На правах рукописи Межклеточные взаимодействия
advertisement
На правах рукописи Хряпенкова Татьяна Геннадьевна Межклеточные взаимодействия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток и дифференцированных клеток сердца и почки 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА 2010 3 Работа выполнена в отделе биоэнергетики НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, на факультете биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В.Ломоносова. Научные руководители Доктор биологических наук, профессор Зоров Дмитрий Борисович Доктор биологических наук Плотников Егор Юрьевич Официальные оппоненты Доктор биологических наук, профессор Воробьёв Иван Андреевич, биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, кафедра клеточной биологии и гистологии Кандидат биологических наук Белоусов Всеволод Вадимович, Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии имени академика М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, отдел геномики и постгеномных технологий, лаборатория молекулярных технологий Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН Защита состоится «___» _________ 2010 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. Автореферат разослан «___»_______________2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.Н.Калистратова 4 Общая характеристика работы Актуальность проблемы Регенеративная клеточная терапия – современное направление медицины, вызывающее немалый интерес как врачей, так и учёных, и получившее большое развитие в последние годы. Сегодня клеточная терапия имеет весьма широкое применение в самых различных областях современной клинической практики. Особенно оправданным является использование этой терапии в борьбе с ишемической болезнью сердца (ИБС), последствиями инфаркта миокарда (ИМ) и другими функциональными и структурными изменениями сердечной ткани, так как патоморфология миокарда человека не сопровождается органной регенерацией. Обычно при этих патологиях происходит гипертрофия кардиомиоцитов при минимальной пролиферативной способности миокарда. Часто единственным способом сохранить больному жизнь является трансплантация сердца – дорогостоящая и опасная операция, вынужденно применяемая на сегодняшний день достаточно широко (Taylor et al., 2009). Сердечно-сосудистые заболевания занимают, в настоящее время, ведущее место среди причин смертности больных в развитых странах. Аналогичные проблемы существуют и для почки, содержащей в основном постмитотические клетки (Humes et al., 2004; Amiel et al., 1999). Для этого органа проблемой также является поиск подходов к лечению острой почечной недостаточности (ОПН) и терминальных стадий хронической почечной недостаточности (ХПН). На сегодняшний день диализ (Чупрасов, 2001) и трансплантация единственно возможные варианты борьбы с этими патологиями. Оба эти подхода сложны для реализации и имеют массу осложнений и противопоказаний. Несмотря на значительный прогресс в лечении ХПН, по-прежнему регистрируется высокая смертность от этого заболевания. Диализ распространен в большей степени, чем трансплантация, но он продлевает жизнь, не восстанавливая функцию почек у больных с терминальными стадиями ХПН, и не дает шансов на выздоровление. Трансплантация может дать полное восстановление функций почки, но связана с массой сложностей из-за дефицита доноров и реакций иммунологической несовместимости, а также высокой стоимости операции. В приведённых выше случаях заместительная клеточная терапия могла бы стать самым оптимальным способом восстановления утраченных функций органа. Но прежде чем начинать применение заместительной клеточной терапии в клинической практике, необходимо убедиться в её безопасности, а также определить механизмы положительных эффектов на клеточном уровне. К сожалению, на сегодняшний день клиническое использование в этой области наверно серьезно превышает количество фундаментальных исследований возможностей клеточных технологий. В данной работе предпринята попытка восполнить этот пробел и расширить знание фундаментальных основ клеточной терапии. В современной литературе идет противоборство двух взглядов на взаимодействие донорских стволовых клеток с организмом реципиента. Согласно одной концепции основу эффекта вводимых клеток составляет их направленная дифференцировка в клетки органа-мишени, согласно второй – положительное действие связано, в первую очередь, с выделением стволовыми клетками неких паракринных факторов, кото5 рые оказывают стимулирующее воздействие на окружающую ткань. Кроме того, особое внимание к себе привлекают некоторые типы межклеточных взаимодействий, характерные, в частности, для стволовых клеток. В первую очередь, это контакты, описанные совсем недавно и названные туннельными нанотрубочками (Rustom et al., 2004). Эти структуры способны осуществлять передачу различных внутриклеточных компонентов между клетками, расположенными на достаточном удалении друг от друга, что отличает их от всех известных клеточных контактов (Onfelt et al., 2004). В работе были исследованы механизмы, которые могут обеспечивать терапевтические эффекты клеточной трансплантации, наблюдаемые в клинической практике. В частности, изучено поведение стволовых клеток при взаимодействии с дифференцированными соматическими клетками: кардиомиоцитами и клетками эпителия почечных канальцев. Исследованы межклеточные взаимодействия этих клеток, в частности, межклеточные контакты и межклеточный транспорт. Цель и задачи исследования Целью работы являлось исследование механизмов интеграции мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) с дифференцированными соматическими клетками (кардиомиоцитами, эпителиоцитами почки крысы); изучение влияния межклеточных контактов на определение пути дифференцировки ММСК. Задачи 1. Исследовать образование межклеточных контактов при совместном культивировании ММСК человека с эмбриональными кардиомиоцитами или эпителиоцитами почки крысы. 2. Определить возможность межклеточного транспорта клеточных компартментов между сокультивируемыми клетками. 3. Исследовать возможность дифференцировки ММСК человека в кардиомиоциты или эпителиоциты почки в условиях сокультивирования. 