ФГОУ ВПО «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ

ФГОУ ВПО «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
На правах рукописи
ДУДАРЕВ
АРТУР АЛЕКСАНДРОВИЧ
ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
ГЕПАТОПРОТЕКТОРА ДИРОНАКС
06.02.03 – ветеринарная фармакология с токсикологией
Диссертация на соискание
учёной степени кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор ветеринарных наук,
Кильметова И.Р.
Научный консультант:
доктор технических наук,
Струнин Б.П.
Уфа – 2014
1
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ......................................................................................................... 4
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................. 8
1.1
Печень и её роль в организме. ................................................................ 8
1.2
Основные патологии печени. ............................................................... 18
1.3 Современные гепатопротекторы, применяемые в ветеринарии. .......... 40
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .................................... 57
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ......................................................... 64
3.1 Производство Диронакса. ......................................................................... 64
3.1.1 Физико-химические свойства Диронакса. .................................... 64
3.1.2 Качественное и количественное определение Диронакса .......... 68
3.1.3 Изучение стабильности Диронакса ............................................... 70
3.1.4 Определение кристаллической структуры Диронакса ................ 74
3.2 Токсикологическая оценка Диронакса. ................................................... 78
3.2.1 Острая токсичность Диронакса. ....................................................... 79
3.2.2 Субхроническая токсичность Диронакса ........................................ 81
3.2.3 Влияние Диронакса на функцию почек........................................... 84
3.2.4 Влияние Диронакса на центральную нервную систему. ............... 85
3.2.5 Влияние Диронакса на детоксицирующую активность печени ... 86
3.3 Оценка гепатопротекторного действия Диронакса ................................ 88
3.3.1 Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении
печени четырёххлористым углеродом. .......................................... 88
3.3.2 Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении
печени парацетамолом ..................................................................... 98
3.3.3 Эффективность Диронакса при экспериментальном
поражении печени этанолом ......................................................... 102
3.4 Эффективность применения Диронакса при гепатите
домашних животных ................................................................ 106
3.4.1 Влияние Диронакса на морфологические и биохимические
2
показатели крови собак .................................................................. 107
3.4.2 Влияние Диронакса на морфологические и биохимические
показатели крови кошек................................................................. 117
3.5 Экономическая эффективность применения Диронакса ..................... 123
4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................... 125
ВЫВОДЫ ........................................................................................................ 133
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ .......................................................... 134
СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ ТЕРМИНОВ…………………… ………… 135
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК .......................................................... 136
3
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. В настоящее время заболевания печени являются
общемировой проблемой. Cпособность печени, как центрального органа
процессов метаболизма, обмена ферментов, гормонов, микроэлементов и витаминов, нейтрализации токсинов к выполнению своих функций нередко
снижается из-за многочисленных веществ, к которым относятся в том числе
и некоторые лекарственные средства, при приеме в высоких, а иногда и в терапевтических дозах, повреждающие орган [10, 80, 160].
Острые и хронические заболевания печени, и желчевыводящих путей
были и остаются важной проблемой ветеринарной медицины. Поскольку болезни печени широко распространены, профилактика, их лечение, изыскание
способов ранней диагностики, коррекции нарушений метаболизма у животных является одной из острых проблем в теоретической и практической работе [11, 95,103].
Несмотря на успехи в медицине и ветеринарии, обычные средства для
лечения гепатопатий имеют нежелательные побочные эффекты, малоэффективны и являются дорогостоящими. Следовательно, существует большая потребность в безопасных альтернативных терапевтических средствах для лечения болезней печени [4, 28, 86].
На отечественном рынке в настоящее время имеется широкий спектр
препаратов и кормовых добавок, способствующих восстановлению печени
при гепатопатиях различной этиологии, таких как гепатовет, лиарсин, глютаМакс, гепалон, полифепан, гепавет, гепатоджект, дюфалайт, гептрал, эссенциале, гепатосан, хофитол, аллохол, метионин, силимарин, лив 52, билигнин, фосфоглив, липоевая кислота, зиксорин и другие [5, 15, 23, 32, 66, 133].
Применение препаратов для лечения гепатопатий требует во многих
случаях терапии в течении нескольких недель, часто с повторным курсом
приёма, в результате чего затраты на лечение животных значительно повышаются. В связи с этим перед возникает необходимость в разработке гепато4
протекторов, имеющих невысокую стоимость и не требующих длительного
курса лечения.
В настоящее время разработан отечественный гепатопротектор Диронакс (диизопропиламмония дихлорацетат). Препарат синтезирован в ООО
«Базис» (г.Уфа) под руководством доктора технических наук Б.П. Струнина.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение токсико-фармакологических свойств гепатопротектора Диронакс и его
применение в ветеринарной практике для профилактики и лечения болезней
печени.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
- определить массовую долю основного вещества, изучить стабильность и
подтвердить кристаллическую структуру Диронакса;
- дать токсикометрическую оценку Диронакса (острая и субхроническая токсичность, влияние на центральную нервную систему, функцию почек, изучить влияние на массу внутренних органов):
- изучить влияние Диронакса на функциональное состояние печени на моделях экспериментальных гепатитов;
- определить терапевтическую эффективность Диронакса при гепатите собак
и кошек;
- определить экономическую эффективность применения Диронакса в ветеринарии.
Научная новизна. Впервые по новой технологии синтезирован отечественный гепатопротекторный препарат Диронакс и доказана его химическая
структура. Впервые проведены исследования широкого комплекса токсикологических показателей гепатопротектора Диронакс, позволившее выявить
степень безопасности его применения. Установлено, что препарат Диронакс
относится к четвертому классу опасности.
Впервые изучены его токсико-фармакологические свойства, влияние на
массу внутренних органов, функциональное состояние печени при экспериментальных гепатитах, морфологические и биохимические показатели крови
5
у лабораторных и домашних животных, в частности у кошек и собак. Препарат имеет положительные показатели на основании доклинических и производственных исследований.
Практическая значимость. Выполненные исследования и полученные
результаты позволяют предложить препарат Диронакс как гепатопротектор
при заболеваниях печени различной этиологии у собак и кошек. Предложенная доза не вызывает отрицательного действия и обладает лечебным действием.
Результаты исследований использованы в учебном процессе при преподавании дисциплины «Болезни собак» и «Болезни кошек» для студентов
факультета биотехнологии и ветеринарной медицины.
Апробация работы. Результаты экспериментальных и клинических
исследований, являющиеся основой диссертации, доложены, обсуждены и
одобрены на V Всероссийской научно-практической конференции молодых
ученых « Молодежная наука и АПК: программы и перспективы» (Уфа, 2012),
на II Всероссийской научно-практической конференции с международным
участием «Состояние и перспективы увеличения производства высококачественной продукции сельского хозяйства» (Уфа, 2013), на VI Всероссийской
научно-практической конференции молодых ученых «Наука молодых – инновационному развитию АПК» (Уфа, 2013), на Международной научнопрактической конференции, посвященной 70-летию ФГБОУ ВПО Ижевская
ГСХА «Научное обеспечение АПК. Итоги и перспективы» (Ижевск, 2013).
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 8
научных статьях, 4 из которых – в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- определение массовой доли основного вещества, подтверждение его структуры и стабильности;
- токсикологическая характеристика препарата;
6
- фармакологическая эффективность препарата при экспериментальном поражении печени на модели острого гепатита у крыс;
- фармакологическая эффективность препарата при гепатите у кошек и собак.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений,
библиографического списка и приложений. Изложена на 153 страницах компьютерного набора. Иллюстрирована 15 рисунками и 26 таблицами. Библиографический список включает 189 источников, в том числе 39 - иностранных
авторов.
7
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Печень и её роль в организме
Печень представляет собой самую большую железу в организме, построенную из огромного количества работающих клеток.
Значение печени достаточно разнообразно, так как она служит барьером в кровообращении между желудочно-кишечным трактом и всеми
остальными частями организма. У млекопитающих печень – единственный
(кроме лёгких) орган в теле, в котором поступающая венозная кровь вновь
растекается по капиллярным сосудам и вступает в очень близкое соприкосновение с клетками печени, меняя свой состав. В печени происходит предварительная обработка венозной крови с выходом из её состава углеводов, откладывающихся в печени в виде гликогена, происходит синтез мочевины и
нейтрализация многих ядовитых веществ. Помимо этого, функция печени
выражается в выделении в двенадцатиперстную кишку секрета – жёлчи.
Также печени приписывается и значение железы внутренней секреции, вырабатывающей гормоны, которые выделяются в кровь, оттекающую через печёночные вены [2, 13, 96,120].
Данный орган обладает большими функциональными способностями,
многие повреждения его переносятся без нарушения функции или клинических проявлений. Главным образом, это происходит благодаря замечательной регенеративной способности ткани печени, в основном при гиперплазии
гепатоцитов [22, 74, 84].
Печень необходима для поддержания полноценного функционирования
организма. Она принимает участие практически во всех биохимических процессах организма, поддерживая в нем баланс обменных процессов (гомеостаза). В связи с многочисленными функциями печени и её расположением относительно других органов она чаще подвергается негативному влиянию
различных факторов, что приводит к развитию патологических процессов и
метаболическим нарушениям в организме. В литературе последнего десяти8
летия проблемам нарушения функции печени у животных уделено большое
внимание [101].
Структурными компонентами печени являются паренхиматозные клетки (гепатоциты), эпителий желчных протоков, клетки ретикулоэндотелиальной системы (РЭС), соединительная ткань. Соединительная ткань формирует
капсулу печени и её нет среди упорядоченных в дольчатую структуру гепатоцитов.
Первичная структурная единица печени – гепатоциты, они составляют
более 60% всей массы органа. 20% паренхимы печени составляют эндотелиальные клетки. Оставшиеся 20% занимает интерстиций (клетки протоков, соединительной ткани и пр.). Основа структуры печени – долька, формирующаяся из гепатоцитов. В центре дольки – центральная вена, являющаяся частью системы печёночной вены. От центральной вены к периферии дольки
располагаются гепатоциты, образующие балки. По периметру дольки расположены портальные тракты, в которых выделяются разветвления воротной
вены, печёночной артерии и желчных протоков. Печень имеет сегментарную
структуру, в ней есть собственная система крово- и лимфотока, оттока желчи
и иннервации [10, 111].
Немаловажная роль отводится печени в регуляции белкового обмена. В
гепатоцитах происходит синтез, расщепление и перестройка белков и аминокислот, а также утилизация продуктов их обмена. Печень синтезирует более
половины клеточных и сывороточных белков организма, в том числе 100%
альбуминов, 75-90% α-глобулинов, 50% β-глобулинов; белки, участвующие в
свертывании крови – фибриноген, протромбин, акцелерин, антигемофилические глобулины; компоненты противосвёртывающей системы (гепарин) [38,
39].
Одним из важнейших процессов, происходящих в печени, можно считать обмен аминокислот. В печени синтезируются различные аминокислоты,
необходимые для обновления тканевых белков, и имеется множество ферментов, осуществляющих преобразования с аминокислотами. Весьма показа9
тельно, что в печени происходит не только синтез аминокислот, но и регулируется постоянство их состава.
В плазмоцитах, ретикулярных клетках печени, а также в купферовских
клетках синтезируется γ-глобулин. Помимо белков в чистом виде, в печени
происходит синтез белковых комплексов гликопротеидов, липопротеидов,
церулоплазмина, трансферрина [8, 66, 67].
При больших затратах энергии в гепатоцитах осуществляется синтез
мочевины из аммиака (орнитиновый цикл), которая экскретируется почками
в мочу.
Печень также принимает участие в липидном обмене. Содержащиеся в
корме жиры в двенадцатиперстной кишке под воздействием желчных кислот
(холевой, литохолевой, дезоксихолевой) и липазы эмульгируются и расщепляются до жирных кислот и глицерина. Полученные продукты частично
участвуют в синтезе жира и фосфолипидов в кишечной стенке, а частично
всасываются в кровь. В печень по воротной вене поступают синтезированный в кишечной стенке жир, жирные кислоты и глицерин, и под воздействием ферментов жир расщепляется до жирных кислот и глицерина. Часть жирных кислот тратится на синтез необходимых для организма липидов, часть
окисляется с выделением энергии. При полном окислении в цикле Кребса
образуются конечные продукты СО2 и Н2О, а при неполном – кетоновые тела: β-оксимасляная кислота, ацетоуксусная кислота и ацетон.
Гепатоциты синтезируют фосфолипиды, нейтральные жиры и холестерин, ненасыщенные жирные кислоты превращают в насыщенные.
Холестерин в печени расщепляется с образованием стероидных гормонов, желчных кислот и витамина D. Желчные кислоты и свободный холестерин экскретируются желчью в двенадцатиперстную кишку. Часть холестерина из двенадцатиперстной кишки всасывается в кровь и поступает обратно в
печень [58].
Изменение содержания холестерина, его концентрации довольно чётко
связано с функциональным состоянием печени. При большинстве функцио10
нально компенсированных заболеваний печени до развития печёночной недостаточности наблюдается повышение содержания холестерина, в то время
как при печёночной недостаточности его содержание падает. Состояние холестеринового обмена имеет прямое отношение к образованию камней, развитию желчнокаменной болезни. Как показали последние исследования,
практически все камни билиарной системы на 95% состоят из холестерина и
только 5% составляют желчные кислоты и некоторые другие соли. Следовательно, развитие желчнокаменной болезни тесно связано с нарушением липидного обмена [55, 56, 75].
Одна из важных функций печени – регуляция углеводного обмена.
Обычно состояние углеводного обмена в норме и при патологических состояниях ассоциируется с заболеваниями поджелудочной железы, однако печень
сохраняет за собой все ключевые позиции в обмене углеводов.
Глюкоза – один из важных источников энергии. С обменом глюкозы
связано образование основного источника энергии – АТФ и глюкуроновой
кислоты. Последняя имеет отношение к синтезу гепарина. Печень поглощает
большую часть всосавшихся в кишечнике углеводов. В гепатоцитах галактоза и фруктоза превращаются в глюкозу. Более того, глюкоза синтезируется из
некоторых аминокислот, молочной и пировиноградной кислот. Благодаря печени сохраняется стабильность гликемии. Уже давно известно, что удаление
печени влечет за собой гибель животного не в состоянии тяжелой печёночной клеточной комы, а тяжелейшей гипогликемии, которая развивается уже
через 3-4 часа после гепатэктомии [11].
Печень обеспечивает синтез и регулирует обмен гликогена. Последний
синтезируется из моносахаридов, поступающих из кишечника. Гликоген является одним из регуляторов уровня сахара в крови, он необходим для сокращения мышц. Большая часть поступающих в печень моносахаридов преобразуется в гликоген. При снижении уровня глюкозы (при выбросе адреналина, глюкагона) в сыворотке крови возможен усиленный распад гликогена,
в результате которого возмещается недостающая глюкоза. Функция печени,
11
связанная с регуляцией углеводного обмена, очень хорошо компенсируется,
поэтому ценность проб, ассоциированных с определением сахара, даже при
различных нагрузках слишком мала для оценки функции печени. Это связано
с тем, что изменения сахарной кривой могут быть вызваны многими причинами: нарушением всасывания глюкозы в кишечнике и в первую очередь поражением поджелудочной железы, поэтому для суждения о функциональном
состоянии печени с привлечением показателей углеводного обмена рекомендуется использовать не глюкозную кривую, а галактозную. В печени синтезируется глюкозо-1-фосфат, недостаточность которого ведёт к развитию галактоземии. Недостаток углеводов приводит к нарушению синтеза белков и
накоплению в клетках кислых продуктов обмена [9, 41, 42, 146].
Печень играет основную роль в утилизации продуктов распада гема через механизмы образования и секреции желчи. Он зависит от поглощения,
конъюгации и аккумулирования желчных пигментов (билирубина) гепатоцитами и экскреции в виде желчи [12, 152, 184].
Билирубин продуцируется из гемоглобиновой фракции гема в ретикулоэндотелиальных клетках, особенно в красной пульпе селезенки. Он является жирорастворимым веществом, которое свободно связывается с альбумином плазмы и транспортируется в печень как свободный, или непрямой билирубин. В гепатоците билирубин конъюгирует с глюкуроновой кислотой и
образует водорастворимый глюкуронид, известный как прямой билирубин.
Этот прямой билирубин выделяется в желчь и откладывается в желчном пузыре с солями желчных кислот, холестерином, бикарбонатом, продуктами
химических реакций и водой, а потом выделяется в двенадцатиперстную
кишку [32, 35, 91, 166].
В тонком отделе кишечника основная часть глюкуронида билирубина
преобразовывается энзимами в уробилиноген, окисляясь затем бактериями
до уробилина (стеркобилина), представляющего собой коричневую жидкость. Около 20% уробилиногена резорбцируется из кишечника и повторно
выделяется в желчь. Некоторая часть (20%) уробилиногена после сосудистой
12
транспортировки выделяется в мочу. В норме экскреция небольшого количества прямого билирубина в мочу происходит у собак, но не у кошек [20].
Соли желчных кислот образуются из продуктов холестерина. Основные
соли желчных кислот (холевая и хенодезоксихолевая кислоты) конъюгируют
с солями натрия и калия гликохолевой и таурохолевой кислот в желчном пузыре и накапливаются здесь до тех пор, пока не происходит их выделение
под воздействием вагуса и холецистокинина. Последний, при наличии в кишечнике липидов, выделяется из клеток слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки. Желчные соли обеспечивают необходимую среду для
эмульгирования, а следовательно, и абсорбции жиров корма [119, 136].
Также печень регулирует метаболизм гормонов. Здесь синтезируется
гепарин. Нарушение этого процесса ведёт к нарушению свёртывания крови.
Хотя стероидные гормоны синтезируются не в печени, последняя отвечает за
их инактивацию. Так, наряду с глюкокортикоидами, в печени разрушаются
тироксин, АДГ, альдостерон, эстрогены, инсулин. При поражении печени
может повышаться концентрация этих гормонов. Развивается вторичный гиперальдостеронизм,
уменьшается
экскреция
17-кетостероидов
и
17-
оксикортикостероидов с мочой, увеличиваются содержание и экскреция эстрогенов. Транскортин – транспортный белок, синтезируется в печени. Он
связывает гидрокортизон, а также инактивирует инсулин. При нарушении
функции печени возможно развитие гипогликемии. С печенью связана
надежность синтеза адреналина, норадреналина, дофамина из тирозина. Последний синтезируется в самой печени [132] .
Большое количество витаминов усваиваются организмом животных с
участием печени. Витамины в обмене веществ участвуют в качестве коферментов. В организм они поступают в основном с кормом, а в самом организме синтезируются в крайне незначительных количествах [134]
Желчь эмульгирует жир и таким образом обеспечивает всасывание из
кишечника жирорастворимых витаминов – A, D, E и K. В печени животных
происходит синтез витамина К и первая фаза активации витамина D [81].
13
Водорастворимые витамины в печени фосфорилируются и включаются
в состав коферментов: В1 – в кокарбоксилазу; В2 – в процессы окислительного дезаминирования аминокислот; пантотеновая кислота В3 – в состав коэнзима А; В6 – в коэнзимы ферментов дезаминирования и декарбоксилирования.
Печень служит депо витаминов A, D, C, B1, B2, B6 и B12 [170]. В печени
постоянно находятся в виде запасов железо, медь, цинк, марганец, молибден.
Печень является регулятором их обмена. При патологических процессах запасы микроэлементов в ней резко истощаются и создается большой избыток
их в циркулирующей крови, что, естественно, является предпосылкой для серьёзных расстройств [110].
Ферменты, поступая в организм, проходят метаболизм в первую очередь в печени. Они способны ускорить химические превращения определенных веществ.
По мнению М. Диксона и Э. Уэбба (1982), вопросы гепатологии занимают первое место, так как в печени сосредоточены все обменные и биохимические процессы, а число энзимов, входящих в состав печеночных клеток,
очень велико.
Каждая из объективных структур гепатоцита обладает определенным
характерным набором ферментов. При повреждении гепатоцитов физикохимическая структура их изменяется - от простого изменения клеточной
проницаемости до некроза. При этом меняется активность ферментов, связанных с субклеточными структурами, и в результате усиленного поступления ферментов в кровь наступает гиперферментемия, механизм которой до
сих пор недостаточно ясен [181].
Существует несколько теорий, по-разному объясняющих повышение
активности ферментов в сыворотке крови:
1) некротическая;
2) пермеабильная;
3) синтетическая;
14
4) регенераторная [134].
В сыворотке крови содержится три вида ферментов – внутриклеточные,
секреторные и экскреторные.
Внутриклеточные ферменты участвуют в метаболических процессах,
происходящих внутри клетки. Наличие их в крови здоровых животных связано с физиологическим лизисом старых клеток. Резкое увеличение активности внутриклеточных ферментов при патологии обусловлено повышением
проницаемости мембран, некрозом и лизисом клеток в пораженных органах.
Из указанной группы ферментов диагностическое значение имеет определение
содержания
аспартат-аминотрансферазы
(АсАТ),
аланин-
аминотрансферазы (АлАТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Они содержатся в
клетках печени, почек, поджелудочной железы, сердечной и скелетной
мышц. Отношение АсАТ/АлАТ называется коэффициентом де Ритиса, он колеблется у мелких домашних животных (собаки и кошки) от 0,42 до 0,97 [39].
Аланин-аминотрансфераза
(АлАТ)
и
аспартат-аминотрансфераза
(АсАТ) – ферменты, участвующие в обмене аминокислот. Самое большое
количество АлАТ содержится в гепатоцитах. Это определяет важное диагностическое значение активности данного фермента при заболеваниях печени.
Часто повышение активности АлАТ происходит значительно раньше, чем
появляются клинические признаки болезни. АлАТ повышается при острых и
хронических гепатитах, жировом гепатозе, холестазе [29, 30].
Максимальное количество АсАТ находится в клетках сердца и печени.
Это применяется при диагностике заболеваний данных органов. Содержание
АсАТ резко увеличивается при миокардитах, миокардозах, инфаркте миокарда, травмах скелетной мускулатуры, при остром и хроническом гепатитах,
холестазе, токсикозах. Коэффициент де Ритиса при болезнях сердца увеличивается, а при острой патологии печени снижается [21,116].
Активность ферментов АлАТ и АсАТ опускается ниже физиологических значений встречается только при очень тяжёлых поражениях печени
15
(некроз, цирроз), при которых резко уменьшается количество клеток, синтезирующих эти ферменты.
Лактатдегидрогеназа (ДДГ) – это фермент, участвующий в одном из
конечных этапов превращения глюкозы. Находится в клетках разных органов
и тканей, содержится в организме в форме 5 изоферментов – ЛДГ1, ЛДГ2,
ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5. Увеличение активности ЛДГ1 и ЛДГ2 происходит при поражениях сердечной мышцы, а ЛДГ5 – при болезнях печени и повреждении
скелетной мускулатуры. Повышение активности ЛДГ свидетельствует о гипоксическом состоянии организма [71].
В некоторых случаях диагностическое значение имеет определение активности креатинфосфокиназы (КФК), γ-глутамилтрансферазы (ГТГ).
Креатинфосфокиназа (КФК) – фермент, участвующий в реакциях энергообразования. Наибольшее его количество содержится в сердечной и скелетной мускулатуре. Повышение активности КФК регистрируют при миокардите, миокардиодистрофии, инфаркте миокарда, аритмиях, при интенсивной мышечной нагрузке, прогрессирующей мышечной дистрофии, нарушении мозгового кровообращения [80].
γ-глутамилтрансфераза (ГГТ) – фермент, участвующий в метаболизме
аминокислот и пептидов. Определение его активности может быть использовано при диагностике заболеваний печени желчевыводящих путей [89].
Секреторные ферменты гепатоциты выделяют в кровь. Они отражают
функциональную активность печени. В частности, холинэстераза (псевдохолинэстераза, ХЭ) характеризует эффективность синтеза.
Концентрация ХЭ снижается при гепатитах, циррозе, застойных явлениях и злокачественных опухолях печени. Повышение активности ХЭ
наблюдается при сахарном диабете и нефрозе.
Экскреторные ферменты выводятся из организма с экскретами. Из них
диагностическое значение имеют α-амилаза и щелочная фосфатаза [156].
α-амилаза – это фермент, участвующий в расщеплении гликогена,
крахмала и ряда других углеводов. Образуется в поджелудочной железе,
16
слюнных железах. При заболевании этих органов чаще всего регистрируют
повышение активности амилазы. Снижение активности амилазы в крови ниже физиологических значений отмечают при длительном голодании, при замещении паренхиматозных клеток поджелудочной железы соединительной
тканью (фиброз), при атрофии поджелудочной железы.
Щелочная фосфатаза (ЩФ) – это фермент, участвующий в реакциях
обмена ионов фосфорной кислоты. ЩФ содержится в стенках желчных протоков печени, костях, почках, слизистой оболочке кишечника. Активность
ЩФ возрастает при нарушении оттока желчи из печени, при поражении почек злокачественными опухолями. Повышение активности ЩФ также характерно для некоторых поражений костей, таких как остеосаркомы, остеодистрофии, рахита, деформирующего остита. При репаративной регенерации
костных переломов активность ЩФ повышается на стадии пролиферации
остеобластов. Снижение активности ЩФ регистрируют при гипотиреозе,
накоплении радионуклидов в кости, уменьшении уровня фосфора [29].
Исходя из локализации в организме ферменты подразделяют следующим образом:
– универсально распространенные (ACT, АЛТ, ФДФА и др.), активность их обнаруживается не только в печени, но и в других органах;
– печёночноспецифические (органоспецифические) (СДГ, аргиназа, Ф-1-ФА
и др.), активность которых обнаруживается исключительно в печени [135].
Печень – основной биологический фильтр организма. В ней обезвреживаются токсические вещества, поступающие из внешней среды с кормом,
водой, воздухом и образующиеся в организме в результате физиологических
обменных процессов. Ведущую роль в детоксикации играют мезосомальные
ферменты гепатоцитов – эстеразы, амилазы, фосфотазы, оксидазы, редуктазы, трансферазы и др. [187].
Обезвреживающая функция печени определяется различными процессами обмена веществ. В частности, это обезвреживание токсичного аммиака
происходит путём включения его в синтез безвредных для организма моче17
вины, глютамина и нуклеиновых кислот. К окислительным процессам относится дегидрирование этанола под действием алкогольдегидрогеназы. Образующиеся при этом альдегиды окисляются до карбоновых кислот. Из восстановительных процессов нужно отметить восстановление хлоралгидрата до
трихлорэтилового спирта, который выделяется из организма в виде глюкоронида [190].
Многие лекарственные вещества в печени подвергаются гидролизу.
Большое значение в обезвреживании имеет также конъюгация, ведущая к
инактивированию или повышению растворимости и ускорению выведения
образующихся продуктов. Таким образом, печень как орган, расположенный
на пути крови из кишечника в общую систему кровообращения, является барьером для различных веществ, в числе которых могут быть вредно действующие на организм [142].
1.2 Основные патологии печени
Существует важное различие между состоянием повреждения печени и
печёночной недостаточности. Повреждение печени не обязательно приводит
к клинически протекающему заболеванию. С другой стороны, термин печёночной недостаточности подразумевает серьезную дисфункцию с клиническими проявлениями. Именно сложность и взаимосвязь печеночных функций, наряду со способностью выдерживать повреждения разной тяжести,
становится причиной трудности клинической диагностики заболеваний печени [119].
Cпособность печени к выполнению своих функций нередко снижается
из-за многочисленных веществ, к которым относятся некоторые лекарственные средства, при приеме в высоких, а иногда и в терапевтических дозах, повреждающих орган [160].
С развитием возможностей диагностики болезней внутренних органов
обнаружено, что болезни печени (гепатопатии) встречаются гораздо чаще,
18
чем было принято считать раньше, и многие неопределённые признаки болезней в своей основе имеют гепатоз. Вследствие важности и многообразия
функций печень наделена природной способностью к высокой регенерации.
Поэтому возникающие под воздействием разных факторов патологические
процессы в ней становятся заметны и проявляются клинически только в прогрессирующих стадиях болезни. Например, желтуха, связанная с гепатопатией, безошибочно указывает на тяжелейшее состояние печени.
Гепатопатии – это токсико-воспалительные дегенеративные повреждения клеток паренхимы печени, происходящие под воздействием ряда факторов [16]. Определение гепатопатия в отношении заболеваний печени выбрано
не случайно, так как само по себе разграничение понятий гепатит, гепатоз с
современной точки зрения весьма относительно. Тяжелые острые и хронические болезни печени (жировая дистрофия, инфекционный гепатит, лептоспироз, туберкулез, цирроз, опухоли, лимфоидная инфильтрация печени) вследствие постепенной прогрессирующей дистрофии и гибели гепатоцитов ведут
к развитию хронической печёночной недостаточности, которая в отличие от
острой нарастает неделями, месяцами и осложняется иногда желтухой. Желтуха и гипербилирубинемия возникают в результате дезорганизации структур печени и холестаза в крови, когда почки перестают справляться с выведением избытка желчных пигментов. Нереализованные желчные пигменты –
яд для организма, и их накопление в крови у животного почти всегда предрекает неблагоприятный исход [134].
Основные симптомы, характеризующие гепатопатию:
– диспепсический синдром: вялость, депрессия, анорексия, рвота,
нарушения дефекации;
– желтуха: брадикардия, бурое окрашивание мочи, светло-серые глинистые фекалии, желтушное окрашивание слизистых оболочек, кожный зуд;
– геморрагический синдром: кровоизлияния в кожу и слизистые оболочки, анемия, увеличение времени кровотечения;
19
– синдром портальной гипертонии: увеличение живота в эпигастрии,
асцит, расширение подкожных вен живота;
– гепатолиенальный синдром: увеличение печени, одновременное увеличение селезёнки [114].
Увеличение печени, определяемое рентгенологически, не является
окончательным доказательством нарушением функций органа. В равной степени нельзя сразу делать вывод об отсутствии патологии только по благоприятным результатам исследований проб мочи и крови.
Решающее значение имеют бромсульфалеиновая проба, определение
активности щелочной фосфатазы или оценка проб трансаминаз в динамике
[14].
По степени значимости в этиологии болезни печени В.Н. Митин (2002)
выделяет следующие группы:
1) токсины, поступаемые с пищей (при кормлении пряностями и копчёностями – действие фенолов), и токсины, образующиеся при неполном переваривании пищи при заболевании кишечника;
2) токсические вещества, возникающие при почечной недостаточности;
3) токсические продукты распада белков при больших злокачественных
опухолях, гемолитических процессах и лейкозе;
4) отравление гепатотоксическими веществами;
5) нарушения белкового, углеводного, жирового обменов веществ, сахарный диабет;
6) сердечная недостаточность и недостаточность кровообращения;
7) инфекции (лептоспироз, аденовирусный гепатит);
8) инфестации (токсокароз, анкилостомоз, кокцидиоз, дипилидиоз,
описторхоз);
9) алиментарная белковая недостаточность (при плохом кормлении собак).
В зависимости от длительности и интенсивности воздействия вышеперечисленных факторов развиваются жировая дистрофия, некроз печёночных
20
клеток, воспаление тканей печени, лимфоидная лейкемическая инфильтрация, опухолевая деструкция либо диффузное разрастание соединительной
ткани. Но в условиях практики провести такое разграничение морфологических повреждений невозможно, так как в арсенале ветеринарных врачей ещё
недостаточно специальных методов исследования. Поэтому предполагается
выделять острую и хроническую гепатопатии, хроническую гепатопатию с
холестазом и цирроз печени, что охватывает весь комплекс болезненных
проявлений и в то же время является достаточным разграничением для дифференцированного терапевтического подхода [121].
Гепатит характеризуется альтеративными (дистрофическими, некротическими и атрофическими) изменениями в паренхиме, экссудативными и
пролиферативными изменениями в строме органа, сопровождающееся нарушением его функций. Воспаление печени носит диффузный характер. Одновременно с этим деление заболеваний печени на воспалительные и дистрофические во многом условное. Дистрофические процессы в печени протекают на фоне воспалительной реакции, а течение воспаления коррелирует с
развитием различного вида дистрофий в гепатоцитах [37].
