ГЕНЕТИКА - Кафедра медицинской генетики СПбГПМУ
advertisement
ГЕНЕТИКА В ПРАКТИКЕ ГИНЕКОЛОГА В. Н. Горбунова, Г. Ф. Кутушева Методическое пособие для слушателей кафедры детской и подростковой гинекологии ФПК СПбГПМА Оглавление Предисловие 1. Наследственные болезни с нарушением первичной половой дифференцировки 1.1. Генетика пола 1.2. Реверсия пола, гермафродитизм 1.3. Дизгенезия гонад без реверсии пола 1.4. Мужское бесплодие 2. Наследственные болезни с нарушением репродуктивной функции 2.1. Хромосомные болезни 2.1.1. Болезнь Шерешевского-Тернера 2.1.2. Болезнь Клайнфельтера 2.2. Моногенные болезни 2.2.1 Адреногенитальный синдром 3. Генетический контроль остеопороза 4. Генетический контроль эндометриоза 5. Вклад генетических составляющих в этиологию онкологических заболеваний, затрагивающих половую сферу 5.1. Молекулярные основы канцерогенеза 5.2. Рак молочной железы 5.3. Рак шейки матки 5.4. Рак яичников и эндометрия 5.5. Герминогенные опухоли 6. Основные положения классической генетики 6.1. Законы Менделя 6.2. Хромосомная теория наследственности 6.3. Спонтанный и индуцированный мутагенез 6.4. Цитогенетические карты 6.5. Наследственные болезни и типы наследования 6.6. Генетические основы развития 6.7. Генетика популяций 6.8. Структура ДНК 6.9. Наследственная информация и пути ее передачи 6.10. Структура и экспрессия генов эукариот 6.11. Мутации генов 6.12. Обратная генетика, генная инженерия Словарь генетических терминов Список Литературы Предисловие Фундаментальными свойствами живой природы, отличающими ее от неживой материи, являются способность к размножению и наследственность, которая заключается в том, что особи любых видов рождают только себе подобных и их потомки, в среднем, более похожи на своих родственников, чем на других представителей того же вида. При этом каждый вид характеризуется определенным уровнем изменчивости, и даже братья и сестры никогда не являются точными копиями друг друга и своих родителей. Генетика это наука о наследственности и изменчивости. Как любая другая биологическая наука генетика состоит из общих и частных разделов. Общие разделы посвящены изучению материальных основ наследственности и изменчивости. В частных разделах исследуются особенности проявления общих теоретических закономерностей у разных видов организмов. Среди них ведущее положение занимает генетика человека. Те ее направления, которые посвящены патологии человека, являются предметом медицинской генетики. Данное пособие посвящено тем вопросам медицинской генетики, с которыми чаще всего приходится сталкиваться врачу гинекологу. В настоящее время насчитывается более 4500 наследственных заболеваний. Их суммарная частота достигает 1,5%, из них на долю хромосомных болезней приходится 0,5% и на долю моногенных – до 1%. В этиологии подавляющего большинство наиболее распространенных болезней человека также имеется генетическая составляющая, которая определяется индивидуальными особенностями комплекса генов, продукты которых, как правило, являются участниками соответствующих патологических метаболических циклов. Эти заболевания называются мультифакториальными или болезнями с наследственной предрасположенностью. В первом параграфе рассмотрены генетические основы детерминации пола и наследственные заболевания, обусловленные нарушениями половой дифференцировки. Подробно изложены молекулярно-генетические основы адреногенитального синдрома. Практически все хромосомные болезни сопровождаются различными нарушениями репродуктивной функции, однако большинство таких больных не доживают до репродуктивного возраста. Исключение составляют хромосоме) и болезни, синдром Дауна (трисомия по 21 обусловленные числовыми аномалиями половых хромосом, такие как синдромы Шерешевского-Тернера и Клайнфельтера. Описанию двух последних синдромов и посвящен следующий раздел. На примере значимых для гинекологов заболеваний – остеопороза и эндометриоза – показано, как проводится поиск и анализ генетических факторов риска, предрасполагающих к развитию мультифакториальной патологии. канцерогенеза Следующий параграф применительно к посвящен генетическим онкологическим основам заболеваниям, затрагивающим половую сферу (рак молочной железы, шейки матки, яичников, эндометрия, герминогенные опухоли). В заключительном разделе в конспективной форме изложены материальные основы наследственности и изменчивости от законов Менделя до расшифровки структуры генома человека. Надеемся, что по мере освоения практических аспектов медицинской генетики у врача-гинеколога появится желаннее подробнее узнать об основных положениях этой интереснейшей науки. Вот тогда он и откроет эту часть пособия. Для облегчения восприятия материала в конце книги дан алфавитный словарь употреблявшихся генетических терминов. Надеемся, что знания, полученные в ходе знакомства с материалом данного пособия, помогут врачу-гинекологу более тесно и продуктивно общаться с пациентами и своевременно разрабатывать меры профилактики с учетом вклада наследственных факторов в этиологию и патогенез заболевания. Во квалифицированные многих случаях рекомендации по врач-гинеколог может консультированию и дать лечению больных лишь в тех случаях, если он овладел относительно простыми принципами медицинской генетики. Сложные случаи требуют обращения к специалисту. 1. Наследственные болезни с нарушением первичной половой дифференцировки 1.1. Генетика пола Очевидно, что дифференцировка пола происходит на нескольких уровнях. Можно говорит о поле: 1) генетическом; 2) гонадном; 3) гаметном; 4) гормональном; 5) анатомическом; 6) поведенческом (самосознание и выбор сексуального партнера); 7) воспитания; 8) гражданском (паспортном). Следствием нарушения генетического контроля любого из первых шести уровней половой дифференцировки может быть снижение репродуктивной функции. Определяющую млекопитающих роль играет в первичной Y-хромосома. При детерминации пола ее развитие отсутствии у происходит по женскому типу. Это свойство Y-хромосомы определяется наличием в ней гена SRY (от англ. sex-determing region Y). При мужском кариотипе (46, XY) и делеции гена SRY развитие идет по женскому типу, хотя при этом оно сопровождается дисгенезией гонад. С другой стороны перенос на X-хромосому локуса Yp11.3, содержащего ген SRY, может привести к формированию мужского фенотипа при женском кариотипе (46, XX). У таких мужчин также будут наблюдаться различные пороки развития половых органов и нарушения репродуктивной функции, обусловленные, в частности, отсутствием расположенного в длинном плече Y-хромосомы локуса AZF, участвующего в генетическом контроле сперматогенеза. Но не только гены Y-хромосомы, но также аутосомные и Ххромосомные гены, участвуют в детерминации пола. До 6-недельного возраста зачатки гонад у эмбриона развиваются как бипотенциальные образования. Наличие в них первичных половых клеток (гоноцитов) не является обязательным для формирования мужских гонад (яичек). Но при отсутствии гоноцитов нарушается дифференцировка яичников. В настоящее время идентифицировано несколько десятков генов, участвующих в контроле развития либо яичек, либо яичников. Среди первой группы SRY-родственный ген SOX9, локализованный в длинном плече хромосомы 17. Ко второй группе относится ген DAX1, локализованный в коротком плече Х-хромосомы. В морфогенезе гонад на ранней бипотенциальной стадии участвует также ген WT1, трансактивирующий ген SRY. Однако, половая дифференцировка гонад сама по себе недостаточна для формирования мужского или женского фенотипа. Вторичная детерминация пола происходит под действием гормонов, вырабатываемых яичками или яичниками. До начала половой дифференцировки выводящая система эмбриона представлена вольфовыми и мюллеровыми протоками. Обособление наружных половых органов начинается с пятой недели эмбриогенеза. У женщин мюллеровы протоки преобразуются в фаллопиевы трубы, матку и верхнюю треть влагалища, а вольфовы протоки атрофируются. У мужчин наоборот, мюллеровы протоки атрофируются, а вольфовы преобразуются в семявыносящие протоки и семенные пузырьки. В формировании мужского фенотипа участвуют два гормона: антимюллеров, вызывающий регрессию мюллеровых протоков, и тестостерон или андроген, под влиянием которого формируются не только половые органы, но и вторичные мужские половые признаки. Ген антимюллерова гормона (AMH), локализованный в области 19p13.2-3, активируется геном SRY на 7ой неделе беременности, и его экспрессия продолжается до пубертатного периода. Важную роль в формировании мужских половых признаков играет не только андроген, но и его рецептор, кодируемый расположенным в области Xq11 геном AR. Биосинтез тестостерона активируется продуктом гена SF1, локализованного в области 9q33. Важную роль в детерминации пола играют также эстрогены и их рецепторы. Однако при недостаточности мужских половых гормонов наружные половые органы формируются по женскому типу независимо от наличия или отсутствия эстрогенов. Мы перечислили только ключевые гены первичной половой дифференцировки. На самом деле количество генов, участвующих в контроле развития репродуктивной системы, очень велико: для яичка – более 1200, для яичника – более 500, для матки – более 1800 и для молочных желез – около 700. Функциональные взаимоотношения между этими генами определяют особенности репродуктивной системы в целом, а нарушения их работы ассоциированы с развитием наследственных заболеваний, затрагивающих половую сферу. В таблице наследственных 1 представлена заболеваний, краткая характеристика обусловленных нарушением некоторых первичной половой дифференцировки. Таблица 1. Наследственные нарушения половой дифференцировки Ген, локус; белок, функции SRY, Yp11.3; транскрипционный фактор с ДНК-связывающим HMGбоксом; трансактивируется геном WT1 Мутации Клинические проявления делеции, мутации в HMGбоксе реверсия пола, XY-женщины с дисгенезией гонад, 50%-ная вероятность опухолей гонад гермафродитизм, реверсия пола с частичным сохранением функции яичников XY-женщины без тестикулярной феминизации ХХ-мужчины, иногда с неполной маскулинизацией за счет эффекта положения при мужском кариотипе реверсия пола, XY-женщины с дисгенезией гонад и иногда с первичной недостаточностью надпочечников, высокая вероятность опухолей гонад мозаицизм мутации de novo SF1, 9q33; стероидогенный фактор 1, ядерный рецептор, вовлеченный в стероидогенез и дифференцировку гонад, трансактивируется геном WT1 транслокации Yp11.3 на Х-хромосому доминантные мутации на стадии недифференцированных гонад и трансактивирует ген DAX1 при женском кариотипе 46,XX адренокортикотропная недостаточность без дефектов яичников DAX1, Xp21.3-p21.2; нонсенс-мутации врожденная гипоплазия ядерный рецептор с новым и делеции со надпочечников у мальчиков в ДНК-связывающим доменом сдвигом рамки сочетании с гипогонадотропным считывания гипогонадизмом WT1, 11p13; доминантные опухоль Вильмса (почек), а также транскрипционный фактор, мутации наследственные синдромы (Денисучаствующий в морфогенезе Драш, Фрайзера и др.), в структуре мочеполовой системы и гонад которых имеются генитальные на ранней бипотенциальной аномалии (реверсия пола при стадии, активирует гены SRY и кариотипе 46, XY, SF1; супрессор опухолей псевдогермафродитизм), почечная недостаточность и опухоли Вильмса SOX9, 17q24.3-q25.1; доминантные кампомелическая дисплазия транскрипционный фактор с мутации с (нанизм с резким искривлением ДНК-связывающим HMGпреждевременной конечностей); у мужчин часто боксом; его трансактивация терминацией наблюдаются варьирующие по геном SRY необходима для трансляции или степени тяжести порки развития образования яичек из затрагивающие вторичных половых признаков недифференцированных ДНКвплоть до полной реверсии пола половых гонад; ранний тестис- связывающий специфический маркер; домен трансактивирует ген COL2A1 AMH, 19p13.2-3; рецессивные синдром незаращения мюллеровых антимюллеров гормон, мутации с протоков – мужской трансактивируется геном SRY преждевременной псевдогермафродитизм на 7-ой неделе беременности терминацией (при наличии мужских половых трансляции органов – крипторхизм, паховые грыжи, фаллопиевы трубы в AMHR2, 12q13; рецессивные рецептор антимюллерова инактивирующие паховом канале, в некоторых случаях диагностируются зачатки гормона мутации матки) полиморфные аллели в генах AMH и AMHR2 AR, Xq11; андрогеновый рецептор DHH, ; ген сегментной полярности Desert hedgehog FSHR, 2p21-p16; рецессивные мутации ассоциация с некоторыми проявлениями поликистоза яичников (уровнем андрогенов, отбором фолликулов) синдром тестикулярной феминизации при кариотипе 46,XY – ложный гермафродитизм, женское строение наружных половых органов при отсутствии яичников и матки, но при наличии яичек дизгенезия гонад XY-типа рецессивные гипергонадотропная дисгенезия рецептор фолликулостимулирующего гормона мутации яичников при нормальном 46, ХХкариотипе в сочетании с тяжелым остеопорозом и др. аномалиями (дизгенезия яичников 1 типа, аутосомно-рецессивная) гипергонадотропная недостаточность яичников, обусловленная дизгенезией яичников (дизгенезия яичников 2 типа, Х-сцепленная) при женском кариотипе истинный гермафродитизм или реверсия пола (46,ХХ-мужчины) BMP15, Xp11.2; костный морфогенетический белок 15, участвующий в регуляции фолликулогенеза доминантные мутации SRA2, 9p24; аутосомно-доминантный тестис-детерменирующий фактор AZF, Yq11.2; район локализации нескольких генов, участвующих в регуляции сперматогенеза (факторов азооспермии) делеции и транслокации 9p24 делеции сперматогенная недостаточность, необструктивная, Y-сцепленная (идиопатическая азооспермия или тяжелая олигоспермия) Insr, Igf1r и Irr; инсулиновые рецепторы трансгенные мыши с одновременной инактивацией трех рецепторов при кариотипе XY развитие по женскому типу с формированием яичников, низкий уровень экспрессии генов Sry и Sox9 Выделим основные группы этих болезней. 1.2. Реверсия пола, гермафродитизм Реверсия пола при кариотипе 46,XY, сочетающаяся с дисгенезией гонад, может быть обусловлена инактивацией гена SRY, кодирующего основной триггер дифференцировки пола по мужскому типу. Кроме того, подобное состояние, иногда сочетающееся с первичной недостаточностью надпочечников, может быть обусловлено присутствием доминантных мутаций в гене стероидогенного фактора 1 (SF1), участвующего в ранней дифференцировке гонад. Однако врожденная гипоплазия надпочечников у мальчиков без реверсии пола, но в сочетании с гипогонадотропным гипогонадизмом чаще всего объясняется присутствием мутаций не в гене SF1, а в гене DAX1, расположенном в коротком плече Х-хромосомы. Ген DAX1 является прямой мишенью гена стероидогенного фактора 1. Реверсия пола при мужском кариотипе может наблюдаться у больных кампомелической дисплазией, обусловленной мутациями в гене SOX9, кодирующем один из наиболее ранних маркеров дифференцировки яичек. Подчеркнем еще раз, что ген SOX9 активируется продуктом гена SRY. А сам ген SRY, также как ген SF1, на ранней бипотенциальной стадии развития гонад активируется продуктом гена WT1 – ключевым регулятором морфогенеза мочеполовой системы. Поэтому неудивительно, что некоторые мутации в гене WT1 сопровождаются генитальными аномалиями у мужчин, вплоть до полной реверсии пола, причем эти аномалии сочетаются с почечной недостаточностью и высокой предрасположенностью к возникновению опухолей почек (опухоли Вильмса) и гонад. По-видимому инсулиновый сигнальный путь также участвуют в активации гена SRY, так как одновременный «нокаут» трех генов инсулиновых рецепторов у трансгенных мышей приводит к резкому снижению экспрессии генов SRY и SOX9 при наличии Y-хромосомы и формированию женского фенотипа у XY-животных. Причиной реверсии пола при кариотипе 46,XX могут быть транслокации гена SRY на Х-хромосому, а также делеции и транслокации проксимального отдела короткого плеча хромосомы 9, где, по-видимому, расположен еще один ген, участвующий в контроле дифференцировки яичек. Некоторые мутации в перечисленных выше генах приводят не к полной реверсии пола, а к различным формам гермафродитизма. Подобные состояния могут наблюдаться при многих наследственных заболеваниях, обусловленных, в частности мутациями в генах антимюллерова гормона и его рецептора, а также андрогенового рецептора. 