идентификация генов, контролирующих уровень

VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНОВ, КОНТРОЛИРУЮЩИХ УРОВЕНЬ СОДЕРЖАНИЯ
ЖИРНЫХ КИСЛОТ В СЕМЕНАХ СОРТОВ Brassica napus L.
БЕЛОРУССКОЙ СЕЛЕКЦИИ
Мозгова Г.В.1, Грушецкая З.Е.1, Бакановская А.В.2
1
220072, Минск, ул. Академическая, 27
ГНУ Институт генетики и цитологии НАН Беларуси
2
222160, Жодино, ул. Тимирязева, 1
РУП НПЦ НАН Беларуси по земледелию
g.mozgova@igc.bas-net.by
Проведен анализ распределения мутантных аллелей генов fad2 и fad3с,
контролирующих содержание олеиновой и линоленовой кислот в рапсовом масле, в коллекции генотипов ярового рапса белорусской селекции. Полученные результаты будут использованы для маркер-сопутствующего отбора родительских
форм по fad2 и fad3c аллелям при получении гибридов с высоким содержанием
олеиновой и низким – линоленовой кислоты в рапсовом масле.
В Республике Беларусь постоянно ведется селекционная работа по созданию отечественных высококачественных сортов рапса пищевого назначения. Основные исследования по данному вопросу проводятся РУП «НПЦ НАН Беларуси
по земледелию», в котором создано 8 сортов озимого и 10 - ярового рапса, адаптированных к условиям Беларуси [1]. До настоящего времени получение новых
сортов рапса в Республике Беларусь проводилось методами классической селекции и не было предпринято исследований по ускорению темпов их создания с
использованием систем маркер-сопутствующего отбора. Вместе с тем, классическая селекция – это длительный процесс отбора и закрепления признаков. Разработка технологии маркер-сопутствующего отбора по хозяйственно-ценным признакам позволит значительно сократить объѐм прорабатываемого селекционного
материала, упростить процесс отбора родительских форм для скрещивания, сократить сроки создания новых сортов рапса.
Одним из основных направлений селекции рапса пищевого назначения
является снижение уровня полиненасыщенных жирных кислот, таких как линоленовая (до 2-4 %), и повышение количества мононенасыщенной олеиновой кислоты (до 80 %) в рапсовом масле, что приведет к снижению скорости окисления
масла и улучшению его качественного состава. Содержание олеиновой кислоты в
масле современных сортов ярового рапса составляет 55-60 %, линоленовой –
8-12 % [1, 4]. С целью создания эффективных методов маркер-сопутствующего
отбора ярового рапса по генам, определяющим уровень содержания жирных кислот в рапсовом масле, нами проводился анализ распределения аллелей главных
генов, контролирующих содержание олеиновой, линолевой и линоленовой кислот, в коллекции генотипов ярового рапса белорусской селекции. У B. napus
главный ген, контролирующий содержание олеиновой кислоты C18:1 – fad2 (Агеном, группа сцепления N5). Он кодирует фермент эндоплазматическую дельта12 олеат десатуразу, отвечающую за дегидрирование олеиновой кислоты (С18:1)
до линолевой (С18:2). Известно, что однонуклеотидная мутация (замена С на Т)
по гену fad2 приводит к увеличению содержания С18:1. В результате мутации
формируется стоп-кодон (ТАG), что приводит к преждевременной терминации
синтеза пептидной цепи. Предполагается, что такой укороченный полипептид не
функционирует и дегидрирование олеиновой кислоты не происходит, что приводит к накоплению С18:1 в мутантных линиях [4].
Ген fad3с (С-геном, группа сцепления N-14) кодирует дельта-15 линолеат
десатуразу, превращающую линолевую кислоту (С18:2) в линоленовую (С18:3).
199
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
В результате секвенирования аллели fad3с, клонированной из канольной линии
Dms100 с высоким содержанием олеиновой и низким – линоленовой кислоты, Hu
et al. (2006) выявили однонуклеотидную мутацию – замену G на A (интрон 6) [4].
Разработанные маркеры к мутантным аллелям генов fad2 и fad3с [4] позволяют выявлять мутации по главным генам, контролирующим синтез дельта-12 олеат десатуразы и дельта-15 линолеат десатуразы, которые должны приводить к увеличению синтеза олеиновой кислоты и снижению линоленовой соответственно. С
помощью данных маркеров выявлены мутантные аллели fad2 и fad3с генов у линии
DMS100 с высоким уровнем олеиновой кислоты и низким – линоленовой [4].
