На правах рукописи ВОРОБЬЕВА Наталья Юрьевна

На правах рукописи
ВОРОБЬЕВА
Наталья Юрьевна
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ МАРКЕРЫ
ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ
ЧЕЛОВЕКА К ВОЗДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕГО
ИЗЛУЧЕНИЯ
03.00.01- радиобиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2007
Работа выполнена в лаборатории радиационной биофизики и экологии
Института химической физики им.Н.Н. Семенова Российской Академии Наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук
Осипов Андреян Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Засухина Галина Дмитриевна
Институт общей генетики
им. Н.И. Вавилова РАН
доктор биологических наук, профессор
Саенко Александр Семенович
Медицинский радиологический научный
центр РАМН
Ведущая организация:
Институт биохимической физики
им. Н.М.Эмануэля Российской академии наук
Защита состоится «…..» _____________ 2007 г. в «
» часов
на заседании диссертационного совета Д.501.001.65. в Московском государственном университете им. Ломоносова по адресу: 119899, г. Москва,
ГСП, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического
факультета МГУ по адресу: 119899, г. Москва, ГСП, Ленинские горы,
МГУ, биологический факультет.
Автореферат разослан «
»_____________2007 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Т.В.Веселова
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время человек часто подвергается воздействию радиации (совместно с другими агентами) в малых дозах, которые могут изменить радиочувствительность организма в сторону:
снижение радичувствительности (адаптивный ответ) и ее увеличение. Следует учитывать и малоизученные виды комплексного воздействия на организм – так, в последние десятилетия резко увеличилось число полетов на
больших высотах, где человек подвергается воздействию целого ряда неблагоприятных факторов: космическое излучение, перегрузки, вибрация,
гиподинамия, стресс и др. Результаты многочисленных медикобиологических исследований свидетельствуют о том, что подобные комплексные воздействия приводят к увеличению частоты цитогенетических
нарушений (Heimers, 2000), заболеваниям опухолевого (Buja et al., 2005) и
неопухолевого генеза (Grosz et al., 2007), изменениям уровня повреждений
генома и чувствительности клеток к дополнительным воздействиям (Пелевина и др., 2007). Эти изменения являются предпосылками для развития
нестабильности генома (Zha et al., 2007). Однако, как правило, оценивается
лишь принципиальная возможность возникновения генотоксических эффектов путем сравнения средних показателей исследуемых групп с контролем. Анализ вариабельности индивидуальных различий отдельных лиц в
большинстве исследований не проводится, в то время как их радиочувствительность может различаться в десятки раз.
С другой стороны для лечения онкологических заболеваний человека часто используется лучевая терапия, где опухоли подвергают локальному облучению в высоких дозах. Известно, что чувствительность опухолей
одного и того же типа к облучению у различных индивидуумов существенно различается (Пелевина и др., 2006). Также резко различается последствия лучевой терапии для организма при облучении опухолей в сходных
дозах (Pinar et al., 2007). Поэтому при онкологических заболеваниях также
чрезвычайно важно определять индивидуальную реакцию на радиационное
воздействие.
Из вышеизложенного следует, что поиск адекватных критериев
оценки индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности является одной из важнейших проблем современной радиобиологии
и медицины.
Так как радиочувствительность организма связана главным образом
со способностью клеточных систем: 1) предотвращать возникновение повреждений ДНК; 2) репарировать индуцированные радиацией повреждения
ДНК; 3) эффективно элиминировать клетки, в которых репарация повреждений ДНК невозможна (запуск апоптоза), то в настоящей работе были
изучены основные компоненты, определяющие клеточную радиочувствительность.
3
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в оценке индивидуальной чувствительности лимфоцитов крови человека к дополнительному облучению в условиях in vitro и выявления маркеров, характеризующих вариабельность радиочувствительности и ее изменение при воздействии профессиональных факторов, развитии онкологических заболеваний и их лучевой терапии.
Были поставлены следующие задачи исследования:
• на лимфоцитах периферической крови контрольных доноров,
летчиков, космонавтов и онкологических больных:
1. Оценить уровень разрывов ДНК и повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro;
2. Изучить эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и
ее индивидуальную вариабельность;
3. Сравнить динамику клеточной гибели (апоптоз, некроз);
4. У онкологических больных до и во время проведения курса лучевой терапии исследовать уровень разрывов ДНК, повреждаемость ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in
vitro, эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК и
гибель клеток по механизмам апоптоза и некроза.
5. Сопоставить информативность изученных показателей для характеристики индивидуальной реакции
Положения, выносимые на защиту:
1. Полеты на больших высотах приводят к увеличению повреждаемости ДНК в лимфоцитах крови при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro и возрастанию индивидуальной
вариабельности радиочувствительности;
2. У онкологических больных (рак простаты) до лучевой терапии в
лимфоцитах крови отмечается повышение уровня разрывов
ДНК, увеличение повреждаемости ДНК при дополнительном
облучении клеток в условиях in vitro и доли гибнущих клеток. В
процессе лучевой терапии рака простаты увеличивается уровень
разрывов ДНК лимфоцитов крови и частота их гибели.
