Виноградова Юлия Вячеславовна ИССЛЕДОВАНИЕ
advertisement
ОБЪЕДИНЕННЫЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ________Лаборатория радиационной биологии_________ На правах рукописи Виноградова Юлия Вячеславовна ИССЛЕДОВАНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ И ПРОЦЕССОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СЕТЧАТКИ ГЛАЗА МЫШЕЙ ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ УСКОРЕННЫМИ ПРОТОНАМИ И ДЕЙСТВИЯ МЕТИЛНИТРОЗОМОЧЕВИНЫ Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук 03.01.01 – радиобиология Научный руководитель: доктор биологических наук В.А. Тронов Дубна – 2015 2 Оглавление Использованные сокращения ................................................................................. 4 Введение ...................................................................................................................... 6 Глава 1. Литературный обзор ............................................................................... 11 1.1. Строение сетчатки глаза животных ......................................................... 11 1.2. Резистентность сетчатки глаза при действии генотоксических агентов .................................................................................................................................. 13 1.3. Факторы, приводящие к цитотоксическим последствиям для сетчатки глаза ......................................................................................................................... 18 1.3.1. Радиационное воздействие на человека при осуществлении пилотируемых космических полетов ............................................................... 18 1.3.2. Радио-, химиотерапия и вторичные патологии зрения ........................ 21 1.4. Действие метилнитрозомочевины на сетчатку глаза животных .......... 23 Глава 2. Материалы и методы исследования ................................................... 26 2.1.Содержание мышей ........................................................................................ 26 2.2. Облучение животных ..................................................................................... 26 2.3. Введение животным метилнитрозомочевины ........................................... 26 2.4. Выделение сетчатки глаза мышей и приготовление суспензии ее клеток .................................................................................................................................. 27 2.5. Приготовление препаратов для морфологических исследований ............. 27 2.6. Вестерн-анализ белков Р53 и ATM ............................................................... 29 2.7. Иммуноцитохимическое определение экспрессии белков .......................... 30 2.8. TUNEL-детекция гибели клеток ................................................................... 32 2.9. Регистрация электроретинограммы ........................................................... 32 2.10. Визуализация глиальных клеток Мюллера в срезах сетчатки глаза ...... 34 2.11. Метод ДНК-комет ....................................................................................... 34 Глава 3. Результаты исследования ..................................................................... 41 3.1. Реакция сетчатки глаза мышей на облучение ускоренными протонами 41 3.2. Влияние метилнитрозомочевины на сетчатку глаза мышей ................... 53 3.3. Спонтанные повреждения и репарация ДНК в клетках сетчатки глаза мышей ..................................................................................................................... 58 3 3.4. Адаптивный ответ сетчатки глаза мышей на введение метилнитрозомочевины и облучение протонами .............................................. 62 Глава 4. Обсуждение результатов исследования .............................................. 76 4.1. Генотоксическая устойчивость сетчатки глаза мышей .......................... 76 4.2. Структурное и функциональное восстановление сетчатки глаза мышей после генотоксического воздействия .................................................................. 80 Выводы ...................................................................................................................... 82 Заключение ............................................................................................................... 83 Список литературы ................................................................................................ 85 4 Использованные сокращения BrUdR Бромдезоксиуридин (bromodeoxyuridine) Casp 3 Каспаза-3 (caspase-3) dsDNA Двунитевая ДНК (double strand DNA) DTIC Дакарбазин (5-(3,3-Dimethyl-1-triazenyl)imidazole-4carboxamide) FasR Трансмембранный гликопротеид (FasR/APO-1/CD95, Mw 45000), принадлежащий суперсемейству рецепторов TNF (Tumor Necrosis Factor) FITC Флуоресцеинизотиоцианат (fluorescein isothiocyanate) mt Момент хвоста кометы (Tail Moment) MАP-киназа Митоген активированные белки NER Эксцизионная репарация нуклеотидов (nucleotide excision repair) PBS Фосфатно-солевой буфер (Phosphate-Buffered Saline) ssDNA Однонитевая ДНК (single strand DNA) Topo 2 Топоизомераза 2 (Topoisomerase 2) TUNEL Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated deoxyuridine triphosphate-digoxygenin nick-end labeling XIAP X-chromosome-linked inhibitor of apoptosis АТМ Ataxia telangiectasia mutated АФК Активные формы кислорода ГКИ Галактическое космическое излучение ГКМ Глиальные клетки Мюллера ИИ Ионизирующее излучение ЛПЭ Линейная передача энергии МНМ Метилнитрозомочевина (Methylnitrosourea) РПЭ Ретинальный пигментный эпителий 5 СКИ Солнечное космическое излучение ФР Фоторецепторные клетки ЭРГ Электроретинограмма 6 Введение Актуальность проблемы. Исследование патогенеза дегенеративных заболеваний сетчатки глаза является ключевой и до сих пор нерешенной проблемой современной экспериментальной и клинической офтальмологии. Значительный вклад в возникновение и развитие этих патологий вносят генотоксические факторы внешней среды – радиация и химические вещества. Изучение механизмов принципиально важно действия для этих оценки факторов рисков на сетчатку постлучевых глаза осложнений, возникающих при лучевой терапии глаза и мозга и, как правило, в сочетании с химиотерапией. Пострадиационная ретинопатия и когнитивные расстройства часто являются нежелательными побочными эффектами при радиотерапии, поскольку локальные дозы на органы головы человека могут быть весьма значительными. Так, при радиотерапии опухолей носоглотки и глаза суммарная доза облучения может превышать 50 Гр, а при протонной терапии меланомы глаза кумулятивная доза фракционированного облучения составляет 54-75 Гр. Радиационный фактор также представляет вполне реальную опасность для сетчатки глаз космонавтов при осуществлении длительных космических полѐтов. В последнем случае речь идѐт о повреждающем действии тяжѐлых заряженных частиц Галактического космического излучения при длительных полетах вне магнитосферы Земли. При этом клинически значимые повреждения могут возникать не непосредственно после воздействия, а спустя месяцы и даже годы, что важно для разработки средств профилактической терапии, базирующейся на способности сетчатки к восстановлению. Цитотоксическая химиотерапия также вызывает офтальмологические осложнения в виде обратимых и необратимых острых и хронических глазных заболеваний. Базовым компонентом стандартных протоколов химиотерапии, в том числе меланомы, являются метилнитрозомочевина (МНМ) и ее производные. Метилнитрозомочевина – монофункциональный метилирующий 7 агент, вызывающий повреждение ядерной ДНК в клетках млекопитающих. В середине 90-х годов в литературе появились сообщения о цитотоксическом действии супермутагена МНМ на клетки сетчатки глаза лабораторных животных (Yuge K. et al, 1996). Особенностью действия МНМ является ее высокая избирательная цитотоксичность по отношению только к фоторецепторным клеткам сетчатки (Tsubura A. et al, 2011), что делает МНМ удобным инструментом для изучения дегенерации сетчатки и оценки эффективности веществ и процедур, препятствующих ее развитию. Основу зрелой сетчатки глаза млекопитающих составляют терминально дифференцированные клетки, утративших свой регенеративный потенциал. Для них апоптоз представляется гибельным, угрожающим существованию органа и организма в целом. Вместе с тем в эмбриогенезе глаза апоптоз играет важную роль. По мере дифференцировки клеточных элементов сетчатки частота апоптоза снижается (Walsh К., Perlman H., 1997). Таким образом, зрелая сетчатка приобретает высокую устойчивость к генотоксическому стрессу и связанному с ним апоптозу. Ранее разными авторами была показана резистентность сетчатки по отношению как к ионизирующему излучению (Gorgels T. et al., 2007, Тронов В.А. и соавт., 2008, Amoaku W.M. et al., 1992), так и к действию алкилирующих агентов (Jenkins G.J.S. et al., 2005). Также было показано, что дозы, вызывающие детектируемые морфологические изменения сетчатки глаза, превышают летальные дозы для исследуемого животного при общем облучении (Gorgels T. et al., 2007; Williams G.R. and Lett J.T., 1996; Keng and Lett, 1981). Наследственная или вызванная внешним воздействием дегенерация сетчатки начинается с гибели фоторецепторных клеток, вслед за которой разрушается система трофической поддержкиткани, приводящая к гибели нейронов сетчатки глаза (Marc R.E. et al, 2003). Хотя доминирующей формой гибели фоторецепторных клеток сетчатки глаза признается апоптоз (Xu G. Z., 1996; Marigo V., 2007), тем не менее связь повреждения ДНК с гибелью 8 постмитотических клеток, формирующих сетчатку глаза, в настоящее время не исследована. Показано, что в постмитотических клетках активной сохраняется репарация ДНК, ассоциированная с транскрипцией активных генов, она из разновидностей экспизионной репарации нуклеотидов (NER) (Nouspikel T., Hanawalt P.C., 2002; Simonatto M. et al, 2007). Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является исследование повреждающего действия протонов высоких энергий и метилнитрозомочевины на функциональную активность и структуру ДНК клеток сетчатки глаза мышей и оценка способности сетчатки к восстановлению после воздействия этих генотоксических агентов. На пути ее выполнения решались следующие задачи: 1. Исследовались морфологические изменения сетчатки глаза мышей после действия ускоренных протонов с энергией 150 МэВ и γ-излучения 60 Co (дозы 14 Гр и 25 Гр) и метилнитрозомочевины (дозы 35 и 70 мг/кг). Данные дозы различаются по их цитотоксичному воздействию на сетчатку. 2. Исследовалось повреждение генома клеток зрелой сетчатки глаза и активность репарационной системы после действия ускоренных протонов, γизлучения и метилнитрозомочевины. 3. Оценивалось изменение функциональной активности сетчатки глаза в ответ на воздействие протонами высоких энергий и метилнитрозомочевиной. 4. Оценивалось адаптирующее действие на сетчатку глаза ускоренных протонов и метилнитрозомочевины в относительно низких дозах и способность сетчатки глаза мышей к восстановлению. 5. Исследовалась роль глиальных клеток Мюллера в повреждении и восстановлении сетчатки глаза мышей после воздействия протонами и метилнитрозомочевиной. 9 Положения и результаты, выносимые на защиту: 1. Ответ зрелой сетчатки глаза на облучение протонами и инъекцию метилнитрозомочевины свидетельствует о наличии у нее генотоксического порога и способности к структурному и функциональному восстановлению. 2. Обнаружен адаптивный ответ сетчатки глаза на фракционированное введение метилнитрозомочевины, а также на комбинированное воздействие протонами и введение МНМ. 3. Обнаружено возможное участие глиальных клеток Мюллера в восстановлении от генотоксического стресса. Научная новизна. В работе впервые: 1. Исследована динамика формирования разрывов ДНК и их последующая репарация in vivo в сетчатке глаза мышей, облученных протонами высоких энергий и γ-квантами повреждения ДНК 60 Co. Показано, что в ответ на возникшие после облучения возрастает экспрессия генострессовых белков АТМ и р53 в сетчатке глаза, которые стимулируют репарацию ДНК и не вызывают апоптоза поврежденных клеток. 2. Показана нелинейная зависимость ответа сетчатки на воздействия, что говорит о наличии у сетчатки глаза генотоксического порога. Этот порог эквивалентен дозе облучения ускоренными протонами ~ 15 Гр, ниже которого происходит восстановление поврежденого генома а также структурной целостности и функциональной активности сетчатки. При воздействии облучения ускоренными протонами в дозе выше пороговой, 25 Гр или после введения МНМ в дозе 70 мг/кг в сетчатке наблюдались структурная деградация и необратимое снижение/утрата функциональной активности. 3. Показано, что предварительное введение мышам МНМ в нетоксической дозе повышает толерантность сетчатки глаза к последующему действию агента в ретинотоксической дозе. Такое фракционированное воздействие МНМ снижает экспрессию эффекторной апоптотической каспазы- 10 3 и гибель фоторецепторных клеток по сравнению с однократным воздействием МНМ в ретинотоксической дозе. 4. Показано, что предварительное облучение протонами в дозе 1 Гр вызывает адаптирующий эффект зрелой сетчатки глаза: она приобретает устойчивость к последующему ретинотоксическому действию МНМ. Эффект радиационного гормезиса сетчатки согласуется с возрастанием эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК. 5. Обнаружена активация глиальных клеток Мюллера (ГКМ) в сетчатке глаза в ответ на инъекцию мышам МНМ в дозе 70 мг/кг. Отмечается тенденция к снижению числа активированных ГКМ в сетчатке глаза после последовательного введения МНМ в дозе 17 и 70 мг/кг. 6. Показано наличие в сетчатке глаза спонтанных повреждений ДНК в виде щелочелабильных сайтов, которые являются окси-модифицированными основаниями ДНК. Научно-практическая значимость работы. Результаты проведенного исследования имеют теоретическое и практическое значение для решения фундаментальной проблемы повреждения и восстановления терминально дифференцированных клеток и, состоящих из них, тканей (в данном случае сетчатки глаза). Результаты по восстановлению и гормезису сетчатки глаза могут быть использованы для оптимизации радио- и химиотерапии опухолей головы, мозга, шеи и глаз (подбор дозы фракционированного воздействия, длительности интервалов между фракциями). Модель МНМ-индуцированной дегенерации сетчатки глаза может использоваться для первичной оценки эффективности лекарственных средств, препятствующих дегенерации сетчатки, и для прогноза опасности ретинотоксического воздействия на человека радио- и химиотерапевтических процедур. Полученные данные также могут послужить прогностическим показателем влияния условий космоса на человека при осуществлении длительных пилотируемых космических полетов. 11 Глава 1. Литературный обзор Как известно, зрительный процесс базируется на прямом воздействии сфокусированных световых лучей на высокочувствительные нейроны глаза. Для его осуществления требуется развитая сеть кровеносных сосудов, благодаря которым в глазах обеспечиваются процессы клеточного катаболизма и метаболизма. В зрительном процессе важная роль принадлежит сетчатке глаза. Она является высоко специализированной многослойной нейрональной тканью, функция которой состоит в осуществлении световой перцепции и процессинга первичного сигнала. 