Материал и методы. Идентификация генов, контролирующих уровень содержания олеиновой, линолевой и линоленовой кислот, проводилась с использованием аллель-специфических маркеров к основным локусам генов fad2 и fad3с
[4] на коллекции генотипов ярового рапса – сортообразце гр. 73704, сортах - Антей, Неман, Янтарь, Гранит, Смак, Водолей, Явар, Гермес, Алмаз, Кромань, Гедемин, Магнат, Прамень, сорто-линейном гибриде F1 Рубин (РУП «НПЦ НАН Беларуси по земледелию»).
Выделение тотальной ДНК из листьев рапса (навеска 100 мг) проводилось
с использованием набора Fermentas Genomic DNA Purification kit. Реакция ПЦР
проходила в 25 мкл реакционной смеси, содержащей ПЦР-буфер (650 мМ ТрисHCl, 166 мМ (NH4)2SO4, 0,2 % Твин 20, pH 8,8), 0,25 мкМ каждого праймера, 1 мкM
dNTP, 2,5 (1,5) mM MgCl2, 1 U Taq-полимеразы и 100 нг тотальной ДНК. Праймеры
к мутантным аллелям генов fad2 и fad3c синтезированы ОДО «Праймтех» (Беларусь). Параметры амплификации для гена fad2: денатурация – 94 °C 4 мин; 30
циклов 94 °C 30 сек, 62 °C 30 сек, 72 °C 30 сек; заключительная элонгация –
72 °C 30 мин. Амплификации для детекции гена fad3c: денатурация – 94 °C 4
мин; 14 циклов 94 °C 30 сек, 62 °C 30 сек, 72 °C 30 сек (с понижением температуры отжига праймеров на 0,7 °C в каждом цикле); 20 циклов 95 °C 30 сек, 52 °C 30
сек, 72 °C 30 сек; заключительная элонгация – 72 °C 7 мин.
Результаты и обсуждение. У сортообразца гр. 73704 распределение мутантных аллелей fad2 и fad3c генов представлено в таблице.
Частота встречаемости мутации по гену fad2 у сортов рапса составила:
Алмаз, Антей, Магнат – 100 %, Смак – 87,5 %, Прамень – 81,8 %, Рубин – 75 %,
Гедемин – 71,4 %, Водолей – 70 %, Кромань – 66,7 %, Явар – 42,9 %, Гермес –
40 %. У индивидуальных растений сорта Неман мутации по гену fad2 не выявлено. Также у всех исследованных сортов рапса не детектировалась мутантная аллель гена fad3c.
РУП НПЦ «НАН Беларуси по земледелию» был проведен биохимический
анализ содержания жирных кислот в индивидуальных растениях рапса сортообразца гр. 73704 после обмолота. У исследованных образцов с мутацией по гену
fad2 содержание олеиновой кислоты превышало стандарт (50-60 %).
Максимальное значение отмечено у № 35, 47, 45, которое составило
65,9 %, 65,6 % и 70,7 %, соответственно. Вместе с тем, у мутантов по гену fad2
отмечен синтез линолевой кислоты. Помимо функциональных копий гена fad2,
принадлежащих группе сцепления N5 генома А, выявлен минорный локус на
группе сцепления N1 [3, 6]. Поэтому предполагается, что синтез дельта-12 олеат
десатуразы не заблокирован в минорном локусе группы сцепления N1.
По биохимическим данным, синтез линоленовой кислоты у сортообразца
гр. 73704 был снижен по сравнению с сортами ярового рапса белорусской селекции
и у некоторых растений не превышал 4,67 %. Известно, что интроны растений содержат высоко консервативные участки сплайсинга на 5' и 3' конце. В процессе
сплайсинга происходит распознавание трех участков пре-мРНК: донорного сайта
сплайсинга, сайта ветвления, и акцепторного сайта сплайсинга комплексом малых
200
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
ядерных РНК. Точность сплайсинга зависит от точности распознавания участков
сплайсинга. Поэтому мутация по гену fad3c может приводить к тому, что экзон 6 и
оба фланкирующих его интрона вырезаются либо сплайсинг на 5' конце участка
сплайсинга блокируется и активируются участки сплайсинга в других позициях [2].
В первом случае будет синтезироваться полипептид, в котором отсутствует аминокислота, кодируемая экзоном 6 fad3c. Активация участков сплайсинга в других позициях может вызывать преждевременную терминацию трансляции и синтез более
короткого полипептида, чем дельта-15 линолеат десатураза, кодируемая fad3c.
