Цитогенетическая диагностика онкологических заболеваний
advertisement
Цитогенетическая диагностика онкологических заболеваний Рубцов Н.Б., Карамышева Т.В. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Анализ процесса малигнизации клеток и дальнейшей опухолевой прогрессией показал, что они тесно связаны с реорганизацией генома, которая нередко выражается структурными или численными изменениями хромосом и их отдельных районов. В настоящее время известны многочисленные примеры хромосомных перестроек, которые либо обуславливают предрасположенность к развитию онкологических заболеваний, либо могут являться прямой причиной злокачественной трансформации (Mitelman et al., 1997). Опухолевая прогрессия также часто связана с появлением клеточных клонов, несущих новые хромосомные перестройки (Potter and Watmore 1992) и отличающихся от исходного штамма целым рядов признаков, имеющих непосредственное значение для прогнозирования развития заболевания и выбора оптимальной стратегии лечения. Ниже мы рассмотрим некоторые из многочисленных случаев реорганизации хромосом человека при онкологических заболеваниях, значение и возможности их своевременного выявления. 1. Реорганизация генома при малигнизации клеток. Роль реорганизации клеточного генома при различных неоплазиях дискутируется более 100 лет. Первые систематические исследования реорганизации клеточных структур при злокачественных новообразованиях были выполнены еще в 1890 году Хансеманном (Hansemann 1890). Четверть века спустя Бовери (Boveri 1914) выдвинул предположение о приобретении опухолевыми клетками наследуемых изменений в виде нарушения геномного баланса. Это соответствует теории опухолегенеза, основанной на соматических мутациях, которые в настоящее время рассматриваются как один из важнейших компонентов канцерогенеза. В 1950-х годах изучение злокачественных асцитов, как спонтанно возникших, так и экспериментально индуцированных, показало, что для малигнизированных клеток характерны численные и структурные хромосомные аномалии. Результаты исследований указывали на то, что хромосомные аберрации играют значительную роль в процессе возникновения и эволюции неоплазий (Levan 1967, Koller 1972, Sandberg 1992). Были выявлены некоторые закономерности появления и дальнейшей эволюции клеток с измененным кариотипом, а развитие постулата, сформулированного в 1930 году Винге (Winge 1930), привело к описанию поведения популяций опухолевых клеток в терминах генетической изменчивости и отбора. Впервые прямая связь между конкретной хромосомной перестройкой и определенным типом злокачественно заболевания была установлена в 1960 году Новеллом и Хунгерфордом (Nowell and Hungerford 1960). Обнаружение филадельфийской хромосомы (Ph), как типичной хромосомной аномалии при хронической миелоидной лейкемии стимулировало интенсивные цитогенетические исследования. Однако, вместо выявления небольшого числа хромосомных перестроек, непосредственно связанных с развитием определенных типов неоплазий, было обнаружено огромное разнообразие аберрантных кариотипов, в том числе и при сравнении казалось бы идентичных неоплазий. В свете этих данных предположение об определяющем значении хромосомных перестроек в их возникновении стало представляться неоправданным. В 60-е годы превалировало мнение, что хромосомные перестройки возникают преимущественно в ходе опухолевой прогрессии и не имеют существенного значения при патогенезе. Положение принципиально изменилось после появления методов дифференциального окрашивания хромосом (Caspersson et al., 1970). Новые методы цитологического анализа хромосом, открыли возможности идентификации не только индивидуальных хромосом человека, но их отдельных районов. Это позволило детально описать огромное число кариотипически аномальных злокачественных и доброкачественных неоплазий. Если первоначально цитогенетические исследования проводились преимущественно в случаях гематологических заболеваний, то в последнее время, благодаря развитию методов интерфазной цитогенетики, резко возросла интенсивность исследований солидных опухолей. К июлю 1996 года были опубликованы результаты анализа 26523 неоплазий, несущих различные хромосомные аномалии. Результаты этих исследований были суммированы в 5-ом издании Каталога хромосомных аберраций при онкологических заболеваниях (Mitelman et al., 1997). Одновременно с накоплением этих данных в 80-е годы были получены результаты молекулярно-биологических исследований, которые значительно расширили наши представления о механизмах неопластических процессов. Значительное число точек разрывов-воссоединений хромосом было охарактеризовано на молекулярном уровне. В результате было выделено два класса генов, которые часто оказывались локализованными в районах близких к местам хромосомных перестроек (Rabbitts 1994, Heim and Mitelman 1995): “доминантные” онкогены и “рецессивные” гены- супрессоры опухолевого роста. Первым описанным случаем активации онкогена в результате хромосомной перестройки оказался перенос онкогена MYC в район транскрипционно активных иммуноглобулиновых генов. Следствием такого переноса является развитие лимфомы Беркитта (Klein 1989). Другим классическим примеров является Ph-позитивный хронический миелоидный лейкоз, при котором перенос ABL онкогена к BCR гену приводит к трансляции аномального протеина, кодируемого гибридным геном BCR/ABL (Rowley 1990). Таким образом, хромосомная перестройка приводит к изменению регуляции онкогена, выражающемуся в его активации. Значительное число подобных примеров было обнаружено при анализе сбалансированных хромосомных перестроек: транслокаций и инверсий в различных типах неоплазий (Rabbitts 1994, Heim and Mitelman 1995). В последнее десятилетие было показано существование другого механизма, посредством которого хромосомные перестройки могут приводить к малигнизации клеток. Инактивация генов-супрессоров опухолевого роста может быть следствием делеции хромосомного района или потери всей хромосомы. В пользу этой концепции говорят результаты исследований наследственных форм онкологических заболеваний, например: таких как ретинобластома, опухоль Вильмса. Потеря районов, содержащих генысупрессоры опухолевого роста, была убедительно продемонстрирована совместными цитогенетическими и молекулярно-биологическими исследованиями (Knudson 1985, 1995, Stanbridge 1992, Weinberg 1994, Knudson 1995). Предполагается, что такой механизм имеет место при возникновении значительного числа различных карцином (Knudson 1985). При проведении достаточного объема исследований присутствие типичных хромосомных перестроек было показано для большого числа неоплазий человека (Mitelman et al., 1997). Были выявлены новые гены, изменение экспрессии которых в ряде случаев приводит к малигнизации клеток (Rabbitts 1994). В это же время стала очевидной клиническая значимость данных хромосомного анализа. Выявление типичных хромосомных перестроек при некоторых заболеваниях оказывается принципиальным при постановке окончательного диагноза, выбора стратегии лечения и контроля эффективности проводимой терапии (Rowley et al., 1993). 2. Вклад цитогенетических исследований в диагностику онкологических заболеваний. В качестве примера рассмотрим подробнее, какая информация, имеющая практическое значение для диагностики и лечения гемопоэтических неоплазий, может быть получена в результате цитогенетических исследований. Детекция клональной пролиферации при определении диагноза. Выявление хромосомной реорганизации в гемопоэтических клетках пациента является серьезным аргументов в пользу постановки диагноза “неоплазия”. Практическое значение цитогенетической диагностики во многом зависит от существования альтернативных более эффективных методов детекции клональной пролиферации. Хромосомный анализ не имеет большого значения для проверки подозрения на В-лимфоцитарные неоплазии, так как клональная пролиферация в этих случаях может быть определена анализом ?/? ?