4. обсуждение

1
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии
имени К.И.Скрябина»
(ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)
на правах рукописи
МАРЗАНОВА Саида Нурбиевна
Разработка генодиагностики комплекса аномалий позвоночника
[CVM] и иммунодефицита[BLAD]
у животных черно-пестрого голштинизированного скота
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор,
член-корреспондент Россельхозакадемии
Девришов Давудай Абдулсемедович
Москва - 2012
2
СОДЕРЖАНИЕ
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.
1.7.
1.8.
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………….……………..
4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………
8
1.1. Краткая характеристика 4-х генеалогических корней молочного скота: черно-пестрого, палево-пестрого, бурого и красного…
1.2. Морфогенетические особенности черно-пестрой породы ……….
1.3. Генетический груз мутаций в породах крупного рогатого скота..
1.4. Краткая история описания комплекса аномалий позвоночника
(CVM - Complex Vertebral Malformation) ……….……………………….
1.5. Этиология комплекса аномалий позвоночника……………………
1.6. Клинические признаки при комплексе аномалий позвоночника..
1.7. Встречаемость CVM у черно-пестрого генеалогического корня…
1.8. Исторические аспекты по изучению дефицита лейкоцитарной
адгезии (BLAD) у крупного рогатого скота ……………………………..
1.9. Этиология дефицита лейкоцитарной адгезии у крупного рогатого скота………………………………………………………………………
1.10. Патогенез и клинические признаки дефицита
лейкоцитарной адгезии у крупного рогатого скота………………….
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ…………………..
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ…………………………………..
3.1. История становления исследований молекулярно-генетических
болезней: дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD) и комплекса
аномалий позвоночника (CVM) у крупного рогатого скота в Российской Федерации……………………………………………………………..
3.2. Отбор образцов для исследований………………………………….
3.3. Оборудование для проведения ПЦР-анализа……………………..
3.4. Комплекты реагентов для выделения ДНК из различных биологических материалов……………………………………………………
3.5. Методы выделения ДНК из различных биологических материалов…………………………………………………………………………….
3.5.1. Фенольно-хлороформовый метод выделения ДНК……………...
3.5.2. Сорбентный метод выделения ДНК………………………………
3.5.3. Перхлоратный метод выделения ДНК…………………………….
3.5.4. Метод солевой экстракции ДНК из крови ………………………..
3.5.5. Метод Кавасаки по выделению ДНК из крови…………………...
3.5.6. Сравнительный анализ методов выделения ДНК из различных
материалов……………………………………………………………………
3.5.7. Определение концентрации ДНК, выделенной из исследуемых образцов…………………………………………………………………
3.6. Характеристика качества пробирок Эппендорфа………………….
8
8
10
14
16
18
20
24
27
28
31
34
34
34
35
38
41
41
42
44
46
48
49
50
51
3
3.7. ПЦР-анализ для диагностики мутантных BL и CV аллелей
c использованием различных типов праймеров ..………………………
3.8. Диагностика миссенс-мутаций CV и BL у крупного рогатого
скота методом ПЦР-РВ……………………………………………………...
3.9. Генетическая генеалогия у быков-производителей, носителей
CV и BL аллелей……………………………………………………………
3.10. Поток генов и характеристика популяций голштинизированного скота в Российской Федерации по CVM и BLAD ………………
3.11. Геногеография BL и CV в Российской Федерации и за рубежом.
4. ОБСУЖДЕНИЕ…………………………………………………………...
5. ВЫВОДЫ…………………………………………………………………..
6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ
НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ………………………………………………
7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ……………………………………………………
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ……………………
9. ПРИЛОЖЕНИЕ
52
66
73
85
101
104
113
115
115
116
4
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. В настоящее время у крупного рогатого скота
описано около 60 наследственных заболеваний, которые выявляются на
уровне ДНК [136]. Они вызывают морфологические и функциональные аномалии, негативно влияют на здоровье и продуктивность животного. Точность диагностики комплекса аномалий позвоночника [CVM] и дефицита
лейкоцитарной адгезии [BLAD] значительно повысилась благодаря установлению генетической природы данных молекулярных болезней [145; 217; 92;
41; 74; 71; 110; 184; 43; 198; 30]. В развитых странах Европы и Северной
Америки созданы специальные программы по элиминации мутантных CV и
BL аллелей в популяциях черно-пестрой породы [208; 209; 103; 2007; 210]. В
России выдающихся производителей и ремонтный молодняк также проверяют на носительство мутантных аллелей, а результаты регулярно публикуют в каталогах по племенным быкам [66; 54; 59; 31].
Для формирования здорового племенного и высокопродуктивного поголовья животных важной задачей ветеринарных врачей и специалистов по
племенному делу является своевременная диагностика и искоренение источника, вызывающего генетически обусловленных заболеваний. Знание молекулярной структуры, определение гетерозиготного носителя и мутанта, является основой для эффективной борьбы с наследственным заболеванием в
связи, с чем данная работа имеет важное научное и практическое значение.
Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка комплексной диагностики CV и BL мутаций у крупного рогатого скота
чёрно-пестрого генеалогического корня и генетическая оценка родословных
быков-производителей-носителей по данным аллелям.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
5
1. Провести сравнительный анализ и определить оптимальный режим
выделения ДНК для проведения ПЦР на CVM и BLAD.
2. Дать характеристику голштинизированной чёрно-пёстрой популяции
крупного рогатого скота по частотам встречаемости мутантных CV и BL аллелей.
3. Дать характеристику генетической генеалогии быков-производителей
носителей CV и BL аллелей.
4. Изучить геногеографию CV и BL мутаций у животных из различных
регионов Российской Федерации и за рубежом.
Научная новизна. Впервые методом ПЦР-РВ разработана одновременная генодиагностика комплекса аномалий позвоночника [CVM] и дефицита
лейкоцитарной адгезии [BLAD] у черно-пестрого скота с кровностью
голштинской породы. Проведен анализ генограммы родословных линий
черно-пестрого голштинизированного скота по CV и BL аллелям. Геногеографический анализ показал степень распространения миссенс-мутаций в
мире и
России. Носителями CV и BL аллелей в России явились быки-
производители и семя, полученное от импортированного из Германии, Канады и США скота. Они являются прямыми потомками лидеров голштинской
породы Осборндейл Айвенго 1189879, П. Айвенго Стар 1441440 и Карлин
М. Айвенго Белла 1667366. Все три элитных быка принадлежат к знаменитой линии Монтвик Чифтейн 95679.
В стадах черно-пестрого голштинизированного скота установлены четыре группы животных: первая, носители только BL, вторая – CV, третья обеих мутаций, четвертая - неносители. Больше всего мутантных аллелей
выявлено у племенных коров, чем у быков, это указывает на то, что коровы
являются своеобразным резерватом, т.е. хранителями мутантных аллелей в
стаде. Мутации CV и BL аллелей выявлены в 6 из 9 регионов России, (Московская, Кировская, Ленинградская, Смоленская области, Кабардино-
6
Балкарская Республика). Носительство CV/BL редко встречается, оно было
установлено только у одного быка.
Практическая значимость работы. Предложены рекомендации по купированию распространения мутаций, вызывающих BLAD и CVM в Российской Федерации. В основу зоотехнического и ветеринарного консультирования специалистов хозяйств положено проведение аттестации быковпроизводителей, ремонтных бычков, быковоспроизводящих групп коров, закупаемого семя и эмбрионов. Наличие генетического паспорта на закупаемую племенную продукцию позволит эффективно вести селекционную работу в стадах.
Личный вклад соискателя. Автор принимала непосредственное участие в разработке генной технологии по выявлению мутантных аллелей, вызывающих CVM и BLAD. Ей принадлежит осуществление исследований по
разработке одновременной генодиагностики CV и BL мутаций, а также анализ и интерпретация полученных результатов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы обсуждались на заседаниях кафедры иммунологии и Ученого совета ФГБОУ
ВПО МГАВМиБ [Москва, 2009-2012]. Часть полученных материалов диссертации
была представлена в трудах
VII Всероссийской научно-
практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010» под редакцией академика РАМН В.И. Покровского
[Москва, 2010], научно-практической конференции, прошедшей под эгидой
ОАО «ГЦВ СЖ» МСХ РФ и ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии [Быково, 2011] и
в материалах международной научно-практической конференции на тему:
«От теории к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и
медицины» [Саратов, 2011].
7
Публикации. По результатам исследований опубликовано 5 научных
работ, в т.ч. 4 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит
из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практического использования полученных научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, списка использованной литературы. Материал изложен на 142 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 22
рисунка. Список использованной литературы включает 234 источника, в том
числе 163 на иностранных языках.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту:
- Результаты разработки метода комплексного выявления мутантных CV
и BL аллелей.
-Генетико-генеалогический анализ выдающихся быков-производителейносителей мутантных CV и BL аллелей.
- Распространение миссенс-мутаций CV и BL среди высокопродуктивных коров.
8
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Краткая характеристика 4-х генеалогических корней молочного скота: черно-пестрого, палево-пестрого, бурого и красного. Отличие сельскохозяйственных животных от диких особей заключается в том, что
их биологические особенности формируются под влиянием и контролем человека, тогда как дикие животные формируются под стихийным влиянием
природы. В результате влияния труда человека, экономических и природных
условий, сельскохозяйственные животные изменяются, совершенствуются –
исчезают старые и создаются новые специализированные породы. Как только порода перестает соответствовать уровню сельскохозяйственного производства, она неизбежно должна быть изменена или заменена более совершенной, отвечающей новым требованиям сельскохозяйственного производства. Высокая продуктивность отдельных пород скота связана с уровнем животноводческой культуры и является следствием постоянного улучшения их
человеком [3; 15; 33].
Большинство из наиболее распространенных пород крупного рогатого
скота молочного направления продуктивности, разводимых в России, создавалось путем метизации их с иностранными культурными породами: голландской, симментальской, айрширской, швицкой, ангельнской и другими.
Специалисты при этом придерживались принципа выведения зональных типов, имеющих общий генетический корень. В процессе развития исторически сложилось четыре генеалогических корня: черно-пестрый, палевопестрый, бурый и красный. В последние годы в силу обильномолочности,
наибольшее внимание специалисты обращали на разведение черно-пестрого
генеалогического корня.
1.2. Морфогенетические особенности черно-пестрой породы. Формирование черно-пестрого (голландского) скота как породы произошло более 400 лет назад в провинции Фрисляндия (Нидерланды). Из Нидерландов
9
животные экспортировались
в большом количестве в
Великобританию,
Францию, США, Канаду, Германию, Новую Зеландию и другие страны мира. Краниологи-систематики относят этот скот к Bos primigenius.
Издавна в Германии черно-пестрый скот известен под названием остфризский. При этом выделяют ряд отродий: везермаршское, йеверландское и
джювелендское [47]. В Великобритании черно-пестрый скот называют британо-фризским; фризским в США; Канаде и Японии – голштино-фризским.
В Россию черно-пестрый скот начали завозить в начале XVIII века из
Голландии и использовали при создании бестужевской, аулиэатинской
[1880], украинской белоголовой [1895], тагильской [1905] и других пород
крупного рогатого скота [16].
С 1925 года черно-пестрый скот утвержден плановой породой в СССР, а
с 1930 года начался завоз его из Германии, Голландии, Швеции, Прибалтийских стран. В 1959 году средне-русское, сибирское и уральское отродья, ряд
породных групп черно-пестрого скота СССР были объединены в отечественную черно-пеструю породу крупного рогатого скота. В настоящее время её разводят во всех регионах России, а совершенствуют в 126 племзаводах и более 300 племенных репродукторах [56].
Современный черно-пестрый скот в России по численности занимает
первое место и по последним данным его доля в общей численности крупного рогатого скота составляет 62,5% [26]. Выделены зональные типы [рис. 1].
Исследованиями Кузнецова И.М. [37], Новикова Е.А. [50], Лебедева
М.М и Бима А.И. [38], Костомахина Н.М. [32] показана роль остфризского
скота при формировании массива черно-пестрой породы
бывшего СССР.
на территории
10
Голландская порода
Местный скот
Центральнороссийский
Северный
Уральский
Сибирский
Серый
украинский
Среднеазиатский
Зональные типы черно-пестрого скота
Центральнороссский
Прибалтийский
Уральский
Сибирский
Средняя Азия
и Кавказ
Рисунок 1 - Схема формирования пород крупного рогатого скота
черно-пестрой породы на территории бывшего СССР
[Машуров А.М. (47) в некоторой нашей модификации]
Вместе с тем, наряду с положительными качествами, связанными с
обильномолочностью,
формой
вымени,
черно-пестрый
впоследствии
голштинизированный скот, принес в наши хозяйства ряд породных недостатков, связанных с наследственными заболеваниями.
1.3. Генетический груз мутаций в породах крупного рогатого скота.
Под генетическим грузом понимается термин, чаще всего используемый для
обозначения суммы неблагоприятных летальных и сублетальных мутаций в
геноме организмов-членов популяции. Концепция была предложена английским популяционным генетиком Haldane J.B.S. [128].
Генетический груз (genetic load) - накопление летальных и сублетальных отрицательных мутаций, вызывающих при переходе в гомозиготное состояние выраженное снижение жизнеспособности особей, или их гибель. В
более строгом смысле генетический груз в популяционной генетике - это выражение уменьшения селективной ценности для популяции по сравнению с
той, которую имела популяция, если бы все индивидуальные организмы соответствовали наиболее благоприятному генотипу.
11
Генетический груз рассматривается, как мера неприспособленности популяции к условиям окружающей среды. Существуют различные типы генетического груза. Одной из его форм является иммиграционный груз (immigration load), когда за счет притока генов из других популяций или пород, происходит насыщение улучшаемой породы мутациями наряду с положительными генами. Иммиграционный груз создается включением в данный генофонд посторонних генов, которые в новой генотипической среде понижают
приспособленность. Ярким примером этого являются миссенс-мутации
голштинской породы, которые вызывают ряд наследственных заболеваний у
представителей черно-пестрого генеалогического корня.
В ХХ столетии интенсивное использование мирового породного генофонда и биотехнологий репродукции (искусственное осеменение, трансплантация эмбрионов, клонирование) позволили значительно повысить генетический потенциал продуктивности животных за счет получения потомства
производителей - лидеров породы. Вместе с тем в поголовье все чаще проявляются признаки генетической эрозии - накопления груза вредных рецессивных мутаций [18; 20; 44]. При этом снижаются воспроизводительная способность и плодовитость, жизнеспособность новорожденных и молодняка, резистентность, продолжительность хозяйственного использования животных,
что отрицательно влияет на рентабельность производства.
У крупного рогатого скота выявлено свыше 400 генетически обусловленных морфологических и функциональных нарушений [171]. По шести
породам с широким ареалом, которых разводят и в России, наибольшее число таких отклонений зафиксировано в голштинской, далее следует фризская,
черно-пестрая, симментальская, бурая швицкая и айрширская [соответственно 45, 32, 26, 24, 20 и 19 аномалий]. Выявленное отличие голштинской породы от других связано с особенностями разведения и воспроизводства. В породе, как известно, существует ограниченное число линий и родственных
12
групп [О. Айвенго, Р. Соверинг, М. Чифтейн, В.Б. Айдиал, С.Т. Рокит, Астронавт и некоторые другие].
Кроме того формирование популяций голштинского скота на его родине
происходило при интенсивном использовании небольшого числа быков. Так,
в родословных практически всех животных породы в 7-10-м рядах предков
имеется, по крайней мере, один из 20 быков-основателей голштинской породы. То есть при формальном аутбридинге фактически трудно избежать подборов пар, в родословных которых нет этих основателей или их потомков.
С одной стороны, такая система разведения при интенсивном отборе
способствует консолидации породы, с другой - повышает вероятность
накопления и перехода в гомозиготное состояние комплекса мутантных генов, обусловливающих различные нарушения.
Очевидно, голштинской породе скрытый сегрегационный груз мутаций
передал голландский скот, от которого она ведет происхождение. Действительно, ряд аномалий встречается как у черно-пестрого голландского, фризского, так и у голштинского скота.
Согласно сводным данным, рецессивно наследуемая бульдожья форма
ахондроплазии (локус 2004) встречается у голштинов в США, Канаде, британских фризов, фризов во Франции, Германии, Швеции, датского и польского черно-пестрого скота [171]. Дефицит аргининсукцинатсинтетазы обнаружен у животных фризской породы в Австрии и голландской - в США [локус 2039], артрогрипоз 1 - черно-пестрой в Германии и голштинской в США
[локус 2040], артрогрипоз передних конечностей 2 - черно-пестрой в Германии и голштинской в Бразилии [локус 2045], врожденная катаракта 1 голштинской в США, черно-пестрой и красно-пестрой (производная от
голштинов с геном рецессивного окраса) - в Германии [локус 2094]. Пупочные грыжи [локус 2192] обнаружены с высокой частотой у черно-пестрого
скота, голштинов в США, Канаде и ряде европейских стран, у фризов в Индонезии [68].
13
Следует отметить, что высокая частота пупочных грыж зарегистрирована в потомстве быка Заказника 82 голландской породы в совхозе «Сумино»
Ленинградской области. Аналогичную патологию отмечали у родственников
этого быка в Чехословакии, а также черно-пестрого скота в Германии при
использовании быков-производителей из некоторых линий голштинского
скота. О наследственных пупочных грыжах у голштинского скота сообщалось и ранее [150; 69]. Еще один генетический дефект, наследуемый по аутосомно-рецессивному типу, двойная шейка матки зарегистрирован у коров
немецкой черно-пестрой и шведской голштино-фризской пород [локус 2392].
Описанные нарушения — пример прямого переноса мутантных генов от одной породы в другую.
В последнее время сложилась обратная ситуация: при использовании
быков голштинской породы для «улучшения» популяций черно-пестрого
скота в их генофонд одновременно с интродукцией полезных признаков были занесены рецессивные мутации, обусловливающие дефицит лейкоцитарной адгезии [BLAD] [1-я группа сцепления, ген СD 18, обозначаемый также
как локус 2244, выявлен у голштинов в ряде стран]; комплекс аномалий позвоночника [CVM]; нарушение свертывания крови [или дефицит фактора ХI]
[рецессивная мутация в 17-й группе сцепления [локус 2068] и др. [167; 210].
Многие из перечисленных мутаций, представляющих собой характерный только для голштинов генетический груз, вероятно, возникли недавно,
именно в этой породе, некоторые имеют более раннее происхождение. Это
касается BLAD и CVM, получившие широкое распространение в популяциях
голштинского скота вследствие интенсивного использования в воспроизводстве потомков быка Осборндейл Айвенго 1189870 и прежде всего его внука
Карлина М. Айвенго Белла 1667366.
Сообщалось,
что средняя частота гетерозиготных носителей BLAD-
синдрома у голштинов в США и других странах составляла 20 % [169; 97;
14
234], но в результате выбраковки таких быков в 1990-е годы уменьшилась
до минимума [24].
В начале XXI столетия датскими учеными у голштинов была выявлена
новая мутация, обусловливающая CVM (Complex Vertebral Malformation) –
комплекс аномалий позвоночника.
1.4. Краткая история описания комплекса аномалий позвоночника
(CVM - Complex Vertebral Malformation). Впервые данная аномалия была
выявлена у человека и известна в человеческой тератологии с 18 века под
названием Perosomus elumbis [137].
О заболевании Perosomus elumbis у телят впервые было опубликовано в
ветеринарной литературе в 1832 г. немецким анатомом и патологоанатомом
Эрнстом Гурлтом в его книге об уродствах домашних животных [124]. Сорок
пять лет спустя он же опубликовал некоторые дополнительные случаи, однако недостаточно подробно [125].
Сто лет спустя американский ученый Williams W.L. [228] написал работу, основанную на тщательном анализе восьми случаев этого уродства у телят. Кроме Williams W.L. [228] много материалов по этому вопросу было
накоплено в Германии [125; 126; 129; 132; 138; 139; 233 и др.].
В октябре 2000 года датские исследователи объявили международному
сообществу голштинского скота об открытии нового летального генетического дефекта, который они назвали Complex Vertebral Malformation (CVM) комплекс аномалий позвоночника. Сотрудники датской программы генетических болезней крупного рогатого скота обнаружили, что с октября 1999
года возросло количество телят с похожими уродствами [75].
Из всех видов и пород крупного рогатого скота наиболее часто болезнь
устанавливается у голштинской породы, поскольку носителем рецессивного
аллеля оказался знаменитый бык Пенстейт Айвенго Стар 1441440, один из
родоначальников небольшой группы производителей от которых пошла по
всему миру эта высокомолочная популяция животных.
15
К сведению, многие пораженные телята CVM в Дании были потомками
датского голштинского быка KOL Nixon (ДК 2340452). KOL Nixon (ДК
2340452) использовался примерно для 127 тысяч осеменений в этой стране
начиная с 1994 года. Бык Т. Burma (ДК 230104) приходился дедом ряду телят
и при оценке родословной стало ясно, что Т. Burma должен быть носителем
того же самого мутантного гена. Больше чем 340 тыс. осеменений спермой
Т. Burma было произведено в Дании с 1994 г.
Лабораторная экспертиза выявила общего предка этих быков. Им оказался американский голштинский бык Карлин М. Айвенго Белл 1667366 [51].
Предполагается, что мутация возникла у Пенстейта Айвенго Стара 1441440,
отца Карлина М. Айвенго Белла 1667366 или по его материнской линии в
США, и благодаря применению искусственного осеменения, распространилась по всему миру, где использовались американские голштины и их потомки [186].
Сотрудниками Датского института сельскохозяйственных наук вначале
был предложен тест, который по косвенным генетическим маркерам позволял идентифицировать мутантный CV аллель. Однако данный тест ограничивался анализом потомков быка Карлин М. Айвенго Белла 1667366, поскольку молекулярная основа CVM-синдрома не была достаточно изучена.
При использовании этого метода диагностирования брали ДНК, выделенную
из мышечной ткани пораженного теленка, крови матери и семени отца и
сравнивали альтернативные гены. Позже датская группа объявила, что они
клонировали аллель, вызывающий эту аномалию и разработали уже молекулярно-генетический тест, предоставляющий возможность тестирования всех
животных, независимо от происхождения. Оба эти теста были ими запатентованы и в 2001 г. тестирование выполнялось только лабораториями Дании и
в Нидерландах. В начале 2002 года была получена лицензия ImmGen, Inc.,
College Station, Texas от федерации Датского общества по искусственному
осеменению и Датского института сельскохозяйственных наук для проведе-
16
ния исследований на CVМ. Стоимость данного теста в Дании составляет 65
долларов или 600 датских крон [108; 186; 51].
1.5. Этиология комплекса аномалий позвоночника. Пока этиология
данного заболевания еще недостаточно известна, однако по данному вопросу