1.3. Дизгенезия гонад без реверсии пола Дизгенезия гонад XY-типа у мужчин обусловлена мутациями в аутосомном гене Гипергонадотропная сегментной полярности Desert hedgehog (DHH). дисгенезия яичников при нормальном женском кариотипе в сочетании с тяжелым остеопорозом и некоторыми другими аномалиями, наследующаяся по аутосомно-рецессивному типу, связана с мутациями в гене рецептора фолликуло-стимулирующего гормона. Это моногенное заболевание особенно часто встречается в Финляндии. сцепленный с полом вариант гипергонадотропной обусловлен присутствием доминантных А дисгенезии яичников мутации в гене BMP15, участвующим в регуляции фолликулогенеза. Напомним, что дизгенезия яичников объясняет около половины случаев первичной аменореи, и часто она связана с крупными перестройками в Х-хромосоме. 1.4. Мужское бесплодие Причины мужского бесплодия достаточно разнообразны. Геномные и сбалансированные хромосомные перестройки часто сопровождаются нарушением сперматогенеза. Аномалии кариотипа встречаются у 10-15% мужчин с азооспермией и у 5-8% – с олигозооспермией. До 30% необструктивной азооспермии и тяжелой олигозооспермии вызваны возникающими de novo в клетках сперматогенного ряда микроделециями, расположенными в Y-хромосоме в области Yq11.2. В дистальной части Yq11.2 идентифицирован локус AZF, получивший название «фактора азооспермии». В дальнейшем этот локус был разделен на 3 участка AZFa, AZFb и AZFc, и в каждом из них были идентифицированы гены, участвующие в контроле сперматогенеза. Чаще всего наблюдаются микроделеции в локусе AZFc, и они вызывают нарушения сперматогенеза различной степени тяжести. Делеции в AZFb связывают с более тяжелыми нарушениями. Делеции в AZFa обычно обнаруживаются при синдроме «только клетки Сертоли» I типа. В среднем, частота микроделеций в локусе AZF при азооспермии составляет 15% и при тяжелой олигозооспермии – 6%. Конечно, AZF не единственный локус, связанный со сперматогенезом. При муковисцидозе наблюдается прогрессирующая непроходимость семявыносящих протоков и нарушения сперматогенеза. Некоторые мутации в гене муковисцидоза (CFTR) приводят к врожденному билатеральному отсутствию vas deferens и аспермии (CBAVD) иногда без проявления других признаков муковисцидоза. Оказалось, что частота гетерозиготных носителей мутаций в гене CFTR среди пациентов с CBAVD составляет 47%. Более того, по крайней мере, 14% мужчин с азооспермией и 17% – с олигозооспермией являются гетерозиготными носителями мутаций в гене CFTR. 2. Наследственные болезни с нарушением репродуктивной функции 2.1. Хромосомные болезни Все хромосомные болезни сопровождаются нарушением репродуктивной функции, и за редким исключением такие больные не оставляют потомства. Довольно часто числовые аномалии затрагивают половые хромосомы. Так, отсутствие одной из Х-хромосом у женщин приводит к синдрому Шерешевского-Тернера, а присутствие дополнительной Х-хромосомы у мужчин – к синдрому Клайнфельтера. Оба эти заболевания характеризуются бесплодием и различными отклонениями от нормального развития. 2.1.1. Синдром Шерешевского-Тернера Синдром Шерешевского-Тернера или моносомия по Х-хромосоме наблюдается только у женщин. Первым описал это заболевание наш соотечественник Н. А. Шерешевский в 1925 году, затем в 1938 году американский эндокринолог Х. Тернер. Наличие моносомии-Х можно предположить у новорожденных девочек с массой тела не более 2500 г., с крыловидными складками кожи на шее сзади и лимфатическим отеком кистей и стоп. Подобные клинические проявления наблюдается у половины новорожденных с синдромом Шерешевского-Тернера. Происхождение лимфатического отека объясняется сердечно-сосудистой недостаточностью, развивающейся вследствие врожденного наблюдаемого у этих больных. порока сердца, нередко Примерно у четверти больных диагностируются пороки развития внутренних органов, чаще всего сердца и почек. До 9-10 лет больные девочки развиваются без особенностей. Затем у них отмечается отставание в росте и легкая степень задержки психического развития. Малыми признаками дизэмбриогенеза при этом заболевании является эпикант, реже птоз (опущение верхнего века), косоглазие, помутнение хрусталика и/или роговицы глаз. Рисунок 1. Больная синдромом Шерешевского-Тернера Ведущим симптомом болезни Шерешевского-Тернера является половой инфантилизм, связанный с дисгенезией гонад, что в полной мере раскрывается в пубертатном периоде и старше. Гениталии имеют женское строение со значительной степенью недоразвития. Половой инфантилизм, первичная аменорея и бесплодие являются следствием изменений в гонадах, которые вызваны отсутствием одной Х-хромосомы. У больных не происходит нормального образования примордиальных фолликул. Рисунок 2. Кариотип больной синдромом Шерешевского-Тернера Герминальные и фолликулярные клетки дегенерируют и почти не вырабатывают эстрогены. Следствием этого является первичная аменорея, недоразвитость молочных желез, скудное оволосение на лобке и в подмышечных впадинах. У больных наблюдается гормонозависимое снижение роста. В возрасте 16-23 лет рост больных обычно не превышает 135 см – рис. 1. Маленький рост девушки в сочетании с первичной аменореей является обязательным показанием к ее кариотипированию, при котором наблюдается отсутствие одной Х-хромосомы – 45,Х (рис. 2). Частота заболевания равна 1:2000 – 1:5000 новорожденных, а при росте взрослых женщин 130 – 145 см эта частота возрастает до 1:14У части девушек, которым клинически поставлен диагноз этой хромосомной болезни, может наблюдаться мозаичный вариант заболевания. В этом случае у больных наряду с клетками, имеющими нормальный кариотип, наблюдаются клетки с патологическим кариотипом, то есть без одной Х-хромосомы. Кариотип в этих случаях выглядит так: 46,ХХ/45,Х. У некоторых женщин с мозаичным вариантом болезни Шерешевского-Тернера наблюдается нормальное развитие вторичных половых признаков, включая гениталии. Более того, такие женщины способны в отдельных случаях беременеть традиционным способом. Некоторым из них применяются методы экстракорпорального оплодотворения. Конечно, таким беременным нужно проводить пренатальное кариотипирование для исключения хромосомной аномалии у плода. 2.1.2 Синдром Клайнфельтера описан в 1942 году. Характерными симптомами этого заболевания являются бесплодие, атрофия яичек, олигоспермия (маленький объем эякулята) и азооспермия (отсутствие сперматозоидов в сперме), выявляемые при исследовании спермограммы, гинекомастия и нередко умственная отсталость. Клиническая симптоматика болезни наиболее выражена в препубертатном и пубертатном возрасте. Чаще такие больные выявляются медицинской комиссией в военкомате при осмотре допризывников. Юноши с синдромом Клайнфельтера отличаются от сверстников высоким ростом и несоответствием роста и размера размаха рук, который иногда превышает рост не менее чем на 10 см, евнухоидным телосложением (длинные ноги, высокая талия, относительно широкий таз) со склонностью к ожирению. Половой член нормальных размеров, яички опущены в мошонку, но мягкие на ощупь и очень маленькие. Диаметр яичек редко превышает 1,5 см, в то время как у здорового юноши эта величина равна 5 см. Частота синдрома среди новорожденных мальчиков составляет 1:850, в популяции равна 1:18000 здоровых мужчин, среди мальчиков, у которых наблюдается отставание психического развития, – 1:100 и такая же частота наблюдается среди мужчин, страдающих бесплодием. При лечении больных синдромом Клайнфельтера применяются мужские половые гормоны (тестостерон пропионат и его аналоги). При гинекомастии – хирургическое вмешательство. По показаниям могут быть рекомендованы психостимуляторы и нейрометаболические препараты, как это общепринято при других формах олигофрении. При создании семьи показано применение вспомогательных репродуктивных технологий с использованием донорской спермы. В 1958 году в работе П. Е. Полани с соавторами впервые при цитогенетическом исследовании больных синдромом Клайнфельтера были выявлены две Х-хромосомы наряду с Y-хромосомой. В дальнейшем оказалось, что самым распространенным вариантом кариотипа при синдроме Клайнфелтера является 47, ХХУ, но встречаются больные, у которых число Х-хромосом доходит до 4-х и более. Таким образом, указанные выше симптомы являются основанием для исследования кариотипа пациента. 2.2. Моногенные болезни. В настоящее заболеваний, время описано затрагивающих репродуктивные известными из них являются тестикулярной феминизации несколько десятков моногенных функции. Наиболее адреногенитальный синдром, синдром и другие наследственные заболевания, обусловленные нарушением первичной половой дифференцировки. 2.2.1. Адреногенитальный синдром. Примером наследственного нарушения обмена стероидных и глюкокортикоидных гормонов является адреногенитальный синдром или врожденная гиперплазия надпочечников. Заболевание впервые описано в 1886 году J. Phillips. Частота адреногенитального синдрома по данным разных авторов составляет 1 на 5000 – 15000 новорожденных, частота гетерозиготного носительства 1 на 20-50 человек. Только в середине прошлого века были раскрыты патогенез и характер гормональных нарушений при этом заболевании. Рисунок 3. Метаболизм адреногенитального синдрома стероидов и генетические варианты При адреногенитальном синдроме наблюдается гиперплазия коры надпочечников, что ведет к патологической концентрации кортизола в ответ на стимуляцию адренокортикотропного гормона. Это связано с уменьшением или отсутствием ферментативной активности на некоторых стадиях синтеза стероидов – рис. 3. За дефицитом каждого из ферментов следует специфическая для данного нарушения клиническая картина заболевания. В настоящее время описано 5 клинических вариантов адреногенитального синдрома. Около 90% всех случаев заболевания относится к дефициту ключевого фермента биосинтеза гормонов коры надпочечников – 21-гидроксилазы, обусловленному мутациями в гене CYP21A2 (так называемый синдром дефицита 21-гидроксилазы – СД21-Г). В редких случаях у больных идентифицированы мутации в генах, кодирующих другие ферменты биосинтеза глюкокортикоидов и минералокортикоидов. При этом варианте наблюдается уменьшение уровня кортизола в плазме крови, вызванное нарушением превращения 17-гидрооксипролина в 11-дезоксикортизол. Это в свою очередь вызывает избыточную секрецию адренокортикотропного гормона и далее повышение продукции предшественников кортизола, андрогенов и половых стероидов. Подобные дефекты гормонального метаболизма приводят, прежде всего, к нарушениям развития в области половой сферы. Заболевание характеризуется значительной клинической гетерогенностью. Классические варианты делятся на тяжелую сольтеряющую и более легкую простую вирильную формы. В первом случае у больных наблюдаются выраженные нарушения солевого обмена в виде гипонатриемии и гиперкалиемии, которые у новорожденных или в раннем неонатальном периоде могут приводить к летальным сольтеряющим кризам. Нарушения солевого метаболизма сопровождаются различными пороками развития наружных половых органов, выраженность которых зависит от степени остаточной активности дефектного фермента. При простой форме заболевания, которая клинически проявляется в виде изолированной вирилизации наружных половых органов, не наблюдается грубых нарушений гормонального метаболизма, так как происходит компенсация частичной недостаточности 21-гидроксилазы. Неклассические или взрослые варианты включают различные нарушения полового созревания в подростковом или пубертатном возрасте в виде гирсутизма, акне, аменореи, бесплодия. В некоторых случаях подобные патологические состояния у больных женщин развиваются после рождения ребенка. Выделяют также позднюю неклассическую и латентную бессимптомную формы заболевания. Простая форма составляет 1/3 всех случаев заболевания. У девочек с рождения наблюдаются признаки маскулинизации вплоть до трудности определения пола ребенка, что диктует немедленное исследование кариотипа или хотя бы полового хроматина. У мальчиков вирильная форма диагностируется с 5 лет и старше при появлении признаков преждевременного полового развития. Опережение физического и полового развития может быть причиной неадекватного поведения, психических нарушений, преимущественно эмоционально-волевой сферы. У взрослых больных наблюдается олигоспермия (пониженный объем эякулята) и бесплодие. У девочек – гиперпигментация в области гениталий и грудных желез. При сольтеряющей форме кроме вышеуказанных симптомов уже в периоде новорожденности ребенка наблюдаются срыгивания, упорная рвота, потеря веса, признаки эксикоза; характерно развитие коллаптоидных кризов с цианозом и бледностью, потливостью, потеря сознания, иногда судороги. Характерна внезапность возникновения кризов, длительность которых может варьировать от нескольких минут до получаса. Необходимо отметить, что данные кризы, протекающие с недостаточностью кровообращения, могут приводить к гибели больного. В крови отмечается гиперкалиемия, метаболический ацидоз, может быть гипогликемия. При третьей поздней неклассической форме у новорожденных девочек отсутствуют признаки вирилизации. Первые проявления патологии манифестируют в подростковом возрасте. Для девочек характерно ранние менархе (возраст наступления первой менструации), до развития молочных желез, гирсутизм, маскулинное телосложение. Для мальчиков - ускорение костного возраста с ранним закрытием ростовых зон, преждевременное оволосение лобковой области. Клинические проявления четвертой латентной формы заболевания отсутствуют, хотя, как и при других формах, в сыворотке крови наблюдается умеренное повышение предшественников кортизола, включая 17-гидрооксипролин. Ген CYP21A2 расположен в коротком плече хромосомы 6 (6p21.3) в области локализации HLA-генов класса III. Эта область отличается высокими рекомбиногенной и мутагенной активностями. В частности, в непосредственной близости от гена CYP21A2 расположен псевдоген CYP21A1P, неактивный вследствие наличия целой серии мутаций. Спектр мутаций в гене CYP21A2 у больных адреногенитальным синдромом хорошо изучен. Широкое распространение в разных популяциях имеют крупные делеции, включающие весь ген CYP21A2, мутации, гомологичные тем, которые присутствуют в псевдогене CYP21A1P и «химерные» конструкции, состоящие из фрагментов гена CYP21A2 и псевдогена CYP21A1P. На рис. 4 представлен пример молекулярной диагностики мажорных мутаций в гене CYP21A2. При различных классических вариантах адреногенитального синдрома – сольтеряющей и простой – выявляются разные мажорные мутации. В первом случае самой частой является делеция всего гена (delA2), присутствующая почти у половины отечественных больных, в то время как во втором случае на первое место выступает сплайсинговая мутация (28%). Среди пациентов с подозрением на неклассический вариант врожденной гиперплазии коры надпочечников мутации идентифицируются примерно в 10% хромосом больных. Интересно отметить, что у больных адреногенитальным синдромом идентифицированы два типа химерных конструкций между геном CYP21A2 и псевдогеном CYP21A1P, причем одна из них является полиморфной, так как ее частота в отечественной популяции достигает 6%. Но еще выше – около 15% – эта частота оказывается среди больных с неклассической формой врожденной гиперплазии коры надпочечников, подтвержденной биохимическим тестированием. Рисунок 4. Диагностика мажорных мутаций в гене CYP21A2 у больных адреногенитальным синдромом (данные лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний ИАГ им. Д. О. Отта РАМН, зав. лаб. чл-корр. РАМН проф. В. С. Баранов, любезно предоставленные к.б.н. Н. С. Осиновской). При этом общая частота двух «химерных» конструкций в хромосомах этой группы больных составляет 25%. Еще более высокая частота полиморфной «химерной» конструкции обнаруживается в хромосомах женщин с идиопатической андрогенизацией – 28,5%, а суммарная частота обеих «химерных» конструкций в хромосомах этих больных составляет 38%, что, безусловно, указывает на ассоциацию этого состояния с присутствием гетерозиготных «химерных» конструкций между геном CYP21А2 и псевдогеном CYP21A1P. Во многих медико-генетических центрах страны проводится скрининг среди новорожденных на содержание в крови 17-гидрооксипрогестерона с целью раннего выявления больных адреногенитальным синдромом. Пороговая цифра концентрации этого белка составляет 30 нмоль/л. При таком показателе и выше исследование повторяется, а также выполняется ДНК-диагностика При всех применяется заместительная формах адреногенитального синдрома терапия минерало-, глюкокортикоидными препаратами, в зависимости от формы заболевания – симптоматическая терапия. 