Институт биологии гена РАН
advertisement
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук на правах рукописи Долгова Анна Сергеевна ЗАЩИТА ЭКСПРЕССИИ ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ ГЕНОВ В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ ПОСРЕДСТВОМ ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ТЕРМИНИРУЮЩИХ ТРАНСКРИПЦИЮ. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук (Специальность 03.01.07 – молекулярная генетика) Научный руководитель: академик, д.б.н., профессор П.Г. Георгиев Москва 2015 2 Оглавление Оглавление...............................................................................................................................................2 1. Введение...........................................................................................................................................4 2. Обзор литературы.........................................................................................................................10 2.1 Генная инженерия растений.......................................................................................................10 2.2 Методы трансформации.............................................................................................................11 2.2.1 Трансформация растений посредством Agrobacterium tumefaciens................................12 2.2.2 Биолистический метод переноса генов..............................................................................15 2.2.3 Прямая доставка ДНК в протопласты................................................................................16 2.3 Репортерные гены и селективные маркеры..............................................................................18 2.4 Вариабельность трансгенной экспрессии.................................................................................19 2.4.1 Возможные причины вариабельности трансгенной экспрессии.....................................20 2.4.2 Сайт специфическая трансформация и трансформация сдерживающая копийность...23 2.4.3 Дизайн конструкций............................................................................................................28 2.4.4 MAR-элементы.....................................................................................................................31 2.4.5 Вирусная супрессия сайленсинга генов.............................................................................34 2.4.6 Растения мутантные по одной или нескольким составляющим механизма РНКсайленсинга....................................................................................................................................35 2.4.7 Альтернативные способы снижения вариабельности трансгенной экспрессии............37 3. Методы...........................................................................................................................................40 3.1 Молекулярные методы................................................................................................................40 3.1.1 Электрофорез в агарозном геле..........................................................................................40 3.1.2 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.............................................................40 3.1.3 Определение концентрации нуклеиновых кислот............................................................41 3.1.4 Рестрикция............................................................................................................................41 3.1.5 Фосфорилирование олигонуклеотидов..............................................................................41 3.1.6 Лигирование.........................................................................................................................42 3.1.7 Тупление "липких" концов фрагментов плазмидной ДНК..............................................42 3.1.8 Приготовление компетентных клеток................................................................................43 3.1.9 Трансформация клеток E. сoli.............................................................................................44 3.1.10 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса.............................................44 3.1.11 Переосаждение ДНК..........................................................................................................46 3.1.12 Культивирование бактерий для выделения плазмидной ДНК.......................................47 3.1.13 Проведение ПЦР-скрининга.............................................................................................47 3 3.1.14 Трансформация A. tumefaciens..........................................................................................47 3.2 Работа с растениями...................................................................................................................48 3.2.1 Подготовка маточных растений..........................................................................................48 3.2.2 Сбор и подготовка листьев..................................................................................................49 3.2.3 Трансформация табака.........................................................................................................49 3.2.4 Селекция трансгенной ткани, отбор трансформантов и элиминация агробактерий.....50 3.2.5 Мультипликация и укоренение трансформантов..............................................................51 3.2.6 Выделение геномной ДНК из растений (с SDS)...............................................................51 3.2.7 Экстракция тотального белка растений.............................................................................52 3.2.8 Флуоресцентный анализ активности гена gfp...................................................................53 3.2.9 Определение количества GFP методом иммуноферментного анализа (ELISA)............53 3.2.10 Гистохимический анализ GUS-активности.....................................................................54 3.2.11 Флюориметрический анализ GUS-активности...............................................................54 3.2.12 Определение концентрации общего белка.......................................................................55 3.3. Праймеры....................................................................................................................................56 4. Результаты и обсуждение.............................................................................................................58 4.1 Исследование возможности использования синтетических ДНК элементов, терминирующих транскрипцию......................................................................................................58 4.1.1 Генетическая трансформация растений.............................................................................60 4.1.2 Анализ уровня экспрессии репортерных генов................................................................62 4.2 Исследование возможности использования растительных ДНК элементов, терминирующих транскрипцию......................................................................................................65 4.2.1 Поиск регуляторных элементов..........................................................................................65 4.2.2 Конструирование..................................................................................................................77 4.2.3 Генетическая трансформация растений.............................................................................80 4.2.4 Анализ уровня экспрессии репортерных генов.................................................................82 4.3 Статистическая обработка результатов.....................................................................................85 4.3.1 Ограничения дисперсионного анализа и подготовка данных..........................................86 4.3.2 ANOVA..................................................................................................................................92 5. Выводы.........................................................................................................................................104 6. Список литературы.....................................................................................................................106 4 1. Введение Растения являются основным источником пищи для людей и кормов для сельскохозяйственных животных. Многолетние усилия селекционеров превратили растения в продовольственные культуры, которые являются основными источниками углеводов, липидов, белков, витаминов и минералов. Методы традиционной селекции сельскохозяйственных культур к настоящему времени не могут удовлетворить растущие потребности человечества в продовольствии. Последние достижения растительной биотехнологии открывают новые возможности для улучшения урожайности, качества и для удешевления производства сельскохозяйственных культур. В настоящее время для изменения признаков ценных сельскохозяйственных культур всё чаще стала использоваться возможность непосредственного введения гетерологичных генов. Начиная с первого удачного эксперимента в 1983 году к 2014 уже более 18 миллионов производителей по всему миру выращивали трансгенные культуры на площади более 180 миллионов гектаров (James, 2014). В последнее время генетическая инженерия растений является наиболее быстро распространяющейся технологией в сельскохозяйственном производстве (James, 2014). Эффективность использования генетически модифицированных растений напрямую зависит от возможности сохранения морфологических и физиологических характеристик культуры, а также достижения воспроизводимости результатов экспрессии измененного или привнесенного гена. Однако, даже между независимыми растительными линиями, конструкцией, наблюдается протрансформированными значительная одной вариабельность и той же трансгенной экспрессии. Более того во многих случаях происходит полное или частичное ингибирование встроенного гена. На данный момент известно несколько факторов вызывающих изменения уровня экспрессии гетерологичных генов в растениях. Это и непредсказуемое число интегрированных в геном копий, и место интеграции экспрессионной кассеты, и уровень ее метилирования (Bhattacharyya 5 et al., 1994, Hobbs et al., 1993, Linn et al., 1990, Matzke & Matzke 1990, 1998; Kooter et al. 1999). Вариабельность экспрессии между трансформантами и эффекты сайленсинга сильно усложняют как фенотипический анализ, так и создание коммерчески выгодных линий с предсказуемыми характеристиками. Таким образом, одной из главных задач в области трансформации растений в настоящий момент является разработка конструкций и методов трансформации для получения в высоком процентном соотношении трансгенных растений с искомым стабильным фенотипом и снижение различий в уровне экспрессии гетерологичных генов между индивидуальными растениями. Существует ряд стратегий и технологий, применяемых для получения предсказуемых уровней трансгенной экспрессии в растениях, краткий обзор которых представлен ниже. Однако, несмотря на разнообразие подходов, универсального эффективного способа все еще не найдено. В связи с этим весьма актуальным остается поиск путей решения этой проблемы. Одним из наиболее перспективных подходов видится использование для этих целей регуляторных элементов различного происхождения, препятствующих посттранскрипционному ингибированию гена (PTGS). Одной из главных проблем получения трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии является репрессия на посттранскрипционном уровне, что связано с перекрытием транскриптов, которые инициируются в гетерологичном гене и в непосредственной близости от него в геноме. В результате становится возможным формирование двухцепочечной РНК, которая запускает ряд процессов, приводящих к репрессии гетерологичного гена. Поставленная нами цель заключалась в исследовании возможности повышения уровня экспрессии гетерологичного гена с помощью ДНК-элементов, обладающих способностью останавливать транскрипцию. Для ее достижения были поставлены следующие задачи: 1. Изучение влияния вирусных 35S CaMV и агробактериальных nos ДНКэлементов, терминирующих транскрипцию, на уровень репортерных генов в трансгенных линиях растений табака. экспрессии 6 2. Изучение влияния растительных ДНК элементов, терминирующих транскрипцию, на уровень экспрессии репортерных генов под промоторами разной силы и происхождения в трансгенных линиях растений табака. 3. Анализ влияния расположения ДНК элементов, терминирующих транскрипцию, на экспрессию гетерологичных генов в трансгенных линиях растений табака. 4. Оценка влияния ДНК элементов, терминирующих транскрипцию, на вариабельность экспрессии репортерных генов в трансгенных линиях растений табака. Исследование проводилось на нескольких терминирующих транскрипцию элементах различного генеза, как вирусного и бактериального, так и растительного происхождения. В результате в диссертационной работе впервые было показано, что присутствие в экспрессионной конструкции изучаемых ДНКэлементов в определенной позиции, позволяет увеличить транскрипцию репортерного гена в трансгенных растениях в несколько раз. Так как терминаторы транскрипции имеют отличный механизм действия, то они могут быть эффективно использованы совместно с другими регуляторными элементами для синергетического усиления экспрессии репортерных генов в трансгенных растениях. Безусловно, для подтверждения этого предположения необходимо проведение дальнейших исследований, однако уже сейчас видно, что подобные элементы являются весьма перспективным методом создания более эффективных экспрессионных векторов для получения трансгенных растений. Разработанный подход позволит увеличить производительность и ценность многих сельскохозяйственных культур, а также применяться в других областях биотехнологии, например, при экспрессии в растениях различных белков биомедицинского назначения. В результате проведенных исследований были получены следующие результаты: 1) создано два синтетических и три растительных регуляторных элемента, 2) проведен дизайн и конструирование экспрессионных кассет, для 7 изучения влияния на экспрессию трансгена ДНК-элементов, терминирующих транскрипцию, 3) проведен анализ уровня экспрессии репортерных генов и дальнейший статистический анализ полученных результатов. На их основе на защиту выносятся следующие положения: Основные положения, выносимые на защиту 1 ДНК-элементы, содержащие последовательности терминаторов генов агробактерий nos и вирусов 35S CaMV при локализации перед промотором усиливают экспрессию гетерологичных генов в растениях под сильным вирусным промотором 35S CaMV. 2 Расположение растительных ДНК-элементов терминирующих транскрипцию (ATs), при любом расположении относительно кассеты экспрессии оказывает более сильное влияние на экспрессию генов под растительными промоторами по сравнению с вирусными. 3 Расположение ДНК-элементов как с одной, так и с обеих сторон экспрессионной кассеты усиливает экспрессию генов с сильного растительного промотора RuBisCO. ДНК-элементы, расположенные только с 5'-конца гена увеличивают уровень экспрессии с сильного вирусного промотора 35S CaMV. 4 Растительные экспрессионной AT-элементы, кассеты снижают при размещении позиционный с обеих эффект и сторон эффект копийности до двух раз при экспрессии, которая находится под контролем сильного растительного промотора RuBisCO. Работа выполнена с использованием современных методов молекулярной генетики, молекулярной биологии и генетической инженерии растений. Цели, поставленные в работе, достигнуты. 8 Статьи в научных журналах: A.S. Dolgova, S.V. Dolgov, N.N. Nazipova, O.G. Maksimenko, P.G. Georgiev. «Arabidopsis termination elements increase transgene expression in tobacco plants», 2015. Plant Cell, Tissue and Organ Culture Volume 120, Issue 3, 1107-1116. DOI 10.1007/s11240-014-0667-1 Патенты: О.Г. Максименко, А.С. Долгова, А.Н. Бончук, М.В. Тихонов, Н.Б. Гасанов, Е.И. Зарайский, С.В. Долгов, П.Г. Георгиев. Способ создания трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии трансгенного белка. Патент 2507736. Дата приоритета 11.01.2011. Тезисы конференций: Dolgova A, Zaripova D, Dolgov S, Georgiev P, Maksimenko O (2009). Artificial regulatory elements which enables stable expression of a foreign gene in a tobacco plants. In P. Gustafson (Eds.), Proceedings of the 9th International Plant Molecular Biology Congress: Saint Louis, Missouri USA, October 25-30 (p. 190). Lancaster, Pa. : DEStech Publications Долгова А.С., Пушин А.С., Долгов С.В., Георгиев П.Г., Максименко О.Г. «Синтетические регуляторные элементы позволяющие стабилизировать экспрессию гетерологичных генов в растениях табака». 14-я Международная Пущинская Школа-Конференция Молодых Ученых «Биология- Наука XXI Века». Пущино, Россия, 2010 Долгова А.С., Пушин А.С., Долгов С.В., Георгиев П.Г., Максименко О.Г. «Синтетические регуляторные элементы позволяющие стабилизировать экспрессию гетерологичных генов в растениях табака». Международная научнопрактическая конференция молодых ученых «Современнная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и бионанотехнология». Брянск, Россия и Киев, Украина, 2010 9 Максименко О.Г., Долгова А.С., Бончук А.Н., Долгов С.В., Георгиев П.Г. «Создание генетических конструкций на основе регуляторных элементов, обеспечивающих высокоэффективную, стабильную экспрессию гетерологичных генов в растительных экспрессионных системах и поиск новых цис-регуляторных элементов растений». Всероссийская научная конференция «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в области хранения и переработки сельскохозяйственной продукции». Москва, Россия, 2010. 10 2. Обзор литературы 2.1 Генная инженерия растений Достижения классической селекции трудно переоценить, однако, на данный момент, она не может эффективно обеспечивать растущие потребности человечества. Это связано с ограниченнностью пула генов, способных к переносу традиционными методами селекции. В последнее время при создании сельскохозяйственных культур все чаще используют методы генной инженерии, сочетающие культуру ткани in vitro и методы молекулярной биологии. Суть этого метода заключается в переносе гетерологичных генов, выделенных из различных организмов, в новое генетическое окружение. Благодаря тому, что растительные клетки остаются тотипотентными на протяжении всего жизненного цикла из одной измененной клетки можно получить целое растение. С одной стороны, такой подход позволяет привносить в растения признаки, которые невозможно получить с помощью традиционной селекции, с другой стороны, генетическая инженерия позволяет перенести отдельный ген, отвечающей за конкретный признак, что снижает риск разрушения уже сложившегося генотипа. Генетическая инженерия растений начала свое стремительное развитие с появления технологии их трансформации и получения первого трансгенного растения с экспрессией чужеродного гена в начале 80-х гг (Fraley et al., 1983, Horsch et al., 1984; Zambriski et al., 1983). В след за этим последовало появление новых химерных генов (Bevan et al., 1983; Herrera-Estrella et al., 1983a,b), векторов для трансформации (Hoekema et al., 1983; Bevan, 1984), методов доставки ДНК (Hernalsteens et al., 1980; Draper et al., 1982; Krens et al., 1982; Fromm et al., 1985; Sanford et al., 1987) и систем регенерации растений (Zambryski et al., 1983; Paszkowski et al., 1984; Shimamoto et al., 1989; Gordon-Kamm et al., 1990). Было показано, что маркер устойчивости к антибиотикам можно использовать для селекции трансформированных клеток, из 11 которых впоследствии возможно регенерировать нормальные фертильные растения (Bevan et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983). Уже в 1986 году США и Франции проводились первые полевые испытания трансгенных растений – табака с маркерным геном nptII (James and Krattiger, 1996). Табак обыкновенный (Nicotiana tabacum) был и остается ключевым модельным растением, в развитии генно-инженерных технологий. Именно для него была впервые отмечена возможность регенерации in vitro (Skoog and Miller, 1957) и разработана стандартная среда для культивирования (Murashige and Skoog, 1962). В силу простоты трансформации, регенерации и скорости последующего развития табак остается основным модельным объектом для исследований в области генетической инженерии растений. 2.2 Методы трансформации Существует несколько разных методов доставки ДНК в клетку. В целом, все способы переноса ДНК в растения можно разделить на несколько больших групп. Первая группа включает природные системы переноса генов – агробактериальные и вирусные векторы и способы доставки. Вторая группа – это искусственные системы переноса, которые можно разделить на две подгруппы: прямое введение ДНК путем достижения проницаемости протопластов и клеток химическими (полиэтиленгликоль), физическими (электропорация, ультразвук) или механическими способами (кристаллы карбида кремния, лазер) и использование искусственных векторных систем – микрочастиц, микроинъекций или липосом. В третью группу можно включить различные методы, которые в отличие от первых двух не требуют культуры in vitro и их обычно называют методами трансформации in planta. Из всех этих методов наибольшее практическое применение в настоящее время получили агробактериальный метод, биолистический и прямой перенос генов в протопласты. Другие же способы по ряду причин не нашли широкого применения (Barampuram, 2011). 12 2.2.1 Трансформация растений посредством Agrobacterium tumefaciens Агробактериальный метод трансформации растений – это использование в качестве векторов (переносчиков ДНК) бактерий A.tumefaciens, или, более редко, A.rhizogenes. Он основан на способности патогенного организма Agrobacterium переносить из своей Ti-плазмиды в растительные клетки определённые фрагменты ДНК. Благодаря этому, нативные штаммы Agrobacterium способны встраивать в геном растений различные гены, отвечающие за синтез эндогенных фитогормонов, опинов - производных аминокислот и сахаров. В результате экспрессии перенесенных генов формируются опухоли или разросшиеся корни, в которых синтезируются различные типы опинов, являющиеся питательной средой для Agrobacterium, не усваивающиеся растительными клетками. (Chilton et.al., 1977; Пирузян и Андрианов, 1985; Дрейпер и Скотт, 1991). Дальнейшие исследования показали, что Ti-плазмиды могут выступать в качестве биологического вектора для переноса больших фрагментов ДНК (до 50 тыс. п.н.), поскольку обладают всеми необходимыми для этого компонентами: - имеют набор генов вирулентности (VirA, B, C, D, E и G), координированное действие которых обеспечивает перенос и интеграцию переносимой ДНК (Т-ДНК); - консервативные 24х нуклеотидные прямые повторы, которые фланкируют Т-ДНК и выступают в качестве сигналов узнавания системы переноса ДНК; - район Т-ДНК, который может быть заменен на интересующий исследователей ген. - ori-сайт отвечающий за репликацию Ti-плазмиды внутри агробактерии. Помимо vir-генов в работе аппарата переноса Т-ДНК и в обеспечении вирулентности агробактерий принимает участие группа генов, локализованных в бактериальной хромосоме. Гены chv A, chv B, psc A и exo C необходимы для прикрепления агробактерий к стенке растительной клетки (Thomashow et.al., 1987; Cangelosi et. al., 1989). В результате мутаций в этих локусах получаются 13 авирулентные или дефектные по прикреплению штаммы агробактерий. Однако онкогенность и большие размеры нативной плазмиды не позволяли использовать ее для прямого клонирования и переноса чужеродных генов. Эти недостатки были преодолены в начале 80-х. В 1983г. сразу несколько исследовательских групп - одна из Вашингтонского университета (США), вторая из Института растениеводства им. Макса Планка (Германия) и третья из Гентского государственного Университета (Бельгия), используя традиционную технологию рекомбинации ДНК, провели удаление генов вызывающих опухоли (Fraley et.al., 1983; Zambryski et.al., 1983). Эти гены были заменены на гены резистентности к канамицину, в результате чего трансформированные растительные клетки приобрели устойчивость к антибиотику (Bevan et.al., 1983; Fraley et.al., 1983; Herrera-Estrella et.al., 1983а). Таким образом, открылась возможность получения фенотипически нормального фертильного растения с экспрессией чужеродных генов. Первоначально были созданы коинтегративные системы векторов (цисвекторы), у которых большая часть Т-ДНК была заменена на участок ДНК, который имел область гомологии с клонирующими векторами, способным реплицироваться в клетках E.coli. Таким образом, в клетках агробактерии между гомологичной областью модифицированной Ti-плазмиды (vir-помощник) и гомологичной областью промежуточного вектора E.coli происходит рекомбинация. Образуется гибридная Тi-плазмида между нативными границами Т-ДНК которой находится полный коинтегративный вектор E.coli pBR322, содержащий гены для переноса в растения. Бактериальный селективный маркер плазмиды E.coli позволяет поддерживать Тi-коинтеграт в агробактерии, т.к. вектор E.coli в ней не способен реплицироваться автономно. В результате, в штаммах Agrobacterium, содержащих эти конструкции, во время трансформации Т-ДНК переносится в геном растения в результате действия vir области в положении цис (Zambryski et.al., 1983). Бинарная векторная система (транс-векторы) состоит из двух векторов: обезоруженной Ti-плазмиды и вектора, автономно реплицирующегося как в E.coli, 14 так и в агробактерии. Меньший вектор (бинарный) содержит между границами ТДНК гены для переноса в растения. Внутри его Т-ДНК находятся множественные сайты для клонирования, что позволяет осуществить вставку любой интересующей последовательности ДНК. Эта плазмида путём конъюгации переносится в штамм Agrobacterium содержащий большую плазмиду-помощника, лишенную онкогенности, что обеспечивает перенос Т-ДНК из маленькой плазмиды в клетки растения. В результате, перенос чужеродной ДНК из клонирующего вектора в растительную клетку может выполняться vir областью, функционирующей в транс-положении (Hoekama, 1983; Bevan, 1984). Первое трансгенное растение с экспрессией чужеродного гена получили именно агробактериальным методом (Horsch et al., 1984). По сравнению с искусственными системами переноса (как, например, широко используемый биолистический метод) агробактериальный метод обладает двумя важными преимуществами. Первое – агробактерии переносят в геном растений только тот фрагмент, который расположен между двумя определенными последовательностями ДНК, тогда как при использовании искусственных систем трансформированные клетки содержат также фрагменты генов или плазмидной ДНК. Второе – агробактериальный способ обычно приводит к встраиванию только одной или, по крайней мере, ограниченного числа копий гена и при этом, видимо, в определенные локусы хромосом, а другие методы к бессистемному встраиванию множества копий, которые в большинстве случаев сцеплены друг с другом (De Block, 1993). При использовании агробактериального метода частота получения стабильных трансформантов выше по сравнению с биолистическим методом (Mehlenbacher, 1995) и не требуется регенерация из протопластов, как при прямом переносе ДНК. Долгое время основным недостатком системы агробактерий было отсутствие методики агробактериальной трансформации злаковых культур. Но впоследствии для пшеницы (Mooney et al., 1991) и риса (Chan et al., 1992) удалось регенерировать стабильно трансформированный каллус, а позднее агробактериальным способом получили трансгенные растения кукурузы (Ritchie et al., 1993) и риса (Hiei et al., 1994). 15 Из трех наиболее распространенных методов трансформации растений наиболее часто используется агробактериальный. В 2003г агробактериальным метод был использован в 57% всех опубликованных работ по трансформации растений. В то время как биолистическая трансформация и прямая доставка ДНК в протопласты были использованы в 25% и 14% статей соответственно (Vain, 2007). 