Антигены желудка, почки, НЕр-2 клетки, и внутренний фактор

Mosaic IIFT, EUROIMMUN
1
_________________________________________________________________________________________________
Регистрационное удостоверение ФС №2006/1519 от 03.10.2006 г.
Антигены желудка, почки, НЕр-2 клетки, и внутренний фактор
РНИФ
Номера по каталогу:
FA 1360-0405 - 1
FA 1360-1003 - 1
FA 1360-1005 - 1
FA 1360-1010 - 1
FA 1360-2005 - 1
FA 1360-2010 - 1
Набор на 20 определений (4 предметных стекла × 5 зон)
Набор на 30 определений (10 предметных стекол × 3 зоны)
Набор на 50 определений (10 предметных стекол × 5 зон)
Набор на 100 определений (10 предметных стекол × 10 зон)
Набор на 100 определений (20 предметных стекол × 5 зон)
Набор на 200 определений (20 предметных стекол × 10 зон)
Данную инструкцию также можно использовать с наборами: FA1360-####-2, FA1360-####-3, FA1360####-8, FA1360-####-9, FA1362-####-1, FA1362-####-6 (см. стр. 13)
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор предназначен для качественного или полуколичественного in vitro определения человеческих
антител в сыворотке или плазме крови человека.
ПРИНЦИП МЕТОДА
В наборы Антигены желудка (обезьяны) IIFT включены предметные стекла с биочиповыми реакционными
зонами, поверхность которых покрыта различными субстратами. Стекла инкубируют на первой стадии
реакции с образцами разведенной сыворотки или плазмы крови пациента. Имеющиеся в положительных
образцах специфические антитела классов IgA, IgG и IgM связываются с соответствующими антигенами. На
второй стадии связавшиеся антитела выявляют флуоресцентным окрашиванием, которое происходит в
результате инкубации стекол с меченными флюоресцеином антителами к соответствующим
иммуноглобулинам человека. Характер свечения оценивается с помощью флуоресцентного микроскопа.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
Реагенты и материалы, входящие в состав набора на 50 определений (напр. FA1360-1005-1)
Формат
Символ
Компоненты набора
1. Предметные стекла, каждое с 5 биочипами (спецификацию см. на
SLIDE
10 шт.
стр.13).
2. Конъюгат
меченные флюоресцеином антитела к IgAMG человека (козы); готовый к
1 × 1,5 мл CONJUGATE
использованию
3. Положительный контроль
содержащий аутоантитела к митохондриям (АМА), человека; готовый к
1 × 0,25 мл POS CONTROL
использованию
4. Положительный контроль
содержащий аутоантитела к париетальным клеткам (РСА), человека;
POS CONTROL
1 × 0,1 мл
готовый к использованию
5. Отрицательный контроль
1 × 0,1 мл NEG CONTROL
не содержит аутоантител, человека; готовый к использованию
6. Соли для ФСБ (фосфатно-солевого буферного раствора, PBS), рН 7,2
PBS
2 шт.
7. Твин 20
TWEEN 20
2 × 2,0 мл
8. Среда для заливки;
GLYCEROL
1 × 3,0 мл
готовая к использованию
9. Покровные стекла (62 мм × 23 мм)
12 шт.
COVERGLASS
1 шт.
10. Инструкция к набору
Серия
Температура хранения
Для in vitro диагностики
Невскрытый набор использовать до
Отдельные предметные стекла поставляются вместе с покровными стеклами. Также можно заказать
дополнительно положительный контроль (например, номер по каталогу СА 1620-0101, CА 1361-0101) и
отрицательный контроль (например, номер по каталогу CА 1000-0101 Z).
Для проведения теста необходимы шаблоны-подложки TRAY, которые не включены в состав набора. Их
можно заказать у фирмы EUROIMMUN: ZZ 9999-0110 для предметных стекол, включающих до 10 зон,
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
2
_________________________________________________________________________________________________
ХРАНЕНИЕ И СТАБИЛЬНОСТЬ НАБОРА
Предметные стекла должны храниться при температуре от минус 40 °С (не ниже) до 8 °С, остальные
реагенты набора - при температуре 2-8 °С. При соблюдении условий хранения стабильность набора
гарантируется в течение 18 месяцев со дня изготовления.
УТИЛИЗАЦИЯ ОТХОДОВ
Обращайтесь с исследуемыми образцами, контролями и предметными стеклами как с потенциально
инфицированными материалами. Все реагенты и материалы, являющиеся отходами, должны
утилизироваться в соответствии с действующими нормативами.
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ (реакционные зоны 5 × 5 мм)
Техника TITERPLANE разработана фирмой EUROIMMUN с целью стандартизации иммунологических
анализов: образцы или меченые антитела вначале наносят на реакционные зоны специального шаблонаподложки. Затем в углубления шаблона-подложки помещают предметные стекла с биочипами, так что
сразу все биочипы приходят в соприкосновение с каплями жидкости, и реакция со всеми биочипами
начинается одновременно. Расположение и высота капель точно заданы геометрией всей системы. Все
жидкости заключены в огороженное пространство, поэтому не нужна обычно используемая в таких случаях
”влажная камера”. Таким образом, можно инкубировать в идентичных условиях любое количество
образцов, размещая их один за другим.
Подготовка реагентов и образцов сыворотки или плазмы крови описаны на стр. 3 и 4
данной инструкции.
Нанесите по 25 мкл разведенного образца сыворотки или плазмы крови в каждую
Нанесение
реакционную зону шаблона-подложки. Избегайте образования пузырьков воздуха.