3. Генетический контроль остеопороза Остеопороз - это системное заболевание скелета, характеризующееся снижением массы костей и микронарушениями в архитектонике костной ткани, приводящими к увеличению хрупкости костей и переломам. Клиническими проявлениями инволюционного остеопороза являются: сухость кожи, ломкость ногтей, урогенитальные атрофические процессы, боли в суставах, костях, мышцах, ограничение подвижности и переломы. Постменопаузальный остеопороз I типа, в первую очередь, связан с недостаточной продукцией эстрогенов. Для начального периода заболевания характерны переломы лучевой кости. В возрасте 60–70 лет обнаруживаются компрессионные переломы тел позвонков. У пациентов старше 70 лет чаще случаются переломы шейки бедра. Сенильный остеопороз II типа характеризуется снижением образования витамина D и/или развитием устойчивости к его действию, сочетающимся с гиперпродукцией паратиреоидного гормона. Несмотря на то, что остеопороз принято считать возрастным заболеванием, на ход развития заболевания влияют такие факторы, как: низкое содержание кальция и фосфора в пище, вредные привычки (курение и употребление алкоголя), избыточный вес, астеничность телосложения. Костная ткань, на первый взгляд не подвергающаяся никаким изменениям, на самом деле постоянно обновляется, и каждые 10 лет старая костная ткань заменяется новой. У детей и подростков образование новой костной ткани происходит быстрее, чем резорбция, и ее плотность увеличивается, достигая максимума к 18 годам. Затем наступает равновесие – оба процесса идут с одинаковой скоростью. Примерно к 40 годам начинается возрастное истончение костей, и резорбция постепенно начинает преобладать над увеличением минеральной плотности кости. Вероятность развития остеопороза у женщин гораздо больше, чем у мужчин: на их долю приходится 80% случаев этого заболевания. С возрастом женщины лишаются одного из важных "протекторов" костной ткани – эстрогенов, и с наступлением менопаузы скорость резорбции у них резко возрастает. Основным регулятором ремоделирования костной ткани является секретируемый гликопротеин остеопротегерин (или остеокластогенез- ингибирующий фактор) – один из членов семейства рецепторов фактора некроза опухолей. Остеопротегерин в своей активной форме подавляет дифференцировку остеокластов. Активность остеопротегерина падает при его взаимодействии с соответствующим лигандом. Характер ремоделирования костной ткани во многом определяется балансом между продукцией остеопротегерина, его лиганда и рецептора для этого лиганда. Повышенное соотношение лиганд/остеопротегерин ассоциируется со способностью поддерживать формирование и активацию остеокластов. Когда клетки дифференцируются, соотношение лиганд/остеопротегерин уменьшается. Эстроген индуцирует экспрессию остеопротегерина в остеобластах и подавляет экспрессию лиганда, что и приводит к блоку остеокластогенеза и сдерживанию процесса разрушения костной ткани. С возрастом по мере уменьшения количества эстрогенов сдерживающий эффект ослабевает, а с появлением менопаузы вообще исчезает. Кроме того, эстроген увеличивает время жизни остеобластов и одновременно способствует саморазрушению остеокластов. Триггерами остеокластогенеза систематическая активация которых приводит к лиганда и резорбции являются Т-клетки, увеличению экспрессии костной ткани. На экспериментальной модели Т- клеточного воспалительного артрита у крыс показано, что назначение животным остеопротегерина в начальный период развития болезни предотвращает деструкцию костной и хрящевой ткани, но не подавляет воспаление. В редких случаях остеопороз наследуется как моногенное заболевание. Иногда его трудно отличить от мягких форм несовершенного остеогенеза, обусловленного доминантными мутациями в генах коллагена I типа – COL1A1 и COL1A2. Поэтому неудивительно, что около 2% таких мутаций ассоциированы с остеопорозом. Найдена (CALCA) у больных с мутация, в гене кальцитонина ювенильной формой остеопороза. Доказана связь некоторых доминантных форм остеопороза, а также синдрома «остеопороз-псевдоглиома» с мутациями в гене одного из рецепторов липопротеинов низкой плотности - LRP5. Однако в общем случае остеопороз следует рассматривать как гетерогенную группу мультифакториальных заболеваний. Генетическими факторами риска, формирующими наследственную предрасположенность к мультифакториальному заболеванию, являются широко распространенные среди населения полиморфные аллели генов, в относительно небольшой степени влияющие на их активность, так называемые функциональные полиморфизмы. Продукты этих генов, получивших название генов- кандидатов или генов предрасположенности, как правило, являются участниками соответствующих патологических метаболических путей или формируют защитные функции организма. Полиморфные аллели генов- кандидатов лишь в том случае являются генетическими факторами риска, если их частоты в выборках больных достоверно превышают контрольные уровни. Доказана ассоциация остеопороза с тремя полиморфными аллелями, локализованными в промоторной области гена COL1A1. Особенно четко эта связь прослеживается с G-T заменой в Sp1-сайте гена COL1A1 (Sp1- полиморфизм). Эта замена не затрагивает структуру альфа1-цепи коллагена I типа, но снижает скорость еѐ синтеза. Частота Sp1-полиморфизма в различных популяциях составляет около 20%, и она становится, по крайней мере, вдвое больше в выборках больных с тяжелыми формами остеопороза или переломами позвоночника. G/T-гетерозиготы имеют достоверно более низкую минеральную плотность кости по сравнению с нормальными G/Gгомозиготами. Это неудивительно, если учесть, что экстраклеточные фибриллы коллагена I типа участвуют в поддержании минеральной плотности кости. Определенную роль в патогенезе остеопороза играют антагонисты костных морфогенетических белков, такие как ноггин и склеростин. Один из полиморфизмов гена склеростина (SOST), ассоциирован с уменьшением минеральной плотности кости в головке бедра и поясничных позвонках у женщин, что и приводит к формированию наследственной предрасположенности к постменапаузальному остеопорозу. При сочетании полиморфизмов в генах SOST и COL1A1 наблюдается аддитивный эффект, и риск развития постменапаузального остеопороза увеличивается почти в 10 раз. Гомозиготные инактивирующие мутации в гене остеопротегерина (OPG) являются причиной развития деформирующего ремоделированием остоза, костной ювенильной болезни Педжета или характеризующегося ткани, остеопенией, ускоренным множественными переломами и прогрессирующими скелетными деформациями. В ряде исследований было показано, что полиморфные аллели в промоторной области гена OPG ассоциированы с пониженной минеральной плотностью кости у постменапаузальных женщин. Интересно подчеркнуть, что в обширных геном-скринирующих исследованиях было показано сцепление остеопороза с областями локализации генов остеопротегерина (OPG), его лиганда (OPGL) и рецептора для этого лиганда (RANK). Дисбаланс системы OPGL/RANK/OPG приводит к серьезным нарушениям ремоделирования костной ткани, что и лежит в основе ее разрушения при некоторых формах постменопаузального остеопороза, болезни Педжета, костных потерях при метастазах рака и ревматоидном артрите. Остеопротегерин претендует также на роль долго разыскиваемого недостающего звена между остеопорозом и поражением артерий – два этих состояния очень часто сочетаются. Показано, что инактивация гена Opg у трансгенных мышей приводит к развитию раннего остеопороза, переломам позвонков у взрослых особей, в сочетании с кальцификацией аорты и почечных артерий. Не исключено, что остеопротегерин может замедлять процесс снижения минеральной плотности кости и предотвращать кальцификацию крупных артерий. В настоящее время начато генноинженерное производство остеопротегерина, который уже применяется в клинических испытаниях как средство лечения остеопороза. Дефицит эстрогенов способствует также снижению концентрации кальцитонина — гормона пептидной природы, который вырабатывается парафолликулярными клетками щитовидной железы. В норме кальцитонин тормозит резорбцию костной массы и высвобождение из нее кальция и фосфата. При недостатке эстрогенов содержание цитокинов и простагландинов падает, появляются ―пустые‖ рецепторы эстрогенов, что усиливает разрушение кости. Одна из полиморфных мутаций в гене рецептора кальцитонина (CALCR) ассоциирована с достоверным снижением костной массы у постменапаузальных женщин. Противоречивые данные получены в отношении связи остеопороза с полиморфными аллелями гена рецептора витамина Д (VDR). При взаимодействии рецептора витамина Д с кальцитриолом (активной формой витамина Д) происходит индукция синтеза остеокальцина - мажорного неколлагенового белка костной ткани, ответственного за минерализацию кости. Некоторые полиморфизмы в гене VDR могут влиять на уровень сывороточного остеокальцина. Однако прямой ассоциации между полиморфизмами гена VDR и минеральной плотностью кости не найдено. Эти полиморфизмы могут оказывать эффект на формирование предрасположенности к остеопорозу лишь в комбинации с какими-то другими генетическими или средовыми факторами риска. Более определенно доказана ассоциация с пониженной минеральной плотностью кости и остеопорозом различных полиморфных аллелей, расположенных в промоторной области гена рецептора эстрогенов – ESR1. Частота остеопороза у носителей неблагоприятных полиморфных аллелей гена ESR1 в зависимости от генотипа становится в 2,5 – 10 раз выше по сравнению с нормой. Первая модель наследственного остеопороза была получена путем инактивации у мышей гена малого интерстициального протеогликана-I – бигликана. Мутантные гомозиготы характеризуются задержкой костного возраста и развитием остеопороза. Склонность к остеопорозу у трансгенных животных развивается вследствие снижения скорости роста костей и уменьшения их массы. Направленная инактивация у мышей гена остеопонтина – структурного белка внеклеточного матрикса, ответственного за минерализацию кости, приводит к повышению устойчивости трансгенных животных к резорбции кости, индуцируемой овариоэктомией. Эти результаты указывают на специфическую роль остеопонтина в формировании постменапаузального остеопороза. Возможно, подавление активности остеопонтина в постменапаузальный период может оказывать протективную роль в отношении развития остеопороза у женщин. В таблице 2 указаны основные гены-кандидаты, функциональные полиморфизмы которых могут быть ассоциированы с остеопорозом. Таблица 2. Гены-кандидаты, ассоциированные с остеопорозом Ген Белок COL1A1 CALCR альфа1-цепь коллагена мажорного фибриллярного коллагена I типа склеростин – антагонист костных морфогенетических белков остеопротегерин или остеокластогенез-ингибирующий фактор – один из членов семейства рецепторов фактора некроза опухолей лиганд остеопротегерина рецептор лиганда остеопротегерина кальцитонин – пептидный гормон, вырабатываемый парафолликулярными клетками щитовидной железы рецептор кальцитонина LRP5 рецептор 5 липопротеинов низкой плотности ESR1 рецептор I эстрогенов VDR рецептор витамина Д BGN OPN протеогликан-I, бигликан остеопонтин, секретируемый фосфопротеин 1, обеспечивающий прикрепление остебластов к неорганическому компоненту костного матрикса SOST OPG OPGL RANK CALCA 4. Генетический контроль эндометриоза Эндометриоз – доброкачественное разрастание ткани, сходной по своим морфологическим и функциональным характеристикам с эндометрием. Эндометриоз может быть «внутренний» или «наружный» при расположении в теле матки или за ее пределами. Основными клиническими проявлениями эндометриоза, поражающего от 6% до 10-15% женщин репродуктивного возраста, являются дисаменоррея, тазовые боли и бесплодие. Риск развития эндометриоза у тех женщин, у которых имеется больная мать или сестра, вдвое выше общепопуляционного. Таким образом, вклад генетических составляющих в семейные формы эндометриоза не вызывает сомнения. Эндометриоз - эстроген-зависимая болезнь, и при локальном снижении концентрации эстрогенов может наблюдаться регресс эндометриоидных разрастаний. В эндометриоидных тканях резко повышена активность генов, участвующих в генетическом контроле стероидогенеза. Это гены стероидогенного фактора 1 (SF1), стероидогенного регуляторного фактора (STAR) и ароматазы, увеличивающие локальную продукцию эстрогенов. Стероидогенный регуляторный фактор облегчает вхождение холестерина в митохондрии, ароматаза катализирует финальный шаг конверсии C19 стероидов в эстрогены. В нормальных тканях эндометрия эти ферменты не обнаруживаются. Их производство регулируется стероидогенным фактором 1, который является ключевым регулятором эндокринных связей между гипотоламусом, гипофизом и надпочечниками, а также гипотоламусом, гипофизом и гонадами. В стромальных клетках эндометриоидных разрастаний экспрессия гена SF1 повышена более чем в 50 раз, причем это повышение идет за счет гипометилирования промоторной области гена. В связи с вышесказанным перспективным представляется использование ингибиторов ароматазы при лечении эндометриоза с целью локального снижения уровня эстрогенов в эндометриоидных разрастаниях. Важную роль в генезе эндометриоза отводят медиаторам межклеточных взаимодействий, в частности, цитокинам. Эндометриоидные клетки характеризуются повышенной активностью интерлейкина-8, интерлейкина-6 и фактора некроза опухолей α. Полиморфные аллели соответствующих генов, повышающие активность этих цитокинов, рассматриваются в настоящее время как генетические факторы риска, предрасполагающие к развитию эндометриоза. Около 60% больных эндометриозом оказываются нечувствительны к гормональным препаратам, у части из них развиваются побочные эффекты. Различная реакция пациентов на терапию часто зависит от состояния генов, участвующих в лекарственном метаболизме. Определяющая роль в этом процессе принадлежит ферментам детоксикации ксенобиотиков. 1-я фаза детоксикации осуществляется с участием цитохромов p450, эпоксид гидролазы и других ферментов, 2-я и 3-я фазы – с участием глютатион-S-, Nацетил- и других трансфераз. В генах системы детоксикации найдены многочисленные полиморфные аллели, влияющие на их активность. Ассоциация с эндометриозом найдена для нулевого аллеля гена GSTT1 и полиморфизмов гена микросомальной эпоксид гидролазы mEPHX1, понижающих активность фермента (так называемые «медленные» аллели). Риск эндометриоза у носителей полиморфных аллелей каждого из этих генов увеличен примерно вдвое. Найдены ассоциации определенных сочетаний генотипов (GSTM1 0/0 + GSTT1 0/0 и GSTM1 0/0 + NAT2 S/S) с тяжелыми формами заболевания. При сочетании неблагоприятных генотипов по четырем генам фазы 2 системы детоксикации риск эндометриоза увеличивается в 3 – 10 раз, причем именно эти больные оказываются в большей степени устойчивы к лечению гормонами. Результаты исследований, проведенных в лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний ИАГ им. Д. О. Отта РАМН, возглавляемой чл-корр. РАМН проф. В. С. Барановым, убедительно свидетельствуют о наличии прямой зависимости между риском возникновения эндометриоза, тяжести его течения, эффективности лечения и функциональным состоянием генов системы детоксикации. А это, в свою очередь, свидетельствует о роли неблагоприятных экзогенных факторов, таких как промышленные загрязнения, сельскохозяйственные и другие яды, в возникновении и распространении эндометриоза. Производные ароматических углеводородов, свободные радикалы, перекиси и другие вредные для клеток продукты метаболизма ксенобиотиков играют важную роль в этиологии эндометриоза. Глютатион-S-опосредованная детоксикация обеспечивает резистентность клеток к перекисному окислению липидов, свободным радикалам, алкилированию белков, а также предотвращает поломки ДНК. Функционально неполноценные аллели генов детоксикации, особенно «нулевые» варианты глютатион-S-трансфераз, обнаруживают наиболее выраженную ассоциацию с эндометриозом. Таким образом, молекулярное тестирование женщин репродуктивного возраста на наличие неблагоприятных вариантов генов детоксикации и их сочетаний должно быть внедрено в клиническую практику с целью досимптоматического выявления женщин, имеющих высокий генетический риск развития эндометриоза, и разработки комплексной профилактики этого частого инвалидизирующего заболевания. 