ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ На правах рукописи Мартынова Екатерина Владимировна РОЛЬ ПЛАЗМОЦИТОИДНЫХ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК В ПАТОГЕНЕЗЕ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология 14.03.03 – патологическая физиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.б.н., профессор Ризванов А.А. д.м.н., профессор Анохин В.А. Казань – 2015 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 4 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................... 11 1.1 Происхождение ВИЧ и штаммы возбудители ......................................... 11 1.2 Роль дендритных клеток в иммунном ответе ............................................... 17 1.3 Молекулярные механизмы развития ВИЧ инфекции ................................. 22 1.3.1 Апоптоз в патогенезе ВИЧ-инфекции ....................................................... 22 1.3.2 Генетические факторы в патогенезе ВИЧ-инфекции ............................... 24 1.3.3 Лимфоидные органы в патогенезе ВИЧ-инфекции .................................. 25 1.4 Участие желудочно-кишечного тракта развитии ВИЧ-инфекции ............. 25 1.4.1 Поражение ЖКТ при ВИЧ-1 инфекции ..................................................... 26 1.5 Антиретровирусная терапия и желудочно-кишечный тракт ...................... 30 1.6 Патогенетические этапы развития ВИЧ-инфекции ..................................... 31 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................ 38 2.1.Методы работы с клеточными культурами .................................................. 38 2.2 Выделение ВИЧ-1 из периферической крови человека .............................. 39 2.3 Подтверждение наличия p24-антигена ВИЧ и определение титра вируса 40 2.4 Инфицирование мононуклеарных клеток периферической крови человека полученным вирусом ВИЧ-инфекции................................................................. 41 2.5 Проточная цитофлуорометрия мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения количества ПДК и ВИЧ-инфицированных клеток...................................................................................................................... 42 2.6 Выделение плазмоцитоидных дендритных клеток методом отрицательной магнитной сепарации ............................................................................................ 42 2.7 Прижизненная биопсия двенадцатиперстной кишки с помощью фиброгастродуоденосокопии ............................................................................... 43 2.8 Иммуногистохимические методы анализа ................................................... 44 2.9 Подготовка образцов тканей для иммуногистохимического исследования44 2.10 Флуоресцентная иммуногистохимия .......................................................... 45 2.11 Окраска гематоксилином-эозином .............................................................. 47 3 2.12 Проточная цитофлуорометрия образцов крови больных ВИЧ-инфекцией ................................................................................................................................. 47 2.13 Исследование апоптоза методом окрашивания Annexin-V FITC и PI..... 48 2.14 Программное обеспечение и статистический анализ результатов .......... 48 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .................................................. 49 3.1. Получение и титрование ВИЧ «дикого типа» ............................................. 49 3.2 Плазмоцитоидные дендритные клетки в периферической крови пациентов с ВИЧ-инфекцией .................................................................................................. 52 3.3 Плазмоцитоидные дендритные клетки в двенадцатиперстной кишке у ВИЧ-инфицированных пациентов ....................................................................... 57 3.4 Оценка жизнеспособности культур клеток, инфицированных ВИЧ-1...... 68 3.5 Оценка уровня инфицирования ВИЧ культуры плазмоцитоидных дендритных клеток ................................................................................................ 68 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ...................................................... 71 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ..................................................................................................... 80 ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 82 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................... 83 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................... 86 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА ......................................... 102 4 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Одной из глобальных угроз человечеству в новейшей истории, безусловно является ВИЧ-инфекция. Гигантский объем исследований по изучению этого заболевания не позволяет, тем не менее, однозначно объяснить генез ряда его проявлений. Одним из звеньев инфекционного процесса, как показали последние наблюдения, является фиксация ВИЧ фолликулярными дендритными клетками. (Scialdone et al., 2015). При кажущемся очевидном участии в развитии самой инфекции плазмоцитоидных дендритных клеток (пДК), роль их остается мало понятной (Gilliet et al 2008). пДК – популяция сравнительно небольшого пула антиген-презентирующих клеток (0,2-0,5% от мононуклеарных клеток периферической крови) (Petit et al., 2005). Однако, при этом пДК играют значимую роль в индукции адаптивного иммунного ответа (Bignold et al.2009). Выделяют миелоидные (CDllc+) и плазмоцитоидные (CDllc-/CD123+) ДК, имеющие общих предшественников с макрофагами и лимфоцитами, и выполняют в организме различные функции. Клетки Лангерганса участвуют в первых этапах ВИЧ-инфицирования, экспрессируя на своей поверхности CD4+, рецепторы хемокинов (СХСR4, CCR5). Однако, вопрос о вовлечении ДК в механизм прогрессирования ВИЧ остается неясным, поскольку зараженные клетки, в отличие от лимфоцитов, не погибают. Существует вероятность того, что ДК могут служить своеобразным резервуаром ВИЧ (Gezelter et al., 1995;, Santos et al., 2004; Veazey and Lackner, 2004). В исследованиях Bridgeman показано, что снижение числа дендритных клеток в крови ВИЧ-инфицированных лиц ассоциируется с увеличением вирусной нагрузки (Bridgeman et al. 2015). Дальнейшая работа в этом направлении способна пролить свет на механизмы взаимодействия ДК и ВИЧ. На ранней стадии острой ВИЧ-инфекции преобладает 5 взрывной характер процессов активации транскрипции, синтеза белков- предшественников, сборки вирионов и их почкования: за сутки в одном лимфоците может образоваться до 1000 вирусных частиц. При ВИЧ-инфекции одним из факторов иммунокомпетентных иммуносупресии клеток. Однако, является каким активация образом ВИЧ апоптоза вызывает гиперактивацию апоптоза в организме до конца не выяснено. Одним из объяснений является, то что при связывании растворимого гликопротеина ВИЧ gp120 с рецептором CD4 и ко-рецепторами (CXCR4, CCR5) инициируется апоптоз неинфицированных клеток (Nardacci et al., 2015). Таким образом, изучение роли апоптоза при ВИЧ-инфекции остается актуальным. Данное исследование имеет принципиальное значение для поиска новых механизмов и этапов патогенеза ВИЧ-инфекции. Таким образом, ДК, оказывающие существенный вклад в работе иммунной системы человека, могут осуществлять депонирование и миграцию ВИЧ в различных лимфоидных органах, что может послужить ключом к поиску новых возможностей лечения данного заболевания. Опираясь на данные о влиянии пДК на распространение ВИЧ-инфекции, была поставлена следующая цель. Целью работы явилось: Определить значимость плазмоцитоидных дендритных клеток в патогенезе ВИЧ-инфекции. Основные задачи исследования: 1. Провести сравнительную оценку количества плазмоцитоидных дендритных клеток в периферической крови у ВИЧ-инфицированных лиц и условно здоровых доноров. 2. Определить количество плазмоцитоидных дендритных клеток в кишечнике у ВИЧ-инфицированных лиц и условно здоровых доноров. 6 3. Исследовать уровень экспрессии маркеров CD11c, CD303, CD123, CD80, Ki- 67, CD56, CD4, гранзим B в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта при ВИЧ-инфекции. 4. Изучить механизмы гибели плазмоцитоидных дендритных клеток при ВИЧ- инфекции. Научная новизна работы В результате проведенного иммуногистохимическомого анализа биопсийного материала двенадцатиперстной кишки больных ВИЧ-инфекцией и проточной цитофлуорометрии мононуклеарных клеток периферической крови выявлены следующие фенотипические характеристики плазмоцитоидных дендритных клеток: экспрессия на поверхности ДК маркеров CD 11c, CD4, CD56, CD80, Ki-56, наличие экспрессии гранзима В. Впервые показано, что у больных с ВИЧинфекцией в ЖКТ имеет место ко-экспрессия маркеров CD303/CD56. Впервые показано, что в слизистой кишечника больных ВИЧ присутствуют ПДК предшественники клеток из костного мозга, экспрессирующие маркер CD11c. Достоверное увеличение плазмоцитоидных дендритных клеток в желудочнокишечном тракте в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки при ВИЧинфекции одновременно коррелировало со сниженными показателями абсолютного количества CD4+ клеток и увеличенным уровнем вирусной нагрузки у ВИЧ-инфицированных лиц в периферической крови. Впервые показана экспрессия в слизистой 12-перстной кишки у ВИЧ-инфицированных пациентов гранзима В. Впервые показана преимущественная инфицируемость вирусом иммунодефицита человека плазмоцитоидных дендритных клеток по сравнению с общей популяцией мононуклеарных клеток человека. Определены возможные механизмы гибели плазмоцитоидных дендритных клеток при их инфицировании ВИЧ-1. Выявлено, что гибель дендритных клеток, 7 подвергшихся инфицированию ВИЧ in vitro, связана с апоптотическими изменениями мононуклеарных клеток крови человека. Установлено, что в слизистой желудочно-кишечного тракта больных ВИЧинфекцией пДК экспрессируют маркер CD11c, характерный для незрелых дендритных клеток. Показано, что пДК в ткани кишечника активнее экспрессируют маркер активации CD80, чем аналогичные клетки периферической крови, что может свидетельствовать о миграции активированных пДК в слизистую. При иммуногистохимическом анализе слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки ВИЧ-инфицированных пациентов было обнаружено снижение экспрессии CD123 на дендритных клетках. Было показано, что при инкубировании культуры клеток человека с ВИЧ в условиях in vitro, клетки подвергаются апоптозу, при этом задействована поздняя фаза апоптоза. Научно-практическая значимость. Апробированные методы выделения и культивирования плазмоцитоидных дендритных клеток, а также их инфицирование ВИЧ-1 в модели in vitro могут быть использованы при разработке методов скрининга веществ, обладающих потенциальной анти-ретровирусной активностью. Это имеет важное значение для поиска новых методов терапии ВИЧ-инфекции. Применение полученных результатов в области биологического феномена перераспределения дендритных клеток, которые связаны с прогрессированием ВИЧ-инфекции у пациентов позволит выяснить новые механизмы вирусной репликации, а также развития иммунодефицита у таких больных. 8 Основные положения, выносимые на защиту: 1. Фазы тяжелого иммунодефицита у больных ВИЧ-инфекцией протекают на фоне низкой активности плазмоцитоидных дендритных клеток периферической крови с одновременным ростом числа ПДК в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки. 2. В желудочно-кишечном тракте больных ВИЧ-инфекцией изменяется иммунофенотип плазмоциоидных дендритных клеток. Личный вклад диссертанта Все данные, приведенные в работе, получены при личном участии соискателя на всех этапах проведения исследования, а именно: составление плана работы, планирование и проведение экспериментов, анализ и систематизация полученных данных, а так же оформление публикаций. Связь работы с базовыми научными программами Эксперименты, выполненные в рамках настоящей диссертационной работы, проводились при финансовой поддержке грантов: Грант У.М.Н.И.К. по проекту «Разработка биобезопасной клеточной тест-системы для скрининга антиретровирусных препаратов» (2011-2012). Грант РФФИ 11-04-00612-а «Исследование внутриклеточных стадий жизненного цикла вируса иммунодефицита человека in vitro с использованием рекомбинантных лентивирусов» (2011-2013). Грант CarlZeiss 2011 «Разработка биобезопасной клеточной модели ВИЧинфекции на основе рекомбинантного лентивируса для исследования патогенеза ВИЧ». Стипендия Президента Российской федерации для молодых ученых и аспирантов, осуществляющих перспективные научные исследования и разработки по приоритетным направлениям модернизации российской экономики, СП- 1606.2012.4 «Использование рекомбинантных лентивирусов для исследования 9 патогенеза инфекции in vitro и скрининга лекарственных препаратов» (20122014). Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на: научно-практических конференциях молодых ученых Казанского государственного медицинского университета (Казань, 2011, 2012 гг.), Международном молодежном научном форуме «Ломоносов» (Москва, 2013г.), IV Российском съезде врачей общей практики I 2013, V Всероссийской научно-практической конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2013г.), Современных проблемах фундаментальной медицины и биологии (Казань, 2013г.), II Международной научно-практической конференции «Естественные и медицинские науки: актуальные проблемы и перспективы развития» (Казань, 2013г.), III Заочной международной научно-практической конференции «Медицина: актуальные вопросы и тенденции развития» (Москва, 2013г.), 18 международной конференции Symbiose – 2015 (Александруполис, 2015г.) Публикация результатов исследования Основные результаты диссертационного исследования отражены в 7 научных работах, в том числе 4-х статьях в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией для защиты кандидатских и докторских диссертаций, 3 тезисов докладов на Международных и Всероссийских конференциях и конгрессах. Структура и объем диссертационной работы Диссертационная работа состоит из Введения, Обзора литературы, описания Материалов и методов исследования, главы описания Результатов, главы Обсуждения полученных результатов, Заключения, Выводов, Практических рекомендаций, библиографического списка и списка иллюстрированного 10 материала. Работа изложена на № 103 странице машинописного текста, включает 16 рисунков, 5 таблиц. Библиографический список содержит 151 источников, в том числе 9 на русском и 142 на английском языках. Практическая значимость, внедрение результатов Полученные результаты позволяют рекомендовать определение интенсивности процессов апоптоза и активации пДК для оценки тяжести и стадии ВИЧ-инфекции. Данные по изучению этих процессов могут быть использованы для прогноза инфекционного процесса и анализа эффективности специфической противовирусной терапии. Применение полученных результатов в области биологического феномена перераспределения дендритных клеток, который связан с прогрессированием ВИЧ-инфекции у пациентов позволит выяснить новые механизмы вирусной репликации, а также развития иммунодефицита у таких больных. 11 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Происхождение ВИЧ и штаммы возбудители Вирус иммунодефицита 1 типа принадлежит к роду Lentivirus, семейству Retroviridae. Одной из наиболее пораженным континентом является Южная Африка, которая содержит около 60% ВИЧ-инфицированных людей среди своего населения (Clavel, Guetard et al. 1986). В 1983 году ВИЧ-1 был открыт как возбудитель синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИДа), в 1986 году у пациента из западной Африки был выделен низковирулентный штамм вируса и ставший в последствии известным как ВИЧ-2. Популяции шимпанзе служат своеобразным резервуаром большого числа ретровирусов. ВИЧ-2, близкий ВИЧ1, но менее патогенный вирус (Barre-Sinoussi, Chermann et al. 2004). ВИЧ-1 и ВИЧ-2 эволюционировали независимо друг от друга и происходят от соответствующих вирусов шимпанзе (ВИОcpz) и ВИО от обезьян вида черный мангобей. Возможно, вирус перешел от обезьяны к человеку при добыче и разделке мяса этих животных. Из вирусов, циркулирующих в настоящее время у животных к ВИЧ-1 ближе всего оказался вирус иммунодефицита обезьян, обнаруженный у шимпанзе (ВИОcpz) (Barre-Sinoussi, Chermann et al. 2004; Azevedo-Pereira, Santos-Costa et al. 2005). По ряду особенностей течения ВИЧ-2инфекции отличается от ВИЧ-1. Нелеченная ВИЧ-2-инфекция протекает значительно легче. Некоторые серологические и молекулярно-биохимические методики, ориентированные на выявление ВИЧ-1, не обнваруживают ВИЧ-2. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ОТ), активные против ВИЧ-1, не способны блокировать ОТ ВИЧ-2 (Хоффман К 2011). ВИЧ циркулирует во внутренних жидкостях организма в виде вириона, содержащего РНК. Вирус способен активно проникать в клетки, 12 экспрессирующие на своей поверхности рецептор CD4+, к которому ВИЧ прикрепляется. Это циркулирующие элементы крови, лимфы и тканевой жидкости, а также к неспецифическим элементам нервной ткани. Основной признак ВИЧ-инфекции – прогрессирующее снижение количества CD4+ Т-лимфоцитов в организме и кровяном русле, которое обуславливает развитие иммунной дисфункции и возникновение вторичных заболеваний. Несмотря на все успехи, достигнутые в области лечения ВИЧ-инфекции, следует признать, что полное избавление от вируса по-прежнему невозможно. Более того, появились новые проблемы, связанные, в том числе, с краткосрочной и долгосрочной токсичностью антиретровирусных препаратов, формированием мутаций вирусного генома, приводящих к развитию резистентности возбудителя. (Gao, Bailes et al. 1999; Хоффман К 2011). Структура вируса иммунодефицита человека. По своей структуре ВИЧ сходен с другими ретровирусами. Его капсид, образованный белком p24, окружает две копии РНК (вирусный геном) и две копии вирусной обратной транскриптазы (p66/p51), это отражено на рисунке 1. Внутри капсида также находятся копии нуклеокапсидного протеида (p7), связанные с вирусной геномной РНК (Liu and Berkhout 2009). Рисунок 1 – Схема строения ВИЧ-1 13 Проникновение многоступенчатый ретровируса процесс, в который клетку-мишень реализуется – сложный, взаимодействием гликопротеинов вирусной оболочки и рецепторами клетки-мишени, что приводит, в конечном итоге, к слиянию вирусной и клеточной мембран. Инфицирование начинается со связывания поверхностного гликопротеида gp120 с рецептором CD4 на поверхности клетки (рисунок 2). Рецептор CD4 представляет собой мономерный гликопротеин массой 58 кДа. Его можно обнаружить на поверхности примерно 60% T-лимфоцитов (как зрелых, так и клеток-предшественников), моноцитов, макрофагов, эозинофилов, дендритных клеток и клеток микроглии центральной нервной системы (ЦНС) (Witmer and Danovich 2009). Связывание рецептора CD4 с гликопротеинов вирсной оболочки gp120 запускает конформационные изменения в gp120, что облегчает его взаимодействие с вирусным ко-рецептором, которым обычно служат белки CXCR4 и CCR5 (хемокиновые рецепторы для лимфа– и моноцитотропных штаммов ВИЧ-1, соответственно). Связывание с ко-рецептором запускает дальнейшие конформационные изменения в gp41 — гликопротеине, закрепленном во внешней оболочке вируса и нековалентно связанном с gp120. Изменения в gp41 приводят к внедрению его концевого домена («белка слияния») в клеточную мембрану (Delelis, Zamborlini et al. ; Zeichner 1994). Таким образом, вирус проникает в клетку-мишень, где продолжается клеточный цикл развития вируса. Обратная транскрипция и транспорт в ядро. Обратная транскрипция (синтез провирусной ДНК на матрице вирусной РНК в цитоплазме клетки под действием фермента обратной транскриптазы) и декапсидизация («раздевание») вируса – тесно связанные процессы (Ocwieja, Sherrill-Mix et al.). Молекулярный механизм, лежащий в основе РНК-ДНК преобразования вируснорй РНК, достаточно хорошо изучен, но каким именно образом происходит декапсидизация вируса, до сих пор окончательно не ясно. Ранние исследования показали, что вирусная частица подвергается декапсидации вскоре после ее проникновения в клетку (Betancor, Alvarez et al. ; Bure, Makhdoomi et al. ; Ocwieja, Sherrill-Mix et 14 al.). Однако, недавние результаты демонстрируют, что это процесс может произойти позже (Betancor, Alvarez et al.), вблизи центросомы или ядерной оболочки. Используя механизм клеточного ядерного транспорта, ВИЧ-1 переносит преинтеграционный комплекс (ПИК) в ядро с последующей интеграцией в клеточную ДНК. Преинтеграционный комплекс это комплекс вирусных нуклеопротеинов, таких как нуклеокапсид (Воронкова О.