Нанесите до начала инкубации все образцы, исследуемые в данной постановке
анализа (до 200 капель). Для удобства используйте полистироловый шаблон для
нанесения.
Начните все реакции одновременно, поместив предметные стекла с биочипами в
Инкубация
соответствующие углубления шаблона-подложки. Следите, чтобы каждый образец
образцов
(1-я стадия)
контактировал с биочипом на предметном стекле и чтобы отдельные образцы не
соприкасались друг с другом. Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной
температуре (от +18 °С до +25 °С).
Ополосните предметные стекла в течение 1 секунды под струей буфера ФСБ-Т
Промывка
(используйте стакан или колбу), поместите их сразу в промывочную кювету,
содержащую ФСБ-Т, и промывайте в течение как минимум 5 минут. По возможности
используйте встряхивание на шейкере орбитального типа.
Нанесите по 20 мкл меченных флюоресцеином антител к глобулинам человека в
Нанесение
каждую реакционную зону чистого шаблона-подложки. Все капли реагента должны быть
нанесены до начала 2-й инкубации. Для нанесения используйте пипетку-степпер. Перед
использованием меченые антитела необходимо перемешать с помощью пипетки. Для
экономии времени можно нанести конъюгат на отдельный шаблон-подложку пока идет
инкубация с разведенными образцами сыворотки или плазмы крови.
Извлеките одно предметное стекло с биочипом из кюветы с буфером ФСБ-Т, в течение
Инкубация
пяти секунд бумажной салфеткой протрите только заднюю сторону и края по длине
конъюгата
(2-я стадия)
стекла и сразу поместите предметное стекло с биочипами в углубления шаблонаподложки. Не высушивайте области между реакционными зонами. Следите, чтобы
каждая капля конъюгата контактировала с биочипом на предметном стекле. Затем ту же
процедуру проделайте со следующими предметными стеклами. С этого момента
предохраняйте стекла от воздействия прямых солнечных лучей. Инкубируйте в течение
30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С).
Ополосните предметные стекла в течение 1 секунды под струей буфера ФСБ-Т
Промывка
(используйте стакан или колбу), поместите их сразу в промывочную кювету,
содержащую ФСБ-Т, и промывайте в течение как минимум 5 минут. По возможности
используйте встряхивание на шейкере орбитального типа. Для контрастного
окрашивания на каждые 150 мл фосфатного буфера можно добавить 10 капель
красителя Эванса голубого.
Нанесите среду для заливки на покровное стекло – капли объемом 10 мкл на каждую
Заливка
реакционную зону. Используйте полистироловый шаблон для заливки. Извлеките одно
предметное стекло с биочипами из кюветы с буфером ФСБ-Т, бумажной салфеткой
протрите заднюю сторону, все четыре края стекла, а также всю поверхность вокруг, но
не между реакционными зонами. Положите предметное стекло биочипами вниз на
подготовленное покровное стекло. Сразу проверьте, чтобы покровное стекло попало в
прорези предметного стекла. При необходимости скорректируйте положение стекол.
Флюоресценцию оценивают с помощью микроскопа.
Учет
___________________________________________________________________________________________
Подготовка
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
3
_________________________________________________________________________________________________
результатов
Объектив: для срезов органов 20х, для инфицированных клеток 20х, для клеточных
субстратов 40х.
Фильтр возбуждения: 488 нм, цветоделительное устройство: 510 нм, блокирующий
фильтр: 520 нм.
Источник света: ртутная лампа, 100 ватт, EUROIMMUN LED, EUROStar Bluelight.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание. Реагенты каждой серии подобраны друг к другу, поэтому не следует смешивать в одном
анализе реагенты разных серий. После первого использования все реагенты стабильны до истечения
указанного срока годности при хранении при температуре 2-8°С и предохранении от микробной
контаминации, если ниже не оговорены особые условия хранения.
- Предметные стекла с биочипами
Предметные стекла готовы к использованию. Снимите предохраняющую упаковку со стекла только
после того, как стекло прогреется до комнатной температуры во избежание конденсации влаги и
повреждения субстрата. Промаркируйте стекла фломастером с мягким стержнем. Не дотрагивайтесь до
биочипов. После вскрытия упаковки предметные стекла с биочипами должны быть проинкубированы в
течение 15 минут. Если предохраняющая упаковка повреждена, стекло нельзя использовать для
диагностики.
- Меченные флюоресцеином вторичные антитела (ФИТЦ)
Меченые антитела готовы к использованию. Перед использованием меченые антитела необходимо
тщательно перемешать с помощью пипетки. Конъюгат чувствителен к свету. Предохранять от
воздействия солнечных лучей.
- Положительный и отрицательный контроли
Контроли готовы к использованию. Перед использованием контроли необходимо тщательно перемешать
с помощью пипетки.
- ФСБ-Т
1 упаковку «Соли для ФСБ» следует растворить в 1 л дистиллированной воды (оптимальной является
вода для вливаний, вода для инъекций) и смешать с 2 мл твина 20. Приготовленный ФСБ-Т стабилен в
течение 1 недели при хранении при температуре 2-8 °С и соблюдении правил использования. Если
раствор ФСБ-Т помутнел или в нем появился пророст, использовать его нельзя.
- Среда для заливки
Готова к использованию.