существуют следующие гипотезы:
Как известно, позвоночник проходит 3 стадии своего развития. На ранних этапах нейруляции образуется хорда, представляющая собой гибкий несегментированный тяж, идущий вдоль средней линии спинной стороны эмбриона. Во время второй стадии формируются тела позвонков и сам позвоночник, состоящие из хрящевых структур. Третья стадия включает замену
хрящевого на костный скелет. При этом хрящевой осевой скелет, а позже костный заменяют функцию хорды. Экспериментальное удаление спинной
хорды и нервной трубки способствовало полному отсутствию осевого скелета или его редуцированию до неузнаваемости [137].
Согласно теории эмбриональной индукции Шпемана, в определенных
частях зародыша возникают организующие факторы - индукторы, которые
оказывают индуцирующее влияние на другие участки зародыша, обуславливая его развитие в определенном направлении. Организатор первого порядка
находится в дорсальной губе бластопоры. Он индуцирует участок эктодермы, обуславливая его развитие в нервную пластинку. Нервная пластинка и
хорда определяют развитие и взаимное расположение других частей зародыша.
В течение эмбриогенеза происходит такая важная стадия в ходе которой
нервная трубка трансформируется и прикрепляется своим каудальным концом к бластопору. Уродства или нарушения миграции нервной трубки на
данной стадии будут сопровождаться частично неправильным развитием
хорды, следствием чего будут и позиционные аномалии некоторых брюшных органов, что и подтверждает теория Шпемана. В то же время врожденные дефекты могут быть результатом нарушений в переходных стадиях эм-
17
брионального развития. Возникновение дефектов может обуславливать аномалии либо в одной клеточной группе или системе органов [121, 122].
Морфогенез и нормальная клеточная дифференциация должны быть
четко синхронизированы с экспрессией определенных генов. Оба - и зигота
и, главным образом, активные гены устанавливают правильное соответствие
множества временных и пространственных структур и способствуют процессу развития. Эти структуры по существу являются переводом одномерной
хромосомной ДНК в трехмерную структуру [116].
Учеными было выяснено, что за специфику построения тела отвечают
так называемые Homebox – гены (Hox 1.1 и др.) и их протеиновая продукция.
Hox 1.1 - гены экспрессируются ввиде отдельных структур центральной и
периферической нервной системы, осевого скелета и нервной трубки на
уровне от 4-го шейного до 1-го поясничного позвонков. Клетки склеротома
(зародышевые зачатки костно-хрящевой ткани) также отражают экспрессию
Hox 1.1-гена и являются предшественниками ребер, позвонков, мезодермы
желудка и, позднее метанефроса [164]. Hox 2.1 - и Hox 3.1 - гены также
имеют большое значение в формировании клеточной памяти и определении
местоположения клеток вдоль передней и задней оси хорды [205]. Hox 2
преимущественно участвует в формировании отделов задней части мозга,
всей длины спинной хорды, мезонефроса, тогда как Hox 3.1 чаще встречается в предпозвоночной области и по дорсо-вентральной оси эмбриона [134].
Тканеспецифичная экспрессия этих генов происходит в течение эмбрионального, постнатального периодов, а также у зрелого организма [90].
Таким образом, напрашивается вывод, что причиной нарушения органогенеза, а также появления уродств групп скелетных, нервных и висцеральных органов, представленных у CVM-пораженных телят может быть мутация в семействе Homebox - генов [137]. Судя по имеющимся материалам,
следует сказать, что СVM-синдром обусловлен аутосомной рецессивной мутацией.
18
1.6. Клинические признаки при комплексе аномалий позвоночника.
Комплекс аномалий позвоночника или СVM – сложный тератологический
синдром телят голштинской породы, заключающийся, прежде всего, в абортах, преждевременных родах, мертворождении или смерти телят в первые
дни жизни, а, значит, воздействующий
на
смертность молодняка и вос-
производительные способности скота [137, 186].
Возникновение данного синдрома обусловлено аутосомной рецессивной мутацией SLC35A3 - гена и явлением плейотропии, при котором этот
ген вызывает резкие отклонения от нормального хода развития и множественные аномалии. Как правило, все плейотропно действующие гены в данном случае летальны и поэтому особь, гомозиготная по SLC35A3 - гену не
жизнеспособна.
Изучение многочисленных случаев комплекса аномалий позвоночника у
телят дало общую картину заболевания. Самым ярким проявлением этой
аномалии, о чем говорит уже само ее название, являются многочисленные
уродства скелета.
В позвоночном столбе наблюдается большое количество полупозвонков,
а также сросшихся и деформированных позвонков, неправильное развитие
позвоночных дисков, сколиоз, кифоз, расщепление позвоночника надвое [75;
186].
Главным образом все перечисленные пороки встречаются в заднешейном и переднегрудном отделах позвоночника. Вследствие этого имеют место
и уродства ребер, которые зачастую слиты между собой проксимальными и
иногда средними частями, при этом дистальные части свободны, а межреберные пространства между такими ребрами не параллельны. У некоторых
телят с множественными позвоночными уродствами количество ребер в пораженной области было уникалатерально и/или билатерально редуцировано
[137; 75]. В среднем уродства случаются от первого шейного до второго поясничного, и, далее в 13, 18, 19 и 20 поясничных позвонках. В целом количе-
19
ство пораженных позвонков колеблется от 2 до 18. Причем к поражениям
шейного и грудного отделов часто присоединяется артрогрипоз [75]. Однако
был описан и случай полного отсутствия поясничных, крестцовых, и хвостовых позвонков, т.е. пояснично-крестцовый отдел состоял только из мягких тканей. Из-за отсутствия пояснично-крестцовой опоры были выявлены
пороки тазовых костей [137].
У телят со сложным уродством позвоночника выявляются поражения
передних и/или задних конечностей, атрофированы мышцы. Вместе с тем
отклонений в строении черепа и головы не наблюдаются, однако у многих
телят отмечено каудовентральное смещение ушей, высунутый язык и поражения конъюктивы глаз.
Одним из сопутстующих признаков CVM является низкий вес и различные аномалии внутренних органов [137]. Кроме того, у некоторых телят были отмечены выпячивание брюшной полости и пупочная грыжа [75].
У всех телят были выявлены различные пороки сердечно-сосудистой
системы, заключающиеся в дефекте интравентрикулярной перегородки
сердца, гипертрофии правого желудочка, правосторонней позиции дуги аорты и перемещении легочной артерии, а также ателектаз легких, западение
легких вследствие слабости дыхательных движений, в некоторых случаях у
абортированных плодов недоставало одной почки [137; 75; 186]. Описан
единичный случай, когда у теленка женского пола, имеющего обширные
нарушения осевого скелета в пояснично - крестцовой области были обнаружены отклонения в развитии половой системы. Несмотря на то, что яичники
и рога матки были в норме, наблюдалось недоразвитие наружных половых
органов, тела матки и отсутствие шейки, при этом тело матки каудально соединялось с мочевым пузырем, а краниально с ободочной кишкой. Прямая
кишка представляла собой тонкостенный слепо оканчивающийся мешочек,
наполненный слизистыми желто-коричневыми массами, оканчивающийся
щелевидным анусом, открытым на 0,5 см.
20
1.7. Встречаемость CVM у черно-пестрого генеалогического корня.
Комплекс аномалий позвоночника (CVM) является наследственным заболеванием с аутосомно-рецессивным типом наследования. Впервые молекулярно-генетическая природа болезни была изучена у датской популяции
голштинского скота в 1999 году, в результате чего была выявлена ключевая
мутация, вызывающая развитие данной патологии [75]. Главным источником
распространения мутантного аллеля явился элитный бык 1974 года рождения черно-пестрой голштинской породы – Карлин М. Айвенго Белл 1667366
[76; 198]. Карлин М. Айвенго Белл 1667366, знаменитый бык-производитель
голштинской породы, оказал огромное влияние на улучшение молочной
продуктивности у черно-пестрого генеалогического корня не только в Российской Федерации, но и мире.
Позднее мутация была выявлена во многих странах мира. В гомозиготном состоянии CV аллель вызывает высокую эмбриональную смертность,
что сопровождается массовыми абортами и большим числом мертворожденных телят. Телята, гомозиготные по данному аллелю, при рождении имеют
множественные анатомические отклонения. Особенно это касается шейной и
грудной области позвоночного столба, уменьшенным числом ребер и контрактурами задних и передних конечностей.
Причиной возникновения данной болезни является миссенс-мутация гена SLC35A3, состоящая в замещении гуанина на тимин (G559T), в результате
которой в синтезируемом белке происходит замена валина на фенилаланин
в 180 позиции (V180F).
Ген SLC35A3 расположен на хромосоме BTA3
крупного рогатого скота и участвует в синтезе белка. Белок осуществляет
перенос 5’-дифосфат-N-ацетилглюкозамина, который
является активным
участником формирования костной ткани позвонков [218]. Жигачевым А.И.
и др. [25] проведен анализ встречаемости рецессивной мутации у голштинской породы, вызывающий CVM – комплекс аномалий позвоночника
[табл. 1].
21
Таблица 1 - Результаты проверки быков голштинской породы на носительство рецессивной мутации гена CV, вызывающего CVM-синдром
(эмбриональная смертность, аборты, множественные уродства) [25]
Страна
Проверено,
гол.
США
Канада
5659
529
Голландия
Франция
Германия
Италия
Чехия
Венгрия
Австралия
Великобритания
Всего
Россия*
67
35
28
13
8
1
1
1
6342
343
Из них, гол. [%]
гетерозиготные свободно
от
носители
носительства
1136 (20,07)
4523 (79,93)
34 (6,42)
495 (93,50)
26 (38,80)
15 (42,85)
2 (7,15)
2 (15,40)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
0 (0)
1215 (19,15)
18 (5,25)
41 (61,20)
20 (57,15)
26 (92,85)
11 (84,60)
8 (100)
1 (100)
1 (100)
1 (100)
5127 (80,85)
325 (94,75)
Примечание: * - среднее по 15 племпредприятиям [в число обследованных включены
быки от разных породных сочетаний - ФГУП «Белгородское», «Курское» и другие области
Центральной России]. На тех племзаводах, где используют в основном чистопородных
голштинов, доля носителей составляла 14,6-18,8 %, что почти соответствует средней частоте по ряду стран мира
Результаты приведены в табл. 1 вместе с данными по ряду стран, представленными на сайте Всемирной ассоциации по разведению голштинской
породы. Как видно из табл. 1, потомок, наследующий от каждого из гетерозиготных родителей рецессивный ген, обычно погибает на ранней стадии
эмбриогенеза, либо отел происходит на 2 недели раньше срока и теленок
рождается мертвым.
Таким образом, проблема контроля генетических дефектов у крупного
рогатого скота в условиях глобализации и коммерциализации племенного
дела стала важной частью отечественной профилактической ветеринарии и
корректирующей селекции.
По данным Эрнста Л.К., Жигачева А.И. [69], среди 6342 обследованных
быков доля гетерозиготных носителей CV аллеля в США, Канаде, Голландии, Франции, Германии и Италии составляла соответственно 20,07; 6,42;
38,80; 42,85; 7,15 и 15,40 % [при среднем значении 19,15 %].
22
Источник мутантных аллелей BL и CV - соответственно бык Осборндейл Айвенго 1189870 и Пенстейт Айвенго Стар 1441440, широко использовавшиеся затем в программах репродукции молочного скота. Распространение мутантных BL и CV аллелей у голштинского скота показывает, насколько опасно интенсивное использование производителей без проверки на носительство мутантных генов.
При анализе распространения дефектов по породам и странам разведения видно превышение общего числа обнаруженных относительно описанных [табл. 2].
Таблица 2 - Число генетических дефектов, обнаруженных в ряде
пород крупного рогатого скота при разведении в разных странах [25]
Порода
1
Черно-пестрая
Голштино-фризская
(голштинская)
Фризская
Обнаружено генетических дефектов
Страна
число
2
3
Германия
19
Дания
3
Венгрия
1
Бельгия
1
Голландия
3
Чехия
1
Швеция
1
Польша
2
Всего
31
США
30
Бразилия
2
Австралия
4
Канада
10
Англия
3
Германия
7
Япония
2
Голландия
4
Франция
3
Россия
4
Италия
3
Дания
4
Новая Зеландия
Швеция
Всего
Германия
Нидерланды
1
1
78
8
7
23
Айрширская
Продолжение таблицы 2
Швеция
6
Англия
7
Новая Зеландия
4
Египет
3
Южная Африка
2
Палестина
1
Австрия
2
Дания
3
Израиль
1
Индонезия
2
Ирландия
1
Шотландия
1
Франция
3
Всего
51
Шотландия
1
Англия
6
США
7
Финляндия
Новая Зеландия
Канада
Япония
Дания
Всего
Швейцария
Симментальская
Германия
Австрия
Румыния
Ирландия
Венгрия
Россия
США
Всего
Германия
Швицкая
Швейцария
США
Турция
Всего
Примечание: данные взяты из работы M i l l a r P. et al. (171)
5
2
3
1
1
26
4
10
1
3
1
2
3
2
26
4
9
7
1
21
По черно-пестрой породе эта разница [31 против 25] означает, что одни
и те же дефекты были описаны в нескольких странах. Для голштинской породы разница составляет 35 и обусловлена тем, что во многих странах
голштинов разводят как породу с наибольшей молочной продуктивностью и
24
скоростью молокоотдачи, обладающую способностью к интенсивному раздою. При этом племенной материал (быки и их сперма) в основном поставлялся из США, где по породе выявлено наивысшее число генетических дефектов при наибольшем поголовье [табл. 2].
В США длительное время применяют чистопородное разведение
голштинов, а во многих других странах осуществляют голштинизацию, т.е.
скрещивание с черно-пестрым скотом [в первом варианте вероятность выщепления гомозигот по мутантным генам выше, чем во втором]. Отметим,
что Американская ассоциация по разведению голштинов публикует каталоги
оценки производителей по результатам учета случаев уродств в потомстве
проверяемых быков. Число генетических дефектов, обнаруженных в ряде
пород крупного рогатого скота, при разведении в разных странах по их распространению выделяется Германия,
далее идут Нидерланды, Англия и
Швеция. Следует отметить, что они распространены в значительной степени
и в Российской Федерации [160; 7; 19; 22].
Обсуждая проблему генетического груза у крупного рогатого скота, не
следует забывать, что в последние годы в Российской Федерации более 60 %
коров и телок осеменяются спермой быков голштинской и черно-пестрой
пород, значительная доля поголовья симментальской, красной степной, холмогорской и ярославской пород - производителями, несущими гены краснопестрых или черно-пестрых голштинов. В этой связи, разработка и осуществление постоянно действующих законодательно оформленных программ в этом направлении обеспечит дальнейшее повышение генетического
потенциала животных в стране.
1.8. Исторические аспекты по изучению дефицита лейкоцитарной
адгезии (BLAD) у крупнго рогатого скота. В ряде стран для исключения из
интенсивного воспроизводства быков-носителей упоминавшегося выше
BLAD были разработаны специальные программы селекции. Это нарушение
обусловлено мутацией гена CD 18 и проявляется в подавлении клеточного
25
иммунитета. У особей, гомозиготных по рецессивному аллелю, резко снижается устойчивость к бактериальным и вирусным инфекциям, замедляется
рост. Большинство телят погибает в возрасте 3-7 мес. от кишечных и легочных инфекций. Мутация быстро распространилась в голштинской породе изза доминирования потомков быков-носителей деда, отца, братьев, сестер и
многочисленных сынов, внуков и других родственных групп Карлин М. Айвенго Белла 1667366.
В начале 1990-х годов в США доля носителей среди племенных быков и
исследованных коров составила соответственно 15 и 6 %, в ряде стран Европы, куда активно завозились голштины, - еще выше.
Большое число потомков Карлин М. Айвенго Белла 1667366 завезено в
Россию. Так, только на племпредприятия Ленинградской области поступило
42 его внука. Исследования быков ряда племпредприятий на BLAD носительство, проведенные в ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии и ГЦВ СЖ, выявили
частоту мутантного гена 2,5-5,0 %. Без мониторинга генофонда популяции
черно-пестрого скота и животных других пород с разной долей кровности по
голштинам мутация может распространиться [42; 62].
Впервые дефицит лейкоцитарной адгезии или LAD был выявлен у человека Crowley C.A. et al. [102]. Он является наследственным, аутосомнорецессивным заболеванием и сопровождается высокой чувствительностью
к бактериальным и грибковым инфекциям. У болеющих особей отмечаются
частые пневмонии, сильно выраженный гингивит десен, массовые кровоизлияния по всему желудочно-кишечному тракту [165; 120].
Данное заболевание выявлено у различных видов животных, однако
наиболее известным оно стало после ее диагностики у высокомолочных особей голштинской породы крупного рогатого скота. Ранее заболевание называлось «синдромом гранулоцитопатии», сейчас известна по имени двух ее
первооткрывателей, как «болезнь Хагемозера-Такахаши». В последние годы
в
научной
литературе
звучит
как «BLAD-синдром», что означает
26
Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency или дефицит лейкоцитарной адгезии
крупного рогатого скота [28].
Исследования, проведенные Американским Национальным Центром
болезней животных, позволили дать более полную молекулярную и генетическую характеристику болезни и разработать точный диагностический тест
- ДНК-диагностику на основе ПЦР-анализа. Хотя еще не известно влияние
гетерозиготного генотипа на здоровье животного, тем не менее, уже ясно
влияние гомозиготного генотипа на проявление наследственной болезни
[146].
Болезнь в основном встречается у крупного рогатого скота, хотя выявляется и у других видов домашнего скота [208; 209]. Установлено, что CD18
cвиньи по своей генетической структуре подобен СD18 человека на 81%,
мыши на 75% и крупного рогатого скота на 89% [156].
Из всех видов и пород крупного рогатого скота наиболее часто, как было отмечено выше, наследственная болезнь устанавливается у голштинской
породы, поскольку носителем рецессивного аллеля оказался знаменитый бык
Осборндейл Айвенго 1189870, один из родоначальников группы производителей, от которых пошла по всему миру эта высокомолочная популяция животных. Мутация является своеобразным породообразующим элементом у
голштинов. Мутация возникла в Голландии и благодаря применению искусственного осеменения распространилась по всем странам, где использовались американские голштины или их потомки. Генеалогический анализ родословных голландских быков-производителей, пораженных генетическим
дефектом, показал, что впервые рецессивный BL аллель был выделен в
потомстве черно-пестрого голландского быка 1952 года рождения Осборндейл Айвенго 1189870. В дальнейшем этот аллель передавался по следующим генеалогическим генерациям: Осборндейл Айвенго 1189870  Пенстейт
Айвенго Стар 1441440  Карлин М. Айвенго Белл 1667366 и другие.
27
В голштинской породе выявлены такие линии, получившие распространение в европейских странах и являющиеся носителями дефектного аллеля
BLAD: Харрисбург Ней Идеал, Айвенго Стар, Карлин А.Белл, Белл Трой,
Джесси, Хенри, Сикрет, Юлиус, Берт, Белл Райс, Пеппи, Ванквард, Стардом,
и др. Это лишь частичный перечень линий пораженных указанным дефектным геном. Установлено также, в области Оснабрюкер в Германии интенсивно использовали сыновей Карлин М. Айвенго Белла 1667366 (носителя
аллеля BLAD) производителей Соутвинда, Трифекта и Михаэля. Однако они
оказались свободными от данного гена [8]. Предполагается, причиной возникновения заболевания является мутация и сопровождается резким увеличением числа лейкоцитов до 100 000 в 1 мл крови у животного. Причем, вся
лейкоцитарная популяция представлена нейтрофилами. Считается, данное
заболевание наиболее изученным из всех известных наследственных патологий животных. По расчетам Shuster D.E. et. al. [208; 209] стадо можно сделать свободным от заболевания в течение одного года.
1.9. Этиология дефицита лейкоцитарной адгезии у крупного рогатого скота. Обычно взаимодействие клеток друг с другом, а также с экстрацеллюлярным матриксом на уровне молекул главным образом происходит
через три семейства адгезивных белков: иммуноглобулинов, интегринов и
селектинов. Семейство интегринов в свою очередь включает следующие
факторы LFA-1, Mac-1 и p150,95, известные в международной классификации как CD11/CD18 [212]. Все три семейства белков являются гетеродимерами, каждый состоит соответственно из -субъединиц [CD11a,CD11b и
CD11c] и общей ß-субъединицы [CD18]. Локус CD18 человека располагается на хромосоме 21q22.3, тогда как у крупного рогатого скота на хромосоме 1 в группе синтении U10 [217]. У человека LAD является причиной нарушения адгезии в организме, аналогичная ситуация с синдромом гранулоцитопатии и у представителей крупного рогатого скота черно-пестрого генеалогического корня. Kehrli M.E.Jr. et al. [145] показали, что это связано с
28
дефицитом Мас-1 гликопротеина [CD11b/CD18] лейкоцитов крови крупного
рогатого скота и оно эквивалентно LAD человека, отсюда произошло ее
название BLAD.
Считается, что BLAD является уникальным случаем для сравнительной медицины человека и ветеринарной медицины при изучении LAD человека и других видов животных. Прекрасной моделью для сравнительной генетики, по которой можно изучать клинику, фенотип и генетику самой болезни, провести разработку диагностических подходов.
Это заболевание характеризуется резким снижением в лейкоцитах 2
интегрина, что вызывает в свою очередь резкое снижение функциональной
активности фагоцитоза, эндотелиальной адгезии, невозможности выхода
лейкоцитов за пределы кровеносного сосуда и хемотаксиса. Лейкоциты,
больных BLAD, содержат очень низкое количество 2 интегрина на своей
поверхности, менее 2% от 160 кD белка здорового животного. Причиной
заболевания является мутация CD18 гена кодирующего гликопротеиновое
вещество или 2 интегрин [208; 209].
Более конкретно ситуация выглядит следующим образом: в данном
локусе две мутации, - одна «немая», в 775 положении цитозин замещается на
тимин, что ведет в 259 положении аминокислотной последовательности замене лейцина на
изолейцин. Другая мутация связана с заменой нуклеотида
аденина на гуанин в 383 позиции ДНК, вызывающая в свою очередь замещение в положении 128 аспарагиновой кислоты на глицин.
1.10. Патогенез и клинические признаки дефицита лейкоцитарной
адгезии у крупного рогатого скота. Немецкими учеными из ветеринарного
института г. Ганновера [ФРГ] целенаправленным подбором гетерозиготных
животных было получено 50 гомозиготных телят по BLAD [219; 154].
Изучение этих животных дало общую картину
заболевания. Гомо-
зиготные телята заболевают в первые месяцы жизни и умирают, как правило, в течение года.
29
Течение болезни хроническое. Животные значительно отстают в росте
и развитии, худеют при хорошем аппетите и очень восприимчивы к разного
рода инфекциям. У телят часто наблюдается лишай. Одновременно отмечаются приступ лихорадки, постоянные нарушения в деятельности желудочнокишечного тракта, а также признаки воспаления верхних дыхательных путей
и легких. В большинстве случаев воспаляется область ротовой полости (гингивит). Попытка лечения приводит к исходным результатам, занимает много времени, и в конечном итоге оказывается безуспешной.
Анализ крови больного теленка до 41-дневного возраста показал резкое возрастание числа нейтрофилов в крови. Так, к моменту рождения и на
второй день количество нейтрофилов составляло соответственно 14000 и
17000 клеток/мл крови, на седьмой день - 34600, а к 41 дню жизни хроническую нейтрофилию. Количество нейтрофилов превышало 100000 клеток/мл,
что на 85% больше относительно исходных данных при рождении. Проведенная оценка in vitro изолированных нейтрофилов у 38 и 45 дневных телят
выявила специфические функциональные нарушения, отсутствовавшие в
контрольных образцах, взятых от здоровых животных [146].
Результаты иммуноблотинга нейтрофильных лизатов показали резкое
снижение Мас-1 фактора [CD11b/CD18]. Иммунофлюоресцентный анализ
нейтрофилов крови полусибсов [телочек и бычков] подтвердил дефицит
Мас-1 -cубъединицы [CD18]. Позднее установлен аутoсомный рецессивный
характер наследования аллеля BLAD-синдрома. Клинические и патологоанатомические признаки оказались идентичными ранее выявленным признакам у человека и собак [ирландского сеттера] [123]. При вскрытии павших
животных выявляется поразительно высокая частота определённых воспалительных изменений практически во всех органах [табл. 3].