2.2.2 Биолистический метод переноса генов Биолистический метод заключается в том, что металлическим частицам (диаметр 1-4 мкм), покрытым ДНК, придается определённая скорость, они проникают через стенки интактных клеток и вносят в них молекулы ДНК (Klein et al., 1987; Sanford et al., 1987). Небольшие отверстия в мембранах и клеточных стенках быстро затягиваются, “проколы” существуют непродолжительное время и не нарушают целостность клеток. Частицы же настолько малы, что оставаясь в протоплазме, не мешают естественным клеточным процессам. (Klein et al., 1987; McCabe et al., 1988). Этот метод переноса генетической информации впервые был разработан в середине 60-х вирусологами, которые применили высокоскоростные частицы для поранения растительных клеток с целью заражения их вирусами (MacKenzie, 1966). Исследователи Корнельского университета значительно усовершенствовали методику биолистического переноса генов (Klein et al., 1987; Sanford, 1993). Они разработали ряд приспособлений для ускорения вольфрамовых частиц до скорости 250 м/с, достаточной для проникновения через клеточную стенку, что позволило транспортировать антитела, ферменты, синтетические микромолекулы и молекулы ДНК в растительные клетки. Усовершенствование, адаптация и модификация этого метода проводились многочисленными группами исследователей во всём мире (McCabe et al., 1988; Oard et al., 1990; Finer et al., 1992). Мишенями для бомбардировки ДНК были не только растения, но и водоросли, грибы, животные клетки (Sanford et al., 1993). 16 Ключевым преимуществом биолистического метода, или бомбардамента (переноса ДНК с помощью микрочастиц), является то, что ДНК может быть встроена практически в любую ткань независимо от генотипа. Для некоторых видов растений, в первую очередь однодольных и голосеменных, могут возникать трудности при трансформации агробактерией. В этих случаях можно использовать метод бомбардировки. Кроме того, для переноса бомбардаментом можно использовать более простые плазмидные конструкции, так как нет необходимости в сохранении последовательностей необходимых для репликации и переноса ТДНК. Также микрочастицами можно использовать для поранения тканей перед агробактериальным заражением (Bidney et al., 1992; Zuker et al., 1997). Более того, биолистическим методом можно трансформировать непосредственно меристемы растений. При этом стадия культуры ткани уменьшается до минимума и способ можно применять для видов, для которых еще не разработана методика регенерации. Однако с середины 90-х стала развиваться система трансформации таких культур посредством использования агробактерий (Hiei et al., 1994), что снизило темпы роста использования биолистичеких методов. Основные недостатки биолистического переноса генов — высокая стоимость необходимого оборудования, низкая частота интеграции ДНК, получение химерных растений (Sanford, 1993) и множественная вставка интродуцируемого гена, следствием которой является частая нестабильность экспрессии гетерологичных генов в геноме (Pawlowski и Somers, 1996). 2.2.3 Прямая доставка ДНК в протопласты Техника прямого переноса представляет собой инкубацию растительных протопластов с ДНК таким образом, что ДНК проникает в ядра клеток. Растительные клетки обрабатываются ферментами, разрушающими целлюлозную стенку клетки, в результате чего становится возможным перенос чужеродной ДНК. Доставка ДНК в протопласты не представляет особых сложностей, основная проблема – это регенерация из них растений. Часто требуется разработка 17 протокола регенерации даже для отдельных сортов, не говоря уже о видах, что ограничивает применение этого метода (Davey et al., 2005). Прямой перенос чужеродной ДНК в растительные протопласты может производиться при использовании так называемых агентов слияния, например липосом (положительно заряженных сфер липидов, которые обволакивают трансформирующую ДНК) (Zhang и др.,1988). Более распространенным методом прямого введения ДНК в протопласты как животных, так и растений является электропорация: кратковременные электрические разряды (1-100 мкс при напряженности поля 1000-10000в/см), которые увеличивают проницаемость мембран протопластов, куда и проникает находящаяся в растворе ДНК. Транзиентная экспрессия, полученная электропорацией растительных клеток, применяется в исследованиях различных направлений (Higo and Higo, 1996; Ecker and Davis, 1986; Fisk and Dandekar, 1998). Этот способ обладает преимуществом по сравнению с другими, так как не только способствует введению молекул ДНК, но и повышает у протопластов способность регенерировать растения, что, возможно, связано с поглощением регуляторов роста или необходимых питательных веществ через поры в плазмалемме, образующиеся при этой процедуре (Rech et al., 1987). Эффективность электропорации довольно высока: 6.25% для зародышей и 54.6% для каллусных структур, что вполне сравнимо с наилучшими результатами, полученными в экспериментах с бомбардировкой микрочастицами (Deshayes et al., 1985). Основной недостаток этого метода – трудоемкость получения и регенерации растений из протопластов коммерчески значимых сортов. Однако в 1995 году была показана возможность трансформации методом электропорации интактных меристем (Chowrira et al. 1995). Заслуживает внимания также и возможность избежать фазы регенерации использованием трансформации этим методом пыльцы (Saunders and Matthews, 1995). Прямой перенос ДНК в протопласты особенно интересен для культур, мало чуствительных к другим методам трансформации (Rakoczy-Trojanowska, 2002). 18 2.3 Репортерные гены и селективные маркеры Ни одна из методик трансформации растений не обеспечивает стопроцентного выхода трансформированных клеток, более того, этот процент обычно не велик. В связи с этим необходимым является отбор клеток со встроенной гетерологичной ДНК. Встраивание вместе с целевой конструкцией гена, обеспечивающего рост трансформированных клеток в гибельных для других условиях, позволяет проводить селективный отбор уже на первых этапах трансформации (негативная селекция). В качестве селективных маркерных генов чаще всего используются гены устойчивости к различным антибиотикам или гербицидам. Наиболее часто используется ген устойчивости к аминогликозидным антибиотикам – nptII – один из первых селективных маркерных генов для растений (Bevan et al., 1983). Этот ген придает устойчивость к таким антибиотикам, как канамицин, паромомицин, неомицин и G418 (генетицин). Другим широко используемым селективным маркером является гигромицин Б. Устойчивость к нему придает ген гигромицин фосфотрансферазы – hpt, выделенный из E.coli (Rao et al., 1983). Кроме резистентности к антибиотикам, селекцию трансформированных клеток проводят также с участием генов обеспечивающих устойчивость к гербицидам. Из этой группы наибольшее применение получили гены устойчивости к фосфинотрицину. Эти гены– bar (Thompson et al., 1987) и схожий ген pat (Strauch et al., 1988) были выделены из бактерий рода Streptomyces. Отработку систем трансформации, равно как и отслеживание наследования гетерологичных генов, удобно производить с помощью репортерных генов, чью экспрессию можно легко оценивать количественно. Наиболее распространенным репортерным геном на протяжении многих лет остается uidA (gus), клонированный из штамма E. coli К12, и кодирующий фермент -глюкуронидазу (GUS). Это гидролаза, катализирующая расщепление β-глюкуронидов, многие из которых являются коммерческими препаратами и используются в качестве субстратов для спектрофотометрического, 19 флюориметрического и гистохимического анализов (Jefferson и др., 1986). В настоящее время все чаще используется ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), клонированный из медузы (Aequora victoria). Экспрессия дикого типа gfp в растениях очень слаба (Niedz et al., 1995) и на данный момент используется модифицированная последовательность, в которой GFP накапливается в эндоплазматическом ретикулуме (Haseloff et al., 1997). Детекция GFP отличается высокой чувствительностью, несложной технологией применения, низкой стоимостью и уже разработанной системой применения для большинства видов растений и культур клеток. Более того, в отличии от GUS, GFP позволяет проводить детекцию в живых клетках. 2.4 Вариабельность трансгенной экспрессии Развитие методов генетической трансформации привело к использованию трансгенных растений в различных областях, таких как улучшение важных признаков ряда сельскохозяйтвенных культур (Lanfranco, 2003), выработка растениями ценных белков (биофарминг) (Twyman et al., 2003; Fischer et al., 2004) и использование трансгенных растений в качестве инструмента для изучения механизмов функционирования генов (обратная генетика) (Lloyd, 2003 и Kusaba, 2004). Однако существует значительная вариация уровня экспрессии гетерологичных генов, которая всегда наблюдается в пределах популяции растений, трансформированных одной и той же конструкцией, одним и тем же методом и при одинаковых условиях (Peach and Velten, 1991; Bennet, 1993; Birch, 1997; Bhat and Srinivasan, 2002; Butaye et al., 2004). Эта вариабельность трансгенной экспрессии сильно усложняет как анализ фенотипических признаков, так и создание коммерчески выгодных культур с предсказуемыми характеристиками. Для снижения затрат, уровня прилагаемых усилий и количества ошибок при интерпретации результатов исследований было предпринято множество попыток достижения стабильной трансгенной экспрессии и предсказуемости ее уровня. На вариабельность трансгенной экспрессии влияют 20 множество причин, это разное число встраиваемых в геном копий, сайты инсерции гетерологичного гена, РНК-сайленсинг в растении-хозяине и т.д. Как правило, результатом генетической трансформации растений является высокая частота образования трансгенных растений с непредсказуемым уровнем экспрессии гетерологичного гена. Например, это показано для такого стандартного репортерного гена как gus (Hobbs et al. 1993; Elmayan and Vaucheret 1996; Brouwer et al. 2002; De Bolle et al. 2003). Более того, даже те растения, которые демонстрируют желательные уровни экспрессии, могут утерять эти характеристики через ряд поколений (Scheid et al. 1991; Bhat and Srinivasan 2002; Vain et al. 2002; Butaye et al. 2004). Вариабельность трансгенной экспрессии неудобна еще и тем, что делает просто необходимым анализ большого числа трансформационных событий для нахождения индивидуальных трансформантов с приемлемыми уровнями экспрессии и желательным фенотипом, и усложняет интерпретацию результатов проводимых исследований (Birch 1997; Bhat and Srinivasan 2002; De Bolle et al. 2003). 2.4.1 Возможные причины вариабельности трансгенной экспрессии На данный момент известно несколько факторов вызывающих вариабельность уровня экспрессии гетерологичных генов в растениях. Одной из главных причин является непредсказуемое число интегрированных в геном копий. На самом деле многократные копии чужеродной ДНК имеют тенденцию образовывать один или несколько инсерционных сайтов, что возможно, является следствием связывания фрагментов гетерологичной ДНК перед интеграцией (Pawlowski and Somers, 1998; De Buck et al., 1999). Теоретически увеличение копийности должно приводить и к увеличению уровня экспрессии. Однако многокопийные кластеры часто бывают связаны с низким уровнем экспрессии, а особенно такие комплексы как тандемные повторы (TR) (Jorgensen et al., 1996; Sijen et al., 1996; Wang and Waterhouse, 2000) и инвертированные повторы (IR) (Hobbs et al., 1993; Depicker and VanMontagu, 1997; Stam et al., 1997; Muskens et al., 21 2000). По-видимому, причиной такого снижения экспрессии является взаимодействие между гомологичными последовательностями и, как следствие, гомолого-зависимое умолкание генов (homology-dependent genesilencing (HDGS)) (Meyer and Saedler 1996). Это явление обнаруживается не только в случаях многократной инсерции гена в один локус, но и при встраивании генов в разные участки ДНК. Этот феномен, поначалу приводивший ученых в замешательство, может действовать на двух уровнях: транскрипционном (transcriptional gene silencing; TGS) и пост-транскрипционном (post-transcriptional gene silencing; PTGS). На протяжении многих лет считалось, что именно эти два явления (PTGS и TGS) являются главными определяющими факторами, влияющими на трансгенную экспрессию в растениях. Предполагается, что явление PTGS, на данный момент более известное как РНК-сайлесинг или РНК-интерференция, это консервативный эукариотический механизм растительного мониторинга вирусных частиц, защищающий геном от транспозонов и участвующий в регуляции экспрессии генов (Baulcombe, 2004). Механизмы РНК-сайленсинга у грибов (quelling-подавление), животных (РНК-интерференция (RNAi)) и у растений (PTGS) обладают сходными необходимыми генетически опосредованными условиями и характерными биохимическими особенностями, но значительно разнятся в путях прохождения реакций, задействованных этими группами организмов, приводящих к умолканию генов. РНК сайленсинг был обнаружен почти во всех эукариотических организмах (за исключением почкующихся дрожжей S. cerevisea) (Denli and Hannon, 2003; Finnegan and Matzke, 2003; Matzke and Matzke, 2003; Pickford and Cogoni, 2003; Waterhouse and Helliwell, 2003; Baulcombe, 2004; Susi et al., 2004). Кроме совокупности кластеров мультикопийной ДНК, таких как IRs или другие спусковые механизмы PTGS, в растениях так же могут присутствовать: дцРНК, одновременная экспрессия смысловых и антисмысловых генов, гомология между гетерологичными и родными генами, продукция аберрантной РНК (незаконченные преждевременные транскрипты, продукты распада или антисмысловые РНК), высокие уровни трансгенной экспрессии, превышающие определенную присущую растениям 22 пороговую величину (Matzke et al., 2002). Как таковой, РНК-сайленсинг может играть ведущую роль в проявлении вариабильности трансгенной экспрессии. TGS, как и PTGS, основывается на узнавании нуклеиновыми кислотами гомологичных последовательностей. Однако, в этом случае, узнавание идет на транскрипционном уровне и, следовательно, транскриптов просто не образуется. Явление TGS часто связано с метилированием промоторных последовательностей гетерологичного гена и часто оказывается мейотически наследуемым (Park et al., 1996). На протяжении долгого времени предполагалось, что TGS и PTGS используют два различных механизма. Однако в настоящее время господствует гипотеза о том, что siРНК (siRNA-small interfering RNAs), которые являются ключевыми действующими единицами РНК-умолкания, так же участвуют и в регуляции экспрессии на транскрипционном уровне генов в ядре, через ремоделирование хроматина и РНК-направленного ДНК-метилирования (Aufsatz et al., 2002; Pickford and Cogoni, 2003; Matzke et al., 2004). Границы между TGS и PTGS размываются и TGS теперь воспринимается просто как РНК-сайленсинг внутри ядра. Другой источник вариации экспрессии между индивидуальными растениями относится к эпигенетическим позиционным эффектам, т.е. то место в пределах генома, куда произошла встройка гетерологичного гена, влияет на способность гетерологичных генов экспрессироваться (Matzke and Matzke, 1998). В отличие от прокариот и низших эукариот, таких как дрожжи, интеграция гетерологичной ДНК гомологичной рекомбинацией редка у высших эукариотических организмов, где ДНК встраивается в основном за счет соединения концов разорванных ДНК, обходящегося без гомологии, или незаконной рекомбинации (Gheysen et al., 1991; De Buck et al., 1999; Hohn and Puchta, 2003). Как следствие, встраивание чужеродной ДНК в геном растений может произойти фактически в любом участке. В результате, интеграция может происходить в регионах, как с низким, так и с высоким уровнем транскрипции. Предполагается, что интеграция гена в конденсированный хроматин, или в области прилегающие к нему, приводит к снижению экспрессии и/или к 23 увеличению её вариабельности. Окружение эндогенными регуляторными последовательностями, такими как энхансеры или ингибиторы транкрипции, будет так же оказывать влияние на уровень экспрессии (Matzke and Matzke, 1998, Meyer, 2000, Francis and Spiker, 2005). Естественно, трансгенная экспрессия будет подвержена влиянию и других факторов кроме копийности, РНК-сайленсинга и влияния сайта интеграции. Другой причиной может являться сомаклональная вариация, которая обычно определяется как генетическая и фенотипеческая изменчивость между клонально размноженными растениями одного донора. Это явление, скорее всего, связано с определенными физиологическими нарушениями, вызванными культивированием на искусственной питательной среде и в изоляции от целого организма. (Phillips et al., 1994; Duncan, 1997; Kaeppler et al., 2000). К тому же, влияние специфических регуляторных последовательностей, главным образом промоторов и терминаторов, прямо влияющих на экспрессию, к сожалению, изучено не так широко как хотелось бы (De Bolle et al., 2003). Подводя итог, можно сказать, что многие факторы, такие как копийность, РНКсайленсинг, позиционные эффекты, сомаклональная изменчивость и регуляторные последовательности, значительно усложняют получение подходящих стабильных уровней трансгенной экспрессии в растениях. Причем каждый отдельный фактор воздействует не независимо, а в тесной связи с остальными, и механизмы этой связи не всегда известны. Для преодоления этих проблем и достижения высоких и стабильных уровней экспрессии трансгена можно применять различные стратегии трансформации и вспомогательные регуляторные элементы. 2.4.2 Сайт специфическая трансформация и трансформация сдерживающая копийность С целью получения более предсказуемых результатов, для фенотипического анализа часто используют однокопийные трансформанты. Но даже этот метод не всегда дает гарантированный стабильный уровень экспрессии, и если в некоторых 24 работах искомый уровень легко достигается, другие предоставляют более спорные результаты (Elmayan and Vaucheret, 1996; De Wilde et al., 2001; Meza et al., 2002; De Buck et al., 2004; Shingo Nagaya et al., 2005). Широко известен тот факт, что получение трансгенных растений путем искусственного переноса генов (биолистический метод, электропорация) приводит к наличию в растении большого числа трансгенных копий (по некоторым сообщениям до 100), тогда как трансформация посредством Agrobacterium tumefaciens приводит к вставке значительно меньшего числа копий (до 10) и большого числа однокопийных трансгенных клонов (Hansen and Wright, 1999; Koprek et al., 2001; Gelvin, 2003; Reddy et al., 2003). Таким образом, предпочтительно использовать агробактериальную трансформацию, так как мультикопийность часто вызывает понижение уровня экспрессии (Muskens et al., 2000). Однако и при искусственном переносе генов иногда можно получить некоторый процент одно-трехкопийных клонов (например, Romano et al., 2003). Тем не менее, число копий гетерологичного гена может сильно варьировать независимо от используемого метода трансформации, что, вероятно, зависти от ряда факторов, которые еще не удалось установить. Некоторые исследования позволяют предположить, что структура и сложность трансгенного локуса может зависеть от используемого штамма агробактерии (De Block и Debrouwer, 1991), вида или даже экотипа растения (Nam et al., 1997) и типа используемого экспланта растения-хозяина (Grevelding et al., 1993). Те штаммы агробактерии, которые менее эффективно переносят Т-ДНК, могут оказаться полезными для получения однокопийных инсерций. Некоторые данные позволяют предположить, что менее благоприятные условия трансформации ведут к снижению числа копий гетерологичных генов, но нет пока причин считать такую корреляцию полностью обоснованной (Butaye et al., 2005). Следовательно, необходимо более детальное исследование систем интеграции, прежде чем можно будет сделать окончательные выводы о возможностях различных стратегий доставки с контролируемой частотой гетерологичных генов в растительный геном. Для молекулярной биологии растений большое значение имеет разработка методики трансформации для 25 получения однокопийных трансгенных растений. Однокопийные трансформанты получаются не всегда, и развитие технологий сфокусировано, в том числе, и на этой проблеме. В литературе описывается многообещающий метод создания растений с одной копией гетерологичного гена основанный на воздействии рекомбиназы на многократные инсерции (Srivastava et al., 1999). Котрансформация кукурузы двумя конструкциями одной с фланкирующими противоположно направленными lox-сайтами и другой, Cre-экспрессирующей (Cre-lox система состоит из Cre рекомбиназы размером 38кДа, которая узнает 34х нуклеотидные последовательности известные как lox), в результате привела к высокому процентному соотношению трансформантов содержащих лишь одну копию вводимого гена. Такая система способствует так же и сайт-специфическому встраиванию чужеродной ДНК в геном (Ow, 2002). Однако, работы на табаке показали, что в этом случае предсказуемую трансгенную экспрессию можно наблюдать лишь в 50% случаев, а в остальных 50% - радикально сниженный уровень экспрессии. (Day et al. 2000). То есть интеграция идентичных трансгенных вставок в одинаковые районы генома в растениях не обеспечивает абсолютной стабильности экспрессии. Авторы предполагают, что умолкание гетерологичного гена в этих случаях является результатом метилирования чужеродной ДНК благодаря интеграции в регионы растительного генома, восприимчивые к метилированию ДНК. Так же, наблюдается и низкая эффективность применяемого метода, только около половины клонов на самом деле точно содержат лишь одну копию, интегрированную в предопределенный локус. Стратегия обратной селекции может быть направлена на получение однокопийных, сайт-специфических трансгенных линий. Более того, система сайт-специфической рекомбинации, описанная выше, все еще основана на случайной интеграции целевого сайта, такого как lox, что является неблагоприятным событием, так как инсерция Т-ДНК может разрушить транскрипционные единицы и в результате привести к мутантному фенотипу (Errampalli et al., 1991; Lindsey et al., 1993; Svabados et al., 2002). 26 В идеале, одна копия гена должна быть интегрирована в регион генома, обладающий высоким уровнем транскрипционной активности, без нарушения уже присутствующих там генов растения-хозяина. В теории, встраивание гена в заранее предусмотренный хромосомный сайт может происходить за счет гомологичной рекомбинации. предусмотренный Теоретически хромосомный сайт доставки можно целевого добиться гена в гомологичной рекомбинацией. Тем не менее, на данный момент растение мха Physcomitrella patens, которое является гаметофитом, - единственное растение у которого показано наличие высокого уровня гомологичной рекомбинации. Поэтому он представляет особый интерес в развитии технологий точной доставки генов (Schaefer, 2002). Интеграция трансгенной ДНК через гомологичную рекомбинацию так редка у высших растений, что делает доставку гена в определенное местно генома этим методом чрезвычайно сложной задачей. Наблюдаемая частота гомологичной рекомбинации у высших растений не выше 10-3-10-5, независимо от вида растения или метода трансформации (Hohn and Puchta, 2003). Многие исследования посвящены преодолению проблемы низкой эффективности гомологичной рекомбинации в растениях, не столько для того, чтобы оптимизировать трансгенную экспрессию, а скорее для облегчения функционального эндогенного анализа инсерционным мутагенезом интересующего гена (Kumar and Fladung, 2001). Например, в одном из исследований (Terada et al., 2002, 2004, 2007) описывается процедура с сильной позитивно/негативной селекцией для модификации генов риса (WAXY и Adh2). И хотя наблюдаемая частота гомологичной рекомбинации все еще оставалась в тех же рамках (10-3-10-5), метод строгой селекции облегчил скрининг удачных трансформантов. Процент таковых в случае гена WAXY составил около 1%, а в 2007 году для гена алгокольдегидрогеназы частота искомых трансформантов достигла 2%. Другие попытки концентрировались на улучшении продуктивности вовлеченного ферментативного механизма гомологичной рекомбинации. Одним из путей её усиления является применение для трансформации растений гиперактивных участков ДНК с горячими точками рекомбинаци, выделенных из 27 других видов. В Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae такие сайты были найдены в непосредственной близости к регионам, связанным с блокированием вилок ДНК репликации или с интенсивной транскрипционной активностью. Было показано, что применение таких гиперактивных участков ДНК из дрожжей (нетранскрибируемые участки и последовательности между генами рибосомной РНК) для трансформации A. thaliana усиливают частоту гомологичной рекомбинации (Urawa et al., 2001). Другая попытка увеличить частоту гомологичной рекомбинации в растениях представляла собой индукцию двухцепочечных разрывов в ДНК. Индукция таких разрывов напрямую связана с частотой гомологичной рекомбинации (Puchta et al., 1993). Один из путей стимулирования таких разрывов лежит через использование редко встречающихся ферментов рестрикции, таких как I-SceI (Puchta et al., 1993), ICeuI (Chilton and Que, 2003) или нуклеазы домена цинковых пальцев (Lloyd et al., 2005). На табаке было показано, что когда геномные двухцепочечные разрывы индуцируются в непосредственной близости к гомологичным повторам, они в одной трети случаев могут быть восстановлены за счет гомологичной рекомбинации (Siebert and Puchta, 2002). Разработка высоко специфичных эндонуклеаз специального назначения является одним из ключевых этапов в распостранении этой технологии (Epinat et al., 2003). Таким образом, до сих пор применение технологий использующих гомологичную рекомбинацию для снижения уровня вариабельности трансгенной экспрессии не является установившейся практикой. Низкая частота является главным препятствием, но современный прогресс в адресном влиянии на гены, так же, как и накапливание знаний о регуляции уровней будущего рекомбинации, развития являются подходов гомологичной рекомбинации. обнадеживающими трансформации предзнаменованиями растений, основанных на 28 2.4.3 Дизайн конструкций Кроме разработки методов трансформации растений, управляемая трансгенная экспрессия в растительных клетках требует создания экспрессионных кассет содержащих в себе сам ген (или гены) и подходящие регуляторные последовательности для достижения целевой экспрессии вводимого гена. 2.4.3.1 Промоторы Применение соответствующих промоторов и терминаторов сильно влияет на экспрессию генов. На заре исследований трансформации растений для управления трансгенной экспрессией главным образом использовались промоторы и терминаторы из опухолеиндуцирующих (Ti) плазмид A. tumefaciens (например, pNOS и tNOS; Depicker et al., 1982). С тех пор было проведено много исследований для выделения и описания характеристик более сильных конститутивных промоторов, так как многие области биотехнологии растений нуждаются в стабильной трансгенной экспрессии на высоких уровнях. В целом сильными конститутивными промоторами для растений считаются широко используемый промотор вируса мозаики цветной капусты CaMV p35S (Cauliflower mosaic virus promoter, Odell et al., 1985), промотор вируса мозаики маниоки pCAS (Cassava Vein Mosaic Virus promoter; Verdaguer et al., 1996) и растительные промоторы, которые отвечают за ситнез генов домашнего хозяйства, такие как, например, убиквитиновые (pUBI; e.g. Binet et al., 1991). Последние исследования показали, что сравнимыми по эффективности с CaMV p35S могут быть промоторы фактора трансляции SUI1 и рибосомального белка L36, полученные из такого растения как ананас (Koia et al., 2013). В настоящее время для повышения эффективности экспрессии встраиваемых генов в экспериментах стали использовать и тканеспецифичные промоторы, которые позволяют белку накапливаться в определенных органах и тканях (Hiwasa-Tanase et al. 2012). 29 2.4.3.2. 