оотношения. В случаях Т-лимфоцитарных неоплазий клональная пролиферация может быть установлена ДНК анализом перестроек в tcr генах (T-сell receptor genes). Следует отметить, что хромосомный анализ позволяет выявить клональную пролиферацию и в тех случаях, когда анализ tcr генов оказывается не информативным. Цитогенетический анализ более значим при диагностике неоплазий миелоиднойлинии, так как другие методы применимы только для женщин, гетерозиготных по генам Х хромосомы, которые могут быть использованы при проведении диагностики. Хромосомный анализ имеет большое значение для диагностики случаев, когда трансформация произошла в лимфоцитах очень низкого уровня дифференцировки - еще до перестройки генов иммуноглобулинов или tcr генов. При таких заболеваниях другие методы диагностики оказываются мало эффективными. Отметим случаи, когда выявление клональности цитогенетическими методами имеет большое значение для постановки окончательного диагноза. Диагностика гипопластической острой миелоидной лейкемии при возможной апластической анемии. Дифференцирование миелоидного диспластического синдрома и иных нарушений функций костного мозга. Дифференцирование гиперэозинофильного синдрома, обусловленного миелоидной неоплазией и реактивной эозинофилии. Подтверждение диагноза полицитемии rubra vera. Подтверждение анализа хронической гранулоцитной лейкемии на ранних стадиях. Подтверждение диагноза лимфомы в случаях ангиоиммунобластных лимфоаденопатия-подобных лимфом. Отличие лимфом, особенно иммунобластных лимфом, от неконтролируемой пролиферации, обусловленной инфекцией EBV иммунодефицитных пациентов. Подтверждение диагноза гранулоцитной лейкемии, особенно в случаях без перестройки tcr генов. Наличие клона клеток с хромосомной аномалией может рассматриваться как доказательство неоплазии, однако, неудача в выявлении кариотипически аномального клона не может исключать ее наличие. Среди гемопоэтических неоплазий не существует форм, для которых бы не были известны случаи отсутствия цитологически регистрируемых хромосомных аномалий. Даже для хронического гранулоцитарного лейкоза, который почти всегда связан с появлением Ph хромосомы, известны случаи отсутствия хромосомных перестроек, идентифицируемых на микроскопическом уровне. То же можно сказать про лимфому Беркитта и острую промиелоцитную лейкемию. Можно предположить, что в этих случаях реорганизация генома происходит на субмикроскопическом уровне, или трансформированные клетки не входят в митоз в условиях, используемых при проведении цитогенетической диагностики. Следует отметить, что выявление двух кариотипически аномальных клонов не обязательно является результатом присутствия двух отдельных популяций трансформированных клеток. Кариотипически различные клоны были обнаружены у 4% пациентов с острой миелоидной лейкемией. Сходный процент был найден у пациентов с миелоидными диспластическими синдромами. У пациентов с острой лимфобластной лейкемией, хроническими лимфоидными лейкемиями, а также Т- и В-клеточными лимфомами этот процент равен приблизительно единице. Вероятно, в большинстве таких случаев кариотипически различные клоны имеют общего предшественника. Действительно независимые клоны у пациентов с гематопоэтическими неоплазиями встречаются крайне редко. Хромосомные аномалии, как указание на происхождение неоплазий. Цитогенетический анализ может представить информацию о моменте, когда произошла клеточная трансформация. Имела ли она место в плюрипотентной стволовой клетке, способной дифференцироваться и в лимфоидном, и в миелоидном направлениях, или трансформация произошла в мультипотентной стволовой клетке, дальнейшая дифференцировка которой ограничена миелоидным рядом, или же в клетках, коммиттированных к моноцитной/гранулоцитной или лимфоцитарной дифференцировке. Выяснение этого вопроса имеет не только чисто теоретический интерес, но также большое значение для прогнозирования развития заболевания. Была показана достаточно тесная связь между определенными хромосомными нарушениями и мутациями в определенных типах стволовых клеток. Обнаружение таких хромосомных аномалий может рассматриваться как указание на клеточную трансформацию, произошедшую в стволовых клетках определенного иерархического уровня. Показано, что при хронических гранулоцитных лейкемиях Ph хромосома присутствует во всех миелоидных производных, эритроидных сериях, мегакариоцитах, гранулоцитах (нейтрофилах, эозинофилах и базофилах) и моноцитах, макрофагах. При лимфобластной трансформации Ph хромосома присутствует также в В-лимфобластах. Это указывает на прохождение основного лейкемиегенного события в плюрипотентных стволовых клетках, которые во время хронической стадии могут дифференцироваться в миелоидные клетки. В отдельных случаях Т-лимфобластной трансформации Ph хромосома встречается также в Тлимфобластах. В случае острых лейкемий, трансформация имеет место, главным образом, в коммиттированных или мультипотентных стволовых клетках. Вероятно, клоны клеток, несущие t(15;17), t(8;21) и inv(16), происходят из трансформированных коммиттированных стволовых клеток. Варианты кариотипов с –5, -5q, -7, -7q, +8, t(6;9) и inv(3) связаны преимущественно с трансформацией мультипотентных стволовых клеток. Острые лейкемии, возникшие вследствие трансформации плюрипотентных клеток, проявляют себя либо как билинейные, включающие одновременно и лимфоидные и миелоидные клетки, либо как бифенотипные лейкемии, клетки которых имеют и лимфоидные и миелоидные признаки. Найдены хромосомные аномалии, тесно связанные с такими лейкемиями. Их выявление служит гематологу указанием на возможность присутствия билинейной/бифенотипной лейкемии. Одним из ярких примеров является связь t(4;11)(q21;q23) и билинейной (лимфоидной и моноцитной) лейкемии, встречающейся преимущественно у детей дошкольного возраста. Несколько слабее выражена связь между билинейными/бифенотипными лейкемиями и разнообразными хромосомными транслокациями, вовлекающими район 11q23. Цитогенетические исследования миелоидных диспластических синдромов позволяют предполагать, что они являются следствием преимущественно трансформации мультипотентных стволовых клеток. Однако, известны, по крайней мере, два случая, когда результаты хромосомного анализа указывают на трансформацию плюрипотентных клеток: хромосомные аномалии присутствуют как в В-лимфоцитах, так и в клетках миелоидного ряда. Цитогенетический анализ и механизмы лейкемиягенеза. Определение хромосомных перестроек в ряде случаев позволяет высказывать предположения о механизме клеточной трансформации. Действительно, как уже упоминалось выше, транслокации хромосом могут приводить к созданию гибридных генов или переносить онкогены в районы, находящиеся под влиянием промоторов и энхансеров других генов, а делеции хромосомных районов могут вести к потере геновсупрессоров опухолевого роста. В связи с этим, анализ генного состава районов, утерянных или прилежащих к точкам разрывов, может оказаться информативным не только для определения механизма клеточной информации, но и для поиска молекулярных зондов, которые бы позволили проводить диагностику не на метафазных хромосомах, а непосредственно на интерфазных ядрах. Такая диагностика имеет большое значение для оценки стадии заболевания и эффективности проводимой терапии. Анализ этиологии заболевания. Выявление любой из траслокаций хромосом, характерных для лимфомы Беркитта, является указанием на возможную роль EBV или подавления иммунной системы, например в результате инфицирования вирусом иммунодефицита человека. Выявление аномалий хромосом 5 и 7 в случаях миелоидных дисплазий или острых миелоидных лейкемий у пациентов, проходивших до этого курсы химиотерапии, свидетельствует о том, что один или несколько использованных препаратов мог быть причиной новой клеточной трансформации. Наиболее часто это происходит при длительном использовании таких алкилирующих агентов, как хлорамбуцил, бузулфан, мелфалан или циклофосфамид. Недавно группа таких индуцированных лейкемий была связана с транслокациями и другими хромосомными перестройками, затрагивающими район 11q23. Наиболее часто встречалась t(9;11). Несколько реже – t(11;19) ,t(11;17) ,t(X;11) ,t(11;21), inv(11) и 11q-. Эти случаи были связаны не с использованием алкилирующих агентов, а с группой препаратов, включающих антрациклины, эпиподофиллотоксины и актиномицин D. Выявление делеций, моносомий хромосом 5 и 7, а также хромосомных перестроек с точкой разрыва в 11q23 предполагает предшествующую терапию с использование препаратов, имеющих мутагенное действие. В тех случаях, когда пациент не получал таких препаратов и радиотерапии, можно ожидать, что он подвергался мутагенному воздействию на рабочем месте или в быту. Подтверждение диагноза. Острые миелоидные лейкемии: В большинстве случаев диагностика не требует проведения хромосомного анализа. Однако, в ряде случаев цитогенетическое обследование может быть полезно для проведения дифференцирования между острой миелоидной лейкемией и рефрактерной анемией с избытком бластов при трансформации. Это актуально для небольшой группы пациентов с процентом бластов менее 30, но классификация заболевания которых, тем не менее, больше соответствует острой миелоидной лейкемии, и имеет высокую вероятность полной ремиссии при терапии, соответствующей острой миелоидной лейкемии. Для этих случаев характерны такие хромосомные перестройки, как t(8;21) и inv(16), типичные для острых миелоидных лейкемий. Хромосомный анализ оказывается полезным для дифференцирования гипопластической острой миелоидной лейкемии и апластической анемии, а также для диагностирования на ранних стадиях острой миелоидной лейкемии у пациентов, страдающих апластической