1.1. Строение сетчатки глаза животных Сетчатая оболочка глаза мышей состоит из 10 слоев (рис. 1): внутренней пограничной мембраны, слоя волокон зрительного нерва, слоя ганглиозных клеток, внутреннего плексиформного слоя, внутреннего нуклеарного слоя, наружного плексиформного слоя, наружного нуклеарного слоя, наружной пограничной мембраны, слоя палочек и колбочек и пигментного эпителия (Шамшинова А.М. и Волков В.В., 1999). Клетки ретинального пигментого эпителия (РПЭ) формируют первый слой сетчатки. Он оказывает трофическую поддержку и выполняет важную роль в регенерации сетчатки. Благодаря наличию в клетках этого слоя пигмента меланина, в нем поглощается и рассеивается ультрафиолетовый свет и снижается его разрушительное действие на сетчатку, что обеспечивает создание в сетчатке первого защитного барьера (Siu T.L., Morley J.W. and Coroneo M.T., 2008). Эпителиальные клетки регулируют также транспорт питательных веществ и продуктов метаболизма. Наряду с этим, РПЭ обладают фагоцитарной активностью и участвуют в процессе постоянного обновления внешних сегментов фоторецепторных клеток. РПЭ содержат крупные лизосомы, которые осуществляют лизис сегментов и экспорт содержимого к кровеносным капиллярам хороида (сосудистой оболочки глаза). Кроме того, пигментный эпителий содержит 12 Рис. 1. Схема и микрофотография сетчатки глаза мышей: 1- внутренняя пограничная мембрана, 2 - слой волокон зрительного нерва, 3 - слой ганглиозных клеток, 4 - внутренний плексиформный слой, 5 - внутренний нуклеарный слой, 6 - наружный плексиформный слой, 7 - наружный нуклеарный слой, 8 - наружная пограничная мембрана, 9 - слой палочек и колбочек и 10 – слой пигментного эпителия. (Логинова и др., 2008, http://webvision.med.utah.edu/sretina.html#overview) 13 фермент изомеразу, превращающую all-trans ретиналь в 11-цис-ретиналь, необходимый для осуществления зрительного цикла (Strauss O., 2005). В сетчатке глаза различают три иерархически организованных клеточных слоя: наружный ядерный слой (outer retina), представленный ядрами фоторецепторных клеток и их сегментами; внутренний слой (inter retina), состоящий из биполярных клеток (нейроцитов) и слой ганглиозных нейроцитов. Из отростков (аксонов) ганглиозных нейроцитов формируется зрительный нерв, который направляется в мозг. Зрительный сигнал, формируемый в фоторецепторных клетках, передается к биполярным и ганглиозным нейроцитам. В межклеточном пространстве сетчатки располагаются большие глиальные клетки Мюллера (ГКМ). Они радиально пронизывют все слои от фоторецепторных клеток до хороида сетчатки. Известно, что глиальные клетки Мюллера выполняют опорную, буферную и трофическую функции. ГКМ играют важную роль в поддержании стабильности всех нейрональных функций в центральной нервной системе. Предполагается также их важная роль в процессах регенерации сетчатки (Bernardos R.L. et al., 2007). Клеточный состав зрелой сетчатки глаза был исследован авторадиографически после введения 6-недельным мышам 3Н-тимидина (Young R.W., 1985). Показано, что в сетчатке глаза фоторецепторные клетки (ФР) составляют 73%, биполяры — 20%, клетки Мюллера — до 6%. Также содержится небольшое число (около 1%) амакриновых и ганглиозных клеток. 1.2. Резистентность сетчатки глаза при действии генотоксических агентов Сетчатка индуцирующих глаза постоянно разные виды подвергается ретинопатии: воздействию факторов, соматических токсинов, окислительного стресса, сфокусированного света, химических и физических агентов (в том числе радиационное воздействие). Изучение радиационного поражения тканей глаза началось с открытием рентгеновских лучей. К 14 настоящему времени накопились многочисленные данные (таблица 1) о чувствительности тканей глаза к действию рентгеновского излучения (Kirwan J.F. et al., 2003). Таблица 1. Чувствительность тканей глаза человека к действию рентгеновского излучения (Kirwan J.F. et al., 2003) Ткани глаза Конъюнктива Доза, сГр Латентный период 5000 4-6 нед Конъюнктивит 3000-5000 2-4 нед Поздняя телеангиэктазия сосудов Эпителиальная кератинизация >5000 Роговица 5000 12 лет Цитологические изменения Симблефарон 2000 4-6 нед Мягкий точечный кератит Язва эпителия и отек стромы >2000 Склера Эффект 750 >10 лет Утоньшение склеры 2400 3-20 лет Некроз, инфекционный cклерит Сосудистая оболочка глаза 1000-2000 3-4 сут Мягкий преходящий уверит 6000-8000 6-8 нед Стойкий уверит Хрусталик 250 от 6 мес до 20 лет Непрогрессирующие хрусталика помутнение Катаракта (50% — прогрессирующая) 750 1500 8-24 сут 3000 >6 мес Сетчатка Мягкая форма ретинопатии (Perrers-Taylor M. et al.,1965) Высокий риск лучевой ретинопатии (Brown G.C. et al., 1982) 15 Клетки, составляющие сетчатку глаза, являются постмитотическими, за исключением глиальных клеток и клеток ретинального пигментного эпителия. Поскольку, в соответствии с правилом J. Bergonie и L.Tribondeau (1906), радиочувствительность клеток тем выше, чем интенсивней они делятся и чем менее они дифференцированы, сетчатка глаза является довольно радиорезистентной тканью, что находит отражение в величинах повреждающих ее доз облучения (таблицы 1 и 2). Как видно из таблицы 2, дозы, вызывающие детектируемые морфологические изменения, превышают летальные дозы для исследуемого животного при общем облучении (Gorgels T., Pluijm I. and Brandt R., 2007; Williams G.R and Lett J.T., 1996; Keng C. and Lett J.T., 1981). Таблица 2. Чувствительность сетчатки глаза животных к действию ИИ Виды животных Эффект Виды излучений Пороговая Латентный доза, Гр период Мыши Апоптоз ФР и РПЭ кванты 18,5 – 25 7 сут Gorgels T., Pluijm I. and Brandt R., 2007 Крысы Гибель ФР кванты 10 5 20 15 1 мес 6 мес 1 мес 6 мес Amoaku W.M. et al., 1989; Amoaku W.M. et al., 1992 2-10 0,5 - 2,5 года Williams G.R. and Lett J.T., 1994; 45 — Williams G.R. and Lett J.T. 1996; Keng C. and Lett J.T., 1981 Гибель РПЭ Кролики Гибель ФР Утрата ЭРГ Зачастую ответ 20 Ne, 40Ar, 56 Fe - в пике Брэгга; кванты сетчатки на облучение Литература обнаруживается не непосредственно после воздействия, а в отдаленный период через месяцы и 16 даже годы (таблица 3). Также он зависит от дозы ионизирующего излучения (ИИ) и видовой принадлежности организма. Таблица 3. Ответ сетчатки in vivo на локальное облучение глаза крыс Вид Доза, ионизирующего Гр излучения Рентгеновское 2-20 Период наблюдения Реакция сетчатки глаза 30 сут, ФР не изменены (< 10 Гр) электронная микроскопия В РПЭ происходит разбухание митохондрий (>5 Гр) Литература Amoaku W.M. et al., 1989 Летального исхода не наблюдается (20 Гр) Рентгеновское ≤20 6 мес, В ФР наблюдаются электронная изменения (>5 Гр) микроскопия В РПЭ повреждений не обнаружено (15 Гр) 1 год Amoaku W.M., et al., 1992 Доминирует реакция сосудов В нейронах и глиальных клетках повреждений не обнаружено Рентгеновское 15 6 мес Наблюдается повреждение сегментов и ядер ФР Stitt A.W. et al., 1994 Протонное 8и 28 >3 мес Повреждение и истощение ядерного слоя ФР Mao X.W. et al., 2009 Снижение длины ретинальных капилляров Рентгеновское 20-25 7 сут Полное исчезновение ФР Gorgels T., et al., 2007 Во многих работах по электронной микроскопии срезов сетчатки глаза животных отмечается, что наиболее радиочувствительными являются 17 фоторецепторные клетки. У них наиболее чувствительными являются сегменты. Они повреждаются и разупорядочиваются ранее, чем наблюдаются какие-либо изменения в ядрах фоторецепторных клеток. Более того, клетки ретинального пигментного эпителия (РПЭ), сохраняющие способность к делению, оказываются даже более радиоустойчивыми по сравнению с неделящимися фоторецепторными клетками (Amoaku W.M. et al., 1989; Amoaku W.M. et al., 1992). Хотя в приведенных работах исследуемые дозы превышают 10 Гр, имеются данные, свидетельствующие о том, что облучение в меньших дозах может вызывать биохимические изменения в сетчатке глаза. После облучения глаз крыс протонами в дозах 0,5 - 4 Гр рядом авторов (Mao X.W. at al. 2010) наблюдалась активация генов, продуцирующих окси-стресс в сетчатке глаза (Fmo2, Gpx2, Noxa1 and Sod3), и экспрессия проапоптотических генов Fas и Faslg. Это указывает на вероятность возникновения индуцированного протонами окси-стресса, а также на связанный с ним апоптоз, который является предпосылкой необратимых структурных изменений в сетчатке глаза. В результате воздействия ионизирующих излучений в сетчатке глаза происходили функциональные изменения. Они регистрировались с помощью электроретинограммы (ЭРГ). Показано, что зависимость амлитуды a- и b-волн электроретинограммы от дозы облучения (γ-кванты 12 60 Со, ускоренные ионы С) напоминает аналогичную зависимость для светового воздействия (Sannita W.G. et al., 2007; Труханов К.А. и др., 2001). С увеличением дозы облучения сетчатки глаза мышей ускоренными ионами 12 С наблюдалось снижение амплитуды a- и b-волн ЭРГ, а также отмечалась тенденция к сглаживанию ее профиля (Sannita W.G. et al., 2007). Снижение амплитуды ЭРГ у кроликов после γ-облучения и облучения тяжелыми ионами в дозах 20-45 Гр также отмечено в исследовании ряда авторов (Keng C. and Lett J.T., 1981). Однократное облучение кроликов γ-квантами или разными видами тяжелых заряженных частиц в дозах, не превышающих 41 Гр, сопровождалось восстановлением амплитуды ЭРГ до 18 нормы через 48 часов. Стремительная утрата электрической активности сетчатки глаза и величина дозы, при которой это происходит, позволяют предположить, что дозолимитирующим фактором физиологической активности нервной ткани у кроликов являются морфологические повреждения ткани. Другими словами, функциональное изменение сетчатки глаза является вторичным по отношению к структурным и морфологическим нарушениям. Тогда следует признать наличие радиационного порога морфологических изменений в ответе сетчатки глаза мышей на облучение. 1.3. Факторы, приводящие к цитотоксическим последствиям для сетчатки глаза Зрительная система вообще и сетчатка глаза, в частности, представляются довольно устойчивыми структурами к действию ионизирующей радиации. В то же время значительные контингенты людей оказываются, по разным причинам, в условиях, когда цитотоксическое воздействие генотоксикантов превышает уровень устойчивости сетчатки, а также когда тип этого воздействия не является адаптивным для человека. Это может происходить, по крайней мере, в трех ситуациях: при проведении радиационной терапии опухолей мозга и меланомы глаза, при химиотерапии онкологических заболеваний и при осуществлении длительных пилотируемых космических полетов. 1.3.1. Радиационное воздействие на человека при осуществлении пилотируемых космических полетов Основным поражающим фактором при пилотируемых космических полетах являются потоки заряженных частиц, составляющих Галактическое космическое излучение (ГКИ), и протоны, генерируемые при солнечных вспышках. Поскольку зрительная система (в том числе и сетчатка глаза) характеризуются достаточно высокой степенью радиационной устойчивости, то 19 следует исключать рентгеновские лучи и кванты, как ретинопатические факторы при космических полетах. Основную часть ГКИ составляют протоны и ионы гелия (до 98%). Остальная часть представлена тяжелыми заряженными частицами (Винклер Дж.Р., 1964; Сurtis S.B., 1974). При длительных полетах вне магнитосферы Земли наибольшую биологическую опасность представляет ГКИ из-за высокого содержания высокоэнергетичных тяжелых (http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=12045&displayrelated=22). ядер При прогнозировании длительных космических полетов в глубоком космосе имеют значение следующие особенности протонов и ГКИ: — протоны солнечных вспышек обладают энергией до нескольких ГеВ/нуклон, — тяжелые ядра в составе ГКИ характеризуются высокими величинами линейных потерь энергии (ЛПЭ). Поэтому видимый биологический эффект при их воздействии достигается уже при невысоких дозах, — магнитосфера и атмосфера Земли практически исключают попадание высокоэнергитичных заряженных частиц на ее поверхность. Вследствие этого все живые организмы не имеют эволюционной адаптации к этим воздействиям. В наземных условиях смоделировать воздействие космических видов излучения возможно лишь в лабораторных экспериментах, проводимых на ускорителях протонов и тяжелых заряженных частиц. В Объединенном институте ядерных исследований для таких экспериментов используются фазотрон, генерирующий протоны с энергией 660 МэВ, Нуклотрон - ускоритель релятивистских тяжелых ядер с энергиями до нескольких ГэВ/нуклон и изохронный циклотрон МЦ-400, ускоряющий заряженные ядра до энергии 50 МэВ/нуклон. При облучении ретинальных эксплантов эмбрионов цыплят (Vazquez M.E. and Kirk E., 2000) морфометрически было показано, что дозы 0,1-0,5 Гр тяжелых ионов железа тормозят формирование нейритов ганглиозными 20 клетками. Максимальное торможение наблюдалось при дозе 1 Гр. Однако при морфологическом анализе срезов сетчатки глаза крыс после пролета отдельных ускоренных ионов аргона с энергией 570 МэВ/нуклон (доза 1 Гр) во всех слоях облученной сетчатки не было обнаружено «микроповреждений» (Krebs W. et al., 1988). Отмечалось, что облучение сетчатки глаза крыс in vivo ускоренными ионами железа с энергией 450 МэВ/нуклон в дозе 2,5 Гр приводило к 20%-му снижению общего количества клеток пигментного эпителия, фоторецепторов и биполяров. Со временем наблюдалось ее восстановление до контрольных значений. При облучении в дозе 0,1 Гр повреждающий эффект отмечен не был (Krebs W., Krebs I. and Worgul B.V., 1990). Уже при первых пилотируемых космических полетах космонавты фиксировали появление в глазах световых вспышкек (фосфенов) в виде ярких точек, черточек и линий, двигающихся по зрительному полю. Было высказано предположение, что их появление является следствием пролета заряженных частиц, присутствующих в космических лучах. Эта гипотеза была подтверждена экспериментально. В прямых экспериментах с участием добровольцев аналогичные вспышки наблюдались при пролете через глаз ускоренных тяжелых заряженных частиц с энергией, ниже пороговой для видимого черенковского свечения (Curtis S.B., 1994). Проведенный анализ частоты вспышек в глазах космонавтов показал, что они вызваны, в основном, ионами углерода и/или кислорода. Хотя наблюдения не идентифицировали каких-либо прямых последствий от фосфенов для зрения космонавтов, тем не менее их исследование включено в научные программы по безопасности NASA для космонавтов, работающих на МКС (Sannita W.G., Narici L. and Picozza P., 2006; http://www.nap.edu/openbook.php?record_id=12045&page=9). Следствием воздействия ГКИ на космонавтов могло быть наблюдаемое у них впоследствии возникновение катаракты. Изучение катарактогенеза при действии низких доз радиации способствовало тому, что была пересмотрена норма минимальной дозы радиоактивного излучения, вызывающая образование 21 катаракты у человека. Если ранее минимальная доза равнялась 2 Гр, то в 2012 г. она была снижена до 0,6 Гр (Thorne M.C., 2012). Под действием радиации нарушаются процессы образования и миграции волоконных клеток хрусталика глаза. В результате этого в эпителиальном слое появляются пустоты, что ведет к увеличению диффузии молекул кислорода в хрусталик, а в кортексе появляются клетки, содержащие митохондрии. Увеличение концентрации кислорода в хрусталике приводит к усилению образования активных форм кислорода (АФК) в митохондриях, откуда они диффундируют в окружающие ткани. Так, взаимодействие АФК с белками хрусталика вызывает денатурацию и агрегацию белка, приводит к нарушению белок-белковых взаимодействий и усилению светорассеяния в цитоплазме хрусталика. Помутнение хрусталика затрагивает сначала кортикальные области, но постепенно распространяется и на его ядерную область. Конечной стадией этого процесса является окислительное повреждение белков цитоплазмы волоконных клеток хрусталика, главным образом, кристаллинов (Муранов К.