В.), матрикс (MA), обратная транскриптаза (ОТ), интеграза (ИН), а также нескольких клеточных белков, связанных с геномом вируса (Betancor, Alvarez et al.). Пока продолжается обратная транскрипция, комплекс ОТ постепенно трансформируется в ПИК (Das, Jeeninga et al. ; Zeichner 1994). Известно, что цитоплазма клеток, являясь вязкой средой, содержащей органеллы и элементы цитоскелета, встроенные в плотный белковый матрикс, делает невозможной пассивную диффузию вирусных частиц (Brenchley, Schacker et al. 2004). Для достижения ядра, ретровирусные белки взаимодействуют с элементами цитоскелета и компонентами двигательного молекулярного комплекса (комплекс Гольджи) (Akhmanova and Hoogenraad). Входящий в ПИК gag-белок соединяется с легкой цепью микротрубочки (МТ) двигательного динеина и накапливается в зонах от центросомы до места ядерной транслокации (Kandel, Chou et al.). Кроме того, проникающие ВИЧ-1 частицы доставляются по сети MT от периферии клетки к центросоме (Delelis O., et al., 1994). Было проведено исследование по влиянию белка импортина- альфа (Imp – α ) на репликацию ВИЧ-1. Количественный анализ полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени показал, что «выключение» Impalpha3 в клетках HeLa, CD4+C8166 Т-клетках и макрофагах привело к значительному снижению уровня 2-LTR, в тоже время не было зарегистрировано подобного эффекта в отношении обратной транскриптазы ВИЧ. Эти данные подтверждают важность Impalpha3 в ядерном импорте ВИЧ. Интеграза (ИН) способна взаимодействовать с Impalpha3 как в клеточной (экспрессионной) системе на основе культуры клеток 293T, так и 15 в ВИЧ-инфицированных CD4+ Т-клетках. В целом, это исследование впервые продемонстрировало, что Impalpha3 является ко-фактором ПИК (Delelis, Zamborlini et al. ; de Jong, Aarts et al. 2009). ПИК включает белок эмерин (EM) (Bhattacharya, Alam et al. ; Li, Song et al. ; Melcon, Kozlov et al. 2006). Группой исследователей было показано, что фосфорилирование EM индуцируется в ранние сроки инфицирования неделящихся клеток (Li, Song et al.). Этот процесс зависит от активности вирион-ассоциированной митоген-активирующей протеинкиназы (МАПК). Специфическое подавление активности МАПК с помощью ингибиторов киназы заметно снижало фосфорилирование EM и приводило к подавлению процессов интеграции провирусной ДНК в хроматин. Этот фермент играет важную роль в содействии интеграции кДНК после ядерной транслокации (Melcon, Kozlov et al. 2006; Meira, Nobrega et al. 2009; Wang, Xie et al. 2009). Рисунок 2 – Схема патогенеза ВИЧ-1 при взаимодействии с CD4 позитивной клеткой 16 Интеграция, транскрипция и сборка новых вирусных частиц. Интеграция лентивируса в геном клетки-хозяина является обязательным этапом для его репликации. Она осуществляется с помощью фермента интегразы (ИН) (Cavrois, Neidleman et al. 2006). Современные исследования показывают, что интеграционный процесс – не случаен, он регулируется на молекулярном уровне (Onono, Guze et al. ; Tao, Onono et al.). Клеточные факторы репликации играют ключевую роль на этапе интеграции (Tao, Onono et al.). Интеграция обеспечивает экспрессию вирусных генов, и, таким образом, продукцию новых вирусов. Тем не менее, интеграция – событие нечастое. Показано, что большое число вирусных частиц не являются инфекционными (Shah, Pirrone et al.). Вероятно, это обусловлено дефектностью большинства вирусных генов. Из восьми вирусных частиц только одна начинает обратную транскрипцию и последующую интеграцию (Tao, Onono et al.). Интегрированная вирусная информация составляет лишь 5-10% общего содержания вирусной ДНК в зараженных клетках. Внехромосомные линейные молекулы и кольцевые молекулы ДНК, имеющие один или два длинных концевых повтора (LTR), содержат наибольшее количество вирусной ДНК (Gomez and Hope 2005). Линейная кДНК, которая считается прямым предшественником провируса, без интеграции быстро разрушается (по оценкам, ее период полураспада, равен 1-2 дням) (Gomez and Hope 2005). Круговые формы LTR, которые рассматриваются как тупиковая продукция прерванного интеграционного события и могут способствовать экспрессии вирусных генов (Хоффман К 2011). Вклад неинтегрированных форм вирусного генома в репликацию описан в последних работах, где отмечается образование новых вирионов из ВИЧ-1-инфицированных лимфоцитов покоя возобновляется в присутствии ингибиторов интегразы (Delelis, Zamborlini et al.). Были описаны и другие виды активности фермента ИН (Bure, Makhdoomi et al.). Реакцию дезинтеграции, которая рассматривается как обратный перенос цепи вирусной ДНК, можно наблюдать in vitro (Cavrois, Neidleman et al. 2006). ИН обладает эндоцитолитической активностью, что способствует расщеплению в 17 зонах стыка LTR-LTR 2-LTR кругов. Интеграза-опосредованное расщепление происходит симметрично, по обеим нитям. Предположительно, интеграза может использовать 2-LTR-последовательности, в том числе, и в качестве субстратапомощника для интеграции. Ферментативные свойства ИН тесно связаны с ее олигомерным состоянием: реакция 3'-процессинга эффективно катализируется при помощи димеров ИН, а интеграция и эндонуклеолитическая активность осуществляются благодаря тетрамерам (Proudfoot, Power et al.). Несколько клеточных белков, таких как SNF5/Ini1 или Ku80, взаимодействующие с ИН и/или связанные с ретровирусным ПИК, усиливают ее функцию (Delelis, Zamborlini et al. ; Bignold 2009) 1.2 Роль дендритных клеток в иммунном ответе Дендритные клетки (ДК) — «профессиональные» антиген-презентирующие клетки, которые первыми исследуют окружающую среду в местах входа патогена и играют значительную роль индукции приобретенного иммунного ответа (Rubbert, Combadiere et al. 1998). Эти клетки были открыты в 1970-ых годах как иммунные клетки с уникальными свойствами, отличными от макрофагов и моноцитов (Steinman and Cohn 1973). С момента открытия этих клеток прошло много времени и исследователи изучили механизмы, с помощью которых ДК участвуют в воспалительной реакции. Уже давно пДК были определены как естественные интерферон- продуцирующие клетки. Они производят в 100 раз больше интерферона I типа (ИФН-альфа, -бета, -омега) на клетку, чем моноциты. Они реагируют на стимуляцию Толл-подобных рецепторов (TLR) -7 -9 и других рецепторов, что объясняет их иммунный ответ на широкий диапазон вирусов, в том числе ВИЧ, и других микроорганизмов (Colonna et all., 2004). В организме человека, дендритные клетки обычно делятся на пять подгрупп, в зависимости от экспрессии ряда маркеров на их мембране: миелоидные ДК, 18 лимфоидные ДК, дермальные ДК и плазмоцитоидные ДК, эпидермальные дендритные клетки (Teleshova, Frank et al. 2003; Piccioli, Tavarini et al. 2007). Экспрессия маркеров различными типами ДК представлена в таблице 1. Известно, что пДК это уникальная популяция иммунных клеток, производных костномозговых клеток. При активации патогенами пДК начинают производить большие объемы интерферона I и III типа, а также провоспалительные цитокины (Cella, Jarrossay et al. 1999; Piqueras, Connolly et al. 2006). Таким образом, пДК играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе. Неактивированные пДК чаще называют пре-пДК (Shortman and Naik 2007) или покоящиеся пДК (Soumelis and Liu 2006). В таком состоянии пДК под воздействием хемокинов CCR7, CCR9 могут мигрировать в ткани такие как лимфатические узлы или слизистую ткань кишечника (Nagira, Imai et al. 1997). Такая миграция пДК в ткани впоследствии является важным для формирования иммунной толерантности (Lock, Hermans et al. 2002; Reis e Sousa 2006; Hadeiba, Sato et al. 2008). Известно, ВИЧ-1 может проникнуть в организм через его захват интраэпителиальными ДК, которые выстилают на поверхности слизистой (Coleman, Gelais et al. 2013). Если произошло попадание вируса в результате повреждения, истончения эпителия, то в этом случае происходит контакт с субэпителиальными ДК. После того, как ДК захватывают ВИЧ, они переносят ВИЧ в лимфатический узел (ЛУ), где он становится основным местом воспроизводства вируса (Pantaleo, Graziosi et al. 1993). Захват вируса происходит благодаря рецептору DC-SIGN (от англ. Dendritic cell-specific intracellular adhesion molecule-3-grabbing now-integrin), он участвует в распознавании таких вирусов, как ВИЧ-1, вирус гепатита С, вирус Дэнге, цитомегаловирусная инфекция, вирус Эбола и ряда других (Beignon, McKenna et al. 2005). 19 Таблица 1 – классификация дендритных клеток по типу экспрессии маркеров (Summers, Hock et al. 2001) Тип клеток Клетки Экспрессия маркеров Лангерганса CD45+, CD1a+, MHC II типа, CD207 (эпидермальные дендритные (лангерин), Е-кадгерин, EpCAM клетки) дДК (дермальные CD14+, CD1c+, CD45, CD11b, CD11c, MHC дендритные клетки) II типа, CD209 (DC-SIGN) CD14-, CD1c+, CD1a+\-, CD45, CD11b, CD11c, MHC II типа пДК (плазмоцитоидные CD123+, CD303+, CD304+, TLR 7, TLR 9 дендритные клетки) мДК (миелоидные CD141+, CLEC 9A+, CD11b, XCR1+, TLR3, дендритные клетки) лДК FLT3+, CD11c (лимфоидные CD11+, CD11b+,CX3CR+ , CD209 (DC-SIGN) дендритные клетки) Рецептор DC-SIGN представлен на макрофагах и дендритных клетках, инициатор фагоцитоза. Благодаря этому рецептору происходит заражение и распространение инфекции ВИЧ от дендритных клеток (van den Berg and Geijtenbeek). Каудхари и коллеги провели исследования по идентификации рецептора DC-SIGN у больных ВИЧ-инфекцией. Экспрессия этого рецептора в мононуклеарных клетках периферической крови человека оказалась значительно выше у ВИЧ-1-инфицированных пациентов по сравнению со здоровым серонегативым контролем (Chaudhary, Kumar et al. 2015). В зависимости от типа патогена и микроокружения незрелых ДК, развиваются различные подтипы ДК, которые способствуют появлению 20 эффекторных клеток Th-1 и Th-2 типов из нативных Th0 клеток. ДК могут распознавать патогены через специальные рецепторы, например Толл-лайк рецепторы (TLR) и С-тип лектина. Связывание рецетора с патоген- ассоциированной молекулой может привести к эндоцитозу, активации ДК или апоптозу (Bromley, Iaboni et al. 2001). Не так давно были обнаружены 11 видов TLR-рецепторов, которые способны к связыванию различных видов микробных соединений (Kapsenberg 2003). Во многих исследованиях показано, что начальная вспышка вирусной репликации ВИЧ-1 и ВИО происходит в CCR5 позитивных Т-клетках памяти в собственной пластинки слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта (lamina propria) (Veazey, DeMaria et al. 1998; Kewenig, Schneider et al. 1999; Vajdy, Veazey et al. 2000; Veazey, Tham et al. 2000; Mehandru, Poles et al. 2004). Через несколько недель после инфицирования ВИЧ, CCR5 позитивные Т-клетки лимфатической ткани становятся основным местом продукции вируса. Только спустя большое количество времени в течении вирусной инфекции провирусную ДНК можно обнаружить в CXCR4+ нативных Т клетках (Veazey, Mansfield et al. 2000).В настоящкк время, не до конца ясен основной механизм использования рецептора CCR5 вирусом ВИЧ-1. Одна из существующиъ гипотиз, это использование рецептора для преодоления слизистого барьера через эпителиальные CCR5+ клетки (Veazey and Lackner 2004). Кроме того, вирус ВИЧ-1 может существовать в ДК на протяжении 1-2 дней, после чего необходимо повторное заражение вирусом, для передачи Т-клеткам (Pope, Gezelter et al. 1995; Turville, Santos et al. 2004; Nobile, Petit et al. 2005). Существуют несколько типов ДК, но не все они исследованы в отношении взаимодействия с ВИЧ. Так существует небольшая популяция плазмоцитоидных денжритных клеток (пДК). Эти клетки, производные костного мозга и способны экспрессировать большое количество интерферона (ИНФ) I и III типа и могут дифференцироваться в антигенпрезентирующие дендритные клетки, в результате стимуляции патогенном. В крови человека, плазмоцитоидные дендритные клетки находятся в весьма 21 ограниченном количестве (0,2-0,5% от мононуклеарных клеток периферической крови) (Swiecki and Colonna 2010). На сегодняшний день изучается роль пДК в иммунных процессах в желудочно-кишечном тракте (Lombardi and Khaiboullina). ВИЧ-1, прямо или косвенно препятствует формированию эффективного противовирусного иммунитета и иммунной активации. Плазмоцитоидные дендритные клетки играют жизненно важную роль в активации противовирусного иммунитета и подавление клетки может смягчить иммунный ответ против ВИЧ-1 (Cavrois, Neidleman et al. 2006). Благодаря тому,что ВИЧ-1 ускользает от клеток врожденного иммунитета, это приводит к снижению созревания и формированию поколения с низкими противовирусными реакциями и способствует развитию Tрегуляторных клеток (Treg). В зависимости от стадии инфекции ВИЧ-1, функции мДК изменяются при взаимодейсвии с TLR-рецеторами (Ludewig et al., 1995). Это затрудняет формирование адаптивного иммунитета. ВзаимодействиепДК с ВИЧ-1 одновременно может обладать как иммуностимулирующим, так и иммуносупрессивным действием. (Lehmann, Jung et al. ; Miller and Bhardwaj) Было показано, что низкий уровень пДК и высокие уровни Treg могут быть связаны с онкогенным вирусом папилломы человека. (Strickler, Martinson et al.). Было показано, что различные виды ДК могут по разному влиять на инфекционный процесс при взаимодействии с Т-клетками. Так например, мДК и пДК были изолированы из периферической крови и ко-культивировали с Тклетками в присутствии ВИЧ. Было обнаружено, что мДК повышают инфицирование вирусом, через захват вируса и последующий перенос к Тклеткам. Созревшие мДК имеют различную эффективность передачи ВИЧинфекции, пДК подавляет репликацию вируса ВИЧ в Т-лимфоцитах посредством продукции ИНФ-α и пока не изученных небольших молекул (Groot et al., 2006) . 22 1.3 Молекулярные механизмы развития ВИЧ инфекции Высокая вирусная нагрузка, глубокий иммунодефицит и быстрая потеря CD4+ Тклеток являются отличительной чертой острой ВИЧ-инфекции (Schuetz et al., 2014). Уменьшение количества Т-клеток до определенного уровня приводит к развитию различных инфекционных и опухолевых процессов. Следует отметить, что некоторые из проявлений СПИДа не могут быть объяснены только иммунодепрессивным действием ВИЧ. Патогенетические механизмы ВИЧинфекции многофакторны и многофазны, Активация иммунной системы является важным компонентом адекватного иммунного ответа на внешний антиген. В физиологических условиях, когда иммунная система реагирует на антигенный стимул, после прекращения действия раздражителя, система как правило, возвращается в состояние покоя. Тем не менее, во время инфекции иммунной системы ВИЧ находится в постоянном состоянии активации в связи с наличием хронической инфекции. (Schuetz et al., 2014). Это состояние характеризуется гиперстимуляцией В-лимфоцитов спонтанного пролиферацию лимфоцитов, экспрессия маркеров активации на поверхности CD4+ и CD8+ лимфоцитов, гиперплазии лимфатических узлов, повышение секреции провоспалительных цитокинов, повышенным уровнем неоптерина, бета 2-микроглобулина, кислотно-чувствительна интерферон, интерлейкин-2, и аутоиммунные процессы. Постоянная активация иммунной системы может иметь ряд негативных последствий, это истощает иммунную систему и она неспособнна реагировать на широкий спектр антигенов в результате долгой и непрерывной антигенной сигнала (Zeichner 1994). 1.3.1 Апоптоз в патогенезе ВИЧ-инфекции При ВИЧ-инфекции гибель CD4+ Т-лимфоцитов происходит не только из-за цитотоксического влияния самого вируса, но и также из-за активации ими апоптоза в клетках. При ВИЧ-инфекции уровень апоптоза значительно возрастает 23 и представляет собой механизм, при котором отражается аномальные процессы, возникающие при постоянной иммунной активации (Tan, Wang et al.). Апоптоз играет важную роль в поддержании оптимального количества клеток в организме. Роль апоптоза при различны инфекционных заболеваниях, в том числе ВИЧ-инфекции, представляет фундаментальный интерес для понимания патогенетических процессов протикающих в иммунной системе. Для того, чтобы инактивировать патогенные клетки из организма, цитотоксические Т-лимфоциты и натуральные киллеры активируют специальные молекулы в направлении определенных клеток-мишеней. Среди этих гранул, такие как: гранзимы и перфорины. Гранзимы – это экзогенные сериновые протеиназы, высвобождение которых происходит из цитоплазматических гранул цитотоксических лимфоцитов. После связывания цитотоксических лимфоцитов с клеткой-мишенью содержимое гранул высвобождается в межклеточное пространство, откуда, после воздействия перфорина, попадает в цитозоль клеткикишени. Гранзим B активирует внутриклеточный каскад активации каспаз, приводя в итоге к гибели клетки-мишени. Гранзим A также способен индуцировать апоптоз в клетках-мишенях, но вовлекаемые при этом молекулярные механизмы пока не выяснены. Повышение уровня растворимых гранзимов было установлено у пациентов, с системными вирусными инфекциями, такими как ВИЧ-инфекция, цитомегаловирусная инфецйия, гепатит A и лихорадка Денге. Предполагается, что гранзимы участвуют в остром отторжении при трансплантации почки, т.к. в инфильтрирующих лимфоцитах отторгаемой почки их экспрессия существенно повышена. Гранзимы вызывают фрагментацию ДНК в клетке и запускают апоптоз по внутреннему, митохондриальному пути пути (А.А.Яриллин 2010). Последние исследования показывают, что гранзим-опосредованный запуск факторов для апоптоза является необходимым для полной активации каспазы-3. 24 Таким образом, гранзим В действует с нескольких сторон, чтобы инициировать гибель клетки (Lord, Rajotte et al. 2003). Апоптоз является нормальным генетически запрограммированым процессом, который реализуется во время эмбрионального развития, при патологических состояниях и в процессе старения. В процессе апоптоза активированные эндогенные нуклеазы расщепляют ДНК на фрагменты, при этом сохраняется целостность клеточных мембран и внутриклеточного содержимого, отсутствуют повреждения тканей и лейкоцитарная инфильтрация. В отличие от апоптоза, некроз представляет собой патологическую форму гибели клеток в результате их острого повреждения, разрыва оболочки, высвобождения содержимого цитоплазмы и индукции воспалительного процесса. Суперантигены способны связываться и активировать целые субпопуляции Т-лимфоцитов, и это ведет к массированной активации Т-клеток, которые, в результате, не способны реагировать на другие стимулирующие сигналы, и исключаются из процесса иммунного ответа (Tan, Wang et al. ; Torresilla, Larocque et al.). Аутоиммунные процессы при ВИЧ-инфекции характеризуются наличием антител к лимфоцитам и нейтрофилам, играя роль в развитии тромброцитопении у больных с ВИЧ-инфекицией (Roscoe, Kinney et al.) С появлением АРВТ увеличился спектр аутоимунноых заболеваний. Точный механизм развития аутоиммунитета у ВИЧ-инфицированных пациентов, находящихся на АРВТ сложен и включает влияние Treg-клеток на иммунную систему пациента. Был описан клинический случай ВИЧ-ассоциированной системной склеродермии у 9летней девочки (Okong'o, Webb et al.). 