анемией. Миелодисплазивные синдромы: Их диагностика сильно зависит от проведения хромосомного анализа. Он особенно важен для пациентов с неизвестной природой анемии, макроцитозом, нейтропенией или тромбоцитопенией, у которых нет увеличения числа бластов, и слабо выражена морфологическая дисплазия. Выявление хромосомных аномалий позволяет проведение надежной диагностики. Эозинофильные и базофильные лейкемии: Отдельные случаи идиопатического гиперэозинофильного синдрома представляют собой миелопролиферативные нарушения. Диагностика таких случаев сильно затруднена, однако, выявление клональных хромосомных аномалий в эозинофилах обычно позволяет диагностировать заболевание как эозинофильную лейкемию. Диагноз базофильная лейкемия обычно устанавливается без цитогенетического анализа, однако, в большом числе случаев базофильной лейкемии присутствуют хромосомные аномалии. Часто такой аномалией является Ph хромосома. Эти случаи могут рассматриваться как варианты хронической гранулоцитной лейкемии. Первичная тромбоцитемия: Диагностика может представлять проблемы особенно в случаях несущественного повышения числа тромбоцитов. Клональные хромосомные аномалии обнаружены лишь у 5% пациентов. Их обнаружение подтверждает диагноз. Среди выявленных нарушений обычны 5q-. У некоторых пациентов с тробоцитозом была найдена Ph хромосома. Ее детекция подтверждает диагноз миелопролиферативного нарушения, но более точным диагнозом этих случаев является вариант хронической гранулоцитной лейкемии, а не первичной тромбоцитемии. Полицитемия rubra vera: В тех случаях, когда у пациентов есть другие признаки миелопролиферативных нарушений, такие как гепатомегалия, спленомегалия, лейкоцитоз, тромбоцитоз или базофилия, диагностика не представляет серьезных проблем. Однако, существует группа пациентов без выраженных миелопролиферативных нарушений, у которых для подтверждения диагноза полицитемии rubra vera существенно выявление клональной хромосомной аномалии, например 20q-. В отсутствии хромосомных аномалий более адекватным диагнозом является первичный или идиопатический эритроцитоз. Значение цитогенетических данных в классификации гемопоэтических неоплазий. Классификация гематопоэтических неоплазий, к сожалению, позволяет выделять не отдельные заболевания, а скорее группы сходных заболеваний, которые, тем не менее, могут отличаться по своей этиологии, механизму лейкемиегенеза и прогнозу развития. В качестве примера мы рассмотрим только острые лейкемии. Они могут быть классифицированы в соответствии с их морфологическими, иммунофенотипическими и цитогенетическими характеристиками. Эти три метода классификации были объединены в единую MIC (morphological, immunological, cytogenetic) классификацию, включающую в себя FAB (French-Amercan-British) морфологическую классификацию, которая разделяет острые миелолейкемии на семь или восемь групп, а острые лимфолейкемии на три группы. MIC классификация обеспечивает более детальное подразделение острых лейкемий и позволяет введение новых групп при проведении дальнейших исследований (таблицы 1 и 2) (Bain 1992). Для классификации лимфобластных лейкемий огромное значение играет проведение иммунологического и цитогенетического анализа. При классификации острых миелоидных лейкемий большое значение имеют морфологические и кариотипические исследования. Определение иммунофенотипа существенно только для опознавания острой мегакариобластной лейкемии (М7) и М0 типа острой миелоидной лейкемии. Определение хромосомных аномалий может служить как для подтверждения анализа, так и для его постановки. Примером последнего служит диагностика гипогранулярного варианта М3 типа острой миелоидной лейкемии при выявлении t(15;17). Таблица 1. MIC классификация острых миелоидных лейкемий. Основные группы Морфологический тип Хромосомные аномалии М2 t(8;21)(q22;q22) M3 или M3V t(15;17)(q22;q12 или 21) M5 del/t(11)(q23) M4EO inv(16)(p13q22), t(16;16)p13;q22), del(16)(q22) M1 t(9;22)(q34;q11) M2Baso или M4Baso t(6;9)(p23;q34.3) M1 inv(3)(q21q26) или t(3;3)(q21;q26) M5 t(8;16)(p11;p13) M2Baso 12p- Подтипыa M4 или M5 del/t(11)(q13-14) M4, M1, M2 Трисомия 4 М4 Трисомия 22 М1 9q- M2 t(7;11)(p15;p12) a - менее четко описаны и менее обычны. Таблица 2. MIC классификация острых лимфобластных лейкемий. В-тип острых лимфобластных лейкемий Морфотип Иммунофенотип Хромосомные аномалии L1 или L2 TdT позитивный, t(4;11)(q21;q23), HLA-Dr позитивный, t(11;19)(q23;p1323) и другие хромосомные перестройки с CD19 позитивный, CD10 негативный, точкой разрыва в 11q23, t(9;22(q34;q11) Cy/Sm Ig негативный L1 или L2 TdT позитивный, t(1;11)(p32;q23), HLA-Dr позитивный, 6q-, i(6)(p10), i(7)(q10), CD19 позитивный, t dic(7;9)(p11-13;p11) CD10 позитивный, 9p-, i(9)(q10), Cy/Sm Ig негативный t dic(9;12)(p11-13;p11-12) t(9;22)(q34;q11), t(11;19)(q23;p13), t/del(12)(p11-p13), t(12;17)(p12-13;q12), t(14;22)(q32;q11), i(17)(q10), L1 или L2 TdT позитивный, t(1;11)(q32;q23), HLA-Dr позитивный, t(1;19)(q23;p13.3), CD19 позитивный, 6q-, Cy Ig позитивный, t(9;22)(q34;q11), Sm Ig негативный t(2;8), t(8;14), t(8;22) (Беркиттлимфома) L3 TdT позитивный, dup(1)(q12-q31), HLA-Dr позитивный, t(8;22)(p12;q24), CD19 позитивный, 6q-, Cy Ig позитивный или t(8;14)(q24;q32), негативный, t(8;22)(q24;q11) Sm Ig позитивный Т-тип острых лимфобластных лейкемий L1 или L2 TdT позитивный, t(1;14)(p32;q11), CD7 позитивный, 6q-, ER или СD2 негативный хромосомные перестройки с точкой разрыва в 7q32-36 t(8;14)(q24;q11), L1 или L2 TdT позитивный, t/del(9p), CD7 позитивный, i(9)(q10), ER или СD2 позитивный t(10;14)(q24;q11), t(11;14)(p13;q11), del/t(12)(p11-p13), inv(14)(q11q32) Выявление клональной и эволюции, связанной с ухудшением прогноза. Обнаружение кариотипических аномалий в случаях миелодисплазивного синдрома, ранее имеющего нормальный кариотип, указывает на ухудшение прогноза. Об ухудшение прогноза свидетельствует и выявление новых хромосомных аномалий при хронической гранулоцитной лейкемии. Во время бластного криза значительная часть пациентов имеют вторичные кариотипические аномалии. Интересно отметить различия дополнительных кариотипических нарушений, имеющих место при лимфобластной и миелобластной трансформациях, что, вероятно, является следствием реализации различных генетических механизмов клеточной трансформации. Рецидивы миелобластной лейкемии часто связаны с появлением клеток с новыми кариотипическими аномалиями. Значение цитогенетических данных для выбора варианта терапии. Кроме перечисленных выше моментов, информация о кариотипических изменениях может оказаться полезной для определения вероятности регрессии заболевания, эффективности трансплантации костного мозга, наследственного характера некоторых заболеваний, дифференциации между рецидивом и вторичной лейкемией. В связи с этим не удивительно, что результаты цитогенетического анализа могут оказывать большое влияние на выбор оптимальнойстратегии лечения, и на ее корректировку. В настоящей статье не представляется возможным подробно рассмотреть этот вопрос. Тем не менее, в качестве наглядного примера кратко коснемся этой проблемы для острых лимфобластных лейкемий. В случаях этих заболеваний определенные кариотипические изменения являются указанием на применение интенсивного варианта лечения в отличие от стандартно используемого (Pui et al., 1990). Это касается Ph хромосомы, t(4;11), t(2;8), t(8;14), t(8;22), а также значительного изменения числа хромосом. Другие кариотипические изменения представляют собой специфические характеристики заболевания и должны рассматриваться в совокупности с другими прогностическими факторами. 