4. Исследовать возможность интеграции ММСК в орган in vivo при различных патологиях, приводящих к структурно-функциональным изменениям. Научная новизна работы Было показано, что в совместной культуре между ММСК человека и дифференцированными соматическими клетками крысы образуются межклеточные контакты, в частности щелевые контакты и туннельные нанотрубочки. По этим контактам осуществляется межклеточный перенос цитоплазматических и мембранных компонентов и органелл, в частности митохондрий. В ММСК в условиях сокультивирования с соматическими клетками запускается дифференцировка по кардио- или нефроспецифическому пути, и эта дифференцировка в значительной мере зависит от наличия специфических контактов между клетками. 6 Научно-практическое значение работы Данные, полученные в настоящем исследовании, расширяют представление о возможностях заместительной терапии повреждений почки и сердца. Получены новые данные о механизмах взаимодействия донорских клеток с клетками организма реципиента (на уровне культуры клеток и на уровне организма). Полученный материал может использоваться для дальнейшего клинического внедрения клеточных технологий для предотвращения патологических изменений при почечной недостаточности или патологиях сердца и улучшения терапевтических эффектов заместительной клеточной терапии. Основные положения, выносимые на защиту 1. ММСК человека могут при совместном культивировании образовывать контакты с дифференцированными соматическими клетками крысы, такими как кардиомиоциты и клетки почечного эпителия. 2. Между контактирующими клетками происходит обмен клеточным содержимым. 3. Следствием образования межклеточных контактов в совместной культуре клеток становится дифференцировка ММСК по тканеспецифичному пути. 4. ММСК человека при введении животным способствуют уменьшению выраженности повреждения почек при острой почечной недостаточности. Апробация работы Результаты диссертационной работы были представлены на теоретических семинарах отдела биоэнергетики НИИ Физико-Химической Биологии им. А.Н. Белозерского. Отдельные аспекты работы представлялись на Международной Пироговской Студенческой научной конференции (Москва, 2007); конференции «Биология — наука 21-го века» (Пущино, 2007); международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007, 2009); Международном молодежном медицинском конгрессе (Санкт-Петербург, 2007); XV Международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2008, 2010); 15-ой Европейской Биоэнергетической Конференции EBEC (Дублин, 2008); Международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008); Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных “Актуальные вопросы медицинской науки” (Ярославль, 2009); Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009). Публикации Основные положения диссертации опубликованы в 18 печатных работах. Из них 6 – в журналах, рекомендованных ВАК. 7 Структура и объём работы Диссертация написана на 120 страницах, состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Благодарности» и «Список литературы». Список литературы включает 9 отечественных и 202 иностранных источника. Материалы и методы исследования Первичная культура кардиомиоцитов была получена из сердца эмбрионов крыс 15-17 дней гестации. Сердечная ткань подвергалась механическому измельчению (до кусочков размером приблизительно 1-1,5 мм). Кусочки ткани помещали в раствор Хенкса, отмывали от крови. После этого ткань подвергали воздействию 0,1% коллагеназы 2 типа. После ферментативной обработки суспензия центрифугировались при 100g в течение 1 мин. Раствор, содержащий фермент, отбирался. Осадок клеток ресуспендировали в среде DMEM-F12(4:1) с 15% содержанием сыворотки крупного рогатого скота. Аналогичным образом выделялись эпителиоциты почек 1-3-дневных крысят. Клетки ресуспендировали в среде DMEMF12(1:1) с 10% содержанием эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки культивировали в инкубатор при температуре 37ºС и 5% СО2. Культура ММСК, полученная из аутопсийного материала плодов 11-13 недель гестации, была предоставлена НЦ Акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова. Фенотип ММСК был подтвержден позитивной окраской на маркеры CD90 и CD105, и отрицательной на маркеры CD34, CD45. Митохондриальный трансмембранный потенциал оценивали при помощи этилового эфира тетраметилродамина (TMRE, Invitrogen, США). Для оценки транспорта цитоплазматического содержимого клетки окрашивались 2,5 мкМ Calcein AM (Invitrogen, США). Для оценки транспорта митохондрий клетки окрашивались 1 мкМ Mitotracker Green FM или Mitotracker Red (Invitrogen,США). Для оценки транспорта липидов мембран клетки окрашивались 2,5 мкМ DiO, DiD или DiL (Vybrant, Invitrogen, США). Микроскопическое изучение клеток почки производилось на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе LSM510 (Carl Zeiss, Германия). Изображения обрабатывались программным пакетом ImageJ. Проточная цитофлуориметрия проводилась с помощью проточного цитометра CyFlow (Partec GmbH, Германия). Опыты по моделированию ишемии/реперфузии (И/Р) почки проводились на самцах белых беспородных крыс массой тела 180-200 г, содержавшихся в условиях вивария. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского. Для моделирования И/Р у животных под хлоралгидратным наркозом выделяли и пережимали сосудистую ножку почки сосудистым зажимом на различные периоды времени. После снятия зажимов отсчитывали время реперфузии. После окончания периода реперфузии либо удаляли почку для дальнейшего анализа, либо накладывали швы и выводили животное из наркоза. 