Химическая коммуникация у бактерий
advertisement
Химическая коммуникация у бактерий (Quorum Sensing регуляция) И.А. Хмель, ИМГ РАН В последние годы внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами в различных областях биологии и медицины, было обращено на явление, получившее название Quorum Sensing (QS). Quorum Sensing (QS) – это особый тип регуляции экспрессии генов бактерий, зависящей от плотности их популяции. QS системы включают низкомолекулярные сигнальные молекулы, названные аутоиндукторами, легко диффундирующие через клеточную стенку, и регуляторные белки, с которыми связываются аутоиндукторы (AI). По мере того, как популяция бактерий увеличивается и достигает критического уровня, AI накапливаются до необходимого порогового значения и взаимодействуют с соответствующими регуляторными белками, что приводит к резкой активации (индукции) экспрессии определенных генов у бактерий. С помощью AI осуществляется коммуникация бактерий - межклеточная передача информации между особями бактерий, принадлежащих к одному и тому же и разным видам, родам и даже семействам; поэтому сигнальные молекулы считают «словами» в этом своеобразном «языке» бактерий. Благодаря QS регуляции бактерии получают возможность скоординированно контролировать экспрессию генов во всем сообществе. В подобном поведении бактерий проявляются черты сходства с многоклеточными организмами; бактерии используют преимущества «социального» поведения, которые не были доступны им как индивидуальным клеткам. Передача информации от клетки к клетке с использованием QS систем, которая приводит к индукции специализированных наборов генов, способствует быстрой адаптации популяций бактерий к меняющимся условиям среды и их выживанию в природных условиях. Впервые QS регуляция была обнаружена и описана в начале 70-х годов у светящейся морских бактерии Vibrio fischeri. У этой бактерии способность к биолюминесценции за счет синтеза люциферазы кодируется lux опероном (luxCDABE), и биолюминесценция происходит только при высокой плотности популяции бактерий (до 10¹¹ клеток/мл). V. fischeri живет в симбиозе с некоторыми морскими животными, в специализированном световом органе животного. В этой симбиотической ассоциации животное – хозяин обеспечивает бактерию богатой питательной средой, а бактерия хозяина – светом. Каждый эукариотический организм использует свет для своих 1 специфических целей. Например, улитка Euprymna scolopes, освещая себя с помощью V. fischeri, не отбрасывает тени при свете луны и звезд, что помогает ей спасаться от врагов. Рыба Monocentris japonicus использует свет для привлечения партнера [по 3]. Довольно долго считалось, что QS регуляция – это весьма редкий случай, однако, в последние годы выяснилось, что этот тип регуляции широко распространен у бактерий различных таксономических групп. В настоящее время QS регуляция обнаружена у более чем 50 видов бактерий. Большое разнообразие соединений используется бактериями в качестве аутоиндукторов QS систем; количество вновь обнаруженных AI увеличивается. При этом один вид бактерий может использовать и узнавать более чем один тип сигнальных молекул. В настоящее время показано, что регуляторные системы типа QS играют ключевую роль в большом количестве процессов бактериальной клетки. Они участвуют во взаимодействии многих бактерий с высшими организмами, животными и растениями, в регуляции вирулентности бактерий, формировании биопленок, регуляции экспрессии генов, связанных с синтезом различных экзоферментов, токсинов, антибиотиков и других вторичных метаболитов, конъюгации и др. Использование в последние годы методов транскриптомного и протеомного анализа показало, что QS системы функционируют как глобальные факторы регуляции. Исследование QS систем регуляции, их роли в метаболизме и взаимодействии бактерий определяет совершенно новый подход к изучению поведения бактерий в природных условиях; эти исследования могут иметь огромное прикладное значение. Особенно велика роль QS систем в регуляции процессов взаимодействия патогенных бактерий с эукариотическим организмом – хозяином. Инфекционный процесс происходит при достижении достаточно больших популяций патогенных бактерий; при этом увеличение концентрации сигнальных молекул в среде приводит к синхронному синтезу факторов вирулентности, способствующих разрушению тканей организма. Такая стратегия способствует успешному преодолению бактериями иммунного ответа организма – хозяина. Способность бактерий формировать биопленки является существенным фактором их патогенности. Биопленки – физические структуры с уникальными характеристиками, образуемые связанными с поверхностями микробными сообществами. Образование биопленок является одной из основных стратегий, повышающих выживание бактерий в окружающей среде, в том числе, в организме - хозяине. Способность бактерий существовать в составе биопленок создает большие трудности для медицинской 2 практики, так как при этом значительно повышается устойчивость бактерий к действию антибактериальных препаратов, а также к воздействию дезинфектантов, неблагоприятных факторов среды, таких как низкие или высокие уровни pH, высокая осмотическая сила и др., и действию иммунной защиты организма-хозяина. Образование бактериальных биопленок на имплантируемом оборудовании (например, катетерах, искусственных клапанах сердца, линзах и др.) является причиной ряда тяжелых, чрезвычайно трудно излечиваемых хронических заболеваний. Было показано, что QS регуляция играет важнейшую роль в формировании биопленок Тот факт, что QS может быть важным фактором регуляции вирулентности бактерий, обусловил новое направление исследований, связанное с использованием QS регуляции в качестве потенциальной мишени для борьбы с инфекционными заболеваниями. Предполагается, что подавление функционирования QS систем может обеспечить новые способы лечения, приводя к фактическому превращению патогенных бактерий в непатогенные без использования обычно применяемых антибиотиков и других лекарственных средств. В настоящее время этот подход рассматривается как новая перспективная стратегия антимикробной терапии. В большом количестве лабораторий проводится поиск и изучение веществ, подавляющих QS. Ниже будут рассмотрены известные QS системы у бактерий и перспективы создания лекарственных препаратов нового поколения, направленных непосредственно на подавление патогенности бактерий. Quorum Sensing системы у бактерий и молекулярные механизмы их действия QS системы грамотрицательных бактерий LuxI-LuxR типа. У грамотрицательных бактерий лучше всего изучены QS системы, функционирующие с участием аутоиндукторов N-ацил-гомосеринлактонов (AHL, или AI-1). AHL включают гомосеринлактонное кольцо и боковые ацильные группы. Описано более 40 AHL, отличающихся длиной ацильных цепей в молекуле. Специфичность действия AHL определяется количеством ацильных групп (от С4 до С16) и присутствием некоторых дополнительных группировок. AHL, содержащие короткие ацильные цепи, свободно диффундируют через клеточные мембраны; AHL с длинными ацильными цепями для выхода из клеток нуждаются в активном транспорте . 