Они локализуются, прежде всего, в области пищеварительного и дыхательного трактов. Типичными состояниями больных с BLAD являются: отставание в росте [94%], воспаление лёгких [62%], воспаление желудочно-
30
кишечного тракта [64%], глубокое воспаление гортани [40%], а также сильное воспаление дёсен [52%], частичное выпадение зубов.
Изменения кишечника показывают полную характерную картину заболевания, а именно, поражения отмечены в середине тонкого отдела кишечника в форме отчётливого, разграниченного очага разрушения слизистой оболочки от здоровой ткани.
Таблица 3 - Клиническое состояние телят больных
дефицитом лейкоцитарной адгезии – BLAD
Признаки заболевания
Отставание в росте
Процент встречаемости
94%
Воспаление лёгких
62%
Воспаление кишечного тракта
64%
Глубокое воспаление гортани
40%
Сильное воспаление дёсен
52%
Частичное выпадение зубов
43%
Поразительно то, что только те области кишечника изменены, которые
содержат лимфатическую ткань, т.е. пейеровы бляшки. Переход от сильно
воспалённой слизистой оболочки к здоровой ткани происходит очень резко.
Без исключения, все животные имеют воспалённую селезёнку, а лимфатические узлы равным образом увеличены, отмечается высокое воспаление кровеносных сосудов, дерматит. Носители мутантного аллеля в гомозиготе не
поддаются лечению [214; 72].
Таким образом, приведенные материалы по двум наследственным заболеваниям показали важность особого внимания в изучении BLAD и CVM у
высоко молочных пород черно-пестрого генеалогического корня, наличии
генетического паспорта при купле-продаже племенного материала, разработке методов диагностики для проведения массовых исследований элитных
стад.
31
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводили с 2009 по 2012 годы на кафедре иммунологии
ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и ЗАО «Синтол» по схеме, представленной
на
рис. 2.
Взятие образцов для исследований
Выделение ДНК
Проведение ПЦР и ПЦР-РВ
Подбор специфических праймеров и оптимизация режима
амплификации
Рестриктный анализ Taq I и Hae III для
разрезания участка ДНК, содержащий
нужный фрагмент
Разработка метода одновременной диагностики мутантных аллелей комплекса аномалий позвоночника (CVM) и дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD). Электрофорез в агарозном геле, для выявления определенного
фрагмента, соответствующего участку ДНК в норме и при наличии мутантных
BL и CV аллелей
Исследовали быков-производителей (n=474) и быковоспроизводящих групп коров (n=127) черно-пестрой породы с разной кровностью по голштинской черно-пестрой породе. Аттестация быков и коров на носительство мутантных CV и BL аллелей. Определение частоты встречаемости аллелей и генотипов в локусах SLC 35A3 и CD 18, оценка генетического равновесия по локусам двух наследственных болезней. Генетико-генеалогический анализ
происхождения быков-производителей, носителей мутантных CV и
BL аллелей. Геногеографический анализ носительства CV и BL в Российской
Федерации и за рубежом
Рисунок 2. Общая схема исследований
32
Источником исследования служили кровь, взятая у коров и семя быков-производителей черно-пестрого голштинизированного скота.
ДНК выделяли из семени быка и крови коров с помощью фенольнохлороформного и сорбентного (ДНК-сорб-В, ООО «ИнтерЛабСервис») методов.
Выделенную ДНК исследовали по аллелям двух наследственных заболеваний: комплекса аномалий позвоночника [CVM] и дефицита лейкоцитарной адгезии [BLAD].
Выделение ДНК из крови и спермы, оценка его качества, а также генотипирование аллелей проводили по схеме, предложенный Kantanen J. [143].
Диагностику мутантного BL аллеля, вызывающую дефицит лейкоцитарной адгезии или BLAD осуществляли по методике, изложенной в работах
Shuster D.E. et al. [208, 209] и Tammen I. [217].
В качестве праймеров для диагностики мутантных CV и BL аллелей использовали следующие последовательности [табл. 4]:
Таблица 4 – Характеристика праймеров, использованных
для определения мутантных CV и BL аллелей
Название праймера
Последовательность праймера
Для диагностики BL аллеля
BLAD forward
5’ – GTC AGG CAG TTG GGT TCA – 3’
BLAD reverse
5’ – GAG GTC ATC CAC CAT CGA GT – 3’
Для диагностики CV аллеля
CVM forward
5’ – TCA GTG GCC CTC AGA TTC TC – 3’
CVM reverse
5’ – CCA AGT TGA ATG TTT CTT ATC CA – 3’
33
Что касается диагностики мутантного CV аллеля комплекса аномалий
позвоночника [CVM], то она осуществлялась по методу, описанному Rusc A.,
Kaminski S. [2007].
Разработку методики ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для одновременной диагностики CV и BL проводили на приборе Rotor Gene Q (Corbett
Research, Австралия).
Изучали генетические параметры: частоты встречаемости аллелей, генотипов, наличие генетического равновесия в изучаемых локусах методом χ2.
Проверку генетического равновесия в изучаемых локусах проводили по
формуле:
χ 2 = Σ [Pэмп - Ртеор]2 / Ртеор,
где χ2 - критерий соответствия наблюдаемого распределения животных
данного генотипа ожидаемому распределению; Рэмп - фактическое число особей данного генотипа в популяции; Ртеор - теоретически ожидаемое число
особей данного генотипа.
Теоретически ожидаемое число особей определяли по формуле Харди Вайнберга для двухаллельных систем:
N = Np2 + N2pq + Nq2,
где N – общее число исследованных животных; p – частота встречаемости нормального аллеля; q – частота встречаемости мутантного аллеля.
Часть цифровых материалов обрабатывали общепринятыми методами
вариационной статистики с применением персонального компьютера: Microsoft Office Excel, 2003; STATISTICA for Windows. Version 7. 1999.
34
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. История становления исследований молекулярно-генетических
болезней: дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD) и комплекса аномалий позвоночника (CVM) у крупного рогатого скота в Российской Федерации. Исследования по диагностике аллеля дефицита лейкоцитарной адгезии или BLAD были начаты в 1994 году в лаборатории генетики животных
ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии под руководством д.б.н., проф. Н.С. Марзанова. Большую помощь в организации данных исследований оказали сотрудники отдела разведения и генетики животных Ганноверского Ветеринарного института [ФРГ] доктора ветеринарных наук Б. Харлициус и И.
Таммен. Немецкие коллеги предоставили контрольные образцы ДНК от гомо- и гетерозиготных животных по BL аллелю. На примере диагностики BL
аллеля отработана схема и методология определения моногенных наследственных заболеваний у сельскохозяйственных животных. Cогласно этой
схеме, отбор образцов для исследований осуществляли из различных племенных хозяйств регионов Российской Федерации.
Что касается метода диагностики CV аллеля, то здесь следует отметить,
продуктивное сотрудничество с фирмой ЗАО «Синтол» (Москва).
3.2. Отбор образцов для исследований. В качестве источников для исследований служили образцы крови, свежеполученная и глубокозамороженная сперма, взятые от животных черно-пестрого голштинизированного скота. До использования в ПЦР-реакциях, биоматериал хранился при температуре - 200С в стеклянных или пластмассовых флаконах.
Для экстракции ДНК использовали пробы цельной крови, защищенные
от свертывания путем добавления консерванта в соотношении 1:4, широко
используемого для изучения групп крови различных видов животных. Существует много рецептов по приготовлению различных типов антикоагулянтов
35
и консервантов. В качестве консерванта для взятия крови использовали следующий состав:
1. Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 50 г
Хлористый натрий
(0,9 г в 1 таблетке)
- 10 табл.
Вскипятить маточный раствор, затем остудить до 800С и добавить
Глюкозу
- 10 г
После раствор охлаждаем до 370С, добавляем
Стрептомицин
1 г (2 фл.)
Доводим раствор до 1 л дистиллированной водой.
Данный
консервант
лучше
хранить
в
замороженном
виде
в
морозильнике. Консервант использовали в соотношении 1: 4 – 1: 5 с цельной
кровью. В качестве антикоагулянта хорошо апробирован раствор 0,5%
ЭДТА, он также может быть использован для проведения диагностики
мутантных аллелей.
3.3. Оборудование для проведения ПЦР-анализа. Для проведения
ПЦР-анализа необходимы специальные помещения и набор оборудования.
Используемые приборы могут быть отечественного или зарубежного производства. Минимум оборудования и необходимые помещения, для лаборатории, с целью проведения ПЦР-анализа приведены в табл. 5.
Таблица 5 - Комплектация лаборатории для проведения
ПЦР-анализа
В комплектацию лаборатории входит оборудование для следующих зон:
I. Зона приема и регистрации материала
1.
Стерильный ламинарный бокс (например, «БАВп-0,1»-«Ламинар-С»1,2», «Ламинарные системы», Россия)
2.
Лабораторная центрифуга с ротором R-12/10 с пластиковыми адапторами на 12 мест для 10 мл пробирок (например, «LMC 3000»,
36
« BioSan», Латвия)
3.
Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема
(например, «Ленпипет», Россия)
4.
Штатив для дозаторов
5.
Штатив «рабочее место» для микропробирок 1,5 мл
6.
Штатив для пробирок 1,5-2,0, 15 и 50 мл
7.
Низкотемпературный морозильник от 20 до -90 °С
8.
Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше -16 °С
(например, «Стинол», Россия)
9.
Отдельный халат и одноразовые перчатки
10.
Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США)
11.
Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема
(например, «Axygen», США)
II. Зона выделения нуклеиновых кислот
1.
Стерильный ламинарный бокс (например, «БАВп-0,1»-«Ламинар-С»1,2», «Ламинарные системы», Россия)
2.
Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например,
«Гном», «Термит», ООО «НПО ДНК – технология», Россия)
3.
Вакуумный отсатыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», Россия)
4.
Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс. об/мин
(например, «Mini Spin» «Eppendorf», Германия)
5.
Вортекс (например, «Microspin FV 2400», « BioSan Ltd», Латвия)
6.
Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема
(например, «Ленпипет», Россия)
37
7.
Штатив для дозаторов
8.
Штатив рабочее место 50×1,5 мл
9.
Штативы для хранения пробирок 100×1,5 мл
10.
Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200
мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США)
11.
Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen»,
США)
12.
Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше -16 °С.
(например, «Стинол», Россия)
13.
Отдельный халат и одноразовые перчатки
14.
Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США)
III. Зона приготовления реакционной смеси для исследований
1.
Бокс для ПЦР-диагностики (например, БАВ-ПЦР-«Ламинар-С»,
«Ламинарные системы»,Россия)
2.
Вортекс (например, «Microspin FV 2400», « BioSan Ltd», Латвия)
3.
Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема
(например, «Ленпипет», Россия)
4.
Штатив для дозаторов
5.
Штатив «рабочее место» для микропробирок 1,5 мл, 72 лунки
6.
Штатив «рабочее место» для микропробирок 0,5 мл, 200 лунок (для
амплификатора «Терцик»), штатив «рабочее место» для микропробирок 0,2 мл, 200 лунок (для амплификатора Rotor Gene Q (Corbett Research, Австралия))
7.
Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше -16 °С.
(например, «Стинол», Россия)
8.
Микроволновая печь
38
9.
Отдельный халат и одноразовые перчатки
IV. Зона проведения гельэкрофореза
1.
Блок питания для электрофореза «Эльф 4»
2.
Камера для электрофореза SE-2
3.
Трансиллюминатор (Vilber Lourmat) ECX-15М
4.
Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема
(например, «Ленпипет», Россия)
5.
Штатив для дозаторов
6.
Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше -16 °С
(например, «Стинол», Россия)
7.
Отдельный халат и одноразовые перчатки
8.
Персональный компьютер
V. В отдельном помощении находится
1.
Амплификатор «Терцик» с возможностью программирования
и контроля за процессом работы без использования персонального
компьютера
При наличии в лаборатории, как в нашем случае, детектирующего ам-
плификатора в реальном времени Rotor Gene Q (Corbett Research, Австралия), необходимы все составные части лаборатории, приведенные в табл. 5,
за исключением амплификатора.
3.4. Комплекты реагентов для выделения ДНК из различных биологических материалов. Существует целый набор методов и комплектов
для выделения ДНК из различного биоматериала:
Комплект реагентов для выделения ДНК «Проба-Рапид». Простой,
удобный и быстрый метод, позволяющая выделить ДНК из биологических
образцов [мазков, соскобов]. Транспортировка биоматериала и выделение
ДНК осуществляется в одной пробирке, которая в процессе обработки не от-
39
крывается, что исключает кросс-контаминацию между образцами и обеспечивает полную защиту персонала от контакта с содержимым в пробирке. В
процессе выделения образуется осадок голубого цвета, при этом выделенная
ДНК содержится в надосадочной жидкости. Условия хранения комплекта в
холодильнике при +2…+8°С. Срок годности – 6 мес.
Комплект реагентов для выделения ДНК и РНК «Проба-НК». Универсальный метод в основе которого лежит иммунопреципитация, позволяющая выделять как ДНК, так и РНК из плазмы крови, соскобов, мазков, мокроты, мочи, спермы, молока и др. В процессе выделения образуется окрашенный осадок серо-голубого цвета, который и содержит выделенные нуклеиновые кислоты. Условия хранения комплекта в холодильнике при
+2…+8°С. Срок годности – 6 мес.
Комплект реагентов для выделения ДНК «Проба-ГС». В основе лежит сорбентный метод. Комплект универсален и позволяет проводить выделение ДНК из биоптатов, плазмы крови, соскобов, мокроты и пр. Условия
хранения комплекта в холодильнике при +2…+8°С. Срок годности – 6 мес.
Комплект реагентов для выделения мононуклеаров периферической крови [МПК]. В случае необходимости работы с чистыми культурами
клеток лейкоцитарного ряда можно использовать комплект реагентов для
выделения МПК или мононуклеаров периферической крови.
Комплект
реагентов
для
выделения
геномной
ДНК
«ДНК-
ЭКСТРАН-1». Комплект реагентов предназначен для выделения ДНК из образцов цельной крови, костного мозга и культуры клеток. Эффективность
выделения ДНК зависит от количества, качества и типа исходного материала. Образцы крови должны быть собраны в пробирки, содержащие ЭДТА
или цитрат натрия. В случае выделения ДНК из старых (или содержащих
сгустки) образцов, рекомендуется исользовать Протеиназу К. Приблизительный выход ДНК составляет 10-20 мг из 300 мкл цельной крови с соотношением D (A260/A280) = 1,8 – 1,9.
40
При частом использовании возможно хранение при комнатной температуре (+ 20 + 25 °С), при редком – хранение при +4 +8 °С. Срок годности составляет 12 месяцев.
Комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала «ДНК-сорб- В». Объем исследуемого материала для выделения ДНК – 0,1
мл. Эффективность выделения ДНК составляет 50 – 70%. Очищенную ДНК
можно хранить в течение 1 нед. При температуре от 2 до 8 °С, и в течение
года при температуре не выше минус 16 °С.
Материалом для дисследования служат: цельная кровь, плазма и другой
клинический материал (клеточный осадок мочи, слюна, ликвор, мокрота, биоптаты, бронхо-альвеолярный лаваж и промывные воды бронхов, фекалии,
семя быков).
В состав комплекта реагентов входят: лизирующий раствор, раствор для
отмывки 1, раствор для отмывки 2, сорбент универсальный, ТЕ - буфер для
элюции ДНК.
Биологический образец (как правило, клинический материал, помещенный в транспортную среду) обрабатывается лизирующим раствором в присутствии частиц сорбента. В результате происходит деструкция клеточных
мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов, и высвобождение ДНК.
Растворенная ДНК в присутствии лизирующего раствора связывается с
частицами сорбента, в то время как другие компоненты лизированного клинического материала остаются в растворе и удаляются при осаждении сорбента центрифугированием и последующей отмывкой.
При добавлении раствора для элюции ДНК к сорбенту происходит переход ДНК с сорбента в раствор. В результате указанной процедуры получается высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции
амплификации.
41
Комплект реагентов хранить при темературе от 2 до 25 °С. Срок годности – 12 месяцев.
При отсутствии возможности приобретения комплектов для выделения
ДНК из различных образцов, можно использовать апробированные методы,
которые приведены в разделе 3.5.
3.5. Методы выделения ДНК из различных биологических материалов. Кроме комплектов, для выделения ДНК из крови, спермы и других
биологических материалов апробированы следующие методы выделения НК.
К ним относятся фенольно-хлороформовый [96] в модификации Ausubel
F.M. et al. [89], солевой экстракции [173], перхлоратный [11] и Kawasaki E.S.
[144], а из спермы модифицированный метод Li H. et al. [158].
3.5.1. Фенольно-хлороформовый метод выделения ДНК. Данный метод является классическим, поскольку выделяемая ДНК является высокой
степени очистки. Однако классический метод, хотя и давал высокоочищенную ДНК, он требовал при этом больших затрат времени.
Используемые ингредиенты для приготовления растворов:
Лизирующий раствор (хранить при комнатной температуре):
50 мМ Трис-HCI, рН=8,0; 100 мМ NaCl; 100 mM ЭДТА, рН=8,0; 1%
SDS.
Раствор протеиназы К (хранить при +4° С):
20 мг/мл в дистиллированной воде.
Раствор Т10Е10 (хранить при комнатной температуре):
10 мМ Трис-HCI, рН=7,8; 10 мМ ЭДТА, рН=8,0.
Раствор NDB (хранить при комнатной температуре):
75 мМ NaCI; 25 мМ ЭДТА, рН=8,0.
Буфер ТЕ (хранить при комнатной температуре):
10 мМ Трис-HCI, рН=7,5; 1 мМ ЭДТА, рН=8,0.
42
Фенол-CIA (хранить при +4° С максимум до двух недель или при - 200С
для более длительного использования): представляет смесь, состоящую из 25
об. фенола, эквилибрированного буфером ТЕ (рН=7,5-8,0) : 24 об. хлороформа : 1 об. изоамилового спирта.
CIA (хранить при +4° С):
представляет смесь, состоящую из 24 об. хлороформа : 1 об. изоамилового спирта.
3.5.2. Сорбентный метод выделения ДНК.
Кровь. Цельную кровь в количестве 400 мкл помещают в 2-х мл пробирку типа Эппендорф и смешивают с 1,6 мл раствора Т10Е10 [10 мМ Трис
HCl, рН 7,8; 10мМ ЭДТА, рН 8,0]. После встряхивания пробирки центрифугируют в течение 30 сек при 16000 об/мин для осаждения лейкоцитарной
фракции.
После удаления надосадочной жидкости, содержащей лизат эритроцитов, процедуру очистки лейкоцитов повторяют с 2 мл буфера Т10 Е10. Затем
лейкоцитарный шарик ресуспензируют в 400 мкл буфера NDB [75 мМ NaCl,
25 мМ ЭДТА, рН 8,0] с добавлением 20 мкл 10 % раствора додецилсульфата
натрия [SDS] и 10 мкл протеиназы К до конечной концентрации 0,5 мг/мл.
С целью лизиса лейкоцитов пробы инкубируют при +580С в течение 12
часов. Затем для дальнейшей очистки ДНК, от присутствующих в нем белков
и жиров, проводят экстракцию органическими растворителями [фенол,
хлороформ, изоамиловый спирт].
К прозрачному лизату добавляют 400
мкл фенол-CIA [25 об. фенола : 24 об. хлороформа : 1 об. изоамилового
спирта] и после интенсивного встряхивания [около 3 мин] центрифугируют
при 16000 об/мин в течение 3 мин. При этом присутствующие в растворе
белки и жиры переходят в нижнюю фенольную фракцию, а ДНК остается в
верхней водной фазе.
43
Не затрагивая промежуточную фазу, ДНК содержащую фракцию переносят с помощью пипетки в чистую 1,5 мл центрифужную пробирку и добавляют 400 мкл CIA [24 об. хлороформа : 1 об. изоамилового спирта]. Затем содержимое интенсивно встряхивают в течение 3 мин и центрифугируют
при 16000 об/мин в течение 3 мин для разделения фаз. Верхнюю фазу переносят в чистую пробирку.
Для осаждения ДНК из раствора добавляют 30 мкл 3 М раствора ацетата
натрия, рН 5,2 и 800 мкл 100% этилового спирта и несколько раз осторожно перемешивают для осаждения шарика ДНК. После удаления жидкой фазы, шарик ДНК промывают 70% спиртом и высушивают на воздухе в течение 30-40 мин. Шарик ДНК в зависимости от размера растворяют в 30-80
мкл дистиллированной воды. Пробирки оставляют на ночь при +40С и затем
тщательно ресуспензируют.
Ткань. Образцы тканей для выделения ДНК хранятся до момента их
использования в замороженном состоянии при -20°С и более в морозильнике. Они должны быть с четкой нумерацией. Для работы берут от 50 до 100 мг
образцов измельченной ткани помещают в 1.5 мл центрифужную пробирку
типа Эппендорф, содержащую 350 мкл лизирующего буфера с содержанием
10-15 мкл раствора протеиназы К до конечной концентрации 0.7-1.0 мг/мл и
лизируют при температуре 60°С в течение 12 часов. Лизис считается завершенным, если в пробирках не видны кусочки ткани.
Молоко. Молоко доместицированных животных может быть
использовано для выделения ДНК. Особенно это важно при исследовании на
BLAD быковоспроизводящих коров. В здоровом молоке достаточно большое
количество соматических клеток. По разным данным в норме они
составляют от 200 000 до 500 000 клеток/мл, которые на 90% состоят из
лейкоцитов. Кроме соматических клеток, в молоке присутствуют до 2%
эпителиальных клеток [202; 182; 148].
44
Образцы молока и молозива могут храниться в морозильнике при - 200С
и выше. После медленного оттаивания при 40С в условиях обычного
холодильника, в дальнейшем молоко можно использовать для выделения
ДНК. Молоко и молозиво можно также хранить в холодильнике при 40С до
3-х недель без какой-либо обработки.
Метод выделения включает следующие этапы: 3 мл молока или 2 мл
молозива разводят в соотношении 1:1 50 мМ Трис-НСI [pH 7.6] и
центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Затем клеточный осадок
ресуспендируют раствором Т10Е1 [10 мМ трис-HСI, pH 7.5 + 1мМ EDTA, pH
8]
и
переносится
в
пробирку
центрифугируется в течение 1 мин
Эппендорфа.
Клеточная
суспензия
при 16000 об/мин, после удаления
супернатанта к клеточному осадку добавляется К - лизирующий буфер [10
мМ Триса, рН 8.3 + 50 мМ КСI + 0.5 % Твина 20 + 0.4% протеиназы К].
Суспензия инкубируется при 560 С в течение 45 минут, а затем при 940 С в
течение 10 мин. После центрифугирования в течение 1 мин при 16000
об/мин, полученный образец ДНК можно хранить в морозильнике.
Метод пригоден также для выделения ДНК из крови. Проведенный
сравнительный анализ с другими методами, например китом «Perkin Elmer
StockMarks PCR», для тестирования крови и луковиц волоса крупного
рогатого скота, показал аналогичные результаты. Образцы молока были
также взяты от коз, овец и свиней. Описанный метод позволяет легко и
быстро выделять ДНК для проведения массовых анализов в молоке и других
биологических субстратах [152].
3.5.3. Перхлоратный метод выделения ДНК.
Используемые ингредиенты для приготовления растворов:
Реагент А [хранить при +4°С]
10 мМ Трис-HCI, рН=8.0; 320 мМ сахароза; 5 мМ MgCI2; 1% Тритон X100.
Реагент В [хранить при комнатной температуре]
45
400 мМ Трис-HCI, рН=8.0; 60 мМ ЭДТА, рН=8.0; 150 мМ NaCI; 1%
SDS.
Раствор перхлората натрия [хранить при комнатной температуре]
5 М раствор перхлората натрия.
Раствор протеиназы К [хранить при +4° С]
20 мг/мл в дистиллированной воде.
CIA [хранить при +4° С]
Смешать 24 об. хлороформа с 1 об. изоамилового спирта.
Буфер ТЕ [хранить при комнатной температуре]
10 мМ Трис-HCI, рН=7.5; 1 мМ ЭДТА, рН=8.0.
Подготовка проб крови и выделение ДНК. К 300 мкл консервированной крови добавляют 1.2 мл реагента А, тщательно перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин 2 мин. Процедуру очистки ядросодержащих
клеток от различных остатков крови проводится несколько раз с использованием реагента А.
Аналогичным образом проводится выделение ДНК из спермы и тканей.
В данном случае берется 100 мкл спермы, а образец тканей размером 2-3
мм2 и смешивают с 400 мкл реагента А. Смесь центрифугируют при 10000
об/мин в течение 2 мин, супернатант сливают, а к осадку добавляют 13 мкл
1М DTT или дитиотрейтола [1,4-Dithio-DL-threitol]. Исследуемый косочек
ткани, размером 2-3 мм2, очищенную сперму, осадок лейкоцитов или соматических клеток, выделенных из молока помещают в 1,5 мл пробирки Эппендорфа, добавляют 150 мкл реагент В, 5 мкл протеиназы [20 мг/мл] и инкубируют при 600 в течение 12 часов. Обычно данную процедуру проводят
на ночь, чтобы продолжить дальнейшее выделение ДНК на следующий день.
Для этого, к полученному лизату ядросодержащих клеток добавляют 50