1.3.2 Генетические факторы в патогенезе ВИЧ-инфекции Роль генов главного комплекса гистосовместимости была показана в ряде исследований, а также ряда других генетических факторов в патогенезе ВИЧинфекции. В частности, предполагается определенная связь генетических факторов с клиническими проявлениями заболевания, а также с 25 предрасположенностью к более длительному выживанию или, наоборот, к более агрессивному течению болезни. Экспрессия антител на поверхности Тлимфоцитов может иметь генетические механизмы, обеспечивающие их более выраженные цитотоксические свойства и, следовательно, более эффективную иммунную защиту от ВИЧ-инфекции. Так же не исключается влияние экспрессии генов, обеспечивающих более быстрое распознавание инфицированных клеток. 1.3.3 Лимфоидные органы в патогенезе ВИЧ-инфекции Лимфоузлы являются основными анатомическими органами, где происходит репликация ВИЧ. Лимфаденопатия отражает клеточную активацию и иммунный ответ на вирус, который происходит в лимфоидной ткани и проявляется гиперплазией фолликул и зародышевых центров лимфоидной ткани ). По мере прогрессирования ВИЧ-инфекции структура лимфоидных органов начинает разрушаться, а функция вируса становится все более ограниченной. На этой стадии происходит усиление плазменной вирусемии, увелечение количества инфицированных лимфоцитов в периферической крови. Завершающие стадии болезни характеризуются высоким уровнем плазменной вирусемии, а также процессом лимфоузлов (Roscoe, Kinney et al.). 1.4 Участие желудочно-кишечного тракта развитии ВИЧ-инфекции Связь между ВИЧ-1 инфекцией и заболеванием желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) было отмечено еще в 1984 году. В том же году, Котлер с коллегами наблюдали гистологические нарушения слизистой оболочки ЖКТ, мальабсорбцию, и лимфоцитарное истощение у ВИЧ-инфицированных лиц, и пришли к выводу, по данным гистологических результатов, можно сказать, что специфический патологический процесс происходит в собственной пластинке тонкой кишки и толстой кишки у некоторых пациентов (Kotler, Gaetz et al. 1984). Слизистая оболочка ЖКТ формирует уникальную анатомическую и физиологическую нишу для защиты от микроорганизмов, она служит основным структурным и иммунологическим барьером в организме человека. 26 Следовательно, нарушение целостности слизистой оболочки ведет за собой неблагоприятные последствия (Brenchley, Schacker et al. 2004). Хотя уже давно известно, что прогрессирование ВИЧ-1 и вируса иммунодефицита обезьян (ВИО) связанно с патологией ЖКТ и уже начали оценивать в полной мере взаимоотношения между отрицательным воздействием ВИЧ-1 на ЖКТ во время острой фазы инфекции и прогрессирования болезни во время хронической фазы СПИДа (Kewenig, Schneider et al. 1999). Количество CD4+ Т-клеток в желудочно-кишечном тракте резко снижается у людей в острой фазе ВИЧ-1 и у приматов с острой инфекцией ВИО. Кроме того, ВИЧ-1 человека и ВИО у макак-резусов характеризуются энтеропатией и увеличением кишечной проницаемости. (Lima, Silva et al. 1997; Kewenig, Schneider et al. 1999). Последние наблюдения показывают, что системная иммунная активация может возникнуть и от перемещения микроорганизма через поврежденный слизистый барьер. Более того, многие из оппортунистических инфекций, которые обычно контролируются слизистым барьером, могут проникать через это барьер, вследствие негативного влияния ВИЧ-1 на слизистую оболочку ЖКТ. (Lima, Silva et al. 1997; Brenchley, Price et al. 2006). Хотя многие СПИД-ассоциированные заболевания могут быть связаны с потерей иммунитета слизистой оболочки и проявляться спустя несколько лет после заражения ВИЧ-1, большинство патологических изменений, как структурных, так и иммунологических, происходят на поверхности слизистой оболочки уже с начала инфицирования ВИЧ-1. (Brenchley, Price et al. 2006). 1.4.1 Поражение ЖКТ при ВИЧ-1 инфекции Поражение ЖКТ особенно остро происходит в период острой фазы ВИЧ-1 инфекции у людей или ВИО у макак-резусов. Непосредственная вирусная инфекция приводит к острому снижению большинства Т-клеток CD4 + в ЖКТ в острой фазе инфекции. Это приводит к развитию истощения CD4 позитивных 27 клеток, которое продолжается в течение всего периода заболевания, поскольку большинство CD4+ клеток находятся в ЖКТ и такое их распределение является неблагоприятным для поражения иммунной системы. Другие поражения ЖКТ так же связаны с воздействием ВИЧ-1 и ВИО инфекцями. Биопсия ЖКТ у ВИЧ-инфицированных лиц показала снижение экспрессии генов, ответственных за регулирование клеточного цикла, жирового обмена, эпителиального клеточного барьера и пищеварительную функцию. Эти изменения могут оказать негативное влияние на пищеварительную функцию, абсорбцию питательных веществ, а так же повлиять на эффективность антиретровирусной терапии. Энтеропатия, которая связана с ВИЧ-1 и ВИО может возникнуть в любой период инфекции. Последние данные свидетельствуют о том, что ВИОиндуцированный апоптоз клеток кишечника лежит в основе механизма энтеропатии в период ранней инфекции. Такая энтеропатия включает диарею, усиление воспалительного процесса в ЖКТ, повышение кишечной проницаемости (до 5-раз выше, чем в контроле), а также нарушение всасывания желчных кислот и витамина В12 (Brenchley, Price et al. 2006; Ancuta, Kamat et al. 2008). Гистологически энтеропатия включает воспалительные лимфоцитарные инфильтраты и поврежденный эпителиальный слой ЖКТ, а именно: атрофия, сглаженность ворсинок и гиперплазия крипт. Важно, что эти патологические изменения происходят в отсутствии явных признаков присутствия бактериальных, вирусных, грибковых энтеропатогенов, часто ассоциированных с энтеропатией. С другой стороны, концентрация продуктов жизнедеятельности микробов, таких как липополисахариды (ЛПС), в кровотоке у ВИЧ- инфицированных лиц существенно повышена (Ancuta, Kamat et al. 2008). Это очевидно, что на поверхности слизистой оболочки имеется дефект в элементе контроля проникновения микробов, который может зависеть от снижения концентрации субпопуляции Т-клеток, Th17 клеток. Эти лимфоциты, секретируют цитокин интерлейкин-17 (ИЛ-17), как считается, имеющий большое 28 значение в контроле над деятельностью бактерий и грибов, особенно на поверхности слизистой оболочки. В восстановлении количества нейтрофилов Th17 клетки играют важную роль, в поддержании и пролиферации энтероцитов, и продукции антибактериальных белков. Последние исследования демонстрируют, что у ВИЧ-инфицированных людей и ВИО-инфицированных макак-резусов происходят преимущественные потери Th17 клеток ЖКТ и восстановление этих субпопуляций после ВААРТ очень низкое. Учитывая важность Th17 клеток в слизистой, их потери при ВИЧ-инфекции могут иметь диспропорционально неблагоприятный эффект на регулирование иммунного ответа в слизистой оболочке. Последствия иммунной активации при хронической ВИЧ-инфекции негативно отражается на иммунной системе человека. Во-первых, значительный круговорот CD4 + и CD8 + Т-клеток влияет на количественные показатели Т– клеток в сторону уменьшения их количества. Кроме того, истощение Т-клеток в конечном итоге может привести к истощению пула Т-клеток памяти (Guadalupe, Reay et al. 2003). Во-вторых, повреждение лимфоидной ткани в этих условиях приводит к дисфункции вилочковой железы и ее фиброзу, опосредованному трансформирующим фактором роста (TGF)–β. Фиброз лимфатических узлов, в свою очередь, связан с аномальным воздействием эффекторного типа Т-клеток на ткань лимфатических узлов. (Mehandru, Poles et al. 2004; Mattapallil, Douek et al. 2005). Не все последствия иммунной активации при ВИЧ-инфекции наносят вред. Иммунная активация приводит к пролиферации Т-клеток. Таким образом, иммунная активация может помочь сохранить определенную степень иммунокомпетенции. Понимание причин иммунной активации при ВИЧ-1 инфекции может привести к новым терапевтическим изменениям, которые могут улучшить прогноз при терапии у ВИЧ-инфицированных лиц. Развитие СПИДа 29 Может показаться нелогичным, что у больных ВИЧ-инфекцией, несмотря на значительное повреждение иммунологических и структурных барьеров ЖКТ в течение короткой острой фазы инфекции, часто на протяжении многих лет не развиваются сопутствующие инфекции на фоне медленного прогрессирования заболевания. Во-первых, последние исследования показывают, что повреждения ЖКТ в острой фазе ВИЧ-1 инфекции вызывают микробную транслокацию, что приводит к значительному повышеннию уровню ЛПС в плазме при хроническом течении ВИЧ-1 инфекции. Повышенные концентрации ЛПС связаны с увеличением уровня растворимых CD14 и ЛПС–связывающего белка в крови, и снижением уровня антител, направленных против ядерного антигена ЛПС. Кроме того, уровень ЛПС-связывающих белков связан как с частотой активированных CD8+ Т-клеток памяти, так и с количеством провоспалительных цитокинов, ИНФ–α в плазме крови при ВИЧ-инфекции (Reyes, Canfield et al. 2004). Эти результаты предполагают, что ЛПС плазмы, в дополнение иммуностимулирующему действию через TLR-4 к своему мощному рецептор, также служит маркером транслокации микробных продуктов, которые стимулируют иммунную систему. Соответственно, микробная транслокация может служить причиной иммунной активации у ВИЧ-инфицированных лиц в хронической фазе. Таким образом, можно установить прямую связь между повреждением ЖКТ во время острой фазы инфекции и прогрессированием иммунодефицита при ВИЧинфекции (Ancuta, Kamat et al. 2008). Повреждения ЖКТ начинаются во время острой фазы инфекции ВИЧ/ВИО и продолжается в хронической фазе инфекции. Было показано медленное, но непрерывное снижение CD4 + Т-клеток в хронической фазе инфекции в ЖКТ у макак-резусов с ВИО. (Groot, van Capel et al. 2006). Действительно, поддержание количества Т-клеток при ВИЧ-инфекции в большей степени зависит от производства новых CD4+ эффекторных Т-клеток памяти. Такая неустойчивость популяции тканевых эффекторных CD4+ Т-клеток памяти с 30 течением времени не может объясняться увеличением поврежденных клеток, а скорее связана с прогрессирующим сокращением их производства из основного пула (Reyes, Canfield et al. 2004). Темп этого истощения и сроки заболевания в значительной мере определяются уничтожением самого вируса, отсутствием продукции, и постепенным снижением центральных CD4+ Т-клеток памяти. Хотя активация иммунной системы и может приводить к прогрессированию заболевания, тем не менее вирус играет ключевую роль в патогенезе заболевания, в результате инфицирования и уничтожения Т-клеток. 1.5 Антиретровирусная терапия и желудочно-кишечный тракт В настоящее время доступная антиретровирусная терапия (АРВТ) в целом способна уменьшить количество РНК ВИЧ-1 в плазме до неопределяемого уровня, что в итоге приводит к увеличению в периферической крови CD4 + Тклеток (Kotler, Shimada et al. 1998). Можно было бы ожидать, что репликация вируса снижается во всем организме и что восстановление CD4 + Т-клеток, наблюдаемое в крови, отражается во всем организме. Ранние исследования свидетельствуют, что симптомы желудочно-кишечных расстройств, такие как: спастические боли в животе, вздутие живота и жидкий стул уменьшаются после 1 недели от начала АРВТ (Kotler, Shimada et al. 1998; Mehandru, Poles et al. 2006). Кроме того, результаты однонедельного периода приема ВААРТ привели к десятикратному снижению РНК ВИЧ-1 в ректальной ткани, с незначительным увеличением CD4+ Т-клеток, в поле зрения, одновременно, с незначительным уменьшением числа CD4 позитивных клеток, подвергшихся аопроптоз в ректальной ткани. Эти данные позволяют предположить, что вирус играет центральную роль в наблюдаемой нами патологии ЖКТ и что ВААРТ может улучшить течение энтеропатии (Mehandru, Poles et al. 2006). Впоследствии несколько исследований тонкой кишки (в частности, двенадцатиперстной кишки) и анализов крови с использованием иммуногистохимии, проточной цитометрии показало, что восстановление CD4 + Т-клеток в ЖКТ при длительном ВААРТ незначительно и происходит гораздо 31 более медленными темпами, чем в периферической крови (). Восстановление CD4+ Т-клеток в ЖКТ при ВИЧ-1 является более успешным, если ВААРТ осуществляется на ранних стадиях ВИЧ-1 инфекции, чем в хронической фазе. У пациентов, получавших ВААРТ в ранней фазе ВИЧ-1 инфекции можно достичь двухкратного увеличения CD4+ Т-клеток ЖКТ, в то время как у пациентов, получавших аналогичное лечение в хронической фазе инфекции ВИЧ-1, это наблюдается редко (Mehandru, Poles et al. 2006). Механизмы, лежащие в основе незначительного восстановления CD4+ Тклеток в ЖКТ при ВИЧ-инфекции, не до конца ясны. Одним из возможных объяснений этого феномена восстановления CD4+ клеток является местное воспаление в слизистой ткани ЖКТ. Действительно, местная иммунная активация связана с фиброзом лимфоидной ткани в периферических лимфатических узлах. Важно отметить, что последние данные свидетельствуют, что фиброзные отложения коллагена возникают в Пейровых бляшках кишечника, даже во время острой фазы ВИЧ-инфекции (Estes, Baker et al. 2008). 1.6 Патогенетические этапы развития ВИЧ-инфекции Было установлено, что первичными клеточными мишенями ВИЧ являются клетки Лангенгарса и дентритные клетки, которые затем передают вирус лимфоцитам. После контакта вируса с CD4+ Т-лимфоцитами происходит интенсивная репликация вируса и развитие вирусемии, ведущей к распространению вируса по региональным лимфоузлам в головной мозг и другие ткани. После попадания ВИЧ в организм инфицированные клетки могут обнаруживаться в лимфоузлах в течение 2 дней, в плазме на 5 день (Reyes, Canfield et al. 2004). Развитие хронической и устойчивой инфекции Уникальность ВИЧ-инфекции заключается в том, что, несмотря на интенсивный клеточный и гуморальный иммунный ответ, вирус уничтожается не 32 полностью, а продолжает ограниченную репликацию, которая может протекать в течение 10 лет до развития клинических симптомов СПИДа). Существует несколько механизмов, позволяющих избежать уничтожения ВИЧ иммунной системой. В частности вирус обладает способностью мутировать. Другой важный механизм сопротивления элиминации вируса из организма, связан с тем, что в период первичной инфекции ВИЧ и в процессе ее перехода в хроническую форму происходит парадоксальное разделение активированных цитолитических Т-лимфоцитов от их предшественников. Причем это происходит не в лимфоидной ткани, где происходит репликация вируса, а в периферической крови. В течение длительного периода времени прогрессирующее снижение концентрации CD4+ Т-лимфоцитов не сопровождается какими-либо симптомами. Понимание этого привело к выделению фазы болезни, которая характеризуется как клиническая латентность, которая, однако, не является эквивалентной понятию патогенетической латентности, поскольку инфекция продолжает прогрессировать, несмотря на отсутствие клинических симптомов (Shah, Pirrone et al.). После различных периодов времени, обычно исчисляемых годами, концентрация CD4+ Т–лимфоцитов в крови падает до критического уровня (менее 200 клеток на 1 мл крови). Продолжительность стадии латентной ВИЧ-инфекции связана с сохранением количества CD4-лимфоцитов. Завершающей стадией ВИЧ-инфекцией является СПИД. Он проявляется летальными осложнениями в виде тяжелого течения оппортунистических инфекций и различных новообразований. Основным проявлением терминальной стадии ВИЧ-инфекции является СПИД-кахексия. Однако основной причиной смерти больных в терминальной стадии ВИЧ-инфекции является не вирус, а сопутствующие СПИДу заболевания (Milush, Reeves et al. 2007). Корреляция между высоким уровнем ИНФ I типа и низкой вирусной нагрузкой или высоким количеством CD4+ Т-клеток указывают на роль ИНФ в 33 контроле репликации ВИЧ. Было доказано на диком вирусе ВИЧ-1 in vitro и на примере мышиных моделях ex vivo, что ИНФ – α и – β имеют сильную противовирусную активность. ИНФ I типа может также оказывать косвенную противовирусную активность. ИНФ I типа повышает лизис инфицированных NKклеток, специфических цитотоксических Т-клеток или клеток Th1. Тип I и II ИНФ также индуцирует лизис инфицированных АПК-клеток, в том числе, ДК. Инкубация с живым или инактивированным вирусом ВИЧ, усиливает цитотоксичность в моноцитах, а также в ДК. Цитотоксичность опосредована частичным действием фактора некроза опухоли (ФНО) на апоптоз- индуцирующий лиганд (TRAIL), который заякорен на моноцитах и ДК ВИЧ– инфицированных. Уровень TRAIL в плазме ВИЧ-1 инфицированных пациентов коррелирует с вирусной нагрузкой. ИФН–α индуцируется в результате острой вирусной инфекции, в естественных условиях стимулирует антиген кросспрезентацию. Кросс-презентация CD8+ Т-лимфоцитов, вероятно, играет решающую роль в контроле репликации ВИЧ-1. Все эти защитные эффекты могут иметь пагубные последствия, особенно индукция апоптоза в неинфицированных CD4+ Т-клеток. Кроме того, I тип ИФН повышает экспрессию MHC-1, которое ингибуруется Nef-белком ВИЧ на всех типах клеток, включая ДК. Это может помочь сохранить презентацию CD8 + Т-лимфоцитов в вторичных лимфоидных органах (Muller-Trutwin and Hosmalin 2005). 1.7 Вирусные модели in vitro Коллективом авторов была разработана безопасная клеточная модель ВИЧинфекции на основе рекомбинантного лентивирусного вектора и культуры клеток человека HEK 293T (Е.В. Головин 2011). Она позволяет оценить процессы, происходящие с момента попадания вируса внутрь поражаемой клетки до интеграции генетического материала в ее хромосомный аппарат. Первый опыт ее создания показал, что инфекция достаточно хорошо и стабильно воспроизводится в культуре клеток человека HEK 293T. Модель позволяет оценить первые этапы патогенеза ВИЧ-инфекции (проникновение возбудителя в клетку, обратная 34 транскрипция, образование ПИК, интеграция его в хромосомный аппарат клетки). Это дает возможность определить наличие антиретровирусной активности у потенциальных и ныне используемых лекарственных препаратов.(Е.В. Головин 2011) Недавно была создана модель с применением плазмиды pREC_nfl_HIV-1 транспортный вектор, содержащий почти полный (nfl) геном ВИЧ и клеток HEK 293T, для изучения свойств ВИЧ (Dudley, Gao et al. 2009). Для изучения свойств вирусов, разработан метод субклонирования генов ВИЧ-1, фрагмента таких генов или всего генома в вектор, на основе дрожжевой культуры. Более 38 различных генов или кодирующих областей теперь могут быть вставлены в различные сайты pREC_nfl_ вектора HIV-1 посредством дрожжевых рекомбинаций. В общей сложности было собрано свыше 500 химерных вирусов содержащих гены вируса env, gag, и pol, а также другие кодирующие последовательности. Эти химеры планируется использовать для исследования препаратам. лекарственной Такой метод чувствительности бактериального к антиретровирусным клонирования предполагает трансфекцию клеток линии человека провирусной векторной ДНК с удаленным специфичным геном и материалом от больного ВИЧ-1, полученный при помощи ПЦР (Pandey and Grandgenett 2008). Гомологичная рекомбинация в клетках млекопитающих может помочь сконструировать полногеномный ВИЧ-1. Метод относительно прост, хотя и не лишен ряда недостатков: эукариотическая рекомбинация пока малоактивна, сложно восстановить клонированный геном, медленно проходит рекомбинация вируса (Schafer, Neffgen et al. 2008; Dudley, Gao et al. 2009). Вирусные модели in vivo. Одним из серьезнейших препятствий в исследовании ВИЧ-инфекции было отсутствие подходящей модели на небольших животных. Вирус поражает только людей и шимпанзе. Эксперименты на шимпанзе подвергаются протестам с этической стороны, и их использование и содержание в 35 лабораториях дорого. Для решения этого вопроса ученые разработали «гуманизированную» мышь. Она была создана в 2006 году доктором Гарсиа и его коллегами из Миннесотского университета (Denton and Garcia ; Martin-Padura, Agliano et al.). «Гуманизированная» мышь сразу стала самой передовой технологией для доклинического тестирования экспериментальных препаратов. Первые мыши для исследования ВИЧ были созданы благодаря скрещиванию мышей с врожденным иммунодефицитом и здоровых мышей. У полученной популяции мышей с иммунодефицитом практически не было иммунной системы, и они не могли отторгать человеческую ткань. Группе ученых удалось создать у мыши иммунную систему, схожую с человеческой, трансплантировав ей печень, клетки тимуса и костного мозга человеческого эмбриона (Joseph, Zheng et al. ; Sango, Joseph et al.). Такая модель позволила провести на мыши исследования, которые ранее были невозможны без подобной модели ВИЧ-инфекции in vivo (Joseph, Zheng et al.). В течение последнего десятилетия было получено несколько линий иммунодефицитных мышей для облегчения приживления иммунной системы человека и последующего инфицирования ВИЧ. Новая мышь является генетической химерой – ее иммунная система является человеческой, поэтому ее можно инфицировать ВИЧ. В 2009 году группа ученых под руководством доктора Гарсии-Мартинеза продемонстрировала, что антиретровирусные препараты, принятые до инфицирования ВИЧ, могут предотвратить передачу ВИЧ-2 половым путем у «гуманизированной» мыши. Это предполагает, что если у женщин есть повышенный риск заражения ВИЧ-инфекцией, то они могут ежедневно принимать препарат против вируса в целях профилактики. Такой метод профилактики является очень перспективным, так как эти препараты уже одобрены для лечения людей с ВИЧ, их безопасность уже хорошо изучена.