Диссертация Маркова А. А. - Российский онкологический

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
ИМЕНИ Н.Н.БЛОХИНА
На правах рукописи
Маркова Алина Александровна
МЕХАНИЗМЫ ГИБЕЛИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ ДЕЙСТВИИ
НОВЫХ КАТИОННЫХ ГЛИЦЕРОЛИПИДОВ
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
по специальности 14.01.12 «онкология»
Научный руководитель - доктор медицинских наук А.А.Штиль
Москва 2014
1
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
6
12
1. Актуальность проблемы
12
2. Новизна темы
13
3. Научно-практическая значимость исследования
14
4. Цель работы
14
5. Задачи
14
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
16
1. Фосфатсодержащие противоопухолевые липиды
16
1.1.Эдельфозин
17
1.2.Илмофозин
19
1.3.Милтефозин
20
1.4.Перифозин
22
1.5.Эруфозин и эрицилфосфохолин
23
2. Бесфосфорные глицеролипиды алкильного типа с положительно
25
заряженным полярным доменом
3. Апоптотическая гибель опухолевых клеток при действии
фосфатсодержащих липидов
30
3.1.Механизм действия эдельфозина и его аналогов,
опосредованный изменениями цитоплазматической мембраны
31
3.2.Механизм действия эдельфозина и его аналогов, опосредованный
локализацией в эндоплазматическом ретикулуме
36
3.3.Развитие митохондриального пути апоптоза при действии
фосфатсодержащих противоопухолевых липидов
2
38
4. Механизмы гибели опухолевых клеток
4.1.Рецептор-опосредованный (внешний) апоптоз
39
40
4.2.Митохондриальный (внутренний) апоптоз. Каспазозависимый
и каспазонезависимый пути
42
4.3. Некроз, регулируемый некроз, некроптоз
45
4.4.Аутофагия
46
4.5. «Митотическая катастрофа»
47
4.6. Аноикис
48
4.7. Энтоз
48
4.8. Партанатоз
49
5. Протеинкиназы как возможные мишени противоопухолевых
липидов
49
5.1.Протеинкиназы С
50
5.2. Протеинкиназа Met
53
5.3. Протеинкиназа Src
54
5.4. Киназа инсулинового рецептора
56
5.5. Протеинкиназа Pim-1
56
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
59
1. Культивируемые клеточные линии
59
2. Препараты для исследований
59
3. МТТ-тест для исследования цитотоксичности
61
4. Исследование действия липидов на лимфоциты
61
5. Исследование способности липидов повреждать мембрану
эритроцитов
62
6. Исследование способности липидов повреждать смоделированную
мембрану липосом
62
3
7. Окраска клеток пропидия иодидом для исследования изменений
клеточного цикла
63
8. Обратная транскрипция и ПЦР (RT-PCR)
63
9. ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)
65
10. Определение белков методом иммуноблоттинга
66
11. Окрашивание клеток аннексин V- пропидия иодид
68
12. Исследование межнуклеосомной деградации ДНК
68
13. Проверка изменения межмембранного потенциала митохондрий
при действии липидов
69
14. Наблюдение локализации флуоресцентно-меченного липида в
клетке
70
15. Накопление липида 6FL в клетках С6
70
16. Исследование способности липидов к ингибированию
протеинкиназ в тест-системе Streptomyces lividans aphVIII+
17. Скрининг протеинкиназ как возможных мишеней действия ипидов
70
71
18. Исследование влияния липидов на функционирование
топоизомеразы I
71
19. Определение параметров связывания липид-ДНК
72
20. Моделирование возможного взаимодействия липидов с ДНК и
топоизомеразой I
73
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Исследование цитотоксичности катионных глицеролипидов
76
79
2. Исследование способности липидов повреждать мембрану
эритроцитов и смоделированную мембрану липосом
3. Исследование изменений клеточного цикла
3.1. Окраска клеток пропидия иодидом
4
83
85
85
3.2. Изучение влияния катионных липидов на уровень p21waf1/cip1
86
4. Определение типа гибели опухолевых клеток при действии
катионных липидов
89
4.1. Окрашивание клеток аннексин V- пропидия иодид
89
4.2. Исследование межнуклеосомной деградации ДНК
91
4.3. Определение роли процессированного PARP и каспаз 3, 9, 12
в апоптозе, индуцированном липидами
91
4.4. Проверка изменения межмембранного потенциала
митохондрий при действии липидов
93
4.5. Исследование влияния р53 на апоптоз, опосредованный
действием липидов
95
5. Поиск мишеней действия липидов
96
5.1. Наблюдение локализации флуоресцентно-меченного липида
в клетке
97
5.2. Скрининг протеинкиназ как возможных мишеней для липида
100
6. Поиск потенциальных мишеней для липидов при условии их
модификации
101
6.1. Исследование влияния липидов на функционирование
топоизомеразы I
102
6.2.Определение параметров связывания липид-ДНК
104
6.3. Моделирование возможного взаимодействия липидов с ДНК
и топоизомеразой I
106
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
110
ВЫВОДЫ
113
БЛАГОДАРНОСТИ
114
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
115
5
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ABL - Abelson murine leukemia viral oncogene homolog
ADP (АДФ) - Adenosine diphosphate
AIF- Apoptosis-inducing factor
APS - Ammonium persulfate
ASK - Apoptosis signal-regulating kinase
ATG – Autophagy
BAD - Bcl-2-associated death promoter
BCR - B-cell receptor
Bid - BH3-interacting domain death agonist
BSA - Bovine serum albumin
CASMER - Cluster of apoptotic signaling molecule-enriched rafts
CCT - CTP:phosphocholine cytidyltransferase
Cdk - Cyclin-dependent kinase
CDP-холин - Cytidine 5′-Diphosphocholine
CHOP - C/EBP homologous protein growth arrest
cIAPs - Cellular inhibitor of apoptosis proteins
CYLD – Cylindromatosis
DAG – Diacylglycerol
6
DAPK - Death-associated protein kinase
DCC - Deleted in colorectal carcinoma
DD - Death Domain
DED - Death-effector domain
DIABLO - Direct IAP-binding protein with low pI
DISC - Death-inducing signaling complex
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium
DOPC – 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine
DOPE – Dioleoylphosphatidylethanolamine
EGF - Epidermal growth factor
ENDOG - Endonuclease G
ERK - Extracellular-signal-regulated kinase
ERMES - ER-mitochondria encounter structure
FADD - Fas-Associated protein with Death Domain
Hal – Галогенид-ион
HGF/SF - Hepatocyte growth factor/scatter factor
Hsp90 - Heat shock protein 90
HTRA2 - High temperature requirement protein A2
IAP - Inhibitor of apoptosis protein
7
IGF - Insulin-like growth factor
IGFBP - Insulin-like growth factor binding protein
IgG - Immunoglobulin G
IR – Insulin receptor
IRS - Insulin receptor substrate
JAK - Janus kinase
JNK - c-Jun N-terminal kinase
KB - Kinase-Glo® Plus Buffer
LC - Light chain
LPC - 2-lysophosphatidylcholine (1-acyl-sn-glycero-3- phosophocholine)
MAPK - Mitogen activated protein kinases
MARCKS - Myristoylated alanine-rich C-kinase substrate
MTT-тест – «Methylthiazol Tetrazolium Assay» - тест на цитотоксичость, выявляющий
способность дегидрогеназ живых клеток восстанавливать 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5дифенилтетразолия бромид в формазан
NF-κB - Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
PARP - Poly (ADP-ribose) polymerase
PBS - Phosphate buffered saline
PC – Phosphatidyl choline
PDGF - Platelet-derived growth factor
8
PH-домен - Pleckstrin-homology domain
PI – Propidium iodide
PI(3,4,5)P3 - Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate
PI(4,5)P2 - Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphatePI3K – Phosphoinositide 3 - kinase
PIM-1 - Proviral integration Moloney virus
PKB - Protein kinase B
PKC - Protein kinase С
PLAD - Pre-ligand assembly domain
PLC - Phospholipase C
PP2A - Protein phosphatase 2A
PTE-ET - (all-(E)-1-O-(15’-phenylpentadeca-8’,10’,12’,14’-tetraenyl)-2-O-methyl-rac-glycero3-phosphocholine)
PTPC - Permeability transition pore complex
PTRI-ET (all-(E)-1-O-(15’-phenylpentadeca-10’,12’,14’-trien-8’-ynyl)-2-O-methyl-rac-glycero3-phosphocholine)
RIP - Receptor-interacting protein kinase
RIPA - Radioimmunoprecipitation assay
ROCK1 - RHO-associated, coiled-coil containing protein kinase 1
SDS - Sodium dodecyl sulfate
9
SH-домен – SRC Homology Domain
SMAC - Second mitochondria-derived activator of caspases
SQSTM1 - Sequestosome 1
STAT - Signal Transducer and Activator of Transcription
TAB - TAK1-binding protein
TAK1 - TGFb-activated kinase 1
TBST - Tris-Buffered Saline and Tween 20 mixture
TEMED - Tetramethylethylenediamine
TNF - Tumor necrosis factor
TP – Tumor protein
TRAF - TNFR-associated factor
TRAIL -TNF-related apoptosis-inducing ligand
Yn-BDP-ET - (1-O-(13’-(1’’,3’’,5’’,7’’-tetramethyl-4’’,4’’-difluoro-4’’-bora-3a’’,4a’’-diaza-s
indacen-2’’-yl)tridec-12’-ynyl)-2-O-methyl-rac-glycero-3-phosphocholine)
АТР (АТФ) – Adenosine triphosphate
БЭ – Бромистый этидий
ДМСО - Диметилсульфоксид
ДНК – Дезоксирибонуклеиновая кислота
ДОФХ – 1,2-диолеил-sn-глицеро-3-фосфохолин
10
ДТТ – Дитиотреитол
ЖКТ – Желудочно-кишечный тракт
ПКГ – Пластический комплекс Гольджи
ПЦР (PCR) – Полимеразная цепная реакция
РНК – Рибонуклеиновая кислота
Трис - Трис(гидроксиметил)аминометана
УФ – Ультрафиолет
ФАТ – Фактор активации тромбоцитов
ЭДТА – Этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭПР – Эндоплазматический ретикулум
11
ВВЕДЕНИЕ
1.Актуальность проблемы
Поиск новых
низкомолекулярных соединений-кандидатов в лекарственные
препараты требует комплексирования знаний органической и физической химии,
биохимии, молекулярной биологии, компьютерного моделирования. Исследования новых
синтетических биологически активных соединений необходимы для определения
механизма их действия и для выявления связей между компонентами химической
структуры и аспектами биологической активности.
Катионные глицеролипиды как класс синтетических соединений возник на основе
алкильных аналогов фактора активации тромбоцитов – эдельфозина, илмофозина,
милтефозина, эрицилфосфохолина и эруфозина. Эти фосфатсодержащие алкильные
липиды
проявляют
противоопухолевую,
антибактериальную
и
противовирусную
активность. В настоящее время они активно исследуются и находятся на разных стадиях
биологических испытаний в рамках проектов создания лекарственных препаратов на их
основе. Недостатки фосфатсодержащих липидов, в частности, эдельфозина, такие как
высокий гемолитический эффект, недостаточная селективность противоопухолевого
действия и метаболическая нестабильность, стали основанием к исключению фосфатной
группы из их структуры – синтезу положительно заряженных глицеролипидов.
Представители катионных глицеролипидов, имеющие в своей структуре полярные
домены различного типа, перспективны для создания противоопухолевых препаратов
благодаря способности накапливаться в пролиферирующих клетках и вызывать их гибель,
сопоставимую с эффектом фосфатсодержащих предшественников.
Структура
модификации
их
исследуемых
молекул
соединений
для
получения
позволяет
проводить
соединений
с
многообразные
оптимизированными
противоопухолевыми характеристиками. При химической модификации полярного
12
домена в глицеролипиде имеются возможности создать новые производные, активные как
самостоятельные цитотоксические агенты по отношению к опухолевым клеткам, но
малоактивные по отношению к нормальным клеткам. Актуальность темы определяется
важностью установления молекулярных механизмов гибели опухолевых клеток при
действии
новых
катионных
глицеролипидов
-
прототипов
перспективных
противоопухолевых препаратов.
2. Новизна темы
В литературе отсутствуют систематические исследования молекулярных событий,
сопровождающих смерть непластических клеток в ответ на действие катионных
глицеролипидов. Недостаточны знания о внутриклеточных мишенях, взаимодействие с
которыми обуславливает противоопухолевый эффект изучаемого класса соединений. В
рамках данной работы впервые проведены следующие исследования:

выявлена cпособность новых катионных глицеролипидов вызывать гибель клеток
рака молочной железы MCF7, толстой кишки HCT116, аденокарциномы SCOV3,
лейкоза К562, лейкоза HL60;

идентифицирован тип клеточной гибели, вызываемой указанным классом
соединений;

установлены внутриклеточные мишени, взаимодействие новых катионных
глицеролипидов с которыми существенно для проявления цитотоксического
эффекта;

исследовано накопление и распределение в опухолевых клетках производного
активного катионного глицеролипида с использованием флуоресцентного зонда;

проведено исследование селективности действия новых противоопухолевых
агентов изучаемого класса на неопухолевых лимфоцитах и фибробластах
человека;
13

определена гемолитическая активность исследуемых соединений для перехода к
испытаниям на животных моделях;

исследована способность новых катионных глицеролипидов модулировать
активность топоизомеразы I типа и определены параметры связывания липидов с
их потенциальной мишенью - ДНК, что необходимо для дальнейшей
модификации соединений этого класса с целью их направленной доставки в ядро.
3.Научно-практическая значимость исследования
Исследование
механизмов
цитотоксического
действия
новых
катионных
глицеролипидов позволило обосновать эффективность этого химического класса для
лечения онкологических заболеваний. Определение параметров связывания изучаемых
соединений с ДНК дало основу для дальнейших модификаций катионных глицеролипидов в
аспекте их действия на новую для данного класса мишень противоопухолевой терапии.
4.Цель работы
Изучение молекулярных механизмов действия новых химических соединений класса
катионных глицеролипидов – кандидатов в противоопухолевые препараты.
5.Задачи
1. Установить
антинеопластическое
действие
модификационного
ряда
новых
катионных глицеролипидов с полярными доменами различной структуры и выявить
соединение-лидер, обладающее наибольшей противоопухолевой активностью.
2. Провести
исследование
влияния
новых
катионных
глицеролипидов
на
неопухолевые клетки.
3. Исследовать молекулярные механизмы нарушений клеточного цикла и гибели
опухолевых клеток в ответ на действие катионных глицеролипидов, сопоставить
14
полученные данные с известными аспектами действия соединения-прототипа
эдельфозина.
4. Изучить
механизм
взаимодействия
с
потенциальными
внутриклеточными
мишенями (ДНК, топоизомераза I) новых катионных глицеролипидов с различными
структурными доменами.
15
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.Фосфатсодержащие противоопухолевые липиды
Установление в 1979 г. структуры фактора активации тромбоцитов (ФАТ, 1-алкил2-ацетил-sn-глицеро-3-фосфорилхолин, 1, рис.1) – природного биорегулятора широкого
спектра действия – привело к открытию новых механизмов клеточной регуляции,
осуществляемых этим уникальным фосфолипидом [1]. ФАТ активирует специфические
рецепторы (ФАТ-рецепторы) и стимулирует дегрануляцию и агрегацию тромбоцитов и
нейтрофилов, увеличивает проницаемость кровеносных сосудов, опосредует ряд
воспалительных и аллергических процессов [2-4]. Поскольку ФАТ вызывает выраженное
тромбоцит-агрегирующее действие, само это соединение не может быть использовано в
терапевтических целях. Синтезированы многочисленные структурные аналоги ФАТ и
исследованы их биологические эффекты.
1
Рис.1 Фактор активации тромбоц
Многие соединения липидной природы могут быть как агонистами, так и
антагонистами ФАТ-рецепторов. Так, модификации типа связи и заместителей в
положениях С(1) и С(2) глицеринового остова обусловливают негативную регуляцию
рецепторов липидными аналогами ФАТ [2, 3]. Действие алкильных глицеролипидов –
структурных аналогов ФАТ - зависит от длины углеводородных заместителей,
формирующих их гидрофобный домен. Одно из направлений таких модификаций
заключается в разработке эффективных агентов для липосомальной доставки экзогенной
16
ДНК в клетки (в частности, для генной терапии) – это соединения, содержащие два
длинноцепочечных заместителя (С12-С18) в гидрофобной части глицеролипида [5-9].
Соединения с короткоцепочечной группой (С1-С4) при С(2) атоме глицерина,
присоединенной простой эфирной связью, проявляют антинеопластическое действие,
приводя к подавлению пролиферации опухолевых клеток, стимуляции их гибели,
ингибированию действия ряда ферментов и активации макрофагов. Эти липиды обладают
противоопухолевым, противовирусным и антибактериальным действием и, в отличие от
многих противоопухолевых лекарств, не вызывают серьезных побочных эффектов [9].
1.1.Эдельфозин
Эдельфозин (1-октадецил-2-метил-rac-глицеро-3-фосфохолин, Et-18-OCH3, 2, рис.
2)
–
алкильный
фосфатсодержащий
глицеролипид,
проявляющий
выраженную
противоопухолевую активность [10, 11] (таблица 1).
2
Рис. 2. Эдельфозин
Таблица 1. Показатели цитотоксичности (IC50) эдельфозина при действии на
линии опухолевых клеток человека. Данные МТТ-теста после 72 часов инкубации
клеток с соединением 2
Линия клеток
Показатель IC50 для эдельфозина, мкМ
HL60 (промиелоцитарный лейкоз)
3,2
HCT116 (рак толстой кишки)
1,6
17
Продолжение таблицы 1
CEM (Т-клеточный лейкоз)
1,5
HUT-78 (Т-клеточная лимфома)
4,5
Namalwa (лимфома Беркитта)
15,3
SKOV3 (аденокарцинома яичника)
4,9
SK-MEL-2 (меланома)
5,4
XF498 (глиома)
4,9
Структура эдельфозина характеризуется наличием метильной группы при С(2)
атоме углерода глицеринового скелета, связанной с ним простой эфирной связью (в
отличие от ФАТ, у которого во 2-м положении глицерина находится ацетильный
заместитель).
Эдельфозин проявляет выраженную противоопухолевую активность и in vivo [12].
Однако
в
клинических
испытаниях
установлено,
что
эдельфозин
в
качестве
самостоятельного лекарственного средства малопригоден для лечения опухолей из-за
высокой гемолитической активности: концентрация эдельфозина, при которой он
вызывает лизис 50% эритроцитов – 16 мкМ [13]. С целью снижения этого клинически
неблагоприятного свойства эдельфозин заключают в липосомы [14]. При создании таких
липосом
в
качестве
(диолеоилфосфатидилэтаноламин),
липида-хелпера
холестерин,
DOPC
использовались
DOPE
(диолеоилфосфатидилхолин).
Наиболее устойчивыми и при этом наименее токсичными для клеток крови оказались
липосомы, содержащие холестерин (50%-ый гемолиз при 661 мкМ эдельфозина) [15, 16].
Эдельфозин прошел II фазу клинических испытаний при лечении немелкоклеточной
карциномы легкого и рака мозга [17, 18]. Также по результатам II фазы клинических
исследований сообщалось о его перспективности при обработке клеток перед
аутологичной трансплантацией костного мозга при терапии острого лейкоза [19].
18
1.2.Илмофозин
Противоопухолевую
активность
проявляет
илмофозин
(1-гексадецилтио-2-
метоксиметил-1,3-пропандиол-фосфохолин, ВМ 41.440, 3, рис.3). Он отличается от
эдельфозина наличием тиоэфирной связи при С(1) атоме глицерина, а также длиной
заместителя, связанного тиоэфирной связью.
3
Рис.3. Илмофозин
Исследования
показали
высокую
антинеопластическую
активность
этого
соединения для различных видов опухолей. Как и эдельфозин, илмофозин вызывает
апоптоз опухолевых клеток [20]. Известны данные о цитотоксичности илмофозина в
субмикромолярных концентрациях по отношению к ряду клеточных линий (таблица 2)
[21].
Таблица 2. Показатели цитотоксичности (IC50) илмофозина при действии на
линии опухолевых клеток человека. Данные МТТ-теста после 72 часов инкубации
клеток с соединением 3.
Линия клеток
Показатель IC50 для илмофозина, мкМ
MCF7 (аденокарцинома молочной железы)
7,2 (R)
19
Продолжение таблицы 2
A427 (аденокарцинома легкого)
20
A549 (аденокарцинома легкого)
7,5 (R)
CCRF/CEM (Т-клеточная лейкемия)
2,8
HeLa (аденокарцинома шейки матки)
9,9
Обнаружено, что для линий MCF7 и А549 оптические изомеры проявляют разную
цитотоксичность:
приведены значения показателей цитотоксичности для R-изомера
относительно хирального центра при 2-м атоме углерода глицеринового остова. Для Sизомера концентрация, необходимая для 50% гибели, на 10 мкМ выше [21]. При
относительно высоких цитотоксических концентрациях и необходимости проводить
энантиоселективный синтез для достижения удовлетворительного противоопухолевого
эффекта илмофозин пока не получил широкое практическое распространение, в отличие
от эдельфозина и его аналогов, проявляющих значительную цитотоксичность для
широкого набора клеточных линий в виде рацемической смеси [22-24]. Фаза I
клинических
испытаний
илмофозина
ограничила
его
максимальную
дозу
для
перорального и внутривенного введения в основном за счет желудочно-кишечной
токсичности [25, 26], и результаты фазы II не показали удовлетворительных результатов
[27, 28].
1.3.Милтефозин
Помимо алкильных антинеопластических липидов, содержащих в своей структуре
глицериновый
остов,
широкое
распространение
получили
липиды,
в
которых
гидрофобный алкильный остаток присоединен непосредственно к фосфатной группе.
Наряду с проявлением противоопухолевых свойств, у этих соединений выявлена высокая
20
антибактериальная и антипаразитарная активность. Пример указанных алкильных
фосфолипидов - милтефозин (гексадецилфосфохолин, 4, рис.4).
4
Рис. 4. Милтефозин
Милтефозин проявляет противоопухолевое действие по отношению к ряду линий
клеток (таблица 3) [29, 30]. Однако у этого соединения выявлен неблагоприятный
гемолитический эффект: концентрация милтефозина, при которой он вызывает лизис 50%
эритроцитов – 38,3 мкМ [29, 31]. В связи с этим потенциал использования милтефозина
ограничивается пероральным и местным применением.
Таблица 3. Показатели цитотоксичности (IC50) милтефозина при действии на
линии опухолевых клеток человека. Данные МТТ-теста после 72 часов инкубации
клеток с соединением 4
Линия клеток
IC50 для милтефозина, мкМ
PC3 (аденокарцинома простаты)
13,8
MCF7 (аденокарцинома молочной железы)
17,3
A431 (плоскоклеточная карцинома)
24,6
U937
(лейкемическая
моноцитарная
7,9
лимфома)
В отличие от эдельфозина, проявляющего широкий спектр антинеопластической
активности, к милтефозину чувствительны немногие опухолевые клеточные линии и
21
модели. В клинических исследованиях милтефозин применялся против саркомы мягких
тканей, метастатического колоректального рака, плоскоклеточного рака головы и шеи [32,
33]. Однако эти исследования были прекращены на фазе II, так как пероральные дозы,
необходимые для системного эффекта, были токсичны для желудочно-кишечного тракта.
По этой причине, с момента его появления в качестве препарата Miltex ® в 1992 году в
Германии, клиническое применение милтефозина ограничивается местной обработкой
при лечении рака молочной железы и кожных метастазов. Однако милтефозин широко
исследуется, и оцениваются перспективы его перорального применения для лечения
висцерального и кожного лейшманиоза, а также ряда паразитарных заболеваний [34-37].
1.4.Перифозин
Структура перифозина (октадецил-(N,N-диметил-пиперидин-4-ил)-фосфат, D 21266, 5,
рис.5) отличается от милтефозина наличием N,N-диметил-пиперидиниевого фрагмента,
присоединенного к алкилфосфатной цепи, вместо холина. Такая замена структуры
полярного домена привела к увеличению его стабильности и периода полувыведения в
физиологических условиях [38].
5
Рис.5. Перифозин
Как и милтефозин, перифозин рассматривается для перорального применения,
поскольку он хорошо накапливается в ЖКТ. Известны данные о субмикромолярной
цитотоксичности перифозина по отношению к ряду опухолевых клеток (таблица 4) [39,
40].
22
Таблица 4. Показатели цитотоксичности (IC50) перифозина при действии на
линии опухолевых клеток человека. Данные МТТ-теста после 24 часов инкубации
клеток с соединением 5
Линия клеток
IC50 для перифозина,
мкМ
15,8
THP1 (острый моноцитарный лейкоз)
MV4-11
(бифенотипический
B-
2,7
миеломоноцитарный лейкоз)
CEM-S (Т-клеточный лейкоз)
7
Исследования in vivo показали его высокое накопление в опухолевых клетках KB
(эпидермальная карцинома полости рта) [38]. Наблюдалось значительное накопление
перифозина в желудочно-кишечном тракте мышей, в то время как в сердце и тканях мозга
его уровень был относительно низким [38]. По итогам II фазы клинических испытаний
перифозина в качестве средства для лечения рака молочной железы, рака головы и шеи,
сарком мягких тканей, метастатической меланомы, рака простаты, и аденокарциномы
были неудачными [39]. Однако на основании стабильности перифозина и его высокой
способности накапливаться в опухолях он рассматривается как перспективный агент для
использования в сочетании с другими препаратами для химиотерапии, а также в качестве
радиосенсибилизатора [40-44]. Помимо этого, перифозин исследуется для терапии
лейшманиоза, наряду с внедряемым в клиническую практику милтефозином [45].
1.5.Эруфозин и эрицилфосфохолин
В ряду противоопухолевых липидов без глицеринового остова известны эруфозин
(эрицил-N,N,N-триметил-пропаноламинофосфат) 6 и эрицилфосфохолин 7 (рис. 6).
Структуры их гидрофобной части одинаковы между собой и отличаются от милтефозина
длиной алкильной цепи и наличием цис-двойной связи. Эта модификация позволила
добиться наибольшей гидрофобности неполярного домена в ряду фосфатсодержащих
алкильных
липидов,
поскольку
в
водных
23
растворах
эти
липиды
формируют
липосомальные структуры [46]. Это свойство эруфозина и эрицилфосфохолина является
важным, так как оно снижает гемолитическую активность соединения (гемолиз
эритроцитов - 1,3% и 1,6% соответственно при действии 2 мМ, за 100% принят гемолиз,
вызываемый дистиллированной водой [46]), а следовательно, появляется возможность
перейти от перорального введения соединения к внутривенному.
6
7
Рис.6. Эруфозин и эрицилфосфохолин
Эруфозин и эрицилфосфохолин способны проникать через гематоэнцефалический
барьер и накапливаться в опухолевых клетках головного мозга [47]. Цитотоксичность
эруфозина и эрицилфосфохолина по отношению к клеткам опухолей мозга человека
представлена в таблице 5 [46].
Таблица
5.
Показатели
цитотоксичности
(IC50)
эруфозина
и
эрицилфосфохолина при действии на линии опухолевых клеток человека. Данные
МТТ-теста после 72 часов инкубации клеток с соединениями 6, 7
Линия клеток
IC50, мкМ
эруфозин
эрицилфосфохолин
А172 (глиобластома)
29
36
T98G (глиобластома)
35
37
24
Также значимым свойством эруфозина, в отличие от милтефозина и перифозина,
является его цитотоксическая активность по отношению к клеткам лейкоза человека HL60 – показатель IC50 составляет 4,5 мкМ [48], в то время как аналогичной активности по
отношению к этой линии у милтефозина и перифозина не выявлено [49]. Несмотря на
достаточно высокие показатели цитотоксичности, исследования этих соединений
продолжаются in vitro и in vivo, и эруфозин рассматривается как соединение для
химиотерапии в комбинации с цитарабином, этопозидом и идарубицином, а также в
качестве радиосенсибилизатора [48-53].
2.Бесфосфорные глицеролипиды алкильного типа с положительно заряженным
полярным доменом
Интерес к бесфосфорным аналогам глицеролипидов алкильного типа обусловлен
их пролонгированным действием, поскольку, в отличие от фосфорсодержащих липидов,
они не гидролизуются фосфолипазами [54]. Механизмы противоопухолевого действия
бесфосфорных катионных глицеролипидов в настоящее время активно изучаются.
Известно, что представители этого класса могут оказывать цитотоксическое действие на
опухолевые клетки, вызывая клеточный арест и апоптоз, не проявляя гемолитического
эффекта, в отличие от прототипа – эдельфозина [54]. Синтетические катионные
бесфосфорные глицеролипиды, проявляющие сопоставимый с их фосфатсодержащим
предшественником противоопухолевый эффект, можно условно подразделить на три
основные серии:
1. липиды с катионной головкой в форме “обращенного” холина (таблица 6);
2. липиды
с
аммониевой
группой,
глицериновому скелету (таблица 7);
25
присоединенной
непосредственно
к
3. липиды с катионной головкой, присоединенной к глицериновому фрагменту
через спейсерную группу (таблица 8).
Анализ
структурно-функциональной
зависимости
для
этих
соединений
осложняется тем, что разные по природе злокачественные клетки существенно
различаются по чувствительности к липидам [54]. Противоопухолевая активность
глицеролипидов алкильного типа in vitro не всегда коррелирует с активностью in vivo. Так,
увеличение токсичности, вызванное изменением структуры липида, иногда приводит к
снижению
селективности
действия,
что
дает
значительные
различия
эффектов
модифицированного соединения и его предшественника в экспериментах in vivo. Поэтому
можно выявить только самые общие закономерности влияния структуры соединений на
их антинеопластическую активность.
“Обращенные” холины [55-57] – первая группа (таблица 6) - в основном
оказывались менее активными, чем соединения второй и третьей группы, которые
сравнимы по активности с эдельфозином, имеющим показатель цитотоксичности для
клеток промиелоцитарного лейкоза линии HL-60 3,2 мкМ [10].
Отклонение размера
длинноцепочечного алкильного заместителя при атоме С(1) глицерина от интервала С 16–
С18, или замена его на ароматическую систему снижает активность соединения в
отношении клеток HL-60. Так, соединение 8е проявляет низкую активность в пределах
измеряемых концентраций. Удлиннение заместителя при С(2) атоме глицеринового остова
в соединении 8f снижает его цитотоксическую активность. Наличие метокси- или
этоксигруппы при атоме С(2) не сказывается на уровне активности. Однако, присутствие
алкильного заместителя с длиной цепи более пяти атомов углерода резко снижает
активность соединения. Влияние гетероатома (S или О) при атоме С(1) глицерина точно
не выяснено [56].
26
Таблица 6. Концентрации, необходимые для 50%-ного ингибирования роста
неопластических клеток промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 в
ряду липидов с катионной головкой в форме «обращенного» холина
8
Соед.