мкл 5М раствора перхлората натрия и тщательно перемешивают. После добавляют 300 мкл смеси CIA и опять тщательно перемешивают в течение 5
46
мин. Полученный раствор центрифугируют 5 мин при 16000 об/мин. Образовавшийся ДНК-содержащий верхний слой осторожно отбирают и переносят
в другую пробирку. При недостаточной очистке после добавления смеси
CIA, можно повторно провести данную процедуру.
Верхний слой снова отбирают в чистую 1,5 мл эппендорфовскую пробирку. В нее добавляют 600 мкл 100% этилового спирта и тщательно встряхивают для осаждения ДНК. При правильном проведении всей процедуры на
дне пробирки образуется шарик ДНК. В случае отсутствия данного шарика
ДНК, пробирки повторно центрифугируют в течение 3 мин при 16000
об/мин.
Надосадочную жидкость удаляют и добавляют охлажденный при - 200С
70% этиловый спирт в количестве от 0,5 до 1 мл и оставляют на 10 мин при
комнатной температуре. По истечении этого времени 70% этиловый спирт
удаляют. Для проведения сушки ДНК шарика, пробирки переворачивают на
30 мин при комнатной температуре. После завершения данной процедуры,
содержимое пробирки ресуспендируют в 30-60 мкл буфера ТЕ или дистиллированную воду для хранения.
Перхлоратный метод - недавно предложенный и широко используемый
способ выделения ДНК. Относительно ранее известных способов, преимуществом данного метода является, возможность его использования для биологических образцов, находившихся в экстремальных условиях. Чаще всего,
в таких образцах, как колбасные изделия, разные формы высушенных и замороженных тканей, консервы, археологические ископаемые и другие биологические источники, содержат деградированную ДНК. Перхлоратный метод не требует применения фенола, выделяемая ДНК является высокомолекулярной [20-50 т.п.н.] и с высокой степенью очистки.
3.5.4. Метод солевой экстракции ДНК из крови.
Используемые ингредиенты для приготовления растворов:
Гомогенизирующий буфер [хранить при комнатной температуре]:
47
160 мМ сахарозы, 80 мМ ЭДТА, рН=8,0; 100 мМ Трис-HCI, рН=8.0;
0,5 % SDS.
Раствор протеиназы К [хранить при +4° С]
20 мг/мл в дистиллированной воде.
Раствор NaCl [хранить при комнатной температуре]:
4,5 М раствор NaCl
CIA [хранить при +4° С]:
Смешать: 24 об. хлороформа : 1 об. изоамилового спирта.
Буфер ТЕ [хранить при комнатной температуре]:
10 мМ Трис-HCI, рН=7.5; 1 мМ ЭДТА, рН=8.0.
400 мкл цельной крови помещают в 2-х мл пробирку типа Эппендорф и
смешивают с 1,6 мл раствора Т10Е10 [10 мМ Трис HCl, рН 7,8; 10мМ ЭДТА,
рН 8,0]. После встряхивания, пробирки центрифугировуют в течение 30 сек
при 16000 об/мин для осаждения лейкоцитарной фракции.
После удаления надосадочной жидкости, содержащей лизат эритроцитов и другие частицы крови, процедуру очистки лейкоцитов повторяют с 5
об. [5 х 400 мкл] буфера Т10 Е10. Затем полученный осадок в виде лейкоцитарного шарика ресуспензируют в 200 мкл гомогенизирующего буфера [160
мМ сахароза, 80 мМ ЭДТА, рН 8,0, 100 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 0,5% SDS] и 5
мкл протеиназы К [20 мг/мл] до конечной концентрации 0,5-0,1 мг/мл.
Затем пробирки помещают в водяную баню с температурой +650С на 812 часов. К клеточному лизату добавляют 200 мкл 4,5 М NaCl и 300 мкл
CIA.
По истечении этого времени пробы интенсивно встряхивают в течение 5
мин для экстракции ДНК и центрифугируют 5 мин
при 16000 об/мин.
Верхнюю ДНК-содержащую фазу переносят в чистую пробирку. После добавления 500 мкл 100% этанола с целью осаждения ДНК ее интенсивно перемешивают.
48
При обнаружении шарика ДНК надосадочную жидкость удаляют. В
случае отсутствия шарика ДНК повторно проводят центрифугирование в течение 3 мин при 16000 об/мин. После выявления шарика ДНК, надосадочную жидкость удаляют, добавляют 0,5 мл 70% этилового спирта, охлажденного при -200С и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Затем удаляют этанол, шарик ДНК высушивают в течение 30-40 мин при комнатной
температуре. В зависимости от размера шарика, проводят ресуспензирование
ДНК в 30-60 мкл буфера ТЕ или дистиллированной воды.
3.5.5. Метод Кавасаки по выделению ДНК из крови.
Используемые ингредиенты для приготовления растворов:
Лизирующий буфер [хранить при комнатной температуре]:
20 мМ Трис-HCI, рН=8,3; 1,5 мМ MgCl2; 25 mM KCl, 0,5% [v/v]100
Tween.
Раствор протеиназы К [хранить при +4° С]:
20 мг/мл в дистиллированной воде.
Пробу цельной крови в количестве 100 мкл помещают в 200 мкл буфера
Кавасаки [20мМ Трис-HCI, рН8.3, 1.5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 0.5% [v/v]
Tween 20] с добавлением 5 мкл протеиназы К [20 мг/мл] до конечной концентрации 0.5 мг/мл и инкубируют 8-24 часа при +580С.
После завершения лизиса исследуемого образца, для инактивации протеиназы К, пробирки выдерживают при +950С в течении 10-15 мин, затем
охлаждают и центрифугируют 2 мин при 16000 об/мин для осаждения остатков клеток. Прозрачный лизат используют для дальнейшей работы при проведении ПЦР-анализа.
В случае потребности проведения последующих анализов лизат может
храниться в обычном холодильнике при +4 0С до 2-3 недель или в морозильнике при -200С в течение нескольких месяцев. Лизаты тканей без дополнительной очистки могут быть использованы для ПЦР-анализа при замене SDS
49
на Tween 20, присутствующего в протеиназе К-буфере. Tween 20 не нарушает ход полимеразной цепной реакции. Вместе с тем, методом Кавасаки невозможно выделять фрагменты ДНК длиной 20 т.п.н. и более.
3.5.6. Сравнительный анализ методов выделения ДНК из различных материалов. Для анализа животных методом ПЦР вполне подходит
ДНК со средней длиной фрагментов 20-50 т.п.н. Поскольку не требуется
наличия высокомолекулярной ДНК, для ее выделения обычно используются
широко апробированные методы: фенольно-хлороформовый, перхлоратный,
солевой экстракции, Кавасаки и многие другие. Проведённый сравнительный анализ различных методов выделения ДНК показал, что каждый метод
имеет как свои преимущества, так и свои недостатки.
Фенольно-хлороформовый метод позволяет выделять высоко очищенную ДНК хорошего качества, однако требует больших затрат времени, а
также использования вредного для здоровья реагента фенола. Тем не менее,
получаемая таким способом ДНК высокого качества и она может храниться
длительное время. Данный метод хорош при создании Банков ДНК, требующий их длительного хранения.
Метод солевой экстракции не требует использования вредного реагента
фенола, а также он более быстр в исполнении по сравнению с фенольнохлороформовым способом выделения ДНК. Применение данного метода
также позволяет добиться выделения высокомолекулярной ДНК [20-50
т.п.н.] и высокой степени ее очистки. Он имеет ряд преимуществ как перед
стандартным фенольно-хлороформовым способом экстракции ДНК, так и
перед другими методами выделения ДНК:
-не требуется экстракция фенолом;
-экстрагированная ДНК является высокомолекулярной [20-50 т.п.н.];
-степень очистки ДНК довольно высокая, что позволяет её широкое использование при проведении ПЦР-анализа.
50
Метод Кавасаки является очень быстрым, исключает длительную процедуру экстракции и позволяет использовать для последующего ПЦР лизат
клеток. Использование лизатов ткани без дополнительной очистки и концентрации ДНК для ПЦР-анализа возможно вследствие замены ионного детергента SDS, присутствующего в протеиназе К - буфера, на не ионный детергент Tween 20, который не нарушает протекание ПЦР [29; 11; 12]. Наиболее
широкое применение метод Кавасаки нашел в работе с кровью свиней [65].
Оптимальным для нашей работы представляется сорбентный метод выделения ДНК (ДНК-сорб-В, ООО «ИнтерЛабСервис»). Он обладает технической простотой и позволяет экономить время, не прибегая к трудоемкой
процедуре фенольной экстракции. Тем не менее, нужно учитывать, что качество и стабильность препаратов в целом заметно ниже, чем фенольнохлороформных экстрактов. Сорбентный метод удобен в том случае, если
препарат выделенной ДНК не нужно хранить долгие годы. Очищенную ДНК
можно хранить в течение одной недели при температуре от 2 до 8°С в обычном бытовом холодильнике, в течение года при температуре не выше минус
16°С. Поэтому для повседневной работы в дальнейшем нами был выбран
сорбентный метод выделения ДНК.
3.5.7. Определение концентрации ДНК, выделенной из исследуемых образцов. Одним из важных этапов в работе по эффективности метода
выделения ДНК является определение ее концентрации. Содержание ДНК
определяли на спектрофотометрах различных классов, например Specord
M40, Genesis-5 и другие. Для этого исходный раствор ДНК разбавляли в
200-300 раз и определяли оптическую плотность раствора при прохождении
лучей с длиной волны 260 нм [OD260].
Между концентрацией ДНК и степенью поглощения света существует
прямая зависимость. Чем больше света поглощает раствор ДНК, тем выше
концентрация ДНК.
51
Расчет концентрации
ДНК
проводили
по формуле, приводимой
Sambrook J. et al. [200]:
С [мкг/мкл]= OD260 * 50 * f/1000, где OD260 - оптическая плотность раствора ДНК, при длине волны 260 нм;
f - фактор разбавления;
50 - коэффициент для приведения концентрации в мкг/мкл;
1000 - концентрация ДНК [мкг/мл] при OD260=1.
Для контроля степени очистки ДНК определяли соотношение оптических плотностей раствора ДНК при длине волны 260 нм и 280 нм
[OD260/OD280]. Для чистых препаратов ДНК это соотношение должно быть
равно 1,8-2,0.
Существуют и другие методы проверки ДНК на концентрацию, нативность и подвижность.
3.6. Характеристика качества пробирок Эппендорфа. Улучшение качества PCR результат изменения структуры строения пробирок Эппендорфа.
В процессе хранения ДНК, РНК или белков в обычной пробирке, образец
больше чем 90 % может быть потерян из-за адсорбции пластмассовой поверхностью. Усовершенствованная пробирка Eppendorf DNA LoBind Tubes
может быть до 30 % выше по своей эффективности. Типовая потеря в стандартных пробирках может привести к неверному истолкованию эффективности PCR и к существенной переоценке количества ДНК в образцах.
52
3.7. ПЦР-анализ для диагностики мутантных BL и CV аллелей c
использованием различных типов праймеров. Для выявления носителей
мутантного аллеля дефицита лейкоцитарной адгезии или BLAD использовали различные типы праймеров. В данной работе приводим характеристику 2х типов праймеров [I и II], созданных по методу Shuster D.E. et al. [208] с некоторыми модификациями Tammen I. [217].
После соответствующей апробации и некоторой доработки, они получили широкое использование для диагностики аллеля дефицита лейкоцитарной адгезии или BLAD в условиях Российской Федерации.
Праймеры типа I были в следующей последовательности и обозначены
соответственно Ivan 2 и Ivan 3 [217]:
Ivan 2 - 5`- GAG GTC ATC CAC CAT CGA GT – 3’;
Ivan 3 - 5`- GTC AGG CAG TTG CGT TCA A – 3’
В начале исследований для работы были использованы праймеры типа I,
синтезированные на ДНК/РНК синтезаторе - Модель 392 [Applied
Biosystems, Вайтерштадт, ФРГ], в отделе разведения и генетики животных
Ганноверского Ветеринарного института [зав. отделом, д.в.н. Б. Харлициус].
В дальнейшем они воспроизводились на аналогичном оборудовании в
условиях различных фирм, специализирующих по их изготовлению в Российской Федерации [«Синтол», «ЛиТех» (Москва) и др.].
Праймеры типа II изготовленные
в условиях фирмы ЗАО «Синтол»
(Москва) имели следующую последовательность:
''12.4'' - 5`- GCC AAG GGC TAC CCC ATC - 3`;
''12.5'' - 5`- GGA GTA GCT GCT TCC TCA CCA ATG – C - 3`.
Обычно оба типа праймеров подбирали к фрагменту ДНК, включающему
в себя позицию 383, изменения в которой приводят к замене аденина на гуа-
53
нин [рис. 3], что является генетической основой, вызывающей BLAD [208;
209; 72].
Схема структуры нормального TL аллеля или D 128:
361
366
379
383 387
|
|
|
|
|
5’ - // - - AGG G*CC - - - // - - - AT*C GAC CTG - - // - 3’
Asp 1 2 8
Схема структуры мутантного BL аллеля или D 128G:
361
366
379
383
387
|
|
|
|
|
5’ - // - - AGG G*CC - - - // - - -ATC GG*C CTG - - // - 3’
Gly 1 2 8
Рисунок 3 - Схемы участков ДНК крупного рогатого скота
в норме и при наличии мутантного BL аллеля
На рис. 3 представлены схемы аллелей локуса CD-18, ответственных за
синтез 2-интегрина или гликопротеинового вещества, участвующего в норме [D 128] и при дисфункции [D 128G] в процессе лейкоцитарной адгезии в
крови и тканях организма.
Принцип метода полимеразной цепной реакции [ПЦР] разработан Кэри Мюллисом [фирма "Cetus", США] в 1983 году, за что впоследствии ему
была присуждена Нобелевская премия [177]. В дальнейшем метод энзиматической амплификации ДНК с использованием специфических стартеров
(праймеров) полимеризации был усовершенствован Saiki R.K. et al. [199].
Позднее вследствие применения термостабильной Taq-полимеразы метод ПЦР-анализа был упрощен и автоматизирован [199]. В настоящее время
данный метод широко используется как для научных исследований, так и
для диагностических целей в практическом здравоохранении и ветеринарии.
Он включает генотипирование возбудителей и диагностику инфекционных
заболеваний. В биологии сельскохозяйственных животных метод ПЦР-
54
анализа приобрел особое значение с целью установления генов хозяйственно-полезных признаков, наследственных заболеваний и других маркирующих систем.
Исследуемым материалом для диагностики аллелей на CVM и BLAD
могут служить кровь, сперма, ткани разного происхождения от крупного рогатого скота. Забор исследуемого материала следует производить в стерильные пробирки.
Обычно для проведения ПЦР-анализа использовали программируемый
термостат или амплификатор «Терцик».
Для выявления носителей мутантного BL аллеля были апробированы
различные типы праймеров. Чаще всего используются 2 типа праймеров
[Ivan 2, Ivan 3 и 12.4, 12.5], изготовленные по методу Shuster D.E. et al. [208,
209] с некоторыми модификациями.
Вследствие замены аденина на гуанин [A-G] в кодирующей части аллеля
локуса CD18 появляется дополнительный сайт рестрикции для фермента
Hae III и исчезает аналогичный сайт для Taq I.
Принцип постановки ПЦР-анализа основан на обладании ДНК способности к самовоспроизведению. То есть при соответствующих условиях синтезировать определенные участки ДНК при наличии затравки или стартеров
(праймеров) и других ингредиентов.
Смесь для ПЦР-анализа содержала 100 нг препарата ДНК, 0,4 мкМ
каждого типа праймера, 1х ПЦР-буфера, по 200 мкМ/мл
дезокси-
нуклеотидтрифосфатов, а также по 0,3-0,5 U Taq I или Hae III, 1,5 мM MgСl2.
ПЦР-анализ проводили в объёме 25 мкл в термоциклере типа «Терцик».
Число циклов - 35 при режиме: 5 мин 940 С - денатурация ; 10 циклов по 30
сек 940 С [60 сек 560 С] 30 сек 720 С; 25 циклов по 30 сек 900 С [60 сек 560 С]
30 сек 720 С - отжиг праймеров и 5 мин 720 С - элонгация.
Для выявления носителей BL мутации, как было сказано выше, использовали рестриктазы Hae III и Taq I. В исследованиях для электрофореза бра-
55
ли 2% агарозный гель. При этом ПЦР-продукты разделяли на три части перед рестрикционным анализом:
1 - не обработанный ферментами;
2 - обработанный ферментом Taq I;
3 - обработанный ферментом Hae III.
При проведении ПЦР, для контроля контаминации использовали 0проба. Это означает, в ПЦР параллельно наряду с отобранными для исследования образцами применяли реакционную смесь, в которой отсутствовала
ДНК. При этом реактивы и все условия реакции сохранялись, что позволяло
использовать его в качестве негативного контроля. Контролем служили образцы ДНК, полученные от гомо- и гетерозиготного животных-носителей
BL аллеля. В состав реакционной смеси входили компоненты, представленные в табл. 6.
Таблица 6 - Состав реакционной смеси с учетом
используемых праймеров
Комбинация
праймеров
Ivan2/Ivan3
12,4/12,5
Реакционная смесь
100 нг
200мкМ
0,4мкМ
0,3-,05 ед.
1х
1,5 мМ
до 25 мкл
100 нг
200 мкМ
0,4 мкМ
0,3-,05 ед.
1х
1,5 мМ
до 25 мкл
ДНК
каждого dNTP
каждого праймера
Taq-полимеразы
ПЦР-буфер
MgCl 2
бидистиллированная вода
ДНК
каждого dNTP
каждого праймера
Taq-полимеразы
ПЦР-буфер
MgCl 2
Бидистиллированная вода
56
Оценку результатов ПЦР проводили на концетрацию и специфичность
амплификата электрофоретическим методом в 2% агарозном геле, при
напряжении электрического тока 40В в течение 1 часа. Для этого достаточно
нанести на гель 5 мкл амплификата или фрагмента BL аллеля, смешанного с
1 мкл 10 х буфера для нанесения проб на гель.
Оценку результатов электрофореза проводили после окрашивания гелей
этидиумом бромидом под ультрафиолетовым излучением на трансиллюминаторе фирмы «Vilber Lourmat» ECX-15М при длине волны 290-330 нм.
Комплекс аномалий позвоночника (CVM), как и дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD) является наследственным заболеванием у крупного рогатого скота.
Впервые CVM был открыт у датской популяции голштинского скота в
1999 году [75].
Как было установлено датскими учеными, главным источником распространения аллели данной наследственной болезни, явился элитный бык 1974
года рождения голштино-фризской породы - Карлин-М Айвенго Белл
1667366 [76; 198].
Ранее было установлено, что он явился главным источником дефицита
лейкоцитарной адгезии или BLAD в голштинской популяции во всем мире.
В гомозиготном состоянии CV аллель вызывает высокую эмбриональную смертность, что сопровождается массовыми абортами и большому числу мертворожденных телят. Телята, гомозиготные по CV и BL аллелям, при
рождении имеют множественные анатомические отклонения.
Причиной возникновения обоих болезней является миссенс-мутация.
Например, при CVM, когда происходит в локусе SLC35A3 замещение в 559
позиции гуанина на тимин (G→T), в результате в синтезируемом белке аминокислота валин замещается на фенилаланин в 180 позиции (V180F).
Наличие CV и BL аллелей является ярким примером носительства мутации с одной стороны, а с другой проявления однонуклеотидного полимор-
57
физма или SNP (single nucleotide polymorphism) в ДНК у крупного рогатого
скота.
Локус SLC35A3 расположен на хромосоме BTA3 крупного рогатого
скота и участвует в транспорте UDP-N-ацетилглюкозамина [218], тогда как
локус CD 18 в BTA1 и его продукт β-интегрин участвует в защите организма,
в частности в процессе фагоцитоза.
При тестировании на CVM и BLAD выявляются 4 класса животных:
1. Неносители или нормальные: когда в генотипе оба аллеля являются
нормальными, не мутантными. Исследуемая особь здорова. Потомство от таких животных будет свободным от мутантного аллеля [рис. 4].
Отец
Мать
Потомок
Не носитель
х
Не носитель
>
100% не носитель
Не носитель
х
Носитель
>
50% не носители+50% носители
Не носитель
х
Больной
>
100% носители
Носитель
х
Не носитель
>
50% не носители+50% носители
>
25% не носители+25% больные
Носитель
х
Носитель
+50% носители
Носитель
х
Больной
>
50% носители +50% больные
Больной
х
Не носитель
>
100% носители
Больной
х
Носитель
>
50% носители + 50% больные
Больной
х
Больной
>
100% Больные
Рисунок 4 - Характеристика вариантов подбираемых пар
и прогнозируемого потомства в зависимости от присутствия
или отсутствия мутантного аллеля
2. Носители: когда в генотипе один аллель является нормальным, а
другой измененным или мутантным. Причем, одни являются носителями
только BL, а другие CV аллеля. Особи с такими генотипами передают половине своего потомства нормальный аллель, а другой половине мутантный. У
них нет определенного проявления болезни, поскольку
мутация является
58
рецессивным аллелем. Однако, благодаря передаче 50% потомков мутации,
происходит насыщение стада рецессивным аллелем. Широкое использование
не проверенных быков-производителей, не аттестованное семя или эмбрионы, в которых имеется мутантный аллель, приведет к созданию экстремальной ситуации в стаде, где используется такой племенной материал.
3. Больные: когда у исследуемой особи в генотипе в наличии два мутантных аллеля и болезнь проявляется со всеми клиническими признаками.
Например, при CVM, такая особь не жизнеспособна, поскольку у нее присутствуют оба мутантных аллеля. Эмбрион с двумя мутантными аллелями
либо абортируется, либо погибает на ранней стадии своего развития. Даже,
если рождается такой теленок, то он тоже не жизнеспособен, в силу серьезных у него морфофункциональных нарушений. Особенно это касается шейной и грудной области позвоночного столба, уменьшенным числом ребер и
контрактурами задних и передних конечностей.
На рис. 4 представлены варианты спаривания особей-носителей и неносителей мутантного аллеля. На ней же видны возможные варианты получаемого потомства. Исходя из этого, можно легко спрогнозировать, каково будет будущее получаемое потомство.
На рис. 5 представлено изображение части последовательности ДНК
нормального и CV аллелей SLC35A3 локуса. Как видно из рис. 5 в районе
559-го нуклеотида локуса SLC35A3 показано замещение одного аллеля другим и как идет формирование триплета с мутантным CV аллелем.
Принципиальным в данном случае является и то, что на нем представлены места разрезания ДНК рестриктазами PstI и EcoT22I. Данная методика
по выявлению CV аллеля была в свое время предложена группой японских
ученых [142]. Однако в своей работе, мы использовали другую методику,
предложенную Rusc A., Kaminski S. [198].
59
Рисунок 5 - Продукт ПЦР-анализа при использовании Pst I и
Eco T22 I прямых праймеров для нормального и CV аллелей:
Локус SLC 35A3, экзон 4
637
466
Обратный праймер
Нормальный аллель
559
aactttcagctggctcacaatttgtaggtctcatggcagttctcacagcatgtttttcca
Pst I прямой праймер: 5’–cacaatttgtaggtctcactgca - 3’
Pst I site
559
CV аллель
aactttcagctggctcacaatttgtaggtctcatggcatttctcacagcatgtttttcca
Eco T22 I прямой праймер: 5’–cacaatttgtaggtctcaatgca - 3’
EcoT22 I
site
В последующем, мы тоже отказались от этой методики, в силу ее громоздкости и длительности по времени проводимых исследований. Что касается BLAD, то здесь было проведено больше исследований с использованием классического типа ПЦР, поскольку в начале своих исследований мы не
имели возможности использовать ПЦР-РВ. Поэтому для проведения ПЦР, с
целью доказательства наличия мутации, ампликоны, полученные на основе
использования различных типов праймеров, обрабатывали рестриктазами
Taq I и Hae III. При этом данные ферменты разрезали ПЦР-продукт в различных местах в зависимости от расположения точковой мутации [рис. 6].
60
Рисунок 6 - Продукт ПЦР-анализа, формируемый при использовании
праймеров Ivan 2 и Ivan 3:
Ivan3
Ivan2
101 п.н.
Обработка ПЦР продукта рестриктазами Taq I и Hae III:
нормальный аллель [D128]
Taq I*
52 п.н.
32 п.н.
17п.н.
Hae III
65 п.н.
36 п.н.
мутантный аллель ( D128G)
Taq I
84 п.н.
Hae III**
17п.н.
46п.н. 19 п.н. 36 п.н.
Примечание: *- в этом участке при BL мутации разрушается сайт рестрикции для Taq I; ** - в этом участке при мутации возникает дополнительный сайт рестрикции для Hae III. Полученные данные характерны для ПЦРпродукта после его обработки рестриктазами Taq I и Hae III при использовании праймеров Ivan 2 и Ivan 3 в норме и BLAD-синдроме
У здоровых животных или неносителей BL аллеля, при использовании
праймеров Ivan 2 и Ivan 3 выявлялась 101 пара нуклеотидов ПЦР-продукта.
На рис. 6 и на фотографии агарозы [рис. 7] это представлено наглядно.
61
Рисунок 7 - Результаты агарозного гельэлектрофореза, 101 п.н. показывает ампликон не обработан рестриктазами
После воздействия рестриктазой Hae III, ампликон нормального аллеля
расщепляется на 2 фрагмента 65 и 36 пар нуклеотидов, и соответственно 52,
32 и 17 пар нуклеотидов после обработки Taq I [рис. 8].
Рисунок 8 - Результаты гельэлектрофореза, после обработки ампликона рестриктазами Taq I и Hae III
62
Что касается мутантного BL аллеля от гетерозиготного животного (носителя), то после воздействия на его ампликон рестриктазой Taq I, он расщепляется на 2 фрагмента, содержащих на агарозе соответственно 84 п.н. и
17 п.н. После обработки рестриктазой Hae III появляется 3 фрагмента: 46
п.н., 19 п.н., 36 п.н.
Получаемые результаты четко представлены в табл. 7. У гомозиготного
по BL аллелю, после воздействия Hae III, ампликон расщепляется уже на 3
фрагмента – 19 п.н., 36 п.н. и 46 п.н., тогда как обработка Taq I сопровождается образованием только 2-х полос: 84 п.н. и 17 п.н. [табл. 7].
Таблица 7 - Агарозный электрофорез аллелей CD18 [D128 и D128G]
после амплификации праймерами Ivan-2 и Ivan-3 и обработки Taq I - и
Hae III - рестриктазами; п.н. - пар нуклеотидов
Число пар
ТaqI
Нae III
ТaqI
Нae III
Нуклеотидов T/CGA GG/CC T/CGA GG/CC