3 AHL взаимодействуют с регуляторными белками, гомологичными LuxR белку Vibrio fischeri, которые составляют семью LuxR – подобных белков. Молекулы этих белков содержат два домена , определяющие связывание белка с AHL и с ДНК. При присоединении AHL изменяется конфигурация LuxR-подобного белка, в результате чего он может связываться с ДНК и функционировать как активатор транскрипции. В биосинтезе AHL у нескольких изученных в этом отношении бактерий участвует S-аденозил метионин (SAM) (образование гомосеринлактонного кольца) и белок ACP, переносчик ацильных групп. QS системы, функционирующие с участием AHL, обнаружены у большого количества грамотрицательных бактерий, включающих роды Agrobacterium, Aeromonas, Burkholderia, Chromobacterium, Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Hafnia, Pantoea, Pseudomonas, Ralstonia, Rhodobacter, Rhizobium, Serratia, Vibrio, Yersinia и т. д. Среди них - бактерии, являющиеся патогенными и фитопатогенными. Наиболее подробно исследована QS регуляция lux оперона Vibrio fischeri. В ней участвуют два основных регуляторных компонента: 1) LuxI белок (синтаза аутоиндуктора) отвечает за продукцию N-(3-оксогексаноил)- гомосеринлактона (3OC12-HSL); 2) LuxR белок присоединяет аутоиндуктор, и затем комплекс LuxR3OC12-HSL, связываясь с промотором lux оперона, активирует его транскрипцию, что приводит к синтезу люциферазы и эмиссии света. Когда культура Vibrio fischeri растет, 3OC12-HSL накапливается до порогового уровня, который достаточен для активации LuxR, связывания его с промоторной областью lux оперона и индукции этого оперона. Т.к. ген синтазы аутоиндуктора LuxI входит в состав этого оперона, количество AI в этих условиях резко увеличивается, что приводит к дальнейшей индукции lux оперона и синтезу люциферазы. Из патогенных бактерий лучше всего изучены QS системы Pseudomonas aeruginosa. В клетках Pseudomonas aeruginosa, оппортунистического патогена человека, вызывающего тяжелые инфекции дыхательных путей, большое количество генов, включая гены, ответственные за синтез факторов вирулентности, активируются двумя QS системами LuxI-LuxR типа: LasI-LasR и RhlI-RhlR. LasI белок отвечает за продукцию аутоиндуктора N-3(оксододеканоил) гомосеринлактона (3OC12-HSL), RhlI белок является синтазой N-бутаноил- гомосеринлактона (C4-HSL), участвует в регуляции образования биопленок. LasI-LasR система регулирует синтез секретируемых факторов вирулентности, ответственных за деструкцию тканей организма–хозяина при инициировании инфекционного процесса: эластазы, кодируемой геном lasB, протеазы, 4 кодируемой lasA, экзотоксина, кодируемого toxA, щелочной фосфатазы, кодируемой геном aprA. LasR-LasI QS система активирует также экспрессию генов второй QS системы P. aeruginosa, RhlI-RhlR, приводя к ее индукции. Комплекс белка RhlR с соответствующим аутоиндуктором C4-HSL индуцирует экспрессию двух генов, регулируемых QS системой первого типа, lasB и aprA, и. еще нескольких генов, важных для вирулентности бактерий и их выживания в природных условиях. Было показано, что экспрессия более 600 генов P. aeruginosa контролируются QS. Показано, что 3OC12-HSL может оказывать непосредственное действие на организм: молекулы 3OC12-HSL взаимодействуют с компонентами иммунной системы, такими, как интерлейкины, модулируя иммунный ответ организма на инфекцию P. aeruginosa; ингибируют пролиферацию лимфоцитов, дифференциацию T-клеток, продукцию цитокинов, уменьшают продукцию факторов некроза опухолей; инъекции этого соединения индуцировали у мышей воспалительный процесс. У P. aeruginosa был обнаружен аутоиндуктор иной природы – 2-гептил-3гидроокси-4-хинолон (названный PQS). PQS частично регулирует экспрессию гена эластазы lasB вместе с двумя описанными выше QS системами. Для экспрессии PQS необходим белок LasR, а PQS, в свою очередь, активирует транскрипцию гена rhlI. Таким образом, QS системы принимают участие в контроле вирулентности P. aeruginosa в сложной, иерархической сети регуляции. При микроскопировании легких у больных кистозным фиброзом (CF) было обнаружено, что P. aeruginosa обитает там преимущественно в составе биопленок. Было показано, что клетки P. aeruginosa, несущие lasI мутацию, не формируют зрелых биопленок, образование биопленок останавливается на стадии микроколоний. Эти мутации могли быть комплементированы экзогенным добавлением аутоиндуктора 3OC12-HSL. Исследования, проведенные с P. aeruginosa, показали, что образование биопленок может быть важнейшим фактором колонизации легких этим патогеном . Другая патогенная бактерия, у которой активно изучается роль QS в регуляции вирулентности, Burkholderia cepacia, содержит CepI-CepR QS систему, участвующую в регуляции факторов патогенности (экзопротеаза, сидерофоры). Синтез аутоиндукторов QS регуляции N-октаноил-гомосеринлактона (C8-HSL) и N-гексаноил- гомосеринлактона (C6-HSL) у этой бактерии очень слабый. Было показано. что в большинстве случаев у больных кистозным фиброзом легкие были инфицированы одновременно B. cepacia и P. aeruginosa. При этом межвидовая коммуникация между этими бактериями могла усиливать патогенность B. cepacia. Так, добавление 5 культуральной жидкости P. aeruginosa к культурам B. cepacia приводило к существенному увеличению экзопротеазной активности и продукции сидерофоров. Это был первый пример, когда бактерия могла регулировать продукцию своих факторов патогенности за счет синтеза AI другой бактерией. Изучение подобных особенностей поведения бактерий в природных условиях открывает новые аспекты, важные для эпидемиологии. Действительно, в эпидемиологии не учитываются такие вполне возможные ситуации, когда взаимодействие непатогенных бактерий – продуцентов AHL и слабо патогенных бактерий (или практически непатогенных в данных условиях) может привести к развитию инфекции. Имеющиеся сейчас данные настоятельно ставят вопрос о необходимости серьезных исследований коммуникации различных бактерий в природных условиях и молекулярных механизмов подобной коммуникации. QS у грамположительных бактерий У грамположительных бактерий наиболее подробно изучены несколько систем, принимающих участие в контроле вирулентности у Staphylococcus aureus, в регуляции компетентности (т.