3. In situ гибридизация в современной цитогенетике. Основная масса данных, упомянутых выше, была получена при использовании классических цитологических методов хромосомного анализа. Появление новых технологий молекулярной цитогенетики, базирующихся преимущественно на in situ гибридизации нуклеиновых кислот, значительно расширило возможности хромосомной диагностики. Метод in situ гибридизации был разработан для локализации конкретных последовательностей ДНК непосредственно на цитологических препаратах. Проведение такой локализации одновременно с цитологическим анализом морфологии клеточных структур привело к настоящей революции в цитогенетике, что в свою очередь определило наступление в 90-е годы новой эры хромосомного анализа при онкологических заболеваниях. Произошел переход в идентификации хромосом и хромосомных районов с анализа цитологической организации хромосомы на анализ последовательностей ДНК, входящих в их состав. Сравнение эффективности классических цитологических методов выявления и анализа хромосомных перестроек, таких как дифференциальные окраски хромосом, с современными молекулярно-цитогенетическими технологиями показало, что при гематологических нарушениях цитологический анализ хромосом детектирует и правильно идентифицирует лишь около трети хромосомных перестроек, выявляемых при использовании спектрального кариотипирования (SKY)(Смотри ниже). Еще около трети перестроек идентифицируются цитологическими методами неверно, а треть остается совсем незамеченной. Положение с солидными опухолями было еще хуже. Классические методы цитогенетического анализа позволяют выявлять лишь около 15% хромосомных перестроек, идентифицируемых с помощью SKY. Ниже мы рассмотрим современные методы хромосомного анализа и их приложение к диагностике онкологических заболеваний. Принцип in situ гибридизации крайне прост: меченная и денатурированная нуклеиновая кислота наносится на цитологический препарат, также прошедший необходимую предобработку, создаются условия для формирования дуплекса меченой ДНК и ДНК цитологического препарата, несвязанная меченая ДНК отмывается, а затем проводится детекция гибридизованного ДНК-зонда. Впервые in situ гибридизация с 32Р-меченным зондом была описана в 1969 году (Gall and Pardue, 1969; John et al., 1969). Совершенствование методов мечения ДНК-зондов, проведения гибридизации и детекции меченой ДНК на цитологических препаратах позволило перейти от анализа распределения в хромосомах кластерированных повторов к локализации уникальных последовательностей (Takahashi et al., 1990). Важным шагом в развитии in situ гибридизации явилась разработка нерадиоактивных систем мечения и детекции ДНК зондов. Метод in situ гибридизации стал более безопасным, простым в исполнении и менее трудоемким при обработке результатов. Благодаря стремительному развитию технологий цифровой записи микроскопических изображений и их компьютерной обработке, были созданы принципиально новые подходы к визуализации и идентификации хромосомного материала (Lichter et al.,1991; Spreicher et al., 1996; Schroeck et al., 1996; Chudoba et al., 1999а). Прогресс в этой области сделал in situ гибридизацию незаменимым инструментом при проведении многочисленных исследований, посвященных как изучению генома человека, так и ежедневной клинической диагностике. Удивительна скорость внедрения этих, относительно дорогих, методов в зарубежные диагностические лаборатории. Это может быть объяснено как их высокой эффективностью в получении разнообразной и достоверной информации, так и высоким уровнем финансирования этих лабораторий. В настоящее время можно выделить несколько основных подходов, широко используемых современной молекулярной цитогенетикой при анализе хромосомных изменений в случае онкологических заболеваний: 1. Идентификация материала протяженных хромосомных районов и целых хромосом. 2. Детекция в интересующем районе конкретной последовательности ДНК. 3. Анализ нарушения баланса отдельных хромосомных районов. Для идентификации материала протяженных хромосомных районов и целых хромосом широко используются хромосом специфичные и район-специфичные ДНК-библиотеки. Так как при FISH они “окрашивают” целые хромосомы или хромосомные районы, они получили название “painting probes” (“окрашивающие зонды”). В настоящее время существует большое разнообразие коммерчески доступных “окрашивающих зондов”, созданных путем хромосомного сортинга и последующей DOP-PCR (Telenius et al., 1992). Такой способ их производства требует дорогостоящего оборудования. Однако, ДНКзонды могут быть получены и при использовании микроманипуляционных технологий (Senger et al., 1997, Rubtsov et al., 2000) Параллельное развитие методов in situ гибридизации, создания и детекции ДНК-зондов с одной стороны и совершенствование эпифлуоресцентной микроскопии, разработки новых способов цифровой записи и компьютерной обработки микроизображений с другой привели к появлению новых технологий, позволяющих использовать в одном эксперименте одновременно до нескольких десятков ДНК-зондов. Это произошло благодаря введению понятия “псевдоцвета”. Кратко коснемся принципов многоцветной FISH. В ее основе лежит комбинаторное мечение, при котором ДНК-зонд метится не одним, а комбинацией флуорохромов, и регистрация для всех точек изображения интенсивности свечения всех флуорохромов. В этом случае одновременное использование n числа флуорохромов позволяет получить значительно большее число псевдоцветов. Пусть точка, окрашенная флуорохромом “a”, будет считаться точкой псевдоцвета №1, точка, окрашенная флуорохромом “b”, будет считаться точкой псевдоцвета №2, в этом случае можно принять, что точка, окрашенная флуорохромами “а” и “b” одновременно, будет считаться точкой псевдоцвета №3. Таким образом, использование двух флуорохромов позволяет пометить и анализировать в FISH одновременно 3 пробы ДНК, получая трехцветное изображение. В эксперименте одна из проб должна быть помечена и флуорохромом “a”, и флуорохромом “b”. Очевидно, что использование n флуорохромов позволяет одновременно анализировать 2n-1 ДНК-зондов. При использовании для мечения зондов всего пяти флуорохромов такой подход позволяет одновременно анализировать результаты гибридизации 31 ДНК-зонда. Этого с запасом хватает для индивидуальной визуализации в одной метафазе материала всех хромосом человека (Schroeck et al., 1996; Speicher et al, 1996, Chudoba et al., 1999а). Комбинированное использование прямо- и гаптен-меченых ДНК зондов позволяет уменьшить число флуорохромов, необходимых для визуализации в метафазе материала всех хромосом человека до трех (Heerema et al., 1999). В принципе, этот метод позволяет проводить “одновременную” детекцию 41 ДНК-зонда, однако, такая версия многоцветного FISH является значительно более трудоемкой и, по мнению авторов, едва ли найдет широкое применение в практической диагностике. 4. Варианты многоцветной FISH В настоящее время существует два основных подхода получения псевдомногоцветных изображений. В простейшем варианте используются наборы специфичных комбинаций возбуждающих и запирающих фильтров и устройство для черно-белой цифровой регистрации сигнала. Однако современная техника способна обеспечить регистрацию не только интенсивности сигнала, но и его спектральных характеристик. Такое приборное оснащение лежит в основе спектрального кариотипирования (SKY). M-FISH. M-FISH (multitarget, multifluor, multicolor или multiplex FISH) является общим названием для традиционных многоцветных FISH, использующих комплекты флуорохромспецифичных фильтров. Принцип M-FISH заключается в раздельной цифровой регистрации сигнала всех используемых флуорохромов, что достигается последовательной сменой комплектов фильтров. Обычно все изображения записываются в отдельные файлы, что позволяет проводить их эффективную обработку, связанную с разделением сигнала и фона, а также количественной оценкой сигнала. Обработка всей записанной информации с помощью специального программного обеспечения переводит информацию об уровне сигналов флуорохромов в каждой точке изображения в псевдоцвета. Одним из основных ограничений числа используемых ДНК-зондов является число доступных флуорохромов, с неперекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, и наличие соответствующих комплектов фильтров. 24-цветная FISH. Наиболее широко M-FISH используется как 24-цветная FISH для одновременной идентификации материала всех хромосом человека. Она обладает высокой эффективностью при детекции хромосомных транслокаций, но не предназначена для выявления делеций и инверсий. Однако, эта проблема может быть частично решена одновременной окраской хромосом DAPI, что дает возможность проведения анализа дифференциальной исчерченности хромосом, хромосомная принадлежность материала которых уже идентифицирована. К сожалению, необходимо заметить, что качество DAPIбэндинга хромосом после M-FISH существенно уступает GTG-дифференциальной окраске и даже DAPI-бэндингу после обычной in situ гибридизации. Следует также иметь в виду, что при транслокациях, затрагивающих хромосомы, мечение которых отличается одним дополнительным флуорохромом, точка разрыва, определяемая при использовании автоматического классификатор хромосом, смещается на расстояние от половины до бэнда в сторону района, меченного меньшим числом флуорохромов. Это обусловлено распластыванием хромосомного материала на стекле в момент приготовления препарата, а также техникой детекции флуорохромов, регистрирующей сигнал не только в месте расположения ДНК-мишени, но и в прилегающих районах (Christian et al., 1998). RxFISH. Принцип M-FISH был использован для создания многоцветного бар кода хромосом человека (Mueller et al., 1997) и метода многоцветного бэндинга хромосом (Mueller et al., 1998), основанного на межвидовой in situ гибридизации. В отличие от 24 цветной FISH этот метод позволяет непосредственно выявлять часть внутрихромосомных перестроек. ДНК зонды, используемые в RXFISH, помечены комбинацией 3-х флуорохромов, что обеспечивает 7 псевдоцветов. Они специфично окрашивают