X
R1
R2
N
IC50, мкМ
8a
S
C16H33
Me
2
4,66
8b
S
C16H33
Et
2
3,72
8c
S
C16H33
Et
3
2,95
8d
S
C18H37
Me
3
3,55
8e
O
Me
2
10
8f
S
C6H11
2
7,15
C16H33
Соединения без спейсерного фрагмента, принадлежащие ко второй серии проявили
заметную цитотоксическую активность [56, 57]. В представленной серии (таблица 7)
изменение типа катионного домена с алифатического на гетероциклический не привело к
снижению цитотоксичности. Соединение 9d, с короткоцепочечным (С8) заместителем при
С(2) атоме глицеринового остова практически не проявило активность.
27
Таблица 7. Концентрации липидов, необходимые для 50%-ного ингибирования роста
неопластических клеток лимфолейкоза человека
HL-60 в ряду
глицеролипидов
присоединенной
с
аммониевой
группой,
непосредственно к глицериновому скелету
9
Соед.
R1
R2
Y+
IC50, мкМ
C16H33
Me
NMe3
1,59
9b
C16H33
Et
NEt3
0,68
9c
C16H33
Et
9d
C8H17
Me
NMe3
9e
C16H33
Me
N
1,01
N
21,15
1,07
Me
9f
C18H37
Et
2,92
N
Me
Среди
соединений
третьей
серии
(таблица
8)
ингибирование
роста
неопластических клеток слегка снижается при увеличении длины спейсерной группы, но
остается близким к активности эдельфозина [56, 58, 59]. Наличие четвертичной
аммониевой группы является необходимым для проявления цитотоксичности по
отношению к опухолевым клеткам, причем пиридиниевые производные более активны
[57].
28
Таблица 8. Концентрации липидов, необходимые для 50%-ного ингибирования роста
неопластических клеток лимфолейкоза человека HL-60 в ряду липидов
с катионной головкой, присоединенной к глицерину через спейсерную
группу
10
IC50,
мкг/мл
Соед.
R1
R2
Z
Q-
10a
C16H33
Me
O(CH2)2
Br
2,30
10b
C16H33
Et
O(CH2)4
Br
1,86
10c
C18H37
Me
O(CH2)2
Cl
1,25
10d
C18H37
Me
(OCH2CH2)2
Cl
1,25
Тип приведенных спейсерных групп не значительно влияет на проивоопухолевый
эффект. Сопоставимую с эдельфозином активность проявили соединения с длиной
спейсера 2-4 метиленовых звена [58, 59].
Приведенные данные позволяют установить общую структуру синтетических
бесфосфорных алкильных катионных глицеролипидов, обладающих противоопухолевой
активностью (11, рисунок 7).
29
11
Рис.7. Общая формула противоопухоолевых бесфосфорных глицеролипидов
Х – O, S;
R1 – длинноцепочечный (С16–С18) алкильный заместитель;
R2 – короткоцепочечный (С1-С4) алкильный заместитель;
Z - может отсутствовать или представлять собой спейсерную группу (C1-C6);
Y+ - аммониевая алифатическая группа с небольшими (С1-С3) заместителями
алкильного типа либо гетероциклическая головка с положительно заряженным
атомом азота;
Q- - противоион (Hal -).
Бесфосфорные алкильные катионные глицеролипиды недостаточно исследованы.
Их
цитотоксичность
для
трансформированных
клеток
(различного
тканевого
происхождения) без значительного повреждения нормальных клеток и гемолитического
эффекта делают этот класс перспективным для создания новых противоопухолевых
соединений и исследования механизмов их действия.
3.Апоптотическая гибель опухолевых клеток при действии фосфатсодержащих
липидов
Основными этапами в исследовании механизма действия противоопухолевых агентов
является определение типа клеточной гибели и особенностей изменения клеточного
цикла, поиск ключевых мишеней и маркеров действия соединения, особенности
изменения клеточной структуры. Эти аспекты изучены в разной степени для
представителей
фосфатсодержащих
алкильных
30
противоопухолевых
липидов
–
эдельфозина, илмофозина, милтефозина, перифозина, эрициофосфохолина и эруфозина.
Известно, что эти липиды вызывают апоптоз опухолевых клеток, инициируют арест
клеточного цикла, изменяют структуру липидных рафтов, проникают в гидрофобные
домены цитоплазмы. В отличие от других противоопухолевых агентов, эти соединения не
проникают в ядро и напрямую не разрушают ДНК, а действуют на уровне
цитоплазматической мембраны и гидрофобных доменов внутриклеточного пространства.
Наиболее
изученный
липид
эдельфозин,
ставший
прототипом
для
ряда
фосфатсодержащих и бесфосфорных противоопухолевых липидов, вызывает типичные
апоптотические изменения опухолевых клеток: блеббинг цитоплазматической мембраны,
образование
комплекса
трансмембранного
DISC
потенциала
(«death-inducing
митохондрий,
signaling
активацию
complex»),
падение
эффекторных
каспаз,
деградацию ядерной ДНК [60, 61]. Эдельфозин и его аналоги инициируют апоптоз,
накапливаясь за счет своей амфифильности в различных гидрофобных компартментах
опухолевой
клетки:
липидных
рафтах
цитоплазматической
мембраны,
эндоплазматическом ретикулуме и/или внешней мембране митохондрий [12, 52, 62-64].
Это распределение во многом зависит от типа опухолевых клеток: для лейкозов в
основном характерны изменения на уровне липидных рафтов, а для клеток солидных
опухолей характерна его локализация в эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях
[65].
3.1.Механизм
действия
эдельфозина
и
его
аналогов,
опосредованный
изменениями цитоплазматической мембраны
Наличие длинного гидрофобного углеводородного звена в структуре алкильных
фосфолипидов обуславливает возможность их встраивания в липидные мембраны клетки.
Эдельфозин и его аналоги взаимодействуют с липидными рафтами цитоплазматической
мембраны и проявляют аффинность к холистерину [14, 66]. Ключевую роль в этом играет
31
геометрия липидов: соотношение размеров поперечного сечения полярной «головки» и
гидрофобного фрагмента позволило смоделировать и подтвердить экспериментально
липид-липидные взаимодействия [14]. Молекулы фосфатидилэтаноламинов и стеролов
имеют
меньшее
сечение
полярной
головной
группы,
чем
неполярной
части
(конусообразная форма). У эдельфозина и его аналогов, наоборот, полярная часть
молекулы больше, чем неполярная (форма перевернутого конуса). За счет такого
взаимодействия прямых и перевернутых конусообразных структур формируется
стабильный бислой, что объясняет накопление эдельфозина и его аналогов в липидных
рафтах [67].
Показано, что фосфатсодержащие липиды влияют на активность ряда белков на
уровне клеточной мембраны. Эдельфозин, встроенный в липидные рафты, вмешивается в
процесс ассоциации Raf-1 с мембраной, что уменьшает киназную активность Raf-1 [68].
Для
функционирования
митоген-активированных
протеинкиназ
MAPK
требуется
связывание Raf-1 с мембраной и его последующее взаимодействие с активированным
белком Ras. Эдельфозин напрямую не взаимодействует с МАРК или Raf-1, однако его
присутствие в мембране вызывает ингибирование этого сигнального пути [69, 70]. Также
эдельфозин ингибирует действие фосфолипаз. Он изменяет ассоциацию фосфолипазы С
PLC-β1 с ее прямым активатором Gαq/11 [71]. Фосфолипаза D, стимулированная
форболовыми эфирами, ингибируется эдельфозином и илмофозином
[72, 73].
Аналогичный эффект наблюдается и при действии эдельфозина и его аналогов на
протеинкиназу С (РКС) [74]. Как известно, этот фермент также стимулируется
форболовыми эфирами, и наряду с ацильными глицеролипидами, глицеролипиды
алкильного типа также способны модулировать его активность. Среди алкильных
фосфолипидов сильным ингибитором протеинкиназы С классического типа стал
милтефозин с показателем IC50, равным 12 мкМ [75]. Эдельфозин и его структурные
аналоги также являются ингибиторами РКС, как классической (РКСα), так и нетипичной
32
(РКСε) изоформ [74]. Активность РКС классического типа подвержено большему
влиянию эдельфозина, чем РКС нетипичной изоформы. При сравнении уменьшения
активности
РКС
под
действием
аналогов
эдельфозина
наблюдается
большее
ингибирование при наличии простых эфирных связей, чем сложноэфирных, между
алкильными фрагментами и глицериновым остовом [74].
Важным событием для инициации гибели опухолевых клеток является активация
рецепторов смерти. Эдельфозин и перифозин вызывают кластеризацию рафтов,
активацию и олигомеризацию рецепторов смерти Fas/CD95 независимо от присутствия их
лиганда FasL, что приводит к апоптозу опухолевой клетки. При активации этих
рецепторов формируется комплекс DISC [76], содержащий Fas/CD95, FADD и прокаспазу
8, которые взаимодействуют друг с другом через домены смерти (DD), присутствующие в
Fas и FADD и эффекторные домены смерти (DED), присутствующие в FADD и прокаспазе
8, образуя олигомерный комплекс [77-79]. Сформировавшийся комплекс DISC приводит к
активации каспазы 8 с последующей активацией эффекторных каспаз 3,6,7 [80, 81] или к
активации Bid, транслоцирующегося в липидных рафтах и являющегося важным
компонентом сигналинга между рецепторами смерти и митохондриями, с последующим
развитием митохондриального пути апоптоза [82, 83]. Кроме того, на лейкозных клетках
Jurkat и Peer при действии эдельфозина и перифозина описан апоптотический сигнальный
путь FAS-Daxx-JNK [62, 84-86]. Исследования апоптотического действия эдельфозина на
лейкозные клетки выявили помимо образования комплекса DISC его ассоциацию со
следующими сигнальными молекулами Bid, JNK и прокаспазой 10 в кластер обогащенных
апоптотическими сигнальными молекулами рафтов «CASMER» (cluster of apoptotic
signaling molecule-enriched rafts) [86-89]. Таким образом, после действия эдельфозина
мембранные
рафты
служат
в
качестве
платформы
сборки
различных
кросс-
взаимодействующих сигнальных молекул и участвуют в передаче сигналов от Fas/CD95.
После образования комплекса CASMER в ответ на накопление эдельфозина и его
33
аналогов в липидных рафтах в зависимости от типа клеток реализуется непосредственно
сигнализация к апоптотической гибели клетки (Fas/CD95, Fadd, каспаза-8, JNK) и/или
ингибируется действие сигнальных путей, необходимых для выживания опухолевой
клетки
(ERK,
Аkt).
Баланс
между
этими
процессами
может
модулироваться
перераспределением и локальным накоплением молекул белков в рафтах [85, 90]. В этом
контексте, обработка эдельфозином клеток Т-клеточного лейкоза Jurkat способствует
встраиванию белка теплового шока 90 (Hsp90) и JNK в липидные рафты, что приводит к
активации JNK [85]. Шаперон Hsp90 сверхэкспрессируется во многих опухолевых клетках
и способствует принятию необходимой конформации синтезированными в клетке
белками, в том числе обеспечивающими рост опухолевых клеток, например HER-2/Erb2,
Akt, Raf-1, Bcr-Abl и мутантного p53 [91]. Действие эдельфозина способствует отдалению
Hsp90 от белков, ответственных за опухолевый рост, и вместо этого он способствует
развитию апоптоза, взаимодействуя с белками комплекса CASMER [85]. Таким образом,
JNK становится новой мишенью белка Hsp90, при условии, что обе молекулы
сосредоточены в липидных рафтах [85].
Присутствие эдельфозина, милтефозина и перифозина в липидных рафтах
приводит также к ингибированию PI3K-Akt/PKB сигнального пути [92-94]. Серинтреониновая протеинкиназа Akt в активированном виде подавляет апоптоз путем
ингибирования проапоптотического белка Bad и прокаспазы 9. Механизмом инактивации
Akt-киназы при действии эдельфозина, перифозина и милтефозина является ее
вытеснение из структуры липидных рафтов, что вызывает активацию р21 и апоптоз [9295]. На примере перифозина это показано более подробно: нарушаются мембранные
микродомены, ответственные за активацию Akt-киназы, и/или вытесняются ее лиганды
PI(4,5)P2 и PI(3,4,5)P3 от РН-домена Akt, также Akt не может принять конформацию,
необходимую для ее активации путем фосфорилирования по Thr308 и Ser473 [93, 94, 96,
97].
34
Важным аспектом действия эдельфозина и его аналогов на уровне клеточной
мембраны является угнетение синтеза фосфатидилхолинов (РС) [98-102]. Поскольку РС –
важнейший компонент клеточных мембран млекопитающих, их усиленный синтез
необходим при делении клеток. Эдельфозин ингибирует фосфохолинцитидилтрансферазу
(ССТ), что приводит к уменьшению синтеза фосфатидилхолинов [98-101]. В процессе
биосинтеза РС поглощенные клеткой холины фосфорилируются холин-киназами, а затем
ССТ катализирует перенос холина от фосфохолина на цитидин-5'-дифосфат (CDP-холин)
[103], который используется холин-трансферазой вместе с диацилглицерином в синтезе
РС [104-106]. ССТ – ключевой фермент в регуляции биосинтеза РС [104-106]. Эдельфозин
и милтефозин ингибируют de novo синтез РС на этапе ССТ за счет своей схожести с
природным
регулятором
ее
физиологической
активности
LPC
[98-102].
Такое
конкурентное ингибирование препятствует синтезу CDP-холина, что угнетает синтез РС.
Этот эффект, продемонстрированный при исследовании эдельфозина и милтефозина,
вызывает арест в G2/M- фазе клеточного цикла и последующий апоптоз [107-109]. Если в
случае
лейкозных
клеток
механизм
действия
противоопухолевых
алкильных
фосфолипидов связан в первую очередь с активацией рецептор-опосредованного
апоптоза, то для клеток солидных опухолей характерным событием перед гибелью
является именно G2/M клеточный арест и последующий р53-независимый апоптоз [65]. В
частности, перифозин при действии на линии HN12, HN30 и HaCaT вызывают G2/M
клеточный арест за счет экспрессии р21, что не зависит от экспрессии р53 [110].
Смена фаз клеточного цикла контролируется циклин-зависимыми киназами (cdk).
Регуляция их активности в основном происходит за счет стехиометрического связывания
cdk-ингибиторов с комплексом cdk-циклин. Белок p21waf1/cip1 является таким cdkингибитором, а также эффектором опухолевого супрессора р53. Функции p21waf1/cip1
заключаются в регуляции клеточного ареста, дифференцировки, репарации ДНК и
апоптоза. p21waf1/cip1 модулируется на этапе транскрипции и посттранскрипционном
35
уровне, и р53 является транскрипционным активатором p21waf1/cip1. Тем не менее,
p21waf1/cip1 не всегда связан с р53. При действии фосфатсодержащих алкильных липидов, в
частности, перифозина, показана транскрипционная активация промотора p21waf1/cip1,
повышение уровня мРНК и соответствующее увеличение количества белка p21waf1/cip1, что
сопровождается G1/S или G2/M арестом клеточного цикла [110]. Данный эффект не
зависит от р53, и воспроизводится на моделях с инактивированным р53. Повышение
количества p21waf1/cip1 влечет за собой ингибирование комплексообразования cdk2/цикин Е
и cdk2/циклинВ, что приводит к G1/S или G2/M арестам соответственно.
3.2.Механизм
действия
эдельфозина
и
его
аналогов,
опосредованный
локализацией в эндоплазматическом ретикулуме
Гибель опухолевых клеток, опосредованная действием эдельфозина и его аналогов,
наступает по времени раньше при обработке клеток лейкозов, чем в случае клеток
солидных опухолей [59]. Эдельфозин вызывает быстрый апоптоз гемопоэтических клеток
Т-лейкозов Jurkat и Peer, острого миелоидного лейкоза HL-60 [84, 111-113]. Позднее
развитие апоптотической гибели, которому предшествует арест в G2/M фазе клеточного
цикла наступает в клетках карциномы шейки матки HeLa, карциномы легких A549 и
аденокарциномы поджелудочной железы линий BxPC-3, Capan-2 и Hup-T4 [65, 114].
Такое различие объясняется двумя вариантами субклеточной локализации эдельфозина: в
липидных
рафтах
цитоплазматической
мембраны
в
случае
лейкозов
и
в
эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях в случае солидных опухолей [65, 84,
112-116]. Как известно, эндоплазматический ретикулум (ЭПР) участвует в биосинтезе и
транспорте
белков
и
липидов,
в
посттрансляционной
модификации
белков,
депонировании ионов кальция и может модулировать клеточную гибель. В составе стенок
ЭПР, помимо ненасыщенных фосфолипидов, присутствует также холестерин и
сфинголипиды, что влияет на накопление эдельфозина и его аналогов. Нарушение
36
функции ЭПР приводит к ошибкам в фолдинге белков и накоплению неправильно
свернутых белков в ЭПР – серия этих событий характеризуется ЭПР-стрессом. Результат
стрессового состояния ЭПР зависит от баланса двух процессов: с одной стороны, ЭПРстресс
может
привести
к
цитопротекторной
активации
Grp78/BiP,
что
может
способствовать выживанию клетки, с другой стороны, активность проапоптотического
сигнального пути ASK1/JNK может привести к гибели [115]. Накопление эдельфозина в
ЭПР клеток солидных опухолей сопровождается ингибированием синтеза белков,
повышением регуляторной проапоптотической активности CHOP/GAD153, активацией
Bax, каспазы 4 и каспазы 8, а также активацией JNK, опосредованной ASK1 [114, 115].
При этом уровень белков Grp78/BiP остается без изменений, что означает смещение
баланса между выживанием и гибелью в сторону гибели клетки [115]. Показано, что в
случае
ингибирования
JNK
развитие
эдельфозин-опосредованного
апоптоза
предотвращается, что свидетельствует о важной роли ASK1/JNK сигнального пути в
механизме действия эдельфозина [114, 115]. Кроме того, обнаружено, что важное
значение в индуцированном эдельфозином апоптозе, опосредованном развитием ЭПРстресса,
имеют
митохондрии.
Усиление
антиапоптотических
факторов
Bcl-XL,
локализующихся, в частности, в митохондриях, ведет к снижению апоптоза клеток
солидных опухолей, вызыванного эдельфозином [115]. С другой стороны, в результате
развития ЭПР-стресса наблюдается повышение уровня проапототических белков Bax и
Bad, которое наряду с высвобождением ионов кальция из ЭПР ведет к сенситизации
митохондрий [115]. Важно отметить, что за счет физического взаимодействия между ЭПР
и митохондриями [117] происходит перенос фосфолипидов между мембранами ЭПР и
митохондрий
через
специализированные
фракции
ЭПР,
плотно
связанные
с
митохондриями [118-124], за счет комплекса ERMES (ER-mitochondria encounter structure)
[125, 126], который представлен трансмембранными белками обеих органелл и
37
расположен на их стыке. По-видимому, наличие этого комплекса играет важную роль в
транспорте и метаболизме фосфолипидов между ЭПР и митохондриями [127].
3.3.Развитие
митохондриального
пути
апоптоза
при
действии
фосфатсодержащих противоопухолевых липидов
Апоптоз опухолевых клеток при действии эдельфозина и его аналогов запускаемый
как от рецепторов смерти, так и вследствие развития ЭПР-стресса, развивается с участием
митохондриального сигналинга. Эдельфозин-опосредованный апоптоз характеризуется
падением трансмембранного потенциала митохондрий, что способствует высвобождению
из них цитохрома С и активации каспазы 9. Это сопровождается заметным снижением
гиперэкспрессии Bcl-2 или Bcl-XL – факторов, защищающих целостность мембраны
митохондрии [61, 84, 114]. В конечном итоге освобождение из митохондрии
проапоптотических белков приводит к активации каспазы 3, фрагментации ДНК и гибели
клетки.
Захваченный клеткой путем эндоцитоза эдельфозин локализуется в липидных
рафтах цитоплазматической мембраны, в ЭПР или во внешней митохондриальной
мембране за счет особенностей своей структуры (форма перевернутого конуса) и сродства
к холистерину. Связь между локализацией эдельфозина в липидных рафтах и
митохондриальной мембране может быть объяснена наличием рафт-подобных структур.
Наличие рафт-подобных доменов в митохондриях остается спорным вопросом [128-130].
Тем не менее, накапливается все больше данных об их наличии в этой органелле.
Митохондрии, как сообщается, содержат ганглиозид GD3 и холестерин [131, 132].
Несмотря на то, что митохондрии считаются органеллами с низким уровнем холистерина
(в пределах 0,5-3% от его содержания в плазматической мембране [133]), показано, что
митохондриальный порообразующий комплекс содержит холестерин [134], и наличие в
митохондрии таких рафт-подобных доменов, по-видимому, имеет решающее значение для
38
функционирования митохондрий во время апоптоза, вызванного эдельфозином [131]. Так
или иначе, применение флуоресцентно-меченных аналогов эдельфозина PTE-ET (all-(E)-1O-(15’-phenylpentadeca-8’,10’,12’,14’-tetraenyl)-2-O-methyl-rac-glycero-3-phosphocholine),
PTRI-ET (all-(E)-1-O-(15’-phenylpentadeca-10’,12’,14’-trien-8’-ynyl)-2-O-methyl-rac-glycero3-phosphocholine), Yn-BDP-ET (1-O-(13’-(1’’,3’’,5’’,7’’-tetramethyl-4’’,4’’-difluoro-4’’-bora3a’’,4a’’-diaza-s-indacen-2’’-yl)tridec-12’-ynyl)-2-O-methyl-rac-glycero-3-phosphocholine)
показало их митохондриальную локализацию [74]. Во внешней мембране митохондрии
эдельфозин вызывает повышение ее кривизны, способствуя ее дестабилизации с
образованием неровностей поверхности, мицелл и мелких пузырьков, что приводит к ее
деструкции [135-138].
Помимо этого, выявлено, что эдельфозин действует на Bid и BAP31 – белки,
которые
связывают
рецептор-опосредованный
путь
апоптоза
и
ЭПР-стресс
с
митохондриями соответственно [82, 83, 115, 114]. При активации каспазой 8 Bid (активная
форма - tBid) рекрутируется в липидные рафты мембраны, расщепляется до фрагмента в
18кДа и осуществляет проведение сигнала от Fas/CD95 и FADD к митохондрии [84, 86].
BAP31 является интегральным белком мембраны, и его расщепление каспазой 8 до
фрагмента в 20 кДа направляет апоптотический сигнал из ЭПР к митохондрии [139-141].
Обработка опухолевых клеток эдельфозином приводит к расщеплению Bid и BAP31, тем
самым осуществляется проведение апоптотического сигнала от липидных рафтов и ЭПР к
митохондрии.
4.Механизмы гибели опухолевых клеток
Для анализа экспериментальных данных при определении типа гибели клеток,
опосредованной действием новых соединений, важно рассмотреть существующие
механизмы клеточной гибели. Современные представления об их классификации
объединяют морфологические и биохимические критерии оценки.
39
4.1. Рецептор-опосредованный (внешний) апоптоз
Схема внешнего пути апоптоза представлена на рис. 8 [142].
Рис. 8. Внешний апоптоз
Инициация программы апоптоза может быть вызвана внешними стимулами, такими,
как связывание лигандов: Fas/CD95 лиганд (FASL/CD95L), фактор некроза опухоли TNFα
и лиганды семейства TNF (например, TRAIL) с рецепторами смерти (FAS/CD95, TNFαрецептор 1 (TNFR1) и TRAIL-рецептор (TRAILR) соответственно) [143]. С другой
стороны, внешняя проапоптотическая сигнализация может быть запущена и без
взаимодействия лиганд-рецептор – примером этому может служить FAS-опосредованный
путь. При отсутствии FASL, FAS субъединицы могут олигомеризоваться в мембране,
собираясь в тримеры (PLAD) [144]. Связывание FASL стабилизирует такие тримеры, что
40
способствует сборке динамического мультибелкового комплекса в цитозольной части
рецептора. Это происходит в связи с наличием консервативной последовательности из 80
аминокислотных остатков, которые характерны для рецепторов смерти, - "домен гибели"
(DD) [145, 146]. Белками, взаимодействующими с DD FAS, являются рецепторвзаимодействующие протеинкиназы 1 (RIP1), FAS-ассоциированный белок с DD (FADD);
несколько изоформ с-FLIP; [147, 148], клеточный ингибитор апоптотических белков
(cIAPs), E3 убиквитинлигазы [149-153]. Получаемый супрамолекулярный комплекс
(DISC) представляет собой платформу, которая регулирует активацию каспазы-8 (или -10)
[150, 154]. DD некоторых рецепторов смерти, например, TNFR1, могут связывать и другие
белки, отличные от компонентов DISC, в том числе TNFR-ассоциированные факторы 2
(TRAF2) и TRAF5 [154]. При взаимодействии TNF с TNFR1 происходит тримеризация
TNFR1 с последующим образованием комплекса TNFR-I, белка TRADD, серинтреониновой киназы RIP и TRAF2. Этот комплекс активирует антиапоптотический
транскрипционный фактор NF-κB. Таким образом, активация рецептора смерти не всегда
влечет за собой трансдукцию сигналов к гибели.
В некоторых клетках, включая лимфоциты (I тип) [156, 157] активная каспаза-8
непосредственно катализирует протеолитическое созревание каспазы 3, тем самым
вызывая
эффекторную
фазу
каспазо-зависимого
апоптоза,
не
затрагивая
митохондриальную сигнализацию [158]. В клетках другого типа, таких как гепатоциты и
В-клетки поджелудочной железы (II тип) [156, 157, 160] каспаза 8 является посредником
протеолитического
расщепления
BID
в
активный
tBID,
который
способствует
пермеабилизации внешней мембраны митохондрий [159, 160]. Таким образом, в то время
как клетки I типа претерпевают внешней апоптоз независимо от участия митохондрий
(активация BID и может произойти в этих клетках, но она необязательна для реализации
внешнего апоптоза), клетки II типа проводят сигнал от рецепторов смерти через
митохондрии, что способствует падению ее трансмембранного потенциала и выходу в
41
цитоплазму цитохрома С и AIF [161]. Каспаза 10, близкий гомолог каспазы 8, также
может быть включена в комплекс DISC и активироваться в ответ на передачу сигналов от
рецепторов смерти [149, 162], однако, считается, что каспаза 10 не может полностью
функционально заменить каспазу 8 [162]. Кроме того, предполагается, что каспаза 10
играет важную роль в реализации сигнального каскада от рецепторов смерти в
присутствии ингибиторов каспаз [163].
Некоторые рецепторы смерти активируются в ответ на отсутствие своего лиганда и
вызывают быстрый апоптоз. В частности, такие рецепторы как DCC или UNC5B
транслируют сигналы о гибели при отсутствии их лиганда (Netrin-1). От DCC проапоптотический сигналинг протекает через сборку активного комплекса Dral-TUCAN,
содержащего прокаспазу 9, которая активируется в каспазу 9 и далее активирует
эффекторные каспазы [164]. Аналогично рецептор UNC5B формирует комплекс PP2ADAPK, котором происходит дефосфорилирование DAPK с последующей активацией
каспазы 9 и эффекторных каспаз [165, 166].
Таким образом, внешний апоптоз развивается через один или несколько сигнальных
каскадов: (1) рецептор смерти – каспаза 8 (или 10) – каспаза 3; (2) рецептор смерти –
каспаза 8 – tBID – пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны – каспаза 9 –
каспаза 3; (3) рецептор смерти – каспаза 9 – каспаза 3.
4.2.Митохондриальный
(внутренний)
апоптоз.
Каспазозависимый
каспазонезависимый пути
Схема внутреннего пути апоптоза представлена на рис.9 [142].
42
и
Рис.9. Внутренний апоптоз
Апоптотическая гибель клеток может быть вызвана множеством внутриклеточных
условий, в том числе повреждениями ДНК, окислительным стрессом, цитозольной
перегрузкой
ионами
кальция,
накоплением
неправильно
свернутых
белков
в
эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР-стресс). Хотя сигнальные каскады, которые
вызывают внутренний
апоптоз, опосредованы различными стимулами, все они
затрагивают митохондрии, и центральным механизмом внутреннего апоптоза является
регуляция митохондриальных изменений [161]. Часто наряду с распространением
проапоптотического сигналинга, в клетках активируются и антиапоптотические каскады,
направленные на выход клетки из стрессового состояния, - оба эти процесса сходятся на
митохондрии, внешняя мембрана которой становится проницаемой при преобладании
43
проапоптотической стимуляции. Митохондриальные изменения регулируются белками
семейства Bcl-2, включающего антиапоптотические белки (Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1,
Bcl2/10 (Boo/Diva), Bcl-2/12); проапоптотические белки подсемейства Bax (Bax, Bak, Bok,
Bcl-G, Bcl-ramboo, Bfk); проапоптотические белки BH3-доменного подсемейства (Bid,
Bad, Bik, Bim, Noxa, Puma, Hrk, Beclin1, MULE) [167].
Пермеабилизация внешней митохондриальной мембраны может начаться вследствие
порообразующего действия проапоптотических членов семейства белков Bcl-2, таких как
Bak и Вах, или может быть результатом так называемой переходной митохондриальной
проницаемости, которая происходит на внутренней митохондриальной мембране за счет
открытия мультибелкового комплекса, известного как поровый комплекс переходной
проницаемости (PTPC) [168, 169]. Независимо от конкретных биохимических и
физических механизмов, через которые происходит пермеабилизация, она затрагивает
большинство митохондрий клетки и имеет несколько смертельных исходов: падение
трансмембранного потенциала митохондрии с прекращением синтеза митохондриальной
АТФ; высвобождение в цитозоль токсических белков из межмембранного пространства
митохондрии, таких как цитохром С, фактора индукции апоптоза (AIF), эндонуклеазы G
(ENDOG), IAP-связывающего белка DIABLO, также известного как SMAC, и протеазы
HTRA2; ингибирование дыхательной цепи (в связи с потерей цитохрома С) [161].
После выхода из митохондрии в цитозоль цитохром С вместе с dATP, APAF1 и
прокаспазой
9
участвует
в
формировании
апоптосомы,
которая
активирует
протеолитический каскад каспаза 9-каспаза 3 [170, 171]. AIF и ENDOG перемещаются в
ядро, где они опосредуют фрагментацию ДНК независимо от участия эффекторных каспаз
[172-175]. SMAC / DIABLO и HTRA2 ингибируют антиапоптозные функции нескольких
белков-членов семейства ингибиторов апоптоза IAP, тем самым устраняя угнетение ими
каспазы 9 и эффекторных каспаз [176-178]. Кроме того, HTRA2 может действовать по
44
каспазо-независимому механизму за счет своего протеолитического потенциала, в таком
случае HTRA2 способствует деструкции цитоскелета [179, 180]. Перечисленные
механизмы могут идти параллельно, и генетический нокаут или ингибирование одного из
белков межмебранного пространства митохондрий не всегда влияет на протекание
внутреннего апоптоза [181].