е. способности принимать экзогенную ДНК при трансформации) у Streptococcus pneumoniae, регуляции компетентности и споруляции у Bacillus subtilis. В качестве аутоиндукторов QS систем у грамположительных бактерий используются секретируемые пептиды, AIP. Среди них – линейные пептиды и пептиды, содержащие тиолактонное кольцо. Они узнаются специфическими рецепторами – двухкомпонентными, связанными с мембранами сенсорными гистидин-киназами. Пептидные сигнальные молекулы не диффундируют через клеточную мембрану; повидимому, за выход их из клетки в среду ответственны экспортеры пептидов. При этом в большинстве случаев происходит процессирование и модификация пептидов. Различные грамположительные бактерии синтезируют различные пептидные сигнальные молекулы. Сигнальный механизм функционирует через каскад фосфорилирование/ дефосфорилирование. Сенсорная киназа фосфорилируется, после чего фосфорильная группа переносится на соответствующий белок - регулятор ответа. Фосфорилированный регулятор ответа связывается с ДНК и активирует транскрипцию гена-мишени. Лучше всего изучена система QS у Staphylococcus aureus. S. aureus использует бифазную стратегию при инфекции макроорганизма. При низкой плотности популяции бактерий (первый этап инфекции) клетки продуцируют белковые факторы, способствующие их прикреплению и колонизации; при высокой плотности популяции 6 (второй этап) бактерии репрессируют синтез этих факторов, и в них начинается секреция токсинов и протеаз; этот этап регулируется Agr QS системой. Система включает аутоиндуктор пептид AIP и agrBDCA-оперон. Ген agrD кодирует AIP, гены agrC и agrA - два двухкомпонентных белка, сенсор-киназы, AgrC и AgrA. Ген agrB кодирует белок, который экспортирует и модифицирует AIP (добавляет тиолактонное кольцо). Связывание AIP с AgrC приводит к фосфорилированию AgrA. Фосфорилированный AgrA индуцирует экспрессию регуляторной РНК (РНКIII), которая подавляет экспрессию факторов клеточной адгезии во время второго этапа инфекции. Активированный AgrA также индуцирует экспрессию agr оперона, что вызывает индукцию синтеза AIP. Известны четыре группы S. aureus, синтезирующие AIP с различной последовательностью. Интересно, что каждый тип AIP активирует свой собственный рецептор AgrC, но ингибирует активацию рецепторных белков у трех остальных групп вследствие конкурентного связывания с этими белками; в результате, AIP каждой группы стафилококков подавляет активацию каскада вирулентности остальных трех групп S. aureus. В соответствии с такой стратегией, очищенный пептид AIP II группы стафилококков подавляет вирулентность S. aureus группы I при инфекции мышей. Второй QS механизм, функционирующий в S. aureus, включает белок RAP (он же рибосомальный белок L2) и белок TRAP; последний является цитоплазматическим транскрипционным фактором. TRAP в фосфорилированном состоянии активирует РНК III; его фосфорилирование стимулируется белком RAP. Вирулентность S. aureus может ингибироваться пептидом RIP (RNA III inhibiting peptide). Пептид RIP ингибирует фосфорилирование белка TRAP, приводя к ингибированию синтеза РНК III, что приводит к подавлению синтеза токсина и снижению вирулентности клеток. Фосфорилирование TRAP может ингибироваться также в присутствии AIP; это показывает, что сложная сеть сигнальной трансдукции участвует в регуляции патогенеза S. aureus. У других грамположительных бактерий, стрептомицетов, среди которых – основные продуценты антибиотических веществ, используемых в медицине, в качестве аутоиндукторов QS систем используются соединения иной природы - γ-бутиролактоны. QS у этих бактерий участвует в регуляции их морфологической дифференции и продукции вторичных метаболитов. Интересно, что сигнальные молекулы стрептомицетов структурно сходны с N-ацил0-гомосеринлактонами грамотрицательных бактерий. Неизвестно, однако, существует ли в природе коммуникация между этими 7 таксономически далекими группами бактерий с использованием указанных сигнальных молекул. QS система, использующая аутоиндуктор AI-2 Аутоиндуктор AI-2 был обнаружен впервые в клетках Vibrio harveyi; это соединение с необычной структурой, фуранозил-борат диэфир. AI-2 накапливается во второй половине экспоненциальной фазы роста, но содержание его резко уменьшается при входе культуры в стационарную фазу. Синтазой AI-2 является белок LuxS, кодируемый геном luxS; гены luxS высоко гомологичны у разных бактерий. Фактически, ген luxS присутствует в половине всех секвенированных бактериальных геномов. AI-2 продуцируется из S-аденозилметионина через три стадии; субстратом для LuxS-синтазы является S-аденозил-гомоцистеин, который далее превращается в аденин, гомоцистеин и 4,5-дигидрокси-2,3-пентандион (DPD). Из DPD, весьма реактивного продукта, легко перестраивающегося и вступающего в дополнительные реакции, могут образовываться сигнальные молекулы, которые различные виды бактерий распознают как AI-2. Недавно была определена структура еще одной сигнальной молекулы AI-2 у Salmonella typhimurium; это вещество фурановой природы отличается от AI-2 V. harveyi, в том числе, не содержит атома бора. Показано, что эти два AI-2 и их предшественники, образуемые из DPD, могут находиться в природных условиях в равновесии и легко взаимопревращаться. Предполагают, что появление бора в молекуле AI-2 V. harveyi может быть связано с высокой концентрацией этого элемента в морской воде, где обитает эта бактерия; в то же время его концентрация в условиях обитания S. typhimurium значительно ниже. Наличие бора в молекуле AI-2 V. harveyi и его отсутствие в AI-2 S. typhimurium, по-видимому, существенны для действия этих аутоиндукторов в клетках продуцирующих их организмов. Таким образом, эти