1 ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК

ПОВЕРХНОСТЬ. РЕНТГЕНОВСКИЕ, СИНХРОТРОННЫЕ И НЕЙТРОННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. 2005, N5,
с 87-92
УДК 576.3.314: 579.23.234
ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФОЛОГИИ ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК
AZOTOBACTER CHROOCOCCUM В УСЛОВИЯХ ГИПЕРТЕРМИИ МЕТОДОМ
АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ
Ю.Ю. Гущина1, Л.Н. Олюнина2, Т.А. Гончарова2, А.П. Веселов2,
Ю.А. Мацкова2, М.А. Ежевская2
1
2
- Научно-образовательный центр “Физика твердотельных наноструктур”
Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского
- Кафедра биохимии и физиологии растений Нижегородского государственного
университета им. Н.И. Лобачевского
Поступила в редакцию
Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) исследованы морфологические
параметры клеток Azotobacter chroococcum. Установлено, что размеры бактериальных
клеток и структурированность их мембран изменяются в зависимости от величины и
времени гипертермического воздействия. Для более резистентного типа клеток
характерно термоиндуцированное уменьшение шероховатости поверхности и увеличение
размеров.
Выявленные
изменения
ориентированы
на
поддержание
адаптивного
потенциала у клеток бактерий в «жестких» условиях существования. Скорость и
направленность этих изменений зависит как от возраста культуры, так и от условий
культивирования.
условиях,
ВВЕДЕНИЕ
до
сих
пор
недостаточно
В настоящее время большое внимание
исследован. Так, например, остается мало
исследователей
изучение
изученной роль поверхностных структур,
механизмов ответа клеток прокариот на
которые, являясь внешними барьерами
воздействие
привлекает
факторов
стрессирующих
клетки,
должны
в
первую
очередь
различной природы. Некоторые из этих
претерпевать те или иные изменения под
механизмов
влиянием биотических и абиотических
подробно,
описаны
тогда
других
факторов среды. Это обусловлено их
процессов, приводящих к сохранению
высокой структурной лабильностью и
активности
способностью быстро реагировать даже
клеток
как
достаточно
в
ряд
экстремальных
1
на незначительные изменения в условиях
культивировали в течение 48 часов при
существования [1].
температуре, оптимальной для их роста
В
последнее
время
для
изучения
(26°С), и путем подсчета образовавшихся
структуры клеток широко применяется
макроколоний
атомно-силовая
дополняющая
оценивали
микроскопия
(АСМ),
колониеобразующую способность (КОЕ)
традиционные
методы
стрессированных
клеток
(контроль
анализа биологических объектов [2-5]. В
бактерии, не подвергавшиеся ТШ).
представленной
Параллельно
с
осуществляли
отбор
возможности
работе
оценивали
применения
АСМ
для
регистрацией
–
КОЕ
материала
для
сравнительного анализа поверхностной
атомно-силовой
структуры прокариотических клеток в
поверхность покровного стекла размером
связи
6×6
с
действием
экстремальных
факторов.
мм
бактерий
микроскопии.
наносили
в
каплю
На
суспензии
дистиллированной
воде.
Концентрацию бактерий в суспензии
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
определяли по оптическому стандарту
Объектом исследования служили клетки
мутности. Она составляла 109 / мл. АСМ-
бактерий – чистая культура Azotobactеr
исследования
chroococcum 66 . Бактерии выращивали
естественного высыхания образцов на
при 26°С на агаризованной среде Эшби.
воздухе на атомно-силовом микроскопе
Клетки
экспоненциальной
Solver Bio (NT-MDT) в неконтактном
(односуточная культура) и стационарной
режиме. Использовались неконтактные
(двухсуточная) фазах роста смывали с
кремниевые зонды серии NSG11 (NT-
агара раствором хлорида натрия (0,15 М),
MDT) жесткостью 5,5 Н/м, резонансной
либо
частотой
в
раствором
глюкозы
(0,1М),
проводили
приблизительно
после
150
кГц,
центрифугировали (6000 об/мин, 15 мин),
радиусом закругления 10 нм, высота
вновь
зонда 10-20 мкм. Обработку полученных
суспендировали
растворах
указанных
и после выравнивания по
оптической
тепловому
в
плотности
шоку
изображений
подвергали
(ТШ).
шероховатости
Диапазон
и
расчет
поверхности
арифметического
средней
(среднего
отклонения)
Ra
использованных температур: 41°, 47°
проводили с помощью программного
(для бактерий в экспоненциальной фазе
обеспечения TermoMicroscopes SPMLab.
роста); 44°, 47°, 50° (в стационарной
фазе);
экспозиция
10-40
мин.
РЕЗУЛЬТАТЫ
По
ОБСУЖДЕНИЕ
окончании термошока бактерии высевали
на
твердую
питательную
среду,
2
И
ИХ
Имеется достаточное количество работ
растворе NaCl (0,15М), находящейся на
по изучению бактерий методом атомно-
охарактеризованных выше стадиях роста,
силовой
показано на рис. 1-4.