У свиней выделена аутоиммунная нозологическая форма гепатита. Такие поражения печени, по данным Л.М. Пивовара (1987), возникают в результате сенсибилизации организма антигенами печени и характеризуются
иммунным воспалительным процессом, рецидивирующим течением, наличием иммунокомпетентных лимфоцитов и противопеченочных аутоиммуноглобулинов [78].
Этиопатогенетическая классификация гепатитов открывает наиболее
рациональные подходы к лечению. По этиологии гепатиты делятся на:
– инфекционный гепатит (сальмонеллез, клостридиоз, лептоспироз,
аденовироз типа I, герпесвирусная инфекция);
– инвазионный гепатит (бабезиоз, лейшманиоз, токсоплазмоз);
– токсический гепатит, возникающий как следствие отравления (четыреххлористым углеродом, соединениями тяжёлых металлов), применения
21
токсичных препаратов (антибиотиков тетрациклинового ряда, сульфаниламидов, аминазина, фенобарбитала, производных стероидов и др.), а также нередко вследствие воздействия на печень эндотоксинов;
– реактивный гепатит, развивающийся на фоне заболеваний поджелудочной железы, желудочно-кишечного тракта, матки.
Во всех случаях лечение должно быть направлено, прежде всего, на ведущее звено этиопатогенетической цепи печеночных нарушений [133].
Хронический гепатит чаще всего является следствием острого гепатита, однако может развиваться и как самостоятельное заболевание при длительном действии ядовитых веществ. Также возможен переход гепатоза в
хронический гепатит.
Общие патогенетические механизмы – клеточная инфильтрация, белково-углеводная и жировая дистрофии, некроз и лизис клеток печени. Преобладающее звено при остром гепатите – некроз и лизис гепатоцитов, при
хроническом – их дистрофия [128].
Патогенез гепатита находится в зависимости от этиологического фактора, непосредственное воздействие на клетки печени оказывают вирусы
специфического гепатита, возбудитель лептоспироза, которые поселяются и
размножаются в клетках печени, вызывая их дистрофию, некроз и гибель [69,
72].
Другие инфекционные болезни вызывают гепатит через продукты распада тканей, сенсибилизирующих клетки печени.
Негативное воздействие на печень патогенных простейших заключается в том, что пироплазмы, бабезии, нуталлии, размножаясь в эритроцитах,
разрушают их. В результате образуется много свободного билирубина, который не успевает обезвреживаться. Он относится к ядовитым веществам, вызывает гибель печёночных клеток, их аутолиз. Происходит распад самих
простейших с образованием токсических веществ. Возбудители тейляриозов
размножаются не только в лимфатических узлах, но и в печени, вызывая её
воспаление. Кокцидии проникают в эпителиальные клетки кишечника, а у
22
кроликов, кроме того, и в эпителиальные клетки желчных протоков, где проходят цикл своего развития, вызывая гибель клеток печени. Возбудители
токсоплазмоза размножаются в различных органах, включая печень, с теми
же последствиями: Воспаление и некроз клеток печени вызывает возбудитель лейшманиоза собак [137].
В случаях поражения печени гельминтами также может быть вызван
гепатит вследствие механического повреждения тканей печени, аллергизации
её продуктами жизнедеятельности гельминтов. Миграция личинок фасциол в
печени иногда сопровождается заносом в неё из кишечника сальмонелл, кишечной палочки, разнообразных кокков и др. [103].
Токсины патогенных грибов, химические вещества, алкалоиды и другие ядовитые вещества действуют непосредственно на клетки печени, вызывая дистрофию и некроз [73].
Целостность внутридольковых капилляров, междольковых вен и артерий, а также капилляров желчных протоков при гепатите нарушается, что ведет к снижению желчеобразования и желчевыделения, развивается печёночная желтуха.
Поврежденные клетки печени теряют способность синтезировать гликоген, глюкозу, факторы свертывания крови, альбумины, участвовать в реакциях обмена аминокислот, жирных кислот и других продуктов метаболизма,
утилизировать аммиак и другие вредные продукты, конъюгировать билирубин. Снижение барьерной функции печени сопровождается накоплением в
крови и тканях вредных веществ, действующих на почки, сердце и другие органы, вызывая в них дистрофию и даже некрозы.
При гепатите нарушается функция центральной нервной системы, органов пищеварения, сердца, почек и др. [148].
По мнению В.Н. Байматова (1990), в первую очередь в печени расходуется гликоген, так как он используется в процессе детоксикации. Соответственно
в
организме
мобилизуются
резервные
и
компенсаторно-
приспособительные механизмы для восстановления гомеостаза. Это, прежде
23
всего, активация процесса глюконеогенеза и кетогенеза. В крови увеличивается концентрация промежуточных продуктов основного обмена: пировиноградной и молочной кислот, кетоновых тел, аминокислот. Накопление этих
продуктов вызывает «порочный» круг. Перевозбуждение симпатической
нервной системы приводит к ускорению глюконеогенеза. Образовавшийся
ацетон в повышенном количестве является гепатотропным ядом, действует
на гепатоциты.
Гепатит, как правило, возникает после какой-либо инфекционной или
инвазионной болезни, поэтому симптоматика его складывается из признаков
основной болезни.
К общим симптомам относятся: угнетение, снижение или потеря аппетита, жажда, рвота, повышение температуры тела, увеличение объема печени, ее болезненность при пальпации. Явно проявляется синдром паренхиматозной желтухи: диспептические расстройства, зуд кожи, расчесы, интенсивное желтое окрашивание слизистых оболочек и непигментированных участков кожи, повышение в крови уровня свободного билирубина [147].
Отмечают синдром печёночной недостаточности, проявляющийся
нарушением важнейших функций организма – расстройством пищеварения,
плохим усвоением жира, повышенной кровоточивостью, общей интоксикацией, резким угнетением, потерей упитанности, истощением. Селезенка при
гепатите увеличивается.
В крови снижается содержание альбумина и повышается количество
альфа- и бета-глобулинов, концентрация аммиака, холестерина, активность
трансаминазы, уменьшается активность холинэстеразы. Моча при гепатите
темного цвета. У молодняка частыми признаками инфекционного гепатита
являются: конъюнктивит, рахит, понос, увеличение миндалин. Регистрируют
кератит на одном правом или обоих глазах. Нередки судороги и параличи
конечностей [124].
Диагноз ставят на основании данных анамнеза, клинической картины,
лабораторных и патологоанатомических исследований. Нельзя ограничи24
ваться лишь внешними клиническими исследованиями. Для полного представления о функционально-морфологическом состоянии печени необходимо
проводить комплексное исследование, которое включало бы в себя биохимические и прижизненные морфологические исследования.
При лапароскопическом исследовании животных с острым паренхиматозным гепатитом обнаружено, что их печень имеет гладкую, блестящую поверхность с кровоизлияниями, края ее несколько утолщены. Цвет тёмнокоричневый с вишневым оттенком.
При микроскопическом изучении образцов печени, полученных методом биопсии, выявлены клеточная инфильтрация, дистрофия гепатоцитов.
Паренхима органа полиморфна, балочное строение нарушено. Ткань печени
первоначально кровенаполнена. В отдельных дольках центральные вены и
синусоидальные сосуды резко расширены и заполнены элементами крови
[65].
Все вышеуказанные клинические признаки во многом схожи с симптомами, отмечаемыми при ряде других болезнях органов пищеварения, поэтому постановка окончательного диагноза должна вестись на основании лабораторных исследований. У больных животных снижается концентрация гемоглобина в среднем на 15-20%. Число лейкоцитов увеличивается с высокой
степенью достоверности в среднем на 35-40%, в лейкограмме отмечают гиперрегенеративный сдвиг ядра влево в нейтрофильной группе [95].
Более специфичными в диагностике гепатита являются биохимические
тесты крови. Их можно разделить их на следующие группы:
– пробы, направленные на изучение обмена пигментов, белков, углеводов, липидов, витаминов и минералов;
– пробы контроля активности гепатоспецифических ферментов;
– пробы, изучающие детоксикационную функцию;
– пробы анализа экскреторной функции [167].
Исследование пигментного обмена включает определение билирубина
в сыворотке крови, уробилина в моче и стеркобилина в кале. По мнению
25
большинства исследователей, динамика билирубинемии у животных довольно четко отражает фазу и тяжесть болезненного процесса. Содержание билирубина в крови в 2-3 раза выше нормы является признаком билирубинемии
(желтухи). Одновременно с увеличением билирубина в сыворотке происходит повышение концентрации уробилина в моче и стеркобилина в кале [177].
Нарушение белкового обмена при гепатодистрофии сопровождается
гипер- или гипопротеинемией и диспротеинемией. Последнее происходит за
счет увеличения концентрации γ-глобулинов и значительного снижения альбуминов. С целью контроля нарушений углеводного обмена определяют содержание в сыворотке глюкозы и применяют углеводные нагрузки с использованием глюкозы, галактозы, сахарозы.
Из нарушений липидного обмена отмечают липидемию, гиперхолестеринемию, увеличение кетоновых тел и неэстерифицированных жирных кислот. Из изменений в минерально-витаминном обмене наиболее типичным является снижение концентрации жирорастворимых витаминов и нарушение
обмена кальция и фосфора с развитием гипокальцемии и гипофосфатемии
[78, 157].
Гепатозы – общее название болезней печени, характеризующихся дистрофическими изменениями печёночной паренхимы при отсутствии выраженных признаков воспаления. В зависимости от этиологических факторов,
их силы и продолжительности воздействия может преобладать жировая дистрофия – жировой гепатоз, амилоидная дистрофия – амилоидоз печени и другие виды дистрофии. Жировой гепатоз (жировая дистрофия, стеатоз печени)
– заболевание, характеризующееся накоплением триглицеридов в гепатоцитах и нарушением основных функций печени. Различают острый жировой
гепатоз (токсическая дистрофия печени) и хронический жировой гепатоз; последний встречается значительно чаще, чем первый. В условиях интенсификации животноводства жировой гепатоз является наиболее распространенным заболеванием у высокопродуктивных коров, откармливаемого скота, в
26
том числе и у овец. Часто болеют свиньи, пушные звери, собаки, животные
зоопарков. Токсическая дистрофия печени чаще встречается у свиней [149].
Амилоидоз печени регистрируется как вторичное заболевание, характеризующиеся отложением амилоида в печени вследствие хронических инфекций и опухолей. Амилоидоз сопровождается гепатомегалией, нарушением кровообращения в печени и развитием печеночной недостаточности. Диагноз ставится на основании биопсии [85,159].
Основная причина болезни – интоксикация организма. Токсическая
дистрофия печени может развиваться как первичное, так и вторичное заболевание.
Первичная интоксикация может быть вызвана испорченными кормами
(недоброкачественный силос), ядами растительного (алкалоиды, сапонины) и
животного происхождения, односторонним белковым кормление, преобладанием в рационе животных недоброкачественного жома и избыточное содержание его, барды, недостаток в рационе серосодержащих аминокислот (метионина, цистина, холина) [27].
Выделяют две формы дистрофии печени: экзотоксическую, которая является следствием отравления животных ядами минерального и растительного происхождения, и послеродовую.
Одностороннее белковое кормление негативно влияет на обмен веществ, в частности, на накопление гликогена и зависящую от этого устойчивость печеночных клеток, на жирорастворимую функцию печени. Создаются
условия перегрузки паренхимы печени липидами, всосавшимися из кишечника и поступающими из жировых депо организма. В то же время снижается
жизнеспособность печеночных клеток вплоть до появления субмилиарных
очагов некроза.
Как вторичная токсическая дистрофия печени развивается вследствие
острых инфекционных болезней, гастритов, энтеритов, эндометритов, септических процессов [65].
27
Механизм развития жирового гепатоза складывается из двух основных
патогенетических моментов: повышенного поступления в печень и накапливания в гепатоцитах жирных кислот и их предшественников; усиления синтеза триглицеридов в гепатоцитах и снижения скорости их удаления из печени.
Жировой гепатоз наступает в тех случаях, когда поступление жирных
кислот превышает возможности гепатоцитов их метаболизировать и секретировать в кровь в составе триглицеридов. Такое может наблюдаться при ожирении, усиленном липолизе в жировой ткани при кетозе, сахарном диабете,
голодании.
Интенсивное производство жирных кислот и триглицеридов в печени
наблюдается при избыточном потреблении жиров и углеводов, перекорме
животных. Подавление в печени синтеза жирных кислот ведет к повышению
образования триглицеридов. Наряду с этим угнетается образование в печени
липопротеидов – основной транспортной формы триглицеридов из клеток
печени. Поступление в организм гепатропных ядов угнетает синтез апопротеина – белка, входящего в состав липопротеидов, тормозится транспорт
триглицеридов, поэтому они накапливаются в гепатоцитах [94].
Вследствие накопления жира в гепатоцитах происходит пролиферация
звёздчатых эндотолиоцитов, в патологический процесс вовлекаются другие
ткани печени, наступает некроз клеток, который наиболее сильно проявляется при острой токсической дистрофии печени. Дистрофия и некроз печеночных клеток приводят к нарушению желчеобразования и желчевыделения,
белковообразующей, углеводосинтезирующей, барьерной и других функций
печени. Это ведет к расстройству пищеварения, обмену веществ, накоплению
в организме ядовитых продуктов метаболизма и т.д. [124].
Острый жировой гепатоз характеризуется угнетением общего состояния, паренхиматозной желтухой, понижением или отсутствием аппетита.
Температура тела в начале болезни может повышаться на 0,5-1,0оС. Отмечают метеоризм, упорные поносы и запоры, иногда колики, при выраженном
28
токсикозе – печёночную кому. Печень увеличена, мягкой консистенции, малоболезненная, селезенка не увеличена.
В сыворотке крови больных животных понижено содержание глюкозы,
повышены концентрации пировиноградной и молочной кислот, билирубина,
АсАТ, АлАТ, ЛДГ.
Для амилоидной дистрофии характерно исхудание, бледность слизистых оболочек, нарушение пищеварения. Печень увеличенная, гладкая, малоболезненная, селезёнка увеличена, плотной консистенции [38].
При хроническом гепатозе симптомы выражены слабо. Наблюдается
угнетение, общую слабость, уменьшение аппетита, диспепсические явления.
Печень умеренно увеличена, с гладкой поверхностью, болезненная при пальпации и перкуссии. Желтушность слизистых оболочек не проявляется или
очень незначительная. Температура тела нормальная.
Патологоанатомические изменения довольно разнообразны. Они зависят от вида гепатоза, но всегда характеризуются более или менее выраженными дистрофическими изменениями. Процесс может начинаться с периферии печеночной дольки (перилобулярная дистрофия), с центра (центролобулярная дистрофия) или поражается вся печёночная долька (диффузная дистрофия). При сохранении стромы органа эти изменения носят обратимый характер, при тяжелых поражениях может наступить печеночная кома. Если
болезнь протекала длительно, на вскрытии отмечают репаративную регенерацию, фиброз и цирроз органа [53, 97, 105].
Диагноз и дифференциальный диагноз основываются на результатах
клинических, лабораторных, патологоморфологических данных, анализа
кормления животных. Острый жировой гепатоз необходимо отличать от
острого гепатита. При остром гепатите увеличена селезёнка, при гепатозе она
в норме [148].
Жировая инфильтрация печени выявляется с помощью биопсии, но
обычно диагноз устанавливают на основе клинических признаков и исключения других причин. Для большинства пациентов прогноз благоприятный,
29
жировая инфильтрация разрешается, если проводится эффективное лечение
причины заболевания. Но в некоторых случаях заболевание прогрессирует:
развивается стеатогепатит, затем фиброз, снижается функция печени и, в конечном, проявляется цирроз. Причина, по которой это происходит, неизвестна, но можно предположить, что имеется связь с окислительным стрессом.
Острый жировой гепатоз сопровождается тяжёлой печёночной недостаточностью и часто приводит к гибели животных. При хроническом гепатозе, если устранить причины и применить соответствующее лечение, болезнь заканчивается выздоровлением. Острый жировой гепатоз может перейти в хронический, а последний – в цирроз печени [117].
Цирроз печени характеризуется дистрофией и некрозом печёночной паренхимы, сопровождающими её узловой регенерацией паренхимы и диффузным разрастанием соединительной ткани с глубокой перестройкой архитектоники печени. У собак цирроз встречается очень редко, так как животные
обычно не доживают до этого состояния. Развивается он как разрешающая
фаза острых и хронических гепатопатий, но иногда вследствие алиментарной
белковой недостаточности и при застойных явлениях в печени, связанных с
заболеванием сердца [178].
Цирроз представляет собой конечную стадию большинства заболеваний печени. Наиболее частой причиной мелкоузелковой, крупноузелковой и
смешанной форм цирроза являются инфекционные и инвазионные поражения печени.
Первичный билиарный цирроз развивается вследствие аутоиммунного
поражения эпителия внутрипеченочных желчных протоков, приводящего к
их обтурации и развитию внутрипеченочного холестаза. Вторичный билиарный цирроз возникает из-за обтурации желчных протоков вследствие холангита или желчнокаменной болезни. Застойный цирроз печени чаще всего
наблюдают при хронической сердечной недостаточности [129].
Токсины попадают в печень различными путями. Одним из них может
быть воротная вена, когда процесс – атрофический цирроз – локализуется в
30
области конечных разветвлений воротной вены. По периферии печёночных
долек активно разрастается соединительная ткань, в результате чего они
уплотняются и сдавливаются. Давление распространяется и на кровеносные
сосуды, из-за чего ухудшается питание печёночных клеток, происходит их
гибель. Одновременно идёт усиленная инфильтрация образовавшихся дефектов лимфоидными клетками с последующей пролиферацией соединительнотканных элементов во всю толщу дольки [86]. При сильном поражении долей
печени развивается застой крови в системе воротной вены, что и приводит к
возникновению асцита. При общем уплотнении и сморщивании печёночных
долек орган постепенно уменьшается в объёме, наступает атрофия печени.
Эта разновидность цирроза встречается у свиней, кошек, собак, реже у крупного рогатого скота и лошадей. Наряду с асцитом развиваются застойные катары желудочно-кишечного тракта, а иногда воспалительные и язвенные
процессы в нем. Желтуха при данном процессе – не постоянный признак. Её
появление объясняется затруднением оттока желчи через сдавленные ходы
(механическая желтуха) [144].
По мнению Michael D. Willard (1992), воспалительные клетки вызывают гепатоцеллюлярный некроз, который создает пространство, заполняющееся воспалительными клетками. Ответом печени на некроз является производство гепатоцитов и эпителия желчных протоков. Тем не менее, лизосомальные протеазы и свободные радикалы путём воспаления клеток нарушают нормальную печёночную внеклеточную матрицу (ECM) и клеточные
мембраны, вызывая выброс веществ (например, трансформирующий бетафактор роста (TGF-P)), что привлекает коллагенпродуцирующие клетки.
Фиброз вызывает изменения ECM и гепатоциты, производящиеся на ней,
функционально изменяются.
Другим путём проникновения токсинов в печень является печёночная
артерия. В данном случае патологический процесс распространяется и на
междольковую часть стромы органа – наступает гипертрофический цирроз.
Разрастается внутри- и междольковая соединительная ткань, атрофируется
31
паренхима печени. Орган значительно увеличивается в объёме. Эта разновидность цирроза сопровождается механической и паренхиматозной желтухой. Развитие и течение сопутствующих патологических процессов в организме подчиняются тем же закономерностям, что и при атрофическом циррозе [188].
Также токсины могут проникать в междольковые мелкие и крупные
желчные ходы, вследствие чего в них начинает разрастаться соединительная
ткань. Процесс распространяется также на периферию печёночных долек. Изза сужения желчных ходов появляется механическая желтуха.
Общим в происхождении различных форм циррозов является то, что
вне зависимости от причин, вызвавших цирроз, и от путей проникновения
токсических веществ, основным местом, в котором происходят первичные
изменения, является ретикулярная ткань (избирательность действия токсинов
на паренхиму печени или на интерстициальную ткань определяет степень
участия в процессе паренхиматозного или интерстициального фактора) [40].
Глубина нарушений разнообразных функций печени, которая имеет исключительно обширные связи со всеми частями организма, определяет всю
сложность патологического состояния животного при циррозах.
Цирроз печени нельзя рассматривать как единое заболевание, но последствия цирроза в большинстве случаев одни и те же. Наиболее часто
наступает портальная гипертония, появляется асцит и, наконец, печёночная
недостаточность и печёночная кома [144].
Болезнь развивается медленно с симптомами возрастающей печеночной недостаточности. У больных животных отмечается общее угнетение, понижение аппетита, поносы, сменяющиеся запорами, стойкий метеоризм,
кожный зуд, исхудание, признаки полигиповитаминоза. Слизистые оболочки
бледные с желтушным оттенком, в конечной стадии болезни они геморрагичные. Печень при пальпации безболезненна; перкуторные границы ее на
стадии гепатомегалии расширены, при атрофии – сужены. Селезёнка увеличена, безболезненна [83]. Развиваются плохо поддающийся лечению асцит,
32
варикозное расширение вен на груди, животе и в пищеводе. Кровь характеризуется плохим свертыванием, содержание гемоглобина, эритроцитов, лейкоцитов, Т-лимфоцитов снижено, а СОЭ – повышена. В сыворотке крови понижено содержание альбуминов и глюкозы. Содержание билирубина, холестерина, желчных кислот, меди, активность щелочной фосфатазы, АлАТ,
АсАТ повышены. Моча тёмного цвета, при её исследовании отмечают протеинурию, билирубинурию, снижение или полное отсутствие уробилина.
Ультразвуковая структура характеризуется обширными и мелкими
эхопозитивными участками в паренхиме и понижением эхогенности под капсулой, связанное с наличием отечных явлений [185].
Течение болезни длительное. Общее состояние постепенно ухудшается. Нарушение обмена при циррозе печени влечет за собой кахексию и анемию.
Дистрофические, некробиотические повреждения печени и сосудистые
расстройства сопровождаются междольковым и внутридольковым разрастанием ретикулярной, грануляционной и фиброзной тканей различного гистогенеза [93, 106].
Следует отметить большую диагностическую ценность таких методов
исследования, как лапароскопия и биопсия печени. Лапароскопия позволяет
увидеть многие характерные детали: изменение формы, окраски печени и
столь нередкий при циррозах перигепатит. С помощью этого метода не только подтверждается наличие цирроза, но также есть возможность дифференцировать его. Пункционная биопсия печени (особенно прицельная при лапароскопии) уточняет морфологическую форму цирроза [87].
Вследствие огромного функционального резерва печени метаболические и клинические аномалии могут не проявляться вплоть до поздних стадий заболевания, и все это время цирроз называется «компенсированным».
Для диагностики доклинических форм цирроза надежных и простых биохимических методов нет. Потенциально для этого подходят динамические те33
сты оценки функции печени, но для их проведения требуется много времени,
и они не используются в обычных клинических условиях.
Значительный интерес представляет разработка неинвазивных методов
выявления фиброза печени у пациентов с риском цирроза. Это необходимо
для того, чтобы назначить лечение, которое может замедлить или предупредить прогрессирование болезни. Основным методом диагностики является
биопсия, но она инвазивна и сопровождается хотя и низким, но существенным уровнем осложнений и смертности. Кроме того, ее результаты могут
быть отрицательными вследствие ошибки при взятии образца ткани. Таким
образом, сегодня усилия направлены на создание биохимических тестов для
выявления фиброза [168].
Печень – обычное место возникновения метастазов злокачественных
опухолей. По мнению В.Дж. Маршалла, Р.К. Бангерта [2014], первичные
опухоли связны с циррозом и действиями различных канцерогенов, включая
афлатоксины. При постановке диагноза первичной гепатоцеллюлярной карциномы у 70 % пациентов обнаруживается повышенная концентрация
α-фетопротеина в плазме. Этот белок можно считать ценным маркером таких
опухолей, хотя его концентрация может возрастать, обычно в меньшей степени, при остром и хроническом гепатите и при циррозе. Инфильтративные
состояния, сказывающиеся на функции печени, включают лимфомы и амилоидоз.
Первичный рак печени, по современным данным, является следствием
цирроза (у собак до 50-70%), длительного воздействия канцерогенных факторов (афлотоксинов, хлорорганических соединений, фосфорорганических
соединений, производных тяжёлых металлов, циклических углеводородов,
радионуклидов).
Морфологически рак печени у собак обычно протекает в трёх формах:
узловой, солитарной и диффузной [91].
Гистологически опухоли печени собак можно дифференцировать следующим образом:
34
– гепатоцеллюлярные – гепатома и гепатокарцинома;
– холангиокарцинома – рак эпителия желчных проходов;
– гепатохолангиома;
– фиброма и фибросаркома;
– гемангиома и гемангиосаркома.
Вторичные опухоли (метастазы) встречаются гораздо чаще и опосредованы злокачественными новообразованиями органов брюшной полости или
лёгких, молочных желёз и костей.
Развитие опухолей в печени сопровождается увеличением объёма живота, болезненностью печени при пальпации, гепатомегалией и бугристостью, а также развитием симптомов печёночной недостаточности. Первичные опухоли печени метастазируют в лёгкие, брыжеечные лимфатические
узлы, кости, мышцы.
Диагноз ставится на основании рентгенографии, УЗИ, лапароскопии и
биопсии [131].
Патология желчных путей у собак проявляется дискинезией, холециститом, желчнокаменной болезнью и опухолями. Первичные заболевания
желчных протоков протекают долгое время бессимптомно, но вследствие
нарушения выведения желчи может развиться обтурационная желтуха, сопровождающаяся синдромами холемии и ахолии.
Холемия представляет собой комплекс нарушений, обусловленных появлением в крови основных компонентов желчи – желчных кислот, билирубина, холестерина, что сопровождается желтушным окрашиванием кожи и
слизистых оболочек, обесцвечиванием кала и потемнением мочи, кожным
зудом и брадикардией.
Ахолия – симптомокомплекс, развивающийся в результате нарушения
поступления желчи в кишечник и сопровождающийся стеатореей, обесцвечиванием кала, метеоризмом, запорами и геморрагическим синдромом [130].
Дискинезия желчных путей – снижение тонуса, сократимости желчного
пузыря, протоков, сфинктеров билиарной системы. Дискинезия возникает как
35
первично, так и вторично. У собак чаще встречаются вторичные дискинезии
как осложнения при органических поражениях желчных путей, желудка,
двенадцатиперстной кишки, поджелудочной железы, почек и других органов
брюшной полости. При устранении провоцирующих факторов дискинезия
обратима без существенных последствий.
Холецистит – воспаление желчного пузыря, холангит – воспаление
желчных протоков. Эти заболевания чаще развиваются одновременно с преимущественным поражением в одних случаях желчного пузыря, в других –
желчных протоков [145, 169].
Исследования S. Caney, T.J. Gruffyd-Jones (1992) показали, что холангит рассматривается как второе наиболее распространенное заболевание печени у кошек в США после идиопатического печёночного липидоза. В странах, в которых печёночный липидоз встречается реже, таких как Великобритания, холангит может представлять собой наиболее распространенное расстройство печени кошек.
Воспаление может быть острым или хроническим. Первое, по мнению
Hendricks et all (1980), предположительно связано с восходящими инфекциями из кишечника у собак и могут приводить к холестазу и желтухе [178]. Истинное хроническое заболевание встречается у кошек, однако этиология его
не вполне изучена. По всей видимости, кишечный рефлюкс или инфекция не
относятся к основным этиологическим факторам.
В желчные ходы и в желчный пузырь микрофлора проникает из кишечника, реже из печени, куда микробы попадают с током крови или лимфы.
При холецистите и холангите развивается холестаз – застой желчи, изменяются её химические свойства. В стенке желчных протоков и желчного пузыря может возникнуть катаральный, гнойный или смешанный воспалительный
процесс. Нередко холецистит и холангит сочетаются с желчнокаменной болезнью.
У больных животных отмечаются такие клинические признаки, как болезненность в области печени, рвота, диарея, матовость шерстного покрова.
36
У многих больных собак выявляют компоненты дерматологического симптомокомплекса: кожный зуд, кожные сыпи (первичные и/или вторичные),
алопеции – животных [143,171].
У собак, больных холециститом, активность щелочной фосфатазы,
концентрация общего и связанного билирубина повышены, имеется тенденция к снижению содержания альбуминов. Характерно увеличение коэффициента де Ритиса вследствие повышения активности фермента АсАТ.
По результатам ультразвукового сканирования печени больных холециститом регистрируют увеличение размеров желчного пузыря и повышение
эхогенности его стенок. Повышение эхогенности и неоднородность паренхимы свидетельствуют о том, что холецистит проявляется одновременно с гепатитом [180].
При хроническом холецистите отмечают увеличение или уменьшение
размеров желчного пузыря, изменение его формы. Стенки желчного пузыря
утолщены и деформированы [70].
Воспаление желчных путей иногда является фактором, предрасполагающим к образованию камней. Кроме того, патологический процесс может
распространяться на паренхиму печени.
Желчнокаменная болезнь – образование камней в желчном пузыре и
протоках печени, которые затрудняют или полностью препятствуют поступлению желчи в кишечник [108].
Камни в желчном пузыре у собак бывают очень редко, и обнаруживают
их случайно при ревизии органов брюшной полости во время операции.
При неспецифических явлениях: наличие рвоты, слизистого стула, повышение активности щелочной фосфатазы и нормальных значениях трансаминаз, – можно предположить образование камней в желчном пузыре
[173].
Доказательством диагноза служит холецистография. Течение болезни
длительное, бессимптомное [26].
37
При хроническом холецистите в желчном пузыре образуются камни,
что связано с кристаллизацией желчных кислот вследствие нарушения структуры коллоидов желчи.
Клинически желчекаменная болезнь проявляется спазмами желчного
пузыря. При обтурации желчного протока камнями диагностируют механическую желтуху и печеночную колику.
При ультразвуковом исследовании выявляют деформацию желчного
пузыря, утолщение его стенок. В полости желчного пузыря обнаруживают
эхопозитивные участки, дающие эхонегативную «дорожку» [39].
Печень играет центральную роль в метаболизме многих лекарственных препаратов, превращая их в полярные водорастворимые соединения, которые могут выводиться с желчью и мочой. Ферменты, участвующие в этих
процессах, локализованы в гладком эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов. Метаболизм обычно включает два типа реакций: метаболизм 1-й фазы, например, окисление и деметилирование ферментами, сцепленными с цитохромом Р450; и метаболизм 2-й фазы, при котором метаболиты первой фазы конъюгируются с полярными молекулами, например, с глутатионом или
глюкуроновой кислотой [91, 139].
А.Ю. Барановский (2013) представил в виде таблицы спектр поражения
печени лекарственными препаратами (таблица 1).