отдельные районы хромосом, создавая их цветную исчерченность. Такая особенность ДНК проб для RXFISH обусловлена способом их получения. Они представляют собой хромосом специфичные ДНК библиотеки двух видов гиббонов: Hylobates concolor и Hylobates syndactylus. В результате интенсивных хромосомных перестроек, имевших место при формировании современных видов гиббонов, материал их хромосом оказался сильно перетасованным в сравнении с организацией хромосом у человека, хромосомы которого известны своим консерватизмом. Отношение хромосомы 1 человека к хромосомам гиббонов приведено на рисунке 1, а на рисунке 2 приведен общий вид хромосом человека полученный в результате RXFISH. Очевидно, что, несмотря на всю фантастичность картины RXFISH, использование этого метода имеет достаточно серьезные ограничения: перестройки хромосом, имевшие место внутри одного цветного RX-бэнда не могут быть выявлены с помощью этого метода, если они не приводят к значительным и легко видимым изменениям размера этого бэнда. Более того, зонды окрашивают несколько хромосомных районов разных хромосом в один псевдоцвет. Тем не менее, следует признать, что RXFISH, при увеличении числа используемых флуорохромов, несомненно, будет более информативным, чем рутинная 24-цветная FISH. Рисунок 1. Цветная исчерченность хромосомы 1 человека при RXFISH. Авторы выражают благодарность фирме “Applied Imaging” за предоставленную иллюстрацию. Рисунок 2. Цветная исчерченность хромосом человека при RXFISH. Авторы выражают благодарность фирме “Applied Imaging” за предоставленную иллюстрацию. а) Метафазная пластинка. б) Раскладка хромосом. В настоящее время совместно с фирмой “Applied Imaging” авторы метода превратили его в рутинную процедуру, создав коммерчески доступный KIT, и необходимое программное обеспечение. К достоинствам RXFISH в настоящее время, несомненно, следует отнести следующие пункты: Метод позволяет осуществлять анализ всего генома человека в одном эксперименте многоцветной FISH. Имеются в наличии коммерчески доступные наборы меченых ДНК проб и необходимых систем детекции. Метод позволяет проводить быструю идентификацию значительной части внутри и межхромосомных перестроек. Возможна автоматическая идентификация метафазных хромосом “цветного бэндинга”. Для каждой хромосомы человека существует уникальный цветовой бар код. RXFISH интегрирован в рабочую станцию CytoVision и стандартные системы флуоресцентной микроскопии. К недостаткам RXFISH можно отнести большой размер многих цветных бэндов. А такие хромосомы человека, как 15, 18, 19, 21, 22, X и Y представляют собой один цветной бэнд каждая. Использование в будущем большего числа флуорохромов и новых ДНК проб, полученных благодаря использованию искусственных хромосом или микродиссекции метафазных хромосом, может значительно повысить разрешающие способности метода. С новостями RXFISH читатель может ознакомиться на WEBSITE фирмы “Applied Imaging” (http://www.aii.co.uk/). Многоцветный бэндинг хромосом (Multi Color Banding MCB) Цифровая запись микроизображений открыла широкие возможности их компьютерной обработки. В псевдоцвета могут быть переведены не только комбинации флуорохромов, но и соотношения их интенсивностей. Были сделаны попытки использовать такой подход для получения 24 цветной FISH, но он оказался менее надежным и не нашел широкого применения. Тем не менее, этот подход оказался продуктивен для разработки метода многоцветного бэндинга хромосом (MuliColor Banding - МСВ) (Chudoba et al., 1999b, Rubtsov et al., 2000). В отличие от RXFISH он предназначен не для полного анализа всех хромосом, а для проведения детального анализа отдельной хромосомы. Данная система была разработана сотрудниками Института генетики человека Университета города Йены в сотрудничестве с фирмой MetaSystems GmbH. В этих целях был получен комплект микродиссекционных ДНК-зондов, обеспечивающих необходимые профили интенсивности сигналов, и разработано специальное программное обеспечение “MetaSystems’ isis mFISH” для сравнительного анализа уровня свечения различных флуорохромов. Район специфичные ДНК пробы были помечены различными флуорохромами или комбинациями флуорохромов. Уровень сигнала каждой из микродиссекционных район-специфических ДНК-библиотек варьирует по интенсивности, достигая максимума в центре и постепенно падая практически до нуля на его границах. Перекрывание профилей интенсивности сигналов ДНК проб обеспечивает вариации соотношений интенсивностей флуоресценций различных флуорохромов вдоль хромосомы. Отношения интенсивностей может быть переведено в термины псевдоцвета, и таким образом, каждой точки изображения приписан свой псевдоцвет. В результате программной обработки изображения каждому из хромосомных районов будет соответствовать свой псевдоцвет. Наглядным примером использования данного подхода может служить цветной бэндинг хромосомы 5 человека. Семь район специфичных микродиссекционных ДНК проб были помечены 5 различными флуорохромами. Профили интенсивности сигналов ДНК-проб представлены на рисунке 3. Компьютерная обработка соотношений интенсивности свечения флуорохромов выделила более 20 бэндов различных псевдоцветов. Причем, это число бэндов выявляется даже на коротких, сильно конденсированных хромосомах, что открывает возможности проведения высокоразрешающего хромосомного анализа при окрашивании хромосом поздней метафазы. Данный вариант многоцветной FISH оказался высокоэффективным при анализе не только межхромосомных, но и внутрихромосомных перестроек при онкологических заболеваниях (Chudoba et al., 1999b, Starke et al., in press). Правда, для успешного его применения исследователь должен предварительно определить хромосому, в детальном изучении которой он заинтересован. С новыми разработками фирмы MetaSystems GmbH можно познакомиться на WEBSITE http://www.metasystems.de/. К настоящему времени, авторами статьи совместно с коллегами из Института генетики человека Йенского Университета получены комплекты ДНК-зондов, обеспечивающие получение МСВ всех хромосом человека. Рисунок 3. Многоцветный бэндинг хромосомы 5 человека (in situ гибридизация районспецифичных ДНК-библиотек на хромосому 5; профили сигналов район-специфичных ДНК-библиотек на хромосоме 5; многоцветный бэндинг хромосомы 5; идиограмма хромосомы 5; флуорохромы, использованные для МСВ). Авторы выражают благодарность фирме MetaSystems GmbH за предоставленную иллюстрацию. Для получения многоцветного бэндинга могут быть использованы не только микродиссекционные библиотеки, но и комплекты YAC-ов, несущих фрагменты ДНК соответствующих хромосомных районов (Heller et al., 2000). Однако, для получения МСВ индивидуальной хромосомы требуется несколько сот YAC-ов, а информативность полученного МСВ уступает МСВ полученному с помощью 3-7 микродиссекционных ДНК библиотек. Следует отметить, что благодаря сохранению пространственной организации хромосомы на всех стадиях клеточного цикла (Claussen et al., in preparation), МСВ позволяет проводить анализ реорганизации хромосом даже в интерфазных ядрах. Это открывает принципиально новые возможности цитогенетической диагностики при онкологических заболеваниях. Спектральное кариотипирование (spectral karyotyping SKY). Основные принципы анализа микроскопических изображений при спектральном кариотипировании практически не отличаются от используемых при M-FISH. Отличия связаны со способом регистрации изображения. Для этого используется технология “Spectral Imaging”, хорошо зарекомендовавшая себя ранее как в промышленности, так и в разнообразных исследованиях, требующих точного описания спектральных характеристик объекта. Внедрение этой технологии в биологию и медицину имело исключительно большой эффект. Она позволяет в ходе одного измерения получать спектральные кривые для всех точек изображения, вне зависимости связано ли это с эпифлуоресценцией или с традиционной световой микроскопией. Такой способ регистрации сигнала оказался менее чувствителен к вариациям интенсивностей сигналови позволяет достичь лучшего отношения сигнал/шум. Для спектрального кариотипирования всех хромосом человека используют пять флуорохромов: один в зеленом спектре, два в красном и два в инфракрасном. Возбуждение и эмиссия всех флуорохромов, используемых при мечении ДНК зондов, проходит при одном комплекте фильтров, что позволяет избежать их последовательной смены, промежуточных фокусировок, а, следовательно, и связанных с ними проблем, таких как пространственный сдвиг изображения, определение пороговых значений и сегментационных масок. В одном акте экспозиции полная спектральная характеристика испускаемого света одновременно записывается для каждого пикселя CCD имиджа. На основании анализа спектральных кривых определяется наличие или отсутствие в данной точке конкретных флуорохромов. Следующим шагом является процедура