3. Использованный в работе комплекс клеточно-молекулярных
методов и подходов позволяет дать адекватную оценку индивидуальной радиочувствительности человека и ее вариабельности.
Научная новизна. Впервые на лимфоцитах крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов проведено исследование исходного уровня
разрывов ДНК, выхода двунитевых разрывов ДНК при дополнительном
облучении клеток в условиях in vitro, эффективности их репарации и динамика гибели клеток (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в
условиях in vitro.
Впервые на лимфоцитах крови больных раком простаты до и в про4
цессе лучевой терапии изучено изменение уровня разрывов ДНК, повреждаемости ДНК при дополнительном облучении клеток в условиях in vitro,
эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК и динамика клеточной гибели (ранний и поздний апоптоз, некроз) при инкубации в условиях
in vitro.
Впервые с применением современных клеточно-молекулярных методов дана комплексная сравнительная оценка вариабельности радиочувствительности в когортах контрольных доноров, летчиков, космонавтов и
онкологических больных до и во время лечения.
Научно-практическая ценность работы. Результаты работы могут
быть использованы: в радиационной биологии для определения различий в
индивидуальной реакции на облучение; в медицине и космической биологиии для выявления у пилотов и космонавтов ранних признаков необходимости прекращения полетов; в медицине для прогнозирования эффективности и последствий лучевого лечения онкологических заболеваний.
Личный вклад диссертанта. Представленная работа является частью исследований, проведенных лабораторией радиационной биофизики и
экологии ИХФ РАН с личным вкладом диссертанта, в получение представленных в работе материалов не менее 70 %. Автор самостоятельно осуществляла постановку и проведение исследований, первичную обработку и
анализ полученных данных, формулировала положения и выводы работы.
Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и обсуждались на Международной конференции БИОРАД-2006 «Биологические эффекты радиации и радиоактивное загрязнение среды» (Сыктывкар, 2006); 4th International Workshop on Space Radiation Research and
17th Annual NASA Space Radiation Health Investigators’ Workshop (Moscow St. Petersburg, Russia, 2006); 35th Annual Meeting of the European Radiation
Research Society and the 4th Annual Meeting of the Ukrainian Society for Radiation Biology (Kiev, Ukraine, 2006); International Free Radical Summer
School 2006 (Spetses Island, Greece, 2006); III Международном симпозиуме
«Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (МоскваДубна, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ,
в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК
РФ.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, использованных в
работе, трех глав результатов исследований и их обсуждения, заключения,
выводов и списка литературы. Работа изложена на __ страницах машинописного текста и содержит __ таблиц и __ рисунков. Список литературы
включает __ источников, из них __ на иностранном языке.
5
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для исследований были подобраны четыре различных когорты людей.
1) Группу контроля составили здоровые сотрудники лаборатории
лабораторных методов исследований клинико-диагностического отделения
ФГУ РНЦРР Росмедтехнологии, доноры пункта переливания крови МРНЦ
РАМН. У всех контрольных доноров было получено согласие на проведение данного исследования. Всего было обследовано 33 контрольных доноров.
2) В группу летчиков вошли 41 пилот гражданской авиации, летавшие на разной высоте (6000–17000 м), различное количество часов (390–
4520 ч). Общий налет составил от 390 до 4520 часов, а накопленная доза
0,019 – 1,4 сГр.
3) В группу космонавтов вошли 8 человек, обследование которых
проводилось спустя 10 – 20 лет после завершения полетов, время в космосе
составляло от 11 до 679 суток (суммарно за несколько полетов) и накопленная доза составила 0,14 – 22,7 сГр.
4) Группу онкологических больных до лечения составили 18 пациентов с диагнозом рак предстательной железы, которые были госпитализированы в отделение урологии ФГУ РНЦРР Росмедтехнологий в период с
апреля по сентябрь 2007 года. Диагноз был подтвержден морфологически и
методом ИФА. У 10 человек размер опухоли был определен как T1N0M0, у
7- T2N0M0.
5) Группу онкологических больных во время лечения составили 6
пациентов. Взятие материала было произведено до начала лечения и спустя 2-5 месяцев после начала лечения (локальная суммарная поглощенная
доза на предстательную железу составляла 41-123 Гр).
Выделение лимфоцитов из гепаринизированной венозной крови
проводили путем центрифугирования в градиенте плотности фиколлверографин (Histopaque, Sigma) в соответствии с прилагаемой инструкцией.
После выделения лимфоциты отмывали и ресуспензировали в фосфатносолевом буфере (рН 7,4) до конечной концентрации 1-2 x 106 клеток/мл.
Для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК и эффективности их
репарации в лимфоцитах использовали метод электрофореза единичных
клеток (метод ДНК-комет) в нейтральных условиях. Степень поврежденности ДНК, определяемая этим методом, оценивается по увеличению количества мигрировавшей из ядерной области ДНК и расстояния ее миграции после проведения электрофореза ДНК иммобилизованных в агарозу
единичных клеток. Сравнительные фотографии ДНК-комет лимфоцитов
крови контрольных доноров после облучении в различных дозах представлены на рис. 1.