8 Иммуноцитохимия. Клетки фиксировали 4% раствором формалина; пермеабилизировали 0,2% Triton X-100. Организация цитоскелета клеток оценивалась при помощи флуоресцентного красителя ТРИТЦ-фаллоидин (Sigma, США), а также моноклональных антител против тяжелой цепи кардиоспецифического βмиозина человека, после чего клетки инкубировали с вторичными антителами, конъюгированными с ФИТЦ. Для визуализации митохондрий использовали антитела к цитохромС-оксидазе человека. Также в работе использовались антитела к ядрам человеческих клеток (Human Nuclei); к белку Тамма Хорсфаля (THF) – специфическому белку почечных канальцев. Вестерн-блоттинг. Содержание белка определяли с помощью бицинхониновой кислоты. Электрофорез белков проводили по Лэммли (Laemmli, 1970). Для проведения электрофореза использовали 12,5% разделяющий гель и Трисглициновый электродный буфер. По окончании электрофореза белки переносили на PVDF мембрану (Amersham Pharmacia Biotech, Rainham, UK) согласно методике, описанной ранее (Towbin et al., 1992). Мембраны обрабатывали 5% раствором обезжиренного сухого молока, инкубировали с первичными антителами, промывали три раза по 15 мин, и инкубировали 1 ч со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Искомые белковые локусы на мембране детектировали с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL (Еnhanced chemiluminescence system, Amersham Pharmacia Biotech) с последующей детекцией хемилюминесценции на фотопленке Kodak (США). Изображение оцифровывали и анализировали с помощью программы ImageJ. Магнитно-резонансная томография (МРТ). Для исследования методом МРТ животных анестезировали хлоралгидратом и помещали в устройство позиционирования с системой стереотаксиса и терморегуляции томографа BioSpec 70/30. Трансплантируемые клетки для данного метода предварительно инкубировали с препаратом железа (Мальтофер, Vifor, Швейцария) в течение 12 часов. После этого клетки промывали, трипсинизировали и отмывали от диссоциирующих агентов. Полученный осадок клеток разводили физиологическим раствором до концентрации, необходимой для введения животным и вводили непосредственно в почку. Во время МРТ проводился мониторинг с помощью прибора для контроля жизнедеятельности Small Animal Monitoring and Gating System, (SA Instruments Inc., USA). Анализ МР-изображений проводился в программе ImageJ. Результаты и обсуждение Характеристика культуры клеток сердца эмбрионов крысы. Гетерогенность культуры Тщательной отработкой методов выделения и подбором оптимальных условий для содержания данной культуры было достигнуто образование клеточных ассоциатов, способных к самопроизвольному сокращению и обладающих признаками сердечной ткани уже через 24 часа. В зависимости от плотности культуры сокращались как отдельные прикреплённые к пластику клетки, так и многоклеточные островки, сокращение клеток в которых было согласованным и периодичным. Выделенная культура являлась гетерогенной - помимо клеток, способных к 9 сокращению, она содержала также и высокий процент недифференцированных кардиофибробластов. Данная культура была охарактеризована по ряду признаков: 1. Дифференцированные кардиомиоциты способны к самопроизвольному сокращению. 2. Флуоресценция TMRE в этих клетках почти в 4 раза превышает данный показатель в кардиофибробластах. 3. Миофибриллы расположены в этих клетках упорядоченно и имеют поперечную исчерченность. 4. Дифференцированные кардиомиоциты имеют повышенное содержание внутриклеточного кальция; способны к циклическим колебаниям концентрации ионов кальция во внутриклеточных депо. 5. Таких клеток в культуре около 50%. В дальнейшем эти признаки использовались для наблюдения только за кардиомиоцитами в экспериментах по сокультивированию их с мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками (ММСК), поскольку нас интересовало взаимодействие ММСК именно с сократительными элементами миокарда. Формирование межклеточных контактов в смешанной культуре клеток различного происхождения В работе использовалась модель совместного культивирования двух различных типов клеток с целью изучеВ А ния поведения стволовых клеток в ткани после трансплантации. Нами выявлено, что в процессе культивирования ММСК Г Б с кардиомиоцитами или клетками почечного эпителия в обоих типах клеток наблюдается образование Рис.1. Образование нанотрубочек при сокультивировании множества протяММСК и других типов клеток. А, фазовый контраст, видны женных межкленанотрубочки различной толщины, соединяющие кардиомио- точных структур, циты и ММСК. Шкала 20 мкм. Б, сканирующая электронная причем длина тамикроскопия, нанотрубочки соединяющие клетки. Шкала 3 ких цитоплазматимкм. В,Г, трансмиссионная микроскопия; нанотрубочки, со- ческих выростов в единяющие кардиомиоциты и ММСК (указаны маленькими ряде случаев была чёрными стрелками); наличие в нанотрубочках визикулярных структур (большая чёрная стрелка); структура концевого уча- сопоставима с размерами клетки стка нанотрубочки (длинная чёрная стрелка). Шкала 5 мкм. (рис.1). Первоот10 крыватели этих структур назвали их туннельными нанотрубочками, ТНТ (Rustom et al., 2004). В данной работе было показано, что нанотрубочки и более крупные по диаметру тяжи цитоплазмы достаточно активно образуются в культуре кардиомиоцитов и при культивировании их в монокультуре без соседствующих ММСК. Вероятно, это отражает фенотипическую предрасположенность кардиомиоцитов к образованию единого многоклеточного синцития, как это происходит в ткани сердца. Напротив, в монокультуре клеток почечного эпителия такие контакты практически не наблюдались. Однако в условиях сокультивирования образование нанотрубочек значительно усиливалось, причем как со стороны ММСК, так и клеток сердца (и, возможно, почки, так как в ряде случаев сложно определить, какая из контактирующих клеток являлась ТНТ-образующей). ММСК в условиях монокультуры также образовывали ТНТ. Причём, если сравнивать количество ТНТ-образующих клеток в монокультурах ММСК и кардиомиоцитов, оно будет сопоставимым; тогда как в монокультуре клеток почки таких клеток крайне мало. Полученные данные подтвердили образование между клетками совместной культуры межклеточных контактов по типу ТНТ (~ 0,1 мкм в диаметре) наряду с другими типами цитоплазматических тяжей, соединяющих клетки (~ 3 мкм). На электронных микрофотографиях видно, что клетки образуют множество выростов цитоплазмы по типу филлоподий, которые могут как перемещаться вдоль субстрата так и выпячиваться перпендикулярно клеточной мембране (рис.1В). Образовавшиеся ТНТ, соединяющие клетки, имеют вид натянутых нитей и не имеют контактов с подложкой (рис.1А,Б), что