- Шаблоны-подложки
Поверхность реакционных зон шаблона-подложки должна быть гидрофильна, а поверхность вокруг этих
зон - гидрофобна. Если необходимо, протрите их обезжиривающим реагентом (например, Extran MA 01,
“Merck”) и промойте большим количеством воды. Для дезинфицирования погрузите шаблон-подложку на
1 час в дезинфицирующий раствор (например, в 3% раствор Sekusept Extra, “Henkel”). После
дезинфицирования промойте шаблон-подложку большим количеством воды и протрите ее
фильтровальной бумагой.
Внимание! Биочипы, покрытые антигенным субстратом, обработаны дезинфицирующим фиксирующим
реагентом. Контроли были проверены на отсутствие антигена гепатита В, а также антител к вирусу гепатита
С, ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью методов иммуноферментного анализа и непрямой иммунофлюоресценции.
Однако, все компоненты тест-системы следует считать потенциально инфекционно опасными
материалами и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры предосторожности. Часть
реагентов содержит токсичный азид натрия. Избегайте контакта реагентов с кожей.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Исследуемые образцы
Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
Стабильность
Исследуемые образцы сыворотки или плазмы крови могут храниться до 14 дней при температуре 2-8 °С.
Разведенные образцы следует исследовать в течение одного рабочего дня.
Рекомендуемые разведения образцов для качественного анализа
Образцы сыворотки или плазмы крови пациентов разводят 1:10 буфером ФСБ-Т. Например, разведите 11,1
мкл исследуемого образца в 100 мкл ФСБ-Т и тщательно перемешайте (например, на вортексе в течение 4
секунд). При использовании мозаик FA1360-####-2, FA1360-####-3, FA1360-####-8, FA1360-####-9 образцы
дополнительно разводят 1:100. Например, разведите 10,1 мкл образца в 1000 мкл буфера ФСБ-Т и
тщательно перемешайте (например, на вортексе в течение 4 секунд).
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
4
_________________________________________________________________________________________________
Рекомендуемые разведения образцов для полуколичественного анализа
Образцы сыворотки или плазмы крови пациентов разводят буфером ФСБ-Т. При разведении каждого из
образцов в пробирку вносят 100 мкл ФСБ-Т и 11,1 мкл предыдущего более концентрированного
разведения, затем смесь перемешивают (например, на вортексе в течение 2 секунд). Для анализа фирма
EUROIMMUN рекомендует использовать образцы, начиная с разведения 1:10.
Разведение
1:10
Схема разведения
100 мкл ФСБ-Т + 11,1 мкл неразведенного
образца
1:100
100 мкл ФСБ-Т
разведенного 1:10
+
11,1
мкл
образца,
1:1000
100 мкл ФСБ-Т +
разведенного 1:100
11,1
мкл
образца,
11 1мкл
11.1мкл
После каждых двух
шагов
разведения
следует
сменить
наконечники
на
новые
для
предотвращения
переноса
...
...
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Образец положительной реакции флюоресценции
На замороженных срезах желудка (приматов) флуоресцентное свечение наблюдается только в цитоплазме
париетальных клеток слизистой оболочки желудка. Оно представляет собой тонкие – грубые пласты. Все
остальные структуры темнее. Очень важно дифференцировать антитела к митохондриям и другим
компонентам цитоплазмы от антител к париетальным клеткам. В отрицательных случаях флуоресцентное
свечение париетальных клеток в желудке имеет такую же яркость, что и окружающие области.
Антитела к митохондриям (АМА) могут быть обнаружены в различных субстратах и в НЕр-2 клетках. Для
прицельного определения и дифференциации этих антител используют субстраты из замороженных срезов
почек (крысы, мыши). В цитоплазме проксимальных и дистальных отделов канальцев наблюдается
гранулярное флуоресцентное свечение преимущественно рядом с базальной мембраной. Клубочки
окрашиваются незначительно при АМА. Картина флуоресцентного свечения совпадает с таковой у
положительной контрольной сыворотки. Любое флуоресцентное свечение в просвете среза канальца не
учитывают.
Антитела к ядерным антигенам могут быть обнаружены в различных субстратах. Для прицельного
определения и дифференциации антинуклеарных антител используют субстраты из эпителиальных клеток
человека (НЕр-2). В клеточном ядре наблюдается четкое флуоресцентное свечение, которое
характеризуется определенной картиной. Если в образце отсутствуют антитела, в ядре отсутствует
специфическое свечение. В каждом обследуемом поле исследуют ядра как в период интерфазы, как и
митотически делящиеся, по возможности в нескольких областях.
Кроме того печень приматов реагирует со многими другими антителами, из которых наиболее важными
являются антитела к рибосомальному Р-белку, печеночно-специфическому белку (LSP), мембране
печеночных клеток (LMA), желчным протокам, эндотелиальным клеткам, эндомизию и гранулоцитам
(cANCA, pANCA). PANCA и АNA можно достоверно дифференцировать, так как гранулоциты в печеночных
синусоидах лежат чуть выше ядра гепатоцитов и могут быть таким образом
идентифицированы зрительно.
Печень (крысы) реагируют дополнительно с другими антителами. Антитела к
печеночно-почечным микросомам (LKM) имеют значение.
На замороженных срезах желудка (крысы, мыши) антитела против гладкой
мускулатуры (ASMA) демонстрируют четкое флуоресцентное свечение
цитоплазмы мышечной оболочки, а также мышечной пластинки слизистой
оболочки и интергранулярных сократительных фибрилл слизистой оболочки.
Картина флуоресцентного свечения совпадает с таковой у положительной
контрольной сыворотки. При отсутствии этих антител, сократительные
элементы не окрашиваются.