5'-UTR последовательности Работы ряда исследовательских групп говорят об увеличении трансгенной экспрессии при использовании экспрессионных кассет содержащих оптимизированные 5' и 3' регуляторные последовательности, представляющие собой участки ДНК, соответствующие 5'- и 3'- нетранслируемым областям транскрипта иРНК (5'-и 3'-UTR). Еще в 1987 году (Gallie et al., 1987) было показано, что 5'-UTR последовательность из штамма U1 вируса табачной мозаики TMV (tobacco mosaic virus), сейчас известная как Ω-последовательность, сильно увеличивает уровень экспрессии репортерного гена. Последующие исследования показали, что Ω-последовательность является энхансером как при стабильной, так и при транзиентной трансгенной экспрессии в табаке и рисе (Mitsura et al., 1996). Дальнейшие работы показали, что и 5'-UTR последовательности высших растений также обладают энхансерным воздействием. Например, регуляторные последовательности запасных белков из семян фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris), β-фазеолиновый промотор в комбинации с терминатором гена arcelin 5-I, повышают экспрессию гетерологичного белка в семенах двудольных до 36% от общего растворимого белка семян гомозиготных растений, вместо 1% при использовании 35S промотора (De Jaeger et al., 2002). Другая работа описывает создание экспрессионной кассеты с нетранслируемыми 5' и 3' регионами гена хризантем, кодирующего малую субъединицу рибулозо-1,5- бифосфаткарбоксилазы (rbcS1). При использовании rbcS1-кассеты, уровень трансгенной экспрессии достиг в листьях табака 10% от общего растворимого белка (Outchkourov et al., 2003). В 2004 году на предмет влияния на уровень экспрессии была проверена 5'-UTR последовательность гена алкогольдегидрогеназы (NtADH), выделенного из суспензионной культуры клеток табака BY-2. При использовании репортерного гена GUS, было показано, что применение этой последовательности увеличивает уровень трансгенной экспрессии в 30-100 раз в случае культуры клеток BY-2 и в 30-60 раз для культуры клеток арабидопсиса Т87. Таким образом, по эффективности своего воздействия эта последовательность сравнима с признанным трансляционным энхансером Ω. 30 Правда уровень экспрессии в культуре клеток риса Oruza sativa, также протрансформированной конструкцией содержащей 5'-UTR последовательность NtADH, изменился лишь незначительно (Saton et al. 2004). Однако, использование интрона из 5'-UTR последовательности гена rubi3 самого риса, эффективно усиливающей трансгенную экпрессию (Lu et al., 2003, 2008), обеспечило 26кратное увеличение уровня экспрессии репортерного гена GUS (Sammader et al. 2008). 5'UTR цитозольной формы глютамин синтетазы так же ведет себя как энхансер в растительных клетках, увеличивая уровень экспрессии репортерного гена примерно в 20 раз (Ortega et al., 2012). SynJ, синтетическая 5'UTR последовательность может усиливать трансгенную экспрессию белка, даже находящегося под таким сильным промотором как CaMV 35S (Kanoria and Burma, 2012). 2.4.3.3 Интроны Кроме промоторов и терминаторов на уровень трансгенной экспрессии в растениях влияют присутствие в гене последовательностей интронов и их положение (Rethmeier et al. 1997; Bourdon et al. 2001; Rose 2004, Emami et al. 2013). Опосредованное интроном усиление экспрессии генов IME (Intron-Mediated Enhancement) как правило вызывает увеличение уровня экспрессии гетерологичного гена в 2-10 раз, по сравнению с идентичной конструкцией без интрона. Причем в однодольных разница может быть значительно больше (Maas et al., 1991; Zhang et al., 1994). Сила IME зависит от используемых промоторрепортерных систем (Callis et al., 1987; Luehrsen & Walbot,1991; Rethmeier et al., 1998), последовательностей фланкирующих интрон (Maas et al, 1991; Clancy et al., 1994) и типа ткани в которой проходит экспрессия (Gallie & Young, 1994). Несмотря на то, что высокая степень изменчивости экспрессии в растениях делает сравнение между исследования достаточно трудным, увеличение экспрессии, опосредованной интронами, можно заметить на уровне мРНК (Callis et al 1987; Dean et al 1989; Rethmeier et al, 1997; Rose & Last, 1997; Wang et al, 2002). 31 Все эти примеры говорят о том, что надо внимательно и осторожно выбирать регуляторные элементы для их использования в определенных конструкциях. Оптимизация последовательностей могут и внедрение значительно специфических увеличить уровень регуляторных трансгенной экспрессии и снизить её вариабельность. 2.4.4 MAR-элементы Последовательности ДНК, обладающие способностью связывания с ядерным матриксом, получили название MARs (matrix attachment regions). Влияние MAR на экспрессию в растениях изучено гораздо меньше, чем в животных организмах и первые исследования в этой области проводились с использованием гетерологичных MAR. Куриная матрикс связывающая последовательность лизоцима курицы (А-элемент) – один из наиболее изученных MAR позвоночных, он был использован и для воздействия на экспрессию в растениях. При биолистической доставке ДНК этот элемент усиливал уровень экспрессии в 36 раз (Odell and Krebbers, 1998). Однако такой значимый эффект был замечен только в культуре клеток кукурузы. Тем не менее его влияние в растениях табака при использовании в качестве переносчика ДНК бактерий A.tumefaciens тоже является достаточно значимыми, более того, элемент А, в некоторых случаях, приводил так же и к довольно заметному снижению вариабельности экспрессии. Можно сказать, что это единственный из матрикссвязывающих элементов, который так значительно влияет на вариабельность экспрессии в растениях, снижая её в семь-восемь раз (Mlynarova et al., 1994,1995). Вместе с тем, в 2003 году для этой последовательности, были однозначно доказаны ее протекторные свойства, ограждающие экспрессию репортерного гена от РНК-сайленсинга (Mlynarova et al., 2003). Были исследованы и другие матрикс связывающие элементы курицы (Butaye et al., 2004; Oh et al., 2005; De Bolle et al., 2007), однако такого заметного влияния на экспрессию у полноценных растений ни один из них не оказал. Кроме регуляторных элементов курицы, в растениях 32 также исследовалось влияние и других чужеродных MAR – человеческого βglobin-SAR (Breyne et al., 1992) и ARS-1 из дрожжей (Allen et al., 1993; Vain et al., 1999; Holmes-Davis and Comai, 2002). И если человеческий элемент не оказал никакого воздействия использование находящуюся кроме незначительного последовательностей под 35S промотором, снижения дрожжей в 3-12 вариабельности, усиливало раз при экспрессию, биолистической трансформации, в клетках табака и в растениях риса (Allen et al., 1993; Vain et al., 1999). В последствии, однако, стали использоваться MAR идентифицированные в самих растениях. Около трети подобных исследований, начиная с 1996 года (Allen et al., 1996), включали в себя изучение MAR-последовательности табака RB7. Эта последовательность длиной 1166 нп, эффективно связывающаяся с ядерным матриксом, содержит весь набор последовательностей характерных для MARэлементов: А-бокс, Т-бокс, сайты связывания топоизомеразы, ARS- последовательности и G-содержащие регионы. Несмотря на то, что использование RB7 MAR не приводило к снижению вариабельности, практически во всех экспериментах этот элемент на порядок увеличивал уровень экспрессии репортерного гена, в некоторых случаях до 650 раз (Cheng et al., 2001). Только в растениях тополя при полевых условиях его использование не вызвало положительных изменений в уровне экспрессии, хотя в эксплантах приводило к семи-девяти кратному увеличению (Han et al., 1997; Li et al., 2008). Однако и в этом случае было отмечено положительное влияние, выражавшееся в снижении числа слабо экспрессирующих линий. На самом деле такое поведение довольно характерно для MAR элементов. Многие из них, вне зависимости от влияния на уровень экспрессии, снижают количество молчащих и слабоэкспрессирующих линий и клеток (Han et al., 1997; Mankin et al., 2003; Maximova et al., 2003; Xue et al., 2005; Abranches et al., 2005; Li et al., 2008). Для RB7 MAR было показано и другое его свойство. Наряду с усилением трансгенной экспрессии и увеличением процентного соотношения экспрессирующих линий RB7, помимо этого, стабилизирет экспрессию в растениях во время их развития, предотвращая сайленсинг и замолкание генов (Abranches et al., 2005). Так же для RB7 отчетливо 33 видно, что лучшие результаты он показывает при билистической доставке экспрессионной кассеты, тогда как при использовании Т-ДНК, экспрессия возрастает не более чем в девять раз. Хотя, скорее всего, завышенные уровни экспрессии при использовании MAR в культуре клеток при баллистической трансформации вызваны быстроделящимися, недиффиринцированными клетками, нежели какими-то уникальными способностями RB7 MAR или преимуществами прямой доставки ДНК. Всего двумя работами ограничилось и исследование влияния MAR-последовательностей арабидопсиса (обе проводились на растениях табака). Ни один из использованных элементов не оказал влияния на вариабельность, но, все же, At MAR проявил себя как эффективный регуляторный элемент, увеличивая экспрессию репортерного белка в пять-десять раз (Liu and Tabe, 1998). Два других элемента арабидопсиса, исследованных позднее, не оказали такого сильного воздействия (Zhang et al., 2002). MAR- последовательности самого табака, даже не беря в расчет RB7, использовались в работах так же довольно часто. Некоторые из них достаточно эффективны и усиливают экспрессию в пять - десять раз: TM2 (Zhang et al., 2002, 2009; Xue et al., 2005), TM6 (Ji et al., 2013) и CHN50 MAR (Fukuda and Nishikawa, 2003). Кроме уже перечисленных растительных матрикс-связывающих элементов неплохой эффект можно отметить и у некоторых MAR бобовых. Например, SARL сои увеличивает концентрацию белка примерно так же, как и TM2 (Schöffl et al., 1993), а phas MAR фасоли (van der Geest et al., 1994) и pea MAR гороха (Li et al., 2001) примерно в два-три раза. Более того, для некоторых MAR было обнаружено их влияние не только на уровень экспрессии гена, но также и на частоту трансформации, благодаря усилению экспрессии nptII гена (Zhang et al. 2007; Ji et al., 2013). И хотя в основном MAR элементы используются только для улучшения трансгенной экспрессии и предотвращения сайленсинга генов, эта способность позволяет применять MAR элементы и для достижения более высокой эффективности трансформации как в однодольных, так и в двудольных растениях. 34 В целом результаты исследований влияния MAR на трансгенную экспрессию в растениях до сих пор остаются весьма неоднозначными. Причиной этого является, вероятно, как наше ограниченное представление о ядерной организации и ядерном матриксе в целом, так и недостаточное количество исследований о связывании MAR с хроматином в растительных системах и механизмов их влияния. Например, некоторые MAR показывают себя как полноценные инсуляторные последовательности (TBS MAR, phas 3' MAR), некоторые нет (ADH1 и RB7 MAR), а для большинства, таких данных опять же просто нет (Hily et al., 2009). С другой стороны, однозначно показано, что анализ связывания с ядерным матриксом коррелирует с силой воздействия элемента и, соответственно, может предшествовать выбору MAR, для создания конструкций (Zhang et al. 2002). Тем более, даже сейчас видно, что некоторые MAR, например RB7, уже могут применяться на практике для усиления трансгенной эксперессии коммерчески важных белков в сельскохозяественных культурах, моделируя их свойства и увеличивая устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам, что является одной из главных задач в этой области. 2.4.5 Вирусная супрессия сайленсинга генов Для широкомасштабных исследований функций растительных генов для больших объемов генома доказана эффективность применения метода замолкания РНК (Wang and Waterhouse, 2002, Waterhouse and Helliwell, 2003). По большей части, разработка шпилечных конструкций (Helliwell and Waterhouse, 2003) и конструкций для вирус-индуцируемого подавления генов растений (VIGS, virus induced gene silencing) (Johansen and Carrington, 2001; Lu et al., 2003; Burch-Smith et al., 2004), снижающих уровень генной экспрессии, значительно усовершенствовала возможности функциональных геномных исследований. С другой стороны, РНК сайленсинг сильно усложняет фенотипические анализы и создание коммерчески выгодных культур, с предсказуемым и стабильным проявлением генов. Другим способом борьбы с нежелательно низким уровнем 35 экспрессии является применение известных на данный момент знаний о механизмах умолкания РНК в технологиях трансформации. По-видимому, некоторые вирусные гены кодируют белки, которые подавляют РНК умолкание. Скорее всего, они возникли эволюционным путем в противовес упомянутому выше антивирусному механизму (Roth et al., 2004). Высокий уровень экспрессии был достигнут комбинированием такого подхода с использованием более специфического вирусного супрессора PTGS, вспомогательного компонента протеиназы (HC-Pro helper component-proteinase) вируса гравировки табака (TEV Tobacco Etch Virus). В листьях взрослых растений табака уровень экспрессии белков увеличился до 3% от общего растворимого белка, благодаря коэкспрессии HC-Pro и PVX-ампликона (Mallory et al. 2002). Однако следует отметить, что трансгенные растения с HC-Pro часто страдают от заметных фенотипических аномалий, задержки в росте и обладают изменённой формой листьев (Pruss et al. 2004). Следовательно, такая методика скорее подходит для получения растений с высоким уровнем экспрессии гетерологичных генов, чем для фенотипических исследований. Еще в одной подобной стратегии используется система транзиентной экспрессии основанная на коэкспрессии гетерологичного гена и супрессора сайленсинга генов р19 вируса кустистой карликовости томатов (TBSV tomato bushy stunt virus). Опыт проводился на репортерном гене GFP, и его продукция в присутствии р19 увеличилась более чем в 50 раз за счет предотвращения PTGS в протрансформированных тканях (Voinnet et al. 2003). Коэкспрессия гетерологичного гена и гена вирусного супрессора как таковая, может оказаться привлекательным методом для снижения вариабельности трансгенной экспрессии вызванной РНК умолканием. 2.4.6 Растения мутантные по одной или нескольким составляющим механизма РНК-сайленсинга Другим подходом преодоления негативного влияния замолкания РНК при трансгенной экспрессии оказалось использование PTGS мутантов, как мишеней 36 для трансформации. Исследования мутантов A. thaliana ослабленных по PTGS привели к идентификации некоторых генов, которые предположительно играют роль в механизме PTGS, включая гены кодирующие предполагаемую РНК зависимую РНК полимеразу (RdRp) (SGS2/SDE1/RDR6; Dalmay et al. 2000; Mourrain et al. 2000; Xie et al. 2004), биспиральный белок неизвестной функции (SGS3; Mourrain et al. 2000), РНК-хеликазу (SDE3; Dalmay et al. 2001) и белок содержащий PAZ и Piwi домены (AGO1; Fagard et al. 2000). В работе 2004 года (Butaye et al. 2004) было показано, что стабильная экспрессия высокого уровня может быть получена применением мутантов A. thaliana по PTGS sgs2 and sgs3, при этом нарушая типичную бимодальную систему экспрессии для генов под 35Sпромотором в растениях дикого типа. В популяции первого поколения растений арабидопсиса протрансформированных репортерным геном gusA под 35Sпромотором распространение растений с высоким уровнем экспрессии изменилось от 20% у дикого типа до 100% у линий sgs2 и sgs3. В соответствии с результатами полученнными для GUS, экспрессия GFP в растениях дикого типа была гораздо ниже и более нестабильной, по сравнению с sgs2, где все индивидуумы обладали чистым фенотипом. Так же, когда sgs2 мутанты были протрансформированы геном ингибитора 6-циклин зависимой киназы под контролем 35S-промотора, все трансформанты показали чистый фенотип, характеризуемый зубчатыми листьями, тогда как такой фенотип был зарегистрирован лишь у одного из пяти протрансформированных растений дикого типа. Экспрессия GUS, управляемая промотором 35S, оставалась высокой и стабильной и у следующего поколения линий sgs2 и sgs3, в противоположность вариабильной экспрессии в Т2 популяциях дикого типа. В дальнейшем было показано, что конструкции Т-ДНК фланкированные последовательностями chiMAR вызывают повышение активности β-глюкуронидазы в пять раз в случае sgs2 и в 12 для растений sgs3, достигая при этом до 10% от общего растворимого белка, в то время как для дикого типа таких изменений не наблюдалось. Векторы для растительной трансформации содержащие связывающиеся с матриксом элементы применяемые к PTGS-мутантам могут быть ценными, как для высоко 37 производительного исследования фенотипов растений основанных на чужеродных генах, так и для получения чрезвычайно высоких уровней экспрессии. По существу поведение мутантов sgs2 и sgs3, по отношению к проявлению фенотипа и эффективности трансформации, не отличалось от растений дикого вида. Несмотря на то, что подход «MAR-PTGS» был применен к восьми различным трансгенам, используя MAR-элементы из различных источников и PTGS мутации, влияющих на разные гены, для экстраполяции этих результатов на другие виды растений необходимо провести еще много дополнительных экспериментов. PTGSослабленные индивиды в этих видах могут быть найдены посредством мутационного скрининга или создания с использованием технологий шпилек регулируемых генов, играющих роль в механизме PTGS. 2.4.7 Альтернативные способы снижения вариабельности трансгенной экспрессии Окончательной альтернативой в борьбе с преодолением межиндивидуальной вариабельности экспрессии могло бы стать создание искусственных растительных хромосом (PLACs plant artificial chromosomes) на подобие искусственных хромосом дрожжей (YACs yeast artificial chromosomes). Обеспечивая определенное хромосомное окружение для гена, клонированного в PLAC, можно увеличить шансы на создание растений с воспроизводимыми уровнями экспрессии гена (Somerville and Somerville 1999). Разъяснение функций растительных центромер это первый шаг к разработке PLACs. В случае модельного растения A. thaliana центромеры уже были картированы (Copenhaver et al. 1998). Однако не надо забывать и о других необходимых для создания функционирующей растительной центромеры факторах, существующих помимо ДНК последовательности. Анализы, основывающиеся на трансмиссии искусственных хромосом, значительно облегчат характеризацию индивидуальных особенностей функциональных составляющих растительных центромер. Такие эксперименты уже были произведены на искусственных хромосомах человека 38 (HACs human artificial chromosomes Grimes et al. 2002). Последующие исследования на PLACs дадут возможность проведения анализов, объясняющих роль длины центромеры, искусственных составляющих и белков, связывающихся с центромерой во время мейоза и митоза (Hall et al. 2004). Выше был представлен обзор различных стратегий и технологий, применяемых для получения предсказуемых уровней трансгенной экспрессии в растениях, которые или уже используются, или еще только разрабатываются. Не смотря на широкий спектр возможных вариантов, финальная цель, однако, пока все еще не достигнута. Методика получения прогнозируемых уровней экспрессии без сомнения нуждается в усовершенствовании уже используемых технологий, их комбинации или в разработке новых, еще более современных методов. Необходимо внимательно наблюдать за прогрессом в развитии этого направления для применения полученных результатов в создании векторов и стратегий трансформации. При последующих исследованиях одни технологии могут оказаться привлекательнее других в зависимости от конкретной поставленной цели и задач эксперимента или специфики применения в определенном технологическом производстве. Например, транзиентные экспрессионные системы могут быть улучшены применением вирусных векторов или с помощью вирусных супрессоров сайленсинга генов. Если требуются только несколько трансгенных растений с высоким уровнем экспрессии, может быть рассмотрена трансформация пластид или использование высокопродуктивных кассет для ядерной трансформации. С другой стороны, применение трансформации векторами содержащими MAR-элементы при использовании PTGS мутантов или системы «ампликон плюс» скорее всего окажутся предпочтительнее для высокопроизводительного скрининга фенотипов. Анализируя весь объем представленной информации можно сказать, что на сегодняшний день разработка таких методик идет в одном направлении с самыми актуальными течениями современной науки. Многое в достижении стабильной и предсказуемой экспрессии в растениях уже достигнуто и будущее без сомнения принесет много 39 новых методов дальнейшей оптимизации трансгенной экспрессии для различных областей применения, т.к. на данный момент такая работа идет достаточно активно. Таким образом, разработка и создание новых методов, позволяющих добиться высокого и стабильного уровня экспрессии у трансгенных растений, сегодня без сомнения является весьма актуальной задачей. 40 3. Методы 3.1 Молекулярные методы 3.1.1 Электрофорез в агарозном геле Буфер 50X TAE (на литр): 242 г Tris, 100 мл 0.5M EDTA (pH 8.0), 57.1 мл ледяной уксусной кислоты. Электрофорез проводили в 1 – 2 %-ном агарозном геле с использованием буфера 1х TAE с добавлением бромистого этидия в течение 40 - 60 мин при напряжённости электрического поля 10-20 В/см. Концентрацию агарозного геля подбирали ориентируясь на необходимость оптимального разделения фрагментов ДНК. В лунки вносили 3 мкл пробы, предварительно смешивая их с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 0,25% ксилолцианола, 30% глицерина) в отношении 5:1. В качестве маркера длин фрагментов ДНК на агарозный гель дополнительно наносили 1kb DNA Ladder Mix (Fermentas) или ДНК бактериофага , порезанную PstI. Визуализацию ДНК проводили с помощью трансиллюминатора и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. 3.1.2 Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей Продукты рестрикции ДНК разделяли методом горизонтального гельэлектрофореза, вырезали из агарозного геля с помощью ультрафиолетовой лампы (λ=360нм) участок, содержащий интересующий нас фрагмент ДНК, и переносили в эппендорфы. Далее использовался набор для очистки плазмидной ДНК Zymoclean Gel DNA Recovery Kit. Следуя инструкции производителя к агарозному гелю добавляли необходимое количество соответствующего буфера и 41 инкубировали на 55°С до полного растворения агарозы (~15`). Затем раствор переносили на колонку, центрифугировали 30 сек при 12000 об/мин и промывали спиртом. Фрагменты ДНК смывали 50 мкл H2O (3 мин при 12000 об/мин). 3.1.3 Определение концентрации нуклеиновых кислот Концентрацию определяли либо спектрофотометрическим методом при λ=260 нм на спектрофотометре, либо по силе флуоресценции бромистого этидия в ультрафиолете с использованием метода гель электрофореза при сравнивании с образцами с известной концентрацией 3.1.4 Рестрикция Реакцию рестрикции проводили в соответствующем буферном растворе в 20 мкл, в случае аналитического расщепления, или в 30-50 мкл, для препаративного расщепления. Реакционная смесь для рестрикции содержала: -1х буфер, соответствующий выбранным рестриктазам; -плазмидная ДНК (конечная концентрация 0.02-0.2 мкг/мл); -1-10 ед. эндонуклеазы рестрикции; Инкубация проводилась при 37°С в течение 2ч. 3.1.5 Фосфорилирование олигонуклеотидов Смешивались олигонуклеотиды, примерно по 30пМ, 1/10 объема PNKбуфера (буфер для полинуклеотидкиназы, прямая реакция), 1/10 объема 10 мМ раствора рибоАТФ , 1/10 объема PNK, стерильной водой MilliQ объем доводился до 10-20 мкл. Инкубация проходила при 37°С 1 час и при 70°С 30 мин. 42 3.1.6 Лигирование Реакционная смесь для лигирования содержала: 10-50 нг фрагмента ДНК вектора; 50-400 нг фрагмента ДНК вставки; 1х буфер; 2-5 ед ДНК-лигазы бактериофага T4; 1/10 объема 50% ПЭГ – при лигировании «тупых» концов. Инкубация проходила при комнатной температуре в течение ночи. 3.1.7 Тупление "липких" концов фрагментов плазмидной ДНК 3.1.7.а) с использованием фрагмента Кленова Реакцию проводили в объеме 15 мкл. Реакционная смесь содержала: 0,5-1 μг плазмидной ДНК; 1х буфер; 0,05mM 4 dNTP смеси; 2 ед фрагмента Кленова. Смесь инкубировали в термостате в течение 20 минут при 37oC. По истечении времени реакции фермент инактивировали нагреванием: смесь выдерживали в течение 15 минут при 75 oC. 3.1.7.б) с использованием T4-ДНК полимеразы Реакцию проводили в объеме 15 мкл. Реакционная смесь содержала: 0,5-1 мкг плазмидной ДНК; 1х буфер; 0,05mM 4dNTP смеси; 10 ед. T4 ДНК – полимеразы. Смесь инкубировали в термостате в течении 15 минут при 11 oC. По истечении времени реакции фермент инактивировали нагреванием: смесь выдерживали в течение 15 минут при 75 oC. 43 3.1.8 Приготовление компетентных клеток Растворы и питательные среды, применявшиеся для культивирования E.coli и приготовления компетентных клеток: 1. SOB: 2% бакто-триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4. Для агаразированной среды добавляем еще агар 15г/л 2. TB: 250 мМ KCl, 10 мМ MOPS, 15 мМ CaCl2, 55 мМ MnCl2. Работа с бактериальными клетками проводилась в стерильных условиях. Со стока на чашку с агаризированной средой SOB высевались клетки штамма DII5α. Инкубация проводилась при 37 0С до появления крупных колоний (2-3 мм). На ночь петлей с краев десяти колоний собирались клетки и высевались в 5 мл среды SOB в 50 мл пробирку. Инкубация проводилась при 18 0С на качалке, при 180 об/мин около суток. В ночь рассевались 200 мкл этой суспензии в 250 мл среды SOB, в двухлитровой колбе. Инкубировали при 18 0С на качалке до оптической плотности 0,6-1,0 единиц, при λ=600нм. После помещали клетки на 10 минут в лед, далее в охлажденный цетрифужный стан и откручивали 10 мин при 2500 об/мин в центрифуге, предварительно охлажденной до 4 0С. Клетки ресуспендировали в 80 мл охлажденного во льду буфера TB и переносили их в две 50ти мл пробирки. Инкубировали 10 мин во льду и откручивали при 2000 об/мин 10 мин. Клетки ресуспендировали в 20 мл буфера TB и, медленно помешивая, добавляли в суспензию ДМСО до 7%. Инкубировали клетки 10 мин, разливали в охлажденные эппендорфы и замораживали в жидком азоте. Хранили готовые компетентные клетки при -700С. Компетентность клеток оценивали трансформацией плазмидой pBluescript SK с известной концентрации (0,5 нг/мкл). В качестве отрицательного контроля на загрязнение компетентных клеток чужеродной плазмидной ДНК, проводили 44 трансформацию клеток без добавления плазмиды. Компетентность клеток обычно составляла около 1*106 кл/мкг ДНК. 3.1.9 Трансформация клеток E. сoli 1. LB на 1 л: NaCl – 10 г; дрожжевой экстракт – 5 г; бакто-триптон – 10г. Для агаразированной среды добавляем еще агар 15г/л 2. YT (на 1 л): 8 г бакто-триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl. Использовали компетентные клетоки. Клетки размораживали в ледяной бане. Охлажденную до +4°С ДНК (200 пг-10 нг в объеме 1-20 мкл) добавляли в размороженные клетки и смесь инкубировали во льду в течение 30 мин. Затем пробирки помещали на 30 сек в водяную баню с температурой 42°C или в термостат. После теплового шока клетки быстро переносили в лед, и инкубировали еще в течение 5 мин. После охлаждения аликвоту высевали на чашки с LB-агаром с ампициллином и/или канамицином и/или хлорамфениколом. Клетки инкубировали в течение 16-18 часов при 370 С. Перед последним этапом в некоторых случаях к клеткам добавляли 900 мкл среды YT, инкубировали 60 мин при 37°C и только потом высевали на чашки Петри с соответствующим антибиотиком. При клонировании использовался штамм E.coli DH5альфа. 3.1.10 Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса Растворы: Раствор 1 (лизирующий): 50 мМ трис рН8; 10 мМ ЭДТА. Раствор 2 (денатурирующий): 45 0,2 М гидроксид натрия; 1% додецилсульфат натрия (SDS). Раствор 3 (солевой): 7,5 М ацетат аммония. 3.1.10.а) Минипрепаративное выделение плазмидной ДНК Выросшую на чашке с ампициллином колонию переносили в 15 мл пробирку с 3 мл среды LB с ампициллином и наращивали в течение 16-18 часов на термостатированной качалке при 370С, 220 об/мин. 2мл среды с клетками центрифугировали 1 мин при 12000 об/мин. Супернатант отбирали водоструйным насосом. Осадок ресуспендировали в 200 мкл раствора 1 и инкубировали при комнатной температуре. Затем добавляли 400 мкл раствора 2 и инкубировали 5мин. при 00С. Далее добавляли предварительно охлажденный 400 мкл 2,8М раствор NH4Ас и инкубировали 5 мин. при 00С. Центрифугировали 10 мин при 12000 об/мин. Супернатант переносили в новую пробирку, добавляли 0,6V изопропанола, перемешивали и оставляли в течение 10 мин. при +4 0С. Центрифугировали в течение 10 мин при 12000 об/мин, тщательно удаляли изопропанол при помощи водоструйного насоса. Осадок промывали 70% этанолом, центрифугировали в течение 5 минут. Полученный осадок высушивали и растворяли в 20-30 мкл деионизированной воды. 3.1.10.