(Joseph, Zheng et al. ; Sango, Joseph et al.) Недавно была создана новая линия «гуманизированной» мыши – NSG мышь. Из-за функционирования остаточного иммунитета, первые поколения этих линий поддерживали низкий уровень приживления клеток человека, полученных 36 из тимуса, печени и костного мозга. Из-за нехватки у последних поколений NSGмыши собственных зрелых иммунных клеток и низкого цитокинового ответа, человеческие стволовые клетки и мононуклеары периферической крови стали приживаться лучше (Joseph, Zheng et al.). 1.7.1 Рекомбинантные лентивирусы и биобезопасные модели ВИЧ-инфекции Данные о жизненном цикле ВИЧ были использованы для разработки лентивирусных векторных систем, которые имеют ряд преимуществ перед традиционными ретровирусными векторными системами (Liu and Berkhout 2009). По соображениям безопасности репликация некомпетентных лентивирусных векторных систем и риск возникновения репликации компетентного вируса была сведена к минимуму. Перспективным для генной терапии ВИЧ-инфекции может быть создание условно репликативного вида ВИЧ-1 в качестве безопасной живой вакцины, конструирование мини-вариантов ВИЧ, в качестве препаратов вирусной терапии против лейкемии, а также использование условно живого анти-ВИЧ вектора для генной терапии ВИЧ-инфекции. Были разработаны несколько векторов и проведены эксперименты на различных животных, моделирующих болезни человека. Хотя проблема безопасности, безусловно, останется за использованием репликации компетентных векторных систем на основе ВИЧ, некоторые из результатов в системах культур клеток являются весьма перспективными для лечения ВИЧ-инфекции и требуют дальнейшего тестирования на соответствующих животных моделях (Das, Jeeninga et al.). В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании различных этапов патогенеза ВИЧ-инфекции от момента слияния и интеграции вируса в клетку-мишень до момента репликации. В тоже время в литературе практически отсутствуют данные о роли различных органов и систем человека, в частности лимфоидного аппарата ЖКТ в патогенез ВИЧ-инфекции. Уже достаточно много изучены подходы в терапии и поиске новых антиретровирусных препаратов на различных моделях вирусной инфекции in vivo 37 и in vitro. Несмотря на большое количество публикаций, остается множество вопросов относительно избирательного инфицирования CD4+ клеток, в частности плазмоцитоидных дендритных клеток. Нами была выдвинута гипотеза, согласно которой пДК могут избирательно быть инфицированы ВИЧ, а так же накапливаться в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки. 38 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена в ГБОУ ВПО Казанский ГМУ Минздрава России и иммунологической лаборатории ГБУЗ «РЦПБ СПИД и ИЗ МЗ РТ», отдельные этапы работ проводились в отделе генных и клеточных технологий НОЦ фармацевтики и кафедре генетики института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО «Казанского (Приволжского) федерального университета». 2.1.Методы работы с клеточными культурами Характеристика предмета и объекта исследования. Объектом исследования являлись вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), мононуклеарные клетки периферической крови человека (МКПК), плазмацитоилные дендритные клетки (пДК). Исследование одобрено локальным этическим комитетом Казанского государственного медицинского университета (протокол №8 от 28 октября 2014 г). Клеточная линия МКПК — мононуклеарные клетки периферической крови человека, полученные из цельной крови здорового донора. Клеточная линия пДК– плазмоцитоидные дендритные клетки, полученные путем магнитной сепарации с помощью колонки для выделения MACS (Biotec). Данные клеточные линии являются суспензионными, поэтому для культивирования использовались культуральные принадлежности без адгезивных свойств. Все работы проводились в стерильных условиях ламинарного бокса II класса защиты SafeFAST Elite 215 S. 39 2.2 Выделение ВИЧ-1 из периферической крови человека Периферическую кровь от больных ВИЧ-1 получали из обсервационного отделения ГУЗ РКИБ РТ. Больные не принимали АРВТ последние 4 месяца перед забором крови. Возраст больных варьировался от 29 лет до 42 лет и среднее значение составило 35 лет. Сбор крови производился в вакутейнеры, содержащие гемоконсервант антикоагулянт цитрат фосфатный буфер декстрозы аденина (ЦФДА-1). Выделение мононуклеаров проходило сразу же после получения цельной крови. В качестве контроля использовали кровь здорового донора. Мононуклеарную фракцию выделяли в градиенте плотности фиколла (ρ=1,077 г/см3) по ранее описанной методике (Fuss, Kanof et al. 2009). Для этого в 50 мл пробирки добавляли раствор фиколла и аккуратно при помощи автоматического дозатора равный объем цельной крови. Проводили центрифугирование при 1900 об/мин в течение 30 минут при замедленном торможении, после чего получали разделение крови на фракции: плазма, кольцо лейкоцитов, фиколл и эритроциты. Кровь задерживается над фиколлом и не смешивается с ним, плазма образует верхний слой. Постепенно эритроциты склеиваются фиколлом и опускаются на дно пробирки. Гранулоциты, имеющие большую плотность, чем седиментирующий раствор, оседают вместе с эритроцитами. Аккуратно отбирали лейкоцитарную фракцию в чистую пробирку и отмывали стерильным раствором фосфатно-солевого буфера, модифицированного Дульбекко (ФСБД, ПанЭко) , в соотношении 1:2 при 1500 об/мин в течение 10 минут 2 раза. Для удаления эритроцитов клетки ресуспендировали в гипотоническом лизирующем буфере (0,168 M NH4Cl, 0,1M KHCO3, 1,27 мМ EDTA, pH 7,3). После проведения лизиса эритроцитов клетки отмывали в растворе ФСБД (ПанЭко). Таким же образом выделяли МКПК от здорового донора. МКПК от здорового донора культивировали в среде RPMI-1640 (ПанЭко), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки FBS (от англ. fetal bovine serum) (RAA), 1X раствор антибиотиков пенициллина и стрептомицина (100Ед/мл; 100 мкг/мл), (ПанЭко), 146 мг L-глутамина (ПанЭко) и 10 мг/мл 40 раствора фитогемаглютинина (ФГА) (ПанЭко), в течение 48 часов. После этого к культуре клеток добавляли МКПК крови человека, больного ВИЧ-инфекцией. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением интерлейкина-2 (ИЛ-2) (GenScript) в течение 5 дней при температуре 37° С, в CO2 инкубаторе (Hanneke S. 2005). Супернатант собирали, центрифугировали и измеряли титр при помощи иммуноферментного анализа на сердцевинный белок ВИЧ p-24 (Вектор Бест, Уфа). Полученный вирус аликвотировали по 1,5 мл микропробирки и хранили при -80º С. 2.3 Подтверждение наличия p24-антигена ВИЧ и определение титра вируса Супернатанты собирали в отдельные пробирки и хранили при -80°С. Для определения титра вирусного стока использовали набор для иммуноферментного выявления (ИФА) и подтверждения наличия антигена p24 ВИЧ-1 (Вектор Бест, Уфа). Сам метод основан на твердофазном иммуноферментном анализе. Принцип метода выявления заключается во взаимодействии антигена p24 ВИЧ-1 из исследуемого образца с моноклональными антителами, иммобилизированными в лунках полистиролового планшета. Связавшийся антиген выявляют с помощью биотинилированных анти-ВИЧ-1 антител и конъюгата стрептовидина с пероксидазой хрена (Вектор-Бест 2013). Подтверждение наличия белка p-24 вируса ВИЧ осуществляется методом конкурентного иммуноферментного анализа, основанного на принципе нейтрализации p-24-антигена специфическими антителами. Использовали 4 стрипа для проведения ИФА. 1. Во все лунки вносили по 50 мкл раствора для разведения образцов. 2. Далее вносили 150 мкл контрольных и исследуемых образцов супернатанта. Стрипы закрывали пленкой и инкубировали в термошейкере при 37° С 60 минут и 600 об/мин. 3. После инкубации содержимое дезинфицирующим раствором лунок собирали в емкость с 41 4. Лунки промывали 5 раз промывочным раствором ФСБ-Т 5. Во все лунки стрипов вносили по 100 мкл раствора конъюгата 1 6. Стрипы закрывали пленкой и инкубировали в термошейкере при 37° С 30 минут 7. Лунки стрипов промывали, как описано ранее 8. Вносили во все лунки 100 мкл раствора конъюгата 2 9. Стрипы закрывали пленкой и инкубировали в термошейкере при 37° С 60 минут 10. После окончания инкубации во все лунки стрипов вносили по 100 мкл раствора ТМБ. Стрипы выдерживали в защищенном от солнечного света месте при комнатной температуре 30 минут 11. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл стоп-реагента (Вектор-Бест 2013) 12. Через 2-3 минуты измеряли оптическую плотность. 13. Результаты регистрировали с помощью спектрофотометра (TECAN infinite M200PRO), измеряя оптическую плотность в двухволновом режиме: основной фильтр – 450 нм, референс-фильтр – в диапазоне 620-650 нм. 2.4 Инфицирование мононуклеарных клеток периферической крови человека полученным вирусом ВИЧ-инфекции От здорового донора была выделена культура клеток МКПК. К клеточной суспензии добавили стримулятора клеточной пролиферации фитогемаглютинина (ФГА, ПанЭко), в концентрации 10 МЕ на мл в среде RPMI 1640 (ПанЭко). Клетки культивировали 24 часа в CO2 инкубаторе при 37º С и 5% содержании CO2. На следующие сутки к культуре клеток добавили вирус иммунодефицита человека. Плашку с культурой клеток и вирусом инкубировали в CO2 инкубаторе при 5% содержании CO2 120 часов. 42 2.5 Проточная цитофлуорометрия мононуклеарных клеток периферической крови человека для определения количества ПДК и ВИЧ-инфицированных клеток Культуру клеток отмывали 2 раза центрифугированием при помощи стерильного раствора ФСБД (ПанЭко). Согласно (http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=flow), протоколу клетки фиксировали в 4% раствора параформальдегида и инкубировали 10 минут при 37º С. Затем к раствору добавляли холодный раствор метанола (ТатХимПродукт) и инкубировали 30 минут на льду. Добавляли 2 мл буфера для инкубации (0,5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 100 мл 1X фосфатно-солевого буфера (ФСБ)) и 2 раза отмывали центрифугированием с раствором ФСБД. Затем добавляли антитела, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом к специфичному маркеру пДК (FITC Anti-human CD303 (BDCA-2) Antibody, 2371035, BioLegend) и конъюгированные с фикоэритрином антитела к внутриядерному белку ВИЧ-1 p-24 (Santa Cruz, sc-69728). Инкубировали 1 час при комнатной температуре в темном месте. Результаты оценивали при помощи метода проточной цитометрии FACS Canto II, используя программу FACS Diva (BD Biosciences). 2.6 Выделение плазмоцитоидных дендритных клеток методом отрицательной магнитной сепарации Принцип работы основан на иммуномагнитном выделении клеток, с помощью иммуномагнитного сортера (Biotec). Биотин-конъюгированные моноклональные антитела прикрепляются к мононуклеарам, кроме пДК. Данные моноклональные антитела выступают в качестве основного агента маркировки, а анти-биотин моноклональные антитела, конъюгированные с микрошариками, в качестве вторичного агента маркировки. Магнитно-меченые не-пДК остаются на колонке MACS® в магнитном поле. В то время, как немаркированные дендритные клетки проходят через колонку. 43 От здорового донора было получено 10 мл гепаринизированной крови. Методом седиментации в градиенте плотности фиколла 1,077 г/л (ПанЭко) были выделены МКПК. Клетки были подсчитаны при помощи камеры Горяева для последующего использования в магнитной сепарации. Использовался набор для магнитной сепарации фирмы MACS (Miltenyi Biotec I) Plasmacytoid Dendritic Cell Isolation Kit. Клетки были разведены в буфере. Буфер состоит из фосфатносолевого раствора с pH 7.2, 0.5% раствора BSA (бычий сывороточный альбумин) и 2 мM EDTA (от англ. ethylenediaminetetraacetic acid). Раствор необходимо держать на льду при температуре 4°С во время всего проведения эксперимента. Клетки были подсчитаны в камере Горяева. После этого клетки центрифугировали при 300×g 10 минут, весь супернатант удаляли. Осадок был разведен в 400 мкл буфера. Затем добавили 100 мкл PDC Biotin-Antibody Cocktail, аккуратно ресуспензировали и инкубировали в холодильнике в течение 10 минут. После этого промывали клетки, добавляя 10 мл раствора-буфера, центрифугируя при 300×g в течение 10 минут. Супернатант удаляли и промывали еще раз. Далее клеточный осадок разводили в 400 мкл буфера и добавляли 100 мкл Anti-Biotin MicroBeads. Инкубировали 15 минут в холодильнике. Промыли клетки как описано выше. Клеточный осадок ресуспензировали и вносили в магнитную колонку. После магнитной сепарации, отфильтрованные клетки центрифугировали и производили подсчет в камере Горяева. Данные клетки представляли собой плазмоцитоидные дендритные клетки, содержащие поверхностный маркер CD303. 2.7 Прижизненная биопсия двенадцатиперстной кишки с помощью фиброгастродуоденосокопии Процедуру забора материала проводили на базе ГАУЗ РКИБ РТ им. Проф. А.Ф. Агафонова в отделении гастроскопии, совместно с заведующей отделением согласно протоколу проведения фиброгастродуоденоскопии (ФГДС) (Wies Langenberg, 1990,). У всех больных было взято добровольное согласие на проведение процедуры. 44 У 6 пациентов с диагнозом ВИЧ-инфекция и 6 пациентов из контрольной группы бла проведена ФГДС, с последующей прижизненной биопсией двенадцатиперстной кишки. Материал помещали в 30% раствор сахарозы для последующего проведения иммуногистохимического анализа. Информированное согласие было получено от каждого участника исследования в соответствии с протоколом (статья 20 Федерального закона "О праве граждан об охране здоровья Российской Федерации" N323- ФЗ, 11.21.2011) 2.8 Иммуногистохимические методы анализа 2.9 Подготовка образцов тканей для иммуногистохимического исследования 1. Биопсийные образцы были помещены в 10% забуференный раствор формалина. Материал выдерживали в этом растворе 24 часа при +4 °С. 2. После этого образцы промывали 3 часа в проточной воде. 3. Далее фрагмент ткани обезвоживали в последовательных разведениях этанола: 50% - 1 час, 70% - 2 часа, 80% - 1 час, 96% I - 30 мин, 96% II - 30 мин, 96% III – 12 часов. 4. На следующий день фрагмент ткани заливали в парафин Hystomix: абсолютный спирт I – 30 мин, абсолютный спирт II – 30 мин, абсолютный спирт/толуол в равных пропорциях – 20 мин, толуол II – 20 мин, толуол I – 20 мин, толуол III – 20 мин (37˚С), толуол/Hystomix в равных пропорциях – 25 мин (58˚С), HystomixI – 60 мин, Hystomix II – 60 мин,HystomixIII заливали в формы, которые затем охлаждали, излишки Hystomix обрезали. 5. Изготовляли блоки, которые нарезали на микротоме на срезы толщиной 5 мкм. Блоки закрепляли на предметных стеклах. Проводили депарафинизацию срезов в реагенте Roticlear I – 7 мин, Roticlear II – 7 мин, абсолютном этаноле – 5 мин, 96% этаноле – 5 мин, гидратировали дистиллированной водой 3 мин. 45 6. Стекла помещали в цитратный буфер (лимонная кислота 1,92 г, 1N NaOH до рН 6,0; 0,5 мл Tween 20, дистиллированная вода – до 1 литра) на 30 мин при 95˚С, после чего давали остыть в буфере. 7. Промывали ФСБ (ПанЭко). 2.10 Флуоресцентная иммуногистохимия Для обнаружения дендритных клеток и выяснения их фенотипа, серийные продольные срезы биопсии 12-персной кишки подвергали двойному иммуннофлуоресцентному окрашиванию (Akhtar R.S. et al., 2007). 1.Срезы регидратировали в ФСБ (ПанЭко) и 0,5% растворе Tween-20 (Applichem) в течение 5 мин. 2. Инкубировали срезы при комнатной температуре в увлажненной камере с 0,1% раствором Тритона Х-100 в течение 20 мин для пермобилизации мембраны. 3. Инкубировали с 10% нормальной сывороткой козы для блокирования неспецифического связывания вторичных антител в течение 30 мин в увлажненной камере, удаляли излишки сыворотки. 4. Наносили на срезы первичные антитела, инкубировали 1 час во влажной камере при комнатной температуре или в течение ночи при температуре +4°С. 5. Промывали срезы в растворе ФСБ (ПанЭко) и 0,5% Tween-20 3 раза по 5 минут 6. Инкубировали срезы со вторичными антителами, конъюгированными с флюорохромами в течение 2 часов. 7. Промывали срезы в ФСБ-Т 3 раза по 5 минут 8. Окрашивали ядра с помощью DAPI в течение 10 минут 9. Промывали срезы в растворе ФСБ (ПанЭко) и 0,5% растворе Tween-20 (Applichem) и заключали под покровное стекло с помощью водорастворимой монтирующей среды ImmuMount (Thermo Scientific Shandon). 46 Таблица 2 – Антитела, использованные в работе для иммунофлуоресцентного окрашивания срезов тканей и проточной цитофлуорометрии Название антитела Источник CD303-FITC, mouse anti- MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA Разведение 1:500 ИГХ human (антитела к пДК) (clone AC144) CD123-PE, mouse MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA 1:500 ИГХ anti‐Human (антитела к ИЛ-3) (clone AC145) CD80-PE, mouse Beckman Coulter, Brea, 1:500 ИГХ anti‐Human (антитела к Т- CA, USA лимфоцитам) (clone 2D10) CD4-PE, mouse MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA 1:500 ИГХ anti‐Human (антитела к Лимфоцитам) (clone VIT4) CD303-APC mouse anti- MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA 1:10 ПЦ human (clone AC144) CD123-PE Mouse MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA 1:10 ПЦ anti‐Human (clone AC145) CD45-PerCP Mouse Beckman Coulter, Brea, CA, USA 1:10 ПЦ anti‐Human (clone Ros220) CD4-PE Mouse MiltenyiBiotec, Auburn, CA, USA 1:10 ПЦ anti‐Human (clone VIT4) FITC – Fluorescein isothiocyanate, PE – phycoerythrin, APC – Allophycocyanin, PerCP – Peridinin chlorophyll, ПЦ – проточная цитометрия, ИГХ – иммуногистохимия. 47 Результат оценивали методом флуоресцентной микроскопии на приборе Axio Observer Z1 (Carl Zeiss) с компьютерной системой фотодокументации. Антитела, использованные в работе, представлены в таблице 2. 2.11 Окраска гематоксилином-эозином После проведения депарафинизации как описано выше, проводили окрашивание гематоксилином-эозином в два этапа согласно протоколу (Lynch MJ 1969). Одну каплю гематоксилина добавили на срез, после 2 минут остатки раствора удаляли фильтровальной бумагой. Окрашивали водным раствором эозина 4 минуты, затем промывали в трех порциях дистиллированной воды для удаления избытка эозина. Удаляли воду из срезов в одной порции 70 этанола, двух порциях 96° этанола. Экспозиция была в каждой порции спирта – 2 минуты. Просветляли срезы в двух порциях карболксилола – 1 минуту. Производили окончательное обезвоживание срезов в двух порциях ксилола или то луола 2 минуты. Заключали срезы в канадский бальзам (Lynch MJ 1969). 