Таблица 1 - Виды лекарственных поражений печени
Морфологическое повре-
Примеры препаратов
ждение
1
2
Парацетамол, дисульфирам, изониазид, галотан, индомета-
Острый гепатит (в том цин, фенитоин, сульфаниламиды, дапсон, диклофенак, фиачисле фульминантная пе- луридин, кетоконазол, флуконазол, метилдофа, никотиновая
чёночная недостаточностъ) кислота, нитрофурантоин, пропилтаоурация, 1 вальпроевая
кислота, флутамид
Холестаз без гепатита
Пероральные контрацептивы, анаболические стероиды
38
Окончание таблицы 1
1
2
Аминазин, ингибиторы АПФ, амиодарон, пропафенон, дикло-
Паренхиматозно-
фенак, противоопухолевые препараты, симвастатин, ранитидин,
канальцевый холестаз
тиабендазол, клавулановая кислота, эритромицин, пенициллины
Аллопуринол, дапсон, диазепам, дилтиазем, гидралазин, пени-
Гранулематозный гепатит
циллин, фенилбутазон, фенитоин, хинидин, прокаинамид, сульфаниламиды
Стеатоз макровезикулярный
Глюкокортикоиды, L-аспарагиназа, метотрексат, моноциклин,
нифедипин, полное парентеральное питание
Амиодарон, ацетилсалициловая кислота, толметин, азидотимидин, диданозин, фиалуридин, пироксикам, вальпроевая кислота,
Стеатоз микровезикулярный тетрациклины, изониазид, тиклопидин, гидразин, аминептин,
тианептин, пергексилин, желчные кислоты, оротовая кислота,
препараты ниацина, синтетические эстрогены
Метилдофа, изониазид, метотрексат, витамин А, циклофосфа-
Фиброз/цирроз
мид, азатиоприн, изониазид
Фосфолипидоз
Амиодарон, кетаназол, пергексилен, дилтиазем, нифедипин
Деструктивный холангит
Аминазин, галоперидол, прохлорперазин
Склерозирующий холангит 5-фтордезоксиуридин, 5-фторурацил
Веноокклюзионная болезнь
Азатиоприн, бусульфан, циклофосфамид, мелфалан, тиотеф,
этопозид, алкалоиды пирролизидина
Оральные контрацептивы, тамоксифен, андрогены, даназон,
Пелиоз печени
иногда азитроприн, анаболические и андрогенные стероиды,
гидроксимочевина
Синдром Бадда-Киари
Очаговая
нодулярная
Эстрогены (оральные контрацептивы)
ги-
перплазия/аденома
Гепатоцеллюлярная карцинома
Эстрогены (оральные контрацептивы)
Анаболические и андрогенные стероиды
Холангокарцинома
Торостраст
Гепатобластома
Эстрогены
Ангиосаркома
Мышьяк, винилхлорид, торотраст
39
1.3
Современные гепатопротекторы, применяемые в ветеринарии
Обычные препараты, используемые при лечении болезней печени, являются иногда малоэффективными и могут иметь серьёзные побочные эффекты. Следовательно, необходимы альтернативные препараты для лечения
заболеваний печени, способные заменить использующиеся в настоящее время вещества сомнительной эффективности и безопасности [175].
Гепатопротекторные средства призваны повышать устойчивость печени к патологическим воздействиям, усиливать ее обезвреживающую функцию, стимулируя активность её ферментных систем (в том числе цитохрома
Р450 и других микросомальных ферментов), и способствовать восстановлению ее функционирования при различных повреждениях (включая алкогольную интоксикацию) [165, 179].
По М.Д. Машковскому (2012), гепатопротекторный эффект в той или
иной степени могут проявлять различные фармакологические средства,
улучшающие метаболические процессы в организме, – витамины, препараты,
ингибирующие перекисное окисление липидов, а также оказывающие антигипоксическое действие, эссенциале, дипромоний, аминокислоты (метионин,
орнитин и т.п.), липоевая кислота, липамид и т.д.
В качестве специальных гeпатопротекторных средств внедрены в практику некоторые суммарные препараты флавоноидной структуры (силибинин,
силибор, катерген), близкие по структуре к витаминам группы Р (рутин,
кверцетин), и препараты из лекарственных растений (лив-52, валилив и др.).
Особое значение имеют гепатопротекторы в комплексной терапии инфекционных заболеваний печени (в сочетании с противовирусными, антибактериальными и иммуностимулирующими средствами).
Препараты аминокислот
Адеметионин (Ademetionin; гептрал) – биогенное вещество; предшественник цистеина, глутатиона; участвует в процессах трансметилирования.
Предшественник полиаминов: путресцина, который стимулирует регенера40
цию клеток, пролиферацию гепатоцитов, спермидина и спермина, входящих
в структуру рибосом [123].
Адеметионин (S-аденозил-L-метионин) – природное вещество, эндогенно синтезируемое из метионина и аденозина. Адеметионин участвует по
крайней мере в 3 типах биохимических реакций: трансметилировании, транссульфурировании и синтезе полиаминов.
Оказывает детоксикационное, регенерирующее, антиоксидантное, антифиброзирующее, гепатопротекторное и нейропротекторное действие. Препарат назначают внутрь, вводят внутримышечно или внутривенно при циррозе, токсических поражениях печени [88].
Реакции трансметилирования являются важным этапом синтеза фосфолипидов (в первую очередь фосфатидилхолина), обеспечивающих текучесть
мембран и их поляризацию, которая играет важную роль в синтезе желчи.
Нарушение транссульфурирования приводит к дефициту глутатиона – важнейшего клеточного антиоксиданта. Недостаток глутатиона снижает устойчивость гепатоцитов к повреждающему действию свободных радикалов.
Помимо этого адеметионин служит предшественником других тиоловых соединений, таких как цистеин, таурин, коэнзим А. Наконец, третья
группа реакций, в которой принимает участие адеметионин, – синтез полиаминов – имеет непосредственное отношение к процессам пролиферации гепатоцитов и регенерации печени [154].
Экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что
адеметионин оказывает антиоксидантное, детоксицирующее действие, ускоряет регенерацию печеночной ткани и замедляет развитие фиброза. На фоне
его применения у больных циррозом отмечено повышение исходно сниженных концентраций глутатиона, цистеина и таурина в сыворотке и ткани печени, что свидетельствует о нормализации метаболических процессов.
Известно, что основной токсический продукт метаболизма этанола –
ацетальдегид – блокирует систему восстановления глутатиона, что обусловливает повреждение гепатоцитов продуктами перекисного окисления липи41
дов. Адеметионин, являясь донором сульфгидрильной группы, способствует
ликвидации дефицита глутатиона [57].
Кроме того, адеметионин обладает антидепрессивной активностью, активирует обмен моноаминов в головном мозге. Отмечено также его болеутоляющее и противовоспалительное действие.
Препарат хорошо всасывается из пищеварительного тракта. Большая
его часть метаболизируется при первом прохождении через печень, в связи с
чем биодоступность его очень низкая. Максимальная концентрация в плазме
крови накапливается через 3-5 ч. Некоторые количества проникают в ЦНС. С
белками плазмы крови адеметионин связывается в незначительной степени.
Большая часть препарата метаболизируется. Менее 16% выделяется в течение первых 48 ч с мочой и около 23% – с экскрементами (за 72 ч).
Гепатопротекторный эффект связан с активацией синтеза мембранных
фосфолипидов (препарат является донатором метальных групп), а также с
образованием из цистеина (метаболит адеметионина) глутатиона, сульфатов
и таурина, обладающих детоксицирующими свойствами (рисунок 1).
Вводят адеметионин внутрь, внутривенно и внутримышечно [140]
Показаниями к применению адеметионина являются лекарственные и
токсические поражения печени, особенно сопровождающиеся внурипечёночным холестазом [43].
Исследуется эффективность препарата при депрессии, дегенеративных
артропатиях, миелопатии [140].
Метионин (Methionine) – незаменимая аминокислота, необходимая для
поддержания роста и азотистого равновесия организма. Содержит метильную
группу, которая участвует в процессе переметилирования. Способствует синтезу холина, за счет чего нормализует синтез фосфолипидов из жиров и
уменьшает отложение в печени нейтрального жира. Метионин участвует
синтезе адреналина, креатина, активирует действие ряда гормонов, ферментов, цианкобаламина, аскорбиновой и фолиевой кислот. Обезвреживает некоторые токсичные вещества путем метилирования.
42
Показаниями к применению метионина является лечение и профилактика заболеваний и токсических поражений печени: цирроз, поражения препаратами мышьяка, хлороформом, бензолом и др. [24].
Рисунок 1 - Схема гепатопротекторного действия адеметионина
Препараты растительного происхождения.
Расторопши пятнистой плодов экстракт (silybi mariani fructuum
extract). Сухой экстракт содержит смесь изомеров (силибинин, силимарин,
силикристин, силидианин). Препарат стабилизирует мембраны гепатоцитов.
обладает антиоксидантной активностью, ингибирует процессы перекисного
43
окисления липидов и препятствует проникновению в клетку ряда гепатотоксических веществ [19].
Препаратами плодов расторопши пятнистой являются близкие по составу и действию препараты, производящиеся в разных странах под различными названиями: Карсил, Легалон, Лепротек, Силимарин, Флавобнон,
Apihepar, Carsil, Dorogan, Duricol, Hepadestal, Laragon, Silarine, Silgen,
Silibancol, Silimarin, Silybln, Silymarin, Silymarol, Somatron и др. [92].
Свойства антиоксиданта и функции регенерации клеток в результате
увеличения синтеза белка рассматриваются как самые важные.
1. Антиоксидантные свойства. Цитозащитные эффекты силимарина
проявляются в основном за счет его антиоксидантных свойств и свойств
очистки свободных радикалов. Силимарин также может взаимодействовать
непосредственно с компонентами клеточной мембраны, чтобы предотвратить
любые отклонения в содержании липидной фракции, ответственной за поддержание нормальной текучести [174].
2. Стимуляция синтеза белка: силимарин может проходить внутрь ядра
и взаимодействовать с РНК-полимеразой, что приводит к повышенному образованию рибосом. Это в свою очередь ускоряет синтез белка и ДНК. Это
имеет важное терапевтическое значение в восстановлении поврежденных гепатоцитов и нормализации функции печени [172].
3. Противовоспалительное действие: тормозящий эффект на 5липоксигеназу, который приводит к ингибированию синтеза лейкотриенов,
является ключевым фармакологическим преимуществом силимарина. Синтез
лейкотриенов (B4) уменьшается, в то время как синтез простагландинов (E2)
не изменяется даже при более высоких концентрациях использования силибинина [189].
4. Антифиброзное действие: фиброз печени может привести к изменению её архитектуры, что в свою очередь приводит к печеночной недостаточности, портальной гипертензии и печеночной энцефалопатии. Эти процессы
включают комплекс взаимодействий клеток и медиаторов. На начальном
44
этапе идет распространение клеток печеночной паренхимы. Превращение
звездчатых клеток печени (HSC) в миофибробласты рассматривается как
центральное звено в фиброгенезе. Силимарин подавляет транскрипционный
фактор NF-κB, а также замедляет активацию HSC.
5. При поражениях печени, связанных с наркотиками и токсинами, силимарин оказывает регулирующее действие на клетку и проницаемость митохондриальных мембран в связи с увеличением стабильности мембран против повреждения ксенобиотиками [54].
Это может предотвратить всасывание токсинов в гепатоциты, а также
ингибировать многие транспортные белки в мембранах. Эти свойства делают
силимарин подходящим препаратом для лечения токсических заболеваний
печени [176].
Показаниями к применению силимарина являются:
– токсические повреждения печени;
– хронический гепатит;
– цирроз печени;
– состояния после инфекционного и токсического гепатитов;
– дистрофия и жировая инфильтрация печени;
– коррекция нарушений липидного обмена [1].
Тыквеол (Tycveolum) – комплексный препарат, содержащий биологически активные вещества, получаемые из тыквы (каротиноиды, токоферолы,
фосфолипиды, стерины, фосфатиды, флавоноиды, витамины В1, В2, С, Р, РР,
F, насыщенные, ненасыщенные и полиненасыщенные жирные кислоты –
пальмитиновая, стеариновая, олеиновая, линолевая, линоленовая, арахидоновая). Препарат оказывает противоязвенное, гепатопротекторное и желчегонное действие. Снижает пролиферацию клеток предстательной железы. При
наружном применении оказывает противомикробное действие.
Показан для приёма внутрь при гепатитах, жировой дистрофии печени;
холецистохолангие, дискинезии желчевыводящих путей, гастриет, язвеннаой
болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, колите, энтероколите, гемор45
рое, атеросклерозе, простатите, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, эрозии шейки матки. Для наружного и местного применения
- при герпесе, дерматите, диатезе, псориазе, экземе, ожогах и ожоговой болезни, пародонтозе [109].
Лив 52 (Liv 52) – комплексный препарат, изготовляемый из соков и отваров ряда растений в виде таблеток и раствора (капель) для приема внутрь.
Состав: экстракты каперсов колючих, цикория обыкновенного, паслена черного, сенны западной, терминалии аржуны, тысячелистника обыкновенного,
тамарикса гальского и железа оксид.
Оказывает гепатопротекторное, антитоксическое, противовоспалитель
ное, желчегонное действие. Улучшает процесс пищеварения; стимулирует
гемопоэз. Гепатопротекторное действие Лив-52 обусловлено антиоксидант
ными и мембраностабилизирующими свойствами входящих в его состав
компонентов. Препарат снижает деградацию клеточных мембран, обусловленную НАДФН-зависимым перекисным окислением липидов, повышает
уровень токоферолов (антиоксидантов) гепатоцитов, предотвращает формирование радикальных дериватов [28].
Антитоксическое действие основано на защите эндоплазматического
ретикулума гепатоцитов от дегенерации. Препарат нормализует и повышает
уровень цитохрома Р450. При повреждениях, вызванных этанолом, увеличивает скорость выведения ацетальдегида. Лив-52 стимулирует биосинтез белков, холестерола и фосфолипидов, способствует восстановлению клеток печени. Каперсы колючие (Capparis spinosa) оказывают гепатостимулирующее
и гепатопротекторное, диуретическое и послабляющее действие, способствуют улучшению аппетита. Цикорий обыкновенный (Cichorium intybus)
оказывает гепатопротекторное и диуретическое действие, потенцирует действие каперсов колючих, тонизирует органы пищеварительной системы.
Паслен черный (Solarium nigrum) вызывает сильный диуретический эффект,
оказывает мягкое послабляющее и гепатопротекторное действие. Сенна западная (Cassia occidentalis) оказывает диуретический и холеретический эф46
фекты, тонизирует органы пищеварительной системы. Терминалия аржуна
(Terminalia arjina) обладает диуретическим действием, оказывает общетонизирующее воздействие на организм. Тысячелистник обыкновенный (Achillea
millefolium) тонизирует органы пищеварительной системы, оказывает ветрогонное действие. Тамарикс гальский (Tamarix gallica) оказывает гепатопротекторное действие. Железа оксид способствует кроветворению.
Показания. Инфекционный и токсический гепатит; хронически активный гепатит; начальные стадии цирроза печени; жировой гепатоз; профилактика поражений печени, вызываемых лекарственными препаратами, химическими веществами, алкоголем; анорексия; период реконвалесценции после
тяжелых заболеваний, перенесенных операций, лучевой и химиотерапии [7].
Билигнин (Bi1igninum) - препарат растительного происхождения (из
древесных пород), являющийся модифицированным лигнином (органическое
полимерное соединение, содержащееся в клеточных оболочках и способствующее их одревеснению).
Аморфный порошок от коричневого до тёмно-коричневого цвета с лёгким характерным запахом и нерезко выраженным вяжущим вкусом. Практически нерастворим в воде и спирте [104].
Оказывает гепатопротекторное и умеренное гиполипидемическое действие. При приеме внутрь связывает желчные кислоты в кишечнике, уменьшает их обратное всасывание и способствует их выведению с фекалиями.
Применяют при заболеваниях печени (холестатический гепатит, билиарный цирроз и др.), а также при заболеваниях, связанных с нарушением обмена и повышением содержания желчных кислот и холестерина в организме
[186].
Артишока
экстракт
(Агtichoke
cxtгact) (синонимы:
Хофитол,
Chophyto1, Суnага extract). Артишок (Суnага) – род травянистых растений
семейства сложноцветных (Compositae) со времен античности культивировался и употреблялся в пищу в Средиземноморье. Листья артишока издавна
использовали в народной медицине. В настоящее время созданы стандарти47
зованные препараты экстракта листьев артишока полевого (Cynara arvensis,
или С. scolimus), которые, по некоторым сведениям, обладают желчегонным,
гепатопротекторным, дезинтоксикационным, диуретическим и гиполипидемическим действием. Сведения о действующих началах препаратов артишока противоречивы; имеются указания на то, что ими являются кофеилхинная
кислота, цинарин и ряд флавоноидов [122, 150].
Экстракты листьев артишока используют в комплексной терапии ожирения, дискинезии желчевыводящих путей по гипокинетическому типу, хронических холециститов, различных хронических гепатитов, цирроза печени,
хронического нефрита, хронической почечной недостаточности.
Некоторые заявленные эффекты экстрактов артишока не нашли достоверного подтверждения в широкомасштабных клинических исследованиях. В
частности, полученных сведений не достаточно для доказательства гиполипидемического их действия. Многие препараты артишока в России и за рубежом не имеют статуса лекарственного средства и применяются в качестве
биологически активных добавок к пище [68, 155].
Эссенциальные фосфолипиды
«Эссенциальные» (незаменимые) фосфолипиды играют важную роль в
формировании структуры клеточных мембран. Для понимания механизма их
действия следует учитывать, что все клеточные мембраны имеют типичное
строение и в среднем на 2/3 (мембрана митохондрий – на 92%) состоят из
фосфолипидов, 80-90% которых представлены фосфатидилхолином.
Помимо структурной функции фосфолипиды участвуют в процессах
молекулярного транспорта, делении и дифференцировке клетки, стимулируют активность различных ферментных систем. Различные патогенные факторы, особенно этанол и гепатотоксические вещества, вызывают повреждение
цитоплазматической и митохондриальных мембран гепатоцитов, что закономерно ведет к нарушению внутриклеточного метаболизма и гибели клетки
[182].
48
Физиологические функции «эссенциальных» фосфолипидов заключаются:
– в поддержании нормальной текучести и репарации мембран;
– в антиоксидантном действии;
– в защите митохондриальных и микросомальных ферментов от повреждения;
– в замедлении синтеза коллагена и повышении активности коллагеназы, что проявляется антифиброгическим эффектом.
Важным представляется подавляющее действие «эссенциальных» фосфолипидов на развитие фиброза, продемонстрированное в ряде экспериментальных исследований in vivo и in vitro [57].
Фосфолипиды (диглицериновые фосфолипиды холинфосфорной кислоты, линолевая, линоленовая и другие ненасыщенные жирные кислоты) при
курсовом лечении нормализуют метаболизм и процессы микроциркуляции в
печени, улучшают её детоксицирующую функцию, а также оказывают нормализующее влияние на липидный состав крови [82].
Фосфолипиды выполняют многочисленные функции в организме, среди которых основными являются структурная функция, стимуляция активности ферментных систем, участие в процессах молекулярного транспорта, деления и дифференцировки клетки. Встраиваясь в мембраны поврежденных
гепатоцитов, полиненасыщенные фосфатидилхолины EPL занимают там
большее пространство, чем свойственные организму насыщенные или мононенасыщенные жирные кислоты, и способствуют активации мембранозависимых процессов обмена веществ, обеспечивая одновременно непрерывность
и текучесть мембран [151].
При помощи современных клинических, биохимических, гистологических и электронно-микроскопических методов подтверждено, что при токсическом повреждении печени, вызванном лекарственными средствами и химическими веществами, остром вирусном и хроническом гепатите, жировой
дистрофии и циррозе печени EPL приводят к нормализации структуры мем49
бран и органелл клетки, уменьшению или исчезновению жировой дистрофии
и некроза гепатоцитов и улучшению биохимических показателей функции
печени [127].
Предполагается, что эти эффекты обусловлены уникальной способностью основного компонента EPL (дилинолеоил-фосфатидилхолина) активировать коллагеназу липоцитов. EPL также способствуют увеличению количества клеток, усиливающих продукцию коллагена, и усилению синтеза фосфатидилхолинов [18].
Таким образом, фосфолипиды обладают гепатопротекторным, гипогликемическим, гиполипидемическим действием. Это основные элементы в
структуре клеточной оболочки и митохондрий. Они регулируют липидный и
углеводный обмены, функциональное состояние печени и её детоксикационную функцию, способствуют сохранению и восстановлению структуры гепатоцитов, тормозят формирование соединительной ткани в печени [17].
Эссенциале (Essentiale) – комплексный препарат, в состав которого
входят «эссенциальные» (необходимые) фосфолипиды (EPL)-диглицерино
вые эфиры холинфосфорной кислоты и ненасыщенные жирные кислоты (линолевая – около 70%, линоленовая и олеиновая) вместе с витаминами (пиридоксином, цианокобаламином, никотинамидом, пантатеновой кислотой).
Назначают при гепатитах, дистрофии, циррозе, токсических и связанных с диабетом, алкоголизмом и др. поражениях печени.
Применение препарата положительно влияет на липидный спектр
плазмы крови и показатели перекисного окисления [118].
Фосфоглив (Phosphogliv) – отечественный комплексный препарат, отчасти являющийся аналогом эссенциале. Фосфоглив содержит фосфолипиды
растительного происхождения (из сои) и глицират (натриевую соль глицирризиновой кислоты) из корня солодки.
Фосфолипидный компонент препарата оказывает гепатопротекторное,
а глицирризиновая кислота – противовирусное действие. Фосфолипиды состоят на 80% из фосфатидилхолина – основного структурного элемента кле50
точных и внутриклеточных мембран гепатоцитов. Фосфатидилхолин способен, действуя подобно «мембранному клею», восстанавливать структуру и
функции поврежденных мембран, благодаря чему предотвращает потерю
клетками ферментов и других активных веществ, нормализует белковый, липидный и жировой обмен, восстанавливает детоксицирующую функцию печени, ингибирует формирование соединительной ткани, снижая риск возникновения фиброза и цирроза печени [113].
По некоторым данным, глицират подавляет репродукцию вируса в печени и других органах за счет стимуляции продукции интерферонов, повышения фагоцитоза, увеличения активности естественных киллеров и др.
Фосфоглив применяют внутрь в составе комплексной терапии острых и хронических гепатитов, жирового гепатоза, токсического поражения печени,
цирроза печени. Имеются сведения о благоприятном действии препарата при
псориазе и экземе [77].
Лецитин (Lecitin) представляет собой комплекс фосфолипидов (фосфатидилхолин, фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол), содержащихся в лецитине соевых бобов. Незаменимые фосфолипиды являются компонентами
внешней мембраны клеток печени и необходимы не только для образования,
но и для стабилизации ее биологической структуры и регенерации. При различных заболеваниях печени лецитин уменьшает цитотоксическое действие
лимфоцитов и некроз гепатоцитов. Незаменимые фосфолипиды регулируют
работу клеточных механизмов: ионный обмен, тканевое дыхание, биологическое окисление; способствуют улучшению деятельности дыхательных ферментов в митохондриях, энергетического обмена клеток и нормализуют
нарушенный обмен липидов. Препарат нормализует белковый и жировой обмен, обладает липотропным действием, защищает клеточную структуру печени, восстанавливает иммунные функции лимфоцитов и макрофагов [163,
164].
Показания: жировая дегенерация печени различной этиологии, острый
и хронический гепатит, цирроз печени, печеночная кома, пищевые и лекар51
ственные отравления, токсикоз беременных, алкогольные и лучевые поражения печени, склеротические поражения сосудов. Как дополнительное средство в сочетании с противотуберкулезными препаратами (для защиты печени
от их токсичного действия). Общеукрепляющая терапия [123].
Эссливер форте (Еssliver forte) способствует восстановлению клеточных мембран гепатоцитов, улучшает дезинтоксикационную функцию печени,
тормозит образование в ней соединительной ткани. Нормализует липидный и
жировой обмен, окислительно-восстановительные процессы.
Показания: гепатит (острый, хронический), цирроз печени, интоксикация (алкогольная, наркотическая, лекарственная и др.), псориаз, нарушения
функции печени и липидного обмена, лучевая болезнь
Препараты разных групп
Липоевая кислота (Тиоктацид) – 6,8-дитиооктановая кислота – кофермент, участвующий в окислительном декарбоксилировании пировиноградной
кислоты и α-кетокислот. Улучшает энергетический метаболизм гепатоцитов
[3].
Действие тиоктовой кислоты заключается в нормализации энергетического, углеводного и липидного обменов, а также в регуляции холестеринового метаболизма. Антиоксидантные свойства тиоктовой кислоты связывают
с наличием в ее молекуле тиоловых групп. Она катализирует превращение
молочной кислоты в пировиноградную и ее декарбоксилирование, способствуя ликвидации метаболического ацидоза. Кроме этого, тиоктовая кислота
действует на систему глутатиона и убихинона (Q-энзима), обладает положительным липотропным действием, облегчая перенос ацетата и жирных кислот из цитозоля в матрицу митохондрий для последующего окисления за счет
повышения выработки коэнзима А. Данная кислота подавляет синтез гепатоцитами NO, который в условиях инфекционных и токсических воздействий
образуется в избытке и обладает выраженным цитотоксическим и вазоактивным влиянием [79].
52
Результирующее действие тиоктовой кислоты при заболеваниях печени
сводится к улучшению ее функционирования, снижению повреждающего
воздействия на гепатоциты эндогенных и экзогенных токсинов [33].
Препараты липоевой кислоты выпускаются под такими торговыми
названиями, как альфа-липоевая кислота, липоевая кислота, «Берлитион
300», «Липамид», «Октолипен», «Тиогамма», «Тиоктацид 600Т», «Тиоктацид
БВ», «Тиолепта», «Эспа-Липон».
Урсодеоксихолевая кислота (Ursodeoxycholic acid) – препарат естественной жёлчной кислоты. Оказывает цитопротективное, иммуномодулирующее, желчегонное и холелитическое действие.
Гепатопротективное действие осуществляется за счет стабилизации мембраны гепатоцита. Препарат используют для лечения первичного билиарного
цирроза, первичного склерозирующего холангита, токсических поражениях
печени, алкогольном и неалкогольном стеатогепатите. Благодаря холелитической активности его применяют для растворения камней в желчном пузыре
[90].
Зиксорин (Zixorin) (Флумецинол, Flumecinol, Synklit) – гепатопротектор.
Препарат индуцирует оксидазную ферментативную активность микросом
печени; усиливает образование глюкуронидов, способствует выведению из
организма эндогенных и экзогенных метаболитов, увеличивает выделение
желчи. Препарат на микросомальные ферменты действует относительно избирательно, других выраженных фармакологических эффектов не оказывает.
Способствует регрессии желтухи, особенно в случае ее паренхиматозного
характера. 3иксорин хорошо всасывается при приёме внутрь, метаболизируется в печени, метаболиты выделяются с мочой и калом [98].
Показан при остром гепатите с желтушным синдромом, функциональной гипербилирубинемии, в том числе наследственной (болезнь Жильбера);
желтухе новорожденных; необходимости ускорения биотрансформации алкоголя и некоторых лекарственных средств [34].
53
Дипромоний, Дипромоний М (Dipromonium, Dipromonium М) - Белый
кристаллический порошок горького вкуса. Легко растворим в воде и спирте.
По химической природе и биологической активности дипромоний имеет элементы сходства с пангамовой кислотой. Оказывает липотропное действие, улучшает детоксикационную функцию печени, стимулирует окислительные
процессы,
проявляет
слабую
гипотензивную
и
ганглио
блокирующую активность [76].
Назначают при хронических гепатитах и жировой дистрофии печени,
облитерирующем эндартериите и атеросклерозе сосудов мозга, хронических
заболеваниях легких, а также для уменьшения побочных реакций, связанных
с использованием противотуберкулезных препаратов. Имеются данные о
применении дипромония при рассеянном склерозе [15].
В настоящее время в практической ветеринарии широко применяются
кормовые добавки и препараты, в том числе и гомеопатические, способствующие восстановлению функции печени при различных гепатопатиях. Это гепатовет, лиарсин, ГлютаМакс, гепалон, полифепан, гепавет, гепатоджект,
дюфалайт, гептрал, гепатосан.
Гепатовет разработан ООО «АПИ-САН». Назначают в виде оральной
суспензии при острых и хронических заболеваниях печени различной этиологии, для нормализации функции и регенерации клеток печени после эндои экзотоксикозов, инфекционных заболеваниях, а также для снижения отрицательного влияния препаратов, обладающих гепатотоксичностью.
В состав препарата входят эссенциальные фосфолипиды, флавоноиды,
аминокислоты – метионин и орнитин. Биологически активные вещества, входящие в препарат улучшают функциональное состояние печени, детоксикационную функцию, способствует сохранению и восстановлению структуры
гепатоцитов, нормализует уровень аммиака в организме, ускоряют регенерацию клеток печени.
Назначают гепатовет 2-3- раза в день в течение 3-5 недель, при необходимости курс лечения повторяют через 2-3-недели [63].
54
Инъекционный ветеринарный препарат гепатоджект также разработан ООО «АПИ-САН». В его состав входят аминокислоты (L-орнитина гидрохлорид, L-цитруллин, L- аргинина гидрохлорид, бетаин, сорбитол). Данный препарата обладает мемтранопротекторным, детоксикационным, антиоксидантным, желчегонным и имменомодулирующим действием, избирательной гепатопротекторной активностью [64].
Лиарсин
-
ветеринарный
гомеопатический
препарат
компании
«ХЕЛВЕТ» нормализует обменные процессы в организме, восстанавливает
функцию печени, оказывает неспецифическое иммуностимулирующее действие, улучшает работу желудочно-кишечного тракта. Назначают для профилактики и лечения гепатитов, жировой дистрофии и циррозах печени в виде
инъекций [59, 100].
ГлютаМАкс является кормовой добавкой состоящей из пивных
дрожжей, целлюлозы, диоксида кремния, сухого экстракта куркумы, расторопши и артишока, аминокислот, витаминов группы В, стеарата магнезии.
Применяют в виде таблеток и паст в случаях нарушения метаболизма
при острых и хронических гепатитах, кормовых отравлениях, расстройствах
пищеварения, при инфекционных и паразитических заболеваниях, а также
при антибиотикотерапии [60].
Гепалон – концентрированный экстракт печени крупного рогатого скота, освобождённый от белка. Препарат содержит цианкоболамин и другие
биологически активные вещества. Оказывает благоприятное воздействие при
нарушениях функции печени различной этиологии и обладает антианемическим действием. Назначают его в виде инъекций [62].
Полифепан является энтеросорбентом. Способен связывать и обезвреживать токсические вещества различного происхождения, выводя их из организма, оказывает детоксикационный эффект. Полифепан активно связывается с различными патогенными микроорганизмами или продуктами их жизнедеятельности, которые представляют собой бактериальные, вирусные или
грибковые токсины. Также препарат обладает способностью связывать: ле55
карственные препараты; различные яды; соли тяжелых металлов; радиоактивные изотопы; аммиак; алкоголь и продукты его трансформации; билирубин; холестерин; мочевина; другие метаболиты и аллергенные частицы.
Полифепан является лекарственным средством растительного происхождения, которое получают из гидролизного лигнина. Назначают его в виде
порошка и таблеток [6]
Таким образом, в данной работе обобщены данные о значении печени
для организма, показаны основные заболевания печени, встречающиеся у
животных, и перечислены основные гепатопротекторы, применяемые в современной ветеринарии. Недостатком вышеперечисленных препаратов является длительная терапия животных, соответственно материальные затраты на
лечение тех или иных заболеваний печени значительно повышаются. Также
многие препараты применяются в виде инъекций, что является дополнительных стрессом для животных.
Целью нашей работы является изучение токсикологических параметров, фармакологических свойств и механизма действия нового гепатопротектора Диронакса, а также установление его эффективности при гепатитах у
домашних животных, в частности, у кошек и собак.
56
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Работа выполнена с 2011 по 2014 годы на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет», в институте органической химии Уфимского научного центра РАН, государственном бюджетном учреждении
«Уфимская городская ветеринарная станция», в обществе с ограниченной ответственностью «Базис» (г.Уфа).
Основной объект исследований – субстанция / препарат Диронакс –
диизопропиламмония дихлорацетат, синтезируемый ООО «Базис» (г.Уфа).
Массовую долю основного вещества определяли с помощью метода,
основанного на реакции образования цветного комплекса диизопропиламмония дихлорацетата с бромтимоловым синим. Интенсивность окрашивания
при этом пропорциональна концентрации диизопропиламмония дихлорацетата. Реакция осуществлялась при рН=6,8.
Массовую долю основного вещества в процентах вычисляли по формуле: % = С*10-6*100*50*100/m = 0,5 *C/m, где
С-
количество
диизопропиламмония дихлорацетата, определенное
по калибровочному графику пробы, г.
m - навеска пробы, г.