О. и Островский М.А., 2013). 1.3.2. Радио-, химиотерапия и вторичные патологии зрения Для сетчатки глаза человека другим опасным фактором является радиационная терапия опухолей мозга и меланомы глаза. Для эффективности проводимого лечения при проведении используется фракционированное курса облучение, в радиотерапии ходе которого обычно могут достигаться высокие дозы облучения. В отдельных случаях представляется возможным применение сфокусированного однократного облучения ионизирующим излучением в дозах 40-80 Гр (Haas A. et al., 2002). Тем не менее, как свидетельствуют данные Monroe A.T. et al. (2005), даже гиперфракционирование дозы облучения опухолей головы и шеи (1,1 Гр дважды в сутки до суммарной дозы 50-60 Гр) приводило к развитию ретинопатии у 80% больных, что завершалось слепотой, по крайней мере, 22 одного глаза. В работах (Barabino S. at al. 2005; Parsons J.T. et al. 1996), обобщающих результаты радиотерапии опухолей вблизи глаз и глазного нерва с фракционированным облучением (по 1,8-2 Гр за фракцию), отмечаются радиационные повреждения поверхности глазного яблока, слезных желез, сетчатки и зрительного нерва. Подчеркивается, что время экспрессии и глубина повреждений имеют дозозависимое плато, а при дозах выше 40 Гр степень повреждения и его скорость нарастают с увеличением дозы. При проведении радиотерапии опухолей головы и шеи протонами и ионами углерода у пациентов не были выявлены достоверные различия по частоте развития слепоты (Demizu Y. et al., 2009). Различные патологии зрения после радиотерапии опухолей глаз и опухолей окологлазной локализации приведены в обзоре (Barabino S. et al., 2005). Известно, что химиотерапия рака не менее токсична, чем радиационное воздействие. Впервые о связи химиотерапии рака с вторичными патологиями зрения стало известно в 1989 году (Imperia P.S., Lazarus H.M. and Lass J.H. 1989). В последующем эта связь стала предметом многочисленных исследований (Al-Tweigeri T., Nabholtz J.M. and Mackey J.R., 1996). В работе (Eagle R.C. Jr. et al., 2011) были ретроспективно проанализированы гистопатологические изменения глаз восьми пациентов после курса внутриартериальной химиотерапии ретинобластомы. У них были выявлены: неоваскулярная глаукома, стойкое отслоение сетчатки, инвазии в ткани оптического нерва и в хороид, признаки ишемической атрофии наружной сетчатки и хороида, тромбоз глазных сосудов. Два цикла химиотерапии по поводу рака груди (последовательно фторурацил + эпирубицин + циклофосфамид) привели к потере зрения и изменению цветного зрения, проявляемых как цитотоксическая зрительная нейропатия (Giralt J. et al., 2012). Увеличивающийся перечень офтальмологических осложнений после цитотоксической химиотерапии рака (Schmid K.E. et al., 2006) привлекает 23 внимание офтальмологов, диктуя необходимость их прямого участия в проведении курсов онкотерапии (Salvin J.H. and Hendricks D., 2012). 1.4. Действие метилнитрозомочевины на сетчатку глаза животных В середине 90-х годов (Yuge K. et al., 1996) японскими исследователями был обнаружен ретинотоксический эффект метилнитрозомочевины от однократной внутрибрюшинной инъекции крысам и мышам. Доза вводимого препарата для мышей составляла 60 мг/кг (Tsubura et al., 2010). Морфологическая деструкция сетчатки наступала более чем через 48 ч и захватывала только наружный слой сетчатки, главным образом, фоторецепторный слой клеток (Yoshizawa K. et al., 1999). Поскольку процесс протекал в течение нескольких дней, это позволило предложить его в качестве удобной лабораторной модели для исследования дегенерации сетчатки при различных патологиях глаз (Tsubura A. et al., 2011). Метилнитрозомочевина – монофункциональный агент, метилирующий основания ДНК (Beranek D.T., 1990). Следствием тотального метилирования оснований ДНК является нарушение ее структуры, появление ошибок и блока репликации, приводящими к нарушению эпигенетической регуляции активности генов. Во многом с этим связан цитотоксический эффект МНМ и ее производного дакарбазина, используемого в химиотерапии меланомы (Тронов В.А. и др., 2011). На рисунке 2 приведены структурные формулы метилнитрозомочевины и дакарбазина (DTIC). МНМ-индуцированная дегенерация сетчатки у крыс сопровождается более чем двукратным увеличением экспрессии 64 генов, вовлеченных в МАРкиназный, Toll-подобный и апоптотический сигнальные пути (Yang L. et al., 2007). Наследственная или вызванная внешним воздействием дегенерация сетчатки глаза мышей начинается с гибели фоторецепторных клеток, вследствие чего разрушается система трофической поддержки ткани, 24 Рис. 2. Структурные формулы метилнитрозомочевины (а) и дакарбазина (5-(3,3-Dimethyl-1-triazenyl)imidazole-4-carboxamide) (б) 25 приводящая к гибели нейронов сетчатки (Marc R.E. et al, 2003). Хотя доминирующей формой гибели фоторецепторных клеток сетчатки глаза признается апоптоз (Xu G.Z., 1996; Marigo V., 2007), тем не менее в настоящее время остается не исследованной связь повреждения и репарации ДНК с гибелью постмитотических клеток, формирующих сетчатку глаза. Показано, что в постмитотических клетках, какими является основная часть клеток зрелой сетчатки, сохраняется активная репарация ДНК, ассоциированная с транскрибируемыми генами — одна из разновидностей эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) (Nouspikel T. and Hanawalt P.C., 2002; Simonatto M., Latella L. and Puri P.L., 2007). Это обстоятельство может отразиться как на спорадических поврежденниях ДНК, так и на устранении из нее дефектов, вызванных генотоксикантами. В проведенном нами исследовании использованы три агента, которые вызывают образование основных типов повреждений ДНК с разными механизмами их репарации. Как известно, γ-излучение вызывает, главным образом, однонитевые разрывы ДНК, равномерно распределенные по всему геному. Ускоренные протоны являются более эффективными в индукции двунитевых разрывов, возникающих в области трека частиц (Schrogel P., 2009). Двунитевые разрывы являются летальным повреждением вследствие их высокой эффективности в индукции апоптоза делящихся клеток (Lips J. and Kaina B., 2001). Метилирующий агент метилнитрозомочевина вызывает образование в ДНК таких безразрывных дефектов, как метилированные основания, апуриновые и апиримидиновые (АП) сайты (Beranek D.T., 1990). 26 Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1.Содержание мышей Всего в экспериментах было использовано около 200 половозрелых мышей-гибридов CBAxC57Bl, F1 (♀) в возрасте 2,5 мес., с массой тела 24-28 г. Животных содержали в стандартных лабораторных условиях при температуре 22±2оС, относительной влажности воздуха 60±10% и 12-часовом световом периоде. Доступ к воде и гранулированному корму был свободным. 2.2. Облучение животных Облучение мышей проведено на установках Объединенного института ядерных исследований (г. Дубна): — общее облучение γ-квантами 60 Со проводили на аппарате для дистанционной лучевой терапии «Рокус-М» в Медико-техническом комплексе ОИЯИ. Поглощенная доза составила 14 Гр, мощность дозы — 0,64 Гр/мин. — тотальное и локальное облучение мышей ускоренными протонами проводили на протонном терапевтическом пучке фазотрона. Энергия частиц в пучке составляла 150 МэВ/нуклон, ЛПЭ — 0,49 кэВ/мкм. Животных облучали в дозах 14 и 25 Гр с мощностью дозы — 1 Гр/мин. При локальном действии протонов облучалась только область головы мышей. При облучении использовали специально сконструированные штативы, ограничивающие подвижность животных. 2.3. Введение животным метилнитрозомочевины Кристаллическую метилнитрозомочевину (Sigma) хранили при -20 0 С. Свежеприготовленный стерильный раствор МНМ в PBS вводили мышам внутрибрюшинно в дозах по 17, 35 и 70 мг/кг. Контрольным животным вводили соответственно равный объем PBS (до 0,7 мл). 27 2.4. Выделение сетчатки глаза мышей и приготовление суспензии ее клеток Все процедуры с животными осуществлялись в соответствии с Положением Комитета по этике ИБХФ РАН. После облучения мышей умерщвляли в парах хлороформа и извлекали глаза. Один глаз фиксировали в растворе Буэна для получения гистологических препаратов, из второго глаза выделяли сетчатку, которую помещали в охлажденный фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) с рН 7,4. Используя пипетку, сетчатку острожно диспергировали, центрифугировали в течение 2 мин при 400 g, затем снова диспергировали осадок и полученную клеточную суспензию немедленно использовали в работе. Сетчатка глаза является высокоспециализированной тканью, состоящей из терминально дифференцированных клеток. Важная особенность клеток сетчатки – неустойчивость во внешней среде – делает невозможными длительное манипулирование с клетками in vitro и использование прижизненных клеточных показателей апоптоза. На рисунке 3 представлены микрофотографии клеток сетчатки глаза мышей после их окрашивания прижизненными красителями (акридиновым оранжевым и бромистым этидием в соотношении 1:1). Живые клетки окрашивались в зеленый цвет, а погибшие (с поврежденной мембраной) – в оранжевый. Как видно, сразу после получения суспензии (рис. 3 а) практически все клетки сохраняют жизнеспособность, а после двухчасовой инкубации в забуференном растворе Хенкса (при комнатной температуре) наблюдается значительное увеличение числа погибающих клеток (рис. 3 б). 2.5. Приготовление препаратов для морфологических исследований Глаза, зафиксированные в жидкости Буэна (смесь пикриновой кислоты, формалина и уксусной кислоты в соотношении 15:5:1), отмывали несколько раз в 70%-ном этаноле, проводили по стандартной методике через батарею 28 Рис. 3. Микрофотографии клеток сетчатки глаза мышей: а – непосредственно после приготовления суспензии, б – через 2 часа после инкубации в растворе Хенкса. 29 спиртов с возрастающей крепостью от 80о до 100о. Затем глаза обрабатывали смесью спирт-ксилол (соотношения 1:1 и 1/4:3/4) и выдерживали в ксилоле. После дегидратации в ксилоле их помещали в смесь парафина с ксилолом (при 57оС) и, наконец, подвергали окончательной пропитке в парафине, после чего формировали парафиновый блок. С помощью ротационного микротома готовили серийные срезы сетчатки глаза толщиной 5 мкм. Полученные поперечные срезы окрашивали гематоксилин-эозином на предметном стекле и анализировали с помощью светового микроскопа (Carl Zeiss, Jena 410960). Для морфометрического измерения слоев сетчатки использовали окулярную линейку. 2.6. Вестерн-анализ белков P53 и ATM После центрифугирования суспензии клеток сетчатки глаза, в PBS осадок ресуспендировали в 100-150 мкл лизирующего буфера следующего состава: 0,093 М Трис-HCl pH 6.8, глицерин (23,2%), Na-додецилсульфат (2,3%), β- меркаптоэтанол (23%), Protease Inhibitor Cocktail в разведении 1:50 (Sigma). Лизаты выдерживали в кипящей водяной бане в течение 5 мин, центрифугировали и замораживали при –20 оС. Для анализа Р53 аликвоты лизатов, содержащие 80 мкг белка, подвергали электрофорезу в 12,5% ПААГ при 100 В в течение 4,5 ч в камере для вертикального электрофореза. Блотперенос осуществляли на блоттере (Helicon Semi-Dry Transfer) в буфере (25 mM Трис, 250 mM глицин и 20% метанол) в течение 60 минут. Мембрану блокировали раствором 1% БСА в PBS-t. Мембрану инкубировали в течение ночи на холоду с первичным антителом (разведение 1:2000) и после 3-кратной промывки в PBS-t инкубировали с конъюгатом вторичного антитела с пероксидазой хрена в разведении 1:400. Зону белка детектировали с помощью системы ECL (Amersham Biosciences) и рентгеновской пленки Retina. анализа АТМ электрофорез проводили в 10% в полиакриламидном геле при Для 30 60 В в течение 10 ч. Последующие операции были такими же, как и для Р53. Все используемые антитела получены от фирмы Abcam. 2.7. Иммуноцитохимическое определение экспрессии белков Клетки иммобилизовали в низкоплавкой агарозе (0,7% в PBS) в виде тонкого слайда на поверхности предметного стекла. Клетки фиксировали, инкубируя слайды 20 мин в 3% формальдегиде в PBS на холоду. Затем слайды пермеабилизовали в 0,2% тритон Х-100 в PBS (20 мин в холодильнике). Слайды, предназначенные для определения уровня FasR, этой процедуре не подвергалась. После каждой процедуры слайды трижды отмывали в PBS. Последнюю отмывку от первичного антитела (таблица 4) проводили в PBS, содержащем 2% эмбриональной сыворотки. На слайд наносили раствор первичного антитела в PBS (30 мкл, 1-2 мкг/мл), накрывали покровным стеклом и инкубировали 1 ч в темноте при комнатной температуре. Затем стекло удаляли, а слайд отмывали трижды холодным PBS. После удаления излишков влаги с поверхности слайда на него наносили 30 мкл буферного раствора PBS, содержащего конъюгат вторичных антител с FITC (1 мкг/мл), накрывали покровным стеклом и инкубировали 1 ч в темноте. После удаления покровного стекла слайды отмывали в PBS, дегидратировали в метаноле, высушивали и окрашивали йодистым пропидием (1 мкг/мл). Микроскопирование клеток проводили с помощью флуоресцентного микроскопа с набором фильтров для FITC. В качестве контроля использовали слайды с иммобилизованными клетками, которые подвергались такой же обработке, но без первичных антител. FITC-флуоресцирующие клетки фотографировали. Полученные изображения анализировали на компьютере с помощью программы ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA; http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html). На каждом слайде регистрировали флуоресценцию не менее 150 клеток и определяли долю FITC-позитивных клеток. Показателем уровня экспрессии каждого белка служило произведение 31 среднего значения флуоресценции одной клетки на долю FITC-позитивных клеток. Таблица 4. Антитела, использованные в исследовании Антитела Специфичность Клон Изотип Конъюгат с Разведение АntiP53 (Abcam, Англия) Человек, крыса, мышь PAb240 IgG1 (мышь) PrimaryAb 1 : 200 АntiBrUdR (Millipore, Австралия) Человек, крыса, мышь B5 IgI (мышь) PrimaryAb 1 : 100 АntiFasR (Gen Way, США) Человек, мышь B500 IgG1 (мышь) PrimaryAb 1 : 100 АntiATM (Calbiochem, США) Человек, мышь Поликлон IgG (кролик) PrimaryAb 1 : 100 АntiCaspase3 active (Gen Way, США) Кролик, человек, мышь Поликлон IgG (кролик) PrimaryAb 1 : 60 PARP (Abcam, Англия) Человек, мышь 5А5 IgG1 (мышь) PrimaryAb 1 : 200 Anti-rabbit (Sigma, США) Кролик Поликлон IgG (кролик) Аnti-mouse (Millipore, Австралия) Мышь Поликлон IgG (баран) FITC 1 : 500 Anti-rabbit (Abcam, Англия) Кролик Поликлон IgG (кролик) FITC 1 : 500 Пероксидазой 1 : 1000 32 2.8. TUNEL-детекция гибели клеток На микроскопических срезах сетчатки глаза на предметном стекле для регистрации гибели клеток использовали методику TUNEL. Процедуры к проводили в соответствии с стандартному набору прилагаемой инструкцией TUNEL (Trevigen, http://www.trevigen.com/item/3/13/118/508/TACS_2_TdT_Fluorescein_Kit/). Визуализацию микроскопических изображений на срезах проводили с помощью флуоресцентного микроскопа с набором фильтров для регистрации флуоресценции флуоресцеинизотиоцианата (FITC). 