6
Рис.1 Сравнительные фотографии ДНК-комет лимфоцитов крови
контрольных доноров после облучении в различных дозах.
Краткое описание метода:
20 мкл суспензии лимфоцитов смешивали со 100 мкл 0.5 % раствора
легкоплавкой агарозы (тип IV) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) при
температуре 37˚С и наносили на предварительно покрытые 1% слоем нормоплавкой агарозы предметные стекла, накрывали покровными стеклами и
выдерживали 5 мин при 4˚С на предварительно охлажденной металлической пластине. После солидификации агарозы удаляли покровные стекла
и полученные сайды помещали в охлажденный (4˚С) фосфатно-солевой
буфер.
Облучение проводили на терапевтической установке «Алтай» (Россия, источник гамма-излучения 60Co) в дозе 1 и 10 Гр при мощности дозы
1,5 Гр/мин.
Через 1-2 мин после окончания облучения слайды переносили в холодный (4˚C) лизирующий буфер (2.5 M NaCl, 100 мM Na2EDTA, 20 мM
Tris-HCl, pH 10.0, 1 % Triton X-100 и 10 % DMSO) в течение 2 ч. После лизиса клеток слайды переносили в холодный (4˚C) трис-боратный буфер
(TBE, рН 8.2, Sigma) и выдерживали 20 мин. Электрофорез проводили в
ТBE буфере при напряжении 1.5 В/см при температуре 4˚С в течение 20
мин. После электрофореза слайды слегка подсушивали и фиксировали в 70
% этаноле в течение 10 мин.
Для исследования эффективности репарации ДНК, агарозные слайды
с облученными клетками помещали в среду RPMI-1640, содержащей 20%
7
сыворотки крупного рогатого скота и инкубировали при 37°С в течение
60 мин. После чего проводили лизис, электрофорез и фиксацию согласно
описанной выше процедуре.
Для окраски ДНК использовали акридиновый оранжевый (Sigma)
(2 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере, рН 7.4). Визуализацию ДНК-комет
проводили с помощью люминесцентных микроскопов ЛЮМАМ И8 и
МИКМЕД-2 вар 11 (ЛОМО, Россия) и видеосистемы на основе цифровой
камеры. Фильтр возбуждения ФС1-5 (400-440 нм), запирающий фильтр 515
(515 нм). Использование запирающего фильтра 515 позволяет фиксировать
преимущественно «зеленую» флуоресценцию, характерную для комплексов акридиновый оранжевый – двунитевая ДНК. Для анализа ДНК-комет
использовали программу СometScore (TriTek Corp. http://tritekcorp.com).
Оценивали момент хвоста ДНК-комет равный произведению расстояния
от центра ядра до центра плотности хвоста кометы на % ДНК в хвосте.
Дополнительно у отдельных индивидуумов проводили исследования уровня радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК, при
помощи анализа фосфорилированного гистона H2AX (γ-H2AX). Фосфорилирование серина 139 гистона H2AX на сайтах повреждений ДНК является
наиболее ранним откликом клеток млекопитающих на образование двунитевых разрывов ДНК и свидетельствует о распознавании повреждения
ДНК-зависимыми киназами ATM, ATR и DNA-PK (Ismail et al., 2007). Анализ проводится с помощью специфических антител к γ-H2AX, конъюгированных с флуоресцентными красителями.
Для определения уровня γ-H2AX использовали набор «anti-phosphoHistone H2AX» (Millipore Corp.), согласно прилагающемуся протоколу.
Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Daco Galaxy (Дания) со
скоростью 200 клеток/сек. Компьютерную обработку проводили с использованием программы FlowMax. В каждом образце анализировали 30 000
клеток.
Для изучения сравнительной динамики апоптотической гибели контрольных (необлученных) и облученных в дозе 1 Гр лимфоцитов при инкубации в полной среде in vitro использовали метод проточной цитофлуорометрии с анализом фосфатидилсерин-позитивных клеток и клеток с поврежденной мембраной. Известно, что после индукции апоптоза происходит переход молекул фофатидилсерина с внутренней стороны клеточный
мембраны на наружную. Данное событие является необратимым и свидетельствует о том, что в клетках запущен механизм апоптотической гибели.
Идентификация фосфатидилсерин-позитивных клеток основана на специфическом связывании фофатидилсерина аннексином 5 (плацентарный
антикоагулирующий белок-1) конъюгированным с флуоресцентным красителем (FITC). Анализ фосфатидилсерин-позитивных клеток методом проточной цитофлуорометрии является одним из наиболее быстрых и эффективных методов обнаружения апоптотических клеток. Использование ком8
бинированного окрашивания клеток флуоресцентными красителями,
конъюгированными с аннексином 5, и йодистым пропидием, проникающим только в погибшие клетки с нарушенной мембраной, позволяет раздельно детектировать раннюю и позднюю стадии апоптоза, а также некроз.