Вследствие незавершенной трансляции синтезированный фермент может быть неактивен, что приведет к блокированию синтеза линоленовой кислоты и снижению
накопления С18:3 в семенах рапса. Остаточный синтез линоленовой кислоты, повидимому, может индуцироваться продуктом гена fad3a (А-геном, группа сцепления
N4) либо нескольких минорных генов, отвечающих за дегидрирование линолевой
кислоты [5, 7]. Вместе с тем, полученные нами данные, выявившие отсутствие мутации по гену fad3c у сортов рапса белорусской селекции, подтверждаются результатами биохимических исследований об относительно высоких уровнях накопления
линоленовой кислоты у сортов ярового рапса – до 11,9 % (сорт Антей).
Таблица – Распределение мутантных аллелей генов fad2 и fad3c
у индивидуальных растений сортообразца
ярового рапса гр. 73704
№ образца
3
4
8
9
10
11
12
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
50
51
Мутация по гену fad2
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Мутация по гену fad3c
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
Заключение. Проведен анализ распределения мутантных аллелей главных
генов, контролирующих уровень содержания жирных кислот в семенах рапса, fad 2 и fad3с у сортообразца гр. 73704, 13 сортов и 1 сортолинейного гибрида
ярового рапса белорусской селекции. Частота мутации по гену fad2 у исследованных сортов варьировала от 0 до 100 %. Биохимический анализ жирнокислотного состава семян растений с мутацией по гену fad2 показал, что содержание
201
VI международная конференция молодых ученых и специалистов, ВНИИМК, 20 11 г.
олеиновой кислоты в семенах индивидуальных растений сортообразца гр. 73704
превышало стандарт (50-60 %) и достигало 70,7 %. Синтез линоленовой кислоты
у сортообразца гр. 73704 был снижен по сравнению с сортами ярового рапса и у
некоторых растений не превышал 4,67 %, что подтверждается данными молекулярно-генетического анализа. Вместе с тем, выявлено отсутствие мутации по гену
fad3c у сортов рапса белорусской селекции, что подтверждается результатами
биохимических исследований.
Полученные результаты будут использованы для маркер-сопутствующего
отбора родительских форм по fad2 и fad3c аллелям при получении гибридов
сортообразца ярового рапса гр. 73704, индивидуальные растения которого характеризуются повышенным содержанием олеиновой и пониженным – линоленовой
кислот, и коллекционных сортов, различающихся по жирнокислотному составу.
Исследования проводятся под руководством канд. биол. наук Лемеш В.А.
и канд. с.-х. наук Пилюк Я.Э. по заданию государственной программы «Инновационные биотехнологии» на 2010-2012 годы и на период до 2015 года.
Литература
1. Пилюк Я.Э. Рапс в Беларуси (Биология, селекция и технология возделывания). – Минск: Бизнесофсет, 2007. – 240 с.
2. Brown J.W.S., Simpson C.G. Splice site selection in plant pre-mRNA splicing // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. – 1998. – Vol. 49. – P. 77–95.
3. Scheffler J.A. et al. Dasaturase multigen families of Brassica napus arose
through genome duplication // Theor. Appl. Genet. – 1997. – Vol. 94. – P. 583–591.
4. Hu X. et al. Mapping of the loci controlling oleic and linolenic acid contents
and development of fad2 and fad3 allele-specific markers in canola (Brassica napus L.)
// Theor. Appl. Genet. – 2006. – Vol. 113. – P. 497–507.
5. Rücker B., Röbbelen G. Impact of low linolenic acid content on seed yield
of winter oilseed rape (Brassica napus L.) // Plant Breed. – 1996. – Vol. 115. – P. 226–230.
6. Schierholt A. Mapping a high oleic acid mutation in winter oilseed rape
(Brassica napus L.) // Theor. Appl. Genet. – 2000. – Vol. 101. – P. 897–89.
7. Udall J.A. et al. Detection of chromosomal rearrangements derived from
homeologous recombination in four mapping populations of Brassica napus L. // Genetics. – 2005. – Vol. 169. – P. 967–979.
IDENTIFICATION OF GENES CONTROLLING LEVEL OF FATTY ACIDS
CONTENT IN SEEDS OF VARIETIES OF Brassica napus L.
OF THE BELARUSIAN DEVELOPMENT
Mozgova G.V., Grushetskaya Z.E., Bakanovskaya A.V.
The analysis of distribution of mutant alleles of genes fad2 and fad3с controlling oleic and linolenic acid contents in rapeseed oil in the collection of genotypes of
the Belarusian development has been carried out. The received results will be used for
marker-assisted selection of parental forms on fad2 and fad3c alleles by developing
rapeseed hybrids of the high oleic and low linolenic acid content.
202