Том - Cell Motility Lab
advertisement
1989 ЦИТОЛОГИЯ Том XXXI, № 2 ВЛИЯНИЕ ВЫСОКОГО ГИДРОСТАТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦЕНТР И МИКРОТРУБОЧКИ В КЛЕТКАХ КУЛЬТУРЫ ТКАНИ И. А. Воробьев, В. А. Драчев Межфакулътетская проблемная научно-исследовательская, лаборатория молекулярной биологии и биоорганической химии, Московский университет При гидростатическом давлении 700—1200 атм происходит значительное, а при давлении 2000 атм полное разрушение микротрубочек в митотических и интерфазных клетках СПЭВ. После снятия давления в 1000 атм через 5 мин наблюдается полное отсутствие микротрубочек, которые начинают восстанавливаться только через 20 мин после сброса давления. Рост микротрубочек начинается диффузно по всей цитоплазме; микротрубочки, прикрепленные к перицентриолярным сателлитам, появляются спустя 45 мин после сброса давления. Динамика разборки микротрубочек под давлением и восстановления их после снятия давления свидетельствует о полной инактивации в этих условиях клеточного центра. Микротрубочки представляют собой относительно лабильную часть цитоскелета. Они могут обратимо деполимеризоваться при различных воздействиях: понижении температуры до 0—4 °С, добавлении колхицина или его аналогов (колцемида, нокодазола), при повышении концентрации ионов кальция (см. обзоры: Гельфанд, Розенблат, 1976; Dustin, 1984). На ряде живых объектов было показано, что микротрубочки обратимо разрушаются при действии повышенного гидростатического давления, примерно 400—700 атм (Moore, 1972; Rytting, Chatterju, 1974; Salmon, 1975a, 1975b). В то же время оказалось, что микротрубочки головного мозга млекопитающих выдерживают давление до 650 атм безо всяких признаков деполимеризации как in situ, так и в выделенном виде (O'Gonnor et al., 1974). Более детальные исследования показали (Engelborghs et al., 1976), что повышение давления снижает константы скорости полимеризации микротрубочек, но влияние его при температуре 35 °С невелико (изменения констант были прослежены до давления 1000 атм), в то время как при температурах около 15 °С — весьма значительно. Поэтому вопрос о том, какое гидростатическое давление достаточно для деполимеризации микротрубочек в клетках млекопитающих, остается открытым. Следует также отметить, что в литературе приводится ряд данных о деполимеризации под действием высокого гидростатического давления веретена деления (Pease, 1941, 1946; Marsland, 1951; Salmon, 1975a, 1975b), а также микротрубочек аксонем и аксостилей (Tilney et al., 1966; Marland et al., 1971; Moore, 1972). Однако практически отсутствуют данные о реакции на давление цитоплазмати-ческих микротрубочек. Исходя из этого в настоящем исследовании мы поставили задачу установить, при каком давлении деполимеризуются цитоплазматические микротрубочки в клетках культуры ткани, и проследить за процессом их восстановления после 170 снятия высокого гидростатического давления. При разборке микротрубочек, происходящей при действии на клетки холода и колцемида, наблюдается определенная реакция клеточного центра, выражающаяся в появлении в нем дополнительных центров нуклеации микротрубочек (Воробьев, Ченцов, 1982, 1985). Поэтому в настоящей работе мы хотели также проверить, будет ли наблюдаться подобная реакция клеточного центра в ответ на повышенное гидростатическое давление. Материал и методика В качестве объекта использовали клетки перевивной культуры С11ЭВ, ультраструктура клеточного центра которых была детально исследована ранее (Воробьев, Ченцов, 1982а, 19826, 1985). Для экспериментов клетки выращивали на покровных стеклах 9X18 мм. Через 48 ч после посева клетки на стеклах переносили в специальную камеру объемом около 4 мл (рис. 1), заполненную культуральной средой. Поскольку в настоящей работе использовалось давление до 2000 атм, то передающая давление диафрагма должна была компенсировать уменьшение объема культураль-ной среды (примерно на 10 %) и обеспечить надежную изоляцию ее от среды, передающей давление, в течение 1 сут. По этим причинам описанная ранее ячейка (Черняк и др., 1984) была нами модифицирована. Модифицированную камеру изготавливали из части медицинского шприца, где передающей давление диафрагмой служил поршень этого же шприца. Возможные потери давления, возникающие в силу упругости уплотняющих колец поршня, составили не более 10 атм. Внутри камеры находилась ячейка с 20%-ным раствором глутароного