Окраску лимфоцитов проводили с использованием набора «Аннексин V» (Beckman Coulter), согласно прилагающемуся протоколу. Образцы
анализировали на проточном цитофлуориметре Daco Galaxy (Дания) со
скоростью 200 клеток/сек. Компьютерную обработку проводили с использованием программы FlowMax. Анализ клеток в образце проводили по
четырем параметрам: интенсивность прямого и бокового светорассеяния
(FSC/SSC) в линейных координатах и интенсивность флуоресценции FITC
и пропидий йодида (FL1/FL2) в логарифмических единицах. В каждом образце анализировали 30 000 клеток.
Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с
использованием программы Statistica 6.0.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Уровень разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови
летчиков, космонавтов и онкологических больных
Уровень повреждений ДНК, определяемый с помощью метода
ДНК-комет, в клетках человека может сильно варьировать в зависимости
от наличия заболеваний (Collins et al., 1998) и курения (Frenzilli et al., 1997).
Поэтому для исследований отбирались только здоровые, некурящие доноры в возрасте от 30 до 50 лет. Результаты исследований 33 контрольных
доноров показали, что в контрольной когорте наблюдаются существенные
индивидуальные различия в исходных уровнях разрывов ДНК, но не один
из доноров не выходил за границы 95%-ного доверительного интервала
(табл. 1). Полученные результаты, в целом, свидетельствуют об адекватном выборе контрольной когорты.
Исследования лимфоцитов крови летчиков показали, что в когорте
летчиков параметры распределения уровня разрывов ДНК резко отличаются от контрольных (табл. 1). Средние значения уровней разрывов ДНК
6-ти летчиков выходят за верхнюю границу 95% доверительного интервала
контрольного распределения, в то время как для 1 летчика этот показатель
выходит за нижнюю границу 95% доверительного интервала контрольного
распределения. Сравнение дисперсий распределения уровней разрывов
ДНК в группах летчиков и контроле, показало, что эти различия статистически достоверно различаются по F критерию Фишера. Таким образом,
условия полетов приводят к возрастанию индивидуальной вариабельности
и по уровню разрывов ДНК лимфоцитов крови.
В отличие от результатов, полученных при обследовании летчиков,
9
обследование небольшой когорты космонавтов не выявило статистически
достоверных изменений уровня разрывов ДНК по сравнению с контролем
(табл. 1). По всей видимости, отсутствие различий обусловлено более тщательным медицинским отбором и последующим контролем за состоянием
здоровья. Кроме того исследования космонавтов проводились спустя 10-20
лет после прекращения полетов.
Наиболее выраженные изменения уровня разрывов ДНК были зарегистрированы при исследовании онкологических больных с раком простаты. Было показано, что у онкобольных до лечения среднее значение момента хвоста ДНК-комет было статистически достоверно выше контрольного
значения в 2.3 раза (табл. 1). Во время лечения онкобольных среднее значение момента хвоста ДНК-комет лимфоцитов увеличивалось еще в большей степени (~3.4 раза по сравнению с контролем) и статически достоверно отличалось от контроля (t=2.55, p<0.05), что, по всей видимости, является следствием лучевой терапии опухоли. Дисперсии распределения уровней разрывов ДНК в группах онкобольных и контроле статистически достоверно различаются по F критерию Фишера.
Таблица 1. Параметры распределения уровней разрывов ДНК (момент хвоста ДНК-комет, усл. ед.) лимфоцитов крови контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных.
Группа
N
Среднее ±
SE
Контроль
33
8,87± 0.60
Летчики
41
Космонавты
SD
N ex
95%
t
F
3.46
0
-
-
9.46± 1.03
6.59
7
0.64
3.64
p<0.001
8
8.55±1.90
5.38
1
0.84
2.42
Онкобольные до
лечения
18
20.15± 1.91
8.09
13
6.98
p<0.001
5.48
p<0.001
Онкобольные во
время лечения
6
29.76±3.14
7.68
6
11.00
p<0.001
4.94
p<0.01
Примечание. N – число обследованных людей; SE -стандартная ошибка; SD стандартная дисперсия; N ex 95% - число людей, выходящих за границу соответствующего 95% доверительного интервала контрольной группы; t -значения tкритерия Стьюдента при сравнении с контрольным распределением; F - значения
F критерия Фишера при сравнении с дисперсией контрольного распределения.