микроскопии,
однако
практически отсутствуют публикации по
использованию АСМ для характеристики
изменения
их
экстремальных
преимущество
морфологии
ситуациях.
зондовой
в
Основное
микроскопии
применительно к микробиологическим
а)
б)
объектам – возможность их изучения в
условиях, максимально приближенных к
нативным.
Из
определителя
бактерий
Берджи
известно, что клетки Az. chroococcum в
экспоненциальной
форму
фазе
палочек
с
По
мере
концами.
роста
имеет
в)
Из диаграмм видно, что изменения в
закругленными
перехода
структуре
к
приобретают
всем
кокковидную
составляет
мкм
[6].
в
менее
частности,
прогрев
суспензии
бактерий данного варианта при 41° не
микроорганизма
1,5-2,0
были
В
десятиминутный
или в скоплениях. Средний диаметр
данного
параметрам
выраженными.
форму, располагаются одиночно, парами
клеток
бактерий
экспоненциальной фазе роста колоний по
стационарной фазе развития колоний
клетки
поверхности
вызывал
АСМ-
заметных
изменений
изображение Az. chroococcum, штамм 66
шероховатости клеточной стенки. Однако
представлено на рис. 1а,б. Размеры
следует
бактерий
морфология
исследуемого
штамма
поверхности
в
целом,
стала
участки, шероховатость которых снижена
роста – 2,0×1,3 мкм; в стационарной
примерно
размер колеблется от 1,4×1,4 мкм до
в
1,5-2,0
раза.
Сходные
изменения обнаружены и при 47°С, 10
1,8×1,8 мкм.
размеров
структурированности
мин (Рис. 2).
и
клеточной
поверхности после гипертермического
воздействия на клетки культуры Az.
chroococcum,
что,
неравномерной, появились более гладкие
составляют в экспоненциальной фазе
Изменение
отметить,
суспендированных
в
3
2,5
2,5
50 °
44 °
ширина клеток, мкм
3
47 °
44 °
контроль
длина клеток, мкм
3,5
3
47 °
4
41 ° 41 °
2
1,5
1
2
44 °
контроль
4,5
41 °
44 ° 47 ° 50 °
41 °
47 °
1,5
1
0,5
0,5
0
0
0
10
30
1
У
10
10
ТШ,мин
40
10
0
10
бактерий,
10
30
10
1
2
10
ТШ, мин
стрессированных
40
10
2
в
У бактерий, подвергнутых тепловому
экспоненциальной фазе роста колоний,
шоку
роста
длина клеток увеличивалась только при
шероховатость их поверхности резко
тепловом шоке 47°С, 10 мин (в среднем в
снижалась (44°С, 10 мин). С увеличением
1,6 раза); в стационарной фазе роста при
времени
величины
десятиминутном прогреве – в среднем в
температурного воздействия (47°С) этот
1,4 раза при 44°С и 47°С, в 1,2 раза при
эффект
50°С.
в
стационарной
прогрева
или
уменьшался;
наблюдалась
обратная
шероховатость
фазе
при
50°С
реакция
Наблюдались
–
также
морфологические
становилась
и
другие
изменения,
в
контроля
частности, у стресссированных клеток
(Рис. 2). Клеточная стенка при этой дозе
(независимо от дозы гипертермического
теплового
хорошо
воздействия) зафиксировано появление
выраженную структурированность (Рис.
вдавливаний на полюсах, тогда как у
4).
контрольных
максимальной
относительно
шока
имела
особенностей
(а)
стенки
не
бактерий
в
подобных
структуре
клеточной
обнаружено
(Рис.1в).
Параллельное
определение
колониеобразующей способности (КОЕ)
нм
(б)
позволило
выявить
большую
резистентность
клеток,
подвергнутых
тепловому шоку в стационарной фазе
роста.
мкм
Воздействие
повышенными
температурами индуцировало изменение
размеров клеток, преимущественно за
счет изменения их длины (Рис. 3).
4
10
азотобактера
в
качестве
среды
ресуспендирования использовали раствор
глюкозы (0,1 М) (Рис. 6-8).
900 нм
900 нм
900 нм
900 нм
(а)
Как видно из рис. 5, клетки односуточной
(б)
900 нм
культуры оказались чувствительнее к
гипертермии. Их прогрев при 44°С в
течение 40 мин полностью подавлял
репродуцирующую
варианте
активность,
“термошок,
в
900 нм
(в)
двухсуточная
Рис 6.
культура” при такой же дозе воздействия
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Сравнение
результатов,
использованными
исследованиях
сделать
наших
методами,
что
структурированности
также
полученных
в
вывод,
увеличение
характерно
Ra/Ra контроль, %
она оставалась довольно высокой.
позволяет
уменьшение
поверхности,
размеров
для
а
44°
47 °
50 °
47°
41 °
44 °
47°
47 °
10 10 20 30
1
клеток
Рис 7.