На BIOCHIP, покрытых внутренним фактором, на темном фоне видны зеленые
округлые области
.
BIOCHIP, покрытые
внутренним фактором
В случае отрицательной реакции, весь BIOCHIP с нанесенным внутренним фактором темный, округлые
области могут быть едва ли идентифицированы.
Для точной дифференциальной диагностики между положительным и отрицательным результатами
контроли и некоторые нормальные сыворотки должны сравниваться с образцами пациентов.
Картина флуоресцентного свечения совпадает с таковой у положительной контрольной сыворотки.
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
5
_________________________________________________________________________________________________
Если положительный контроль не дает четкого флуоресцентного свечения или наблюдается явное
флуоресцентное свечение отрицательного контроля, результаты анализа не учитывают, тест следует
повторить.
Качественный анализ
Антитела РСА
Оценка
Отсутствие
реакции
при Отрицательная. В сыворотке пациента антитела к париетальным
разведении 1:10
клеткам отсутствуют.
Положительная
реакция
при Положительная. При наличие соответствующих симптомов, указывает
разведении 1:10
на пернициозную анемию, хронический атрофический гастрит или
другие аутоиммунные заболевания, особенно имеющие аутоиммунную
полиэндокрилогическую форму. Имеется риск развития карциномы
желудка.
Антитела к АМА
Отсутствие
реакции
разведении 1:100
Положительная
реакция
разведении 1:100
Оценка
при Отрицательная. В сыворотке пациента антитела к митохондриям
отсутствуют.
при Положительная. Указывает на различные заболевания, например,
первичный билиарный цирроз, аутоиммунный гепатит, некоторые
формы системной красной волчанки, сифилис (см. ниже).
Антитела к ANA
Отсутствие
реакции
разведении 1:100
Положительная
реакция
разведении 1:100
Положительная
реакция
разведении 1:320
Оценка
при Отрицательная. В сыворотке пациента антитела к ядерным антигенам
отсутствуют.
при Слабо положительная. Иммунофлуоресцентные типы: гомогенный
рисунок, центромеры, ядерные пятнышки, Jo-1, типичная картина для
SS-A/SS-B, Sm/RNP – возможное указание на наличие различных
ревматоидных и других заболеваний.
при Положительная. Указывает на наличие различных ревматоидных и
других заболеваний.
Антитела к ASMA
Отсутствие
реакции
разведении 1:100
Положительная
реакция
разведении 1:100
Оценка
при Отрицательная. В сыворотке пациента антитела к антигенам гладкой
мускулатуры отсутствуют.
при Положительная. Указывает на хронический активный гепатит,
вирусный гепатит, инфекционный мононуклеоз и другие заболевания.
Антитела
к
внутреннему
фактору
Отсутствие
реакции
при
разведении 1:10
Положительная
реакция
при
разведении 1:10
Оценка
Отрицательная. В сыворотке пациента антитела к внутреннему
фактору отсутствуют.
Положительная. Если присутствуют соответствующие клинические
признаки, указывает на пернициозную анемию. У пациентов с
хроническим атрофическим гастритом указывает на повышенный риск
развития пернициозной анемии в будущем.
На сайте фирмы EUROIMMUN (www.euroimmun.com) можно найти множество примеров картин
флуоресцентного свечения.
Полуколичественный анализ
Титр определяют как последнее разведение образца, при котором специфическая флюоресценция еще
вполне отчетлива. При этом следует проводить сравнение с реакцией, полученной при эквивалентном
разведении отрицательной сыворотки.
Титр антител можно оценить по результатам флюоресценции, полученным при различных разведениях
образца, используя следующую таблицу.
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
6
_________________________________________________________________________________________________
1:10
слабая
умеренная
сильная
сильная
сильная
сильная
сильная
.
.
.
Флюоресценция при разведении образца
1:100
1:1000
отсутствует
отсутствует
отсутствует
отсутствует
слабая
отсутствует
умеренная
отсутствует
сильная
слабая
сильная
умеренная
сильная
сильная
.
.
.
.
.
.
1:10 000
отсутствует
отсутствует
отсутствует
отсутствует
отсутствует
отсутствует
слабая
.
.
.
Титр антител
1:10
1:32
1:100
1:320
1:1000
1:3200
1:10 000
.
.
.
При постановке диагноза наряду с серологическими результатами следует всегда учитывать и клинические
симптомы.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Антиген
Для определения аутоантител к париетальным клеткам с помощью непрямой иммунофлуоресценции
сегодня преимущественно используются замороженные срезы желудка (приматов).
При использовании дополнительного субстрата из почек крысы, сравнение картины флуоресцентного
свечения антител к париетальным клеткам и митохондриям делает возможным дифференциальную
диагностику этих аутоантител.
Антитела к внутреннему фактору обычно определяются путем иммуноферментного анализа (EUROIMMUN,
ELISA EA 1362-9601А) или радиоиммунного анализа (РИА). Однако их также можно дифференцировать
путем непрямой иммунофлуоресценции с использованием комбинированного субстрата, состоящего из
желудка приматов и очищенного внутреннего фактора (EUROIMMUN FA 1362-1005-1).
Для определения антинуклеарных антител с помощью непрямой иммунофлуоресценции сегодня
преимущественно используются эпителиальные клетки человека (НЕр-2). НЕр-2 демонстрируют широкой
спектр человеческих ядерных антигенов и оценка картины флуоресцентного свечения делает возможным
проведение предварительной дифференциации большого количества антител.