пока еще немногочисленные исследования QS систем, включающих аутоиндукторы типа AI-2, показали, что с помощью консервативного пути биосинтеза, использующего фермент LuxS, бактерии синтезируют интермедиаты сигнальных молекул, дальнейшая судьба которых может определяться особенностями окружающей среды. У Vibrio harveyi рецепторным сенсорным белком является LuxP, непосредственно связывающий AI-2. Комплекс LuxP-AI-2 взаимодействует с мембранно-связанной 8 гистидин-киназой LuxQ. При низких плотностях популяции бактерий LuxQ фосфорилируется, и фосфат переносится на цитоплазматический белок LuxU, а затем с этого белка на регуляторный белок LuxO, связывающийся с ДНК. Далее, происходит сложная цепь событий, включающих активацию генов, кодирующих пять маленьких регуляторных РНК, белком фосфо-LuxO и сигма 54 субъединицей РНК-полимеразы; эти РНК взаимодействуют с РНК-шапероном белком Hfq, что приводит к связыванию и дестабилизации мРНК, кодирующей активатор транскрипции LuxR. LuxR требуется для активации транскрипции lux оперона Vibrio harveyi; при низких плотностях популяции бактерий мРНК luxR деградирует, и в результате биолюминесценция отсутствует. При высоких плотностях популяции бактерий количество AI-2 сильно возрастает, что приводит к дефосфорилированию белка LuxO. Нефосфорилированный LuxO не может индуцировать экспрессию маленьких регуляторных РНК. В результате становится возможной трансляция мРНК luxR, синтез белка LuxR и биолюминесценция. Таким образом, в конечном итоге накопление AI-2 вызывает активацию экспрессии генов lux оперона. Большой интерес представляет факт, что в регуляции lux оперона V. harveyi принимают участие три вида аутоиндукторов QS систем, взаимодействующих между собой: AI-2, AHL (таб. ) и CAI-1. В настоящее время вопрос о роли AI-2 как сигнальной молекулы и регулятора экспрессии генов у разных бактерий остается недостаточно изученным и требует дальнейших исследований. В отношении патогенных бактерий на основании изучения мутантов с инактивированным геном luxS было показано, что этот ген, считающийся геном синтазы AI-2, участвует в регуляции экспрессии генов, связанных с вирулентностью энтеропатогенных штаммов E. coli, Vibrio cholerae, Streptococcus pyogenes. QS системы этого типа являются глобальными регуляторами экспрессии бактериальных генов; так, было показано, что luxS участвует в регуляции транскрипции 242 генов E. coli, составляющих 5,6% генома этой бактерии. Среди бактерий семейства Enterobacteriaceae наиболее хорошо изучены QSсистемы II типа у E. coli и S. typhimurium. У S. typhimurium обнаружены гены, кодирующие тип рецептора AI-2, отличный от рецептора AI-2 LuxP у V. harveyi. Это АТФ-зависимый транспортер, названный LsrB (от LuxS-regulated). Такой же рецептор AI-2 был обнаружен и у других представителей семейства Enterobacteriaceae. Оказавшись внутри клетки, AI-2 фосфорилируется и связывается с белком LsrR. В отсутствие AI-2 белок LsrR репрессирует lsr оперон. AI-2 накапливается во второй 9 половине экспоненциальной фазы роста, содержание его в среде резко уменьшается при входе культуры в стационарную фазу. Клетки E. coli и S. typhimurium импортируют AI-2 при переходе в стационарную фазу с помощью транспортера Lsr . На основании изучения эффекта мутаций, инактивирующих ген luxS, был сделан вывод о том, что синтаза LuxS участвует в регуляции экспрессии генов, связанных с вирулентностью, у патогенных штаммов E. coli EHEC и EPEC - контролирует экспрессию системы секреции III типа, которую кодируют гены LEEлокуса, участвует в регуляции миграции клеток, формировании биопленок, в синтезе токсинов и др. Транскриптомный анализ показал, что LuxS является глобальным регулятором EHEC, контролируя экспрессию более 400 генов. Опубликовано большое количество данных, показывающих, что мутации в гене luxS приводят к отсутствию синтеза AI-2 и оказывают существенное влияние на клеточные процессы различных бактерий семейства Enterobacteriaceae: S. marcescens, Serratia sp., Erwinia carotovora и amylovora. Однако, в экспериментах по комплементации мутации в гене luxS при использовании выделенного и химически синтезированного AI-2 было установлено, что не все фенотипы, зависимые от luxS, контролируются непосредственно AI-2. Регуляторная роль AI-2 доказана точно для биолюминесценции штамма V. harveyi BB170 и экспрессии lsr-оперона у S. typhimurium. Эти результаты показали, что данные о влиянии AI-2 на некоторые свойства клеток, которые ранее считались зависимыми от QS системы II типа, должны быть пересмотрены с учётом того, что синтез AI-2 – это не единственная функция LuxS синтазы. В клетках бактерий с инактивированными генами luxS накапливается S-рибозил-гомоцистеин, так как не происходит его дальнейшее расщепление до гомоцистеина и DPD. В этом случае в клетке резко снижается уровень гомоцистеина, который необходим для синтеза метионина, и клетка будет использовать другие пути его образования, в частности, через оксалоацетат. Следовательно, изменение экспрессии различных генов у luxS-мутантов может определяться не (или не только) QS-регуляцией, но и серьезными нарушениями метаболизма бактерий, вызывающими плейотропные эффекты. Чтобы ответить на вопрос, связано ли влияние luxS-мутантов на различные фенотипы бактерий с отсутствием функционирования QS-систем на основе AI-2, или это результат плейотропных эффектов при нарушении метаболизма, был проведен анализ геномных баз данных на наличие генов известных рецепторов AI-2 (LuxPрецептора Vibrio harveyi и Lsr-рецептора S. typhimurium) Было высказано 10 предположение, что зависимость фенотипов от QS регуляции II типа ограничивается преимущественно организмами, несущими гены рецепторов AI-2, а изменение фенотипов у luxS мутантов, не содержащих эти гены, можно объяснить нарушениями в клеточном метаболизме. Геномный анализ позволил установить наличие Lsr-подобных рецепторов AI-2 у представителей семейства Enterobacteriaceae, таких как E. coli, Photorhabdus luminescens, Klebsiella pneumoniae, Yersinia spp., Shigella dysenteriae и Shigella flexneri, Salmonella spp. Гомологи известных рецепторов AI-2 не обнаружены в опубликованных банках последовательностей генов и белков бактерий родов Serratia и Erwinia. Хотя и не было неожиданностью отсутствие двухкомпонентной сенсорной киназы LuxPQ (этот рецептор до сих пор был