РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

УДК 615.21:57.083.3
РАЗРАБОТКА ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО
АНАЛИЗА ПСИХОАКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В
БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ
В.С. Морозова, Е.Д. Другова, М.А. Мягкова
Институт физиологически активных веществ РАН , Северный проезд, 1, г. Черноголовка,
Ногинский район, Московская область,142432, Россия, email: vmorozova@gmail.com
Аннотация
В статье представлена разработка иммунохроматографических (ИХ) тест-систем (тест-полосок) для выявления психоактивных
веществ (ПАВ) шести классов: опиаты, амфетамины, каннабиноиды, экстази, бензодиазепины, метадон. Впервые созданы простые
методики пробоподготовки для быстрого ИХ определения указанных ПАВ в спектре биологических и небиологических объектов:
потожировых выделениях, волосах, моче, смывах с поверхностей, частях растений, неизвестных субстанциях. Пределы обнаружения
ПАВ в моче составили: 200 нг/мл для морфина, 300 нг/мл для амфетамина, 50 нг/мл для каннабиноидов, 500 нг/мл для экстази, 200
нг/мл для диазепама, 300 нг/мл для метадона. Представленные методы пробоподготовки и анализа не требуют специального
оборудования и реагентов и могут быть использованы в «полевых» или домашних условиях неспециалистами для предварительного
скрининга ПАВ. Разработанные тест-системы имеют широкие перспективы применения: для диагностики наркомании, выявления
наркопотребления в школах, вузах, на предприятиях, среди работников опасных производств, силовых структур, в работе полиции.
Ключевые слова:
иммунохроматографический анализ, наркотические вещества, психоактивные вещества, моча, потожировые
выделения, волосы, смывы с поверхностей, части растений
Поступило в редакцию: 02.12.2014
Опубликовано: 29.12.2014
Это произведение доступно по лицензии Creative Commons «Attribution» («Атрибуция») 4.0 Всемирная. Чтобы
увидеть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
1. Введение
Одной из самых актуальных задач в современном обществе является борьба с распространением
наркомании, в том числе совершенствование методик своевременной диагностики наркозависимости и
определения наркотиков в различных матрицах. Наиболее удобным и недорогим скрининговым методом
определения наркотических веществ является иммунохроматографический анализ (ИХА). Из-за простоты в
использовании и возможности применения в «полевых» условиях, без оборудования, метод получил
наиболее широкое распространение среди всех скрининговых методов в различных областях: клинической
диагностике, самодиагностике, экологическом мониторинге, сельском хозяйстве, ветеринарии, биозащите и
др. [He, Parker, 2013, p. 139].
Разработка технологических стадий иммунохроматографического анализа является по сути
«перенесением» иммунореагентов из формата более известного иммуноферментного анализа (ИФА) на
формат ИХА, т.е. на нитроцеллюлозную тест-полоску. Однако данный процесс является многостадийным:
подбор материалов, реагентов и условий проведения анализа осуществляется на нескольких этапах
разработки ИХА. Перечислим эти основные этапы:
 Выбор материалов для производства тест-полосок;
 подбор оптимальных концентраций иммунореагентов: конъюгатов антитела-метка, конъюгатов антигенбелок-носитель, антивидовых антител;
 подбор дополнительных реагентов для предобработки компонентов тест-полоски (позволяет улучшить
свойства потока, и тем самым обеспечить лучшую чувствительность теста);
 подбор реагентов и их концентраций для «забивки» мембраны (позволяет улучшить характеристики
анализа и стабильность теста) [He, Parker, 2013; Lateral Flow Immunoassay, 2009].
На рис. 1 представлена схема производства иммунохроматографических тестов. На каждом этапе
данной технологической схемы производится оптимизация условий.
Открытый научный бюллетень. Вып. 4. 2014
Open Scientific Bulletin. Issue 4. 2014
www.openbull.com
Рис. 1. Схема стадий производства иммунохроматографических тестов
Для эффективного выявления потребителей наркотиков необходим скрининг наркотических веществ
в разных видах объектов: биологических и небиологических. При установлении факта приема ПАВ
конкретным человеком и диагностики наркозависимости определяют ПАВ и их метаболиты в моче
[Горбачева, Морозова, Мягкова, 2013; Демерчян, 2007; Otero-Fernández, 2013; Солодухина и др., 2010],
слюне [Горбачева, Морозова, Мягкова, 2013; Киселева, Мягкова, Шакир и др., 2010; Киселева, Мягкова,
Анохин и др., 2010], крови, волосах [Горбачева, Морозова, Мягкова, 2013; Imbert et al., 2014], смывах с кожи
(потожировые выделения), экстрактах тканей. Все данные виды биообъектов не являются
взаимозаменяемыми, так как каждый из них показывает разные сроки употребления ПАВ и используется,
соответственно, для различных целей [Брюн, Мягкова, Сокольчик и др., 2011]. В работе полиции, связанной
с борьбой с наркотиками, часто необходимо определять наличие наркотических веществ в неизвестных
субстанциях, подозрительных частях растений, на поверхностях. Путем выявления ПАВ в смывах,
сделанных на рабочем месте человека (с рабочего стола, клавиатуры и др. предметов, с которыми часто
соприкасается человек), можно определить наркопотребителя без согласия на тестирование и даже без
ведома подозреваемого. Это особенно важно для предотвращения употребления наркотиков работниками,
занятых в опасных и особенно ответственных сферах, на работах, связанных с риском техногенных
катастроф и опасностью для населения.
