках детектива, или опыт исследования останков семьи последнего российского императора / Н.К. Янковский // Соровский образовательный журнал. – 1996. – № 2. – С. 21 – 27. * Литература из списка была использована при написании данного пособия 164 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение..............................................................................................3 Список принятых сокращений ....................................................4 Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК...............................................................5 Метод А.Максома и В.Гилберта (химический метод)...........................6 Метод Ф.Сангера (энзиматический метод)..........................................8 Глава 2. Синтез ДНК .....................................................................13 Химический синтез ДНК ................................................................. 13 Полимеразная цепная реакция (ПЦР).............................................17 ПЦР с обратной транскрипцией .....................................................23 ПЦР в реальном времени ................................................................24 Глава 3. ДНК-диагностика............................................................26 ДНК-диагностика с использованием меченых гибридизационных зондов .........................................................26 ДНК-фингерпринтинг................................................................30 Диагностика инфекционных заболеваний........................................33 ДНК-диагностика генетических заболеваний .....................................33 ДНК-диагностика генетических заболеваний с использованием гибридизационных зондов .........................................................34 ДНК-диагностика серповидноклеточной анемии ..............................36 Обнаружение однонуклеотидных замен с использованием методов ПЦР и лигирования олигонуклеотидных зондов (ПЦР/ЛОЗ)......38 Идентификация мутаций в разных участках одного гена с помощью нескольких гибридизационных зондов .......................................41 Идентификация биологических останков с использованием молекулярно-генетического анализа с целью выявления их принадлежности к определенной семье ....................................42 Глава 4. Ферменты и методы в генетической инженерии..46 Ферменты в генетической инженерии .............................................47 Ферменты, фрагментирующие ДНК ........................................................48 Нуклеазы ......................................................................................48 Ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК или РНК ...................55 ДНК-полимераза.............................................................................55 Обратная транскриптаза .................................................................57 165 Ферменты, лигирующие фрагменты ДНК .................................................58 ДНК-лигаза ....................................................................................58 Ферменты, модифицирующие концы НК ..........................................59 Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза...........................................59 ПолиА-полимераза ..........................................................................60 Фосфатазы ...................................................................................61 Полинуклеотидкиназа ......................................................................62 Методы в генетической инженерии ....................................................62 Получение генов ....................................................................................62 Введение гена в вектор и получение рекомбинантного вектора .........................66 Плазмидные векторы ........................................................................69 Фаговые векторы .............................................................................73 Космиды .......................................................................................77 Фазмиды .......................................................................................80 Челночные векторы ..........................................................................80 Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки животных.....80 Векторы, используемые для введения чужеродной ДНК в клетки растений ...83 Введение рекомбинантного вектора в клетки модифицируемого организма ......86 Получение ГМО .................................................................................89 Глава 5. Генная инженерия прокариот ...................................90 Экспрессия генов, клонированных в клетках прокариот ..................93 Практическое применение генетически модифицированных бактерий.................................................................................100 Генетически модифицированные бактерии на службе медицины ..100 Лекарственные препараты ...................................................................100 Инсулин .....................................................................................101 Гормон роста (соматотропин) ..........................................................105 Рекомбинантные вакцины .................................................................106 Роль генетически модифицированных бактерий при создании диагностических средств в медицине ..........................................108 Использование генетически модифицированных бактерий для получения продуктов немедицинского назначения ..................111 Биодеградация токсических веществ с помощью генетически модифицированных бактерий ................................................113 Глава 6. Эукариотические системы экспрессии чужеродных генов ..................................................................115 Генная инженерия дрожжей .........................................................116 Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток насекомых ........118 Экспрессия чужеродных генов в культурах клеток млекопитающих ...........................................................................121 166 Глава 1. Определение нуклеотидной последовательности ДНК Глава 7. Генная инженерия растений .....................................123 Практическое применение трансгенных растений .......................127 Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам .........................127 Трансгенные растения, устойчивые к насекомым-вредителям ........129 Трансгенные растения, устойчивые к вирусам ...............................130 Трансгенные растения, устойчивые к патогенным грибам и бактериям .............................................................................131 Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям ...........132 Трансгенные растения с измененными пищевыми качествами ......133 Трансгенные растения «биореакторы» ..........................................136 Глава 8. Генная инженерия животных ....................................137 Перспективы использования трансгенных животных .................144 Трансгенные животные – «биореакторы» ........................................144 Трансгенные животные с улучшенными характеристиками ...........146 Трансгенные животные, устойчивые к заболеваниям .....................148 Создание животных – генетических моделей заболеваний человека ..................................................................................149 Глава 9. Генотерапия ...................................................................150 Способы доставки «лечебных генов» в клетки пациентов .................154 Достижения и перспективы генотерапии ........................................157 Рекомендуемая литература ......................................................164 167 Учебное издание РЕЗЯПКИН Виктор Ильич ПРИКЛАДНАЯ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Пособие Редактор М.В. Вахмянина Компьютерная верстка: О.М. Санковская Дизайн обложки: О.В. Канчуга Подписано в печать 05.01.2011. Формат 60×84/16. Бумага офсетная. Ризография. Гарнитура Palatino Linotype. Усл. печ. л. 9,77. Уч.-изд. л. 8,9. Тираж 150 экз. Заказ Издатель и полиграфическое исполнение: Учреждение образования «Гродненский государственный университет имени Янки Купалы». ЛИ № 02330/0549484 от 14.05.2009. ЛП № 02330/0494172 от 03.04.2009. Пер. Телеграфный, 15а, 230023, Гродно ISBN 978-985-515-430-4 9 789855 15430 4
