секция 1 молекулярные механизмы генетических процессов

СЕКЦИЯ 1
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНА uox
К.В. Азарин, В.А. Усатов
Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия
azkir@rambler.ru
Кодирующие макромолекулы эволюционируют с разными скоростями. Наибольшую
консервативность проявляют гены и белки «домашнего хозяйства» контролирующие
основные и наиболее древние жизненные функции и процессы, которые идентичны или
генетически подобны у многих форм жизни. Одним из таких древних метаболических путей
является процесс катаболизма пуринов. Ключевой фермент пуринового метаболизма
уриказа (uox), катализирует превращение мочевой кислоты в аллантоин. Аллантоин и
мочевая кислота являются одними из важных звеньев «неферментативной части»
антиоксидантной системы, обеспечивающих адаптацию к воздействию разнообразных
факторов [1, 2,]. Мочевая кислота, превращается под действием уриказы в аллантоин,
который способен выполнять роль тушителя свободных радикалов как часть общей
антиоксидантной системы. Помимо этого, экспериментально была показана высокая
антимутагенная активность аллантоина [2]. Тем не менее, при интерпретации данных по
антиоксидантной активности аллантоина у человека необходимо учитывать то, что мочевая
кислота также обладает определенной антиоксидантной активностью. При этом нужно
учесть, что урат является основным катаболитом азотсодержащих соединений у высших
приматов. В связи с чем, целью данной работы было исследование антиоксидантного
потенциала аллантоина и мочевой кислоты при помощи апробированной нами ранее
методологии и анализ свойств и закономерностей в последовательности ДНК гена uox на
молекулярно – генетическом уровне.
В ходе анализа были выявлены 12 консервативных регионов гена уриказы, которые
практически неизменны у всех исследованных позвоночных, включая как несинонимичные,
так и синонимичные мутации.
Данные регионы могут, как входить в состав активного центра, так и быть
ответственными за формирование пространственной структуры. Присутствие таких
консервативных участков может свидетельствовать о давление отбора направленного как на
активный, так и на псевдо ген uox в случае высших приматов. Была предсказана вторичная
структура аминокислотной последовательности уриказы. В результате структурного анализа
выборки последовательностей, обнаружен детерминизм распределения локально
упорядоченных жестких сегментов полипептидной цепи – альфа-спиралей и бета-тяжей.
Однако на протяжении длительной эволюции приматов ген uox сохранял функциональность
и только у гоминид произошло превращение гена в псевдоген. В этой связи возникает
вопрос, достаточно ли прошло времени, чтобы за счёт случайно фиксированных мутаций
нарушились все поддерживающиеся до этого времени консервативные мотивы и
предсказанная вторичная структура белка. Расстояние между геном мыши и человека 49
замен, а расстояние между геном мыши и мартышек – 25. То есть в гене uox Н. sapience 24
«сверхнормативно» фиксированных мутаций на общую длину 915 н.п., или 2.6 %. Можно
предположить, что 2.6 % перечисленных замен локализуются в вариабельных областях по
случайным причинам. С этой целью путём моделирования было внесено случайным образом
по 24 мутации в последовательность функционального гена uox M. mulatta. На полученных
таким образом 50 последовательностях, было проверено насколько нарушаются
8
консервативные мотивы и предсказанная вторичная структура. Консервативные регионы,
неизменные у всех исследованных позвоночных с активным геном uox, сохраняют эту
тенденцию и у Н. sapience, где частота мутирования составляет 0.0 %. Частота мутирования
этих участков в модельных последовательностях от 22 % до 46 %. То есть, в среднем
вероятность возникновения случайной замены составляет 35.5 % для каждого
консервативного региона, что на высоком уровне значимости (P = 0.001) отличается от
последовательности Н. sapience. Следовательно, с высокой вероятностью можно судить, что
разница между распределением мутаций носит не случайный, а систематический характер.
Анализируемые последовательности гена uox по значениям генетических дистанций
образуют два крупных кластера, первый из которых состоит из последовательностей ДНК
характерных для млекопитающих, а второй – для земноводных. Генетические дистанции
между Xenopus tropicalis и млекопитающими находятся в пределах от 0.456 до 0.475, где
минимально значение относится к Sus scrofa, а максимальное к M. musculus. Типы гена uox
приматов по генетическим дистанциям вначале образуют 2 группы, разделяющие обезьян
Нового и Старого света. Дистанция между Aotus trivirgatus и Н. sapience ровняется 0.054.
Наибольшее различие с приматами Нового света наблюдается для вида Gorilla gorilla
(0.058), следующим идёт Hylobates lar и P. troglodytes (0.053). В общем, кластер,
объединяющий Hominoidea, отличается боле высокими генетическими дистанциями в
отношение Aotus trivirgatus, тогда как для кластера Cercopithecidae они снижены и
приобретают наименьшее значение у Papio hamadryas (0.041). Генетические дистанции в
группе приматов не превышают расстояние между близкими видами M. мusculus и Rattus
norvegicus.
Результаты влияния урата и аллантоина на индуцированный перекисью водорода SOSответ клеток E. coli показали, что урат, также как и аллантоин, проявляет антимутагенную
активность практически, во всех вариантах опыта. Максимальная активность
регистрируется для концентрации 10-3 М. Максимальная активность регистрируется для
аллантоина в концентрации 10-4 М. В отличие от урата, его активность сохраняется и при его
малых концентрациях – 10-10 - 10-11М. Максимальное значение антимутагенной активности
аллантоина превышает аналогичный показатель для урата в 1,37 раза.