Иммунохроматографические тесты для определения наркотических и психоактивных веществ в моче
широко распространены на рынке медицинских изделий. Это наиболее простой метод определения
недавнего факта употребления ПАВ. Ранее нами разработан метод ИХА определения ПАВ в слюне
[Мягкова, Морозова, 2010], предназначенный для выявления состояния наркотического опьянения.
Определение ПАВ в более сложных объектах, требующих пробоподготовки (волосы, ногти, смывы,
небиологические объекты) производится только хромато-масс-спектрометрическими методами в химикотоксикологических и экспертно-криминалистических лабораториях [Imbert et al., 2014; Брюн, Мягкова,
Морозова и др., 2011]. Простых методов пре-скрининга для таких видов объектов нет. Задача настоящей
работы – разработка тест-систем ИХА и методик пробоподготовки для быстрого скрининга шести наиболее
распространенных классов ПАВ (опиаты, амфетамины, каннабиноиды, экстази, бензодиазепины, метадон) в
различных видах биологических и небиологических объектов: потожировых выделениях, волосах, смывах с
поверхностей, частях растений, неизвестных субстанциях.
2. Условия эксперимента
Использовали реагенты: белки Овальбумин (Ова), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma,
США), неорганические соли, органические растворители (Химмед, Россия), этиловый спирт медицинский
95% («Ферейн», Россия), наночастицы коллоидного золота (НКЗ) диаметром от 5 до 60 нм («ЭКОССибирь», Россия), конъюгат овечьих антител к иммуноглобулинам мыши, меченных пероксидазой хрена
(«Имтек», Россия), антивидовые антитела «кролик против мыши» (antibodies-online GmbH, Германия),
мышиные моноклональные антитела к морфину, амфетамину, ∆9-тетрагидроканнабинолу, экстази,
диазепаму, метадону (antibodies-online GmbH, Германия). Психотропные вещества (морфин, амфетамин,
тетрагидроканнабинол, экстази, диазепам, метадон, их производные и родственные вещества)
предоставлены лабораторией токсикологии Университета Крита (Греция). Для приготовления стандартных
2
Открытый научный бюллетень. Вып. 4. 2014
Open Scientific Bulletin. Issue 4. 2014
www.openbull.com
растворов ПАВ были использованы калибраторы, контроли и мульти-контроли фирмы «Abbott» (США). В
качестве рабочего буфера в ИХА и ИФА использовали 0,2 М фосфатный буфер, рН 7,4 (ФБС).
Материалы: микропланшеты для ИФА («Nunc», Дания), нитроцеллюлозная мембрана (Whatman,
США). Для приготовления спайковых образцов частей растений использовали табак трубочный (Погарская
сигаретно-сигарная фабрика, Россия).
Биологические объекты: образцы мочи, смывов с кожи, волос были собраны у 65 пациентов
Московского научно-практического центра наркологии Департамента здравоохранения г. Москвы: больные
героиновой зависимостью – 17 человек, амфетаминовой – 14, полинаркоманией – 11, злоупотребляющих
каннабиноидами – 8, экстази – 4, метадоном – 6, проходящих лечение бензодиазепинами – 10 человек. В
качестве контрольной группы использовали биологические образцы 10 здоровых доноров.
Синтез конъюгированных антигенов морфина (Мор), амфетамина (Амф), ∆9-тетрагидроканнабинола
(Кан), экстази (МДМА), диазепама (Бзд), метадона (Мтд) с Ова и БСА проводили с использованием
карбодиимидного метода, как описано нами ранее [Мягкова, Лушникова, Полевая, 1989]. Конъюгаты
специфических антител (Ат) с НКЗ (Ат-Au) получали по методике, описанной в [Hermanson, 2013]. К НКЗ
добавляли раствор Ат при рН от 7,5 до 10,0, инкубировали при комнатной температуре и дополнительно
стабилизировали раствором БСА. НКЗ с иммобилизованными молекулами Ат отделяли от несвязавшихся
молекул Ат центрифугированием. После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 50 мМ Кфосфатном буфере, рН 7,4, с 0,1М раствором NaCl, содержащем 0,25% БСА и 0,25% Твин-20.
Конъюгаты Ат-Au разного диаметра тестировали в формате непрямого конкурентного ИФА: на
планшетах, сенсибилизированных различными антигенами (Аг): Мор-Ова, Амф-Ова, МДМА-Ова, Кан-Ова,
Бзд-Ова, Мтд-Ова (Аг-Ова). Оптическую плотность измеряли при 450 нм на спектрофотометре «Bio-Rad».