5. Вклад генетических составляющих в этиологию онкологических заболеваний, затрагивающих половую сферу 5.1. Молекулярные основы канцерогенеза В настоящее время не вызывает сомнения тот факт, что ведущая роль в возникновении и развитии канцерогенеза принадлежит генетическим нарушениям. Многие неблагоприятные факторы окружающей среды могут оказывать воздействие на этот процесс, однако подобное влияние чаще всего опосредуется через накопление мутаций в генах. Около 1% генов человека связаны с канцерогенезом. Мутации в этих генах служат предпосылкой для развития неопластического процесса, и они часто обнаруживаются в опухолевых тканях больных и в многочисленных культивируемых раковых линиях клеток. Эти гены делятся на два класса, как по характеру своего действия, так и по типам кодируемых белков. Первый класс - это протоонкогены или доминантные онкогены. Их продукты, как правило, участвуют в позитивном контроле клеточного роста. Второй класс составляют супрессоры опухолей или рецессивные онкогены, называемые также антионкогенами. Кодируемые этими генами белки часто являются негативными регуляторами клеточного роста и в норме обладают противоопухолевым эффектом. К доминантным онкогенам относятся гены сигнальной трансдукции, определяющие переход клетки от состояния покоя к делению. Это гены факторов роста, их рецепторов, промежуточных молекул, передающих сигнал от мембраны к ядру и ядерных транскрипционных факторов – регуляторных белов, способных координировано запускать или подавлять работу целых каскадов других генов, экспрессия которых необходима для деления клетки. В некоторых случаях канцерогенный эффект доминантных онкогенов обусловлен гиперпродукцией кодируемых белков, что характерно, в частности, для генов факторов роста и их рецепторов. В опухолевых тканях больных часто наблюдается избирательное увеличение числа копий (амплификация) этих генов. Однако для других протоонкогенов в большей степени характерны не амплификации, а доминантные мутации, которые приводят к образованию аномального продукта, обладающего новой агрессивной функцией. В общем случае, у мутантного белка появляется способность к передаче сигнала, индуцирующего клетку к делению, при отсутствии внешнего стимула. Это приводит к постоянной активации всей сигнальной цепи и неконтролируемому делению клетки. Необходимой предпосылкой для роста опухолей и образования метастазов является неоваскуляризация. Ключевую роль в неоангиогенезе опухолей играет ростовой фактор эндотелия сосудов Vegf, обладающий не только выраженной митогенной активностью, но способный вызывать миграцию и инвазию в коллагеновый слой клеток эндотелия, одновременно повышая проницаемость сосудов. В норме ген VEGF не экспрессируется в клетках эндотелия, но его активация происходит во многих типах опухолевых клеток, особенно, если они находятся в условиях гипоксии. В то время как доминантные онкогены интенсивно исследуются уже на протяжении нескольких десятилетий, участие в инициации и промоции канцерогенеза генов, вовлеченных в контроль системы негативных регуляторов роста, было обнаружено значительно позднее. Для проявления трансформирующего эффекта этих генов необходима инактивация обоих гомологичных аллелей, сопровождающаяся потерей их функции. Для многих рецессивных онкогенов характерно присутствие гетерозиготных делеций в области их локализации, причем не во всех, а только в опухолевых тканях больного. Это явление получило название потеря гетерозиготности (LOH). Инактивация второго гомологичного аллеля, как правило, достигается за счет мутаций, либо эпигенетических модификаций соответствующего гена-супрессора. Гетерозиготные носители мутаций в антионкогенах, так называемые зародышевые мутанты, часто имеют повышенную наследственную предрасположенность к возникновению онкологических заболеваний, дебютирующих в относительно молодом возрасте. Это наследственные формы раков. Фундаментальным свойством опухолевых клеток является генетическая нестабильность, которая проявляется как на хромосомном уровне, так и на уровне отдельных генов и других генетических маркеров. В процессе эволюции были выработаны мощные механизмы, направленные на поддержание стабильности генетического материала при делении клеток. Одним из таких механизмов является репарация ДНК, то есть исправление дефектов, происходящих в процессе ее репликации. Второй механизм – арест продвижения клетки по циклу в ответ на повреждение ДНК. И третий – направление клетки к апоптозу при невозможности исправления дефекта. Реализация системы ареста клетки для проведения репарации ДНК и направления ее к апоптозу осуществляется с помощью негативных регуляторов роста, важнейшим из которых является транскрипционный фактор p53, кодируемый геном TP53. Многие гены, кодирующие ферменты репарации и негативные регуляторы роста, в том числе и TP53, относятся к классу супрессоров опухолей. Существенный вклад в инвазию и метастазирование опухолевых клеток вносят генетические нарушения межклеточной адгезии. Продукты генов, участвующих в контроле межклеточных взаимодействий, могут проявлять себя как антионкогенам, относятся (CTNNB1). В супрессоры опухолей. В также частности, гены Е-кадхерина (CDH1) и к -катенина регуляции фокальной адгезии клеток и сигнальной трансдукции участвует известный антионкоген PTEN. Критическую роль в осуществлении адгезии клеток играет композиция внеклеточного матрикса, в формировании которой непосредственное участие принимают матриксные металлопротеиназы. Известно, что на скорость возникновения мутаций существенное влияние могут оказывать как экзогенные, так и эндогенные факторы. Любые физические и химические воздействия, усиливающие мутагенез, такие как облучение или действие мутагенов, обладают канцерогенным эффектом и приводят к развитию индуцированных форм раков. С другой стороны, наследование инактивирующей мутации в одном из генов-супрессоров опухолей может, опосредовано, приводить к значительному увеличению частоты возникновения соматических мутаций в других онкогенах и антионкогенах, а значит и к ускорению злокачественной трансформации клетки. Мы уже говорили о том, что это наследственные формы онкологических заболеваний. Их передача в ряду поколений подчиняется законам Менделя. Суммарная частота среди населения носителей доминантных мутаций в антионкогенах в разных популяциях колеблется в пределах от 0,5% до 2%. Они объясняют от 5% до 10% рака молочной железы, 20-30% случаев рака яичника и до 15% случаев рака толстой кишки и эндометрия, развившихся в возрасте до 50 лет. Главными и в большинстве случаев единственными клиническими проявлениями наследственных раков являются новообразования, причем риск их появления с возрастом достигает 80-100%. Для них типичен более ранний дебют, высокая частота билатерального развития патологии и рецидивирующий характер заболевания, при этом локализация повторно возникшей опухоли может отличаться от первичной. В настоящее время доказано, что некоторые функциональные полиморфные аллели в протоонкогенах или в генах ферментов метаболизма канцерогенов являются генетическими факторами риска, предрасполагающими к развитию опухолей. В этих случаях частоты полиморфных аллелей в выборках больных будут достоверно превышать контрольные уровни, и этот эффект становится особенно очевиден, когда больной подвергается действию канцерогенов. Онкологические заболевания, ассоциированные с подобными полиморфизмами, формально относятся к классу мультифакториальных болезней, то есть болезней с наследственной предрасположенностью. Однако в большинстве своем онкологические заболевания носят спорадический характер. Не удается выявить индуцирующего влияния неблагоприятных внешних факторов, присутствия в семье других больных родственников или наследственной предрасположенности к заболеванию. Но и в этих случаях можно с уверенностью утверждать, что процессу возникновения и развития опухоли предшествует накопление мутаций в онкогенах и генах супрессоров опухолей в тех соматических клетках и тканях, которые затем вовлекаются в процесс неоплазии. Все эти факты дают основание утверждать: рак – это болезнь генов. 5.2. Рак молочной железы (РМЖ) – самое частое и наиболее изученное онкологическое заболевание женщин. Для опухолевых тканей больных характерна огромная хромосомная нестабильность и часто наблюдается амплификация некоторых онкогенов. В частности, в 25% случаев оказывается амплифицирован ген рецептора эпидермального фактора роста (ERBB2 или HER2/NEU), что является маркером неблагоприятного прогноза заболевания. С меньшими частотами встречаются амплификации онкогенов C-MYC (один из ядерных транскрипционных факторов), CCND1 (циклин D1) и др. Наследственные формы РМЖ ассоциированы с присутствием зародышевых доминантных гетерозиготных мутаций в двух главных супрессорных генах BRCA1 и BRCA2. Белковые продукты этих генов участвуют в репарации двунитевых разрывов ДНК. Потеря гетерозиготности в области локализации этих генов в опухолевых тканях наблюдается в 8090% семейных и в 30-40% спорадических случаев раков молочной железы и яичников, а также в 10-70% случаев при других формах раков. Не вызывает сомнения причастность к возникновению и прогрессии рака молочной железы соматических мутаций в гене TP53. Однако этот ген не является специфическим для данного типа опухолей, так как p53 вовлечен в патогенез большинства злокачественных новообразований. Доказано присутствие в лобулярных карциномах инактивирующих мутаций в гене Екадхерина (CDH1), однако это небольшая часть от общего числа РМЖ. Гетерозиготные носители мутаций в генах BRCA, частота которых среди населения, в среднем, составляет 0,1%, имеют риск развития РМЖ или яичников к 30 годам – 7% , к 40 годам – 13% и к 70 годам – 90%. Наследуемые мутации в гене BRCA1 обнаруживаются в 90% семей, отягощенных по РМЖ и раку яичников, и в 50% семейных случаев РМЖ, не сочетающегося с раком яичников. Однако в некоторых популяциях, например среди евреев восточно-европейского происхождения, частота гетерозигот по генам BRCA достигает 2% за счет широкого распространения всего нескольких мажорных мутаций. Это позволяет ставить вопрос о тотальном скрининге всего населения данной этнической группы с целью выявления гетерозиготных носителей специфических мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 и проведения среди них профилактической предупредительной терапии. Исследование большого количества семей (237) с четырьмя и более случаями заболевания показало, что в 52% заболевание обусловлено присутствием мутаций в гене BRCA1, в 32% - в гене BRCA2 и лишь в 16% семей оказалось связано с мутациями в других генах (CHK2, ATM и др.). Огромное количество исследований посвящено анализу генетических факторов риска, предрасполагающих к РМЖ, однако их результаты носят противоречивый характер. Ассоциация с РМЖ доказана лишь для редких полиморфных аллелей в онкогене HRAS, и в меньшей степени для некоторых генов стероидного метаболизма (CYP1A1, CYP17). Неоднозначность результатов исследований, выполненных в разных популяциях, объясняется большим разнообразием этиологических факторов, лежащих в основе заболевания. 5.3. Рак шейки матки (РШМ) или цервикальная интерэпителиальная неоплазия (CIN) – одно из наиболее распространенных онкологических заболеваний женщин, занимающих второе место после РМЖ. Заболевание развивается в сравнительно раннем возрасте и чаще всего затрагивает неоднократно рожавших женщин. В последние десятилетия в развитых странах отмечается снижение заболеваемости и смертности от РШМ. Это объясняется медицинским просвещением населения, улучшением бытовых условий и широкомасштабным цитологическим скринингом соскобов слизистой цервикального отдела, который позволяет определить морфологические изменения в отслоившихся клетках, обусловленные злокачественным перерождением цервикального эпителия. Первичным событием в патогенезе CIN является инфицирование при половом контакте некоторыми типами ДНК-содержащего папилломавируса человека (HPV). Однако болезнь развивается только у 3-5% инфицированных женщин. В настоящее время идентифицировано более 100 типов HPV, из них аногенитальными являются около 30 и к классу онкогенных могут быть отнесены около 15-20 типов. Наибольшей онкогенной активностью обладают 16 и 18 типы, и в большинстве случаев развитию CIN предшествует инфицирование именно этими типами HPV. HPV экспрессирует 8 белковых продуктов, 2 из которых – E6 и E7 – обладают наиболее выраженным онкогенным эффектом. Рак шейки матки достаточно четко классифицируется по степени морфологических изменений в эпителиальных клетках. Слабая дисплазия – это CIN I, более заметные изменения – CIN II и резкая дисплазия – CIN III. При карциноме in situ дифференцированный эпителий полностью отсутствует. На этой стадии возможна инвазия в соседние ткани. На стадии CIN I наблюдается активная репликация HPV сначала в базальном слое эпителия – рис. 5. В это время вирус находится в цитоплазме клетки в виде небольших кольцевых молекул ДНК – эписом. Его концентрация достигает 50-100 копий на клетку. В это время начинают экспрессироваться гены Е6 и Е7, и это трансформация индуцирует происходит хромосомную с высокой нестабильность. частотой и Дальнейшая сопровождается интеграцией вирусной ДНК в геном клетки-хозяина. На начальном этапе экспрессируется около 15% интегрированных форм вируса, и регуляция этого процесса осуществляется эписомальными фракциями вируса. Рисунок 5. Развитие папилломовирусной инфекции Продукты генов E6 и E7 индуцируют переход дифференцированных клеток цервикального эпителия в S-фазу клеточного цикла. Экспрессия этих генов регулируется продуктом гена E2, являющимся репрессором их транскрипции. Ключевым событием в малигнизации клеток является интеграция вируса в геном хозяина, которая сопровождается делецией гена E2, что приводит к стабильной экспрессии генов E6 и E7. На этой стадии любые противовирусные препараты уже не способны остановить процесс опухолевой трансформации. Контроль клеточного цикла белками E6 и E7 осуществляется путем их взаимодействия с ключевыми негативными регуляторами клеточного роста – p53 и Rb – и последующей инактивацией этих супрессоров опухолей. Потеря их функции сопровождается резким увеличением частоты возникновения мутаций и, в конечном счете, к малигнизации – рис. 6. Онкобелок E7 влияет также на активность других белков клеточного цикла, таких как А и Е циклины, cdk2 киназа, игибиторы циклин-зависимой киназы p21 и p27. Рисунок 6. Механизм опухолевой трансформации клеток, инфицированных HPV. При РШМ наблюдается потеря гетерозиготности в определенных участках длинного плеча хромосомы 6. Очевидно, что в этиологии РШМ немаловажная роль принадлежит p53. Во многих популяциях человека широко распространен полиморфный аллель в гене TP53, приводящий к замене пролина на аргинин в 72 положении белка. Оказалось, что p53Arg разрушается белком Е6 HPV с гораздо большей скоростью по сравнения с вариантом p53Pro. Таким образом, аллельное состояние гена TP53 может влиять на предрасположенность женщин к CIN. Действительно, частота гомозигот по полиморфной замене p53Arg среди больных CIN превышает 70%, в то время как в контрольных выборках этот показатель не достигает 20%. Разработана высоко эффективная профилактическая вакцина GARDASILTM, направленная против четырех наиболее распространенных онкогенных типов HPV – 6, 11, 16 и 18. По результатам клинических испытаний рекомендуется обязательная профилактическая вакцинация девочек в подростковом и юношеском возрасте до начала половой жизни, а также молодых женщин в возрасте до 26 лет только после определения уровня инфицированности. При наличии инфекции вакцинация уже не дает результата. Среди 30 000 вакцинированных женщин не было выявлено ни одного случая морфологических изменений в эпителии шейки матки, которые свидетельствовали о наличии CIN. В нашей стране в ряде медицинских центров Москвы и Санкт-Петербурга проводится лабораторная диагностика HPV-инфекции. Однако масштабная вакцинация женщин против РШМ еще не начата. 