б) Максипрепаративное выделение плазмидной ДНК Культуру клеток наращивали в среде LB с ампицилином объемом 50 мл в 250 мл колбах 16-18 часов при 37 oC при скорости помешивания 220 об/мин. После наращивания клетки осаждали в 50 мл пробирках для центрифугирования 5 минут (6000 об/мин). Супернатант отбирали водоструйным насосом. К полученному осадку клеток последовательно добавляли растворы 1, 2, 3 в пропорции 1:1:1. 1-ый раствор добавляли охлажденным (4 мл), смесь ресуспендировали. После добавления 2-го раствора (4 мл), содержимое пробирок мешали легким переворачиванием и держали во льду не более 5 минут. 3-ий раствор (4мл) добавляли охлажденным, мешали переворачиванием. После 46 добавления 3-го раствора пробирки для центрифугирования ставили в ледяную баню, держали 5 минут, центрифугировали 20 минут (6000 об/мин) при 4 oC. После центрифугирования супернатант отбирали в новые пробирки для центрифугирования объемом 50 мл. К отобранному супернатанту добавляли 0,6 объема изопропанола, перемешивали переворачиванием, выдерживали 10-15 минут при 4 oC и центрифугировали 15-20 минут (6000 об/мин) при 4 oC. После центрифугирования тщательно удаляли изопропанол, осадок высушивали. К высушенному осадку добавляли 1 мл охлажденного 2M NH4Ас, держали в ледяной бане 5 минут и тщательно ресуспендировали. Полученную суспензию переносили в чистые пробирки объемом 1,5 мл и центрифугировали 5-7 минут (12000 об/мин). Супернатант переносили в новые чистые объемом 2 мл, добавляли 0,6 объема изопропанола, выдерживали 10 минут при 4 центрифугировали 10 минут (12000 об/мин). После o C и центрифугирования изопропанол тщательно отбирали. Осадок ДНК промывали 200 мкл 70% этанола, центрифугировали 5 минут. Полученный осадок высушивали и растворяли в 100 мкл деионизованной воды. 3.1.11 Переосаждение ДНК К раствору, содержащему ДНК, добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия, перемешивали, добавляли 3 объема 96% этанола (или 1 объем изопропанола), перемешивали еще раз и выдерживали при -70 oC в течение 20 минут. По истечении нужного времени раствор центрифугировали 20 минут (12000 об/мин). Супернатант удаляли. Осадок промывали 70% этанолом, центрифугировали 5 минут. Полученный осадок высушивали и растворяли в необходимом количестве деионизованной воды. 47 3.1.12 Культивирование бактерий для выделения плазмидной ДНК С чашки с бакто-агаром, в который был добавлен ампициллин или канамицин и/или хлорамфеникол, в стерильных условиях снимали 1 колонию и помещали ее в пробирку на 15 мл с 3 мл среды LB, в которую также был добавлен ампициллин, канамицин и/или хлорамфеникол. Культивировали в течение ночи при 37С на качалке (220 об/мин). 3.1.13 Проведение ПЦР-скрининга Реакционные смеси (20 мкл) содержали 1 x SuperTaq буфер, 0.2 мМ нуклеозидтрифосфатов, 1 мкМ каждого из праймеров, 1 ед активности Taq полимеразы. Перед началом реакции смесь прогревали в течение 5 мин при 96º С. Цикл амплификации включал в себя денатурацию ДНК при 92º С (30 сек), отжиг при 35ºС (30 сек), элонгацию при 74ºС. Всего проводили 20 циклов на приборе «Mastercycler personal» («Eppendorf»). 3.1.14 Трансформация A. tumefaciens LB на 1 л: NaCl – 10 г; дрожжевой экстракт – 5 г; бакто-триптон – 10г. Для агаразированной среды добавляем еще агар 15г/л Для трансформации применяли обезоруженный супервирулентный штамм A. tumefaciens CBE21 (Revenkova et al., 1993) 1) одной колонией A. tumefaciens с агаризованной LB инокулировали жидкую среду LB (2 мл). Инкубировали при 37ºС 12-16 часов на качалке (150 об/мин); 2) отбирали 50 мкл клеточной суспензии и ею инокулировали свежую жидкую LB из расчета 1,5 мл на 1 трансформацию, инкубировали при 37 ºС до оптической плотности А600 =0,6 на качалке; 48 3) 1,5 мл клеточной суспензии отбирали в новый эппендорф и осаждали клетки центрифугированием 6 мин 6500 об/мин; 4) к осадку добавляли 500 мкл охлажденного 0,025М CaCl2, ресуспендировали и инкубировали на льду в течение 20 мин; 5) осаждали клетки путем центрифугирования 4 мин при 6500 об./мин, к осадку добавляли 200 мкл 0,025М ледяного CaCl2, ресуспендировали; 6) к клеточной суспензии добавляли 10-50 нг плазмидной ДНК или объем лигазной смеси, содержащий 50-100 нг ДНК, инкубировали на льду в течение 60 мин; 7) шокировали клетки, поместив пробирки на 60-120 секунд в водяную баню, нагретую до 32ºС, после чего сразу же помещали эппендорфы на лед на 20 мин; 8) добавляли 800 мкл жидкой среды LB и инкубировали 3-4 часа при 37ºС на качалке; 9) осаждали клетки путем центрифугирования 6 мин при 6500 об./мин; 10) осадок суспендировали в 50 мкл среды LB и растирали стеклянным шпателем на чашке Петри с агаризованной LB, содержащей соответствующий антибиотик; 11) инкубировали чашки 16 - 18 часов при 37ºС, затем оценивали количество колоний-трансформантов. 3.2 Работа с растениями 3.2.1 Подготовка маточных растений МS (Murashige и Skoog, 1962): 170 мг/л KH2PO4, 1,9 г/л KNO3, 180,5 мг/л MgSO4, 1,65 мг/л NH4NO3, 25 мкг/л CoCl2x6H2O, 25 мкг/л CuS04.5H2O, 6,2 мг/л Н3ВО3, 0,83 мг/л KI, 16,9 мг/л MnSO4.H2O, 0,25 мг/л Na2MoO4.2H2O, 8,6 мг/л 49 ZnS04x7H2O, 332 мг/л CaCl2, 36,7 мг/л FeNaEDTA, 100 мг/л инозитола, 30 г/л сахарозы, 7 г/л агара. В качестве маточных использовались растения Nicotiniana tabacum сорта Petite Havana SR1 культуры in vitro, находящиеся на среде ½ MS с добавлением витаминов MS, в соответствующем количестве, с содержанием сахарозы 10 % и агара 0.8 %. Растения культивировались при 230С, световом режиме дня 16 ч/8 ч (день/ночь), освещенности – 3000-3500 люкс и подвергались пересадки один раз в два месяца. Для эксперимента использовались растения на вторую-третью неделю после очередного пассажа. Стерильные растения выращивали на среде MS (Murashige и Skoog, 1962) при следующих условиях: фотопериод – 16/8 часов, температура – 23-250С,. 3.2.2 Сбор и подготовка листьев Сбор листьев с маточных растений табака двух-трех недельного возраста, содержащихся в культуре in vitro, происходил непосредственно перед постановкой генетической трансформации. Срезали молодые, полностью развернувшиеся листья. Чтобы уменьшить усыхание листьев в процессе последующих операций, их содержат в закрытых чашках Петри с небольшим количеством (20 мл) дистиллированной воды. На одну чашку приходится по 20-25 нарезанных фрагментов листа, приметным размером 0.5х2 см. 3.2.3 Трансформация табака (по методу Horch R.B. (1985) с изменениями) 1. Инокулировать 50 мл питательной среды YEP (Sp 50, Rif 50) агробактериями CBE21 и растить в течение ночи, при 28 ºС. 50 2. Бактерии осадить центрифугированием, 6 мин, 4300 об/мин. 3. К осадку добавить 40 мл MS. Перемешать встряхиванием флакона. Открутить при тех же условиях. 4. Промыть таким образом несколько раз, до полного удаления среды 5. К осадку добавить 50 мл MS и суспендировать. Разлить в два стакана YEP. и довести объем в каждом до 75 мл. 6. Нарезать эксплант в чашке Петри с небольшим слоем MS на дне. 7. В стакан с агробактерией пинцетом перенести нарезанные листья, инкубируем 20-30 минут на столе. 8. Перенести экспланты на чашку Петри с фильтровальной бумагой и подсушить около пяти минут. 9. Перенести экспланты на агаризованную среду MS (сахароза 30 г/л, BAP 1мг/л, ИУК 0,1 мг/л), покрытую фильтровальной бумагой. Культивировать с агробактерией три дня. 10. Экспланты промыть с MS содержащей 500мг/л цефотаксима. 11. Подсушить на стерильной фильтровальной бумаге. 12. Переложить на среду MS (сахароза 30 г/л, BAP 1мг/л, ИУК 0,1 мг/л, 500мг/л цефотаксима + селективный антибиотик) 3.2.4 Селекция трансгенной ткани, отбор трансформантов и элиминация агробактерий Экспланты после инокуляции и кокультивации с агробактериями раскладывают в чашки Петри на поверхность среды MS для регенерации. Чашки заматывают парафильмом и инкубируют в термостате в темноте при температуре 23-250С. Через три дня экспланты пререносят на среду для регенерации дополненную антибиотиками цефотоксимом 500 мг/л и канамицином 100 мг/л. Цефотоксим используют для элиминации остатков агробактерии на эксплантах. Канамицин выступает в роли селективного агента, поскольку в векторных 51 конструкциях в качестве селективного маркера используется ген неомицинфосфотрансферазы nptII. 3.2.5 Мультипликация и укоренение трансформантов Стерильные растения выращивали на среде MS при следующих условиях: фотопериод – 16/8 часов, температура – 23-250С, освещенность – 3000-3500 люкс. В процессе прересадок постепенно снижали содержание гормонов, уже через два месяца концентрацию БАП уменьшали до 0.3 мг/л, а ИУК убирали полностью, а потом убирали полностью. Концентрацию цефотоксима изменяют в течение пассажей: с каждым месячным пассажем уровень снижают на 100 мг/л от исходных 500 мг/л до конечных 0 мг/л. Побеги размером один-два сантиметра помещали уже на полностью безгормональную среду. Для укоренения экспланты переносились на среду MS со сниженным содержанием сахарозы, постепенно доводя ее концентрацию до 10 мг/л. При последнем пассаже использовалась среда MS, свободная от антибиотиков. Укорененные растения подвергались предтепличной адаптации и высаживались в тепличный грунт, состоящий из смеси торфа и песка в соотношении 1:1. В дальнейшем они культивировались в условиях зимней теплицы при температуре 20-25 0С и естественном освещении с дополнительной подсветкой в ночные часы. 3.2.6 Выделение геномной ДНК из растений (с SDS) Буфер: 100mM ТрисHCl, pH 8.0, 500mM NaCl, 50M ЭДТА, pH 8.0, 0.7mM 2меркаптоэтанол. 1. 100 мг ткани растереть в жидком азоте. 2. Тщательно ресуспендировать в 1 мл буфера; 52 3. Добавить 250 мкл 10% SDS и тщательно ресуспендировать; 4. Отцентрифугировать при максимальных оборотах 10 мин; 5. Надосадок перенести в новый эппендорф; 6. Добавить 625 мкл 5M KAc, тщательно перемешать и перенести на лед на полчаса; 7. Отцентрифугировать при максимальных оборотах 10 мин; 8. Перенести по 900 мкл в две пробирки на 1,5 мл и добавить в каждую по 500 мкл изопропанола; 9. Тщательно перемешать (до появления осадка) и центрифугировать при максимальных оборотах 10 мин; 10. 11. Осадок промыть 70% этанолом и открутить пять минут; Осадок подсушить и растворить в 100 мкл TE буфера или в дистиллированной воде до полного растворения. 12. Для экстракции геномной ДНК использовался растительный материал in vivo. Для анализа с тепличных растений срезался третий лист побега. 3.2.7 Экстракция тотального белка растений Буферы для выделения белка 1: 50mM NaPO4 pH 7.0, 10mM EDTA, 0.1% тритон Х -100, 0.1% саркозил, mM β-меркаптоэтанол 2: 30mM TrisHCl, pH 8.0; 10mM EDTA, pH 8.0; 10 mM β-меркаптоэтанол; 10% глицерин Для экстракции тотального белка из трансгенных растений табака были использованы Замороженный листовые в пластинки, жидком азоте полученные растительный с тепличных материал растений. трансгенных и контрольных линий (200 мг) растирали в порошок при помощи ступки и пестика, и затем экстрагировали в буфере. Белки экстрагировали в течение 20 минут при комнатной температуре, предварительно тщательно перемешав суспензию на 53 вортексе, гомогенат центрифугировали при 10000 g 15 минут при комнатной температуре, супернатант отбирали и использовали для дальнейшего анализа. 3.2.8 Флуоресцентный анализ активности гена gfp Флуоресцентный анализ активности гена gfp осуществляли с помощью флуоресцентного микроскопа ICM 405 фирмы Opton (Германия) со светофильтрами 450–490 нм (возбуждение флуоресценции GFP) и 515–530 нм (эмиссия флуоресценции GFP). 3.2.9 Определение количества GFP методом иммуноферментного анализа (ELISA) Первичные антитела –кроличьи антитела αTaqGFP (Евроген) Вторичные антитела – козьи антикроличьи антитела, коньюгированные со щелочной фосфатазой. PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,76 mM KH2PO4, pH 7,4 Промывочный буфер: PBS, 0.05% Tween 20 Блокировочный буфер: PBS, 0.05% Tween 20, 2% БСА 1. Развести образец в буфере PBS в 1000 раз; 2. Нанести образец в лунки по 200 мкл; 3. Запечатать плашку парафильмом и инкубировать два часа при 370С 600 об/мин; 4. Промыть четыре раза по три минуты в 200 мкл промывочного буфера; 5. Блокировать плашку один час 370С 600 об/мин (200 мкл блокировочного буфера); 54 6. В блокировочном буфере развести антитела 1:5000. Все дейсвия с антителами проводятся на льду; 7. Удалить блокировочный буфер и добавить первичные антитела. Запечатать плашку парафильмом и оставить на ночь на +40С; 8. Удалить первичные антитела и промыть четыре раза по три минуты в 200 мкл промывочного буфера; 9. Приготовить вторичные антитела в промывочном буфере 1:5000. Добавить их в лунки и инкубировать один час 370С 600 об/мин; 10. Удалить вторичные антитела. Промыть четыре раза по три минуты в 200 мкл промывочного буфера; 11. Добавить субстрат и ждать развития окраски; 12. При необходимости остановить реакцию 50 мкл 2N NaOH; 13. Читать на спектрофотометре при 405 нм. 3.2.10 Гистохимический анализ GUS-активности Гистохимическое определение GUS активности проводили по методике Jefferson (1987) с использованием 5-бром-4-хлор-3-индолилглюкуронида (Х-Gluc, Sigma). Для этого листовую ткань (с нанесенными насечками, либо без) помещали в буфер, содержащий 50 мM NaH2PO4, pH 7,0, 10мM Na2ЭДТА, 0,1% тритон X100, 1 мг/л Х-Gluc, инкубировали в течение 2-6 часов при 37 ºС. После чего несколько раз промывали 50% этанолом и хранили окрашенные ткани при 4 ºС в 70% этаноле. 3.2.11 Флюориметрический анализ GUS-активности Был получен белковый экстракт каждого из растений плюс отрицательный 55 контроль (нетрансгенное растение табака). 1. Для каждого образца предварительно инкубировать 500 мкл буфера в котором экстрагировали GUS с 1mM MUG при 370С. 2. Добавить 20 мкл экстракта ткани в реакционную смесь, перемешать, инкубировать 10 мин. 3. Перенести 100 мкл в пробирку с 900 мкл 0.2M Na2CO3. 4. Флюориметр откалибровать по свежеприготовленным стандартным растворам 4-MU в буфере для экстракции GUS с добавлением 0.2M Na2CO3 в соотношении 1:9. Измерение проводилось при использовании реактива 4-MUG (4- метилумбеллиферилглюкоронида), который при расщеплении β-глюкуронидазой до 4-MU (4-метилумбеллиферона) имеет оптимумы возбуждения при 365 нм и излучения при 455 нм. 3.2.12 Определение концентрации общего белка 1) Метод Брэдфорд 1. Довести объём образца до 0.5мл водой; 2. Добавить 0.5мл реагента Coomassie G250; 3. Перемешать и ждать развития окраски (от 5 мин, но не больше 30 4. Измерить оптическую плотность при длине волны 595 (в 1ml кювете); 5. Рассчитать концентрацию белка по калибровочной кривой мин); построенной по БСА (бычий сывороточный альбумин) 2) С использованием набора «Bio-Rad Protein Assay Kit I #500-0002» 56 3.3. Праймеры VirB1 GGCTACATCGAAGATCGTATGAATG VirB2 GACTATAGCGATGGTTACGATGTTGAC NOS CGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAG nptII-2 GCATGCGCGCCTTGAGCCTGG CaMV35S-R TGAATCTTTTGACTGCATCTTTAACCTTCTT nptII-F ACGACGGGCGTTCCTTGCG Mar 2-1 CATAGTGTTACCATCAACCACCTTAACTTC Mar 2-2 TCCTGTCACCGGATGTGTTTTCC Mar 3-1 TCATAGTGTTACCATCAACCACCTTAACTtc Mar 3-2 TTCCGCAAAAATCACCAGTCTCTCTCTAC Стандартные праймеры GUSA1/GUSA2 Для поднятия терминаторов Upstreem праймеры 1TUpDir ATGACCCCATAATACTTTGTGG 1TUpRev CTACGTTTGGGATACCCTCT 2TUpDir TGCTGCGGACAGAGTCTTGA 2TUpRev GACCCGAGTCCGTCAAGTAA 4TUpDir GCCGTTTTGGGCGGAAACGC 4TUpRev ATGACAGGCCGTTCACATTGTC Внутренние праймеры araterm1Dir CTGGCGCCGTTGACCCA araterm1Rev ATCCCGGGGTTGTATTGGA araterm2Dir AAGCATGCCCTGACATTATC araterm2Rev ATCCGCGGGACAATGGTG araterm4Dir AACCCGGGGTCTGTGCC araterm4Rev GAACTAGTGGTATAGAGAAAG Олигонуклеотиды для полилинкера 57 PolyH1, GGCCGCATGGCGCCTCCCGGGTACTAGTCAAGCTTGCTCGAGTCTGCAGAGA CGTCAGCTAGCTCCGCGGAGCATGCAGC PolyH2, CGTACCGCGGAGGGCCCATGATCAGTTCGAACGAGCTCAGACGTCTCTGCAG TCGATCGAGGCGCCTCGTACGTCGCCGG. Олигонуклеотиды для 35S минимального 35SminPA1 GGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGC TGGACGT 35SminPA2 CCAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTT GCCTGCA Праймеры на промоторы и репортерные гены 35SpaDir AGCTGCAGGTCCCCAGAT 35SpaRev TAGACGTCCGTGTTCTCTC RubhxDir GGAAGCTTGCAAGTAATAАAC RubhxRev TACTCGAGTGCTGAAAACC GUSanDir ATGACGTCATGTTACGTCCT GUSRev TTGCTAGCGATCTAGTAACATA GFPerxpDir TACTCGAGATGAAGACTAATC GFPerxpRev TTCTGCAGGATCTAGTAACATA ElipDir TTCTGCAGCGGAGCTCCA ElipRev TAGACGTCTATTTTTCTTCTAC 58 4. Результаты и обсуждение 4.1 Исследование возможности использования синтетических ДНК элементов, терминирующих транскрипцию Большую роль в процессах инактивации, в том числе и гетерологичных генов, играет репрессия на посттранскрипционном уровне (post-transcriptional gene silencing, PTGS). Механизм этого явления связан с тем, что при сосуществовании двух комплементарных молекул РНК, одна из которых может находиться в крайне малой концентрации, возможно возникновение двухцепочечной РНК, запускающей как деградацию самой дцРНК, так и индукцию репрессии гена, ответственного за синтез этой РНК. Предполагается что явление PTGS, на данный момент более известное как РНК-сайлесинг или РНК-интерференция, растительного это консервативный мониторинга вирусных эукариотический частиц, защищающий механизм геном от транспозонов и участвующий в регуляции экспрессии генов. Для преодоления вышеописанных проблем, используют такие методы, как встраивание в экспрессионную кассету, наряду с гетерологичным геном, вспомогательных регуляторных элементов, способствующих увеличению уровня экспрессии и снижению её вариабельности. Такими факторами являются некоторые элементы генома, которые можно условно подразделить на три класса. Это инсуляторы, LCR-элементы (локус контролирующие регионы) и MAR-элементы (последовательности, связывающиеся с матриксом). В некоторых случаях к ним причисляют и определенные виды терминаторных последовательностей, обладающих определенной структурой, характерной для растительной ДНК. Кроме непосредственно терминирующей части, присутствующей и в вирусных терминаторах, и сайта полиаденилирования у таких элементов присутствует ряд 59 других повторяющихся блоков, что способствует наиболее полному и эффективному высвобождению молекулы РНК и дальнейшему участию в процессе трансляции. Исходя из этого, создание регуляторных элементов терминирующих транскрипцию для повышения эффективности экспрессии чужеродных генов в растениях выглядит весьма многообещающе. В то же время репрессионные эффекты при встройке гетерологичного гена могут быть связаны и с транскрипцией, проходящей через сам гетерологичный ген. Инсуляторы и активаторные регуляторные элементы не способны останавливать такую транскрипцию. Таким образом, использование терминаторов транскрипции в экспрессионных векторах должно помочь в защите гетерологичного гена от негативных транскрипционных эффектов генома. Для настоящих исследований, в целях регуляции экспрессии и получения высокого и стабильного уровня выхода целевого белка, было решено в качестве регуляторных, использовать терминаторные последовательности, обрывающие геномные траснкрипты в местах встройки гетерологичного гена. В первой части работы мы проводили исследования по влиянию на экспрессию гетерологичных генов двух новых искусственных регуляторных элементов, условно названных «элемент I» и «элемент II». В одной из последовательностей (элемент-I) терминатор гена NOS (247 пн) был окружен с одной стороны искусственно созданным в нашей лаборатории рибозимом (52 пн), с другой - рибозимом из бета глобинового гена (226 пн) (Teixeira et al., 2004). Рибозим – это последовательность РНК с собственной ферментативной активностью, стимулирующей разрывы в РНК. Для рибозима из бета-глобинового гена была показано ключевая роль в усилении терминации транскрипции (Teixeira et al., 2004). Во втором ДНК-фрагменте (элемент-II) вышеописанными рибозимами был окружен вирусный сигнал полиаденилирования гена CaMV 35S (210 п.н.). Таким образом, оба ДНК-фрагмента должны быть эффективными терминаторами транскрипции в растениях. В нашей лаборатории было сконструировано по два вектора для каждого исследуемого элемента, т.е. в целом были собраны пять конструкций (рис.1). В 60 качестве репортерного гена для дальнейшего анализа показателей уровня экспрессии было решено взять ген β-глюкуронидазы (GUS). Конструкции собирались на основе вектора pBI121 (Jefferson et al., 1987), в котором Т-ДНК несет ген GUS под контролем 35S CaMV промотора и терминатора нопалинсинтетазного гена nos, а также ген неомицинфосфотрансферазы nptII в качестве селективного маркера (Jefferson et al., 1987). Вектор pBIGeI содержал регуляторный элемент I с одной стороны от экпрессионной кассеты, в pBIGeI-I фланкировал ее с обеих сторон. Вектора pBIGeII и pBIGeII-II имели регуляторный элемент II в таких же позициях. В качестве контроля была взята плазмида pBIG с репортерным геном uidA не содержащая дополнительных регуляторных элементов. Рисунок 1. Схематичное изображение использованных в работе конструкций. Промоторы показаны в виде стрелок. 35S - 35S CaMV, промотор вируса мозаики цветной капусты; GUS – ген белка β-глюкуронидазы; Tnos – терминатор нопалин синтазы; Pnos- промотор нопалин синтазы; nptII- ген устойчивости к канамицину; LB, RB -последовательности левой и правой границ Т-ДНК; 4.1.1 Генетическая трансформация растений Полученные плазмиды были перенесены в супервирулентный агробактериальный штамм CBE21, сконструированный на основе дикого штамма A. tumefaciens А281 с Ti-плазмидой pTiBo542. Впоследствии полученные вектора были использованы для проведения трансформации листовых эксплантов табака. Регенеранты отбирались на селективной среде с канамицином в концентрации 50 61 мг/л. Каждое растение, полученное в результате единичного трансформационного события и устойчивое к селективному антибиотику, было впоследствии вегетативно размножено на шесть клонов. Каждое растение, полученное в результате единичного трансформационного события и устойчивое к селективному антибиотику, было впоследствии вегетативно размножено на шесть клонов. После проведения трансформации, клонального микроразмножения полученных растений до требуемого числа и укоренения, производился дальнейший их перевод в условия закрытого грунта. В результате в теплицу было перенесено по шесть растений каждой линии. Для всех полученных линий каждой из пяти плазмид был проведен анализ выделенной тотальной ДНК. Для экстракции геномной ДНК использовался растительный материал in vivo. С тепличных растений срезался третий лист побега. Выделение проводилось по модифицированному нами протоколу. Все полученные линии были проверены на отсутствие вирусной контаминации, проверкой наличия генов вирулентности (virA/virB, 670 пн), и на вставку селективного маркера (nptII, 742 пн), присутствие которого позволяет предварительно сделать вывод о наличии используемой конструкции в геноме исследуемого растения. В линиях свободных от агробактерий и содержащих, по результатам ПЦР, ген неомицинфосфотрансферазы, методом ПЦР проверялось непосредственно наличие репортерного гена и анализируемых нами последовательностей. В связи с тем, что в некоторых конструкциях один и тот же элемент присутствовал в двух различных положениях, анализ таких растений проводился с использованием двух пар праймеров. Проверка проводилась с помощью следующих комбинаций: 1tob2 Mar 2-1 и Mar 2-2 (715 пн) 1tob3 Mar 3-1 и Mar 3-2 (597 пн) 2tob2 Mar 2-1 и nptII-F (2663 пн) Mar 2-2 и CaMV35S-R (922 пн) 2tob3 Mar 3-1 и nptII-F (2551 пн) Mar 3-2 и CaMV35S-R (803 пн) 62 Для определения наличия гена белка GUS использовались стандартные праймеры GUSA1 и GUSA2. Линии, не содержащие одной из последовательностей, были изъяты из эксперимента. Так же наблюдались некоторые потери при поддержании растений in vitrо, в основном за счет бактериального и грибкового заражений. Каждая из оставшихся линий гистохимически проверялась на наличие экспрессии гена GUS путем анализа его активости при использовании реактива XGLUC. Все образцы, не показавшие наличие окраски, а, следовательно, и экспрессии гена GUS, так же не были использованы для дальнейших экспериментов. В результате, для последующих анализов осталось 29 линий (174 растения), см. табл. 1. Таблица 1. Результаты трансформации листовых эксплантов табака. aКонструкции представлены на Рис.1 Векторa Количество эксплантов Количество регенерантов nptII+/Vir- Элемент+/ GUS+ Экспрессия GUS pBIGeI 50 14 8 4 4 pBIGeI-I 50 15 13 8 6 pBIGeII 50 17 11 8 6 pBIGeII-II 50 18 14 8 6 pBIG 50 19 14 7 4.1.2 Анализ уровня экспрессии репортерных генов На следующем этапе измерение активности гена проводилось флюориметрически, что позволило количественно определить уровень экспрессии репортерного гена. Для этого был получен белковый экстракт каждого из растений плюс отрицательный контроль (нетрансгенное растение табака). Экстракция тотального белка растений проводилась с использованием буфера 1. Измерение проводилось при использовании реактива 4-MUG (4- 63 метилумбеллиферилглюкоронида), который при расщеплении β-глюкуронидазой до 4-MU имеет оптимумы возбуждения при 365 нм и излучения при 455 нм. Количество репортерного белка оценивалось относительно общего белка экстракта, определение концентрации Бредфорд. Окончательные которого проводилось концентрации были получены по реакции в следующей размерности: нмоль 4-MU/ ч на μг общего белка. Таблица 2. Активность GUS в трансгенных растениях табака. a Конструкции представлены на Рис.1 b Средняя активность GUS в нмоль 4- MU ·мин-1·мг общего растворимого белка-1 Вектора Среднееb pBIG pBIGeI pBIGeI-I pBIGeII pBIGeII-II 0,74 1,89 0,71 4,52 0,26 Стандартная ошибка 0,13 0,36 0,13 1,19 0,03 Медиана 0,34 1,12 0,31 1,32 0,21 Рисунок 2. Активность GUS в мкмоль 4-метил-умбеллиферона в мин на мг общего белка с ± стандартной ошибкой всех измерений в каждой популяции. Статистически достоверные отличия между группами и контролем отмечены одной звездочкой (p≤0,05) или двумя (p≤0,1). 64 Полученные результаты (рис.2, табл.2) демонстрируют, что присутствие в конструкции тестируемых элементов, способных путем обрыва транскриптов изолировать конструкцию от геномных сигналов, приводит к увеличению уровня экспрессии репортерного гена GUS (в два с половиной раза для pBIGeI и в шесть раз для pBIGeII по сравнению с контролем) при их расположении с одной стороны – выше по ходу транскрипции. При расположении регуляторных элементов по обе стороны экспрессионной кассеты уровень экспрессии наоборот снижается. При этом можно видеть, что и первый и второй эффекты сильнее выражены при использовании элемента-II. Вероятно, это связано с тем, что второй элемент дублирует присутствующий в конструкции nos терминатор, который находится на конце гена неомицинфосфотрансферазы nptII (рис.1). В тоже время дупликация последовательностей в конструкции может приводить к повышению частоты перестроек и снижению эффективности экспрессии. Однако ни один из данных элементов не оказывает положительного влияния на уменьшение вариабельности экспрессии. Можно предположить, что разброс экспрессии, запускаемой с 35S-промотора, зависит от транскрипционной активности хроматина в месте интеграции гетерологичного гена. Тестируемые элементы, которые прерывают транскрипцию, не могут защитить промотор от негативного/позитивного влияния окружающих геномных регуляторных факторов. С другой стороны, элементы, терминирующие транскрипцию, прерывают синтез РНК, который инициируется в окружающих гетерологичный ген последовательностях. Таким образом, происходит частичная супрессия эффекта РНК-интерференции, гетерологичного гена. что приводит Большинство других к увеличению экспрессии регуляторных элементов, используемых для увеличения экспрессии гетерологичного гена, непосредственно влияют на уровень транскрипции: сильные промоторы, А/Т-богатые ДНКпоследовательности, связывающие белки ядерного матрикса и др. Так как терминаторы транскрипции имеют отличный механизм действия, то они могут быть эффективно использованы совместно с другими регуляторными элементами 65 для синергетического усиления экспрессии репортерных генов в трансгенных растениях. Это позволяет отметить данные элементы как возможные компоненты для создания экспрессионных кассет, направленных на получение высоких и стабильных уровней экспрессии целевого гена в различных растительных объектах. Вероятно, данные элементы могут быть использованы в создании трансгенных растений практически для всех отраслей их применения, таких, например, как биотехнология и сельскохозяйственное производство. Однако понятно, что для дальнейшего использования синтезированных элементов, как в научно-исследовательских целях, так и для разработки сельскохозяйственноценных культур, необходим более подробный и надежный анализ их действия, который позволил бы точно оценить влияние этих последовательностей на трансгенную экспрессию и давал бы возможность предсказать их поведение в других растительных организмах, полученных, возможно, при использовании других экспрессионных кассет. 