Выбирали конъюгаты с НКЗ, специфично связывающиеся с конъюгатами Аг-Ова, и имеющие наиболее
высокий титр (от 1:3000 до 1:20000).
Изготовление иммунохроматографических тест-полосок. Реагенты наносили на мембраны (Whatman,
США), с использованием автоматического диспенсера «IsoFlow» («Imagene Technology», США). Для
получения тест-полосок из мультимембранного композита применяли автоматический нарезчик Cutting
Module CM4000 (BioDot, США), полуавтоматический ламинатор Clamshell Lamination Module LM5000
(BioDot, США). Тест-полоски герметично упаковывали в пакеты из ламинированной алюминиевой фольги,
используя в качестве осушителя силикагель.
Разработка ИХА. Выбор оптимальной концентрации конъюгатов Аг-Ова в ИХА проводили как
описано в [Любавина и др., 2005]. Мембраны для конъюгатов обрабатывали растворами конъюгатов Ат-Au,
в фосфатном буфере с Ова в рабочих концентрациях. В зону контрольной линии наносили антивидовые
антитела кролик-анти-мышь разведении 1:2000. В тестовую зону полосок наносили линии конъюгат Аг-Ова
в концентрациях 500, 1000 и 2000 нг/мл, N=3. Затем тест-полоски помещали в растворы фосфатного
буфера, содержащего различные концентрации аналита. Результат определяли визуально по появлению
линий бурого цвета в тестовой и контрольной зоне. При оптимизации концентраций Ат-Au в тестовой зоне
полосок наносились линии растворами Аг-Ова в выбранных концентрациях. На мембрану для конъюгата
наносили растворы Ат-Au в 3-х разных разведениях для каждого вида ИХА. Полоски помещали в
фосфатный буфер (ФБС) и растворы аналита в ФБС в разных концентрациях. Оптимальной выбиралась
концентрация Ат-Au, при которой полоска была чувствительна к наименьшей концентрации аналита.
Определение аналитических характеристик разработанных тест-систем. Предел обнаружения (ПО)
определяли как концентрацию аналита, при которой процент положительных результатов теста равен или
более 95%. Готовили растворы определяемого вещества в ФБС (от 0 нг/мл до 1000 нг/мл, N=20), близких к
предполагаемому значению ПО. Определение специфичности тест-полосок проводили путем анализа
растворов веществ, являющиеся близкородственными к исследуемому веществу, в ФБС.
Приготовление «спайковых» образцов частей растений осуществляли путем обработки сухого табака
растворами ∆9-тетрагидроканнабинола (∆9-ТГК) в концентрации от 1 до 50 мг/мл. Для приготовления
смывов с поверхностей 200 см2 поверхности стола обрабатывали 0,5 мл растворов ∆9-ТГК, морфина,
амфетамина в этаноле в концентрациях 0,2–10 нг/мл, 0,2–10 мкг/мл, 0,3–10 мкг/мл, соответственно.
Разработка методик пробоподготовки образцов. В качестве экстрагента использовали этиловый спирт
медицинский, в качестве растворяющего буфера – ФБС. Смывы производили с помощью деревянной
палочки с тампоном. Экстракт высушивали в чашке Петри в вытяжном шкафу до полного высыхания.
Приготовление экстрактов волос. Волосы отбирали согласно методике, описанной в [Приказ
Минздравсоцразвития … , 2006]: срезали их ближе к коже с теменной или затылочной части головы.
Волосы мелко измельчали ножницами и экстрагировали этиловым спиртом 12 часов при периодическом
встряхивании. Экстракт высушивали в чашке Петри и растворяли в ФБС. Подобным образом проводили
экстракцию измельченных частей растений. Приготовление смывов с кожи и поверхностей. Смывы с кожи
производились с помощью деревянной палочки с тампоном, смоченным спиртом. Тампоном тщательно
протирали поверхности рук и лица (главным образом вокруг рта), периодически смачивая тампон в спирте.
3
Открытый научный бюллетень. Вып. 4. 2014
Open Scientific Bulletin. Issue 4. 2014
www.openbull.com
Далее полоскали тампон в спирте, полученный смыв выливали в чашку Петри, высушивали на воздухе и
растворяли в ФБС. Подобным образом проводили подготовку смыва с поверхности стола.
Образцы мочи, экстракты волос, частей растений, смывы с кожи и поверхностей также анализировали
с помощью подтверждающего метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
(«Милихром А-02», Россия). Статистические характеристики разработанных тест-систем рассчитывали
способом для методик с качественными результатами [He, Parker, 2013]: определяли число истинно
положительных результатов теста (ИП), число ложноположительных (ЛП), истинно отрицательных (ИО) и
ложноотрицательных (ЛО) результатов теста. Статистическую чувствительность теста (Ч) рассчитывали по
формуле:
Ч
ИП
100%,
ИП  ЛО
(1)
а статистическую специфичность (С):
С
ИО
 100%.