является признаком, отличающим их от обычных филлоподий. Из данных просвечивающей микроскопии следует, что ТНТ представляют собой достаточно эластичные структуры, способные растягиваться в поперечнике в 2-4 раза, что может обеспечить транспорт объемных структур - везикул, митохондрий (рис.1Г). Помимо ТНТ в совместной культуре клеток наА Б Рис.2. Образование щелевых контактов между клет- блюдается формирование и ками различного происхождения – человеческих щелевых контактов. Их наММСК и крысиных клеток почки. Конфокальная личие подтвердилось рядом микроскопия; А, иммуноцитохимическое окрашива- экспериментов. В частноние. Зелёная флуоресценция – АТ на Human Nuclei – сти, фиксированные клетки маркер человеческих клеток; красная флуоресценция окрашивали антителами к – АТ на коннексин 43 – маркер щелевых контактов. коннексину 43 – маркеру Коннексин обнаруживается в том числе в области щелевых контактов. Также контакта ММСК и клеток почки. Б, фазовый кон- культуру подвергали ократраст. Шкала 20 мкм. ске антителами на Human Nuclei, чтобы визуализировать популяцию человеческих клеток. На изображении (рис.2) хорошо видно, что 11 клетки различного происхождения (человеческие ММСК с зеленым ядром; соседние клетки почки крысы – с неокрашенными ядрами) находятся в плотном контакте друг с другом. В зоне их непосредственного контакта наблюдаются частицы с красной флуоресценцией – коннексин 43, что свидетельствует о наличии между этими клетками щелевых контактов. Оценка функциональности таких контактов показала, что в режиме реального времени посредством щелевых контактов происходит межклеточная передача цитоплазматического содержимого. Исследование возможности различных клеток образовывать 6 контакты по типу туннельных 5 нанотрубочек в условиях моно- и 4 совместной культуры 3 Было замечено, что в услови2 ях монокультуры практически все 1 ММСК в полумонослойной культу0 ре образуют ТНТ. В культуре карКард-ы ММСК Кард-ы + ММСК диомиоцитов и ММСК число клеРис.3. Количество ТНТ на клетку в чистой ток, образующих ТНТ, возрастало в культуре клеток сердца эмбрионов крыс, чистой культуре ММСК и смешанной куль- условиях совместного культивиротуре кардиомиоцитов и ММСК; наблюдается вания (относительно монокультуры увеличение количества ТНТ на клетку в кардиомиоцитов). В условиях монокультуры кардиомиоцитов таких смешанной культуре. клеток было на 12% меньше. В случае ММСК процент ТНТ7 образующих клеток, напротив, не6 сколько снижался в совместной 5 культуре относительно монокуль4 туры ММСК. Однако более объек3 тивным является подсчет количест2 ва ТНТ на клетку. Оценив количе1 ство ТНТ на ТНТ-образующую 0 ММСК Эпителий ММСК + ММСК + ММСК + клетку, мы обнаружили, что число GA эпителий эпителий + GA ТНТ значимо увеличивается в соРис.4. Количество ТНТ на клетку в чистой вместной культуре (относительно культуре ММСК, чистой культуре почечных монокультуры) (рис.3). Увеличение эпителиоцитов крыс и смешанной культуре ТНТ-образующих клеток в совмепочечных клеток и ММСК; а также в культу- стной культуре, в сочетании с данрах, инкубированных с ингибитором щеле- ными о меньшем проценте таких вых контактов 18-βGA – монокультуре клеток в монокультуре кардиомиоММСК и смешанной культуре эпителиоци- цитов и большим проценте их в тов и ММСК. Среднее количество ТНТ на монокультуре ММСК, позволяет клетку больше в смешанной культуре и у- предположить, что основной вклад меньшается в присутствии 18-βGA. в формирование ТНТ в совместной культуре делают именно ММСК. Аналогично проводили исследования совместЧисло ТНТ на клетку Число ТНТ на клетку 7 12 ной культуры, в состав которой входили клетки почечного эпителия. Было отмечено, что в условиях монокультуры практически все ММСК в полумонослойной культуре образуют ТНТ, а в монокультуре почечного эпителия процент клеток, образующих ТНТ, составлял около 10%. В то же время, в совместной культуре число клеток, имеющих ТНТ, составляло около 30%. В экспериментах с клетками почки, сокультивируемыми с ММСК, мы также оценивали влияние на формирование ТНТ ингибитора щелевых контактов - 18-β глицирретиновой кислоты (18-β GA). Было показано, что в ее присутствии процент ТНТ-образующих клеток уменьшается практически в 2 раза как в монокультуре ММСК, так и в совместной культуре ММСК и клеток почечного эпителия, по отношению к аналогичным опытам без добавления ингибитора. Также нами было обнаружено, что число ТНТ на клетку значительно возрастает в условиях совместной культуры и снижается в присутствии 18-β GA, как в монокультуре ММСК, так и в совместной культуре ММСК и клеток почки (рис.4). Обмен цитоплазмой в смешанной культуре мезенхимальных мультипотентных стромальных и соматических клеток Контактирование клеток, описанное выше, открывает потенциальные возможности межклеточного обмена. Для выявления транспорта цитоплазмы использовали флуоресцентный краситель Calcein-Green AM. ММСК костного мозга или соматические клетки окрашивали Calcein и пересаживали на чашки с неокрашенными клетками. Клетки были проанализированы на конфокальном микроскопе через 24 часа сокультивироваА Б Рис.5. Транспорт цитоплазматического содер- ния. Было обнаружено образоважимого из ММСК в клетки почечного эпителия ние многочисленных нанотрубопосле 24 часов сокультивирования. А, конфо- чек, однако из-за увеличения кальное изображение. Перед сокультивировани- плотности культуры в результате ем ММСК окрашены флуоресцентным зондом пролиферации многие клетки Calcein-AM – зелёная флуоресценция; клетки контактировали уже поверхнопочечного эпителия окрашены флуоресцентным стями плазматических мембран, мембранным красителем Dil – красная флуорес- с возможным образованием щеценция. Через 24 часа флуоресценция Calcein левых контактов. Во многих наблюдается не только в ММСК, но и в контак- кардиомиоцитах, контактируютирующих с ними эпителиоцитах, а в ММСК щих с ММСК, нагруженных Calобнаруживается флуоресценция Dil. Передача cein-AM (с высокой интенсивнокрасителей наблюдается в клетках, несущих настью флуоресценции Calcein в нотрубочки или имеющих щелевые контакты с гетерологическими клетками. Б, фазовый кон- цитоплазме), также