классификации, выполняемая с помощью специального программного обеспечения, которая позволяет прямо и однозначно определять хромосомную принадлежность анализируемого материала. Это обеспечивает надежную идентификацию (с точностью до хромосомы) материала маркерных хромосом, а также дериватов хромосом, являющихся следствием разнообразных перестроек (Macville et al., 1999). Большим достоинством SKY является то, что параллельно спектральному имиджу регистрируется окраска DAPI. Программное улучшение DAPI бэндинга позволяет достичь дифференциальной исчерченности по качеству близкой к GTG-бэндингу. Возможность параллельного анализа спектрального имиджа и качественной дифференциальной окраски хромосом значительно упрощает интерпретацию результатов SKY и позволяет более точно определять точки хромосомных разрывов. Кроме того, следует упомянуть, что SKY совместимо с анализом GTG-дифференциальной окраски. Практика использования “Spectral Imaging” показала, что эта технология является высоко эффективной и для анализа результатов FISH в интерфазных ядрах (спектральная FISH). К несомненным достоинствам SKY относится возможность использования флуорохромов с перекрывающимися спектрами возбуждения и эмиссии, что значительно расширяет список пригодных к использованию флуорохромов, а также увеличивает число, флуорохромов, которые могут быть использованы одновременно. Более того, включение в список нового флуорохрома не требует приобретения нового комплекта фильтров, так как для проведения SKY достаточно одного блока фильтров для спектральной FISH и одного блока фильтров для DAPI. Перечисленные выше преимущества SKY перед традиционной M-FISH отражаются в росте числа научных публикаций, в которых используется эта технология (DGS, 1998) К недостаткам SKY можно отнести длительное время экспонирования, необходимое для записи микроскопических изображений. Так же можно ожидать, что SKY является несколько менее эффективным, чем М-FISH, в случае необходимости проведения исследований с относительно небольшими по размеру ДНК-зондами. По крайней мере, на сегодняшний день нам неизвестно таких исследований. Анализ состава аномальных хромосом методом создания их ДНК-библиотек и обратной FISH. Одним из наиболее прямых и эффективных методов анализа аномальных хромосом является создание их ДНК-библиотек с последующей гибридизацией на хромосомы здорового донора. Как при проведении исследований, посвященных изучению реорганизации генома при злокачественной трансформации, так и в практической диагностике для получения таких ДНК-библотек наиболее эффективным, если не единственно возможным, является метод микродиссекции метафазных хромосом с последующей универсальной амплификацией ДНК изолированной хромосомы. Такой подход позволяет определять состав анализируемой хромосомы, описывая входящие в ее состав районы с точностью, достигающей уровня разрешения цитологического анализа прометафазных и даже профазных хромосом (Рубцов 1996), а так же идентифицировать материал, формирующий гомогенно окрашиваемые хромосомные районы (Guan et al., 1994, Rubtsov et al., 1995). Примеры реализации этого подхода при анализе хромосомных перестроек, имевших место у пациентов Новосибирской областной клиники, приведены в работе, опубликованной в настоящем номере журнала (Дегтярева и др., 2000). Первичное определение аномальной хромосомы, которая должна быть подвергнута детальному исследованию, может быть проведено либо методом GTG-дифференциальной окраски хромосом (Guan et al., 1992, Рубцов 1996), либо многоцветной FISH (Weimer et al., 2000). 5. Интерфазная цитогенетика. Если диагностика хромосомных патологий в интерфазном ядре методами M-FISH еще остается предметом будущих исследований, то ДНК-зонды, специфичные для интересующих районов хромосом, уже сегодня являются рутинным инструментом определения числа их копий в опухолевой клетке. Еще более эффективным оказалось использование сравнительной геномной гибридизации (Comparative Genome Hybridization CGH). Она позволяет определить районы хромосом, представленность которых изменена в исследуемых клетках. Данный метод позволяет выявлять нарушение баланса отдельных хромосомных районов даже в том случаев, когда в распоряжении экспериментатора находится лишь небольшой фрагмент фиксированного и хранящегося долгие годы образца ткани или опухоли. CGH заключается в сравнении результатов in situ гибридизации ДНК-зондов двух образцов: стандартной геномной ДНК человека и ДНК, выделенной из анализируемого образца. В условиях супрессионной in situ гибридизации на нормальные метафазные хромосомы при нарушении в опытном образце баланса хромосомных районов меняется соотношение интенсивностей сигналов (Piper et al., 1995; Du Manoir et al., 1993), что позволяет идентифицировать такие районы. CGH позволяет оценивать и выявлять нарушения количественной представленности хромосомных районов размером не менее 10Мb. Перспективным направлением развития CGH представляется матриксная CGH (Matrix-CGH)(Solinas-Toldo et al., 1997). Ускорение проведение анализа, повышение его эффективности и уровня разрешения достигается полной автоматизацией процедур приготовления чипа и анализа результатов гибридизации (Lampel et al., 2000). 6. Молекулярная цитогенетика онкологических заболеваний. Значение идентификации хромосомных перестроек, как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для клинической диагностики было продемонстрировано в предыдущих разделах настоящей статьи. Были упомянуты методические проблемы хромосомного анализа малигнизированных клеток, а также рассмотрены современные методы молекулярной цитогенетики, разработанные в последние годы. В настоящем разделе мы сделаем попытку проанализировать основные направления использования этих методов для цитогенетической диагностики при онкологических заболеваниях. Можно выделить следующие направления: 1. Создание КИТов для детекции хромосомных перестроек, выявление которых существенно для клинической диагностики и контроля эффективности терапии. 2. Разработка новых методов выявления и анализа хромосомных перестроек. Полный набор хромосом специфичных ДНК зондов позволяет выявлять большинство хромосомных траслокаций, однако, для детекции одной конкретной перестройки достаточно одного или двух ДНК-зондов. Для выявления типичной делеции, в качестве зонда, может быть использован клонированный фрагмент ДНК, имеющий соответствующую локализацию, а набор таких зондов представляет собой эффективный инструмент для уточнения ее границ. Несколько реже ДНК-зонды используются для выявления инверсий. Одним из примеров создания специального КИТа в целях цитогенетической диагностики инверсий может служить исследование по созданию ДНК зондов, позволяющих проводить детекцию inv(16)(p13q22). Идентификация хромосомных перестроек с точками разрывов в 16р13 и 16q22 позволяет выделить определенную группу больных среди пациентов с острой миелоидной лейкемией. Хромосомные аберрации с такими точками разрывов встречаются либо в виде inv(16)(p13q22), либо достаточно редко как t(16;16)(p13q22). inv(16) часто связана с FAB М4ЕО подтипом (bone marrow eosinophilia) острой миелоидной лейкемии. Она также наблюдается в М4 без эозинофилии и в М2 подтипе (Marlton et al., 1995). Для больных с острой миелоидной лейкемией и inv(16) только эта хромосомная аномалия имеет прогностическое значение (Marlton et al., 1995, Ghaddar et al., 1995). Следует заметить, что острая миелоидная лейкемия c inv(16) представляет собой один из самых благоприятных ее вариантов. Число пациентов с ремиссией более 5 лет достигает почти 50% процентов (Schiffer et al., 1989). В то же время, среди пациентов с острой миелоидной лейкемией и inv(16) наблюдается более высокая частота рецидивов, которая, однако, может быть уменьшена при терапии более высокими, чем стандартные, дозами Ara-С (Marlton et al., 1995, Holmes et al., 1985). Таким образом, точная идентификация inv(16) имеет не только прогностическое значение, но также важна для определения стратегии химиотерапии. Для решения этой проблемы были получены 16р и 16q специфичные ДНК зонды. Данные зонды при CISS гибридизации дают яркие сигналы, окрашивая каждое из плеч в свой цвет. В случае перицентрической инверсии хромосомы 16 проведение CISS-гибридизации приводит к чередованию цветов в каждом плече, позволяя легко детектировать inv(16) даже на препаратах очень низкого качества (Chudoba et al., 1996). Очевидно, что поиск диагностически и прогностически значимых хромосомных перестроек требует полного хромосомного анализа малигнизированных клеток. Внедрение в эту область многоцветной in situ гибридизации сделало проведение этих исследований значительно более эффективным. Сравнение результатов SKY и традиционных цитологических методов показало, что в случае анализа лейкемий, лейкозов, MDS и других