ИО  ЛП
(2)
3. Результаты и обсуждение
При разработке иммунохроматографических тест-систем для выявления низкомолекулярных веществ
чаще всего используют непрямую конкурентную схему ИХА (рис. 2). В соответствии с этим форматом были
созданы тест-полоски в настоящей работе: образец, предположительно содержащий ПАВ (Аг), наносится в
нижнюю часть полоски (мембрана для образца) капельным способом, либо путем погружения. Если в
образце нет анализируемого ПАВ, жидкость с помощью капиллярных сил поднимается вверх, проходит
прокладку с нанесенным красящим конъюгатом Ат-Аu, смывает конъюгат, который потом связывается на
тестовой линии с конъюгатом Аг-Ова, в результате чего тестовая линия окрашивается. При наличии ПАВ в
образце в прокладке для конъюгата происходит связывание ПАВ с Ат-Аu. И далее, при прохождении через
тестовую линию, не происходит связывания Ат-Аu с Аг-Ова, - тестовая линия не окрашивается. На полоске
присутствует также контрольная линия с нанесенными антивидовыми Ат, которые связывают
несвязавшиеся Ат-Аu, а также комплексы Ат-Аu:Аг.
Рис. 2. Устройство разработанных тест-полосок
На первой стадии разработки тест-полосок проводили предварительный подбор концентраций
иммунореагентов в формате ИФА, используя параметры созданных нами ранее тест-сиcтем ИФА [Демерчян
и др., 2007; Киселева, Мягкова, Шакир и др. 2010; Брюн, Мягкова, Сокольчик и др. 2011]. Затем на
нитроцеллюлозной мембране оптимизировали эти концентрации. Оптимальные концентрации конъюгатов
Аг-Ова составили: 1 мкг/мл для Мор-Ова, 2 мкг/мл – для Амф-Ова, 0,25 мкг/мл – для Кан-Ова, и 1 мкг/мл –
для МДМА-Ова, 1,5 мкг/мл – для Бзд-Ова, 1 мкг/мл – для Мтд-Ова. Подобраны оптимальные титры Ат-Аu,
которые составили значения от 1:3000 до 1: 20000. Антивидовые Ат наносились на полоски в разведении
1:2000.
Для разработанных ИХ тест-систем проведено исследование основных аналитических характеристик
- чувствительности и специфичности определения наркотических и психотропных соединений. Пределы
обнаружения ПАВ, т.е. минимально определяемая концентрация, определенные путем тестирования
растворов ПАВ в ФБС, составили: 200 нг/мл для морфина, 300 нг/мл для амфетамина, 50 нг/мл для
каннабиноидов, 300 нг/мл для метадона, 500 нг/мл для экстази и 200 нг/мл для диазепама.
Специфичность разработанных тест-полосок определяли путем
нанесения растворов
близкородственных соединений в разных концентрациях в ФБС. В табл. 1. приведены минимальные
концентрации веществ, при которых тест-полоска показывает положительный результат.
4
Открытый научный бюллетень. Вып. 4. 2014
Open Scientific Bulletin. Issue 4. 2014
www.openbull.com
Таблица 1. Специфичность иммунохроматографических тест-полосок.
Соединение
ПО, нг/мл
Полоска «Морфин»
Соединение
ПО, нг/мл
Полоска «Бензодиазепины»
морфин
200
альпразолам
195
кодеин
300
бромазепам
390
героин
300
клобазам
390
этилморфин
6250
диазепам
200
гидрокодон
50000
эстазолам
780
6-моноацетилморфин
400
флунитразепам
>10000
морфин 3--D-глюкоронид
1000
лоразепам
>10000
оксикодон
>10000
нитразепам
100
норхлордиазепоксид
3125
Полоска «Амфетамин»
D-амфетамин
300
оксазепам
200
D,L-амфетамин
390
триазолам
>10000
L-амфетамин
>10000
Полоска «Экстази»
3,4-метилендиокси-амфетамин
1560
3,4-метилендиоксиметамфетамин (МДМА)
500
3,4-метилендиоксиамфетамин
3000
Полоска «Каннабиноиды»
11-нор-9-ТГК-9 COOH
50
3,4-метилендиоксиэтиламфетамин
300
каннабинол
>20000
D-амфетамин
5000
11-нор-8-ТГК-9 COOH
30
Полоска «Метадон»
8-ТГК
150
метадон
300
9-ТГК
150
доксиламин
>10000
6-моноацетилморфин (6-MAM)
800
морфин 3--D-глюкоронид
2650
Представленные тест-системы показали высокую специфичность к определяемым веществам, а также
веществам того же класса. Так, тест-полоска «морфин» может использоваться для определения как самого
морфина, так и других опиатов (героина, кодеина, 6-моноацетилморфина, метаболита морфин-3--Dглюкоронида), более далекие по структуре вещества при этом не определяются, т.е. перекрестной реакции с
соединениями веществами других классов не обнаружено. Аналогичный результат получен и для других
тест-полосок.