84 п.н.

65 п.н.
52 п.н.

32 п.н.
Положение
Генотип
T/CGA GG/CC





неноситель (TL)
D128/D128







19 п.н.
17 п.н.
Нae III

46 п.н.
36 п.н.
ТaqI

носитель (BL)
D128/D128G

больной (BLAD)
D128G/D128G
В результате замены нуклеотидной последовательности в кодирующей
части гена аденина на гуанин в 383 положении, возникла последовательность нуклеотидов гуанин-гуанин-цитозин-цитозин, а это в свою очередь является местом разрезания рестриктазы Hae III, т.е. возник новый сайт ре-
63
стрикции, в результате чего мы и обнаружили на электрофорезе дополнительный фрагмент. Участок ампликона нормального аллеля размером в 65
п.н., у мутированного аллеля расщепляется рестриктазой на 2 фрагмента в
46 п.н. и 19 п.н.
После инкубации с Taq I, мутированный аллель расщеплялся только на 2
фрагмента, содержавших 84 и 17 пар нуклеотидов в каждом, тогда как в
нормальном, он содержал 3 бэнда. Это говорит о том, что здесь исчез сайт
рестрикции для Taq I.
В нормальном аллеле имеется последовательность нуклеотидов [на
участке 370-383 включительно] тимин-цитозин-гуанин-аденин [сайт рестрикции для Taq I], в этом участке мутация заменяет аденин на гуанин. Возникает новая последовательность, и Taq I не способен распознать этот участок. Естественный сайт рестрикции при мутации изчезает.
У особей-носителей BL или гетерозиготных генотипов имеется 2 разных
аллеля, нормальный и мутантный. Обычно у таких животных одновременно
представлены все фрагменты, выявляемые как у неносителей, так и у гомозиготных по мутантному аллелю после соответствующего воздействия Taq I и
Hae III ферментов.
Аналогичная картина отмечается при использовании праймеров 12.4 и
12.5. Здесь следует отметить другой более интересный фактор, для доказательства наличия мутации BL брали более длинные праймеры, при том же
рестриктном анализе, с помощью тех же Taq I и Hae III рестриктаз [рис. 9].
1. Продукт ПЦР-анализа, формируемый при использовании праймеров
12.4 и 12.5:
12.4
152 .н.
12.5
64
2. Обработка рестриктазами:
нормальный аллель [D128]
Taq I*
134 п.н.
Hae III
18п.н.
25п.н. 103 п.н.
24п.н.
мутантный аллель [D128 G]
Taq I
152 п.н.
Hae III**
25п.н. 83 п.н. 20п.н. 24п.н.
Примечание: * - в этом участке при мутации разрушается сайт рестрикции для Taq I; ** - в этом участке при мутации возникает дополнительный сайт рестрикции для Hae III
Рисунок 9 - Характеристика влияния рестриктаз Taq I и Hae III после обработки ПЦР-продукта при использовании праймеров 12.4 и 12.5
При использовании праймеров 12.4 и 12.5, продукт ПЦР-анализа имел
длину 152 пар нуклеотидов [рис. 9].
При рестрикции ПЦР-продукта Hae III здоровые животные [неносители]
имели фрагменты со 103, 25 и 24 парами нуклеотидов, у гетерозиготных
особей [носителей или BL] дополнительно появляются полосы соответственно с 83 и 20 парами нуклеотидов. Здесь мы видим, появление новых
фрагментов, следовательно, и новый сайт рестрикции [табл. 8].
В мутированном аллеле 2 фрагмента с 83 и 20 парами нуклеотидов и соответствуют в сумме здоровому размеру фрагмента в 103 пн. Однако, появившийся новый сайт и наличие двух дополнительных фрагментов говорят
о том, что мы имеем дело с другим аллелем.
При обработке ПЦР-продукта Taq I у здоровых животных отмечали 2
фрагмента ДНК со 134 и 18 парами нуклеотидов, тогда как у носителей обнаруживался только один фрагмент со 152 парами оснований.
65
Таблица 8 - Агарозный электрофорез аллелей D128 и D128G в локусе CD18 после амплификации праймерами’’12.4’’и ‘’12.5’’ и обработки Taq I - и Hae III - рестриктазами; п.н. - пар нуклеотидов
Число
пар
ТaqI
нуклеотидов T/CGA
Нae III
GG/CC
T/CGA
Нae III
GG/CC

152 п.н.
134 п.н.
Тaq I



103 п.н.


83 п.н.
25 п.н.


24 п.н.



20 п.н.
18 п.н.

Положение
Генотип
неноситель (TL)
D128 / D128

носитель (BL)
D128 / D128G
При наличии BL мутации у особей, сайты рестрикции по Taq I отсутствовали. Как мы видим, результаты анализа при применении двух типов
праймеров Ivan 2, Ivan3 и 12.4, 12.5 обладают определенной спецификой по
числу образуемых фрагментов.
Появившийся новый сайт рестрикции для Hae III, и исчезнувший сайт
для Taq I при мутации аллеля, выявляют, как при использовании первого, так
и при использовании второго типа праймеров.
Сравнительный анализ двух типов праймеров показал, что применение
праймеров 12.4 и 12.5 давали лучшие результаты в следующих случаях: 1.
Получаемые фрагменты ДНК более крупных размеров, а следовательно, более чёткие и хорошо видны на реакционном поле. 2. Большая величина
фрагментов ДНК способствовала ускоренному завершению проводимого
электрофореза.
66
Для тестирования нормального и мутантного аллелей CD18 локуса,
смешивали 10 мкг ПЦР-продукта с 5 ед. Taq I и таким же количеством Hae
III. Затем смесь инкубировали 1 час при 650С для Taq I и соответственно
при 370С для Hae III. Амплифицированный фрагмент ДНК выявляли методом электрофореза в 2% агарозном геле в присутствии этидиума бромида.
Для приготовления геля растворяли агарозу в воде на кипящей водяной
бане. После охлаждения до 600С, в раствор агарозного геля добавляли буфер
и раствор этидиума бромида в концентрации 0,5 мкг/мл. Охлажденную смесь
тонким слоем заливали в электрофорезную камеру и с помощью специальных гребенок делали в геле карманы для внесения образца. После застывания геля в карманы вносили амплификат, смешанный с буфером для нанесения образца и содержащего краситель.
Гель с нанесенным образцом переносили в камеру для электрофореза,
заполненную буфером. Камеру подключали к источнику постоянного тока.
Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили при
напряжении 40В в течение 2 часов.
Для определения размера ДНК-фрагментов использовали как стандарт
молекулярной массы 1,5-2 мкг плазмиды pBR322, обработанный рестриктазой MspI. Например, если длина фрагмента BL аллеля составляла 152 п.н.,
то он располагался в геле между полосами маркера 226 и 100 п.н.
Гель просматривали в ультрафиолетовом свете с помощью трансиллюминатора. Этидиум бромид образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФизлучением с длиной волны 290-330 нм. Полученные результаты переносили
в компьютер.
3.8. Диагностика миссенс-мутаций CV и BL у крупного рогатого
скота методом ПЦР-РВ. В открытой печати предложены ряд методов диагностики CVM и BLAD [146; 208; 217; 178; 142; 198]. Однако диагностика
при раздельном их выявлении занимала много времени. В этой связи были
67
начаты работы по одновременному их выявлению, такое стало возможным
при создании нового лабораторного оборудования [210]. В условиях Российской Федерации, аналогичных работ до сих пор не проводилось. Целью данного раздела явилась разработка метода выявления мутантных CV и BL аллелей у черно-пестрого голштинизированного скота, установление их встречаемости,
генетическая
оценка
родословных
быков-производителей-
носителей данного аллеля.
Исследованиями на CV и BL мутации был охвачен 601 образец семени и
крови. Из них, 474 - от быков-производителей и 127 от коров.
Одним из требований при заборе биоматериала для исследования с использованием ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) является необходимость
избегать внесения в образец реагентов, ингибирующих ПЦР или влияющих
на фоновую флуоресценцию реакционной смеси.
К первым можно отнести такие стандартные реагенты, как гепарин, который используют в качестве антикоагулянта при взятии крови. Сюда же относятся хелатирующие агенты типа ЭДТА в высокой концентрации, когда
очистка ДНК не до конца исключает ЭДТА из пробы, что влечет снижение
концентрации свободного магния в реакционной смеси и ингибирование
ПЦР.
Ко второй группе реагентов относятся любые эффективные флуорофоры, например использование в эксперименте флуоресцентных белков типа
GFP в случае плохой очистки образца может влиять на фоновую составляющую ПЦР-РВ. В нашем случае мы коснулись тех ограничений, которые могут оказать влияние для проведения диагностики мутантных аллелей.
ДНК выделяли из замороженного семени быка и крови коров с помощью фенольно-хлороформного и сорбентного [ДНК-сорб-В, ООО «ИнтерЛабСервис»] методов. Работу проводили в несколько этапов. На первом этапе был отработан метод выделения ДНК. Для этого использовли: классический (фенольно-хлороформный) и сорбентный методы выделения ДНК.
68
Проведенный сравнительный анализ различных методов выделения ДНК показал, что каждый метод имеет как свои преимущества, так и свои недостатки. Фенольно-хлороформный метод позволяет выделять высоко очищенную
ДНК хорошего качества, однако требует больших затрат времени, а так же
использования вредного для здоровья фенола. Тем неменее, получаемая таким способом ДНК высокого качества и она может храниться длительное
время. Данный метод хорош при создании Банков ДНК, требующих их длительного хранения.
Оптимальным для нашей работы представляется сорбентный метод выделения ДНК [ДНК-сорб-В, ООО «ИнтерЛабСервис»]. Он обладает технической простотой и позволяет экономить время, не прибегая к трудоемкой
процедуре фенольной экстракции. Однако качество и стабильность препаратов в целом заметно ниже, чем фенольно-хлороформных экстрактов. Сорбентный метод удобен в том случае, если препарат выделенной ДНК не нужно хранить долгие годы. Очищенную ДНК можно хранить в течение одной
недели при температуре от 2 до 8°С в обычном бытовом холодильнике, в течение года при температуре не выше минус 16°С. Поэтому для дальнейшей
работы нами был выбран сорбентный метод выделения ДНК.
ПЦР в реальном (ПЦР-РВ) времени проводили на приборе Rotor Gene Q
[Corbett Research, Австралия]. Использовали программу термоциклирования,
приведенную в табл. 9. В табл. 9 представлены стадии проведения ПЦР-РВ.
Удержание дает команду прибору оставаться при определенной температуре
в течение заданного времени (180 сек., повтор 1).
В процессе циклирования происходит денатурация, отжиг праймеров и
синтез новой цепи ДНК. При циклировании 1 повторов 10, они не детектируются, т.к данные не репрезентативны. При циклировании 2 - повторов 30,
в результате получаемые данные стабильные и являются окончательными в
плане диагностики.
69
Таблица 9 - Характеристика параметров термоциклирования для
диагностики мутантных СV и BL аллелей, вызывающих комплекс аномалий позвоночника и дефицит лейкоцитарной адгезии.
Шаги
Удерживание
температуры
Циклирование 1
Циклирование 2
Температура
0
С
94
Время,
сек
180
Детекции
Повторы
Нет
1
94
20
Нет
10
61
20
Нет
64
30
Нет
94
20
Нет
61
20
Нет
64
30
по каналам: Green,
Yellow, Orange, Red
30
Реакционная смесь имела следующий состав: 50 мМ KCl, 50 мM TRISHCl, 250 нМ dNTP, 2,5 мМ MgCl2, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Syntaq. Праймеры использовали в концентрации 200 нМ, флуоресцентные зонды – в концентрации 100нМ. Все реактивы произведены компанией ЗАО «Синтол».
Следующим этапом являлась разработка системы для выявления мутантных аллелей методом ПЦР-РВ. Использовали технологию аллельспецифических TaqMan зондов. В данном случае флуоресцентным зондом
является олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР.
Зонд метили флуорофором и гасителем флуоресценции, при этом возможно использование как концевого, так и внутреннего мечения олигонуклеотида. При отсутствии мишени, т.е. последовательности, комплементарной
зонду, флуорофор и гаситель сближаются, в результате подавляется флуоресценция зонда. Процесс тушения основан на механизме флуоресцентно-
70
резонансного переноса энергии. При наличии комплементарного зонду
фрагмента ДНК, зонд гибридизуется с ампликоном, что ведет к его расщеплению в процессе синтеза за счет 5’–экзонуклеазной активности Taqполимеразы. Интенсивность сигнала возрастает на соответствующем флуорофору канале флуоресценции с каждым циклом ПЦР, пропорционально
накоплению ампликонов.
Мы применили аллельспецифические зонды для детекции BL и CV мутаций в исследуемом фрагменте генома. Для локуса с мутацией подбирали
пару зондов, так чтобы один из них специфически гибридизовался при температуре проведения синтеза цепей с аллелем нормального (дикого) типа, а
второй зонд – с аллелем мутантного типа. Эти зонды метили разными флуорофорами, и результаты реакции с ними регистрировали на двух различных
каналах детекции прибора для ПЦР-РВ. Для определения CT и CV аллелей
мы использовали 2 канала – Green и Yellow. Нормальный CT аллель дает
рост сигнала по каналу Green, детектируемый флуорофором FAM, а мутантный аллель CV - по каналу Yellow, детектируемый флуорофором R6G.
Что касается TL и BL аллелей, то для их определения использовали тоже 2 канала, только Orange и Red. Нормальный TL аллель дает рост сигнала
по каналу Orange, детектируемый флуорофором FAM, а мутантный аллель
BL - по каналу Red, детектируемый флуорофором Cy5.
Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем
уровне пороговой линией.
Переход порога, это характеристика количества копий ДНК отдельного
гена. При оптимальном количестве копий ДНК, кривая располагается между
двумя пороговыми значениями 10 и 15 циклами амплификации.
При перемещении кривой влево по оси абсцисс, это говорит о высокой
концентрации ДНК, если вправо, то о недостатке ее концентрации в реакции.
71
Все образцы, графики флуоресценции которых, превышают или пересекают эту линию порога, будут считаться положительными по определенному каналу, т.е. содержащими соответствующий каналу флуоресценции
аллель.
Получаемая картина результатов реакций с использованием указанных
зондов на контрольных образцах приведена ниже при определении мутантного CV аллеля.
На рис. 10 результаты исследований гомозиготного дикого типа или
здорового животного или неносителя флуоресценция представлена двумя
линиями.
Рисунок 10 - Результаты исследования гомозиготы дикого типа
(здорового животного или неносителя)
Фиолетовая кривая без маркеров располагается между 10 и 15 циклами
над красной пороговой линией.
Вторая кривая с окружностями ниже пороговой линии. Данная ситуация характерна для здорового исследуемого животного.
72
На рис. 11, представлены результаты исследования гетерозиготного животного или носителя мутантного CV аллеля.
Рисунок 11 - Результаты исследования гетерозиготного животного
(носителя мутантного CV аллеля)
Как видно на рис. 11, обе кривые флуоресценции, пересекают установленную на соответствующем уровне пороговую линию в обозначенном районе, между 10 и 15 циклами ПЦР-РВ.
В то же время следует отметить, что кривая с окружностями располагается выше линии без маркеров.
Данная картина характерна для гетерози-
готного животного или носителя миссенс-мутации.
У нас не было возможности получения больного теленка опытным путем в хозяйственных условиях. В этой связи, нами впервые удалось смоделировать синтетический рецессивный генотип больного теленка по локусу
SLC35A3, в лабораторных условиях совместно с фирмой ЗАО «Синтол», на
основе знания структуры мутантного CV аллеля.
73
На рис. 12 представлен модельный образец животного, гомозиготного
по мутантному CV аллелю.
Рисунок 12 - Результаты исследования гомозиготного по мутантному CV аллелю животного (модельный образец)
Как видно на рис. 12, модельный образец отражает ситуацию характерную для больного теленка. В данном случае линия с окружностями располагается выше порога. В отношении кривой флуоресценции характерной для
здорового животного, то она оказывается под пороговой линией.
Что касается принципа определения BL аллеля, то он аналогичен тому,
что описано в отношении диагностики CV мутации. Анализ проводится, как
по описанной выше методике, только по каналам Orange и Red и вся процедура осуществлялась одновременно.
Таким образом, после отработки всей методологии и надежного выявления двух мутантных аллелей у ряда животных, мы приступили к формированию генетической генеалогии быков-производителей-носителей.
3.9. Генетическая генеалогия у быков-производителей, носителей
CV и BL аллелей. Под генетической генеалогией понимается характеристи-
74
ка родословных на основе использования результатов ДНК-тестов совместно
с традиционными методами исследования у человека и различных видов
животных. Обычно успех традиционных методов целиком зависит от сохранности и существования документов. К таким документам относятся переписные и писцовые книги у человека, каталоги племенных быков, студбуки у лошадей и т. д.
Каждое животное, как и человек, несет в себе своего рода «биологический документ», который не может быть утерян - это ядерная, митохондриальная и Y хромосомы ДНК. Методы генетической генеалогии позволяют
получить доступ к той части ДНК, которая передается неизменной от родителей к потомкам.
ДНК-тесты не просто помощь в генеалогических исследованиях - это
современный передовой инструмент, который специалисты могут использовать для того, чтобы установить или опровергнуть родственные связи между
несколькими породами, типами и линиями животных.
В нашем случае вначале был проведен анализ семени черно-пестрого
голштинизированного быка Пломбира 998. Бык-производитель Пломбир 998
принадлежал ОАО «Смоленское» по племенной работе.
Он был широко использован среди черно-пестрого скота, разводимой в
условиях Смоленской области, а в последующем Кабардино-Балкарии и Ингушетии, в результате закупки семени [табл. 13].
Несмотря на его известную родословную и отсутствие анализа на BLAD
и CVM, семя быка интенсивно использовалось в Смоленской области и двух
Северокавказских республиках.
Как видно на рис. 13, его отцом был Пионер 188. Бык-производитель
Пионер 188 принадлежал ОАО «ГЦВ СЖ». Следует отметить, что он, в свою
очередь, являлся сыном Карлин М. Айвенго Белла 1667366. Сам Карлин М.
Айвенго Белл 1667366 был сыном Пенстейт Айвенго Стар 1441440, который
передал своему сыну оба наследственных заболевания.
75
Пломбир 998
О: Пионер 188
г/ф
М: Сетка 1891
½ ч/п х швц
ММ: Сетка
675
швц
МММ: Сотка
1493
швц
ОММ: Ребус
92122
швц
ОМ:
1688325
г/ф
МОМ:
7843734
г/ф
МО: Килбали
Форте Сюзан
2516422
г/ф
ООМ
1491007
г/ф
ММО:
6370402
г/ф
ОМО:
1592942
г/ф
ОО: Карлин М.
Айвенго Белл
1667366
г/ф
МОО:
7832117
г/ф
Примечание: М – мать; О – отец; г/ф – голштино-фризская; швц – бурая швицкая
Рисунок 13 - Генетическая генеалогия быка-производителя Пломбира 998
ООО: Пенстейт Айвенго
Стар
1441440
г/ф
76
Надо сказать, это редчайший случай, когда бык передавал своему
потомству сразу два мутантных CV и BL аллеля. Мы считаем, что в наших
исследованиях это единственный случай, когда выявлялся племенной бык,
носитель сразу двух миссенс-мутаций.
Бык Пионер 188 не был аттестован на два наследственных заболевания:
комплекс аномалий позвоночника (CVM) и дефицит лейкоцитарной адгезии
или BLAD, поскольку он использовался в системе племенной службы СССР
до разработки методов ДНК-диагностики. В то же время по полученным результатам, мы предполагаем, что бык Пионер 188 оказался носителем двух
миссенс-мутаций, ответственных за возникновение таких наследственных
болезней, как комплекс аномалий позвоночника (CVM) и дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD). Исходя из полученных результатов, следует, что
Пломбир 998 получил обе мутации от отца.
ОАО «ГЦВ СЖ» является головным учреждением по обеспечению высококачественным семенем племенные предприятия Российской Федерации.
По сложившейся практике, к ним приезжают за племенным материалом даже
из республик бывшего СССР. ОАО «ГЦВ СЖ» в самые трудные 90-е годы
продолжало активную работу. Тем не менее, учитывая отсутствие возможности по аттестации на CVM и BLAD, в ОАО «ГЦВ СЖ»
попали быки-
производители, являющиеся носителями CV и BL мутации. На рис. 14 приводим генетическую генеалогию быков, потомков Карлин М. Айвенго Белла
1667366, которые получили от своего предка CV аллель.
Дело в том, что линия Монтвик Чифтейна 95679, является одной из консолидированных популяций в голштинской породе. Она дает одни из лучших высокопродуктивных потомков, поэтому, когда идет отбор ремонтного
молодняка, специалисты ОАО «ГЦВ СЖ» всегда имеют это в виду.
77
Проведенный анализ на рис. 14 показал, что отечественные быкипроизводители Голливуд 64, Бэтман 8694, Спектр 1729, Кубок 1459, Кодек
1452 оказались носителями мутантного CV аллеля. Следует также добавить,
что Голливуд 64 получил миссенс-мутацию непосредственно от отцаносителя Горацио 78987165, который в свою очередь мутантный аллель получил от матери, поскольку отец Темтор 504924 был неносителем.
Что касается ситуации относительно двух других быков: Кубока 1459 и
Кодека 1452, то они получили CV аллель от отца-носителя Конвинкера
2249055. Племенные быки Бэтман 8694 и Спектр 1729 оказавшиеся носителями CV мутации, получили ее от своих матерей, поскольку их отцы Баклан
6352 и Сапфир 6985 оказались неносителями. Исходя из анализа полученных
материалов, следует, что эти животные были правнуками (Кубока 1459 и Кодека 1452) и прапраправнуками (Голливуд 64, Бэтман 8694, Спектр 1729)
Карлин М. Айвенго Белла 1667366. Причем, из 5 отечественных быковносителей, в племенной сети Российской Федерации были использованы
только два: Кубок 1459 и Кодек 1452.
Следует здесь добавить, что в свою очередь Карлин М. Айвенго Белл
1667366 получил мутантный CV аллель, наряду с BL от своего отца Пенстейт Айвенго Стара 1441440. Как видно, в описанной ситуации, особую
значимость имеют не только отцы носители мутантной аллели, но и быковоспроизводящие группы коров. В какой-то мере последние со временем являясь носителями миссенс-мутаций, становятся своеобразным резерватом
для длительного сохранения источника молекулярно-генетической болезни.
78
Монтвик Чифтейн 95679
Р.А. Сексесар 15346
М.Р.Э. Гладиатор 827071
О. ту Фик 848777
Осборндейл
Айвенго
1189870
Темтор 504924
Пенстейн
Айвенго
Стар
1441440
Карлин М.
Айвенго
Белл
1667366
Белл Элтон
1912270
Голливуд 64
Горацио 78987165
Кубок 1459
Конвинкер
2249055
Кодек 1452
В. Белл Жене
1887096
Х. Боудевене
7787
Билл Босс 1882141
Баклан
6352
Сапфир 6985
Бэтман 8694
Спектр 1729
Примечание: красным цветом представлены зарубежные быки, носители CV алелля, от которых получены российские быки,
они обведены, синим цветом
Рисунок 14 - Генетическая генеалогия носителей CV аллеля в линии Монтвик Чифтейн 95679 из ОАО «ГЦВ СЖ»
79
Анализ 601 образца от элитных быков и быковоспроизводящих групп
коров черно-пестрого голштинизированного скота из различных регионов
Российской Федерации на наличие CV аллеля показал, что носителями данной мутации в гетерозиготной форме являются 23 животных или 3,8%, а
число особей с нормальным генотипом соответственно оказалось равным
578 или 96,2% (табл. 10). Причем, число носителей CV аллели у быковоспроизводящих групп коров (n=17) было почти в 3 раза больше, чем у быковпроизводителей (n=6).
Что касается гетерозигот по BL аллели, то их было выявлено 39 животных, что составило по частоте встречаемости 6,5%, а с нормальным генотипом 562 головы или 93,5%.
Как и с CV носителями, аналогичная ситуация складывается и по BL аллелю, только число быковоспроизводящих групп коров-носителей (n=25)
было почти в 2 раза больше, чем быков-производителей с данной мутацией
(n=14). Тем не менее, встречаемость BL аллеля у племенных быков и коров
была выше, чем число животных с CV мутацией.
У всей исследованной группы животных (n=601), частота встречаемости
CV аллеля составила 0,0191 или 1, 91%, а BL - 0,0324 или 3,24%. У быковпроизводителей эти данные составили соответственно 0,0063 (0,63%) и
0,0148 (1,48%). Относительно коров, эти данные выглядели следующим образом: CV - 0,0669 или 6,69%, а BL - 0,0984 или 9,84%.
80
Таблица 10 - Частота встречаемости генотипов и аллелей
в локусах SLC35A3 и CD 18 у животных черно-пестрой породы
Локус SLC35A3
Исследуемая
порода
Чернопестрая
Исследуемые
группы
животных
Всего
исследовано
Быкипроизводители
Племенные
коровы
n
601
474
127
Распре
деление CT/CT
Н
О
Н
О
Н
О
578
578
468
468
110
110
Генотипы
CT / CV CV/CV
23
23
6
6
17
16
0
0
0
0
0
1
Встречаемость аллелей
χ2*
0
CТ
0,9809
CV
0,0191
0
0,9937
0,0063
1
0,9331
0,0669
Локус CD 18
Исследуемая
порода
Чернопестрая
Исследуемые
n
Распре TL/TL
TL/BL
BL/BL
χ2
Встречаемость аллелей
группы
деление
TL
BL
животных
Всего
601
Н
562
39
0
1
0,9676
0,0324
исследовано
О
562
38
1
Быки474
Н
460
14
0
0
0,9852
0,0148
производители
О
460
14
0
Племенные
127
Н
102
25
0
0,2
0,9016
0,0984
коровы
О
102
23
1
Примечание: CT и TL – нормальные аллели; CV и BL – мутантные аллели.
Н – наблюдаемое число животных; О – ожидаемое число животных;
в локусе SLC35A3 Σχ2=1, при df=1, P > 0,05; в локусе CD 18 Σχ2=1,2, при df=1, P > 0,05
81
Проведенный сравнительный анализ ожидаемых и наблюдаемых чисел
конкретных генотипов всей группы выявил отсутствие нарушения генетического равновесия по SLC35A3 (Σχ2=1, при df=1, P > 0,05) и CD 18 (Σχ2=1,2,
при df=1, P > 0,05) локусам у исследованной популяции животных.
Исходя из полученных результатов, следует, что встречаемость CV и BL
аллелей у племенных коров выше, чем у быков-производителей. Объяснением данному явлению следует то, что племенные коровы, находящиеся в стаде становятся своеобразным резерватом по сохранению мутантных CV и BL
аллелей.
Как
показывает
практика
в
отношении
быков-производителей-
носителей мутаций и созданного от них спермобанка, то они удаляются из
племенных станций, хотя можно их использовать под генетическим контролем и получать от них 50% здорового потомства. Однако специалисты заявляют, что нет в этом нужды, есть животные, которыми можно заменить, выбывающих особей.
На рис. 15 представлены результаты электрофореза на 2% агарозном геле. Данный анализ проводили с помощью традиционного ПЦР-анализа.
ПЦР
TL/TL
TL/TL TL/BL (к) TL/BL (к) TL/TL TL/BL
←132 п.н.
← 87 п.н.
← 68 п.н.
← 45 п.н.
Примечание: TL/TL – нормальный аллель; TL/BL – мутантный аллель Пломбира 998,
быка-носителя; TL/BL (к) - контрольные образцы
Рисунок 15 - Результаты электрофореза фрагмента CD 18 у быков,
несущих разные аллели
82
При этом ПЦР-продукты разделяли на две части перед рестрикционным
анализом:
1 - не обработанный рестриктазой;
2 - обработанный ферментом Hae III.
Контролем служили уже известные образцы ДНК, полученные ранее от
двух гетерозиготных животных-носителей BL аллеля [TL/BL(к)] [рис. 15]. До
обработки Hae III рестриктазой продукт амплификации представлял собой
большую полоску, величиной в 132 п.н. После проведения ПЦР, для доказательства наличия мутации, другой ампликон обрабатывали рестриктазой Hae
III. При этом фермент разрезал ПЦР-продукт в различных местах при наличии точковой мутации [TL/BL(к)]. В случае отсутствия мутации получались
другие полосы (TL/TL) на фореграмме [рис. 15].
Оценку результатов электрофореза обычно проводят после окрашивания гелей этидиумом бромидом или димидиумом бромидом. В дан84
ном случае окраску проводили этидиумом
бромидом. Результат разгонки
анализируемого участка ДНК после окрашивания смотрели под ультрафиолетовым излучением на трансиллюминаторе, фирмы «Vilber Lourmat»
ECX-15М при длине волны 290-330 нм.
У животного-неносителя на рис. 15 представлены две полосы. Каждая
из них содержала соответственно 87 п.н. и 45 п.н., т.е. это характерно для
нормального аллеля [табл. 11].
Таблица 11 - Число пар нуклеотидов (п.н.), после обработки рестриктазой Нае III, амплифицированного участка гена CD 18
у быков, несущих разные аллели
Аллель
Продукт ПЦР
Рестриктаза, Hae III
TL/TL
TL/BL
132 п.н.
132 п.н.
87, 45
87, 68, 45, 19
Примечание: TL – нормальный аллель; BL – мутантный аллель
83
Что касается животного-носителя в частности быка Пломбира 998, то у
него было выделено 4 полосы. Каждая из них имела длину 87 п.н., 68 п.н., 45
п.н., 19 п.н. Причина формирования такой картины связана с разрезанием рестриктазой Hae III участка мутантного аллеля в 87 п.н. соответственно на 68
п.н. и 19 п.н.
В отношении методики Rusc A., Kaminski S. [198], то она не показала
нам желаемого результата. По данной методике, все исследованные животные давали отрицательные результаты на носительство мутантного CV аллеля. Видимо требуется определенная работа по доводке данной методики до
ее логического завершения. Только разработанным нами методом ПЦР-РВ
удалось показать, что данный подход требует соответствующей доводки.
В Кабардино-Балкарии BL и CV аллели оказались в результате покупки семени от не проверенного на их носительство быка-производителя Пломбира
998 из Смоленской области. Причем Пломбир 998 оказался носителем сразу
двух мутантных CV и BL аллелей, данное явление обнаружено впервые в
условиях Российской Федерации. Аттестация быков голштинской породы,
которые широко используются для создания массива черно-пестрого скота в
Кабардино-Балкарии и Ингушетии имеет важное значение. В данном случае,
своевременное купирование мутантных аллелей позволит создать здоровой
популяции черно-пестрого голштинизированного скота в двух республиках.
Имеющиеся в отечественной черно-пестрой популяции мутантные BL и
CV аллели связаны как с завозом быков-производителей  носителей, так и с
получением отечественного племенного материала. Карлин М. Айвенго Белл
1617366 оказался основным распространителем источника CVM и BLAD в
мире, России и других странах СНГ. Проведенный анализ показал, что животные-носители BL и CV оказались в России в середине 80-х годов, т.е. до
разработки метода ДНК-диагностики [45].
84
Главные формы распространения мутантных CV и BL аллелей в современных условиях, это быковоспроизводящие группы коров, продажа или
покупка животных-носителей, эмбрионов, через искусственное осеменение
не аттестованным семенем.
На основе проведенных исследований установлено, что в популяциях
голштинизированного скота оцененных нами в Кабардино-Балкарии, в основной своей части оказались потомки от разных быков-производителей.
В случае с быком Пломбиром 998 видно, что он получил аллель CV и
BL по отцовской линии, как было сказано выше от быка Пионера 188. Бык
Пионер 188, принадлежал ОАО «ГЦВ СЖ» и был сыном Карлин М. Айвенго
Белла 1667366.
Разработка метода диагностики на уровне ДНК позволила своевременно
выявлять ряд генетических полиморфизмов, ответственных за хозяйственнополезные признаки у коммерческих пород, и тем самым заложить основы
маркерной селекции. Высокая молочная продуктивность и разработанные
технологии позволили им получить широкое распространение по всему миру, стать породами-космополитами. Так, по данным ФАО, голштинская черно-пестрая порода охватывает ареал жизнедеятельности в 128 государствах
мира.
В то же время жесткая селекционная работа при создании голштинской
породы черно -, а позднее и красно-пестрой мастей привела к тому, что
наряду с высокой продуктивностью, ряд выдающихся быков-производителей
оказались носителями наследственных заболеваний. Эти мутации распространились по всему миру, явившись своеобразным шлейфом высокой продуктивности голштинского скота.
В ряде генетических лабораторий РАСХН и РАН накоплен довольно
большой опыт по диагностике дефицита лейкоцитарной адгезии (BLAD) у
чистопородных и помесных животных по голштинской породе [42; 45; 183].
85
Полученные данные заносятся в периодически издаваемые каталоги быковпроизводителей. Что же касается
комплекса
аномалий позвоночника
(CVM), то первая диагностика с помощью ДНК-анализа была осуществлена
датскими учеными. Они же оформили на нее патент, что создало трудности в
проведении диагностики в Российской Федерации и в большинстве стран
мира из-за невозможности в течение длительного времени создать собственную методическую базу, и дороговизны лицензии. Создание оригинальной
методической базы позволит удешевить проведение аттестации быков на
CVM в условиях России.
Следует также отметить, что ДНК-тесты представляют собой не просто
подспорье в генеалогических исследованиях, это современный передовой
инструмент, который специалисты могут использовать для того, чтобы установить или опровергнуть родственные связи между несколькими породами,
типами и линиями животных, для установления носительства конкретным
животным предпочтительного хозяйственно-полезного признака или мутантного аллеля, ответственного за определенное наследственное заболевание.
3.10. Поток генов и характеристика популяций голштинизированного скота в Российской Федерации по CVM и BLAD. При искусственном
осеменении, когда от одного быка можно получить несколько тысяч телят в
год, опасность распространения вредных генов очень велика. Производитель, гетерозиготный по летальному аллелю, передает его половине своих
потомков.
У двух спариваемых гетерозиготных особей по рецессивному аллелю,
25% телят будут гомозиготами по данному генетическому признаку. Это
значит, возможно, фенотипическое проявление мутантного аллеля, а значит
получение столько же нездорового потомства. Такое больное потомство погибает в раннем возрасте.
86
Поэтому потенциальным распространителем мутантного аллеля можно
считать только гетерозигот, а они, как правило, фенотипически не проявляются. И только лишь, благодаря применению молекулярно-генетических методов,
возможно,
своевременно
выявить
гетерозиготных
животных-
носителей летального аллеля. Гетерозиготы [TL/BL и CT/CV] обозначаются
буквой BL и CV [скрытый носитель], а нормальные гомозиготы соответственно буквой TL и CT. Обычно в каталогах эти значки ставятся после
клички и номера аттестованного животного.
В начальный период исследований в США 14,1% племенных быков
[n=2025], 17,1% из 100 самых лучших быков и 3,8% исследованной популяции коров [n=1559] выявлены как гетерозиготы.
Проявление CVM так глубоко не был изучен как BLAD, возможно оно
было связано с тем, что дефицит лейкоцитарной адгезии оказался первым молекулярно-генетическим заболеванием, выявленный с п омощью ПЦР-анализа.
Встречаемость BL аллеля у родившихся телят в США оценивалась в пределах 0,2%. В других странах, в частности в Германии,
гомозиготы были получены экспериментальным путем, всего было получено
50 телят. Они послужили основой для изучения BLAD в онтогенезе. В июле
1993 среди 100 лучших быков свыше 16% являлись гетерозиготами [115].
Благодаря исследованиям Jorgensen C.B. et al. [140] предполагается, что
в Дании из 1991 исследованных животных приблизительно 450 телят оказались BL носителями.
Duesman K. et al. [107] в Германии при обследовании 665 быковпроизводителей обнаружили среди них 6% гетерозигот по BL. Несмотря на
это, гетерозиготных племенных быков продолжали спаривать с высокопродуктивными коровами в не контролируемых популяциях [217].
87
Следует также отметить, что данный аллель впервые на территории
СНГ выявлен в Российской Федерации [41] и на Украине [10], позже в Республике Беларусь [61].
Исходя из данных Турбиной И.С. (62),
до начала исследований на
BLAD встречаемость его составляла в популяции быков ОАО «ГЦВ СЖ» 4%
[до 2000 года]. После масштабных тестирований и соответствующих мероприятий эта цифра была снижена до 1,5%.
В настоящее время носители BL и CV аллелей в ОАО «ГЦВ СЖ» отсутствуют, поскольку выявляемых животных-носителей до приобретения из
племенных хозяйств тестируют и при установлении носительства выбраковывают. Поэтому особое значение приобретают быковоспроизводящие группы коров, от которых получают бычков на ремонт.
Проведенная аттестация быков черно-пестрого голштинизированного
скота из Северо-Западной области Казахстана (n=21) и Республики Молдова
(n=42) показала отсутствие BL и CV мутаций у исследованного поголовья.
Особого внимания наших селекционеров заслуживают потомки американского голштинского быка-производителя Карлин М. Айвенго Белла
1667366. Использование его сыновей способствовало повышению генетического потенциала в стадах Российской Федерации [34]. Несмотря на свои
высокие племенные качества, он оказался носителем не только BL, но и CV
аллеля [75]. Проведенный генетико-генеалогический анализ, показывает, что
Осборндейл Айвенго 1189870 и Пенстейт Айвенго Стар 1441440 соответственно BL и CV аллели получили от матерей [186; 93; 45]. На рис. 16 представлена генеалогия линии Монтвик Чифтейна 95679.
88
Рисунок 16 - Линия Монтвик Чифтейн 95679
Монтвик
Чифтейн
95679
Р. А.
Сексесар11534
6
М. Р. Э.
Гладиатор827071
О. Ту Фик
8487770
О. Айвенго
1189870
П. А. Стар
1441440
CV, BL
К. М. А.
Белл
1667366
CV, BL
Л. И. Б.
Джесси
1842389
Трой
1882797
Сад 11
Жордан 48
Диез 1843
Билл 187
Пионер 188
CV, BL
Пломбир 998
CV, BL
97
М. Пастфайн Де
105420
Монограм
122443
Войджем
197964
С. Ф. Фонд
Хоуп
212300
Л. Фонд
Хоуп
1243697
- быки-носители BL аллели, принадлежащие ОАО «ГЦВ СЖ»,
за исключением Пломбира 998
 - бык-носитель, от которого распространился BL аллель в страны,
где разводится черно-пестрая порода
- быки, унаследовавшие BL аллель с материнской стороны
CV, BL - одновременно носители мутантных CV и BL аллелей
Ф. Мат
1392858
Ю.М. Георг
338561
Шейк 632
89
Ее представителем является бык Осборндейл Айвенго 1189870, от
которого пошло распространение BLAD по всему миру. Бык Пенстейт
Айвенго Стар 1441440 был получен путём кросса двух генеалогических
линий: Осборндейл Айвенго 1189870 и Пабст Гувернера 882933. Он же,
Пенстейт Айвенго Стар 1441440 оказался носителем двух мутаций, которые получил как от отца (BL), так и от матери (CV), которые затем
передал своему знаменитому сыну, Карлин М. Айвенго Беллу 1667366.
Именно от быка Карлин М. Айвенго Белл 1667366 получено
наибольшее количество как элитных, и в то же время потомковносителей BL и CV аллелей. Через сыновей и дочерей Карлин М. Айвенго Белла 1667366, эти два наследственных заболевания распространились как в Российской Федерации, СНГ, так и по всему миру. Причем,
одним он передал BL, другим CV аллель и очень редко оба миссенсмутации одному потомку.
Таким единственным сыном, которому он передал оба мутантных
аллеля, был Пионер 188, который в свою очередь передал оба аллеля
своему сыну Пломбиру 998 [рис. 16].
В активной части мировой популяции используются десятки сыновей Карлин М. Айвенго Белла 1667366, полученных методом трансплантации эмбрионов. Так, у 40 быков, полученных от Карлин М. Айвенго Белла 1667366, средний индекс племенной ценности равен +648, а
средний удой дочерей за полновозрастную лактацию 8828 кг молока
жирностью 3.6%. Прогнозируемая разность по типу [РДТ] находится на
уровне +0.79...+0.86. Прогнозируемая разность по удою быковтрансплантантов составляет + 481 кг молока, а быков полученных при искусственном осеменении, + 521 кг.
В США большой популярностью пользуются такие сыновья Карлин
М. Айвенго Белла 1667366, как Хилтон [Лар-Лин Белл Хилтон ЕТ1872346] и Бэлвезор [Ларлин Белвезор ЕТ-1872345]. Это родные братья,
90
полученные методом трансплантации в 1982 году. Донором была корова
Лар-Лин Глендл Хейти 9840547, отличавшаяся высокой оценкой типа
[+2.05]. В возрасте 5 лет 3 месяца при двукратном доении от неё за 365
дней лактации получено 19572 кг молока жирностью 3.6%. Она дочь
выдающегося производителя Глендл Арлинда Чифа 1556373. Быки Хилтон и Бэлвезор проверены по качеству потомства, хотя и на недостаточно большом количестве дочерей [53, 63]. Их племенная ценность равна
соответственно +803 и +621, и оба они входят в список лучших быков
США.
Высокой племенной ценностью [TPJ=+776] отличается Трой ЕТ1882797, он является гетерозиготным по BL аллелю и сыном Карлин М.
Айвенго Белла 1667366, оценен по 68 дочерям, лактировавшим в 46 стадах. Средний удой дочерей за полновозрастную лактацию составляет
8672 кг молока при жирности 3.8%. Этот бык является улучшателем по
удою [PDM=+373], по проценту жира [PDж=+0.15%], по проценту белка
[PDр=+0.07] и по типу [PDT=+0.78]. В свою очередь Трой ЕТ-1882797
является отцом Жордана 48, которому он передал мутантный BL аллель.
Жордан 48, купленный ОАО «ГЦВ СЖ» в Канаде, наиболее широко использовался в условиях племенных хозяйств России.
Естественно, есть основание предполагать, что от него получено
наибольшее количество потомков, носителей BL аллеля.
Среди сыновей Карлин М. Айвенго Белла 1667366 наивысший индекс племенной ценности [TPJ=+919] имеет производитель Лэккер Айвенго Белл Джесси ЕТ-1842398. Он выявлен как носитель BL аллеля.
Его улучшающий эффект по удою равен +736 кг молока, по проценту
жира +0,12, по типу +1.1.
От Лэккер Айвенго Белл Джесси ЕТ-1842398 был получен племенной бык-производитель Сад 11. Он так же, как и Жордан 48, широко ис-
91
пользовался в условиях племенных хозяйств Российской Федерации и
оказался носителем BL аллеля.
Наряду с увеличением молочной продуктивности, Карлин М. Айвенго Белл 1667366 расширил горизонты распространения BL в России
и СНГ через других своих потомков [Диез 1843, Билл 187].
Представитель линии Монтвик Чифтейн 95679 бык-производитель
Шейк 632 тоже оказался носителем BL и он широко использовался в ряде регионов России. Известен путь получения им мутантного BL аллеля
– через мать.
Проверка этих выдающихся животных на CV показала, отсутствие
носительства источника комплесной аномалии позвоночника.
Носителем BL аллеля также оказался представитель линии
Силинг Трайджун Роккит 252803, известный бык-производитель Жест
750 [рис. 17].
Рисунок 17 - Линия Силинг Трайджун Роккит 252803
Силинг
Силинг
Райбрук
Трайджун - Рокмэн - Старлайт - Жест 502259 - Жест 750
Рокит
275932
308691
252803
-бык–носитель BL аллеля, принадлежащий ОАО «ГЦВ СЖ»
- бык, унаследовавший BL аллель с материнской стороны
Бык относится к немецкой черно-пёстрой породе. Он родился в
ФРГ 1 августа 1983 года. Имеет 7/8 голштино-фризкой крови. На Центральной станции искусственного осеменения использовался с 12 января 1985 года. Относится к классу элита-рекорд. Живая масса в 5 лет 2
мес. составляла 876 кг. Его отцом является бык Жест 502259, а матерью
Николь 3265711 1981 года рождения с удоем 9518 кг за 305 дней лактации при жирности 4,19%, она даже превосходила по удою свою мать
92
Нини 534969, у которой удой составлял 7891 кг с жирностью молока
4,47%. Обе коровы относились к классу элита – рекорд. Отцом матери
является Пенстейт Айвенго Стар 1441440, потомок знаменитого быка
Осборндейл Айвенго 1189870 носителя BL аллеля. В этом случае отчётливо видно, что мутация передалась по материнской линии. Бык использовался на протяжении 12 лет. За это время было получено 298305
доз семени. Только в Московской области имеет 5076 дочерей. Оплодотворяющая способность спермы составляла 65,4 %.
Племенной бык использовался в ОАО «Головном Центре по воспроизводству сельскохозяйственных животных» с января 1985 года. Относится к классу элита-рекорд.
Живая масса в 2 года 1 мес. составляла 710 кг. Его отцом является
бык Жест 502259, а матерью Николь 3265711 с удоем 9518 кг за 305
дней лактации при жирности 4,19% и относилась к классу элита-рекорд.
Эта линия связана с линией Монтвик Чифтейн 95679 благодаря отцу матери, знаменитого быка, носителя BL аллеля, Пенстейт Айвенго
Стар 1441440, как известно, он является сыном Осборндейл Айвенго
1189870.
Здесь мы отчётливо видим, что мутация в этом случае передалась
по материнской линии. Поэтому вполне обоснованно считать, что проверять на носительство аллеля нужно не только быков, но и быковоспроизводящих групп коров. Оценка быка на CV мутацию была отрицательной.
В линии Уес Идеал 933122 также обнаружен носитель BL аллеля.
Носителем BL оказался племенной бык Код 189, а также ремонтный
молодняк - Лиман 1381 и Тир 46 [рис. 18].
Бык-производитель Код 189 был завезён на Центральную станцию
искусственного осеменения 24 мая 1986 года. Его отцом является лучший бык из линии Бутмайкера, Литфильд Колумбус ЕТ 1724657. Индекс
93
племенной ценности превышает более +500. Он в свое время входил в
список 100 лучших быков США [39].
В 2002 году в ОАО «ГЦВ СЖ» из хозяйств Московской области
были завезены быки Тир 46 и Лиман 1381. В течение длительного времени в хозяйствах Московской области работал Жордан 48. Он и оказался ОММ этих быков.
Мутантный аллель был получен с материнской стороны. Быки не
прошли оценку по качеству потомства, так как были удалены из племенного поголовья в силу носительства BL аллеля. Тир 46, рожден
07.01.2000 г. в ЗАО «Глебовское ПО» Истринского района.
Лиман 1381, рожден 07.01.2001 г. в ГПЗ «Непецино» Московской
области. На основе генеалогического анализа трех племенных быков
линии Уес Идеал 933122 [Код 189, Тир 46, Лиман 1381] видно, что ситуация с BL носителями схожа с линией Силинг Трайджун Роккит
252803. Мутированный аллель перешел из линии Осборндейл Айвенго
1189870 через матерей. Все быки данной линии оказались не носителями CV аллеля.
94
Рисунок 18 - Линия Уес Идеал 933122
Уес
Идеал
93312
2