4.2 Исследование возможности использования растительных ДНК элементов, терминирующих транскрипцию 4.2.1 Поиск регуляторных элементов В настоящее время для достижения высоких уровней наработки целевых белков в трансгенных растениях используются, в основном, сильные регуляторные элементы вирусного происхождения. В первой части эксперимента мы изучали влияние фрагментов терминаторов генов NOS и CaMV 35S, определенным образом совмещенные с рибозимами, на экспрессию гетерологичных генов в растениях табака. Однако, не смотря на то, что применение этих последовательностей показало себя достаточно эффективным, в целом, использование как вирусных, так и бактериальных элементов может 66 привести к негативным последствиям. Часто такое влияние негативным образом сказывается на метаболизме растения и его фенотипе, что, отчасти, и было замечено нами в предыдущем эксперименте. Кроме того, использование трансгенных растений с чужеродными последовательностями бактериального или вирусного происхождения в сельскохозяйственном производстве встречает настороженное отношение потребителей к продуктам, содержащим фрагменты генома пусть и растительных, но патогенных организмов, несмотря на многократно доказанную их безвредность для человека. Использование регуляторных элементов растительного происхождения и создания цисгенных растений, может стать решением этих проблем. В связи с этим целью дальнейшей работа было создание растений именно с такими регуляторными элементами и исследование их свойств. В связи с тем, что предыдущие наши исследования показали достаточный уровень влияния терминаторных последовательностей, в дальнейшем предполагалось использовать элементы с такой же функцией. Однако в настоящий момент, не известно структуры даже более-менее подробно описанных и изученных растительных терминаторных последовательностей, обеспечивающих значимое влияние на уровни экспрессии в растениях, да и в принципе растительных терминаторов. Таким образом, первым нашим шагом в достижении поставленной задачи был поиск терминаторных последовательностей в растительном геноме. Для решения подобной задачи можно полагаться не только на сами последовательности, отвечающие за терминацию транскрипции, но ориентироваться также и на сайты полиаденилирования, которые присутствуют в непосредственной близости от них. Наличие этих признаков должно указывать на сильные терминаторные способности сайта. Однако, на данный момент, в литературе нет полного и обобщенного описания даже самих сайтов терминации транскрипции у растений, их структуры и механизмов функционирования. По большей части, это связано с тем, что и особенности процесса терминации транскрипции в растительных клетках на данный момент практически не изучены. Опубликованные в этом направлении исследования фрагментарны, и не 67 представляется возможным создать полную картину структуры таких элементов и особенностей их функционирования в растительных объектах. Эти работы, в большинстве случаев, представляют собой описания конкретных сайтов терминации у отдельно взятых растительных генов. Однако и такие описания зачастую бывают достаточно подробными, более того, в некоторых работах представлены типичные, предположительно консервативные, последовательности вблизи сайтов терминации, по которым возможна идентифицикация в геноме. Рисунок 3. Возможные сайты терминации ранскрипции Lhcb1*6. (Hasegawa et al., 2003). 3′-фланкирующая область гена Lhcb1*6. Стоп-кодон и предполагаемый поли(А) сигнал обведены рамкой, поли(А) сайт отделен чертой. Примерные 3′-концы транскриптов выделены (T1–4). Обнаружение таких консервативных терминирующих последовательностей существенно затруднено так же и в связи с тем, что эукариотические мРНК накапливаются в виде полиаденилированных форм in vivo, а понимание процессов формирования 3′-конца мРНК в растениях весьма смутно. Тем не менее и эту проблему удается преодолеть. Например, в работе 2003 года (Hasegawa et al., 2003), для исследования регуляторных последовательностей была использована система in vitro без детектирующейся полиаденилирующей активности, что, с 68 практической точки зрения, позволило обнаружить 3′- концы пре-мРНК. Были идентифицированы сайты поли(А) в in vivo транскриптах lhcb1 гена (рис. 3). У млекопитающих и дрожжей высококонсервативный поли(А) сигнал, шестинуклеотидная последовательность AAUAAA, в большинстве случаев задает поли(А) сайт через 10-30 нуклеотидов (Zhao et al., 1999). Эта последовательность известна в растениях так же как ближний элемента против хода транскрипции (NUE-near upstream element). В случае дрожжей поли(А) сигнал играет важную роль в контроле и инициации и терминации транскрипции полимеразой II (Minvielle-Sebastia and Keller, 1999). Несмотря на то, что последовательности содержащие поли(А) сигнал в растительных мРНК менее консервативны, AAUAAA или AAUAAA-подобные последовательности часто обнаруживаются в концевой части растительных мРНК (Mogen et al., 1992; Wu et al., 1993, 1995). Однако это верно не для всех случаев. Например в петунии AAТAAA – подобных последовательностей обнаружено не было (Dunsmuir et al., 1985), так же, как и в случае гена lhcb1*9 в Nicotiana sylvestris (Hasegawa et al., 2003). Более того стандартная последовательность NUE AATAAA находится в консервативной позиции лишь у 10% генов арабидопсиса (Loke et al., 2005), тогда как для человеческого генома это верно для половины генов (Hu et al., 2005). Если посмотреть на геном млекопитающих - у них за поли(А) сигналом располагается дополнительный цис-элемент, который как правило состоит из T/TG-богатых последовательностей. Такие FUE-последовательности (far upstream elements) представляются так же важными элементами функционирования поли(А) сигнала (Zhao et al., 1999). В растительных мРНК выше поли(А) сигнала были найдены похожие последовательности, но большей длины и менее консервативные (Rothnie, 1996; Wu et al., 1995). Было показано, что NUEs и FUEs в геноме Arabidopsis thaliana могут иметь более чем 50 вариантов (Loke et al., 2005). Поли(А) сайт был идентифицирован in vivo и в шести генах LHCB1 N. sylvestris. На 12-21 нуклеотидов выше поли(А) сайта присутствуют AAТAAA – подобные последовательности. Кроме того, выше предполагаемого поли(А) сигнала были 69 обнаружены и FUE GT-богатые последовательности, которые, возможно, так же играют важную роль в полиаденилировании (Hasegawa et al., 2003) и по которым, соответственно, такие сайты можно идентифицировать. Исходя из этого, подобные сайты использовались в нашем поиске, для подтверждения терминирующих свойств последовательностей и такие группы были обнаружены после некоторых генов в арабидопсисе. При использовании метода защиты от РНКаз были детерминированы 3′- концы in vitro транскриптов гена lhcb1*6 (Hasegawa et al., 2003). При электрофоретическом разделении среди нескольких обнаруженных продуктов, был и соответствующий поли(А) сайту из растений in vivo. Кроме вышеупомянутого поли(А)-продукта в использованной системе наблюдалось еще четыре значительных полосы соответствующих продуктам большей длины. Эти полосы воспроизводимо обнаруживались в череде экспериментов и так же были замечены при использовании конструкций с укороченным кодирующим регионом. Эти результаты напрямую говорят о том, что терминация транскрипции у lhcb1*6 происходит в нескольких определенных сайтах. Эти сайты расположены внутри или поблизости от Т-богатых регионов. В клетках млекопитающих было однозначно показано, что PolII-зависимые гены имеют специфические G-богатые регионы, расположенные после поли(А) сигнала, которые вызывают паузы в транскрипции, что в результате ведет к активации полиаденилирования in vitro (Yonaha and Proudfoot, 1999). Однако никаких подобных G-богатых последовательностей не было обнаружено в области, соответствующей 3′-концу транскрипта lhcb1*6, и, таким образом, эти результаты свидетельствовали о различии в процессе терминации транскрипции растений и таковых в клетках млекопитающих. Детектировалось и несколько полос продуктов меньших по размеру чем соответствующие поли(А) сайты. В настоящее время объяснения появления этих коротких транскриптов так и не нашли, несмотря на то, что некоторые из них присутствуют и при транскрипции in vivo. Не исключена и частичная деградация продукта. У животных расстояние от поли(А) сайта до места терминации транкрипции варьирует (от нескольких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов), тогда как большинство транскриптов 70 lhcb1*6 терминируются в регионе приблизительно трехста нуклеотидами ниже поли(А) сайта. По этой причине сигнал терминации lhcb1*6 представляется более эффективным, чем подобные последовательности в клетках животных, предотвращая воздействие нижележащих промоторов и, так же, сберегая энергию, сокращая лишнюю транскрипцию с последующих регионов. В целом, последовательности из четырех и более Т-остатков в 3′-области уже считаются эффективными терминаторами (Allison & Hall 1985; Lin-Marq & Clarkson 1998; Platt 1986). При нашем анализе для подтверждения терминирующих функций во внимание принимались как известные NUE и FUE, установленные в описанных работах, так и другие последовательности, упомянутые выше. Обнаружение сразу нескольких последовательностей было значительным стимулом для выбора конкретных участков генома. В качестве донора регуляторных элементов был рассмотрен ряд растений, из которых в результате было выбрано модельное растение Arabidopsis thaliana. Это объясняется тем, что это растение не только хорошо изучено, и используется как модельное наряду с табаком, Nicotiana tabacum, но и является первым растением, для которого было проведено полногеномное сиквенирование. Благодаря этому, для растений арабидопсиса возможен поиск регуляторных единиц по всему геному. Мы использовали электронную базу, содержащую полногеномный сиквенс арабидопсиса The Arabidopsis Information Resource (TAIR) http://www.arabidopsis.org -информационный ресурс по арабидопсису содержащий базу данных генетических и молекулярно-биологических данных модельного растения Arabidopsis thaliana. Информация имеющаяся в этой базе содержит полногеномный сиквенс наряду со структурой генов, сведениями о продуктах работы гена, метаболизме, экспрессии генов, геномными картами, генетических и физических маркеров, а также публикациями. Поиск терминаторных последовательностей в этой базе проводился с помощью специально созданной программы (созд. Тихонов М. В.), основанной на методах математического моделирования, которая отбирала участки, отвечающие определенным требованиям. Мы выбирали участки генома между двумя генами, 71 рамки считывания которых направлены друг на друга, а экспрессия с этих генов идет во всех органах растения и на всех стадиях развития. В результате чего, с высокой долей вероятности можно предполагать, что между этими генами находятся сильные сайты терминации. Так же нас ограничивал размер участков, т.к. последовательности большой длины не выгодно использовать при создании конструкций, что сопряжено с рядом трудностей при ее переносе в растительный геном. Таким образом, из общей массы геномных последовательностей нами было выбрано шесть, предположительно регуляторных элементов, отвечающих за терминацию транскрипции. При ближайшем рассмотрении, основываясь на более подробном изучении наличия и структуры различных последовательностей нуклеотидов и их повторов, особенности которых описаны выше, из этих шести элементов было выбрано три, наиболее полно отвечающих параметрам терминаторов транскрипции (рис. 4). • AT I – последовательность между генами субъединицы коатомера гамма-2 (локус AT4G34450) и гуанин нуклеотид-связывающего белка AGB1 (локус AT4G34460). • AT II – последовательность между генами белка цикла клеточного деления CDC48 (локус AT3G09840) и белка содержащего D111/G-patch домен (локус AT3G09850). • AT I-IV – последовательность между генами 60S субъединицы рибосомного белка P2 (RPP2D) (локус AT3G44590) и циклофилина 71 (локусAT3G44600). 72 ATI 1407 bp GTTGACCCAAGCACAGGTGAAGCAGAAGATGATGGAGTAGAAGATGAGTACCAGC TAGAGGATCTTGAGGTTGTAGCTGGAGATTACATGGTGAAAGTGGGTGTCTCCAATTTCAG GAATGCGTGGGAAAGCATGGATGAAGAAGATGAGCGTGTAGACGAATATGGCCTTGGCCA AAGAGAGAGTTTGGGAGAAGCTGTAAAGGCTGTCATGGATCTTCTTGGCATGCAGACTTGT GAGgttagtctcttccacttttttctcatactctactgagacttgagggctaaaattattgttgataaagtcttttttgagtatatgaccatttgttgtgtt cctgaaattgaaactgacactggataaataacagGGGACGGAGACAATTCCGCTCAATGCAAGGTCACACAC GTGTCTATTGTCAGGTGTGTACATAGGCAACGTGAAAGTGTTAGTGAGGGCACAGTTTGGA ATGGACAGCTCAAAGGACATTGCAATGAAGCTGACAGTTAGAGCTGAAGACGTTTCTGTC GCCGAGGCCATTCACGAGATTGTTGCCAGCGGCTAAaacctcttgcgtttcttcagtatcagagaatgtcatctattcc tgctgctaaacctcaaaaatacatcaactattataaatagcatagtattactttctttcttttttccttgcattattactgtcaaatacactatggaggttttcttttt attttatgacggtgctttttgatttctcatttctgaattttattattacccgttttctcgccaagttgggaatctacagatcatcttgctcggatttgaaaaccact accgtaccgtacaacaggctaggctttctccataagttagaaactcaaaaatagtagcgttttatcgtctgcgttcaatatgaagagatgatagtaaagta aagactggtgggtacacaattgattacagaattcacattgagtagcgtgttgaaggagtttagttcccaatgaagaaataaataaatcaaagcacacta caaaaagggaagtttaattcttctaaccactccactatttcaaaccaaacaccttccacaaaccgaaccttacttcccgactacagaatatattaaccaac aactggagacgtgactcctactttcgttaaatcttctTCAAATCACTCTCCTGTGTCCTCCAAACGCCCATATctgtgtg aattcaacgaaatttcatctatcctctaatttccttacaaacataacatggtaaatgataagcagagacactactaagtactaacCTTTAGAT TTGAATCCCAACTTCCTGTACACAAGGCACTTCCATCTGCTGACAACCCCAAACAGCTTATT CTATTCCTGTGTGAATCCTGCTGTAATCCCAAATCCAATACAAC ATII 1400 bp CCTGACATTATCGATTCAGCTCTTCTCCGTCCTGGAAGGCTTGACCAGCTCATTTACA TTCCACTACCAGATGAGGATTCCCGTCTCAATATCTTCAAGGCCGCCTTGAGGAAATCTCCT ATTGCTAAAGATGTAGACATCGGTGCACTTGCTAAATACACTCAGGGTTTCAGTGGTGCTGA TATCACTGAGATTTGCCAGAGAGCTTGCAAGTACGCCATCAGAGAAAACATTGAGAAGgtta gagatcccatcgccaagctctttatccaaagattgttatactctccaatcgttgaactgaagctcatgttttttttttgtttcagGACATTGAAA AGGAGAAGAGGAGGAGCGAGAACCCAGAGGCAATGGAGGAAGATGGAGTGGATGAAGTA TCAGAGATCAAAGCTGCACACTTTGAGGAGTCGATGAAGTATGCGCGTAGGAGTGTGAGT GATGCAGACATCAGGAAGTACCAAGCCTTTGCTCAGACGTTGCAGCAGTCTAGAGGGTTC GGTTCTGAGTTCAGGTTCGAGAATTCTGCTGGTTCAGGTGCCACCACTGGAGTCGCAGATC CGTTTGCCACGTCTGCAGCCGCTGCTGGGGACGATGATGATCTCTACAATTAGtgataacttctttatc 73 ctttttttttttaagttttaaaactcgaattctctacttttggattactggggaaagtgatactgattctttcctcgtgtttttaagttatccgaatctcttgtgtttgg gttttaatcaatgttcttaattttcgtttcaatacttgtttggtcgttcattacaaatggaaaaaataaaggattataaagtaagttaaaaagattgcaagtgat aagtaattgctttataagtggtaagtatcacaaatgttcccacttatcagcaatttccgcatatcaatgttaatgctctaagatcggtactttcttttatagaat cttggagccgaggatgtatttttttttgcatcaatggtggttaaagaagccaaaagaaaggatgctttattatgtcaacaacattgatgtcaagataacaa caaagctgctcccaagtcttaaacataaattgaacaaaggccacatgttgaagattgaagatgaacatacttaaaaacgatatcttactgttcttgttcaa acattgaccgttaaatacttcaatgtTTAGCCTTCAGCACCTATTCCACGTGCTCTAGGACGTCTGACAGCG ACCAGCGGATTGACTATGCCTTGTGACTCTCTACCCAGACCCGAGCCTTCGACGAAACCCA TTCTCGCCATCATCCTCGACCCAAAGCCTGTTGTGTGCTGCTCAAAGGCTCCCAATCTTTTG TCCCTGATTCTTCCTGAACCAGAGGCACCATTGTC ATIV 1051 bp GTCTGTGCCATCTGGTGGTGGTGTGGCTGTTTCAGCTGCTCCATCAAGCGGTGGTGG TGGTGCTGCTGCCCCTGCGGAGAAGAAAGAAGCCAAGAAGGAAGAGAAAGAAGAGTCTG ATGATgtaaagcatttctctctttatcattttgtttccttattacttagtctttgttatggtcttgatattggtctttatctgactctttgttatatccttcacctt tgatgcagGACATGGGATTCAGTCTCTTCGAGTAAggtttttgtccccacggaaaggagtcgagatttgattttttgttctctta gtggttctggtttttgcttcttggattacgaattttactccttagataatgaagcaagaagagttttttcaactatgttgcgaccttgcgggttattcatttatcgt tttccgtttgatttacatgttgaatctggtctaagcttgtaatttacatagtttagttcatagtatgttagcatatcacaaaataagtgcctaagagggctagaa tttgatacactcatggaaaagtttatctttagtgatcccaaataaacagaaaaatccaaatccaagtgaaattgagattctatgttattaacttcaaacattg gtgttgtcgtgttgtcgtttcagacataaacccatgaagcttggataaattagaagaaagtagatcaactctatttcaagaaaataagaggaattgaagta acattagaagttgaagtctttttgttcactaagcattctcataaaatttgtttgacaaaaacataaaataatgtttagtgtcaagaagatgatgccaccaactt aacctgatctgctcgggtacaacaaacatatcccacagttcgatccatctccgcaagaacaacttcccagcatagaaccaatcacggggttacggatc agcatagattgttcactatctttgagacagtagcaaagatgCTAAGATTTCGGAACGGTGACATTAAGTATCTTCACA TCTTGGTAAGGCCTGTCGTTCTTGTCTGTCTTCACTTTCTCTATACC Рисунок 4. Терминаторные последовательности ATGC-экзон; atgc-интрон; TAA- стоп кодон; atgc – AATAAA NUE DIR; atgc – AATAAA NUE REV; atgc – потенциальное NUE DIR; atgc – потенциальное NUE REV; atgc- FUE DIR; atgc-FUE REV В дальнейшем выбранные нами регуляторные элементы, были клонированы из генома выбранного нами растения Arabidopsis thaliana. Семена арабидопсиса предоставлены А.Ю. Скрипниковым (МГУ, биофак). Растения арабидопсиса были пророщены из семян, и тотальная ДНК из них выделялась по стандартной методике. Получение последовательностей проводилось с использованием 74 специально разработанных нами двух пар праймеров для каждого из ДНК элемнтов, терминирующих транскрипцию. Причем одна из пар праймеров являлась комплементарной участкам цепи генома арабидопсиса, располагающимся в более дистальной позиции, чем участки, комплементарные второй паре. Таким образом, сначала происходил синтез более длинного участка цепи с upstream праймеров, который подвергался последующему выделению и очистке и лишь потом с использованием его как матрицы, происходил синтез непосредственно того участка, содержащего интересующий нас регуляторный элемент, который использовался нами в дальнейшей работе. Для анализа влияния полученных элементов на уровень экспрессии генов в растениях, эти последовательности были сгруппированы нами в два кластера, один из которых впоследствии имел расположение справа от экспрессионной кассеты, а второй, соответственно, слева от неё. В качестве репортерных генов для последующей оценки показателей уровня экспрессии снова был взят ген βглюкуронидазы GUS, а также ген зеленого флуоресцентного белка GFP. В создаваемых экспрессионных векторах оба репортерных гена были помещены под промоторы разной силы и природы (вирусной, бактериальной или растительной), что в дальнейшем позволило произвести более полный и многосторонний анализ изменения экспрессии, при использовании регуляторных элементов. Использовались два промотора вирусного происхождения, наиболее часто используемых при трансформации растений, и два более редких растительных промотора. • 35S CaMV - промотор вируса мозаики цветной капусты • 35Smin - минимальная активная единица CaMV 35S промотора, представляющая собой 57-нуклеотидный фрагмент (от -49 до +8) • RuBisCO - сильный растительный промотор малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы томата (RuBisCO) c 250 нуклеотидным интроном, представляющим собой комбинацию 5'UTR последовательности гена 75 фосфоенолпируват карбоксилазы томата (сорт Ялф) и энхансера (синтетического двойного энхансера ocs агробактериального промотора гена октопин синтазы) • ELIP - уникальный укороченный по HindIII сайту промотор белка светового стресса ELIP (Bruno & Wetzel, 2004) Без сомнения именно 35S промотор вируса мозаики цветной капусты на данный момент является наиболее изученным и широко используемым при трансформации растений, как в исследовательских целях, так и для коммерческого применения. Вирус мозаики цветной капусты (CaMV) является параретровирусом поражающим семейство Brassicaceae. CaMV был одним из первых изученных ДНК вирусов растений и его двойная кольцевая ДНК полностью отсеквенирована (Franck et al 1980). Регуляторные элементы этого вируса используются уже с 80х годов (Hohn et al 1982), и в особенности промотор 35S. Это сильный конститутивный промотор, обеспечивающий высокие уровни генной экспрессии при трансформации растений содержащими его конструкциями. 35S промотор широко используется в экспериментах по трансформации благодаря своей высокой активности в большинстве клеток широкого спектра видов растений. Проведены исчерпывающие исследования его поведения во многих растениях и экспрессионных системах (см. обзор Hull et al., 2002). Структура 35S CaMV промотора подробно описана, а природа его взаимодействия с энхансерами хорошо понятна. Именно поэтому, эту последовательность мы выбрали в качестве сильного конститутивного вирусного промотора. Более того результаты предыдущего эксперимента с использованием именно этого промотора оказались весьма показательными. Часть домена А промотора CaMV35S содержащая ТАТА бокс и располагающаяся в промежутке от -46 до +8 является коровой частью, так называемым 35S минимальным промотором (Benfey et al., 1990), наиболее сильно урезанной версией 35S CaMV, у которой все еще наблюдается детектируемый уровень экспрессии. Этот промотор был выбран нами как слабый вирусный. 76 RuBisCO (рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза) - бифункциональный фермент хлоропластов растений, который катализирует инициацию процесса фиксации двуокиси углерода в цикле Кальвина и функционирует как оксигеназа при фотореспирации. RuBisCO, видимо, самый распространенный белок в мире. Примерно половина растворимых белков в листе – это белки RuBisCO. У высших растений он состоит из двух субъединиц, большой (LSU), кодируемой в геноме хлоропластов, и малой (SSU), кодируемой ядерным геномом (Ellis, 1981). Органы растений содержат RuBisCo, в растворимой фракции может содержаться до 50% этого белка. Таким образом, промотор SSU изначально являлся привлекательным кандидатом для получения высоких уровней экспрессии в зеленых частях трансгенных растений (Ellis, 1981). Промотор малой субъединицы обеспечивает тканеспецифичную и регулируемую светом экспрессию генов (Khoudi et al. 1997) и он отлично подходит для генной инженерии растений (Jung et al. 2010; Kim et al. 2010; Kim et al. 2012). Этот промотор был использован нами в качестве сильного растительного промотора. Установлено, что ранние индуцируемые светом белки семейства ELIP (Elip от Early light inducible protein) связаны в тилакоидах хлоропластов с фотосистемой II. Эти белки связаны со стрессом вызванным светом, холодом, или недостатком питательных веществ. В высших растениях они синтезируются в ядре в виде предшественников и попадают в хлоропласты уже посттрансляционно (Montane, Kloppstech, 2000). ELIP промотор томата, укороченный по HindIII сайту, в предварительных экспериментах в лаборатории экспрессионных систем и модификации генома растений ФИБХ РАН показал активность как в плодах, так и в листьях томата (неопубликованные данные). Он отлично подошел нам в качестве слабого растительного промотора, показывающего, тем не менее экспрессию во всех растительных органах. Такая стратегия, при которой используются промоторы разного происхождения и разной силы, позволяет не только сравнить влияние элементов при экспрессии с сильного и слабого промоторов и отличия во влиянии на растительные промоторы, но и проанализировать значимость расположения 77 элементов. В нашем случае последовательности располагались как по обе стороны от экспрессионной кассеты, так и только с одной стороны, выше первого промотора, т.к. предыдущий эксперимент показал эффективность такой локализации. 4.2.2 Конструирование Сборка экспрессионных конструкций проводилась в векторе, изначально созданном для сайленсинга в растениях - векторная система на базе pHANNIBAL (с геном β-лактамазы в качестве бактериального маркера, рис.5). Из этого вектора Рисунок 5. Схематичное изображение вектора pHANNIBAL. по сайтам NotI была вырезана смысловая конструкция и встроен синтезированный полилинкер. Экспрессионная кассета затем по этим же сайтам NotI может быть вырезана и в дальнейшем лигируется в бинарный вектор, в нашем случае pART27 (Gleave, 1992), который используется для трансформации растений. Выбор этого вектора для сборки мотивировался тем, что 78 использованная его часть имеет достаточно маленький размер и лишь незначительное количество сайтов рестрикции. Это было весьма важным, т.к. создаваемые нами конструкции имели значительный размер, а так же, в качестве регуляторных элементов, содержали терминаторные последовательности из генома арабидопсиса, каждая из которых, в свою очередь, несет большое количество сайтов узнаваемых рестриктазами. Для создания такой системы была разработана последовательность полилинкера, содержащая определенное количество сайтов ферментативной рестрикции, рассчитанная непосредственно для последовательного клонирования элементов, необходимого для правильной сборки создаваемой конструкции. Для его создания были рассчитаны и заказаны олигонуклеотиды PolyH1 и PolyH2. На их основе была синтезирована полилинкерная последовательность. NotI NarI XmaI SpeI HindIII XhoI PstI AatII NheI SacII SphI NotI Сайты воздействия эндонуклеаз рестрикции выбирались с их учетом наличия в клонированных из арабидопсиса регуляторных последовательностях. Выбраны были уникальные сайты рестрикции, такие которые впоследствии давали бы возможность заменить любую часть конструкции, не повреждая остальные составляющие. Конструирование проводилось по схеме, представленной ниже. Процесс включал в себя несколько этапов, в зависимости от желаемого конечного результата. 1. а) Плазмида pHANNIBAL разрезалась по сайтам NotI и XhoI, и из геля выделяли вектор NotI- NotI, в который впоследствии проводили вставку полилинкера. б) По сайтам NotI- NotI вставляли полилинкер в плазмиду. 2. По сайтам SphI-SacII клонировали последовательность araterm II. 3. а) По сайтам HindIII-XhoI вставляли RuBisCO или 35S CaMV. 79 RuBisCO был клонирован из вектора pBI121-t3A-rbcS-ppc-ocs (Ovchinnikova et al., 2008) с использованием праймеров RubhxDir и RubhxRev. 35SCaMV промотор был клонирован из стандартного вектора pBI121 (Jefferson et al., 1987) с использованием праймеров 35SpaDir и 35SpaRev б) По сайтам XhoI-PstI клонировали последовательность GFPer+term Последовательность GFPer была получена в результате амплификации с праймеров GFPerxpDir и GFPerxpRev с плазмиды pBINmGFP5ER (Haseloff et al., 1997) в) По сайтам AatII-NheI клонировали последовательность GUS+term Последовательность GUS была клонирована из вектора pBI121 (Jefferson et al., 1987) с использованием праймеров GUSanDir и GUSRev. 4 а) По сайтам XmaI-SpeI вставляли araterm IV б) По сайтам NarI-XmaI вставляли araterm I 5 а) По сайтам NarI-SpeI в конструкцию, получившуюся в пункте 3, клонировали вырезанный по этим же сайтам фрагмент конструкции получившейся в пункте 4. б) По сайтам PstI-AatII вставляли промоторы ELIP или 35Smin ELIP был амплифицировн с праймеров ElipDir и ElipRev. Мини промотор был собран из олигонуклеотидов 35SminPA1 и 35SminPA2. 6. По сайтам NarI-NheI в конструкцию, получившуюся в пункте 2, клонировали вырезанный по этим же сайтам фрагмент конструкции из пункта 5 Для получения конструкций с терминирующими элементами с обоих концов выполняли все пункты. Для получения терминаторов только с одного конца – пропускались пункты 2 и 6. Для создания контрольной конструкции, не содержащей регуляторных элементов, были выполнены только пункты 1, 3 и 5б. Выбранная нами стратегия клонирования позволила создать следующие комбинации используемых элементов (рис. 6), каждая из которых представляет научный интерес для исследования влияния новых элементов на трансгенную экспрессию: 80 Обе группы регуляторных элементов присутствуют в конструкции, при этом гены репортерных белков находятся под контролем сильных промоторов Обе группы регуляторных элементов присутствуют в конструкции, при этом гены репортерных белков находятся под контролем слабых промоторов Присутствует группа регуляторных элементов, находящаяся лишь с одной стороны от экспрессионной кассеты, при этом гены репортерных белков находятся под контролем сильных промоторов Присутствует группа регуляторных элементов, находящаяся лишь с одной стороны от экспрессионной кассеты, при этом гены репортерных белков находятся под контролем слабых промоторов Ни одной из групп исследуемых элементов нет в экспрессионном векторе - это контрольная конструкция Наличие четырех вариантов комбинации исследуемых растительных регуляторных элементов и промоторов разной силы, влияющих на ход экспрессии двух различных репортерных белков, позволило оценить степень влияния новых растительных терминаторов на уровень и вариабильность экспрессии белка, в экспрессионной кассете которого они содержатся. В дальнейшем, каждая из экспрессионных кассет была вырезана по фланкирующим сайтам рестрикции из вектора, использующегося для сборки кассет, и рядом последовательных клонирований перемещена непосредственно в вектор pART27 (Gleave, 1992), который в дальнейшем использовался для трансформации растительных тканей. 