Процедуры пробоподготовки биологических и небиологических объектов разрабатывались таким
образом, чтобы создать набор реагентов, который можно использовать в «полевых» условиях, без
специального лабораторного оборудования. В работе производился подбор массы (объема) образцов и
объемов растворителя и ФБС с целью получения максимального извлечения ПАВ из образца и его
успешного определения с помощью тест-полосок. В результате, разработаны следующие методики
пробоподготовки (рис. 3):
На первом этапе происходит измельчение объекта, если это требуется (для волос, частей растений,
твердых объектов). Твердый объект «натирают» абразивной бумагой до состояния порошка. Далее
измельченный объект или порошок в количестве 200 мг помещают во флакон с 5 мл этанола, встряхивают
несколько раз и оставляют на ночь до полной экстракции. Затем еще раз встряхивают.
При исследовании следов наркотических веществ на поверхностях приготавливают смыв с
поверхности: палочку с ватным тампоном смачивают во флаконе с 5 мл этанола, хорошо протирают
поверхность (объект) несколько раз, помещают тампон во флакон с растворителем, хорошо перемешивают,
повторяют процедуру несколько раз. Затем выливают полученный раствор в чашку Петри и оставляют в
вытяжном шкафу до полного высыхания (2-3 часа) или высушивают в потоке воздуха. Далее в чашку Петри
добавляют 0,5 мл ФБС, встряхивают, и полученный экстракт используют для проведения ИХА.
Неизвестные жидкости (5-10 капель) смешивают непосредственно с 0,5 мл ФБС и полученный раствор
используют при проведении анализа.
5
Открытый научный бюллетень. Вып. 4. 2014
Open Scientific Bulletin. Issue 4. 2014
www.openbull.com
Рис 3. Схема проведения пробоподготовки и ИХА ПАВ в различных объектах
Для определения характеристик разработанных методик при анализе реальных объектов используют
два подхода: анализ большого числа реальных загрязненных образцов, либо, если это невозможно,
изготовление «спайковых» образцов, т.е. искусственное введение различных концентраций вещества в
объект с последующим анализом. В обоих случаях проводят параллельное исследование образцов
подтверждающим методом (в нашем случае – ВЭЖХ). Моча, волосы, смывы с кожи были собраны у
наркозависимых, проходящих лечение в МНПЦ наркологии. Вычисляли статистическую чувствительность
и специфичность методик (табл. 2). Указанные характеристики составили значения от 89 до 100%, что
доказывает высокую для предварительного метода достоверность определения ПАВ в данных биообъектах.
Значение специфичности 100% во всех случаях означает, что ни один чистый образец не дал
положительного результата в ИХА, т.е. ложноположительных результатов не наблюдалось.
Таблица 2. Статистические характеристики ИХА ПАВ в моче, экстрактах волос, смывах с кожи
Класс ПАВ
опиаты
амфетамины
каннабиноиды
Количество употребляющих
ПАВ
20
18
12
моча
волосы
кожа
моча
волосы
кожа
моча
волосы
кожа
Чувствительность, %
100
90
90
100
89
89
100
86
91
Специфичность, %
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Класс ПАВ
экстази
метадон
бензодиазепины
Количество употребляющих
ПАВ
9
9
8
Чувствительность, %
100
89
95
100
89
89
100
100
94
Специфичность, %
100
100
100
100
100
100
100
100
100
6
Открытый научный бюллетень. Вып. 4. 2014
Open Scientific Bulletin. Issue 4. 2014
www.openbull.com
Следует отметить, что с помощью разработанных методик по моче и смывам с кожи возможно
определить как наркоманов, так и эпизодических потребителей наркотиков. В волосах содержатся более
низкие концентрации веществ, поэтому выявить человека, который только разово пробовал наркотик,
крайне сложно с помощью предложенного скринингового метода. Только высокоточные виды массспектрометрии могут справиться с этой задачей. Предложенная методика предназначена для быстрого
скрининга в полевых условиях с последующим проведением подтверждающего анализа.
Анализ смывов с различных поверхностей, в т.ч. клавиатур, столов – используется в практике
судебно-медицинской экспертизы и криминалистики [Иванов и др., 2004]. Следы наркотика, остающиеся на
руках систематического потребителя (человек регулярно берет руками сам наркотик – марихуану, порошок,
таблетки), при постоянном потреблении накапливаются на рабочих поверхностях. Апробацию методик для
выявления ПАВ в частях растений и смывах с поверхностей проводили с помощью теста «введено-найдено»
(табл. 3).
Сравнение введенной и найденной концентрации показывает, что процент извлечения ПАВ из
растений составляет 51-70%, в смывах с поверхностей – 44-60%. Данные значения приемлемы для целей
предварительного скрининга ПАВ в полевых условиях и обусловлены тем, что создаваемые методики
пробоподготовки были направлены не на количественное извлечение, а на быстрый скрининг без
применения специального оборудования.
Таблица 3. Анализ спайковых образцов табака и смывов с поверхности
Образцы табака
Введенная
концентрация, мг/г
Смыв с поверхности стола
Найденная концентрация, мг/г
ИХА, n=3
ВЭЖХ
1
+/-
0,51
5
+
20
+
Введенная концентрация, нг / 100
см2
Найденная концентрация,
нг/100 см2
ИХА, n=3
ВЭЖХ
50
+/-
28
2,9
200
+
94
14
1000
+
447
50
+
24
200
+
116
1000
+
463
75
+
36
300
+
182
1000
+
605
∆9-тетрагидроканнабинол
морфин
амфетамин
В процессе апробации методик и тест-систем в реальных объектах были оценены пределы
обнаружения ПАВ в моче, волосах, смывах с поверхностей, таблетках, твердых субстанциях, порошках,
частях растений и жидкостях (табл. 4).