наблюдалась зеленая флуоресценция, однако траст. Шкала 50 мкм. более низкой интенсивности. Это свидетельствует о миграции цитоплазматического содержимого ММСК в ци13 тозоль соседних кардиомицитов. В части клеток-реципиентов наблюдалось появление окрашенных клеточных компартментов. Исходя из природы красителя, было сделано предположение, что эти окрашенные Calcein компартменты являются органеллами из клеток-доноров А Б (ММСК), окрашенных Calcein. Ана3ч 24ч логично исследовали передачу цитоплазматического содержимого в смешанной культуре клеток почки и ММСК. В данном случае клетки почки предварительно окрашивали мембранным красителем Dil – красВ Г 3ч 24ч ная флуоресценция (рис.5). В экспериментах было отмечено, что обмен является ненаправленным – в культуре обнаруживались клетки с двойным окрашиванием с преимущественным содержанием как цитоплазматического, так и мембранного 24ч, в условиях вибрации Д красителя (рис.5). Образование межклеточных контактов и обмен содержимым цитоплазмы между клетками были также проанализированы с помощью проточной цитометрии. В одной сеРис.6. Передача между кардиомиоцитами и рии экспериментов Calcein-AM окММСК цитоплазматического красителя рашивали ММСК, которые затем пеCalcein, исследованная по изменению соот- ресевали на культуральные флаконы ношения окрашенной и неокрашенной по- с неокрашенными кардиомиоцитами. пуляций клеток в совместной культуре. Во второй серии Calcein-AM окраЦитофлуориметрия. Окрашена культура шивали кардиомиоциты крысы, а заММСК (А,Б,Д); или культура кардиомио- тем к ним подсаживали неокрашенцитов (В,Г). Показано образование единой ные ММСК. Было обнаружено, что популяции через 24 часа совместного куль- через 3 часа смешанная культура тивирования (Б,Г); а также отсутствие объ- клеток в обеих сериях опытов четко единения популяций в условиях вибрации разделялась на 2 субпопуляции по (Д), препятствующей образованию ТНТ. интенсивности флуоресценции Calcein (рис.6А,В). После 24 часов сокультивирования деление клеток на 2 субпопуляции исчезало. В клеточной суспензии наблюдалось равномерное распределение по интенсивности с одним пиком (рис.6Б). Во второй серии экспериментов при сокультивировании кардиомиоцитов, окрашенных Calcein-AM, и неокрашенных ММСК деление клеток на 2 субпопуляции, наблюдавшееся через 3 часа совместного культивирования (рис.6В), также исчезало через 24 часа (рис.6Г). В качестве контроля смешанную культуру клеток содержали в условиях вибрации в течение 24 часов: сразу после прикрепления клеток флакон с культурой помещали на шейкер (50 колебаний в минуту). В данном случае сохранялось разделение клеток 14 на окрашенные и неокрашенные, то есть физическое препятствие формирования межклеточных контактов предотвращало межклеточный обмен. Аналогичное исследование проводили и с клетками почки в составе совместной культуры. Также было показано образование между сокультивируемыми клетками контактов, по которым часть окрашенного Calcein цитоплазматического содержимого была передана в неокрашенные клетки почки. При контрольном сокультивировании в одной культуральной чашке, но на отдельных покровных стеклах, клетки разделялись на две популяции даже через 48 часов, как в случае предварительного окрашивания клеток почки, так и в случае предварительной окраски ММСК. Чтобы оценить вклад щелевых контактов в обмен, мы инкубировали совместную культуру с ингибитором щелевых контактов – 18-β GA – и также не наблюдали слияния пиков; происходило незначительное сближение пиков и образование небольшой промежуточной популяции. Транспорт митохондрий из мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток в клетки сердца или почки При окраске смешанной культуры митохондриальным красителем TMRE внутри ТНТ, образуюА Б щихся между клетками, обнаруживались структуры окрашенные этим В зондом. В смешанной культуре клеток почки и ММСК мы воспользовались другим митоГ хондриальным красителем – JC-1 и также показали наличие окраД шенных им митохондрий внутри ТНТ (рис.7А). Также мы подРис.7. Наличие в туннельных нанотрубочках митохондрий и других везикулярных структур. А, наложение фа- твердили наличие мизового контраста и флуоресцентного изображения; совме- тохондрий внутри ТНТ стная культура эпителиальных клеток почки и ММСК. посредством электронКрасная флуоресценция – JC-1 – визуализация митохон- ной трансмиссионной дрий. Шкала 10 мкм. Б-Д, электронная трансмиссионная микроскопии. Было помикроскопия; совместная культура кардиомиоцитов и казано, что в ТНТ наММСК; большими стрелками показаны структуры с 2-мя ходятся двумембранмембранами – митохондрии, а также одномембранные ные образования, котовезикулы – длинными стрелками; шкала 0,5 мкм. рые по размерам и морфологическим особенностям соответствовали именно митохондриям (рис.7Б-Д). 15 Обмен митохондриями в смешанной культуре клеток почки и ММСК был также исследован с помощью А 0ч Б 24ч проточной цитофлуориметрии (рис.8). При исследовании на разных сроках сокультивирования было обнаружено, что сразу после смешивания культура разделяется на две популяции с разВ 48ч Г 48ч, раздельные Д 24ч стёкла ной интенсивностью флуоресценции митохондриального зонда (рис.8А). Уже через 3 часа наблюдался сдвиг популяции, нагруженной Mitotraсker, в стоРис.8 Передача между почечными клетками и рону уменьшения интенсивности ММСК митохондриального красителя флуоресценции. Эта тенденция Mitotracker, исследованная по изменению соот- продолжала развиваться к 24 чаношения окрашенной и неокрашенной популя- сам (рис.8Б); к 48 часам сокульций клеток в совместной культуре. Цитофлуо- тивирования пики обеих популяриметрия. A-Г, ММСК окрашены Mitotracker ций практически сливались Green; Д, клетки почки окрашены Mitotracker (рис.8В). Таким образом, происGreen. Показано, что со временем пики в совме- ходит транспорт митохондристной культуре заметно сближаются (Б,В), или ального красителя, то есть даже сливаются (Д); тогда как при культивироММСК передают окрашенные вании на разных культуральных стёклах сближение значимо слабее, а слияния пиков не на- Mitotraсker митохондрии в клетки почки. При сокультивироваблюдается