За результат анализа принимали среднее арифметическое трех параллельных определений, абсолютное расхождение между которыми не превышает допустимое расхождение, равное 1,0%. Допустимая относительная погрешность результатов анализа ±6,5%, при доверительной вероятности 0,05.
Качественное определение Диронакса проводили методом инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье. Измерения в среднем диапазоне порошкообразных образцов выполняли методом прессованием образцов
в таблетки и измерения спектров в режиме пропускания. Исследуемые образцы были сначала измельчены в тонкий порошок, а потом перемешаны с
непоглощающим веществом – KBr. Измельченный и смешанный с KBr обра57
зец помещали прямо в стаканчик для образца, поверхность образца выравнивали и потом вводили в приставку диффузного отражения для измерений.
Изучение стабильности лекарственного препарата Диронакс проведено
на 3 последующих сериях: 040, 041, 042 методом ускоренного старения при
температуре 45С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия по 100 г., 200 г., 300 г.
Определение кристаллической структуры Диронакса было выполнено
методом монокристального рентгеноструктурного анализа (РСтА). Бесцветные пластинчатые монокристаллы диизопропиламмония дихлорацетата были
получены из раствора в термостатированных условиях при 20°С, с точностью
до 0,1 °С при медленном испарении, для чего 0,5 г исследуемого порошка
растворяют в 1 литре дистиллированной воды. Стакан с получившимся раствором устанавливают на место, лишенное вибраций и оставляют для испарения при указанной температуре. В процессе испарения в течение двух месяцев выпадает кристаллический продукт. Когда размер кристаллического
продукта достигает 0,5–1 мм, кристаллы извлекают, промакивают фильтровальной бумагой и помещают в бюкс.
Рентгеноструктурный анализ монокристаллов Диронакса проведён в
Отделении рентгеноструктурных исследований Центра коллективного пользования ЦКП САЦ на базе Лаборатории дифракционных методов исследований ИОФХ им. А.Е.Арбузова КазНЦ РАН.
Кристаллографические характеристики соединения, параметры экспериментов и уточнения структур выполнены на автоматическом рентгеновском дифрактометре Bruker Smart Apex II CCD (MoКα графитовый монохроматор λ 0.71073 Ǻ 293 К). Структура была расшифрована с использованием
программы SHELXS и уточнена методом наименьших квадратов с использованием программы SHELXL. Все неводородные атомы уточнены в анизотропном приближении. Координаты атомов водорода (за исключением, атомов водорода аминогруппы) рассчитаны на основе стереохимических крите58
риев и уточнены по соответствующим моделям «наездника». Координаты
атомов водорода аминогруппы выявлены из разностных карт электронной
плотности и уточнены на заключительных стадиях в изотропном приближении. Сбор, редактирование данных и уточнение параметров элементарной
ячейки выполнены с использованием пакета программ АРЕХ 2. Bce расчеты
произведены с использованием пакета программ WinGX. Анализ межмолекулярных взаимодействий проведен с использованием программы PLATON.
Программа Mercury использовалась для выполнения рисунков.
В лабораторных и экспериментальных опытах было использовано: 36
белых мышей; 316 белых крыс; 8 собак; 8 кошек.
Лабораторные животные содержались в одинаковых зоогигиенических
условиях вивария. Кормление животных проводили согласно суточной потребности лабораторных животных.
Общетоксические свойства Диронакса были изучены и определены в
соответствии с «Методическими указанями по определению токсических
свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве», утверждёнными ГУВ СССР и «Методческими рекомендациями по токсикоэкологической оценке лекарственных средств, применяемых в ветеринарии»,
одобренных секцией отделения ветеринарной медицины РАСХН (1998).
Опыты проводили с соблюдением принципов, изложенных в Европейской Конвенции по защите животных, используемых для экспериментальных
целей.
Перед началом опыта животных взвешивали и рассчитывали количество препарата для каждого животного индивидуально в миллиграммах на 1
кг массы животного. На каждую группу брали не менее 6 животных, подобранных по принципу аналогов. Исследуемый препарат вводили перорально
при помощи ротожелудочного зонда.
Параметры острой токсичности препарата вычислялись с помощью
пробит-анализа по методу Литчфильда и Уилкоксона [8].
59
Значения LD84 и LD16 найденные по характеристической кривой, использовались для вычисления коэффициента вариабельности смертельных
доз, который характеризовали зону токсического действия и вычислялись как
отношение LD84 к LD16.
Изучение субхронической токсичности проводили на белых крысах
массой 170-190 г. в течение 30-ти дней.
Морфологические исследования крови проводили на гематологическом
анализаторе Abacus junior vet, а также общепринятыми методами.
Выведение лейкограммы проводили с помощью окрашивания мазков
по Романовскому-Гимзе.
Биохимические показатели крови (общий белок, глюкоза, холестерин,
билирубин, щелочная фосфатаза, аланин-аминотрансфераза (АлАТ), аспартат-аминотранфераза (АсАТ), определяли на биохимическом и иммуноферментном автоматическом анализаторе ChemWell Combo, и по общепринятым
методам [31].
Исследование влияния препарата Диронакс на изменение массы внутренних органов изучали на беспородных белых крысах со средней живой
массой 170 - 190 г. Были созданы 3 группы: 2 опытные и контрольная (интактная) по 20 животных в каждой группе. Исследуемый препарат ежедневно
вводили перорально в дозе 25мг/кг в течение 30 дней. Животных на 15-е и
30-е сутки декапитировали под наркозом и производили взвешивание внутренних органов.
Влияние на центральную нервную систему препарата Диронакс проводили исследуя ориентировочные реакции и исследовательский рефлекс крыс.
На 30-й день от начала опыта при ежедневном пероральном введении в дозе
25 мг/кг число изучали число вертикальных вставаний, исследуемых отверстий и актов чистки в течение 3 минут.
Влияние препарата Диронакс на функцию почек изучали в течение 30
дней. Для этого были подобраны на крысы средней массой 170-190 г. Исследуемый препарат вводили перорально в эффективной дозе 25 мг/кг.
60
На 30-е сутки эксперимента исследовали влияние препарата на диурез.
Мочу собирали с помощью индивидуальных мочесборников у животных, получивших водную нагрузку: 5 мл на 100 г. массы животного. За 12 часов до
начала опыта животных лишали пищи и воды. Количество мочи измеряли
каждый час в течение трех часов.
Гепатозащитное действие препарата Диронакс изучали на экспериментальных моделях поражения печени четырёххлористым углеродом, парацетамолом и этанолом.
Определение эффективной дозы исследуемой дозы было проведено на
модели острого ССl4 - гепатита на 96 белых беспородных крысах линии
Wistar обоего пола массой 170-200 г. Экспериментальный гепатит воспроизводился путем одно-, двух-, трехдневного внутрибрюшинного введения 50%го раствора ССl4 в дозе 0,4 мл на 100 г. веса крысы.
Диронакс (20, 25, 30 мг/кг) исследовали при пероральном способе введения. Вводили по следующей схеме: каждый день, начиная с первого дня
введения ССl4 (в течение 3 дней) за 1 час до введения гепатотоксина и в течение последующих 25 дней в одно и то же время до кормления животных.
Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени
парацетамолом изучали на 80 крысах линии Wistar обоего пола, массой 170210 г. Лекарственное поражение печени воспроизводили введением парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение двух дней. Изучаемые соединения и препарат сравнения вводили перорально на протяжении 30 дней, начиная с первого дня эксперимента (одновременно с введением гепатотоксина).
Биохимические показатели и желчегонную активность исследовали на 10й,
20й, 30й день эксперимента. Исследуемые соединения вводили в эффективной дозе (25 мг/кг), рассчитанной на модели поражения печени четыреххлористым углеродом. В качестве препарата сравнения использовали Карсил
«Софарма» в дозе 25 мг/кг.
Эффективность Диронакса при экспериментальном поражении печени
этанолом изучали на 80 крысах обоего пола линии Wistar, массой 170-190 г.
61
Экспериментальное повреждение печени у крыс вызывали пероральным введением 40% раствора этанола в дозе 1,2 мл на 100 г массы животного в течение 4 дней. Диронакс и препарат сравнения Карсил «Софарма» по 25 мг/кг
каждый вводили перорально при помощи зонда на протяжении 30 дней с
первого дня эксперимента.
При определении гепатозащитного действия Диронакса на моделях поражения печени четыреххлористым углеродом, парацетамолом и этанолом
определяли и желчегонную активность препарата. Для этого животных
наркотизировали уретаном, фиксировали и вскрывали брюшную полость. Затем определяли место перехода желчного протока в двенадцатиперстную
кишку и производили перевязку участка кишки наложением лигатур с обеих
сторон сфинктера протока. В перевязанный участок кишки вставляли канюлю с закрепленной на другом конце полимерной пробиркой. Желчегонную
активность оценивали по скорости секреции желчи и общему количеству
желчи за 3 часа.
Для гистологических исследований кусочки печени крыс фиксировали
в 10-%-ном водном растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии
спиртов возрастающей концентрации, заливали в парафин по общепринятой
методике. Срезы получали на замораживающем миротоме после депарафинации и окрашивали гематоксилином Майера и эозином, по РомановскомуГимза, Ван Гизону по общепринятым методам.
Микроскопические исследования проводили с использованием светового микроскопа JENAVAL фирмы «CARL ZEISS» (Германия).
Для оценки влияния препарата Диронакс при остром гепатите были
сформированы опытные группы из домашних животных (собаки и кошки),
поступивших в ветеринарную лечебницу. В каждой группе наблюдалось не
менее 8 животных. Анализ крови проводили в день поступления заболевших
животных, а также на 10-й и 20-й дни наблюдения.
Экономическую эффективность устанавливали по «Методике определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий».
62
Результаты проведённых исследований обрабатывали статистически с
применением метода вариационной статистики и проверкой достоверности
результатов с использованием уровня значимости и критерия Стьюдента (Р).
Достоверность различий оценивали при Р≤ 0,05.
63
3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
В настоящее время производство Диронакса (диизопропиламмония дихлорацетата) в Российской Федерации отсутствует. В связи с необходимостью в ветеринарии гепатопротекторного препарата, способного эффективно
лечить гепатопатии при отсутствии побочного действия, возникла острая потребность в его производстве. Обществом с ограниченной ответственностью
«Базис» (г.Уфа) разработана новая технология производства диизопропиламмония дихлорацетата. Препарат был наработан в количестве 5 тонн на
Федеральном казенном предприятии «Авангард» (г.Стерлитамак). В рамках
научного сотрудничества ООО «Базис» и ФГБОУ ВПО Башкирский ГАУ
нами изучались фармако-токсикологические свойства препарата Диронакс.
3.1 Производство Диронакса
3.1.1 Физико-химические свойства Диронакса.
Диронакс (диизопропиламмония дихлорацетат) – белый мелкокристаллический порошок без запаха, горького вкуса, легко растворим в воде и
спирте, трудно растворим в эфире. Применяется как фармакологическое
средство.
Химизм процесса. Основная реакция протекает по схеме:
O
Cl2CH
+
C
OH
CH3
CH3
CH3
O
CH
NH
2
Cl2CH
+
NH2
C
O
CH
CH3
2
при температуре 25-40С в присутствии растворителя и мольном соотношении реагентов ДХУК : ДИПА = 1:1,05. В качестве растворителя используют воду.
Выпаривание растворителя осуществляют при температуре 35-55С и
остаточном давлении 10-50 мм рт. ст.
64
Описание технологического процесса. Основную химическую стадию
проводят в вакуум-гребковой сушилке. После проверки сушилки на герметичность в нее дозируют из мерника расчетное количество воды. Включают
сушилку в работу, подают в рубашку охлаждающую воду. Затем из мерника
дозируют необходимое количество дихлоруксусной кислоты (ДХУК). Для
предотвращения уноса паров на линии воздушки установлен обратный холодильник.
Из мерника, который также имеет обратный холодильник для предотвращения выбросов диизопропиламина (ДИПА) в атмосферу, дозируют
ДИПА в вакуум-гребковую сушилку со скоростью 0,3-0,8 л/мин., при этом
подачей холодной воды в рубашку сушилки (поз.6) обеспечивают минимальную температуру реакции 25-40С. Пары ДИПА из сушилки попадают в обратный холодильник и возвращаются в мерник ДИПА.
По окончании дозирования (около 5 часов) вакуум-гребковую сушилку
переводят в режим отгонки воды и сушки продукта.
Окончание реакции проверяют по наличие щелочной реакции реакционной массы по универсальной лакмусовой бумаге, рН должна быть в пределах 8,0-10,0.
Пары воды из вакуум-гребковой сушилки под действием вакуума, создаваемого вакуумной системой, попадают в циклон, затем конденсируются
в холодильнике и сливаются в емкость. После получения положительных результатов по сушке продукта (продукт должен быть сыпучим, белого цвета)
сухой продукт выгружают из сушилки и направляют на фасовку. При необходимости производят помол сухого продукта.
Собранную конденсированную воду в циклоне возвращают в сушилку.
Собранную отогнанную воду из сборника сливают в канализацию.
65
Дихлоруксусная кислота
Диизопропиламин
Температура 20-25С
Время 1 час
- Δ Н = -1,15 ккал/моль
Вода
Температура 25-40С
Время 5 часов
- Δ Н = -15,70 ккал/моль
Вакуум-выпарка
Температура 35-55С
Р ост. 10 мм рт. ст.
Вода
Очистка при
необходимости
Помол
Фасовка
Диронакс на склад
Рисунок 2 - Блок-схема производства Диронакса:
66
Хлорирование уксусной кислоты в
присутствии трёххлористого фосфора
Разделение хлорированных производных уксусной кислоты
Этерификация дихлоруксусной кислоты этиловым спиртом
Ректификация этилового эфира дихлорацетата кислотой
Гидролиз этилового эфира дихлорацетата
Взаимодействие диизопропиламина с
дихлорацетатом в водной среде
Фильтрация диизопропиламмония
дихлорацетата
Сушка товарного продукта
Размол продукта
Фасовка продукта
Рисунок 3 – Процесс производства Диронакса.
67
3.1.2 Качественное и количественное определение Диронакса
Определение массовой доли Диронакса осуществляли с помощью метода, основанного на реакции образования цветного комплекса диизопропиламмония дихлорацетата с бромтимоловым синим. Интенсивность окрашивания при этом пропорциональна концентрации диизопропиламмония дихлорацетата. Реакция осуществлялась при рН=6,8.
Подготовка к анализу: приготовление буферного раствора. Буферный
раствор готовится из стандарт-титра типа 4 рН=6,8 разряда Ст-рН-04.3 ТУ
2642-004-33813272-2006 (соответствует требованиям ГОСТ 8.153-2004). Для
приготовления используется мерная колба объемом 1 дм3 по ГОСТ 1770-74 и
вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72. В мерную колбу устанавливается
стеклянная воронка с пробойником. Ампулу со стандарт-титром устанавливают на пробойник и пробивают легким постукиванием по другому концу
ампулы. Переворачивают ампулу со стандарт-титром и пробивают второй
конец ампулы. Содержимое ампулы смывают дистиллированной водой в
мерную колбу. Пробойник и воронку смывают. Объем воды должен быть
500-600 см3. Встряхиванием мерной колбы проводят растворение стандарттитра. И только потом доводят объем до метки и перемешивают. Температура должна быть 25° С. Буферный раствор хранят в стеклянной посуде из темного стекла, плотно закрытой. Срок хранения - 4 месяца.
Приготовление раствора бромтимолового синего. Для приготовления
раствора бромтимолового синего взвешивают 100 мг (навеска точная) продукта и количественно переносят в мерную колбу объемом 100 см3. Растворение производят 20%-иым этиловым спиртом.
Стандартный раствор диизопропиламмония дихлорацетата. 100 мг диизопропиламмония дихлорацетата поместить в мерную колбу объемом 100
см3, растворить в дистиллированной воде и довести до метки. 2 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят
68
объем раствора дистиллированной водой до метки. Полученный раствор используется для проведения калибровки.
Приготовление эталонных растворов готовят внесением в делительные
воронки вместимостью 50 см3 0,25, 0,50, 1,00, 1,50, 2,00 см3 стандартного
раствора, что соответствует следующим количествам диизопропиламмония
дихлорацетата в пробах: 5, 10, 20, 30, 40 мкг соответственно. Прибавляют воды дистиллированной 1,75, 1,50, 1,00, 0,50, и 0 см 3, соответственно. Далее в
каждую делительную воронку приливают по 5 см3 буферного раствора и по 1
см3 спиртового раствора бромтимола синего с концентрацией 0,1% массовых.
Затем в каждую делительную коронку прибавляют по 5 см3 хлороформа и
содержимое встряхивают в течение 2 минут. По окончании экстракции отстаивают в течение 5 минут и отделяют хлороформный слой, который спектрофотометрируют при длине волны 409 нм. В качестве раствора сравнения
используют холостую пробу.
Проведение анализа. В колбу с притертой пробкой вместимостью 100
см3 помещают 0,1±0,005 г анализируемой пробы диизопропиламмония дихлорацетата, взвешенной с точностью 0,0002 г, растворяют в дистиллированной воде и доводят до метки. Затем отбирают 2 см3 полученного раствора,
вносят в мерную колбу объемом 100 см3 и доводят до метки. 1 см3 раствора
переносят в делительную воронку объемом 50 см3, добавляют 5 см3 буферного раствора, 1 см3 бромтимола синего и 5 см3 хлороформа.
Встряхиванием в течение 2 минут экстрагируют цветной комплекс диизопропиламмония дихлорацетата и отстаивают в течение 5 минут. Хлороформный слой фотометрируют относительно хлороформного слоя холостой
пробы (без добавления диизопропиламмония дихлорацетата). Обработка результатов. Массовую долю основного вещества в процентах вычисляли по
формуле: % = С*10-6*100*50*100/m = 0,5 *C/m, где
С - количество диизопропиламмония дихлорацетата, определенное по
калибровочному графику пробы, г.
m - навеска пробы, г.
69
За результат анализа принимали среднее арифметическое трёх параллельных определений, абсолютное расхождение между которыми не превышает допустимое расхождение, равное 1,0%. Допустимая относительная погрешность результатов анализа ± 6,5%, при доверительной вероятности 0,05.
По результатам исследований было установлено, что массовая доля основного вещества составила 99,8%.
Качественное определение. Структура Диронакса была подтверждена с
помощью Фурье-спектроскопии (англ. Fourier-transformed spectroscopy) - метода оптической спектроскопии, позволяющего получать спектр в результате
обратного Фурье-преобразования интерферограммы исследуемого излучения, зависящей от оптической разности хода двух лучей и представляющей
собой Фурье-образ спектра (функцию распределения энергии излучения по
частоте). Измерение проводили на приборе Vector-22 фирмы BRUKER.
Измерения в среднем диапазоне порошкообразных образцов выполняли методом прессованием образцов в таблетки и измерения спектров в режиме пропускания. Исследуемые образцы были сначала измельчены в тонкий
порошок, а потом перемешаны с непоглощающим веществом – KBr. Измельченный и смешанный с KBr образец помещали прямо в стаканчик для образца, поверхность образца выравнивали и потом вводили в приставку диффузного отражения для измерений.
Характеристические шкалы спектра Диронакса полностью совпадают
со шкалами стандартного образца диизопропиламмония дихлорацетата,
находящегося в библиотеке прибора (приложение №1), что подтверждает его
структуру.
3.1.3 Изучение стабильности Диронакса
Стабильность (устойчивость) - это фактор качества лекарственных
средств. Критерием стабильности лекарственного вещества служит сохранение его качества, т.е. внешнего вида, растворимости, подлинности, доброка70
чественности и количественного содержания. Снижение количественного содержания фармакологически активного вещества в лекарстве подтверждает
его нестабильность. При этом не должны образовываться токсичные продукты разложения или изменяться физико-химические свойства лекарственного
вещества. Уменьшение количественного содержания лекарственного вещества на 10 % не должно происходить в течение 3 – 4 лет в готовых лекарственных формах.
Сроком годности называют период времени, в течение которого данное
лекарственное средство полностью сохраняет терапевтическую активность,
безвредность и соответствует требованиям качества.
Методы ускоренного хранения (ускоренного старения) позволяют за
15-115 дней при 40-70°С установить сроки хранения, которые, как правило,
совпадают с результатами, полученными при хранении лекарственного вещества при комнатной температуре в течение 3-5 лет. Исследования ведут в
климатических шкафах или комнатах, которые имеют устройства, позволяющие автоматически регулировать заданные условия хранения: температуру,
влажность, свет. Оценку стабильности осуществляют, исследуя физические и
химические изменения лекарственного вещества.
Таким образом, методы ускоренного старения основаны на изучении
кинетики реакций разложения лекарственных веществ. Используя факторы,
ускоряющие химические реакции (температуру, свет, влагу, рН среды, кислород), можно в течение короткого промежутка времени количественно
установить те изменения, которые происходят с лекарственном средстве при
длительном хранении. Из перечисленных факторов чаще всего используют
температуру. На основе полученных результатов устанавливают оптимальные параметры хранения лекарственного средства: температурный режим,
влажность, освещенность, рН среды, характер упаковки и т.д.
Место проведения исследований - научно-производственная лаборатория ООО «Базис».
71
Изучение стабильности лекарственного препарата Диронакс проведено
на 3 последующих сериях: 040, 041, 042 методом ускоренного старения при
температуре 45С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия по 100 г., 200 г., 300 г. В течение всего эксперимента поддерживалось строгое соблюдение температурного режима. Для этого
использовали ультратермостаты, позволяющие поддерживать температуру на
заданном уровне с точностью ±(0,2-1) °С. Свойства препарата изучались
непосредственно перед опытом, затем на 46-е, 91-е, 137-е и 182-е сутки опыта. Стабильность препарата оценивалась визуально (порошок белого цвета),
ИК-спектрометрией и определением массовой доли основного вещества.
Результаты испытания приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Физико-химические показатели Диронакса.
Номер
серии
1
Срок годности
2
3
040
0
0
040
46
0.5
040
1
1.0
040
137
1.5
040
182
2.0
Описание
Подлинность
4
5
Качественные реакции
1. Диизопропиламмония дихлорацетат.
ИК- спектроскопия
ЭкспеИК- спектр поглощения субримент Экспери- Порошок
станции с КВr в области от
при мент при белого цве434 до 4000 см-1, должен
45ºС, 20ºС, год
та
иметь полное совпадение посут.
лос поглощения с полосами
поглощения спектра стандартного образца диизопропиламмония дихлорацетата.
соответствует
соответствует
соответствует
соответствует
соответствует
Количественное
определение диизопропиламмония дихлорацетата %*масс,
препарата
6
подтвержд.
99,7
подтвержд.
99,6
подтвержд.
99,6
подтвержд.
99,5
подтвержд.
99,3
72
1
2
3
041
0
0
041
46
0,5
041
91
1.0
041
137
1.5
041
182
2.0
042
0
0
042
46
0.5
042
91
1.0
042
137
1.5
042
182
2.0
4
соответствует
соответствует
соответствует
соответствует
соответствует
соответствует
соответствует
соответствует
соответствует
соответствует
5
Окончание таблицы 2
6
подтвержд.
99,3
подтвержд.
99,2
подтвержд.
99,2
подтвержд.
99,1
подтвержд.
99,0
подтвержд.
99,2
подтвержд.
99,2
подтвержд.
99,0
подтвержд.
99,0
подтвержд.
89,9
По результатам проведенного исследования можно сделать вывод, что
экспериментальный срок годности Диронакса при 45°С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия составляет 182
суток, что соответствует сроку годности в 2 года при 20° С.
73
3.1.4 Определение кристаллической структуры Диронакса
Нами была изучена кристаллическая структура Диронакса методом монокристального рентгеноструктурного анализа (РСтА).
Бесцветные пластинчатые монокристаллы диизопропиламмония дихлорацетата были получены из раствора в термостатированных условиях при
20°С, с точностью до 0,1 °С при медленном испарении, для чего 0,5 г исследуемого порошка растворяют в 1 литре дистиллированной воды. Стакан с
получившимся раствором устанавливают на место, лишенное вибраций и
оставляют для испарения при указанной температуре. В процессе испарения
в течение двух месяцев выпадает кристаллический продукт. Когда размер
кристаллического продукта достигает 0,5 – 1 мм, кристаллы извлекают, промакивают фильтровальной бумагой и помещают в бюкс.
Рентгеноструктурный анализ монокристаллов диронакса проведён в
Отделении рентгеноструктурных исследований Центра коллективного пользования ЦКП САЦ на базе Лаборатории дифракционных методов исследований ИОФХ им. А.Е.Арбузова КазНЦ РАН.
Кристаллографические характеристики соединения, параметры экспериментов и уточнения структур приведены в таблице 3. Эксперимент выполнен на автоматическом рентгеновском дифрактометре Bruker Smart Apex II
CCD (MoКα графитовый монохроматор λ 0.71073 Ǻ 293 К). Структура была
расшифрована с использованием программы SHELXS и уточнена методом
наименьших квадратов с использованием программы SHELXL. Все неводородные атомы уточнены в анизотропном приближении. Координаты атомов
водорода (за исключением, атомов водорода аминогруппы) рассчитаны на
основе стереохимических критериев и уточнены по соответствующим моделям «наездника». Координаты атомов водорода аминогруппы выявлены из
разностных карт электронной плотности и уточнены на заключительных стадиях в изотропном приближении. Сбор, редактирование данных и уточнение
параметров элементарной ячейки выполнены с использованием пакета про74
грамм АРЕХ 2. Bce расчёты произведены с использованием пакета программ
WinGX. Анализ межмолекулярных взаимодействий проведен с использованием программы PLATON. Программа Mercury использовалась для выполнения рисунков. Геометрия соединения показана на рисунке 1, а некоторые
геометрические характеристики молекул приведены в таблице 3.
Соединение кристаллизуется в виде соли, при этом диизопропиламинный катион, имея собственную симметрию С2, теряет ее в кристалле, так что
анион и катион находятся в общих положениях моноклинной ячейки. Метинные атомы водорода диизопропиламина отклонены от плоскости C-N-C
фрагмента в разные стороны. Длины связей и валентные углы в молекуле соединения в пределах экспериментальных погрешностей близки к соответствующим стандартным значениям.
Таблица 3 - Параметры кристаллов Диронакса и условия
рентгеноструктурного эксперимента.
Соединение, брутто-формула
Молекулярный вес (g/mol)
Сингония
1 Пространственная группа
Z. Z'
Параметры элементарной ячейки
C6H16N, С2НС12O2
230.13
Моноклинная
Р21 / с
4,1
а = 10.157(1) Ǻ
b = 9.076(1) Ǻ
с = 13.843(2) Ǻ
β = 106.262(1)°
Объем, Ǻ3
1225.2(3)
F(000)
488
3
Плотность (выч.), г/см
1.248
Коэффициент поглощения, см-1
5.04
Область измерений по углу θ, град
2.72≤ θ ≤ 28.44
Измерено отражений
13334
Число наблюдаемых независимых отражений с I > 2959
2σ(I) [R(int)]
[R(int) = 0.0217]
Restraints/ parameters
6/149
Значения факторов расходимости,
0.0415/0.1139
R1/wR2 [I > 2σ(I)]
Ri / wR2 .(все данные)
0.0629 0.1297
2
Параметр подгонки (goodness of fit on F )
1.025
Максимальный и минимальный пики, е А -3
0.177 /- 0.270
75
Таблица 4 - Длины связей в молекулах Диронакса
Связь
Длина связи, А
С8-01
1.232(2)
С 8-02
1.213(2)
С8-С7
1.524(2)
C1-N1
1.494(2)
С1-СЗ
1.498(3)
С1-С2
1.511(3)
C4-N1
1.493(2)
С4-С6
1.505(3)
С4-С5
1.509(3)
С7-С11В
1.708(5)
С7-С12А
1.737(5)
С7-С12В
1.761(4)
С7-С11А
1.826(4)
N1-H12
0.83(2)
N1-H11
0.84(2)
0(2)-С(8)-0(1)
127.49 (15)
0(2)-С(8)-С(7)
119.07 (14)
Рисунок 4 - Строение молекул соединения в кристалле и схема нумерации.
76
Супрамолекулярная структура в кристалле Диронакса формируется
главным образом за счет реализации классических водородных связей Н…О
типа. Два атома водорода аминогрупп участвуют в одинаковых водородных
связях с атомами кислорода карбоксильных групп двух симметрически связанных с ней молекул образованием зигзагообразных цепочек молекул вдоль
кристаллографической оси 0b (рис.5).
Параметры взаимодействия N1-H11.О2’
следующие:
d
(N1...02’)
2.755(2) Ǻ, d (H11…О2 l.95(2) Ǻ, angle (N1-H11...02’) 162(l)°, (операция
симметрии х, -1+у, z), взаимодействия N1-H12…О1’’ следующие: d
(N1...О1”) 2.795(2) Ǻ, d (H12...О1) 1.97(2) Ǻ, angle (N1-H12...О1”) 173(1) °, (2х,-1/2+у, 1/2-z). В этом же направлении действуют взаимодействия C-H..О
типа (показаны на рисунке 2 пунктирами) между атомами кислорода и метинным атомом водорода (d (H1...О1) 2.46 Ǻ).
Рисунок 5 - Фрагмент цепочки Н-связанных молекул в кристалле соединения I.
В целом упаковка молекул соединения кристалле характеризуется образованием бислоевых супрамолекулярных структур с внутренними гидрофильными фрагментами молекул и внешними гидрофобными сторонами, состоящими хлорсодержащих фрагментов (рис 6). Причем внутри подобного
бислоя Н-связанные цепочки анионов и катионов плотно упаковываются
вдоль кристаллографического направления 0с, но существенных межмолеку77
лярных взаимодействий (за исключением обычных Ван-дер-ваальсовых)
между цепочками не наблюдается.
Рисунок 6 - Гофрированный слой Н-связанных молекул в кристалле соединения I. Водородные связи показаны пунктиром.
Связывание же бислоев между собой осуществляется за счет взаимодействии Н…С1 типа. Интересно отметить, что, в то время как положения
атомов кислорода карбоксильной группы достаточно хорошо стабилизированы в кристалле за счет указанных водородных связей, атомы хлора открываются разупорядоченными по двум положениям с относительными заселенностями 0.48 и 0.52. Тем не менее, даже в разупорядоченном их положении
наблюдаются взаимодействия H...CI типа с расстояниями между взаимодействующими атомами 2.92 А. Каков характер этой разупорядоченности - динамический или статистический - предстоит выяснить с помощью низкотемпературных экспериментов.
3.2 Токсикологическая оценка Диронакса
Одним из параметров установления активности Диронакса было определение его токсичности, так как её выявление может стать основной причиной токсикозов у животных.
78
3.2.1 Острая токсичность Диронакса
Исследование острой токсичности Диронакса направлено на установление количественных параметров токсичности данного химического соединения, изучение характера его действия и специфического токсического эффекта. Гибель животных после однократного воздействия вещества может
наступить не сразу: сроки смерти зависят от механизма действия вещества,
поэтому в токсикологии принято наблюдать за животными в течение 14 суток.
Острую токсичность Диронакса определяли на мышах массой 18,0 20,0 г, подобранных по принципу аналогов (с учётом возраста, пола, массы
тела и клинического состояния).
Животные содержались при постоянном доступе к воде и пище. Кормление проводили согласно нормам, принятым для лабораторных животных.
Регистрацию гибели животных осуществляли в течение первых суток
после введения препарата, затем наблюдение за животными проводили в течение 14 суток (регистрировали клиническое состояние, характер токсического действия введённого препарата, поведение, двигательную активность,
поедаемость корма и отправление физиологических функций), так как сроки
смерти зависят от механизма действия препарата Диронакс.
Исследуемое вещество вводили внутрь вместе с водой однократно индивидуально по 0,5 мл на мышь в дозах от 1000 мг/кг до 5000 мг/кг. Токсическое воздействие Диронакса оценивали по срокам гибели, числу павших животных, по состоянию и поведению животных
Результаты исследования представлены в таблице 5.