При непрямой иммунофлуоресценции на срезах печени выявляются лишь ограниченный спектр ядерных
антигенов, но они реагируют с другими аутоантителами имеющие диагностическую значимость.
Для определения аутоантител к гладкой мускулатуре (ASMA) с помощью непрямой иммунофлуоресценции
сегодня преимущественно используются замороженные срезы тканей различных органов, желудка (крысы,
мыши). Некоторые антитела, направленные против гладкой мускулатуры, направлены против актина и
выявляются при использовании комбинированного субстрата, состоящего из НЕр-2 клеток и срезов печени
приматов.
Стабильность
При соблюдении условий хранения стабильность набора гарантируется в течение 18 месяцев со дня
изготовления.
Диапазон определения
Начальным для данной тест-системы является разведение 1:10. Далее образцы можно разводить с шагом
10, так что получается серия разведений 1:1000, 1:10000 и т.д. Верхнего предела определения нет.
Воспроизводимость в пределах одной постановки
Воспроизводимость в пределах одной постановки оценивали по 10 определениям двух
охарактеризованных образцов, инкубируемых параллельно. При полуколичественном анализе отклонения
интенсивности флюоресценции отсутствовали. Интенсивность специфической флюоресценции в числовом
выражении фирмой EUROIMMUN называется уровнем интенсивности флюоресценции. Эта величина
может измеряться числами от «0» (отсутствие специфической флюоресценции) до «5» (чрезвычайно
высокая степень специфической флюоресценции).
Воспроизводимость между постановками
Воспроизводимость между постановками оценивали более чем по пяти двойным определениям каждой их
двух охарактеризованных образцов, инкубируемых в параллели в два разных дня. При полуколичественном
анализе отклонения интенсивности флюоресценции отсутствовали.
Воспроизводимость между сериями
Воспроизводимость между сериями оценивали более чем по различным сериям с помощью
охарактеризованного образца. При полуколичественном анализе отклонения составляли не более + 1
уровня интенсивности флюоресценции.
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
7
_________________________________________________________________________________________________
Перекрестные реакции
Антитела
ANA
PCA
ASMA
AMA
Анти-внутренний фактор
Перекрестная реактивность
11 охарактеризованных образцов были проинкубированы и дали
ожидаемую картину флуоресцентного свечения (CDC 1 – CDC 11).
Результаты показали отсутствие перекрестной реактивности при
использовании данных сывороток.
Данные о перекрестной реактивности у фирмы EUROIMMUN отсутствуют.
Данные о перекрестной реактивности у фирмы EUROIMMUN отсутствуют.
Данные о перекрестной реактивности у фирмы EUROIMMUN отсутствуют.
Данные о перекрестной реактивности у фирмы EUROIMMUN отсутствуют.
Влияние гемоглобина, триглицеридов и билирубина
Не отмечено искажения результатов при исследовании данным набором гемолизированных, липемических
или желтушных образцов сывороток.
Референтный диапазон
Титр 1: < 10
Чувствительность и специфичность
Субстрат
Желудок (обезьяна)
РСА
%
98
Почки (крыса)
АМА
100
Anti-LKM
100
НЕр-2 клетки
(человека)
ANA
Печень (обезьяна)
ANA
Печень (крыса)
Anti-LKM
100
97
100
ANA
100
Желудок (мыши)
ASMA
100
BIOCHIP с
внутренним
фактором:
Внутренний фактор
100
Чувствительность
Референс
Н+/К+-АТФаза ИФА
(n=190, происхождение: Германия)
%
91
Национальные референсные центры
(n=38, происхождение: Германия)
Национальные референсные центры
(n=37, происхождение: Германия)
100
ИФА + блот
(n= 128, происхождение Германия)
100
НЕр-2 РИФ
(n= 268, происхождение Германия)(
Национальные референсные центры
(n=30, происхождение: Германия)
НЕр-2 РИФ (n=200, происхождение
Германия)
Национальные референсные центры
(n=36, происхождение: Германия)
РИА и ИФА
(n=42, происхождение: Германия)
100
81
100
59
100
100
Специфичность
Референс
Н+/К+-АТФаза ИФА
(n=190, происхождение: Германия)
Национальные референсные центры
(n=38, происхождение: Германия)
Национальные референсные центры
(n=37, происхождение: Германия)
ИФА + блот
(n= 128, происхождение Германия)
НЕр-2 РИФ
(n= 268, происхождение Германия)
Национальные референсные центры
(n=30, происхождение: Германия)
НЕр-2 РИФ (n=37, происхождение
Германия)
Национальные референсные центры
(n=36, происхождение: Германия)
РИА и ИФА
(n=42, происхождение: Германия)
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
Аутоантитела к париетальным клеткам и внутреннему фактору:
Париетальные клетки в слизистой оболочке желудка продуцируют соляную кислоту и внутренний фактор.
Тагерным антигеном для аутоантител к париетальным клеткам (РСА), как было выяснено, является Н+/К+
АТФаза, которая участвует в продукции соляной кислоты. Кроме того, также возможно, что РСА также
направлен против рецепторов гастрина. Оба антигена расположены на поверхности париетальных клеток.
Внутренний фактор представляет собой гликопротеин, который связывается с витамином В12 и
предотвращает его раннее разрушение в кишечнике до тех пор пока он не всосется в дистальном отделе
подвздошной кишки.
Пернициозная анемия характеризуется дефицитом витамина В12 с симптомами гиперхромной анемии.