альдегида (Merck), доведенного до рН 7.0. Объем ячейки составлял 0.35 мл. Во время эксперимента камера находилась при температуре 37 °С. Клетки фиксировали, не открывая камеру, путем переворачивания ячейки с глутаровым альдегидом с помощью магнитного поля, как было описано ранее (Черняк и др., 1984). Примерно через 5 мин после Рис. 1. Камера для инкубации фиксации клеток камеру открывали, стекла с клетками клеток под давлением. извлекали и готовили препараты для электронной микроскопии 1 — внешняя стенка, 2 — пор- • по стандартной методике. Серийные срезы изготавливали на шснь шприца, 3 — уплотникольцо, 4 — ячейка с ультрамикротоме LKB-III, монтировали на покрытые тельное глутаровым альдегидом, S — формваровой подложкой бленды, окрашивали цитратом свинца покровное стекло с клетками. по Рейнольдсу, просматривали и фотографировали на элекронных микроскопах HU-11 и HU-12 («Хитачи», Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ. Результаты Используя даже серийные ультратонкие срезы, трудно проследить за поведением системы микротрубочек по всей клетке, в особенности доказать полное отсутствие микротрубочек. Поэтому наш анализ ограничивался главным образом околоядерной областью цитоплазмы. Наиболее подробно на полных сериях срезов был исследован клеточный центр. Для каждого описываемого момента времени (при действии повышенного давления и после снятия его) были изучены серийные срезы не менее чем 10 клеток. В качестве контроля мы рассматривали клетки, зафиксированные после 14часового пребывания в камере при атмосферном давлении. Ультраструктура этих клеток мало отличается от стандартной. Микротрубочки в клеточном центре присутствуют, и характер расположения их соответствует описанному ранее (рис. 2; см. вкл. IV; ср.: Воробьев, Ченцов, 1982а). В интерфазных клетках СПЭВ при действии гидростатического давления в 700—1200 атм цитоплазматические микротрубочки оставались до 2 ч инкубации. Единичные микротрубочки сходились в район клеточного центра и были прикреплены к перицентриолярным сателлитам (рис. 3). При увеличении времени пребывания клеток под давлением до 15 ч микротрубочки в районе клеточного центра (по-видимому, и во всей цитоплазме) отсутствовали полностью 171 в большинстве клеток. Никаких других изменений в строении клеточного центра в этих условиях не происходило: на одной из центриолей сохранялись перицентриолярные сателлиты, сохранялись также триплеты микротрубочек самих центриолей. Для исследования динамики восстановления микротрубочек после высокого давления клетки инкубировали под давлением 1000 атм при температуре 37 °С в течение 12—14 ч, затем сбрасывали давление в течение 90—120 с до атмосферного и фиксировали клетки через различные промежутки времени. Реакция клеток оказалась парадоксальной. Через 3 мин после начала снижения давления (т. е. примерно через 90 с после достижения атмосферного давления в камере) в клетках появлялись отдельные микротрубочки (рис. 4), а еще через 2 мин они полностью исчезали. Центриоли и клеточный центр в целом в этих условиях не менялись. Таким образом, через 5 мин после начала сброса давления в клетках отсутствовали не только цитоплазматические микротрубочки, но и микротрубочки митотического аппарата и даже наиболее устойчивые в клетках микротрубочки остаточного тельца (рис. 5). Восстановление системы микротрубочек начиналось примерно через 20 мин после начала сброса давления. При этом восстанавливался нормальный вид остаточных телец и появлялись отдельные микротрубочки в цитоплазме (рис. 6; см. вкл. V). Вновь образованные микротрубочки были прямыми или слабо изогнутыми (по крайней мере на том протяжении, на котором их можно наблюдать на ультратонких срезах) и располагались в цитоплазме клеток совершенно хаотично. В это время микротрубочки не имели никаких контактов с клеточным центром (рис. 7), более того, вблизи центриолей они встречались реже, чем в других участках цитоплазмы. Через 30 мин после начала сброса давления вблизи центриолей появлялись первые микротрубочки (рис. 8). По-прежнему они не подходили ни к перицентриолярным сателлитам, ни к поверхности центриолей. Микротрубочки, радиально расходящиеся от перицентриолярных сателлитов, обнаруживались только через 45 мин после сброса давления (рис. 9; см. вкл. V). В отличие от контрольных клеток вокруг центриолей в это время отсутствовали короткие хаотично расположенные микротрубочки, а