4.3.Некроз, регулируемый некроз, некроптоз
В течение долгого времени некроз рассматривался как пассивный тип гибели,
сопровождающийся нарушением целостности цитоплазматической мембраны и быстрым
истечением клеточного содержимого при отсутствии морфологических и биохимических
признаков апоптоза или аутофагии [182, 183]. Однако установлено, что некроз может
происходить и регулируемым образом [184-189]. Некоторые факторы могут индуцировать
регулируемый некроз, в частности, алкилирующие повреждения ДНК, цитотоксическое
воздействие и лигирование рецепторов смерти [184, 186, 187, 190, 191]. Действительно,
когда каспазы (в частности, каспаза 8) ингибируются вследствие генетических
воздействий (например, нокаут генов или РНК-интерференция) или при действии
химических ингибиторов каспаз, рецептор-взаимодействующая протеинкиназа 1 RIP1 и ее
гомолог RIP3 не разрушаются и могут индуцировать некротическую гибель клеток [184,
186, 187, 189].
При связывании фактора некроза α (TNFα) с рецепторами смерти TNFR1,
цитоплазматическая
часть
рецепторов
(тримера
TNFR1)
рекрутирует
TNFR-
ассоциированный домен смерти (TRADD), RIP1, клеточный ингибитор апоптоза 1
(cIAP1), cIAP2, TNFR-ассоциированный фактор 2 (TRAF2) и TRAF5. В образующемся
комплексе RIP1 полиубиквинтинирована молекулами cIAP, тем самым обеспечивая сайт
связывания TGFb-активирующей киназы 1 (TAK1), ТАК-связывающего протеина 2
(TAB2) and TAB3, которые вместе проводят сигнал к активации транскрипционного
45
фактора NF-κB. В ряде патофизиологических и экспериментальных состояний, когда
каспазы (в частности, каспаза 8) инактивированы, деубиквинтиназа CYLD снимает
убиквинтин с RIP1, что позволяет ему связаться с RIP3, активируя некротическую гибель
клетки. Некроз, сопровождающийся активацией RIP1 (также называемый некроптоз),
может регулироваться, в частности, подавляться, действием некростатинов [186, 192-194].
Также описаны случаи RIP3-зависимой, но RIP1-независимой регуляции некроза [187,
195].
4.4.Аутофагия
На основании морфологических признаков, аутофагическая гибель клеток
сопровождается
выраженной
цитоплазматической
вакуолизацией
-
образованием
аутофагических вакуолей (аутофагосом), увеличением пластического комплекса Гольджи
и уменьшением ЭПР и митохондрий [182, 196, 197]. Аутофагия способствует избавлению
клетки от поврежденных органелл, участвует в процессах дифференцировки и
трансформации, явлется одним из механизмов клеточной гибели. Аутофагия может
возникать в качестве реакции на химиотерапевтические препараты, способствуя гибели
опухолевых клеток (особенно, когда им не хватает необходимых модуляторов апоптоза,
таких как Вax, Bak и/или каспазы) [198, 199], что показано на выбранной панели
химиотерапевтических агентов in vitro [200, 201]. Тем не менее, в большинстве известных
случаев, аутофагия играет цитопротекторную роль, активируясь при попытке умирающей
клетки справиться со стрессом, и ингибирование аутофагии часто ускоряет, а не
предотвращает гибель клетки [202]. Идентифицировать аутофагическую гибель клетки по
биохимическим критериям: она может быть подавлена ингибированием аутофагического
пути химическими веществами (например, агентами, действующими на VPS34) и/или
генетическими средствами (например, генным нокаутом
или мутациями, РНК-
интерференцией), затрагивающими такие модуляторы аутофагии, как AMBRA1, ATG5,
46
ATG12 или Beclin1 [203, 204]. Белки семейства ATG могут иметь не связанные с
аутофагией функции, и их активность, направленная на гибель клетки, возникает, в
частности, путем протеолитического расщепления (например, ATG5 и ATG6) [205-207].
Помимо
этого,
биохимическими
маркерами
аутофагии
служат
липидизация
ассоциированного с микротрубочками белка 1 по легкой цепи (LC3/Atg8) или повышенная
деградация субстратов аутофагии, таких как SQSTM1 [142].
4.5.«Митотическая катастрофа»
Митотическая
катастрофа
относится
к
случаям
гибели
клеток,
которая
инициируется аберрациями хромосом или повреждениями ДНК, и реализуется во время
митотического деления или в последующей интерфазе [182, 196]. После аномального
митоза в клетках обнаруживается значительные ядерные изменения (например, микро- и
многоядерность, полиплоидность) – морфологические маркеры митотической катастрофы
[182]. Однако в таких клетках обнаруживаются и признаки апоптоза и некроза [208, 209].
Биохимически митотическая катастрофа возникает в связи с угнетением прохождения
клеткой 2 чекпоинта, и может быть связана с дезактивацией chk1, chk2, atm, atr, plk1, pik1,
mln1, p53, p21 [210]. Однако митотическая катастрофа в ряде случаев характеризуется
активацией каспазы-2 [211], опухолевого супрессора TP53 [208, 212] и его гомологов, в
частности, одного из вариантов TP73 - TAp73 [213, 214]. Поскольку нарушения митоза
могут также приводить клеточному старению или к восстановлению клеткой гомеостаза с
последующей деградацией микроядер, митотическая катастрофа не является только
механизмом гибели. Тем не менее, в контексте клеточной гибели митотическая
катастрофа инициируется возмущениями митотического аппарата, начинается в М-фазе
клеточного цикла, развивается в параллели с G2/M-арестом [142] .
47
4.6.Аноикис
Аноикис характеризует гибель прикрепленных клеток, возникающую вследствие
отсутствия их связи с матриксом. Выживание нетрансформированных адгезионных клеток
зависит от сигналов об их взаимодействии с внеклеточным матриксом, передаваемых
интегринами и рецепторами факторов роста (в частности, EGFR) [215, 216]. Следствием
устойчивости
клеток
к
аноикису
может
стать
приобретение
инвазивного
и
метастатического потенциала, как в случае эпителиальных опухолевых клеток [217].
Аноикис характеризуется отсутствием b1-интегринового взаимодействия, подавлением
экспрессии EGFR, ингибированием киназы ERK1 и связанного сней сигналлинга, и
гиперэкспрессией Bim (белка семейства Bcl-2) [216, 218]. Стоит отметить, что развитие
аноикиса реализуется с задействованием механизмов внутреннего апоптоза и активацией
эффекторных каспаз 3,6,7 [216].
4.7.Энтоз
Энтоз описан как тип гибели, при котором одна клетка интернализуется внутри
другой, это наблюдается
в клинических опухолевых
образцах нефагоцитирующих
клеток [219, 220]. Энтоз характеризуется потерей связывания клетки с матриксом, однако,
в отличие от аноикиса, энтоз не влечет за собой активацию эффекторных каспаз и
подключение апоптотических механизмов [219]. Показано, что важную роль в клеточной
адгезии играет металлотионеин 2А, при ингибировании которого возникает морфология,
характерная для энтоза [221]. Энтоз протекает каспазонезависимо, он нечувствителен к
ингибированию гиперэкспрессией Bcl-2, сопровождается активацией малой ГТФазы RHO
и ассоциируемой с ней протеинкиназы ROCK1 в поглощающей клетке [219, 222].
Особенностей биохимии поглощаемых клеток пока не выявлено, они погибают,
предположительно,
при
действии
лизосомальных
48
гидролаз.
Изучение
энтоза
продолжается, исследуются факторы и механизмы функционального разделения клеток и
приобретения фагоцитирующей способности поглощающими клетками.
4.8.Партанатоз
Данный тип гибели клеток характеризуется повреждениями ДНК, которые связаны
с работой ферментов поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARPs), и в частности, PARP1, на
который приходится более 90% клеточной активности PARP [223]. В физиологических
условиях PARP1 способствует репарации ДНК для обеспечения геномной стабильности
при ДНК-повреждениях [224]. Сверхактивация PARP1 приводит к ряду цитотоксических
эффектов, а именно NAD+
и АТФ-истощение, а также падение митохондриального
потенциала и выход AIF из межмембранного пространства митохондрий [225-227].
Показано, что AIF имеет высокое сродство к поли-(АДФ-рибоза)-связывающему домену
(PAR), и для партанатоза in vitro и in vivo, по-видимому, характерно физическое
взаимодействие между PAR и AIF [228]. Партанатоз представляет тип гибели, не
зависящий от каспаз [229].
5.Протеинкиназы как возможные мишени противоопухолевых липидов
Важная роль в реализации гибели опухолевых клеток принадлежит протеинкиназам.
Как известно, фосфорилирование белков протеинкиназами является одним из способов
модуляции их активности. Протеинкиназы регулируют рост и дифференцировку клеток,
клеточный цикл и апоптоз. Как показано выше, противоопухолевое действие
фосфатсодержащих липидов во многом связано с изменением активности протеинкиназ, в
частности, с ингибированием протеинкиназы С, что способствует развитию апоптоза. В
контексте инициации гибели неопластических клеток роль протеинкиназ как возможных
мишеней
противоопухолевых
агентов
можно
рассматривать
через
регуляцию
проаптоптотического сигналинга и через модуляцию каскадов, способствующих
выживанию клеток.
49
5.1.Протеинкиназы С
Протеинкиназы С (РКС) относятся к серин-треининовым протеинкиназам, ее
субстраты – различные ферменты, ядерные белки, белки цитоскелета. РКС содержит N—
концевой гидрофобный домен, который заякоривает фермент в мембране и играет
регуляторную роль, и гидрофильный домен, содержащий активный центр фермента.
Пептидный мостик между доменами может быть расщеплен кальций-зависимыми
протеазами с образованием
каталитически активного фрагмента (протеинкиназы М),
активность которого не зависит от кальция и от фосфолипидов.
PKC представлены семейством протеинкиназ из порядка десяти изоферментов,
классифицирующихся по вторичным посредниками на традиционные, оригинальные и
нестандартные.
Традиционные
изоформы
(РКСα, РКСβI , РКСβII и РКСγ)
содержат
четыре консервативных участка (С1-С4) и пять вариабельных участков (V1-V5). Участки
С1, С2, V1, V2 входят в состав гидрофбоного регуляторного домена, участки С3, С4, V4,
V5 - в состав гидрофильного каталитического домена, а участок V3 играет роль связки.
Оригинальные изоформы (РКСδ, РКСε, РКСν и РКСθ) не содержат домена С2,
участвующего в связывании кальция. Участок С1 содержит кластер повторяющихся
цистеин-богатых последовательностей с высоким сродством к иона цинка. Нестандартные
изоформы (РКСζ, РКСλ, и РКСμ) лишены участка С2 и, кроме того, имеют только одну
богатую цистеином последовательность в участке С1 [230].
Для активации традиционных РКС в качестве кофакторов требуются ионы кальция,
диацилглицерин или фосфохолин. При гидролизе фосфатидилинозитол-4,5,-дифосфата
фосфолипазой С образуются инозитол-1,4,5,-трисфосфат и диацилглицерин (DAG). DAG
активирует PKC путем увеличения ее сродства к Са2+ и фосфолипидам, а инозитол-1,4,5,трисфосфат активирует кальциевые каналы ЭПР, вызывая тем самым повышение
концентрации ионов кальция в клетке. Ca2+ и DAG связываются с доменами С2 и С1 РКС
50
и вызывают ее прикрепление к мембране. Взаимодействие с мембраной вызывает
освобождение псевдосубстрата из каталитического центра PKC и активирует фермент.
Для осуществления подобных аллостерических взаимодействий, протеинкиназе С
требуется предварительное фосфорилирование. PKC содержит несколько сайтов
фосфорилирования 3-фосфоинозитол-зависимой протеинкиназой-1 (PDK 1). После
активации протеинкиназа С переносится к плазматической мембране и присоединяются к
RACK-белкам (Receptor for Activated C-Kinase), аминокислотная последовательность
которых гомологична бета-субъединицам G-белков.
Активированная под
действием
внешних
сигналов
РКС
характеризуется
повышенным сродством фермента к мембранам, как цитоплазматической, так и ядерной,
также РКС может связываться с ЭПР, ПКГ, цитоскелетом. В покоящихся клетках РКС
распределена диффузно в цитозоле, либо связывается с мембранами с низким сродством.
При активации происходит перераспределение PKCα и PKCε к клеточной мембране,
PKCβ1 в ЭПР , PKCβ2 связывается с цитоскелетом, PKCγ в локализуется в ПКГ, PKCε в мембране ядра. Степень активации РКС зависит от структуры DAG. Условием для
наибольшей активации РКС является содержание остатков ненасыщенных жирных кислот
в структуре DAG. При этом на прикрепление РКС к мембране влияет и содержание в ней
DAG [231]. Оригинальные изоформы активируются DAG и не требуют ионов кальция.
Активация нестандартных РКС независима ни от DAG, ни от ионов кальция.
Механизм активации РКС описывается двумя моделями. Участок С1 регуляторного
гидрофобного домена содержит последовательность, гомологичную последовательностям
субстратов
РКС,
однако
не
содержащую
остатков
серина
или
треонина
(последовательность псевдосубстрата) [232]. В неактивной РКС последовательность
псевдосубстрата в регуляторном домене связана с активным центром каталитического
домена, расположенного в гидрфильной области РКС [233].
51
Первая модель активации предполагает связывание аллостерических активаторов
или кофакторов РКС с регуляторным доменом, что за счет обратимого конформационного
изменения фермента делает активный центр доступным для связывания субстрата. Вторая
модель активации РКС связана с протеолитическим расщеплением РКС по участку V3
(пептидного мостика между гидрофильным и гидрофобным доменами) с последующим
высвобождением каталитического фрагмента.
Помимо этого, некоторые селективные окислительные модификации гидрофобного
домена ведут к образованию активной формы РКС, не требующей ни ионов кальция, ни
фосфолипида.
Белковыми
субстратами
киназы, MARCKS (myristoylated
РКС
alanine-rich
являются
C-kinase
MAP-киназы, Rafsubstrate,
производные миристоленовой кислоты, богатые аланином). Белки-субстраты РКС играют
роль в поддержании формы клеток, способности к движению, секреции, трансмембранном
транспорте, регуляции клеточного цикла. Роль РКС в сигналинге во многом зависит от
изоформы фермента.
РКС-дзета фосфорилирует и активирует киназы МАР-каскада. Тромбоцитарный
фактор роста PDGF в Swiss 3T3 клетках из четырех изоформ РКС (РКСα, РКСδ, РКСε и
РКСζ) селективно активирует изоформы - РКСδ и РКСε. В клетках RBL-2H3 (клетки
базофильной лейкемии крыс) активно экспрессируется c-fos, что опосредовано
активностью РКСβ и РКСζ, а изоформы РКСα и РКСδ не участвуют в данной индукции.
РКСδ также может активироваться PDGF, EGF, Src.
Действие определенных типов РКС вызывают запуск различных сигнальных путей,
что может влиять как на выживание, так и на гибель опухолевой клетки. К примеру, в
контексте развития апоптотического сигналинга, фрагмент РКС-дельта при отщеплении
каспазой 2 перемещается в ядро, где фосфорилирует p53, p73β и Rad9 [234], и накопление
в ядре активной РКС-дельта способствует развитию апотоза [235, 236]. Также РКСδ
52
увеличивает активность каспазы 3, играющей важную роль в реализации апоптоза. PKCζ,
наоборот, фосфорилируя каспазу 9, инициирует осмотический стресс и угнетает ее
активность [237].
5.2.Протеинкиназа Met
Трансмембранная тирозинкиназа Met (входящая в состав рецептора фактора роста
гепатоцитов HGF/SF) индуцирует выживаемость клеток, стимулирует пролиферацию,
инвазию и защищает клетки от апоптоза. Рецептор Met кодируется протоонкогеном c-Met,
широко экспрессирующимся в клетках эпителиального происхождения. Met-рецептор
состоит из двух субъединиц: альфа-субъединица формирует внеклеточный домен, бетасубъединица включает в себя лиганд-связывающий домен, трансмембранную часть и
цитоплазматическую тирозинкиназу. Фосфотирозиновые остатки трансмембранных
тирозинкиназ обладают сродством к Src-гомологичными доменам (SH2-домен), за счет
чего активированный рецептор может удерживать у мембраны ряд белков цитоплазмы. На
С-конце Мet-рецептора имеется последовательность, при фосфорилировании которой
происходит его связывание с SH2 доменами фосфолипазы С, с последующей активацией
протеинкиназы С и мобилизацией ионов кальция. Также показано связывание
активированного Met-рецептора с SH2-доменами белка-активатора ras GTP-азы ras GAP) и
фосфатидилинозитол-3-киназы PI3K
HGF/SF
[238].
активирует ras
p21 в клетках
карциномы легкого А549 [238], стимулирует интенсивное образвание DAG в культурах
первичных гепатоцитов крысы [239]. Помимо этого, эпителиальные клетки линии
MDCK и клетки ряда линий карцином человека приобретают способность инвазировать
в коллагеновый гель при культивировании в среде, содержащей HGF/SF [240]. HGF/SF и
рецептор Met играют роль в прогрессии и метастазировании опухолей, и в частности,
карцином in vivo. HGF/SF выступает в роли сильного митогена для гепатоцитов, и
мотогена для различных эпителиальных клеток, в частности клеток молочной железы,
эндотелиоцитов.
Мотогенный
эффект
HGF/SF
53
опосредован
вызываемой
им
стимуляцией Ras-Raf-MAPК сигнальных путей: об этом свидетельствует его отмена при
ингибирования функции МЕК1 и блокировании передачи сигнала к ERK1/2 [241, 242].
Мутации протоонкогена Met, которые приводят к повышенной стимуляции его
тирозинкиназной активности, являются онкогенными, так как они способны вызывать
ссответствующую морфологическую трансформацию в культивируемых in vitro клетках
[243].
Для деструкции в эпителиальных клетках Е-кадхериновых межклеточных контактов и
стимуляции клеточной локомоции необходима одновременная активация Raf и PI3K ,
которая при действии HGF/SF может индуцироваться как по Ras-зависимому, так и по
Ras-независимому механизмам [244, 245]. Пути клеточной сигнализации PI3K-Akt и RASERK играют центральную роль в антиапоптотическом ответе, вызванном активированным
Met. Во многих исследованиях HGF/SF-индуцированные реакции выживания клеток
коррелируют с повышенной экспрессией антиапоптотических факторов-белков Bcl-XL и
Bcl-2, которые ингибируют внутренний (митохондриальный) путь апоптоза [246, 247]. С
другой стороны, показано, каспазное расщепление протеинкиназ: в частности, каспаза-2
может расщеплять рецепор Met, что вызывает высвобождение его фрагмента в 40кДа
(р40), содержащего тирозинкиназный участок. Высвободившийся в цитоплазму р40
независимо от своей тирозинкиназной активности способствует пермеабилизации
митохондрий и развитию внутреннего пути апоптоза [248].
5.3.Протеинкиназа Src
Тирозинкиназы нерецепторного типа семейства Src имеют значение в регуляции
транскрипции, клеточной адгезии, миграции, дифференцировки, а также клеточного цикла
и апоптоза. Семейство Src включает тирозинкиназы с обширным спектром экспрессии Fyn ,Yes и с ограниченным - Fgr , Lyn , Hck , Lck , Bik , Yrc. Src-белки (молекулярная
масса 52-62 кДа) состоят из шести функциональных областей: Src-гомологичный домен
4 (SH4, содержащий сигналы для модификации остатками жирных кислот ), уникальный
54
домен
(специфичный
для
каждого
представителя
этого
семейсва) , SH3-домен
(необходимый для взаимодействия с белками-субстратами, а также обеспечивает
внутримолекулярные связи, регулирующие каталитическую активность, локализацию
белка в клетке и ассоциацию с белками- мишенями), SH2-домен (который контролирует
спектр белков, взаимодействующих с семейством Src) , каталитический домен и Стерминальная регуляторный домен.
Киназы Src вовлечены в индукцию синтеза ДНК при активации различных
тирозиновых рецепторов факторов роста. Дезактивация белка Src приводит к
ингибированию синтеза ДНК под действием эпителиального фактора роста EGF
и тромбоцитарного фактора роста PDGF. Однако в PDGF-индуцированном сигналинге
клеток мышей с дефектными генами Src, Yes и Fyn наблюдалось прохождение сигнала от
рецептора данного фактора роста [249]. v-Src активирует МАР-киназный каскад и РI3К,
важные для клеточной пролиферации. Белок Src включен в регуляцию G2/M-перехода
клеточного цикла.
Активность Src значительно возрастает в заблокированных в метафазе клетках,
причем стимуляция киназы коррелирует с фосфорилированием киназой CDC2 белка Src в
его уникальном домене. Деление фибробластов мышей блокируется инъекцией Srcспецифических антител на стадии G2 [250]. Помимо Src в делении клеток участвуют и
другие белки этого семейства (Fyn и Yes ). Взаимодействие с С-концевым пептидом этих
белков иншибирует деление клеток. Субстратом Src в процессе митоза является
белок Sam68, связывающийся с SH3- и SH2-доменами Src [251].
Src-киназы активируют белок Raf, который является эффектором Ras в Ras –
МАРК
каскаде
[252]. Src
киназы
Экспрессия v-Src препятствует
также
переходу
вызывает
некоторых
антиапоптотический
эффект.
типов
апоптоз,
клеток
в
индуцированный элиминацией цитокинов, облучением или разрушением клеточных
контактов
с
экстрацеллюлярным
матриксом
55
[253].
Активация
Src
подавляет
эффективность цитокиновых
рецепторов,
интегринов и
другие
рецепторные
пути
передачи сигналов, что защищает клетку от реализации апоптоза.
5.4.Киназа инсулинового рецептора
Рецептор инсулина имеет высокую аффинность к инсулину и более низкое
сродство к двум смежных факторов роста IGF-1 и IGF-2. Рецептор инсулина локализован
на поверхности клеток и имеет тирозинкиназный участок. Рецептор присутствует в
плазматической мембране в виде дисульфидно-связанного гетеротетрамера. Он содержит
N-концевую α-цепь и С-концевую β-цепь. Дисульфидные связи сшивают α и β цепи
каждого мономера.
Система IGF/инсулин состоит из трех лигандов (IGF-I, IGF-II, и инсулина), шести
лиганд-связывающих
белков
IGFBP
1-6
и
2
трансмембранных
рецепторов
с
тирозинкиназной акивностью - рецептор IGF (IGF-IR) и рецептора инсулина (IR). После
связывания лиганда с внеклеточными α-субъединицами, рецепторы подвергаются
конформационным изменениям в результате тироинкиназной активности и трансфосфорилирования внутриклеточных β-субъединиц. Связавшиеся с лигандом рецепторы
фосфорилируют адаптерные белки, в том числе субстраты инсулинового рецептора (IRS
1-6) и Shc. Активируются несколько сигнальных путей, в том числе PI3K-Akt и МАРКкаскад,
увеличивается
активность
антиапоптотических
белков
семейства
Bcl-2,
инактивируется Bid. Это приводит к стимуляции ряда клеточных функций, таких как
пролиферация, ингибирование апоптоза, метастазирование, усиление обмена веществ,
ангиогенез и лекарственной устойчивости [254, 255].
5.5.Протеинкиназа Pim-1
Фермент PIM-1 (proviral integration Moloney virus) мышиного лейкоза Молони –
серин-треониновая протеинкиназа, участвующая в выживаемости клеток, пролиферации,
56
дифференцировке, апоптозе, и канцерогенезе [256, 257]. Гиперэкспрессия Pim-1 связана с
развитием
и
прогрессированием
нескольких
гемопоэтических
злокачественных
новообразований и рака предстательной железы [258, 259]. PIM-1 - киназы имеют
цитоплазматическую, мембранную и ядерную локализацию [260, 261]. Изофермент 44 кДа
PIM-1 в первую очередь находится на плазматической мембране, в то время как изоформа
33 кДа присутствует как в цитозоле, так и в ядре, и предполагается, что эти две изоформы
могут регулировать различные сигнальные пути в опухолевых клетках [261].
Избыточная активность PIM-1 в тканях взрослого организма может способствовать
злокачественной трансформации. Усиленная экспрессии PIM-1 у трансгенных мышей
приводит к увеличению лимфопролиферации и ингибированию апоптоза [260, 262]. PIM-1
избыточно экспрессирован при раке предстательной железы [258], при предраковых
поражениях
и
аденокарциноме
предстательной
железы
по
сравнению
с
доброкачественным эпителием [258, 263, 264]. Избыточная экспрессия PIM-1 была также
найдена при плоскоклеточном раке ротовой полости [265] и в различных человеческих
лейкозах, таких как В-клеточные лимфомы, эритролейкозы и острый миелолейкоз [259,
266, 267]. PIM-1 взаимодействует с антиапоптическим белком A1 в BCR/ABLопосредованном возникновении и развитии лейкозов [268].
Экспрессия PIM-1 индуцируется несколькими цитокинами и пролактином
посредством активации JAK / STAT сигналинга [268]. Кроме того, PIM-1 сам по себе
может негативно регулировать JAK / STAT пути посредством связывания с белками SOCS
(группа негативных регуляторов STAT активности) [269]. PI3K-АКТ сигнальный путь
также
участвуют
в
регуляции
экспрессии
PIM-1
[270,
271].
Hsp90
является
координационно регулируется с PIM-1 и отвечает за стабилизацию и функцию PIM-1 [272,
273]. Субстратами PIM-1 являются p21Cip1/WAF1 [274, 275], Cdc25A [276], PTPU2 [277],
NuMA [278], C-TAK1 [279], и Cdc25C [279], что указывает на участие PIM -1 в G1 / S и G2
57
/ M переходах. PIM-1 также вносит свой вклад в регуляциию клеточного апоптоза,
проявляя антиапоптотическую активность [276, 280, 281]. Прямое воздействие PIM-1
показано на ингибирование митохондриального пути апоптоза. PIM-1 связывается,
фосфорилирует и инактивирует Bad как in vitro, так и in vivo [282, 283].
Описанные в данном обзоре аспекты механизмов биологического действия
фосфатсодержащих противоопухолевых липидов продолжают уточняться и дополняться.
Литературных данных о гибели опухолевых клеток, обработанных катионными
глицеролипидами, в настоящее время недостаточно для описания механизма действия и
мишеней соединений этого класса.
58
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1.Культивируемые клеточные линии
Для экспериментов использованы следующие линии клеток человека: К562
(миелогенная лейкемия), HCT116 (рак толстой кишки), HCT116p53KO (рак толстой
кишки с делецией обоих аллелей гена р53, получена в лаборатории B.Vogelstein, Johns
Hopkins University, США, предоставлена Б.П.Копниным), HL-60 (промиелоцитарный
лейкоз), MCF-7 (аденокарцинома молочной железы), SCOV-3 (аденокарцинома яичника),
неопухолевые фибробласты; клеток мышей B-16 (меланома); клеток крыс С6 (глиома).
Все линии клеток протестированы в American Type Culture Collection, США. Клетки
НСТ116, НСТ116р53КО, MCF-7, SCOV-3, B16, C6 культивировались в среде DMEM,
клетки К562 и HL-60 - в среде RPMI-1640. В культуральные среды добавлялись 5%
эмбриональной телячьей сыворотки, 2mМ L-глутамина, 100ЕД/мл пенициллина и
100мкг/мл стрептомицина (среды и добавки производства ПанЭко, Россия), инкубация
проводилась при 370С, 5% СО2 в увлажненной атмосфере. В экспериментах использованы
культуры в логарифмической фазе роста. Для профилактики микоплазменного заражения
использовался препарат Mycokill (ПанЭко, Россия). Перед началом экспериментов
проводилось не менее трех пассажей на свободной от антимикоплазменного препарата
среде.
2.Препараты для исследований
Катионные глицеролипиды:
rac-N-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-Nметилпиперидинийбромид,
rac-N-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-N-метил-4гидроксипиперидинийиодид,
59
rac-N-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-N-метилморфолинийиодид,
rac-N-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-Nпиридинийбромид,
rac-N-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-N-этилимидазолинийиодид,
rac-N-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}N,N-диметил-N(2-гидроксиэтил)аммонийиодид,
rac-N-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-N-метилимидазолинийиодид,
rac-N-(4-((2-этокси-3-октадецилокси)проп-1-илоксикарбонил)бутил)-N,Nдиметил-N-(2-(N’-дансил)аминоэтил)аммоний иодид,
rac-N-{4-[(2-октадециолокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-Nметил-имидазолинийиодид,
rac-N-{4-[(2-этокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-N-имидазол
(предоставлены МИТХТ им.М.В.Ломоносова) использовались в виде 10мМ стоковых
растворов в ДМСО (ПанЭко, Россия), эдельфозин 1-октадецил-2-метил-sn-глицеро-3фосфохолин (Sigma-Aldrich, США) использовался в виде 10мМ стокового раствора в
этаноле. Растворы липидов хранились в замороженном виде при -200С, размораживались
непосредственно
перед
использованием.
В
качестве
контролей
экспериментов
использовались коммерческие препараты доксорубицин (Ebewe, Австрия), митоксантрон
(Лэнс-Фарм, Россия), и бис-1-индолилмалеимид (предоставлен ИОГен РАН).
60
3.МТТ-тест для исследования цитотоксичности
Клетки рассеивали в лунки 96-луночного планшета (NUNC, США) (5000 клеток в
190 мкл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37 оС, 5% СО2, в увлажненной
атмосфер. Вносили по 10 мкл раствора исследуемых веществ в культуральной среде,
приготовленных серийными разведениями из исходного раствора в ДМСО (10 мМ), до
конечных концентраций 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2; 6; 12; 25 и 50 мкM. Контролем служили
клетки без препарата. Клетки инкубировали 72 часа при 37 оС, 5% СО2, в увлажненной
атмосфере. За 1 час до окончания инкубации в лунки вносили по 20 мкл (100 мкг)
водного раствора МТТ (5 мг/мл, ПанЭко, Россия). После окончания инкубации
культуральную среду отбирали, клетки ресуспендировали в 100 мкл ДМСО и измеряли
оптическую плотность раствора на планшетном спектрофотометре Мultiscan FC (Thermo
Scientific, США) при длине волны 570 нм. Процент клеток, выживших при действии
каждой дозы липида, подсчитывали как частное от деления средней оптической плотности
в лунках после инкубации с данной дозой к средней оптической плотности контрольных
лунок (значения последних приняты за 100%). Каждую концентрацию липида изучали c 4х кратной статистикой.
4.Исследование действия липидов на лимфоциты
Лимфоциты выделяли из крови человека: кровь инкубировали при 37 оС 15 мин., к
5 мл фиколла (ПанЭко, Россия) добавляли наслаиванием 10 мл крови, центрифугировали
10 мин. при 500 об./мин., отбирали белый слой лимфоцитов. Лимфоциты помещали в
лунки 96-луночного планшета (NUNC, США) (5000 клеток в 190 мкл культуральной
среды DMEM (ПанЭко, Россия)). Вносили раствор исследуемых веществ в культуральной
среде до конечной концентрации 25 мкМ. Контролем служили клетки без препарата.
Клетки инкубировали 72 часа при 37 оС, 5% СО2, в увлажненной атмосфере. Исследовали
морфологию клеток методом конфокальной микроскопии при увеличении в 500 раз.