2.9. Регистрация электроретинограммы Перед регистрацией электроретинограммы мышей адаптировали к темноте (не менее 12 ч) и лишали корма на 24 ч. При слабом освещении мышей анестезировали внутримышечной инъекцией смеси золитил – ксилазин 1/1 в дозе 0,2 мл на 100 г веса животного. Для расширения зрачка в глаз закапывали 0,5% раствор мидриацила. Электрод опускали на глазное яблоко, как контактную линзу. Игольчатые электроды сравнения и заземления вводили под кожу около ушных раковин. ЭРГ записывали с помощью электрофизиологической системы «Нейрософт» при использовании программы Нейро-МВП.NET. Стимуляцию ответа сетчатки осуществляли с помощью вспышек белого цвета мини-ганцфельд-стимулятора широкопольный фотостимулятор) длительностью интенсивности варьировал 5 мс, (миниатюрный логарифм от –3 до –0,5 кд*с/м2. ЭРГ характеризовали амплитудой, равной сумме a- и b-волн. Результат представлялся в виде среднего значения из трех последовательно снятых ЭРГ при значениях логарифма интенсивности вспышек –1,5, –1 и –0,5 кд*с/м2 с интервалом между ними 3 мин. Как видно на рисунке 4, при таком режиме регистрации электроретинограммы амплитуда ЭРГ выходит на плато при увеличении интенсивности вспышки до -1,5 и более. Это позволяет корректно проводить 33 Рис. 4. Изменение амплитуды электроретинограммы при значениях логарифма интенсивности вспышек белого цвета. 34 сравнение по этому параметру. 2.10. Визуализация глиальных клеток Мюллера в срезах сетчатки глаза Процедуру промечивания клеток Мюллера in vivo с помощью пролиферативного маркера BrUdR проводили в течение 48 ч дважды в день (утром и вечером). Животным вводили внутрибрюшинно стерильный раствор маркера, растворенного в PBS (по 50 мг/кг в объеме <0,7 мл). После выделения сетчатки и приготовления микросрезов клетки, аккумулировавшие маркер, проявлялись анти-BrUdR антителами, сконъюгированными с FITC, по флуоресценции которого микроскопически визуализировали глиальные клетки Мюллера (Wohl S.G. et al, 2011). С помощью программы ImageJ подсчитывали число фокусов на единицу площади среза или оценивали интенсивность флуоресценции на единичную площадь среза. 2.11. Метод ДНК-комет Оценку повреждений ДНК сетчатки глаза проводили с помощью метода ДНК-комет, который включал в себя следующие процедуры (рис. 5): — получение клеток суспензии сетчатки, извлеченной из глаз мышей. Для этого ткань тщательно размельчали с помощью препаративных ножниц и аккуратно гомогенизировали 1-2 раза тефлоновым микрогомогенизатором Поттера; — взвесь центрифугировали при 1500 об/мин (400g) в течение 1 - 1,5 мин; — после ресуспендирования осадка в 800 мкл холодного PBS его оставляли на 15-30 с на льду для осаждения агрегатов клеток. Супернатант отбирали и получаемую из него клеточную суспензию анализировали методом ДНК-комет; — получение ДНК-комет. 35 Рис. 5. Схема получения и визуализации ДНК-комет: 1 – приготовление клеточной суспензии; 2 – смешивание клеточной суспензией с раствором низкоплавкой агарозы; 3 – получение гель-слайда на предметном стекле; 4 –лизис клеток; 5 – электрофорез; 6 – окрашивание клеток пропидиум йодидом; 7 – визуализация комет с помощью флуоресцентного микроскопа 36 При получении ДНК-комет суспензию клеток в PBS смешивали с низкоплавкой агарозой (Sigma, type IV) до концентрации 0,75%. Смесь наносили тонким слоем на поверхность предметного стекла для проведения микроскопирования. В результате лизиса формируются нуклеоиды, иммобилизованные в агарозе. В процессе электрофореза ДНК нуклеоидов мигрирует и ее петли вытягиваются к аноду, образуя хвост кометы и придавая нуклеоиду асимметрию. При визуальном анализе ДНК-кометы делят на несколько условных типов в зависимости от степени повреждения их ДНК (рис. 6). Комета на рисунке 6а содержит неповрежденную ДНК, характерную для контрольных клеток. Кометы на рисунках 6б и 6в содержат поврежденную ДНК. Чем меньше голова кометы и больше ее хвост, тем сильнее повреждена ДНК. Наибольшее повреждение у кометы на рисунке 6в. При проведении электрофореза в буфере с рН 8,0 (неденатурирующие условия) выявляются только двунитевые разрывы ДНК (Ostling et al., 1984). В денатурирующих условиях (при рН <12,5) определяются, помимо двунитевых разрывов, и однонитевые разрывы ДНК. В агрессивных щелочных условиях (при рН > 13) к ним присоединяются и щелочелабильные АP-сайты (апуриновые и апиримидиновые сайты), гидролизующиеся в этих условиях в однонитевые разрывы ДНК (Collins A.R. et al, 2008). После электрофореза в щелочном буфере гель-слайды погружали на 10 мин. в нейтрализующий раствор (0,4 М Трис, pH 7,4); после электрофореза в нейтральных условиях слайд помещали в 0,3 M NaOH на 5 минут, а затем в Трис, pH 7,4 – для нейтрализации и ренатурации ДНК. Далее слайды высушивали на воздухе и фиксировали в метаноле в течение 30 минут. Непосредственно перед проведением анализа их окрашивали флуоресцирующим красителем (иодистым пропидием или Sybr-Green). Слайды микроскопировали на флуоресцентном микроскопе. Полученные кометы анализировали путем визуального наблюдения и с использованием 37 Рис. 6. Микрофотографии и схематическое изображение комет с разным уровнем повреждения ДНК: а) кометы с неповрежденной ДНК; б) кометы со слабо поврежденной ДНК; в) кометы с сильно поврежденной ДНК 38 компьютерной программы CASP (Konca K. et al., 2003). В качестве параметра поврежденности ДНК использовали момент хвоста кометы (Olive Tail Moment). При визуализации комет их ориентируют так, чтобы голова комет располагалась слева, а хвост – справа (рис. 7). Сначала устанавливается рамка, в пределах которой программа анализирует точки, принадлежащие комете. Также устанавливается окно фона, интенсивность которого будет вычитаться при проведении компьютерного анализа (рис. 7 а). Предполагается, что точки с наибольшей интенсивностью сосредоточены в голове кометы. В случае их отсутствия в пределах головы кометы прибегают к искусственной генерации центра головы кометы. Если размер центральной точки в голове кометы составляет 1-3 пикселя, то ее вкладом в увеличение флуоресценции головы кометы можно пренебречь. В исследовании мы использовали два параметра для сравнения различных комет и их распределений: 1) доля ДНК в хвосте кометы Ft, 2) момент хвоста кометы, mt = Ft*Xm (Olive P.L., 1999), где Ft – доля ДНК в хвосте кометы, Xm — расстояние между центрами тяжести хвоста и головы (рис. 7 б): Хm Ii Xi Ii , где Ii — интенсивность флуоресценции в точке i, Xi — расстояние от центра тяжести головы до точки i хвоста кометы. Для выявления количества двунитевых разрывов ДНК использовали нейтральный вариант метода. Суспензию клеток в PBS (3-5 x 105 клеток/мл) смешивали с равным объемом 1,5% раствора низкоплвкой агарозы (type IV, Sigma). Смесь наносили на предметные стекла, заранее покрытое тонким слоем 1% агарозы, накрывали покровным стеклом. После полимеризации геля с иммобилизованными в нем клетками стекла погружали в сосуд, заполненный лизирующим раствором (2,5 M NaCl, 0,1 M EDTA, 0,02 M Tris-HCl, 39 Рис. 7. Схема визуализации ДНК-кометы: а) рамка обсчета с выбранным центром и контуром головы кометы; б) компьютерный скан кометы: 1 – профиль головы кометы, 2 - профиль кометы, 3 – профиль хвоста кометы. Пунктирными линиями обозначены центры тяжести головы и хвоста кометы. Хm – расстояние между ними. 40 1 % Triton X-100, 10 % DMSO, pH 10). Лизис проводили в холодильнике в течение 24 мин. Затем слайды помещали в камеру для горизонтального электрофореза, заполненную трис-ацетатным буфером (pH 8). Спустя 30 мин проводили электрофорез при 0,65 В/см на холоду в течение 45 мин. По окончании электрофореза слайды помещали на 10 мин в раствор, содержащий 300 мМ NaOH и 1 мМ EDTA (pH >13). В завершение слайды помещали в нейтральный раствор 0,4 M Tris (pH 7,4) и затем высушивали на воздухе. Для определения количества однонитевых разрывов ДНК использовалась та же схема, кроме стадии электрофореза. В этом случае электрофорез проводили в щелочном буфере (pH >13) при 0,8 В/см в течение 25 минут на холоду. Высушенные слайды дегидратировали в метаноле, подсушивали и после окрашивания раствором йодистого пропидия (5 мкг/мл) в антифейде (50 мкл) накрывали покровным стеклом (24 х 24 мм). Для микроскопирования использовали флуоресцентный микроскоп с фотокамерой Coolpix 4500 (Nikon). Кометы визуализировали при возбуждении флуоресценции при 490 нм с барьерным фильтром 540 нм. При статистическом анализе полученных результатов в качестве параметра использовалось среднее значение эмпирического распределения. Значимость различий между сравниваемыми средними величинами определяли с помощью t - критерия Стьюдента. Эмпирические распределения сравнивали между собой с помощью непараметрической статистики КолмогороваСмирнова. 41 Глава 3. Результаты исследования 3.1. Реакция сетчатки глаза мышей на облучение ускоренными протонами Тотальное облучение животных в дозе 14 Гр не приводило к существенным дегенеративным изменениям сетчатки глаза мышей в течение трех суток после облучения ускоренными протонами и γ-квантами 60 Co. Как можно видеть на рисунке 8, некоторые изменения наблюдаются только через 7 суток после облучения. После воздействия ускоренными протонами отмечено (рис. 8) небольшое снижение толщины ядерного слоя фоторецепторных клеток (рис. 8 б), которое не сопровождалось морфологическими изменениями ядер и сегментов фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей (рис. 8 а). Аналогичная картина наблюдается и после γ-облучения животных. Через 7 суток после облучения мышей γ-квантами 60Co в той же дозе отмечается только некоторое разупорядочивание слоя фоторецепторных клеток сетчатки глаза (рис. 8 а). В обоих случаях морфологические изменения ядер и сегментов фоторецепторных клеток сетчатки глаза не являлись стабильно воспроизводимым эффектом при тотальном облучении мышей. Исследование влияния облучения на физиологическую активность сетчатки глаза мышей проводилось электроретинографически: сравнивались профили электроретинограммы (ЭРГ) и зависимости амплитуд а- и b-волн от интенсивности вспышек белого света в контрольных животных и для облученных ускоренными протонами и γ-квантами 60Co тотально в дозе 14 Гр. На рисунке 9 представлены репрезентативные профили ЭРГ сетчатки глаза мышей. Можно видеть, это исследование не показало существенных изменений электроретинограммы у облученных животных по сравнению с контролем. Небольшое снижение амплитуды ЭРГ после облучения протонам высоких энергий, скорее всего, не связано с деструктивным эффектом облучения, как и в случае с изменением толщины ядерного слоя (рис. 8). При этом не отмечено существенных различий у животных, облученных тотально как ускоренными протонами, так и γ-квантами 60Co. 42 Рис. 8. Морфологические изменения сетчатки глаза мышей после тотального облучения ускоренными протонами и γ-квантами 60Co в дозе 14 Гр: а) микрофотографии сетчатки глаза, полученные в разные сроки после общего облучения: СФР – слой наружных и внутренних сегментов фоторецепторных клеток, НЯС – наружный ядерный слой, НСС – наружный сетчатый слой, ВЯС - внутренний ядерный слой, ВСС - внутренний сетчатый слой, СГК – слой ганглиозных клеток, СГВ – слой ганглиозных волокон. б) средняя толщина ядерного слоя фоторецепторных клеток (% от общей толщины сетчатки), соответствующая микрофотографиям 43 Рис. 9. Изменение физиологической активности (ЭРГ) сетчатки глаза мышей через 15 ч после общего облучения ускоренными протонами (p) и γ квантами в дозе 14 Гр: а) контроль, б) и в) облученные животные. 44 Зависимость величины амплитуды электроретинограммы от интенсивности возбуждающих вспышек белого света с интервалом 3 минуты между ними представлена на рисунке 10. Как в контроле, так и у обученных животных амплитуды a- и b-волн электроретинограммы увеличиваются с повышением интенсивности вспышек белого света. В области интенсивностей от -1,5 до -0,5 кд*с/м2 (lg) кривые выходят на плато (рис. 10 а), что позволяет корректно провести усреднение значений амплитуд ЭРГ в этом диапазоне интенсивностей. Средние значения амплитуд электроретинограммы в зависимости от срока исследования (9, 15 и 20 ч) представлены в виде гистограммы на рисунке 10 б. Можно отметить некоторое снижение величин амплитуд ЭРГ в первые 10-15 часов после облучения ускоренными протонами. В последующем, к электроретинограммы исходу первых суток, значения амплитуд сетчатки глаза мышей после облучения восстанавливаются до контрольных значений. Несмотря на отсутствие существенных изменений в морфологии и функциональной активности сетчатки глаза мышей, тем не менее, облучение животных ускоренными протонами и γ-квантами 60 Co тотально в дозе 14 Гр вызывало увеличение экспрессии генострессовых белков АТМ и р53. На рисунке 11 представлен репрезентативный результат вестерн-блоттинга для этих белков в сетчатке глаза мышей в разные сроки после облучения ускоренными протонами и γ-квантами в дозе 14 Гр. Показано, что после воздействия облучения в сетчатке глаза мышей происходит накопление белков АТМ и р53. Видно, что через 12-14 ч после воздействия ускоренными протонами и γ-квантов 60 Co наблюдается нормализация экспрессии белков АТМ и р53 до контрольного уровня. 45 Рис. 10. Изменение амплитуды ЭРГ сетчатки глаза мышей: а) в зависимости от интенсивности вспышек белого света через 9 ч после тотального облучения ускоренными протонами и γ-квантами; б) в зависимости от сроков наблюдения после облучения протонами Рис. 11. Вестерн-анализ экспрессии белков АТМ и р53 в сетчатке глаза мышей в разные сроки после облучения ускоренными протонами и γ -квантами в дозе 14 Гр 46 Генострессовые белки р53 и АТМ являются сенсорами однонитевых и двунитевых разрывов ДНК. Поэтому было важно исследовать динамику репарации таких разрывов в клетках сетчатки глаза после облучения животных. Нами впервые была осуществлена попытка оценить динамику репарации однонитевых и двунитевых разрывов ДНК в сетчатке in vivo методом ДНКкомет после воздействия ионизирующего излучения в дозе 14 Гр. Как видно на рисунке 12, отмечается аналогичный характер динамики возникновения однонитевых и двунитевых разрывов ДНК. Возникающие однонитевые и двунитевые разрывы ДНК сетчатки глаза эффективно репарируются в течение 10-15 ч после воздействия ускоренными протонами и γ-квантами 60Co. Этот процесс коррелирует с динамикой снижения экспрессии генострессовых белков АТМ и р53 после облучения (рис. 11). Локальное облучение головы мышей ускоренными протонами позволило увеличить дозу облучения до 25 Гр. В результате такого облучения животные сохраняли жизнеспособность в течение 6 дней. За этот период исследования наблюдалась нарастающая во времени дегенерация фоторецепторных клеток сетчатки глаза. По микрофотографиям срезов сетчатки глаза мышей на рисунке 13 видно, что происходило разупорядочивание и деструкция сегментов фоторецепторных клеток, снижение общего количества клеток ядерного слоя и уменьшение его толщины. Снижение толщины слоя сегментов и ядерного слоя фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей после облучения протонами высоких энергий в дозе 25 Гр подтверждено представленными результатами на рисунке 14. Эти изменения оставались достоверными (р<0,01) в течение 6 дней после облучения. Они отражают нарастающую гибель фоторецепторных клеток в сетчатке глаза мышей в течение исследуемого периода после облучения. 