5.4. Рак яичников занимает второе место после рака шейки матки среди онкологических заболеваний, затрагивающих женские гениталии, и первое место по показателям смертности. Последнее обстоятельство объясняется высокой частотой обсеменения раковыми клетками брюшной полости с последующим обширным метастазированием. Яичник обильно снабжен кровеносными и лимфатическими сосудами, которые связывают его с регионарными лимфатическими узлами, соседними и отдаленными органами. Он может непосредственно контактировать с окружающими органами таза и даже брюшной полости, особенно при его увеличении за счет опухолевого поражения, что и объясняет в значительной мере высокую скорость распространения рака яичников. В 30% случаев рака молочной железы и яичников наблюдается гиперэкспрессия гена HER2/NEU, что является плохим прогнозом в отношении развития заболевания. В опухолевых тканях больных раком яичников часто наблюдаются нарушения фосфатидилинозитол-3’-киназного сигнального пути (PI3K/Akt) за счет накопления активирующих мутаций в доминантных онкогенах PIK3CA и AKT1, кодирующих фосфатидилинозитол3’-киназу альфа и одну из серин/треониновых протеинкиназ соответственно. Соматические мутации в гене PIK3CA и амплификации области его локализации обнаруживаются в 30% опухолей яичника. Однако наиболее частыми генетическими нарушениями в опухолевых тканях больных являются инактивирующие мутации в генах супрессорах опухолей, участвующих в контроле клеточной адгезии. Так, почти в половине опухолей яичника наблюдается потеря гетерозиготности в области локализации гена OPCML, кодирующего иммуноглобулино-подобный опоид-связывающий белок, относящийся к молекулам клеточной адгезии. Более чем в 80% случаев в соматических опухолевых тканях происходит гиперметилирование промоторной области гена OPCML, ассоциированное с его репрессией. В опухолях яичника часто находят мутации в гене Е-кадхерина (CDH1). Частичная или полная потеря экспрессии гена CDH1 в опухолевых тканях достоверно коррелирует с неопластической трансформацией опухолей. Онкогенный эффект дефектного Е-кадхерина обусловлен нарушением межклеточных контактов. Следствием этого нарушения может быть, в частности, снижение функциональной активности p53. Таким образом, CDH1 может рассматриваться как ген супрессор инвазии. C Е-кадхерином взаимодействует β-катенин, участвующий в опосредовании межклеточной адгезии. Соматические мутации в гене β-катенина (CTNNB1) часто обнаруживаются в опухолях муцинового типа. яичника эндометриоидного типа и реже – Рак яичников входит в структуру двух наследственных онкосиндромов: рака молочной железы и/или яичников и синдрома Линча – неполипозного рака толстой кишки 1 типа. В первом случае больные являются гетерозиготными носителями мутаций в генах супрессоров опухолей BRCA1 и BRCA2 (см. 5.2.). При синдроме Линча зародышевые гетерозиготные мутации обнаруживаются в одном из генов ферментов репарации неспаренных оснований (MSH2). В редких случаях у больных раком яичников были найдены зародышевые мутации в другом гене репарации – MLH1. Однако наследственные мутации во всех четырех перечисленных выше генах объясняют лишь небольшой процент случаев рака яичников. 5.5. Рак эндометрия Примерно в 20% случаев рака эндометрия в опухолевых тканях больных наблюдается высокая генетическая нестабильность, которая выявляется по анализу микросателлитных маркеров (микросателлитная нестабильность – MSI). Это значит, что мутантными могут быть гены ферментов репарации неспаренных оснований – MSH2, MSH3, MSH6 и MLH1. Зародышевые мутации в любом из этих генов приводят к к различным генетическим вариантам неполипозного рака прямой кишки, который часто сопровождается раком эндометрия. В опухолевых тканях больных раком эндометрия часто наблюдаются соматические мутации в известном супрессорном гене PTEN, ассоциированном с раком предстательной железы и многими другими онкологическими заболеваниями, а также в гене Е-кадхерина (CDH1). Белковый продукт гена PTEN является ингибитором PI3K/Akt-сигнального пути и участвует в регуляции инвазии и метастазирования посредством образования фокальных межклеточных контактов, а также в регуляции опухоль-индуцируемого ангиогенеза фосфоинозитид-зависимых сигналов. посредством выработки 5.6. Герминогенные опухоли – это гетерогенная группа новообразований, развивающихся из зародышевых клеток. Подавляющее большинство подобных опухолей располагаются внутри гонад. Появление примерно в 5% случаев экстрагонадных опухолей связывают с нарушением миграции гамет в гонады, находящиеся на бипотенциальной стадии эмбрионального развития. Герминогенные опухоли, главным образом, поражают мужчин. Их разделяют на три типа. Первый составляют новообразования раннего детского возраста – тератомы и опухоли желточного мешка, которые могут располагаться в яичках, яичниках, забрюшинном пространстве, головном мозге и других тканях. К опухолям второго типа относят семиномы и «несеминомы», развивающиеся в яичках у мужчин в возрасте от 15 до 40 лет. У женщин гомологом семиномы является достаточно редкая опухоль – дисгерминома яичника. Третий тип – это сперматоцитные семиномы, развивающиеся после 50 лет. Хотя тестикулярные опухоли являются относительно редкими, но за последние 40 лет их частота почти удвоилась. Среди мужчин молодого возраста (от 25 до 35 лет) герминогенные опухоли являются наиболее частой онкологической патологией и основной причиной онкологической смертности. В ряде случаев отмечается рецидивирующий характер заболевания. Наиболее частым генетическим нарушением, которое наблюдается в герминогенных опухолях, является амплификация короткого плеча хромосомы 12, однако до сих пор неясно, активация какого именно онкогена, расположенного в этой области генома (12p), ответственна за индукцию данной формы канцерогенеза. Сперматоцитные семиномы содержат нормальное число копий 12p, но для них характерно присутствие дополнительных копий хромосомы 9. Удивительной чертой некоторых билатеральных опухолей яичка является присутствие специфической мутации в онкогене KIT, кодирующем одну из рецепторных тирозинкиназ. Мутация в 816 кодоне гена KIT присутствует в 93% парных опухолей и лишь в 1,3% монолатеральных новообразований яичников. По-видимому, данное генетическое нарушение возникает в раннем эмбриогенезе до миграции зародышевых клеток в гонады. В отличие от большинства других новообразований герминогенные опухоли хорошо поддаются цитостатической химиотерапии и в 90% случаев могут быть полностью излечены даже при обширной диссеминации. В определенной степени это объясняется тем, что в них редко обнаруживаются мутации в гене TP53, то есть, не нарушен генетический контроль апоптоза и сохраняется чувствительность к химиотерапии. Однако более важным является то обстоятельство, что практически во всех герминогенных опухолях наблюдаются дефекты репарации, не позволяющие восстанавливать повреждения в структуре ДНК, возникающие под действием цитотостатических препаратов и приводящие опухолевые клетки к гибели. Это свойство в сочетании с высокой чувствительностью зародышевых клеток к различным устойчивостью сигналам резко химиотерапевтических апоптоза снижают и их возможность препаратов новых повышенной отбора опухоли представляют действием генетических трансформированных клеток, резистентных к лечению. герминогенные под мутагенной собой вариантов Таким образом, прекрасный пример использования достижений фундаментальной онкологии в клинической практике. 6. Основные положения классической генетики 6.1. Законы Менделя. Основополагающие законы наследования были открыты во второй половине XIX века Грегором Менделем. Анализируя результаты опытов, проведенных c гибридами гороха, Мендель предположил, что за формирование двух альтернативных проявлений одного признака организма ответственны два дискретных наследственных фактора. В гибридном организме один из этих факторов (А) – доминантный – подавляет проявление другого фактора (а) – рецессивного. Только один из этих двух факторов с равной вероятностью может попадать в зародышевые клетки или гаметы. В потомстве от скрещивания двух гибридных растений будут появляться растения, как с доминантным, так и с рецессивным признаком в соотношении 3:1. В последствии постулированные Менделем наследственные факторы были названы генами, совокупность генов – генотипом, а совокупность признаков организма – фенотипом. Варианты наследственных факторов или альтернативные состояния генов называются аллелями. Генотип может быть гомозиготным при наличии двух аллелей одинакового типа (АА или aа) или гетерозиготным, если аллели разные (Аа). Аллели влияют на характер развития признаков, что и служит основой для фенотипической изменчивости. Если эта изменчивость не выходит за пределы нормы, то соответствующие аллели называют нормальными или аллелями дикого типа. Нормальные аллели, обычно, имеют широкое распространение, однако их существенно различаться. Те частоты в разных популяциях аллели, частоты которых могут в популяции превышают определенный уровень, например 5%, называют полиморфными аллелями или полиморфизмами. Аллели, приводящие к патологическому развитию признака, называют мутантными аллелями или мутациями. Сочетания нормальных и мутантных аллелей различных генов определяют индивидуальную наследственную конституцию каждого человека. Таким образом, люди отличаются между собой не по наборам генов, а по их состояниям, то есть по наследственной конституции. Анализ родословных человека позволяет судить о том, является признак наследственным и подчиняется ли он законам Менделя. 6.2. Хромосомная теория наследственности. На рубеже XIX и XX веков были изучены основные этапы деления клетки. Время жизни клетки с момента ее образования до деления составляет клеточный цикл, одной из важнейших стадий которого является митоз или собственно деление клетки (рис. 7). Ключевая роль в митозе принадлежит хромосомам – ядерным структурам, которые в период деления клетки отчетливо видны при световой микроскопии и использовании специфических методов окрашивания. Важным функциональным участком хромосом, определяющим их правильное расхождение при делении клетки, является центромера. Она разделяет хромосому на два плеча: короткое (p) и длинное (q). Конечные участки хромосом – целостность. В теломеры – соматических клетках обеспечивают их структурную высших каждая хромосома представлена двумя копиями, то есть диплоидным набором. И только в половых клетках наблюдается одинарный или гаплоидный набор хромосом. Это обеспечивается за счет особой формы деления половых клеток – мейоза (рис. 7), который включает два клеточных деления: мейоз I или редукционное деление и мейоз II. Во время мейоза I из одной диплоидной клетки образуются две гаплоидные, при этом может происходить обмен участками между гомологичными хромосомами – кроссинговер или гомологичная рекомбинация. Рисунок 7. Митоз и мейоз Рисунок 8. Нормальный женский кариотип и его кариограмма После завершения мейоза II диплоидная родительская клетка делится на четыре гаплоидные половые клетки, причем образовавшиеся гаметы не идентичны друг другу – фрагменты материнских и отцовских хромосом находятся в удивительно них в различных напоминает комбинациях. поведение Поведение постулированных хромосом Менделем наследственных факторов или генов. В дальнейшем было показано, что гены расположены в хромосомах линейно. Количество и морфология хромосом специфичны для каждого вида. У человека 23 пары хромосом. У женщин обе хромосомы каждой пары гомологичны друг другу. У мужчин такая гомология сохраняется только для 22 пар хромосом, которые называются аутосомами. Оставшаяся пара у мужчин состоит из двух различных половых хромосом – X и Y, а у женщин – из двух гомологичных Х-хромосом. Набор хромосом одной клетки называется кариотипом. Нормальный кариотип женщины записывается как (46, ХХ), а мужчины – (46, ХY) – рис. 8. Во всех клетках женского организма одна из Х-хромосом инактивирована и выглядит в виде компактной хорошо окрашенной структуры хроматина округлой формы, расположенной вблизи от ядерной мембраны - это тельце Барра или половой гетерохроматин. Его идентификация является самым простым способом цитогенетической диагностики пола. Таким образом, появилось представление о гене, как об участке хромосомы или хромосомном локусе, который отвечает за один признак и одновременно является единицей рекомбинации и мутации, ведущей к изменению фенотипа. 6.3. Спонтанный и индуцированный мутагенез. Мутации постоянно возникают спонтанно в любых популяциях с частотами 10-8 - 109 на один ген за одно поколение. Отбор мутантов из природных популяций привел к созданию генетических линий многих видов микроорганизмов, растений и животных, моделирующих, в частности, различные наследственные заболевания человека. Ионизирующее облучение и некоторые химические соединения резко увеличивают частоту возникновения мутаций. Мутагенный эффект наблюдается при любой дозе облучения и при повторном облучении суммируется. При химическом мутагенезе наблюдается прямая зависимость от дозы и продолжительности обработки. Многие мутагены обладают канцерогенным эффектом, что связано с природой опухолевого процесса. Кроме того, они способны оказывать тератогенное воздействие на плод в процессе беременности, индуцируя формирование врожденных пороков развития. Рисунок 9. Последствия мутации de novo Мутации, возникающие de novo в зародышевых клетках, приводят к гонадному мозаицизму, то есть они будут присутствовать лишь в определенном проценте гамете. Мутации, возникающие в клетках зародыша, приводят к соматическому мозаицизму, то есть они будут выявляться лишь в части клеток одного или нескольких органов взрослого организма. Соматические мутации, возникающие в процессе жизни человека в специфических генах ассоциированных с (онкогенах или канцерогенезом, супрессорах являются опухолей), причиной развития онкологических заболеваний – рис. 9. 6.4. Цитогенетические карты определяют принадлежность генов и других генетических элементов к отдельным хромосомам и их взаимное расположение внутри хромосом относительно друг друга и видимых хромосомных маркеров. Классическим методом построения карт генов является анализ наследования признаков в родословных. На первом этапе выявляют гены, локализованных в одной и той же хромосоме (группы сцепления), определяют их принадлежность к определенным хромосомам и цитогенетическим маркерам, а затем вычисляют генетические расстояния между этими генами. Анализ сцепления оказался мало эффективен для построения карт генов человека. Методы соматической гибридизации резко ускорили этот процесс. К дальнейшему успеху привели разработка методов дифференциального окрашивания хромосом и создание банков долгоживущих клеточных культур наиболее информативных обширных родословных. Идентификация высоко изменчивых молекулярных маркеров, равномерно и с высокой плотностью распределенных по всем хромосомам, а также разработка простых методов определения их состояния у отдельных индивидуумов, завершили процесс построения цитогенетических карт человека, не уступающих по степени детализации хорошо изученным экспериментальным объектам, таким как дрозофила или мышь. 6.5. Наследственные болезни и типы наследования. В настоящее время не существует единой классификации наследственных болезней, и, к сожалению, иногда их не отличают от врожденных и семейных болезней. Причиной развития наследственных болезней являются мутации в определенных генах или хромосомах, присутствующие в половых клетках родителей. Эти мутации могут передаваться потомству в ряду поколений. Врожденные заболевания проявляются сразу после рождения, и они могут быть как наследственными, так и приобретенными, например, под действием тератогенных факторов или осложнений в родах. Приобретенные врожденные пороки развития не передаются по наследству. Семейными называются болезни, присутствующие у нескольких членов одной семьи. Они также могут быть наследственными или обусловливаться средовыми влияниями, например неправильным питанием, вредными привычками или присутствием токсических соединений в окружающей среде. В свою очередь, наследственные болезни не обязательно являются врожденными или семейными. Основной целью медицинской генетики является изучение роли генетических составляющих в этиологии и патогенезе различных заболеваний человека. Эти болезни делятся на два класса: собственно наследственные болезни, куда входят хромосомные и генные заболевания, и болезни с наследственной предрасположенностью, которые называют мультифакториальными. Хромосомными являются болезни, вызванные нарушением числа, либо структуры хромосом. Генные болезни обусловлены присутствием мутаций в генах. Моногеннными называются болезни, обусловленные присутствием мутаций в одном гене. В этиологии мультифакториальных заболеваний, наряду с действием неблагоприятных