61
5.Исследование способности липидов повреждать мембрану эритроцитов
Эритроциты выделяли из крови человека: кровь инкубировали при 37 оС 15 мин., к 5 мл
фиколла (ПанЭко, Россия) добавляли наслаиванием 10 мл крови, центрифугировали 10
мин. при 500 об./мин., отбирали бордовый слой эритроцитов, добавляли PBS (ПанЭко,
Россия) в соотношении 1:1. Центрифугировали при 3 мин. при 1000 об./мин.
Приготовление проб: к 150 мкл осадка эритроцитов добавляли исследуемые соединения
до необходимых концентраций, тщательно перемешивали. В контрольную пробу без
липидов добавляли по 50 мкл дистиллированной воды до достижения 100%-ного
гемолиза. Инкубировали 15 мин. при 370 С. Центрифугировали 5 мин при 1000 об./мин.
Отбирали надосадки.
Проводили измерение оптической плотности надосадков на
планшетном спектрофотометре Мultiscan FC (Thermo Scientific, США) при длине волны
545 нм.
6.Исследование способности липидов повреждать смоделированную мембрану
липосом
Липосомы,
нагруженные
карбоксифлуоресцеином,
получали
по
ранее
опубликованному методу [284]. Смесь 5 мг ДОФХ (Sigma, США) и 5 мг холестерина
(Sigma, США) растворяли в 200 мкл хлороформа, упаривали в токе азота и высушивали 1 ч
при давлении 0,1 мм рт. ст. К полученной липидной пленке добавляли 1 мл буферного
раствора, содержащего 10 мМ Tрис основания, 10 мМ 2-N-морфолиноэтансульфоновой
кислоты, 100 мМ КСl и 70 мМ карбоксифлуоресцеина (буфер А), обрабатывали
ультразвуком в течение 5 мин. и подвергали пяти циклам замораживания-оттаивания,
встряхивая взвесь после каждого цикла. Полученную смесь мультиламеллярных липосом
пропускали через поликарбонатный фильтр с порами диаметром 0,1 мкм, используя миниэкструдер
Avanti
(Avanti
Polar
Lipids,
США).
He
включившийся
в
липосомы
карбоксифлуоресцеин отделяли гель-хроматографией на колонке 0,5×18 см, заполненной
сефадексом G-50 и уравновешенной буфером А, не содержавшем карбоксифлуоресцеина.
62
Суспензию липосом, очищенных от несвязанного карбоксифлуоресцеина, помещали
в кювету, добавляли буфер А до конечного объема 2 мл и вносили исследуемые соединения
(конечная концентрация 50 мкМ). Изменение флуоресценции регистрировали через 20 мин.
инкубации
на спектрофлуориметре
Cary Eclipse (Varian, США). Флуоресценцию
карбоксифлуоресцеина возбуждали при длине волны 490 нм и регистрировали при 520 нм
(ширина щелей 5 нм). Долю вышедшего красителя рассчитывали по формуле:
α = (Ff - F0)/(Fm - F0),
где F0 и Ff – интенсивность флуоресценции до и после добавления соединений, Fm –
интенсивность флуоресценции после полного разрушения липосом детергентом Тритон X100 (конечная концентрация 2,4%).
7.Окраска клеток пропидия иодидом для исследования изменений клеточного цикла
Клетки НСТ116 рассеивали в 60-мм чашки Петри в логарифмической фазе (100000200000 клеток в 4 мл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37оС, 5% СО2, в
увлажненной
атмосфере, обрабатывали необходимыми дозами препарата. В качестве
контроля служили необработанные клетки. Образцы инкубировали при 37 оС, 5% СО2, в
увлажненной атмосфере в течение 24 и 48 часов. После окончания инкубации клетки
снимали с подложки раствором трипсин-ЭДТА и осаждали центрифугированием (1000
об./мин., 15 мин.). К осадку клеток добавляли 0,5 мл лизирующего буфера (состав водного
раствора: цитрат Na – 0,1%, NP40 – 0,3%, РНКаза A - 100 мкг/мл, пропидия йодид - 50
мкг/мл), тщательно перемешивали. Исследовали на проточном цитофлуориметре BD
FACS Canto II (BD, США).
8.Обратная транскрипция и ПЦР (RT-PCR)
Клетки рассеивали в 6-луночные планшеты (Costar, CША; 100000 клеток в 4 мл
культуральной среды на лунку) и обрабатывали необходимыми дозами препарата. В
качестве контроля служили необработанные клетки. Образцы инкубировали при 37 оС, 5%
63
СО2,
в
увлажненной
атмосфере
в
течение
24
часов.
Клетки
осаждали
центрифугированием и лизировали реагентом TRIzol (Invitrogen, CША). На 800000 клеток
использовали 0,8 мл TRIzol. К лизату добавляли 0,16 мл хлороформа, перемешивали,
оставляли при комнатной температуре до начала разделения фаз и центрифугировали 10
мин. при 12000 об./мин. Водную фазу переносили в новую пробирку, добавляли 0,5 мл
изопропанола, перемешивали и инкубировали 10 мин. при комнатной температуре. Смесь
центрифугировали 10 мин. при 12000 об./мин., осадок (тотальная клеточная РНК)
промывали 0,5 мл 70% водного этанола, просушивали от спирта и растворяли в 10 мкл
деионизированной воды.
Обратную транскрипцию и ПЦР проводили, используя реактивы Fermentas (CША).
К образцу тотальной РНК добавляли 1 мкл (50 нг) смеси гексамеров (Random hexamer
primers, Литех, Россия) и 1 мкл 10 мкМ смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов
(dNTP mix, Fermentas, США), инкубировали 10 мин. при 650С, затем добавляли по 3 мкл
деионизированной воды, 4 мкл солевого буфера для обратной транскрипции, содержащего
MgCl2 - 5 мM, дитиотрейтол - 10 мM (5x RT-buffer, Fermentas, США), и по 1 мкл обратной
транскриптазы (Fermentas, США). Пробы инкубировали 10 мин. при комнатной
температуре, затем 50 мин. при 420С и 15 мин. при 700С.
Синтезированную кДНК
растворяли в 50 мкл деионизированной воды и хранили при -200С или использовали для
ПЦР.
ПЦР: на 25 мкл (общий объем каждой пробы) вносили кДНК 2 мкл, буфер для
ПЦР (10х Fermentas, США) 2,5 мкл, смесь четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов
(Fermentas, США) 0,4 мкл (10mM), MgCl2 1,5 мкл (25mM), Taq-полимераза (Fermentas,
США) - 1 единица активности, деионизированная вода – 13,4 мкл.
64
Для амплификации использовали праймеры (Литех, Россия):
β-актин:
5’-GGCATCGTGATGGACTCCG-3’ (прямой);
5’-GCTGGAAGGTGGACAGCG A-3’ (обратный)
Длина продукта 140 п.н., число циклов 24.
p21waf1/cip1:
5'-GGAAGACCATGTGGACCTGT-3' (прямой)
5'-ATGCCCAGCACTCTTAGGAA-3' (обратный)
Длина продукта 403 п.н., число циклов 26.
Количество циклов подобрано экспериментально при изучении диапазонов
линейного прироста продуктов ПЦР. Амплификацию каждой кДНК проводили в
отдельных пробирках на приборе Терцик (Россия). Длительность и температурный режим
циклов ПЦР: денатурация для первого цикла – 1 минута (940С), для каждого
последующего – 10 сек (940С), отжиг праймеров - 10 сек. (600С), элонгация - 30 сек (720С).
Для электрофоретического разделения продуктов ПЦР использовали по 10 мкл проб,
содержащих синтезированную кДНК, смешивали с погружным буфером 6X DNA Loading
Dye (Thermo Scientific, США) и наносили на 1% агарозный гель. Электрофорез проводили
в трис-ацетатном буфере. Продукты реакции наблюдали в ультрафиолетовом свете после
окрашивания гелей бромистым этидием (0,5 мкг/мл), фотографировали и проводили
денситометрию полос.
9.ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)
Для проведения ПЦР в реальном времени использовали набор с красителем SYBR
Green I (Синтол, Россия).
65
Праймеры (Литех, Россия):
β-актин:
5’-GGCATCGTGATGGACTCCG-3’ (прямой);
5’-GCTGGAAGGTGGACAGCG A-3’ (обратный)
p21waf1/cip1:
5'- TGAGCCGCGACTGTGATG-3' (прямой)
5'- GTCTCGGTGACAAAGTCGAAGTT-3' (обратный)
Готовили реакционную смесь: 2,5-кратная смесь (Синтол, Россия) 10 мкл, по 2,5
мкл каждого праймера, 9 мкл деионизированной воды, 1 мкл смеси после обратной
транскрипции (содержащей кДНК) – приведены концентрации для 1 пробы. ПЦР
проводили в амплификаторе Bio-Rad IQ5 (Bio-Rad Laboratories, США). Детектировали
результат в программе Bio-Rad IQ5 Software (Bio-Rad Laboratories, США). Длительность и
температурный режим циклов ПЦР в реальном времени: денатурация для первого цикла –
5 минут (950С); для каждого последующего из 45 циклов – 50 сек (950С), отжиг праймеров
- 50 сек. (600С), элонгация - 50 сек (720С), детекция сигнала SYBR Green I – 20 сек (860С);
полное достраивание продукта – 10 мин. (720С), построение кривой плавления ДНК –
каждые 10 секунд температура повышалась на 1С (60-950С).
10.Определение белков методом иммуноблоттинга
Клетки НСТ116 рассеивали в 60-мм чашки Петри в логарифмической фазе (100000200000 клеток в 4 мл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37оС, 5% СО2, в
увлажненной атмосфере, обрабатывали необходимыми дозами препаратов. В качестве
контроля служили необработанные клетки. Образцы инкубировали при 37оС, 5% СО2, в
увлажненной атмосфере в течение 24 и 48 часов. После окончания инкубации клетки
снимали с подложки раствором версена и осаждали центрифугированием (1 000 об./мин.,
66
15 мин.). Осадок клеток промывали холодным PBS-буфером и лизировали на льду в
течение 30 мин. в буфере RIPA (50мМ Tris-HСl pH 7,4; 150 мМ NaCl; 1% NP40; 0,25%
диоксихалата натрия) с добавлением
фенилметилсульфонил фторида до конечной
концентрации 2 мМ и смеси ингибиторов протеаз Protein Inhibitor Coctail (Sigma, США)
непосредственно перед лизированием. Лизаты центрифугировали в течение 15 мин. при
10000 об./мин., 4°C. Отбирали надосадки. Для измерения концентрации белка в лизатах
использовали раствор Брэдфорда (Sigma, США) и предлагаемую производителем
методику. Для построения калибровочной кривой использовали серийные разведения
БСА от 10 мг/мл до 312 мкг/мл. Измерение оптической плотности проводили в 96луночных планшетах (Greiner, США) на спектрофотометре Benchmark Plus Microplate
Reader (BIORAD, США) при длине волны 595 нм.
Электрофорез белков проводили в 10% полиакриламидном разделяющем геле,
содержащем на 10 мл: 3,3 мл 30%-ной акриламидной смеси, 2,5 мкл 1,5М Трис-глицерин
(pH8,8), 100 мкл 10% SDS, 100 мкл 10% APS, 4 мкл TEMED. Концентрирующий гель на 5
мл содержал: 830 мкл 30%-ной акриламидной смеси, 630 мкл 1М Трис-глицерин (pH6,8),
50 мкл 10% SDS, 50 мкл 10% APS, 4 мкл TEMED. Электрофорез проводили в аппарате
фирмы BioRad (США) при 100 В. В гель вносили 60 мкг/лунку тотального белка.
После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (поры
0,45 мкм, Amersham, США) в трис-глициновом буфере, содержащем 20% метанола, при
370 мА в течение 1 часа. Мембрану отмывали в 5% растворе обезжиренного сухого
молока в TBST буфере для блокирования. Использовали антитела (Cell Signalling, США):
к процессированным каспазам 12, 9, 3; расщепленному фрагменту поли(АДФ)рибозополимеразы (PARP); β-актину; фосфориллированному р53; p21waf1/cip1 (все разведения
1:1000). Для визуализации белков методом хемилюминесценции использовали вторичные
антитела к IgG кролика (Amersham, США), конъюгированные с
пероксидазой хрена
(1:5000). После блокирования мембраны инкубировали с первыми антителами в 1% BSA в
67
TBS-буфере с добавлением 0,1% Tвина-20 (Хеликон, Россия) при 4°С в течение 8 часов.
Мембраны отмывали в TBS-буфере с добавлением 0,1% Tвина-20 3 раза по 15 минут и
инкубировали со вторыми антителами в 5% обезжиренном молоке в TBS-буфере с
добавлением 0,1% Tвина-20. После инкубации Мембраны отмывали в TBS-буфере с
добавлением 0,1% Tвина-20 раза по 15 минут. Проявку белков проводили в растворе для
хемилюминесценции LumiGLO (Cell Signalling, США) и
визуализировали в камере
ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, США).
11.Окрашивание клеток аннексин V- пропидия иодид
Клетки НСТ116 рассеивали в 60-мм чашки Петри в логарифмической фазе по
100000-200000 кл. в 3 мл культуральной среды, инкубировали 24 часа при 37оС, 5% СО2, в
увлажненной
атмосфере.
Вносили
исследуемые
соединения
в
необходимых
концентрациях. Инкубировали 24 и 48 часов в СО2 –инкубаторе при температуре 370 С.
Клетки снимали с подложки версеном, центрифугировали, удаляли надосадок. К осадку
добавляли по 100 мкл 5-ти кратного аннексинового буфера (BD Pharmingen, США), по 5
мкл PE-аннексина V (BD Pharmingen, США) и пропидия йодида на пробу. Инкубировали
15 мин. при комнатной температуре в темноте. Центрифугировали, удаляли надосадок,
добавляли к осадку по 500 мкл 5-кратного аннексинового буфера. Исследовали на
проточном цитофлуориметре BD FACS Canto II (BD, США).
12.Исследование межнуклеосомной деградации ДНК
Клетки НСТ116 рассеивали в 60-мм чашки Петри в логарифмической фазе (100000200000 клеток в 4 мл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37оС, 5% СО2, в
увлажненной атмосфере, обрабатывали необходимыми дозами препаратов. В качестве
контроля служили необработанные клетки. Образцы инкубировали при 37 оС, 5% СО2, в
увлажненной атмосфере в течение 24 и 48 часов. После окончания инкубации клетки
снимали с подложки раствором версена и осаждали центрифугированием (1 000 об./мин.,
15 мин.).
68
Осадок лизировали в 0,5 мл буфера, содержащего 0,35M NaCl, 20 мM Tris-HCl
(pH7,4), 2 мM MgCl2, 1 мM ДТТ, 0,5% NP-40, дистиллированную воду). Лизировали на
льду 30 мин. Надосадочную жидкость центрифугировали при 12000 об./мин. 10 мин.
Супернатант удаляли и осадки последовательно растворяли в 100 мкл лизирующего
буфера, добавляли получившийся лизат к осадку клеток. Через 30 мин. Лизиованные
клетки переносили в новые пробирки и добавляли 500 мкл хлороформа с фенолом в
соотношении 1:1. Центрифугировали 10мин. При 12000 об./мин. Переносили водную фазу
в новые пробирки, добавляли 50 мкл 3М ацетата натрия (pH5,2) и 1,5 объема абсолютного
этанола. Замораживали при -20оС в течение 8 часов. ДНК осаждали центрифугированием
при 12000 об./мин. 20 мин., супернатант удаляли и добавляли по 1 мл 70% этанола, после
чего центрифугировали при 12000 об./мин. 10 мин. Осадки высушивали и растворяли в
растворе 47 мкл буфера TAE и 3 мкл 10 мг/мл РНКазы А. Пробы помещали в термостат на
30 мин. при 37оС. Проводили ээлектрофорез ДНК в 1% агарозном геле, визуализировали в
ультрафиолете после окраски бромистым этидием (0,5 мкг/мл).
13.Проверка изменения межмембранного потенциала митохондрий при действии
липидов
Клетки НСТ116 рассеивали в 60-мм чашки Петри в логарифмической фазе (по
100000-200000 кл. в 4 мл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37оС, 5% СО2,
в увлажненной атмосфере. Вносили исследуемые соединения в концентрациях 12,5 мкМ
и 25 мкМ. Инкубировали 48 часов в СО2 –инкубаторе при температуре 370 С. Клетки
снимали с подложки версеном, центрифугировали, удаляли надосадок. К осадку
добавляли по 100 мкл 5-ти кратного буфера (Invitrogen, США), по 5 мкл Mitotracker Red
(Invitrogen, США) на пробу. Инкубировали 20 мин. при комнатной температуре в темноте.
Центрифугировали, удаляли надосадок, добавляли к осадку по 500 мкл 5-кратного буфера.
Исследовали на проточном цитофлуориметре BD FACS Canto II (BD, США).
69
14.Наблюдение локализации флуоресцентно-меченного липида в клетке
Клетки C6 рассеивали в 60-мм чашки Петри в логарифмической фазе (100000200000 клеток в 4 мл культуральной среды), инкубировали 24 часа при 37оС, 5% СО2, в
увлажненной
атмосфере, обрабатывали дозой флуоресцентно-меченного препарата 12
мкМ. В качестве контроля служили необработанные клетки. Образцы инкубировали при
37 оС, 5% СО2, в увлажненной атмосфере в течение 24 часов. После окончания инкубации
клетки визуализировали распределение липида на микроскопе AxioCam Hrm digital camera
(Carl Zeiss, Германия).
15.Накопление липида 6FL в клетках С6
Клетки C6 рассеивали в 60-мм чашки Петри в логарифмической фазе (100000200000 клеток в 4 мл культуральной среды), обрабатывали дозой флуоресцентномеченного препарата в указанных концентрациях. В качестве контроля служили
необработанные клетки. Образцы инкубировали при 37 оС, 5% СО2, в увлажненной
атмосфере от 15 мин. до 48 ч. После окончания инкубации клетки снимали с подложки
версеном,
центрифугировали,
центрифугировали,
удаляли
надосадок.
Осадок
ресуспендировали в 1мл буфера PBS, центрифугировали 2 мин. при 2000 об./мин. Осадок
ресуспендировали в 0,6 мл буфера PBS, флуоресценцию снимали на проточном
цитофлуориметре BD FACS Calibur (BD, США).
16.Исследование способности липидов к ингибированию протеинкиназ в тестсистеме Streptomyces lividans aphVIII+
Тестовую культуру Streptomyces lividans aphVIII+ помещали в чашки Петри,
вносили в них бумажные диски (диаметром 8 мм), содержащие канамицин 3 мкг/диск, а
также 20 нмоль/диск тестируемых препаратов. В качестве контроля использовали диски с
канамицином
(3
мкг/диск),
а
также
с
70
канамицином
(3
мкг/диск)
и
бис-1-
индолилмалеимидом (400 нмоль/диск). Инкубировали при 28°С в течение 20 ч. Измеряли
зоны ингибирования для контрольных дисков и дисков с препаратами.
17.Скрининг протеинкиназ как возможных мишеней действия липидов
Внесли в лунки 96-ти луночного планшета 15 мкл протеинкиназ Ins-R, Met, Src,
Pim-1 и в контрольные лунки 15 мкл реакционного буфера Kinase-Glo® Plus Buffer (КВ).
Переносили в каждую лунку, кроме контрольных, по 15 мкл раствора исследуемых
соединений до конечных концентраций 10 мкМ. Количество повторов – 8. Инкубировали
смесь при комнатной температуре в течение 30 мин., прикрыв крышкой, после чего в
каждую лунку добавляли по 15 мкл субстрат-АТР смеси, перемешивали. Инкубировали
киназную реакцию при 37°С в течение 30-120 мин., закрыв планшеты крышками от
испарения. Приготовили реагент: растворили Kinase-Glo® Plus Substrate в 10 мл буфера
Kinase-Glo® Plus Buffer. Конечные концентрации веществ в киназной реакции: Киназа 50
нг на лунку, субстрат поли(Glu, Tyr 4:1) 5 мкг на лунку = 0,25 мкг/мкл, исследуемые
соединения 1-10 мкM, АТР 5 мкM, ДМСО 1,25 %. Объем реакционной смеси 45 мкл. По
окончании киназной реакции добавляли в каждую лунку по 30 мкл реагента,
инкубировали планшет 10 мин. при комнатной температуре, закрыв крышкой, и измерили
люминесценцию на Beckman Coulter© DTX 880 Multimode Detector. Параметры
измерения: время измерения – 100, 400, 1000 мс, чувствительность измерения – expected
high activity.
18.Исследование влияния липидов на функционирование топоизомеразы I
Реакционную смесь (20 мкл), содержащую 0,25 мкг ДНК плазмиды pBR322
(Fermentas, США), топоизомеразу I (1 ед.акт.) (Promega, США) и исследуемые вещества
инкубировали в буфере: 35 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 72 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ, 2
мМ спермидина, 0,1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина – все реактивы фирмы
«Sigma», США) в течение 30 мин. при 37° С. Реакция останавливали внесением
додецилсульфата натрия до конечной концентрации 1 %. После добавления раствора (0,5
71
мг/мл) протеиназы К (1:10) реакционную смесь инкубировали 40 мин. при 37°С. В
анализируемые пробы добавляли 0,1% раствор бромфенолового синего (1:10) и продукты
реакции разделяли в 1%-ном агарозном геле (3 В/см) в течение 4-5 час. Состав буфера: 40
мМ Трис-основания, 1 мМ ЭДТА, 30 мМ ледяной уксусной кислоты. После проведения
электрофореза
гель
обрабатывали
раствором
бромистого
этидия,
0,7
мкг/мл.
Визуализацию гелей проводили в УФ-свете.
19.Определение параметров связывания липид-ДНК
Лиофильно высушенный препарат натриевой соли ДНК из молок семги
(предоставлен С.А. Потехиным, Институт белка РАН). Препарат ДНК имел отношение
оптических плотностей D260 / D280 , равное 1,75, и содержал менее 0,5% белковых
примесей. Молекулярный вес ДНК опредееляли по данным измерения вязкости растворов
ДНК в 0,2 M NaCl в интервале концентраций 0,1−0,8 мг/мл.
Измерения проводили на автоматическом вискозиметре Зимма AV-1 (НПО
«Биоприбор», Россия) при температуре 20,0±0,1°С и среднем градиенте сдвига 1,2 с-1.
Значение характеристической вязкости препарата ДНК - [ ]  5.320.17 дл/г. Используя
уравнение Марка-Куна-Хувинка, получили значение молекулярной массы ДНК M  730
kDa.
Готовили раствор липида в ДМСО с концентрацией 15 мМ. Раствор ДНК в
фосфатном буфере (рН 7,3, ионная сила 0,016) получали диализом против буферного
раствора в течение 20 ч. при 4 °С. Концентрацию ДНК после диализа уточняли по
1mg mL
экстинкции E260
nm
1
 20.3 .
Аликвоту раствора липида в ДМСО добавляли в фосфатный буфер (рН 7.3, ионная
сила 0.016) и получали раствор липида в буфере с концентрацией 1 мМ. Содержание
ДМСО в этом растворе составляло 7.5%. В раствор ДНК добавляли ДМСО до
72
концентрации 7,5% и получали раствор ДНК с концентрацией пар оснований 1 мМ.
Смешением
равных
объемов
указанных
растворов
ДНК
и
липидов
готовили
эквимолярные смеси ДНК-липид (моль пар оснований/моль липида). Смеси выдерживали
перед измерениями при комнатной температуре в течение 20 ч.
Калориметрические измерения проводили на дифференциальном адиабатном
сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4 (НПО «Биоприбор», Россия) в температурном
интервале 10-130 °С при скорости нагревания 1 К∙мин-1 и избыточном давлении 0.25 МПа.
Первичную обработку термограмм и преобразование парциальной теплоемкости в
избыточную теплоемкость наблюдаемых переходов проводили с помощью программы
НАИРТА 2.0 (Институт элементоорганических соединений РАН, Москва). Температуру
максимума кривой избыточной теплоемкости ДНК или липида принимали за температуру
соответствующего перехода. Энтальпию перехода определяли интегрированием функции
избыточной теплоемкости.
Размер липидных частиц в буферном растворе (рН 7,3, ионная сила 0,016, 7,5 %
ДМСО) определяли методом динамического светорассеяния на приборе Malvern Zetasizer
Nano-ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания) при 25 °С под углом 173°.
Концентрация липидов составляла 0,5 мМ. Источником света с длиной волны 632,8 нм
служил гелий-неоновый лазер. Испытуемый раствор фильтровали через 22 мкм мембрану
Millipore в 1 см кювету, предварительно промытую 1 мл фильтрата. Время установления
температурного
равновесия
в
кювете
-
10
мин.
Распределение
частиц
по
гидродинамическому радиусу получали усреднением 5 измерений, каждое из которых
было результатом 10-16 сканирований.
20.Моделирование возможного взаимодействия липидов с ДНК и топоизомеразой I
3-D модели лигандов и мишеней создавали с помощью SYBYL 8.0 молекулярнографического пакета (Tripos Inc., St.Louis, USA).
73
Стартовые координаты для
топоизомеразы и ДНК взяты базы данных PDB (ID:1A36). Оптимизацию моделей и
устранение неблагоприятных Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий проводили с помощью
молекулярно-механической минимизации в SYBYL, используя метод Пауэла и
следующие параметры: для молекулярно-механических вычислений использовали
силовое поле TRIPOS, частичные заряды на атомах мишенях рассчитывали с помощью
топологического подхода, используя метод Гайстагера – Хюккеля, радиус обрезания для
нековалентых взаимодействий был равным 8 ангстрем, диэлектрическую проницаемость
принимали как функцию от расстояния, число итераций - 500, в начале оптимизации
использовали симплекс-метод, критерий сходимости для градиента энергии 0,05 kcal mol1Å-1. Для расчёта зарядов на атомах лигандов использовали гибридный функционал
плотности B3LYP с базисным набором 6-31G (d, p). Для электронной плотности заряды
рассчитывали с использованием электростатического потенциала на сетке. Все квантовомеханические вычисления делали с помощью пакета Gaussian 9.
Для определения наиболее вероятного сайта связывания на поверхностях мишеней
и оценки энергии связывания использовали программу Autodock 4.2. Конформацию ДНК
оставляли неизменной. Докинг на поверхность топоизомеразы проводили в два этапа: на
первом этапе её поверхность не менялась, на втором этапе конформация боковых групп
аминокислотных остатков, формирующих активный центр (Arg488, Arg590, His632 and
Phe723), и остатков (Tyr231, Glu232, Glu255, Phe259, Tyr308, Phe309 and Glu356), несущих
отрицательный заряд и расположенных в сайте, где лиганды показали наиболее высокое
сродство к мишени во время первой процедуры докинга, были подвижными.
Использовали Ламарковский генетический алгоритм. Для расчёта энергии связывания
использовали сеточный метод: перед процедурой докинга в узлах решётки рассчитывали
электростатические и ван-дер-Ваальсовы вклады для каждого типа атомов, формирующих
лиганд. Параметры для оценки межатомных взаимодействий и энергии десольватации
брали из силового поля Amber. Количество узлов задавали 126×126×126, а размер ячейки 74
0.375 Å. Центр сетки располагался в геометрическом центре масс мишени. Параметры для
докинга выбрали по умолчанию, при этом число запусков было равным 100. Оценка
энергии связывания производилась с помощью полуэмпирической оценочной функции
программы AutoDock 4.2. Энергия связывания оценивалась по формуле:
ΔGbinding = ΔGelec + ΔGvdW + ΔGhbond + ΔGdesolv
Терм ΔGelec, оценивающий электростатический вклад,
рассчитан с использванием
диэлектрической проницаемости, зависимой от расстояния по формуле Mehler and
Solmajer. Ван дер Ваальсов вклад ΔGvdW рассчитан с помощью потенциала ЛенардаДжонса. Терм ΔGhbond,,
оценивающий энергию водородных связей, рассчитан с
применением 10/12 потенциала, при этом энергия в минимуме бралась равной 5 kcal/mol,
а расстояние между донором и акцептором было равным 1.9Å. Энергия десольватации
ΔGdesolv, оценивалась по Stouten et al [285].
Все эксперименты проведены с минимумом тремя независимыми повторами.
Количественную
обработку
результатов
проводили
с
использованием
методов
параметрической статистики пакета «Microsoft Office Excel» (Microsoft Corporation,
США).
75
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1
Установление структуры фактора активации тромбоцитов (ФАТ) стало важным
шагом в поиске новых соединений для лекарственной терапии опухолей. Этот
биорегулятор широкого спектра действия стал прототипом ряда лекарственных
препаратов. Широкомасштабные исследования позволили получить близкие по структуре
и действию ФАТ соединения, не обладающие его основным недостатком - мощной
тромбоцит-агрегирующей способностью. Одним из наиболее известных перспективных
противоопухолевых агентов липидной природы является эдельфозин - алкильный
фосфатсодержащий глицеролипид, являющийся структурным аналогом ФАТ, но не
проявляющий тромбоцит-агрегирующей способности. Эдельфозин вызывает гибель
опухолевых клеток различного тканевого происхождения, однако он обладает высокой
гемолитической активностью. Этот факт повлек за собой поиск структурных аналогов
эдельфозина, которые индуцируют гибель опухолевых клеток и менее токсичны для
неопухолевых клеток, и вызывают минимальный гемолитический эффект. Еще одним
недостатком эдельфозина состоит в том, что его фосфатсодержащие структурные аналоги
могут разрушаться под действием фосфолипаз, что дало начало синтезу и биологическим
исследованиям алкильных катионных глицеролипидов, не содержащих фосфатную
группу.
При этом учитывались обнаруженные ранее требования к структуре алкильных
противоопухолевых глицеролипидов [286]. Для проявления их противоопухолевой
активности важным является наличие в структуре алкильных бесфосфорных катионных
глицеролипидов следующих структурных единиц:

длинноцепочечный алкильный, алкенильный или ацильный заместитель в С(1)
положении глицеринового остова (14-19 метиленовых групп);
1
Нумерация соединений, схем, таблиц и рисунков, принятая в разделах «Результаты и обсуждение»,
«Заключение» и «Выводы», отличается от нумерации в «Обзоре литературы».
76

короткоцепочечный алкильный заместитель в С(2) положении (1-2 метиленовые
группы);

аммониевая
группа
с
небольшими
заместителями
алкильного
типа
или
гетероциклическая катионная головка с положительно заряженным атомом азота
или серы, присоединенная либо непосредственно к С(3) атому глицеринового
остова, либо через спейсерную группу алкильного, ацильного или алкенильного
типа.
Природа
катионного
домена
играет
значительную
роль
в
проявлении
противоопухолевого эффекта глицеролипида [287].
В предыдущих исследованиях тестировались катионные бесфосфорные алкильные
глицеролипиды, структурные формулы которых различались только типом катионной
алифатической головки [287]. Среди ранее полученных липидов был получен rac-N-{4[(2-этокси-3-октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}N,N-диметил-N-(2гидроксиэтил)аммонийиодид, сопоставимый по своей противоопухолевой активности с
эдельфозином.