Таблица 4. Минимально определяемые концентрации (ПО) ПАВ в различных объектах.
Класс ПАВ
ПО в
моче,
нг/мл
ПО в смывах с
поверхностей,
нг/100 см2
ПО в
волосах,
мкг/г
ПО в частях
растений, мг/г
ПО в твердых
объектах, мкг/г
ПО в
жидкостях,
мкг/мл
Опиаты
200
100
4,2
-
0,5
0,8
Амфетамин
300
150
6,1
-
0,75
1,2
Каннабиноиды
50
50
1,6
2
0,125
0,2
Бензодиазепины
300
-
6,5
-
0,75
1,2
Экстази
500
-
12
-
1,25
2
Метадон
200
-
4,4
-
0,5
0,8
Разработанные тест-полоски и методики пробоподготовки легли в основу создания тест-системы
«Набор реагентов для иммунохроматографического выявления психоактивных веществ и их метаболитов в
моче, смывах с кожи и поверхностей, экстрактах тканей и волос, таблетках, твердых субстанциях,
порошках, частях растений и жидкостях (Дианарк-Био-Мульти)», состоящей из набора тест-полосок,
7
Открытый научный бюллетень. Вып. 4. 2014
Open Scientific Bulletin. Issue 4. 2014
www.openbull.com
запаянных в пластиковый корпус, флакона с растворителем (5 мл), флакона с ФБС (0,5 мл), деревянной
палочки с ватным тампоном, чашки Петри, бумаги абразивной.
Наборы реагентов могут использоваться в «полевых» условиях для предварительного анализа на
наличие наркотического или психоактивного вещества в объекте, а также установление его класса без
применения дополнительного оборудования и реактивов. Разработанные тест-системы имеют широкие
перспективы применения оперативными службами, в криминалистике, при выявлении наркопотребления в
школах, колледжах, училищах, вузах, в наркологических лечебных учреждениях, в автохозяйствах при
предрейсовых осмотрах водителей транспортных средств, при массовых обследованиях контингента лиц
повышенного риска (заключенные в местах отбывания наказания, подростки, стоящие на учете в милиции и
др.), а также для самоконтроля.
Литература
Брюн Е.А., Мягкова М.А., Морозова В.С., Морозов С.В. Сравнительный опыт определения наркотических веществ в России и за
рубежом // Вопросы наркологии. 2011. №1. С. 7-14 .
Брюн Е.А.; Мягкова М.А., Сокольчик Е.И., Морозова В.С., Петроченко С.Н., Киселёва Р.Ю. Комплексная методика диагностического
тестирования для выявления потребителей наркотических веществ. Методические рекомендации №13 / М.: Деп. здравоохранения
Правительства Москвы, 2011. 32 с.
Горбачева Н.С., Морозова В.С., Мягкова М.А. Сравнительное иммунохроматографическое определение наркотических веществ в
жидкости ротовой полости, моче и волосах человека // Вопросы наркологии. 2013. №5. C. 94-99.
Демерчян Ш.А., Петроченко С.Н., Смирнов А.В., Абраменко Т.В., Мягкова М.А. Твердофазный иммуноферментный метод
определения амфетаминов в моче // Клиническая лабораторная диагностика. 2007. № 12. С. 20-33.
Иванов П.А., Попова Т.В., Звонарев А.Г., Баранов Ю.Н. Криминалистическое исследование наркотических средств, психотропных и
сильнодействующих веществ: Учебное пособие. / Москва: ИМЦ ГУК МВД России. 2004. 120с.
Киселева Р.Ю., Мягкова М.А., Анохин Л.А., Петроченко С.Н., Смирнов А.В., Морозова В.С., Брюн Е.А. Сравнительный анализ
выявления амфетаминов методом ИФА и газовой хроматографии с масс-спектрометрической детекцией // Судебно-медицинская
экспертиза. 2010. № 2 С. 42-44.
Киселева Р.Ю., Мягкова М.А., Шакир И.В., Брюн Е.А., Морозова В.С. Разработка иммуноферментного анализа амфетаминов в
биологических жидкостях человека // Биотехнология. 2010. № 4. С. 89-93.
Любавина И.А., Зинченко А.А., Лапенков М.И., Николаева Т.Л. Экспресс-метод выявления морфина в водных образцах с помощью
иммунохроматографии
с
использованием
моноклональных
антител,
меченных
коллоидным
золотом
// Биоорганическая химия. 2005. Т.31. № 1. С. 108-112.
Мягкова М.А., Морозова В.С. Способ определения наркотических средств в ротовой жидкости человека методом
иммунохроматографии // Патент на изобретение RU 2442988. 2010.