2.12 Проточная цитофлуорометрия образцов крови больных ВИЧ-инфекцией Венозную кровь собирали в пробирки, содержащие этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). Впоследствии, 100 мл цельной крови были проинкубированы с 5 мкл антител anti-human CD45-PerCP, anti‐human CD303‐APC и anti‐human CD123‐PE в течение 20 минут при комнатной температуре. Клетки анализировали методом проточной цитометрии FACS Canto II, используя программу FACS Diva (BD Biosciences). Для каждого образца было собрано по 300 000 событий. Плазмоцитоидные дендритные клетки были идентифицированы благодаря экспрессии CD45+, CD303+, CD123+. Использованные в работе антитела и их соотношения представлены в таблице 2. 48 2.13 Исследование апоптоза методом окрашивания Annexin-V FITC и PI. Через 120 часов культивирования МНПК с ВИЧ, клетки собирали центрифугированием 5 мин при 500 g, промывали два раза и окрашивали AnnexinV FITC PI (иодид пропидия (от англ. propidium iodide)) согласно инструкции фирмы-производителя (Sigma). 2.14 Программное обеспечение и статистический анализ результатов Данные представлены в виде среднее значение ± стандартная ошибка, уровень значимости p<0,05. Статистический анализ проводили с использованием теста Манна-Уитни U для сравнений между отдельными экспериментальными группами (инфицированных и неинфицированных). 49 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Получение и титрование ВИЧ «дикого типа» Для получения ВИЧ «дикого типа» использовали мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) человека, больного ВИЧ-инфекцией. Для этого с помощью градиентного центрифугирования из периферической крови в плотности фиколла были выделены ядросодержащие клетки. Выход составил порядка 5×104 клеток из 5 мл цельной периферической крови, при этом количество жизнеспособных клеток было не менее 95%. Аналогичным образом, была получена мононуклеарная фракция периферической крови здорового донора в количестве 5×104 ядросодержащих клеток, соответственно количеству МКПК больного ВИЧ. Впоследствии выделенные клетки стимулировали фитогемаглютинином (ФГА), добиваясь активации пролиферации клеток. Внесением МКПК ВИЧ-инфицированного пациента в культуру МКПК донора (ко-культивирование) добивались заражения здоровых клеток вирусом иммунодефицита человека. Инфицирование ВИЧ-1 через 72 часа ко- культивирования мононуклеарной фракции здорового и ВИЧ-инфицированного пациента было подтверждено по факту обнаружения вирусного сердцевинного белка ВИЧ-1 в супернатантах клеточных культур, что составляло 567 ± 106,0 пкг/мл. В ходе проведенной амплификации вируса в клетках периферической крови, нам удалось добиться увеличения его концентрации. Например, содержание белка p24 в супернатантах (n=3) мононуклеарной фракции периферической крови человека составляло 1100±116,0 пкг/мл и 2308±97,5 пкг/мл, на 5 день и 8 день, соответственно, что отражено в таблице 4. Таким образом, был получен и амплифицирован дикий (природный) изолят ВИЧ-1, который использовался в дальнейшей работе в титре 1100 пкг/мл. 50 Таблица 3 – Уровень вирусного белка ВИЧ р-24 в супернатантах МКПК 3 день 567 р24gag (пкг/мл) Известно, что одним 5 день ± 1100±116, 106,0 из 0 ключевых факторов, 8 день 2308±97,5 обеспечивающих инфицирование вирусом клеток, является экспрессия на поверхности клетокмишеней молекул CD4. Исследования последних лет показывают, что ДК могут играть важную роль в патогенезе ВИЧ-инфекции и в переносе вируса к T-клеткам (Novak N 2004). Тем не менее, способность ДК быть инфицированными ВИЧ-1 остается по-прежнему дискутабельной. В связи с вышеизложенным, представляло интерес оценить степень инфицирования ВИЧ-1 пДК в популяции МКПК и их способность поддерживать вирусную репликацию. Для решения поставленной задачи была проведена оценка уровня экспрессии ядерного белка ВИЧ-1 р-24 в пДК, входивших в состав МКПК. Клеточную культуру инкубировали 120 часов с изолятом ВИЧ-1. Для определения числа клеток с активной вирусной репликацией проводили окрашивание по CD303 (маркер плазмацитоидных ДК), меченых FITC и ядерному белку ВИЧ-1 p-24, меченых PE. При оценке числа продуктивно-инфицированных клеток методом проточной цитометрии было установлено, что процент p-24-позитивных клеток в общей популяции был менее 1% (Рисунок 2Б). Однако, число p-24-позитивных клеток в популяции плазмоцитоидных ДК (CD303-позитивных) составляло 51 98,28% (рисунок 2Г). Рисунок 3 – Проточная цитометрия мононуклеарных клеток периферической крови человека, зараженных изолятом ВИЧ-1. А. Точечная диаграмма SSCбоковое светорассеивание (от англ. Side Scatter, SSC). Мононуклеары периферической крови человека. Зеленое свечение - окраска на CD303 FITC, Красное свечение - окрашивание на белок p-24. Б. Точечная диаграмма флуоресценция клеток по CD303 – 0,69%. В. Точечная диаграмма флуоресценция клеток по p-24 красное свечение (зеленое параллельное свечение CD303) 7,31% от общего количества клеток; Г. Наличие белка p-24 в плазмоцитоидных дендритных клетках – 98,28%. Инкубация 120 часов. 52 3.2 Плазмоцитоидные дендритные клетки в периферической крови пациентов с ВИЧ-инфекцией Учитывая полученный нами факт возможности инфицирования ВИЧ-1 популяции пДК in vitro, было решено провести сравнительный анализ количества пДК в периферической крови доноров и ВИЧ-инфицированных пациентов. Для решения поставленной задачи проводили окрашивание периферической крови доноров и ВИЧ-инфицированных лиц с помощью меченных антител (мАТ) к CD303-APC (маркер пДК) и CD123-PE (рецептор ИЛ-3). Были выявлены существенные различия в количестве циркулирующих плазмоцитоидных дендритных клеток между контрольной группой ВИЧинфицированными пациентами (рисунок 4). Количество пДК у больных ВИЧинфекцией составило 0,044±0,084, в то время как у контрольной группы это число составило 0,093±0,014 (p=0,0031). Таким образом, уровень пДК по маркеру CD303 у здоровой группы в 2 раза выше, чем у ВИЧ-инфицированных лиц. В данной работе было исследовано 23 больных с диагнозом ВИЧ-инфекция (таблица 4); 8 из которых были женщины (36%) и 15 (64%) мужчин. Средний возраст составил 35,6 лет. Пути передачи инфекции включали половой контакт 10 случаев (48%) и гемоконтактный путь в 13 случаях (52%). При этом 16 больных (69,5%) получали противовирусное лечение, в то время как 7 пациентов (30,4%) не принимали антиретровирусную терапию (АРВТ). В АРВТ входили нуклеозидные и не нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы, а так же ингибиторы протеазы. Средняя вирусная нагрузка составила 412,1±342 копий/мл (n=23), в 8 случаях (34,7%) имели вирусную нагрузку выше, чем 250 копий/мл; в 12 случаях (52,1%) имели вирусную нагрузку менее 200 копий/мл. Среднее количество CD4+ клеток было 306,1±56 клеток/мл (n=23). По мере развития заболевания, у некоторых больных диагностировались оппортунистические инфекции, среди которых были кандидоз, волосистая лейкоплакия и туберкулез, что соответствует 3 и 4 стадиям заболевания ВИЧ-инфекцией по И.В. Покровскому. 53 Рисунок 4 – Количественная оценка плазмоцитоидных дендритных клеток в крови больных ВИЧ-инфекцией. А – Точечная диаграмма, флуоресценция клеток крови, окрашенных антителом к маркеру CD303-APC, пациенты из контрольной группы. Б – Точечная диаграмма флуоресценции клеток крови по CD303-APC и CD123PE, пациенты из контрольной группы. В – Точечная диаграмма SSC-боковое светорассеивание, флуоресценция клеток крови, окрашенных антителом к маркеру CD303-APC, пациенты с ВИЧ-инфекцией. Г – Точечная диаграмма флуоресценции клеток крови по CD303-APC и CD123-PE, пациенты с ВИЧинфекцией. В контрольной группе было 10 здоровых людей. Средний возраст 26,5 лет, среди которых 3 женщины (30%) и 7 мужчины (70%). Все лица контрольной группы не имели каких-либо инфекционных заболеваний, а результаты лабораторных исследований на ВИЧ-1 были отрицательными. Было установлено, что по мере 54 прогрессирования заболевания у больных существуют достоверные различия в количестве пДК в крови, Ткр≤0,01. Чем тяжелее стадия заболевания, тем количество пДК в крови снижается. В исследуемую группу вошли 23 ВИЧ-инфицированных пациента, в группу сравнения – 10 здоровых контролей. Таблица 4 - Клинические данные больных ВИЧ-инфекцией Номер пол Стадия Стаж АРВТ заболе вания (лет) Количество CD4 (клеток/мл) ВИЧ РНК коп/мл Уровень пДК % Сопутст вующие заболева ния 55430 М 3 1 нет 378 0 0,1004 нет 393954 М 3 1 нет 901 1500 0,1180 ХВГС 407587 М 3 1 нет 788 142100 0,0714 ХВГС 386599 М 3 2 да 285 330 0,1153 ХВГС 310865 М 3 2 нет 346 233900 0,0949 Туберку лез легких 300718 М 3 5 да 384 0 0,0666 нет 514 62971 0,094433 Среднее значение 7332 Ж 3 2 да 306 568 0,0405 ХВГС 108688 М 4а 9 да 72 0 0,053 нет 74557 М 4а 12 да 34 784700 0,0149 Туберку лез легких 74049 М 4Б 10 да 91 2400 0,0563 Туберку лез легких 72982 М 4Б 12 да 509 0 0,02 ХВГС, волосист ая лейкопл акия 64794 М 4Б 13 да 371 45400 0,1197 ХВГС, туберкул ез легких 55 Продолжение таблицы 4 Номер пол Стадия Стаж АРВТ заболе вания (лет) Количество CD4 (клеток/мл) ВИЧ РНК коп/мл Уровень пДК % Сопутствующи е заболевания 75713 М 4Б 12 да 867 0 0.0525 ХВГС, волосистая лейкоплакия языка 132665 М 4В 2 да 55 762500 0.0139 Туберкулез легких и периферически х лимфоузлов 799 М 4В 3 нет 222 4566 0.0264 Туберкулез легких 277 199945 0,044588 Среднее значение 109315 ж 4а 9 да 89 1222 0,0534 нет 399 ж 4а 9 нет 45 1544 0,0628 нет 74601 ж 4а 12 да 54 2600 0,0836 Туберкулез легких 399604 ж 4Б 1 да 410 0 0.0539 ХВГС, волосистая лейкоплакия языка 408512 ж 4Б 1 нет 22 113500 0,0248 Туберкулез легких 14750 ж 4Б 2 да 3 257800 0,0074 Туберкулез легких 39001 ж 4В 1 да 23 13345 0,0148 ХВГС, туберкулез легких 92,2 55716 0,042957 6 420800 0,0130 Среднее значение 85521 м 5 11 да ХВГС Важно отметить, что были обнаружены статистически значимые различия между группами по некоторым клинико-лабораторным показателям, а именно по снижению 56 количеств пДК и CD4-клеток в крови у ВИЧ-инфицированных пациентов по сравнению с контролем (таблица 4). Был также проведен корреляционный анализ для оценки возможной взаимосвязи между количеством пДК и уровнем вирусной нагрузки, который не выявил статистически значимых различий между этими показателями. В то же время, была обнаружена взаимосвязь между количеством пДК и стадией заболевания, что позволяет говорить об уменьшении количества пДК в зависимости степени тяжести заболевания. Клинические данные больных ВИЧ - инфекцией Более половины пациентов были мужчины, инфицированные гемо- контактным путем. Большинство пациентов находились в 3 стадии ВИЧинфекции по классификации В.И. Покровского, 2001, и имели выраженную степень иммунносупрессии. Самыми распространенными клиническими маркерами иммунодефицита были туберкулез различной этиологии (39%) и волосистая лейкоплакия языка (13%). При исследовании показателей уровня содержания дендритных клеток в зависимости от прогрессирования ВИЧ-инфекции было выявлено, что при нарастании лабораторных признаков иммуносупрессии показатели количества пДК снижаются. Статистически значимые эти различия были для подгрупп пациентов между мужчинами, находящимися в 3 стадии ВИЧ и контролем. Было показано, что уровень CD4, пДК, коррелирует с уровнем вирусной нагрузки. Так же наблюдались достоверные различия между контрольной группой неинфицированных людей и больных ВИЧ-инфекцией пациентов (p≤0,01), у женщин с диагнозом 4 стадия ВИЧ по классификации В.И. Покровского, 2001. Если две сравниваемые совокупности подчинялись закону нормального распределения, использовали критерий Стьюдента, если нет, то критерий МаннаУитни. 57 Таблица 5 – Соотношение количества дендритных клеток к вирусной нагрузке РНК ВИЧ коп/мл Уровень пДК % М (ср.откл)/Ме М (ср.откл)/Ме CD4 Больше 500 70803,53 (750) 0,04 (0,06195) n=4 CD4 200-500 n=8 CD4 Менее 81639,74 (449) 200 307777,02 (13345) 0,04 (0,08075) 0,03 (0,0248) n=11 Рисунок 5 – Соотношение пДК к общему количеству лимфоцитов в процентах. Среднее количество пДК в случае ВИЧ-инфицированных 0,044 ± 0,084, для контроля это значение составило 0,093 ± 0,014 (р = 0,0031). 3.3 Плазмоцитоидные дендритные клетки в двенадцатиперстной кишке у ВИЧ-инфицированных пациентов Полученные нами данные убедительно свидетельствуют о снижении количества пДК в периферической крови у ВИЧ-инфицированных пациентов. 58 Данный факт может быть обусловлен как интенсивной гибелью данной популяции клеток в результате ее непосредственного инфицирования ВИЧ-1, либо являться следствием перераспределения клеток в лимфоидную ткань желудочно-кишечного тракта. Для выяснения правомочности данных предположений были предприняты следующие исследования. Таблица 6 – Подсчет количества плазмоцитоидных дендритных клеток в микроскопическом поле иммуногистохимического среза у больных ВИЧ и контроля Участок гистологического среза 1 2 3 4 5 Сумма Участок гистологического среза 1 2 3 4 5 Сумма На Контроль 1 2 1 1 3 2 0 5 1 1 1 1 6 10 Больные ВИЧ первом распределения 3 4 5 6 2 4 1 0 2 9 3 3 1 3 1 11 1 0 3 2 2 8 2 4 2 5 2 15 Среднее Среднее 1 2 3 4 5 6 10 12 15 9 9 18 12 7 14 15 14 18 16 12 17 10 17 10 10 15 10 13 11 13 11 11 7 17 13 11 59 57 63 64 64 70 этапе были предприняты эксперименты по пДК в слизистой оболочке кишечника, 61,4/4,5 изучению а именно двенадцатиперстной кишки. С этой целью была проведена прижизненная биопсия двенадцатиперстной кишки доноров и ВИЧ-инфицированных пациентов. Для идентификации дендритных клеток двенадцатиперстной кишки было проведено в слизистой оболочке иммуногистохимическое окрашивание срезов биопсийного материала двенадцатиперстной кишки у 6 пациентов с ВИЧ-инфекцией и 6 пациентов из контрольной группы с 59 последующим фенотипированием биопсийного материала на маркеры CD303, CD123, CD80 и CD4. Результаты инфильтрации проведенного плазмоцитоидными исследования дендритными выявили признаки клетками ткани двенадцатиперстной кишки у больных ВИЧ-инфекцией (рисунок 7). На рисунке 7 А, Б, В, Г, Д, Е у больных ВИЧ-инфекцией в слизистой двенадцатиперстной кишки хорошо видна экспрессия маркера пДК CD303 (зеленое свечение). Этот факт может свидетельствовать о том, что миграция пДК из периферической крови происходит в ткань ЖКТ, в данном случае в двенадцатиперстную кишку. Напротив, в контрольной группе (рисунок 7) не наблюдалось инфильтрации пДК в кишечнике. Для дальнейшего изучения пДК в патогенезе ВИЧ-инфекции были проведены эксперименты по исследованию фенотипа ДК и активации Т-клеток, что отражено ниже. Рисунок 6 – Экспрессия маркера пДК CD303 в слизистой кишечника 12перстной кишки у ВИЧ-инфицированных пациентов. Значение р<0,01. 60 Рисунок 7 – Анализ экспрессии плазмоцитоидных дендритных клеток в двенадцатиперстной кишке больных ВИЧ. A-Е. Инфильтрация плазмоцитоидными дендритными клетками – экспрессия CD303-FITC (зеленое свечение) двенадцатиперстного отдела кишечника у 6 пациентов с ВИЧ- 61 инфекцией. Д-Н. Биопсия от здоровых людей Отсутствие инфильтрации плазмоцитоидными дендритными клетками. Масштаб шкалы 20 мкм. В таблице 6 и на рисунке 6 отражена количественная оценка пДК между здоровым контролем и больными ВИЧ-инфекцией в слизистой желудочнокишечного тракта. Случайным образом были выбраны пять микроскопических полей для каждого из субъекта. Количество пДК у ВИЧ-инфицированных в слизистой кишечника было в 6 раз больше по сравнению с контролем (р <0,0051). Окрашивание гистологических срезов гематоксилин-эозином Контрольная биопсия от здорового человека; Б. Интенсивное окрашивание гистологического среза слизистой двенадцатиперстной кишки больного ВИЧинфекцией. Окрашенные срезы на гематоксилин-эозин слизистой двенадцатиперстной кишки от больных ВИЧ-инфекцией и биопсии от здоровых людей показывают, что срез слизистой был на уровне крипт. Визуально обнаруживается большое количество окрашенных ядер в гистологическом препарате у ВИЧ-инфицированных пациентов. Рисунок 8 – Гистологические срезы слизистой двенадцатиперстной кишки больного ВИЧ-инфекцией, окрашенные гематоксилин-эозином. А. 62 Рисунок 9 – Анализ активации маркеров плазмоцитоидных дендртитных клеток и лимфоцитов в двенадцатиперстной кишке у больных ВИЧ-инфекцией. Экспрессия маркера плазмоцитоидных дендритных клеток CD303 (зеленое свечение) и маркера лимфоцитов CD4 (красное свечение) в 12-перстной кишке у больных ВИЧ-инфекцией (A,Б) и контрольной группы (Г,Д). В,Е – Объединение изображений. Масштаб шкалы 20 мкм. На рисунке 9 показано, что дендритные клетки в двенадцатиперстной кишке у больных ВИЧ-инфекцией экспрессируют маркер плазмоцитоидных дендритных клеток, а именно CD303 (A) и маркер лимфоцитов CD4 для связывания с вирусом ВИЧ-1 (Б). 63 Рисунок 10 – Анализ экспрессии CD303/CD123 и CD303/CD80 в биопсийном материале двенадцатиперстной кишки. Экспрессия маркера плазмоцитоидных дендритных клеток CD303 (зеленое свечение) (А) и 64 маркера CD123 (красное свечение) (Б) в двенадцатиперстной кишке у больных с ВИЧ-инфекцией) и контрольной группы (Г,Д). В,Е – Объединение изображений. Двойное окрашивание на маркер CD303 (зеленое свечение) и CD80 (красное свечение) (З) у больных ВИЧ-инфекцией и в контрольной группе (К,Л). И,М – Объединение изображений. Масштаб шкалы 20 мкм. Двойное окрашивание биопсийного материала двенадцатиперстной кишки от ВИЧ-инфицированных больных показало, что все CD303 положительно окрашенные клетки, также положительны по маркеру активации T-лимфоцитов CD80. При этом в группе больных ВИЧ-инфекцией значительно ниже количество CD123 положительных клеток (рецептор ИЛ-3), чем в группе контроля (рисунок 10). Это результат косвенно свидетельствует о снижении продукции ИЛ-3 клетками пДК. Рисунок 11 – материале Анализ ко-экспрессии CD 303 и CD11c в биопсийном двенадцатиперстной кишки больного ВИЧ-инфекцией. Экспрессия маркера CD303 (зеленое свечение) (А) и CD 11c (красное 65 свечение) (Б) и контрольной группы (Г, Д). В, Е – Объединение изображений. Масштаб шкалы 20 мкм. Незначительная популяция костномозговых клеток-предшественников ДК, так же экспрессируют маркер мДК CD11c. Таким образом обнаружено, что большинство пДК в двенадцатиперстной кишке в биоптатах от ВИЧинфицированных больных экспрессируют CD11c+ (рисунок 9 A – В); Однако, CD303+/CD11c+ позитивные клетки не были обнаружены у здоровых людей (Рисунок 11 Г - Е). Рисунок 12 – Анализ ко-экспрессии маркеров CD303 и CD56 в биопсийном материале двенадцатиперстной кишки у больного ВИЧ-инфекцией. Экспрессия маркера CD303 (зеленое свечение) (А) и CD 56 (красное свечение) (Б) и контрольной группы (Г,Д). В,Е – Объединение изображений. Масштаб шкалы 20 мкм. Предыдущие исследования показали, что в ЖКТ при ВИЧ-инфекции происходят патологические процессы, такие как проникновение 66 микроорганизмов из слизистой ЖКТ в кровь и наоборот. Но механизмы этого процесса до сих пор не изучены. У пДК есть способность распознавать фенотип цитотоксических Т-лимфоцитов и лизировать клетки-мишени посредством механизма с задействованием гранзима B. В двенадцатиперстной кишке пДК активируют гранзим B. Наличие гранзима B во время ВИЧ-инфекции может способствовать повреждению слизистой кишечника. Биопсийный материал от больных ВИЧ-инфекцией и контроль исследовали на ко-экспрессию маркера пДК CD303 и гранзима B. В результате наблюдается значительное увеличение ко-экспресии CD303 +/ гранзим B в группе ВИЧ-инфицированных, как показано на рисунке 13 А - В. Рисунок 13 – Анализ ко-экспрессии CD 303 и гранзима B в биопсийном материале двенадцатиперстной кишки больного ВИЧ-инфекцией. Экспрессия маркера CD303 (зеленое свечение) (А) и Гранзим B (красное свечение) (Б) и контрольной группы (Г,Д). В,Е – Объединение изображений. (Масштаб шкалы на всех фотографиях 20 мкм) 67 В группе контроля наблюдалось отсутствие иммунореактивности (Рис. 13 ГЕ). Известно, что грaнзим B активирует маркер CD56, дополнительно были исследованы образцы кишечника на ко-экспрессию маркеров CD56 и CD 303. Показано, что у больных ВИЧ-инфекцией в ЖКТ имеет место ко-экспрессия маркеров CD303/CD 56 (Рисунок 12 А - В). В контрольной группе коэкспрессии CD303 + / CD56 не наблюдалось + (Рисунок 12 Г - Е). Рисунок 14 – Анализ ко-экспрессии маркера CD303 и Ki-67 в двенадцатиперстной кишке больного ВИЧ-инфекцией. Экспрессия маркера CD303 (зеленое свечение) (А) и Ki-67 (красное свечение) (Б) контрольной группы и у больных ВИЧинфекцией (Г,Д). Б,Е – Объединение изображений. (Масштаб шкалы на всех фотографиях 20 мкм) Обнаружено положительное окрашивание на маркеры CD303+ / Ki-67+ (клеточный маркер пролиферации) в биоптатах слизистой двенадцатиперстной кишки ВИЧ-инфицированных пациентов (Рисунок 14 68 Г,Д), по сравнению с данными в контрольной биопсии (Рисунок 14, A,B).. Появление маркера Ki-67 происходит в конце фазы G1 клеточного цикла, его уровень постепенно нарастает на протяжении S-фазы и достигает максимума к митозу. Увеличение экспрессии клеточного маркера пролиферации Ki-67 говорит о пролиферации и делении пДК в желудочно-кишечном тракте ВИЧинфицированных пациентов. 