В
настоящей
работе
исследуются
синтезированные
в
МИТХТ
им.М.В.Ломоносова липиды с катионными доменами гетероциклической природы,
различающиеся типами полярной головки (таблица 1) [285]. Изучение их биологического
действия
и
сравнение
с
rac-N-{4-[(2-этокси-3-
октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}N,N-диметил-N-(2гидроксиэтил)аммонийиодидом и эдельфозином стало предметом данной работы.
Таблица 1. Формулы исследуемых катионных глицеролипидов
№
1
Формула
Название соединения
rac-N-{4-[(2-этокси-3октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-Nметилпиперидинийбромид
77
Продолжение таблицы 1
2
rac-N-{4-[(2-этокси-3октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-Nметил-4-гидроксипиперидинийиодид
3
rac-N-{4-[(2-этокси-3октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-Nметил-морфолинийиодид
4
rac-N-{4-[(2-этокси-3октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-Nпиридинийбромид
5
rac-N-{4-[(2-этокси-3октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-Nэтил-имидазолинийиодид
6
rac-N-{4-[(2-этокси-3октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}N,Nдиметил-N-(2-гидроксиэтил)аммонийиодид
7
rac-N-{4-[(2-этокси-3октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-Nметил-имидазолинийиодид
78
Продолжение таблицы 1
Эдельфозин, 1-октадецил-2-метил-
8
sn-глицеро-3-фосфохолин
1.Исследование цитотоксичности катионных глицеролипидов
Цитотоксическое действие 1-8 исследовалось методом МТТ-теста (по способности
восстановления желтой соли 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтераразола в темносиний кристаллический формазан дегидрогеназами митохондрий живых клеток) для ряда
культур опухолевых клеток (таблицы 2, 3).
Таблица 2. Кривые выживаемости опухолевых клеток при действии 1-8.
НСТ116
SCOV-3
90
90
Доля выживших клеток, %
100
Доля выживших клеток, %
100
80
70
60
50
40
30
20
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Концентрация липида, мкМ
Концентрация липида, мкМ
79
Продолжение таблицы 2
100
100
90
90
Доля выживших клеток, %
MCF-7
Доля выживших клеток, %
HL-60
80
70
60
50
40
30
20
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
Концентрация липида, мкМ
Концентрация липида, мкМ
K562
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Доля выживших клеток, %
Доля выживших клеток, %
B-16
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Концентрация липида, мкМ
Концентрация липида, мкМ
80
Таблица 3. Показатели цитотоксичности IC50 (концентрации, необходимые для
гибели 50% клеток) при действии 1-8
IC50, мкМ
Соединение
HCT116
SCOV-3
HL-60
MCF-7
B16
К562
1
14,3±0,3
40,0±1,8
17,2±1,3
>50
36,2±1,7
42±1,5
2
14,5±0,4
35,2±0,9
17,3±0,9
>50
41,0±2,1
40±1,3
3
15,0±0,8
42,5±1,9
28,0±1,2
>50
>50
>50
4
12,8±0,2
12,8±0,8
4,8±0,4
10,9±1,3
16,1±0,7
17,5±0,5
5
11,5±0,4
8,9±0,7
4,9±0,6
30,0±1,0
14,8±0,4
18±0,5
6
14,7±0,5
9,9±0,4
4,9±0,3
14,8±0,7
16,2±0,5
14±0,9
7
10,8±0,3
8,0±0,5
3,8±0,6
20,4±0,6
14,1±0,5
17±0,6
8
1,0±0,5
3,4±0,2
2,0±0,2
6,5±0,5
6,0±0,7
32±2,0
На все использованные клеточные линии, кроме К562, эдельфозин (8) оказывает
цитотоксическое действие в субмикромолярных концентрациях. Значения показателей
IC50 больше 20 мкМ интерпретируем как незначительный цитотоксический эффект для
липидов, при IC50, больших 50, соединения нетоксичны. Клетки НСТ-116 подвержены
наибольшему цитотоксическому действию катионных липидов с пиридиниевым (4),
этилимидазолиевым (5) и метилимидазолиевым (7) полярными доменами. Линия SCOV-3
в меньшей степени подвержена цитотоксическому действию изучаемых соединений:
показатели цитотоксичности 5 и 7 сопоставимы со значением для образца сравнения с
алифатическим полярным доменом 6. Для MCF-7 4 токсичнее, чем образец сравнения 6.
На клетки В-16 липиды 4, 5, 7 оказали большее действие, чем 6. Клетки HL-60
чувствительны к действию большинства исследованных липидов, 7 токсичнее, чем 6, и
сопоставим
с
8.
Для
линии
К562
удовлетворительные
значения
показателя
цитотоксинчости проявили липиды 4-7. Эта линия не чувствительна к эдельфозину 8.
Разница между чувствительностью клеток солидных опухолей и лейкозов к эдельфозину
объясняется его накоплением во внутриклеточных гидрофобных компартментах
81
(мембранах
ЭПР
и
митохондрий)
и
в
рафтах
цитоплазматической
мембраны
соответственно. Возможно, низкие для данного ряда показатели цитотоксичности на HL60
(и относительно низкие по сравнению с эдельфозином на К562) могут быть опосредованы
аналогичной разницей в локализации катионных липидов.
Анализ приведенных данных по всем исследованным клеточным линиям позволил
выбрать из предоставленных соединений с гетероциклическими головками липиды с
пиридиниевым (4), этилимидазолиевым (5) и метилимидазолиевым (7) катионными
доменами для дальнейших исследований. Липиды с метилпиперидиниевой (1), метил-4гидроксипиперидиниевой (2) и метилморфолиниевой (3) катионными головками
оказались слаботоксичными.
Цитотоксичность 4-7 для неопухолевых фибробластов человека приведена на рис.1.
Доля выживших клеток,%
100
4
50
5
6
7
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Концентрация липида, мкМ
Рис.1. Кривые выживаемости неопухолевых фибробластов человека при действии 47
Гибель 50% здоровых клеток происходит при концентрациях липидов 4-7,
превышающих 30 мкМ (слабая токсичность). В интервале цитотоксических концентраций
для опухолевых клеток от 12 до 25 мкМ наилучший результат показал липид с
метилимидазолиевой головкой (7), в его цитотоксическом интервале выжило 85-95%
здоровых клеток. Этот результат лучше, чем для эдельфозина, для которого в его
эквитоксическом интервале - 2-8 мкМ - выжило 80-90 % здоровых клеток. Тестируемые
82
алкильные
катионные
бесфосфорные
глицеролипиды
практически
не
убивают
нормальные клетки, что выгодно отличает их от эдельфозина.
В качестве здоровых клеток нами также использовались лимфоциты, выделенные из
донорской крови человека. Они инкубировались 72 часа с липидами 4, 5, 6, 7 и
эдельфозином (8) в максимальной концентрации 25 мкМ – для бесфосфорных липидов и
10 мкМ – для эдельфозина. После истечения времени инкубации морфологически
лимфоциты в контрольной пробе без липидов не отличались от клеток образцов,
содержащих катионный липид: они были округлой формы, без видимых повреждений.
Отсутствие этой разницы может свидетельствовать о том, что исследуемые липиды не
влияют на здоровые лимфоциты.
2.Исследование
способности
липидов
повреждать
мембрану
эритроцитов
и
смоделированную мембрану липосом
При высоких показателях цитотоксической активности по отношению к опухолевым
клеткам некоторые соединения могут обладать и высокой гемолитической активностью. В
частности, гемолитический эффект является одним из недостатков эдельфозина. Мы
проверили
активность
исследуемых
соединений
вызывать
гемолиз
донорских
4
7
Доля гемполиза относительно
эдельфозина, %
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
6
7
8
вода
Доля гемолиза относительно воды,
%
эритроцитов (рис.2).
Соединение
100
80
60
40
20
0
1
2
3
5
6
Соединение
12 мкМ
18 мкМ
25 мкМ
12 мкМ
18 мкМ
25 мкМ
2 мкМ
4мкМ
8мкМ
2мкМ
4мкМ
8мкМ
Рис. 2. Результат проверки гемолитической активности
83
8
По отношению к гемолизу, вызванныму дистиллированной водой – 100%,
эдельфозин (8) проявил достаточно сильный гемолитический эффект, составивший 10%.
По сравнению с эдельфозином исследуемые соединения проявили в 10 раз меньший
эффект. 1%-ный гемолиз для исследуемых катионных липидов относительно контроля с
водой является нормальным показателем и открывает возможность их использования в
экспериментах in vivo без дополнительных модификаций для снижения гемолиза
(например, включения в липосомы).
Прямое мембранолитическое действие липидов исследовали также в физикохимической системе: соединения 4, 5, 7, 8 инкубировали с искусственными липосомами, в
состав которых входят фосфатидилхолины и холестерин. Внутрь таких частиц помещали
краситель карбоксифлуоресцеин, не образующий химические связи с компонентами
липосомы. Если целостность липосомы нарушается экзогенным соединением,
карбоксифлуоресцеин вытекает, что детектируется по нарастанию флуоресценции в
растворе с суспендированными липосомами.
4
5
7
8
Рис.3. Вытекание карбоксифлуоресцеина из липосом при действии 4, 5, 7, 8
84
Эдельфозин
(8)
вызывает
существенно
более
выраженное
вытекание
карбоксифлуоресцеина из липосом, чем бесфосфорные липиды 4, 5, 7 в диапазоне
соотношений “исследуемое соединение:липосомальный липид” от 0,008 до 0,2. Эти
данные подтверждают полученные результаты исследования гемолиза. При увеличении
концентрации противоопухолевых липидов (возрастании соотношения “исследуемое
соединение:липосомальный липид” до 1) мембранолитические свойства бесфосфорных
катионных липидов различались: соединение 4 вызвало наибольшее вытекание красителя,
сравнимое с эффектом 8. Для 5 и 7, различающихся заместителем в имидазолиевой
катионной головке, эффект вытекания красителя при увеличении концентраций
существенно не увеличился, т.е. эти соединения не повреждали липосомы даже в
относительно высоких концентрациях.
Сильная способность к нарушению целостности мембран фосфатсодержащего
эдельфозина и его аналогов объясняется геометрическим преобладанием размера
гидрофильной головки над размером гидрофобной части молекулы. В случае
бесфосорных катионных глицеролипидов это преобладание уменьшается, что может стать
объяснением снижения мембранолитической способности исследуемых соединений по
сравнению с эдельфозином.
3.Исследование изменений клеточного цикла
Под воздействием химических агентов могут происходить определённые изменения
клеточного цикла. Характер таких изменений важен для понимания механизма действия
исследуемых соединений.
3.1. Окраска клеток пропидия иодидом
Исследование
клеточного
цикла
проводили
методом
проточной
цитофлуориметрии, окрашивая фиксированные клетки НСТ116 интеркалирующим в ДНК
85
красителем (пропидия иодидом, PI). Липиды 4, 6, 7 исследовали в концентрациях 12 и 25
мкМ после 24 и 48 часов инкубации клеток.
12 мкМ
24ч
К
4
25 мкМ
48ч
G1 S G2/M
G1 S G2/M
24ч
G1 S G2/M
48ч
G1 S G2/M
G1 S G2/M
G1 S G2/M
G1 S G2/M
G1 S G2/M
G1 S G2/M
G1 S G2/M
6
G1 S G2/M
G1 S G2/M
G1 S G2/M
G1 S G2/M
G1 S G2/M
G1 S G2/M
7
Рис.4. Гистограммы клеточного цикла клеток НСТ116 при действии 4, 6, 7
Обнаружен арест клеток в G1-фазе, затрудняется переход в S-фазу, а также
появляются клетки с фрагментированной ДНК (пик subG1). Клеточный арест наблюдается
как при действии 12 мкМ 4, 5, 6, так и для 25 мкМ концентрации. Для липида 6 эффект
ареста временный, с увеличением времени инкубации с 24 до 48 часов количество клеток
в G2/M фазе увеличивается. Действие липида с 7 пролонгировано, он показал наибольший
эффект ареста. Наблюдалось увеличение числа пораженных клеток (фаза SubG1) как с
увеличением концентрации соединений, так и с увеличением времени инкубации от 24
часов до 48 часов.
3.2.Изучение влияния катионных липидов на уровень p21waf1/cip1
Полученные данные о возникновении G1/S клеточного ареста стали основанием для
проверки активности p21waf1/cip1 в ответ на действие наиболее активных из исследуемых
катионных глицеролипидов на уровне экспрессии гена (рис.5) и на уровне белка с
86
использованием в качестве контроля митоксанрона (эквитоксическая концентрация 2
мкМ), который повышает уровень p21waf1/cip1 при наличии активного р53 (рис.6).
Поскольку
из
литературных
источников
известно,
что
фосфатсодержащие
противоопухолевые липиды, такие, как эдельфозин и перифозин, независимо от р53
вызывают торможение клеточного цикла, активируя ингибитор циклинзависимых киназ
p21waf1/cip1, контролирующий переходы G1/S и G2/M, мы проверили активацию p21waf1/cip1
на парных клеточных линиях: НСТ116 (клетки дикого типа)
и НСТ116р53КО с
нокаутированным геном р53.
А. RT-PCR
p21waf1/cip1 (403 п.н.)
НСТ116 24ч.
β-актин (140 п.н.)
К
12
12
12
12
4
4
5
6
7
8
мкМ
Б. Real-time PCR p21waf1/cip1
НСТ116; 24ч.
Увеличение экспрессии р21
относительно небоработанных
клеток, разы
6
5
4
12 µM
25 µM
3
4 µM
2
8 µM
1
0
4
6
Липид
7
Рис.5. Результаты ПЦР-анализа экспрессии p21waf1/cip1
87
8
р21 (21 кДа)
НСТ116 24ч.
β-актин (45 кДа)
р21 (21 кДа)
НСТ116р53КО 24ч.
β-актин (45 кДа)
12
Контроль
25
6
12
25
7
2
8
Митоксантрон
8
мкМ
Рис.6. Результаты иммуноблоттинга с антителами к p21waf1/cip1
По результатам RT-PCR на клетках НСТ116 экспрессия p21waf1/cip1 возрастает
относительно контрольных необработанных проб при действии липидов 4, 6, 7, более
чувствительный метод Real-time PCR для расширенного диапазона концентраций показал
большее увеличение экспрессии p21waf1/cip1 для липидов в концентрациях 25 мкМ после 24
часов инкубации. Липид 7 проявил наибольший эффект активации p21waf1/cip1,
превысивший действие эдельфозина 8. Однако по результатам иммуноблоттинга
заметное повышение уровня белка p21waf1/cip1 наблюдается в клетках НСТ116 только при
действии липидов 7 и 8 (эдельфозин), и уровни этого белка в данных пробах сопоставимы.
На линии НСТ116р53КО с нокаутным р53 эта тенденция воспроизводится, и, в отличие от
липида 7, липид 6 не инициирует увеличение количества p21waf1/cip1 – это может быть
опосредовано разной степенью наблюдаемого эффекта ареста. Полученные результаты
дают основание полагать, что с активацией p21waf1/cip1 связан клеточный арест НСТ116,
наиболее ярко представленный липидом 7. Помимо этого, активация p21waf1/cip1 в культуре
НСТ116р53КО поставила вопрос о роли р53 в гибели опухолевых клеток, опосредованной
действием катионных липидов.
88
4.Определение типа гибели опухолевых клеток при действии катионных липидов
На основании литературных данных об апоптотической гибели опухолевых клеток,
вызываемой
соединениями-предшественниками
-
фосфатсодержащими
противоопухолевыми липидами, выявление типа гибели при действии бесфосфорных
катионных
глицеролипидов
проводилось,
исходя
из
гипотезы
об
аналогичном
апоптотическом эффекте исследуемых соединений. Для ее проверки использовалось
двойное окрашивание (аннексин V- пропидия иодид) и электрофоретический анализ
целостности ДНК. Более детально исследовалось участие каспаз и р53 в реализации
апоптоза, а также изучалось падение трансмембранного потенциала митохондрий.
4.1. Окрашивание клеток аннексин V- пропидия иодид
Поскольку эдельфозин вызывает апоптотическую гибель опухолевых клеток, мы
исследовали связывание аннексина V с мембранами клеток НСТ116, обработанных
наиболее активными липидами 6, 7, 8 при совместном окрашивании с пропидия иодидом.
При анализе полученных на проточном цитофлуориметре гистограмм необходимым
условием определения апоптоза является наличие смещения вправо относительно
контроля пика аннексина V.
Соединения 6, 7 применялись в концентрациях 12 мкМ и 25 мкМ с, а соединение 8
использовалось для сравнения в концентрации 8 мкМ; время инкубации клеток с
соединениями составило 48 часов (рис. 7).
89
Контроль
6
12 мкМ
25 мкМ
7
12 мкМ
25 мкМ
8
8 мкМ
Рис.7. Результаты исследования мембранных проявлений апоптоза клеток НСТ116 (48ч. инкубации)
На гистограммах происходит смещение пика аннексина V вправо вдоль оси абсцисс,
что соответствует мембранным проявлениям апоптоза. Наибольший сдвиг происходит
при действии соединения 7 и эдельфозина (8). Для образца сравнения 6 сдвиг меньше.
Наличие Sub-G1 фазы при окрашивании клеток пропидия йодидом и сдвиг пика
аннексина V подтверждюат предположение об апоптотическом типе гибели клеток.
90
4.2.Исследование межнуклеосомной деградации ДНК
Одним из поздних морфологических признаков апотоза является межнуклеосомная
фрагментация ДНК. Мы исследовали наличие этого признака при действии липидов 6, 7, 8
в концентрациях 25 мкМ после 48 и 72 часов инкубации клеток НСТ116 (рис. 8).
48 часов
72 часа
К
6
7
8
Рис.8. Электрофорез фрагментов ДНК при действии 6,7,8 на НСТ116
После 48 часов инкубации клеток с липидами 6, 7, 8 фрагментов, соответствующих
межнуклеосомной деградации ДНК, не наблюдалось. После 72-часовой инкубации при
разделении ДНК такие фрагменты выявлены после действия всех трех липидов.
Наблюдение
при
электрофорезе
«лестницы»
фрагментированной
ДНК
стало
подтверждением гипотезы об апоптотической гибели клеток НСТ116 в ответ на действие
липидов 6 и 7.
4.3.Определение роли процессированного PARP и каспаз 3, 9, 12 в апоптозе,
индуцированном липидами
Более детальное установление механизма апоптоза предполагало исследование
активации каспаз и PARP после действия липидов 6, 7, 8 и определение пути апоптоза.
Межнуклеосомная деградация ДНК может быть опосредована расщеплением
91
PARP,
который, в свою очередь, является мишенью каспазы-3. Эти белки исследовались после
72-часовой инкубации клеток НСТ116 с липидами 6, 7, 8 в эквитоксических
концентрациях. Поскольку из литературных данных известно, что эдельфозин в клетках
солидных опухолей инициирует ЭПР-стресс и митохондриальный апоптотический каскад,
мы проверили способность исследуемых липидов активировать каспазу-12 и каспазу-9
после 24, 48 и 72 часов инкубации. Поскольку для каспазы-9 видимый эффект наблюдался
в пробах после 48 часов инкубации, а для каспазы-12 различий для проб на этих
временных интервалах не было, приведены данные для 48-часовой инкубации. Контролем
служил препарат митоксантрон в концентрации 2мкМ.
Каспаза-12
(42.5 кДа)
Каспаза-9
(37 кДа)
48ч.
β-актин
(45 кДа)
Каспаза-3
(17,19 кДа)
PARP
72ч.
(89 кДа)
β-актин
(45 кДа)
2
Контроль
Митоксантрон
12
25
12
6
25
7
8
мкМ
8
Рис.9. Результаты иммуноблоттинга белков НСТ116 с антителами к каспазам и
процессированному PARP при действии липидов 6, 7, 8
92
По представленным результатам при действии липидов 6 и 7 каспаза-12 не
активируется, однако присутствует увеличение по сравнению с контролем количества
каспазы-9, уровень которой для концентраций катионных липидов 25 мкМ сопоставим с
пробой для эдельфозина (8), что свидетельствует об участии митохондрий в реализации
апоптоза при действии липидов. Эффект с активацией каспазы-3 и процессированием
PARP присутствует лишь для контрольных проб с митоксантроном и эдельфозином,
исследуемые липиды 6 и 7 не проявили подобной активности – это свидетельствует о
каспазонезависимом характере апоптоза при действии соединений 6, 7. Межнуклеосомная
деградация ДНК в результате каспазонезависимого апоптоза может быть опосредована
выходом из межмембранного пространстава митохондрий в цитозоль фактора индукции
апоптоза AIF и эндонуклеазы G (ENDOG), которые перемещаются в ядро и способствуют
фрагментации ДНК без участия эффекторных каспаз.
4.4.Проверка изменения межмембранного потенциала митохондрий при действии
липидов
Внутренний путь апоптоза предполагает падение трансмембранного потенциала
митохондрий в связи с выходом в цитозоль митохондриальных белков. После инкубации
клеток НСТ116 с липидами пробы окрашивали Mitotracker red и исследовали методом
проточной цитофлуориметрии. Соединения 6,7 применялись в концентрациях 12 мкМ и
25 мкМ с, а соединение 8 использовалось для сравнения в концентрации 8 мкМ; время
инкубации клеток с соединениями составило 48 часов (рис. 10).
93
Контроль
6
12 мкМ
25 мкМ
7
12 мкМ
25 мкМ
8 мкМ
8
Рис.10.
Результаты
исследования
падения
митохондриального потенциала клеток НСТ-116 (48ч. инкубации)
94
трансмембранного
Увеличение левого пика вдоль оси абсцисс на гистограммах по сравнению с
контрольными необработанными клетками свидетельствует о падении трансмембранного
потенциала митохондрий. Для катионных липидов этот эффект увеличивается с
повышением концентрации. Липид 7 оказал большее влияние, чем липид 6, и полученные
данные сопоставимы с действием эдельфозина 8. Эти результаты подтверждают гипотезу
о
митохондриальном
пути
апоптоза,
индуцированного
действием
исследуемых
соединений.
4.5.Исследование влияния р53 на апоптоз, опосредованный действием липидов
Наблюдавшийся на предыдущих этапах работы эффект активации p21waf1/cip1 в ответ на
действие липида 7 в культуре НСТ115р53КО (с генетически инактивированным р53), а
также литературные данные о р53-независимом апоптозе при действии эдельфозина стали
основанием для более детальной проверки влияния р53 на гибель, индуцированную
действием липида 7. Проводили исследование цитотоксичности 7 на клетках НСТ116 и
НСТ116р53КО после 72 часов инкубации методом МТТ-теста (рис.11 А). Далее методом
иммуноблоттинга проверяли уровень фосфориллированного белка р53 в клетках НСТ116
после 24 часов инкубации с липидом 7 и 6 (в качестве соединения сравнения). Липиды 6 и
7 исследовались в концентрациях 12 и 25 мкМ, контролем служили эдельфозин 8 и
препарат доксорубицин в эквитоксических концентрациях 8 и 2 мкМ соответственно (рис.
11 Б).
95
А. Кривые выживаемости после 72ч. инкубации клеток с 7
100
Доля выживших клеток, %
90
80
70
60
50
НСТ116
40
НСТ116р53КО
30
20
10
0
0
10
20
30
40
50
Концентрация липида 7, мкМ
Б. Результаты иммуноблоттинга белков НСТ116 с антителами к р53 при действии липидов
6,7,8
р53 (53 кДа)
β-актин
2
Контроль
12
Докс.
25
12
6
25
7
8
мкМ
8
Рис.11. Исследование активации р53 при действии липидов 6,7,8
По результатам МТТ-теста динамика гибели клеток использованных линий при
действии липида 7 одинакова. Иммуноблоттинг с антителами к фосфориллированному
р53 выявил его отсутствие как в пробах с катионными липидами 6,7, так и с эдельфозином
8. Следовательно, апоптотическая гибель клеток происходит без активации р53.
5.Поиск мишеней действия липидов
Одним
из
аспектов
исследования
противоопухолевого
действия
катионных
глицеролипидов стал поиск их возможных мишеней, взаимодействие с которыми
96
приводит к клеточной гибели. В литературе описано взаимодействие с протеинкиназой С
фосфатсодержащих липидов милтефозина и эдельфозина, также имеются данные о
влиянии этих предшественников на активность ряда протеинкиназ в клетках. Мишени
бесфосфорных катионных глицеролипидов не выявлены, и нашей задачей стал их поиск –
на данном этапе в контексте непосредственного взаимодействия с исследуемыми
соединениями. Для этого был синтезирован и исследован липид с флуоресцентным
зондом и проанализирована динамика его накопления в клетках, а также визуалзировано
его внутриклеточное распределение. Далее проводился скрининг протеинкиназ как
возможных мишеней липидов.
5.1.Наблюдение локализации флуоресцентно-меченного липида в клетке
Для
исследования
внутриклеточной
локализации
бесфосфорных
катионных
глицеролипидов в МИТХТ им.М.В.Ломоноcова синтезирован липид 6FL (rac-N-(4-((2этокси-3-октадецилокси)проп-1-илоксикарбонил)бутил)-N,N-диметил-N-(2-(N’дансил)аминоэтил)аммоний иодид ), содержащий флуоресцентную метку – дансильную
группу (рис.12 А). Введение дополнительной группы в структуру полярного домена
может отразиться на его биологическом действии, поэтому мы проверили его
цитотоксичность по отношению к клеткам НСТ116 и С6 после 72 часов инкубации
методом МТТ-теста (рис. 12 Б).
97
А.Структура липида с дансильной меткой
6FL
Доля выживших клеток, %
Б. МТТ-тест НСТ116 и С6, 72ч.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
6, НСТ116
6FL, НСТ116
6, С6
6FL, С6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Концентрация соединения, мкМ
Рис. 12. Цитотоксичность липида с флуоресцентной меткой по сравнению с липидом
6
По результатам исследования цитотоксичности 6FL он применим для исследования
накопления и распределения в клетках, так как его цитотоксичность мало отличается от
исходного липида 6.
Время накопления липида 6FL в клетках С6 определяли методом проточной
цитофлуориметрии по каналу 452 (Pacific Blue), исключив PI-позитивную популяцию.
98
Контроль
Время
12 мкМ
25 мкМ
15 мин.
30 мин.
1 ч.
24 ч.
Рис. 13. Накопление липида 6FL в клетках С6
99
Значительное накопление липида наблюдалось после 24 часов инкубации. Это
объясняет небыструю гибель опухолевых клеток. Липид с флуоресцентной меткой
использовался
для
определения
его
внутриклеточного
распределения
методом
флуоресцентной микроскопии после 24 часов инкубации с клетками С6 (рис.14).
Рис. 14. Внутриклеточная локализация липида 6FL
Видно накопление липида в гидрофобных компартментах клетки, исследуемый аналог
не проникает в ядро. Эти данные опосредуют поиск внеядерных мишеней для липидов, с
которыми
возможно
его
непосредственное
взаимодействие
без
дополнительных
модификаций.
5.2.Скрининг протеинкиназ как возможных мишеней для липида
Способность липидов к модуляции активности серин-треониновых протеинкиназ
исследовалась в ИОГен РАН с применением бактериальной тест-системы Streptomyces
lividans
aphVIII+.
антибиотику
Штамм Streptomyces
канамицину
за
счет
lividans
протеинкиназ,
устойчив к
аминогликозидному
активирующих
аминогликозид
фосфотрансферазу aphVIII. Протеинкиназные ингибиторы снижают эту резистентность и
вызывают бактериальный лизис штамма при действии канамицина. Контролем служил
ингибитор бис-индолилмалеимид I. Липиды 4-7 после 24 часов инкубации повышали
100
диаметр зоны бактериального лизиса с 8 мм (канамицин без ингибитора, 3 мкг) до 11 мм
(канамицин 3 мкг + липид 20 нмоль), контрольный ингибитор проявлял такой же эффект в
дозе 400нмоль, что говорит о способности исследуемых липидов к ингибированию серинтреониновых протеинкиназ.
Ингибирующее действие катионного липида 7 и эдельфозина 8 исследовалось во
внеклеточной системе на панели из 15 протеинкиназ: AKT1, ARK5, Aurora-B, AXL, BRAF
V600E, CK2-alpha1, IGF1-R, INS-R, FAK, MET wt, PLK1, PRK1, SRC, TRK-B, VEGF-R2; а
также PIM-1 (ИОГен РАН). Липид 7, в отличие от эдельфозина 8, ингибирует
протеинкиназы INS-R, MET wt, SRC, в концентрациях 10 мкМ на 40% и PIM-1 в
концентрации 1 мкМ на 9% . На дополнительной панели из 10 протеинкиназ (ProQinase
GMBH): фосфотидилинозитол-4 киназ PI4K2A и PI4KB, а также фосфотидинозитол-3
киназ
PIK3C2A, PIK3C2B, PIK3C2G, PIK3C3, PIK3CA/PIK3R1, PIK3CB/PIK3R1,
PIK3CD/PIK3R1, PIK3CG в концентрации 10 мкМ ингибирующего действия 7 не
выявлено. Таким образом, протеинкиназы INS-R, MET wt, SRC и PIM-1 могут служить
мишенями для липида 7.
6.Поиск потенциальных мишеней для липидов при условии их модификации
Поскольку исследуемые липиды относятся к катионным амфифильным соединениям,
одной из гипотез стала возможность их взаимодействия с ДНК и модуляция активности
топоизомеразы
I.
низкомолекулярные
Препятствуя
ДНК-лиганды
восстановлению
-
ингибиторы
целостности
цепей
каталитической
ДНК,
активности
топоизомеразы I - способствуют накоплению поврежденных молекул ДНК, в конечном
счёте, приводя к гибели клетки. Таким образом, топоизомераза I становится молекулярной
мишенью действия многих противоопухолевых агентов, в том числе, возможно, и
исследуемых липидов, что может стать существенным при условии модификации липидов
с целью их доставки в ядро, например, с использованием одного из сигналов ядерной
локализации. Задачей подобной модификации является усиление цитотоксической
101
активности исследуемых соединений за счет задействования дополнительного механизма
гибели. На данном этапе работы исследуется вопрос о возможности взаимодействия
липидов с ДНК и топоизомеразой I, что могло бы стать предпосылкой к синтезу
модифицированных липидов, способных к проникновению в ядро.
6.1. Исследование влияния липидов на функционирование топоизомеразы I
Для
изучения
влияния
катионных
глицеролипидов
на
функционирование
топоизомеразы I нами был выбран модификационный ряд липидов, отличающихся
разными структурными единицами: наиболее активный липид 7 с метилимидазолиевой
головкой, липид 5 с этильным заместителем в имидазолиевой части, липид 3 с
метилморфолиниевой головкой, соединение 9 с длинноцепочечным заместителем при 2
атоме углерода в глицериновом остове, незаряженный липид 10 с имидазолиевой
головкой, эдельфозин как соединение сравнения – табл.4. Способность топоизомеразы I
переводить суперскрученную ДНК (ДНКсс) в релаксированную форму проверяли во
внеклеточной системе в присутствии 1,5,20 мкМ липидов после 30 минут инкубации
(рис.15).