Мягкова М.А., Лушникова М.В., Полевая О.Ю. Иммунохимические свойства естественных и индуцированных антител человека к
морфину // Вопросы наркологии. 1989. №4. C. 7-11.
Приказ Минздравсоцразвития РФ от 27 января 2006 г. N 40 «Об организации проведения химико-токсикологических исследований при
аналитической диагностике наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических
веществ». [Электронный ресурс]. URL: http://docs.pravo.ru/document/view/13349/17359/
Солодухина Н.М., Абраменко Т.В., Пушкина В.В., Морозова В.С., Мягкова М.А., Грицкова И.А. Экспресс-метод для определения
опиатов в биологических жидкостях человека // Микроэлементы в медицине. 2010. № 11 (3-4). С. 71-74.
He J., Parker S. Chapter 2.7 Qualitative Immunoassay - Features and Design // The Immunoassay Handbook. Theory and Applications of Ligand
Binding, ELISA and Related Techniques. / Editor: Wild D. – Elsevier Science, 2013. P. 139–147.
Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. Third Edition / USA: Academic Press, 2013. – 1200 p.
Imbert L., Dulaurent S., Mercerolle M., Morichon J., Lachâtre G., Gaulier J.-M. Development and validation of a single LC–MS/MS assay
following SPE for simultaneous hair analysis of amphetamines, opiates, cocaine and metabolites // Forensic Science International. 2014. V.
234. P. 132-138.
Lateral Flow Immunoassay / Editors: Wong R.C., Tse H.Y. – USA: Springer, 2009. 223 p.
Otero-Fernández M., Cocho J.Á., Tabernero M.J., Bermejo A.M., Bermejo-Barrera P., Moreda-Piñeiro A. Direct tandem mass spectrometry for
the simultaneous assay of opioids, cocaine and metabolites in dried urine spots // Anal. Chim. Acta. 2013. V.784 (19). P. 25-32.
8
Открытый научный бюллетень. Вып. 4. 2014
Open Scientific Bulletin. Issue 4. 2014
www.openbull.com
DEVELOPMENT OF IMMUNOCHROMATOGRAPHIC ASSAY OF
PSYCHOACTIVE SUBSTANCES IN BIOLOGICAL OBJECTS
V.S. Morozova, E.D. Drugova, M.A. Myagkova
Institute for Physiologically Active Compounds of the Russian Academy of Sciences, Severnyi proyezd, 1, Chernogolovka, Noginskiy
district,Moscow region,142432, Russia, email: vmorozova@gmail.com
Abstract
The article presents the development of immunochromatographic (IC) test systems (strips) for the detection of psychoactive substances (PAS)
of six classes: opiates, amphetamines, cannabinoids, ecstasy, benzodiazepines, methadone. For the first time, simple sample preparation
techniques for the rapid IC detection of PAS in variety of biological and non-biological samples were developed: in sweat swabs, hair samples,
urine, swabs from surfaces, parts of plants, unknown objects. The limits of PAS detection of developed tests in urine were: 200 ng/ml for
morphine, 300 ng/ml for amphetamine, 50 ng/ml for cannabinoids, 500 ng/ml for ecstasy, 200 ng/ml for diazepam, 300 ng/ml for methadone.
Presented methods of sample preparation and analysis do not require any special equipment and reagents, and can be used in the "field" or at
home by non-specialists for PAS screening. The test system has broad application prospects: for the diagnosis of drug abuse, drug detection in
schools, universities, at plants, hazardous industries, law enforcement agencies and in the work of the police.
immunochromatographic assay, drugs of abuse, psychoactive substances, urine, sweat swabs, hair samples, swabs from
Keywords:
surfaces, parts of plants
Submitted: 02.12.2014
Published: 29.12.2014
This work is licensed under the Creative Commons Attribution 4.0 International License. To view a copy of this
license, visit http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.
References
Brjun E.A., Mjagkova M.A., Morozova V.S., Morozov S.V. (2011) Sravnitel'nyj opyt opredelenija narkoticheskih veshhestv v Rossii i za
rubezhom [Comparative Experiment determination of drugs in Russia and abroad] // Voprosy narkologii. 2011. №1. S. 7-14 .
Brjun E.A.; Mjagkova M.A., Sokol'chik E.I., Morozova V.S., Petrochenko S.N., Kiseljova R.Ju (2011) Kompleksnaja metodika
diagnosticheskogo testirovanija dlja vyjavlenija potrebitelej narkoticheskih veshhestv. Metodicheskie rekomendacii No. 13 [Complex
technique of diagnostic testing to identify drug consumers. Guidelines No. 13] M.: Dep. zdravoohranenija Pravitel'stva Moskvy, 2011. 32 p.
Gorbacheva N.S., Morozova V.S., Mjagkova M.A. (2013) Sravnitel'noe immunohromatograficheskoe opredelenie narkoticheskih veshhestv v
zhidkosti rotovoj polosti, moche i volosah cheloveka [Comparative immunoassay determination of drugs in oral fluid, urine, and human
hair] // Voprosy narkologii. 2013. №5. C. 94-99.