4.2.3 Генетическая трансформация растений Трансформация проводилась по той же методике, что и в первом эксперименте. Для каждой плазмиды было взято по 50 эксплантов, получены независимые регенеранты, которые в дальнейшем селектировались на среде с канамицином и проверены на наличие экспрессии гена GFP микроскопированием (табл. 3). Каждая линия так же гистохимически проверялась на наличие 81 экспрессии гена GUS, для первоначального подтверждения наличия экспрессионной кассеты в геноме растения. Все растения с подтвержденным наличием GFP давали положительный ответ и при гистохимическом анализе GUS. Рисунок 6. Схематичное изображение использованных в работе конструкций. Промоторы показаны в виде стрелок. Обозначения: 35S, промотор CaMV 35S; 35Smin, -49 to +8 участок промотора CaMV 35S, RuBisCO, промотор гена малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы томата (rbcS) c интроном, ELIP, укороченный по HindIII сайту промотор белка светового стресса ELIP; LB, RB -последовательности левой и правой границ Т-ДНК. Растения с детектируемой экспрессией GFP и GUS клонально размножались в условиях in vitro. По шесть клонов было адаптировано и перенесено в условия защищенного грунта. Все линии были проверены на отсутствие бактериальной контаминациии и на присутствие гена селективного маркера методом ПЦР (табл. 3). Так как перенос Т-ДНК осуществляется от правой к левой границы, то присутствие селективного маркера, расположенного у левой границы (LB), с высокой долей вероятности свидетельствует полноразмерной кассеты экспрессии. о успешном переносе 82 Таблица 3. Результаты трансформации листовых эксплантов табака конструкциями с растительными элементами. aКонструкции представлены на Рис.6 Векторa Экспланты Регенеранты pBI35S Экспрессия nptII+и Укоренившиеся GFP и GUS Vir- 50 42 29 29 29 50 31 18 18 17 50 44 33 27 20 pBIER 50 55 33 32 30 pBIERIIV 50 71 32 30 26 pBIERII 50 59 36 33 27 pBI35SI -IV pBI35SI I 4.2.4 Анализ уровня экспрессии репортерных генов Анализ уровня экспрессии GUS производился так же, методами флюориметрии. Исследование количества и уровня экспрессии репортерного белка GFP проводилось методом иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ (Enzyme immunoassay) это метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции ферментативной метки с последующей ее детекцией с помощью соответствующего субстрата, изменяющего свою окраску. Определение общего белка экстракта проводилось, как и в первом случае, по методике Бредфорд, но уже с использованием готовых наборов. Исходя из данных, представленных в таблице 4 (так же рис. 7), можно сказать, что влияние на экспрессию с промотора 35S в сторону ее увеличения оказывают лишь регуляторные элементы, находящиеся только с одной стороны от экспрессионной кассеты (в конструкции pBI35SI-IV), что согласуется с предыдущими результатами, для регуляторных элементов I и II. Однако в случае RuBisCO это влияние хорошо выражено в конструкциях и pBIERI-IV и pBIERII. Более того, при фланкировании регуляторными элементами экспрессионной кассеты с обеих 83 сторон, влияние на экспрессию под промотором RuBisCO сильнее, чем при расположении только выше по ходу транскрипции. Для промотора ELIP увеличение уровня экспрессии в конструкции pBIERII так же сильнее чем в pBIERI-IV, однако, влияние элементов выражено гораздо слабее, чем для RuBisCO. Ни одна из комбинаций элементов не влияет на экспрессию, находящуюся под 35Smin - минимальным промотором. Однако при анализе данных нельзя остановиться только лишь на сравнении сдвига средних между группами и игнорировать не менее важные параметры распределения признака, такие как меры рассеяния (дисперсия, размах) и меры формы (эксцесс и ассиметрия). Для математической подобных статистики, расчетов такие как необходимо метод применять ANOVA методы (ANALYSIS OF VARIANCE). Такой анализ и был проведен нами. Таблица 4. Активность GUS и уровень экспрессии GFP в трансгенных растениях табака. a Конструкции представлены на Рис.6 b Количество трансгенных растений табака с детектируемой активностью GUS и уровнем экспрессии GFP. c Средняя активность GUS в нмоль 4- MU ·мин-1·мг общего растворимого белка-1 d Средний уровень экспрессии GFP в мкг· мг общего растворимого белка -1 Количество трансгенных линийb Количество проанализированных растений pBI35S 29 174 pBI35SI-IV 17 102 pBI35SII 20 120 7.19 1.21 pBIER 30 180 6.07 0.56 pBIERI-IV 26 156 pBIERII 27 162 Вектор a Активность GUSc Уровень экспрессии GFPd 6.51 1.31 35Smin ELIP 7.30 5.54 7.95 35S RuBisCO 2.47 0.96 1.30 84 A Б Рисунок 7. Влияние АT-элементов на экспрессию GFP и активность GUS в трансгенных растениях табака. (A) Средний уровень экспрессии eGFP в мкг на мг общего растворимого белка ± стандартная ошибка (SE); (Б) Средняя активность GUS в нмоль 4-метил-умбеллиферона в мин на мг общего белка с ± стандартной ошибкой (SE). Статистически достоверные отличия между группами и контролем отмечены одной звездочкой (p≤0,05) или двумя (p≤0,1). 85 4.3 Статистическая обработка результатов Наиболее адекватным методом для решения нашей задачи было проведение двухфакторного иерархического дисперсионного анализа, где в качестве первого фиксированного фактора выступало наличие изучаемых элементов в конструкции, а в качестве второго (случайного) - возможные различия между линиями с одной экспрессионной конструкцией. Принятие во внимание второго фактора позволяет оценить влияние изучаемых нами регуляторных элементов на экспрессию репортерных генов под разными промоторами, нивелируя влияние места встраивания экспрессионной кассеты и ее копийности, т.к. все это включает в себя анализ данных в качестве влияющего фактора. Такой подход позволяет обойтись без дополнительных экспериментов, таких, например, как Саузерн блот. Более того дисперсионный анализ позволяет изучить влияние первых двух факторов на фоне повторяемости данных - ошибки измерения. В нашем случае причиной этой вариабельности стало различие между клонами одной линии. Дисперсионный анализ, основы которого были разработаны Фишером в 1920-1930 гг., позволяет устанавливать не только степень одновременного влияния на признак нескольких факторов и каждого в отдельности, но также их суммарное влияние в любых комбинациях и дополнительный эффект от сочетания разных факторов. Дисперсию измеряемого признака разлагают на независимые слагаемые, каждое из которых характеризует влияние того или иного фактора или их взаимодействия. Последующее сравнение таких слагаемых позволяет оценить значимость каждого изучаемого фактора, а также их комбинации. Разумеется, и в этом случае остается масса неучтенных факторов, но, во-первых, методика позволяет оценить долю их влияния на общую изменчивость признака, а вовторых, исследователь обычно имеет возможность выделить несколько ведущих факторов и исследовать именно их воздействие на изменчивость признаков. Дисперсионный анализ – анализ изменчивости признака под влиянием каких-либо контролируемых переменных факторов в зарубежной литературе именуется 86 ANOVA – «Analisis of Variance». Вариативность, обусловленная действием исследуемых переменных и их взаимодействием, соотносится со случайной вариативностью. Показателем этого соотношения является F – критерий Фишера. В иерархической модели (nested ANOVA) подразумевается, что один фактор – основной, а внутри основного фактора каждый уровень может быть разделен на подуровни главного фактора. В формулу расчета критерия F вводят оценки дисперсий, и, следовательно, этот метод относится к разряду параметрических. Чем в большей степени вариативность признака обусловлена исследуемыми переменными или их взаимодействием, тем выше эмпирические значения критерия F. Основная идея дисперсионного анализа состоит в сравнении групповой дисперсии, порождаемой воздействием фактора и остаточной дисперсии, обусловленной случайными причинами. Если различие между этими дисперсиями значимо, то фактор оказывает существенное влияние на измеряемую величину. В этом случае средние наблюдаемых значений на каждом уровне также значимо различаются. Математическая модель, на которой основано вычисление критических значений F, предполагает следующее: 1.Каждая выборка независима от остальных выборок. 2.Каждая выборка случайным образом извлечена из исследуемой совокупности. 3.Совокупность нормально распределена. 4.Дисперсии всех выборок равны. При существенном нарушении хотя бы одного из этих условий нельзя пользоваться дисперсионным анализом. В этом случае надо использовать его непараметрический аналог. 4.3.1 Ограничения дисперсионного анализа и подготовка данных Дисперсионный (установлено), что анализ следует распределение применять тогда, результативного когда известно признака является 87 нормальным. Однако полученные нами данные имели распределение далекое от нормального и сильно отличались друг от друга. В связи с этим в целях сглаживания распределения они были прологарифмированы по основанию 10 и дальнейшие расчеты и анализы проводились уже для преобразованных данных. Так же для уравнивания числа значений случайным образом были отобраны линии, данные по которым далее не принимали участие в обработке (см. ниже). В результате этих преобразований для первого эксперимента было проанализировано только по 4 линии из каждой конструкции. Для проверки нормальности распределения следует провести расчеты ассимметрии и эксцесса по следующим формулам: A = Σ (xi – xср)3 / n3 mA= √6/n E = (Σ (xi – xср)4 / n4 ) - 3 mE= 2√6/n , где А и Е – ассимметрия и эксцесс, а m A репрезентативности. и mE – их ошибки После подстановки значений не должно оказаться так, чтобы ассимметрия и эксцесс превышали более чем втрое свои ошибки репрезентативности, в противном случае распределение нельзя считать нормальным. Ассиметрию и эксцесс рассчитывается по модулю. Так же производился подсчет дисперсии ассиметрии (Da) и эксцесса (De) Da= (6*(n-1))/((n+1)*(n+3)) De = (24*n*(n-2)*(n-3))/((n+1)*(n+1)*(n+3)*(n+5)) Ищем соотношение 3*КОРЕНЬ(Da) –теоретическая ассиметрия 5*КОРЕНЬ(De)–теоретический эксцесс 88 Производим сопоставление величин: |A| <= 3*КОРЕНЬ(Da) |E| <= 5*КОРЕНЬ(De) При соблюдении этого требования, распределение можно считать нормальным. Все полученные в результате данные представлены в таблице 5. Из таблицы 5 видно, что для всех популяций описанные выше требования соблюдены. Например, для синтетических элементов |A|=0,133595, что меньше чем 3*КОРЕНЬ=0,65709, а |E|=0,40403, меньше чем 5*КОРЕНЬ=2,101393. Таблица 5. Расчеты ассимметрии и эксцесса. Растительные элементы Синтетически е элементы 35S Rub 35Smin Elip А 0,133595 -0,32106 -0,072463 0,189716 0,249603 Е -0,40403 0,206536 0,439709 0,175867 -0,31314 3*корDa 0,65709 0,369732 0,331626 0,369732 0,337877 5*корDe 2,101393 1,216768 1,094122 1,216768 1,114305 mA 0,223607 0,124035 0,111111 0,124035 0,113228 mE 0,447214 0,248069 0,222222 0,248069 0,226455 Более того, для проверки гипотезы соответствия распределения нормальному используем так же и один из двух критериев: либо КолмогороваСмирнова либо Шапиро-Уилка. Правило, появившееся в результате сравнения вероятностей ошибок второго рода, говорит о том, что для «маленьких» выборок эта ошибка меньше у критерия Шапиро-Вилка, а для больших – у критерия Колмогорова-Смирнова. При этом в маленьких выборках предполагается меньше 60 наблюдений, в больших – больше 60. В данном случае будет использоваться второй критерий, это связано с тем, что число наблюдений для каждой из конструкций значительно превышает 60. Для выборки соответствующей 89 популяции с синтетическими элементами P-value равно 0,062, что выше пороговой отметки уровня значимости - принимаем гипотезу о нормальном распределении. Для растительных элементов так же сначала проверили на соответствие нормальным распределениям значения внутри групп с одинаковым промотором. Результаты анализа представлены в следующей таблице. Таблица 6. Проверка на нормальность распределения внутри групп. Синтетически е элементы Промотор группы Уровень значимост и (p) Растительные элементы 35S 35S RUB 35Smi n ELIP 0,062 0,07 5 0,08 6 >0,15 0,05 8 Как видно из таблицы 6, все распределения выборок с определенным уровнем значимости (p>0,05) можно считать нормальными. Наименьшую значимость имеет гипотеза о нормальности, для результатов опыта, в котором репортерный белок находился под промотором ELIP. В связи с тем, что для этой группы значимость находится на пределе принятого нами уровня достоверности, анализ распределения был проведен так же и внутри подгрупп, как для вышеозначенной группы, так и для остальных, для повышения точности выводов. Проведенные расчеты показали, что распределения внутри всех 12 подгрупп можно читать нормальными с уровнем значимости p>0,15, что является достаточно высоким показателем. Для растениий с синтетическими элементами, нормальность внутри подгрупп проверяем другим тестом - критерием РайанаДжойнера (идентичен тесту Шапиро-Уилка), т.к. в этом случае в каждой отдельной популяции по 24 растения. Уровень значимости здесь во всех случаях больше 0,100. В результате осуществленного анализа, было принято решение считать распределение наших данных нормальным и соответствующим дальнейшему исследованию методом ANOVA. 90 Дисперсионный анализ требует также, чтобы между комплексами соблюдалось равенство дисперсий. Предположение об однородности дисперсии в различных группах является важным для дисперсионного анализа. В литературе по этому вопросу предлагается (и доказана правомочность предложения) удовлетворять такое требование уравниванием числа значений в каждом из комплексов, что и было сделано нами. Кандидаты на удаление выбирались случайным образом при помощи генератора случайных чисел. Не смотря на это для проверки эффективности предыдущего шага, использовали критерии Левена и Бартлетта. Критерий Левена (однородности дисперсии): Для каждой зависимой переменной, проводится дисперсионный анализ абсолютных отклонений наблюдаемых значений от соответствующих средних по группам. Если критерий Левена является статистически значимым, гипотеза об однородности дисперсии должна быть отвергнута. Критерий Бартлетта – статистический критерий, позволяющий проверять равенство дисперсий нескольких (двух и более) выборок. Нулевая гипотеза предполагает, что рассматриваемые выборки получены из генеральных совокупностей, обладающих одинаковыми дисперсиями. Критерий Бартлетта является параметрическим и основан на дополнительном предположении о нормальности выборок данных. Поэтому перед применением критерия Бартлетта рекомендуется выполнить проверку нормальности. Неспособность удовлетворить данному допущению приведёт к большим остаткам, поскольку остаток – это часть значения данных, которая не объясняется эффектами аддитивного фактора. Это в свою очередь приведёт к большому среднему квадрату остатка, который даст большие стандартные ошибки средних значений, и поэтому потребуются бóльшие различия между средними величинами факторов, чтобы они были признаны значимыми. Проверку однородности дисперсий проводили сначала при сравнении подгрупп линий с идентичными экспрессионными кассетами между собой внутри группы промотора (табл. 7). А в дальнейшем, для большей уверенности в 91 однородности дисперсий, сравнивали их для разных линий, внутри подгрупп (табл. 8, 9). Таблица 7. Проверка на однородность и равенство дисперсий. Растительные элементы Тест Бартлета Тест Левена Синтетически 35S RUB 35Smin ELIP е элементы 0,067 0,129 0,420 0,483 0,038 0,213 0,176 0,406 0,517 0,066 Таблица 8. Сравнение однородности дисперсий разных линий внутри подгрупп для популяций с растительными элементами. 35S II I-IV К RUB II I-IV К 35Smin II I-IV К ELIP II I-IV 0,276 0,046 0,773 0,003 0,002 0,011 0,114 0,781 0,664 0,006 0,120 0,04 0,319 0,059 0,933 0,160 0,146 0,100 0,253 0,648 0,955 0,153 0,338 0,118 К Тест Бартлета Тест Левена Таблица 9. Сравнение однородности дисперсий разных линий внутри подгрупп для популяций с синтетическими элементами. Тест Бартлета Тест Левена K GeI GeII GeI-I GeII-II 0,046 0,254 0,552 0,354 0,152 0,05 0,087 0,713 0,498 0,062 В том случае, когда значение p-value превышает уровень значимости (для большинства подобных исследований - 0,05), дисперсии принимаются принадлежащими к одной выборке. Как видно из таблицы 8, для популяций содержащих растительные элементы все три выборки с разным расположением элементов (контроль, II и I-IV), без учета влияния места встройки экспрессионной кассеты и других, не контролируемых нами условий, принадлежат к одной выборке с весьма высоким уровнем значимости. Для растений с синтетическими элементами ситуация аналогична. При учете влияния случайных факторов критерий Левина все еще говорит об однородности дисперсий. Тем не менее, видно, что по тесту Бартлета уровень значимости однородности дисперсий внутри 92 линий, в некоторых случаях ниже порогового. Однако этот тест очень чувствителен к отклонению от нормальности выборки, так что им, в данном случае, позволяется пренебречь. К тому же, важно понимать, что предположение однородности дисперсии не так критично, как другие предположения дисперсионного анализа, в частности, в случае сбалансированных планов (с равным числом наблюдений n, как в нашем случае). Более того, описанные ниже критерии сами по себе не обязательно являются очень устойчивыми (робастными) (например, в работе Glass and Hopkins, 1996, стр. 436, эти критерии называются "фатально недоработанными"; см. также описание этих критериев). В то время как сама техника дисперсионного анализа является "робастной". Этот термин, используемый статистиками, означает, что данные допущения могут быть в некоторой степени нарушены, но, несмотря на это, технику можно использовать. 4.3.2 ANOVA После проведенного анализа данных на правомочность применения к ним метода ANOVA, было проверено непосредственно само влияние элементов на экспрессию генов (табл. 10). В данном случае фактор 1 – это данные по конструкциям, он фиксирован. Фактор 2 – по линиям внутри конструкций, это случайный фактор. Повторяемость внутри линий – 6 значений (это клоны). Идея метода основана на сравнении величин дисперсий, (систематическая, или порожденных межгрупповая влиянием дисперсия) внешнего и фактора дисперсии DA выборки, освобожденной от воздействия внешнего фактора DR (остаточная, или внутригрупповая дисперсия). Систематическая дисперсия определяется как дисперсия между средними каждой из k групп, соответствующих различным уровням фактора. Эта дисперсия характеризует степень разброса усредненных по группам значений, ее величина зависит лишь от степени влияния фактора на изменение случайной величины. 93 Таблица 10. Двухфакторный дисперсионный анализ (two-way ANOVA) Уровень значимости помечен * - 0.01, ** -0.001,*** - примерно 0. SS - сумма квадратов разностей между средним арифметическим и значениями выборки по каждому виду дисперсии, умноженные на весовые коэффициенты, равные числу объектов в группе; df - число степеней свободы по каждому виду дисперсии; MS - среднее значение суммы квадратов разностей по каждому виду дисперсии, определяемое как отношение SS/df; F value - значение статистики Фишера (F статистики) для MS, отношение суммы квадратов к числу степеней свободы; p (Pr>F) значение уровня значимости для рассчитанного значения статистики F. Если величина F увеличивается, то значение p должно уменьшаться. Степени 35Svir MF (фактор 1) межгр. NF in MF (фактор 2) межподгруп. внутри групп Residuals (остаточная) внутри подгрупп GUSElip MF (фактор 1) межгр. NF in MF (фактор 2) межподгруп. внутри групп Residuals (остаточная) внутри подгрупп MF (фактор 1) межгр. NF in MF (фактор 2) межподгруп. внутри групп Residuals (остаточная) внутри подгрупп MF (фактор 1) межгр. NF in MF (фактор 2) межподгруп. внутри групп Значение статистики Pr(>F) (уровень (df) 4 (SS) 2,6922 (MS) 0,673 (F value) 6,049 гипотезы) 0,004 * 15 1,6689 0,1113 6,804 0,000 *** 100 1,6352 0,0164 Степени Сумма Средн. Значение статистики Pr(>F) (уровень свободы квадратов квадр. Фишера (оценка дисперсии) значимости нулевой (df) 2 (SS) (MS) 1,827831 0,913915 (F value) 5,487949 гипотезы) 0,005966 * 75 12,48985 0,166531 4,21174 0 *** 390 15,42052 0,03954 Значение статистики Pr(>F) (уровень Сумма Средн. свободы квадратов квадр. Фишера (оценка дисперсии) значимости нулевой (df) 2 (SS) (MS) 0,595307 0,297653 (F value) 1,525797 гипотезы) 0,227807 48 9,363868 0,195081 5,250498 0 255 9,474443 0,037155 Значение статистики Pr(>F) (уровень Степени GFP35S Средн. свободы квадратов квадр. Фишера (оценка дисперсии) значимости нулевой Степени GUS35Smin Сумма Сумма Средн. *** свободы квадратов квадр. Фишера (оценка дисперсии) значимости нулевой (df) 2 (SS) (MS) 6.533478 3.266739 (F value) 5.109748 гипотезы) 0.009731 * 48 30.68712 0.639315 10.21944 0 *** 94 Residuals (остаточная) 255 внутри подгрупп Степени GFPRub 15.95247 0.062559 Сумма Средн. Значение статистики Pr(>F) (уровень свободы квадратов квадр. Фишера (оценка дисперсии) значимости нулевой MF (фактор 1) межгр. NF in MF (фактор 2) (df) 2 (SS) (MS) 12,20841 6,104207 (F value) 10,82091 гипотезы) 0 *** 75 42,30841 0,564112 7,632192 0 *** 390 28,82576 0,073912 межподгруп. внутри групп Residuals (остаточная) внутри подгрупп Остаточная дисперсия определяется как совокупная внутригрупповая дисперсия, причем в каждой группе наблюдаемые значения варьируются относительно своей групповой средней. Исчисление этой дисперсии исключает влияние рассматриваемого фактора, ее величина определяется лишь погрешностью измерений и влиянием других, неучтенных факторов. Если систематическая дисперсия соизмерима с остаточной, то и влияние фактора нельзя признать значимым, ибо объясняемое им разнообразие поведения случайной величины соизмеримо с разнообразием, порожденным неточностью измерений. Другое дело, если объясненная наличием фактора часть дисперсии существенно больше, чем ее часть, порожденная случайными помехами. Решение о значимости воздействия внешнего фактора принимается на основании сравнения наблюдаемого и теоретического значений F-статистики Фишера – Снедекора. Выдвигается гипотеза H0, состоящая в том, что рассматриваемый фактор не оказывает существенного влияния на изменение случайной величины (по существу, гипотеза об отсутствии статистической разницы между групповыми средними). В качестве статистик выбираются частные F1 MS межгр MS межподгр , F2 MS межподгр MSвнутригр Справа от F-отношения указывается уровень значимости указанной Fстатистики. Если значимость F-статистики близка к нулю, есть основание принять 95 гипотезу Н1 - фактор значимо влияет на конечный результат (конкурирующая с H0 гипотеза). В данном случае значимость F1 для обеих конструкций с 35S и для ELIP меньше 0.01 – значит, с уровнем значимости 0.01 для обратного предположения, верна гипотеза о значимости факторов в этих двух случаях. Для RuBisCO уровень значимости практически равен нулю, т.е. вероятность ошибочно отклонить нулевую гипотезу об отсутствии различий практически равна нулю, что говорит о сильном влиянии элементов на этот промотор. А для 35Smin уровень значимости нулевой гипотезы гораздо больше 0,05, что приводит нас к выводу об отсутствии влияния использованных элементов в любом из положений на уровень экспрессии репортерного белка под этим промотором. Мы можем прийти к таким же заключениям, и принять или отклонить гипотезу Н1, основываясь на том, большее или меньшее значение имеет F, по сравнению с Fкрит (значение которого можно взять из таблицы для Fраспределения с уровнем значимости 0,05). Из полученных данных (табл. 10) можно сделать вывод о том, что, безусловно, наибольший эффект влияния исследуемых элементов наблюдается для сильного растительного промотора RuBisCO при использовании растительных регуляторных элементов. Однако данный анализ не может сказать нам, какое из расположений элементов влияет на уровень экспрессии, и в какую сторону. Для выяснения этих обстоятельств необходимо провести дальнейшие пост-хок тесты. Имеет смысл указать еще и доверительный интервал для разности средних, дающий возможность судить о величине различий. Более того, доверительные интервалы вполне могут заменить статистические критерии и при оценке статистической значимости различий. Дело в том, что истинная разность средних может находиться в любой точке доверительного интервала. Поэтому, если полученный при работе с выборками доверительный интервал содержит нулевое значение, это значит, что истинная разность средних также может быть равна нулю. Следовательно, мы не имеем оснований отвергнуть нулевую гипотезу. В свою очередь, если доверительный интервал не содержит нуля, мы можем с 96 заданной уверенностью отказаться от нулевой гипотезы и считать различия статистически значимыми Критерий Даннета строит доверительный интервал для разности средних каждого из опытов, сравнивая их с контролем. Для него мы как раз учитываем, проходит ли доверительный интервал для разности средних через нулевую разность. Если в интервал попадает нулевая разность, это значит, что разницы между контролем и опытом нет. Из полученных данных видно, что на экспрессию под промотором RUBISCO влияют оба расположения элементов, как с одной, так и с обеих сторон. На ELIP влияние оказывается лишь при фланкировании экспрессионной кассеты элементами с обеих сторон (табл.11). Для 35S при 95% интервале различий выявлено не было, однако, несмотря на это, согласуя действия с тем, что результаты дисперсионного анализа показали наличие существенного различия, мы увеличили доверительный интервал до 90%. После этого стало видно, что для этого случая влияние оказывает расположение элемента лишь с одной стороны. В случае синтетических элементов для GeI-I так же был использован 90% интервал, т.к. значения для 95% лишь незначительно перекрывали нулевую отметку (табл.12). Они оказывают влияние на экспрессию с 35S промотора во всех случаях кроме GeII-II. Однако сразу видно, что наибольший эффект заметен при расположении этих последовательностей «выше по течению» от экспрессионной конструкции, что подтверждает наши первичные предположения. Тогда как статистические тесты значимости показывают нам вероятность того, что экспериментальные математического ожидания, результаты измерения отличаются величины от случайного эффекта показывают относительные величины экспериментального воздействия, говорят об его силе. 97 Таблица 11. Доверительный интервал для разности средних. Данные по экспрессии в каждом эксперименте в сравнении с контролем. LL-нижний лимит; DM-разность средних; UL-верхний лимит. Растительные элементы 35S-GFP 90% II 35S-GFP 90% I-IV Rubisco-GFP 95% II Rubisco-GFP 95% I-IV Elip-GUS 95% II Elip-GUS 95% I-IV LL DM UL -0,1273 0,0923 0,3118 -0,4729 -0,2534 -0,0338 -0,5873 -0,3956 -0,2039 -0,3858 -0,1941 -0,0024 -0,2296 -0,1254 -0,0212 -0,0908 0,0134 0,1175 Таблица 12. Доверительный интервал для разности средних. Данные по экспрессии в каждом эксперименте в сравнении с контролем. LL-нижний лимит; DM-разность средних; UL-верхний лимит. Синтетические элементы GeI (95% инт) LL DM UL 0,0856 0,2068 0,3280 GeII (95% инт) 0,2287 0,3499 0,4711 GeI-I (90% инт) 0,099 0,11674 0,22362 GeII-II (95% инт) -0,1945 -0,0733 0,0478 Величины эффектов особенно важны, т.к. они позволяют нам сравнивать размеры экспериментального влияния в нескольких разных опытах. И хотя отличие между опытом и контролем может быть измерено в процентах, такие выкладки часто сложно истолковать и практически невозможно использовать для четкой и ясной интерпретации в свете экспериментальных парадигм. Итак, мы узнали, какое расположение элементов воздействует на некоторые из экспрессионных кассет. Естественно, нас заинтересовала величина эффекта, которую вычисленные нами факторы оказывают на уровень экспрессии используемых в опыте белков. Разницу между опытом и контролем вполне возможно проанализировать через оценку величины эффекта фактора. Для этого применяются следующие алгоритмы. 