Таблица 4. Модификационный ряд для исследования влияния липидов на
функцию топоизомеразы I.
3
5
7
8
9
10
102
Топоизомеры
3
5
7
8
9
10
Релакс.
ДНКсс
ТопоI
Суперскруч.
1
5
20
1
5
20
1
5
20
1
5
20
1
5
20
1
5
Концентрация липида, мкМ
Рис. 15. Электрофореграмма продуктов реакции релаксации суперскрученной
плазмидной ДНК под действием топоизомеразы I в присутствии липидов 3, 7, 8, 9, 10
и без них. ДНКсс – суперскрученная форма ДНК (pBR322), ТопоI – действие
топоизомеразы I на ДНКсс без липидов.
Все липиды, приведенные в таблице 9, с увеличением концентрации оказывали
ингибирующее действие на процесс релаксации суперскрученной формы ДНК под
действием топоизомеразы I, что проявлялось в наличии остаточного количества исходной
плазмидной ДНК. Эдельфозин (8) ингибировал работу фермента только при 20 мкМ, а
липиды 3, 5 и 9 ингибировали ее, начиная с 5 мкМ. Липид 9 вызвал лучшее
ингибирование, чем липид 7, что свидетельствует о позитивном влиянии второго
длинноцепочечного гидрофобного заместителя в структуре амфифила. Действие
незаряженного глицеролипида 10 оказалось схожим с действием катионного липида 7, что
дает возможность сделать вывод, что заряд соединения не оказывает определяющего
влияния на протекание реакции релаксации суперскрученной ДНК под действием
топоизомеразы I. В контексте ингибирования функции топоизомеразы I возникает вопрос
о механизме, опосредующем этот эффект: липиды могут связываться с ДНК либо с самим
ферментом.
103
20
6.2.Определение параметров связывания липид-ДНК
Для определения параметров связывания липидов и ДНК использовался метод
высокочувствительной сканирующей калориметрии. Поскольку связывание липидов из
модификационного ряда таблицы 9 с ДНК может быть обусловлено как полярностью
«головки», так и гидрофобностью «хвоста» молекулы амфифила, рассматривались
кумулятивно
оба
эти
параметра.
Применяемая
в
этом
исследовании
модель
подразумевает, что в водных растворах липиды образуют надмолекулярные комплексы
(мицеллы), которые при добавлении к раствору ДНК могут перегруппировываться с
образованием комплексов ДНК-липид.
Измерялись температуры плавления липидных комплексов (мицеллы в водном
растворе с pH=7.3, содержащем 7% ДМСО) и комплексов ДНК-липид (соотношение 1:1)
(рис. 16).
А.
Б.
Липид
Температура плавления комплексов, °С
ДНК-липид
Липидные мицеллы
3
99,9
17,0
5
94,0
18,4
7
96,2
19,4
9
97,7
54,0
10
64,8
42,4
Рис.16. Результаты калориметрии. А. Термограмма плавления комплексов: (1) –
липидные мицеллы, (2) – несвязанная ДНК, (3) – комплекс ДНК-липид для 3, 5, 7, 9;
Б. Численные значения температур плавления комплексов
При плавлении изолированной ДНК на термограмме наблюдался один пик
удельной теплоемкости ср (пик 2). Введение липидов 3, 5, 7, 9 в смесь с ДНК
сопровождалось появлением на теплограмме пиков 1 и 3, соответствующих липидным
104
мицеллярным комплексам и комплексам липид-ДНК. Увеличение температуры плавления
комплекса липид-ДНК по сравнению с температурой плавления несвязанной ДНК
свидетельствует об электростатической стабилизации дуплекса. Незаряженный липид 10
не изменял стабильность дуплекса из-за слабой полярности «головки». Температуры
плавления липидных комплексов (перехода «порядок-беспорядок» - от упорядоченной
мицеллы к неупорядоченному раствору) в случае соединений 9 и 10 больше, чем для
остальных липидов, что свидетельствует о более сильном гидрофобном взаимодействии в
их мицеллах.
Определение
энтальпий
перехода
«порядок-беспорядок»,
отвечающих
за
гидрофобную составляющую связывания ДНК-липид, и энтальпий плавления комплексов
липидов с ДНК, отвечающих за электростатический параметр связывания, позволило
рассчитать соответствующие свободные энергии этих типов взаимодействий и вычислить
суммарную свободную энергию связывания липидов с ДНК (табл. 5).
Таблица 5. Расчеты вкладов гидрофобного и электростатического взаимодействий в
общий эффект связывания липидов с ДНК
Свободная энергия связывания, кДж/моль
Относительный
вклад
компонент, %
Гидрофобная Электростатическая Суммарное
Липид
компонента
компонента
значение
-ΔGГФ
-ΔGЭЛ
-ΔGСВЯЗЫВ.
Гидрофоб.
Электростат.
3
0,22
0,92
1,14
19
81
5
0,15
0,76
0,91
16
84
7
0,39
0,63
1,02
38
62
9
3,37
0,47
3,84
88
12
10
1,62
0
1,62
100
0
105
Представленные данные свидетельствуют о наличии связывания липидов с ДНК. На
основании сравнения абсолютных значений свободных энергий связывания ДНК-липид
можно заключить, что наилучшее связывание происходит у липида 9. Липид 10 также
хорошо связывается с ДНК, и, как и в случае 9, это опосредовано большим вкладом
гидрофобной компоненты. Липиды 3, 5, 7 связываются с ДНК примерно в равной степени,
и преобладает электростатическое взаимодействие. Следовательно, в зависимости от
структуры липида, формирование его комплекса с ДНК может основываться как на
электростатическом, так и на гидрофобном взаимодействии.
6.3.Моделирование возможного взаимодействия липидов с ДНК и топоизомеразой I
Поскольку механизм ингибирования действия топоизомеразы I может быть
обусловлен как связыванием липидов с ДНК, так и их взаимодействием с самим
ферментом, было проведено компьютерное моделирование этих взаимодействий в
программе AutoDock 4.2 и проанализированы их параметры. Использованная модель
основывается на переносе одиночной молекулы липида из водного окружения на двойную
спираль ДНК и на поверхность топоизомеразы I. При этом рассматриваются вклады
электростатического взаимодействия (ΔGЭЛ), ван-дер-ваальсовых взаимодействий (ΔGВдВ)
и водородных связей (ΔGВС) с учетом гидратационных эффектов (ΔGДЕСОЛВ), а также
эффекта «замораживания» внутренних движений связанной молекулы липида в
свободную энергию связывания (ΔGТОРС).
По результатам компьютерного моделирования связывания липидов с ДНК
определены предпочтительные сайты расположения липидов на двойной спирали и
компоненты свободной энергии связывания (рис. 17).
106
А. Предпочтительные сайты связывания липидов с ДНК
3
5
7
9
10
Б. Водородная связь на модели взаимодействия липида 7 с ДНК (показана
стрелкой)
В. Компоненты свободной энергии связывания ДНК-липид
Липид
-ΔGЭЛ
-(ΔGВдВ+
-(ΔGЭЛ+
ΔGВС+
ΔGВдВ+
ΔGДЕСОЛВ)
ΔGВС+
-ΔGТОРС
-ΔGСВЯЗЫВ.
ΔGДЕСОЛВ)
3
2,51
11,40
13,91
-8,65
5,26
5
2,31
13,11
15,42
-8,95
6,48
7
2,19
12,71
14,90
-8,65
6,26
9
1,41
14,17
15,58
-13,42
2,16
10
0
12,16
12,16
-8,65
3,51
Рис. 17. Результаты компьютерного моделирования связывания липидов с ДНК
107
Липиды, несущие заряд, располагаются рядом с отрицательно заряженными
кислородами ДНК. Имидазолиевые кольца липидов 5, 7, 9 стремятся расположиться в
узкой бороздке, а метилморфолиниевый цикл липида 3 - в ложбине между фосфатными
группами одного из гребней, формирующих узкую бороздку двойной спирали (рис. 16 А).
Помимо этого, связывание отдельных молекул липидов с ДНК может быть усилено
образованием водородных связей кислородов, входящих в глицериновые составляющие
головок и выступающих в роли акцепторов, с
донорными группами, входящими в
основания ДНК (рис. 16 Б). В целом, гидрофобные заместители всех липидов
располагаются в малой бороздке. При этом электростатические силы вносят небольшой
вклад в свзывание.
Сравнение абсолютных значений энергий связывания, полученных при компьютерном
моделировании, дает большие значения для липидов 3, 5, 7, чем для липидов 9 и 10. Это
не соотносится с экспериментальными данными калориметрии, однако по критерию
электростатических взаимодействий выявлена достаточно надежная корреляция данных
двух исследований (r=0,97).
Моделирование взаимодействия липидов с топоизомеразой I и аналогичные
параметры связывания представлены на рис. 18.
108
А. Предпочтительные места связывания липидов с топоизомеразой I
Липид
-ΔGЭЛ
-(ΔGВдВ+
-(ΔGЭЛ+
ΔGВС+
ΔGВдВ+
ΔGДЕСОЛВ)
ΔGВС+
-ΔGТОРС
ΔGСВЯЗЫВ.
ΔGДЕСОЛВ)
Рис.18.
3
0,51
9,5
10,01
-8,65
1,36
5
1,71
8,98
10,69
-8,95
1,73
7
1,91
10,09
12,0
-8,65
3,34
9
0,35
13,67
14,02
-13,42
0,6
10
0,19
10,27
10,46
-8,65
1,81
Результаты компьютерного моделирования связывания липидов с
топоизомеразой I Б. Компоненты свободной энергии связывания ТопоI – липид
Полученные модули значений свободных энергий связывания липидов с
ферментом
меньше,
чем
для
взаимодействия
липид-ДНК,
что
означает
предпочтительность связывания липидов с ДНК. Вклад электростатических сил меньший,
чем остальных, что говорит о некритической роли заряда исследуемых соединений и
согласуется с полученными данными эксперимента с топоизомеразой I.
109
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Катионные бесфосфорные глицеролипиды представляют перспективный класс
противоопухолевых соединений. В данной работе исследовано цитотоксическое действие
модификацонного ряда алкильных катионных глицеролипидов на панели опухолевых
клеток и на неопухолевых фибробластах человека, выявлен лидерный липид,
биологическое действие которого изучено более подробно. Установлены различия в
механизме противоопухолевого действия катионных бесфосфорных глицеролипидов с
гетероциклической и алифатической полярными головками по сравнению с их
фосфатсодержащим
предшественником
эдельфозином.
Исследованные
соединения
показали важное преимущество над эдельфозином – ослабление гемолиза эритроцитов,
что важно для их дальнейших испытаний in vivo. Также обнаружены мишени действия
катионных липидов среди протеинкиназ, на которые эдельфозин не оказывал влияния.
Потенциальной мишенью катионных липидов при условии их модификации с целью
доставки в ядро стала ДНК, и возможность связывания с ней открывает новые
перспективы биологического действия соединений данного класса.
По результатам исследования цитотоксичности липидов из модификационного
ряда с гетероциклическими полярными доменами на разных опухолевых линиях
выявлено, что они вызывают гибель в субмикромолярных концентрациях. Хороший
эффект
показали
липиды
с
пиридиниевой
(4),
этилимидазолиевой
(5)
и
метилимидазолиевой (7) катионными головками. Эти соединения наряду с его
бесфосфорным предшественником с алифатической катионной головкой (6) оказались
слаботоксичны по отношению к неопухолевым клеткам - фибробластам кожи и
лимфоцитам. Выявлена разница цитотоксических эффектов липидов с катионными
головками разной природы по отношению к ряду клеточных линий, однако вопрос о связи
конкретной химической группы в структуре полярного домена липида с особенностями
его механизмом действия на клетку определенной линии остается открытым. Тем не
110
менее, на основании представленных данных можно выделить наиболее чувствительную к
действию липидов линию (НСТ116) и сделать вывод о сопоставимой с эдельфозином
слабой токсичности для неопухолевых клеток. Помимо этого, важной является
чувствительность клеток К562 к представителям бесфосфорных липидов, в отличие от
эдельфозина.
На клетках НСТ116 показан G1/S-арест и апоптотический тип гибели, вызываемый
исследованными
липидами.
Наиболее
активный
липид
rac-N-{4-[(2-этокси-3-
октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-N-метил-имидазолинийиодид
(7)
вызывал
активацию p21waf1/cip1 независимо от статуса р53, что схоже с эффектом эдельфозина,
однако, в случае эдельфозина при действии на клетки солидных опухолей возникает
G2/M-арест, также контролируемый p21waf1/cip1. Как и в случае эдельфозина, апоптоз при
действии липида 7 р53-независимый, что важно, поскольку в случае многих опухолей р53
дезактивирован. Реализация апоптоза, инициируемого липидом 7, как и алифатическим
аналогом 6, происходила без активации каспазы-12, эффекторных каспаз и без
расщепления PARP, однако с падением трансмембранного потенциала митохондрий и
активацией каспазы-9. По-видимому, наблюдаемая также межнуклеосомная деградация
ДНК опосредована проникновением в ядро белков, вышедших из межмембранного
пространства митохондрий. Митохондриальный путь апоптоза свойственен также
эдельфозину и другим фосфатсодержащим аналогам, параллельно с ним развивается ЭПРстресс, однако поздние апоптотические события сопровождаются действием каспазы-3 и
расщеплением PARP. Таким образом, в путях апоптотической гибели при действии
катионных бесфосфорных глицеролипидов и фосфатсодержащих липидов выявлены
различия. Предположительно, разница в наличии активной каспазы-12 и сопряженным с
ней ЭПР-стрессом, а также в выраженности активации каспазы-9 связана с тем, что
бесфосфорные липиды менее интенсивно встраиваются в мембраны ЭПР и митохондрий
и/или слабее их разрушают, чем фосфатсодержащие противоопухолевые липиды.
111
Исследование мембранолитической способности катионных глицеролипидов на
эритроцитах и липосомальной модели показали значительно меньшее разрушение
мембран при действии бесфосфорных катионных глицеролипидов, чем при действии
эдельфозина.
Наблюдавшийся
низкий
уровень
гемолиза
эритроцитов
является
преимуществом исследованных липидов, поскольку позволяет применять их in vivo без
дополнительных технологических модификаций, таких, как заключение в липосомы (что
необходимо в случае эдельфозина). При отсутствии фосфатной группы в структуре
исследованных соединений уменьшается разница между размерами гидрофильной и
гидрофобной частей молекулы - это может стать объяснением их пониженной
мембранолитической способности.
Поиск мишеней действия катионных глицеролипидов выявил селективное
ингибирование соединением 7 протеинкиназ Src, Met wt, Ins-R, PIM-1 в бесклеточной
системе. Проверка этих эффектов при работе с клетками – задача следующих
исследований.
Установленное
внутриклеточное
внеядерное
распределение
флуоресцентно-меченного липида подтвердило, что полученный эффект ингибирования
топоизомеразы I в бесклеточной системе при переходе к клеткам потребует модификаций
липидов с целью их доставки в ядро. Тем не менее, в рамках данной работы рассмотрены
возможные механизмы модуляции активности топоизомеразы I, и по результатам
калориметрического анализа и компьютерного моделирования выявлен потенциал
катионных липидов к связыванию с ДНК, более сильному, чем с топоизомеразой I.
Использование дополнительного модификационного ряда липидов позволило установить
влияние заряда и гидрофобности соединения на возможное связывание с ДНК и на эффект
ингибирования топоизомеразы I.
112
ВЫВОДЫ
1. Новые алкильные катионные глицеролипиды с гетероциклическими полярными
доменами
вызывают
гибель
опухолевых
клеток
в
субмикромолярных
концентрациях без значительного повреждения здоровых клеток. Среди них
выявлены
наиболее
цитотоксические
и
выбран
rac-N-{4-[(2-этокси-3-
октадецилокси)пропил]оксикарбонилбутил}-N-метил-имидазолинийиодид
(7)
как лидерное соединение.
2. Алкильные
катионные
глицеролипиды
вызывают
минимальный
гемолитический эффект и слабое повреждение модельной мембраны, что
является их преимуществом перед фосфатсодержащим предшественником
эдельфозином.
3. Механизмы гибели опухолевых клеток при действии липида 7 включают G1/Sарест клеточного цикла, опосредованный активацией p21waf1/cip1 независимо от
статуса р53, и последующий апоптоз.
4. Апоптотическая гибель опухолевых клеток при действии липида 7 происходит
по митохондриальному пути без активации эффекторных каспаз и расщепления
PARP.
5. Липид 7 в бесклеточной системе селективно ингибирует протеинкиназы Src,
Met
wt,
Ins-R,
PIM-1
–
возможные
мишени
действия
катионных
глицеролипидов.
6. Алкильные катионные глицеролипиды ингибируют активность топоизомеразы
I. Моделирование и калориметрическое исследование выявили возможный
механизм этого процесса - связывание липидов с ДНК – с их потенциальной
мишенью при условии направленной доставки липидов в ядро.
113
Благодарности
Выражаю
благодарность
сотрудникам
Московского
государственного
университета тонких химических технологий им. М.В.Ломоносова к.х.н. Н.В.Плявник,
д.х.н. М.А.Маслову, к.х.н. Н.Г.Морозовой за синтез и предоставление соединений для
исследований; к.х.н. Л.Г.Деженковой (Институт по изысканию новых антибиотиков им.
Г.Ф.Гаузе) за обучение методике исследования активности топоизомеразы; д.х.н.
В.Я.Гринбергу (Институт элементоорганических соединений им. А.Н.Несмеянова РАН) за
помощь в калориметрии; к.х.н. В.Б.Цветкову (Институт нефтехимического синтеза им.
А.В.Топчиева РАН) за создание компьютерных моделей; М.С.Вагида и А.А.Калининой за
помощь в проточной цитофлуориметрии; к.б.н. В.А.Глазуновой и к.б.н. В.В.Татарскому
мл. за обсуждение результатов исследоваия; д.м.н. А.А.Штилю за научное руководство
работой.
114
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Prescott S. M., Zimmerman G. A., Stafforini D. M., McIntyre T. M. Platelet-activating
factor and related lipid mediators // Annu. Rev. Biochem. – 2000. – V. 69. – P. 419-445.
2. Snyder F., Lee T. Ch., Blank M. L. Platelet-activating factor and related ether lipid
mediators. Biological activities, metabolism, and regulation // Annals of New York
Academy of Sciences. – 1989. – V. 568. – P. 35-43.
3. Konstantinova I. D., Serebrennikova G. A. Positively charged lipids: structure, methods
of synthesis and applications // Russ. Chem. Rev. – 1996. – V. 65. – P. 537-553.
4. Константинова И. Д., Зайцева Н. М., Ушакова И. П., Серебренникова Г. А. Синтез
катионных липидов алкильного типа с коротко цепными заместителями при атоме
С(2) глицеринового скелета // Изв. АН, Сер. хим. – 1994 – № 10. – С. 1826-1830.
5. Miller A. D. Cationic liposomes for gene therapy // Angew. Chem. Int. Ed. – 1998. – V.
37. – P. 1768-1785.
6. Lasik D. D., Templeton N. Liposomes in gene therapy // Adv. Drug Del. Rev. – 1996. –
V. 20. – P. 221-266.
7. Маслов М. А., Сычева Е. В., Морозова Н. Г., Серебренникова Г. А. Катионные
амфифилы липидной и нелипидной природы в генной терапии // Изв. АН, Сер. хим.
– 2000. – № 3. – С. 385-400.
8. Zhi D., Zhang S., Wang B., Zhao Y., Yang B., Yu S. Transfection efficiency of cationic
lipids with different hydrophobic domains in gene delivery // Bioconjug. Chem. – 2010. –
V. 10(4). – P. 563-577.
9. Montier T., Benvegnu T., Jaffrès P. A., Yaouanc J. J., Lehn P. Progress in cationic
lipid-mediated gene transfection: a series of bio-inspired lipids as an example // Curr.
Gene Ther. – 2008. – V. 8(5). – P. 296-312.
115
10. Reis-Sobreiro M., Roué G., Moros A., Gajate C., de la Iglesia-Vicente J., Colomer D.,
Mollinedo F. Lipid raft-mediated Akt signaling as a therapeutic target in mantle cell
lymphoma // Blood Cancer J. – 2013. – V. 3(5). – P. 118-144.
11. Naseer A., Bok Hee B., Jongki H., Chong L., Boo Ahn S., Kwang Sik I., Jee H.
Additional Bioactive Lyso-PAF Congeners from the Sponge Spirastrella abata // J. Nat.
Prod. – 2001. – V. 6. – P. 533-535.
12. van Blitterswijk W. J., Verheij M. Anticancer mechanisms and clinical application of
alkylphospholipids // Biochim. Biophys. Acta. – 2013. – V. 1831(3). – P. 663-674.
13. Ahmad I., Filep J. J., Franklin J. C., Janoff A. S., Masteers G. R., Pattassery J., Peters A.,
Schupsky J. J., Zha Y., Mayhew E. Enhanced therapeutic effects of liposome-associated
ssociation of 1-O-octadecyl-2-O-methyl-sn-glycero-3-phosphocholine // Cancer Res. –
1997. – V. 57. – P. 1915-1921.
14. Busto J., del Canto-Jañez E., Goñi F., Mollinedo F., Alonso A. Combination of the antitumour cell ether lipid edelfosine with sterols abolishes haemolytic side effects of the
drug // J. Chem. Biol. – 2008. – V. 1. – P. 89-94.
15. Mayhew E., Ahmad I., Bhatia S., Dause R., Filep J., Janoff A. S., Kaisheva E., Perkins
W. R., Zha Y., Franklin J. C. Stability of association of 1-O-octadecyl-2-O-methyl-snglycero-3-phosphocholine with liposomes is composition dependent // Biochim. Biophys.
Acta. – 1997. – V. 1329. – P. 139-148.
16. Perkins W. R., Dause R. B., Li X., Franklin J. C., Cabrall-Lilly D. J., Zha Y., Dank E. H.,
Mayhew E., Janoff A. S. Combination of antitumor ether lipid with lipids of
complementary molecular shape reduces its hemolytic activity // Biochim. Biophys. Acta.
– 1997 – V. 1327 (1). – P. 61-68.
17. Gajate C., Mollinedo F. Biological activities, mechanisms of action and biomedical
prospects of the antitumor ether phospholipid ET-18-OCH3 (Edelfosine), a proapoptotic
agent in tumor cells // Current Drug Metabolism. – 2002. – V. 5(3). – P. 491-525.
116
18. Vogler W., Berdel W. Autologous bone marrow transplantation with alkyllysophospholipid-purged marrow // Journal of Hematotherapy. – 1993. – V. 2(1). – P.
93-102.
19. Diederichs J., Richter W., Weber L. Topical Dosage Form Comprising Tri-Substituted
Glycerol Compounds. – 2009 – патент US 20100179226 A1.
20. Giantonio B. J., Derry C., McAleer C., McPhillips J. J., O’Dwyer P. J. Phase I and
pharmacokinetic study of the cytotoxic ether lipid ilmofosine administered by weekly
two-hour infusion in patients with advanced solid tumors // Clin. Cancer Res. – 2004. –
V. 10. – P. 1282-1288.
21. Bittman R., Byun H., Chandraprakash Reddy H., Samadder P., Arthur H.
Enantioselective Synthesis and Antiproliferative Properties of an Ilmofosine Analog, 2(Trimethylammonio)ethyl 3-(Hexadecyloxy)-2-(methoxymethyl)propyl Phosphate, on
Epithelial Cancer Cell Growth // J. Med. Chem. – 1997. – V. 40. – P. 1391-1395.
22. Goekjian P. G., Jirousek M. R. Protein Kinase C Inhibitors as Novel Anticancer Drugs //
Expert Opin Investig Drugs. – 2001. – V. 10(12). – P. 2117-2140.
23. Duclos R. I., Chia H. H., Abdelmageed O. H., Esber H., Fournier D. J., Makriyannis A..
Synthesis of racemic and nearly optically pure ether lipids and evaluation of in vitro
antineoplastic activities // J. Med. Chem. – 1994. – V. 37. – P. 4147-4154.
24. Principe P., Braquet P. Advances in ether phospholipids treatment of cancer // Crit. Rev.
Oncol. Hematol. – 1995. – V. 18. – P. 155-178.
25. Herrmann D., Neumann H., Bredel W., Heim M., Fromm M., Boerner D., Bicker U. et al.
Phase I trial of the thioether phospholipid analogue BM 41,440 in cancer patients //
Lipids. – 1987. – V. 22 (11). – P. 962-966.
26. Giantonio B., Derry C., McAleer C., McPhillips J., O´Dwyer P. Phase I and
Pharmacokinetic Study of the Cytotoxic Ether Lipid Ilmofosine Administered by Weekly
117
Two-Hour Infusion in Patients with Advanced Solid Tumors // Clinical Cancer Research.
– 2004. – V. 10. – P. 1282-1288.
27. Winkelmann M., Ebeling K., Strohmeyer G., Hottenrott G., Mechl Z., Berges W. et al.
Treatment results of the thioether lipid ilmofosine in patients with malignant tumours //
J. Cancer Res. Clin. Oncol. – 1992. – V. 118(6). – P. 405-407.
28. Van Woolley P., Schultz C., Rodriguez G., Games R., Rowe Jr K., Dadey M. et al. A
phase II trial of ilmofosine in non-small cell bronchogenic carcinoma // Invest. New
Drugs. – 1996. – V. 14(2). – P. 219-222.
29. Papazafiri P., Avlonitis N., Angelou P., Calogeropoulou T., Koufaki M., Scoulica E.,
Fragiadaki I. Structure-activity relationships of antineoplastic ring-substituted ether
phospholipid derivates // Cancer Chemother. Pharmacol. – 2005. – V. 56. – P. 261-270.
30. Paris C., Bertoglio J., Breard J. Lysosomal and mitochondrial pathways in miltefosineinduced apoptosis in U937 cells // Apoptosis. – 2007. – V. 12. – P. 1257-1267.
31. Scherer G. F. E., Stoffel B. A plant lipid and the platelet-activating factor stimulate ATPdependent H+ transport in isolated plant membrane vesicles // Planta. – 1987. – V. 172.
– P. 127-130.
32. Verweij J., Gandia D., Planting A., Stoter G., Armand J. Phase II study of oral
miltefosine in patients with squamous cell head and neck cancer // Eur. J. Cancer. – 1993.
– V. 29A(5). – P. 778-779.
33. Planting A., Stoter G., Verweij J. Phase II study of daily oral miltefosine
(hexadecylphosphocholine) in advanced colorectal cancer // Eur. J. Cancer. – 1993. – V.
29A(4). – P. 518-519.
34. Sugiura T., Yamashira A., Kudo N., Fukuda T., Miyamoto T., Chang N., Kishimoto S.,
Waku K., Tanaka T., Tsukatani H., Tokumura A. Platelet-activating factor and its
structural analogues in the earthworm Eisenia foetida // Biochim. Biophys. Acta. – 1995.
– V. 1258. – P. 19-26.
118
35. Temer M. R., Lumb R. H. Synthesis of platelet activating factor by tissues from the
rainbow trout, Salmo gairdneri // Biochim. Biophys. Acta. – 1989. – V. 1004. – P. 49-52.
36. Croft S., Snowdon D., Yardley V. The activities of four anticancer allkylphospholipids
against Leishmania donovani, Trypanosoma cruzi, and Trypanosoma brucei // J.
Antimicrob. Chemother. – 1996. – V. 38. – P. 1041-1047.
37. McBride J., Mullen A., Carter K., Roberts C. Differential cytotoxicity of phospholipid
analogues to pathogenic Acanthamoeba species and mammalian cells // Journal of
Antimicrobial Chemotherapy. – 2007. – V. 60. – P. 521-525.
38. Vink S., Schellens J., van Blitterswijk W., Verheij M. Tumor and normal tissue
pharmacokinects of perifosine, an oral anticancer alkylphospholipid // Invest. New
Drugs. – 2005. – V. 23(4). – P. 279-286.
39. Papa V., Tazzari P. L., Chiarini F., Cappellini A., Ricci F., Billi A. M., Evangelisti
C., Ottaviani E., Martinelli G., Testoni N., McCubrey J. A., Martell i A. M. Proapoptotic
activity and chemosensitizing effect of the novel Akt inhibitor perifosine in acute
myelogenous leukemia cells // Leukemia. – 2008. – V. 22. – P. 147-160.
40. Chiarini F., Del Sole M., Mongiorgi S., Gaboardi G. C., Cappellini A., Mantovani I.,
Follo M. Y., McCubrey J. A., Martelli A. M. Molecular Targets for Therapy. The novel
Akt inhibitor, perifosine, induces caspase-dependent apoptosis and downregulates Pglycoprotein expression in multidrug-resistant human T-acute leukemia cells by a JNKdependent mechanism // Leukemia. – 2008. – V. 22. – P. 1106-1116.
41. Pachioni J. de A., Magalhaes J., Lima E., Bueno L. de M., Barbosa J., de Sa M., RangelYagui C. Alkylphospholipids - a promising class of chemotherapeutic agents with a
broad pharmacological spectrum // J. Pharm. Pharm. Sci. – 2013. – V. 16(5). – P. 742759.
42. Jakubowiak A., Richardson P., Zimmerman T., Alsina M., Kaufman J., Kandarpa M. et
al. Perifosine plus lenalidomide and dexamethasone in relapsed and relapsed/refractory
119
multiple myeloma: a Phase I Multiple Myeloma Research Consortium study // Br. J.
Haematol. – 2012. – V. 158(4). – P. 472-480.
43. Sun W., Modak S. Emerging treatment options for the treatment of neuroblastoma:
potential role of perifosine // Onco. Targets Ther. – 2012. – V. 5. – P. 21-29.
44. Vink S., Blitterswijk W., Schellens J., Verheij M. Rationale and clinical application of
alkilphospholipid analogues in combination with radiotherapy // Cancer Treatment
Reviews. – 2007. – V. 33. – P. 191-202.
45. Lux H., Heise N., Klenner T., Hart D., Opperdoes F. Ether-lipid (alkyl-phospholipid)
metabolism and the mehanism of ether-lipid analogues in Leishmania // Molecular and
Biocemical Parasitology. – 2000. – V. 111. – P. 1-14.
46. Jendrossek V., Hammersen K., Erdlenbruch B., Kugler W., Krügener R., Eibl H.,
Lakomek M. Structure-activity relationships of alkylphosphocholine derivatives:
antineoplastic action on brain umor cell lines in vitro // Cancer Chemother. Pharmacol. –
2002. – V. 50(1). – P. 71-79.
47. Rübel A., Handrick R., Lindner L. H., Steiger M., Eibl H., Budach W. et al. The
membrane
targeted
apoptosis
modulators
erucylphosphocholine
and
erucylphosphohomocholine increase the radiation response of human glioblastoma cell
lines in vitro // Radiat. Oncol. – 2006. – V. 1:6. – P. 1-37.
48. Fiegl M., Lindner L., Juergens M., Eibl H., Hiddemann W., Braess J. Erufosine, a novel
alkylphosphocholine, in acute myeloid leukemia: single activity and combination with
other antileukemic drugs // Cancer Chemother. Pharmacol. – 2008. – V. 62. – P. 321-329.