Характерным является появление мегабластов в костном мозге и мегалоцитов в крови, которые могут
исчезать при назначении витамина В12 (внешнего фактора).
При хроническом атрофическом гастрите наблюдается инфильтрация слизистой оболочки желудка
лимфоцитами, плазмацитами и гранулоцитами. Происходит некроз эпителиальных клеток, а главные и
париетальные клетки замещаются слизеобразующими клетками. В заключительной стадии через много лет
развивается атрофия.
Хронический атрофический гастрит ведет к ограниченной продукции пепсина, соляной кислоты и
внутреннего фактора. В качестве ответной реакции происходит пролиферация G-клеток, и они секретируют
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
8
_________________________________________________________________________________________________
повышенное количество гастрина. Через несколько лет часто развивается пернициозная анемия
вследствие хронического атрофического гастрита (запасы витамина В12).
Аутоантитела к париетальным клеткам можно обнаружить у пациентов с хроническим атрофическим
гастритом и пернициозной анемией, но также у пациентов с эндокринными заболеваниями и у здоровых
людей. Они преимущественно относятся к IgG и IgA. Хотя диагностическая чувствительность при
пернициозной анемии очень высока, 80 –90 %, специфичность их при пернициозной анемии ограничена
вследствие большого количества ассоциированных болезненных состояний. Частота встречаемости при
хроническом атрофическом гастрите достигает 100 %. Это заболевание можно выявить при эндоскопии у
всех пациентов с антителами к париетальным клеткам.
Существует два типа аутоантител к внутреннему фактору. Тип 1 антител реагируют с местами связывания
внутреннего фактора с витамином В12, тогда как тип 2 антител связывается с комплексом витамина В12 и
внутреннего фактора, который, однако, как правило, наблюдаются с типом 1 антител и по этой причине
имеют малое диагностическое значение. Данный тест выявляет преимущественно антитела типа 1.
Хотя частота встречаемости антител к париетальным клеткам снижается в течение болезни, у многих
пациентов образуются антитела к внутреннему фактору, только гораздо позже. Аутоантитела к внутреннему
фактору могут быть уже выявлены в некоторых случаях хронического атрофического гастрита (фундальный
тип), даже без клинических указаний на сопутствующую пернициозную анемию. Возможность, что у такого
пациента позже разовьется пернициозная анемия очень высока. Раньше антитела к внутреннему фактору
выявлялись чаще, так как для лечения использовали экстракт слизистой оболочки желудка свиньи до
введения препаратов витамина В12.
Заболевание
Пернициозная анемия в момент постановки диагноза
Пернициозная анемия после постановки диагноза
Родственники пациентов с пернициозной анемией
Хронический атрофический гастрит (донный тип)
Панкреатит
Карцинома поджелудочной железы
Тироидит Хашимото
Базедова болезнь
Сахарный диабет 1 типа
Сахарный диабет 11А типа
Сахарный диабет 11В типа
Аутоимунная болезнь Аддисона
Идиопатический первичный гипопаратиреоз
Витилиго
Здоровые люди
Антитела к париетальным клеткам, %
90
50 - 70
30 - 40
20 – 35
6
13
29
36
20
22
13
41
20
20
9
Аутоантитела к митохондриям (АМА)
Антитела к митохондриям (АМА) обнаруживают при различных заболеваниях, часто одновременно с
другими аутоантителами (например, ядерными точками). Диагностическое значение при подозрении на
аутоиммунные заболевания имеют девять типов АМА (М1 - М9). Определение этих антител имеет
особенную значимость при диагностике первичного билиарного цирроза печени, но их встречаемость может
также приближаться к 100 % при других заболеваниях (см. таблицу).
Антитела против
М1
М2
М3
М4
М5
М6
М7
М8
М9
Статус заболевания
сифилис (указание активности)
системная красная волчанка
прогрессирующий
системный
склероз,
синдром
Шегрена, синдром Шарпа, ревматоидный артрит
первичный билиарный цирроз печени (высокий титр)
другие хронические заболевания печени
прогрессирующий системный склероз
синдром псевдоволчанки
первичный билиарный цирроз печени
неспецифические коллагенозы
гепатит (индуцированный иприоназидом)
острый миокардит
кардиомиопатии
первичный билиарный цирроз печени
первичный билиарный цирроз печени
другие формы гепатита
Распространение
100%
50%
5-15%
до 96%
30%
7-25%
100%
до 55%
редко
100%
60%
30%
до 55%
37 – 82%
3 - 10%
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
9
_________________________________________________________________________________________________
Внимание: При отсутствии АМА, но при сохраняющимся подозрении на первичный билиарный цирроз
печени, рекомендуется проведение дополнительного теста для определения антител к ядерным точкам (SP
100), так как их патогноманичная значимость также установлена. При непрямой иммунофлуоресценции эти
антитела наиболее достоверно определяются при использовании комбинированного субстрата НЕр-2
клеток и печени приматов.
Антинуклеарные антитела
Определения антинуклеарных антител имеет диагностическую значимость при многих аутоиммунных
заболеваниях. Эти антитела характерны для разных заболеваний, особенно имеющих ревматоидную
форму.