С. Е. Сам
1344345
У. Б. Идеал
1013415
С. К. Ф. Дубль
---1450228
--Р.
Т. Б. Элевейшн
1271810
П. Бутмакер
1450228
Элевейшн
1491007
Л. Колумбус
1724657
С. Х. Традишн
1682485
Лидман
198334
8
Л. Элевейшн
1644629
Т. Секрет
1856904
быки – носители BL аллеля, принадлежащие ОАО «ГЦВ СЖ»
- быки, унаследовавшие BL аллель с материнской стороны
- быки - носители BL аллеля
Код 189
Лесси
122511
Тон
2098991
Лиман 1381
Тир 46
95
Бык Оливер 2170, рожденный 3 ноября 1994 года в Голландии, не
относится ни к одной из перечисленных выше трех знаменитых линий.
Известно только, что он принадлежит родственной группе племенного
американского быка Сэра Мечтилда Maпливуда 6296, рожденного еще
в 1897 году [рис. 19]. В настоящее время генеалогическое древо Оливера 2170 представлено 15 племенными предками, внесшие определенный
вклад в становление голштинской породы в США, а затем и Голландии
[62].
Оливер 2170 является еще одним ярким примером, когда мутация
передалась по материнской линии, и что данный бык также как и многие другие, является синтетическим, носителем крови иных линий.
ОММ был знаменитый бык Карлин М. Айвенго Белл 1667366, который являлся носителем BL и СV аллелей, и принадлежит линии
Монтвик Чифтейн 95679.
В Головной Центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных Оливер 2170 был завезен 12 февраля 1996 года. В 2002 году бык
Оливер 2170 прошел оценку по качеству потомства, и ему была присвоена категория А3Б1. Средний удой дочерей, полученных от него в хозяйствах Московской области, составил 5600-5800 кг молока.
96
Рисунок 19 - Родственная группа Сэра Мечтилда Maпливуда 6296
С.M. Maпливуд 6296 M.M. Питертджи 25795
С.П.O. Мерседес 37–110160
О.С. Маратон 684966
С.С. Нед 1308101
Дж. Мерседес 35077
O. Сенсейшин 274343
С.М. Лэд 714704
С.В.С.Нел 1588639*
С.П.O. Мерседес 44931
O. Сенсейшин 45–442551
В.Б.Б. Сенсейшн 1113263
К.Константин 9043
С. Сенсейшн 1267271
Оливер 2170
* - племенные быки С.В.С.Нел 1588639 и К.Константин 9043 широко использовались
в условиях королевства Нидерландов.
-
бык – носитель BL аллеля, принадлежащий ОАО «ГЦВ СЖ»
- бык, унаследовавший BL аллель с материнской стороны
Н.И. Ормсби 519666
97
В линии Рефлекшен Соверинг 198998 также обнаружен носитель
BL аллеля [40]. Им оказался бык Зонтик 992, принадлежащий ОАО
"Кировское" по племенной работе [рис. 20]. Проверка его на носительство мутантного CV аллеля дала отрицательный результат.
Зонтик 992, 2001 года рождения, относится к черно-пестрой породе и несет в себе 81% голштино-фризкой крови. Он был завезен в ОАО
"Кировское" по племенной работе из ПЗ "Ульянино" Московской области.
Мутантный аллель им также был получен по материнской линии.
По имеющейся информации, у всех 8 предков по отцовской линии BL
аллель отсутствует.
Рисунок 20 - Линия Рефлекшен Соверинг 198998
Рефлекшен Соверинг
198998
Р. С. Сюприм
2496330
Р. П. Танибал
1322381
Р. Адмирал
1383926
П. Ф. Арланда Чиф
1427381/82010
Валериан
1650414/502383
Экспренко
1883228
Эксимер 17
Зонтик 992
 бык-носитель BL аллеля
 бык, унаследовавший BL аллель с материнской стороны
98
Рецессивный аллель он наследовал от деда Осборндейл Айвенго
1189870 и его внука Эппл Элевейшен 1491007, через мать с последующим его распространением по линии Рефлекшен Соверинга 198998 [40].
У данного быка отсутствовал CV аллель.
Таким образом, исходя из анализа представителей знаменитых линий, следует, что в Российской Федерации наиболее распространен и
более изучена геногеография BL аллели, чем CV мутации.
По данным Погребняка В.А. [52], существует высокая степень родства линии Монтвик Чифтейн 95679 с линиями Уес Идеал 933122, Силинг Трайджун Рокит 252803. Кроме того, в чёрно-пестрой породе доля
крови Монтвика Чифтейна 95679 составляет 20,8%, что является высоким показателем. Это говорит о том, что при формировании новых линий вливалась огромная доля крови этого быка и его потомков, и естественно происходило интенсивное расселение дефектного аллеля в различные популяции черно-пёстрого скота.
Среди выявленных BL быков-носителей, линии Силинг Трайджун
Рокит 252803 доля крови Монтвик Чифтейн 95679 составляет 16,6%. В
популяции животных исследованных на носительство BL аллель, в основной своей части оказались быки, потомки Карлин М. Айвенго Белла
1667366.
Исходя из истории разведения черно-пестрого голштинизированного скота в Российской Федерации, можно сделать вывод, что наиболее
интенсивно использовался Жордан 48, затем Диез 1843. Отсюда, от
Жордана 48 и Диеза 1843, аллель BL распространился в наибольшей
степени.
Ведь это не удивительно, оба быка Жордан 48 и Диез 1843, у которых наибольшее количество учтенных дочерей, обладали наивысшими
показателями по удою относительно потомков других быков. Поэтому
они и использовались активно относительно других производителей.
99
Быки-производители Тир 46 и Лиман 1381, после их аттестации и диагностики у них BL аллеля, были исключены из общего пользования.
Вначале эти племенные быки-производители были тестированы только
на носительство BL мутации. Последующая их аттестация на CV показала, что оба они являются неносителями.
При этом необходимо обратить внимание, что Жордан 48 производитель голштинской породы линии Монтвик Чифтейн 95769. Его отец,
Карлин М. Айвенго Белл 1667366, родился на канадской ферме в мае
1974 года и по результатам продуктивности отнесён к классу элитарекорд.
Карлин М. Айвенго Белла 1667366 использовали в основном из-за
высокой продуктивности его матери Н.Т.Буттеркуп 0989833, продуктивность которой по 3-й лактации составляла - удой 17309 кг, при жирности молока 4,4%. При оценке постэмбриональных потерь к приплоду
в АО «Детскосельское», ферма «Центральная», в потомстве Жордан 48
наблюдался наибольший процент смертности (53%). Из 26 результативных осемений получено всего 12 живых телят, 10 оказались мертворожденные, а остальные 4 выкидышы [23].
Предположительно высокий процент смертности, возможно, является следствием воздействия рецессивного BL аллеля. Хотя авторы не
приводят данных о достоверности происхождения животных.
Как известно, число аномальных потомков может увеличиваться с
применением инбридинга, который возникает при продолжительном
использовании ограниченного количества быков-производителей или
наличии гена другого наследственного заболевания.
По данным Щинова М.Ю. [67], из 5 дочерей и 3 внучек быка Жордана 48 на ферме «Дубровицы» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, 4 дочери оказались носителями мутантного BL аллеля. Среди потомков второго поколения быка Жордана 48, носителей не было обнаружено. К со-
100
жалению, автор не приводит результаты исследований по матерям дочерей быка Жордана 48, поэтому можно только предположить, что мутация передалась по отцовской линии.
Ядром голштинской породы являются 20 быков-родоначальников,
поэтому инбредная депрессия у потомков неизбежна. Коэффицент инбридинга в голштинской породе в США составляет 4,3%, в Канаде 1,7%, в Германии - 2.3%. Результаты исследований I. Engelhard [112]
показывают, что в ФРГ от поколения прародителей к родителям рост
инбридинга происходит на 0,32%, при генеративном интервале – 6,8
лет. Ежегодный рост инбридинга составляет – 0,07%.
Родственные связи способствуют накоплению рецессивных генов, в
том числе и мутантных. И тогда концентрация BL и CV аллелей в породе может достичь такого уровня, что возникнет необходимость в специальных мерах для снижения его частоты встречаемости. Основной задачей при этом является выявление животных, в особенности производителей, гетерозиготных по нежелательным аллелям. Так как эти аллели
рецессивные, то выявить гетерозигот очень сложно, поскольку фенотипически он не проявляется.
На основе исследований установлено, имеющийся в черно-пестрой
популяции мутантные BL и CV аллели, связаны с завозом быковпроизводителейносителей и они являются прямыми потомками
Осборндейл Айвенго 1189870, Пенстейт Айвенго Стара 1441440 и Карлин М. Айвенго Белла 1667366. Проведенный анализ показал, что потомки данных животных оказались в Российской Федерации в середине
80-х годов, т.е. до разработки метода ДНК-диагностики.
В настоящее время, главные формы распространения CV и BL аллелей, это быковоспроизводящие матери, продажа или покупка животных-носителей, эмбрионов, через искусственное осеменение не аттестованным семенем [43; 45; 46]. Таким образом, проведенный анализ рас-
101
пространенных линий в Российской Федерации показал, что наиболее
активно
в элитных
стадах
использовались быки-производители-
носители BL мутации. Повторная их аттестации на носительство CV
подтвердила, что в Российской Федерации больше всего было использовано быков-носителей с BL мутантным аллелем.
3.11. Геногеография BL и CV в Российской Федерации и за рубежом. Мутантные гены, вызывающие ослабление или гибель животного мигрируют из одного стада в другое и даже из одной страны в другую. Так, быка голштинской породы Осборндейл Айвенго 1189870, голландского происхождения, родившегося в 1952 году, считали выдающимся производителем в США. От него была получена масса элитного
поголовья быков-производителей и коров, от которых как племенной
материал потомки распространились по всему миру.
Спустя 40 лет, когда стало известно, что он является носителем BL
аллеля, его наследственный материал оказался широко распространенным среди черно-пестрых и красно-пестрых пород крупного рогатого скота во всем мире.
Аналогичная ситуация сложилась и с другими знаменитыми американскими быками-производителями, отцом и сыном: Пенстейт Айвенго
Старом 1441440 и Карлин М. Айвенго Беллом 1667366. Пенстейт Айвенго Стар 1441440 получил от своего отца Осборндейл Айвенго
1189870 мутантный аллель, вызывающий дефицит лейкоцитарной адгезии, а от матери – комплексную аномалию позвоночника (CVM). Оба
эти аллеля он передал своему не менее знаменитому сыну, от которого
по всему миру распространились BL и CV миссенс-мутации.
В настоящее время геногеография BL аллеля является наиболее
изученной. Как видно из геногеографической карты [рис.21], он диагностирован в 6 республиках бывшего СССР, в частности по СНГ в трех
102
республиках [Россия, Белоруссия и Украина], а также в странах Балтии
(Эстония, Латвия, Литва), не установлен в Казахстане и Молдове.
В развитых и развивающихся странах мира, где широко используются для скрещивания черно-пестрые и красно-пестрые популяции высокомолочного голштинского скота, данная ситуация выглядит следующим образом. Аллель BL выявлен в 27 странах:
Северная Америка (n=2): США [127; 145; 118]; Канада
[82].
Латинская Америка и Карибия (n=2): Аргентина [189; 163]; Бразилия [195].
Европа (n=14): Австрия [206]; Бельгия [101], Великобритания [80],
Венгрия [113], Голландия [175; 88], Дания [73; 140], Италия [214], Испания [222], Польша [163]; Румыния [223], Франция [123; 97], ФРГ
[219; 217], Швейцария [170], Чехия [100].
Юго-Восточная Азия и бассейн Тихого океана (n=4):
[157], Япония [215; 178], Новая Зеландия и Австралия [130].
Ближний Восток (n=2): Иран [183], Турция [185].
Южная Азия (n=2): Индия [191], Пакистан [189].
Африка (n=1): ЮАР [213].
Китай
103
Рисунок 21 – Распространение мутантных BL и CV аллелей у черно-пестрого голштинизированного скота в Российской Федерации
104
Животноводческие общества США, Канады [82], ФРГ [81; 141],
Бельгии [82], Голландии [174], Российской Федерации [45] и других животноводческих странах мира решено обязательное тестирование на носительство мутантных аллелей. Что касается CV аллеля, то его география в Российской Федерации и других страна мира менее изучена. Исходя из проведенных исследований, он выявлен в Российской Федерации в следующих областях: Московская, Брянская Кировская, Ленинградская, Смоленская, Кабардино-Балкарская Республика. Не выявлен в
Рязанской и Тамбовской областей. После аттестации на CV и BL аллелей, вызывающих CVM и BLAD, полученные данные заносятся в периодически издаваемые каталоги по племенным быкам.
4. ОБСУЖДЕНИЕ
Увеличение эффективности селекционной работы с крупным рогатым скотом, приводит к необходимости разработки методов выявления
генотипических особенностей животных
[232; 143; 24; 60; 62; 2; 46].
Острота этой проблемы в основном обусловлена двумя следующими обстоятельствами:
- во-первых, уже выявлены продукты структурных генов, аллельные варианты которых могут рассматриваться как прямые хозяйственно
ценные признаки. Современное развитие методов молекулярной генетики позволяет выявлять носителей разных аллельных вариантов в образцах крови животных любого пола и возраста, в семени быков, в эмбрионах;
- во-вторых, широкое использование импортных животных в племенной работе приводит к увеличению риска распространения рецессивных генетических заболеваний [159; 204; 207; 64; 12; 179; 45; 194].
К сожалению, отбор и завоз импортируемого скота в нашу страну
часто производили стихийно без учета последних достижений сельско-
105
хозяйственной биологии. Вследствие этого в племенную сеть попали
производители, имеющие в своей наследственности рецессивные гены.
Особенно это ярко видно на примере CV и BL аллелей.
Порода или группа животных может приобрести аллель либо в результате мутации, возникшей у одного из его членов, либо в результате
иммиграции носителя этого аллеля из другой популяции. Последний создает поток генов.
Носитель нового аллеля, очевидно приобрёл его в результате мутации когда-то в прошлом. Следовательно, поток генов можно рассматривать как запаздывающий эффект мутационного процесса. Тем не менее,
прямым и непосредственным источником некоторых изменений в популяции в каждый момент может быть иммиграция носителей различных аллелей из других биологических структур. Некоторые мутантные
аллели, никогда не возникая в данной группе животных, могут поступать в неё из соседних популяций.
Таким образом, в конечном итоге источником изменчивости в популяции-реципиенте служат генные мутации, возникшие в какой-то момент в прошлом, в каком-то другом месте. Однако действенной причиной изменчивости в данное время и в данном месте является поток генов. Поток генов зависит в свою очередь от процесса  расселения, составляющего его физическую основу [14].
В чем эффективность потока генов в пространстве и времени?
Сколь далеко может распространиться определённый ген в популяционной системе за некий разумный период, при данном потенциале расселения и обычной интенсивности миграции с помощью или без помощи отбора?
Аллели СV и BL, являясь «шлейфом» высокой молочности, распространились по всему миру. Их распространение шло по следующим пу-
106
тям: благодаря покупке животного, через приобретение замороженного
семени или эмбриона.
Поток CV и BL аллелей в настоящее время в популяциях черно- и
красно-пестрого голштинизированного скота в ряде стран СНГ и мира
идет через его перемещение внутри популяции или между хозяйствами,
а также в процессе приобретения племенного материала-носителей данных мутаций из-за рубежа [94; 28; 75; 221; 63; 95; 166; 62; 59; 190; 31;
61; 41; 42; 45; 46].
Ежегодный экономический ущерб, наносимый BLAD, в расчете на
одного теленка составляет в среднем 300 долларов, а в перерасчете
на всю популяцию голштинского скота в пределах 5 миллионов долларов США [208; 118].
В Российскую Федерацию аллели CV и BL занесены вместе с приобретением быков, покупкой эмбрионов, спермы до разработки метода
диагностики.
Племенной материал поступил в ОАО «ГЦВ СЖ» и другие племенные объединения из Германии, Канады, США и Голландии, а также от
племенных животных, выращенных в условиях самой России [45].
Точковые мутации можно разделить на несколько типов, в зависимости от характера изменения в гене. В случае с аллелями CV и BL мы
имеем дело с миссенс-мутациями по классификации В. Гранта [14].
К этому типу принадлежат мутации, когда в одном из триплетов
происходит замена одного нуклеотида другим. При наличии BL аллеля
у животного в триплете ГАЦ происходит замена аденина на гуанин, образуя новый триплет [ГГЦ], после чего измененный триплет участвует в
синтезе аминокислоты глицина, вместо аспарагиновой кислоты [рис.
22].
107
Мутации
Геномные
(полиплоидия)
гаплоидия
гетероплоидия
гаплоидия
эуплодия
Хромосомные
абберации
Внутрихромосомные аберрации
делеция
генные
Межхромосомные
аберрации
дефишенси
Замена нуклеотидов в ДНК
транслокация
инверсия
дупликация
Автополиплоидия
Аллополиплоидия
фрагментация
Вставка или выпадение нуклеотидов в ДНК
Рисунок 22 - Классификация мутаций [Грант В., 1991]
Что касается возникновения CV аллеля, то он тоже продукт миссенс-мутации. В результате замены нуклеотида гуанина на тимин произошло формирование из CAG нового CAT триплета, следствием чего в
белке произошло замещение аминокислоты валина на фенилаланин.
Известно, что мутации генов обеспечивают возможность быстрой
генотипической адаптации при резких изменениях условий среды. Возобновление популяций происходит за счет отдельных генотиповносителей благоприятных мутаций.
108
Вместе с тем, в природе не бывает так, чтобы мутант просто объединился с нормальным аллелем в одной из особей потомков и оказался
в половине его гамет. В естественных условиях мутация, появившаяся в
одном из организмов, не остается в пределах родословной одной семьи,
а входит в состав генофонда данной популяции. Классическим примером как раз служат аллели CV и BL у черно-пестрых и отчасти краснопестрых голштинов и их помесей.
Мутации BL и CV, вызывающие соответственно дефицит лейкоцитарной адгезии и комплекс аномалий позвоночника, находятся под пристальным вниманием специалистов голштинской породы. Оба мутантных аллеля, являясь "шлейфом" высокой молочности, распространились
по всему миру до разработки метода их диагностики.
Распространение шло по следующим путям: благодаря покупке
непроверенного племенного животного, через приобретение не аттестованного замороженного семени или эмбриона. Поток аллелей в настоящее время в массив отечественного скота идет через их перемещение
внутри популяции или между ними, в процессе приобретения племенного материала-носителя данной мутации из-за рубежа [43; 45].
При искусственном осеменении, когда от одного быка можно получить несколько тысяч телят в год, опасность распространения вредных
аллелей очень велика. Производитель, гетерозиготный по летальному
аллелю, передает его половине своих потомков. У двух гетерозиготных
особей 25% потомства будут гомозиготами по рецессивному аллелю,
т.е. возможно фенотипическое проявление.
Потомство, которое является носителем этого аллеля, погибает в
раннем возрасте. Поэтому потенциальным распространителем вредного
аллеля можно считать только гетерозигот, а они, как правило, фенотипически не проявляются. И лишь благодаря применению молекулярно-
109
генетических методов можно своевременно выявить гетерозиготных
животных-носителей летального аллеля [97; 28; 42; 44; 71; 62; 46].
Нами была поставлена задача разработать ПЦР-РВ методику и изучить встречаемость мутантных CV и BL аллелей в условиях России. С
этой целью нами были апробированы различные методы выделения
ДНК из крови коров, семени быков. В результате был подобран оптимальный режим выделения ДНК из крови и семени быков и коров
голштинской породы, а также помесей голштинская х черно-пестрая.
Что касается разработки метода одновременной диагностики CV и BL
аллелей, то она была проведена совместно с ЗАО «Синтол» (Москва).
Голштинская порода - одна из лучших молочных пород мира. Она
имеет самый большой в мире генетический потенциал молочной продуктивности. Исключительно положительным примером генетического
влияния на молочный скот во многих странах является широкое использование животных голштинской породы [9; 57; 36].
Голштинский скот, обладая самым высоким генетическим потенциалом молочности и комплексом других качеств, разводится в 128 странах мира и включен в селекционные программы по совершенствованию
многих пород.
Свыше двух десятилетий голштинская порода является единственным селекционным материалом в улучшении племенных качеств
немецкого чёрно-пёстрого скота. Почти все быки станций искусственного осеменения чёрно-пёстрой породы ФРГ имеют 75% и более процентов «крови» голштинской породы [58].
В ближайшие 15-20 лет голштинская порода сохранит свое лидирующее положение, здесь уже накоплен определенный ген етический потенциал продуктивности [8].
В 1960 году удельный вес коров чёрно-пестрой породы в Российской Федерации составлял 11,7%, через 10 лет он достиг 22,6%, в 1985 г.
110
- 32,5%. По данным Ежегодника ФГНУ ВНИИплем в 2006 г. удельный
вес черно-пестрой и голштинской пород этот показатель уже составил
58,4%.
По данным того же Ежегодника ФГНУ ВНИИплем (2011) в 2010
году удельный вес черно-пестрой и голштинской пород уже составил
62,6%. А с учетом голштинской красно-пестрой и красно-пестрой пород, этот показатель достиг 68,2%. Что касается ряда областей России
(Московская, Ленинградская, Рязанская и др.), то там генофонд почти
на 100% представлен популяцией черно-пестрого скота. Такое положение связываем с большой потребностью в питьевом молоке жителей
этих регионов.
В Канаде, США, Японии и других странах эти цифры превысили
90%. Учитывая широкое использование голштинской породы, составлены генеалогические схемы быков, налажен тщательный генетический