49. Yosifov D., Todorov P., Zaharieva M., Georgiev K., Pilicheva B., Konstantinov S.,
Berger M. Erucylphospho-N,N,N-trimethylpropylammonium (erufosine) is a potential
antimyeloma drug devoid of myelotoxicity // Cancer Chemother. Pharmacol. – 2010. –
V. 10. – P. 1273-1277.
120
50. Handrick R., Rubel A., Faltin H., Eibl H., Belka C., Jendrossek V. Increased cytotoxicity
of ionizing radiation in combination with membrane-targeted apoptosis modulators
involves downregulation of protein kinase B/Akt- mediated survival-signaling //
Radiother. Oncol. – 2006. – V. 80 – P. 199–206.
51. van der Luit A. H., Vink S. R., Klarenbeek J. B., Perrissoud D., Solary E., Verheij M.,
van Blitterswijk W. J. A new class of anticancer alkylphospholipids uses lipid rafts as
membrane gateways to induce apoptosis in lymphoma cells // Mol. Cancer Ther. – 2007.
– V. 6(8) – P. 2337-2345.
52. Jendrossek V.; Handrick R. Membrane targeted anticancer drugs: potent inducers of
apoptosis and putative radiosensitisers // Curr. Med. Chem. Anti-Canc Agents. – 2003 –
V. 3. – P. 343-353.
53. Ruiter G. A., Verheij M., Zerp S. F., van Blitterswijk W. J. Alkyl-lysophospholipids as
anticancer agents and enhancers of radiation-induced apoptosis // Int. J. Radiat. Oncol.
Biol. Phys. – 2001. – V. 49(2). – P. 415-419.
54. Plyavnik N. V., Shtil A. A., Serebrennikova G. A. Ether lipids as anticancer agents:
Focus on non- phosphorus cationic glycerolipids // Mini-Rev. Med. Chem. – 2006. – №
6. – V. 109. – P. 668-679.
55. Civoli F., Daniel L. W. Quaternary ammonium analogs of ether lipids inhibit the
activation of protein kinase C and the growth of human leukemia cell lines // Cancer
Chemother. Pharmacol. – 1998. – V. 42(4). – P. 319-326.
56. Hofmann J., Utz I., Spitaler M., Hofer S., Rybczynska M., Beck W. T., Herrmann D. B.
J., Grunicke H. Resistance to the new anti-cancer phospholipid ilmofosine (BM 41 440) //
Br. J. Cancer. – 1997. – V. 76 (7). – P. 862-869.
57. Morris-Natschke S. L., Meyer K. L., Marasco C. J., Piantadosi C., Rossi F., Godwin P.
L., Modest E. J. Synthesis of quaternary amine ether lipids and evaluation of neoplastic
cell growth inhibitory properties // J. Med. Chem. – 1990. – V. 33 (6). – P. 1812-1818.
121
58. Morris-Natschke S. L., Gumus F., Marasco C. J., Meyer K. L., Marx M., Piantadosi C.,
Layne M. D., Modest E. J. Synthesis of phosphocholine and quaternary amine ether lipids
and evaluation of in vitro antineoplastic activity // J. Med. Chem. – 1993. – V. 36 (14). –
P. 201-225.
59. Ukawa K., Imamiya E., Yamamoto H., Aono T., Kozai Y., Okutani T., Nomura H.,
Honma Y., Hozumi M., Kudo I., Inoue K. Synthesis and antitumor activity of new
amphiphilic
alkylglycerolipids
substituted
with
a
polar
head
group,
2-(2-
trimethylammonioethoxy)ethyl or a congeneric oligo(ethyleneoxy)ethyl group // Chem.
Pharm. Bull. – 1989. – V. 37 (12). – P. 3277-3285.
60. Mollinedo F., Fernandez-Luna J. L., Gajate C., Martin-Martin B., Benito A., MartinezDalmau R., Modolell M. Selective induction of apoptosis in cancer cells by the ether lipid
ET-18-OCH3 (Edelfosine): molecular structure requirements, cellular uptake, and
protection by Bcl-2 and Bcl-XL // Cancer Res. – 1997. – V. 57. – P. 1320-1328.
61. Gajate C., Santos-Beneit A. M., Macho A., Lazaro, M., Hernandez-De Rojas A.,
Modolell M., Munoz E., Mollinedo F. Involvement of mitochondria and caspase-3 in ET
-18-OCH3- induced apoptosis of human leukemic cells // Int. J. Cancer. – 2000. – V. 86.
– P. 208-218.
62. Gajate C., Del Canto-Janez E., Acuna A. U., Amat-Guerri F., Geijo E., Santos-Beneit A.
M., Veldman R. J., Mollinedo F. Intracellular triggering of Fas aggregation and
recruitment of apoptotic molecules into Fas-enriched rafts in selective tumor cell
apoptosis // J. Exp. Med. – 2004. – V. 200. – P. 353-365.
63. Mollinedo F. Antitumor ether lipids: proapoptotic agents with multiple therapeutic
indications // Exp. Opin. Ther. Patents. – 2007. – V. 17. – P. 385-405.
64. Mollinedo F., Gajate C., Martin-Santamaria S., Gago F. ET-18- OCH3 (edelfosine): a
selective antitumour lipid targeting apoptosis through intracellular activation of
Fas/CD95 death receptor // Curr. Med. Chem. – 2004. – V. 11. – P. 3163-3184.
122
65. Nieto-Miguel T., Gajate C., Mollinedo F. Differential targets and subcellular localization
of antitumor alkyl-lysophospholipid in leukemic versus solid tumor cells // J. Biol. Chem.
– 2006. – V. 281 – P. 14833-14840.
66. Ausili A., Torrecillas A., Aranda F. J., Mollinedo F., Gajate C., Corbalan-Garcia S. et al.
Edelfosine is incorporated into rafts and alters their organization // J. Phys. Chem. B. –
2008. – V. 112. – P. 11643-11654.
67. Reis-Sobreiro M., Roue G., Moros A., Gajate C., de la Iglesia-Vicente J., Colomer D.,
Mollinedo F. Lipid raft-mediated Akt signaling as a therapeutic target in mantle cell
lymphoma // Blood Cancer Journal. – 2013. – V. 3. – e118.
68. Samadder P., Richards C., Bittman R., Bhullar R.P., Arthur G. The antitumor ether lipid
1-O-octadecyl-2-O-methyl-rac- glycerophosphocholine (ET-18-OCH3) inhibits the
association between Ras and Raf-1 // Anticancer Res. – 2003. – V. 23. – P. 2291-2295.
69. Zhou X., Lu X., Richard C., Xiong W., Litchfield D.W., Bittman R., Arthur G. 1-Ooctadecyl-2-O-methyl- glycerophosphocholine inhibits the transduction of growth signals
via the MAPK cascade in cultured MCF-7 cells // J. Clin. Invest. – 1996. – V. 98. – P.
937-944.
70. Samadder P., Arthur G. Decreased sensitivity to 1-O-octadecyl-2- O-methylglycerophosphocholine in MCF-7 cells adapted for serum-free growth correlates with
constitutive association of Raf-1 with cellular membranes // Cancer Res. – 1999. – V. 59.
– P. 4808-4815.
71. Strassheim D., Shafer S.H., Phelps S.H., Williams C.L. Small cell lung carcinoma
exhibits greater phospholipase C-beta1 expression and edelfosine resistance compared
with non-small cell lung carcinoma // Cancer Res. – 2000. – V. 60. – P. 2730-2736.
72. Powis G., Seewald M.J., Gratas C., Melder D., Riebow J., Modest E.J. Selective
inhibition of phosphatidylinositol phospholipase C by cytotoxic ether lipid analogues //
Cancer Res. – 1992. – V. 52. – P. 2835-2840.
123
73. Kiss Z., Crilly K.S. Alkyl lysophospholipids inhibit phorbol ester- stimulated
phospholipase D activity and DNA synthesis in fibroblasts // FEBS Lett. – 1997. – V.
412. – P. 313-317.
74. Mollinedo F., Fernandez M., Hornillos V., Delgado J., Amat-Guerri F., Acuna A. U.,
Nieto-Miguel T., Villa-Pulgarin J. A., Gonzalez-Garcia C., Cena V., Gajate C.
Involvement of lipid rafts in the localization and dysfunction effect of the antitumor ether
phospholipid edelfosine in mitochondria // Cell Death Dis. – 2011. – V. 2 – e158.
75. Gajate C., Mollinedo F. The antitumor ether lipid ET-18-OCH3 induces apoptosis
through translocation and capping of Fas/CD95 into membrane rafts in human leukemic
cells // Blood. – 2001. – V. 98. – P. 3860-3863.
76. Kischkel F.C., Hellbardt S., Behrmann I., Germer M., Pawlita M., Krammer P. H., Peter
M. E. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a deathinducing signaling complex (DISC) with the receptor // Embo J. – 1995. – V. 14. – P.
5579-5588.
77. Wang L., Yang J. K., Kabaleeswaran V., Rice A. J., Cruz A. C., Park A. Y., Yin Q.,
Damko E., Jang S. B., Raunser S., Robinson C. V., Siegel R. M., Walz T., Wu H. The
Fas-FADD death domain complex structure reveals the basis of DISC assembly and
disease mutations // Nat. Struct. Mol. Biol. – 2010. – V. 17. – P. 1324-1329.
78. Esposito D., Sankar A., Morgner N., Robinson C. V., Rittinger K., Driscoll P. C. Solution
NMR investigation of the CD95/FADD homotypic death domain complex suggests lack
of engagement of the CD95 C terminus // Structure. – 2010. – V. 18. – P. 1378-1390.
79. Hymowitz S. G., Dixit V. M. Unleashing cell death: The Fas- FADD complex // Nat.
Struct. Mol. Biol. – 2010. – V. 17. – P. 1289-1290.
80. Ashkenazi A., Dixit V. M. Death receptors: Signaling and modulation // Science. – 1998.
– V. 281. – P. 1305-1308.
124
81. Salvesen G. S., Dixit V. M. Caspase activation: the induced-proximity model // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. – 1999 – V. 96. – P. 10964-10967.
82. Li H., Zhu H., Xu C. J., Yuan J. Cleavage of BID by caspase 8 mediates the
mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis // Cell. – 1998. – V. 94. – P. 491501.
83. Luo X., Budihardjo I., Zou H., Slaughter C., Wang X. Bid, a Bcl2 interacting protein,
mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface
death receptors // Cell. – 1998. – V. 94. – P. 481-490.
84. Gajate C., Mollinedo F. Edelfosine and perifosine induce selective apoptosis in multiple
myeloma by recruitment of death receptors and downstream signaling molecules into
lipid rafts // Blood. – 2007. – V. 109. – P. 711-719.
85. Nieto-Miguel T., Gajate C., Gonzalez-Camacho F., Mollinedo F. Proapoptotic role of
Hsp90 by its interaction with c-Jun N-terminal kinase in lipid rafts in edelfosinemediated antileukemic therapy // Oncogene. – 2008. – V. 27. – P. 1779-1787.
86. Gajate C., Gonzalez-Camacho F., Mollinedo F. Lipid raft connection between extrinsic
and intrinsic apoptotic pathways // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2009. – V. 380. –
P. 780-784.
87. Gajate C., Mollinedo F. Cytoskeleton-mediated death receptor and ligand concentration
in lipid rafts forms apoptosis-promoting clusters in cancer chemotherapy // J. Biol. Chem.
– 2005. – V. 280. – P. 11641- 11647.
88. Mollinedo F., Gajate C. Lipid rafts, death receptors and CASMERs: new insights for
cancer therapy // Future Oncol. – 2010. – V. 6. – P. 491-494.
89. Mollinedo F., Gajate C. Lipid rafts and clusters of apoptotic signaling molecule-enriched
rafts in cancer therapy // Future Oncol. – 2010 – V. 6. – P. 811-821.
125
90. Reis-Sobreiro M., Roue G., Moros A., Gajate C., De la Iglesia- Vicente J., Colomer D.,
Mollinedo F. Lipid raft-mediated Akt signaling as a therapeutic target in mantle cell
lymphoma // Blood Cancer J. – 2013. – V. 3. – e118.
91. Whitesell L., Lindquist S. L. HSP90 and the chaperoning of cancer // Nat. Rev. Cancer. –
2005. – V. 5. – P. 761-772.
92. Ruiter G. A., Zerp S. F., Bartelink H., Van Blitterswijk W. J., Verheij M. Anti-cancer
alkyl-lysophospholipids inhibit the phosphatidylinositol 3 -kinase-Akt/PKB survival
pathway // Anticancer Drugs. – 2003. – V. 14 – P. 167-173.
93. Kondapaka S. B., Singh S. S., Dasmahapatra G. P., Sausville E. A., Roy K. K. Perifosine,
a novel alkylphospholipid, inhibits protein kinase B activation // Mol. Cancer Ther. –
2003. – V. 2. – P. 1093-1103.
94. Gills J. J., Dennis P. A. Perifosine: update on a novel Akt inhibitor // Curr. Oncol. Rep. –
2009. – V. 11. – P. 102-110.
95. Reis-Sobreiro M., Roue G., Moros A., Gajate C., De la Iglesia- Vicente J., Colomer D.,
Mollinedo F. Lipid raft-mediated Akt signaling as a therapeutic target in mantle cell
lymphoma // Blood Cancer J. – 2013 – V. 3. – e118.
96. Van Blitterswijk W. J., Verheij M. Anticancer alkylphospholipids: Mechanisms of action,
cellular sensitivity and resistance, and clinical prospects // Curr. Pharm. Des. – 2008. –
V. 14. – P. 2061-2074.
97. Bellacosa A., Chan T. O., Ahmed N. N., Datta K., Malstrom S., Stokoe D., McCormick
F., Feng J., Tsichlis P. Akt activation by growth factors is a multiple-step process: the
role of the PH domain // Oncogene. – 1998. – V. 17. – P. 313-325.
98. Boggs
K.
P.,
Rock C.
hexadecylphosphocholine
O.,
Jackowski
S.
The
toward
HL60
cells
is
antiproliferative
effect
prevented
exogenous
by
lysophosphatidylcholine // Biochim. Biophys. Acta – 1998. – V. 1389. – P. 1-12.
126
of
99. Boggs K. P., Rock C. O., Jackowski S. Lysophosphatidylcholine attenuates the cytotoxic
effects of the antineoplastic phospholipid 1-O-octadecyl-2-O-methyl-rac-glycero-3phosphocholine // J. Biol. Chem. – 1995. – V. 270 – P. 11612-11618.
100.
Boggs K. P., Rock C. O., Jackowski S. Lysophosphatidylcholine and 1-O-
octadecyl-2-O-methyl-rac-glycero-3-phosphocholine inhibit the CDP-choline pathway of
phosphatidylcholine synthesis at the CTP: Phosphocholine cytidylyltransferase step // J.
Biol. Chem. – 1995. – V. 270. – P. 7757-7764.
101.
Baburina I., Jackowski S. Apoptosis triggered by 1-O-octadecyl- 2-O-methyl-rac-
glycero-3-phosphocholine is prevented by increased expression of CTP: Phosphocholine
cytidylyltransferase // J. Biol. Chem. – 1998. – V. 273. – P. 2169-2173.
102.
Van der Luit A. H., Budde M., Ruurs P., Verheij M., Van Blitterswijk W. J.
Alkyl-lysophospholipid accumulates in lipid rafts and induces apoptosis via raftdependent endocytosis and inhibition of phosphatidylcholine synthesis // J. Biol. Chem. –
2002 – V. 277. – P. 39541- 39547.
103.
Kennedy E. P., Weiss S. B. The function of cytidine coenzymes in the
biosynthesis of phospholipids // J. Biol. Chem. – 1956. – V. 222. – P. 193- 214.
Kent C. Regulation of phosphatidylcholine biosynthesis // Prog. Lipid Res. –
104.
1990. – V. 29. – P. 87-105.
Kent C. Eukaryotic phospholipid biosynthesis // Annu. Rev. Biochem. – 1995. –
105.
V.64. – P. 315-343.
106.
Kent C. CTP: Phosphocholine cytidylyltransferase // Biochim. Biophys. Acta. –
1997. – V. 1348. – P. 79-90.
107.
Pushkareva M. Y., Janoff A. S., Mayhew E. Inhibition of cell division but not
nuclear division by 1-O-octadecyl-2-O-methyl-Sn- glycero-3-phosphocholine // Cell
Biol. Int. – 1999. – V. 23. – P. 817-828.
127
108.
Na H. K., Chang C. C., Trosko J. E. Growth suppression of a tumorigenic rat liver
cell line by the anticancer agent, ET-18-O- CH3, is mediated by inhibition of cytokinesis
// Cancer Chemother. Pharmacol. – 2003. – V. 51. – P. 209-215.
109.
Van der Sanden M. H., Houweling M., Duijsings D., Vaandrager A. B., Van
Golde L. M. Inhibition of phosphatidylcholine synthesis is not the primary pathway in
hexadecylphosphocholine-induced apoptosis // Biochim. Biophys. Acta. – 2004. – V.
1636. – P. 99-107.
110.
Patel V., Lahusen T., Sy T., Sausville E., Gutkind J., Senderowicz A. Perifosine,
a Novel Alkylphospholipid, Induces p21WAF1 Expression in Squamous Carcinoma Cells
through a p53-independent Pathway, Leading to Loss in Cyclin-dependent Kinase
Activity and Cell Cycle Arrest // Cancer Research. – 2002. – V. 62. – P. 1401-1409.
111.
Gajate C., Santos-Beneit A., Modolell M., Mollinedo F. Involvement of c-Jun
NH2-terminal kinase activation and c-Jun in the induction of apoptosis by the ether
phospholipid
1-O-octadecyl-
2-O-methyl-rac-glycero-3-phosphocholine
//
Mol.
Pharmacol. – 1998. – V. 53. – P. 602-612.
112.
Mollinedo F., De La Iglesia-Vicente J., Gajate C., De Mendoza A., Villa-Pulgarin
J. A., Campanero M. A., Blanco-Prieto M. J. Lipid raft-targeted therapy in multiple
myeloma // Oncogene. – 2010. – V. 29. – P. 3748-3757.
113.
Mollinedo F., De la Iglesia-Vicente J., Gajate C., De Mendoza A., Villa-Pulgarin
J. A., De Frias M., Roue G., Gil J., Colomer D., Campanero M. A., Blanco-Prieto M. J.
In vitro and in vivo selective antitumor activity of Edelfosine against mantle cell
lymphoma and chronic lymphocytic leukemia involving lipid rafts // Clin. Cancer Res. –
2010. – V. 16. – P. 2046-2054.
114.
Gajate C., Matos-da-Silva M., Dakir E. L., Fonteriz R. I., Alvarez J., Mollinedo F.
Antitumor alkyl-lysophospholipid analog edelfosine induces apoptosis in pancreatic
cancer by targeting endoplasmic reticulum // Oncogene. – 2012. – V. 31. – P. 2627-2639.
128
115.
Nieto-Miguel T., Fonteriz R. I., Vay L., Gajate C., Lopez- Hernandez S.,
Mollinedo F. Endoplasmic reticulum stress in the proapoptotic action of edelfosine in
solid tumor cells // Cancer Res. – 2007. – V. 67. – P. 10368-10378.
116.
Gajate C., Gonzalez-Camacho F., Mollinedo F. Involvement of raft aggregates
enriched in Fas/CD95 death-inducing signaling complex in the antileukemic action of
edelfosine in Jurkat cells // PLoS One. – 2009. – V. 4. – e5044.
117.
De Brito O. M., Scorrano L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to
mitochondria // Nature. – 2008. – V. 456. – P. 605-610.
118.
Voelker. D. R. Characterization of phosphatidylserine synthesis and translocation
in permeabilized animal cells // J. Biol. Chem. – 1990. – V. 265. – P. 14340-14346.
Voelker D. R. Lipid transport pathways in mammalian cells // Experientia. –
119.
1990. – V. 46. – P. 569-579.
120.
Vance J. E. Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with
mitochondria // J. Biol. Chem. – 1990. – V. 265. – P. 7248- 7256.
121.
Ardail D., Gasnier F., Lerme F., Simonot C., Louisot P., Gateau-Roesch O.
Involvement of mitochondrial contact sites in the subcellular compartmentalization of
phospholipid biosynthetic enzymes // J. Biol. Chem. – 1993. – V. 268. – P. 25985-25992.
122.
Gasnier F., Ardail D., Febvay G., Simonot C., Lerme F., Guillaud J., Louisot P.,
Gateau-Roesch
O.
Further
microcompartmentation
within
evidence
the
for
membranes
both
of
functional
two
and
associated
structural
organelles,
mitochondrion and endoplasmic reticulum // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1993. –
V. 195. – P. 1365-1370.
123.
Gaigg B., Simbeni R., Hrastnik C., Paltauf F., Daum G. Characterization of a
microsomal subfraction associated with mitochondria of the yeast, Saccharomyces
cerevisiae. Involvement in synthesis and import of phospholipids into mitochondria //
Biochim. Biophys. Acta. – 1995. – V. 1234. – P. 214-220.
129
124.
Shiao Y. J., Lupo G., Vance J. E. Evidence that phosphatidylserine is imported
into mitochondria via a mitochondria-associated membrane and that the majority of
mitochondrial
phosphatidylethanolamine
is
derived
from
decarboxylation
of
phosphatidylserine // J. Biol. Chem. – 1995. – V. 270. – P. 11190-11198.
125.
Kornmann B., Currie E., Collins S. R., Schuldiner M., Nunnari J., Weissman J. S.,
Walter P. An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen
// Science. – 2009. – V. 325. – P. 477-481.
126.
Kornmann B., Walter P. ERMES -mediated ER-mitochondria contacts: molecular
hubs for the regulation of mitochondrial biology // J. Cell Sci. – 2010. – V. 123. – P.
1389-1393.
127.
Osman C., Voelker D. R., Langer T. Making heads or tails of phospholipids in
mitochondria // J. Cell Biol. – 2011. – V. 192. – P. 7-16.
128.
Ciarlo L., Manganelli V., Garofalo T., Matarrese P., Tinari A., Misasi R., Malorni
W., Sorice M. Association of fission proteins with mitochondrial raft-like domains // Cell
Death Differ. – 2010. – V. 17. – P. 1047-1058.
129.
Sorice M., Manganelli V., Matarrese P., Tinari A., Misasi R., Malorni W.,
Garofalo T. Cardiolipin-enriched raft-like microdomains are essential activating
platforms for apoptotic signals on mitochondria // FEBS Lett. – 2009. – V. 583. – P.
2447-2450.
130.
Zheng Y. Z., Berg K. B., Foster L. J. Mitochondria do not contain lipid rafts, and
lipid rafts do not contain mitochondrial proteins // J. Lipid Res. – 2009. – V. 50. – P. 988998.
131.
Garofalo T., Giammarioli A. M., Misasi R., Tinari A., Manganelli V.,
Gambardella L., Pavan A., Malorni W., Sorice M. Lipid microdomains contribute to
apoptosis-associated modifications of mitochondria in T cells // Cell Death Differ. –
2005. – V. 12. – P. 1378-1389.
130
132.
Grimm S., Brdiczka D. The permeability transition pore in cell death // Apoptosis.
– 2007. – V. 12. – P. 841-855.
133.
Soccio R. E., Breslow J. L. Intracellular cholesterol transport // Arterioscler.
Thromb. Vasc. Biol – 2004. – V. 24. – P. 1150-1160.
134.
De Pinto V., Benz R., Palmieri F. Interaction of non-classical detergents with the
mitochondrial porin. A new purification procedure and characterization of the poreforming unit // Eur. J. Biochem. – 1989. – V. 183. – P. 179-187.
135.
Torrecillas A., Aroca-Aguilar J. D., Aranda F. J., Gajate C., Mollinedo F.,
Corbalan-Garcia S., De Godos A., Gomez- Fernandez J. C. Effects of the anti-neoplastic
agent ET-18-OCH3 and some analogs on the biophysical properties of model membranes
// Int. J. Pharm. – 2006. – V. 318. – P. 28-40.
136.
Busto J. V., Del Canto-Jañez E., Goñi F. M., Mollinedo F., Alonso A.
Combination of the anti-tumour cell ether lipid edelfosine with sterols abolishes
haemolytic side effects of the drug // J. Chem. Biol. – 2008. – V. 1. – P. 89-94.
137.
Ausili A., Torrecillas A., Aranda F. J., Mollinedo F., Gajate C., Corbalan-Garcia
S., De Godos A., Gomez-Fernandez J. C. Edelfosine is incorporated into rafts and alters
their organization // J. Phys. Chem. B. – 2008. – V. 112. – P. 11643-11654.
138.
Sprong H., Van der Sluijs P., Van Meer G. How proteins move lipids and lipids
move proteins // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2001. – V. 2. – P. 504-513.
139.
Ng F. W., Nguyen M., Kwan T., Branton P. E., Nicholson D. W., Cromlish J. A.,
Shore G. C. p28 Bap31, a Bcl-2/Bcl-XL- and procaspase-8-associated protein in the
endoplasmic reticulum // J. Cell Biol. – 1997. – V. 139. – P. 327-338.
140.
Breckenridge D. G., Germain M., Mathai J. P., Nguyen M., Shore G. C.
Regulation of apoptosis by endoplasmic reticulum pathways // Oncogene. – 2003. – V.
22. – P. 8608-8618.
131
141.
Breckenridge D. G., Stojanovic M., Marcellus R. C., Shore G. C. Caspase
cleavage product of BAP31 induces mitochondrial fission through endoplasmic reticulum
calcium signals, enhancing cytochrome c release to the cytosol // J. Cell Biol. – 2003. –
V. 160. – P. 1115- 1127.
142.
Galluzzi L., Vitale I., Abrams J. M., Alnemri E. S., Baehrecke E. H.,
Blagosklonny M. V., Dawson T. M., Dawson V. L., El-Deiry W. S., Fulda S., Gottlieb
E., Green D. R., Hengartner M. O., Kepp O., Knight R. A., Kumar S., Lipton S. A., Lu
X., Madeo F., Malorni W., Mehlen P., Nun ˜ez G., Peter M. E., Piacentini M.,
Rubinsztein D. C., Shi Y., Simon H. U., Vandenabeele P., White E., Yuan J.,
Zhivotovsky B., Melino G., Kroemer G. Molecular definitions of cell death subroutines:
recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2012 // Cell Death and
Differentiation. – 2012. – V. 19. – P. 107–120.
Wajant H. The Fas signaling pathway: more than a paradigm // Science. – 2002. –
143.
V. 296. – P. 1635-1636.
144.
Siegel R. M., Frederiksen J. K., Zacharias D. A., Chan F. K., Johnson M., Lynch
D. et al. Fas preassociation required for apoptosis signaling and dominant inhibition by
pathogenic mutations // Science. – 2000. – V. 288. – P. 2354–2357.
145.
Boldin M. P., Mett I. L., Varfolomeev E. E., Chumakov I., Shemer-Avni Y.,
Camonis J. H. et al. Self-association of the ‘death domains’ of the p55 tumor necrosis
factor (TNF) receptor and Fas/APO1 prompts signaling for TNF and Fas/APO1 effects //
J. Biol. Chem. – 1995. – V. 270. – P. 387–391.
146.
Schulze-Osthoff K., Ferrari D., Los M., Wesselborg S., Peter M. E. Apoptosis
signaling by death receptors // Eur. J. Biochem. – 1998. – V. 254. – P. 439–459.
147.
Thome M., Schneider P., Hofmann K., Fickenscher H., Meinl E., Neipel F. et al.
Viral FLICE- inhibitory proteins (FLIPs) prevent apoptosis induced by death receptors //
Nature. – 1997. – V. 386. – P. 517–521.
132
148.
Budd R. C., Yeh W.C., Tschopp J. cFLIP regulation of lymphocyte activation and
development // Nat. Rev. Immunol. – 2006. – V. 6. – P. 196–204.
149.
Boldin M. P., Goncharov T. M., Goltsev Y. V., Wallach D. Involvement of
MACH, a novel MORT1/FADD-interacting protease, in Fas/APO-1- and TNF receptorinduced cell death // Cell. – 1996. – V. 85. – P. 803–815.
150.
Muzio M., Chinnaiyan A. M., Kischkel F. C., O’Rourke K., Shevchenko A, .Ni J.
et al. FLICE, a novel FADD-homologous ICE/CED-3-like protease, is recruited to the
CD95 (Fas/APO-1) death – inducing signaling complex // Cell. – 1996. – V. 85. – P.
817–827.
151.
Meier P., Vousden K. H. Lucifer’s labyrinth – ten years of path finding in cell
death // Mol. Cell – 2007. – V. 28. – P. 746–754.
152.
Lavrik I., Golks A., Krammer P. H. Death receptor signaling // J. Cell Sci. –
2005. – V. 118. – P. 265–267.
153.
Wang J., Chun H. J., Wong W., Spencer D. M., Lenardo M. J. Caspase-10 is an
initiator caspase in death receptor signaling // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2001. – V.
98. – P. 13884–13888.
154.
Kischkel F. C., Hellbardt S., Behrmann I., Germer M., Pawlita M., Krammer P. H.
et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a deathinducing signaling complex (DISC) with the receptor // EMBO J. – 1995. – V. 14. – P.
5579–5588.
155.
Micheau O., Tschopp J. Induction of TNF receptor I-mediated apoptosis via two
sequential signaling complexes // Cell. – 2003. – V. 114. – P. 181–190.
156.
Barnhart B. C., Alappat E. C., Peter M. E. The CD95 type I/type II model //
Semin. Immunol. – 2003. – V. 15. – P. 185–193.
157.
Scaffidi C., Fulda S., Srinivasan A., Friesen C., Li F., Tomaselli K. J. et al. Two
CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways // EMBO J. – 1998. – V. 17. – P. 1675–1687.
133
158.
Srinivasula S. M., Ahmad M., Fernandes-Alnemri T., Litwack G., Alnemri E. S.
Molecular ordering of the Fas-apoptotic pathway: the Fas/APO-1 protease Mch5 is a
CrmA- inhibitable protease that activates multiple Ced-3/ICE-like cysteine proteases //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – V. 93. – P. 14486–14491.
159.
Yin X. M., Wang K., Gross A., Zhao Y., Zinkel S., Klocke B. et al. Bid-deficient
mice are resistant to Fas-induced hepatocellular apoptosis // Nature. – 1999. – V. 400. –
P. 886–891.
160.
Luo X., Budihardjo I., Zou H., Slaughter C., Wang X. Bid, a Bcl2 interacting
protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of
cell surface death receptors // Cell. – 1998. – V. 94. – P. 481–490.
161.
Kroemer G, Galluzzi L, Brenner C. Mitochondrial membrane permeabilization in
cell death. Physiol Rev 2007; 87: 99–163.
162.
Sprick M. R., Rieser E., Stahl H., Grosse-Wilde A., Weigand M. A., Walczak H.
Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing
signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute
caspase-8 // EMBO J. – 2002. – V. 21. – P. 4520–4530.
163.