найден только у представителей семейства Vibrionaceae), отсутствие в геноме этих бактерий и Lsr-рецепторного комплекса стало сюрпризом. Этот факт вызывает серьезные сомнения в существовании у них QS-систем, функционирующих с участием AI-2, и предполагает преимущественно метаболическую роль LuxS у этих бактерий. Хотя, конечно, нельзя исключить возможности наличия у них ещё не изученных рецепторов AI-2. Таким образом, функции веществ типа AI-2 могут быть различными у разных бактерий. Однако, даже в тех случаях, когда эти вещества в составе QS систем не являются регуляторами экспрессии генов клетки-хозяина, они могут, выделяясь в среду, участвовать в регуляции клеточных процессов других бактерий в популяции, осуществляя их коммуникацию. Подобные взаимоотношения были показаны для искусственных смешанных популяций бактерий, состоящих из клеток E. coli и V. harveyi, а также V. cholerae, который может сосуществовать с E. coli в человеческом организме. QS системы, использующие аутоиндуктор AI-3 и гормоны AI-3 впервые был описан как компонент использованной культуральной среды штамма патогена EHEC, который активировал экспрессию генов, отвечающих за адгезию бактерий на эукариотических клетках . Эксперименты по изучению структуры AI-3 показали, что это соединение ароматической природы, высказано предположение об аминокислотной природе AI-3. Однако, полностью структура и механизм синтеза этой сигнальной молекулы еще не определены. Предполагается, что как и в случае 11 АГЛ, имеется целое семейство соединений, подобных AI-3. Было показано, что синтез AI-3 не зависит от гена luxS в E. coli, в отличие от синтеза AI-2. Обнаружили, что АI-3 активирует транскрипцию генов вирулентности LEE-локуса у EHEC штаммов E. coli. Для определения АI-3 были получены биосенсоры - штаммы E. coli K-12, содержащие в хромосоме конструкции на основе генов LEE-локуса и гена репортера lacZ. С помощью биосенсоров было обнаружено, что различные бактерии кишечной микрофлоры, непатогенные штаммы E. coli и Enterobacter cloacae и патогенные виды Shigella, Salmonella и Klebsiella, синтезируют Для функционирования AI-3 у E. coli необходима двухкомпонентная система, включающая сенсорную киназу QseC и регулятор ответа QseB. В присутствии в периплазматическом пространстве AI-3 QseC вначале фосфорилируется, затем переносит фосфат на QseB, который связывается с соответствующими промоторами и вызывает активацию экспрессии собственного гена и генов flhDC-оперона, отвечающего за синтез жгутиков [118, 119]. AI-3 также участвует в регуляции генов LEE-локуса [113]. Обнаружена двухкомпонентная система, названная QseEF, ответственная за регуляцию этих генов. QseCB и QseEF системы, кроме AI-3, отвечают на еще один класс сигнальных молекул – катехоламиновые гормоны, в частности, эпинефрин/норэпинефрин (или адреналин/норадреналин), синтезируемые организмом-хозяином. Анализ бактериальных геномов показал, что AI-3/эпинефрин/норэпинефрин сигнальные каскады присутствуют в большом количестве бактериальных видов. QS и апоптоз у бактерий. Кроме описанных выше QS систем, у E. coli обнаружена QS система, функционирующая с участием пептидов в качестве сигнальных молекул, которая участвует в регуляции апоптоза бактерий. Апоптоз или программируемая клеточная смерть (ПКС) - генетически обусловленная программа гибели клеток у многоклеточных эукариотических организмов. ПКС способствует нормальному функционированию биологической системы, освобождая ее от поврежденных, закончивших жизненный цикл или появившихся вследствие возникновения мутаций потенциально опасных клеток. Найдены системы со сходной функцией и у прокариот. Прокариотическим аналогом апоптоза можно считать гибель части клеточной популяции бактерий в 12 условиях остановки роста популяции, например, в стационарной фазе роста при исчерпании питательного субстрата или под влиянием стрессовых факторов. В результате гибели и автолиза части клеток оставшиеся живые клетки могут использовать продукты автолиза как питательный субстрат и продолжать расти, синтезируя необходимые клеточные компоненты, что полезно для выживания бактериальных популяций. ПКС может способствовать обмену генетической информацией в популяции бактерий при высвобождении ДНК в результате лизиса клеток. Кроме того, уничтожение клеток с повреждениями генетического аппарата также полезно для популяции бактерий. Генетические механизмы ПКС в прокариотических системах полностью не выяснены. Большое внимание было уделено изучению токсин-антитоксин систем (ТАсистемы), обнаруженных у E. coli и других бактерий. ТА-модули состоят из пары генов в геномах бактерий: гена, кодирующего стабильный токсин, который вызывает гибель клеток, и гена, кодирующего лабильный антитоксин, который ингибирует активность токсинов; гены токсинов ко-транскрибируются с генами соответствующих антитоксинов в составе одного оперона. Система E. coli mazEF является одной из наиболее изученных ТА-систем. Ген mazF кодирует стабильный цитотоксический белок, а mazE – нестабильный антитоксин, разрушаемый АТФ-зависимой ClpAP сериновой протеазой. Токсин MazF представляет собой эндорибонуклеазу, которая преимущественно расщепляет однонитевые мРНК в последовательности ACA и действует также на 16S РНК в декодирующем центре 30S субьединицы рибосомы, что приводит к ингибированию синтеза белка. До тех пор, пока MazE и MazF экспрессируются совместно, MazE взаимодействует с MazF, нейтрализуя его токсичное действие. В нормально растущих клетках токсин и антитоксин образуют стабильный комплекс, что мешает токсину осуществлять токсическое действие. В стрессовых условиях, которые препятствуют экспрессии mazEF-оперона, индуцированные стрессом протеазы разрушают MazE, и в результате стабильный токсин MazF может действовать на клеточные РНК, что приводит к гибели клеток и автолизу большей части популяции. mazEF-опосредованный регулируется апоптоз зависит от плотности популяции, он QS-фактором EDF (extracellular death factor, внеклеточный фактор смерти). EDF является линейным пентапептидом Asn-Asn-Trp-Asn-Asn. Было установлено, что EDF увеличивает активность MazF in vitro. В то же время, активация MazF приводила к увеличению синтеза EDF, что в свою очередь вызывало увеличение 13 гибели клеток в стрессовых условиях. Было обнаружено прямое сайт-специфическое связывание EDF и MazF. Результаты