имелись только сравнительно длинные прямые микротрубочки, прикрепленные только к головкам сателлитов. Нормальная картина расположения микротрубочек в клеточном центре восстаналивалась только через 2 ч после снятия давления. Поскольку деполимеризация микротрубочек под действием давления около 1000 атм занимает много часов и даже спустя 15—16 ч в некоторых клетках остаются отдельные микротрубочки, то мы пробовали добиться более быстрой деполимеризации микротрубочек, повысив давление в камере до 2000 атм. При таком давлении для полного разрушения всех цитоплазматических микротрубочек оказалась достаточной 2-часовая инкубация клеток. При этом полностью отсутствовали микротрубочки как в цитоплазме клеток, так и прикрепленные к перицентриолярным сателлитам. В большинстве клеток на активной центриоли при этом давлении обнаруживается первичная абортивная ресничка. Ресничка может достигать длины 2—3 мкм и часто выходит на поверхность клетки (рис. 10—12). В отличие от нормальной первичной реснички абортивная ресничка в клетках, находящихся под давлением, полностью лишена аксонемы и представляет собой просто мембранный вырост, начинающийся от дистального конца активной центриоли. Следует еще раз подчернуть, что во всех описанных выше опытах ультраструктура клеточного центра не изменялась (за исключением входящих в него микротрубочек). Полностью сохранялись триплеты микротрубочек центриолей; на активной центриоли оставались и перицентриолярные сателлиты, и придатки; сами центриоли не расходились. 172 Обсуждение Условия, необходимые для разрушения микротрубочек в живых клетках СПЭВ, оказались значительно жестче тех, которые приводились в литературе для делящихся клеток HeLa (Salmon et al., 1976). К сожалению, в работе О'Коннора с соавторами (О'Connor et al., 1974), где исследовалась чувствительность к давлению микротрубочек в клетках головного мозга, было показано лишь, что эти микротрубочки выдерживают давление примерно в 700 атм (10 000 p. s. i.) в течение 45 мин, но не было выяснено, при каком же давлении они деполимери-зуются. Наша установка позволила получить почти в 3 раза более высокое .давление, и мы наблюдали полную деполимеризацию микротрубочек в этих условиях (2000 атм, 2 ч), в то время как под давлением в 700 атм микротрубочки сохранялись в большей части клеток СПЭВ более 2 ч. Поэтому мы полагаем, что деполимеризация микротрубочек происходит непосредственно под действием высокого гидростатического давления, однако устойчивость микротрубочек у морских и пресноводных организмов, живущих при температурах не выше 20 °С, значительно ниже, чем в клетках млекопитающих, на что указывают эксперименты in vitro (Engelborghs et al., 1976). Кроме того, следует отметить и тот факт, что концентрация такого общеупотребительного антитубулинового агента, как колхицин, необходимая для деполимеризации микротрубочек в клетках разных видов млекопитающих, может отличаться в несколько раз (Креншоу, Марелл, 1985). Таким образом, сама по себе различная устойчивость к гидростатическому давлению микротрубочек у разных организмов вполне вероятна. В настоящей работе мы не ставили целью проследить подробно за динамикой разрушения микротрубочек. На основании полученных результатов можно лишь констатировать, что при давлениях 700—1000 атм часть микротрубочек сохраняется в течение 2 ч. Однако если под действием колцемида сохранялись избирательно только микротрубочки, прикрепленные к перицентриолярным сателлитам (Воробьев, Ченцов, 1985), то под действием высокого давления такой избирательности не было: число микротрубочек, сходящихся к центриолям. значительно уменьшалось, но также наблюдались и сохранившиеся микротрубочки в цитоплазме, вдали от клеточного центра. При более длительной инкубации под давлением в 1000 атм в отличие от того, что наблюдается при действии на клетки колцемида в умеренных концентрациях, происходила полная разборка микротрубочек в клеточном центре. Деполимеризация микротрубочек под действием холода (0—2 °С), описанная для клеток СПЭВ ранее (Воробьев, Ченцов, 19826), также отличается от того, что мы наблюдали в настоящей работе: при низкой температуре очень быстро и полностью деполимеризуются все микротрубочки, связанные с перицентриолярными сателлитами, и при этом остаются одиночные микротрубочки в цитоплазме (аналогичная картина на светооптическом уровне была описана с использованием антител к тубулину