Аутоиммунное заболевание
Частота встречаемости ANA, %
Системная красная волчанка
активная
95-100
неактивная
80-100
Лекарственная красная волчанка
100
Смешанные заболевания соединительной ткани (синдром Шарпа)
100
Ревматоидный артрит
20-40
Другие ревматоидные заболевания
20-50
Прогрессирующий системный склероз
85-95
Полимиозит и дерматомиозит
30-50
Синдром Шегрена
70-80
Хронический активный гепатит
30-40
Язвенный колит
26
При системной красной волчанке определение антител против двуспиральной ДНК считается одним из
наиболее важных критериев диагностики. Иммунные комплексы двуспиральной ДНК и соответствующих
аутоантител вызывают повреждение тканей в подкожном слое, почек и других органах. Титр антител
коррелирует с активностью заболевания. Антитела против Sm также рассматриваются как патогмоничные
для системной красной волчанки. При этом заболевании могут быть выявлены дополнительные антитела
против других полинуклеотидов, рибонуклеотидов, гистонов и других клеточных антигенов. При
лекарственной красной волчанке постоянно присутствуют антитела против гистонов.
Аутоантитела при системной красной волчанке
Антиген
Частота встречаемости, %
Двуспиральная ДНК
60-90
Односпиральная ДНК
70-95
РНК
50
Гистоны
95
U1-nRNP
30-40
Sm
20-40
SS-A (Ro)
20-60
SS-B (La)
10-20
Циклин (PCNA)
3
Ku
10
RNP: рибосомальный белок Р
10
(Hsp-90: белок теплового шока, 90 кДа
50)
(Кардиолипин
40-60)
Высокий титр аутоантител против U1-nRNP характерен для смешанного заболевания соединительной ткани
(синдрома Шарпа). Титр антител коррелирует с активностью заболевания.
Аутоантитела при смешанном заболевании соединительной ткани (синдроме Шарпа)
Антиген
Частота встречаемости, %
U1-nRNP
95-100
Односпиральная ДНК
20-50
При ревматоидном артрите в половине случаев наблюдаются антитела против гистонов, тогда как
антитела против U1-nRNP обнаруживаются реже. Антитела против ядерного антигена, ассоциированного с
ревматоидным артритом (RANA) нельзя выявить без использования клеточной линии НЕр-2.
Аутоантитела при ревматоидном артрите
Антиген
Частота встречаемости, %
Гистоны
15-50
U1-nRNP
95-100
Односпиральная ДНК
20-50
(Ядерный антиген при ревматоидном артрите (RANA)
90-95)
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
10
_________________________________________________________________________________________________
Прогрессирующий системный склероз (склеродерма) может проявляться в двух формах, которые не
всегда легко дифференцировать. До сих пор антитела против фибрилларина, РНК-полимеразы 1 и Scl-70
были отмечены только при диффузной форме. Аутоантитела против центромеров ассоциированы с
локализованной формой прогрессирующего системного склероза.
Аутоантитела при прогрессирующем системном склерозе (диффузная форма)
Антиген
Частота встречаемости, %
Фибрилларин
5-10
РМ-Scl (РМ-1), включая перекрестные синдромы
50-70
Scl-70
25-75
РНК-полимеразы 1
4
7-2-РНК (То)
Редко
NOR –90
Редко
Аутоантитела при прогрессирующем системном склерозе (ограниченная форма)
Антиген
Частота встречаемости, %
Центромеры
80-95
Аутоантитела против РМ-Scl наблюдаются при полиомиозите и дерматомиозите, но при этих
заболеваниях также выявлены антитела против других ядерных антигенов (Mi-1, Mi-2, Ku) и антитела
против Jo-1.
Аутоантитела при полимиозите и дерматомиозите
Антиген
Частота встречаемости, %
РМ-Scl (РМ-1), включая перекрестные синдромы
50-70
Jo-1 (гистидил-tРНК синтетаза)
25-35
Mi-1
10
Mi-2
5
Ku
50
Односпиральная ДНК
40-50
PL-7 (треонил- tРНК синтетаза)
4
PL-12 (аланил - tРНК синтетаза)
3
При первичном синдроме Шегрена присутствуют антитела против SS-A и SS-B, преимущественно в
сочетании. Кроме того, аутоантитела против секреторных протоков слюнных желез обнаруживаются в 40 –
50 % всех случаев.
Аутоантитела при первичном синдроме Шегрена
Антиген
Частота встречаемости, %
SS-A (Ro)
40-95
SS-B (La)
40-95
Односпиральная ДНК
13
(RANA
70)
(Секреторные протоки слюнных желез
40-60)
(Ревматоидные факторы
60-80)
Аутоантитела против ядерных антигенов возникают при многих других заболеваниях, таких как первичный
билиарный цирроз и хронический активный аутоиммунный гепатит. Иногда антитела против ядерных
антигенов определяются у видимо здоровых людей, обычно в низких титрах (различные классы
иммуноглобулинов, преимущество IgM).