10
2. Повреждаемость ДНК лимфоцитов периферической крови
летчиков, космонавтов и онкологических больных при
дополнительном облучении in vitro
В настоящей главе представлены результаты исследования индукции
двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов периферической крови летчиков,
космонавтов и онкологических больных при дополнительном воздействии
γ-излучения в дозе 1 Гр. Для оценки уровня двунитевых разрывов ДНК
использовали метод ДНК-комет. Предполагается, что именно двунитевые
разрывы ДНК влияют на фрагментированность ДНК, определяемую методом ДНК-комет при проведении электрофореза в нейтральных условиях
(Calini et al., 2002). Выход радиоиндуцированных двунитевых разрывов
ДНК для редкоионизирующего излучения может колебаться от 20 до 50 на
клетку/Гр (Ward, 1988) и зависит от состояния антиоксидантных защитных
систем клеток и степени конденсации хроматина (в активных областях, где
доступ свободных радикалов к ДНК не лимитирован белками количество
радиационных повреждений ДНК значительно выше, чем в неактивных
областях). В наших предварительных исследованиях было показано, что
значения момента хвоста ДНК-комет статистически достоверно
(r>0.9, р<0.01) коррелирует с количеством фосфолирированного гистона
Н2AX (γ-Н2AX), то есть с количеством распознанных двунитевых разрывов ДНК.
Облучение лимфоцитов крови контрольных доноров, летчиков и онкологических больных in vitro в дозе 1 Гр приводило к статистически достоверному увеличению уровня разрывов ДНК, регистрируемому методом
ДНК-комет почти во всех обследованных группах за исключением группы
космонавтов (рис. 2).
Дополнительно проводили исследования изменений уровня гистона
γ-Н2AX в лимфоцитах отдельных индивидуумов из групп контрольных
доноров, а также онкологических больных до и время лечения. Было показано:
1. В лимфоцитах крови онкологических больных до лечения уровень гистона γ-Н2AX выше чем лимфоцитах контрольных доноров;
2. Лучевая терапия рака простаты приводит к увеличению уровня
γ-Н2AX в лимфоцитах крови по сравнению с показателями до
лечения;
3. Дополнительное облучение лимфоцитов крови в дозе 1 Гр вызывает увеличение уровня γ-Н2AX во всех исследованных группах.
В целом, результаты исследований подтверждают данные полученные помощью метода ДНК-комет.
11
Рис. 2. Уровни разрывов ДНК лимфоцитов крови в различных исследуемых когортах до и после облучения клеток in vitro в дозе 1 Гр. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. *** - p<0.001,
* - p < 0.05 – достоверность различий по сравнению с исходным уровнем.
Так как межгрупповые уровни исходных разрывов ДНК значительно различались, то для оценки радиоповреждаемости ДНК нами было сочтено целесообразным использование значений увеличения момента хвоста
ДНК-комет после дополнительного облучения в дозе 1 Гр за вычетом значений до облучения (инкремент момента хвоста). Инкремент момента хвоста был рассчитан для каждого человека. Результаты статистического анализа полученных данных представлены в табл. 2.
Как видно из табл. 2 вариабельность уровня двунитевых разрывов
ДНК вызванных облучением была высока, но не одно из значений не выходило за границы 95%-ного доверительного интервала. В группе летчиков
отмечалось статически достоверное (p<0.05) увеличение повреждаемости
ДНК при облучении по сравнению с контролем. Дисперсии распределения
уровня двунитевых разрывов ДНК в группе летчиков и контроле после облучения в дозе 1 Гр также статистически достоверно различались по F
критерию Фишера (p<0.05). Уровни радиоиндуцированных двунитевых
разрывов ДНК лимфоцитов крови 9-ти летчиков выходили за верхнюю
границу 95% доверительного интервала контрольного распределения. Увеличение радиоповреждаемости ДНК свидетельствует, о том, что у отдель12
ных индивидуумов полеты ведут к изменениям молекулярно-клеточных
параметров,
определяющих
уровень
первичных
радиационноиндуцируемых повреждений ДНК (степень конформации хроматина, уровню экспрессии генов и концентрации эндогенных антиоксидантов, находящихся в непосредственной близости от ДНК).
Анализ данных, полученных при исследовании лимфоцитов крови
космонавтов, показал отсутствие достоверных различий среднего значения
уровня радиационно-индуцированных разрывов ДНК (табл. 2).
Таблица 2. Значения абсолютного увеличения (инкремент) момента хвоста
ДНК-комет (усл. ед.) лимфоцитов крови контрольных доноров, летчиков,
космонавтов и онкологических больных после облучения клеток in vitro в 1
Гр за вычетом значений до облучения.
Группа
N
Среднее ±
SE
Контроль
33
10.93 ±1.14
Летчики
41
Космонавты
SD
N ex
95%
t
F
6,54
0
-
-
15.93±1.53
9,78
9
2.52
p<0.05
2.24
p<0.05
8
9.00±3.54
10,01
1
0.67
2.34
Онкобольные до
лечения
18
19.11±2.55
10,82
7
3.37
p<0.01
2.74
p<0.05
Онкобольные во
время лечения
6
12.99±2.56
6,28
1
0.71
1.08
Примечание. N – число обследованных людей; SE -стандартная ошибка; SD стандартная дисперсия; N ex 95% - число людей, выходящих за границу соответствующего 95% доверительного интервала контрольной группы; t -значения tкритерия Стьюдента при сравнении с контрольным распределением; F - значения
F критерия Фишера при сравнении с дисперсией контрольного распределения.
Наиболее выраженное увеличение повреждаемости ДНК при дополнительном облучении отмечалось для онкологических больных до лечения.