79
Таблица 5 - Острая токсичность Диронакса для белых мышей при
внутрижелудочном введении (n = 6)
№
Доза,
Наблюдаемый
Наблюдаемый эффект,
п/п
мг/кг
эффект (погибшие/выжившие жи-
%
вотные)
1
3000
0
-
2
5000
1/6
16,6
3
5300
2/6
33,3
4
5600
4/6
66,6
4
6000
5/6
83,6
6
7000
6/6
100
1
2
3
4
5
6
В результате проведённых исследований нами установлено, что однократное введение Диронакса в дозе 3000 мг/кг не вызывает изменений клинической картины токсикоза у белых мышей. При увеличении дозы с 5000
мг/кг до 7000 мг/кг массы тела признаки отравления проявлялись через 6-10
часов после введения Диронакса. У животных отмечались судорожные явления (подёргивание лапок, запрокидывание головы), вялость, угнетение.
Смерть наступала через 20-24 часа после введения препарата в токсических
дозах.
Среднесмертельная доза (LD50) препарата составляет для белых мышей
5450 мг/кг (5068÷5784), LD16=5000 мг/кг. LD84=6000 мг/кг.
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено,
что согласно ГОСТ 12.1.007. - 76 Диронакс относится к четвертому классу
опасности (малоопасные вещества).
80
3.2.2 Субхроническая токсичность Диронакса
Субхроническую токсичность Диронакса изучали на 60 белых беспородных крысах массой 160-190 г. в течение 30-ти дней.
Таблица 6 - Влияние Диронакса на периферическую систему крови
крыс при 30-дневном введении.
Лейкоциты, 109 /л
17,00±1,83
Эритроциты, 1012 /л
Интактный контроль
5,38±0,57
Гемоглобин, г/л
105,3±1,69
На 15-й день
16,21±1,75
6,26±0,09
118,6±2,06*
На 30-й день
14,04±0,97
5,9±0,08
95,3±1,09
*– достоверно по отношению к данным интактного контроля (P˂0,05).
Животным ежедневно вводили с помощью зонда в желудок водный
раствор Диронакса в эффективной дозе 25 мг/кг. В начале опыта, через 15 и
30 дней у животных оценивали токсическое действие по следующим параметрам: интегральные показатели (внешний вид, симптомы интоксикации,
прирост массы тела, потребление пищи и воды); на отдельные биохимические показатели крови (уровень белка, холестерина, билирубина, аминотрансфераз: АлАТ, АсАТ); на периферическую кровь (лейкоциты, эритроциты, гемоглобин). Кроме того, проводили макро- и микроскопические исследования внутренних органов.
Показатели морфологического состава крови, ее биохимические параметры не выходили за пределы колебаний физиологической нормы в течение
всего эксперимента. Биохимические показатели крови изменились лишь к 30му дню (таблица 7).
81
Таблица 7 - Влияние Диронакса на биохимические показатели крови
крыс при 30-дневном введении.
Общий,
АлАТмк-
АсАТ,
Щелоч-
Глюко-
Холесте-
Билиру-
МДА,
белок
кат/л
мккат/л
ная
за,
рин,
бин,
мкМоль/
фосфа-
ммоль/
ммоль/л
мкмоль/л
л
таза,
л
2,78±0,25
17,38±1,6
г/л
ед/л
Интактный контроль
53,53±2,
0,81±0,14
38
0,85±0,
6,68±0,4
3,29±3,
09
7
17
3,17±0,09
9
15-й день
48,29±1,
0,62±0,03
44
0,78±0,
5,74±0,4
2,93±0,
2,60±0,10
2,17±0,07
12,99±0,8
03
4
35
*
*
5*
30-й день
47,59±1,
14
0,44±0,05*
0,73±0,
2,99±0,3
3,91±0,
1,54±0,09
1,61±0,06
10,61±1,1
02
2*
22
*
*
6*
* - достоверно по отношению к данным интактного контроля (P ˂ 0,05)
В течение всего эксперимента не отмечали падежа животных. Поведение животных и внешний вид волосяного покрова и кожи на протяжении
эксперимента оставался без изменений.
Весовые коэффициенты внутренних органов животных, получавших
Диронакс, незначительно повысились относительно контрольных животных
лишь к 30-му дню эксперимента (таблица 8).
82
Таблица 8 - Влияние Диронакса на весовые коэффициенты
внутренних органов крыс
Группы
Вес
Весовые коэффициенты органов (мг/100 г)
живот-
крысы,
ных
г
сердце
лёгкие
селезен-
печень
почки
надпочеч-
ка
1
2
3
4
ники
5
6
7
33,53±4,
275,1±19,
57,3±3
1
8
,2
35,02±2,
282,7±10,
56,9±3
7
1
,5
33,31±3,
279,5±13,
55,0±6
5
7
,4
278,8±10,
57,9±4
4
,8
305,4±22,
66,5±2
6
,6
8
Исходные данные
Кон-
171,2±2
троль
,7
Опыт: 1
168,2±3
30,6±2,1
группа
,5
8
Опыт: 2
180,1±0
28,9±1,9
группа
,9
30,9±1,7
97,9±10,7
98,8±5,3
96,7±9,2
2,8±0,4
3,1±0,19
3,3±0,21
15-й день
Кон-
169,4±2
31,4±
99,2±
троль
,1
3,1
1,8
Опыт: 1
166,5±2
42,3±1,7
94,4±10,9
группа
,5
*
Опыт: 2
-
33,9±4,3
-
43,5±4,1
-
-
-
2,9±0,7
3,2±0,3
-
-
группа
30-й день
Контроль
168,1±1
31,5±2,
100,0±1
,6
9
1,7
Опыт: 1
-
-
Опыт: 2
188,4±2
группа
,1
34,5±4,8
280,2±
58,6±4, 2,8±0,9
10,1
2
-
-
-
-
-
38,1±2,
86,5±14,
49,7±4,2
382,5±33,
71,1±5, 12,3±1,5**
1
7
**
3*
6
группа
*
* - достоверно по отношению к контрольной группе (P ˂ 0,02);
** - достоверно по отношению к контрольной группе (P ˂ 0,05);
*** - достоверно по отношению к контрольной группе (P ˂0,001).
1 группа – убой животных на 15-й день;
2 группа – убой животных на 30-й день.
83
В результате проведенных исследований установлено, что Диронакс в
дозе 25 мг/кг при пероральном введении не вызывает значительных изменений морфологических и биохимических показателей периферической крови,
незначительно влиет на массу органов крыс и не вызывает гибели животных.
3.2.3 Влияние Диронакса на функцию почек
Влияние препарата на мочевыделительную систему изучали на 60 белых беспородных крысах массой 160 – 190 г. в течение 30 дней. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом режиме. В
контрольную и опытные группы входили животные одного возраста. Животным ежедневно вводили с помощью зонда в желудок водный раствор Диронакса в эффективной дозе 25 мг/кг. На 30-е сутки эксперимента исследовали
влияние препарата на диурез. Мочу собирали с помощью индивидуальных
мочесборников у животных, получивших водную нагрузку: 5 мл на 100 г.
массы животного. За 12 часов до начала опыта животных лишали пищи и воды. Количество мочи измеряли каждый час в течение трёх часов. Результаты
исследований представлены в таблице
Как видно из таблицы 9, в начале эксперимента уровень выделяемой
мочи практически не отличался у опытных и контрольной группы и составлял 2,7±0,19 мл и 3,03±0,14 мл, соответственно. На 30-е сутки опыта в группе
опытных крыс, получавших Диронакс в дозе 25 мг/кг суммарное количество
мочи за 3 часа составило 3,18±0,14 мл, тогда как в контроле - 2,91±0,19 мл.
Таблица 9 - Влияние препарата Диронакс на диурез крыс (n=6)
Соединение
Доза, мг/кг
Диронакс
25
Контроль
-
Время наблюдения, сут.
исходное
через 30 сут.
исходное
через 30 сут.
Количество мочи, мл
Через 1 час
Через 2 часа
Через
часа
3 Всего
0,77±0,10
1,3±0,20
1,27±0,21
1,12±0,15
1,03±0,15
0,82±0,07
0,68±0,12
1,12±0,14*
0,9±0,10
1,07±0,17
1,1±0,26
0,67±0,14
2,7±0,19
3,18±0,14
3,03±0,14
2,91±0,19
84
* - достоверно по отношению к исходным данным (P˂0,05).
В течение всего эксперимента во всех группах моча была светложёлтого цвета, прозрачная, без примесей и резкого специфического запаха.
Акты мочеиспускания были произвольными и производились в естественной
позе.
Таким образом, согласно данным, приведённым в таблице, диурез у
опытных животных через 30 дней введения соединения аналогичен таковому
у контрольных, что позволяет сделать вывод, что Диронакс не влияет на
функцию почек.
3.2.4 Влияние Диронакса на центральную нервную систему
Для изучения влияния препарата Диронакс на функции центральной
нервной системы крыс был использован тест «Открытое поле» [25], для чего
было сформировано 2 группы животных: опытная, животные которой получали диронакс ежедневно в течение 30 дней в дозе 25 мг/кг, и контрольная.
Через сутки после последнего введения препарата каждое животное
помещали на квадратную площадку, представляющую собой камеру (метр на
метр) с высокими бортами. Пол установки расчерчен на равные сектора (25
штук), предназначенных для визуальной регистрации горизонтальной двигательной активности экспериментальных животных. В местах пересечений
линий секторов в полу имеются отверстия (16 штук), предназначенные для
фиксации исследовательской активности. Площадка освещалась лампой.
В течение 3 минут регистрировали:
- число вертикальных стоек, как показатель неспецифического уровня
возбуждения;
- число исследованных отверстий, отражающих исследовательскую
активность;
- число актов чистки (грумминг), выявляющих эмоциональную активность.
85
Результаты исследования представлены в таблице 10.
Таблица 10 - Влияние Диронакса на центральную нервную систему
крыс (n=6).
Соединение
Доза, мг/кг
Число стоек
Число исследо-
Число актов
ванных отвер-
чистки
стий
Диронакс
25
3,3±0,51
14,2±1,02
1,5±0,51
Контроль
-
3,0±0,85
15,2±1,54
1,0±0,34
Как видно из таблицы 10, после 30-дневного введения Диронакса число
вертикальных стоек, исследуемых отверстий и актов чистки в течение 3 минут были аналогичны как в опытной, так и в контрольной группах, однако
данные статистически недостоверны. Таким образом, длительное применение диронакса не оказывает влияния на функцию центральной нервной системы.
3.2.5 Влияние Диронакса на детоксицирующую активность печени
В ходе проведения эксперимента по исследованию субхронической
токсичности диронакса нами было изучено влияние препарата на функциональную активность печени. Влияние диронакса на продолжительность сна,
вызванного снотворными препаратами, изучали на белых крысах обоего пола
массой 130-140 г. На 21-е сутки эксперимента за 1 час до введения снотворных веществ животным перорально вводили диронакс в дозе 25 мг/кг. Затем
внутрибрюшинно вводили снотворные препараты: раствор гексенала в дозе
80 мг/кг в виде 0,2%-ного раствора, хлоралгидрат в дозе 325 мг/кг и тиопентал в дозе 35 мг/кг.
Эффект снотворных препаратов оценивали по длительности утраты
гравитационного рефлекса. Наступление сна устанавливали по переходу жи86
вотных в боковое положение, время нахождения в котором и принимали за
продолжительность сна. Полученные результаты изложены в таблице 11
Таблица 11 - Влияние Диронакса на продолжительность сна крыс при
применении снотворных препаратов
Группы жи-
Количество жи-
вотных
вотных
Продолжительность сна, мин.
гексеналовый
хлоралгидратовый тиопенталовый
Диронакс
6
29,34,8
53,72,08
83,74,8
Контроль
6
21,11,9
47,51,9
124,07,4
Продолжительность гексеналового и хлоралгидратового сна в опытных
группах была больше, чем у контрольных животных, но разница статистически недостоверна, то есть продолжительность медикаментозного сна опытных животных не отличалась от группы контроля. Продожительность тиопенталового сна в группе опытных животных была достоверно меньше, чем в
контрольной группе.
Таким образом, Диронакс не влияет на продожительность снотворного
действия гексенала и хлоралгидрата и не вызывает угнетения активности печени, но уменьшает продолжительность сна, вызванного тиопенталом.
Уменьшение продолжительности сна, вызванного тиопенталом, может быть
связано с усилением катаболизма препарата печенью под влиянием диронакса.
87
3.3 Гепатопротекторное действие Диронакса
3.3.1 Эффективность Диронакса при экспериментальном
поражении печени четырёххлористым углеродом
Опыты проводились на 96 белых беспородных крысах линии Wistar
обоего пола массой 170-200 г. Животные содержались в условиях вивария с
естественным световым режимом на стандартной диете [ГОСТ Р 50258-92], с
соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных,
используемых для экспериментов или в иных научных целях» [2007] и правил лабораторной практики при проведении доклинических исследований в
РФ [ГОСТ Р 51000.3-96, ГОСТ Р 51000.4-96]. Убой животных проводился согласно требованиям «Международных рекомендаций по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» [2007]. Определение эффективной дозы исследуемой дозы было проведено на модели
острого ССl4 - гепатита, который воспроизводился путем одно-, двух-, трехдневного внутрибрюшинного введения 50%-го раствора ССl4 в дозе 0,4 мл на
100 г. веса крысы [3].
Таблица 12 – Схема эксперимента
Количество животных, взятых в эксперимент
Сроки
убоя
Карсил
Интактный
25 мг/кг
контроль
6
6
6
18
6
6
-
18
6
6
-
Опыт
Контроль
15-й день
18
20-й день
25-й день
Диронакс (20, 25, 30 мг/кг) и Карсил (25 мг/кг) исследовали при пероральном способе введения. Вводили по следующей схеме: каждый день,
начиная с первого дня введения ССl4 (в течение 3 дней) за 1 час до введения
гепатотоксина и в течение последующих 25 дней в одно и то же время до
кормления животных (таблица 12).
88
Лечебное действие Диронакса определяли:
- по биохимическим показателям сыворотки крови крыс – уровню активности аланин- и аспартат – аминотрансфераз сыворотки крови (АЛТ,
АСТ) и по коэффициенту де Ритиса);
- по желчеобразовательной функции печени (определяли общий объем
выделенной желчи в мг на 100 г массы животного за 3 часа).
Как видно из таблицы 13, во всех группах наблюдается повышение
уровня АЛТ и билирубина, а так же понижение коэффициента де Ритиса относительно интактного контроля, что говорит о развитии гепатита после введения четыреххлористого углерода. Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) в
группе, получавшей Диронакс в дозе 25 мг/кг в течение 15 дней, соответствовал величине 0,88 ± 0,071 в группе Карсила – 1,02±0,087, в контроле –
0,69 ± 0,078.
Таблица 13 – Биохимические показатели крови крыс с ССl4индуцированным гепатитом на 15-й день эксперимента
Коэффициент де
Группы
Ритиса
Билирубин
АЛТ, мккат/л
ACT, мккат/л
(АСТ/АЛТ)
Интактный
контроль
Контроль
(гепатит)
Карсил 25
мг/кг
Диронакс 20
мг/кг
Диронакс 25
мг/кг
Диронакс 30
мг/кг
общий,
мкмоль/л
1,18 ±0,08
0,038 ± 0,002
0,045 ± 0,005
5,2 ± 0,48*
0,69 ± 0,078 *
0,055 ±0,004 *
0,038 ±0,005
18,6 ± 1,66
1,02 ±0,087 *
0,0497 ± 0,0063
0,0492 ± 0,003
15,4 ± 1,48
0,865 ±0,078 *** 0,054 ± 0,0024 **
0,047 ± 0,005
16,6 ± 1,67
0,043 ± 0,004 *
15,5 ± 1,39
0,88 ±0,07 ***
0,81 ± 0,043 **
0,050 ±0,0058
0,053 ± 0,0027 ** 0,043 ± 0,003 ****
15,9 ± 1,12
* - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,001);
** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,01);
89
*** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,02);
**** - достоверно по отношению к контрольной группе (p <0,02).
На 20-й день эксперимента во всех группах было выявлено улучшение
биохимических показателей крови, относительно контрольной группы (гепатит). Наиболее положительная динамика выявлена в группах, получавших
Диронакс в дозе 25 мг/кг и Карсил, хотя величина АЛТ во всех группах была
выше нормы в 1,3 раза, что говорит о неполном восстановлении функции печени (таблица 14).
Таблица 14 – Биохимические показатели крови крыс с ССl4индуцированным гепатитом на 20-й день эксперимента
Коэффициент де
Группы
Ритиса
Билирубин
АЛТ, мккат/л
ACT, мккат/л
(АСТ/АЛТ)
Контроль
(гепатит)
Карсил 25
мг/кг
Диронакс 20
мг/кг
Диронакс 25
мг/кг
Диронакс 30
мг/кг
общий,
мкмоль/л
0,782 ± 0,06 ****
0,061± 0,003 **** 0,047 ± 0,003
17,2 ± 1,84
0,81 ±0,05 ****
0,041 ± 0,002 *
10,8 ± 0,94 **
0,825 ± 0,06 ****
0,045 ± 0,0037 *
0,89 ±0,051 ****
0,046 ± 0,0032
0,87 ± 0,06 *
0,049 ±
0,0026
***
0,033 ± 0,002 **
0,0368 ±
0,002 *****
0,041 ±0,0028 **
12,3 ± 1,11
11,2 ± 0,78 *
0,042 ±0,0029 *** 11,5 ± 0,91
*- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,001);
**- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,01);
***- достоверно по отношению к группе карсил (P<0,05);
****- достоверно по отношению к интактным животным (P<0,001);
***** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,01);
****** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,02).
На 25-й день эксперимента также отмечали положительную динамику
во всех группах. В группах, получавших Диронакс в дозе 25 мг/кг и Карсил,
90
биохимические параметры крови достигли пределов физиологической нормы
(таблица 15, рисунок 7). Так, количество общего билирубина составляло 6,1 и
6,2 мкмоль/л соответственно, тогда как в контрольной группе уровень этого
параметра составлял 13,6 мкмол/л.
Таблица 15 – Биохимические показатели крови крыс с ССl4индуцированным гепатитом на 25-й день эксперимента
Коэффициент де
Группы
Ритиса
Билирубин
АЛТ, мккат/л
ACT, мккат/л
(АСТ/АЛТ)
Контроль
0,96 ± 0,043
(гепатит)
****
Карсил 25
мг/кг
Диронакс 20
мг/кг
Диронакс 25
мг/кг
мг/кг
мкмоль/л
0,0528 ± 0,003
0,051 ±0,003 ***
1,06 ±0,068
0,0495 ± 0,005
0,051 ±0,002
0,96 ± 0,089
0,047 ± 0,0026
0,044 ± 0,003
1,01 ±0,12
0,0432 ± 0,0034 * 0,0425 ± 0,003 **
Диронакс 30 0, 95 ±0,08
****
общий,
0,044 ± 0,003
0,041 ±0,0026 *
13,6 ± 1,51 *
6,2 ± 0,42 *
7,9 ± 0,81
6,1 ± 0,51 **
6,4 ± 0,62
*- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,05);
** - достоверно по отношению к группе карсил (P<0,05);
*** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,02);
**** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,05).
После 15-дневного введения Диронакса в ежедневной дозе 25 мг/кг на
фоне токсического гепатита, вызванного ССl4, наблюдали выраженный желчегонный эффект по сравнению с другими группами в среднем в 1,5 раза
(таблица 16).
91
Таблица 16 – Желчеобразовательная функция печени на 15-й день эксперимента.
Группы
Интактный
Контроль
Карсил
Диро-
Диронакс
Диронакс
контроль
(гепатит)
25 мг/кг
накс
25 мг/кг
30 мг/кг
20 мг/кг
Относи-
0,040
0,037
0,0335 ±
0,034
тельная
±0,0031
±0,001
0,0024
±0,0014
Общее ко-
779,0 ±
личество
35,87
619,6
±30,87 ***
0,030
±0,0012 *
0,036 ±
0,002
1204,4
848,7 ±
84,9
масса печени
826,1
±76,3 **
992,5 ±
84,0 *
±72,7
желчи мг
на 100 г за
3 часа
*- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,01);
**- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,05);
*** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,01).
На 20-й день эксперимента,как видно из таблицы 17, желчегонная актиность печени в группах, получавших Диронакс и Красил была значительно
выше относительно группы контроля (гепатит)
Таблица 17 – Желчеобразовательная функция печени на 20-й день эксперимента.
Группы
Относительная масса
печени
Общее количество
желчи мг на 100 г за 3
Контроль
Карсил
Диронакс
Диронакс
Диронакс
(гепатит)
25 мг/кг
20 мг/кг
25 мг/кг
30 мг/кг
0,029
±0,0014 ***
0,020 ±
0,002 *
0,034
±0,0012 **
0,022
0,0312
±0,0022 ****
615,3 ±76,9
924,1
±62,2**
819,7
±72,2
±0,001 *
989,0 ±
85,0 *
838,5
±50,6 **
часа
* - достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,01);
92
** - достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,02);
*** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,01);
**** - достоверно по отношению к группе карсил (P<0,01).
На 25-й день опыта сохранилась прежняя динамика эксперимента. Макимальное количество желчи за 3 часа выявлено в группе, получавшей Диронакс в дозе 25 мг/кг (таблица 18).
Таблица 18 – Желчеобразовательная функция печени на 25-й день эксперимента.
Группы
Контроль
Карсил
Диронакс
Диронакс
Диронакс
(гепатит)
25 мг/кг
20 мг/кг
25 мг/кг
30 мг/кг
Относительная масса
0,028
0,031
0,0336
0,033
0,034 ±
печени
±0,001 ***
±0,002
±0,001 *
±0,001 *
0,002 **
Общее количество
820,2 ±
953,6
842,4 ±
982,5 ±
913,0 ±
желчи мг на 100 г за 3
78,0
±54,32 ****
63,72
66,5 ****
45,8 ****
часа
*- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,01);
**- достоверно по отношению к контрольной группе (P<0,02);
*** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,01);
**** - достоверно по отношению к интактным животным (P<0,05).
93
1,2
1
Контроль
Диронакс 20 мг/кг
Диронакс 25 мг/кг
Диронакс 30 мг/кг
Карсил 25 мг/кг
0,8
0,6
0,4
0,2
0
15-й день 20-й день 25-й день
Рисунок 7 – Динамика изменения коэффициента де Ритиса на модели ССl4индуцированного поражения печени.
В результате изучения гепатозащитного действия Диронакса в различных дозах, мы выявили наиболее эффективную дозу, которая составляет 25
мг/кг. В этой дозе Диронакс обладает выраженным желчегонным эффектом и
способствует восстановлению функции печени уже к 25 дню.
Для гистологической оценки эффективности Диронакса было сформировано пять групп: в I-III группах животным ежесуточно перорально вводили
водный раствор Диронакса в дозе 20, 25 и 30 мг/кг соответственно; животные
IV группы находились на обычном рационе; контролем служили интактные
особи (V группа).
Кусочки печени для исследования фиксировали в 10%-ном растворе
нейтрального формалина. Парафиновые срезы окрашивали гемотоксилином
и эозином, и просматривали с помощью светового микроскопа.
Печень интактных животных (V группа) была неизменённой величины.
Под микроскопом было установлено, что дольки имели светло-красную
окраску. Междольковые артерии и вены сопровождались желчными протоками и образовывали триады, хорошо видна междольковая соединительная
ткань. Отчётливо видны внутридольковые (синусоидные) капилляры, кото94
рые располагались раздельно и сливались в центре. Гепатоциты располагались радиально (рисунок 8).
Рисунок 8 - Печень интактных крыс V группы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х100.
Через 15, 20 и 25 суток после введения ССl4 под микроскопом были
выявлены изменения в печени и гепатоцитах (IV группа). Центральные вены
и впадающие в них синусоиды были расширены и заполнены кровью, в печёночных пластинках наблюдалась их дискомплексация, гепатоциты имели нечёткую окраску, нечёткие границы, по периферии долек располагались
набухшие гепатоциты с темными ядрами и зернистой цитоплазмой.
В клеточном детрите в зоне некроза отмечено скопление эритроцитов и
лейкоцитов, глыбок пигмента в макрофагах. При гистологическом исследовании выявлены нарушения структуры печёночных тяжей, дистрофические
изменения гепатоцитов, увеличение размера последних и появление клеток
неправильной формы с ячеистой или сетчатой цитоплазмой. Наблюдались
уменьшенные в объёме, сморщенные формы ядра гепатоцитов. Центральные
вены были расширены и заполненные кровью. В междольковой соединительной ткани, портальных зонах, участкам микронекрозов наблюдалась инфильтрация лимфоидными, плазматическими клетками, гистиоцитами и
фибробластами. В некоторых дольках обнаружены очаги некроза, характери95
зующиеся кариолизисом гепатоцитов. Следовательно, после отравления к 20му дню в печени белых крыс развивается паренхиматозный гепатит, характеризующийся альтеративными изменениями паренхимы, инфильтрацией
стромы органа клетками гематогенного и тканевого происхождения.
В течение первых 15 суток в группах, где животным ежедневно вводился Диронакс, наблюдалась аналогичная картина, как и в IV группе. Далее
отмечалось, что в участках печени с относительно хорошо сохранившейся
паренхимой отмечено повышение числа гепатоцитов с признаками гипертрофии, что проявлялось увеличением появления большого количества ядрышек, поялением двухядерных и делящихся печёночных клеток (Рисунок
9).
Рисунок 9 - Печень крыс I группы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х500
На 20 сутки у животных, получавших Диронакс, после отравления четырёххлористым углеродом в печени выявлена белковая и жировая дистрофия гепатоцитов центральных частей долек. В печени выявлены слабо выраженные признаки венозной гиперемии и зернистой дистрофии гепатоцитов
96
периферических участков долек, что свидетельствует о снижении гипоксического состояния (Рисунок 10).
Рисунок 10 - Печень крыс II группы. Окраска гематоксилином и эозином.
Увеличение х100
Компенсаторно-приспособительные процессы в печени белых крыс характеризуются гипертрофией гепатоцитов, активацией белкового обмена, регенерацией паренхимы печени. К 25 дню морфологические признаки функциональной активности печени белых крыс возвращаются к норме с сохранением зернистой дистрофии гепатоцитов в центральных зонах долек (Рисунок
11).
97
Рисунок 11 - Печень крыс III группы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х100.
3.3.2 Эффективность Диронакса при экспериментально поражении
печени парацетамолом
Опыты проведены на 80 крысах линии Wistar обоего пола, массой 170210 г. Животные содержались в условиях вивария с естественным световым
режимом на стандартной диете с соблюдением «Европейской конвенции о
защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в
иных научных целях» и правил лабораторной практики для проведения доклинических исследований в РФ. Забой животных проводился согласно требованиям
«Международных
рекомендации
по
проведению
медико-
биологических исследований с использованием животных».
Лекарственное поражение печени воспроизводили введением парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение двух дней. Изучаемые соединения и препарат сравнения вводили перорально на протяжении 30 дней, начиная с первого дня эксперимента (одновременно с введением гепатотоксина).
98
Биохимические показатели и желчегонную активность исследовали на 10й,
20й, 30й день эксперимента.
Исследуемые соединения вводили в дозе 25 мг/кг, рассчитанной на модели поражения печени четыреххлористым углеродом. В качестве препарата
сравнения использовали Карсил «Софарма» в дозе 25 мг/кг.
Было сформировано 3 группы (контроль гепатит, Карсил и Диронакс)
по 24 животных в каждой, в группе интактного контроля – 8 животных.
Желчегонную активность соединения оценивали по желчесекреторной
(мг/мин на 100 г массы) и желчевыделительной (общее количество желчи за
3 часа в мг на 100 г) функциям гепатоцитов (Рисунок 12). О гепатозащитном
действии судили по активности ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ)
и аспартатаминотрансферазы (АСТ), билирубина в сыворотке крови с помощью наборов «Lachema» (Чехословакия).
Рисунок 12 – Определение желчегонной активности Диронакса у крыс
Несмотря на то, что парацетамол является на сегодняшний день одним
из наиболее безопасных анальгетиков, передозировка данного препарата может вызвать тяжелое поражение печени. Признаками интоксикации парацетамолом, прежде всего, является повышение АЛТ и АСТ в сыворотке крови и
гипербилирубинемия.
99
Так, данные проведенных исследований свидетельствуют о том, что
введение парацетамола в желудок в дозе 500 мг/кг в течение двух дней увеличивает содержание АЛТ на 80% и АСТ на 9% (Таблица 19).
На фоне введения исследуемого соединения отмечается уменьшение
активности биохимических показателей крови, характеризующих цитолиз и
холестаз.
Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) в группах, получавших Карсил и
Диронакс, в среднем был равен 1, что на 45-50% выше, чем в контрольной
группе (гепатит).
Таблица 19 - Биохимические показатели сыворотки крови при
экспериментальном поражении печени парацетамолом
Группа
АСТ,
АЛТ,
Коэффициент
Билирубин
животных
мккат/л
мккат/л
де Ритиса
общий,
(АСТ/АЛТ)
мкмоль/л
10-й день
Интактный кон-
0,045±0,0020
0,035±0,0020
1,28±0,044
4,9±0,22
0,044±0,0036
0,063±0,0040
0,70±0,039
13,2±1,56
Карсил
0,043±0,0020
0,041±0,0031
1,08±0,080
9,6±0,50
Диронакс
0,046±0,0014
0,049±0,0019
0,94±0,017
11,4±0,58
троль
Контроль (гепатит)
20-й день
Контроль (гепа-
0,049±0,0017
0,056±0,0048
0,89±0,056
10,1±0,71
Карсил
0,046±0,0015
0,039±0,0039
1,20±0,075
7,3±0,83
Диронакс
0,047±0,0012
0,047±0,0015
0,94±0,017
9,4±1,02
тит)
100
Окончание таблицы 19
Группа
АСТ,
АЛТ,
Коэффициент
Билирубин
животных
мккат/л
мккат/л
де Ритиса
общий,
(АСТ/АЛТ)
мкмоль/л
30-й день
Контроль (гепа-
0,047±0,0026
0,50±0,0032
0,94±0,029
7,4±1,00
Карсил
0,047±0,0014
0,038±0,0015
1,24±0,071
5,2±0,24
Диронакс
0,046±0,0015
0,046±0,0012
0,98±0,036
6,7±0,94
тит)
При интоксикации парацетамолом наблюдаются значительные нарушения уровня билирубина. Содержание билирубина у больных животных
было повышено в 2,7 раза по отношению к интактной группе. Диронакс и
Карсил оказывали эффективное фармакотерапевтическое действие на функциональное состояние печени, снижая уровень билирубина в среднем на 20%
по отношению к контрольной (гепатит) группе.
Также, введение исследуемого соединения на фоне поражения печени
парацетамолом увеличивает скорость секреции желчи и общее количество
желчи по сравнению с контролем (гепатит) (таблица 20).
Таблица 20 - Влияние Диронакса на массу печени и желчегонную
функцию гепатоцитов при интоксикации печени парацетамолом у крыс.
Группа
Относительная
животных
масса печени,
Интенсивность секреции
желчи,
мг/100 г
ство желчи на 3
мг/мин на 100 г
1 ч.
2 ч.
Общее количечаса, мг/100 г.
3 ч.
10-й день
Интактный
5,85±0,25
5,16±0,65
4,31±0,43 3,8±0,61
795,9±58,2
7,57±0,13
4,68±0,43
2,10±0,35 3,30±0,27 604,28±52,75
6,02±0,17
6,21±0,21
5,31±0,45 4,33±0,25 946,72±34,83
контроль
Контроль
(гепатит)
Карсил
101
Окончание таблицы 20
Группа
Относительная
животных
масса печени,
Интенсивность секреции
желчи,
мг/100 г
Диронакс
6,55±0,17
ство желчи на 3
мг/мин на 100 г
1 ч.
4,84±0,21
2 ч.