Антиген
Антинуклеарные антитела: основные заболевания
Заболевание
Частота
встречаемости, %
Двуспиральная ДНК
Системная красная волчанка
60-90
Односпиральная ДНК Системная красная волчанка
70-95
Лекарственная системная волчанка
60
Смешенное заболевание соединительной ткани
20-50
Полимиозит/дерматомиозит
40-50
Склеродерма, синдром Шегрена, ревматоидный артрит
8-14
РНК
Системная красная волчанка
50
Склеродерма, синдром Шегрена
65
Гистоны
Лекарственная системная волчанка
95
Системная красная волчанка
30-70
Ревматоидный артрит
15-50
U1-nRNP
Смешенное заболевание соединительной ткани
95-100
Системная красная волчанка
30-70
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
11
_________________________________________________________________________________________________
Sm
SS-A (Ro)
SS-B (La)
Фибрилларин
РНК полимераза 1
РМ-Scl (РМ-1)
Центромеры
Scl-70
Циклин (РCNA)
Ku
Mi-1, Mi-2
Ревматоидный артрит
Системная красная волчанка
Синдром Шегрена
Системная красная волчанка
Неонатальная красная волчанка
Синдром Шегрена
Системная красная волчанка
Прогрессирующий системный склероз, диффузная форма
Прогрессирующий системный склероз, диффузная форма
Полимиозит/дерматомиозит/синдром перекрытия
Прогрессирующий системный склероз, диффузная форма
Прогрессирующий системный склероз, локализованная форма
Прогрессирующий системный склероз, диффузная форма
Системная красная волчанка
Системная красная волчанка
Поли/дерматомиозит, прогрессирующий системный склероз
Дерматомиозит
3
20-40
40-95
20-60
100
40-95
10-20
5-10
4
50-70
5-10
80-95
25-75
3
10
30-55
5-10
Антитела против компонентов цитоплазмы НЕр-2 клеток не всегда могут быть четко дифференцированы.
Только некоторые антитела, направленные против структур цитоплазмы могут быть связаны с
определенным заболеванием, например, антитела против митохондрий связаны с первичным билиарным
циррозом печени, а против белков PL-7 и PL-12 – с полимиозитом и дерматомиозитом. В последствие при
полимиозите были обнаружены редкие антитела, направленные против OJ, EJ и сигнал-распознающих
частиц (SPR). Другие цитоплазматические антитела – против рибосом, аппарата Гольджи, лизосом и
составляющих цитосклета, таких как актин, виментин, цитокератин, имеют незначительную клиническую
значимость. Диагностическая ценность митоз ассоциированные антигены еще полностью не определена.
Аутоантитела к тканям гладкой мускулатуры (ASMA)
Аутоантитела к тканям гладкой мускулатуры появляются при различных заболеваниях печени
(аутоиммунном гепатите, циррозе печени). Их определение имеет особое значение при диагностике
аутоиммунного (волчаночного) хронического активного гепатита. ASMA также обнаруживают при
инфекционном мононуклеозе и других вирусных инфекциях, при системной красной волчанке, карциноме
молочной железы и яичников, а также при злокачественных меланомах, но при данных заболеваниях они
не имеют никакой диагностической значимости. При вирусных гепатитах титр антител, как правило, быстро
снижается.
Высокие концентрации антител к гладкой мускулатуре являются указанием на аутоиммунный гепатит (АИГ),
с частой встречаемости 70 %. Титр IgG и IgM антител может коррелировать с активностью заболевания.
АИГ наблюдается преимущественно у женщин, и в половине случаев заболевание развивается до 30 лет. У
40 % пациентов заболевание начинается с острого гепатита. При биопсии печени выявляют некроз
паренхиматозных клеток с лимфоцитарно-плазмацитарной инфильтрацией.
В зависимости от выявляемых аутоантител и вирусов аутоиммунный гепатит можно разделить на
различные этиологические подгруппы. В случае АИГ, аутоантитела к ядрам клеток, двуспиральной ДНК и
цитоплазме гранулоцитов (pANCA) часто выявляют наряду с антителами к гладкой мускулатуре.
Низкие титры ASMA также выявляют у пациентов с первичным билиарным циррозом (50 %), алкогольным
циррозом, при обструкции желчных протоков и у приблизительно 2 % клинически здоровых людей.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
euroimmun_FA1360-1 _FA1362-1.doc
9/1/2009 3:53:00 PM
Оригинал: FA_1360_A_UK_C03.doc
Stand:25.09.04 15:13
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
12
_________________________________________________________________________________________________
Техника TITERPLANE
___________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2007
FA 1362-####-6
FA 1362-####-1
FA 1360-####-9
FA 1360-####-8
EUROPLUS: Желудок
(Мыши) / Внутренний
фактор
EUROPLUS: Желудок
(Обезьяна) / Внутренний
фактор
Желудок, мыши
Желудок, обезьяна
Печень, крыса
Желудок, обезьяна
HEp-2 клетки
Желудок, обезьяна
Mosaic Желудок
(Обезьяна) / Печень
(Обезьяна) /Почки (Крыса)
FA 1360-####-2
HEp-2 / Печень(Обезьяна) /
Желудок (Обезьяна) /
Почки (Крыса)
Желудок(Обезьяна) /
Печень (Обезьяна) /
Почки (Крыса) / Печень
(Крыса)
Печень (Крыса) / HEp-2 /
Желудок (Обезьяна) /
Почки (Крыса)
Желудок, обезьяна
Mosaic: Желудок
(Обезьяна) / Почки (Крыса)
FA 1360-####-1
FA 1360-####-3
1
Описание
No. по каталогу
по 5 реакционных зон)
Внутренний фактор
BIOCHIPs
Внутренний фактор
BIOCHIPs
HEp-2 клетки
Печень, обезьяна
Печень, обезьяна
Печень, обезьяна
Почки, крыса
2
Желудок, обезьяна
Почки, крыса
Желудок, обезьяна
Почки, крыса
3
Почки, крыса
Печень, крыса
Почки, крыса
4
Эта инструкция предназначена для использования с перечисленными ниже наборами (#### обозначает формат, например, 1005 = 10 слайдов
5x5
5x5
5x5
5x5
5x5
5x5
5x5
Field (mm)
Mosaic IIFT, EUROIMMUN
13
_________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru