Виды фотовоздействия на биологические ткани. Оптическая

СПЕЦКУРС
ОПТИЧЕСКИЙ БИОИМИДЖИНГ
лекция 1
Турчин Илья Викторович
ИПФ РАН, отдел радиофизических методов в медицине
НижГМА, научная лаборатория флуоресцентного биомиджинга НИИ БМТ
E-mail: ilya@ufp.appl.sci-nnov.ru
http://bioimaging.ru/
Тел.: 8(831)4368010
Нижний Новгород 2013
Электромагнитное излучение
Видимый и ближний инфракрасный диапазон (400-1300 нм)
Виды фотовоздействия на биологические ткани
Облученность [Вт/см2]
Фотоакустические повреждения
Лазерная хирургия (фотокоагуляция
и фотоабляция)
0.1 J/cm2
Тепловое разрушение
Фотодинамическая терапия
Диагностика
Время воздействия [сек]
Encyclopedia of Optical Engineering, 2004
Диагностика биотканей оптическими методами
Видимый и ближний инфракрасный диапазон длин волн (400-1300 нм) в
приложениях к медико-биологическим исследованиям
• Неинвазивность (при разумных дозах излучения)
•Высокое пространственное разрешение (различные виды
микроскопии)
• Возможность визуализации на глубине (оптическая томография)
• Возможность определения компонентного состава биологических
тканей (использование зондирующего излучения на нескольких
длинах волн)
• Возможность использования оптических контрастов
(специфическое окрашивание)
Распространение света в биологических тканях
• Рассеяние – фотон отклоняется от своего первоначального
направления
Источники
света
(фотонов)
•Поглощение – фотон поглощается,
выделяется тепло.
При поглощении короткого светового
импульса (наносекундного) из места
поглощения распространяется
ультразвуковая волна
•Флуоресценция – фотон
поглощается веществом
(флуорофором) и
переизлучается на другой длине
волны
Рассеяние в тканях обусловлено микронеоднородностями
показателя преломления n
n
Размер, µm
Клетка
1.36-1.4
5-30
Ядро
1.39-1.47
3-10
Митохондрия
1.40-1.42
0.5-3
Нерассеивающая
(слабо рассеивающая среда)
Примеры: рентгеновское излучение,
оптическое излучение в оптически
прозрачных объектах
Сильно рассеивающая среда
Примеры: оптическое излучение практически
во всех биологических тканях
Детекторы
Детекторы
Источники
Источники
Зависимость поглощения света в биотканях от длины волны
Терапевтическое окно прозрачности
биотканей, где поглощение света
минимально: 600 -1200 нм
УФ
ИК
микроволны
Зависимость ослабления света от длины
волны при прохождении сквозь слой биоткани
Длина волны, нм
Зависимость показателя поглощения
различных компонент биологических тканей
от длины волны
Формирование оптического изображения (оптический контраст)
Свойства биологических тканей:
- рассеяние,
- поглощение света,
- зависимость оптических параметров от длины волны,
- автофлуоресценция.
Использование специфического окрашивания:
- флуоресцентные метки,
- биолюминесцентные метки,
- метки с высоким показателем поглощения/рассеяния.
Исследование внутренней структуры биотканей оптическими методами
Зондирующее излучение
Спектральный
диапазон
Методы оптического
биоимиджинга
Микроскопия
(контраст - показатель преломления,
флуорофоры)
Глубина исследования
100 -200 микрон
Любой:
400-1200 нм
(от видимого до
ближнего ИК)
Оптическая когерентная томография
(контраст – показатель рассеяния)
1-2 мм
Оптоакустическая томография
2-20 мм
(контраст – показатель поглощения)
Оптическая
диффузионная томография
(контраст - показатели рассеяния и
поглощения),
От нескольких
миллиметров до 10 см
диффузионная флуоресцентная
томография
(контраст - флуорофоры),
глубина
600-1200 нм
(дальнекрасный
– ближний ИК
диапазоны)
700-950 нм
(минимальное
поглощение)
Исследование внутренней структуры биотканей оптическими методами
Зондирующее излучение
Спектральный
диапазон
Методы оптического
биоимиджинга
Микроскопия
(контраст - показатель преломления,
флуорофоры)
Глубина исследования
100 -200 микрон
Любой:
400-1200 нм
(от видимого до
ближнего ИК)
Оптическая когерентная томография
(контраст – показатель рассеяния)
1-2 мм
Оптоакустическая томография
2-20 мм
(контраст – показатель поглощения)
Оптическая
диффузионная томография
(контраст - показатели рассеяния и
поглощения),
От нескольких
миллиметров до 10 см
диффузионная флуоресцентная
томография
(контраст - флуорофоры),
глубина
600-1200 нм
(дальнекрасный
– ближний ИК
диапазоны)
700-950 нм
(минимальное
поглощение)
Флуоресцентная микроскопия
Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (КЛСМ) позволяет получать
флуоресцентные изображения образцов биотканей с высоким качеством
с глубины до 200 микрон
Биологический материал, как правило, сам по себе
флуоресцирует крайне слабо, но благодаря применению
ярких и разнообразных флуоресцентных молекул
(флуорофоров), способных специфически окрашивать
разные структуры тканей и клеток, метод флуоресцентной
микроскопии оказался очень ценным для медикобиологических исследований.
Синтезированные
флуорофоры
Флуоресцентные
белки
Конфокальная лазерная сканирующая
микроскопия (КЛСМ)
(Laser scanning microscopy (LSM))
(LSM
Широкопольная микроскопия
Сканирующее
устройство
Лазер
Приемник
Пинхол детектора
(конфокальная
диафрагма)
Объектив
Поперечное (1) и продольное (2)
разрешение для КЛСМ
Widefield microscopy
Флуоресцентная КЛСМ
Фотодетектор
(ФЭУ)
Пинхол
детектора
Эмиссионный
фильтр
Источник
возбуждающего
излучения
(лазер)
Дихроическое
зеркало
Объектив
Пинхол
источника
Фокальные
плоскости
Образец
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys598om/spring12/Lectures/files/Lecture%206%20confocal%202012.pdf
Сравнение широкопольной микроскопии и
конфокальной микроскопии
Функция размытия
точки (ФРТ) – point
spread function
Поле подсветки
X
Широкопольная
микроскопия
(widefield
microscopy)
Z
Конфокальная
микроскопия
(confocal
microscopy)
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys598om/spring12/Lectures/files/Lecture%206%20confocal%202012.pdf
Сравнение широкопольной микроскопии и КЛСМ
Широкопольная
микроскопия
Конфокальная
микроскопия
(a) and (b) Mouse brain hippocampus thick section treated with primary antibodies to glial fibrillary
acidic protein (GFAP; red),neurofilaments H (green), and counterstained with Hoechst 33342 (blue) to
highlight nuclei. (c) and (d) Thick section of rat smooth muscle stained with phalloidin conjugated to
Alexa Fluor 568 (targeting actin; red), wheat germ agglutinin conjugated to Oregon Green 488
(glycoproteins; green), and counterstained with DRAQ5 (nuclei; blue). (e) and (f) Sunflower pollen
grain tetrad autofluorescence.
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys598om/spring12/Lectures/files/Lecture%206%20confocal%202012.pdf
Применение многофотонной КЛСМ в медицинской диагностике
http://www.jenlab.de/
• Диагностика различных кожных заболеваний, в т.ч.
раннее обнаружение злокачественных новообразований
• Тканевая инженерия
• Исследование применения косметических препаратов
• Мониторинг действия лекарственных препаратов in
situ
• Исследования на лабораторных животных
Виртуальный срез кожи человека in vivo (Papilla)
(Зеленый цвет: автофлуоресценция; красный:
двухфотонное возбуждение)
Дифракционный предел в конфокальной микроскопии
ограничивает разрешение метода –
световой луч нельзя сфокусировать в пятно меньшего размера
500 нм
200 нм
Длина волны
Линза
Методы микроскопии сверхвысокого разрешения
позволяют «преодолеть» дифракционный предел:
• Stimulated emission depletion (STED)
• Photoactivated Localization Microscopy (PALM)
• Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)
Микроскопия сверхвысокого разрешения –
Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM)
Флуоресценция одной молекулы
и положение ее центра
Флуоресценция нескольких близко
расположенных молекул
Локализация молекул
путем последовательного
их включения
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
Принцип действия STORM
Флуоресценция нескольких молекул
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
Принцип действия STORM
1. Перевод молекул в неактивное состояние
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
Принцип действия STORM
2. На небольшом участке одна молекула под воздействием
активирующего излучения стохастически перешла в активное
состояние, в котором способна флуоресцировать
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
Принцип действия STORM
3. Высвечивание молекулой большого количества фотонов
привело к ее фотообесцвечиванию (либо молекула была
переведена в неактивное состояние лазерным излучением)
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
Принцип действия STORM
4. Под воздействием активирующего света стохастически в
активное состояние перешла другая молекула
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
Принцип действия STORM
5. V.потом другая
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
Принцип действия STORM
V.и так далее
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
Принцип действия STORM
Таким образом, метод определил
положения всех молекул в данной области с точностью,
превышающей дифракционный предел
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
КЛСМ
5 µm
B-SC-1 cell,
Microtubules stained with anti-β tubulin
Cy3 / Alexa 647 secondary antibody
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
STORM
5 µm
Bates et al, Science 317, 1749 – 1753 (2007)
КЛСМ
STORM
500 nm
5 µm
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
STORM
█ Cy3 / Alexa 647: Clathrin (Клатрин)
█ Cy2 / Alexa 647: Microtubule
(микротрубка)
5 µm
Bates et al, Science 317, 1749 – 1753 (2007)
STORM
1 µm
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
STORM
Avg = 172 nm
200 nm
http://online.physics.uiuc.edu/courses/phys498bio/spring08/Lec13%20Part%20II%20022508%20STORM.ppt
Флуоресцентная ультрамикроскопия
просветленных образцов биоткани
5
ИПФ РАН/
ИНФ РАН
3
1
3
4
2
Ультрамикроскопия
КЛСМ
мозжечок взрослой мыши
(a)
z, мм
(Глубина)
(b)
1
х, мм
эмбрион мыши
Б
Институт прикладной физики РАН, лаборатория биофтоники –
разработка методов оптического биоимиджинга
микроскопия
Оптоакустика
Диффузионная флуоресцентная
томография
Диффузионная
спектроскопия
Ультрамикроскопия
(a)
50
40
30
20
10
0
0
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90
90
(b)