Данные по СУА аллантоина и мочевой кислоты показывают, что для аллантоина
увеличение концентрации не приводит к достоверному росту СУА, тогда как для урата
обнаружена явная зависимость эффекта от дозы. Максимум супероксидустраняющей
активности проявляет урат в концентрации 10-5М. Это указывает на значительную роль
мочевой кислоты в качестве клеточного протектора от активных форм кислорода, таких как
супероксид-анион.
Мочевая кислота, как показано выше, является эффективным тушителем гидроксильных
и супероксид радикалов. С повышением концентрации урата, вследствие Uox- мутаций [3],
связывают увеличение продолжительности жизни у человека и снижение уровня возрастных
раковых заболеваний [1]. С другой стороны, в результате атаки мочевой кислоты
свободными радикалами образуется аллантоин, обладающий свойствами антиоксиданта,
антимутагена и витамина [2]. Таким образом, неферментативная генерация аллантоина у
видов, потерявших уриказную активность, может отражать развитие адаптационной
составляющей окислительного стресса. В организме существует целый ряд
взаимосвязанных антиоксидантных систем, основная роль которых заключается в
поддержании гомеостаза клеток и тканей при действии экстремальных факторов,
обладающих прооксидантными свойствами. Низкомолекулярные антимутагены - это лишь
часть системы защиты от ДНК-тропных воздействий. Но эта часть отражает эволюционное
развитие метаболизма, сложившегося в аэробных условиях и несущего определенную
антиокислительную нагрузку. Полученные в этой работе данные дают материал для
рациональной оценки места урата и аллантоина в системе антиоксидантной защиты.
9
Совокупность таких антиоксидантов, как мочевая кислота и аллантоин, вносит вклад в
общий антиоксидантный пул метаболизма, величина которого имеет важнейшее адаптивное
значение.
1. Ames B.N.,Cathcart R., Schwiers E., Hochstein P. Uric acid provides an antioxidant defense in humans against
oxidant- and radical-caused aging and cancer: a hypothesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1981. – vol. 11, - P.
6858-6862.
2. Гуськов Е.П., Клецкий М.Е., Корниенко И.В., Олехнович Л.П., Чистяков В.А., Шкурат Т.П., Прокофьев В.Н.,
Жданов Ю.А. Аллантоин как тушитель свободных радикалов // ДАН, серия Биохимия, Биофизика – М. 2002. - Т. 383, № 2. -с.105-107.
3. Oda M., Satta Y., Takenaka O., Takahata N. Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary
implications // Molecular Biology and Evolution.- 2002.- vol. 19,- P. 640-653.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ
УЛЬТРАФИОЛЕТА ДИАПАЗОНА UV-A
Г.А. Аниканов, С.В. Глушен
Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь
anikanov_g@yahoo.com
Генотоксические и цитотоксические эффекты солнечного света исследуются уже давно.
Известно, что его ультрафиолетовый компонент вызывает повреждения ДНК и активирует
репарационные системы клетки. Ввиду того, что ультрафиолет с длиной волны 280-320 нм
(диапазон UV-B) поглощается азотистыми основаниями, вызывая, главным образом,
образование димеров тимина, он рассматривается как более опасный для клеток, чем
ультрафиолет с длиной волны 320-400 нм (диапазон UV-A), который прямо на ДНК не
влияет [1].
Однако, в последнее время было показано, что облучение клеток ультрафиолетом
диапазона UV-A также вызывает значительные повреждения ДНК, но не прямо, а индуцируя
образование активных форм кислорода. Поэтому ультрафиолет диапазона UV-A может
провоцировать нестабильность генома и, соответственно, активность систем быстрой
репарации ДНК [2]. Недавно стало известно, что непосредственно после облучения
ультрафиолетом диапазона UV-A в культуре кератиноцитов наблюдается резкий всплеск
количества одинарных и двойных разрывов ДНК, которые затем репарируются [3].
Целью нашего исследования было проверить эффект быстрого повреждения ДНК
непосредственно после облучения клеток ультрафиолетом диапазона UV-A и установить, в
какой степени разрывы ДНК могут отразиться на структуре хроматина клеточного ядра.
Исследование проводилось на перевиваемой культуре клеток К562, которые облучали
ультрафиолетом с длиной волны 365 нм. Энергетическая светимость источника 5 мВт/см2,
высота источника над панелью с клетками - 20 мм. Экспозиция составляла 30, 60, 90 и 120
секунд, контролем служили необлученные клетки. Уровень разрывов ДНК определяли
методом comet assay. Для оценки структуры хроматина клетки окрашивали акридиновым
оранжевым в концентрации 5 мкг/мл, фотографировали с помощью микроскопа Eclipse 50i
фирмы Никон (объектив Plan Fluor 60×/0.85, телекамера DS-5M), а затем измеряли размеры,
яркость и текстурные параметры клеточных ядер.
Использованный нами щелочной вариант comet assay позволяет оценить суммарный
уровень одинарных и двойных разрывов ДНК в клетках. Полученные результаты
показывают, что после облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 365 нм в
клетках культуры К562 наблюдается экспоненциальный рост количества разрывов ДНК
пропорционально времени облучения (рис. 1).
У облученных клеток изменяется по сравнению с контролем ряд параметров клеточного
ядра: уменьшаются размеры, увеличивается интегральная яркость, снижаются текстурные
10