даже через 48 часов (Г). нии окрашенных почечных эпителиоцитов и неокрашенных ММСК деление клеток на 2 субпопуляции, наблюдавшееся сразу после смешивания, исчезало уже через 24 часа (рис.8Д), что указывает на более эффективный транспорт митохондрий из А почечных клеток в ММСК. Ещё одним методом, подБ Рис.9. Обмен митохондриями в совместной тверждающим обмен митохондкультуре клеток почечного эпителия и ММСК. риями между клетками в совмеА, иммуноцитохимическое окрашивание анти- стной культуре, стала иммунотелами к цитохром С-оксидазе человека (зелёная цитохимия. Фиксированные флуоресценция); красная флуоресценция – ядра клетки окрашивали антителами человеческих ММСК. Показано, что в клетке к цитохром С-оксидазе человека, почки (стрелка), находящейся в контакте с а также к ядрам человеческих ММСК (окрашенное ядро), выявляются мито- клеток (Human Nuclei). Было похондрии из ММСК. Б, фазовый контраст. Шкаказано, что человеческие ММСК ла – 20 мкм. имеют положительную окраску 16 на цитохром С-оксидазу и Human Nuclei, а клетки почки крысы – отрицательны по обоим маркерам. Почечные клетки, лежащие в зоне непосредственного контакта с ММСК имеют положительную окраску на цитохром С-оксидазу, но отрицательную по Human Nuclei. Очевидно, что это клетки эпителия почки, получившие митохондрии от ММСК (рис.9). Такие клетки появляются уже через 1 сут совместного культивирования, а через 4 сут их количество возрастает. Обмен мембранными компонентами в совместной культуре клеток почки и мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками Для исследования обмена между клетками мембранными компонентами мы также использовали проточную цитометрию. Предварительно, липофильным красителем окрашивалась одна из культур - либо культура ММСК, либо клеток почки (рис.10). Было обнаружено, что сразу после смешивания в культуре выделяются две популяции с разной интенсивностью флуоресценции DiO (липидный краситель) (рис.10А). При А 0ч Б 24ч В 48ч Г 48ч,раздельные сокультивировании стёкла происходит уменьшение обеих начальных популяций и появление большого числа клеток Д 24ч Е 48ч, раздельные Ж 24ч, инкубация с с промежуточными зна18 -GA стёкла чениями интенсивности флуоресценции, то есть клеток почки, в которые транслоцировался Рис.10. Передача между клетками почечного эпителия и зонд из ММСК ММСК мембранного флуоресцентного красителя DiO, ис- (рис.10Б,В). При соследованная по изменению соотношения окрашенной и культивировании понеокрашенной популяций клеток в совместной культуре. чечных эпителиоцитов, Цитофлуориметрия. А-Г,Ж, окрашена культура ММСК; окрашенных DiO, и неД,Е, окрашена культура эпителиоцитов. Ж, смешання ММСК культура инкубировалась с ингибитором щелевых контак- окрашенных тов 18-β GA. Наблюдается заметное сближение пиков или также происходила пемембранного даже их слияние через 24 - 48 часа совместного культиви- редача рования (Б,В,Д), а также отсутствие объединения популя- красителя из эпителиоций в условиях культивирования на раздельных стёклах цитов в неокрашенные даже через 48 часов (Г,Е). Показано также, что в условиях ММСК (рис.10Д). При инкубирования с 18-β GA (Ж) сохраняется разделение сокультивировании в культуры на 2 популяции. одной культуральной чашке, но на отдельных покровных стеклах, что предотвращает контактирование, клетки оставались разделенными на две популяции даже через 48 часов, как в случае предварительного окрашивания клеток почки, так и в случае предварительной окраски ММСК (рис.10Г,Е). Можно заключить, что именно непосредственный контакт клеток в совместной культуре является обязательным условием передачи клеточных компартментов. Как уже показано выше, основными контактами, участвующими в 17 таком транспорте, являются ТНТ и щелевые контакты. Чтобы оценить вклад щелевых контактов в обмен, мы инкубировали совместную культуру с ингибитором щелевых контактов, 18-β GA, что приводило к уменьшению эффективности передачи красителя, но не отменяло его полностью (рис.10Ж). Дифференцировка мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток по ткане-специфичному пути Особенно важным результатом сокультивирования является запуск дифференцировки стромальных клеток по специфическому пути после их контактирования с дифференцированными соматическими клетками. В данной работе было показано, что уже через 1 сут после сокультивирования ММСК человека и кардиомиоцитов крысы, в ММСК выявляются гранулы, положительно окрашивающиеся антителами на кардиоспецифический β-миозин человека. При использоА Б В Почка Почка вании антител в чистой культуре ММСК 7сут 3сут человека крысы ММСК подобной окраски на βмиозин в клетках обнаружено не было, то есть сами по себе стволовые клетки не экспрессируют кардиоспецифический β-миозин. Нами Сокультивирование использовались высокоспецифичГ Рис.11. Появление специфичных для почки ные антитела к тяжелой цепи челобелков в ММСК на разных сроках сокульти- веческого β-миозина, что исключавирования ММСК и клеток почечного эпите- ет возможность транспорта донорлия. А-В, конфокальная микроскопия. Им- ского миозина из кардиомиоцитов в муноцитохимическое окрашивание антите- ММСК, а также окраску миозина в лами к THF – красная флуоресценция; к Hu- кардиомиоцитах крысы, что было man Nuclei - зелёная флуоресценция. А, чисподтверждено отдельными экспетая культура ММСК; Б, смешанная культура риментами. на 4 сутки совместного культивирования; В, Что касается смешанной смешанная культура на 4 сутки совместного культивирования в условиях, препятствую- культуры клеток почки и ММСК, щим контактированию клеток. Шкала 50 то в данном случае для оценки мкм. Г, иммуноблотинг. Антитела к цитоке- дифференцировки использовались антитела к цитокератину (при имратину 5,6,18. муноблоттинге), специфичному для эпителиальных клеток почки или к белку Тамма Хорсфаля (THF) – специфическому белку почечных канальцев (при иммуноцитохимии) (рис.11). В первом случае мы наблюдали высокий процент содержания цитокератина в контрольных образцах человеческой почки, а также отсутствие его в чистых ММСК человека. Образцы крысиной почки также не окрашивались антителами к цитокератину в виду высокой видоспецифичности этих антител к человеческому белку. В образцах сокультвированых клеток уже через 3 сут мы наблюдали появление полосы 18 цитокератина, которая через 7 сут становится более интенсивной. Это говорит о том, что в смешанной культуре клеток ММСК начинали синтезировать видоспецифичный человеческий цитокератин, то есть человеческие ММСК начали дифференцироваться в эпителий. С увеличением срока совместного культивирования увеличивалось число дифференцировавшихся клеток и/или концентрация данного белка в клетках. О том, что ММСК начинали дифференцироваться именно в эпителий почечных канальцев, говорят и эксперименты по выявлению в этих же ММСК почечного белка THF, вырабатывающегося в почечных канальцах. Мы использовали антитела к THF, не обладающие видоспецифичностью, поэтому этот белок выявляется и в клетках крысиной почки. В этом случае для визуализации ММСК мы дополнительно окрашивали смешанную культуру антителами к Human Nuсlei. Было обнаружено, что в чистой культуре ММСК данный белок не синтезируется, тогда как на четвёртые сутки сокультиврования появлялись клетки с положительной окраской и на Human Nuclei, и на THF – то есть человеческие ММСК, в которых появился специфический почечный белок. Также мы обнаружили, что в условиях, препятствующих возникновению межклеточных контактов, синтез THF в ММСК на четвёртые сутки практически отсутствовал. Это позволяет сделать вывод, что для запуска дифференцировки ММСК в клетки того же типа, с которыми они сокультивируются, необходимо наличие непосредственных физических контактов между этими клетками. Влияние мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток при введении в почку in vivo Для того чтобы оценить физиологические последствия введения ММСК на уровне целого организма, был проведён ряд экспериментов на животных с использованием модели острой почечной недостаточности (ОПН). Крысе, после 90минутной тепловой ишемии левой почки, в повреждённую почку интрапаренхиматозно вводили суспензию ММСК. После этого оценивались биохимические показатели: креатинин, мочевина, клиренс креатинина, реабсорбция натрия. Все животные, не получившие лечения после 90-минутной тепловой ишемии единственной почки, погибли от ОПН (на 2-4 сутки). После введения ММСК от ОПН не погибла ни одна крыса. Показатели функции почки у выживших крыс восстанавливались до нормальных значений через 1-2 месяца, за исключением канальцевой реабсорбции натрия, которая нормализовалась уже через 2 недели. Для уточнения вопроса, связано ли терапевтическое действие ММСК при постишемической ОПН с встраиванием пересаженных клеток в почечные структуры, или же оно обусловлено их паракринным влиянием, в части опытов мы инъецировали в почку ММСК, меченые флуоресцентным красителем Calcein. При исследовании срезов почки через 1 сут выявляли наличие меченых ММСК в месте инъекции и в прилежащих областях (рис.12А), однако только в интерстициальном пространстве ткани почки. Двойное окрашивание прижизненных срезов почки митохондриальным красителем TMRE и Calcein-AM показало, что введенные ММСК сохраняют митохондриальный трансмембранный потенциал, то есть большая часть трансплантированных клеток остается неповрежденной и функционально активной (рис.12Б). 19 Учитывая приведённые данные, можно полагать, что встраивания ММСК в эпителиальную выстилку поврежденных канальцев не происходит, по крайней мере, на ранних сроках после введения, и что основной терапевтический эффект достигается, вероятно, за счет паракринного действия. При анализе распределения меченых ММСК в почке в более отдаленА Б Рис.12. Распределение ММСК, введенных в ные сроки (7 сут) после транспочку, по ткани. Конфокальная микроскопия плантации, число клеток выяввитальных срезов почки после 90-минутной ляемых на одном срезе было знатепловой ишемии почки и интрапаренхима- чительно меньше, чем в первые тозного введения ММСК, меченых Calcein- сутки, что может объясняться AM; дополнительная окраска срезов флуорес- возможной гибелью клеток. Одцентным зондом TMRE. А, флуоресцентная новременно с этим происходила микроскопия витальных срезов почки через 1 миграция единичных ММСК на сутки после введения ММСК. Видно распро- большие расстояния от места странение введенных клеток (зеленая флуо- инъекции практически по всей ресценция) по интерстицию почки между по- паренхиме почки, что подтверчечными канальцами (красная флуоресценждалось серийными срезами почция). Большой стрелкой указано место введения клеток. Шкала – 50 мкм. Б, окраска жизне- ки. Было также показано, что при способных ММСК обоими красителями дает окраске фиксированных срезов желтую окраска (клетки помечены стрелками). почки антителами к Human Nuclei через 7 сут после трансплантации Шкала – 20 мкм. клетки в основном локализуются в интерстиции. Чтобы обнаружить трансплантированные клетки в почке на отдалённых сроках мы использовали метод МРТ для отслеживания меченных препаратом железа клеток. На МРизображении клетки были видны в виде затемнённой области А Б В (рис.13). Эта область Рис.13. ММСК, введённые в почку. МР-изображения по- практически не изменячек крыс после 90-минутной тепловой ишемии почки и ет своих размеров и поинтрапаренхиматозного введения ММСК, меченых пре- ложения в течение двух паратом железа. Клетки, меченные железом, видны в виде недель. Это может гозатемнённой области (стрелка). A, 3 суток после введе- ворить о том, что осния; Б, 2 недели после введения; В, интактные почки. новная масса трансплантированных клеток если и мигрирует в ткани почки, то на незначительное 20 расстояние; высокая элиминационная способность почечной ткани исключает возможность накопления препарата железа в клетках почечного эпителия. Выводы 1. Показана возможность образования межклеточных контактов между человеческими мезенхимальными мультипотентными стромальными клетками и кардиомиоцитами или клетками почки крысы. Клетки разного происхождения контактируют как через щелевые контакты, так и через туннельные нанотрубочки. 2. После сокультивирования с кардиомиоцитами в мезенхимальных мультипотентных стромальных клетках наблюдаются признаки дифференцировки в кардиомиоциты: экспрессия человеческого кардиоспецифического βмиозина. 