3.4 Оценка жизнеспособности культур клеток, инфицированных ВИЧ-1 Учитывая многочисленные и порой противоречивые данные об имеющихся нарушениях в регуляции программы апоптоза в инфицированных клеточных популяциях, а также принимая во внимание полученный нами факт значительного снижения количеств пДК у ВИЧ-инфицированных лиц, представляло интерес изучение возможных механизмов гибели пДК при ВИЧ-инфекции. Чрезвычайно низкий процент пДК в культурах МКПК доноров, а также высокая вероятность межклеточных взаимодействий между различными популяциями клеток, входящих в состав МКПК, изучение механизмов гибели пДК в результате их инфицирования ВИЧ-1 предполагало выделение ―чистой‖ популяции пДК. 3.5 Оценка уровня инфицирования ВИЧ культуры плазмоцитоидных дендритных клеток Из МКПК здорового донора при помощи магнитной сепарации была выделена чистая линия пДК. При культивировании была продемонстрирована хорошая жизнеспособность клеточной линии. При инфицировании ВИЧ пДК показали низкую инфицируемость по сравнению с инфицируемостью в культуре клеток МКПК и данная клеточная культура не смогла оправдать ожидания в изучении ВИЧ. 69 Рисунок 15 – Изолированная культура дендритных клеток после инфицирования ВИЧ. 120 часов после инфицирования. Комбинация аннексина – V FITC/PI позволяет разделить три различные фенотипа: живые клетки, они не связываются с меткой, апоптозные клетки связываются только с аннексином – V FITC, некротические клетки связываются с аннексином – V FITC и PI. Используя набор Annexin – V FITC/PI для окрашивания МКПК, после 120 часов инкубирования с вирусом, показало, массовую гибель клеток по механизму апоптоза на поздней стадии (гейты Q2 на Рисунок 14), а количество клеток, подвергающихся гибели по механизму апоптоза на ранней стадии и некроза в контроле и после инфицирования ВИЧ-1 существенным образом не отличалось друг от друга. 70 Рисунок 16 – Проточная цитофлуорометрия МКПК, после инфицирования ВИЧ на явления апоптоза. Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Sigma). 120 часов. A – контроль культуры клеток МКПК без вируса. Ранний апоптоз (Q1) – 7,5%, Поздний апоптоз (Q2) - 2%, Живые клетки (Q3) – 89,1 %, Некроз (Q4) – 1,4%; B – Культура клеток МКПК, после инфицирования ВИЧ, 120 часов PI. Ранний апоптоз (Q1) - 10%, Поздний апоптоз (Q2) - 23,1%, Живые клетки (Q3) - 62,9 %, Некроз (Q4) - 4% 71 ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Дендритные клетки (ДК) играют важную роль в иммунологическом распознавании вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Различают две основные популяции ДК: миелоидные и плазмоцитарные. Важно отметить, что эти две популяции ДК отличаются между собой по механизму распознавания антигена и презентации его эффекторным клеткам. Например, если миелоидные ДК (мДК) после распознавания антигена мигрируют в лимфатический узел, где представляют антиген активированным лимфоцитам, то плазмоцитарные ДК (пДК) процессируют и представляют антиген в инфекционном очаге и не мигрируют в региональные лимфатические узлы (Groot, van Capel et al. 2006). Однако, было показано, что ВИЧ способен использовать ДК для поддержания вирусной репликации. Так например, работа Катрин Джонс и коллег показала, пДК могут служить резервуаром для ВИЧ in vitro (Kathryn S Jones 2011). Незрелые ДК после встречи с инфекционными агентами и микроорганизмами становятся активированными и мигрируют в лимфатические узлы, где стимулируют нативные Th клетки (Tel, Smits et al. 2012). Бин Су и соавторами было показано, что ВИЧ-инфицированные пДК, при ко-культивировании с активированными Т-клетками человека, способны передавать вирус ВИЧ Тлимфоцитам in vitro. Этими же авторами был подтвержден факт, что пДК инфицируются вирусом значительно выше в присутствии CD4 Т-клеток, по сравнению с отдельным культивированием пДК с вирусом Эти данные свидетельствуют о роли пДК в патогенезе ВИЧ-инфекции не только как переносчика инфекции, но и поддержании постоянного резервуара вируса в организме. Кроме того наши исследования так же показали, что клетки пДК человека чувствительны к заражению ВИЧ in vitro. Нами было показано, что 72 после инкубации мононуклеарных клеток периферической крови от здорового донора с ВИЧ in vitro, процент инфицированных пДК составил 98,28%, что подтверждает приоритетное инфицирование пДК вирусом. Циркулирующие пДК составляют около 0,5% всех лейкоцитов в крови здорового человека. Кроме того, существует фракция пДК расположенных преимущественно в лимфоидной ткани желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей (Lombardi and Khaiboullina ; de Heer, Hammad et al. 2004; Kingham, Chaudhry et al. 2007). Во время воспалительных процессов количество пДК обычно значительно увеличивается (Bromley, Iaboni et al. 2001; Kapsenberg 2003). Активированные пДК способны высвобождать провоспалительные цитокины (Sabado, O'Brien et al.). Однако, при различных патологических состояниях пДК способны мигрировать в пораженные ткани. Например, было показано увеличение миграции пДК в кожу у больных СКВ (Chan, Nie et al.). Так же увеличение количества пДК в кишечнике у больных с синодромом хронической усталости . Интересно, что увеличение тканевой фракции пДК сопровождается снижением количества этих клеток в циркулирующей крови. Измененное распределение пДК у ВИЧ-инфицрированных животных было показано Маллере с соавторами (Malleret, Maneglier et al. 2008). Эти данные получили дальнейшее подтверждение в исследованиях Брауна с соавторами, которые наблюдали быстрое снижение циркулирующих пДК, этот факт подтверждает их миграцию в лимфатические узлы (Brown, Wijewardana et al. 2009). Уменьшение количества циркулирующих пДК было так же показано у больных ВИЧ. (Sabado, O'Brien et al. ; Schmidt, Scott et al. 2004; Schmidt, Fujimura et al. 2006). Было высказано несколько гипотез, объясняющих снижение количества циркулирующих пДК при ВИЧ-инфекции, включая возможность цитопатического эффекта вируса на пДК, а так же возможное перераспределение пДК в ткани (Yamakami, Honda et al. 2004; Muller-Trutwin and Hosmalin 2005; Mavilio, Lombardo et al. 2006; Swiecki, Gilfillan et al. 2010). Нами были проведены исследования по выяснению распределения пДК в организме ВИЧ- 73 инфицированных больных. В диссертационной работе отражены данные о том, что в крови пациентов с ВИЧ-инфекцией количество циркулирующих пДК в 2 раза меньше, чем в контрольной группе. Эти данные подтверждают данные, полученные другими исследователями. Более того, нами было показано, что снижение циркулирующих пДК связано с их перераспределением в ткани ЖКТ. Так с помощью метода иммуногистохимии нами было выявлено, 6 кратное увеличение количества пДК увеличено в слизистой двенадцатиперстной кишки у ВИЧ-инфицированных лиц по сравнению с контролем. данные совпадают с результатами, полученными Интересно, что наши при исследовании распределения пДК при вирусе иммунодефицита обезьян. Известно, что пДК инфильтрируют колоректальную область ЖКТ у макак-резусов, инфицированных ВИО в остром периоде заболевания (Kwa, Kannanganat et al.). Схожие результаты были показаны Ривзом с коллегами, где сообщалось о повышенном накоплении пДК слизистой кишечника у обезьян с ВИО (Reeves, Evans et al.). Кроме того, Ли и коллеги наблюдали четырехкратное увеличение пДК в лимфатических узлах тонкого и толстого кишечника макак-резусов, инфицированных вирусом ВИО (Liu and Berkhout). Миграция CD4+ лимфоцитов в ткань объясняется повышением экспрессии хоуминг-рецептора CD103 (Reeves, Evans et al.). Таким образом, нами было показано перераспределение пДК в организме ВИЧ-инфицированных пациентов. Наши данные совпадают с опубликованными результатами, полученными на модели инфекции у животных. (Bruel, Dupuy et al. 2014). Но еще не было показано, какой фенотип могут иметь пДК мигрировавшие в слизистую пДК ВИЧ-инфицированного больного. Во время хронической стадии ВИЧ-инфекции, пДК уменьшают продукцию ИНФ (Tilton, Manion et al. 2008). пДК из костного мозга не могут производить ИНФ I типа, так же как зрелые пДК. Они имеют фенотип, отличный от зрелых циркулирующих пДК, который зависит от стадии их дифференцировки (MartinMartin, Almeida et al. 2009). В связи с этим фактом, было исследовано на каких 74 стадиях дифференцировки могут находиться пДК в организме больного ВИЧинфекцией. Различают три стадии развития и дифференцировки пДК. На всех стадиях развития пДК экспрессируют маркер CD123 . Этот маркер является рецептором для ИЛ - 3α, который служит ростовым фактором для пДК (Fonteneau, Larsson et al. 2004). Кроме того, экспрессия маркера CD184 (CXCR4) обнаружена на всех трех этапах развития пДК. Однако экспрессия других маркеров изменяется в зависимости от стадии дифференцировки. Так например, экспрессия CD4 отсутствует у пДК, находящихся на 1 стадии дифференцировки. Однако, на поздних стадиях пДК, характеризуется экспрессией CD4, стадия II, III (MartinMartin, Almeida et al. 2009). Известно, что ВИЧ использует CD4 и СD 184 для проникновения в клетку-мишень. Поэтому можно сделать заключение, что пДК могут быть мишенью для ВИЧ и инфицирование возможно через связывание с CD184 и CD4 рецепторами этих клеток. Наши результаты по инфицированию лейкоцитов человека подтверждают это предположение. Поскольку экспрессия CD184 и CD4 рецеторов обнаруживается начиная со II стадии дифференцировки, возможно, что инфицирование пДК происходит на поздних стадиях развития этих клеток. В диссертационной работе было показано, что пДК в двенадцатиперстной кишке экспрессируют маркер Ki-67, который отсутствует у пДК в контрольной группе. Интересно, что эти результаты соответствуют данным, полученным у макак циномолгус, зараженных ВИО, где пДК, находящиеся в ЖКТ экспрессируют клеточный маркер пролиферации Ki-67 (Bruel, Dupuy et al. 2014). Однако нами, впервые была показана экспрессия Ki-67 у пДК у человека. Известно, что пДК в крови не делятся, а клетки в ЖКТ у обезьян, возможно являются предшественниками из костного мозга. Экспрессия белка Ki-67 связана с пролиферацией клеток. Известно, что белок Ki-67 участвует во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2 и митоз) и отсутствует в покоящихся клетках (G0), поэтому его можно считать маркером клеточной пролиферации. Присуствие 75 Ki-67 на поверхности пДК в ткани кишечника у ВИЧ-инфицированных лиц свидетельствует о их недавней пролиферативной активности, а следовательно, можно предположить, что эти пДК являются свежей генерацией только что мигрироваршей из костного мозга (Scholzen and Gerdes 2000; Brown, Wijewardana et al. 2009). Увеличение экспресии ко-стимулирующей молекулы В7 (CD80) было показано у ВИЧ-инфицированных клеток in vitro. (Fonteneau, Larsson et al. 2004); Однако было показано, что пДК, циркулирующие в крови здоровых или ВИЧ инфицированных пациентов в небольшом количестве экспрессируют CD80. В ходе анализа литературы были обнаружены данные, что пДКнаходящиеся в слизистой кишечника активно экспрессируют маркер CD80. Полученный результат может свидетельствовать о более активированном состоянии пДК, в ткани кишечника у ВИЧ-инфицированных больных, по сравнению с клетками циркулирующей крови этих же больных. В литературных источниках описано, что зрелые ДК способны активировать Т-лимфоциты и в зависимости от степени зрелости ДК и плотности экспрессируемых молекул для взаимодействия зависит прочность и длительность контакта между клетками. В дальнейшем активированный Т-лимфоцит отделяется от ДК для выполнения эффекторных функций (Воронкова О.В. 2010). В пролиферации Т-лимфоцитов играет роль маркер CD11c , а так же в развитии иммунологической толерантности (Grassi, Hosmalin et al. 1999). В литературе, имеются данные о том, что в крови ВИЧинфицированных больных снижается процент процент CD11c позитивных ДК. Однако, не было обнаружено корреляции между уровнем экспрессии CD11c на циркулирующих ДК, вирусной нагрузкой, клиническими данными и количеством CD4+ клеток у больных зараженных ВИЧ. Более того, количество CD11с позитивных клеток в крови больных ВИЧ не менялось, несмотря на проводимое АРВТ лечение (Grassi, Hosmalin et al. 1999). Экспрессию интегрина СD11c у ВИЧ-инфицированных больных в слизистой двенадцатиперстной кишки при иммуногистохимическом анализе ранее не проводили и наши . результаты 76 выявили экспрессирую данного маркера в большом количестве. Нами было показано, что пДК перераспределяются из циркуляции в слизистую ЖКТ, однако фенотипический профиль этих пДК остается неизвестным. Поэтому нами была изучена экспрессия CD11c на пДК в слизистой двенадцатиперстной кишки у ВИЧ-инфицированных пациентов. Нами были выявлены присутствие данного маркера на поверхности пДК исключительно у ВИЧ-инфицированных больных. В наших экспериментах увеличение экспрессии CD11c, сопровождалось отсутствием экспрессии CD123 рецептора для ИЛ-3 в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки у ВИЧ-инфицированных пациентов. Наши результаты подтверждаются литературными данными, где было показано, что повышение количества интегрина CD11c обратно пропорционально активности ИЛ-3 (Kohrgruber, Halanek et al. 1999). Активированные пДК экспрессируют цитотоксический фермент гранзим B , который является компонентом плотных цитоплазматических гранул, секретируемых цитотоксическими T-лимфоцитами или натуральными киллерами (Bratke, Nielsen et al.). Известно, что цитокины могут регулировать продукцию гранзима B, где ИНФ-α проявляет ингибирующий эффект, в то время как ИЛ-3 его активирует. В рамках выполнения данной работы показано, что пДК в кишечнике ВИЧ-инфицированных больных характеризуются низкой экспрессией CD123. Поэтому можно предположить, что пДК в кишечнике у ВИЧ-больных менее подвержены влиянию ИЛ-3. Существует связь между экспрессией гранзима B и ИЛ-3 (Bratke, Nielsen et al.). Низкий уровень ИЛ-3 активирует экспрессию этого фермента и поэтому, было высказано предположение, что нарушение регуляции в экспрессии CD123 (ИЛ - 3-рецептор) может потенциально активировать экспрессию гранзима B (Fonteneau, Larsson et al. 2004). Известно, что предшественники пДК экспрессируют CD123 (рецептор ИЛ-3) и зависят от ИЛ-3, чтобы дифференцироваться в предшественники пДК (Kohrgruber, Halanek et al. 1999; Fonteneau, Larsson et al. 2004). Таким образом, низкая экспрессия CD123, может активировать фермент гранзим В. 77 Прогрессирование ВИЧ-1 связанно с патологией ЖКТ и повреждением ткани кишечника, что ведет к увеличению проницаемости эпителия кишечника и является отличительной чертой ВИЧ-инфекции (Stiksrud, Nowak et al.). Показано, что процесс повреждения целостности эпителиального покрова остается необратимым даже после длительной антиретровирусной терапии (Mehandru, Poles et al. 2004; Guadalupe, Sankaran et al. 2006; Chun, Nickle et al. 2008). Обнаруженная нами экспрессия гранзима B в клетках пДК кишечника ВИЧинфицированных больных, позволяет по новому объяснить повреждение эпителия кишечника. Известно, что гранзим В связывается с клеткой-мишенью вызывая апоптоз. (Ullrich, Zeitz et al. 1992; Dandekar 2007; Sankaran, George et al. 2008). Ранее не было описано, что у больных ВИЧ-инфекцией в пДК в лимфоидной ткани ЖКТ происходит повышение экспрессии гранзима B и снижение уровня экспрессии маркера CD123. В связи с тем, что активированные цитотоксические T-лимфоциты экспрессуирют маркер CD56, было проведено исследование по обнаружению данного маркера среди пДК (Kumar, Perdomo et al.). Оказалось, что большинство пДК клеток также экспрессируют CD56 (NCAM 1-нейрональная молекула клеточной адгезии), данное наблюдение хорошо согласуется с предыдущими работами, в которых описано, что в пДК, активированных вакциной к вирусу клещевого энцефалита, наблюдается коэкспрессия маркеров CD303, CD56, и гранзима B. (Tel, Smits et al. 2012). Нами впервые показано перераспределение пДК из крови у ВИЧинфицированных больных в слизистую кишечника. Однако, наши исследования так же показали, что заражение ВИЧ in vitro вызывает апоптоз пДК. Поэтому в завершении проведенных нами исследований, была предпринята попытка изучить механизм гибели пДК клеток при ВИЧ-инфекции in vitro. Апоптоз играет ведущую роль в поддержании постоянства численности клеток организма и их соотношения, а так же удаление генетически-дефектных клеток. (А.А.