внешних факторов, существенное влияние оказывают состояния не одного, а многих генов. Количество этих генов, формирующих наследственную предрасположенность к заболеванию, иногда исчисляется десятками или даже сотнями. К мультифакториальным относятся большинство наиболее распространенных болезней человека, таких как патология, онкологические болезни, сахарный сердечно-сосудистая диабет, многие гинекологические и другие заболевания. Характер наследования моногенных заболеваний зависит от того, является признак доминантным или рецессивным и аутосоме или половой хромосоме. находится ген в Рисунок 10. Типы наследования моногенных заболеваний В соответствии аутосомно-рецессивный с этим, выделяют и сцепленный с аутосомно-доминантный, полом типы наследования. Последний, в свою очередь, также может быть доминантным или рецессивным – 10. При аутосомно-доминантном наследовании (а) больными чаще всего являются гетерозиготные носители мутации. В браке между больным и здоровым соотношение больных и здоровых детей независимо от пола составляет 1:1, при этом здоровые дети, родившиеся от больного родителя, всегда имеют здоровое потомство. Однако в большинстве случаев доминантные заболевания являются результатом мутации de novo. При аутосомно-рецессивном заболевании (б) больные дети независимо от пола с вероятностью 25% рождаются у здоровых родителей, которые являются гетерозиготными носителями мутации. В браке между больным и здоровым дети всегда здоровы, однако больными могут быть внуки. Опасность рождения детей с рецессивной патологией повышена в родственных браках. При рецессивном Х-сцепленном наследовании болеют мальчики, которые наследуют мутацию от своей здоровой, но чаще всего гетерозиготной материи (г). При этом может наблюдаться передача заболевания от деда к внуку и никогда – от отца к сыну (в). Y-хромосома содержит немногим более 90 генов. Некоторые из них, расположенные в так называемом псевдоаутосомном районе, имеют гомологов в Х-хромосоме. Остальные гены специфичны только для Y- хромосомы. Среди них ген SRY, определяющий развитие по мужскому типу, а также целый ряд генов, участвующих в контроле сперматогенеза (AZF). Тип наследования признаков, определяемых специфическими генами Yхромосомы, называется голандрическим, и для него характерна передача заболевания от отца к сыну. При моногенных болезнях, обусловленных мутациями в митохондриальных генах, больными могут быть как мужчины, так и женщины, но наследственная передача заболевания происходит только по материнской линии. В некоторых случаях структура и характер проявления мутаций могут приводить к отклонениям от законов Менделя и нетрадиционным типам наследования (болезни геномного импринтинга, экспансии, однородительские дисомии и др.). К классу полигенно наследуемых признаков относятся количественные признаки, такие как рост, вес и др., а также многие мультифакториальные болезни человека. Изменчивость по фенотипическим проявлениям таких признаков в различных популяциях, чаще всего, соответствует нормальному распределению. 6.6. Генетические основы развития. В настоящее время не подвергается сомнению тот факт, что индивидуальное развитие организма находится под генетическим контролем. В древности существовало представление о том, что в женских половых клетках уже присутствует сформированный зародыш, в яйцеклетках которого, в свою очередь, содержится еще более маленький зародыш и так далее. По подсчетам одного из основоположников сформулированной выше гипотезы А. Галлера в яичнике Евы должно было содержаться около 200 миллиардов зародышей. Сейчас очевидна несостоятельность этой теории. В половых клетках содержится не сам зародыш, а инструкция в виде заключенной в молекуле ДНК генетической информации, которая во взаимодействии с внешними факторами управляет развитием организма. Огромное количество исследований посвящено анализу молекулярногенетических основ онтогенеза. Процесс дифференцировки детально изучен на морфологическом уровне. В последние десятилетия произошел огромный прогресс в понимании биохимических и молекулярных превращений, участвующих в контроле развития. Однако до сих пор нет удовлетворительного ответа на вопрос, как из одной оплодотворенной яйцеклетки образуется более 200 гистологических типов клеток, составляющих наш организм. В первую очередь, это связано с тем, что процесс онтогенеза отличается необычайной сложностью и удивительной организованностью. Рисунок 11. Различные специализированные клетки крови, образующиеся из стволовых клеток (1 – ретикулоциты, 2 – мегакариоциты, 3 – моноциты, 4 – эритроциты, 5 – тромбоциты, 6 – макрофаги, 7 – нейтрофилы, 8 – эозинофилы, 9 – базофилы, 10 – Т-клетки, 11 – В- клетки, 12 – гранулоциты). Зигота, эмбриональные и различные специализированные клетки содержат одинаковые наборы генов, то есть дифференцировка не сопровождается утратой генетического материала. Меняется лишь характер экспрессии генов. Дифференцированные клетки теряют тотипатентность, то есть способность давать начало любым другим типам клеток. Это свойство в определенной мере сохраняется лишь за стволовыми клетками, служащими источником для возобновления некоторых специализированных клеток (рис. 11). Однако ядра дифференцированных клеток, а значит и ДНК, не утрачивают тотипатентности и, будучи трансплантированы в безъядерную зиготу, способны инициировать развитие, что убедительно показано в опытах по клонированию животных. Терапевтическое клонирование имеет огромные перспективы, в частности, в трансплантологии, так как позволяет выращивать из отдельных стволовых клеток специализированные ткани и даже органы. При этом может быть снята одна из самых серьѐзных проблем трансплантологии – отторжение пересаженных тканей. Однако работы в области клонирования человека, то есть получения нового организма из соматической клетки реципиента, в настоящее время считаются недопустимыми. Это связано не только с большим количеством этических и правовых проблем, но и с недостаточной изученностью биологических аспектов клонирования, в частности, взаимоотношений между цитоплазматическим и ядерным контролем развития. Подчеркнем еще раз, что развитие из ядра соматической клетки происходит только в том случае, если оно помещено в детерминированную к развитию ооплазму оплодотворенной яйцеклетки. В процессе женского гаметогенеза (оогенеза) экспрессируются практически все гены, и в ооплазме накапливается большое количество материнских белков и мРНК, которые и управляют первыми этапами дробления зародыша. Таким образом, генотип матери в большей степени влияет на формирование признаков у потомства, чем генотип отца. В период созревания ооцита происходит формирование строго упорядоченной гетерогенности ооплазмы, так называемая ооплазматическая сегрегация, в ходе которой закладывается план строения будущего организма. При механическом разрушении цитоплазматических градиентов зародыша не происходит. концентраций белков и мРНК развития В зрелых ооцитах транскрипция не обнаруживается. Она восстанавливается только на стадии поздней зиготы, когда наблюдается прогрессивная активация или репрограммирование эмбрионального генома. Напомним, что у человека первичные половые клетки закладываются уже в конце бластуляции, то есть спустя две недели после оплодотворения. Затем они мигрируют в энтодерму и попадают в зачатки гонад. Там женские половые клетки вступают в мейоз, но не заканчивают его, так как их деление блокируется. Они окружаются фоликуллярными клетками и в виде ооцитов I порядка сохраняются до половой зрелости. Потенциальные яйцеклетки созревают перед овуляцией, когда снимается первый блок мейоза, причем весь мейоз завершается лишь с началом оплодотворения. У мужчин сперматогенез происходит каждые 70-72 дня. Таким образом, одна оплодотворенная яйцеклетка физически связывает три поколения. И в некоторых случаях последствия неблагоприятных внешних воздействий в период детерминации и закладки первичных половых клеток плода беременной женщины могут проявиться в виде различных аномалий развития у ее внуков. Ведущая роль в морфогенезе тканей принадлежит экспрессирующимся в раннем эмбриогенезе генам транскрипционных факторов – секреторных белков, служащих индуктивными сигналами для развития. Подобные белки способны взаимодействовать с регуляторными участками других генов и осуществлять активацию или репрессию так называемой «генной сети» каскада генов, координированная экспрессия которых определяет специфические программы детерминации, дифференцировки и морфогенеза отдельных органов и тканей. Генетический контроль сегментации организма, включающий разделение на головной, грудной и брюшной отделы, универсален в животном мире. При взаимодействии перекрывающихся градиентов морфогенетически активных белков, являющихся на первых этапах продуктами материнских генов, активируются ранние эмбриональные гены транскрипционных факторов, что, в конце концов, приводит к локальной экспрессии самой многочисленной группы сегментной полярности. После формирования границ каждого сегмента их специфические черты детерминируются гомеозисными генами. Эти гены содержат специфические гомеобоксы - HOX, PAX (pair-бокс), SOX (SRY-родственный HMG-бокс) и др., белковые продукты которых (гомеодомены) взаимодействуют с регуляторными участками ДНК, осуществляя активацию или репрессию соответствующей «генной сети». Органогенез регулируется последовательными индуктивно-тканевыми взаимодействиями, реализация которых осуществляется с участием многих клеточных процессов, таких как пролиферация, адгезия, апоптоз, миграция и дифференцировка. Рисунок 12. Развитие зародыша и дифференцировка тканей (1 – клетки кожи, 2 – нейроны мозга, 3 – пигментные клетки, 4 – сперматозоиды, 5 – яйцеклетки, 6 – сердечная мышца, 7 – миофибриллы, 8 – клетки почечных канальцев, 9 – эритроциты, 10 – гладкомышечные клетки, 11 – альвеолярные клетки, 12 –тиреоидные клетки, 13 – клетки поджелудочной железы). На рис. 12 показаны основные этапы развития зародыша и дифференцировки тканей. Внутриутробное развитие будущего ребенка от оплодотворения до рождения исследователи разделяют на два периода: эмбриональный и фетальный или плодный. Эмбриональный (embrion – по греч. зародыш) период составляет первые 8 недель. Весь остальной период, отсчет которого начинается с 9-й недели гестации, – фетальный (fetus – по лат. плод). Важно отметить, что первые 14-15 дней эмбрионального периода, называемого преэмбриональным яйцеклетке или происходят периодом очень бластуляции, важные в оплодотворенной морфогенетические процессы, детерминирующие будущее развитие организма. Происходит активация генов зиготы, формируются начинает осуществляться зародышевые внезародышевых тканей дифференцировка листки будущих амниона, клеток, внутренних органов и амниотических ножек (будущей пуповины) и др. Эти две недели являются первым критическим периодом внутриутробного развития человека – время, при котором крохотный организм в высшей степени чувствителен к различного рода «посторонним» воздействиям. Ответная реакция реализуется по принципу «все или ничего». Зародыш или погибает в результате развития бластопатии, или, благодаря большой репаративной способности, продолжает развиваться без формирования пороков. Максимальная чувствительность (ранимость) зародыша наблюдается на 3-8 неделе – второй критический период. В это период продолжается дифференцировка («специализация») клеток и тканей (гистогенез), происходит закладка и формирован6ие органов. Этот процесс в основном заканчивается к 10-й неделе, когда плод принимает облик человека. ВПР, такие как дефекты заращения нервной трубки (ДЗНТ), пороки сердца и сосудистой системы (ВПС), расщелины губы и/или неба и многие другие, формируются в этом периоде, и потому они называются эмбриопатиями. Из 100 зарегистрированных беременностей в 13 (13%) наблюдаются эмбриопатии у зародыша; в самопроизвольными абортами; 10% эти беременности завершаются около 60% замерших беременностей и выкидышей составляют зародыши с хромосомными аномалиями. ВПР, формирующиеся после 9-й недели гестации и далее в фетальном периоде, называются фетопатиями. В этом периоде возможна гипоплазия отдельных органов или плода в целом, обусловленная различными воспалительными процессами, которые могут развиваться, в частности, при наличии у беременной генитальных инфекций. Чаще всего результатом этого процесса будет самопроизвольное прерывание беременности. Но в отдельных случаях беременность продолжится, но при этом у плода произойдет формирование фетопатии. 6.7. Генетика популяций. Изучение генетического разнообразия популяций и закономерностей его поддержания являются предметом популяционной генетики. В больших панмиктических популяциях, в которых нет предпочтения в образовании супружеских пар, действует закон ХардиВайнберга, то есть за одно поколение устанавливается равновесие по соотношению между частотами аллелей и генотипов: если частоты аллелей А и а равны p и q, (p + q = 1), тогда частоты гомозигот АА и аа будут соответственно равны p2 и q2, а гетерозигот Аа – 2pq. В соответствии с этим законом частоты гетерозигот в популяциях по наиболее распространенным рецессивным заболеваниям составляют от 1:20 до 1:50 человек, для рецессивных болезней со средним уровнем распространенности – не менее 1:100 и для очень редких заболеваний, распространенность которых не превышает 1 на миллион населения, – 1:500 и менее. В среднем, каждый человек является ассоциированных гетерозиготным с подобными носителем около заболеваниями. 10 мутаций, Распространение рецессивной патологии в популяциях происходит, главным образом, за счет гетерозигот, не имеющих клинических проявлений заболевания. Поэтому выдвигавшиеся в начале XX века евгенические предложения по стерилизации больных с рецессивной патологией с современных генетических позиций оказываются несостоятельными. При отборе, направленном против определенных генотипических классов, мутациях или инбридинге, который возникает при близкородственных браках или в генетических изолятах, соотношения Харди-Вайнберга нарушаются. Мутации, возникающие у членов изолированных замкнутых сообществ, получают в генетических изолятах более широкое распространение – «эффект основателя». В результате частоты некоторых редких наследственных заболеваний и ассоциированных с ними мутаций в изолированных популяциях могут быть в несколько раз выше по сравнению с общим уровнем. Для всех популяций характерен полиморфизм, то есть сосуществование нескольких генетических форм, при этом разные популяции различаются по частотам полиморфизма. Анализ распределения полиморфных аллелей разных локусов в различных популяциях, этнических группах, расах или даже видах позволяет оценивать степень эволюционного родства между ними, которая выражается в терминах генетического расстояния. В среднем, межпопуляционная изменчивость по нуклеотидным последовательностям ДНК на 10-15% выше по сравнению с внутрипопуляционной изменчивостью. Распространенность в различных популяциях мутаций, ассоциированных с наследственной патологией, определяет их генетический груз, оценка которого важна для правильной организации медико-генетической помощи населению. Основная доля генетического груза подобно айсбергу скрыта в генофонде популяции в гетерозиготном состоянии. 6.8. Структура ДНК. Хромосомы всех исследованных видов организмов состоят из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и белков, большую часть которых составляют гистоны – рис. 13. В опытах по трансформации (искусственной передаче наследственных признаков) было показано, что материальной субстанцией генов или веществом наследственности являются молекулы ДНК. В 1953 г. Дж. Уотсон и Фр. Крик на основании рентгеноструктурного анализа кристаллов ДНК, выполненного Р. Франклин, предложили модель, в соответствии с которой ДНК состоит из двух полимерных цепей, образующих форму двойной спирали. В основании каждой из этих цепей лежат последовательности из одинаковых сахаров (дезоксирибозы), соединенных между собой остатками фосфорной кислоты. Каждый сахар соединен гликозидной связью с одним из четырех азотистых оснований: аденином (A), гуанинома (G), цитозином (C) и тимином (T). Рисунок 13. Структура хромосом и ДНК Азотистое основание, сахар и остаток фосфорной кислоты составляют нуклеотид, то есть цепь ДНК является последовательностью нуклеотидов. Две цепи ДНК удерживаются вместе за счет водородных связей между нуклеотидами по правилу комплементарности: A-T, G-C. При разрыве водородных связей между нуклеотидами ДНК переходит в однонитевую форму. Этот процесс называется денатурацией или плавлением ДНК. Нить ДНК начинается с 5’-конца и заканчивается 3’-концом. При восстановлении водородных связей, то есть гибридизации, двойная спираль ДНК восстанавливается. Длина ДНК измеряется в нуклеотидах или в парах оснований (п.