и для других клеток — Bershadsky et al., 1979). Таким образом, динамика деполимеризации микротрубочек под действием каждого из вышеперечисленных факторов (колцемида, холода и высокого давления) оказывается различной, что свидетельствует в пользу различных механизмов действия на клеточном уровне трех указанных агентов. Процесс восстановления микротрубочек после снятия высокого гидростатического давления принципиально отличается от того, что происходит после охлаждения или после отмывки колцемида. Характерной особенностью двух последних случаев является звездообразный рост микротрубочек от клеточного центра (Frankel, 1976; Osborn, Weber, 1976; см. обзор: Vorobjev, Nadezhdina, 1987). В настоящей работе мы, наоборот, наблюдали поначалу диффузный рост микротрубочек по всей цитоплазме. До некоторой степени эта картина напоминает процесс восстановления микротрубочек после отмывки нокодазола в усло- виях дефицита АТФ, описанный де Брабандером с соавторами (DeBrabander et al., 1982). К сожалению, эта работа была выполнена в основном на светооптическом уровне с использованием антител к тубулину, и потому прямое сопоставление ее с нашими данными затруднительно. Сходство процессов восстановления при снижении уровня АТФ и после снятия высокого гидростатического давления состоит в том, что в обоих случаях происходит неупорядоченный рост значительного числа прямых микротрубочек длиной порядка 1 мкм. Основное же различие между этими двумя экспериментами касается полимеризации микротрубочек в районе клеточного центра: после отмывки нокодазола рост микротрубочек начинается преимущественно в районе клеточного центра и в меньшей степени — по всей цитоплазме (DeBrabander et al., 1982). После снятия высокого давления, наоборот, рост микротрубочек сначала идет повсеместно в цитоплазме, затем они появляются вблизи центриолей, и только в последнюю очередь возникают микротрубочки, прикрепленные к головкам перицентриолярных сателлитов. Возможно, что эти микротрубочки, которые мы видели через 45 мин после сброса давления, не выросли от самих сателлитов, а вторично прикрепились к ним. Таким образом, под действием высокого гидростатического давления клеточный центр как центр организации микротрубочек полностью инактивируется. Инактивация его не сопровождается никакими ультраструктурными перестройками, в противоположность активации, наблюдавшейся под воздействием холода или колцемида (Воробьев, Ченцов, 19826, 1985). Нормальные взаимоотношения микротрубочек с клеточным центром восстанавливаются только через 45 мин после снятия давления. Литература (Бершадский А. Д . , Гелъфапд В. И . , Свшпкина Т. М., Тинт И. С.) Berskadsky A. D., Gelfand V. I . , S v i t k i n a Т. М., Tint I. S. Cold-stable microtubules in the cytoplasm of mouse embryo i'ibroblasts // Cell Biol. Int. Rep. 1979. Vol. 3. P. 45—50. — (Воробьев И. А., Надеждина Е. С . ) Vorobjev I. A., Nadezhdina E. S. The centrosome and its role in the organization of microtubules// Int. Rev. Cytol. 1987. Vol. 106. P. 227—293. — (Воробьев И. А., Ченцов Ю. С.) Vorobjev I. A., Chentsov Yu. S. Centrioles in the cell cycle. I. Epithelial cells // .1. Cell Biol. 1982a. Vol. 98. P. 938—949. — Воробьев И. А., Ченцов Ю. С. Динамика восстановления микротрубочек вокруг клеточного центра в культивируемых клетках после их охлаждения // Цитология. 19826. Т. 24, № 11. С. 1286—1289. —Воробьев И. А., Ченцов Ю. С. Цснтриоли и микротрубочки в интерфазных клетках при воздействии колцемида. Эффект, зависимый от концентрации и времени действия яда // Цитология. 1985. Т. 27, № 10. С. 1101 — 1105. — Гельфанд В. И . , Розенблат В. А. Микротрубочки. Их структура, химия и функциональная роль // Итоги науки и техники. Сер. «Биологическая химия». Т. 11. М.: ВИНИТИ, 1977. С. 78—143. — Креншоу Э., Маррелл Л. Энуклеация клеток человека, образующих монослой, после обработки колцемидом и слияния микрокариопластов с целыми клетками при помощи полиэтиленгликоля // Методы генетики соматических клеток. М.: Мир, 1985. Т. 2. С. 342— 362. — (Черняк В. Я . , Драчев В. А., Николаева Н. Г . , Черняк Б. В . ) Chernyak V. Ya., Dra-chev V. A., Nikolaeva N. G., Chernyak B. V. High-pressure enzyme kinetics // FEBS Lett. 1984. Vol. 169. P. 97 — 100. —DeBrabander M., Geuens G., Nuydens R., WMebrords R., DeMey J. Microtubule stability and assembly in living cells: the influence of metabolic inhibitors, taxol and pH //' Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1982. Vol. 46. P. 227—240. — Dustin P. Microtubules. Amsterdam: Elsevier, 1984. 