Lafont E., Milhas D., Teissie J., Therville N., Andrieu-Abadie N., Levade T. et al.
Caspase-10- dependent cell death in Fas/CD95 signalling is not abrogated by caspase
inhibitor zVAD- fmk // PLoS One. – 2010. – V. 5. – e13638.
164.
Mille F., Thibert C., Fombonne J., Rama N., Guix C., Hayashi H. et al. The
Patched dependence receptor triggers apoptosis through a DRAL–caspase-9 complex //
Nat. Cell Biol. – 2009. – V. 11. – P. 739–746.
165.
Guenebeaud C., Goldschneider D., Castets M., Guix C., Chazot G., Delloye-
Bourgeois C. et al. The dependence receptor UNC5H2/B triggers apoptosis via PP2Amediated dephosphorylation of DAP kinase // Mol. Cell. – 2010. – V. 40. – P. 863–876.
134
166.
Bialik S., Kimchi A. The death-associated protein kinases: structure, function, and
beyond // Annu. Rev. Biochem. – 2006. – V. 75. – P. 189–210.
167.
Youle R. J., Strasser A.. The BCL-2 protein family: opposing activities that
mediate cell death // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2008. – V. 9(1). – P. 47-59.
168.
Tait S. W., Green D. R. Mitochondria and cell death: outer membrane
permeabilization and beyond // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. – 2010. – V. 11. – P. 621–632.
169.
Brenner C., Grimm S. The permeability transition pore complex in cancer cell
death // Oncogene. – 2006. – V. 25. – P. 4744–4756.
170.
Li P., Nijhawan D., Budihardjo I., Srinivasula S. M., Ahmad M., Alnemri E.S. et
al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates
an apoptotic protease cascade // Cell. – 1997. – V. 91. – P. 479–489.
171.
Zou H., Henzel W. J., Liu X., Lutschg A., Wang X. Apaf-1, a human protein
homologous to C. elegans CED-4, participates in cytochrome c-dependent activation of
caspase-3 // Cell. – 1997. – V. 90. – P. 405–413.
172.
Joza N., Susin S. A., Daugas E., Stanford W. L., Cho S. K., Li C. Y. et al.
Essential role of the mitochondrial apoptosis-inducing factor in programmed cell death //
Nature. – 2001. – V. 410. – P. 549–554.
173.
Susin S. A., Lorenzo H. K., Zamzami N., Marzo I., Snow B. E., Brothers G. M. et
al. Molecular characterization of mitochondrial apoptosis-inducing factor // Nature. –
1999. – V. 397. – P. 441–446.
174.
Li L.Y., Luo X., Wang X. Endonuclease G is an apoptotic DNase when released
from mitochondria // Nature – 2001. – V. 412. – P. 95–99.
175.
Buttner S., Eisenberg T., Carmona-Gutierrez D., Ruli D., Knauer H., Ruckenstuhl
C. et al. Endonuclease G regulates budding yeast life and death // Mol. Cell. – 2007. –
V. 25. – P. 233–246.
135
176.
Chai J., Du C,. Wu J. W., Kyin S., Wang X., Shi Y. Structural and biochemical
basis of apoptotic activation by Smac/DIABLO // Nature. – 2000. – V. 406. – P. 855–
862.
177.
Yang Q. H., Church-Hajduk R., Ren J., Newton M. L., Du C. Omi/HtrA2 catalytic
cleavage of inhibitor of apoptosis (IAP) irreversibly inactivates IAPs and facilitates
caspase activity in apoptosis // Genes Dev – 2003. – V. 17. – P. 1487–1496.
178.
Srinivasula S. M., Gupta S., Datta P., Zhang Z., Hegde R., Cheong N. et al.
Inhibitor of apoptosis proteins are substrates for the mitochondrial serine protease
Omi/HtrA2 // J. Biol. Chem. – 2003. – V. 278. – P. 31469–31472.
179.
Vande Walle L., Van Damme P., Lamkanfi M., Saelens X., Vandekerckhove J.,
Gevaert K. et al. Proteome-wide identification of HtrA2/Omi substrates // J. Proteome
Res. – 2007. – V. 6. – P. 1006–1015.
180.
Hegde R., Srinivasula S. M., Zhang Z., Wassell R., Mukattash R., Cilenti L. et al.
Identification of Omi/HtrA2 as a mitochondrial apoptotic serine protease that disrupts
inhibitor of apoptosis protein–caspase interaction // J. Biol. Chem. – 2002. – V. 277. – P.
432–438.
181.
David K. K., Sasaki M., Yu S. W., Dawson T. M., Dawson V. L. EndoG is
dispensable in embryogenesis and apoptosis // Cell Death Differ. – 2006. – V. 13. – P.
1147–1155.
182.
Kroemer G., Galluzzi L., Vandenabeele P., Abrams J., Alnemri E. S., Baehrecke
E. H. et al. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee
on Cell Death 2009 // Cell Death Differ. – 2009. – V. 16. – P. 3–11.
183.
Galluzzi L., Zamzami N., de La Motte Rouge T., Lemaire C., Brenner C.,
Kroemer G. Methods for the assessment of mitochondrial membrane permeabilization in
apoptosis // Apoptosis. – 2007. – V. 12. – P. 803–813.
136
184.
Cho Y. S., Challa S., Moquin D., Genga R., Ray T. D., Guildford M.
Phosphorylation-driven assembly of the RIP1–RIP3 complex regulates programmed
necrosis and virus-induced inflammation // Cell. – 2009. – V. 137. – P. 1112–1123.
185.
Degterev A., Huang Z., Boyce M., Li Y., Jagtap P., Mizushima N. et al. Chemical
inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury //
Nat. Chem. Biol. – 2005. – V. 1. – P. 112–119.
186.
He S., Wang L., Miao L., Wang T., Du F., Zhao L. et al. Receptor interacting
protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha // Cell. – 2009. – V.
137. – P. 1100–1111.
187.
Zhang D. W., Shao J., Lin J., Zhang N., Lu B. J., Lin S. C. et al. RIP3, an energy
metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis //
Science. – 2009. – V. 325. – P. 332–336.
188.
Hitomi J., Christofferson D. E., Ng A., Yao J., Degterev A., Xavier R. J. et al.
Identification of a molecular signaling network that regulates a cellular necrotic cell death
pathway // Cell – 2008. – V. 135. – P. 1311–1323.
189.
Vandenabeele P., Galluzzi L., Vanden Berghe T., Kroemer G. Molecular
mechanisms of necroptosis: an ordered cellular explosion // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. –
2010. – V. 11. – P. 700–714.
190.
Zong W. X., Ditsworth D., Bauer D. E., Wang Z. Q., Thompson C. B. Alkylating
DNA damage stimulates a regulated form of necrotic cell death // Genes Dev. – 2004. –
V. 18. – P. 1272–1282.
191.
Bano D., Young K. W., Guerin C. J., Lefeuvre R., Rothwell N. J., Naldini L. et al.
Cleavage of the plasma membrane Na+/Ca2+ exchanger in excitotoxicity // Cell. – 2005.
– V. 120. – P. 275–285.
137
192.
Degterev A., Hitomi J., Germscheid M., Ch’en I. L., Korkina O., Teng X. et al.
Identification of RIP1 kinase as a specific cellular target of necrostatins // Nat. Chem.
Biol. – 2008. – V. 4. – P. 313–321.
193.
Wang K., Li J., Degterev A., Hsu E., Yuan J., Yuan C. Structure–activity
relationship analysis of a novel necroptosis inhibitor, Necrostatin-5 // Bioorg. Med.
Chem. Lett. – 2007. – V. 17. – P. 1455–1465.
194.
Vakifahmetoglu H., Olsson M., Tamm C., Heidari N., Orrenius S., Zhivotovsky
B. DNA damage induces two distinct modes of cell death in ovarian carcinomas // Cell
Death Differ. – 2008. – V. 15. – P. 555–566.
195.
Upton J. W., Kaiser W. J., Mocarski E. S. Virus inhibition of RIP3-dependent
necrosis // Cell Host Microbe. – 2010. – V. 7. – P. 302–313.
196.
Galluzzi L., Maiuri M. C., Vitale I., Zischka H., Castedo M., Zitvogel L. et al.
Cell death modalities: classification and pathophysiological implications // Cell Death
Differ/ – 2007. – V. 14. – P. 1237–1243.
197.
Kroemer G., Levine B. Autophagic cell death: the story of a misnomer // Nat.
Rev. Mol. Cell Biol. – 2008. – V. 9. – P. 1004–1010.
198.
Shimizu S., Kanaseki T., Mizushima N., Mizuta T., Arakawa-Kobayashi S.,
Thompson C. B. et al. Role of Bcl-2 family proteins in a non-apoptotic programmed cell
death dependent on autophagy genes // Nat. Cell Biol. – 2004. – V. 6. – P. 1221–1228.
199.
Fazi B., Bursch W., Fimia G. M., Nardacci R., Piacentini M., Di Sano F. et al.
Fenretinide induces autophagic cell death in caspase-defective breast cancer cells //
Autophagy. – 2008. – V. 4. – P. 435–441.
200.
Grander D., Kharaziha P., Laane E., Pokrovskaja K., Panaretakis T. Autophagy as
the main means of cytotoxicity by glucocorticoids in hematological malignancies //
Autophagy. – 2009. – V. 5. – P. 1198–1200.
138
201.
Laane E., Tamm K. P., Buentke E., Ito K., Kharaziha P., Oscarsson J. et al. Cell
death induced by dexamethasone in lymphoid leukemia is mediated through initiation of
autophagy // Cell Death Differ. – 2009. – V. 16 – P. 1018–1029.
202.
Boya P., Gonzalez-Polo R. A., Casares N., Perfettini J. L., Dessen P., Larochette
N. et al. Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis // Mol. Cell Biol. – 2005. – V.
25. – P. 1025–1040.
203.
Fimia G. M., Stoykova A., Romagnoli A., Giunta L., Di Bartolomeo S., Nardacci
R. et al. Ambra1 regulates autophagy and development of the nervous system // Nature. –
2007. – V. 447. – P. 1121–1125.
204.
Liang X. H., Jackson S., Seaman M., Brown K., Kempkes B., Hibshoosh H. et al.
Induction of autophagy and inhibition of tumorigenesis by beclin 1 // Nature. – 1999. –
V. 402. – P. 672–676.
205.
Cho D. H., Jo Y. K., Hwang J. J., Lee Y. M., Roh S. A., Kim J. C. Caspase-
mediated cleavage of ATG6/beclin-1 links apoptosis to autophagy in HeLa cells //
Cancer Lett. – 2009. – V. 274. – P. 95–100.
Yousefi S., Perozzo R., Schmid I., Ziemiecki A., Schaffner T., Scapozza L. et al.
206.
Calpain-mediated cleavage of Atg5 switches autophagy to apoptosis // Nat. Cell Biol. –
2006. – V.8. – P. 1124–1132.
207.
Wirawan E., Vande Walle L., Kersse K., Cornelis S., Claerhout S.,
Vanoverberghe I. et al. Caspase-mediated cleavage of beclin-1 inactivates beclin-1induced autophagy and enhances apoptosis by promoting the release of proapoptotic
factors from mitochondria // Cell Death Dis. – 2010. – V. 1. – e18.
208.
Castedo M., Coquelle A., Vivet S., Vitale I., Kauffmann A., Dessen P. et al.
Apoptosis regulation in tetraploid cancer cells // EMBO J. – 2006. – V. 25. – P. 2584–
2595.
139
209.
Vakifahmetoglu H., Olsson M., Tamm C., Heidari N., Orrenius S., Zhivotovsky
B. DNA damage induces two distinct modes of cell death in ovarian carcinomas // Cell
Death Differ. – 2008. – V. 15. – P. 555–566.
210.
Castedo M., Perfettini J. L., Roumier T., Andreau K., Medema R., Kroemer G.
Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition // Oncogene. – 2004. – V. 23. –
P. 2825–2837.
211.
Vakifahmetoglu-Norberg H,, Zhivotovsky B. The unpredictable caspase-2: what
can it do? // Trends Cell Biol. – 2010. – V. 20. – P. 150–159.
212.
Sedic M., Poznic M., Gehrig P., Scott M., Schlapbach R., Hranjec M. et al.
Differential antiproliferative mechanisms of novel derivative of benzimidazo[1,2alpha]quinoline in colon cancer cells depending on their p53 status // Mol. Cancer Ther. –
2008. – V. 7. – P. 2121–2132.
213.
Tomasini R., Tsuchihara K., Tsuda C., Lau S. K., Wilhelm M., Ruffini A. et al.
TAp73 regulates the spindle assembly checkpoint by modulating BubR1 activity // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. – 2009. – V. 106. – P. 797–802.
214.
Tomasini R., Tsuchihara K., Wilhelm M., Fujitani M., Rufini A., Cheung C. C. et
al. TAp73 knockout shows genomic instability with infertility and tumor suppressor
functions // Genes Dev. – 2008. – V. 22. – P. 2677–2691.
215.
Frisch S. M., Francis H. Disruption of epithelial cell–matrix interactions induces
apoptosis // J. Cell Biol. – 1994. – V. 124. – P. 619–626.
216.
Reginato M. J., Mills K. R., Paulus J. K., Lynch D. K., Sgroi D. C., Debnath J. et
al. Integrins and EGFR coordinately regulate the pro-apoptotic protein Bim to prevent
anoikis // Nat. Cell Biol. – 2003. – V. 5 – P. 733–740.
217.
Frisch S. M., Screaton R. A. Anoikis mechanisms // Curr. Opin. Cell Biol. –
2001. – V. 13 – P. 555–562.
140
218.
Mailleux A. A., Overholtzer M., Schmelzle T., Bouillet P., Strasser A., Brugge J.
S. BIM regulates apoptosis during mammary ductal morphogenesis, and its absence
reveals alternative cell death mechanisms // Dev. Cell. – 2007. – V. 12. – P. 221–234.
219.
Overholtzer M., Mailleux A. A., Mouneimne G., Normand G., Schnitt S. J., King
R. W. et al. A nonapoptotic cell death process, entosis, that occurs by cell-in-cell invasion
// Cell. – 2007. – V. 131. – P. 966–979.
220.
Mormone E., Matarrese P., Tinari A., Cannella M., Maglione V., Farrace M. G. et
al. Genotype-dependent priming to self- and xeno-cannibalism in heterozygous and
homozygous lymphoblasts from patients with Huntington’s disease // J. Neurochem. –
2006. – V. 98. – P. 1090–1099.
221.
Lai Y., Lim D., Tan P. H., Leung T. K., Yip G. W., Bay B. H. Silencing the
metallothionein-2A gene induces entosis in adherent MCF-7 breast cancer cells // Anat.
Rec. (Hoboken). – 2010. – V. 293. – P. 1685–1691.
222.
Fiorentini C., Falzano L., Fabbri A., Stringaro A., Logozzi M., Travaglione S. et
al. Activation of rho GTPases by cytotoxic necrotizing factor 1 induces macropinocytosis
and scavenging activity in epithelial cells // Mol. Biol. Cell. – 2001. – V. 12. – P. 2061–
2073.
223.
Ame J. C., Spenlehauer C., de Murcia G. The PARP superfamily // Bioessays
2004 . – V. 26. – P. 882–893.
Jeggo P. A. DNA repair: PARP – another guardian angel? // Curr. Biol. – 1998. –
224.
V. 8. – P. 49-51.
225.
Andrabi S. A., Kim N. S., Yu S. W., Wang H., Koh D. W., Sasaki M. et al.
Poly(ADP-ribose) (PAR) polymer is a death signal // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –
2006. – V. 103. – P. 18308–18313.
141
226.
Yu S. W., Andrabi S. A., Wang H., Kim N. S., Poirier G. G., Dawson T. M. et al.
Apoptosis-inducing factor mediates poly(ADP-ribose) (PAR) polymer-induced cell death
// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. – V. 103. – P. 18314–18319.
227.
Yu S. W., Wang H., Poitras M. F., Coombs C., Bowers W. J., Federoff H. J. et al.
Mediation of poly(ADP-ribose) polymerase-1-dependent cell death by apoptosisinducing factor // Science – 2002. – V. 297. – P. 259–263.
228.
Wang Y., Kim N. S., Haince J. F., Kang H. C., David K. K., Andrabi S. A. et al.
Poly(ADP-ribose) (PAR) binding to apoptosis-inducing factor is critical for PAR
polymerase-1-dependent dell death (parthanatos) // Sci. Signal. – 2011. – V. 4 (20). – P.
1-40.
229.
David K. K., Andrabi S. A., Dawson T. M., Dawson V. L. Parthanatos, a
messenger of death // Front. Biosci. – 2009. – V. 14. – P. 1116–1128.
230.
Akimoto K., Mizuno K., Osada S.-i., Hirai S.-i., Tanuma S.-i., Suzuky K., Ohno
S. A new member of the third class in the protein kinase C family, PKC lambda,
expressed dominantly in an undifferentiated mouse embryonal carcinoma cell line and
also in many tissues and cells // The Journal of Biological Chemistry. – 1994. – V. 269. –
P. 12677-12683.
231.
Wise B.C., Glass D.B. , Chou C-H.J. Phospholipid-sensitive calcium dependent
protein kinase from heart. II. Substrate specificity and inhibition by various agents. // J.
Biol. Chem. – 1982. – V. 257. – P. 8489-8495.
232.
House C., Kemp B.E. Protein kinase C contains a pseudosubstrate prototope in its
regulatory domain. // Science. – 1987. – V. 238. – P. 1726-1728.
233.
Soderling T.R. Protein kinases. Regulation by autoinhibitory domains. // J. Biol.
Chem. – 1990. – V. 265. – P. 1823-1826.
234.
Griner E. M., Kazanietz M. G. Protein kinase C and other diacylglycerol effectors
in cancer // Nat. Rev. Cancer. – 2007. – V.7(4). – P. 281-294.
142
235.
D'Costa A. M., Denning M. F. A caspase-resistant mutant of PKC-delta protects
keratinocytes from UV-induced apoptosis // Cell Death Differ. – 2005. – V. 12(3). – P.
224-232.
236.
DeVries-Seimon T. A., Ohm A. M., Humphries M. J., Reyland M. E. Induction of
apoptosis is driven by nuclear retention of protein kinase C delta // J. Biol. Chem. –
2007. – V. 282(31). – P. 22307-22314.
Kurokawa M. and Kornbluth S. Caspases and Kinases in a Death Grip // Cell. –
237.
2009. – V. 138(5). – P. 838–854.
238.
Craziani A., Gramaglia D., Zonca P.D., Comoglio P.M. Hepatocyte growth
factor/scatter factor stimulates the Ras-guanine nucleotide exchanger // J.Biol.Chem. –
1993. – V. 268. – P. 9165-9168.
239.
Osada S., Nakashima S., Saji S., Nakamura T., Nozawa Y. Hepatocyte growth
factor
(HGF)
mediates
the
sustained
formation
of
1,2-diacylglycerol
via
phosphatidylcholine-phospholipase C in cultured rat hepatocytes. // FEBS Lett. – 1992. –
V. 297. – P. 271-274.
240.
Weidner K.M., Behrens J., Vandekerckhove J., Birchmeier W. Scatter factor:
molecular characteristics and effect on the invasiveness of epithelial cells // J. Cell. Biol.
– 1990. – V. 111. – P. 2097-2108.
241.
Tanimura S., Chatani Y., Hoshino R., Sato M., Watanabe S., Kataoka T.,
Nakamura T., Kohno M. Activation of the 41/43 kDa mitogen-activated protein kinase
signaling pathway is required for hepatocyte growth factor-induced cell scattering //
Oncogene. – 1998. – V. 17. – P. 57-65.
242.
Herrera R. Modulation of hepatocyte growth factor-induced scattering of HT29
colon carcinoma cells. Involvement of the MAPK pathway // J. Cell Sci. – 1998/ – V.
111. – P. 1039-1049.
143
243.
Jeffers M., Fiscella M., Webb C. P., Anver M., Koochekpour S., Vande Woude,
G. F. The mutationally activated Met receptor mediates motility and metastasis // Proc.
Natl. Acad. Sci. U S A. – 1998. – V. 95. – P. 14417-14422.
244.
Khwaja A., Lehmann K., Marte B. M., Downward J. Phosphoinositide 3-kinase
induces scattering and tubulogenesis in epithelial cells through a novel pathway // J.
Biol.Chem. – 1998. – V. 273. – P. 18793-18801.
245.
Potempa
S.,
Ridley,
A.
J.
Activation
of
both
MAP
kinase
and
phosphatidylinositide 3-kinase by Ras is required for hepatocyte growth factor/scatter
factor-induced adherens junction disassembly // Mol. Biol. Cell. – 1998/ – V. 9. – P.
2185-2200.
246.
Fan S., Wang J. A., Yuan R. Q., Rockwell S., Andres J., Zlatapolskiy A. et al.
Scatter factor protects epithelial and carcinoma cells against apoptosis induced by DNAdamaging agents // Oncogene. – 1998. – V. 17. – P. 131–141.
247.
Yamamoto K., Morishita R., Hayashi S., Matsushita H., Nakagami H., Moriguchi
A. et al. Contribution of Bcl-2, but not Bcl-xL and Bax, to antiapoptotic actions of
hepatocyte growth factor in hypoxia-conditioned human endothelial cells // Hypertension
– 2001. – V. 37. – P. 1341–1348.
248.
Lefebvre J., Muharram G., Leroy C., Kherrouche Z., Montagne R., Ichim R.,
Tauszig-Delamasure S., Chotteau-Lelievre A., Brenner C.,
Mehlen. P., Tulasne D.
Caspase-generated fragment of the Met receptor favors apoptosis via the intrinsic
pathway independently of its tyrosine kinase activity // Cell Death and Disease. – 2013. –
V. 4. – P. 871-885.
249.
Klinghofer R.A., Sachsenmaier C., Cooper J.A. and Soriano P. Src family kinases
are required for integrin but not PDGFR signal transduction // EMBO J., – 1999. – V. 18.
– P. 2459-2471.
144
Tailor S. J., Shalloway D. Src and the control of cell division // BioEssays. –
250.
1996. – V. 18. – P. 9-11.
251.
Weng Z., Thomas S. M., Rickles R. J., Taylor J. A., Brauer A. W., Seidel-Dugan
C., Michael W. M., Dreyfuss G., Brugge J. S. Identification of Src, Fyn, and Lyn SH3binding proteins: implications for a function of SH3 domains // Molecular and Cellular
Biology. – 1994. – V. 14. – P. 4509-4521.
252.
Pathan N. I., Ashendel C. L., Geahlen R. L., Harrison M. L. Activation of T cell
Raf-1 at mitosis requires the protein-tyrosine kinase Lck // J. Biol. Chem. – 1996. – V.
271. – P. 30315-30317.
253.
Basu A., Cline J. S. Oncogenic transformation alters cisplatin-induced apoptosis
in rat embryo fibroblasts // Int. J. Cancer. – 1995. – V. 63. – P. 597-603.
254.
Tanno S., Mitsuuchi Y., Altomare D. A., Xiao G. H., Testa J. R. AKT activation
up-regulates insulin-like growth factor I receptor expression and promotes invasiveness
of human pancreatic cancer cells // Cancer Res. – 2001. – V. 61(2). – P. 589–593.
255.
Ciampolillo A., De Tullio C., Giorgino F. The IGF-I/IGF-I receptor pathway:
Implications in the Pathophysiology of Thyroid Cancer // Curr. Med. Chem. – 2005. – V.
12(24). – P. 2881–2891.
256.
Wang Z., et al. Pim-1: a serine/threonine kinase with a role in cell survival,
proliferation, differentiation and tumorigenesis // J. Vet. Sci. – 2001. – V. 2. – P. 167–
179.
257.
Bachmann M., Moroy T. The serine/threonine kinase Pim-1 // Int. J. Biochem.
Cell Biol. – 2005. – V. 37. – P. 726–730.
258.
Dhanasekaran S. M., et al. Delineation of prognostic biomarkers in prostate cancer
// Nature. – 2001. – V. 412. – P. 822–826.
145
259.
Amson R., et al. The human protooncogene product p33pim is expressed during
fetal hematopoiesis and in diverse leukemias // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1989. –
V. 86. – P. 8857–8861.
260.
Saris C. J., Domen J., Berns A. The pim-1 oncogene encodes two related protein-
serine/threonine kinases by alternative initiation at AUG and CUG // EMBO J. – 1991. –
V. 10. – P. 655–664.
261.
Xie Y., et al. The 44 kDa Pim-1 kinase directly interacts with tyrosine kinase
Etk/BMX and protects human prostate cancer cells from apoptosis induced by
chemotherapeutic drugs // Oncogene. – 2006. – V. 25. – P. 70–78.
262.
Moroy T., Grzeschiczek A., Petzold S., Hartmann K. U. Expression of a Pim-1
transgene accelerates lymphoproliferation and inhibits apoptosis in lpr/lpr mice // Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A. – 1993. – V. 90. – P. 10734–10738.
263.
Cibull T. L., et al. Overexpression of Pim-1 during progression of prostatic
adenocarcinoma // J. Clin. Pathol. – 2006. – V. 59. – P. 285–288.
264.
Valdman A., Fang X., Pang S.T., Ekman P., Egevad L. Pim-1 expression in
prostatic intraepithelial neoplasia and human prostate cancer // Prostate. – 2004. – V. 60.
– P. 367–371.
265.
Chiang W. F., et al. Up-regulation of a serine-threonine kinase proto-oncogene
Pim-1 in oral squamous cell carcinoma // Int. J. Oral Maxillofac. Surg. – 2006. – V. 35. –
– P. 740–745.
266.
Alizadeh A. A., et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified
by gene expression profiling // Nature. – 2000. – V. 403. – P. 503–511.
267.
Mizuki M., et al. Suppression of myeloid transcription factors and induction of
STAT response genes by AML-specific Flt3 mutations // Blood. – 2003. – V. 101. – P.
3164–3173.
146
268.
Nieborowska-Skorska M., Hoser G., Kossev P., Wasik M. A., Skorski T.
Complementary functions of the antiapoptotic protein A1 and serine/threonine kinase
pim-1 in the BCR/ABL-mediated leukemogenesis // Blood. – 2002. – V. 99. – P. 4531–
4539.
269.
Peltola K. J., et al. Pim-1 kinase inhibits STAT5-dependent transcription via its
interactions with SOCS1 and SOCS3 // Blood. – 2004. – V. 103. – P. 3744–3750.
270.
Krishnan N., Pan H., Buckley D. J., Buckley A. Prolactin-regulated pim-1
transcription: identification of critical promoter elements and Akt signaling // Endocrine.
– 2003. – V. 20. – P. 123–130.
271.
Krumenacker J. S., Narang V. S., Buckley D. J., Buckley A. R. Prolactin signaling
to pim-1 expression: a role for phosphatidylinositol 3-kinase // J. Neuroimmunol. –
2001. – V. 113. – P. 249–259.
272.
Mizuno K., et al. Regulation of Pim-1 by Hsp90 // Biochem. Biophys. Res.
Commun. – 2001. – V. 281. – P. 663–669.
273.
Shay K. P., Wang Z., Xing P. X., McKenzie I. F., Magnuson N. S. Pim-1 kinase
stability is regulated by heat shock proteins and the ubiquitin-proteasome pathway // Mol.
Cancer Res. – 2005. – V. 3. – P. 170–181.
274.
Wang Z., et al. Phosphorylation of the cell cycle inhibitor p21Cip1/WAF1 by
Pim-1 kinase // Biochim. Biophys. Acta. – 2002. – V.1593. – P. 45–55.
275.
Zhang Y., Wang Z., Magnuson N. S. Pim-1 kinase-dependent phosphorylation of
p21Cip1/WAF1 regulates its stability and cellular localization in H1299 cells // Mol.
Cancer Res. – 2007. – V. 5. – P. 909–922.
276.
Wang Z., et al. Pim-1 negatively regulates the activity of PTP-U2S phosphatase
and influences terminal differentiation and apoptosis of monoblastoid leukemia cells
// Arch. Biochem. Biophys. – 2001. – V. 390. – P. 9–18.
147
277.
Bhattacharya N., Wang Z., Davitt C., McKenzie I. F., Xing P. X., Magnuson N. S.
Pim-1 associates with protein complexes necessary for mitosis // Chromosoma. – 2002. –
V.111. – P. 80–95.
278.
Bachmann M., Hennemann H., Xing P. X., Hoffmann I., Moroy T. The oncogenic
serine/threonine kinase Pim-1 phosphorylates and inhibits the activity of Cdc25Cassociated kinase 1 (C-TAK1): a novel role for Pim-1 at the G2/M cell cycle checkpoint
// J. Biol. Chem. – 2004. – V. 279. – P. 48319–48328.
279.
Bachmann M., et al. The oncogenic serine/threonine kinase Pim-1 directly
phosphorylates and activates the G2/M specific phosphatase Cdc25C // Int. J. Biochem.
Cell Biol. – 2006. – V. 38. – P. 430–443.
280.
Shirogane T., et al. Synergistic roles for Pim-1 and c-Myc in STAT3-mediated
cell cycle progression and antiapoptosis // Immunity. – 1999. – V. 11. – P. 709–719.
281.
Pircher T. J., Zhao S., Geiger J. N., Joneja B., Wojchowski D. M. Pim-1 kinase
protects hematopoietic FDC cells from genotoxin-induced death // Oncogene. – 2000. –
V. 19. – P. 3684–3692.
282.
Yan B., et al. The PIM-2 kinase phosphorylates BAD on serine 112 and reverses
BAD-induced cell death // J. Biol. Chem. – 2003. – V. 278. – P. 45358–45367.
283.
Aho T. L., et al. Pim-1 kinase promotes inactivation of the pro-apoptotic Bad
protein by phosphorylating it on the Ser112 gatekeeper site // FEBS Lett. – 2004. – V.
571. – P. 43–49.
284.
Стоилова Т. Б., Дуцева Е. А., Пашковская А. А., Сычев С. В., Ковальчук С.
И., Собко А. А., Егорова Н. С., Котова Е. А., Антоненко Ю. Н., Суровой А. Ю.,
Иванов В. Т. Различные типы ионных каналов, индуцированные в липидных
мембранах производными грамицидина А, несущими на С-конце катионную
последовательность // Биоорганическая химия. – 2007. – Т.33. – № 5. – стр. 511519.
148
285.
Stouten P. F. W., Frommel C., Nakamura H., C. Sander. An Effective Solvation
Term Based on Atomic Occupancies for Use in Protein Simulations // Mol. Simul. –
1993. – V. 10. – P. 97-120.
286.
Plyavnik N. V., Kramareva T. V., Serebrennikova G. A. Synthesis of cationic
alkyl glycerolipids with heterocyclic nitrogen-containing bases as polar domains //
Rus. J. Bioorg. Chem. – 2011. – V. 37. – № 4. – P. 492-498.
287.
Романова С. Г., Штиль А. А., Серебренникова Г. А. Синтез новых
бесфосфорных аналогов эдельфозина и их цитотоксичность // Биоорган. Химия. –
2008. – Т. 34. – №6. – С. 827-830.
149