более
терморезистентного типа бактериальных
клеток.
Мы
полагаем,
что
направленности
предшествует
теплового
параметров
летальным
шока,
смена
изменений
вышеперечисленных
дозам
свидетельствуя
истощении
адаптивного
Последний,
по-видимому,
об
потенциала.
выше
у
бактерий, находящихся на стационарной
фазе развития колоний.
С целью интенсификации дыхания и
энергетического
обмена
Рис 8.
клеток
5
10 40 10 10
ТШ, мин
2
Следует отметить, что в присутствии
адаптации
глюкозы,
«ТШ,
декомпенсация защитных механизмов и
односуточная культура», так и в варианте
ускоренная гибель клеточной культуры.
«ТШ,
Из рис. 8 видно, что при прогреве 47°
как
в
варианте
двухсуточная
культура»,
не
наступает
быстрая
зависимо от дозы гипертермического
выживаемость
воздействия, изменений размеров клеток
культуры значительно ниже, чем клеток
по
культуры,
сравнению
с
зафиксировано.
контрольными
Однако
не
значения
клеток
двухсуточной
находящейся
в
экспоненциальной фазе роста в момент
шероховатости зависели от дозы ТШ и от
воздействия
стадии
показатель шероховатости при 44° С
развития
колоний
стрессора.
действия
в
момент
Так,
в
стрессора.
При
этом
(экспозиция 10 мин) был в 2,5 раза ниже
экспоненциальной фазе роста прогрев
контрольных
суспензии
при
увеличение
дозы
десятиминутной экспозиции приводил к
увеличение
средней
снижению шероховатости (Ra) по всей
клеточной стенки в 1,5 – 1,8 раза
поверхности
относительно
до
41°С
скана
в
уже
2,3
раза;
на
значений.
Дальнейшее
ТШ
вызывало
шероховатости
контроля
(рис.
7).
отдельных участках эта разница еще
Известно,
более существенна (снижение в 3,9 раза).
бактериальной культуры в стационарную
При прогреве суспензии клеток до 47°С в
фазу роста происходят существенные
течение 20 мин параметр Ra минимален.
перестройки
С увеличением экспозиции до 30 минут
метаболических
средняя шероховатость клеточной стенки
репрессию
несколько
достигая,
трикарбоновых кислот и увеличение доли
однако, контрольного уровня (Рис. 7).
гликолиза в углеводном метаболизме [7].
Можно предположить, что на ранних
Кроме того, гликолитические ферменты
стадиях
являются
возрастала,
развития
chroococcum
колоний
добавление
дополнительного
субстрата
не
чем
среду
клеток
переходе
сфере
центральных
путей,
включающие
ферментов
более
ферменты
добавление
поддержанию
потенциала
в
при
цикла-
терморезистентными,
цикла-трикарбоновых
кислот. Вероятно, в условиях термошока,
энергетического
способствует
адаптивного
в
Az.
что
глюкозы
в
в
суспензионную
приводит
к
еще
среду
большей
условиях повышенных температур.
активации гликолиза и, как следствие
В варианте «ТШ, двухсуточная культура»
этого, к накоплению кислых продуктов
динамика
исследованных
обмена, снижению рН в клетке и целому
параметров свидетельствует об обратном:
ряду других процессов, влияющих на
после
терморзистентность.
изменений
кратковременного
периода
6
Итак, известно, что химический состав,
культивирования
строение клеточной стенки постоянны
chroococcum на ранних стадиях развития
для
колоний.
определенного
вида
бактерий,
однако, как показали наши исследования,
в
ее
структуре
могут
Azotobacter
Таким образом, метод АСМ позволил
происходить
зарегистрировать
изменения
быстрые модификации. Эти изменения
поверхностных
(их скорость, направленность) зависят
Azotobacter chroococcum, направленные
как от возраста культуры, так и условий
на
культивирования и ориентированы на
активности
сохранение функциональной активности
температурного режима.
бактерий
в
«жестких»
условиях
России”.
Проведено изучение морфологических
параметров клеток бактерий Azotobacter
атомно-силовой
микроскопии. Установлено, что размеры
структурированность
их
поверхности изменяются в зависимости
от
величины
и
воздействия
Уменьшение
времени
внешнего
(тепловой
шок).
структурированности
поверхности,
а
также
увеличение
размеров клеток характерно для более
терморезистентной стадии в развитии
культуры (стационарная фаза роста).
Смена
направленности
в
вышеперечисленных
предшествует
теплового
шока,
изменении
параметров
летальным
дозам
свидетельствуя
об
истощении адаптивного потенциала.
Последний может быть повышен
добавлением
энергетического
дополнительного
субстрата
при
смене
исследования и высшее образование в
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
методом
бактерий
функциональной
NN-001 программы “Фундаментальные
смене температурного режима.
клеток,
сохранение
клеток
Работа поддержана грантом REC-
существования, в частности, при резкой
chroococcum
структур
в
среду
7