Demerchjan Sh.A., Petrochenko S.N., Smirnov A.V., Abramenko T.V., Mjagkova M.A. (2007) Tverdofaznyj immunofermentnyj metod
opredelenija amfetaminov v moche [Enzyme-linked immunosorbent method for determining amphetamines in urine] // Klinicheskaja
laboratornaja diagnostika. 2007. № 12. S. 20-33.
Ivanov P.A., Popova T.V., Zvonarev A.G., Baranov Ju.N. (2004) Kriminalisticheskoe issledovanie narkoticheskih sredstv, psihotropnyh i
sil'nodejstvujushhih veshhestv: Uchebnoe posobie [Forensic investigation of narcotic drugs and psychotropic substances: Textbook.] /
Moskva: IMC GUK MVD Rossii. 2004. 120s.
Kiseleva R.Ju., Mjagkova M.A., Anohin L.A., Petrochenko S.N., Smirnov A.V., Morozova V.S., Brjun E.A. (2010) Sravnitel'nyj analiz
vyjavlenija amfetaminov metodom IFA i gazovoj hromatografii s mass-spektrometricheskoj detekciej [Comparative analysis of the
detection of amphetamines by ELISA and gas chromatography with mass spectrometric detection] // Sudebno-medicinskaja jekspertiza.
2010. № 2 S. 42-44.
Kiseleva R.Ju., Mjagkova M.A., Shakir I.V., Brjun E.A., Morozova V.S. (2010) Razrabotka immunofermentnogo analiza amfetaminov v
biologicheskih zhidkostjah cheloveka [Development of an enzyme immunoassay amphetamines in human biological fluids] //
Biotehnologija. 2010. № 4. S. 89-93.
Ljubavina I.A., Zinchenko A.A., Lapenkov M.I., Nikolaeva T.L. (2005) Jekspress-metod vyjavlenija morfina v vodnyh obrazcah s pomoshh'ju
immunohromatografii s ispol'zovaniem monoklonal'nyh antitel, mechennyh kolloidnym zolotom [Rapid method for detecting morphine in
water samples using immunoassay using monoclonal antibodies labeled with colloidal gold] // Bioorganicheskaja himija. 2005. Vol.31.
No. 1. pp. 108-112.
Mjagkova M.A., Morozova V.S. (2010) Sposob opredelenija narkoticheskih sredstv v rotovoj zhidkosti cheloveka metodom
immunohromatografii [Method for determining the narcotic drugs in human oral fluid by immunochromatography] // Patent na izobretenie
RU 2442988. 2010.
Mjagkova M.A., Lushnikova M.V., Polevaja O.Ju. (1989) Immunohimicheskie svojstva estestvennyh i inducirovannyh antitel cheloveka k
morfinu [Immunochemical properties of natural and human-induced antibodies to morphine] // Voprosy narkologii. 1989. №4. C. 7-11.
Prikaz Minzdravsocrazvitija RF ot 27 janvarja 2006 g. N 40 «Ob organizacii provedenija himiko-toksikologicheskih issledovanij pri
analiticheskoj diagnostike nalichija v organizme cheloveka alkogolja, narkoticheskih sredstv, psihotropnyh i drugih toksicheskih
veshhestv». [Order of the Health Ministry of the Russian Federation dated January 27, 2006 N 40 "On the organization of the chemicaltoxicological studies with analytical diagnosis of the presence in the body of alcohol, narcotics, psychotropic and other toxic substances"].
URL: http://docs.pravo.ru/document/view/13349/17359/
Soloduhina N.M., Abramenko T.V., Pushkina V.V., Morozova V.S., Mjagkova M.A., Grickova I.A. (2010) Ekspress-metod dlja opredelenija
opiatov v biologicheskih zhidkostjah cheloveka [Express method for determination of opiates in human biological fluids] // Mikrojelementy
v medicine. 2010. № 11 (3-4). S. 71-74.
He J., Parker S. (2013) Chapter 2.7 Qualitative Immunoassay - Features and Design // The Immunoassay Handbook. Theory and Applications of
Ligand Binding, ELISA and Related Techniques. / Editor: Wild D. – Elsevier Science, 2013. P. 139–147.
Hermanson G.T. (2013) Bioconjugate Techniques. Third Edition / USA: Academic Press, 2013. – 1200 p.
Imbert L., Dulaurent S., Mercerolle M., Morichon J., Lachâtre G., Gaulier J.-M. (2014) Development and validation of a single LC–MS/MS
assay following SPE for simultaneous hair analysis of amphetamines, opiates, cocaine and metabolites // Forensic Science International.
2014. V. 234. P. 132-138.
Lateral Flow Immunoassay / Editors: Wong R.C., Tse H.Y. – USA: Springer, 2009. 223 p.
Otero-Fernández M., Cocho J.Á., Tabernero M.J., Bermejo A.M., Bermejo-Barrera P., Moreda-Piñeiro A. (2013) Direct tandem mass
spectrometry for the simultaneous assay of opioids, cocaine and metabolites in dried urine spots // Anal. Chim. Acta. 2013. V.784 (19). P.
25-32.
9