482 p. — Engelborghs J . , Ueremans К. А. Н., DeMayer L. C. M., Hoebeke J. Effects of temperature and pressure on polymerization equilibrium of neuronal microtubules // Nature. 1976. Vol. 259. P. 686—689. — Frankel F. R. Organization and energydependent growth of microtubules in cells // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1976. Vol. 73. P. 2798— 2802. — Marsland D. The action of hydrostatic pressure on cell division // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1951. Vol. 51. P. 1327—1335. — MarslandD., Tilney L. G., Hirshfield M. Stabilizing effects of D2O on the microtubular components and needle-like form of heliozoan axopods: a pressuretemperature analysis // J. Cell. Physiol. 1971. Vol. 77. P. 187—193. — Moore K. C. Pressureinduced regression of oral apparatus microtubules in synchronized Tetra-hymena // J. Ultrastruct. Res. 1972. Vol. 41. P. 499—517. — O'Connor F. M., Houston L. L., Samson F. Stability of neuronal microtubules to high pressure in vivo and in vitro // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1974. Vol. 73. P. 867—871. — Pease D. C. Hydrostatic pressure effects upon the spindle figure and chromosome movement // Biol. Bull. 1946. Vol. 91. P. 145—169. — R y t t i n g J. П., Chatter-ju D. C. Effects of temperature and pressure on the morphology of plate174 lets and their microtubules // J. Cell Biol. 1974. Vol. 63, No 2, pt 2. P. 294a. — Salmon E. D. Pressure-induced depolymerization of spindle microtubules. I. Changes in birefringens and spindle length // J. Cell Biol. 1975a. Vol. 65. P. 605—614. — Salmon E. D. Pressure-induced •depolymerization of spindle microtubules. II. Thermodynamics of in vivo assembly // J. Cell Biol. 1975b. Vol. 66. P. 114—127. — Salmon E. D., Goode D., Maugel T. K., Bonar D. B. Pressureinduced depolymerization of spindle microtubules. III. Differential stability in HeLa cells // J. Cell Biol. 1976. Vol. 69. P. 443—454. — Tilney L. G., Hiramoto Y., Marsland D. .Studies on the microtubules in Heliozoa. III. A pressure analysis of the role of these structures in the formation and maintenance of the axopodia of Actinosphaerium nucleofilum (Barrett) // J. Cell Biol. 1966. Vol. 29. P. 77—95. Поступила 15 VII 1987 THE EFFECT OF HIGH HYDROSTATIC PRESSURE ON THE CELL CENTER AND MICROTUBULES IN TISSUE CULTURE CELLS /. A. Vorobjev, V. A. Drachev Interfaculty Problem Research Laboratory of Molecular Biology and Bioorganic^ Chemistry, Moscow University A network of cytoplasmic microtubules in PE cells disassembles at 37 °C under 1000 atm pr. in 12 to 14 hours; under 2000 atm pr., the disassembly time is not more than 2 hours. The recon.stitution process sets in 20 minutes after pressure dropping to proceed diffusely throughout the cytoplasm. Microtubules attached to the cell center reappear in 45 minutes. The dynamics of inicrotubular disassembly and reconstitution indicates a complete inactivation of the cell center as a microtubule-organizing center. К ст. И. А. Воробьева, В. А. Драчева (с. 170 Рис. 2—5. Ультраструктура клеток при действии высокого давления и после его снятия 2 — контроль; 3 —через 2 ч при давлении 1000 атм; 4 —через 3 мин восстановления после действн давления 1000 атм в течение 14 ч; 5 —через 5 мин восстановления после такого же воздействия- виш остаточное тельце, в котором нет микротрубочек. Стрелками указаны перицентриолярные сателлиты двойными стрелками указаны микротрубочки. ВКЛЕЙКА V К ст. И. А. Воробьева, В. А. Драчева (с. 189) Рис. 6—8. Ультраструктура клеток в период восстановления после воздействия давления 1000 атм в течение 14 ч. 6 — 20 мин восстановления, видны микротрубочки в цитоплазме; 7 — 20 мин восстановления, микротрубочек в клеточном центре нет; s — 30 мин восстановления, единичные микротрубочки появляются вблизи центриотей. Остальные обозначения те же, что и на рис 2—5. К. ст. И. А. Воробьева, В. А. Драчева (с. 170) Рис. 9—12. Ультраструктура клетки при действии высокого давления и после его снятия. 9 — 45 мин восстановления после воздействия давления 1000 атм в течение 14 ч- 10—12 — 2000 атм 2ч: серийные срезы (1-й, 5-й, 7-й) через абортивную ресничку; микротрубочки в аксопеме и в цитоплазме отсутствуют. Стрелками указаны перицентриолярные сателлиты.