47 Рис. 12. Динамика репарации однонитевых (1) и двунитевых (2) разрывов ДНК в клетках сетчатки глаза in vivo после общего облучения мышей в дозе 14 Гр: а) ускоренными протонами; б) γ-квантами Рис. 13. Микрофотографии срезов сетчатки глаза через 3-5 дней после локального облучения головы мышей ускоренными протонами в дозе 25 Гр: а) морфологические изменения в сетчатке глаза мышей; б) микрофотографии TUNEL-флуоресценции срезов сетчатки глаза: справа показана фрагментация ядер фоторецепторных клеток 48 Рис. 14. Толщина слоя сегментов (1) и ядерного слоя (2) фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей в разные сроки после облучения протонами в дозе 25 Гр (% от общей толщины сетчатки). К – необлученный контроль 49 Через 3-5 суток после локального облучения головы мышей ускоренными протонами в дозе 25 Гр было проведено сравнение морфологических изменений в сетчатке глаза мышей с результатами проведенного TUNELтестирования клеток сетчатки, которое определяет количество гибнущих клеток сетчатки глаза мышей. Показано, что уменьшение общего содержания клеток в фоторецепторном слое сетчатки (рис. 13 а) сопровождается их массовой гибелью (рис. 13 б). Однако на основании только результатов TUNEL не представляется возможным судить о механизме клеточной гибели (об апоптозе или некрозе), поскольку в основе этого метода лежит реакция терминальной нуклеотидтрансферазы. Она маркирует разрывы ДНК клеток сетчатки глаза. Тем не менее, мы полагаем, что не исключено участие механизма апоптоза в гибели фоторецепторных клеток после облучения протонами высоких энергий. Подтверждением характерных ядер, содержащих может служить конденсированный наличие хроматин, и фрагментированных ядер в фоторецепторных клетках сетчатки глаза мышей. Исследование динамики изменения физиологической активности сетчатки глаза мышей после локального облучения головы мышей протонами в дозе 25 Гр показало (рис. 15), что облучение вызывает нарастающее во времени снижение амплитуд а- и b-волн электроретинограммы в диапазоне интенсивностей светового возбуждения от -3 до -1 кд*с/м2 (lg) на протяжении всего исследуемого срока наблюдения. На рисунке 16 представлена динамика физиологической активности сетчатки глаза в виде графиков зависимости значений амплитуд ЭРГ от интенсивности вспышек белого света. Видно, что с увеличением интенсивности светового стимула происходит снижение амплитуды ЭРГ у облученных животных. На рисунке 17 видно, что спустя 24 ч после облучения протонами наблюдалась повышенная экспрессия белков FasR и каспазы 3 с помощью иммуноцитохимического анализа. Также повышенной сохранялась экспрессия белка Р53. Поскольку белки Р53, FasR и Casp3 являются проапоптотическими, 50 Рис. 15. Изменение профиля электроретинограммы сетчатки глаза в разные сроки после облучения головы мышей протонами в дозе 25 Гр Рис. 16. Динамика физиологической активности сетчатки глаза в разные сроки после облучения головы мышей ускоренными протонами в дозе 25 Гр: изменение амплитуды a- и b-волн ЭРГ в зависимости от интенсивности вспышек света у облученных мышей (2) по сравнению с контролем (1). 51 Рис. 17. Уровень экспрессии проапоптотических белков в клетках сетчатки глаза через 24 ч после облучения головы мышей ускоренными протонами (p) в дозе 25 Гр. К – необлученный контроль 52 эти данные также свидетельствуют в пользу апоптоза как механизма гибели фоторецепторных клеток сетчатки вследствие облучения ускоренными протонами в дозе 25 Гр. Полученные в этих экспериментах данные подтверждают тезис о высокой радиоустойчивости сетчатки глаза мышей. Морфологические изменения и снижение функциональной активности сетчатки четко выявлялись только при воздействии в дозе 25 Гр, причем по прошествии нескольких суток после облучения. Доза 14 Гр не вызывает таких изменений в течение всего периода наблюдения и в ДНК клеток сетчатки глаза формируются радиационные разрывы, которые успешно репарируются. По ходу развития репарационных процессов изменяется и экспрессия генострессовых белков сетчатки глаза. Из полученных данных следует, что белки р53 и АТМ при относительно низких дозах облучения стимулируют репарацию, но не апоптоз. Вследствие этого сохраняется возможность для сетчатки глаза мышей восстанавливать свою структуру и функцию. Таким образом, радиационные повреждения в клетках сетчатки глаза, нарастая с увеличением дозы облучения, активируют процесс апоптоза в фоторецепторных к клетках, являющихся наиболее чувствительными воздействию повреждающих агентов. Процесс ассоциирован с возрастанием экспрессии белков, сопутствующих апоптозу (p53, FasR, Casp3). Невысокий уровень повреждений ДНК соответствует малому уровню экспрессии проапоптотических белков, которые активируют репарацию повреждений ДНК c последующем выживанием клеток и восстановлением функциональной активности сетчатки. Это наблюдается при относительно низкой дозе воздействия (<14 Гр). С увеличением дозы облучения увеличивается количество повреждений, а уровень экспрессии белков становится достаточным для индукции апоптоза. Гибель фоторецепторных клеток сетчатки глаза становится значительной, что приводит к необратимой дегенерации и снижению или полной утрате ее функциональной активности. 53 Высокая устойчивость сетчатки глаза мышей и активная репарация повреждений ДНК отражаются в зависимости цитотоксической реакции сетчатки глаза от дозы протонного облучения, приводя к характерной Sобразной кривой (рис. 18) и гипотезе генотоксического порога (Calabrese E.J., Baldwin L.A., 2003; Тронов В.А. и соавт., 2012). На рисунке 18 видно, что при увеличении дозы облучения ускоренных протонов от 2,5 Гр до 14 Гр процентное содержание фоторецепторных клеток в ядерном слое сетчатки глаза мышей не изменяется, а при последующем увеличении дозы (до 25 Гр) происходит резкое уменьшение толщины слоя фоторецепторных клеток сетчатки. Это снижение отражает деградацию сетчатки глаза под действием ускоренных протонов в дозе от 14 до 25 Гр. Такой характер изменения чувствительности сетчатки указывает на существование генотоксического порога к воздействию ускоренных протонов на сетчатку глаза мышей. 3.2. Влияние метилнитрозомочевины на сетчатку глаза мышей В рамках этого представления находятся результаты действия другого генотоксического агента – метилнитрозомочевины. Однократное введение мышам метилнитрозомочевины в дозе 70 мг/кг приводит к деструктивным изменениям в сетчатке глаза. Они затрагивают, главным образом, слой фоторецепторных клеток (рис. 19). Прогрессирующая гибель фоторецепторных клеток происходит по механизму апоптоза. На это указывают дегенерация сегментов и снижение толщины ядерного слоя фоторецепторных клеток, наличие фрагментированных ядер фоторецепторных клеток (рис. 20) и увеличенная экспрессия проапоптотических белков — Р53, РARP, FasR и caspase-3 (рис. 21). У многих животных отмечается слепота на 6 сутки после введения агента. Отмечено, что цитотоксическая доза метилнитрозомчевины 70 мг/кг монотонно и необратимо снижает амплитуду ЭРГ у мышей (рис. 22). 54 Рис. 18. Изменение толщины ядерного слоя фоторецепторных клеток (% от общей толщины) сетчатки глаза мышей в зависимости от дозы облучения головы мышей ускоренными протонами: черные квадраты – через 3 суток, белый – через 30 суток 55 Рис. 19. Микрофотографии сетчатки глаза интактных мышей (К) и через 6 дней после инъекции метилнитрозомочевины в дозах 35 и 70 мг/кг Рис. 20. Содержание фрагментированных ядер фоторецепторных клеток (а) и средняя толщина ядерного слоя фоторецепторных клеток (б) сетчатки глаза интактных мышей (к) и метилнитрозомочевины в дозе 70 мг/кг через 6 суток после инъекции 56 Рис. 21. Экспрессия проапоптотических белков через 24 ч после инъекции мышам метилнитрозомочевины в дозе 70 мг/кг Рис. 22. Амплитуда ЭРГ у мышей в разные сроки после однократного введения метилнитрозомочевины в дозах 35 мг/кг (серые столбики) и 70 мг/кг (черные столбики) 57 Как мы видели ранее, такие же деструктивные изменения в сетчатке глаза наблюдались и после облучения протонами в дозе 25 Гр. Но в отличие от действия радиации МНМ в цитотоксической дозе не вызывает общего токсического эффекта на организм животного и не приводит к его гибели, по крайней мере, в пределах длительности эксперимента (≤10 сут). Это обстоятельство вместе с селективным цитотоксическим действием МНМ на фоторецепторные возможности клетки применения в сетчатке этого расширяет агента для экспериментальные изучения механизмов индуцированной и спонтанной дегенерации сетчатки. Поэтому тактика исследования с применением МНМ принципиально не отличалась от таковой с облучением сетчатки. В последующих экспериментах мы исследовали характер дозовой зависимости эффектов. Для этого сравнивались эффекты действия МНМ в цитотоксической дозе (70 мг/кг) с эффектами от введения МНМ в дозе 35 мг/кг. Исследование показало, что наблюдается выраженная зависимость цитотоксического эффекта МНМ от концентрации воздействующего агента. Инъекция мышам МНМ 35 мг/кг не вызывала изменений в фоторецепторном слое сетчатки (рис. 19) и не сопровождалась увеличением экспрессии проапоптотических белков FasR и каспазы-3. Вместе с тем, инъекция мышам МНМ 35 мг/кг приводит к достоверному снижению амплитуды ЭРГ (рис. 22). Существенно также то, что это снижение оказывается обратимым (серые столбики) – профиль и амплитуды волн ЭРГ полностью восстанавливаются до контрольного уровня через 7-9 суток после воздействия. Таким образом, особенностью реакции сетчатки глаза мышей на генотоксический стресс, вызванный облучением или метилирующим агентом МНМ, является нелинейная зависимость цитотоксического ответа сетчатки глаза от дозы воздействующих генотоксикантов. Иными словами, в сетчатке обнаруживается высокий генотоксический порог для этих видов воздействия, который предполагает генотоксического стресса. возможность восстановления сетчатки от 58 Следует отметить, что у пролиферирующих клеток генотоксический порог связывают с активной системой репарации ДНК (Jenkins G.J.S. et al, 2005). В связи с этим, важной характеристикой репарационной системы является уровень спонтанных повреждений ДНК в клетках и способность клеток репарировать индуцированные повреждения ДНК. Спонтанные повреждения характеризуют не только репарационную систему клеток саму по себе, но и агрессивность окружающей среды, воздействующей на клетки. 3.3. Спонтанные повреждения и репарация ДНК в клетках сетчатки глаза мышей В целях оценки спонтанного уровня повреждений ДНК в клетках сетчатки глаза мышей были получены ДНК-кометы при модифицированном процессе лизиса клеток. В лизирующий раствор была добавлена протеиназа К (0,03 мг/мл), которая обеспечивает полную диссоциацию хроматина и высвобождение ДНК (Тронов В.А., Логинова М.Ю. и Крамаренко И.И., 2008), что существенно повысило чувствительность метода. На рисунке 23 для сравнения приведены микрофотографии типичных ДНК-комет из сетчатки глаза и ДНК-кометы лимфоцитов крови интактных мышей, взятых в качестве стандарта. Как видно: слева – внешний вид комет и высокое значение момента хвоста комет однонитевой ДНК из клеток сетчатки (mt=32) свидетельствует о более высоком уровне спонтанных повреждений ДНК в клетках сетчатки по сравнению с лимфоцитами (mt=4,3). Справа – показаны микрофотографии и значения mt для ds-ДНК комет, которые не обнаруживают столь высоких различий между сетчаткой и лимфоцитами. В связи с наличием спонтанных повреждений ДНК в клетках сетчатки глаза мышей было проведено исследование репарации ssДНК после облучения протонами и после введения метилнитрозомочевины. На рисунке 24 (а и б) представлена динамика восстановления структуры ДНК в клетках сетчатки 59 Сетчатка глаза мышей ssДНК, mt=32+/-2 sdДНК, mt=4+/-3 Лимфоциты крови мышей ssДНК, mt=2+/-2 sdДНК, mt=3+/-3 Рис. 23. Микрофотографии ДНК-комет интактных клеток сетчатки глаза и лимфоцитов крови мышей: в щелочных условиях – для обнаружения ssДНК и в нейтральных условиях – для обнаружения dsДНК. Параметр mt – момент хвоста кометы. Рис. 24. Динамика репарации однонитевых разрывов ДНК в клетках сетчатки глаза мышей после облучения протонами (а) и после инъекции метилнитрозомочевины (б). 1 – лизис с добавлением протеиназы К, 2 – лизис без протеиназы. 60 глаза in vivo после облучения мышей протонами в дозе 25 Гр и после инъекции МНМ в дозировке 70 мг/кг. Видно, что добавление протеиназы К в лизирующий буфер значительно повышает чувствительность метода ДНКкомет, что выражается в 3-5-кратном увеличении числа детектируемых повреждений ДНК в интактных клетках по сравнению с лизисом без протеиназы (начальные точки кривых 1 и 2 на рис. 24 а). В то же время, тест протеиназы на наличие у нее нуклеазной активности дал отрицательный результат. Таким же образом, была проведена оценка уровня спонтанных повреждений ДНК в клетках других органов мыши – печени и мозге. Оказалось, что по этому показателю клетки органов мыши располагаются в следующем порядке: лимфоциты < клетки печени < клетки мозга < клетки сетчатки, что совпадает со степенью их оксигенации (Тронов В.А. и др., 2012). Другими словами, выявляемый в щелочных условиях уровень повреждений ДНК коррелирует с уровнем оксигенации тканей. Такими повреждениями могут быть окси-модификации оснований. Именно в щелочных условиях такие основания могут гидролизоваться до разрывов ДНК, которые и обнаруживаются методом ssДНК-комет. По-видимому, эти сайты экранированы белками хроматина, взаимодействующими с ДНК, и поэтому для их проявления необходимо добавление протеиназы К в лизирующий раствор. Как было показано (рис. 23), индуцированные облучением и МНМ повреждения ДНК в клетках сетчатки существовавшие глаза удаляются спорадические механизмом повреждения не репарации, но ранее затрагиваются этими механизмами. Данный факт может свидетельствовать о недоступности этих повреждений для репаративных ферментов. Как и в случае воздействия ионизирующей радиацией, клетки сетчатки глаза мышей обладают устойчивостью и к действию метилнитрозомочевины в широком диапазоне концентраций. При превышении этого диапазона МНМ, как и ионизирующее излучение, индуцирует гибель преимущественно фоторецепторных клеток сетчатки по механизму апоптоза. На это указывает 61 наличие фрагментированных ядер фоторецепторных клеток и экспрессия проапоптотических белков. Хотя природа повреждений и механизмы их репарации при воздействии на клетки ионизирующего излучения и метилнитрозомочевины различны, восстановление клеток сетчатки от повреждений происходит примерно с одинаковой скоростью (время репарации составляет около 10 ч для 90-100% повреждений). Тем не менее, несмотря на полное восстановление ДНК от индуцированных повреждений в результате действия цитотоксической дозы метилнитрозомочевины, наблюдается необратимая деструкция сетчатки и гибель фоторецепторных клеток с утратой ее функций. Этот эффект может указывать на то, что мишенью, запускающей апоптотический каскад под влиянием МНМ, является не только ДНК. Полученный эффект возможно свидетельствует также о том, что апоптотический сигналинг активируется раньше по времени, чем происходит полное восстановление ДНК: например, по достижению максимального уровня повреждения ДНК после инъекции (через 4-5 ч). Существенным отличием реакции сетчатки глаза мышей на введение метилнитрозомочевины по сравнению с облучением протонами является то, что при введении МНМ в дозе ниже цитотоксического порога наблюдается достоверное обратимое снижение электрической активности сетчатки глаза мышей. С одной стороны, это может быть связано с различными мишенями в клетке, на которые воздействуют эти агенты. С другой стороны, наблюдаемый эффект предполагает возможность восстановления сетчатки глаза от генотоксического стресса. Для проверки этого предположения нами исследована способность к восстановлению от повреждения ДНК у клеток зрелой сетчатки глаза мышей. 62 3.4. Адаптивный ответ сетчатки глаза мышей на введение метилнитрозомочевины и облучение протонами В проведенном исследовании отмечена способность клеток сетчатки к восстановлению структуры ДНК от генотоксических повреждений: наблюдалось удаление дефектов и ее восстановление через 24-48 ч после инъекции мышам ретинотоксической дозировки метилнитрозомочевины в дозе 70 мг/кг (рис. 24 б). Однако, несмотря на полную репарацию, происходила деструкция сетчатки, гибель фоторецепторных клеток и необратимая утрата ее функций. Поэтому можно полагать, что репарация ДНК от повреждений, хотя и является необходимым условием для восстановления клеточного состава сетчатки, не служит его исчерпывающим показателем. В исследовании наблюдалась способность сетчатки к функциональному восстановлению (рис. 21) при нецитотоксической дозе МНМ (35 мг/кг). В силу сказанного, в последующих экспериментах были использованы тесты клеточной гибели/выживаемости и функциональной активности (ЭРГ) в качестве показателей восстановления сетчатки глаза от генотоксического воздействия. Тактика эксперимента основана на фракционированном воздействии агента. В токсикологии она используется для характеристики адаптации организма к воздействию токсического агента (Anderson M.G. et al., 2005; Otani A. et al., 2012). Предполагается, что первое, нетоксическое воздействие в низкой дозе создает «защитный фон» в ткани и последующее воздействие агента в высокой концентрации становится менее токсичным. В литературе этот эффект называется «адаптивным ответом», или «гормезисом» (Luckey T.D., 2006). Для его исследования были проведены две серии экспериментов. В одной серии в качестве адаптирующего воздействия использовали низкую дозу метилнитрозомочевины (химический гормезис). Мышам последовательно вводили метилнитрозомочевину в нетоксической дозе 17 мг/кг, а через 4 ч — в 63 токсической дозе 70 мг/кг. Для регистрации реакции глиальных клеток Мюллера мышам вводили пролиферативный маркер бромдезоксиуридин (BrUdR) 50 мг/кг через 12 и 24 ч после последней инъекции МНМ. Схема эксперимента приведена в таблице 5. Таблица 5. Схема эксперимента по адаптивному ответу сетчатки глаза мышей на действие метилнитрозомочевины Время, ч Группа-1 Группа-2 Группа-3 0 МНМ – 17 мг/кг — — 4 МНМ – 70 мг/кг МНМ – 70 мг/кг — 12 BrUdR - 50 мг/кг BrUdR - 50 мг/кг BrUdR - 50 мг/кг 24 BrUdR - 50 мг/кг BrUdR - 50 мг/кг BrUdR - 50 мг/кг 48 Эвтаназия Эвтаназия Эвтаназия В другой серии экспериментов в качестве адаптирующего воздействия использовали облучение головы животных ускоренными протонами в дозе 1 Гр (радиационный гормезис). В качестве повреждающего воздействия, как и в первой серии, была применена инъекция МНМ в ретинотоксической дозе 70 мг/кг. Схема эксперимента приведена в таблице 6. 64 Таблица 6. Схема эксперимента по адаптивному ответу сетчатки глаза мышей после действия ускоренных протонов Время, ч Группа-1 Группа-2 Группа-3 0 p – 1 Гр — — 4 МНМ – 70 мг/кг МНМ – 70 мг/кг — 48 Эвтаназия Эвтаназия Эвтаназия Адаптивный ответ сетчатки глаза на фракционированное введение метилнитрозомочевины (последовательно 17 и 70 мг/кг) представлена в виде профилей ЭРГ (рис. 25 а) и гистограммы амплитуд ЭРГ (рис. 25 б). Видно, что через 6 ч после воздействия МНМ в дозе 70 мг/кг профиль ЭРГ восстанавливается (группа-3). Хотя амплитуда ЭРГ оказалась ниже, чем у контрольной группы мышей (группа-1), тем не менее, она достоверно выше амплитуды ЭРГ после единичной инъекции МНМ — 70 мг/кг (группа-2). Одновременно с помощью иммуноцитохимии прослеживалась экспрессия терминальной апоптотической каспазы-3 в клетках сетчатки глаза мышей в ответ на фракционированное введение МНМ. Наблюдался адаптивный ответ сетчатки глаза мышей в виде экспрессии каспазы-3. На рисунке 26 видно, что у мышей после однократного введения 70 мг/кг резко увеличилось ее содержание в клетках, а после фракционированного воздействия — значительно упало (хотя и остается выше, чем у контрольной группы мышей), что говорит о снижении частоты гибели клеток сетчатки в ответ на дозу 17+70 мг/кг по сравнению дозой только 70 мг/кг. В экспериментах по адаптивной реакции сетчатки глаза на облучении ускоренными протонами все процедуры по изъятию глаз у мышей и последующему приготовлению препаратов проводились спустя 48 ч после облучения. На микрофотографиях (рис. 27) видно, что инъекция МНМ в дозе 65 Рис. 25. Функциональная активность сетчатки глаза мышей после однократной инъекции метилнитрозомочевины в дозе 70 мг/кг и фракционированной инъекции МНМ (17+70 мг/кг) по сравнению с контролем: а) профили ЭРГ, б) амплитуда ЭРГ 66 Рис. 26. Уровень увеличения экспрессии каспазы-3 в сетчатке глаза мышей в контроле, в ответ на фракционированное (17 и 70 мг/кг) и цитотоксическое (70 мг/кг) действие метилнитрозомочевины 67 Рис. 27. Микрофотографии срезов сетчатки глаза мышей в контроле и после инъекции МНМ в дозе 70 мг/кг: а) и б) — изменение TUNEL– флуоресценции погибших клеток; в) и г) — морфологические изменения в сетчатке глаза 68 70 мг/кг приводит к массовой гибели фоторецепторных клеток. На это указывает локализация TUNEL-фокусов только в наружном ядерном слое сетчатки глаза (рис. 27 б). Следует также отметить, что морфологическая деструкция этого слоя сетчатки заметно менее выражена, несмотря на то, что наблюдается разупорядочивание фоточувствительных сегментов фоторецепторных клеток (рис. 27 г). Это служит свидетельством того, что апоптотическая деградация ДНК и активация эндонуклеаз в ядрах фоторецепторных клеток происходит ранее, чем морфологические изменения сетчатки — примерно на 24 ч. На рисунке 28 представлена интенсивность флуоресценции ядерного слоя фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей в контроле и через 48 ч после однократного и комбинированного воздействия протонов и МНМ. Количественная оценка интенсивности TUNEL-флуоресценции была проведена с помощью программы ImageJ. Она показала достоверное снижение цитотоксического эффекта от сочетанного воздействия ускоренных протонов и метилнитрозомочевины по сравнению с эффектом только от однократного введения МНМ в дозе 70 мг/кг (уровень значимости различий р<0,001). Другими словами, предварительное облучение ускоренными протонами головы мышей в дозе 1 Гр делает сетчатку глаза мышей более толерантной к цитотоксическому действию метилнитрозомочевины. Известно, что апоптоз клеток инициируется двунитевыми разрывами ДНК, имеющими ферментативную природу (Разин С.В. и Юдинкова Е.Ю., 1998). Поскольку, как отмечено ранее, метилнитрозомочевина не вызывает разрывов ДНК, то следует предположить, что в апоптотических клетках сетчатки глаза должно наблюдаться формирование таких ферментативных двунитевых разрывов ДНК, инициирующих апоптоз. Их возникновение в клетках может коррелировать со средней скоростью апоптоза в сетчатке глаза. На рисунке 29 видно, что полученные результаты по оценке содержания двунитевых разрывов ДНК в клетках сетчатки глаза подтверждают это 69 Рис. 28. Интенсивность флуоресценции ядерного слоя фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей в контроле и через 48 ч после однократной инъекции 70 мг/кг метилнитрозомочевины и при комбинированном действии протонов (1 Гр) и введения метилнитрозомочевины (70 мг/кг). Штрихи – средние значения для разных срезов сетчатки 70 Рис. 29. Двунитевые повреждения ДНК (dsДНК) в клетках сетчатки глаза мышей через 48 ч после облучения адаптирующей дозой ускоренных протонов (1 Гр) и однократным введением метилнитрозомочевиной (70 мг/кг). а) распределение клеток по степени повреждения двунитевой ДНК; б) микрофотографии комет двунитевой ДНК, доминирующие в каждом из распределений; в) средние значения повреждений ДНК, найденные из этих распределений ±SD 71 предположение. Среднее содержание двунитевых разрывов ДНК в клетках сетчатки после комбинированного действия ускоренных протонов и метилнитрозомочевины оказывается сниженным по сравнению с действием только метилнитрозомочевины. Результаты TUNEL-исследования показали, что этот эффект совпадает с частотой возникновения апоптоза в сетчатке глаза мышей (рис. 28). Поскольку, считается, что важная роль в восстановлении сетчатки от повреждения принадлежит глиальным клеткам Мюллера (ГКМ), мы попытались на феноменологическом уровне оценить участие их и в адаптивном ответе сетчатки у мышей. Активацию этих клеток в сетчатке глаза после адаптирующей инъекции мышам метилнитрозомочевины регистрировали через 48 часов — минимальное время для промечивания ГКМ пролиферативным маркером бромдезоксиуридином. Клетки Мюллера чутко реагируют на химическое воздействие. Эта реакция (реактивный глиозис) на генотоксический стресс выражается их гипертрофией (увеличением размера), пролиферацией и миграцией к поврежденным участкам сетчатки. Эти три компонента реакции ГКМ представлены на микрофотографиях срезов сетчатки глаза в виде FITCфокусов в фоторецепторном слое сетчатки (рис. 30). Фокусы представляют собой ядра пролиферирующих клеток, включивших BrUdR в ДНК. Подсчет таких фокусов на единичной площади среза дает количественную меру активации глиальных клеток Мюллера на генотоксический стресс. При введении МНМ однократно в дозе 70 мг/кг наблюдается выраженная активация ГКМ (рис. 30 б), соответствующая степени повреждения клеток. При последовательном введение МНМ (17+70 мг/кг), разделенном во времени 4-мя часами, обнаруживается снижение глиозиса (рис. 31) по сравнению с однократным введением МНМ по 70 мг/кг. Отмечается уверенная тенденция к снижению числа ГКМ в сетчатке глаза после фракционированного воздействия МНМ, что свидетельствует о снижении повреждающего действия этого агента (P=0,08). 72 Рис. 30. Активация клеток Мюллера в сетчатке глаза мышей in vivo после введения метилнитрозомочевины в дозе 70 мг/кг: а) срезы сетчатки глаза – стрелками показаны глиальные клетки Мюллера, меченные анти-BrUdR антителами; б) число FITC-фокусов на единицу площади среза через 48 часов после введения метилнитрозомочевины 73 Рис. 31. Активация глиальных клеток Мюллера в сетчатке глаза мышей в контроле, при однократном метилнитрозомочевины. и Штрихи фракционированном — средние введении значения активированных глиальных клеток Мюллера в сетчатке глаза мышей мышам количества 74 Следует отметить, что использованная нами процедура визуализации глиальных клеток Мюллера открывает дополнительные возможности для характеристики ответа этих клеток на повреждение сетчатки глаза. На рисунке 32 представлены кометы однонитевой ДНК из клеток Мюллера, включивших маркер BrUdR. Эти кометы указывают на высокую степень поврежденности ДНК в этих клетках. Как уже отмечалось ранее, спонтанные повреждения наблюдаются во всех клетках сетчатки глаза. Поскольку зрительный процесс связан с высоким потреблением кислорода, сетчатка глаза оказывается самой оксигенированной тканью с высоким содержанием активных форм кислорода. Это объясняет высокий уровень спонтанного повреждения ДНК. При такой поврежденности ДНК, наблюдаемая устойчивость клеток сетчатки к апоптозу и способность к восстановлению, подчеркивает высокую степень адаптации сетчатки глаза к генотоксическим воздействиям, механизмы представляют, на наш взгляд, предмет дальнейшего изучения. которой 75 интактная сетчатка Рис. 32. Микрофотографии однонитевых BrUdR-ДНК комет, формируемых глиальными клетками Мюллера в интактной сетчатке глаза мышей. 76 Глава 4. Обсуждение результатов исследования 4.1. Генотоксическая устойчивость сетчатки глаза мышей Результаты проведенного исследования подтверждают ранее высказанный тезис о высокой генотоксической устойчивости зрелой сетчатки глаза мышей к воздействию ионизирующего излучения и метилнитрозомочевины. Ее устойчивость является, вероятно, результатом активной репарации повреждений ДНК после действия как протонов с энергией 150 МеВ/нуклон, так и квантов в дозе 14 Гр (рис. 12). Репарация ДНК сочетается с увеличением экспрессии белков Р53 и АТМ. Полученные данные показали, что экспрессия белков нормализуется спустя 12 ч после облучения. К этому же сроку завершается репарация разрывов ДНК, индуцированных ионизирующем излучением (рис. 12). Высокую генотоксическую устойчивость сетчатки глаза также подтверждают полученные данные об отсутствии морфологических изменений в фоторецепторном слое сетчатки глаза мышей после облучения в дозе 14 Гр. Деградация наружных сегментов фоторецепторных клеток и снижение плотности и толщины ядерного слоя фоторецепторных клеток сетчатки обнаружены при облучении ускоренными протонами и квантами в высокой дозе — 25 Гр (рис. 14). Этот процесс нарастает со временем после облучения. Наблюдаемые нарушения связаны с гибелью фоторецепторных клеток, протекающей по механизму апоптоза. На процесс апоптоза указывает возросшая экспрессия проапоптотических белков Р53, FasR и активной каспазы-3 (рис. 15). Все эти явления наблюдаются и при действии метилнитрозомочевины (рис. 19 и 22). Высокая устойчивость сетчатки и активно протекающая репарация ДНК указывают на существование генотоксического порога, который обусловливает нелинейный характер 77 зависимости эффекта от дозы воздействующих агентов (Johnson G.E. et al, 2009). При действии алкилирующих агентов для пролиферирующих клеток генотоксический порог наблюдался рядом исследователей (Jenkins G.J.S. et al., 2005). Он выражался в нелинейной зависимости возникающей реакции сетчатки глаза от дозы генотоксического агента и был непосредственно связан с активной репарацией ДНК. При исследовании генотоксического действия метилнитрозомочевины нами были выявлены две особенности реакции сетчатки глаза мышей, которые ранее не отмечались в литературе. Во-первых, отмечена высокая степень спонтанного повреждения ДНК в клетках сетчатки глаза мышей (рис. 23). Так, величина параметра mt (момент хвоста) для сетчатки глаза мышей оказалась на порядок выше, чем в лимфоцитах их крови. По этому показателю клетки мышей можно расположить в порядке увеличения степени повреждения ДНК: лимфоциты < клетки печени < клетки мозга < клетки сетчатки. Эта последовательность совпадает со степенью оксигенации этих клеток. Величина среднего момента хвоста комет однонитевой ДНК (mt=32±2) сетчатки интактных мышей соответствует данной величине в сетчатке глаза мышей после облучения ускоренными протонами в дозе 15-20 Гр. Такие дозы облучения неизбежно индуцируют двунитевые повреждения ДНК в клетках сетчатки. Однако клетки сетчатки интактных мышей в нейтральных условиях (применение метода комет для регистрации только двунитевых разрывов ДНК) не обнаруживают разрывов ДНК, хотя форма комет (рис. 23) указывает на декомпактизацию хроматина в клетках и на ослабление его связи с ядерным матриксом. Все вышеперечисленное свидетельствует о том, что спонтанные повреждения ДНК в клетках сетчатки не являются разрывами. Однако они могут трансформироваться в разрывы в щелочных условиях (рН>13). Это может служить показателем того, что эти повреждения являются оксимодифицированными основаниями ДНК. 78 Другой обнаруженной нами особенностью сетчатки глаза является активная репарация повреждений ДНК. Она удаляет большую часть повреждений, индуцированных облучением и влиянием метилнитозомочевины. Однако она не затрагивает ранее существовавшие спонтанные повреждения ДНК (рис. 24). Спонтанные повреждения в виде однонитевых разрывов ДНК в клетках разных органов мышей отмечались и в работах других авторов (Valarde M. et al, 2000; Valarde M., Trejo C. and Rojas E. 2001). Степень повреждаемости ДНК в клетках мышей нарастала в таком же порядке, что и полученная в наших исследованиях: лейкоциты< клетки печени< клетки мозга< клетки сетчатки (Wang A.,L. et al, 2010). Таким образом, наличие нерепарируемых дефектов в ДНК клеток интактной сетчатки, обратимое снижение ее функциональной активности также свидетельствуют о высокой генотоксической устойчивости сетчатки глаза мышей. Как известно, апоптоз пролиферирующих клеток с сохранившимися в них повреждениями ДНК признается радикальным путем предотвращения появления генетически нестабильного потомства клеток. В настоящее время остается неясным, подвергаются ли апоптозу дифференцированные клетки сетчатки глаза под влиянием генотоксического стресса (Walsh K. and Perlman H., 1997). Известно, что в постмитотических клетках подавлены некоторые механизмы репарации. Так, терминально дифференцированные клетки не способны осуществлять репарацию по механизму гомологичной рекомбинации (Homologous Recombination Repair – HRR), ассоциированному с репликацией. Кроме того, в этих клетках регуляторно подавлена глобальная репарация генома — одна из разновидностей механизма NER (Simonatto M., Latella L. and Puri P.L., 2007). Вместе с тем, терминально дифференцированные клетки транскрипционно активны и нуждаются в поддержании целостности транскрибируемой части генома на протяжении их жизни. Данную функцию выполняет механизм репарации, ассоциированный с транскрипцией (Nouspikel T., 2007). Учитывая эти процессы, можно полагать, что большая часть генома 79 терминально дифференцированных клеток (в том числе и клеток сетчатки) является некритичной для выполнения специфических функций этих клеток. И поэтому репарацией ДНК в этой части генома клетка может, в какой-то степени, пренебречь. В результате в ней могут накапливаться спонтанные повреждения ДНК без очевидных цитотоксических последствий. Возникновение спонтанных повреждений ядерной ДНК в клетках сетчатки глаза свидетельствует о толерантности клеток к генотоксическому стрессу. Таким образом, полученные результаты указывают на то, что одной из причин толерантности постмитотических клеток сетчатки к повреждениям ДНК (как и для делящихся клеток) является репарация этих повреждений. Другой причиной их толерантности может быть уменьшение физического размера радиочувствительной мишени до размеров транскрибируемого локуса генома. Можно предположить, что решающая роль в трансформации полученных повреждений ДНК в клетках сетчатки глаза в цитотоксический эффект принадлежит молекулам топоизомеразы 2 (topo 2), локализованным в транскрибируемых сайтах (это относится к разрывам ДНК после облучения, а после воздействия МНМ — к модифицированным основаниям и АП-сайтам). Известно, что регуляция генной экспрессии осуществляется путем структурной перестройки (remodeling) хроматина с формированием петель (Kouzarides T., 2007; Kadauke S. and Blobel G.A. 2009). Важную роль в этом играет топоизомераза 2, входящая в состав комплекса, осуществляющего remodeling (Varga-Weisz P.D. et al., 1997; Kuniaki Sano K. et al, 2008). Тopo 2 локализована в транскрибируемой области генома, где она модифицирует топологию ДНК. При этом она временно надрезает двунитевую ДНК и в последующем лигирует этот разрыв, благодаря своей эндонуклеазной и лигазной активности (Champoux J.J., 2001). Активация эндонуклеазной функции topo 2 может осуществляться индуцированным внешним воздействием, например при применении противоопухолевых препаратов (Sabourin M. and Osheroff N., 2000), или при спонтанно возникающих 80 повреждений ДНК (Liu L. and Gerson S.L., 2004). В результате в транскрибируемых локусах генома формируются нерепарируемые двунитевые разрывы, приводящие к образованию высокомолекулярных (300-0,5 Мb) фрагментов двунитевой ДНК (Taverna P. et al., 2001), которые являются ранним маркером апоптотической деградации генома (Tronov V.A. et al., 1999). Подтверждением данного эффекта могут служить данные, полученные рядом исследователей (Fishel M.L. et al., 2007). Ими показано, что для инициации формирования нерепарируемых двунитевых разрывов ДНК необходимо образование повреждения ДНК в той области, которая перекрывается эндонуклеазной активностью topo 2. В остальных случаях повреждение может быть отрепарировано и не приведет к цитотоксической реакции сетчатки глаза. Такой механизм может объяснить наличие генотоксического порога и вклада репарации в его формирование, а также, в конечном счете, сам процесс трансформации/трансляции полученных повреждений ДНК в цитотоксический эффект для постмитотических клеток сетчатки глаза мышей. 4.2. Структурное и функциональное восстановление сетчатки глаза мышей после генотоксического воздействия Толерантность сетчатки глаза мышей к генотоксическим стрессам указывает на существование механизма ее восстановления от повреждений. Полученные нами данные по адаптирующему влиянию малых доз протонного излучения (рис. 28 и 29) и метилнитрозомочевины в невысоких концентрациях (рис. 25 и 26) несомненно свидетельствуют о способности зрелой сетчатки глаза к структурному и функциональному восстановлению. В токсикологии такой адаптивный ответ получил название «нейрогормезиса» (Luckey T.D., 2006). Нейрогормезис был описан (Anderson M.G. et al., 2005; Otani A. et al., 2012) при действии гамма-излучения на глаза экспериментальных животных. В ряде исследований при использовании модели МНМ-индуцированной 81 дегенерации сетчатки был продемонстрирован ретинопротекторный эффект других соединений: липида, выделенного из семян древесного гриба Ganoderma lucidum (Gao Y. et al., 2010); инактивированного мутацией фактора роста фибробластов крыс (Xu H. et al., 2008); никотинамида (Kiuchi K. et al., 2003). К подобному явлению можно отнести эпидемиологические данные о снижении частоты заболевания глаукомой в популяции людей, переживших атомную бомбардировку в Японии (Miyachi Y. et al., 1994; Yamada M. et al., 2004). Как показывают результаты приведенного нами исследования (рис. 2829), важная роль в радиационном гормезисе принадлежит подавлению процесса апоптоза. Известно, что наиболее активным ингибитором апоптоза в клетке является белок XIAP, кодируемый геном XIAP, расположенном в хромосоме 10 у человека (Srinivasula S.M. et al., 2001). В исследовании, проведенном рядом авторов (Petrin D. et al., 2003), выделенный ген XIAP был введен в глаза крысам. После его интеграции в геном клеток сетчатки крысам вводили внутрибрюшинно метилнитрозомочевину (вектором служил аденовирус). В результате клетки сетчатки глаза крыс, экспрессирующие белок ХIАР, оказались более устойчивыми к действию МНМ. Это было выявлено по частоте возникновения апоптоза и по морфологии сетчатки глаза крыс. Ими было показано, что прямое подавление белком XIAP процесса апоптоза клеток сетчатки глаза крыс делает ее более устойчивой к действию МНМ. Кроме того, не исключено, что в химическом и радиационном гормезисе сетчатки глаза мышей могут играть роль и глиальные клетки Мюллера, чутко реагирующие на различные деструктивные изменения в ней (Chollangi S. et al., 2009). Это подтверждается и проведенные нами исследования: так, при введении цитотоксической дозы МНМ наблюдается достоверная активация клеток Мюллера (рис. 30 и 31). 82 Выводы 1. изменений Исследована зависимость морфологических и функциональных сетчатки глаза мышей от величины дозы воздействия генотоксическими агентами физической и химической природы: гаммаизлучения, ускоренных протонов и метилнитрозомочевины. 2. излучений Наблюдается плато устойчивости сетчатки глаза мышей к действию в диапазоне доз от 0 до 14 Гр, и при введении метилнитрозомочевины в дозах от 0 до 35 мг/кг, отражающее наличие генотоксического порога у сетчатки глаза (14 Гр и 35 мг/кг) и ее способность к восстановлению после воздействия агента в дозах ниже пороговых. 3. Показано, что ускоренные протоны в дозе 25 Гр вызывают морфологические изменения в сетчатке глаза, возрастание экспрессии белков р53, FasR и каспазы-3, связанных с апоптотической гибелью фоторецепторных клеток в сетчатке, что ведет к утрате функциональной активности сетчатки. 4. Аналогично, однократное введение мышам метилнитрозомочевины в дозе 70 мг/кг приводит к массовой гибели фоторецепторных клеток по механизму апоптоза, вызывает дегенерацию сетчатки глаза мышей и необратимо снижает ее функциональную активность. 5. Показана способность зрелой сетчатки глаза мышей к клеточному и функциональному восстановлению и к адаптивному ответу и возможное участие глиальных клеток Мюллера в этих процессах. 6. Обнаружен высокий уровень спонтанных повреждений ДНК сетчатки глаза, в следствие высокой степени оксигенации ткани. 83 Заключение Диссертационная работа была выполнена в Лаборатории радиационной биологии Объединенного института ядерных исследований и в Лаборатории физико-химических основ рецепции Института биохимической физики РАН им Н.М. Эмануэля. В диссертационной работе продемонстрирована потенциальная способность сетчатки глаза мышей к восстановлению от ретинотоксического действия ионизирующих излучений и метилнитрозомочевины, которая определяется восстановлением клеток сетчатки глаза от повреждений, восстановлением ее структуры и функциональной активности. Результаты исследования имеют как фундаментальное, так и прикладное значение. Они пополняют сведения о повреждении и восстановлении терминально дифференцированных клеток и состоящих из них тканей (в данном случае сетчатка глаза) при воздействии разных генотоксических агентов физической и химической природы. Выявленные качественные и количественные характеристики действия протонного излучения и метилнитрозомочевины могут использоваться при проведении лучевой и химиотерапии опухолей глаз, головы, шеи и т.п. Полученные данные могут быть полезными при планировании курсов химио- и лучевой терапии, при расчете оптимальных доз их воздействия. Вместе с тем, результаты могут использоваться для прогноза опасности и последствий пилотируемых космических полетах. Диссертационная работа изложена на 94 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов и заключения, содержит 6 таблиц и 32 рисунка. Список литературы включает 95 наименования, из которых 8 — на русском и 87 — на английском языках. Выражаю глубокую благодарность научному руководителю диссертационной работы доктору биологических наук В.А. Тронову за 84 постоянное внимание, помощь и личное участие, обеспечившими ее выполнение. Выражаю глубокую признательность директору Лаборатории радиационной биологии ОИЯИ члену-корреспонденту РАН профессору Красавину Е.А., заместителю директора Лаборатории доктору физикоматематических наук Тимошенко Г.Н. и заведующему Лабораторией физикохимических основ рецепции ИБХФ РАН академику Островскому М.А. за поддержку и постоянное внимание к работе. Выражаю большую благодарность начальнику Медико-технического комплекса ОИЯИ Мицыну Г.В., кандидатам физико-математических наук Молоканову А.Г. и Гаевскому В.Н., осуществлявшим облучение мышей и дозиметрию на протонном пучке фазатрона и аппарате для дистанционной лучевой терапии РОКУС-М. Приношу благодарность сотрудникам Лаборатории радиационной биологии доктору биологических наук Борейко А.В., кандидату биологических наук Говорун Р.Д. и доктору медицинских наук Иванову А.А. за внимание, поддержку и помощь на разных этапах выполнения работы. 85 Список литературы 1. Винклер Дж.Р. Первичные космические лучи // Радиационная опасность при космических полетах. М.: Мир, 1964. С. 25-52. 2. Муранов К.О., Островский М.А. Молекулярная физиология и патология хрусталика глаза. М.: ТОРУС ПРЕСС. 2013. С. 68-89. 3. Разин С.В., Юдинкова Е.Ю. Крупномасштабная фрагментация ДНК при апоптозе: разрезается ли геном по границам топологических доменов? Известия РАН. Сер. Биол. 1998. № 2. С. 167-171. 4. Тронов В.А., Артамонов Д.Н., Абрамов М.Е., Горбачева Л.Б., Личиницер М.Р. Связь эффективности репарации ДНК, уровня экспрессии белков MLH1, MSH2 и FASR в лимфоцитах больных меланомой кожи с клиническим ответом на химиотерапию. Вопросы онкологии. 2011. Т. 5 № 2. С. 165-172. 5. Тронов В.А., Метилнитрозомочевина Логинова М.Ю., challenge-мутаген в Крамаренко оценке И.И. активности коррекционной репарации ДНК (MMR): связь с некоторыми видами рака. Генетика. 2008. № 44. С. 686-692. 6. Тронов В.А., Виноградова Ю.В., Логинова М.Ю., Поплинская В.А., Островский М.А. Механизмы радиорезистентности терминально дифференцированных клеток зрелой сетчатки глаза. Цитология. 2012. Т. 54. № 3. C. 261-269. 7. Труханов К.А., Бриндикова Т.А., Зак П.П., Лебедев В.М., Спасский А.В., Федорович И.Б., Островский М.А. Действие тяжелых заряженных частиц на родопсин и изолированную сетчатку глаза. Доклады Академии Наук. 2001. № 377. С. 715-717. 8. Шамшинова А.М., Волков В.В. Функциональные исследования в офтальмологии. М.: Медицина. 1999. С. 11. методы 86 9. Al-Tweigeri T., Nabholtz J.M., Mackey J.R. Ocular toxicity and cancer chemotherapy. A review. Cancer. 1996. V. 78. № 7. P. 1359-1373. 10. Amoaku W.M., Frew L., Mahon G.J., Gardiner T.A., Archer D.B. Early ultrastructural changes after low-dose X-irradiation in the retina of the rat. Eye. 1989. V. 3. P. 638-646. 11. Amoaku W.M., Mahon G.J., Gardiner T.A., Frew L., Archer D.B. Late ultrastructural changes in the retina of the rat following low-dose X-irradiation. Greafe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 1992. V. 230. P. 569-574. 12. Anderson M.G., Libby R.T., Gould D.B., Smith R.S., John S.W. Highdose radiation with bone marrow transfer prevents neurodegeneration in an inherited glaucoma. PNAS. 2005. V. 102 . № 12. P. 4566-4571. 13. Barabino S., Raghavan A., Loeffler J., Dana R. Radiotherapy-induced ocular surface disease. Cornea. 2005. V. 24. № 8. P. 909-914. 14. Beranek D.T. Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation with monofunctional alkylating agents. Mutat. Res. 1990. V.231. С. 11– 30. 15. Bergonie J, Tribondeau L. Interpretation de quelques resultats de la radiothera – pie et essai de fixation d’une technique rationelle. Comptes Rendus des Seances de I’Academie des Sciences. 1906. V.143. P. 983-985. 16. Bernardos R.L., Barthel L.K., Meyers J.R., Raymond P.A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Müller glia that function as retinal stem cells. J Neurosci. 2007 Jun 27. V. 27. №26. P. 7028-7040. 17. Brown G.C., Shields J.A., Sanborn G., Augsburger J.J., Savino P.J., Schlatz N.J. Radiation retinopathy. Ophthalmology. 1982. V.89. P. 1494-1501. 18. Calabrese E.J., Baldwin L.A. Toxicology rethinks its central belief. Nature. 2003. V.421. №6924. P. 691-692. 19. Chalupecky H. Ueber die Wirkung der rontgenstrahlen auf das Aufe und die Haut. Z. Prakt Augenheilk. 1897. V.21. P. 234-239. 87 20. Champoux J.J. DNA topoisomerases: structure, function, and mechanism. Annu Rev Biochem. 2001. V.70. P. 369-413. 21. Chollangi S., Wang J., Martin A., Quinn J., Ash J.D. Preconditioninginduced protection from oxidative injury is mediated by leukemia inhibitory factor receptor (LIFR) and its ligands in the retina. Neurobiol Dis. 2009. V. 34. № 3. P. 535–544. 22. Collins A.R., Oscoz A.A., Brunborg G., Gaivao I., Giovannelli L., Kruszewski M., Smith C.C., Stetina R. Review. The comet assay: topical issues. Mutagenesis. 2008. V. 23. P. 143-151. 23. Сurtis S.B. Historical survey of space radiation biology. Chap. 2 // Space radiation, biology and related topics / Ed. C.A. Tobias and P.W. Todd. N.Y.: Acad. Press, 1974. 24. Curtis S.B. Single-track effects and new directions in GCR risk assessment. Adv Space Res. 1994. V. 14. № 10. P. 885-894. 25. Demizu Y., Murakami M., Miyawaki D., Niwa Y., Akagi T., Sasaki R., Terashima K., Suga D., Kamae I., Hishikawa Y. Analysis of Vision loss caused by radiation-induced optic neuropathy after particle therapy for head-and-neck and skull-base tumors adjacent to optic nerves. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2009. V.75. № 5. P. 1487-1492. 26. Eagle R.C. Jr., Shields C.L., Bianciotto C., Jabbour P., Shields J.A. Histopathologic observations after intra-arterial chemotherapy for retinoblastoma. Arch Ophthalmol. 2011. V. 129. № 11. P. 1416-1421. 27. Fishel M.L., He Y., Smith M.L., Kelley M.R. Manipulation of Base Excision Repair to Sensitize Ovarian Cancer Cells toAlkylating AgentTemozolomide. Clin Cancer Res. 2007. V. 13. P. 260-267. 28. Gao Y., Deng X.G., Sun Q.N., Zhong Z.Q. Ganoderma spore lipid inhibits N-methyl-N-nitrosourea-induced retinal photoreceptor apoptosis in vivo. Exp Eye Res. 2010. V. 90. № 3. P. 397-404. 88 29. Giralt J., Rey A., Villanueva R., Alforja S., Casaroli-Marano R.P. Severe visual loss in a breast cancer patient on chemotherapy. Med Oncol. 2012. V. 29. № 4. P. 2567-2569. 30. Gorgels T., Pluijm I., Brandt R. Retinal degeneration and ionizing radiation hypersensitivity in a mouse model for cockayne syndrome. Molecular and Cellular Biology. 2007. V.27. P. 1433–1441. 31. Haas A., Pinter O., Papaefthymiou G., Weger M., Berghold A., Schröttner O., Müllner K., Pendl G., Langmann G. Incidence of radiation retinopathy after high-dosage single-fraction gamma knife radiosurgery for choroidal melanoma. Ophthalmology. 2002. V. 109. № 5. P. 909-913. 32. Imperia P.S., Lazarus H.M., Lass J.H. Ocular complications of systemic cancer chemotherapy. Surv Ophthalmol. 1989. V. 34. № 3. P. 209-230. 33. Jenkins G.J.S., Doak S.H., Johnson G.E.,Quick E, Waters E.M., Parry J.M. Do dose response thresholds exist for genotoxic alkylating agents? Mutagenesis. 2005. V. 20. P. 389–398. 34. Johnson G.E., Doak S.H., Griffiths S.M., Quick E.L., Skibinski D.O., Zaïr Z.M., Jenkins G.J. Non-linear dose-response of DNA-reactive genotoxins: Recommendations for data analysis. Mutat Res. 2009. V. 678. P. 95-100. 35. Kadauke S., Blobel G.A. Chromatin loops in gene regulation. Biochim. Biophys. Acta. 2009. V.1789. P. 17-25. 36. Keng C., Lett J.T. Effects of heavy ions on rabbit tissues: loss of electroretinogram and DNA repair in retinal photoreceptor cells. International Journal of Radiation Biology. 1981. V.39. P. 655-664. 37. Kirwan J.F., Constable P.H., Murdoch I.E., Khaw P.T. Beta irradiation new uses for an old treatment: a review. Eye. 2003. V. 17. P. 207-215. 38. Kiuchi K., Kondo M., Ueno S., Moriguchi K., Yoshizawa K., Miyake Y., Matsumura M., Tsubura A. Functional rescue of N-methyl-N-nitrosoureainduced retinopathy by nicotinamide in Sprague-Dawley rats. Curr Eye Res. 2003. V. 26. № 6. P. 355-362. 89 39. Konca K., Lankoff A., Banasik A., Lisowska H., Kuszewski T., Gozdz S., Koza Z., Wojcik A. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutation Research. 2003. V. 534. P. 15-20. 40. Kouzarides T. Chromatin modifications and their functions. Cell. 2007. V. 128. № 4. P. 693-705. 41. Krebs W., Krebs I., Merriam G.R. Jr., Worgul B.V. The effect of accelerated argon ions on the retina. Radiat Res. 1988. V. 115. № 1. P. 192-201. 42. Krebs W., Krebs I., Worgul B.V. Effect of accelerated iron ions on the retina. Radiat Res. 1990. V. 123. № 2. P. 213-9. 43. Kuniaki Sano K., Miyaji-Yamaguchi M., Tsutsui K.M., Tsutsui K. Topoisomerase IIβ Activates a Subset of Neuronal Genes that Are Repressed in ATRich Genomic Environment. PLoS ONE. 2008. V. 3. № e4103. P. 1-17. 44. Lips J., Kaina B. DNA double-strand breaks trigger apoptosis in p53deficient fibroblasts. Carcinogenesis. 2001. V.22. P. 579-585. 45. Liu L., Gerson S.L. Therapeutic impact of methoxyamine: blocking repair of abasic sites in the base excision repair pathway. Curr Opin Investig Drugs. 2004. V.5. P. 623-627. 46. Luckey T.D. Radiation hormesis: the good, the bad, and the ugly. Dose Response. 2006. V. 4. № 3. P. 169-190. 47. Mader T.H., Gibson C.R., Pass A.F., Kramer L.A., Lee A.G., Fogarty J., Tarver W.J., Dervay J.P., Hamilton D.R., Sargsyan A., Phillips J.L., Tran D., Lipsky W., Choi J., Stern C., Kuyumjian R., Polk J.D. Optic disc edema, globe flattening, choroidal folds, and hyperopic shifts observed in astronauts after longduration space flight. Ophthalmology. 2011. V. 118. № 10. P. 2058-2069. 48. Mader T.H., Gibson C.R., Pass A.F., Lee A.G., Killer H.E., Hansen H.C., Dervay J.P., Barratt M.R., Tarver W.J., Sargsyan A.E., Kramer L.A., Riascos R., Bedi D.G., Pettit D.R. Optic disc edema in an astronaut after repeat longduration space flight. J Neuroophthalmol. 2013. V. 33. №3. P. 249-255. 90 49. Mao X. W., Crapo J. D., Mekonnen T., Lindsey N., Martinez P., Gridley D. S., Slater J. M. Radioprotective effect of a metalloporphyrin compound in rat eye model. Current Eye Res. 2009. V. 34. P. 62-72. 50. Mao X.W., Green L.M., Mekonnen T., Lindsey N., Gridley D.S. Gene expression analysis of oxidative stress and apoptosis in proton-irradiated rat retina. In Vivo. 2010. V. 24. № 4. P. 425-430. 51. Mao X.W., Pecaut M.J., Stodieck L.S., Ferguson V.L., Bateman T.A., Bouxsein M., Jones T.A., Moldovan M., Cunningham C.E., Chieu J., Gridley D.S. Spaceflight Environment Induces Mitochondrial Oxidative Damage in Ocular Tissue. Radiat Res. 2013. V. 180. № 4. P. 340-350. 52. Marc R.E., Jones B.W., Watt C.B., Strettoi E. Neural remodeling in retinal degeneration. Prog Retin Eye Res. 2003. V. 22. P. 607-655. 53. Marigo V. Programmed cell death in retinal degeneration: targeting apoptosis in photoreceptors as potential therapy for retinal degeneration. Cell Cycle. 2007. V. 6. P. 652–655. 54. Miyachi Y., Kasai H., Ohyama H., Yamada T. Changes of aggressive behavior and brain serotonin turnover after very low-dose X-irradiation of mice. Neurosci Lett. 1994. V.175. P. 92–94. 55. Monroe A.T., Bhandare N., Morris C.G., Mendenhall W.M. Preventing radiation retinopathy with hyperfractionation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 2005. V. 61. № 3. P. 856-864. 56. Nouspikel T. DNA repair in differentiated cells: some new answers to old questions. Neuroscience. 2007. V.145. P. 213–1221. 57. Nouspikel T., Hanawalt P.C. DNA repair in terminally differentiated cells. DNA Repair (Amst). 2002. V.1. P. 59–75. 58. Olive P.L. DNA damage and repair in individual cells: applications of the comet assay in radiobiology. Int. J. Radiat. Biol 1999. V.75. № 4. P. 395-405. 91 59. Ostling O., Johanson K.J. Microelectrophoretic study of radiationinduced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 123. №1. P. 291-298. 60. Otani A., Kojima H., Guo C., Oishi A., Yoshimura N. Low-dose-rate, low-dose irradiation Delays neurodegeneration in a model of retinitis pigmentosa. Am. J. Pathol. 2012. V. 180. №1. P. 328-336. 61. Parsons J.T., Bova F.J., Mendenhall W.M., Million R.R., Fitzgerald C.R. Response of the normal eye to high dose radiotherapy. Oncology (Williston Park). 1996. V. 10 № 6. P. 837-847. 62. Perrers-Taylor M., Brinkley D., Reynolds T. Choroido-retinal damage as a complication of radiotherapy. Acta Radiologica: Therapy, Physics, Biology. 1965. V.3. P. 431-440. 63. Petrin D., Baker A., Coupland S.G., Liston P., Narang M., Damji K., Leonard B., Chiodo V.A., Timmers A., Hauswirth W., Korneluk R.G., Tsilfidis S. Structural and Functional Protection of Photoreceptors from MNU-Induced Retinal Degeneration by the X-Linked Inhibitor of Apoptosis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003. V. 44. P. 2757–2763. 64. Sabourin M., Osheroff N. Sensitivity of human type II topoisomerases to DNA damage: stimulation of enzyme-mediated DNA cleavage by abasic, oxidized and alkylated lesions. Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. P. 1947–1954. 65. Salvin J.H., Hendricks D. Ophthalmology manifestations of pediatric cancer treatment. Curr Opin Ophthalmol. 2012. V. 23. № 5. P. 394-9. 66. Sannita W.G., Narici L., Picozza P. Positive visual phenomena in space: A scientific case and a safety issue in space travel. Vision Res. 2006. V. 46. № 14. P. 2159-2165. 67. Sannita W.G., Peachey N.S., Strettoi E., Ball S.L., Belli F., Bidoli V., Carozzo S., Casolino M., Fino L.D., Picozza P., Pignatelli V., Rinaldi A., Saturno M., Schardt D., Vazquez M., Zaconte V., Narici L. Electrophysiological responses of the mouse retina to 12C ions. Neuroscience letters. 2007. V. 416. P. 231-235. 92 68. Schmid K.E., Kornek G.V., Scheithauer W., Binder S. Update on ocular complications of systemic cancer chemotherapy. Surv Ophthalmol. 2006. V. 51 №1. P. 19-40. 69. Schrogel P., Distel L., Kober L., Pizzolotto C., Teufel A., Vogel C., Eyrich W. Investigation of DNA double-strand breaks induced by high-LET protons. 2009. P. 103-104. 70. Simonatto M., Latella L., Puri P.L. DNA Damage and Cellular Differentiation: More Questions Than Responses J. Cell. Physiol. 2007. V. 213. P. 642–648. 71. Siu T.L., Morley J.W., Coroneo M.T. Toxicology of the retina: advances in understanding the defence mechanisms and pathogenesis of drug- and lightinduced retinopathy. Clinical and Experimental Ophthalmology. 2008. V. 36. P. 176–185. 72. Srinivasula S.M., Hegde R., Saleh A., Datta P., Shiozaki E., Chai J., Lee R.A., Robbins P.D., Fernandes-Alnemri T., Shi Y., Alnemri E.S. A conserved XIAP-interaction motif in caspase-9 and Smac/DIABLO regulate caspase activity and apoptosis. Nature. 2001. V. 410. P. 112-116. 73. Stitt A.W., Anderson H.R., Gardiner T.A., McIntyre I., Archer D.B. The combined effects of diabetes and ionising radiation on the rat retina: an ultrastructural study. Curr Eye Res. 1994. V.13. P. 79-86. 74. Strauss O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiol Rev. 2005. V. 85. P. 845–881. 75. Taverna P., Liu L., Hwang H., Hanson A.J., Kinsella J., Gerson S.L. Methoxyamine potentiates DNA single strand breaks and double strand breaks induced by temozolomide in colon cancer cells. Mutat. Res. 2001. V. 485. P. 269– 281. 76. Thorne M.C. Regulataing exposure of the lens of the eye to ionizing radiation. J. Radiol. Prot. 2012. V. 32. P. 147-154. 93 77. Tronov V.A., Konoplyannikov M.A., Nikolskaya T.A., Konstantinov E.M. Apoptosis of unstimulated human lymphocytes and DNA strand breaks induced by the topoisomerase II inhibitor etoposide (VP-16). Biochemistry (Mosc). 1999. V. 64. P. 345-352. 78. Tsubura A., Lai Y.C., Miki H., Sasaki T., Uehara N., Yuri T., Yoshizawa K. Review: Animal models of N-Methyl-N-nitrosourea-induced mammary cancer and retinal degeneration with special emphasis on therapeutic trials. In Vivo. 2011. V. 25. №1. P. 11-22. 79. Tsubura A., Yoshizawa K., Kuwata M., Uehara N. Animal models for retinitis pigmentosa induced by MNU; disease progression, mechanisms and therapeutic trials. Histol. Histopathol. 2010. V. 25. P. 933-944. 80. Valarde M., Fortoul T.I., Diaz-Barriga F., Mejia J., del Castillo E.R. Induction of genotoxicity by cadmium chloride inhalation in several organs of CD-1 moice. Mutagenesis. 2000. V. 15. P. 109-114. 81. Valarde M., Trejo C., Rojas E. Is the capacity of lead acetate and cadmium chloride to induce genotoxic damage due to direct DNA-metal interaction? Mutagenesis. 2001. V. 18. P. 265-270. 82. Varga-Weisz P.D., Wilm M., Bonte E., Dumas K., Mann M., Becker P.B. Chromatin-remodelling factor CHRAC contains the ATPases ISWI and topoisomerase II. Nature. 1997. V. 388. P. 598–602. 83. Vazquez M.E., Kirk E. In vitro neurotoxic effects of 1 GeV/n iron particles assessed in retinal explants. Adv Space Res. 2000. V. 25. №10. P. 20412049. 84. Walsh K., Perlman H. Cell cycle exit upon myogenic differentiation. Curr. Opin. Genet. Dev. 1997. V.7. P. 597–560. 85. Wang A.,L., Lukas T.J., Yuan M., Neufeld A.H. Age-related increase in mitochondrial DNA damage and loss of DNA repair capacity in the neural retina. Neurobiol Aging. 2010. V. 31. P. 2002-2010. 94 86. Williams G.R, Lett J.T. Damage to the photoreceptor cells of the rabbit retina from 56Fe ions: effect of age at exposure. Advances in Space Research. 1996. V.18. P. 55-58. 87. Williams G.R., Lett J.T. Effects of 40Ar and 56Fe ions on retinal photoreceptor cells of the rabbit: implications for manned missions to Mars. Advances in Space Research. 1994. V.14. P. 217-220. 88. Wohl S.G., Schmeer S.W., Friese T., Witte O.W., Isenmann S. In Situ Dividing and Phagocytosing Retinal Microglia Express Nestin, Vimentin, and NG2 In Vivo. PLoS ONE. 2011. V.6. №8. P. 1-18. 89. Xu G. Z. Apoptosis in human degenerations. Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 1996. V.9. P. 411-430. 90. Xu H., Yang J.N., Li X.K., Zheng Q., Zhao W., Su Z.J., Huang Y.D. Retina protective effect of acidic fibroblast growth factor after canceling its mitogenic activity. J Ocul Pharmacol Ther. 2008. V.24. №5. P. 445-51. 91. Yamada M., Wong F.L., Fujiwara S., Akahoshi M., Suzuki G. Noncancer disease incidence in atomic mobm survivors. 1958-1998. Radiat. Res. 2004. V.161. №6. P. 622-632. 92. Yang L., Li D., Chen J., Yang J., Xue L., Hu S., Wu K. Microarray expression analysis of the early N-methy-N-nitrosourea-induced retinal degeneration in rat. Neurosci Lett. 2007 May 11. V.418. №1. P. 38-43. 93. Yoshizawa K., Nambu H., Yang J., Oishi Y., Senzaki H., Shikata N., Miki H., Tsubura A. Mexhanisms of photoreceptor cell apoptosis induced by Nmethyl-N-nitrosourea in Sprague-Dauley rats. Lab. Invest. 1999. V.79. P. 13591367. 94. Young R.W. Cell differentiation in the retina of the mouse. Anat Rec. 1985. V.212. №2. P. 199-205. 95. Yuge K., Senzaki H., Nakao I., Miki H., Uyama M., Tsubura A. Nmethyl-N-nitrosourea-induced photoreceptor apoptosis in the mouse retina. In Vivo. 1996. V.10. P. 483-488.