проведенных исследований показывают, что QS система, участвующая в регуляции апоптоза у E. coli, кардинально отличается от описанных выше QS систем Enterobacteriaceae: 1) EDF – единственная сигнальная молекула пептидной природы, обнаруженная у E. coli; 2) большинство известных молекул, участвующих в функционировании QS, контролируют экспрессию генов на уровне транскрипции, а EDF – на посттранскрипционном уровне. Недавно были обнаружены несколько небольших QS-пептидов, отличающихся по последовательности аминокислот от EDF, синтезируемых грамотрицательной бактерией Pseudomonas aeruginosa и грамположительной Bacillus subtilis, которые могли участвовать в регуляции клеточной гибели, управляемой mazEF [134]. Каждый из этих пептидов, несмотря на различия в строении, активировал эндорибонуклеолитическую активность MazF E. coli, по-видимому, взаимодействуя с различными сайтами этого белка. Таким образом, была обнаружена семья QS пептидов EDF, которая в дальнейшем может стать основой для получения регуляторов нового типа, активирующих ПКС. Приведенные выше QS системы и участвующие в их функционировании аутоиндукторы не исчерпывают всех известных в настоящее время; число вновь открываемых постоянно увеличивается. Ингибирование QS систем бактерий - новый подход к созданию лекарств против патогенности Одной из важнейших проблем современной медицины является все большее распространение бактериальных возбудителей, устойчивых к традиционным лекарственным препаратам. Особенно ярко эта проблема иллюстрируется широким распространением госпитальных инфекций, которые регистрируются сейчас в отделениях интенсивной терапии более чем у 20% пациентов. Распространение устойчивых к лекарственным препаратам форм патогенных бактерий, снижающее эффективность и обесцениваюшее все большее количество обычно применяемых традиционных лекарственных средств, и необходимость разработки способов подавления образования бактериями биопленок ставит вопрос о новых стратегиях для 14 борьбы с инфекционными заболеваниями, о создании лекарственных средств нового поколения, воздействующих на специфические биохимические системы микроорганизмов. В настоящее время принято считать, что одной из наиболее перспективных «мишеней» подобного рода является Quorum Sensing регуляция. QS системы, как было отмечено выше, участвуют в регуляции вирулентности бактерий и формировании ими биопленок. Лекарственные средства, направленные на подавление QS систем, предложено называть «ядами патогенности», т.к. они, в отличие от классических антимикробных лекарств (прежде всего, антибиотиков), не обладают бактерицидным или бактериостатическим действием на патогенные бактерии и поэтому не создают селективного давления, ведущего к образованию резистентных к антибактериальным веществам форм патогенных бактерий. В последнее время за рубежом образованы биотехнологические компании, которые ставят своей целью разработку средств, ингибирующих QS регуляцию и, вследствие этого, снижающих патогенность бактерий и предотвращающих образование ими биопленок. Подавление функционирования QS систем может быть достигнуто несколькими способами. 1. Подавление синтеза аутоиндукторов QS систем. Как упоминалось выше, S-аденозилметионин (SAM) является субстратом для синтеза аутоиндукторов AHL и AI-2 QS систем двух типов. Показано, что различные аналоги SAM, например, S-аденозилгомоцистеин, S-аденозилцистеин действовали, как сильные ингибиторы синтеза AHL у Pseudomonas aeruginosa. Следует отметить при этом, что взаимодействие AHL-синтазы с SAM, по-видимому, происходит очень специфично, несмотря на то, что SAM является обычным предшественником во многих прокариотических и эукариотических биохимических путях. Это позволяет надеяться, что аналоги SAM могут быть использованы как специфические ингибиторы синтеза аутоиндукторов бактериальных QS систем регуляции, не влияющие на ферменты эукариотов . Показано, что некоторые антибиотики – макролиды, ингибиторы синтеза белка на рибосомальном уровне, подавляли синтез AHL и некоторых факторов вирулентности в концентрациях, не ингибирующих рост бактерий. Например, 15 субингибирующие концентрации эритромицина подавляли синтез AHL и факторов вирулентности гемолизина, протеаз, гемагглютининов у Pseudomonas aeruginosa. Бактерии, подвергнутые действию антибиотика, были менее вирулентны для мышей. Эти данные согласовывались с результатами клинических наблюдений, показавших эффективность применения низких доз эритромицина и других макролидов при инфекциях, вызванных штаммами P. aeruginosa, резистентных к этим антибиотикам. Азитромицин в концентрации 2 мкг/мл, не ингибирующей рост P. aeruginosa, подавлял синтез AHL, а также продукцию факторов вирулентности эластазы и рамнолипидов. При этом добавление в культуру AHL экзогенно приводило к восстановлению продукции этих факторов вирулентности, показывая, что именно синтез AHL являлся первичной мишенью действия антибиотика. Механизм действия антибиотиков – макролидов на синтез AHL остается в настоящее время неясным 2. Ингибирование связывания аутоиндукторов с соответствующими регуляторными белками. Подавление функционирования QS систем регуляции может быть достигнуто с помощью молекул антагонистов аутоиндукторов, которые мешают связыванию AI с молекулами рецепторных белков. Показано, что такие ингибиторы могут быть конкурентными AHL – в этом случае они структурно близки сигнальной молекуле аутоиндуктора и связываются с сайтом связывания AHL с рецепторным белком, но не активируют этот белок. Неконкурентные ингибиторы могут иметь слабое сходство с AHL, или вообще быть несходными с ним; эти соединения связываются с различными сайтами на рецепторном белке. В настоящее время подобные ингибиторы активно изучаются; поиск конкурентных ингибиторов проводится с использованием компьютерного дизайна. Получены данные о ингибировании QS регуляции аналогами AHL, несущими модификации в различных частях молекул AHL – в ацильных цепях и гомосеринлактонном кольце. Было показано, что длина ацильной цепи имеет существенное значение для активности AHL. Аналоги AHL с более длинными ацильными цепями, чем у нативных AHL, могли быть ингибиторами активности QS систем. Замена в молекулах AHL 3-оксо-групп на 3-гидроксильные или метильные, введение ненасыщенных связей в ацильные цепи приводит к значительному снижению активности AHL . 