3. После сокультивирования с клетками почки в мезенхимальных мультипотентных стромальных клетках наблюдаются признаки дифференцировки в почечный эпителий: синтез цитокератина и белка Тамма Хорсфаля. 4. Показана возможность межклеточного транспорта различных клеточных компартментов в совместной культуре; показана зависимость этого транспорта от щелевых контактов и туннельных нанотрубочек. 5. При введении мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток в поврежденную почку показана интеграция клеток в ткань почки, сохранение их жизнеспособности. При этом отмечено улучшение показателей функции почки после ишемии/реперфузии. 21 Список публикаций по теме диссертации 1. Khryapenkova TG, Plotnikov EY, Galkina SI, Sukhikh GT, Zorov DB, Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromal cells and renal tubular cells in co-culture. FEBS J, 2010, 277(S1), 136 2. Plotnikov E.Y., Khryapenkova T.G., Galkina S.I., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cytoplasm and organelle transfer between mesenchymal multipotent stromalcells and renal tubular cells in co-culture. Experimental Cell Research, 2010, 316, p2447 – 2455 3. Хряпенкова Т.Г. Механизмы взаимодействия мультпотентных мезенхимальных стромальных клеток с клетками почечных канальцев в условиях совместного культивирования. Материалы Международной конференции “Ломоносов-2010”, 2010, с.308 4. Хряпенкова Т.Г. , Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б. Роль туннельных нанотрубочек в транспорте клеточных структур между мультипотентными мезенхимальными стромальными клетками и клетками эпителия почечных канальцев. Материалы Всероссийского симпозиума по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий», Цитология, 2009, 51(9), с.790-791 5. Хряпенкова Т.Г. , Плотников Е.Ю. , Сухих Г.Т, Зоров Д.Б. Межклеточный транспорт клеточных структур посредством туннельных нанотрубочек в совместной культуре мультпотентных мезенхимальных стромальных клеток и клеток почечных канальцев. Материалы Международной конференции “Рецепция и внутриклеточная сигнализация”, 2009, с.105-107 6. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б.. Транспорт различных клеточных структур между мультпотентными мезенхимальными стромальными клетками и клетками почечных канальцев при совместном культивировании. Материалы Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых учёных “Актуальные вопросы медицинской науки”, 2009, с.101-102 7. Кудрявцев Ю.В., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Казаченко А.В., Марей М.В., Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Морфологические изменения в почках крыс с острой постишемической почечной недостаточностью после внутрипочечного введения фетальных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2009, 1, с. 3-10 8. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Коротецкая М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Гетерогенность митохондриального потенциала как маркер для выделения чистой популяции кардиомиобластов. Клеточные технологии в биологии и медицине, 2008, 4, с.188-195 9. Казаченко А.В., Кирпатовский В.И., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Кудрявцев Ю.В., Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Восстановление функций почки при интрапаренхиматозном и внутривенном введении стволовых и прогениторных клеток при хронической и острой почечной недостаточности. Материалы международного симпозиума «От экспери22 ментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», Судак, 2008, с.68-70 10. Khryapenkova T.G., Plotnikov E.Y., Korotetskaya M.V., Vasileva A.K., Marey M.V., Sukhikh G.T., Zorov D.B.; Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes: the role of mitochondria. Abstract Book: 15th European Bioenergetics Conference 2008, 2008, 1777, Supplement to BBA Bioenergetics. S53-54 11. Исаев Н.К., Е.В. Стельмашук, Е.Ю. Плотников, Т.Г. Хряпенкова, Е.Р. Лозиер, Ю.В. Долудин, Д.Н. Силачев, Д.Б. Зоров. Роль ацитода, NMDA-подтипа глутаматных рецепторров и кислоточувствительных ионных каналов (ASIC1a) в развитии нейрональной гибели при ишемии. Биохимия, 2008, 73(11), 1461-1466 12. Хряпенкова Т.Г., Коротецкая М.В., Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б.. Гетерогенность митохондриального потенциала как маркер для выделения чистой популяции кардиомиобластов. Материалы XV Международной конференции «Ломоносов-2008», 2008, с. 248-249 13. Plotnikov E.Y., Khryapenkova T.G., Vasileva A.K., Marey M.V., Galkina S.I., Isaev N.K., Sheval E.V., Polyakov V.Y., Sukhikh G.T., Zorov D.B. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in coculture. J. Cell. Mol. Med., 2008, 12(5A), pp. 1622-1631 14. Плотников Е.Ю., Хряпенкова Т.Г., Марей М.В., Сухих Г.Т. , Зоров Д.Б. Обмен цитоплазмой между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совместном культивировании. Роль туннельных нанотрубочек. Материалы 11-ой Пущинской конференции молодых ученых “Биология — наука 21-го века”, 2007, с.163-164 15. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Марей М.В., Сухих Г.Т. , Зоров Д.Б. Исследование путей взаимодействия кардиомиоцитов и мезенхимальных стволовых клеток в совместной культуре. Материалы II Международного молодежного медицинского Конгресса, Санкт-Петербург, 2007, 54-55 16. Зоров Д.Б., Исаев Н.К., Плотников Е.Ю., Зорова Л.Д., Стельмашук Е.В., Васильева А.К., Архангельская А.A., Хряпенкова Т.Г. Митохондрия как многоликий Янус. Биохимия, 2007, 72(10), с. 1371 – 1384 17. Хряпенкова Т.Г., Плотников Е.Ю., Васильева А.К., Марей М.В., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Межклеточный транспорт цитоплазмы и органелл между мезенхимальными стволовыми клетками и кардиомиоцитами при совместном культивировании. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 2007, с.278-279 18. Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Функциональная гетерогенность первичной культуры кардиомиоцитов крысы. Материалы второй Международной Пироговской Студенческой научной конференции. Вестник РГМУ, 2007, 2(55), с.323-324 23