о.), тысячах п. о. – килобазах – и миллионов п. о. – мегабазах (мб). У человека она составляет 3,2х109 п.о. Основная масса ДНК находится в ядрах клеток в составе хромосом в суперскрученном состоянии за счет взаимодействия с гистонами и другими белками хромосом. Комплекс из четырех пар гистонов (октамер), связывающий ДНК длиной 147 п.о., образует нуклеосому – основную структурную субъединицу хроматина. Линкерная ДНК связывает нуклеосомы вместе с образованием хроматинового волокна. Около 1% ДНК находится в митохондриях. Молекулы ДНК способны к самовоспроизводству, то есть репликации, которая осуществляется с помощью фермента ДНК-полимеразы, способного вести комплементарный синтез ДНК по однонитевой матрице. В ДНК в виде последовательности нуклеотидов записана информация, определяющая разнообразие всех форм жизни. Варьирующий порядок нуклеотидов определяет огромную информационную ѐмкость ДНК. Гены являются дискретными участками в гигантской молекуле ДНК. 6.9. Наследственная информация и пути ее передачи. В соответствии с центральной догмой молекулярной генетики один ген кодирует одну полипептидную цепь. Конечными продуктами примерно четверти генов человека являются не белки, а рибонуклеиновые кислоты (РНК). РНК, также как ДНК, состоят из четырех типов произвольно чередующихся нуклеотидов. Однако в основании РНК располагается другой сахар – рибоза, и функции тимина выполняет другой нуклеотид – урацил (У). Первым шагом на пути перехода от ДНК к белку является транскрипция – синтез молекул преРНК, комплементарных генам – рис. 14. Транскрипция происходит в ядрах клеток и осуществляется с помощью фермента – РНК-полимеразы. На следующем этапе серия модификаций превращает преРНК в информационную или матричную РНК - мРНК. Эти модификации включают изменения на концах молекулы, обеспечивающие стабилизацию мРНК, и сплайсинг – вырезание некодирующих участков гена – интронов – и сшивки оставшихся кодирующих участков – Рисунок 12. Центральная догма молекулярной генетики экзонов. Затем мРНК переходит в цитоплазму клетки и транслируется. Трансляция – это синтез на рибосомах полипептидной цепи по молекуле мРНК. Трансляция происходит с помощью транспортных РНК (тРНК) и в соответствии с генетическим кодом, согласно которому каждые три нуклеотида в мРНК – кодоны – соответствуют определенной аминокислоте. Каждая тРНК в зависимости транспортировать только от одну структуры антикодона аминокислоту. способна Кодоны мРНК последовательно входят в рибосому, обеспечивая сигналы приближения к рибосомальному комплексу тех тРНК, у которых антикодон оказывается комплементарен соответствующему кодону. Таким образом, происходит специфический отбор аминокислот и их сшивка на рибосоме с образованием полипептидной цепи. Окончание синтеза кодируется любым из трех стопили нонсенс-кодонов. Генетический код оказался одинаковым для всех живых существ от вирусов до человека, и его универсальность является бесспорным доказательством родственности всего живого на Земле. 6.10. Структура и экспрессия генов эукариот. Многие гены человека имеют прерывистую структуру, и экзоны соседствуют, как правило, с гораздо более протяженными интронами. На границах между ними локализованы сайты сплайсинга, необходимые для правильного вырезания интронов. В 5’-нетранслируемой области гена находится основной регулятор работы гена – промотор – место взаимодействия ДНК с ферментом РНКполимеразой. Он определяет правильное начало транскрипции с первого инициирущего ATG-кодона и влияет на ее скорость. В 3’-нетранслируемой области гена локализованы последовательности, участвующие в регуляции созревания мРНК и трансляции. Транскрипция и трансляция с образованием конечного продукта (белка или РНК) называются экспрессией или работой гена. Большинство генов являются тканеспецифическими. Они экспрессируются только в специализированных тканях и на определенных стадиях их дифференцировки. У многоклеточных организмов кроме промотора имеются дополнительные системы регуляции, усиливающие или ослабляющие экспрессию генов и обеспечивающие ее тканеспецифичность. Нарушение экспрессии генов лежит в основе развития многих наследственных заболеваний. Отклонением от нормы является не только снижение экспрессии, но и гиперэкспрессия, а также эктопическая экспрессия. В среднем, в специализированных клетках одновременно работают не более 20% всех генов. Процесс дифференцировки непосредственно зависит от набора экспрессирующихся генов. Важную роль в регуляции экспрессии играют транскрипционные факторы, способные путем взаимодействия с промоторами активировать или репрессировать целую группу других генов, так называемую «генную сеть». Многие гены транскрипционных факторов экспрессируются в раннем эмбриогенезе и активируют «генные сети», ответственные за морфогенез отдельных органов и тканей. Некоторые гены образуют мультигенные семейства. Примерами могут служить гены рибосомальных и тРНК, гены α- и β-глобинов, тубулина, миоглобина, интерферона и др. Особое место среди мультигенных семейств занимают супергены – очень большие кластеры из сотен функционально и структурно родственных генов. служат HLA-комплекс, Классическими примерами супергенов контролирующий главные антигены гистосовместимости, а также комплексы генов, контролирующих синтез тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Для многих генов человека характерна блочная или модульная организация. В разных генах в различных сочетаниях могут присутствовать высоко гомологичные и часто многократно повторяющиеся фрагменты ДНК, кодирующие белковые домены с определенными специализированными функциями. Гены классифицируют не только по их гомологии, но и по участию в определенных биологических процессах, принадлежности к определенным компонентам клеток, а также по исполняемым молекулярным функциям. Причем эти множества генов часто перекрываются, и один и тот же ген может входить в разные группы. 6.11. Мутации генов. Мутации бывают геномными, хромосомными или генными (табл. 3). Геномные и хромосомные мутации приводят к тяжелым патологическим состояниям, часто несовместимым с жизнью. К геномным мутациям относятся увеличения гаплоидного набора хромосом – полиплоидии (они встречаются только у спонтанных абортусов или мертворожденных) или изменения количества хромосом одной пары – анеуплоидии. Наиболее частыми числовыми аномалиями являются моносомии и трисомии – отсутствие или существование добавочной третьей копии одной из гомологичных хромосом. К структурным перестройкам относятся делеции, инсерции, дупликации, инверсии – соответственно отсутствие, вставка, удвоение или переворот на 1800 фрагмента одной из хромосом, а также транслокации – перенос фрагмента одной хромосомы на другую. При сбалансированных транслокациях не происходит утраты генетического материала, и их носители клинически здоровы, но у них повышена вероятность рождения ребенка с хромосомной болезнью. Таблица 3. Типы мутаций Мутации Геномные Хромосомные числовые Генные структурные Полиплоидии Анеуплоидии делеции, инсерции, дупликации, инверсии трисомии транслокации: сбалансированные, моносомии несбалансированные Следует подчеркнуть, что только со сдвигом и без сдвига рамки считывания экспансии: динамические замены нуклеотидов нейтральные, нонсенс, миссенс, нарушающие сплайсинг, нарушающие регуляцию небольшой процент плодов с геномными и крупными хромосомными аномалиями доживают до родов. Частота хромосомных аномалий среди спонтанных абортусов достигает 50%, причем в половине случаев это трисомии по разным хромосомам, остальные – анеуплоидии по половым хромосомам и полиплоидии (примерно в равной степени). Среди мертворожденных эта частота составляет 5%, из них большая часть (75%) – трисомии, около 5% – полиплоидии и 20% – несбалансированные транслокации. Частота детей с аномалиями кариотипа среди новорожденных составляет 0,7%, причем в 30% случаев – это трисомии по трем хромосомам – 13, 18 и 21 (синдромы Патау, Эдвардса и Дауна соответственно), в 34% – анеуплоидии по половым хромосомам и в остальных случаях – сбалансированные транслокации, то есть клинически эти дети здоровы. Интересно отметить, что значительная часть плодов с аномалиями хромосом, совместимыми с завершением эмбриогенеза и живорождением погибают еще в антенатальном периоде – до 99% при моносомии Х и от 30% до 70% при трисомиях 13, 18 и 21. Небольшие структурные перестройки, затрагивающие от одного до несколько нуклеотидов или экзонов, также как замены нуклеотидов относятся к генным или точковым мутациям. Замены могут быть нейтральными без изменения структуры белка, нонсенс-типа с образованием преждевременного стоп-кодона и миссенс-типа с заменой аминокислоты в белке. Наиболее тяжелыми являются нонсенс-мутации и мутации со сдвигом рамки считывания – это структурные мутации, не кратные величине кодона. Широкое распространение имеют мутации, нарушающие сплайсинг. Они могут приводить либо к ошибочному вырезанию экзона, либо к невырезанию интрона, что неизбежно приведет к преждевременному прекращению синтеза белка. К новому типу относятся динамические мутации – увеличение (или экспансия) выше допустимого предела числа повторов, расположенных в функционально значимых областях генов. В некоторых случаях мутации в разных генах приводят к сходным клиническим заболеваниям, то есть к генетической гетерогенности. С другой стороны разные мутации в одном и том же гене могут приводить к различным аллельным заболеваниям, что и определяет их клинический полиморфизм. Средовой и генетический фон могут влиять как на проявление мутации, то есть ее пенетрантность, так и на степень выраженности признака, то есть его экспрессивность. Для многих моногенных заболеваний характерна плейотропия, которая заключается в том, что мутация может приводить к развитию патологических процессов одновременно в нескольких системах, органах или тканях. 6.12. Обратная генетика, генная инженерия. Определение нуклеотидной последовательности кодирующей области гена означает расшифровку аминокислотной последовательности кодируемого белка, что, в свою очередь, позволяет не только прогнозировать его структуру и функции, но и проводить прямой биохимический анализ. Подобная методология «от гена к белку» называется обратной генетикой. Открытие гена сопровождается изоляцией и клонированием его кодирующей области, молекулы комплементарной ДНК (кДНК), которая получается путем обратной транскрипции с использованием в качестве матрицы специфической мРНК гена. Клонирование это эффективный метод поддержания и размножения любых относительно небольших молекул ДНК путем их встраивания в вектор и введения этой конструкции в бактериальные или другие клетки. Этот метод лежит в основе генной инженерии и, в частности, геноинженерного производства лекарственных препаратов. Клонированная кДНК называется «геном в пробирке». Такая система позволяет наращивать число копий гена и проводить с ним различные манипуляции, при этом могут быть обеспечены условия для его экспрессии в клетках-хозяина. Параллельно с этим были разработаны методы конструирования генетических модельных линий путем трансгеноза, то есть искусственного введения чужеродного генетического материала в оплодотворенную яйцеклетку или ранние зародыши экспериментальных объектов. Трансгенные линии животных являются идеальными экспериментальными системами для изучения функций отдельных генов и оценки их биологического действия на организм. Рисунок 15. Создание трансгенных модельных линий Техника трансгеноза позволяет направленно разрушать гены и получать так называемые «нокаут»-линии (рис. 15) или вводить специфические мутации в определенный ген. Генетические манипуляции могут быть проведены только в одной или нескольких специфических тканях экспериментального животного и даже в определенный момент дифференцировки. Подобные модельные линии мышей сконструированы практически для всех известных генов, ассоциированных с наследственными заболеваниями человека. Таким образом, открытие генов наследственных болезней человека создает методические предпосылки для изучения биохимических основ первичных патологических нарушений не только в системе in vitro, но и in vivo, что, в свою очередь, значительно облегчает разработку адекватных методов их метаболической коррекции. Словарь генетических терминов: Аденин (А) – азотистое нуклеотидное основание, относящееся к группе пуринов Аллель – одна из возможных альтернативных форм гена: – доминантный – одна доза которого достаточна для его фенотипического проявления – мутантный или мутация – приводящий к патологическому развитию контролируемого признака –– нормальный или дикого типа – при котором развитие контролируемого признака не выходит за пределы нормы. – полиморфный или полиморфизм – частота которого в популяциях превышает определенный уровень, например 5% – рецессивный – проявляющийся только в гомозиготном состоянии Аллельные заболевания – заболевания, обусловленные разными мутациями в одном и том же гене Аминокислота – основной структурный элемент белка Антикодон – последовательность из трех нуклеотидов в молекуле тРНК, определяющая ее специфичность по отношению к аминокислотам Бластопатия – несовместимая с жизнью аномалия плода, возникающая под действием тератогенов на стадии развития до 15 дня беременности Болезни: – врожденные – присутствующие у больного сразу после рождения – генные – обусловленные присутствием мутаций в генах – геномного импринтинга – обусловленные нарушением геномного импринтинга – митохондриальные – обусловленные присутствием мутаций в митохондриальных генах – моногенные – обусловленные присутствием мутаций в одном гене – мультифакториальные – с наследственной предрасположенностью – наследственные – хромосомные и генные – семейные – присутствующие у нескольких членов одной семьи – хромосомные – обусловленные нарушением числа, либо структуры хромосом – экспансии – обусловленные динамическими мутациями Вектор – модифицированная плазмидная, фаговая, вирусная, дрожжевая или бактериальная ДНК, обеспечивающая проникновение чужеродных ДНК в клетки-хозяина Гаметы – зрелые половые клетки Ген – дискретная единица наследственности; единица мутации, рекомбинации и функции; транскрибируемый участок молекулы ДНК: – «ген в пробирке» – клонированная кДНК гена – гомеозисный – содержащий гомеобокс ген транскрипционного фактора, участвующий в контроле спецификации сегментов зародыша (Hox, Pax, Sox и др.) – онкоген – гетерозиготные доминантные мутации в котором увеличивают пролиферативную способность опухолевых клеток – супрессор опухолей – гомозиготные рецессивные мутации в котором инактивируют супрессорную функцию по отношению к опухолевому росту – тканеспецифический – экспрессирующийся в специфических тканях на определенных стадиях их дифференцировки Генеалогический анализ – Генетика – наука о наследственности и изменчивости – молекулярная – раздел генетики, занимающийся изучением вещества наследственности – ДНК – медицинская – раздел генетики человека, посвященный изучению патологических состояний – популяционная – раздел генетики, занимающийся изучением генетического разнообразия популяций и закономерностей его поддержания – цитогенетика – раздел генетики, занимающийся изучением хромосом и их аномалий – «обратная» – стратегия генетического анализа «от гена к белку» Генетическая гетерогенность – образование сходных фенотипов, обусловленных присутствием мутаций в разных генах Генетическая линия – совокупность сходных по фенотипу и генотипу особей одного вида, устойчиво размножающихся в условиях искусственного разведения Генетический груз – распространенность в различных популяциях мутаций, ассоциированных с наследственной патологией Генетический изолят – небольшая популяция, отделенная от других особей того же вида географическими, социальными, религиозными или иными барьерами Генетический код – правило, определяющее соответствие между кодонами в мРНК и аминокислотами в белке. Свойства: – универсальность – одинаковый характер генетического кода у разных видов организмов от вирусов до человека Генетическое расстояние – между локусами – расстояние между локусами одной хромосомы, измеряемое в сантиморганах (сМ) – между популяциями – мера эволюционной родственности популяций, этнических групп, рас или видов, измеряемая по уровню накопленных генетических различий Генная инженерия – комплекс методов работы с рекомбинантными ДНК «Генная сеть» – группа координировано работающих генов, ответственных за морфогенез отдельных органов или тканей, формирование метаболической цепи, предрасположенности к определенной мультифакториальной патологии и т.