98 Для начала можно оценить величину эффекта для фактора в целом. ^ Таблица 13. Фактор f . Позволяет оценить величину эффекта для фактора в целом. <0.1 слабый эффект; 0.1-0.4 средний эффект; >0.4 сильный эффект. f ^/ кассета MF (фактор 1) межгр. NF in MF (фактор 2) межподгруп. внутри групп Синтетически Растительные элементы 35S-GFP 35SminGUS е элементы Rub-GFP Elip-GUS 35S-GUS 0,20 0,07 0,25 0,17 0,22 1,24 0,84 1,05 0,73 1,30 Из таблицы 13 видно, что наибольший эффект фактор производит на гены, находящиеся под промотором Rubisco (0,25), чуть менее на 35S (0,2), еще слабее ^ эффект для ELIP (0,17). Для 35Smin значение f указывает на очень слабый эффект, что говорит о практически полном отсутствии влияния в этом случае и полностью ^ согласуется с результатами иерархического f дисперсионного анализа. Для 35S промотора, влияние регуляторных элементов вирусного и бактериального происхождения на экспрессию GUS практически идентичны таковым для этого же промотора, но с растительными элементами и другим репортерным геном. На этом примере видно, что разработанные нами растительные регуляторные единицы могут оказывать влияние сравнимое вирусными элементами и, таким образом, подтверждают свою эффективность. Для оценки влияния разного расположения элементов можно использовать дельту Кохена (оценивает величину эффекта - силу влияния фактора). Дельта Кохена – величина эффекта, используемая для обнаружения стандартизированной разницы между двумя средними (в данном случае опыта и контроля). Это один из наиболее подходящих способов для сравнения двух средних. У дельты Кохена есть несколько преимуществ над другими методами измерения силы эффекта. С одной стороны растущая популярность этого метода позволяет принимать дельту за стандартизированную величину. И таким образом, 99 её подсчеты делают возможным немедленное сравнение полученных значений с другими исследованиями. С другой стороны, предположение о том, что величины эффекта менее 0.2 можно считать незначительными, около 0.5 средними, а после 0.8 большими, позволяет нам оценить исследуемые эффекты по вышеописанной шкале. Более того, дельта показывает не только силу влияния, но и его направление. Хотя было написано исчерпывающее количество статей о детализированных методах подсчета размеров эффекта, по крайней мере для некоторых биологических расчетов и, в частности, для многих исследователей, необходим более простой подход. Дельту можно посчитать как разницу средних на объединенное стандартное отклонение (pooled standard deviation) (Thalheimer et al., 2002). В сущности, величина эффекта это и есть разница между двумя средними (например опыт минус контроль) поделенная на стандартное отклонение при разных условиях. Это деление на стандартное отклонение позволяет нам сравнить величины эффектов всего эксперимента. d Cohen X1 - X 2 S pooled Где d(Cohen) –величина эффекта X -среднее S-стандартное отклонение Подсчет объединенного следующей формуле S pooled (n1 1) s12 (n2 1) s2 2 n1 n2 S-стандартное отклонение n-число объектов измерения стандартного отклонения производится по 100 Дельта Кохена / d(Cohen)/. Таблица 14. Дельта Кохена d(Cohen) для синтетических элементов. <0.2 слабый эффект; 0.2-0.8средний эффект; >0.8 сильный эффект. GeI GeII GeI-I GeII-II 0,488868 0,807277 0,279423 -0,19137 Таблица 15. Дельта Кохена d(Cohen) для растительных элементов. <0.2 слабый эффект; 0.2-0.8средний эффект; >0.8 сильный эффект. элемент/кассета 35S-GFP Rubisco-GFP Elip-GUS II -0,2251 1,03426 0,49779 I-IV 0,69411 0,47513 -0,053715 Из данных таблиц (табл. 14 и 15) мы видим, что наибольшее влияние оказывает расположение растительных элементов с двух сторон на сильный растительный промотор RuBisCO. Однако влияние в остальных случаях с подобными последовательностями, учитывая стандартные придержки, так же можно считать значительным. Использование синтетических элементов влияет, в основном, при их расположении лишь с одной стороны от экспрессионной кассеты, особенно в случае GeII. Можно отметить также и некоторое влияние в случае GeI-I. Опять же, сразу видно, что в самом эффективном положении, влияние синтетических последовательностей вполне сравнимо с растительными, в такой же ориентации. Для конструкции GeII d(Cohen)≈0.8, а для растительных элементов I-IV d(Cohen)≈0.7. Так же одним из наиболее часто встречающихся методов определения силы эффекта для дисперсионного анализа является вычисление η2 (Эта в квадрате). η2 это доля общей дисперсии приписываемая эффекту. Эта является довольно необъективной оценкой при малом количестве данных, однако, по мере увеличения их количества, смещение оценки снижается. 101 2 SS м SSо SSм – межгрупповая сумма квадратов разностей SSо -общая сумма квадратов разностей Эта имеет свои придержки 0,01-слабый эффект 0,06-средний 0,14 сильный 2 сила эффекта элементов на экспрессионные кассеты. Таблица 16. Эта в квадрате (η2) для синтетических элементов. ≤0,01 слабый эффект; ≈0,06 средний эффект; ≥0,14 сильный эффект. GeI GeII GeI-I GeII-II 0,24 0,45 0,096 0,01 Таблица 17. Эта в квадрате (η2) для растительных элементов. ≤0,01 слабый эффект; ≈0,06 средний эффект; ≥0,14 сильный эффект. элемент/кассета 35S-GFP Rubisco-GFP Elip-GUS II 0,01 0,21 0,06 I-IV 0,11 0,05 0 Выводы, которые можно сделать из полученных расчетов (табл. 16 и 17) в целом согласуются с данными, полученными при подсчете дельты Кохена. Однако в данном случае сравнивать эффект влияния синтетических и растительных элементов напрямую не рекомендуется, в связи с достаточно сильным различием репрезентативности выборок. Интересным будет так же проследить, как меняется компонент дисперсии случайных факторов. В нашем случае это принадлежность исследуемого образца к определенной линии и клону, при использовании регуляторных элементов (табл. 18 и 19). 102 Таблица 18. Вариационная компонента уровней экспрессии 35S-GUS с синтетическими элементами. VC вариационная компонента ; NF-вариационная компонента между линиями; RES-вариационная компонента между клонами. VC NF% RES% pBIG 56,8 43,2 pBIGeI 53,06 46,94 pBIGeII 41,99 58,01 pBIGeI-I 89,62 10,37 pBIGeII-II 27,69 72,31 Таблица 19. Вариационная компонента уровней экспрессии RuBisCO-GFP, ELIP-GFP, 35S-GUS и 35SminGUS с растительными элементами. NF-вариационная компонента между линиями; RES-вариационная компонента между клонами. NF; % RES; % NF; % RuBisCO RES; % ELIP pBIER 60.95 39,05 pBIER 37.09 62.91 pBIERI-IV 63.71 36,29 pBIERI-IV 34.14 65.86 pBIERII 26.00 74,00 pBIERII 32.78 67.22 35S 35Smin pBI35S 55.89 44.11 pBI35S 39.05 60.95 pBI35SI-IV 59.13 40.87 pBI35SI-IV 44.53 55.47 pBI35SII 64.87 35.13 pBI35SII 40.22 59.78 Видно, что распределения компоненты вариации между нефиксированными факторами для 35S без регуляторных элементов практически идентичны со вторым опытом 2013 (NF pBIG=56,8%, NF pBI35S=55.89%), несмотря на то, что проводилось измерение экспрессии двух разных белков, двумя разными методами. Эти данные дополнительно, хотя и косвенно, подтверждает чистоту экспериментов и методики численного анализа. Из этих таблиц также видно, что для сильных промоторов, в особенности для растительного Rubisco, большая составляющая компоненты дисперсии 103 приходится на различие данных по отдельным линиям, тогда как для слабых около 60% приходится на межклональную разницу. Это говорит о том, что для сильных промоторов более важным является место встраивания экспрессионной кассеты, её окружение и копийность, причем для растительного промотора эти условия воздействуют в большей степени (в данном случае мы сравниваем главным образом контрольные популяции). В то время как для слабых промоторов большую вариабельность привносит различие в уровне экспрессии между клонами одной линии, которая в свою очередь зависит от множества факторов, таких как освещенность, варьирование содержания солей и микроэлементов в почве, её влажность, наличие или отсутствие заражений (как вирусами, так и вредителями) отдельных растений и т.д. Влияние факторов характерных для определенных линий для 35Smin составляет около 40%, а для ELIP и того меньше - около 30%. Видимо, при экспрессии на минимальном уровне, влияние окружения не так сильно. Однако можно отметить, что хотя для контрольной конструкции содержащей сильный растительный промотор Rubisco, принадлежность к определенной линии является наиболее важным компонентом для уровня экспрессии репортерного белка, при расположении используемых нами элементов с двух сторон от экспрессионной кассеты позволяет в два раза снизить уровень вариабельности между линиями, а значит стабилизировать экспрессию под этим промотором, делая ее менее зависимой от точки инсерции конструкции. Для промотора ELIP такое влияние незначительно, что, видимо, связано с тем, что в этом случае влияние факторов принадлежность к линии изначально имеет низкое значение. На вирусные промоторы такого влияния примененные элементы не оказывают. 104 5. Выводы 1 Синтетические элементы, созданные на основе терминаторов генов агробактериального nos и вирусного 35S CaMV происхождения усиливают экспрессию гетерологичных генов в растениях под сильным вирусным промотором 35S CaMV при локализации перед промотором. 2 Показано, что терминирующих расположение транскрипцию растительных (ATs), при любом ДНК-элементов расположении относительно кассеты экспрессии оказывает более сильное влияние на экспрессию генов под растительными промоторами по сравнению с вирусными. Увеличение уровня экспрессии прямо коррелирует с «силой» промотора как растительного, так и вирусного происхождения. 3 Показано, что расположение ДНК-элементов как с одной, так и с обеих сторон экспрессионной кассеты усиливает экспрессию генов с сильного растительного промотора RuBisCO. Экспрессию с сильного вирусного промотора 35S CaMV усиливают ДНК-элементы расположенные только с 5'-конца гена. На слабые промоторы 35S min и ELIP влияние элементов менее выражено. 4 Установлено, что растительные ДНК-элементы, терминирующие транскрипцию (ATs), при размещении с обеих сторон экспрессионной кассеты снижают позиционный эффект и эффект копийности до двух раз при экспрессии, под контролем сильного растительного промотора RuBisCO. 105 Автор выражает благодарность сотрудникам станции искусственного климата «Биотрон» филиала ИБХ РАН за помощь в проведении исследований и за многочисленные ценные советы. Автор выражает благодарность коллективу лаборатории биоинформатики Института математических проблем биологии РАН, в частности Назиповой Нафисе Наиловне результатов. за помощь в проведении математической обработки 106 6. Список литературы 1. Abranches, R., Shultz, R.W., Thompson, W.F., Allen, G.C., 2005. Matrix attachment regions and regulated transcription increase and stabilize transgene expression. Plant Biotechnol J. 3(5): 535-43 2. Allen, G.C., Hall, G. Jr., Michalowski, S., Newman, W., Spiker, S., Weissinger, A.K., Thompson, W.F., 1996. High-level transgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment region from tobacco. Plant Cell 8: 899– 913 3. Allen, G.C., Hall, G.E., Jr., Childs, L.C., Weissinger, A.K., Spiker, S., Thompson, W.F., 1993. Scaffold attachment regions increase reporter gene expression in stably transformed plant cells. Plant Cell 5: 603-613 4. Allison, D.S. & Hall, B.D. 1985 Effects of alterations in the 3′ flanking sequence on in vivo and in vitro expression of the yeast SUP4-o tRNATyr gene. EMBO J., 4, 2657–2664. 5. Aufsatz, W., Mette, M.F., Van der Winden, J., Matzke, A.J.M., Matzke, M., 2002. RNA-directed DNA methylation in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 16499–16506. 6. Bakhsh A, Rao A.Q, Shamim Z and Husnain T (2011) A minireview: Rubisco small subunit as a strong green tissue specific promoter Arch. Biol. Sci., Belgrade, 63 (2), 299-307. 7. Barampuram, S., Zhang, Z.J., 2011. Recent advances in plant transformation. Methods Mol Biol. 701: 1-35. 8. Baulcombe, D., 2004. RNA silencing in plants. Nature 431: 356–363. 9. Benfey PN, Chua N-H (1990) The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants. Science 250: 959–966 10.Bennet, J., 1993. Genes for crop improvement. In: Setlow J.K. (ed.), Genetic Engineering – Volume 15. Plenum, New York: 165–189. 11.Bevan, M., 1984. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721. 12.Bevan, M., Barnes, W.M. end Chilton, M.-D., 1983a. Structure and transcription of the nopaline synthase gene region of TDNA. Nucl. Acids Res. 11: 369-385. 13.Bevan, M.W., Flavell, R.B., Chilton, M.-D., 1983b. A chimaeric antibiotic resistance gene as a selectable marker for plant cell transformation. Nature 304: 184-187. 14.Bhat, S.R. and Srinivasan, S., 2002. Molecular and genetic analyses of transgenic plants: considerations and approaches. Plant Sci. 164: 673–681. 15.Bidney, D., Scelonge, C., Martich, J., Burrus, M., Sims, L., Huffman, G., 1992. Microprojectile bombardment of plant tissues increases transformation frequency by Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol Biol 18: 301–313. 16.Binet, M.-N., Weil, J.-H., Tessier, L.-H., 1991. Structure and expression of sunflower ubiquitin genes. Plant Mol. Biol. 17: 395–407. 107 17.Birch, R.G., 1997. Plant transformation: problems and strategies for practical application. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 297–326. 18.Bourdon, V., Harvey, A., Lonsdale, C.M., 2001. Introns and their positions affect the translational activity of mRNA in plant cells. EMBO Rep. 2: 394–398. 19.Breyne, P., Van Montagu, M., Depicker, A., and Gheysen, G., 1992. Characterization of a plant scaffold attachment region in a DNA fragment that normalizes transgene expression in tobacco. Plant Cell 4: 463-471 20.Brouwer, C., Bruce, W., Maddock, S., Avramova, Z., Bowen, B., 2002. Suppression of transgene silencing by matrix attachment regions in maize: a dual role for the maize 5' ADH1 matrix attachment region. Plant Cell 14: 2251–2264. 21.Bruno AK, Wetzel CM (2004) The early light-inducible protein (ELIP) gene is expressed during the chloroplast-to-chromoplast transition in ripening tomato fruit. J Exp Bot. 55(408):2541-8. 22.Burch-Smith, T.M., Anderson, J.C., Martin, G.B., Dinesh-Kumar, S.P., 2004. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function in plants. Plant J. 39: 734–746. 23.Butaye, K.J.M., Goderis, I.J.W.M., Wouters, P.F.J., Pues, J.M.-T.G., Delaureґ, S.L., Broekaert, W.F., Depicker, A., Cammue, B.P.A., De Bolle, M.F.C., 2004. Stable high-level transgene expression in Arabidopsis thaliana using gene silencing mutants and matrix attachment regions. Plant J. 39: 440–449. 24.Butaye, K.M.J., Cammue, B.P.A., Delaure´, S.L., De Bolle, M.F.C., 2005. Approaches to minimize transgene expression variation in plants. Mol Breed 16:79–91 25.Callis, J., Fromm, M., Walbot, V., 1987. Introns increase gene expression in cultured maize cells. Genes Dev. 1(10):1183–1200. 26.Chan M.T., Lee T.M., Chang H.H., 1992. Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Physiol. 33: 577– 583. 27.Cheng, Z., Targolli, J., Wu, R., 2001.Tobacco matrix attachment region sequence increased transgene expression levels in rice plants. Molecular Breeding 7: 317– 327. 28.Chilton, M-D.M., Que, Q., 2003. Targeted integration of T-DNA into the tobacco genome at double-stranded breaks: new insights on the mechanism of T-DNA integration. Plant Physiol. 133: 956–965. 29.Chowrira, G.M., Akella, V., Lurquin, P.F., 1995. Electroporation-mediated gene transfer into intact nodal meristems in planta. Mol. Biotech. 3: 17-23. 30.Clancy, M., Vasil, V., Hannah, L.C., Vasil, I.K., 1994. Maize Shrunken-1 intron and exon regions increase gene expression in maize protoplasts. Plant Sci 98:153–161 31.Copenhaver, G.P., Browne, W.E., Preuss, D., 1998. Assaying genome-wide recombination and centromere function with Arabidopsis tetrads. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 6: 247–252. 32.Dalmay, T., Hamilton, A., Rudd, S., Angell, S., Baulcombe, D.C., 2000. An RNAdependent RNA polymerase gene in Arabidopsis is required for 108 posttranscriptional gene silencing mediated by a transgene but not by a virus. Cell 101: 543–553. 33.Dalmay, T., Horsefield, R., Braunstein, T.H., Baulcombe, D.C., 2001. SDE3 encodes an RNA helicase required for posttranscriptional gene silencing in Arabidopsis. EMBO J. 20: 2069–2078. 34.Davey, M.R., Anthony, P., Power, J.B., Lowe, K.C., 2005. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol Adv. 23(2): 131-71. 35.Day, C.D., Lee, E., Kobayashi, J., Holappa, L.D., Albert, H., Ow, D.W., 2000. Transgene integration into the same chromosome location can produce alleles that express at a predictable level, or alleles that are differentially silenced. Genes Dev. 14: 2869–2880 36.De Block, M., 1993. The cell biology of plant transformation: current state, problems, prospects and the implications for plant breeding. Euphytica 71: 1-14. 37.De Block, M., Debrouwer, D., 1991. Two T-DNA’s cotransformed into Brassica napus by a double Agrobacterium tumefaciens infection are mainly integrated at the same locus. Theor. Appl. Genet. 82: 257–263. 38. 39.De Bolle, M.F., Butaye, K.M., Goderis, I.J., Wouters, P.F., Jacobs, A., Delauré, S.L., Depicker, A., Cammue, B.P., 2007. The influence of matrix attachment regions on transgene expression in Arabidopsis thaliana wild type and gene silencing mutants. Plant. Mol. Biol. 634: 533-543 40.De Bolle, M.F.C., Butaye, K.M.J., Coucke, W.J.W., Goderis, I.J.W.M., Wouters P.F.J., van Boxel, N., Broekaert, W.F., Cammue, B.P.A., 2003. Analysis of the influence of promoter elements and a matrix attachment region on the interindividual variation of transgene expression in populations of Arabidopsis thaliana. Plant Sci. 165: 169–179. 41.De Bolle, M.F.C., Butaye, K.M.J., Goderis, I.J.W.M., Wouters, P.F.J., Jacobs, A., Delauré, S. L., Depicker, A., Cammue, B. P. A., 2007. The influence of matrix attachment regions on transgene expression in Arabidopsis thaliana wild type and gene silencing mutants. Plant Mol. Biol. 63: 533–543 42.De Buck, S., Jacobs, A., Van Montagu, M.., Depicker A., 1999. The DNA sequences of T-DNA junctions suggest that complex T-DNA loci are formed by a recombination process resembling T-DNA integration. Plant J. 20: 295–304. 43.De Buck, S., Windels, P., De Loose, M., Depicker, A., 2004. Single-copy T-DNAs integrated at different positions in the Arabidopsis genome display uniform and comparable b-glucuronidase accumulation levels. Cell.Mol. Life Sci. 61: 2632– 2645. 44.De Jaeger, G., Scheffer, S., Jacobs, A., Zambre, M., Zobell, O., Goossens, A., Depicker A., Angenon, G., 2002. Boosting heterologous protein production in transgenic dicotyledonous seeds using Phaseolus vulgaris regulatory sequences. Nat. Biotechnol. 20: 1265–1268. 45.De Loose, M., Danthinne, X., Van Bockstaele, E., Van Montagu, M., Depicker A. 1995. Different 5' leader sequences modulate glucuronidase accumulation levels in transgenic Nicotiana tabacum plants. Euphytica 85: 209–216. 109 46.De Wilde, C., Podevin, N., Windels, P., Depicker, A., 2001. Silencing of antibody genes in plants with single-copy transgene inserts as a result of gene dosage effects. Mol. Genet. Genomics 265: 647–653. 47.Dean, C., Favreau, M., Bond-Nutter, D., Bedbrook, J., Dunsmuir, P, 1989. Sequences downstream of translation start regulate quantitative expression of two petunia rbcS genes. Plant Cell. 1(2): 201–208. 48.Denli, A.M., Hannon, G.J., 2003. RNAi: an ever-growing puzzle. Trends Biochem. Sci. 28: 196–201. 49.Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H.M., 1982. Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. J. Mol. Appl. Genet. 1: 561–573. 50.Depicker, A., Van Montagu, M., 1997. Post-transcriptional gene silencing in plants. Curr. Opin. Cell Biol. 9: 373–382. 51.Deshayes, A., Herrera-Estrella, L., Caboche, M., 1985. Liposomemediated transformation of tobacco mesophyll protoplasts by an Escherichia coil plasmid. EMBO J 4: 2731-2737. 52.Duncan, R.R., 1997. Tissue culture-induced variation and crop improvement. Adv. Agron. 58: 201–240. 53.Dunoyer, P., Himber, C., Voinnet, O., 2006. Induction, suppression and requirement of RNA silencing pathways in virulent Agrobacterium tumefaciens infections. Nat. Genet. 38: 258–263. 54.Dunsmuir, P. 1985. The petunia chlorophyll a/b binding protein genes: a comparison of Cab genes from different gene families. Nucl. Acids Res. 13, 2503–2518. 55.Ecker, J.R. and Davis, R.W., 1986. Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 5372-5376. 56.Ellis, R.J. 1981. Chloroplast proteins: Synthesis, transport, and assembly. Annu Rev Plant Physiol, 32, 111-137 57.Elmayan, T., Vaucheret, H., 1996. Expression of single copies of a strongly expressed 35S transgene can be silenced posttranscriptionally. Plant J. 9: 787– 797. 58.Emami, S., Arumainayagam, D., Korf, I., Rose, A.B., 2013. The effects of a stimulating intron on the expression of heterologous genes in Arabidopsis thaliana. Plant Biotech. J. 24. doi: 10.1111/pbi.12043 59.Epinat, J.-C., Arnould, S., Chames, P., Rochaix, P., Desfontaines, D., Puzin, C., Patin, A., Zanghellini, A., Paques, F., Lacroix, E., 2003. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells. Nucleic Acids Res. 31: 2952–2962. 60.Errampalli, D., Patton, D., Castle, L., Mickelson, L., Hansen, K., Schnall, J., Feldmann, K., Meinke Embryonic, D., 1991. Lethal and T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis. Plant Cell 3: 149-157 61.Fagard, M., Boutet, S., More,l J.B., Bellini, C., Vaucheret H., 2000. AGO1, QDE2, and RDE-1 are related proteins required for post-transcriptional gene silencing 110 in plants, quelling in fungi, and RNA interference in animals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11650–11654. 62.Finer, J.J., Vain, P., Jones, M.W., McMullen, M.D., 1992. Development of the particle inflow gun for DNA delivery to plant cells. Plant Cell Rep 11: 323-328. 63.Finnegan, E.J., Matzke, M.A., 2003. The small RNA world. J. Cell Sci. 116: 4689–4693. 64.Fischer, R., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P., Twyman, R.M., 2004. Plantbased productions of biopharmaceuticals. Curr. Opin. Plant Biol. 7: 152-158. 65.Fisk, H.J. and Dandekar, A.M., 1998. Nuclear localization of a foreign gene product in tobacco results in increased accumulation due to enhanced stability. Plant Sci. 133: 177-189. 66.Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horsch, R.B., Sanders, P.R., Flick, J.S., Adams, S.P., Bittner, M.L., Brand, L.A., Fink, C.L., Fry, J.S., Galluppi, G.R., Goldberg, S.B., Hoffmann, N.L., Woo, S.C., 1983. Expression of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 4803-4807. 67.Francis, K.E., Spiker, S., 2005. Identification of Arabidopsis thaliana transformants without selection reveals a high occurrence of silenced T-DNA integrations. Plant J. 41: 464–477. 68.Franck A, Guilley H, Jonard G, Richards K, Hirth L. Nucleotide sequence of cauliflower mosaic virus DNA. Cell 1980; 21:285-94; PMID:7407912; http://dx.doi.org/10.1016/0092-8674(80)90136-1 69.Fukuda, Y., and Nishikawa, S., 2003. Matrix attachment regions enhance transcription of a downstream transgene and the accessibility of its promoter region to micrococcal nuclease. Plant Mol. Biol. 51: 665–675 70.Fukushige, S., Sauer, B., 1992. Genomic targeting with a positive-selection lox integration vector allows highly reproducible gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7905-7909. 71.Gallic, D.R., Sleat, D.E., Watts, J.W., Turner, P.C., Wilson, T.M.A., 1987a. The Yleader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo. Nucleic Acids Res 15: 3257-3273 72.Gallic, D.R., Sleat, D.E., Watts, J.W., Turner, P.C., Wilson, T.M.A., 1987b. A comparison of eukaryotic viral Y-leader sequences as enhancers of mRNA expression in vivo. Nucleic Acids Res 15: 8693 -8711 73.Gallie, D.R., Young, T.E., 1994. The regulation of gene expression in transformed maize aleurone and endosperm protoplasts. Analysis of promoter activity, intron enhancement, and mRNA untranslated regions on expression. Plant Physiol. 106(3):929–939. 74.Gelvin, S.B., 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the ‘‘Gene-Jockeying’’ tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 16–37. 75.Gelvin, S.B., 2003. Improving plant genetic engineering by manipulating the host. Trends Biotechnol. 21: 95–98. 76.Gheysen, G., Villarroel, R., Van Montagu, M., 1991. Illegitimate recombination in plants: a model for T-DNA integration. Genes Dev. 5: 287–297. 111 77.Glass, G.V. & Hopkins, K.D. 1996. Statistical Methods in Education & Psychology, Third Edition. Boston: Allyn & Bacon. 78.Gleave, A.P. 1992. A versatile binary vector system with a T-DNA organisational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome. Plant Mol Biol. 20(6):1203-7. 79.Grevelding, C., Fantes, V., Kemper, E., Schell, J., Masterson, R. 1993. Singlecopy T-DNA insertions in Arabidopsis are the predominant form of integration in root-derived transgenics, whereas multiple insertions are found in leaf discs. Plant Mol. Biol. 23: 847–860. 80.Grimes, B.R., Rhoades, A.A., Willard H.F., 2002. Alphasatellite DNA and vector composition influence rates of human artificial chromosome formation. Mol. Ther. 5: 798–805. 81.Hall, A.E., Keith, K.C., Hall, S.E., Copenhaver, G.P., Preuss D., 2004. The rapidly evolving field of plant centromeres. Curr. Opin. Plant Biol. 2: 108–114. 82.Han, K.H., Ma, C., Strauss, S.H., 1997. Matrix attachment regions (MARs) enhance transformation frequency and transgene expression in poplar. Transgenic Res. 6: 415–420. 83.Hansen, G., Wright, M.S., 1999. Recent advances in the transformation of plants. Trends Plant Sci. 4: 226–231. 84.Hasegawa, K., Yukawa, Y., Sugiura, M., 2003. In vitro analysis of transcription initiation and termination from the Lhcb1 gene family in Nicotiana sylvestris: detection of transcription termination sites. Plant J 33: 1063–1072 85.Haseloff, J., Siemering, K.R., Prasher, D.C., Hodge, S., 1997. Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2122–2127. 86.Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T., 1994. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. Plant J. 6: 271-282. 87.Higo, K. and Higo, H., 1996. Cloning and characterization of the rice CatA catalase gene, a homologue of the maize Cat3 gene. Plant Mol. Biol. 30: 505-521. 88.Hily, J.M., Singer, S.D., Yang, Y., Liu, Z., 2009 A transformation booster sequence (TBS) from Petunia hybrida functions as an enhancer-blocking insulator in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Rep 28(7): 1095-104. 89.Hiwasa-Tanase, K., Kuroda, H., Hirai, T., Aoki, K., Takane, K., Ezura, H., 2012. Novel promoters that induce specific transgene expression during the green to ripening stages of tomato fruit development. Plant Cell Rep. 31(8):1415-24. doi: 10.1007/s00299-012-1257-5. 90.Hobbs, S.L.A., Warketin, T.D., DeLong, C.M.O.,1993. Transgene copy number can be positively or negatively associated with transgene expression. Plant Mol. Biol. 21: 17–26. 91.Hoekama, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J., Schilperoort, R. A., 1983. A binary plant vector strategy based on separation on vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid. Nature 303: 139-180. 112 92.Hohn, T., Richards, K., Geneviève-Lebeurier., 1982. Cauliflower mosaic virus on its way to becoming a useful plant vector. Curr Top Microbiol Immunol 96: 194236Hohn, B., Puchta, H., 2003. Some like it sticky: targeting of the rice gene WAXY. Trends Plant Sci. 8: 51–53. 93.Holmes-Davis, R., Comai, L., 2002. The matrix attachment regions (MARs) associated with the Heat Shock Cognate 80 gene (HSC80) of tomato represent specific regulatory elements. Mol Genet Genomics 266: 891-898 94.Horsch, R.B., Fraley, R.T., Rogers, S.G., Sanders, P.R., Lloyd, A., Hoffmann, N., 1984. Inheritance of functional foreign genes in plants. Science 223 (4635): 496– 498. 