4,62±0,69
Общее количечаса, мг/100 г.
3 ч.
3,87±0,53
799,1±54,1
20-й день
Контроль
6,25±0,35
4,26±0,24
3,14±0,09
3,26±0,17
679,0±17,0
Карсил
6,25±0,17
6,39±0,41
4,74±0,46
5,48±0,58
996,6±24,7
Диронакс
6,29±0,26
5,34±0,36
4,46±0,31
3,68±0,33
809,0±21,96
(гепатит)
30-й день
Контроль
6,36±0,24
4,28±0,12
3,95±0,36
3,91±0,34
728,03±40,23
Карсил
6,13±0,33
6,09±0,37
4,89±0,30
5,28±0,25
975,6±42,8
Диронакс
6,79±0,30
5,13±0,30
4,75±0,37
5,02±0,32
893,9±50,86
(гепатит)
Введение Диронакса в эффективной дозе 25 мг/кг при поражении печени парацетамолом уменьшает выраженность синдромов цитолиза и холестаза, приводит в норму уровень трансаминаз (АСТ, АЛТ) и содержание билирубина, увеличивает интенсивность секреции и выделение желчи гепатоцитами.
3.3.3 Эффективность Диронакса при экспериментальном
поражении печени этанолом
Опыты проводили на 80 крысах обоего пола линии Wistar, массой 170190 г. Все этапы эксперимента были проведены с соблюдением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях» [5], «Международных рекомендаций
по проведению медико-биологических исследований с использованием жи102
вотных» и правил лабораторной практики при проведении доклинических
исследований в РФ.
Экспериментальное повреждение печени у крыс вызывали пероральным введением 40% раствора этанола в дозе 1,2 мл на 100 г массы животного
в течение 4 дней. Диронакс и препарат сравнения Карсил, «Софарма» по 25
мг/кг каждый вводили перорально при помощи зонда на протяжении 30 дней
с первого дня эксперимента. Было сформировано 3 группы: 1 группа служила
контролем, 2-я группа – Карсил (25 мг/кг) и 3-я группа – Диронакс (25 мг/кг).
В каждой опытной группе находилось по 24 животного. В группе интактного
контроля было 8 животных.
На 10-й, 20-й и 30-й день эксперимента проводили оценку желчеобразовательной и гепатопротекторной активности соединения. Желчегонную активность оценивали по желчесекреторной (мг/мин на 100 г массы) и желчевыделительной (общее количество желчи, выделившейся за 3 часа в мг на
100 г) функциям гепатоцитов. О гепатозащитном действии судили по активности ферментов трансаминаз: аланинаминтрансферазы (АЛТ) и аспартатаминтрансферазы (АСТ), билирубина в сыворотке крови с помощью реактивов фирмы «Lachema» (Чехословакия). О степени выраженности воспалительных процессов в печени судили по отношению массы печени к массе тела.
Таблица 21 – Биохимические показатели сыворотки крови при
экспериментальном поражении печении этанолом
Группа
животных
АСТ,
мккат/л
Интактный кон- 0,049±0,0020
троль
1-я группа
(Контроль)
0,057±0,0020
АЛТ,
мккат/л
Коэффициент
(АСТ/АЛТ)
де
Ритиса Билирубин
общий,
Мкмоль/л
Начало эксперимента
0,036±0,0010 1,35±0,040
6,2±0,43
10-й день
0,085±0,0036 0,68±0,034
19,8±1,97
103
Окончание таблицы 21
Группа
АСТ, мккат/л
АЛТ, мккат/л
животных
2-я группа
Коэффициент
де
Билирубин
Ритиса общий,
(АСТ/АЛТ)
Мкмоль/л
0,058±0,0012
0,067±0,0024
0,87±0,037
14,7±1,24
0,056±0,0019
0,074±0,0049
0,77±0,037
17,2±0,70
(Карсил)
3-я группа
(Диронакс)
20-й день
1-я группа
0,054±0,0019
0,072±0,0037
0,76± 0,015
17,2±0,37
0,051±0,0032
0,051±0,0036
0,99±0,046
10,1±1,45
0,054±0,0017
0,058±0,0020
0,93±0,020
12,4±1,41
(Контроль)
2-я группа
(Карсил)
3-я группа
(Диронакс)
30-й день
1-я группа
0,053±0,0020
0,060±0,0034
0,89±0,019
11,3±1,16
0,048±0,0021
0,040±0,0024
1,21±0,077
7,4±0,48
0,050±0,0024
0,051±0,0012
0,99±0,063
8,9±0,804
(Контроль)
2-я группа
(Карсил)
3-я группа
(Диронакс)
Результаты проведенного исследования показали, что пероральное введение 40% раствора этанола в дозе 1,2 мл на 100 г живой массы в течение 4-х
дней приводит к значительным изменениям биохимических показателей сыворотки крови. Повышаются уровни АЛТ (в 2,4 раза) и АСТ (в 1,2 раза),
наблюдается гипербилирубинемия (в 3,2 раза) по отношению к интактным
животным (таблица 21). Биологическое действие соединения Диронакс на
функциональное состояние печени при введении этилового спирта подобно
влиянию известного препарата Карсил. Так, уже на 20й день лечения у животных, получавших Диронакс и Карсил, коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ)
приблизился к 1, снизились уровни АЛТ, АСТ и билирубина.
104
На 30-й день лечения Карсилом и Диронаксом наблюдалось повышение активности АЛТ. Так, её уровень составлял в контроле 0,060±0,0034
мккат/л, во второй группе - 0,040±0,0024 мккат/л и третьей группе 0,051±0,0012 мккат/л.
Выраженность изменений в функциональном состоянии печени при
поражении этанолом сопровождается также степенью угнетения желчеобразовательного и желчеотделительного процессов. У крыс, подвергнутых воздействию этанола, отмечается значительное снижение скорости секреции и
падение общего количества желчи, что свидетельствует о развитии активности холестатического синдрома (таблица 22).
Таблица 22 - Влияние Диронакса на массу печени и желчегонную
функцию при интоксикации этанолом
Группа
животных
Масса
печени,
мг/100 г
Интенсивность секреции
мг/мин на 100 г
1 час
2 часа
желчи, Общее количество желчи за 3
часа,
3 часа
мг/100 г
10-й день
Интактный
кон- 4,30±0,07 5,01±0,66
5,34±0,39
3,92±0,54
855,8±32,2
троль
Контроль (гепатит)
5,38±0,20 3,41±0,33
3,18±0,24
1,94±0,23
591,2±37,3
Карсил
5,20±0,38 5,66±0,57
4,75±0,45
4,08±0,40
869,4±66,1
Диронакс
5,30±0,34 5,15±0,34
3,29±0,44
2,87±0,35
678,6±54,4
20-й день
Контроль (гепатит)
5,21±0,18 4,96±0,56
3,55±0,50
3,03±0,53
692,1±31,3
Карсил
4,90±0,26 5,58±0,49
4,36±0,36
3,24±0,36
790,3±32,6
Диронакс
5,17±0,34 5,61±0,69
3,79±0,42
3,52±0,93
775,0±46,8
30-й день
Контроль (гепатит)
4,80±0,17 5,59±0,43
4,26±0,78
4,26±0,78
789,9±61,3
Карсил
4,32±0,26 5,97±0,50
4,69±0,55
4,69±0,55
942,7±0,55
Диронакс
4,60±0,34 5,43±0,42
4,58±0,34
4,58±0,34
890,1±39,27
105
Диронакс и Карсил по сравнению с контролем (гепатит) увеличивают
дебит желчи. На 30-й день лечения общее количество желчи за 3 часа (мг/100
г) в этих группах было выше, чем у интактных животных. Так, общее количество желчи на 10-й день у интактных животных составляло 855,8±32,2
мг/100 г, у контрольных - 591,2±37,3 мг/100 г, в группах, где вводили Карсил
и Диронакс - 869,4±66,1 мг/100 г и 678,6±54,4 мг/100 г, соответственно.
На 30-й день опыта общее количество желчи за 3 часа составило в контрольной группе 789,9±61,3 мг/100 г, а в группах, где задавали Карсил и
Диронакс - 942,7±0,55 мг/100 г и 890,1±39,27 мг/100 г, соответственно.
По результатам проведенных исследований можно сделать вывод, что
введение Диронакса в дозе 25 мг/кг приводит к уменьшению проявлений интоксикации и восстановлению функционального состояния печени.
Лечение Диронаксом приводит к достоверному снижению АЛТ, АСТ и
билирубина по отношению к контролю (гепатит), а так же нормализует желчегонную функцию печени.
3.4 Эффективность применение Диронакса при гепатите
домашних животных
Целью данной работы явилось изучение гепатопротекторных свойств
Диронакса при гепатите собак и кошек. Для опыта было отобрано по 8 животных в каждой группе. Собаки и кошки поступали в ветеринарную клинку
в возрасте от 1 года до 6 лет. В опыте были использованы беспородные кошки и собаки мелких и средних пород (чау-чау, чихуахуа, той терьеры и йоркширские терьеры).
Диагностику гепатита у поступивших в ветеринарную лечебницу животных проводили с учётом анамнеза, клинических признаков, результатов
ультразвукового исследования органа, общего и биохимического анализа
крови, исключалось инфекционное и паразитарное происхождение заболевания. При сборе анамнеза было установлено, что практически во всех случаях
106
имело место кормление пищей «со стола» (молочные и кисломолочные продукты с высоким содержанием жира, свинина, птица с кожей и жирная птица,
копчёности, сыр, кондитерские изделия).
У животных наблюдалась внезапная потеря аппетита, рвота, температура тела поднималась до 40-41°С. Отмечалось угнетение животных, одышка
и учащённое дыхание, расстройство сердечно-сосудистой системы, болезненность печени при пальпации, диспепсические расстройства, зуд, шёрстный покров был тусклым и взъерошенным. При ультразвуковой диагностике
печени устанавливали выраженную в разной степени неоднородность структуры, которая проявлялась чередованием участков сниженной, средней и относительно повышенной эхогенности. Общая эхогенность паренхимы была
заметно снижена, капсула утолщена и четко визуализировалась. Границы печени были ровными. Сосудистый рисунок обогащен за счет более четкой визуализации стенок печеночных вен. Размеры печени были увеличены. Острый гепатит протекает одновременно с холециститом, что сопровождалось
обнаружением соответствующих ультразвуковых признаков, таких как отёк
стенки желчного пузыря.
Для выявления влияния Диронакса на обменные процессы в организме
собак и кошек было проведено морфологическое и биохимическое исследование крови. Взятие крови проводили во время первичного обращения в клинику, а также на 10-й и 20-й день комплексного лечения с применением препарата Диронакс.
3.4.1 Влияние Диронакса на морфологические и биохимические
показатели крови собак
Одним из наиболее важных диагностических методов воздействия различных физиологических и патологических факторов, является в первую
очередь, общеклиническое исследования крови (определение концентрации
гемоглобина, подсчёт количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбицитов,
107
составление лейкоцитарной формулы) и определение биохимических показателей в сыворотке крови подопытных животных.
Морфологические показатели крови собак, поступивших в клинику с
диагнозом гепатит, представлены в таблице 23. Анализируя полученные данные, следует отметить, что при первичном и повторном взятии крови, содержание эритроцитов, лейкоцитов было в пределах физиологической нормы.
Итак, уровень эритроцитов у заболевших животных был равен 7,92 ±
0,31 х 1012/л; на 10-й и 20-й день лечения препаратом Диронакс количество
эритроцитов составляло 7,66 ± 0,4 х 1012/л и 7,31 ± 0,42 х 1012/л.
Таблица 23 - Морфологические показатели крови больных гепатитом
собак до и после лечения Диронаксом (n=8)
№
п/п
Показатель
Исходные
10-й день ле-
20-й день ле-
данные
чения
чения
Норма
1
Эритроциты, 1012/л
7,92 ± 0,31
7,66 ± 0,4
7,31 ± 0,42
5,5-8,5
2
Лейкоциты, 109/л
10,96 ± 1,37
12,29 ± 1,86
11,36 ± 1,17
6,0-17,0
3
Гемоглобин, г/л
184,0 ± 7,67
170,63 ± 5,98
169,0 ±4,8
120,0-180,0
4
Гематокрит, %
52,18 ± 1,71
48,8 ±2,12
50,60 ± 2,03
37,0-55,0
Лейкоцитарная формула, %
5
Лимфоциты
6
Моноциты
0
0
0
0-6
7
Базофилы
0
0
0
0-1
8
Эозинофилы
4,39 ± 1,0
7,1 ± 0,6
4,9 ± 0,81
2,0-10,0
9
Нейтрофилы
57,38 ± 8,11
62,4 ± 3,09
65,94 ± 2,12
62,0-87,0
10
УОЭ, фл
66,37 ± 1,3
11
ССГЭ, пг
23,24 ± 0,44
23,43 ± 0,32
23,6 ±0,79
19,5-24,5
12
СКГЭ, г/л
349,63 ± 1,56
356,87 ± 3,3
345,43 ± 8,55
310,0-340,0
13
Тромбоциты, 109/л
291,5 ±43,81
300,14 ± 24,6
295,29 ± 21,75
200,0-500,0
14
УОТ, ф/л
8,7 ± 0,47
8,59 ±0,74
9,14 ± 1,01
3,9-11,1
38,23 ± 9,05
30,50 ± 2,79
65,13 ± 1,04
29,16 ± 1,42
66,25 ± 1,04
12,0-30,0
60,0-77,0
108
Содержание лейкоцитов в крови в норме относительно постоянно. По
морфологическим признакам они делятся на зернистые (нейтрофильные,
эозинофильные и базофильные) и незернистые (моноциты и лимфоциты)
Установлено, что количество лейкоцитов во все сроки исследования
оставалось в пределах нормы и составляло 10,96 ± 1,37 х 10 9/л; 12,29 ± 1,86 х
109/л и 11,36 ± 1,17 х 109/л (до лечения, на 10-й и 20-й день соответственно).
Однако полученные результаты статистически не подтверждены.
При выведении лейкоцитарной формулы установлено, что количество
лимфоцитов, эозинофилов было выше физиологической нормы. Повышение
количество эозинофилов наблюдается при воспалительных заболеваниях желудочно-кишечного тракта, а лимфоцитоз может наблюдаться при аллергиях,
гипертиреоидизме, бактериальных воспалениях и т.д.
Так до лечения количество лимфоцитов составило 38,23 ± 9,05 %, а
эозинофилов 4,39 ± 1,0 %, при норме 12,0 – 30,0 % и 2,0 – 4,0 %, соответственно. На 20-й день применения Диронакса их количество доходило до физиологической нормы (29,16 ± 1,42 % и 4,9 ± 0,81 %, лимфоциты и эозинофилов, соответственно), но различия не подтверждаются статистикой.
Нейтрофилы являются важными элементами неспецифической защиты
системы крови. Основная их функция – защита внутренней среды организма
от бактериальных инфекций и контроль сапрофитной микрофлоры пищеварительного тракта.
Уровень нейтрофилов в начале эксперимента был понижен и составлял
57,38 ± 8,11 %, а на 20-й день лечения Диронаксом повышался до 65,94 ± 2,12
%.
Незначительное снижение количества эритроцитов в пределах нормы
определяло и уровень гемоглобина – переносчика кислорода. Так до лечения
его количество составляло 184,0 ± 7,67 г/л, а после терапии Диронаксом 170,63 ± 5,98 г/л и 169,0 ±4,8 г/л (10-й и 20-й день, соответственно), однако
полученные данные были не достоверными.
109
Гематокрит является вспомогательным критерием в практической гематологии. Он включает в себя часть объёма крови, приходящуюся на эритроциты, выраженную в процентах. Обычно понижение гематокрита наблюдается при потере крови, анемии, ускоренном разрушении эритроцитов. В
норме этот показатель составляет у собак 37,0 – 55,0 %. Анализ результатов
исследований показал, что у подопытных животных во все сроки наблюдения
не происходило изменения данного показателя. В начале опыта уровень гематокрита составил 52,18 ± 1,71 % в конце - 50,60 ± 2,03 %.
Усреднённый объём эритроцита (УОЭ) вычисляется делением общего
объёма эритроцитов на число эритроцитов при помощи гематологического
анализатора. Данный показатель может повышаться при заболеваниях, приводящих к диморфизму эритроцитов (различных формах анемий, гипотиреозах, опухолях). Измеряется УОЭ в фемтолитрах (фл). По нашим данным,
УОЭ у заболевших животных составлял 66,37 ± 1,3фл, лечение Диронаксом
не изменяло данный показатель, и на 20-е сутки эксперимента он находился в
пределах физиологической нормы (66,25 ± 1,04 фл).
Среднее содержание гемоглобина в эритроците (ССГЭ) – анализ, позволяющий оценить среднее содержание гемоглобина в эритроците. Измеряется в абсолютных единицах (пг). Данный показатель самостоятельного значения не имеет и всегда соотносится с ОУЭ, СКГЭ и цветовым показателем.
Снижение данного показателя отмечается при гипохромных анемиях, отравлениях свинцом. Повышение – при анемиях при кровопотере, мегалобластных анемиях, гипотиреозе, заболеваниях печени, злокачественных заболеваниях. Нами установлено, что во все сроки опыта данный показатель находился в пределах физиологической нормы, установленной для собак. Так, в
начале опыта ССГЭ составлял 23,24 ± 0,44 пг, а в конце - 23,6 ±0,79 пг.
Количество гемоглобина в 100 мл эритроцитов (Средняя концентрация
гемоглобина в эритроците - СКГЭ) отражает степень насыщения эритроцита
гемоглобином и измеряется в г/л. Снижение данного показателя наблюдается
при заболеваниях с нарушением синтеза гемоглобина (нормохромные, ги110
перхромные и гипохромные анемии). СКГЭ является наиболее стабильным
гематологическим показателем.
Так, по данным таблицы 17, во все сроки наблюдалось незначительное
повышение уровня СКГЭ, которое составляло на начало опыта 349,63 ± 1,56
г/л и в конце 345,43 ± 8,55 г/л. Полученные результаты статистически не подтверждены.
Тромбоциты (тромбопластинки) – безъядерные фрагменты цитоплазмы
клеток красного костного мозга, которые участвуют в свёртывании крови.
Избыток тромбопластинок грозит тромбозом, а понижение их количества сопровождается повышением кровоточивости, гематурией, петехиальными
кровоизлияниями. В ходе проведения опыта установлено, что данный показатель не выходил за пределе физиологической нормы и не имел достоверной
разницы с исходными показателями. Так вначале эксперимента количество
тромбоцитов составило 291,5 ±43,81 х 109/л, а на 20-й день дачи Диронакса 295,29 ± 21,75 х 109/л.
УОТ (усреднённый объём тромбоцитов) не имеет чёткого интервала
значений «нормы». Существует обратная зависимость между размерами
тромбоцитов и их числом. УОТ увеличивается с возрастом, при сахарном
диабете, анемиях, атеросклерозе, тиреотоксикозе и т.д. У подопытных животных УОТ находился в пределах физиологической нормы для данного вида
животного (собаки) и составлял 8,7 ± 0,47 ф/л на начало опыта и 9,14 ± 1,01
ф/л на 20-й день дачи препарата Диронакс.
Биохимические исследования крови также являются необходимым
компонентом для постановки диагноза (таблица 24).
Наиболее важными показателями в диагностике заболеваний печени
являются определение ферментов из группы трансфераз – АСТ и АЛТ, а также ГГТ, ЛДГ, щелочная фосфатаза, холестерин и триглицериды.
Гамма-глутамилтранспептидаза (ГГТ) – фермент, участвующий в обмене веществ. Он содержится во многих тканях, печени, почках, поджелудочной железе. Изменение ГГТ служит ранней диагностикой заболеваний
111
печени. Повышение в крови данного фермента характерно для патологии печени.
Содержание ГГТ в сыворотки крови до лечения составляло 11,68 ± 1,33
ед./л, что на 66,8 % выше нормы. При введении препарата наблюдается постепенное снижение активности фермента до 8,51 ± 0,78 ед./л (20-й день), хотя уровень данного показателя остаётся выше физиологической нормы.
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) – гликолитический фермент, участвующий
в конечных этапах превращения глюкозы. Повышение ЛДГ часто встречается при гибели клеток любого типа. Наибольшая активность данного фермента отмечается в мочках, печени, поджелудочной железе, сердце и скелетной
мускулатуре. Его уровень повышается при болезнях печени, сердца и т.д.
Как видно из таблицы 24 в начале опыта уровень ЛДГ составлял 442,85
± 91,09 ед./л, что в среднем, на 55,3 % выше физиологической нормы. В
дальнейшем, при назначении препарата Диронакс наблюдалось значительное
понижение уровня ЛДГ до 89,66 ± 2,19 ед./л на10-й и 88,68 ± 3,85 ед./л на 20й день лечения Диронаксом (Р<0,01) (рисунок 13).
500
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
де
нь
20
-
й
де
нь
й
10
-
Ис
хо
дн
ые
да
нн
ы
е
ЛДГ,ед./л
Границы нормы
Рисунок 13 – Динамика изменения уровня лактатдегидрогеназы в течение эксперимента.
112
Аспартатаминотрансфераза (АСТ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ) –
ферменты из группы трансфераз, которые участвуют в реакции трансаминирования. Так, применение Диронакса понизило содержание ферментов АСТ
и АЛТ в сыворотке крови собак до пределов физиологической нормы. Достоверное (Р<0,01) снижение уровня активности АСТ было зафиксировано на
10-е и 20-е сутки при использовании препарата на 38 % и 37,2 % по отношению к исходным показателям. Уровень активности АЛТ был значительно повышен относительно нормы. В ходе опыта данный показатель снижался до
нормы, однако полученные данные не показали достоверной разницы с исходными результатами.
Важное диагностическое значение имеет коэффициент де Ритиса,
определяемый отношением АСТ к АЛТ. Он может увеличиваться при заболеваниях сердца. Может наблюдаться его понижение или увеличение при
различных патологиях печени. Нами установлено, что у заболевших животных коэффициент де Ритиса составил 0,38, то есть был значительно ниже параметров физиологических показателей. На 10-й день лечения Диронаксом
этот показатель повысился до 0,4, на 20-й день – до 0,65, что указывает на
положительное действие препарата.
Важными показателями липидного обмена, состояния и работы печени
и поджелудочной железы в клинической практике являются нейтральные
жиры - холестерин и триглицериды. Так, холестерин является компонентом
клеточных мембран, предшественником образования желчных кислот, стероидных гормонов, витамина D и может закупоривать сосуды. По изменению
данного показателя можно судить о состоянии желчного пузыря, работе печени и поджелудочной железы. Повышение холестрина наблюдается при гепатите, панкреатите, гипотиреозе и т.д. Триглицериды – сложные эфиры глицерина и жирных кислот – главный источник энергии в организме. Повышение концентрации триглицеридов наблюдается при заболеваниях печени,
поджелудочной железы, почек и т.д. Анализируя полученные данные, нами
113
установлено, что содержание в сыворотке крови холестерина и триглицеридов было в пределах до и после введения препарата Диронакс.
Так, содержание холестерина в крови больных животных составляло
189,47 ± 17,01 мг/дл. При введении Диронакса на 20-й день его уровень понижался до 182,04 ± 8,84 мг/дл. Применение Диронакса повышало содержание триглицеридов с 57,0 ± 11,05 мг/дл (заболевшие животные) до 63,29 ±
6,45 мг/дл (20-й день лечения). Однако полученные данные статистически не
подтверждены.
Таким образом, введение препарата Диронакс в состав комплексной
терапии у собак, способствует снижению уровня холестерина в крови и повышению запаса энергии в организме.
Щелочная фосфатаза (ЩФ) в основном участвует в реакциях обмена
фосфорной кислоты. Она производится преимущественно в печени. Увеличение активности ЩФ возрастает при различных заболеваниях печени (токсических и лекарственных гепатитах, циррозе и некрозе печёночной ткани,
опухолях печени и желчевыводящих протоков, некоторых поражениях костей и т.д.). Установлено, что у заболевших животных активность щелочной
фосфатазы была довольно высокой и составил 240,88 ± 55,42 ед./л, что выше
физиологической нормы в среднем на 68,4 %. Включение Диронакса в лечение приводило к снижению активности фермента и по окончанию лечения
данный показатель составлял 141,0 ± 9,90 ед/л, то есть сохранялся в пределах
физиологической нормы (рисунок 14).
114
300
250
200
150
100
50
0
нь
де
20
-
й
нь
де
й
ис
хо
дн
10
-
ые
д
ан
н
ые
ЩФ, ед./л
границы нормы
Рисунок 14 – Динамика изменения уровня щелочной фосфатазы в течение эксперимента
Таблица 24 - Биохимические показатели крови больных гепатитом собак до и после лечения Диронаксом (n=8)
п
/п
1
1
2
2
3
3
4
4
Исходные дан-
10-й день
20-й день
ные
лечения
лечения
ГГТ, ед./л
11,68 ± 1,33
11,5 ± 1,27
8,51 ± 0,78
0,0-7,0
ЛДГ, ед./л
442,85 ± 91,09
89,66 ±
88,68 ±
80,0-
2,19*
3,85*
285,0
АЛТ, ед./л
253,6 ± 25,97
115,2 ± 20,1
44,74 ± 3,32
АСТ, ед./л
95,91 ± 17,32
46,46 ±
35,74 ±
1,66*
3,51*
0,380,04
0,40,05
0,650,06
0,42-0,97
33,5 ± 2,24
37,55 ±1,44
37,19 ± 1,38
29,0-43,0
Показатель
Коэффициент
5
де Ритиса
5
6
6
Альбумин, г/л
Норма
19,0107,0
16,0-43,0
115
Окончание таблицы 24
п
Исходные дан-
10-й день
20-й день
ные
лечения
лечения
1014,89 ±
1073,13 ±
510,0-
124,02
97,04
1865,0
93,14 ± 6,27
91,8 ± 13,73
91,46 ± 11,22
20,0-150,0
9
Глюкоза, ммоль/л
6,3 ± 0,42
6,66 ± 0,33
6,83 ± 0,55
3,3-7,3
2
Общий белок, г/л
67,07 ± 2,84
66,68 ± 2,77
68,94 ± 2,21
54,0-71,0
1
Холестерин, мг/дл
189,47 ± 17,01
193,85 ± 14,6
182,04 ± 8,84
108,0-266,0
240,88 ± 55,42
142,71 ± 10,2
141,0 ± 9,90
22,0-143,0
57,0 ± 11,05
49,83 ± 2,72
63,29 ± 6,45
20,0-120,0
/п
6
7
Показатель
α-амилаза, ед./л
8 Креатинин,
мкмоль/л
8
9
10
11
1
12
ЩФ, ед./л
1 Триглицериды,
13
мг/дл
982,71 ± 101,4
Норма
* - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,01).
Остальные показатели (альбумин, α-амилаза, креатинин, глюкоза, общий белок) во все сроки наблюдения и лечения животных также находились
в пределах физиологической нормы. Следует учесть при постановки диагноза, что изменение количества α-амилазы не является критерием специфического теста при заболеваниях печени и поджелудочной железы. У собак может быть кратковременное повышение данного показателя, затем он приходит в норму. Креатинин участвует в энергетическом обмене различных тканей. Он является одним из конечных продуктов белкового обмена в организме. Повышенный креатинин наблюдается при заболеваниях почек или мышечной ткани и поэтому его изменение также не является важным критерием
при постановке диагноза при заболеваниях печени.
Таким образом, по результатам морфологических и биохимических исследований можно сделать вывод, что введение препарата Диронакс в состав
116
комплексной терапии при гепатите собак нормализует метаболические процессы внутри организма.
3.4.2 Влияние Диронакса на морфологические и биохимические
показатели крови кошек
Изучая эффективность применения гепатопротектора Диронакс на организм кошек было проведено морфологическое и биохимическое исследование крови. Морфологические показатели крови кошек представлены в таблице 25.
Анализ полученных результатов показал, что при гепатите у заболевших животных уровень эритроцитов оставался в пределах физиологической
нормы и был равен 8,68 ± 0,82 х 1012/л в начале опыта и 8,57 ± 0,76 х 1012/л на
20-й день применения Диронакса. Соответственно, содержание гемоглобина
составляло 138,13 ± 10,92 г/л и 124,88 ± 8,97 г/л, однако данные были не достоверными.
Количество лейкоцитов в начале опыта было в среднем на 111,4% выше, чем в норме. В дальнейшем, при лечении препаратом Диронакс, их уровень понижался, хотя на 20-й день оставался выше пределов нормы на 18,1
%.
Таблица 25 - Морфологические показатели крови больных гепатитом
кошек до и после лечения Диронаксом (n=8)
№
п/п
Показатель
Исходные
10-й день ле-
20-й день ле-
данные
чения
чения
Норма
1
Эритроциты, 1012/л
8,68 ± 0,82
9,47 ± 0,71
8,57 ± 0,76
5,0-10,0
2
Лейкоциты, 109/л
16,07 ± 4,0
16,43 ± 2,47
8,98 ± 1,18
5,5-7,7
3
Гемоглобин, г/л
138,13 ± 10,92
143,0 ± 9,49
124,88 ± 8,97
80,0-150,0
4
Гематокрит, %
37,95 ± 2,99
42,21 ± 2,7
40,71 ± 2,34
24,0-45,0
37,78 ± 4,0*
20,0-55,0
Лейкоцитарная формула, %
5
Лимфоциты
13,18 ± 2,29
41,09 ± 5,19*
117
Окончание таблицы 25
№
Показатель
п/
Исходные
10-й день ле-
20-й день ле-
п
данные
чения
чения
Норма
6
Моноциты
0
0
0
0-3
7
Базофилы
0
0
0
0-1
8
Эозинофилы
2,50 ± 0,47
3,50 ± 1,07
3,38 ± 0,75
1,0-3,0
9
Нейтрофилы
84,32 ± 2,85
55,41 ± 4,86*
58,84 ± 3,81*
35,0-80,0
10
УОЭ, ф/л
44,38 ± 1,56
44,88 ± 1,69
43,25 ± 1,56
39,0-55,0
11
ССГЭ, пг
16,06 ± 0,51
15,19 ± 0,51
14,18 ± 0,43**
12,5-17,5
12
СКГЭ, г/л
363,0 ± 14,56
339,38 ± 4,16
332,88 ± 6,5
300,0-360,0
13
Тромбоциты, 109/л
226,83 ± 35,02
269,14 ± 43,16
330,63 ± 40,95
300,0-800,0
14
УОТ, ф/л
11,08 ± 0,46
10,75 ± 0,38
12,34 ± 0,68
12,0-17,0
*- достоверно по отношению к исходным данным (Р <0,001)
** - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,02)
При анализе лейкоцитарной формулы нами установлено, что при гепатите на начало эксперимента было снижено содержание лимфоцитов в среднем на 35,7 % и повышено количество нейтрофилов в среднем на 47 % от физиологической нормы. При терапии Диронаксом содержание лимфоцитов и
нейтрофилов на 20-й день приходило к показателям физиологической нормы:
37,78 ± 4,0 % и 58,84 ± 3,81%, соответственно (Р<0,001).
Количество эозинофилов при первичном анализе составляет 2,87 ± 0,47
%, а к концу опыта незначительно повышается до 3,38 ± 0,75 % (20-й день).
Полученные данные не показали достоверной разницы по отношению к исходным показателям.
Содержание нейтрофилов составляет 84,5 ± 2,85 % на начало опыта, а
при даче Диронакса в течение 20-и дней снижается до 58,85 ± 3,81 %, что соответствует физиологической норме (Р<0,001).
Уровень гемоглобина и гематокрита оставался в пределах физиологической нормы. Так, на начало опыта, концентрация гемоглобина составляла
118
138,13 ± 10,92 г/л, а в конце - 124,88 ± 8,97 г/л. Уровень гематокрита составлял 37,95 ± 2,99 % и 40,71 ± 2,34 % на начало и конец эксперимента, соответственно.