п. Геном – полная генетическая система клетки, определяющая характер онтогенетического развития и наследственную передачу в ряду поколений различных свойств организма. В молекулярной генетике геном и ДНК часто используют как синонимы Геномный импринтинг – разное проявление мутантного аллеля в зависимости от его прохождения через материнский или отцовский гаметогенез Генотип – совокупность аллелей различных генов Гетерозиготное состояние – присутствие нормального и мутантного аллеля (Аа) в одном гене Гетерохроматин – темно окрашенные участки хромосом, сохраняющие свое компактное положение на протяжении всего клеточного цикла – половой – тельце Барра Гибридизация ДНК – образование двойной структуры ДНК при восстановлении водородных связей между комплементарными нуклеотидами Гистоны – группа мажорных белков хромосомы, участвующих в ее упаковке Гомозиготное состояние – присутствие двух одинаковых аллелей (АА или аа) в одном гене Группа сцепления – группа генов, локализованных в одной хромосоме Гуанин (Г) – азотистое основание, относящееся к группе пуринов Дезоксирибоза – сахар содержащий 5 атомов углерода (пентоза) Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) – вещество наследственности, нитевидная молекула, в которой остов из чередующихся остатков дезоксирибозы и фосфорной кислоты ковалентно соединен с четырьмя азотистыми основаниями – аденином, тимиом, гуанином и цитозином – комплементарная (кДНК) – однонитевая ДНК, образующаяся при обратной транскрипции мРНК и представляющая кодирующую часть гена – митохондриальная (мтДНК) – молекула ДНК, локализованная в митохондриях Денатурация или плавление ДНК – переход ДНК в однонитевую форму при разрыве водородных связей между комплементарными нуклеотидами ДНК-полимераза – фермент комплементарного синтеза ДНК по матрице Законы Менделя: – гипотеза чистоты гамет – предположение Менделя о существовании двух дискретных наследственных единиц, только одна из которых с равной вероятностью попадает в гамету – первый – закон единообразия гибридов первого поколения: гибриды первого поколения либо походят на одного из родителей, либо имеют промежуточное выражение признака – второй – закон расщепления признаков: при полном доминировании в потомстве от скрещивания гибридов первого поколения будут наблюдаться особи как с доминантным, так и с рецессивным признаком, в среднем, в соотношении 3:1 – третий – закон независимого комбинирования признаков, контролируемых генами разных хромосом Закон Харди-Вайнберга – соотношение между частотами аллелей и генотипов в панмиктических популяциях Инбридинг – близкородственное разведение или повышенная степень родства в браке Интрон – некодирующая часть генов эукариот Кариотип – набор хромосом одной клетки Килобаза (кб) – единица измерения расстояния в молекуле ДНК, равная тысяче пар оснований Клетка-хозяина – любая культивируемая клетка, чаще всего бактериальная, в которую вводится чужеродный генетический материал Клеточный цикл – время жизни клетки с момента ее образования до завершения деления Клонирование: – ДНК – эффективный метод поддержания и размножения любых относительно небольших молекул ДНК путем их встраивания в вектор и введения этой конструкции в клетки-хозяина – ткани, органа или организма – искусственное выращивание ткани, органа или целого организма путем переноса соматических ядер в безьядерную зиготу Кодон или кодирующий триплет – три нуклеотида мРНК, кодирующие в соответствии с генетическим кодом определенную аминокислоту – сайт инициации транскрипции – ATG-триплет, кодирующий метионин – стоп-кодон или нонсенс-кодон – сигнал прекращения трансляции Комплементарность (нуклеотидных пар ДНК) – образование водородных связей по правилу А-Т, Г-Ц в двунитевой молекуле ДНК Кроссинговер – гомологичная рекомбинация Локус – участок хромосомы, ассоциированный с определенной функцией или имеющий какие-то структурные особенности Материнский эффект (цитоплазмы) – влияние материнских белков и мРНК, накопленных в ооците, на первые этапы развития зародыша Мегаобаза (мб) – единица измерения расстояния в молекуле ДНК, равная миллиону пар оснований Мейоз – деление половой клетки Митоз – деление соматической клетки Мозаицизм – присутствие мутации в части клеток – гонадный – присутствие мутации в части гонад – соматический – присутствие мутации в части соматических клеток Мультигенное семейство – группа функционально и структурно родственных генов, часто находящихся под общим регуляторным контролем Мутаген – химическое вещество или физическое воздействие, увеличивающее частоту возникновения мутаций Мутагенез – процесс возникновения мутации Мутация – мутантный аллель, приводящий к патологическому развитию признака: – геномная – увеличения полного гаплоидного набора хромосом или изменения количества хромосом одной пары – – полиплоидия – увеличение полного гаплоидного набора хромосом – мажорная – встречающаяся с высокой частотой в определенной популяции – точковая – затрагивающая один или несколько нуклеотидов – – динамическая – увеличение выше допустимого предела числа повторов, расположенных в функционально значимых областях генов – – миссенс – замена нуклеотида в кодирующей части гена, сопровождающаяся заменой аминокислоты в белке – – нейтральная – замена нуклеотида в кодирующей области гена, не приводящая к изменениям в кодируемом белке – – нонсенс – замена нуклеотида в кодирующей части гена с образованием преждевременного стоп-кодона – – сдвиг рамки считывания – ошибка в образовании кодонов – – соматическая – возникшая в соматической клетке – – сплайсинговая – нарушающая сплайсинг – хромосомная – затрагивающая число или структуру хромосом – – числовая – затрагивающая число хромосом – – – анеуплоидия – изменение количества хромосом одной пары – – – моносомия – отсутствие одной из гомологичных хромосом – – – трисомия – существование третьей добавочной копии одной из гомологичных хромосом – – структурная – мутация, затрагивающая структуру хромосом – – – делеция – отсутствие фрагмента хромосомы или гена – – – дупликация – удвоение фрагмента хромосомы или гена – – – инверсия – переворот на 1800 фрагмента хромосомы или гена – – – инсерция – вставка фрагмента хромосомы или гена – – – сбалансированная – не сопровождающиеся утратой генетического материала – – – транслокация – перенос фрагмента одной хромосомы на другую – de novo – возникшая в половой клетке одного из родителей или в соматической клетке в период эмбриогенеза Наследование: – аутосомно-доминантное – наследование доминантного признака, ген которого расположен в аутосоме – аутосомно-рецессивное – наследование рецессивного признака, ген которого расположен в аутосоме – сцепленное с полом – наследование признака, ген которого расположен в половой хромосоме – Х-сцепленное – наследование признака, ген которого расположен в Х-хромосоме – голандрическое – наследование признака, ген которого расположен в Y-хромосоме – полигенное – наследование признака, контролируемого несколькими генами Наследственная конституция – сочетания нормальных и мутантных аллелей всех генов индивидуума Нуклеосома – ДНК, длиной 147 п.о., связанная с октамером гистонов, – основная структурная субьединица хроматина Нуклеотид – азотистое основание, сахар и остаток фосфорной кислоты в молекуле нуклеиновой кислоты Однородительская дисомия – «ошибочное» получением ребенком двух гомологичных хромосом от одного из родителей Оогенез – женский гаметогенез Ооплазма – цитоплазма ооцита Ооплазматическая сегрегация – формирование гетерогенности цитоплазмы, происходящее в период созревания яйцеклетки Ооцит – женская половая клетка – предшественник яйцеклетки Панмиктическая популяция – популяция, в которой нет предпочтений при образовании супружеских пар Панмиксия – случайное скрещивание Пенетрантность – отсутствие проявления патологического признака у части мутантных особей Плейотропия – одновременное вовлечение в патологический процесс нескольких систем, органов и тканей Полиморфизм – полиморфный аллель – клинический – различия в клиническом проявлении разных мутаций, локализованных в одном и том же гене – популяций – устойчивое сосуществование в пределах одной популяции нескольких генетических форм Полипептидная цепь – последовательность аминокислот, соединенных между собой пептидными связями, процессинг которой завершается образованием зрелого белка Признак: – доминантный – родительский признак, проявляющийся у гибридов первого поколения – количественный – полигенно наследуемый, степень выраженности которого у отдельных индивидуумов может быть измерена количественно – моногеннный – развивающийся под контролем одного гена – рецессивный – родительский признак, не проявляющийся у гибридов первого поколения консультацией, с которого начинается составление родословной Промотор – основной регулятор работы гена, место взаимодействия ДНК с ферментом РНК-полимеразой Рекомбинация – обмен между гомологичными (кроссинговер) или негомологичными участками ДНК Репликация ДНК – комплементарный синтез ДНК по матрице Репрограммирование генома – прогрессивная активация эмбрионального генома, происходящая на стадии зиготы Рибонуклеиновая кислота (РНК) – нитевидная молекула, в которой остов из чередующихся остатков рибозы и фосфорной кислоты ковалентно соединен с четырьмя азотистыми основаниями – аденином, урацилом, гуанином и цитозином – матричная (мНК) или информационная иРНК) – молекула РНК, комплементарная экзонам генов, образующаяся при процессинге преРНК и служащая матрицей для трансляции полипептидных цепей в соответствии с генетическим кодом – преРНК или первичный РНК-транскрипт – молекулы РНК, которые синтезируются в процессе транскрипции – транспортная (тРНК) – кленовообразная молекула РНК, способная образовывать комплекс с одной из аминокислот и транспортировать ее к рибосоме Рибосома – небольшая органелла клетки, состоящая из двух главных субъединиц рибосомальной РНК (рРНК), на которой происходит трансляция белков РНК-полимераза – фермент комплементарного синтеза РНК по матрице ДНК Родословная – графическое изображение семейной истории (семейного дерева) Сантиморган (сМ) или морганида – единица измерения генетического расстояния между локусами одной хромосомы, равная 1% рекомбинации между ними в процессе мейоза Сплайсинг – вырезание последовательностей, комплементарных интронам, из молекулы преРНК и сшивка последовательностей, комплементарных экзонам, с образованием мРНК – сайты сплайсинга – канонические последовательности, локализованные на границах между экзонами и интронами, необходимые для правильного вырезания интронов Суперген – крупное мультигенное семейство, состоящее из десятков и сотен родственных генов Тельце Барра или половой гетерохроматин – выявляемая при анализе женского кариотипа компактная структура хроматина, образованная инактивированной Ххромосомой Тимин (Т) – азотистое нуклеотидное основание, относящееся к группе пиримидинов Тотипатентность – способность дифференцироваться в различные специализированные типы клеток Трансгеноз – искусственное введение чужеродных генетических конструкций в оплодотворенную яйцеклетку или в ранние зародыши экспериментальных животных или растений – «нокаут» – направленное разрушение гена путем трансгеноза – «нокаут» линии – трансгенные модельные линии с направленно инактивированным геном – трансгенные модельные линии – экспериментальные линии животных или растений, полученные путем трансгеноза Трансляция – синтез полипептидной цепи по молекуле мРНК Транскрипционный фактор – регуляторный элемент, способный активировать или репрессировать другие гены Транскрипция – синтез молекул преРНК, комплементарных генам, по матричной ДНК – обратная – ферментативный синтез молекул ДНК по матрице РНК с помощью обратной транскриптазы Трансформация – искусственная передача наследственных признаков Урацил (У) – азотистое нуклеотидное основание, относящееся к группе пиримидинов Фенотип – совокупность признаков индивидуума Фетопатия – аномалия плода, возникающая под действием тератогенов после периода активного органогенеза во втором и третьем триместрах беременности Фон: – генетический – совокупность генотипических факторов, способных влиять на фенотипическое выражение мутации – средовой – совокупность факторов окружающей среды, способных влиять на фенотипическое выражение мутации Хроматин – окрашивающееся вещество хромосом Хромосома – дискретная структура в ядре клетки, отчетливо видная в период ее деления при световой микроскопии и использовании специфических методов окрашивания – аутосома – неполовая хромосома, присутствующая в соматических клетках мужчин и женщин в двойном наборе, а в половых клетках – в одинарном – гаплоидный набор – одинарный набор хромосом половых клеток – диплоидный набор – двойной набор хромосом соматических клеток – половые хромосомы – X- и Y-хромосомы – теломера – концевой участок хромосомы – центромера – функциональный участок хромосомы, разделяющий ее на два плеча: короткое (p) и длинное (q) Центральная догма молекулярной генетики – «один ген – одна полипептидная цепь» Цитогенетическая карта – схема, определяющая принадлежность генов к отдельным хромосомам и их взаимное расположение внутри хромосомы относительно друг друга и видимых цитогенетических маркеров хромосомы Цитозин (Ц) – азотистое нуклеотидное основание, относящееся к группе пиримидинов Экзон – кодирующая часть генов эукариот Экспрессивность – степень выраженности патологического признака у различных мутантных особей Экспрессия гена – транскрипция гена, сопровождающаяся появлением мРНК, и трансляция с образованием конечного белкового продукта – гиперэкспрессия – образование аномально большого количества продукта гена – эктопическая – работа гена в несвойственном типе клеток или в несвойственный момент онтогенетического развития Эмбриопатия – грубая аномалия плода, возникающая под действием тератогенов в период активного органогенеза, начиная с 15 дня до 12 недели беременности «Эффект основателя» – распространение в генетическом изоляте мутации, возникшей у одного из предков Список Литературы 1. Баранов В. С. Основы проэмбрионального и эмбрионального развития человека// В кн. «Пренатальная диагностика наследственных и врожденных болезней» Под ред. акад. РАМН, проф. Э. К. Айламазяна, чл.-корр. РАМН, проф. В. С. Баранова. – М.: МЕДпресс-информ. – 2006. – 416 стр.: илл. 2. Баранов В. С., Иващенко Т. Э., Швед Н. Ю., Крамарева Н. Л. Генетические основы профилактики и лечения эндометриоза// В сб. «Молекулярногенетические технологии в медицинской практике»/ Под ред. А. Б. Масленникова. – Вып. 5. – Новосибирск: Альфа Виста. – 2004. – с. 136-156. 3. Бочков Н.П. Клиническая генетика. Учебник. – М.: ГЭОТАР-МЕД., 2001. – 448 стр. 4. Горбунова В.Н. Молекулярные основы медицинской генетики. СПб.: «Интермедика». – 1999. – 209 стр. 5. Горбунова В. Н. Что вы знаете о своем геноме? – СПб. «Интермедика». – 2001. – 143 стр. 6. Имянитов Е. Н., Хансон К. П. Молекулярная онкология: клинические аспекты. СПб.: Издательский дом СПбМАПО: – 2007. – 211 стр. 7. Кадурина Т. И., Горбунова В. Н. Дисплазия соединительной ткани. Руководство для врачей. – СПб.: Элби-СПб, 2009. – 704 с.: илл. 8. Киселев В. И., Киселев О. И. Вирусы папилломы человека в развитии рака шейки матки. СПб.: Изд-во «Роза мира». – 2003. – 92 с. 9. Курило Л. Ф. Генетический контроль дифференцировки органов половой системы// В сб. «Молекулярно-генетические технологии в медицинской практике»/ Под ред. А. Б. Масленникова. – Вып. 4. – Новосибирск: Альфа Виста. – 2003. – с. 59-68. 10. Осиновская Н. С, Иващенко Т.Э., Соболева Е. Л., Баранов В.С. Мутационные нарушения при различных формах ВГКН и особенности молекулярной диагностики дефицита 21-гидроксилазы при стертых формах заболевания// Мед. генетика. – т. 6, №4. – с.35-41.- 2007.