Среднее значение инкремента момента хвоста ДНК-комет, у онкологических больных было почти в два раза статистически достоверно (p<0.001)
выше по сравнению с контролем (табл. 2). Помимо увеличения среднего
значения инкремента момента хвоста, в группе онкологических больных
отмечалось статистически достоверное (p<0.05) увеличение дисперсии
13
распределения уровня разрывов ДНК по сравнению с контрольным распределением (табл. 2). Уровни радиоиндуцированных двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов крови 7-ти онкольных выходили за верхнюю границу
95% доверительного интервала контрольного распределения.
Анализ данных полученных при исследовании онкологических
больных после лечения не выявил изменений повреждаемости ДНК при
дополнительном облучении (табл. 2). Возможно, вследствие значительно
меньшей статистической выборки.
Для целей практической медицины чрезвычайно важно помимо общих оценок исследуемых групп дать оценку радиочувствительности каждого конкретного индивидуума. На рис. 3 представлено распределение
контрольных доноров, летчиков, космонавтов и онкологических больных
по исходным уровням разрывов ДНК лимфоцитов и уровням разрывов
ДНК после облучения клеток in vitro. Пунктирными линиями показаны
границы 95 % доверительного интервала для контрольной группы. Такая
форма представления данных позволяет нам разделить всех исследуемых
индивидуумов на 4-е группы. К первой группе относятся люди с условно
нормальным уровнем разрывов ДНК и условно нормальной радиоповреждаемостью ДНК. Видно, что из 33 контрольных доноров к этой группе относятся 32 человека (~ 97 %), в то время как из 41 обследованного летчика
к первой группе можно отнести только 26 человек (~ 63 %). В случае космонавтов это 7 чел. (~ 88 %). Для группы онкологических больных до лечения только 3 человека из 18 обследованных (~ 17 %). Для онкологических больных после лечения – 0. Вторая группа - это люди с «нормальным» исходным уровнем разрывов ДНК, но повышенной радиоповреждаемостью ДНК. К этой группе относятся 9 летчиков (~ 22 %), 2 онкологических больных до лечения и один контрольный донор. Третья группа - повышенная радиоповреждаемость ДНК при повышенном исходном уровне
разрывов ДНК. В эту группу входят 5 летчиков (~ 12 %), один космонавт,
одиннадцать онкобольных до лечения (65%) и все 6 онкобольных во время
лечения. И, наконец, к четвертой группе с повышенным исходным уровнем
разрывов ДНК и «нормальной» радиоповреждаемостью ДНК относится
1 летчик и 2 онкобольных до лечения. Для летчиков и космонавтов полученные данные могут иметь важное прогностическое значение. В случае
онкологических больных важно установить чувствительность каждого
больного к лечению. Все индивидуумы, не входящие в первую группу, а в
особенности люди относящиеся к третьей группе, требуют тщательного
медицинского обследования с привлечением молекулярно-биологических
методов для выяснения детальных механизмов обнаруженных отклонений.
14
A
Б
Рис. 3. Распределение контрольных доноров, летчиков и космонавтов (А), а также контрольных доноров и онкологических больных (Б) по
исходным уровням разрывов ДНК лимфоцитов и уровням разрывов ДНК
после облучения лимфоцитов в дозе 1Гр. Пунктирные линии – границы
95 % доверительного интервала для контрольной группы. I – норма. II –
повышенная радиоповреждаемость ДНК. III - повышенная радиоповреждаемость ДНК при повышенном исходном уровне разрывов ДНК. IV повышенный исходный уровень разрывов ДНК.
15
3. Эффективность репарации радационно-индуцированых
двунитевых разрывов ДНК лимфоцитов периферической
крови летчиков, космонавтов и онкологических больных
Для оценки клеточной радиочувствительности необходимо исследовать не только степень радиоповреждаемости наиболее критических для
жизнедеятельности клеток молекулярных структур, но и эффективность
репарации радиационно-индуцированных повреждений. Нами было изучена репарация двунитевых разрывов ДНК после облучения в дозе 10 Гр и
инкубации клеток в полной среде при 37˚C в течение 1 ч. За это время
проходит быстрая фаза репарации путем негомологичной рекомбинации
(Sansar, 2004). Для количественной оценки эффективности репарации рассчитывали процент остаточных, неотрепарированных к окончанию времени инкубации двунитевых разрывов ДНК.
Результаты исследований представлены на рис. 4 как среднее для
групп ± стандартная ошибка и стандартное отклонение. Как видно из рис. 4
в облученных лимфоцитах контрольных доноров после 1 ч инкубации остается примерно 45 % двунитевых разрывов ДНК. Полученные данные
хорошо согласуются с данными литературы (Wojewodzka et. al., 2002).
Рис. 4. Доля неотрепарированных двунитевых разрывов ДНК в лимфоцитах
после облучения в дозе 10 Гр и инкубации клеток в полной среде при 37˚C
в течение 1 ч. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка.