95.Hu, J., Lutz, C.S., Wilusz, J., Tian, B. 2005. Bioinformatic identification of candidate cis-regulatory elements involved in human mRNA polyadenylation. RNA 11(10):1485-1493. 96.Hull, R., S. N. Covey, and P. Dale. 2002. Genetically modified plants and the 35S promoter: assessing the risk and enhancing the debate. Microb. Ecol. Health Dis.12:1–5. 97.James, C. 2014. Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2014 ISAAA Brief 49 98.James, С., Krattiger, A.F., 1996. Global review of the field testing and commercialisation of transgenic plants, 1986 to 1995: The first decade of crop biothecnology. ISAAA Briefs №.1. – ISAAA, Ithaca, NY. 99.Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. GUS fusion: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants // EMBO J. – 1987. – V.6. – P.3901-3907. 100. Jefferson RA 1987. Assaying chimeric genes in plants. The GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep 5:387–405 101. Jefferson, R.A. 1987. Assaying chimeric genes in plants. The GUS gene fusion system. Plant Mol Biol Rep 5:387–405 102. Ji, L., Xu, R., Lu, L., Zhang, J., Yang, G., Huang, J., Wu, C., Zheng, C., 2013 TM6, a Novel Nuclear Matrix Attachment Region, Enhances Its Flanking Gene Expression through Influencing Their Chromatin Structure. Mol Cells 36(2): 127-37. 103. Johansen, L.K., Carrington, J.C., 2001. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium- mediated transient expression system. Plant Physiol. 126: 390–398. 104. Jorgensen, R.A., Cluster, P.D., English, J., Que, Q., Napoli, C.A., 1996. Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences. Plant Mol. Biol. 31: 957–973. 105. Jung S, Kim S, Bae H, Lim H-S, Bae H-J 2010. Expression of thermostable bacterial β-glucosidase (BglB) in transgenic tobacco plants. Bioresour Technol 101:7144–7150 106. Kaeppler, S.M., Kaeppler, H.F., Rhee, Y., 2000. Epigenetic aspects of somaclonal variation in plants. Plant Mol. Biol. 43: 179–188. 113 107. Kanoria, S., Burma, P.K., 2012. A 28 nt long synthetic 5'UTR (synJ) as an enhancer of transgene expression in dicotyledonous plants. BMC Biotechnol. 10;12:85. doi: 10.1186/1472-6750-12-85. 108. Khoudi H, Vézina L-P, Mercier J, Castonguay Y, Allard G, Laberge S 1997. An alfalfa rubisco small subunit homologue shares cis-acting elements with the regulatory sequences of the RbcS-3A gene from pea. Gene 197:343–351 109. Kim S, Kim Y-O, Lee Y, Choi I, Joshi CP, Lee K, Bae H-J (2012) Transgenic poplar as an efficient bioreactor system for the production of xylanase. Biosci Biotechnol Biochem 76:1140–1145 110. Kim S, Lee D-S, Choi IS, Ahn S-J, Kim Y-H, Bae H-J (2010) Arabidopsis thaliana Rubisco small subunit transit peptide increases the accumulation of Thermotoga maritima endoglucanase Cel5A in chloroplasts of transgenic tobacco plants. Transgenic Res 19:489–497 111. Klein, T.M., Wolf, E.D., Wu, R., Sanford, J.C., 1987. High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327: 70–73. 112. Koia, J., Moyle, R., Hendry, C., Lim, L., Botella, .JR., 2013. Pineapple translation factor SUI1 and ribosomal protein L36 promoters drive constitutive transgene expression patterns in Arabidopsis thaliana. Plant Mol Biol. 81(45):327-36. doi: 10.1007/s11103-012-0002-3. 113. Komari T., Hiei Y., Saito Y., Murai N., Kumashiro, T., 1996. Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. Plant J. 10: 165–174. 114. Koprek, T., Rangel, S., McElroy, D., Louwerse, J.D., Williams-Carrier, R.E., Lemaux, P.G., 2001. Transposon-mediated single-copy gene delivery leads to increased transgene expression in barley. Plant Physiol. 125: 1354–1362. 115. Kumar, S., Fladung, M., 2001. Controlling transgene integration in plants. Trends Plant Sci. 6: 155–159. 116. Kusaba, M., 2004. RNA interference in crop plants. Curr. Opin. Biotechnol. 15: 139–143. 117. Lanfranco, L., 2003. Engineering crops, a deserving venture. Riv. Biol. 96: 31–54. 118. Li, J., Brunner, A.M., Meilan, R., Strauss, S.H., 2008. Matrix attachment region elements have small and variable effects on transgene expression and stability in field-grown Populus. Plant Biotechnol J. 6(9): 887-96. 119. Li, X., Zhu, Z., Xu, J., Wu, Q., Xu, H., 2001. Isolation of pea matrix attachment region and study on its function in transgenic tobaccos. Science in China. 44 No. 4.: 400-408 120. Lindsey, K., Wei, W., Clarke, M.C., McArdle, H.F., Rooke, L.M., Topping, J.F., 1993. Tagging genomic sequences that direct transgene expression by activation of a promoter trap in plants. Transgenic Res. 2: 33-47. 121. Lin-Marq, N. & Clarkson, S.G. 1998 Efficient synthesis, termination and release of RNA polymerase III transcripts in Xenopus extracts depleted of La protein. EMBO J., 17, 2033–2041. 114 122. Liu, J.W., Tabe, L.M., 1998. The influences of two plant nuclear Matrix Attachment Regions (MARs) on gene expression in transgenic plants. Plant Cell Physiol. 39: 115-123. 123. Lloyd, A., 2003. Vector construction for gene overexpression as a tool to elucidate gene function. Methods Mol. Biol. 236: 329–344. 124. Lloyd, A., Plaisier, C.L., Carroll, D., Drews, G.N., 2005. Targeted mutagenesis using zinc-finger nucleases in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 2232–2237. 125. Loke, J.C., Stahlberg, E.A., Strenski, D. G., Haas, B.J., Wood, P.C., and Li, Q. Q. (2005).Compilation of mRNA polyadenylation signals in Arabidopsis revealed a new signal element and potential secondary structures. Plant Physiol. 138:1457–1468. 126. Lu, J, Sivamani, E, Li, X, Qu, R., 2003. Activity of the 5' regulatory regions of the rice polyubiquitin rubi3 gene in transgenic rice plants as analyzed by both GUS and GFP reporter genes. Planta. 216:1003-12. 127. Lu, J., Sivamani, E., Azhakanandam, K., Samadder, P., Li, X., Qu, R.., 2008. Gene expression enhancement mediated by the 5'- UTR intron of the rice rubi3 gene varied remarkably among tissues in transgenic rice plants. Mol. Genet. Genomics 279: 563–5726. 128. Lu, R., Martin-Hernandez, A.M., Peart, J.R., Malcuit, I., Baulcombe D.C. 2003. Virus-induced gene silencing in plants. Methods 30: 296–303 129. Luehrsen, K.R., Walbot, V., 1994. Addition of A- and U-rich sequence increases the splicing efficiency of a deleted form of a maize intron. Plant Mol Biol. 24(3):449–463. 130. Maas, C., Laufs, J., Grant, S., Korfhage. C., Werr, W., 1991. The combination of a novel stimulatory element in the first exon of the maize Shrunken-1 gene with the following intron 1 enhances reporter gene expression up to 1000-fold Plant Mol Biol 16: 199–207 131. MacKensie, D.R., Anderson, P.M., Wernham, C.C., 1966. A Mobile Air Blast Inoculator for Plot Experiments with Maize Dwarf Mosaic Virus. Plant Dis. Rep. 50, No. 6: 363-367. 132. Mankin, S.L., Allen, G.C., Phelan, T., Spiker, S., Thompson, W.F., 2003. Elevation of transgene expression level by flanking matrix attachment regions (MAR) is promoter dependent: a study of the interactions of six promoters with the RB7 3´MAR. Transgenic Research 12: 3–12 133. Matzke, A.J., Matzke, M.A., 1998. Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes. Curr. Opin. Plant Biol. 1: 142–148. 134. Matzke, M.A., Aufsatz, W., Kanno, T., Daxinger, L., Papp, I., Mette, M.F., Matzke, A.J., 2004. Genetic analysis of RNAmediated transcriptional gene silencing. Biochim. Biophys. Acta 1677: 129–141. 135. Matzke, M.A., Aufsatz, W., Kanno, T., Mette, M.F., Matzke, A.J., 2002. Homology-dependent gene silencing and host defense in plants. Adv. Genet. 46: 235–275. 115 136. Matzke, M.A., Matzke, A.J., 2003. RNAi extends its reach. Science 301: 1060–1061. 137. Maximova, S., Miller, C., Antúnez de Mayolo, G., Pishak, S., Young, A., Guiltinan, M.J., 2003. Stable transformation of Theobroma cacao L. and influence of matrix attachment regions on GFP expression. Plant Cell Rep. 21(9): 872-83. 138. McCabe, D.E., Swain, W.F., Martinell, B.J., Christou P., 1988. Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration. Bio-Tech. 6: 923–926. 139. Mehlenbacher, S.A., 1995. Transformation of woody fruit trees. HortScience 30: 466-477. 140. Meyer, P., 2000. Transcriptional transgene silencing and chromatin components. Plant Mol. Biol. 43: 221–234. 141. Meyer, P., Saedler, H., 1996. Homology-dependent gene silencing in plants. Annu. Rev. Plant Physiol. 47: 23–48. 142. Meza, T.J., Stangeland, B., Mercy, I.S., Skarn, M., Nymoen D.A., Berg, A., Butenko, M.A., Hakelien, A.M., Haslekas, C., Meza-Zepeda, L.A., Aalen, R.B., 2002. Analyses of single-copy Arabidopsis T-DNA-transformed lines show that the presence of vector backbone sequences, short inverted repeats and DNA methylation is not sufficient or necessary for the induction of transgene silencing. Nucleic Acids Res. 30: 4556–4566. 143. Miller, M., Tagliani, L., Wang, N., Berka, B., Bidney, D., Zhao, Z.Y., 2002. High efficiency transgene segregation in co-transformed maize plants using an Agrobacterium tumefaciens 2 T-DNA binary system. Transgenic Res. 11: 381– 396. 144. Minvielle-Sebastia, L. and Keller, W. (1999) mRNA polyadenylation and its coupling to other RNA processing reactions and to transcription. Curr. Opin. Cell Biol. 11, 352–357. 145. Mitsuhara, I., Ugaki, M., Hirochika, H., Ohshima, M., Murakami, T., Gotoh, Y., Katayose, Y., Nakamura, S., Honkura. R., Nishimiya, S., Ueno, K., Mochizuki, A., Tanimoto, H., Tsugawa, H., Otsuki, Y., Ohashi, Y., 1996. Efficient promoter cassettes for enhancer expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants. Plant Cell Physiol 37: 49–59 146. Mlynárová, L., Hricová, A., Loonen, A., Nap, J.P., 2003. The presence of a chromatin boundary appears to shield a transgene in tobacco from RNA silencing. Plant Cell. 15(9): 2203-17. 147. Mlynarova, L., Jansen, R.C., Conner, A.J., Stiekema, W.J., and Nap, J.P., 1995. The MAR-mediated reduction in position effect can be uncoupled from copy number–dependent expression in transgenic plants. Plant Cell 7: 599–609 148. Mlynarova, L., Loonen, A., Heldens, J., Jansen, R.C., Keizer, P., Stiekema, W.J., and Nap, J.P., 1994. Reduced position effect in mature transgenic plants conferred by the chicken lysozyme matrixassociated region. Plant Cell 6: 417– 426. 116 149. Mogen, B.D., MacDonald, M.H., Leggewie, G. and Hunt, A.G. (1992) Several distinct types of sequence elements are required for efficient mRNA-3′ end formation in a pea rbcS gene. Mol. Cell Biol. 12, 5406–5414. 150. Montane M.H., Kloppstech K. The family of light-harvesting-related proteins (LHCs, ELIPs, HLIPs): was the harvesting of light their primary function? Gene. 2000. V. 258.P. 1-8. 151. Mooney, P.A., Goodwin, P.B., Dennis, E.S. and Llewelleyn, D.J., 1999. Agrobacterium tumefaciens-gene transfer into wheat tissues. Plant Cell Tissue Organ Culture 25: 209-218. 152. Mourrain, P., Beclin, C., Elmayan, T., Feuerbach, F., Godon, C., Morel, J.B., Jouette, D., Lacombe, A.M., Nikic, S., Picault, N., Remoue, K., Sanial, M., Vo, T.A., Vaucheret, H., 2000. Arabidopsis SGS2 and SGS3 genes are required for posttranscriptional gene silencing and natural virus resistance. Cell 101: 533– 542. 153. Muskens, M.W., Vissers, A.P., Mol, J.N., Kooter, J.M. 2000. Role of inverted DNA repeats in transcriptional and posttranscriptional gene silencing. Plant Mol. Biol. 43: 243–260 154. Nagaya, S., Kato, K., Ninomiya., Y., Horie, R., Sekine, M., Yoshida, K., Shinmyo, A., 2005. Expression of randomly integrated single complete copy transgenes does not vary in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 46: 438-444. 155. Nam, J., Matthysse, A.G., Gelvin, S.B., 1997. Differences in susceptibility of Arabidopsis ecotypes to crown gall disease may result from a deficiency in TDNA integration. Plant Cell 9: 317–333. 156. Niedz, R.P., Sussman, M.R., Satterlee, J.S., 1995. Green fluorescent protein: an in vivo reporter of plant gene expression. Plant Cell Reports. 14: 403– 406. 157. Oard, J.H., Paige, D.F., Simmonds, J.A., Gradziel, T.M., 1990. Transient Gene Expression in Maize, Rice and Wheat Cells Using an Airgun Apparatus. Plant Physiol 92: 334-339. 158. Odell, J.T., Krebbers, E., 1998. Enhanced transgene expression in a population of monocot cells employing scaffold attachment regions. World Patent Office. WO1998016650 A1 159. Odell, J.T., Nagy, F., Chua, N.H., 1985. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313: 810–812. 160. Oh, S.J., Jeong, J.S., Kim, E.H., Yi, N.R., Yi, S.I., Jang, I.C., Kim, Y.S., Suh, S.C., Nahm, B.H., Kim, J.K., 2005. Matrix attachment region from the chicken lysozyme locus reduces variability in transgene expression and confers copy number-dependence in transgenic rice plants. Plant Cell Rep 24: 145–154 161. Ortega, J.L., Wilson, O.L., Sengupta-Gopalan, C., 2012. The 5' untranslated region of the soybean cytosolic glutamine synthetase β(1) gene contains prokaryotic translation initiation signals and acts as a translational enhancer in plants. Mol Genet Genomics 287(11-12):881-93. doi: 10.1007/s00438-012-07246 117 162. Outchkourov, N.S., Peters, J., de Jong, J., Rademakers, W., Jongsma, M.A., 2003. The promoter-terminator of chrysanthemum rbcS1 directs very high expression levels in plants. Planta 216: 1003–1012. 163. Ovchinnikova EV, Pushin AS, Dolgov SV 2008. Modifications of ribulose bisphosphate carboxylase small subunit promoter (rbcs 3a) for transgenic plants expression system. International conference - The Biology of plant cells in vitro and biotechnology: 286-287. 164. Ow, D.W., 2002. Recombinase-directed plant transformation for the postgenomic era. Plant Mol. Biol. 48: 183–200 165. Park, Y.D., Papp, I., Moscone, E.A., Iglesias, V.A., Vaucheret, H., Matzke, A.J., Matzke, M.A., 1996. Gene silencing mediated by promoter homology occurs at the level of transcription and results in meiotically heritable alterations in methylation and gene activity. Plant J. 9: 183–194. 166. Pawlowski, W. P., Somers, D. A., 1996. Transgene inheritance in plants genetically engineered by microprojectile bombardment. Mol Biotechnol. 6(1): 17-30. 167. Pawlowski, W.P., Somers D.A., 1998. Transgenic DNA integrated into the oat genome is frequently interspersed by host DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(21): 12106–12110. 168. Peach, C. and Velten, J. 1991. Transgene expression variability (position effect) of CAT and GUS reporter genes driven by linked divergent T-DNA promoters. Plant Mol. Biol. 17: 49–60. 169. Petersen, K., Leah, R., Knudsen, S., and Cameron-Mills V., 2002. Matrix attachment regions (MARs) enhance transformation frequencies and reduce variance of transgene expression in barley. Plant Mol. Biol. 49: 45-58 170. Phillips, R.L., Kaeppler, S.M., Olhoft P., 1994. Genetic instability of plant tissue cultures: Breakdown of normal controls. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 5222–5226. 171. Pickford, A.S., Cogoni, C., 2003. RNA-mediated gene silencing. Cell Mol. Life Sci. 60: 871–882. 172. Platt, T. 1986 Transcription termination and the regulation of gene expression. Annu. Rev. Biochem., 55, 339–372. 173. Pruss, G.J., Lawrence, C.B., Bass, T., Li, Q.Q., Bowman, L.H., Vance V., 2004. The potyviral suppressor of RNA silencing confers enhanced resistance to multiple pathogens. Virology 320: 107–120. 174. Puchta, H., Dujon, B., Hohn, B., 1993. Homologous recombination in plant cells is enhanced by in vivo induction of double strand breaks into DNA by a sitespecific nuclease. Nucleic Acids Res. 21: 5034–5040. 175. Rakoczy-Trojanowska, M., 2002. Alternative methods of plant transformation—a short review. Cell Mol Biol Lett 7:849–58. 176. Rao, R.N., Allen, N.E., Hobbs, J.N. Jr, Alborn, W. E., Kirst, H. A., Paschal, J. W., 1983. Genetic and enzymatic basis of hydromycin B resistance in E.coli. Antimicrob. Agents Chemoth. 24: 689-695. 118 177. Rech, E.L., Ochatt, S. J., Chand, P.K., Mulligan, B.J., Davey, M.R., Power, J.B., 1988. Electroporation increases DNA synthesis in cultured plant protoplasts. Nature Biotechnol. 6: 1091 – 1093. 178. Rech, E.L., Ochatt, S.J., Chand, P.K., Power, J.B., Davey, M.R., 1987. Electro-enhancement of division of plant protoplast-derived cells. Protoplasma 141: 169-176. 179. Reddy, M.S., Dinkins, R.D., Collins, G.B. 2003. Gene silencing in transgenic soybean plants transformed via particle bombardment. Plant Cell Rep. 21: 676–683. 180. Rethmeier, N., Kramer, E., van Montagu, M., Cornelissen, M., 1998. Identification of cat sequences required for intron-dependent gene expression in maize cells. Plant J 13: 833–835 181. Rethmeier, N., Seurinck, J., Van Montagu, M., Cornelissen, M. 1997. Intron-mediated enhancement of transgene expression in maize is a nuclear, genedependent process. Plant J. 12: 895–909. 182. Rethmeier, N., Seurinck, J., Van Montagu, M., Cornelissen, M., 1997. Intron-mediated enhancement of transgene expression in maize is a nuclear, genedependent process. Plant J. 12(4): 895–899. 183. Revenkova, E.V., Kraev, A.S., Skryabin, K.G., 1993. Construction of a disarmed derivative of the supervirulent Ti plasmid pTiBo542. Skryabin KG (ed) Plant biotechnology and molecular biology. Pushchino Research Centre, Moscow, pp 67–76 184. Ritchie, S.W., Liu, C.N., Sellmer, J.C., Kononowicz, H., Hodges, T.K., and Gelvin, S.B., 1993. Agrobacterium tumefaciens-mediated expression of gusA in maize tissues. Transgenic Res. 2: 252-265. 185. Romano, A., Raemakers, K., Bernardi, J., Visser, R. and Mooibroek, H., 2003. Transgene organization in potato after particle bombardment-mediated (co-) transformation using plasmids and gene cassettes. Transgenic Res. 12: 461– 473. 186. Rose, A.B., 2004. The effect of intron location on intron-mediated enhancement of gene expression in Arabidopsis. Plant J. 40: 744–751. 187. Rose, A.B., Last, R.L., 1997. Introns act post-transcriptionally to increase expression of the Arabidopsis thaliana tryptophan pathway gene PAT1. Plant J. 11(3): 455–464. 188. Roth, B.M., Pruss, G.J., Vance, V.B. 2004. Plant viral suppressors of RNA silencing. Virus Res. 102: 97–108. 189. Rothnie, H.M. 1996. Plant mRNA-3′-end formation. Plant Mol. Biol. 32, 43–61. 190. Samadder, P., Sivamani, E., Lu, J., Li, X., Qu, R., 2008. Transcriptional and post-transcriptional enhancement of gene expression by the 5' UTR intron of rice rubi3 gene in transgenic rice cells. Mol. Genet .Genomics 279: 429-439. 191. Sanford, J. C., Smith, F. D., Russell, J. A., 1993. Optimizing Biolistic Process for Different Biological Application. Methods for Transforming Animal and Plant Cells. Methods in Enzymology 217: 483-509. 119 192. Satoh, J., Kato, K., Shinmyo, A. J., 2004. The 5'-untranslated region of the tobacco alcohol dehydrogenase gene functions as an effective translational enhancer in plant. Biosci. Bioeng. 98: 1-8. 193. Saunders, J. A., Matthews, B.F., 1995. Pollen Electrotransformation in tobacco, chapter 6. In: Methods in Molecular Biology vol. 55: Plant Cell Electroporation and Electrofusion Protocols Ed.: J.A. Nickoloff, Humana Press Inc., Totowa, N.J.pp. 81-88. 194. Schaefer, D.G., 2002. A new moss genetics: targeted mutagenesis in Physcomitrella patens. Annu. Rev. Plant Biol. 53: 477–501. 195. Scheid, O.M., Paszkowski, J., Potrykus I., 1991. Reversible inactivation of a transgene in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 228: 104–112. 196. Schöffl, F., Schröder, G., Kliem, M. and Rieping, M., 1993. An SAR sequence containing 395 bp DNA fragment mediates enhanced, gene-dosagecorrelated expression of a chimaeric heat shock gene in transgenic tobacco plants. Transgenic Res. 2: 93-100 197. Shaked, H., Melamed-Bessudo, C., Levy, A.A., 2005. High frequency gene targeting in Arabidopsis plants expressing the yeast RAD54 gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 12 265–12 269. 198. Shewry, P.R., Miles, M.J., Tatham, A.S., 1994. The prolamin storage proteins of wheat and related cereals. Prog Biophys. Mol. Biol. 61: 37–59. 199. Shimamoto, K., Terada, R., Izawa, T., Fujimoto, H., 1989. Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts. Nature 338: 2746. 200. Siebert, R., Puchta, H., 2002. Efficient repair of genomic double-strand breaks by homologous recombination between repeated sequences in the plant genome. Plant Cell 14: 1121–1131. 201. Sijen, T., Wellink, J., Hiriart, J.B., Van Kammen, A., 1996. RNA-mediated virus resistance: role of repeated transgenes and delineation of targeted regions. Plant Cell 8: 2277–2294. 202. Somerville, C., Somerville, S. 1999. Plant functional genomics. Science 285: 380–383. 203. Srivastava, V., Anderson, O.D., Ow, D.W., 1999. Single-copy transgenic wheat generated through the resolution of complex integration patterns. Proceedings in National Academy of Science of the United States of America 96: 11117-11121. 204. Srivastava, V., Ariza-Nieto, M., Wilson, A. J., 2004. Cre-mediated sitespecific gene integration for consistent transgene expression in rice. Plant Biotech. J. 2: 169-179. 205. Stam, M., de Bruin, R., Kenter, S., van der Hoorn, R.A.L., van Blokland, R., Mol, J.N.M., Kooter, J.M., 1997. Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats. Plant J. 1: 63–82. 206. Strauch, E., Wohlleben, W., Puhler, A., 1988. Сloning a phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomyces viridochromogenes Tu494. Gene. 63: 65-74. 120 207. Susi, P., Hohkuri, M., Wahlroos, T., Kilby, N.J., 2004. Characteristics of RNA silencing in plants: similarities and differences across kingdoms. Plant Mol. Biol. 54: 157–174 208. Svabados, L., Kovacs, I., Oberschall, A., Abraham, E., Kerekes, I., Zsigmond, L., Nagy, R., Alvarado, M., Krasovskaja, I., Gal M., Berente, A., Redei, G.P., Haim, A.B., Koncz, C., 2002. Distribution of 1000 sequenced TDNA tags in Arabidopsis genome. Plant J. 32: 233–242. 209. Teixeira, A., Tahiri-Alaoui, A., West, S., Thomas, B., Ramadass, A., Martianov, I., Dye, M., James, W., Proudfoot, N.J., and Akoulitchev, A., 2004. Autocatalytic RNA cleavage in the human beta-globin pre-mRNA promotes transcription termination. Nature 432: 526-530. 210. Terada, R., Asao, H., Iida, S., 2004. A large-scale Agrobacterium-mediated transformation procedure with a strong positive-negative selection for gene targeting in rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Rep. 22: 653–659. 211. Terada, R., Johzuka-Hisatomi, Y., Saitoh, M., Asao, H., Iida, S., 2007. Gene targeting by homologous recombination as a biotechnological tool for rice functional genomics. Plant Physiol 144: 846–856 212. Terada, R., Urawa, H., Inagaki, Y., Tsugane, K., Iida, S., 2002. Efficient gene targeting by homologous recombination in rice. Nat. Biotechnol. 20: 1030– 1034. 213. Thalheimer, W. & Cook, S. (2002, August). How to calculate effect sizes from published research articles: A simplified methodology. Retrieved May 4, 2013 from http://work-learning.com/effect_sizes.htm. 214. Thompson, C.J., Movva, N.R., Tizard R., Crameri, R.,. Davies, J. E., Lauwereys, M., Botterman, J., 1987. Characterization of the herbicide-resistance gene bar from Streptomyces hydroscopicus. EMBO J. 6: 2519-2523. 215. Twyman, R.M., Stoger, E., Schillberg, S., Christou, P., Fischer, R., 2003. Molecular pharming in plants: host systems and expression technology. Trends Biotechnol. 21: 570-577. 216. Urawa, H., Hidaka, M., Ishiguro, S., Okada, K., Horiuchi, T., 2001. Enhanced homologous recombination caused by the non-transcribed spacer of the rDNA in Arabidopsis. Mol. Genet. Genomics 266: 546–555. 217. Vain, P., 2007. Thirty years of plant transformation technology development. Plant Biotech. J. 5: 221–229. 218. Vain, P., DeBuyser, J., Trang, V.B., Haicou,r R., Henry, Y., 1995. Foreign gene delivery into monocotyledonous species. Biotechnol. Adv. 13: 653–671. 219. Vain, P., James, A., Worland, B., Snape, W., 2002. Transgene behaviour across two generations in a large random population of transgenic rice plants produced by particle bombardment. Theor. Appl. Genet. 105: 878–889. 220. Vain, P., Worland, B., Kohli, A., Snape, J.W., Christou, P., Allen, G.C., Thompson, W.F., 1999. Matrix attachment regions increase transgene expression levels and stability in transgenic rice plants and their progeny. The Plant Journal 18: 233–242 121 221. van der Geest, A.H.Y., Hall, G.E., Jr., Splker, S., and Hall, T.C., 1994. The P-phaseolin gene is flanked by matrix attachment regions. Plant J. 6: 413-423 222. Verdaguer, B., de Kochko, A., Beachy, R.N., Fauquet, C., 1996. Isolation and expression in transgenic tobacco and rice plants of the cassava vein mosaic virus (CVMV) promoter. Plant Mol. Biol. 31: 1129–1139. 223. Voinnet, O., Rives, S., Mestre, P., Baulcombe D., 2003. An enhanced transient expression system in plants based on suppression of gene silencing by the p19 protein of tomato bushy stunt virus. Plant J. 33: 949–956. 224. Wang, H., Lee, M. M., Schiefelbein, J.W., 2002. Regulation of the cell expansion gene RHD3 during Arabidopsis development. Plant Physiol. 129(2): 638–649. 225. Wang, M.B., Waterhouse, P.M., 2000. High efficiency silencing of a betaglucuronidase gene in rice is correlated with repetitive transgene structure but is independent of DNA methylation. Plant Mol. Biol. 43: 67–82. 226. Wang, M.B., Waterhouse, P.M., 2002. Application of gene silencing in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 5: 146–150. 227. Waterhouse, P.M., Helliwell, C.A., 2003. Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing. Nat. Rev. Genet. 4: 29–38. 228. Wu, L., Ueda, T. and Messing, J. 1993. 3′-End processing of the maize 27 kDa zein mRNA. Plant J. 4, 535–544. 229. Wu, L., Ueda, T. and Messing, J. 1995. The formation of mRNA-3′-ends in plants. Plant J. 8, 323–329. 230. Xie, Z., Johansen, L.K., Gustafson, A.M., Kasschau, K.D., Lellis, A.D., Zilberman, D., Jacobsen, S., Carrington J.C., 2004. Genetic and functional diversification of small RNA pathways in plants. PLoS Biol. 2: e104. 231. Xue, H., Yang, Y.T., Wu, C.A., Yang, G.D., Zhang, M.M., Zheng, C.C., 2005. TM2, a novel strong matrix attachment region. isolated from tobacco, increases transgene expression in transgenic rice calli and plants. Theor. Appl. Genet. 110: 620-627 232. Zambryski, P., Joos, N., Genetello, G., Leemans, 1983. Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration Capacity. EMBO J. 2: 2143-2150. 233. Zhang H.M., Yang H., Rech E.L., Golds T.J., Davis A.S., Mulligan B.J., Cocking E.C., Davey M.R., 1988. Transgenic rice plants produced by electroporation mediated plasmid uptake into protoplasts. Ibid. 7: 379-84. 234. Zhang, J., Lu, L., Ji, L., Yang, G., Zheng, C., 2009. Functional characterization of a tobacco matrix attachment region-mediated enhancement of transgene expression. Transgenic Res 18: 377–385 235. Zhang, K., Wang, J., Yang, G., Guo, X., Wen, F., Cui, D., Zheng, C., 2002. Isolation of a strong matrix attachment region (MAR) and identification of its function in vitro and in vivo. Chinese Science Bulletin 47 No. 23: 1999-2005 236. Zhang, M.M., Ji, L.S., Xue, H., Yanga, Y.T., Wu, C.A., Zheng, C.C., 2007. High transformation frequency of tobacco and rice via Agrobacterium-mediated 122 gene transfer by flanking a tobacco matrix attachment region. Physiologia Plantarum 129: 644–651. 237. Zhang, S.-H., Lawton, M.A., Hunter, T., Lamb, C.J., 1994. atpk1, a novel ribosomal protein kinase gene from Arabidopsis. I. Isolation, characterization, and expression. J Biol Chem 269: 17586–17592 238. Zhang, W. and Wu, R., 1988. Efficient regeneration of transgenic plants from rice protoplasts and correctly regulated expression of the foreign gene in the plants. Theor. Appl. Genet. 76: 835-40. 239. Zhao, J., Hyman, L. and Moore, C. 1999. Formation of mRNA-3′-ends in eukaryotes: mechanism, regulation, and interrelationships with other steps in mRNA synthesis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. June, 405–445. 240. Zipfel, C., Robatzek, S., Navarro, L., Oakeley, E.J., Jones, J.D.G., Felix, G., Boller, T., 2004. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Nature 428: 764–767. 241. Zuker, A., Ahroni, A., Shejtman, H., Vainstein, A., 1997. Adventitious shoot regeneration from leaf explants of Gypsophila paniculata L. Plant Cell Rep. 16: 775–778.