Яриллин 2010). Инфицированные CD4 позитивные клетки теряют способность к 78 пролиферации in vitro и подвергаются запрограммированной гибели в ответ на определенные раздражители. В настоящее время апоптоз является ведущим фактором снижения численности CD4 позитивных клеток при ВИЧ-инфекции (Ameisen, Groux et al. 1992). Во время апоптоза клетки высвобождают фосфатилидсерин на клеточной поверхности. Аннексин V, являющийся фосфолипид-связывающим протеином, в присутствии ионов кальция селективно, с высокой аффинностью, связывает фосфатидилсерин. Он проявляет очень низкую аффинность к таким фракциям фосфолипидов, как фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин и фосфатидилхолин. При помощи набора Annexin-V FITC/PI (Sigma), в данной работе показано, что под действием ВИЧинфекции снижение пДК в крови так же обусловлено явлениями апоптоза на поздней стадии, когда происходит деградация ДНК. Поскольку при некрозе происходит нарушение целостности мембраны, что может послужить причиной попадания меченного Annexin V внутрь клетки, то двойном окрашивании с красителем PI можно проследить три пула клеток. Annexin V–/PI– (живые), Annexin V+/PI– (раннеапоптотические) и Annexin V+/PI+ (некротические и позднеапоптотические) (С. В. Глушен и др., 2009). Начальная фаза апоптоза включает активацию bsl-2 белка и деполяризацию митохондрий, этот процесс происходит достаточно интенсивно и в короткие сроки, как правило, от 30 минут до нескольких часов. Поздняя фаза апоптоза, после активации каспаз и образования апоптотических телец может занять от 4 до 48 часов (R. Nardacci et al., 2015). В данной диссертационной работе было in vitro, результаты фиксировали после 120 часов инкубации с ВИЧ, тем самым были продемонстрированы некротические и позднеапоптотические изменения в МКПК человека. Таким образом, по-видимому, одними из первых заражению ВИЧ подвергаются пДК в крови и мигрируют в лимфоидную ткань ЖКТ, где поддерживают пул вируса в организме. В то же время в лимфоидной ткани у больных ВИЧ-инфекцией присутствуют пДК на разных стадиях дифференцировки, что свидетельствует о постоянной циркуляции пДК из 79 костного мозга. Снижение иммунитета возникает на фоне уменьшения количества пДК вследствие увеличения проницаемости кишечника и миграции пДК в его слизистую, а так же активации инфицированных Т-лимфоцитов, на фоне интенсивной их гибели по рецептор-зависомому пути. Таким образом, поддерживается постоянный резервуар вируса в организме 80 ЗАКЛЮЧЕНИЕ В работе исследована способность ВИЧ-1 инфицировать плазмоцитоидные дендритные клетки в мононуклеарной фракции здорового донора в условиях in vitro. По данным проточной цитометрии процент клеток, экспрессирующих видоспецифичный антиген ВИЧ p-24 составил более 98%. Этот факт может свидетельствовать о преимущественном инфицировании пДК в начале заболевания ВИЧ. Ранее в литературе были описаны гистологические изменения в слизистой желудочного-кишечного тракта у обезьян, зараженных вирусом иммунодефицита обезьян (Evans, Li et al. ; He, Brocca-Cofano et al. ; Xu, Wang et al.). Однако, таких исследований у человека не проводилось. В данной работе впервые показано, что у больных ВИЧ-инфекцией в периферической крови обнаружено статистически значимое снижение количества плазмоцитоидных дендритных клеток, в то время как в слизистой двенадцатиперстной кишки происходит их статистически значимое увеличение. По сравнению с контролем этот показатель увеличился в 6 раз. Больные, кровь которых была исследована на присутствие плазмоцитоидных дендритных клеток, находились на разных стадиях заболевания и в разные периоды приема антиретровирусной терапии. Уровень пДК у больных коррелирует с уровнем иммунодефицитного состояния, а так же c вирусной нагрузкой. При проведении иммуногистохимического анализа биопсийного материала больных ВИЧ, гистологические срезы были окрашены на различные маркеры, такие как CD303, CD80, CD123, Ki-67, CD56, CD4, Гранзим B и CD11c. В работе был изучен материал от 6 ВИЧ-инфицированных больных, не принимавших 81 антиретровирусную терапию. Увеличение экспрессии маркера плазмоцитоидных дендритных клеток CD303 было в 6 раз. В частности маркер активации Тлимфоцитов CD80 присутствовал у больных ВИЧ-инфекцией, но наблюдалось его отсутствие в контрольной группе. Однако, опираясь на факт выработки дендритными клетками ИЛ-3, не было обнаружено предполагаемой экспрессии CD123 в биоматериале от ВИЧ-инфицированных лиц. Так же выявлено наличие в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки больных ВИЧ цитотоксического фермента гранзима B, который активирует внутриклеточный каскад каспаз, приводящий к апоптозу, а так же играет роль в повышении проницаемости слизистой оболочки при ВИЧ-инфекции. В свою очередь гранзим В активирует выработку гликопротеина CD56 на лимфоцитах осуществляющих лизис клетокмишеней, в частности натуральных киллеров. В диссертационной работе был произведен анализ механизма гибели клеток, зараженных ВИЧ, непосредственно мононоуклеарные клеток в совокупности с дендритными клетками крови in vitro. В культуре клеток выявлены апонекротические изменения. Таким образом, можно предположить, что пДК истощаются в крови не только в результате перераспределения в ткань желудочно-кишечного тракта у больных ВИЧ-инфекцией, но и в результате запущенного инфекцией механизмов апоптоза. 82 ВЫВОДЫ 1. При ВИЧ-инфекции происходит снижение количества плазмоцитоидных дендритных клеток в периферической крови в 2 раза (0,044±0,084 %, (p=0,0031)) и повышается их содержание в слизистой оболочке двенадцатиперстной кишки в 6 раз (р<0,005). 2. Количественные изменения плазмоцитоидных дендритных клеток в крови при ВИЧ-инфекции находятся в обратной зависимости от вирусной нагрузки (p=0,003) и снижения количества CD4+ лимфоцитов (p=0,0006). 3. В слизистой ткани кишечника больных ВИЧ-инфекцией экспрессия маркера пДК CD303, маркера активации Т-лимфоцитов CD80, рецептор интерлейкина-3 – CD123, клеточного маркера пролиферации Ki-67, нейрональная молекула клеточной адгезии CD56, рецептор связывания ВИЧ с клеткой CD4, Гранзим B – активатор апоптоза и маркер мДК CD11c. 4. Увеличение количества плазмоцитоидных дендритных клеток в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта появлением экспрессирующих клеток, у больных ВИЧ-инфекцией маркер CD11c, сопровождается характерный для предшественников плазмоцитоидных дендритных клеток, что свидетельствует об активации этих клеток. 5. При инфицировании мононуклеарных клеток периферической крови человека ВИЧ1 in vitro наблюдается их массовая гибель по рецептор-зависимому сигнальному пути апоптоза, в отличие от неинфицированных клеток в тех же условиях культивирования. В данном случае клетки находились также и в стадии некроза. 83 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ µm (мкм) — микрометр BSA (bovine serum albumin) — бычий сывороточный альбумин CD (Cluster of Differentiation) — кластер дифференцировки\ DC-SIGN (Dendritic cell-specific intracellular adhesion molecule-3-grabbing now-integrin) — рецептор на поверхности дендритных клеток DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) — среда Игла модифицированная Дульбекко FBS (Fetal Bovine Serum) — сыворотка крови плодов коровы FITC – Fluorescein isothiocyanate HEK293Т (Human Embryonal Kidney сell type 293, expressing simian virus 40 T antigen) — клетки эмбриональной почечной линии 293Т человека, экспрессирующие Т антиген вируса обезьян miRNAs — микроРНК R — рецептор RNAi — РНК-интерференция RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium 1640) — среда для культивирования клеток №1640, разработанная в Институте раковых исследований Розвелла Парка siRNAs — короткие интерферирующие РНК TLR (англ. Toll-like receptor) — Толл-лайк рецептор TRAIL (англ. tumor necrosis factor ligand superfamily member) — лиганд, вызывающий апоптоз Treg — T-регуляторные клетки PE (англ. phycoerythrin) —флуорохром фикоэритрин 84 PerCP (англ. peridinin chlorophyll) — флуорохром перридин хлорофильный белок PI (англ. propidium iodide) — иодид пропидия АПК — антиген-презентирующие клетки АРВТ — антиретровирусная терапия АТ — антитела ВААРТ — высокоактивная антиретровирусная терапия ВИО — вирус иммунодефицита обезьян ВИЧ — вирус иммунодефицита человека ВЛМ — вирус лейкемии мышей ВН — вирусная нагрузка ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота ЖКТ — желудочно-кишечный тракт ИГХ — иммуногистохимия ИЛ — интерлейкин ИН — интеграза ИНФ — интерферон ИП — ингибиторы протеаз ИФА — иммуноферментный анализ кДНК — комплементарная ДНК ЛПС — липополисахариды МАПК — митоген-активирующей протеинкиназы мАТ — меченые антитела мДК — миелоидные дендритные клетки МКПК — мононуклеарные клетки периферической крови мМ — микромоль МНПК — мононуклеары периферической крови человека МТ — микротрубочки НК — нуклеокапсид ННИОТ — ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы 85 ОТ — обратная транскриптаза пДК — плазмоцитоидные дендритные клетки ПИК — преинтеграционный комплекс ПЦ — проточная цитометрия ПЦР — полимеразной цепной реакции РНК — рибонуклеиновая кислота СК — синаптический комплекс СПИД — синдром приобретенного иммунодефицита ФГА — фитогемаглютиннин ФГДС — фиброгастродуоденоскопия ФСБ — фосфатно-солевой буфер ФСБД — фосфатно-солевой буфер Дульбекко ФНО — фактор некроза опухоли ЦНС — центральная нервная система ЦФДА-1 (Solution anticoagulante CPhDA-1) — антикоагулянт цитрат фосфатный буфер декстрозы аденина ЭДТА — этилендиаминтетраацетат 86 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Акатова Н.Ю. Роль дородового наблюдения в профилактике перинатальной передачи ВИЧ-инфекции / Н.Ю.Акатова, Е.В.Степанова, Е.Н.Виноградова и др. //Эпидемиология и инфекционные болезни. – 2007. – T. 12, № 4. – С. 25-27. 2. Бережная Н. М. Роль клеток системы иммунитета в микроокружении опухоли. взаимодействие клеток системы иммунитета с другими компонентами микроокружения // Онкология. – 2009. – Т.11, №2. – С. 201-6 3. Вектор-Бест ВИЧ-1 р24-антиген ИФА-БЕСТ. Методика выявления наличия антигена р24 ВИЧ-1 – 2013. – С. 2-13. 4. Воронкова О.В. Особенности иммунного дисбаланса при различных клинико-патогенетических вариантах остропрогрессирующего туберкулеза легких / О.В. Воронкова, В.В. Новицкий, Е.Г. Чурина, и др. // Бюллетень сибирской медицины. – 2009. – № 3. – С. 42-50. 5. Головин Е.В. Биобезопасная клеточная модель ВИЧ-инфекции на основе рекомбинатного лентивируса / Е.В. Головин, А.К. Шафигуллина, Е.В. Мартынова и др.// Врач-аспирант. – 2011. – №2. – С. 409-414. 6. Покровский В.В. ВИЧ-инфекция и СПИД национальное руководство / Москва, ГЭОТАР-Медиа – 2013. – С. 155-170. 7. Шмагель К.В. Роль иммунных комплексов в активации иммунокомпетентных клеток при ВИЧ-инфекции (гипотеза) // Иммунология. – 2014. – № 2. – С. 117-120. 8. Хоффман К. Лечение ВИЧ-инфекции / ГЭОТАР, Москва 2011. – С. 658-736. 9. Яриллин А.А. Основы иммунологии. / ГЭОТАР-Медиа – 2010. – С. 279-298 10. Akhmanova A. Microtubule Minus-End-Targeting Proteins / A. Akhmanova, C. C. Hoogenraad // Curr Biol – 2012. – V.25, № 4 – P.162-171. 87 11. Ameisen J. Programmed death (apoptosis) of T CD4 lymphocytes and AIDS pathogenesis/ J. Ameisen, H. Groux [et al.] // C R Acad Sci III – 1992. – V. 314, №9 – P. 47-50. 12. Ancuta P. Microbial translocation is associated with increased monocyte activation and dementia in AIDS patients. / P. Ancuta, A. Kamat,[ et al.] // PLoS One – 2008. – V. 3, № 6 – P.2516. 13. Akhtar R.S. Immunohistochemical detection with quantum dots / R.S. Akhtar, C.B. Latham, D. Siniscalco,[et al.] // Methods Mol Biol. – 2007. – V.374. – P.11-28. 14. Azevedo-Pereira J. HIV-2 infection and chemokine receptors usage - clues to reduced virulence of HIV-2 / J. Azevedo-Pereira, Q. Santos-Costa, [et al.] // Curr HIV Res – 2005. – V. 3,№ 1 – P. 3-16. 15. Barre-Sinoussi F. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS) / F. Barre-Sinoussi, J. C. Chermann, [et al.] // Rev Invest Clin – 2004. – V.56,№2 – P. 126-9. 16. Beignon A. Endocytosis of HIV-1 activates plasmacytoid dendritic cells via Tolllike receptor-viral RNA interactions. / A. Beignon, K. McKenna, [et al.] // J Clin Invest – 2005. – V.115 № 11 – P. 3265-75. 17. Betancor G. Effects of HIV-1 reverse transcriptase connection subdomain mutations on polypurine tract removal and initiation of (+)-strand DNA synthesis / G. Betancor, M. Alvarez, et al. // Nucleic Acids Res. – 2014. – V. 23 №1 – P. 234-255. 18. Bhattacharya A. Structural basis of HIV-1 capsid recognition by PF74 and CPSF6. / A. Bhattacharya, S. L. Alam, [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A – 2011 – V. 111. №52. – P. 18625-30. 19. Bignold L. P. Mechanisms of clastogen-induced chromosomal aberrations: a critical review and description of a model based on failures of tethering of DNA strand ends to strand-breaking enzymes / L.P. Bignold // Mutat Res – 2010 V. 681, № 2-3 – P. 271-98. 88 20. Biotec M. Plasmasytoid dendritic cell isolation kit Human." from https://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001300/IM000136 6.ashx. 21. Bratke K. Functional expression of granzyme B in human plasmacytoid dendritic cells: a role in allergic inflammation / K. Bratke, J. Nielsen, [et al.] // Clin Exp Allergy – 2011 V. 40,№ 7 – P. 1015-24. 22. Brenchley J. M Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection / J.M. Brenchley, D. A. Price, [et al.] // Nat Med – 2006 V. 12, № 12 – P.1365-71. 23. Brenchley J. M CD4+ T cell depletion during all stages of HIV disease occurs predominantly in the gastrointestinal tract / J.M. Brenchley, T. W. Schacker, [et al.] // J Exp Med – 2004 – V.200, № 6 – p. 749-59. 24. Bromley S. K. The immunological synapse and CD28-CD80 interactions. / S. K. Bromley, A. Iaboni, [et al.] // Nat Immunol – 2001 – V.2, № 12 – P. 1159-66. 25. Brown K. N. Rapid influx and death of plasmacytoid dendritic cells in lymph nodes mediate depletion in acute simian immunodeficiency virus infection / K. N. Brown, V. Wijewardana, [et al.] // PLoS Pathog – 2009 – V.5 – P. 1000413. 26. Bruel T. Plasmacytoid dendritic cell dynamics tune interferon-alfa production in SIV-infected cynomolgus macaques / T. Bruel, S. Dupuy, [et al.] // PLoS Pathog – 2014 – V. 10 – P. 1003915. 27. Bure D. Mutations in the reverse transcriptase and protease genes of human immunodeficiency virus-1 from antiretroviral naive and treated pediatric patients. / D. Bure, M. A. Makhdoomi, [et al.] // Viruses – 2015 – V. 7 – P. 590-603. 28. Cavrois M. Human immunodeficiency virus fusion to dendritic cells declines as cells mature./ M. Cavrois, J. Neidleman, et al. // J Virol – 2006 – V. 80 – P. 1992-9. 29. Cella M. Plasmacytoid monocytes migrate to inflamed lymph nodes and produce large amounts of type I interferon / M. Cella, D. Jarrossay [et al.] // Nat Med – 1999 – V.5, № 8 P. 919-23. 89 30. Chan V. S. Distinct roles of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in systemic lupus erythematosus / V. S. Chan, Y. J. Nie, [et al.] // Autoimmun Rev – 2012 – V. 11, № 12 – P. 890-7. 31. Chaudhary O. Association of DC-SIGNR Expression in Peripheral Blood Mononuclear Cells with DC-SIGNR Genotypes in HIV-1 Infection / O. Chaudhary, S. Kumar [et al.] // Viral Immunol – 2015 – V.11 – P 238-42 . 32. Chun T. W. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long- term antiretroviral therapy/ T. W. Chun, D. C. Nickle, [et al.] // J Infect Dis – 2008 – V. 197 – P. 714-20. 33. Clavel F. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS./ F. Clavel, D. Guetard, [et al] // Science – 1986 – V. 233, № 4761 – P. 343-6. 34. Clutton G. Transient IL-10 receptor blockade can enhance CD8(+) T cell responses to a simian adenovirus-vectored HIV-1 conserved region immunogen / G. Clutton, A. Bridgeman [et al] // Hum Vaccin Immunother –2015 – V.11, № 4 – P. 1030-5. 35. Coleman C. M. Cellular and viral mechanisms of HIV-1 transmission mediated by dendritic cells / C. M. Coleman, C. S. Gelais, [et al] // Adv Exp Med Biol – 2013 – V.762. – P. 109-30. 36. Colonna M, Plasmacytoid dendritic cells in immunity / M. Colonna, G. Trinchieri,Y. Liu // Nat. Immunol. – 2004 – V.5. – P.1219–26. 37. Dandekar S. Pathogenesis of HIV in the gastrointestinal tract / S. Dandekar, // Curr HIV/AIDS Rep – 2007 – V. 4, № 1 P. 10-5. 38. Das A. T. Possible applications for replicating HIV 1 vectors / A. T. Das, R. E. Jeeninga, et al // HIV Ther – 2010 – V.4, № 3 – P. 361-369. 39. de Heer H. J. Essential role of lung plasmacytoid dendritic cells in preventing asthmatic reactions to harmless inhaled antigen / H. J de Heer, H. Hammad [et al.] // J Exp Med – 2004 V. 2001 – P. 89-98. 90 40. de Jong G. M. Animal models for liver metastases of colorectal cancer: research review of preclinical studies in rodents / G. M. de Jong, F. Aarts, [et al.] // J Surg Res – 2009 – V.154,№ 1 – P. 167-76. 41. Delelis O. Chromosomal tethering and proviral integration / O. Delelis, A. Zamborlini, [et al.] // Biochim Biophys Acta – 2010 – V. 1799, № 3-4 – P. 207-16. 42. Denton P. W. Humanized mouse models of HIV infection / P. W. Denton, J. V. Garcia // AIDS Rev – 2011 – V. 13 № 3 – P. 135-48. 43. Dudley D. M. A novel yeast-based recombination method to clone and propagate diverse HIV-1 isolates / D. M. Dudley, Y. Gao, [et al.] // Biotechniques – 2009 – V. 46 – P. 458-67. 44. Estes J. Collagen deposition limits immune reconstitution in the gut / J. Estes, J. V. Baker [et al.] // J Infect Dis – 2008 – V. 198 – P. 456-64. 45. Evans T. I. SIV-induced translocation of bacterial products in the liver mobilizes myeloid dendritic and natural killer cells associated with liver damage / T. I Evans, H. Li, [et al.] // J Infect Dis – 2015 – V. 160. – P. 130-40. 46. Fiume G. Impairment of T cell development and acute inflammatory response in HIV-1 Tat transgenic mice. / G. Fiume, A. Scialdone, [et al.] // Sci Rep – 2015 – V. 5. – P. 138-64. 47. Fonteneau J. F. Human immunodeficiency virus type 1 activates plasmacytoid dendritic cells and concomitantly induces the bystander maturation of myeloid dendritic cells / J. F. Fonteneau, M. Larsson, [et al.] // J Virol – 2004 – V. 78. – P. 5223-32. 48. Fuss I. J. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood / I. J Fuss, M. E. Kanof, et al. // Curr Protoc Immunol – 2009 – Chapter 7 – Unit7 1. 49. Gao F. Origin of HIV-1 in the chimpanzee Pan troglodytes troglodytes / Gao, F., E. Bailes, et al. // Nature – 1999 – V. 397. – P. 436-41. 50. Gilliet M. Plasmacytoid dendritic cells: sensing nucleic acids in viral infection and autoimmune diseases / M. Gilliet, W. Cao, YJ. Liu // Nat Rev Immunol. – 91 2008 – V.8. – P.594-606 51. Gomez C. The ins and outs of HIV replication / C. Gomez, T. J. Hope // Cell Microbiol – 2005 – V.7 № 5. – P. 621-6. 52. Grassi F. Depletion in blood CD11c-positive dendritic cells from HIV-infected patients / F. Grassi, A. Hosmalin, [et al.] // AIDS – 1999 – V.13, №7. – P. 759-66. 53. Groot F. Opposing roles of blood myeloid and plasmacytoid dendritic cells in HIV-1 infection of T cells: transmission facilitation versus replication inhibition / F. Groot, T. M. van Capel, [et al.] // Blood – 2006 – V. 108, № 6 – P. 1957-64. 54. Guadalupe M. Severe CD4+ T-cell depletion in gut lymphoid tissue during primary human immunodeficiency virus type 1 infection and substantial delay in restoration following highly active antiretroviral therapy / M. Guadalupe, E. Reay, [et al.] // J Virol – 2003 – V. 77. – P. 11708-17. 55. Guadalupe M. Viral suppression and immune restoration in the gastrointestinal mucosa of human immunodeficiency virus type 1-infected patients initiating therapy during primary or chronic infection / M. Guadalupe, S. Sankaran, [et al.] // J Virol – 2006 – V.80, № 16 – P. 8236-47. 56. Hanneke S. Isolation, Propagation, and Titration of Human Immunodeficiency Virus Type 1 From Peripheral Blood of Infected Individuals / S. Hanneke, Neeltje A. Kootstra // Methods in Molecular Biology – 2005 – V. 304. – P. 124-128 57. Hadeiba H. CCR9 expression defines tolerogenic plasmacytoid dendritic cells able to suppress acute graft-versus-host disease / H. Hadeiba, T. Sato, et al.] // Nat Immunol – 2008 – V. 9. – P. 1253-60. 58. He T. Critical Role for the Adenosine Pathway in Controlling Simian Immunodeficiency Virus-Related Immune Activation and Inflammation in Gut Mucosal Tissues / T. He, E. Brocca-Cofano, [et al.] // J Virol – 2014. – V. 89 № 18 – P. 9616-30. 59. Jiao Y. A simple and sensitive antigen retrieval method for free-floating and slide-mounted tissue sections / Y.A. Jiao, Z. Sun, T. Lee, F.R. Fusco, [et al.] // J Neurosci Methods. – 1999. – V.93. – P.149-62. 92 60. Joseph A. Inhibition of in vivo HIV infection in humanized mice by gene therapy of human hematopoietic stem cells with a lentiviral vector encoding a broadly neutralizing anti-HIV antibody / A. Joseph, Zheng J. H.,[ et al.] // J Virol .- 2010. – V.84. – Р.6645-53. 61. Kandel J. Automated detection of whole-cell mitochondrial motility and its dependence on cytoarchitectural integrity / J Kandel, P. Chou, [et al.] // Biotechnol Bioeng. – 2015. – V.112. – P.1395-405. 62. Kapsenberg M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization./ M. L.Kapsenberg // Nat Rev Immunol - 2003 - Kapsenberg, M. V.3. – Р. 984-93. 63. Kathryn S. J. Continuous long-term growth of plasmacytoid dendritic cells following in vitro infection with HTLV-1 / S Jones Kathryn, D. C. B., Xue T Bai, Cari Petrow-Sadowski,Tao Fu [ et al] // Retrovirology – 2011 – V.6. – P.543-65. 64. Kewenig S. Rapid mucosal CD4(+) T-cell depletion and enteropathy in simian immunodeficiency virus-infected rhesus macaques./ S. Kewenig, T. Schneider // Gastroenterology – 1999 – V. 116. – Р. 1115-23. 65. Kingham T. P. Murine liver plasmacytoid dendritic cells become potent immunostimulatory cells after Flt-3 ligand expansion / T. P.Kingham, U. I. Chaudhry // Hepatology – 2007 – V.45. – Р. 445-54. 