16
В группе летчиков эффективность репарации двунитевых разрывов
ДНК была несколько ниже, чем в контрольной группе, однако распределения статистически достоверно различаются только по двустороннему tкритерию (р=0.029), что является отражением очень высокой вариабельности в когорте летчиков. Дисперсии распределений % неотрепарированных
двунитевых разрывов ДНК в группе летчиков и контроле также статистически достоверно различались по F критерию Фишера (p<0.05).
В отличие от летчиков, эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК у космонавтов статистически достоверно не отличалась от контроля.
Наиболее выраженное увеличение вариабельности эффективности
репарации двунитевых разрывов ДНК отмечалось в когорте онкологических больных до лечения (F критерий Фишера = 9.15, p<0.01).
В группе онкологических больных во время лечения вариабельность
была ниже и статистически достоверных отличий от контроля не отмечалось.
4. Апоптотическая гибель лимфоцитов периферической крови
летчиков, космонавтов и онкологических больных
Для изучения сравнительной динамики гибели контрольных (необлученных) и облученных в дозе 1 Гр лимфоцитов при инкубации в полной
среде in vitro использовали метод проточной цитофлуорометрии с анализом
фосфатидилсерин-позитивных клеток и клеток с поврежденной мембраной. Анализ полученных данных свидетельствует о высокой вариабельности динамики гибели по механизмам апоптоза и некроза необлученных и
облученных in vitro лимфоцитов периферической крови разных доноров
при инкубации течение 24 ч (37ºС).
Обращает на себя внимание тот факт, что процент клеток гибнущих
без облучения и после облучения по механизму некроза практически не
отличается, в то время как облучение приводит к статистически достоверному увеличению частоты апоптотических клеток после 4 ч инкубации
(рис. 5.1). Причем, как показывает анализ данных, это увеличение обеспечивается в основном за счет клеток находящихся в стадии позднего апоптоза. Процент облученных клеток находящихся в стадии раннего апоптоза
увеличивается лишь на 24 ч.
17
Рис. 5. Изменение относительного количества лифоцитов, гибнущих по
механизмам апоптоза и некроза при инкубации in vitro в течение 0, 2, 4 и
24 ч без дополнительного облучения (A) и после облучение в дозе 1 Гр (Б).
Группы: 1 –контрольные доноры; 2 – летчики; 3 – онкобольные до лечения;
4 - онкобольные во время лечения.
18
В группе исследованных летчиков отмечалось значимое увеличение
как спонтанной апоптотической гибели клеток при инкубации, так и частоты радиоиндуцированного апоптоза (рис. 5.2). Так через 24 ч инкубации
без дополнительного облучения, суммарная частота клеток в стадии позднего и раннего апоптоза составляла для летчиков 13.89±5.18 % по сравнению с 4.57±0.82 % в контроле (р<0.01). После облучения в дозе 1 Гр и
инкубации в течение 24 ч частота апоптотических лимфоцитов крови летчиков составила 17.61±5.62 % против 6.13±0.68 % в контроле (р<0.01).
Дисперсии процента апоптотической гибели лимфоцитов для группы
летчиков и контроля также статистически достоверно различались по F
критерию Фишера.
Для группы онкологических больных до лечения (рис. 5.3) отмечали
статистически достоверное (р<0.01) увеличение частоты апоптотической
гибели лимфоцитов при инкубации и увеличение дисперсии распределения (p<0.05).
Наиболее высокая частота апоптотической гибели лимфоцитов была
зарегистрирована для онкобольных во время лечения (рис. 5.4). Процент
апоптотических лимфоцитов составил 16.79±4.88 % (р<0.01), а после облучения и 24 ч инкубации 19.43±6.03 % (р<0.01). Характерно, что после облучения лимфоцитов онкобольных во время лечения отмечалась весьма
высокая клеточная гибель по пути некроза (рис. 5.4).
Интересно, что лимфоциты крови людей, чувствительных к воздействию ионизирующего излучения, также более чувствительны к условиям
инкубации in vitro, о чем свидетельствует наличие статистически достоверной (р<0.05) корреляционной связи между уровнем радиационноиндуцированных двунитевых разрывов ДНК и частотой спонтанного апоптоза на 24 ч инкубации.
ВЫВОДЫ
1.
2.
3.
Показано, что в лимфоцитах летчиков по сравнению с контрольными
донорами отмечается статистически достоверное увеличение индивидуальной вариабельности уровня разрывов ДНК (p<0.001), уровня двунитевых разрывов ДНК при облучении in vitro в дозе 1 Гр (p<0.05),
увеличение индивидуальной вариабельности эффективности репарации
двунитевых разрывов ДНК (p<0.05).
В группе летчиков по сравнению с контролем отмечалось значимое
увеличение как апоптотической гибели лимфоцитов крови при инкубации in vitro (р<0.01), так и частоты апоптоза индуцированного дополнительным облучением в дозе 1Гр (р<0.01).
Исследования лимфоцитов крови космонавтов не выявили статистически достоверных изменений от контроля по всем исследованным показателям.
19
4.
5.
6.
7.
8.