подобных заболеваний методы дифференциального окрашивания хромосом позволили правильно идентифицировать немногим более трети хромосомных перестроек, выявленных SKY. Около трети перестроек было идентифицировано неверно, а остальные – были не замечены при использовании только цитологических методов анализа (Schroeck, личное сообщение). Положение с анализом цитологическими методами хромосомных перестроек в солидных опухолях оказалось еще более тяжелым: цитологическими методами в солидных опухолях было выявлено и правильно идентифицировано лишь 15% хромосомных перестроек, 40% перестроек были идентифицированы неверно, а 45% остались незамеченными (Schroeck, личное сообщение). Ограниченные возможности цитологических методов хромосомного анализа также были ярко продемонстрированы в исследованиях двух раковых клеточных линий (SW480 и SW620) (Melcher et al., 2000). Следует напомнить, что и SKY эффективно лишь при анализе траслокаций и достаточно крупных делеций. Небольшие делеции могут легко остаться незамеченными и при использовании SKY или M-FISH, а инверсии в принципе не могут быть детектированы этими методами. Более детальное описание хромосомной перестройки может быть достигнуто благодаря использованию многоцветного бэндинга (Chudoba et al., 1999a). Однако, для его использования необходимо получение предварительной информации, какие хромосомы подверглись реорганизации. Высоко эффективным для анализа сложно перестроенных хромосом является метод микродиссекции с последующим получением хромосом или район-специфичных ДНК зондов (Rubtsov et al., 1998). Необходимым условием реализации этого метода была возможность опознания маркерной хромосомы с помощью методов GTGдифференциального окрашивания. Дальнейшее совершенствование технологии микродиссекции метафазных хромосом позволило перейти на микродиссекцию хромосом, идентификация которых проводилась с помощью многоцветной in situ гибридизации (Weimer et al., 2000). Таким образом, удается объединить возможности in situ гибридизации для выявления аномальных хромосом и микродиссекции метафазных хромосом для точной локализации точек разрывов, имевших место при формировании маркерной хромосомы. Микродиссекция метафазных хромосом хорошо зарекомендовала себя в исследованиях, требующих определения происхождения материала цитологически идентифицируемых структур. Примером могут служить исследования, посвященные определению состава гомогенно окрашиваемых районов хромосом и происхождению DM хромосом (Guan et al., 1994, Rubtsov et al., 1995). Далеко не всегда препараты метафазных хромосом оказываются доступными исследователю. В связи с этим, актуальным является развитие методов интерфазной цитогенетики. FISH, при наличии необходимых ДНК зондов, позволяет выявлять численные хромосомные аномалии (Cremer et al., 1988, 1986) и значимые структурные хромосомные перестройки даже при отсутствии на препарате метафазных хромосом. Однако, значительно большие возможности для выявления нарушения баланса хромосомных районов в клетках солидных опухолей обеспечивает проведение сравнительной геномной гибридизации. CGH стала одним из наиболее эффективно используемых в клинической диагностики методов хромосомного анализа (Subero et al., 2000). 7. Заключение Анализ организации современной диагностики онкологических заболеваний, набора используемых методов, а также тенденций их развития наглядно демонстрирует непрерывно возрастающее значение новых технологий молекулярной цитогенетики. К сожалению, стратегия современного цитогенетического анализа находится в сильной, если не полной, зависимости от приборной базы и реактивного обеспечения диагностических лабораторий. В Российской Федерации сделана попытка концентрации средств для проведения исследований, связанных санализом сложных хромосомным перестроек. Основные ресурсы для проведения современной цитогенетической диагностики сконцентрированы в Федеральных медико-генетических Центрах, которые расположены в Москве, Санкт-Петербурге и Томске. Все они были основаны на базе институтов, непосредственно связанных с решением проблем клинической и фундаментальной медицинской генетики. В настоящее время их деятельность главным образом направлена на молекулярную диагностику наследственных заболеваний, идентификацию мутаций, исследования полиморфизма генов, связанных с развитием наследственных заболеваний, а также с детальным анализом сложных хромосомных перестроек. К сожалению, даже в Федеральных Центрах отсутствуют возможности проведения M-FISH и исследования ограничены анализом врожденных хромосомных патологий. В Санкт-Петербурге FISH применяется для интерфазной диагностики анеуплоидий хромосом 13, 18, 21, Х и Y, и для определения происхождения маркерных хромосом (Baranov 1999). В рамках российской программы по картированию генома человека была создана оригинальная коллекция клонированных ДНК последовательностей, которая может быть эффективно использована совместно с коммерчески доступными ДНК зондами (Ворсанова и др., 1998). Проблемы разработки и внедрения новых методов цитогенетического анализа при онкологических заболеваниях, к сожалению, не входят в круг их первоочередных интересов. Единственными известными нами исследованиями в этой области, проводимыми на территории России, являются эпизодические работы, проводимые Институтом цитологии и генетики СО РАН совместно с Новосибирской медицинской академией (Rubtsov et al., 2000, Дегтярева и др., 2000, Бабочкина и др., 2000, Rubtsov et al., in preparation). Основным подходом, используемым в этих исследованиях, являлось получение ДНК-библиотек аномальных хромосом для последующего определения их состава с путем обратной in situ гибридизации. Проведение SKY и МСВ требовало привлечения возможностей коллег из Германии и Швеции (Rubtsov et al., in preparation). Ограничения объемов таких исследований во многом обусловлено их проведением в качестве инициативных проектов без какого-либо целевого финансирования. В то же время в Новосибирском научном центре есть все необходимое для организации более масштабной молекулярно-цитогенетической диагностики онкологических заболеваний, а также производства новых комплектов ДНК-зондов для детекции различных транслокаций и инверсий хромосом, имеющих практическое значение для диагностики и контроля эффективности проводимой терапии. Реализация этих возможностей связана, главным образом, с решением ряда организационных и финансовых проблем. Литература. 1. Бабочкина Т.И.. Дегтярева М.М., Саблина О.В., Рубцов Н.Б. Уточнение результатов хромосомного анализа МДС классической цитогенетической диагностики микродиссекцией метафазных хромосом. // Клиническая онкология и гематология. 2000. No 2. С. ххх 2. Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Соловьёв И.В., // Восьмая итоговая конференция Геном человека-98. 1998. С.70 1. Дегтярева М.М., Карамышева Т.В., Саблина О.В., Рубцов Н.Б. Молекулярноцитогенетическая диагностика сложных хромосомных перестроек при остром миелоидном лейкозе // Клиническая онкология и гематология. 2000. No 2. С. ххх. 2. Рубцов Н.Б. Системы идентификации гомологичных районов хромосом: сравнительная цитогенетика млекопитающих и хромосомные патологии человека // Новосибирск 1996. С. 1-48. 3. Bain B.J. The role of cytogenetics in the assessment of haematological disorders. In: Human Cytogenetics. Volume II. Malignancy and acquired abnormalities. A practical approach. Ed by D.E.Rooney and Czepulkowski. Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. P.121-154. 4. Baranov V.S. Peculiarities of organisation and present state of prenatal diagnosis service in Russia. // E.C.A. News Letter. 1999. N.3 P.9-10. 1. Boveri T, Zur Frage der Entstehung maligner Tumoren. // Verlag von GustavFischer, Jena. 1914. 2. Caspersson T, Zech L, Johansson C, Modest EJ. Identification of human chromosomes by DNA-binding fluorescent agents. // Chromosoma. 1970. V.30. P.215-227. 3. Christian A., McNiel E., Robinson J., Drabek R. Et al., A versatile image analysis approach for simultaneous chromosome identification and localization of FISH probes // Cytogenet Cell Genet 1998 V.82 P.1724. Chudoba I., Plesch A., Loerch T., et al. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosmes. // Cytogenet Cell Genet. 1999b. V.84. P.156-160. 5. Chudoba I., Rubtsov N., Senger G. et al., Improved detection of chromosome 16 rearrangements in acute myeloid leukemias using 16p and 16q specific microdissection DNA libraries. // Oncology reports. 1996. N.3. P.829-832. 6. Chudoba I., Senger G., Plesch A., Claussen U. New developments in clinical cytogenetics. // E.C.AS. News Letter. 1999а. N.3. P.3-6. 7. Claussen U., Lemke J., Michel S., Chudoba I, M?hlig P., Westermann M., Claussen J., Rubtsov N., Grummt U-W., and Liehr T. New concept of chromosome condensation de-condensation in cell cycle // In preparation. 