66. Kohrgruber N. Survival, maturation, and function of CD11c- and CD11c+ peripheral blood dendritic cells are differentially regulated by cytokines. / N. Kohrgruber, N. Halanek [et al] // J Immunol – 1999 – V.163. – Р. 3250-9. 67. Kotler D. P. Enteropathy associated with the acquired immunodeficiency syndrome / D. P.Kotler, H. P. Gaetz [et al] // Ann Intern Med – 1984 – V.101 №4 – Р. 421-8. 68. Kotler D. P. Effect of combination antiretroviral therapy upon rectal mucosal HIV RNA burden and mononuclear cell apoptosis / D. P.Kotler, T. Shimada,[ et al.] // AIDS – 1998 - V12. – Р. 597-604. 69. Kumar A. Granzyme B mediated function of Parvovirus B19-specific CD4(+) T cells / A.Kumar, M. F. Perdomo// Clin Transl Immunology – 2015 – V.4. – P. 1334-39 93 70. Kwa S. Plasmacytoid dendritic cells are recruited to the colorectum and contribute to immune activation during pathogenic SIV infection in rhesus macaques / S.Kwa,S. Kannanganat, [et al.] // Blood – 2011 – V.118. – Р.2763-73. 71. Lehmann C. Longitudinal analysis of distribution and function of plasmacytoid dendritic cells in peripheral blood and gut mucosa of HIV infected patients./ C. Lehmann,N. Jung [ et al.] // J Infect Dis – 2014 – V.209. – P.940-9. 72. Li D. Proteomic and bioinformatic analyses of possible target-related proteins of gambogic acid in human breast carcinoma MDA-MB-231 cells / Li, D., X. Y. // Chin J Nat Med – 2015 - V.13. – Р.41-51. 73. Lima A. A. Mucosal injury and disruption of intestinal barrier function in HIV- infected individuals with and without diarrhea and cryptosporidiosis in northeast Brazil / A. A. Lima, T. M. Silva // Am J Gastroenterol – 1997. – V.92. – Р. 1861-6. 74. Liu Y. P. HIV-1-Based Lentiviral Vectors / Y. P.Liu, B. Berkhout // Methods Mol Biol – 2009 – V.1087. – P.273-84. 75. Liu Y. P. Lentiviral delivery of RNAi effectors against HIV-1 / Y. P. Liu, B. Berkhout // Curr Top Med Chem – 2009 – V.9. – P.1130-43. 76. Lock C. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis / C. Lock, G. Hermans // Nat Med – 2002 – V.8. – Р.500-8. 77. Lombardi V. C. Plasmacytoid dendritic cells of the gut: relevance to immunity and pathology / V. C.Lombardi, S. F. Khaiboullina // Clin Immunol – 2014 – V.153. – P.165-77. 78. Lord S. J. Granzyme B: a natural born killer / S. J Lord, R. V. Rajotte // Immunol Rev – 2003 - V.193. – P.31-8. 79. Ludewig B. Replication pattern of human immunodeficiency virus type 1 in mature Langerhans cells / B.Ludewig,J. Holzmeister // J Gen Virol – 1995 – V.76. – Р.1317-25. 94 80. Lynch MJ Medical Laboratory Technology and Clinical Pathology / MJ Lynch, R. S., Mellor LD, Spare PD Inwood MJ // Philadelphia London Toronto, WB Saunders Co. 1969. – V.5. – P. 324-443 81. Malleret B. Primary infection with simian immunodeficiency virus: plasmacytoid dendritic cell homing to lymph nodes, type I interferon, and immune suppression / B.Malleret,B. Maneglier // Blood – 2008 – V.112. – Р.4598-608. 82. Martin-Martin L. Immunophenotypical, morphologic, and functional characterization of maturation-associated plasmacytoid dendritic cell subsets in normal adult human bone marrow / L.Martin-Martin, J. Almeida // Transfusion – 2009 – V.49. – Р.1692-1708. 83. Martin-Padura I. Sex-related efficiency in NSG mouse engraftment / I. Martin- Padura, A. Agliano, [et al.] // Blood – 2010 – V.116. – Р.2616-7. 84. Mattapallil J. J. Massive infection and loss of memory CD4+T cells in multiple tissues during acute SIV infection / J. J.Mattapallil, D. C. Douek // Nature – 2005 – V.434. – Р.1093-7. 85. Mavilio D. Characterization of the defective interaction between a subset of natural killer cells and dendritic cells in HIV-1 infection / D. Mavilio, G. Lombardo // J Exp Med – 2006 – V. 203. – Р.2339-50. 86. MacDonald K.P. Characterization of human blood dendritic cell subsets / K.P. MacDonald, D.J. Munster, G.J. Clark, A. Dzionek, Schmitz J, and D.N. Hart. // Blood – 2002 – V.100. – P.4512-4520. 87. McLaren P. J. The impact of host genetic variation on infection with HIV-1 / P. J.McLaren,M. Carrington // Nat Immunol – 2015 V.16. – Р.577-583. 88. Mehandru S. Primary HIV-1 infection is associated with preferential depletion of CD4+ T lymphocytes from effector sites in the gastrointestinal tract./ S.Mehandru, M. A. Poles // J Exp Med – 2004 – V. 200. – Р.761-70. 89. Mehandru S. Lack of mucosal immune reconstitution during prolonged treatment of acute and early HIV-1 infection. / S.Mehandru, M. A. Poles [et al.] // PLoS Med – 2006 – V3. – P.484. 95 90. Meira D. D. Different antiproliferative effects of matuzumab and cetuximab in A431 cells are associated with persistent activity of the MAPK pathway / D. D.Meira, I. Nobrega [et al] // Eur J Cancer – 2009 – V.45, №7. – Р.1265-73. 91. Melcon G. Loss of emerin at the nuclear envelope disrupts the Rb1/E2F and MyoD pathways during muscle regeneration / G. Melcon, S. Kozlov // Hum Mol Genet – 2006 – V.15 №4. – Р.637-51. 92. Miller E. Dendritic cell dysregulation during HIV-1 infection / Miller, E. and N. Bhardwaj // Immunol Rev – 2013 – V.254. – Р.170-89. 93. Milush J. M. Virally induced CD4+ T cell depletion is not sufficient to induce AIDS in a natural host / Milush, J. M., J. D. Reeves, [et al.] // J Immunol – 2007 – V.179. – P.3047-56. 94. Muller-Trutwin M. Role for plasmacytoid dendritic cells in anti-HIV innate immunity / M. Muller-Trutwin, A. Hosmalin // Immunol Cell Biol – 2005 – V.83. – P. 578-83. 95. Nagira M. Molecular cloning of a novel human CC chemokine secondary lymphoid-tissue chemokine that is a potent chemoattractant for lymphocytes and mapped to chromosome 9p13 / M. Nagira, T. Imai,[et al.] // J Biol Chem – 1997 – V.272. – P. 19518-24. 96. Nobile C. Covert human immunodeficiency virus replication in dendritic cells and in DC-SIGN-expressing cells promotes long-term transmission to lymphocytes / C. Nobile, C. Petit, [et al.] // J Virol – 2005 – V.79. – P. 5386-99. 97. Novak N A. Characterization of FcepsilonRI-bearing CD123 blood dendritic cell antigen-2 plasmacytoid dendritic cells in atopic dermatitis // N. A. Novak, J., Hagemann T, Jenneck C, Laffer S, [et al.] // J Allergy Clin Immunol. – 2004 – V.114. – P. 364-70. 98. Ocwieja K. A Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay Optimized to Detect Multiple HIV Subtypes. / K. Ocwieja, S. Sherrill-Mix, [et al.] // PLoS One – 2015 –V. 3. – P. 1178-82. 96 99. Okong'o L. HIV-associated juvenile systemic sclerosis: a case report / L. Okong'o, O., K. Webb, [et al.] // Semin Arthritis Rheum – 2015 – V.44. – P.411-6. 100. Onono M. Integrating family planning and HIV services in western Kenya: the impact on HIV-infected patients' knowledge of family planning and male attitudes toward family planning / M. Onono, M. A. Guze, et al // AIDS Care – 2015 – V.27. – P. 743-52. 101. Pandey K. K. HIV-1 Integrase Strand Transfer Inhibitors: Novel Insights into their Mechanism of Action / K. K. Pandey, and D. P. Grandgenett // Retrovirology – 2008 – V.2. – P.11-16. 102. Pantaleo G. HIV infection is active and progressive in lymphoid tissue during the clinically latent stage of disease / Pantaleo, G., C. Graziosi, [et al.] // Nature – 1993 – V.362. – P.355-8. 103. Piccioli D. Functional specialization of human circulating CD16 and CD1c myeloid dendritic-cell subsets / Piccioli, D., S. Tavarini, et al. // Blood – 2007 – V.109. – P. 5371-9. 104. Piqueras B. Upon viral exposure, myeloid and plasmacytoid dendritic cells produce 3 waves of distinct chemokines to recruit immune effectors / B. Piqueras, J. Connolly, [et al] // Blood – 2006 – V.107. – P. 2613-8. 105. Pope M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells / M. Pope, S. Gezelter, et al. // J Exp Med – 1995 – V.182. – P. 2045-56. 106. Proudfoot, A. E. Anti-chemokine small molecule drugs: a promising future? / A. E. Proudfoot, C. A. Power, [et al.] // Expert Opin Investig Drugs – 2010 – V.19. – P. 345-55. 107. Reeves R. SIV infection induces accumulation of plasmacytoid dendritic cells in the gut mucosa. / R. K. Reeves, T. I. Evans, [et al.] // J Infect Dis – 2012 – V.206. – P. 1462-8. 108. Reeves R.K. Dendritic cells in a mature age / R.K. Reeves, T.I. Evans // Nat Rev Immunol – 2006 – V.6. – P. 476-83. 97 109. Reyes R. A. Induction of simian AIDS in infant rhesus macaques infected with CCR5- or CXCR4-utilizing simian-human immunodeficiency viruses is associated with distinct lesions of the thymus / Reyes, R. A., D. R. Canfield, et al // J Virol – 2004 – V.78. – P. 2121-30. 110. Roscoe C. Behcet's disease diagnosed after acute HIV infection: viral replication activating underlying autoimmunity? / C. Roscoe, R. Kinney, et al. // Int J STD AIDS – 2015 – V. 26. – P. 432-5. 111. Rubbert, A. Dendritic cells express multiple chemokine receptors used as coreceptors for HIV entry / A. Rubbert, C. Combadiere, [et al.] // J Immunol – 1998 – V. 160 № 8. – P. 3933-41. 112. Sabado, R. L. Evidence of dysregulation of dendritic cells in primary HIV infection / R. L.Sabado, M. O'Brien, [et al.] // Blood – 2010 – V.116. – P. 3839-52. 113. Sango K. Highly active antiretroviral therapy potently suppresses HIV infection in humanized Rag2-/-gammac-/- mice / K. Sango, A. Joseph, et al. // AIDS Res Hum Retroviruses – 2010 – V.26. – P. 735-46. 114. Sankaran S. Rapid onset of intestinal epithelial barrier dysfunction in primary human immunodeficiency virus infection is driven by an imbalance between immune response and mucosal repair and regeneration / S. Sankaran, M. D. George, [et al.] // J Virol – 2008 – V.82. – P.538-45. 115. Schafer B. A novel yeast-based tool to detect mutagenic and recombinogenic effects simultaneously / B. Schafer, A. Neffgen, [et al.] // Mutat Res – 2008 – V. 652. – P. 20-9. 116. Schmidt B Variations in plasmacytoid dendritic cell (PDC) and myeloid dendritic cell (MDC) levels in HIV-infected subjects on and off antiretroviral therapy / B. Schmidt, S. H. Fujimura, [et al.] // J Clin Immunol – 2006 – V.26 . – P. 55-64. 117. Schmidt B. Low-level HIV infection of plasmacytoid dendritic cells: onset of cytopathic effects and cell death after PDC maturation / Schmidt, B., I. Scott, et al. // Virology – 2004 – V. 329. – P. 280-8. 98 118. Scholzen T. The Ki-67 protein: from the known and the unknown / Scholzen, T. and J. Gerdes // J Cell Physiol – 2000 – V.182. – P. 311-22. 119. Schuetz A. Initiation of ART during early acute HIV infection preserves mucosal Th17 function and reverses HIV-related immune activation / Schuetz, A., C. Deleage, et al. // PLoS Pathog – 2014 – V.10. – P. 230-9. 120. Shah S. Impact of Viral Activators and Epigenetic Regulators on HIV-1 LTRs Containing Naturally Occurring Single Nucleotide Polymorphisms / S. Shah, V. Pirrone, [et al.] // Biomed Res Int – 2015 – V.32 – P.142-50. 121. Shortman K. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development / K. Shortman, S. H. Naik // Nat Rev Immunol – 2008 – V.7. – P. 19-30. 122. Soumelis V. From plasmacytoid to dendritic cell: morphological and functional switches during plasmacytoid pre-dendritic cell differentiation / V. Soumelis, Y. J. Liu // Eur J Immunol – 2006 – V. 36. – P. 2286-92. 123. Steinman R. M. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution / R. M. Steinman, Z. A. Cohn // J Exp Med – 1973 – V. 137. – P. 1142-62. 124. Stiksrud B. Reduced Levels of D-dimer and Changes in Gut Microbiota Composition after Probiotic Intervention in HIV-infected Individuals on Stable ART / B. Stiksrud, P. Nowak, [et al.] // J Acquir Immune Defic Syndr. – 2015 – V. 6. – P. 123-8. 125. Strickler H. D. The relation of plasmacytoid dendritic cells (pDCs) and regulatory T-cells (Tregs) with HPV persistence in HIV-infected and HIV-uninfected women / H. D. Strickler, J. Martinson, et al. // Viral Immunol – 2014 – V. 27. – P. 20-5. 126. Su B. Broadly neutralizing antibody VRC01 prevents HIV-1 transmission from plasmacytoid dendritic cells to CD4 T lymphocytes / B. Su, A. Lederle [et al.] // J Virol – 2014 – V.88. – P. 10975-81. 127. Summers, K. L., B. D. Hock, et al. (2001). "Phenotypic characterization of five dendritic cell subsets in human tonsils." Am J Pathol – 2013 – V.5.– P.285-95. 99 128. Swiecki M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance / M. Swiecki, K. L. Summers, B. D. Hock, [et al.] // Immunol Rev – 2010 – V.234. – P. 142-62. 129. Swiecki M. Plasmacytoid dendritic cell ablation impacts early interferon responses and antiviral NK and CD8(+) T cell accrual / M. Swiecki, S. Gilfillan, et al. // Immunity – 2010 – V. 33. – P. 955-66. 130. Tan J. Some mechanisms of FLIP expression in inhibition of HIV-1 replication in Jurkat cells, CD4+ T cells and PBMCs / J. Tan, X. Wang, [et al.] // J Cell Physiol – 2013 - V.228. – P. 2305-13. 131. Tao A. R. Providers' perspectives on male involvement in family planning in the context of a cluster-randomized controlled trial evaluating integrating family planning into HIV care in Nyanza Province, Kenya / A. R. Tao, M. Onono, [et al.] // AIDS Care – 2015 – V.27. – P. 31-7. 132. Tel J. Human plasmacytoid dendritic cells are equipped with antigen-presenting and tumoricidal capacities / J. Tel, E. L. Smits, [et al.] // Blood 2012 – V.120. – P. 3936-44. 133. Teleshova N. Immunodeficiency virus exploitation of dendritic cells in the early steps of infection / N. Teleshova, I. Frank, [et al.] // J Leukoc Biol – 2003 – V.74. – P. 683-90. 134. Tilton J. Human immunodeficiency virus viremia induces plasmacytoid dendritic cell activation in vivo and diminished alpha interferon production in vitro / J. C. Tilton, M. M. Manion,[ et al.] // J Virol – 2005 – V.82. – P. 3997-4006. 135. Torresilla C. Detection of the HIV-1 minus-strand-encoded antisense protein and its association with autophagy / C. Torresilla, E. Larocque, [et al.] // J Virol – 2003 – V.87. – P. 5089-105. 136. Turville S. Immunodeficiency virus uptake, turnover, and 2-phase transfer in human dendritic cells / Turville, S. G., J. J. Santos, [et al.] // Blood – 2004 – V.103. – P. 2170-9. 100 137. Ullrich, R. Enteric immunologic abnormalities in human immunodeficiency virus infection / R. UllrichM. Zeitz, et al. // Semin Liver Dis –– 1992 – V.12. – P. 167-74. 138. Vajdy M. Differential effects of simian immunodeficiency virus infection on immune inductive and effector sites in the rectal mucosa of rhesus macaques / M. Vajdy, R. S. Veazey, [et al.] // Am J Pathol – 2000 – V.157. – P. 485-95. 139. van den Berg, L. M. Antiviral immune responses by human langerhans cells and dendritic cells in HIV-1 infection / L. M. van den Berg, and T. B. Geijtenbeek // Adv Exp Med Biol – 2013 – V.762. – P. 45-70. 140. Veazey R. S. Gastrointestinal tract as a major site of CD4+ T cell depletion and viral replication in SIV infection / R. S. Veazey, M. DeMaria, [et al.] // Science – 1998 – V. 280. – P. 427-31. 141. Veazey, R. S. Getting to the guts of HIV pathogenesis / R. S. Veazey, and A. A. Lackner // J Exp Med – 2004 – V.200. – P. 697-700. 142. Veazey R. S. Dynamics of CCR5 expression by CD4(+) T cells in lymphoid tissues during simian immunodeficiency virus infection / R. S. Veazey, K. G. Mansfield, [et al.] // J Virol – 2000 – V.74. – P. 11001-7. 143. Veazey R. S. Identifying the target cell in primary simian immunodeficiency virus (SIV) infection: highly activated memory CD4(+) T cells are rapidly eliminated in early SIV infection in vivo / Veazey, R. S., I. C. Tham, [et al.] // J Virol – 2000 – V.74. – P. 57-64. 144. Vujkovic-Cvijin I. Dysbiosis of the gut microbiota is associated with HIV disease progression and tryptophan catabolism / I. Vujkovic-Cvijin, R. M. Dunham, [et al.] // Sci Transl Med – 2013 – V.5. – P.193-9. 145. Wang C. Z. Antiproliferative effects of different plant parts of Panax notoginseng on SW480 human colorectal cancer cells / C. Z. Wang, J. T. Xie, [et al.] // Phytother Res – 2009 – V. 23. – P. 6-13. 146. Langenberg Wies Patient-to-Patient Transmission of Campylobacter pylori Infection by Fiberoptic Gastroduodenoscopy and Biopsy / Wies Langenberg, Erik A. J. 101 Rauws, Jo H. Oudbier, and G. N. J. Tytgat // The Journal of Infectious Diseases – 1990 – V.161. – P. 507-511 147. Witmer M. Selection and analysis of HIV-1 integrase strand transfer inhibitor resistant mutant viruses / M. Witmer, and R. Danovich // Methods – 2009 – V.47. – P. 277-82. 148. Xu H. Type 3 innate lymphoid cell depletion is mediated by TLRs in lymphoid tissues of simian immunodeficiency virus-infected macaques / H. Xu, X. Wang,[ et al.] // FASEB J. – 2015 – V.34. – P. 143-9 149. Yamakami K. Early bone marrow hematopoietic defect in simian/human immunodeficiency virus C2/1-infected macaques and relevance to advance of disease / K. Yamakami, M. Honda, et al. // J Virol – 2004 – V.78. – P. 10906-10. 150. Zeichner, S. L. The molecular biology of HIV. Insights into pathogenesis and targets for therapy / S. L. Zeichner // Clin Perinatol – 1994 – V.21. – P. 39-73. 151. http://www.cellsignal.com/common/content/content.jsp?id=flow. 102 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА Рисунок 1 – Схема строения ВИЧ…………………………………………………..………12 Рисунок 2 – Схема этапов патогенеза ВИЧ………………………………………..………..15 Таблица 1 – Классификация дендритных клеток по типу экспрессии маркеров…………..18 Таблица 2 – Антитела, использованные в работе для иммунофлуоресцентного окрашивания срезов тканей и проточной цитофлуорометрии…………………………….45 Таблица 3 – Нарастание вирусного белка в супернатанте МКПК на 3 день, 5 день и 8 день инкубирования с ВИЧ………………………………………………………………………..49 Рисунок 3 – Проточная цитометрия МКПК полное название , зараженных изолятом ВИЧ in vitro……………………………………………………………………………………………………...50 Рисунок 4 – Количественная оценка пДК в крови больных ВИЧ- инфекцией……………………………………………………………………………………..52 Таблица 4 – Клинические данные больных ВИЧ-инфекцией……………………………..53 Таблица 5 – Соотношение количества дендритных клеток к вирусной нагрузке……………………………………………………………………………………….56 Рисунок 5 – Количество CD4+ клеток в зависимости от вирусной нагрузки у больных ВИЧ-инфекцией………………………………………………………………………………56 Таблица 6 – Подсчет микроскопическом поле количества плазмоцитоидных иммуногистохимического среза дендритных у больных клеток в ВИЧ и контроля………………………………………………………………………………………57 Рисунок 6 – Корреляция уровня пДК от уровня CD4+ клеток у больных ВИЧинфекцией……………………………………………………………………………………..58 Рисунок 7 – соотношение пДК к общему числу лимфоцитов в процентах………………59 Рисунок 8 – окрашивание слизистой двенадцатиперстной кишки больны ВИЧ-инфекцией гематоксилин-эозином……………………………………………………………………….60 103 Рисунок 9 – Анализ экспрессии пДК в двенадцатиперстной кишке больных ВИЧинфекцией………………………………………………………………………………….…61 Рисунок 10 – Анализ активации маркера плазмоцитоидных дендритных клеток и лимфоцитов в двенадцатиперстной кишке у больных ВИЧ- инфекцией…………………………………………………………………………………….62 Рисунок 11 – Анализ экспрессии маркера CD303/CD123 и CD303/CD80 в биопсийном материале двенадцатиперстной кишки у ВИЧ-инфицированных лиц……………………………………………………………………………………………..63 Рисунок 12 – Анализ ко-экспрессии CD303 и CD11c в биопсийном материале двенадцатиперстной кишки ВИЧ-инфицированых лиц……………………………………64 Рисунок 13 – Анализ ко-экспрессии маркеров CD303 и CD56 биопсийном материале двенадцатиперстной кишки ВИЧ-инфицированых лиц……………………………………65 Рисунок 14 – Анализ ко-экспрессии маркеров CD303 и гранзима B биопсийном материале двенадцатиперстной кишки ВИЧ-инфицированых лиц………………………………………………… …………………………………………..66 Рисунок 15 – Изолированная культура дендритных клеток после инфицирования ВИЧ. 120 часов после инфицирования…………………………………………………………….68 Рисунок 16 – Проточная цитометрия МКПК после инфицирования ВИЧ на явление апоптоза………………………………………………………………………………………..69