Показатели УОЭ и ССГЭ у кошек в целом были в пределах физиологической нормы в начале и конце эксперимента.
Анализ таблицы 25 позволяет выявить незначительно повышение
уровня СКГЭ у больных кошек, который затем снижается до физиологической нормы (363,0 ± 14,56 г/л – исходные данные и 332,88 ± 6,5 г/л – 20-й
день эксперимента).
Установлено, что содержание тромбоцитов и УОТ в сыворотки крови
вначале опыта было понижено и составляло 226,83 ± 35,02 х 10 9/л и 11,08 ±
0,46 ф/л, соответственно. На 20-й день терапии Диронаксом их уровень составил 330,63 ± 40,95 х 109/л (тромбоциты) и 12,34 ± 0,68 ф/л (УОТ), что соответствует физиологической норме.
Отслеживая влияние препарата Диронакс при гепатите кошек в течение
всего периода лечения, изучали также динамику изменения биохимических
показателей. Результаты проведённой работы представлены в таблице 26.
Определение в сыворотке крови активности ферментов даёт информацию о локализации процессов происходящих внутри организма.
Так, содержание ГГТ в сыворотки крови понижалось к 20-му дню применения Диронаксом. Так, в начале опыта уровень ГГТ составлял 9,37 ± 1,64
ед./л, что выше нормативных показателей на 56,1 %, к 10-му и 20-му дню лечения Диронаксом этот показатель постепенно нормализовывался и составлял 7,89 ± 0,95 ед./л и 5,61 ± 0,57 ед./л, соответственно.
Уровень ЛДГ в начале исследования составлял 431,16 ± 43,64 ед./л или
на 51,2 % выше нормы. В дальнейшем, при даче препарата Диронакс, наблюдалось также постепенное снижение данного показателя до уровня физиологической нормы - 165,94 ± 27,05 ед./л (10-й день лечения) и 142,25 ± 20,46
ед./л (20-й день лечения). Данные достоверны по отношению к исходному
показателю (Р<0,001).
119
Применение препарата Диронакс способствовало снижению уровня
ферментов АЛТ и АСТ у больных животных на 10-й и 20-й дни лечения. Так,
уровень АЛТ и АСТ при первичном исследовании сыворотки крови составлял, соответственно, 287,63 ± 22,59 ед./л и 162,29 ± 31,37 ед./л, что было в
среднем выше на 173 % и 189 % от верхних пределов физиологической нормы. На 10-й и 20-й день применения Диронакса было зафиксировано понижение данных показателей по отношению к исходным данным и составило:
68,26 ± 11,39 ед./л; 53,86 ± 8,62 ед./л (АЛТ) и 39,09 ± 3,16 ед./л; 36,26 ± 4,39
ед./л (АСТ), соответственно (Рисунок 15).
300
250
200
150
АЛТ
АСТ
100
50
0
Исходные
данные
10-й день
20-й день
Рисунок 15 – Динамика изменения показателей АЛТ и АСТ
в течение эксперимента
В ходе проведения опыта установлено, что коэффициент де Ритиса у
больных животных был ниже уровня физиологической нормы для данного
вида животных. Так при первичном анализе крови у заболевших животных
отношение АСТ к АЛТ составило 0,56, на 10-й день лечения Диронаксом –
0,57 и на 20-й – 0,67, сто говорит о нормализации данного параметра.
120
Таблица 26 - Биохимические показатели крови больных гепатитом кошек, до и после лечения Диронаксом (n=8)
№
п/п
Показатель
Исходные
10-й день лече-
20-й день ле-
данные
ния
чения
Норма
1
ГГТ, ед./л
9,37 ± 1,64
7,89 ± 0,95
5,61 ± 0,57
0,0-6,0
2
ЛДГ, ед./л
431,16 ± 43,64
165,94 ± 27,05*
142,25 ± 20,46*
80,0-285,0
3
АЛТ, ед./л
287,63 ± 22,59
68,26 ± 11,39*
53,86 ± 8,62*
31,0-105,0
4
АСТ, ед./л
162,29 ± 31,37
39,09 ± 3,16**
36,26 ± 4,39**
12,0-56,0
0,560,037
0,570,055
0,670,069
0,6-0,8
5
Коэффициент де
Ритиса
6
Альбумин, г/л
36,84 ± 2,18
36,59 ± 1,08
35,9 ± 1,05
30,0-44,0
7
α -амилаза, ед./л
2087,14 ± 187,8
1299,5 ± 76,18**
651,75 ± 77,35*
365,0-948,0
105, 69 ±17,0
92,8 ± 9,53
81,85 ±10,80
20,0-150,0
9,21 ± 0,63
6,85 ± 0,43***
6,58 ± 0,44**
4,4-7,7
81,47 ± 5,64
79,98 ± 3,16
72,43 ± 3,54
57,0-79,0
194,88 ± 12,75
191,94 ± 13,46
161,08 ± 13,43
38,0-186,0
254,57 ± 49,8
116,57 ± 0,8****
74,18 ± 7,29**
16,0-113,0
108,02 ± 12,24
42,11 ± 6,0*
45,8 ± 6,73*
10,0-114,0
8
9
10
11
12
13
Креатинин,
мкмоль/л
Глюкоза,
ммоль/л
Общий белок, г/л
Холестерин,
мг/дл
ЩФ, ед./л
Триглицериды,
мг/дл
* - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,001);
** - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,01);
*** - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,02);
**** - достоверно по отношению к исходным данным (Р<0,05).
По данным таблицы 26 уровень α -амилазы в крови опытных животных
в начале исследования был значительно повышен и составлял 2087,14 ± 187,8
ед./л, при физиологической норме 365,0 – 948,0 ед./л. В дальнейшем (20-й
день) уровень данного показателя постепенно понижался и составлял 651,75
± 77,35 ед./л (Р<0,001). Как было сказано выше, изменение уровня α –
121
амилазы не является критерием специфичного теста при заболеваниях печени. Так, у кошек повышение данного показателя может быть при различных
заболеваниях внутренних органов незаразной этиологии.
Количество глюкозы в сыворотке крови указывает на состояние углеводного обмена в организме. Так, в начале эксперимента её уровень был повышен и составлял 9,21 ± 0,63 ммоль/л, что в среднем на 19,6 % выше нормы.
В дальнейшем наблюдалось нормализация данного показателя до 6,58 ± 0,44
ммоль/л (Р<0,01), что соответствовало физиологической норме.
Уровень общего белка и холестерина был повышен в начале эксперимента на 3 % и 4,7 %, соответственно. Введение в схему лечения препарата
Диронакс способствовало нормализации данных показателей.
Уровень щелочной фосфатазы у кошек, поступивших с диагнозом гепатит был высокий и составлял 254,57 ± 49,8 ед./л, что в среднем на 125,2 %
выше нормы. При введении Диронакса на 20-й день эксперимента достоверно (Р<0,05) понизилась активность данного фермента в сравнении с исходными показателями.
Содержание триглицеридов в сыворотке крови находилось в верхних
пределах физиологической нормы в начале эксперимента и затем понижалось при даче препарата Диронакс до 45,8 ± 6,73 мг/дл (20-й день) (Р<0,001).
Анализ уровня альбуминов и креатинина показал, что данные показатели соответствовали физиологической норме.
При оценке клинической картины была выявлена положительная динамика у всех опытных животных. Терапевтический эффект Диронакса проявлялся восстановлением аппетита, прекращением диспепсических явлений и
зуда, отсутствием болезненности в области печени.
Анализируя полученные данные, следует отметить, что введение в
комплексную терапию при гепатите кошек гепатопротектора Диронакс способствовало нормализации морфологических и биохимических показателей
крови, что видно по представленным результатам.
122
3.5 Экономическая эффективность применения Диронакса
В ходе исследования лечебных мероприятий в опыте на собаках и кошках с применением гепатопротекторного препарата Диронакс была установлена высокая степень его экономической эффективности.
Средняя стоимость одного животного составила 9200 руб. Предотвращенный в результате лечения больного животного ущерб: Пу=Мз*Ц, где Мз
– количество заболевших животных, подвергнутых лечению, Ц – средняя
стоимость одного животного. Таким образом, получаем Пу= 8*9200 = 73600
руб.
Исходя из стоимости субстанции 12000 руб. за 1кг, в опыте на собаках
было потрачено 17,5 г за 20 дней на 1 одно животное, что составляет 210 руб.
Следовательно, затраты на лечение 8 животных составили 1680 руб.
Экономический эффект, полученный в результате лечения больных
животных: Эв = Пу – Зв, где Пу – предотвращенный в результате лечения
больного животного ущерб, Зв – затраты на ветеринарные мероприятия. Следовательно, Эв = 73600 – 1680 = 71920 руб.
Экономическая эффективность на рубль затрат: Эр = Эв/Зв. Таким образом получаем, Эр = 71920/1680 = 42,81 руб.
В качестве препарата сравнения использовали один из наиболее часто
применяемых при лечении гепатопатий препарат – гепатовет. Стоимость одного флакона препарата объемом 50 мл составляет в среднем 197 руб. С учетом средней массы, животное должно получать 9 мл в день. Так как курс лечения составляет, согласно инструкции по применению препарата в среднем
4 недели, то всего на лечение животного необходимо 252 мл, то есть 6 флаконов. Таким образом, затраты на лечение одного животного составят 1182
руб. Следовательно, 1182*8 = 9456 руб. – затраты на лечение 8 животных.
Экономический эффект, полученный в результате лечения больных
животных: Эв = ПУ – Зв, где Пу – предотвращенный в результате лечения
123
больного животного ущерб, Зв – затраты на ветеринарные мероприятия. Следовательно, Эв = 73600 – 9456 = 64144 руб.
Экономическая эффективность на рубль затрат: Эр = Эв/Зв. Таким образом получаем, Эр = 64144/9456 = 6,78 руб.
Исходя из результатов исследования можно сделать вывод, что Диронакс имеет высокую степень экономической эффективности.
124
4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В настоящее время одной из значительных проблем ветеринарной медицины остается рост патологий печени. Причинами роста болезней печени
являются стресс-факторы, ухудшение экологических условий, нерациональное назначение фармакологических препаратов, в том числе антибиотиков и
гормонов, некачественное и несбалансированное кормление. Многие лекарственные средства, представленные в настоящее время на рынке, имеют нежелательные побочные эффекты, малоэффективны и являются дорогостоящими. Ассортимент лекарственных средств, оказывающих избирательное
действие на печень (гепатопротекторы), представлен небольшой группой
препаратов и биологически активных веществ. К ним относятся: гепатовет,
лиарсин, глютаМакс, гепалон, полифепан, гепавет, гепатоджект, дюфалайт,
гептрал, эссенциале, гепатосан, хофитол, аллохол, метионин, силимарин, лив
52, билигнин, фосфоглив, липоевая кислота, зиксорин и другие [5, 15, 23, 32,
66, 133].
Целью исследования явилось изучение токсико-фармакологических
свойств нового гепатопротекторного препарата Диронакс (диизопропиламмония дихлорацетата) и его применение в ветеринарной практике для профилактики и лечения болезней печени у домашних животных.
В настоящее время производство диизопропиламмония дихлорацетата
в Российской Федерации отсутствует. Обществом с ограниченной ответственностью «Базис» (г.Уфа) разработана новая технология производства
диизопропиламмония дихлорацетата. Препарат был наработан в количестве 5
тонн на Федеральном казенном предприятии «Авангард» (г.Стерлитамак). В
рамках научного сотрудничества ООО «Базис» и ФГБОУ ВПО Башкирский
ГАУ нами изучались свойства препарата Диронакс.
Диронакс (диизопропиламмония дихлорацетат) – белый мелкокристаллический порошок без запаха, горького вкуса, легко растворим в воде и
125
спирте, трудно растворим в эфире. Применяется как фармакологическое
средство.
При определение массовой доли Диронакса нами был использован метод образования цветного комплекса диизопропиламмония дихлорацетата с
бромтимоловым синим. В результате исследования было установлено, что массовая доля основного вещества диизопропиламмония дихлорацетата в препарате составляет 99,8%.
Структура
Диронакса
была
подтверждена
с
помощью
Фурье-
спектроскопии на приборе Vector-22. Основываясь на полученных данных,
был сделан вывод, что структура Диронакса соответствует стандартному образцу, так как характеристические шкалы спектра исследуемого препарата
полностью совпадают со шкалами образца диизопропиламмония дихлорацетата, находящегося в библиотеке прибора.
При изучении стабильности Диронакса пользовались методом ускоренного старения (ускоренного хранения), подтверждая стабильность препарата визуально (порошок белого цвета), Фурье-спектрометрией и определением массовой доли основного вещества. В результате было установлено, что
экспериментальный срок годности Диронакса при 45°С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия составляет 182
суток, что соответствует сроку годности в 2 года при 20° С.
Исследование кристаллической структуры Диронакса было проведено
методом монокристального рентгеноструктурного анализа (РСтА) на автоматическом рентгеновском дифрактометре. По результатам исследования было
выявлено, что супрамолекулярная структура в кристалле диронакса формируется главным образом за счет реализации классических водородных связей
Н…О типа.
Согласно общепринятым стандартам изучение токикологических
свойств препарата Диронакс начали с острого опыта, в результате которого
получили данные о наличии смертельных доз. В результате проведенных исследований установлено, что среднесмертельная доза препарата Диронакс
126
при пероральном применении составляет для белых мышей 5450 мг/кг. Согласно ГОСТ 12.1.007. - 76 Диронакс относится к четвертому классу опасности (малоопасные вещества).
При изучении субхронической токсичности препарата Диронакс, которая была проведена на белых беспородных крысах, в дозе 25 мг/кг, установлено, что длительное применение не оказывает отрицательного влияния на
организм. Все животные в ходе проведения опыта оставались живы, препарат
не оказывал негативного влияния на физиологическое состояние подопытных
животных, поведенческие реакции и рефлексы не притерпели изменений.
При анализе морфологических и биохимических показателей сыворотки крови не выявлено каких-либо значительных различий между контрольными и подопытными группами.
При исследовании влияния препарата на массу внутренних органов
подопытных крыс нами установлено, что Диронакс не изменяет вес внутренних органов (сердце, легкие, селезёнка, печень, почки, надпочечники) в течение всего эксперимента (30 дней). Все органы оставались в пределах физиологической нормы – без деформаций, анатомическое расположение было
правильным, патологоанатомические изменения отсутствовали.
Проведенными нами исследованиями установлено, что применение
Диронакса в течение 30-и дней не приводит к нарушению функционального
состояния почек. Так, в начале эксперимента уровень выделяемой мочи у
опытной и контрольной групп составлял 2,7±0,19 мл и 3,03±0,14 мл, соответственно. На 30-е сутки опыта в группе опытных крыс, получавших Диронакс
в дозе 25 мг/кг суммарное количество мочи за 3 часа составило 3,18±0,14 мл,
тогда как в контроле - 2,91±0,19 мл.
В течение всего эксперимента во всех группах моча была светложёлтого цвета, прозрачная, без примесей и резкого специфического запаха.
Акты мочеиспускания были произвольными и производились в естественной
позе.
127
Анализ результатов влияния препарата Диронакс на функцию центральной нервной системы показал, что как в контрольной, так и в опытной
группе не отмечалось изменений в поведенческих реакциях.
Так после 30-дневного введения препарата Диронакс число вертикальных стоек в опытной группе составляло 3,3±0,51, тогда как в контрольной 3,0±0,85. Число исследованных отверстий и актов чистки в опытной группе
составляло 14,2±1,02 и 1,5±0,51, а в контрольной - 15,2±1,54 и 1,0±0,34, соответственно.
При изучении экспериментальных гепатитов, вызванных четыреххлористым углеродом, парацетамолом и этанолом, установлено, что Диронакс
обладает гепатозащитным и желчегонным действием. На модели гепатита,
вызванного четырёххлористым углеродом, установлена эффективная доза
Диронакса, которая составляет 25 мг/кг. В данной дозе препарат обладает
максимальным эффектом и не оказывает отрицательного влияния на организм. Кроме того, результаты исследования были подтверждены гистологически. Нами была отмечена активация компенсаторно-приспособительных
процессов в печени, характеризующаяся гипертрофией гепатоцитов, активацией белкового обмена и регенерацией паренхимы печени. Морфологические
признаки функциональной активности печени полностью возвращаются к
норме с сохранением зернистой дистрофии гепатоцитов в центральных зонах
долек к 25-му дню.
При изучении действия Диронакса на модели гепатита, вызванного парацетамолом, было установлено, что препарат при данном поражении печени
уменьшает выраженность синдромов цитолиза и холестаза, приводит в норму
уровень трансаминаз и содержание билирубина, увеличивает интенсивность
секреции и выделение желчи гепатоцитами, что свидетельствует о его гепатопротекторных и желчегонных свойствах.
По результатам проведенных на модели этанол-индуцированного поражения печени нами был сделан вывод, что введение Диронакса в эффективной дозе приводит к уменьшению проявлений интоксикации и восстанов128
лению функционального состояния печени, что подтверждается достоверным
снижением уровня АЛТ, АСТ и билирубина, а так же нормализацией желчегонной функции печени.
Эффективность гепатопротектора Диронакс определяли в опытах, проведённых на базе государственного бюджетного учреждения «Уфимская городская ветеринарная станция». Собаки и кошки поступали в ветеринарную
клинику в возрасте от 1 года до 6 лет. В опыте были использованы беспородные кошки и собаки мелких и средних пород.
Диагностику гепатита у поступивших в ветеринарную лечебницу животных проводили с учётом анамнеза, клинических признаков, результатов
ультразвукового исследования органа, общего и биохимического анализа
крови, исключалось инфекционное и паразитарное происхождение заболевания.
Анализ морфологических и биохимических показателей крови проводили в день поступления заболевших животных, а также на 10-й и 20-й дне
лечения Диронаксом.
В ходе проведения производственных испытаний установлено, что у
собак при первичном и повторном взятии крови, содержание эритроцитов,
лейкоцитов было в пределах физиологической нормы.
При анализе лейкоцитарной формулы отмечено, что количество лимфоцитов, эозинофилов было выше физиологической нормы. Повышение данных показателей указывает на воспалительный характер желудочнокишечного тракта. Уровень нейтрофилов был понижен в начале эксперимента и составлял 57,38 ± 8,11 %, а на 20-й день лечения Диронаксом повышался
до физиологической нормы.
Установлено, что на момент начала опыта и на конец эксперимента не
изменялся уровень гематокрита, УОЭ, ССГЭ, СКГЭ и УОТ. Во все сроки
опыта они находились в пределах физиологической нормы.
При анализе биохимических показателей крови установлено, что в
начале у собак были повышены ГГТ, ЛДГ, АЛТ, АСТ, ЩФ.
129
Остальные показатели (альбумин, α-амилаза, креатинин, глюкоза, общий белок, холестерин и триглицериды) находились в пределах физиологической нормы и не изменялись в ходе эксперимента.
Таким образом, установлено, что введение препарата Диронакс при гепатите у собак на 20-й день лечения происходит нормализация морфологических и биохимических показателей крови.
В опытной группе у заболевших кошек уровень эритроцитов и гемоглобина оставался в пределах физиологической нормы во все сроки опыта.
Общее количество лейкоцитов в начале опыта было в среднем на 111,4%
выше, чем в норме. В дальнейшем, при лечении препаратом Диронакс, их
уровень понижался.
Установлено, что у кошек при гепатите на начало эксперимента было
снижено содержание лимфоцитов в среднем на 35,7 % и повышено количество нейтрофилов в среднем на 47 % от физиологической нормы. При терапии Диронаксом содержание лимфоцитов и нейтрофилов на 20-й день приходило к показателям физиологической нормы.
Показатели УОЭ и ССГЭ у кошек в целом были в пределах физиологической нормы в начале и конце эксперимента.
Установлено, что содержание тромбоцитов и УОТ в сыворотки крови
вначале опыта было понижено и составляло 226,83 ± 35,02 х 10 9/л и 11,08 ±
0,46 ф/л, соответственно. На 20-й день терапии Диронаксом их уровень составил 330,63 ± 40,95 х 109/л (тромбоциты) и 12,34 ± 0,68 ф/л (УОТ), что соответствует физиологической норме.
Уровень ГГТ составлял 9,37 ± 1,64 ед./л, что выше нормативных показателей на 56,1 %. К 10-му и 20-му дню лечения Диронаксом этот показатель
постепенно нормализовывался и составлял 7,89 ± 0,95 ед./л и 5,61 ± 0,57
ед./л, соответственно.
Уровень ЛДГ в начале исследования составлял 431,16 ± 43,64 ед./л или
на 51,2 % выше нормы. В дальнейшем, при даче препарата Диронакс, наблю130
далось также постепенное снижение данного показателя до уровня физиологической нормы.
Применение препарат Диронакс способствовало снижению уровня
ферментов АЛТ и АСТ у больных животных на 10-й и 20-й дни лечения.
В ходе проведения опыта установлено, что коэффициент де Ритиса у
больных животных был ниже уровня физиологической нормы для данного
вида животных. Так при первичном анализе крови у заболевших животных
отношение АСТ к АЛТ составило 0,56, на 10-й день лечения Диронаксом –
0,57 и на 20-й – 0,67, что говорит о нормализации данного параметра.
Уровень α -амилазы в крови опытных животных в начале исследования
был значительно повышен и составлял 2087,14 ± 187,8 ед./л. В дальнейшемпри терапии Диронаксом наблюдалось постепенное понижение данного показателя. Как было отмечено ранее зменение уровня α –амилазы не является
критерием специфичного теста при заболеваниях печени.
Количество глюкозы в сыворотке крови начале эксперимента был повышен и составлял 9,21 ± 0,63 ммоль/л. В дальнейшем наблюдалось нормализация данного показателя до 6,58 ± 0,44 ммоль/л (Р<0,01), что соответствовало физиологической норме.
Содержание общего белка и холестерина также было повышено в начале эксперимента. Введение в схему лечения препарата Диронакс способствовало нормализации данных показателей.
Уровень щелочной фосфатазы у кошек, поступивших с диагнозом гепатит был высоким и составлял 254,57 ± 49,8 ед./л. При введении Диронакса
на 20-й день эксперимента достоверно (Р<0,05) понизилась активность данного фермента в сравнении с исходными показателями.
При определении триглицеридов в сыворотке крови установлено, что
их содержание в сыворотке крови находилось в верхних пределах физиологической нормы.
Полученные данные, свидетельствуют о том, что введение в комплексную терапию при гепатите кошек гепатопротектора Диронакс нормализует
131
морфологические и биохимические показатели, что видно по представленным данным.
Исходя из данных, полученных нами при проведении клинических исследований, была рассчитана экономическая эффективность использования
Диронакса. Экономическая эффективность на рубль затрат составила 42,81
руб., что говорит о высокой степени экономической эффективности.
Проведенные исследования показали высокую лечебную активность
препарата Диронакс при заболеваниях печени домашних животных. Разработана и утверждена Временная инструкция по применению Диронакса.
132
ВЫВОДЫ
1. Методом, основанным на реакции образования цветного комплекса
диизопропиламмония дихлорацетата с бромтимоловым синим установлено,
что массовая доля основного вещества Диронакса составила 99,8%.
Срок годности Диронакса при 45°С в полимерных флаконах, укупоренных крышками с контролем первого вскрытия составляет 182 суток, что
соответствует сроку годности в 2 года при 20° С.
Определена кристаллическая структура Диронакса методом монокристального рентгеноструктурного анализа (РСтА).
2. Среднесмертельная доза (LD50) Диронакса составила при пероральном введении для белых мышей 2400 мг/кг (2068÷2784). Согласно ГОСТ
12.1.007. - 76 Диронакс относится к третьему классу опасности (умеренно
опасные вещества).
Применение Диронакса в дозе 25 мг/кг в течение 30 дней не вызывает
изменений морфологических и биохимических показателей крови, не оказывает отрицательного влияние на центральную нервную систему, функцию
почек, на массу органов и не вызывает гибели животных.
Диронакс не влияет на продожительность снотворного действия гексенала и хлоралгидрата, но уменьшает продолжительность сна, вызванного
тиопенталом.
3. При воспроизведении экспериментальных гепатитов, вызванных четыреххлористым углеродом, парацетамолом и этанолом, установлено, что
Диронакс не оказывает отрицательного влияния на функциональное состояние печени, обладает гепатозащитным и желчегонным действием.
При введении Диронакса происходит активация компенсаторноприспособительных процессов в печени, которые характеризуются гипертрофией гепатоцитов, активацией белкового обмена и регенерацией паренхимы печени.
133
4. При пероральном введении Диронакса в течение 20-и дней происходит нормализация морфологических и биохимических показателей крови собак, и кошек, заболевших гепатитом.
5. Экономическая эффективность Диронакса при лечении гепатита в
течение 20-и дней составила на рубль затрат 42,81 руб.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Для улучшения функционального состояния печени домашних животных (собак и кошек) при гепатопатиях различной этиологии, в том числе при
отравлениях, восстановления структуры повреждённой печени, а также для
профилактики заболеваний печени рекомендуется применение гепатопротектора Диронаксе в дозировке 25 мг/кг в течение 20 дней. Препарат задавать
животным индивидуально с кормом или небольшим количеством воды. Использование препарата регламентируется временной инструкцией по применению.
134
СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ ТЕРМИНОВ
ECM
печёночная внеклеточная матрица;
EPL
эссенциальные фосфолипиды;
АЛТ, АлАТ
аланинаминотрансфераза;
АСТ, АсАТ
аспартатаминотрансфераза;
АТФ
аденозинтрифосфат;
ГГТ
гамма-глутамилтранспептидаза;
ДИПА
диизопропиламин;
ДХУК
дихлоруксусная кислота;
КФК
креатинфосфокиназа;
ЛДГ
лактатдегидрогеназа;
МДА
малоновый диальдегид;
СДГ
сорбитолдегидрогеназа;
СКГЭ
средняя концентрация гемоглобина в эритроците;
СОЭ
скорость оседания эритроцитов;
ССГЭ
среднее содержание гемоглобина в эритроците;
УОТ
усредненный объем тромбоцитов;
УОЭ
усредненный объем эритроцитов;
ХЭ
холинэстераза;
ЩФ
щелочная фосфотаза.
135
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1.
Авакаянц, Б. Лeкapствeнныe paстeния в ветеринарной медицине /
Б. Aвaкaянц. – М.: "AКBAPИУM ЛTД'', 2001. – 3З6 c.
2.
Aкaeвский,
A.
И.
Aнaтoмия
домашних
животных
/
А.И.Акаевский, Ю.Ф.Юдичев, С.Б.Селезнев, под ред. С.Б. Селезнева. – 6-e
изд., испр. – М. Аквариум-Принт, 2009. – 638 с.
3.
Аляутдин, Р.Н. Фармакология / Под ред. Р.Н. Аляутдина. — 2-е
изд., испр. — М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. – 592 с.
4.
Антипов, В.А. Вопросы развития ветеринарной фармации / В.А.
Антипов, А.Н. Трошин // Ветеринария Кубани. - 2010 - № 6. – С.
5.
Антипов, В.А. Медикаментозные премиксы в животноводстве и
ветеринарии / В.А. Антипов, М.П. Семененко, С.Л. Соколовский// Матер,
междунар, координац, совещания «Экологические проблемы патологии,
фармакологии и терапии животных» - Воронеж, 1997. - С. 176.
6.
Арестов, И.Г. Фармакология / Под ред. И.Г. Арестова. – Ростов-
на-Дону: Изд-во «Феникс», 2001. – 320 с.
7.
Астафьев, В.А. Основы фармакологии с рецептурой: учебное по-
собие / В.А. Астафьев. – М.: КНОРУС, 2013. – 544 с.
8.
Беленький, М.Л. Элементы количественной оценки фармаколо-
гического эффекта / М.Л. Беленький. – Ленинград: Медгиз, 1963. – 146 с.
9.
Бабкина, Т.Н. Новое в диагностике, терапии и профилактике не-
заразных болезней животных / Т.Н. Бабкина, Г.Г. Таран. – М.: Колос, 2002. –
С.21-23
10.
Бажибина,
Е.Б.
Методы
основы
оценки
клинико-
морфологических показателей крови домашних животных / Е.Б. Бажибина,
А.В. Коробов, С.В. Середа, В.П. Сапрыкин. – М.: ООО «Аквариум-принт»,
2007. – 128 с.
136
11.
Байматов, В.Н. Морфологические и биохимические изменения в
организме животных и человека при патологии печени / В.Н. Байматов, Э.Г.
Давлетов. – М.,1998. – 147с.
12.
Байматов, В.Н. Патологическая физиология / В.Н. Байматов, В.М.
Мешков, А.Г. Савойский. – М.: КолосС, 2008. - 541с.
13.
Барановский, А.Ю. Гастроэнтерология: Справочник / Под ред. А.
Ю. Барановского. — СПб.: Питер, 2013. — 512 с.
14.
Баринов, Н.Д. Гастроэнтерология в ветеринарии: Учебное посо-
бие / Н.Д. Баринов, А.В. Коробов, И.И. Калюжный, Г.Г. Щербаков. – М.:
«Аквариум-принт», 2006. – 192 с.
15.
Барр, Ф. Ультразвуковая диагностика собак и кошек / Ф. Барр. –
М.: «Аквариум-принт», 2010. – 208 с.
16.
Безродных, А.А. Терапевтическое действие дипромония / А.А.
Безродных, Л.А. Копылова, Т.П. Куликова // Сов. Мед. – 1969. – №7. – С.169
17.
Белов, А.Д. Болезни собак: справочник / А.Д. Белов, Е.П. Дани-
лов, И.И. Дукур. – М.: Агропромиздат, 1990. - 368 с.
18.
Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакокинетика. Практика дози-
рования лекарств: Спец. выпуск серии «Рациональная фармакотерапия» / Ю.
Б. Белоусов, К. Г. Гуревич. — М.: Литтерра, 2005. — 288 с.
19.
Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия:
Руководство для врачей / Ю.Б. Белоусов, В.С. Моисеев, В.К. Лепахин. –
Изд. 2-е. — М.: Универсум паблишинг, 1997. – С. 421-423
20.
Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология: национальное руко-
водство / под ред. Ю.Б. Белоусова, В.Г. Кукеса. В.К. Лепахина. В.И. Петрова. –
М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009. – 976 с.
21.
Бергхов, П.К. Мелкие домашние животные. Болезни и лечение /
Пер. с нем. И. Кравец. Изд. 2, испр.и доп. – М.: «АКВАРИУМ-ПРИНТ»,
2006. – 224 с.
22.
Бикхард, К. Клиническая ветеринарная патофизиология / К. Бик-
хард. – М.: Аквариум, 2005. - 397с.
137
23.
Болезни собак: Справочник / Сост. Проф. А.И.Майоров. – 3-е
изд., перераб.и доп. – М.: Колос, 2001. – 472 с.
24.
Бузлама, В.С. Лигфол – новый отечественный ветеринарный пре-
парат широкого спекта действия / Беркович А.М., Бузлама В.С., Бузлама С.В.
и др. Лобашова О.В. // Ветеринарная практика. - 2003. - №3(22). - С.23-27.
25.
Бурбелло, А. Т. Современные лекарственные средства: Клинико-
фармакологический справочник практического врача / А.Т. Бурбелло, А.В.
Шабров, П.П. Денисенко. – 3-е издание, переработанное и дополненное. —
СПб.: Издательский Дом «Нева», 2004. — 896 с.
26.
Буреш, Я. Методики и основные эксперименты по изучению моз-
га и поведения / О. Буреш, Д. П. Хьюстон. – М.: "Высшая школа", 1999. – С.
119 – 122
27.
Бурмистров, Е.Н. Клиническая лабораторная диагностика. Ос-
новные исследования и показатели / Е.Н. Бурмистров. – М.: Шанс, 2002. – 18
с.
28.
Бьурж В. Диетическое кормление — основа поддержания здоро-
вья животных при заболеваниях печени /Винсент Бьюрж //Veterinary Focus.
№20 - 2010.- C.16
29.