8. Cremer T., Landegent JE, Brueckner H., Scholl HP. et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by vizualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. // Hum.Genet. 1986. V.74. P.346-352. 9. Cremer T., Lichter P., Borden J., et al. Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using chromosome-specific library probes. // Hum Genet. 1988. V.80. P.235-246. 10. DGS. SKYtm vs. M-FISH comparison. // 1998. rev 13-Nov. P.1/8-8/8. 11. Du Manoir S. Speicher MR., Joos S. Et al. Detection of complete and partial chromosome gains and losses by comparative genomic hybridization. // Hum Genet. 1993. V.90. P. 590-610. 12. Gall J. G., Pardue M,L. Molecular hybridisation of radioactive DNA to the DNA of the cytological preparations. // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1969. V.64.P.600-604. 13. Ghaddar HM, Pierce S, Reed P, Estey EH. Prognostic value of residual normal metaphases in acute myelogenous leukemia patients presenting with abnormal karyotype. // Leukemia. 1995, V.9. P.779-782. 14. Guan X.-Y., Meltzer P.S., Cao J., Trent J.M. Rapid generation of region-specific genomic clones by chromosome microdissection: isolation of DNA from a region frequently deleted in malignant melanoma. // Genomics. 1992. V.14.P.680-684. 15. Guan X-Y, Meltzer P.S, Dalton W.S, Trent J.M. Identification of cryptic sites of DNA sequence amplification in human breast cancer by chromosome microdissection. // Nature Genetics. 1994. V.8. P.155-161 16. von Hansemann, D. Ueber asymmetrische zelltheilung in epitelkrebsen und deren biologische bedeutung. // Virchows Arch.A.Pathol. Anat. 1890. V.119. V.299-326. 17. Heerema N.A., Bray-Ward P., Ward D.C., Henegariu O. Colour-changing karyotyping: an alternative to M-FISH/SKY. // Nature Genetics. 1999. V.23. N.3. P.263-264. 18. Heim S., Mitelman F. Cancer Cytogenetics. 2nd edn. // Wiley-Liss, New York. 1995. 19. Heller A., Starke H., Trivonov V., Rubtsov N. Multicolor banding (MCB) of human chromosomes based on region specific YAC clones and/or microdissection libraries. // Medgen. 2000. V.12. N.1. P. 92. 20. Holmes R, Keating MJ, Cork A, et al. A unique pattern of central nervous system relapse in acute myelomonocytic leukemia associated with inv(16)(p13q22). // Blood. 1985. V.65. P.1071-1075. 21. John H.A., Birnstiel M., Jones K.W.RNA-DNA hybrids at the cytological level. // Nature (Lond.). 1969. V.223. P.582-587. 22. Klein G. Multiple phenotypic consequences of the Ig/Myc translocation in B-cell-derived tumors. // Genes Chromosom. Cancer. 1989. V.1. p.3-8. 23. Knudson A.G. Hereditary cancer, oncogenes, and antioncogenes. // Cancer res. 1985. V.45. P.1437-1443. 24. Knudson A.G. Mutation and cancer: A personal odyssey. // Adv. Cancer. Res. 1995. V.67. P.1-23. 25. Koller P.C. The Role of Chromosomes in Cancer Biology. // Recent Results in Cancer Research. 1972. Springer Verlag, Berlin. V.38. 26. Lampel S., Nessling M, Soder A. et al. Matrix-CGH allows a fully automated analysis of genetic imbalances in B-CLL. // Medgen. 2000. V.12. P.95. 27. Levan A. Some current problems of cancer cytogenetics. // Hereditas. 1967. V.57. P.343355. 28. Lichter P., Boyle L., Cremer T., Ward D. Analysis of genes and chromosomes by nonisotopic in situ hybridization. // GATA. 1991. V.8 N.1. P.24-35. 29. Macville M., Schroeck E., Padilla-Nash h., et al. Comprehensive and definitive molecular cytogenetic characterization of HeLa cells by spectral karyotiping. // Cancer Res. 1999. V.59. P.141-150. 30. Marlton P., Claxton DF, Liu P., et al. Molecular characterization of 16p deletions associated with inversion 16 defines the critical fusion for leukemogenesis. // Blood. 1995. V.85. P.772-779. 31. Melcher R., Steinlein C. et.al. Spectral karyotyping of the human colon cancer cell lines SW480 and SW620. // Cytogenet Cell Genet. 2000. V.88. P.145-152. 32. Mitelman F., Mertens F, Johansson B. A breakpoint map of recurrent chromosomal rearrngements in human neoplasia. // Nature Genetics. Special issue. 1997. P.415-474. 33. Mueller S, O’Brien PC, Ferguson-Smith MA., Wienberg J. Cross-species colour segmentating: a novel tool in human karyotipe analysis. // Cytometry. 1998. V.33. P.445452. 34. Mueller S, Rocchi M, Ferguson-Smith M., Wienberg J. Toward a multicolor chromosome bar code for the entire human karyotype by fluorescence in situ hybridization. // Hum Genet 100. P.271-278 .1997. 35. Nowell P.C., Hungerford D.A. A minute chromosome in human chronic granulocitic leukemia. // Science. 1960. V.132. P.1497. 36. Piper J., Rutovitz D., Sudar D., Kallioniemi A., Kallioniemi O-P. Computer image analysis of comparative genomic hybridization. // Cytometry. 1995. V.19. P.10-26. 37. Potter A.M., Watmore A. Cytogenetics in myeloid leukaemia. // in “Human Cytogenetics: a practical approach.” 1992. V.11. P.27-67. 38. Pui C-H., Crist W.M., and Look A.T. Biology and clinical significance of cytogenetic abnormalities in childhood acute lymphoblastic leukemia // Blood 1990. V. 76. P.14491463. 39. Rabbitts TH. Chromosomal translocations in human cancer. // Nature. 1994, V.372. P.143-149. 40. Rowley J.D. The Philadelphia chromosome translocation. A paradigm for understanding leukemia. // Cancer. 1990. V.65. P.2178-2184. 41. Rowley J.D., Aster J.C., Sklar J. The clinical applications of new DNA diagnostic technology on the management of cancer patients. // Jama. 1993. V.270. P.2331-2337. 42. Rubtsov N, Junker K, von Eggeling F, Michel S, Claussen U. Chromosomal origin and distribution of DNA from the homogeneously staining regions in COLO 320-HSR cells. //. Medgen, 1995, V. 7, P.55 43. Rubtsov N, Karamysheva T, Babochkina T, Zhdanova N, Trifonov V, Starke H, Heller A, Junker K, Liehr T, Claussen U. A new simple version of chromosome microdissection tested by probe generation for 24-multi-color FISH, Multi-color banding (MCB), ZOOFISH and in clinical diagnostics // Medgen 2000, V.12. P.65 44. Rubtsov N., Sablina O., Ivanova I., Zhdanova N., Graphodatsky A. Chromosome microdissection is a universal tool for studies of mammalian chromosome rearrangements. // Medgen. 1998, 10, P.149. 45. Rubtsov N., Karamysheva T., Degtjareva M., Sablina O., Heller A., Starke H., Trivonov V., Claussen U., Liehr T. Delineation of chromosome rearrangement in AML with chromosome microdissection, SKY, and MCB // Leukemia, in preparation. 46. Sandberg A.A. The Chromosomes in Human Cancer and Leukemia, 2nd edn. // Elsevier. New York. 1990. 47. Schiffer CA, Lee EJ, Tomiyasu T et al. Prognostic impact of cytogenetic abnormalities in patients with de novo acute nonlymphocytic leukemia. // Blood. 1989. V.73. P.263-270. 48. Schroeck E., Manoir S., Veldman T. et al, Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. // Science 1996. V.273. P.494-497. 49. Senger G., Chudoba I., Rubtsov N., Claussen U. Identifizierung strukturell veraenderter Chromosomen durch Mikrosezierung und “reverse painting” // Medgen (1997), V.9. P.146-150. 50. Solinas-Toldo S., Lengauer C., Fries R. Comparative genome map of human and cattle. // Genomics. V.27. P.489-496. 51. Speicher M.R., Ballard S.G., Ward D.C. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. // Nature Genet. 1996. V.12. P.368-375. 52. Stanbridge E.J. Functional evidence for human tumour supressor genes: Chromosome and molecular genetic studies. // Cancer Surv. 1992. V.12.P.5-24. 53. Starke H., Raida M., Trifonov V., Clement J.H., Loncarevic I.F, Cordula B., Nietzel A., Rubtsov N., Heller A., Claussen U., Liehr T. Molecular cytogenetic characterization of an acquired supernumerary minute marker chromosome 11 as sole abnormality in a case clinically diagnosed as Philadelphia negative CML. // Leukemia, in press. 54. Subero M., Ignacio J., Viardot A., Siebert R., Harder S., Bentz M., Schlegelberger B. Secondary aberration in fillicle center lymphoma: evaluatio of the diagnostic power of comparative genomic hybridization (CGH) and standard chromosome analysis (CA) //Medgen 2000. V.12. P.130/ 55. Takahashi E., Hori T., O’Conell P., Leppert M. White R: R-banding and nonisotopic in situ hybridization: pricize localization of the human type II colagen (COL2A1). // Hum.Genet. 1990.V.86.P.14-16. 56. Telenius H., Carter N.P., Bebb C.E. Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by single degenerate primer. // Genomics. 1992. V.13. P.718-725. 57. Weimer J., Kiechle M., Arnold N. FISH-microdissection (FISH-MD) analysis of complex chromosome rearrangements. // Cytogenet Cell Genet. 2000. V.88. P.114-118. 58. Weinberg R.A. Oncogenes and tumor suppressor genes. // CA Cancer J. Clin. 1994. V.44. P.160-170. Winge O. Zytologische untersuchungen uber die natur maligner tumoren. II. Teerkarzinomen bei mausen. // Zeliforsch mikrosk Anat. 1930. V.10. P.683-735.