16 Модификации в гомосеринлактонном кольце молекул AHL существенно влияют на их активность. Природные AHL являются l-изомерами; d-изомеры, в основном, биологической активности не проявляют. Наличие ацильной цепи, по-видимому, необходимо для биологической активности AHL. Замена гомосеринлактонного кольца на гомоцистеинлактонное уменьшало активность AI на порядок, а замена на гомосеринлактамное кольцо приводило к отсутствию активирующих или антагонистических свойств у этой молекулы. Однако, молекулы, в которых гомосеринлактон заменен на гомосеринтиолактон, могут сохранять активность при функционировании некоторых QS систем. При изучении действия аналогов AHL Las системы P. aeruginosa с заменами в гомосеринлактонном кольце было показано, что отношение к этим заменам было различным в случае взаимодействия этих аналогов с RhlR и LasR белками. Этот факт может указывать, что два рецепторных белка P. aeruginosa отличаются существенно в их сайтах связывания с AHL . В последнее время большое внимание уделяется природным антагонистам QS аутоиндукторов, производным фуранонов, в том числе, галогенизированным. Было обнаружено, что австралийская красная водоросль Delisea pulchra различные виды галогенизированных фуранонов; их продукция синтезирует препятствует колонизации этой водоросли морскими бактериями, у которых QS система участвует в регуляции метаболических процессов, и, таким образом, защищает растения от действия бактерий. Фураноны D. pulchra содержат фурановое кольцо с замещенной в C-3 положении ацильной цепью и атомами брома в C-4 положении. Замещения в C-5 положении могут варьировать. Фураноны из природных источников галогенизированы в различных положениях атомами брома, иода или хлора. После обнаружения эффекта фуранонов, образуемых D. pulchra, в различных лабораториях был проведен широкий скрининг веществ природного происхождения и получение химически синтезированных веществ, производных фуранонов, ингибиторов QS. Среди них были производные фуранонов с ацильными цепями различной длины. Было показано, что даже производное фуранона без ацильной цепи с двумя атомами брома было ингибитором QS системы P. aeruginosa. производные фуранонов продуцируются различными Было обнаружено, что организмами: морскими зелеными, красными и бурыми водорослями, грибами, асцидиями, актиномицетами и др.. 17 Изучение механизма действия этих веществ на QS системы показало, что соединения фураноновой природы конкурируют с AHL за сайт связывания с рецепторными белками LuxR типа. Связывание фуранонов с белком – рецептором влияет на стабильность комплекса белок-лиганд, приводя к быстрому расщеплению рецепторного белка . Действие фуранонов в результате приводило к ингибированию клеточных процессов, регулируемых QS: биолюминесценции Vibrio fischeri; продукции факторов вирулентности, включая образование биопленок, и патогенеза P. aeruginosa; вирулентности Erwinia carotovora. Многие химически синтезированные фураноны были значительно эффективнее, чем природные. Представляет большой интерес факт, что синтетические фураноны были активны против бактерий в составе биопленок в тех же концентрациях, что и против QS регуляции планктонно размножающихся бактерий, в отличие от действия классических антибиотиков, используемых для борьбы с инфекциями P. aeruginosa; в последнем случае концентрация антибиотика при росте бактерий в биопленках должна была быть в 100-1000 раз выше. Использование транскриптомного анализа позволило определить, что добавление к клеткам соединений фураноновой природы влияет на экспрессию 93 генов P. aeruginosa PAO1; функционирование 80% этих генов регулировалось с участием QS систем, например, гены, кодирующие эластазу, протеазу LasA, участвующие в синтезе рамнолипидов, феназинов, цианида, хитиназы. Недавно водорослью было D. показано, pulchra, что производное фуранона, продуцируемое (5Z)-4-бромо-5-(бромометилен)-3-бутил-2(5H)-фуранон, ингибировало QS в клетках Escherichia coli с участием аутоиндуктора AI-2; это соединение подавляло также формирование биопленки и вызывало репрессию 56 генов E. coli, 79% которых индуцировалось AI-2. При действии указанного соединения внеклеточная концентрация AI-2 уменьшалась вдвое; предполагается, что этот эффект осуществлялся на посттранскрипционном уровне. Приведенные выше данные показывают, что производные фуранонов перспективны для получения на их основе терапевтических агентов, направленных против патогенности бактерий. Однако, испытанные в настоящее время соединения с ингибирующим QS регуляцию действием токсичны для применения в медицине. Актуальной задачей является их модификация и поиски новых, нетоксичных веществ для применения на практике. 18 Бактерии и эукариотические организмы продуцируют вещества иной природы, подавляющие QS регуляцию у бактерий – циклические дипептиды (дикетопиперазины); о них упоминалось выше как о соединениях, способных активировать QS систему. Предполагают, что они также взаимодействуют с сайтами связывания AHL с рецепторными белками. 3. Деградация AHL. Деградация аутоиндукторов QS систем – один из перспективных путей борьбы с бактериальными инфекциями, регулируемыми этими системами. Разложение AHL может быть следствием действия специфических ферментов бактерий и высших организмов; кроме того, они могут разлагаться в результате щелочного гидролиза, при высоких pH, при повышенной температуре выращивания бактерий. В настоящее время проводится активный скрининг ферментов, деградирующих AHL, в первую очередь, лактоназ, разрушающих гомосеринлактонное кольцо. Лактоназы, гидролизующие AHL, были найдены у бацилл; соответствующий белок был назван AiiA. Было показано, что присутствие этого фермента в клетках бактерий определяет в значительной степени их способность к подавлению фитопатогенных бактерий, у которых вирулентность регулируется QS системами с участием AHL. Перенос гена рекомбинантной AHL-лактоназы в клетки Pseudomonas fluorescens увеличивал способность штамма к биоконтролю заболеваний растений, вызванных фитопатогенными бактериями. Более того, было показано, что трансгенные растения, содержащие введенный ген aiiA, экспрессирующийся в растении, были существенно менее чувствительны к инфекции Erwinia carotovora. Введение гена aiiA в клетки этого фитопатогена снижало синтез AHL и в результате