У больных раком простаты до лучевого лечения отмечается высокий
уровень разрывов ДНК в лимфоцитах крови (в среднем более чем в 2
раза, по сравнению с контролем, р<0.001). Лучевая терапия опухоли
приводит к достоверному увеличению уровня разрывов ДНК в лимфоцитах крови (р<0.05) по сравнению их уровнями у больных до лечения.
Показано, что уровень радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК и его индивидуальная вариабельность при облучении лимфоцитов крови больных раком простаты in vitro статистически достоверно выше, чем у контрольных доноров (р<0.01 и р<0.05, соответственно). Вариабельность эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК в группе онкологических больных до лечения статистически
выше, чем у контрольных доноров (p<0.01). Во время проведения лучевой терапии рака простаты уровни радиационно-индуцированных
двунитевых разрывов ДНК и эффективность их репарации не отличались от контроля.
Обнаружено статистически достоверное (р<0.01) увеличение частоты
апоптотической гибели лимфоцитов у онкологических больных по
сравнению с контрольными донорами.
Лучевая терапия рака простаты приводит к статистически достоверному увеличению частоты гибели лимфоцитов по пути апоптоза (р<0.05),
и некроза (р<0.05). Дополнительное облучение лимфоцитов крови этих
пациентов in vitro приводит к увеличению клеточной гибели в основном по пути некроза.
Анализ радиационно-индуцированных двунитевых разрывов ДНК и
частоты клеточной гибели показывают, что эти показатели могут быть
маркерами индивидуальной радиочувствительности и являются адекватными и информативными тестами для обнаружения индивидуумов
с повышенной радиочувствительностью.
20
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Vorobyova N.Yu., Osipov A.N., Serebryanyi A.M., Tsetlin V.V., Pelevina
I.I. Influence of cosmic radiation on chromatin structure and DNA radiodamaging of peripheral blood lymphocytes in pilots. // Abstracts of the International
conference “Biological effects of low dose ionizing radiation and radioactive
pollution on environment” BIORAD-2006 (February 28 – March 3, 2006, Syktyvkar, Russia) - Syktyvkar. - 2006. - P. 72-73.
2. Pelevina I.I., Antoschina М.М., Bondarenko V.А., Vorobyova N.Yu., Voronkov Yu.I., Gotlib V.U., Kudryashova О.V., Osipov А.N., Ryabchenko N.I.,
Serebryanyi А.М., Tsetlin V.V. The perculiarity of low dose irradiation. The
possible late effects on pilots and cosmonauts. // Abstract book of 4th International Workshop on Space Radiation Research and 17th Annual NASA Space
Radiation Health Investigators’ Workshop (June 5-9, 2006, Moscow - St. Petersburg, Russia). Dubna, Russia – 2006. – P. 95-96.
Osipov A.N., Pelevina I.I., Serebryaniy A.M.,
3. Vorobyova N.Yu.,
Tsetlin V.V. Changes of chromatin structure and DNA radiodamaging in pilots
peripheral blood lymphocytes. // Abstract book of the 35th Annual Meeting of
the European Radiation Research Society and the 4th Annual Meeting of the
Ukrainian Society for Radiation Biology (August 22-25, 2006, Kiev, Ukraine).
Kiev, Ukraine. – 2006. - P. 62
4. Vorobyeva N.Yu , Osipov A.N., Pelevina I.I., Serebryaniy A.M.,
Tsetlin V.V. Primary radiation-induced DNA damage of blood lymphocytes
chromatin in cosmonauts and pilots. // Proc. of the International Free Radical
Summer School 2006 (September 30 to October 6, 2006, Spetses Island,
Greece). Spetses Island, Greece. – 2006. – P. 114.
5. Пелевина И.И., Антощина М.М., Бондаренко В.А, Воробьева Н.Ю.,
Воронков Ю.И., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В., Осипов А.Н., Рябченко
Н.И., Серебряный А.М., Цетлин В.В. Молекулярно-генетические эффекты
в лимфоцитах крови пилотов и космонавтов: результаты исследования отдельных индивидуумов. // III Международный симпозиум, посвященный
100-летию со дня рождения академика Н.М. Сисакяна «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии» (24-28 января 2007 г., Москва-Дубна): Аннотации докладов. – Дубна.: ОИЯИ. 2007. – C. 132-133.
6. Пелевина И.И., Антощина М.М., Бондаренко В.А., Воробьева Н.Ю.,
Воронков Ю.И., Готлиб В.Я., Кудряшова О.В., Осипов А.Н., Рябченко
Н.И., Серебряный А.М., Цетлин В.В. Индивидуальные цитогенетические и
молекулярно-биологические особенности лимфоцитов крови летчиков и
космонавтов. // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2007. - Т. 47. № 2. - С. 141-150.
21
7. Воробьева Н.Ю., Осипов А.Н., Пелевина И.И. Чувствительность лимфоцитов периферической крови летчиков и космонавтов к воздействию γизлучения: индукция двунитевых разрывов ДНК. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144. - № 10. - С. 404407.
22