Венгеровский, А.И. Механизм действия гепатопротекторов при
токсических поражениях печени / А.И. Венгеровский, А.С. Саратиков //
Фармакология и токсикология. – 1988. – Т. 51, №1. – С. 89-92
30.
Волкова, Е. С. Влияние карсила и оксиметиурацила на функцию
печени / Е.С. Волкова, В.Н. Байматов // Ветеринария. – 2002. – №1. – С.48-50
31.
Воложин, А.И. Патофизиология. В 3 т.: учебник для студ. высш.
учеб. заведений / Под ред. А.И. Воложина, Г.В. Порядина. – Т.3. – М.: Издательский центр «Академия», 2006. – 304 с.
32.
Воскобойников В.Ф. Организационно-коммерческий справочник
ветеринарного специалиста: Справочное пособие. – 2-е изд., перераб.и доп. –
М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС, 1999. – 368 с.
138
33.
Высоцкий, Р.А. Сравнительная характеристика морфологических
и функциональных исследований при патологии печени у собак: Автореф.
дис. канд. вет. наук / Р.А. Высоцкий. – М., 2001. – 22 с.
34.
Вышковский, Г.Л. Регистр лекарственных средств России РЛС.
Доктор: Гастроэнтерология и гепатология. — 16,й вып. / Под ред. Г.Л. Вышковского.— М.: ЛИБРОФАРМ, 2012.— 512 с.
35.
Гаевый, М. Д. Фармакология: Учебник для вузов / Под ред. проф.
В.И, Петрова. — М.: ИКЦ «МарТ», 2008. – 560 с.
36.
Гребнев, A. Л. Руководство по гастроэнтерологии / А.Л. Гребнев,
А.И. Хазанов // Болезни печени и билиарной системы, Медицина. – Т.2, 1995.
– с.528
37.
Данилевский, В.М. Внутренние незаразные болезни сельскохо-
зяйственных животных / Под ред. В.М. Данилевского. М.: Агропромиздат,1991. – 123 с.
38.
Денисенко, В.Н. Диагностика и лечение болезней печени у собак
/ В.Н. Денисенко, Е.А. Кесарева. – М.: КолосС, 2006. – 63 с.
39.
Денисенко, В.Н. Диагностика и лечение болезней печени у собак
и кошек / В.Н. Денисенко, Е.А. Кесарева и др. – М.: КолосС, 2012. – 112 с.
40.
Джексон, М. Ветеринарная клиническая патология / М. Джексон.
– М.: «Аквариум-принт», 2009. – 384 с.
41.
Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. – Пер с англ. – М.:
Мир, 1982. – Т1. – 392 с.
42.
Диксон, М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб. – Пер с англ. – М:
Мир, 1982. – Т3. – 1120 с.
43.
Дональд, К. Фармакологические препараты в ветеринарной ме-
дицине / К. Дональд. – М.: Аквариум, 2002. – c.445
44.
Дударев, А.А. Влияние гепатопротекторного препарата диронакс
на биохимические показатели крови и ее морфологический состав / А.А.
Дударев, И.Р. Кильметова // Наука молодых – инновационному развитию
139
АПК: материалы VI Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых. – Уфа: Башкирский ГАУ, 2013. – С. 78-81
45.
Дударев, А.А. Влияние гепатопротекторного препарата диронакс
на функцию центральной нервной системы / А.А. Дударев, И.Р. Кильметова,
Б.П. Струнин // Научное обеспечение АПК. Итоги и перспективы. Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 70летию ФГБОУ ВПО Ижевская ГСХА. – 2013. – Т.1. – C. 176-178
46.
Дударев, А.А. Влияние гепатопротекторного препарата диронакс
на функцию почек при водной нагрузке / А.А. Дударев, И.Р. Кильметова,
Б.П. Струнин // Состояние и перспективы увеличения производства высококачественной продукции сельского хозяйства. Материалы II Всероссийской
научно-практической конференции с международным участием. – Уфа: Башкирский ГАУ,2013. – С. 45-46
47.
Дударев, А.А. Воздействие гепатопротекторного препарата диро-
накс на внутренние органы крыс / А.А. Дударев, И.Р. Кильметова // Вестник
Башкирского Государственного аграрного университета. – 2013. - №4. – С.
36-38
48.
Дударев, А.А. Определение гепатопротекторного и желчегонного
препарата диронакс при поражении печени парацетамолом у крыс / А.А.
Дударев, И.Р. Кильметова, Б.П. Струнин, С.Ф. Габдрахманова, Т.А.
Спаожникова // Труды Кубанского Государственного аграрного университета. – 2013. – №4. – C. 214-216
49.
Дударев, А.А. Эффективность нового гепатопротектора диронакс
при экспериментальном поражении печени этанолом / А.А. Дударев, И.Р.
Кильметова, Б.П. Струнин, Р.Ю. Хисамутдинова, Н.С. Макара // Ветеринария
Кубани. – 2013. – №3. – С. 17-19
50.
Дударев, А.А. Эффективность нового гепатопротектора диронакс
при экспериментальном поражении печени четыреххлористым углеродом /
А.А, Дударев, И.Р. Кильметова // Молодежная наука и АПК: проблемы и
140
перспективы. Материалы V Вероссийской научно-практической конференции молодых ученых. – Уфа: Башкирский ГАУ, 2012. – С.50-52
51.
Европейская Конвенция о защите позвоночных животных, ис-
пользуемых для экспериментов или в иных научных целях. – Страсбург, 18
марта – 1986.
52.
Жаров, А.В. Вскрытие и патоморфологическая диагностика бо-
лезней животных / Под ред. А.В. Жарова. – М.: Колос, 2000 – 400 с.
53.
Жуленко В.И. Общая и клиническая ветеринарная рецептура. –
М.: Колос, 2000. – 463 с
54.
Зайцев, С.Ю. Биохимия животных / С.Ю. Зайцев. – М.: Лань,
2004. – 340 с.
55.
Ивашкин, В.Т. Гастроэнтерология: национальное руководство /
под ред. В.Т. Ивашкина, Т.Л. Лапиной. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – 704 с.
56.
Ивашкин, В.Т. Рациональная фармакотерапия заболеваний орга-
нов пищеварения: Рук.для практикующих врачей / В.Т. Ивашкин. Т.Л. Лапина и др.; Под общ. ред. В.Т. Ивашкина. — М.: Литтерра. 2003.— 1046 с.
57.
Йин, С. Полный справочник по ветеринарной медицине мелких
домашних животных / С. Йин. Пер. с англ. – М.: ООО «Аквариум-Принт»,
2008 – 1024 с.
58.
Инструкция по применению гомеопатического препарата Лиар-
59.
Инструкция по применению питательной добавки ГлютаМакс
син
для улучшения функции печени
60.
Инструкция по применению препарата Гепавет для лечения и
профилактики заболеваний печени
61.
Инструкция по применению препарата Гепалон для лечения и
профилактики заболеваний печени, утвержденная Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ
62.
Инструкция по применению препарата ГЕПАТОВЕТ для лечения
и профилактики заболеваний печени у кошек и собак
141
63.
Инструкция по применению препарата Гепатоджект для лечения
и профилактики заболеваний печени
64.
Ионов, П.С. Внутренние незаразные болезни крупного рогатого
скота / Под ред. П. С. Ионова. — 4-е изд., перераб.и доп. — М.: Агропромиздат, 1985. — 383 с.
65.
Казаков, Д.Н. Этиология, диагностика и лечение при гепатитах у
собак: Автореф.дис. … канд. вет.наук / Д.Н. Казаков. – СПб, 2004. – 20 с.
66.
Кайзер, С. Терапия мелких домашних животных / С. Кайзер. –
М.: «Аквариум-принт», 2010. – 416 с.
67.
Каркищенко, Н.Н. Клиническая и экологическая фармакология в
терминах и понятиях / Н.Н. Каркищенко. — М.: 1МР-Медицина, 1995. – 304
с.
68.
Касьяненко, И.И. Патологическая анатомия болезней органов же-
лудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных / И.И. Касьяненко, В.Э. Прусак-Глотов. – М.: МГАПБ, 1995. – 34 с.
Кесарева, Е.А. Клиническая интерпретация биохимических по-
69.
казателей сыворотки крови собак и кошек / Е. А. Кесарева, В. Н. Денисенко.
– М.: КолосС, 2011. – 34 с.
Козинец, Г.И. Интерпретация анализов крови и мочи и их кли-
70.
ническое значение / Г.И. Козинец. – М.: «Триада-Х», 1998. – 104 с.
Кокуричев, П.И. Патологическая анатомия сельскохозяйствен-
71.
ных животных / П.И. Кокуричев, Б.Г. Домин, М.П. Кокуричева. – СПб.: Агропромиздат, 1994. – 212 с.
72.
Комаров, А.А. Методы оценки качества и безопасности кормов и
кормовых добавок / А.А. Комаров // Ветеринария. – 2001. – №1. – С. 51-56
73.
Комарова, Г.В. Болезни кошек / Г.В. Комарова. – М.: Аквариум,
2005. – 63 с.
74.
Кондрахин, И.П. Методы ветеринарной клинической лаборатор-
ной диагностики: Справочник / Под ред. проф. И.П. Кондрахина. – М.: КолосС, 2004. – 520 с.
142
75.
Кошкин В.М. Применение дипромония в комплексной терапии
больных с хронической артериальной недостаточностью нижних конечностей / В.М. Кошкин // ЭИ. Новые Лекарственные препараты. – 1983. – №4. –
С. 14-16
76.
Краснюк, И.И. Фармацевтическая гомеопатия: учеб.пособие для
студ. высш.учеб.заведений / И.И. Краснюк, Г.В. Михайлова; под ред. Н.А.
Замаренова. – М.: Издательский центр «Академия», 2005. – 272 с.
77.
Красочко, П.А. Болезни сельскохозяйственных животных / П.А.
Красочко, М.В. Якубовский, А.И. Ятусевич и др. — Минск,2005. – 386 с.
78.
Крыжановский, С. Л. Фармакология. В 2 т.: учеб.для студ. сред.
проф. учеб. заведений / С. А. Крыжановский. — Т. 2. — М.: Издательский
центр «Академия», 2007. — 352 с.
79.
Кудинова, Н.А, Гепатозы собак и их терапия с применением
биологически активных веществ в гомеопатических концентрациях: Автореф. дис. … канд. вет. наук. – Воронеж, 2005. – 25 с.
80.
Кузнецов Г.С., Протасов А.И. Справочник по ветеринарии – Л.:
«Колос», 1999 - 768 с
81.
Кукес, В.Г. Клиническая фармакология / Под ред. В.Г. Кукеса. —
3-е изд., перераб.и доп. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. — 944 с.
82.
Кучерук, Л.Ю. Незаразные болезни печени / Л.Ю. Кучерук:
учебное пособие. – М.: Наука, 1998. – 309 с.
83.
Лапина, Т.И. Морфология печени мелких плотоядных животных
/ Т.Н. Лапина. – М.: ИРИУС, 1999. – 435 с.
84.
Ленинджер, А. Основы биохимии: В 3-х т. Т. 2 / А. Ленинджер.
Пер. с англ. – М.: Мир, 1985. – 368 с.
85.
Логинов, А.С. Хронические гепатиты и циррозы печени / А.С.
Логинов. – М.: Медицина, 1987. – С.45
86.
Логинов, A.C. Хронические заболевания печени / A.C. Логинов.
– М.: Медицина, 1997. - 241с.
143
Майский В.В. Фармакология. Учебное пособие / В.В. Майский
87.
— М.: 2003. – 543 с.
Манто, И.Е. Состав аминокислот плазмы крови при гепатобили-
88.
арной патологии / М.Е. Манто: учебное пособие. – Киев: Украина, 1996. —
238 с.
Маркова, И.В. Фармакология / И.В. Маркова, И.Б. Михайлов,
89.
М.В. Неженцев. – СПб.: Фолиант, 2001 – 415 с.
Маршалл, В. Дж. Клиническая биохимия / В. Дж. Маршалл, С.К.
90.
Бангерт. – 6-е изд., перераб.и доп. Пер. с англ. БИНОМ – Диалект, 2014. - 408 с.
91.
Машковский, М.Д. Лекарственные средства: Пособие для врачей.
/ М.Д. Машковский. – 14-е изд. — М.: Изд-во Новая Волна, 2002. - Т. 1. – С.
506-510
92.
Меркулов, Г.А. Курс патогистологической техники / Г.А. Мер-
кулов. – М., 1969. – 426 с.
93.
Мишанин Ю.Ф., Мишанин М.Ю. Практическая ветеринария:
Учебное пособие. – Ростов н/Д: Издательский центр «МарТ», 2002. – 384 с.
94.
Мухутдинова, Д.М. Распространенность и клиническая симпто-
матика некоторых патологий внутренних органов мелких домашних животных / Д.М. Мухутдинова, Г.А. Пахомов // Ветеринарная медицина домашних
животных: Сб. статей. – Казань, 2006. – №3. – С.37-40
95.
Мюллер, Г. Болезни собак / Г. Мюллер. – М.: РИО «Денница»,
1992. – 89 с.
96.
Налетов, Н.А. Патологическая физиология и патологическая ана-
томия животных / Н. А. Налетов, И. В. Иванов, П. Д. Федоров, В. Ф. Черкашин. — М.: Агропромиздат, 1991. — 352 с.
97.
Налетов, С.В. Клиническая фармакология / Под ред. И.А. Зупан-
ца, С.В. Налетова, А.П. Викторова. – Харьков: Изд-во НФаУ: Золотые страницы, 2005. – 400 с.
144
98.
Никитин И.Н., Воскобойник В.Ф. Организация и экономика вете-
ринарного дела: Учеб. для студ. вузов. – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: Гуманит. изд. центр ВЛАДОС, 1999. – 384 с
99.
Нил, М.Дж. Наглядная фармакология: пер. с англ / Под редакци-
ей М.А. Демидовой. – М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999. – 104 с.
100. Ниманд, Х.Г. Болезни собак / Х.Г. Нигманд, П.Б. Сутер. – М.:
Аквариум, 2001. – 303 с.
101. Нугуманова, Г.Н. Биологическая активность производных изатина, функционализированного пространственно затрудненными фенолами /
Г.Н. Нугуманова, Р.Г. Тагашева, С.В. Бухаров, Н.А. Мукменёва, Ю.Н. Олудина, Л.Ф. Саттарова, Б.П. Струнин, В.А. Антипов, П.А. Гуревич // Вестник
Казанского технолог. ун-та. – 2010. – №10. – С. 91-95
102. Огурцов, А. Н. Клиническая диагностика и скорая ветеринарная
помощь при болезнях собак и кошек / А.Н. Огурцов: учебное пособие. – М.:
Аквариум, 2005. – 157 с.
103. Оковитый, С.В. Гепатопротекторы / С.В. Оковитый, Н.Н. Безбородкина, С.Г. Улейчик, А.В. Соляник, С.Н. Шуленин. – М.: ГЭОТАР – Медиа, 2010. – 112 с.
104. Оковитый, С.В. Клиническая фармакология гепатопротекторов /
С.В. Оковитый, С. Н. Шуленин. – СПб.: Изд-во ВМА, 2006. – 80 с.
105. Пальцев, М.А. Патологическая анатомия в 2 томах / М.А. Пальцев, Н.М. Аничков – Т.1.ч.1 – М.: Медицина, 2000 – 528 с.
106. Пальцев, М.А. Патологическая анатомия в 2 томах / М.А. Пальцев, Н.М. Аничков – Т.2.ч.2 – М.: Медицина, 2001 – 736 с.
107. Петров, В. В. Эффективность терапии острых отравлений собак /
В.В. Петров, Ю.Г. Зелютков // Материалы 9 международного конгресса по
болезням мелких животных, 2001. – с.156-157
108.
Плисов, В. А. Новейший справочник фармацевта / В.А. Плисов,
С.Н. Березина. – М.: ООО «Дом Славянской книги», 2013. — 800 с.
145
109. Подгорнова, Е.Д. Сравнительное изучение морфологии печени /
Е.Д. Подгорнова: учебное пособие. – М.: Новая волна, 2005. – 156 с.
110. Подымова, С.Д. Болезни печени / С.Д. Подымова. – М.: Медицина, 2005. – 768 с.
111.
Полищук, Ф.И. Кинология / Ф.И. Полищук, А.Л. Трофименко. –
К.: «Перун», 2007. – 600 с.
112.
Рабинович, М.И. Лекарственные растения в ветеринарной прак-
тике: Справочник / М.И. Рабинович – М.: Агропромиздат, 1987. – 288 с.
113. Радченко, В.Г. Основы клинической гепатологии: Заболевания
печени и билиарной системы / В.Г. Радченко. – М.: Изд. «Бином», 2005. – С.
862
114.
Роудер Джозеф Д. Ветеринарная токсикология / Пер. с англ. М.
Степкин. — М.: ООО «АКВАРИУМ БУК». 2003. – 416 с.
115. Северина, Е.С. Биохимия / Е.С. Северина. — М.: Аквариумпринт, 2003. – С. 779
116. Серов, В.В. Морфологическая диагностика заболеваний печени /
В.В. Серов, К. Лапиш. – АМН СССР. – М.: Медицина, 1989. – 336 с.
117.
Сидоров, И.В. Справочник по лечению собак и кошек с описани-
ем лекарственных средств / И.В. Сидоров, В.В. Калугин и др. – М.: Нива России: Издательский дом «ОНИКС 21 век», 2001. – 576 с.
118. Симпсон, Д. Болезни пищеварительной системы собак и кошек /
Под редакцией В.В. Гриценко. — М.: ООО «АКВАРИУМ БУК», 2003. — 496
с.
119.
Слесаренко, Н.А. Анатомия собаки. Висцеральные системы
(спланхнология): учебник / Н.А. Слесаренко, Н.В. Бабичев, А.И. Торба, А.Е.
Сербский; ред. проф. Н.А. Слесаренко. – СПб.: Изд-во «Лань», 2004. – 88 с.
120. Слободяник, B.C. Морфология печени домашних животных
при гепатодистрофии / B.C. Слободяник: учебное пособие. – М.: Лань, 2007.
– 277с.
146
121. Созинов, В.А. Современные лекарственные средства для лечения
собак и кошек / В.А. Созинов, С.А. Ермолина – М.: «АКВАРИУМ ПРИНТ»,
2004. – 496 с.
122. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России 2012 /
Под ред. Е.А. Лицаревой, Е.А. Толмачевой – М.: АстраФармСервис, 2012. –
1664 с.
123. Cтapчeнкoв, С.В. Бoлeзни мeлких животных: диaгнoстикa,
лeчeниe, пpoфилактика / С.В. Старченков – CПб.: Издaтeльство «Лaнь»,1999.
– 512 c.
124. Струнин, Б.П. Разработка методов аналитического контроля препарата Полизон / Б.П. Струнин, П.А. Гуревич, В.А. Антипов, Т.Б. Пахомова,
Ю.Е. Сапожников, Л.Ф. Саттарова // Вестник Казанского технол. ун-та. –
2010. – №9. – С.84-88
125.
Струнин, Б.П. Структура лекарственного средства диизопропи-
ламмония дихлорацетата / Б.П. Струнин, П.А. Гуревич, Т.Б. Пахомова, И.Р.
Кильметова, А.А. Дударев, В.Н. Калашник, Ю.Е. Сапожников, Л.Ф. Саттарова, Я.Н. Львович // Вестник Казанского технол. ун-та. – 2013. – №1. – С.179181
126. Субботин В.Н., Субботин С.Г. Современные лекарственные средства в ветеринарии. – Ростов-на-Дону.: Феникс,2000 г. – 385 с.
127.
Сутер, П. Болезни собак. 10-е изд. перераб.и расшир. / Под ред.
П. Сутера, Б. Кона. – М.: «Аквариум-принт», 2011. – 1360 с.
128. Тареев, Е.М. Классификация болезней печени / Е.М. Тареев:
учебное пособие. — М.: Медицина, 1991. — 293с.
129. Тили, Л. Болезни собак и кошек / Л. Тили, Ф. Смит. – М.:
ГЭОТАР-МЕД, 2001. – С. 46-49
130.
Торранс, Э. Дж. Руководство по эндокринологии мелких домаш-
них животных практическое руководство / под ред. Э.Д. Торранса, К.Т. Муни. - Изд. 2-е. - М.: Аквариум-Принт, 2006. - 312 с.
147
131. Уколова, М. В. Гепатиты собак в условиях мегаполиса: Автореф.
дис… канд. вет. наук / Уколова М. В. – М., 2005. – 26 с.
132. Уша, Б.В. Болезни печени собак / Б.В. Уша, И.М. Беляков – М.:
ПАЛЬМА пресс, 2002. – 377 с.
133. Уша, Б.В. Ветеринарная гепатология / Б.В. Уша. – М.: Колос,1979. – 263 с.
134. Уша, Б.В. Клиническая диагностика внутренних незаразных болезней животных / Б.В. Уша, И.М. Беляков, Р.П. Пушкарев
135. Уша, Б.В. Вторичная жировая дистрофия печени у собак / Б.В.
Уша, Э.В. Жавнис, Т.Б. Горовая // Актуальные проблемы ветеринарносанитарного контроля и биологической безопасности с.х. продукции. – М.,
МГУПБ, 2004. – C.181
136.
Фрейм, М. Ультразвуковая диагностика заболеваний мелких до-
машних животных / М. Фрейм, Ш. Редроб, Э. Дики, Й. Ленг, В. Шмид, П.
Маннион. – М.: «Аквариум-принт», 2008 – 320 с.
137.
Хабриев, Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиниче-
скому) изучению новых фармакологических веществ. – М.: Медицина, 2005.
– 832 с.
138. Хазанов, А.И. Особенности лекарственных и вирусных поражений печени / А.И. Хазанов, О.Н. Румянцев, А.В. Калинин // Клинический
вестник – №1, 2000. – С. 58-50
139.
Харкевич, Д.А. Фармакология: Учебник — 9-е изд., перераб.,
доп. и испр / Д.А. Харкевич — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. — 736 с.
140.
Хмельницкий, Г.А. Терапия животных при отравлениях / Г.А.
Хмельницкий. – К.: Урожай, 1990. – 216 с.
141.
Холл, Э. Гастроэнтерология собак и кошек / Э. Холл, Д. Симп-
сон, Д. Уильямс. – М.: «Аквариум-принт», 2010. – 416 с.
142.
Чандлер, Э.А. Болезни кошек / Э.А. Чандлер, Р.М. Гаскелл,
К.Дж. Гаскелл. – М.: «Аквариум-принт», 2011. – 712 с.
148
143. Шарабрин, И.Г. Внутренние незаразные болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. Шарабрина И.Г. – М.: Колос, 1976 – 602 с.
144.
Шишков, В.П. Ветеринария. Большой энциклопедический сло-
варь / В.П. Шишков. – М.: АСТ, 1998. – 640 с.
145. Шульпекова, Ю. О. Патология печени: лекарственные поражения
печени / Ю.О. Шульпекова // Консилиум медикум. – т. 8. – № 7, 2006. –
С.37-39
146.
Щербаков, Г.Г. Cпpaвoчник ветеринарного терапевта: Учeбнoe
пoсoбиe. 5-e изд. испp. и дoп. / Пoд peд. пpoф. Г. Г. Щербaкoвa. – СПб.,
Издaтельcтвo «Лaнь», 2009. – 656 с.
147.
Щербаков, Г.Г. Внутренние болезни животных / Под общ. ред.
Г.Г. Щербакова, А.В. Коробова. СПб.: - Издательство «Лань», 2002 – 736 с.
148.
Щербаков, Г.Г. Практикум по внутренним болезням животных /
Под общей редакцией заслуженного деятеля науки РФ, профессора Г.Г.
Щербакова и профессора А. В. Коробова. — СПб.: Издательство «Лань»,
2003. — 544 с.
149.
Энтони, П.К. Секреты фармакологии / Пер. с англ. под ред. Д.А.
Харкевича. – М.: Медицинское информационное агенство, 2004. – 384 с.
150.
Яхонтов, Л.Н. Синтетические лекарственные средства / Под ред.
А.Г. Натрадзе. – М.: Медицина,1983. – 272 с.
151. Alshawsh, M. Hepatoprotective Effects of Orthosiphon stamineus Extract on Thioacetamide-Induced Liver Cirrhosis in Rats / M. Alshawsh, M. Abdulla, I. Salmah, and A. Zahra// Evidence-Based Complementary and Alternative
Medicine. – Volume 11, 2011. – P. 21-27.
152. APEX2 (Version 2.1), SAINTPlus. Data Reduction and Correction
Program (Version 7.31A), Bruker Advansed X-ray Solutions, BrukerAXS Inc.
Madison, Wisconsin, USA, 2006.
153. Carruthers, S.G. Melmon and Morrelli's Clinical Pharmacology, 4th
Edition / S.G. Carruthers, B. Hoffman, K. Melmon, D. Nierenberg. – Elsevier Inc,
2012. – P.386.
149
154. Duke, J. A. Handbook of medicinal herbs / James A. Duke, with Mary
Jo Bogenschutz-Godwin, Judi duCellier, Peggy-Ann K. Duke. – 2nd ed., 2002. –
871 p.
155.
Ettinger, S.J. Textbook of Veterinary Internal Medicine / S.J.
Ettinger, E.C. Feldman. – 6th edition (2 Volume set) Volume 2, 2010. – P. 1079.
156. Ettinger, S.J. Textbook of Veterinary Internal Medicine / S.J. Ettinger,
E. Feldman. – 6th edition (2 Volume set) Volume 1, 2010. – P. 912.
157.
Farrugia, L.J. WinGX Suite for Single Crystal Small Molecule Crys-
tallography / L. J. Farrugia, J. Appl. Cryst. 1999. – P. 837-838.
158. Fossum, T.W. Small animal surgery / С. S. Hedlund, D.A. Hulse, A.L.
Johnson. – Mosby, 1997. – P. 367-401.
159.
Gagliano, N. Mechanism of aging and liver functions / N. Gagliano,
F. Grizzi, G. Annoni. – Digest. Dis. Sci., 2007. – P. 118-123.
160.
Gould, T.D. Mood and Anxiety Related Phenotypes in Mice, Neuro-
methods 42, DOI 10.1007/978-1-60761-303-9_1, Humana Press, a part of Springer
Science+Business Media, LLC, 2009.– P. 45-57.
161. Hall, C.S. Emotional behavior in the rat. III. The relationship between
emotionality and ambulatory activity / C.S. Hall. J. comp. physiol. Psychol. volume 22, 1936. – P. 345-352.
162.
Harvey, R.A., Champe Pamela C. Lippincott's Illustrated Reviews:
Pharmacology / R.A. Harvey. – 4th Edition. Copyright В©2009 Lippincott Williams & Wilkins, 2009. – P.882.
163. Katzung, B.G. Basic & Clinical Pharmacology, 11th Edition /
B. G. Katzung, S. B. Masters, A. J. Trevor. Copyright by The McGraw-Hill Companies, Inc. All rights reserved. Printed in China, 2000. – P. 16-18.
164.
Lullmann, H. Color Atlas of Pharmacology / H. Lullmann, K. Mohr,
A. Ziegler, D. Bieger, J. Wirth. – 2nd edition revised and expanded. Georg Thieme
Verlag, Rudigerstrasse14, Stuttgart, Germany, 2000. – 386 p.
165.
Macovei, N. Diagnosticul paraclinic si incidenta hepatopatiilor la
doge / N. Macovei, 2004. – P.14.
150
166.
Mandjori, S. The secrets of clinical diagnostics the small animals / S.
Mandjori, 2004. –P.427.
167.
Martin, R. A. Liver and biliary system / R.A. Martin, O.I. Lanz, K.M
Tobias. – Textbook of small animal surgery, et 3, WB Saunders, 2003. – P. 145167.
168.
Mayhew, P.D. Choledochal tube stenting for decompression of the
extrahepatic portion of the biliary tract in dogs: 13 cases / P.D. Mayhew, R.W.
Richardson, S.J. Mehler et coll. // Journal of the American Veterinary Medical Association, Volume 228, 2006. – P. 1209-1214.
169. McGowan C. Animal physiotherapy: assessment, treatment and rehabilitation of animals / С. McGowan, L. Goff, N. Stubbs, 2007. – P. 258.
170.
McSherry, B.J. Hyperbilirubinemia in sick dogs with liver deseases /
B.J. McSherry, 1994. –P.211.
171.
Nelson, R.W. Manual of small animal internal medicine / R.W. Nel-
son, C. Couto. – Elsevir Mosby, 2005. – P. 326-415.
172. Nelson, R.W. Manual of small animal small internal medicine / R.W.
Nelson, C. Couto, 1999 by Mosby inc. – P. 953.
173.
Ogilvie, T. Large animal internal medicine / T. 0gilvie.-1st ed., 1998.
– P. 515.
174.
Ozbek, H.S. Hepatoprotective effect Foeniculum vulgare essential
oil: A carbon tetrachloride induced liver fibrosis model in rats / H.S. Ozbek, I.
Ugras, I.U. Bayram, E. Erdogan. – Scand. J. Anim. Sci., 2004. – P. 9-17.
175.
Phaneendra, B., Hepatoprotective herbs: an overwiev / B. Phaneedra
// IJPRD. Vol 3(3), 2011. – P.105 – 111.
176.
Popp, J.P. Cell mediated immune responses to liver membrane pro-
tein in canine chronic hepatitis / J.P. Popp. – Veter. Immunol, Immunopathol., Vol.
57(314),1997. – P.169-178.
177.
Ramsey, I. Small Animal Formulary / I. Ramsey. – 6th Edition. Cop-
yright, BSAVA, 2008. – P. 409.
151
178.
Richards, D. Oxford Handbook of Practical Drug Therapy / D. Rich-
ards, J. Aronson. – Edition Copyright В, 2005. Oxford University Press, 2009. – P.
22-23.
179.
Rutgens, H.G. Covalently protein bound bilirubin conjugates in cho-
lestatic disease of dogs / H.G. Rutgens, S. Haywood. – Am.J.Vet.Res., 1988. –
№49. – P. 702-704.
180.
Sevelius, E. Chronic liver disease in the dogs / E. Sevelius, 1995. –
181.
Shanani, S. Evaluation of hepatoprotective efficacy of APCL-A poly-
136 p.
herbal formulation in vivo in rats / S.Shanani // Indian Drugs. – vol.36, 1999. – P.
628-631.
182.
Sheldrick, G.M. SHELXL97 Program for Solution of Crystal Struc-
ture determination, University of Gottingen, 1997.– P. 35-38.
183.
Sherlock, S. Chronic liver disease in the dog / S. Sherlock, V. Walshe
// Swedish University of Agricultural Science, Department of Pathology, Dissertation, Uppsala, 1995. – 221 p.
184.
Simeone, J.F. The sonographic diagnosis of acute gongrenous chole-
cystitis: importance of the Murphysing / J.F. Simeone, J.A. Brink, P. Mueller //
Vol. 152. ARJ, 1989. – P. 289-292.
185.
Sweetman, S. C. Martindale. The Complete Drug Reference (36 ed.)
© Pharmaceutical Press, 2009. – P. 22-23.
186.
Vatne, M. Glycoproteins and chronic liver disease in the dog / M.
Vatne, 2002, – P. 34-47.
187.
Williams, J.M. The liver and biliary tract / J.M. Williams, D.N.
Jacqui. – BSAVA Manual of Canine and Feline Abdominan Surgery, BSAVA,
2005. – P. 168-194.
188.
Wong, W. Hepatoprotective Effects of Panus giganteus (Berk.) Cor-
ner against Thioacetamide- (TAA-) Induced Liver Injury in Rats / W. Wong, M.
Abdulla, K. Chua, U. Kuppusamy, Y. Tan, and V. Sabaratnam. // Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine. Volume 3, 2012. – P. 185-187.
152
189.
Yamada, T. Serum alpha-fetoprotein values in dogs with various he-
patic diseases / Т. Yamada, M. Fujita, S. Kitao et coll // Journal Vet Med Sci.,
1999. – P.61-657.
153