уменьшало активность пектолитических ферментов и проявление других симптомов гнили растений. Исследуется также потенциал AHL-ацилаз, продуцируемых бактериями, в деградации AHL . Высшие организмы также обнаруживают механизмы специфической деградации AHL. Большой интерес представляют данные о том, что клетки эпителия дыхательных путей человека способны инактивировать AHL P. aeruginosa – 3OC12HSL, но не C4HSL. Эта инактивация имеет, по-видимому, энзиматическую природу. Деградации подвергаются и другие AHL, например, C6-HSL. Способность к деградации AHL обнаружена у некоторых, но не у всех, клеток млекопитающих. Эта находка открывает 19 новую область исследований и позволяет надеяться, что человеческий организм имеет еще одну линию защиты от бактериальных инфекций – через взаимодействие с QS регуляцией вирулентности бактерий. Поиск и изучение ферментов, деградирующих аутоиндукторы QS систем – новый перспективный путь получения терапевтических агентов, направленных на борьбу с бактериальными инфекциями. 4. Подавление QS систем грамположительных бактерий. Вирулентность Staphylococcus aureus, контролируемая QS системами, может ингибироваться природными RIP пептидами, их химически синтезированными аналогами и химерными пептидами. Эти пептиды конкурируют с пептидом RAP, ингибируя фосфорилирование белка TRAP, и в результате подавляют синтез РНКIII, что приводит к ингибированию вирулентности бактерии. Отмечено, что пептиды RIP ингибировали in vivo образование биопленок S. aureus и S. epidermidis . Эффективность пептидов показана при использовании в качестве модели различных животных, инфицированных S. aureus. Использование одновременно RIP пептидов и антибиотиков обеспечивало синергидный эффект, приводя к 100% выживания мышей, инфицированных S. aureus. Возможно также использование ингибиторного действия AIP на QS S. aureus, о чем было сказано выше. Полученные данные подтверждают потенциальную возможность использования пептидов, взаимодействующих с QS системами стафилококков, для борьбы с клиническими инфекциями, вызываемыми этими бактериями. Еще один подход для антибактериальной терапии грамположительных бактерий – вакцинирование организма белками – компонентами QS системы. Например, было показано, что вакцинация мышей белком RAP защищала их против инфекции S. aureus. Заключение Интенсивные исследования Quorum Sensing регуляции, проведенные в последние годы, показали, что QS системы осуществляют глобальную регуляцию большого количества клеточных процессов у бактерий различных таксономических групп. Этот тип регуляции, по-видимому, широко распространен у бактерий. Обнаружен широкий 20 спектр низкомолекулярных регуляторов с различной структурой, вовлеченных в процессы QS регуляции; количество выявленных соединений с подобной активностью возрастает. QS регуляция, безусловно, требует детальных и глубоких исследований. Мало изучены молекулярные механизмы функционирования QS систем различных типов; во многих случаях не выяснено, какие свойства бактерий контролируются этими регуляторами; QS системы и их роль в метаболизме бактерий исследованы лишь для небольшого количества бактерий. В последнее время было показано, что ауторегуляторы QS систем функционируют не только в бактериях - обнаружено их влияние на клеточные процессы и в эукариотических организмах. Выше отмечалось непосредственное влияние 3OC12-HSL (AHL, участвующий в регуляции вирулентности P. aeruginosa) на некоторые свойства клеток млекопитающих. Было обнаружено, что растительный организм (Medicago truncatula) способен отвечать на бактериальные AHL (3OC12-HSL и 3OC16-HSL, продуцируемые соответственно патогеном P. aeruginosa и симбионтом растения Sinorhizobium meliloti). С помощью метода протеомики было определено, что эти AHL вызывают глобальные изменения в продукции более 150 растительных белков. Кроме того, они индуцировали секрецию растениями веществ, которые могли взаимодействовать с QS регуляцией бактерий – ингибировать или стимулировать QS . По-видимому, эукариотические организмы, растения и животные, в процессе эволюции приобрели способность узнавать QS сигналы и отвечать на них, продуцируя вещества, сходные структурно с этими сигнальными молекулами и являющиеся их конкурентами, а также синтезируя ферменты, разрушающие эти сигнальные молекулы. Эукариоты могут использовать природные стратегии терапии, направленные против колонизации и инвазии патогенных бактерий, в результате ингибирования процессов, управляемых QS. Выше сказанное свидетельствует о том, что изучение систем QS регуляции представляет новое обширное поле деятельности для исследователей в различных областях биологии и медицины; это явление заслуживает самого пристального внимания исследователей. Выявление и изучение QS систем различных микроорганизмов может открыть много нового в регуляции клеточных процессов. Особое внимание уделяется изучению участия QS-систем в регуляции процессов, связанных с патогенностью бактерий. Как было показано выше, существенная роль QS в регуляции синтеза факторов вирулентности у бактерий открывает возможность принципиально нового подхода к созданию лекарственных средств для 21 антибактериальной терапии – лекарств, направленных непосредственно на подавление QS регуляции и, вследствие этого, подавлению патогенности бактерий. В настоящее время проводятся интенсивные скрининг и исследования действия различных веществ, полученных из природных источников и в результате химического синтеза, на QS регуляцию и экспрессию генов, связанных с QS. Обнаружено взаимодействие с QS веществ, относящихся к полифенолам; т.к. полифенолы широко распространены в растительном царстве, предполагается, что они могут быть важны для защиты растений от патогенных бактерий. Показано, что целый ряд веществ, продуцируемых растениями, способны взаимодействовать с QS системами; природа этих веществ изучается. В настоящее время есть все основания полагать, что лекарственные средства, осуществляющие ингибирование QS, могут быть многообещающей альтернативой традиционным лекарственным средствам антибактериальной терапии для медицины, сельского хозяйства, пищевых технологий. Или, по крайней мере, они смогут усиливать антимикробное действие используемых препаратов. Работы в этом направлении активно проводятся во многих лабораториях и компаниях в разных странах мира. 22