контроль родословных у выдающихся производителей. Проводится
оценка вклада отдельных быков в генофонд плановых пород, их влияние на генетическую структуру стад, линий, оценку и прогноз инбридинга в популяциях различного происхождения черно-пестрого генеалогического корня [55; 9; 58; 34; 35; 36; 53; 5].
Практически все лучшие племенные заводы России с молочной
продуктивностью свыше 5 тыс. кг использовали и используют голштинский скот [58; 17]. Однако интенсивный отбор животных по молочности
и максимальное использование небольшого количества улучшателей
привел к ряду нежелательных последствий.
В результате в наследственности голштин ских быков постепенно накопились нежелательные рецессивные аллели, получившие следующие обозначения: BD – непропорциональное развитие
челюстей [бульдожистость]; BL – дефицит лейкоцитарной адгезии;
CVM – комплекс аномалий позвоночника; Df – карликовость; NL –
111
отсутствие шерсти у новорожденных телят; IS – очень тонкая кожа; MF
– синдактилизм; РТ – кариес зубов; PG – удлиненный период стельности [более 300 дней].
Указанные шифры нежелательных аллелей вносят в родословные
животных. Выдающихся быков и ремонтный молодняк проверяют на
носительство мутантных аллелей, а результаты регулярно публикуют в
периодически издаваемых каталогах.
Своевременное выявление носителей позволит избежать спаривания двух гетерозигот или, наоборот, использовать их в разведении под
особым контролем в случае высокой их препотентности. И самое главное, можно локализовать животных, несущих мутацию, без значительного сужения генетического разнообразия той популяции, за которой
закрепляется гетерозиготный бык.
В большинстве стран мира созданы и выполняются масштабные
программы по выявлению и исключению из воспроизводства носителей
ряда генетических заболеваний. Так, у голштинской породы обязательным является диагностика мутаций, вызывающих BLAD, CVM и многих других болезней, в зависимости от использованных быков и страны,
где они разводятся [76; 100; 198].
В этой связи, на примере диагностики BL и CV мутаций и генеалогического анализа с использованием ДНК-технологии, предлагаем
скрининговую программу, при разведении голштинизированного скота в России.
Учитывать при аттестации всех быков, племенной ремонтный
молодняк, быковоспроизводящих групп коров черно- и красно-пестрых
голштинизированных животных с занесением этих данных в соответствующие племенные каталоги. Эта система может быть с успехом использована и для других генетических болезней моногенной наследуемости [106; 25].
112
Обязательным должно быть наличие генетического паспорта на
закупаемую сперму, эмбрионы и племенных животных. В настоящее
время в ОАО «ГЦВ СЖ» и других ведущих племенных предприятиях
России нет ни одного носителя BL и CV аллелей.
Формирование поголовья быков идет после их аттестации на носительство мутантных генов. Диагностика BL, CV и других мутантных аллелей и анализ по ним родословных элитных быков позволил заложить
основы ветеринарно-медицинского консультирования специалистов по
купированию источников молекулярных болезней на современном этапе
разведения молочного скота.
113
5. В Ы В О Д Ы
1. Впервые в Российской Федерации предложен ПЦР-РВ метод для
одновременной диагностики двух мутантных аллелей, вызывающих
наследственные болезни: комплексную аномалию позвоночника (CVM)
и дефицит лейкоцитарной адгезии (BLAD) у черно-пестрого голштинизированного скота. Принцип основан на использовании технологии аллельспецифических TaqMan или флуоресцентных зондов.
2. Для выявления CT и CV аллелей использовали 2 канала – Green и
Yellow. Нормальный CT аллель определялся по росту сигнала по каналу
Green, детектируемый флуорофором FAM, а мутантный аллель CV - по
каналу Yellow, детектируемый флуо рофором R6G.
3. Для определения TL и BL аллелей использовали также 2 канала Orange и Red. Нормальный TL аллель дает рост сигнала по каналу Orange, детектируемый флуорофором ROX, а мутантный аллель BL - по
каналу Red, детектируемый флуорофором Cy5.
4. Сравнительный анализ выделения ДНК показал, что лучшим является фенольно-хлороформный метод, поскольку он давал высокоочищенную ДНК, в то же время он требовал больших затрат времени. Оптимальным для работы представляется сорбентный метод выделения
ДНК. Он обладает технической простотой и экономит время, не прибегая к трудоемкой процедуре фенольной экстракции. Сорбентный метод
удобен в том случае, если препарат выделенной ДНК не нужно хранить
долгие годы. Очищенную ДНК при сорбентном методе можно хранить в
течение одной недели при температуре от 2 до 8°С в бытовом холодильнике, в течение года при температуре не выше минус 16°С.
5. Проведен анализ и дана характеристика по 2-м наследственным
болезням (BLAD, CVM) у быков-производителей и быковоспроизводя-
114
щих групп коров разной кровности по голштинской породе, принадлежащих ведущим племенным предприятиям Российской Федерации. Носителями CV и BL аллелей оказались быки-производители, поступившие в нашу страну из Германии, Канады и США и являются прямыми
потомками
лидеров голштинской породы
Осборндейл Айвенго
1189879, П. Айвенго Стар 1441440 и Карлин М. Айвенго Белл 1667366.
6. Из 601 аттестованного животного, носителями рецессивного аллеля комплексной аномалии позвоночника (CVM) оказалось 1,91% животных. Из 474 быков носительство CV мутации было выявлено у
0,63%, в отношении племенных коров - встречаемость данного аллеля
составила 6,69%. Что касается дефицита лейкоцитарной адгезии
(BLAD), то его встречаемость у всей исследованной популяции составила 3,24%, у быков – 1,48%, племенных коров – 9,84%. Генеалогический
анализ показал, что животные, у которых выявлены генетические аномалии являются прямыми потомками быка Карлин М. Айвенго Белл
1667366.
7. CV и BL аллели диагностированы в Брянской, Московской, Кировской,
Ленинградской,
Смоленской
областях
и
Кабардино-
Балкарской Республике. BL аллель у племенных коров встречается чаще, это свидетельствует о том, что они являются своеобразным резерватом мутантных аллелей в стаде. Носительство CV/BL редко встречается,
оно было установлено только у одного быка.
115
6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ
НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
1. Одновременная аттестация элитных животных черно-пестрой
голштинизированной породы по двум миссенс-мутациям (BL и CV) на
основе ПЦР-РВ позволит направленно формировать аллелофонд быковпроизводителей, быковоспроизводящих групп коров, ремонтный молодняк, а также накапливать племенной материал (банк семени и эмбрионов) от здоровых животных.
2. Наличие генетического паспорта на CV и BL мутаций у элитных
животных позволит эффективно вести селекционно-племенную работу в
племенных стадах черно-пестрого генеалогического корня.
3. Полученные результаты исследований используются при чтении
лекций и проведении практических занятий по курсу «Иммунология»,
«Ветеринарная генетика», «Разведение сельскохозяйственных животных» в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ им. К. И. Скрябина, для слушателей
системы аграрного дополнительного профессионального образования в
ФГБОУ РАМЖ.
7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
1. Полученные материалы рекомендуется использовать в отраслевых генетических лабораториях для одновременной диагностики мутантных CV и BL аллелей.
2. На племенных предприятиях для оценки завозимых элитных быков, ремонтных бычков, быковоспроизводящих групп коров, семя и эмбрионов.
116
8. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Амерханов Х.А., Марзанов Н.С. Генетики смотрят в будущее //
Племенное дело. – 1999. – № 1. – С. 7-9.
2. Бенедиктус Г. О чем расскажет ДНК коров? Революция в селекции крупного рогатого скота // Молоко and Корма. Менеджмент. –
2008. – №3(20). – С.2-4.
3. Боголюбский С.Н. Происхождение и преобразование домашних
животных / С.Н. Боголюбский. - М.: Советская наука, 1959.
4. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной
адгезии человека // Успехи современной биологии. – 1994. –Т.114. –
Вып.6. – С.741-753.
5. Букаров Н.Г., Лебедев Е.Ю., Канеев А.З., Морозов И.М. Генетический мониторинг – методология повышения эффективности разведения крупного рогатого скота // Материалы международной научнопрактической конференции: "Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки". – Дубровицы, 2004. – Вып. 62. – Т.1. – С. 43-46.
6. Вартапетян А.Б. Полимеразная цепная реакция // Молекулярная
биология. – 1991. – Том 25. – №4. – C.926-936.
7. Визнер Э., Виллер З. Ветеринарная патогенетика. - М., 1979.
8. Винничук Д.Т., Созинов А.А. Ген «BLAD» в наследственности
голштинского скота // Вiсник аграрной науки. – 1994. – №6. – С.44-46.
9. Волынцев А.А., Прудов А.И., Исаев В.А., Дунин И.М., Аджибеков
К.К.,
Прохоренко
Д.Г.
Генеалогические
схемы
быков-
производителей голштинской породы (Каталог). - Москва, 1989. – 382с.
10. Глазко В.И. ДНК-технологии животных. - Киев, 1997. – 173c.
11. Глазко В.И., Лавровский В.В., Филенко А.Н., Мариуца А.Э.
Внутрипородная генетическая дифференциация и наличие мутации
117
BLAD
у
крупного
рогатого
скота
голштинской
породы
//
Сельскохозяйственная биология. – 2000. – №4. – С.45-47.
12. Глазко В.И., Дунин И.М., Глазко Г.В., Калашникова Л.А.
Введение в ДНК-технологию. – Москва: ФГНУ «Росинформагротех»,
2001. – 434с.
13. Горбунова В.Н., Баранов В.С. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. - СанктПетербург: «Специальная литература», 1997. – 286с.
14. Грант В. Эволюционный процесс: критический обзор эволюционной теории. – Москва: Мир, 1991. – 277с.
15. Данкверт A.Г., Данкверт C.A. История племенного животноводства России. - Изд-во ВНИИплем. Лесные Поляны, 2002. – 333 с.
16. Дмитриев Н.Г. Породы скота по странам мира. - Л.: Колос,
1978. – 288 с. (Справочная книга).
17. Дунин И.М. Материалы Всероссийской научно-практической
конференции на тему: «Научное обеспечение АПК Евро-СевероВостока России». – Саранск: САРАНСК, 2010. – С.29-32.
18. Жигачев А.И. Генетический груз и мониторинг вредных мутаций в популяциях крупного рогатого скота: автореф. дис. докт. биол.
наук. - Л.-Пушкин, 1986.
19. Жигачев А.И. Проблемы мутагенеза в современных популяциях сельскохозяйственных животных. Тез. докл. V съезда ВОГиС. М.,
1987. – Т. V. – С.67-69.
20. Жигачев А.И. Оценка производителей на скрытые генетические дефекты // Зоотехния. – 2001. – №3. – С.10-12.
21. Жигачев А.И. Заболевания скота XXI века - откуда они? Наше
племенное дело. – 2004. – №3. – С. 9-11.
118
22. Жигачев А.И., Савичева С.В. Распространение летального гена у черно-пестрого скота и его селекционная профилактика. В сб.: Селекция сельскохозяйственных животных на устойчивость к болезням,
повышение резистентности и продуктивность долголетия. М., 1992. –
Вып. 9. – С.107-108.
23. Жигачёв А., Богачёва Т., Фогель С. Система контроля за
вредными мутациями // Молочное и мясное скотоводство. – 1998. – N67. – C.18-21.
24. Жигачев А.И., Суллер И.Л. Наследственные аномалии и их
контроль у КРС // Практик. – 2002. – №3-4. – С.46-53.
25. Жигачёв А.И., Эрнст Л.К., Богачёва Т.С. О накоплении груза
мутаций в породах крупного рогатого скота при интенсивных технологиях воспроизводства и улучшения по целевым признакам // Сельскохозяйственная биология. – 2008. – №6. – С.25-32.
26. Ежегодник по племенной работе в молочном скотоводстве в
хозяйствах Российской Федерации / под ред. И.М. Дунина. – Москва:
Изд-во ВНИИплем., 2007. – 222с.
27. Ежегодник по племенной работе в молочном скотоводстве в
хозяйствах Российской Федерации. - ВНИИплем, 2011. – 251с.
28. Игнатьев В.М. Скрининг гена лейкоцитарной адгезии (BLADсиндром) у животных черно-пестрого корня крупного рогатого скота //
Дисс. канд. биол. наук. - Дубровицы, 1998. – 96с.
29. Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И., Глазко Г.В.,
Рыжова Н.В., Голубина Е.П. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных. - Москва, 1999. – 148с.
30. Калашникова Л.А. Геномная оценка молочного скота / Л.А.
Калашникова // Молочное и мясное скотоводство.–2010. – N1. – С.10-12.
119
31. Каталог быков-производителей ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» / под ред. Ескина Г.В.
Быково, 2010. – 36с.
32. Костомахин Н.М. Скотоводство. - Санкт-Петербург-МоскваКраснодар: Лань, 2007. – 431с.
33. Костомахин Н.М. Породы крупного рогатого скота. – Москва:
КолосС, 2011. – 119с.
34. Кузнецов В.М. Статистический анализ родословных // Зоотехния. – 1998. – N2. – C.5-8.
35. Кузнецов В.М. Инбридинг в животноводстве: методы оценки и
прогноза. Зональный НИИСХ Северо-Востока. - Киров, 2000. – 66с.
36. Кузнецов В.М. Современные методы анализа и планирования
селекции в молочном стаде. Зональный НИИСХ Северо-Востока. - Киров, 2001. – 116с.
37. Кузнецов И.М. Молочное скотоводство Голландии // Животноводство. – 1957. – № 7. – С. 75-82.
38. Лебедев M.M., Бим А.И.. Состояние чёрно-пёстрой породы и
мероприятия по её улучшению // Животноводство. – 1973. – № 7. –
С.51-57.
39. Логинов Ж.Г. Быки-лидеры голштинской породы в США и
Канаде // Зоотехния. – 1989. – N4. – С.75-78.
40. Макаров В.Ю. Генетические и селекционные признаки молочного скота в популяциях региона: дис. канд. биол. наук. - Дубровицы,
2008. – 157с.
41. Марзанов Н.С., Попов А.Н., Зиновьева Н.А., Полежаева
В.А., Игнатьев В.М., Брем Г. Скрининг BLAD-синдрома у животных
чёрно-пёстрого корня // Вестник РАСХН. – 1997. –№4. – С.59-61.
120
42. Марзанов Н.С., Турбина И.С., Ескин Г.В., Турбина Г.С.,
Попов А.Н., Игнатьев В.М., Харлициус Б. Скрининг гена дефицита
лейкоцитарной адгезии у черно-пестрого голштинизированного скота //
Сельскохозяйственная биология. – 2003. – №6. – С.23-30.
43. Марзанов Н.С. Отчет по Разделу 2: «Изучить приемлемость
полиморфизма ДНК для оценки биоразнообразия и хозяйственнобиологических качеств сельскохозяйственных животных». - Дубровицы,
2006. – 27с.
44. Марзанов Н.С., Апишева Ф.К., Марзанова Л.К., Саморуков Ю.В., Кертиев Р.М. Современная характеристика понятия порода.
Сельскохозяйственная биология. – 2007. – № 6. – С.16-23.
45. Марзанов Н., Амерханов Х., Ескин Г., Турбина Г., Федорова
Е., Турбина И., Саморуков Ю., Кийко Е., Попов Н., Шукюрова Е.,
Червяков Н., Девришов Д. Геногеография BLAD в популяциях чернопестрого скота России и за рубежом
// Молочное и мясное
скотоводство. – 2008. – №4. – С.2-5.
46. Марзанова С.Н., Алексеев Я.И., Коновалова Н.В., Турбина
И.С., Девришов Д.А., Сочивко Д.Г., Марзанов Н.С. Разработка метода
диагностики комплексной аномалии позвоночника (CVM) методом ПЦР
в реальном времени у черно-пестрого скота. Научно-практическая конференция: «Практическое использование современных научных разработок в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота» // Нучнотеоретический журнал: Проблемы биологии продуктивных животных. –
2011. – №4. Спецвыпуск. – С. 79-82.
47. Машуров А.М. Генетические маркеры в селекции животных. М.: Наука, 1980. – 315с.
121
48. Машуров А.М., Сухова Н.О., Царев Р.О., Тхань Х.Х. Алгоритмы иммунобиохимической генетики. – Новосибирск: Редакционнополиграфическое объединение СО РАСХН, 1998. – 112с.
49. Меркурьева Е.К., Абрамова З.В., Бакай А.В., Кочиш И.И.
Генетика. – М: ВО «Агропромиздат», 1991. – 446с.
50. Новиков Е.А. Чистопородное разведение молочного скота. М.: Сельхозгиз, 1962.
51. Новикова Л.Ф., Карликов Д.В. СУМ - комплексное уродство
позвоночника крупного рогатого скота. - Быково, 2002. - 28c.
52. Погребняк В.А. Селекционные аспекты повышения потенциала
молочной продуктивности черно-пестрой породы: дис. докт. с.-х. наук.
Дубровицы, 1998. – 353с.
53. Попов Н.А., Ескин Г.В. Аллелофонд пород крупного рогатого скота по ЕАВ – локусу. - Москва, 2000. – 299с.
54. Попов Н.А., Червяков Н.А., Белявин Н.А. и др. Каталог быков-производителей ОАО «Кировское». - Киров, 2004. – 73с.
55. Прохоренко П.Н., Логинов Ж.Г. Голштино-фризская порода
скота. – Ленинград: Агропромиздат, 1985. – 238с.
56. Прохоренко П.Н. Методы создания высокопродуктивных молочных стад // Зоотехния. – 2001. – № 11. – С. 2-7.
57. Прудов А.И. Оценка генетических и селекционных признаков
импортного немецкого черно-пестрого скота // Методы повышения
продуктивности сельскохозяйственного скота. Саранск, 1992. – С.17-23.
58. Прудов А.И., Дунин И.М. Использование голштинской породы
для интенсификации молочного скота. – Москва: Нива России, 1992. –
191с.
122
59. Савенко Н.А., Бошляков В.Н., Жуков В.Ф. и др. Каталог быков-производителей ОАО «Московское» по племенной работе. Москва: МСХиП МО, 2007. – 104с.
60. Смарагдов М.Г. Методы молекулярных маркеров в селекции
хозяйственно ценных признаков у крупного рогатого скота // Сельскохозяйственная биология. – 2005. – № 6. – С. 3-7.
61. Трахимчик
Р.В.
Наследственная
устойчивость
быков-
производителей гродненского племпредприятия к BLAD-синдрому
крупного рогатого скота. Международная научная конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 145-летию академии имени
К.А. Тимирязева. Москва, 2010. – Т.1. – С.324-328.
62. Турбина И.С. Характеристика быков-производителей по различным генетическим маркерам: автореф. дис. канд. биол. наук.
Москва, 2006. – 24с.
63. Турбина И.С., Федорова Е.В., Кертиева Н.М., Ескин Г.В.,
Турбина Г.С., Марзанов Н.С. Генеалогия и некоторые биологические
особенности у быков носителей и неносителей BLAD. Труды ВНИИплем «Селекция, кормление, содержание сельскохозяйственных животных и технология производства продуктов животноводства». - Лесные
Поляны, 2004. – С.3-7.
64. Усенбеков Е.С. Генотипирование крупного рогатого скота по
локусам каппа-казеина, бета-лактоглобулина и мутации BLAD // Автореф. дисс. канд. биол. наук. - Санкт-Петербург-Пушкин, 1995 – 16с.
65. Фролкин Д.А. Скрининг гена злокачественного гипертермического синдрома (MHS-гена) у свиней // Дисс. канд. биол. наук. Дубровицы, 2000. – 103с.
66. Шапочкин В.В., Ескин Г.В. Каталог быков-производителей
ФГУП «ЦСИО». Подольск, 2002. – 51с.
123
67. Щинов М.Ю. Использование биотехнологических методов в
генетическом мониторинге разведения крупного рогатого скота // Автореф. дисс. канд. биол. наук. Дубровицы, 2001. – 22с.
68. Эрнст Л.К., Жигачев А.И. Профилактика генетических аномалий крупного рогатого скота. - Л., 1990.
69. Эрнст Л.К., Жигачев А.И. Мониторинг генетических болезней
животных в системе крупномасштабной селекции. - М., 2006.
70. Эрнст Л.К., Жигачев А.И., Кудрявцев В.А. Мониторинг генетического груза в черно-пестрой, голштинской, айрширской породах
крупного рогатого скота // Зоотехния. – 2007. – №3. – С.3-6.
71. Яковлев А., Терлецкий В., Митрофанова О., Дементьева Н.
Определение
носителей
генетических
производителей // Молочное и
дефектов
среди
быков-
мясное скотоводство. – 2004. – №
7. – С. 31-32.
72. Ackermann M.R., Kehrli M.E.Jr., Morfitt D.C. Ventral dermatitis
and vasculitis in a calf with bovine leukocyte adhesion deficiency // J. Am.
Vet. Med. Ass. – 1993. – Vol. 202. – P.413-415.
73. Agerholm J.S., Houe H., Jorgensen C.B., Basse A. Bovine leukocyte adhesion deficiency in Danish holstein-friesian cattle. II. Pathoanatomical description of affected calves // Acta Vet. Scand. – 1993. –
Vol.34. – P. 237-243.
74. Agerholm J.S., Hafner A., Olsen S., Dahme E. Spinal dysmyelination in cross bred brown Swiss calves // J. Vet. Med. – 1994. – Vol. 41.
– N3. – P.180-188.
75. Agerholm J.S., Bendixen C., Arnbjerg J., Anderson O. Complex
vertebral malformation in Holstein calves // J. Vet. Diagn. Invest. – 2001. –
Vol.13. – P.283-289.
124
76. Agerholm J.S., Anderson O., Almskou M.B., Bendixen C., Arnbjerg J., Aamand G.P. Evaluation of the inheritance of the complex vertebral malformation syndrome by breeding studies // Acta Vet Scand. – 2004.
– Vol.45. – P.133-137.
77. Anderson D.C., Schmalstieg F.C., Finegold M.F., Hughes B.J.,
Rothlein R., Miller L.J., Kohl S., Tosi M.F., Jacobs R.L., Waldrop T.C.,
Goldman A.S., Shearer W.T., Springer T.A. The severe and moderate phenotypes of heritable Mac-1, LFA-1 deficiency: their quantitative definition
and relation to leukocyte dysfunction and clinical features // J. Infect. – 1985.
– Vol.152. – P.668 - 689.
78. Anderson D.C., Springer T.A. Leukocyte adhesion deficiency: an
inherited defect in ine Mac-1, LFA-1 and pl50,95 glycoproteins // Ann. Rev.
Med. – 1987. – Vol.38. – P.175-194.
79. Andresen E., Basse A., Brummerstedt E., Flagstad Т. Lethal trait
A 46 in cattle. Additional genetic investigations. Nord. Vet. Med. – 1974. –
Vol. 26. – P.275-278.
80. Andrews A.H., Fishwick J., Waters R.J. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) in a one year old Holstein Friesian bull - the first report in the United Kingdom // British Veterinary Journal. – 1996. –Vol.152.
– P.347-351.
81. Anon. Erbfehler - Was ist Blad? // Hann. Land. Forstwirtsch. Ztg. –
1991. – Vol.11. – N5. – P.91.
82. Anon.
VDS-Beschlu zu BLAD.
Ostfr. Landvolk. – 1992. –
Vol.107. – P.28.
83. Arnaout M.A. Leukocyte adhesion molecules deficiency: its structural basis, pathophysiology and implications for modulating the inflammatory response // Immunol. Rev. – 1990a. – Vol.114. – P.145-180.
125
84. Arnaout M.A. Structure and function of the leukocyte adhesion
molecules CD11/CD 18 // Blood. – 1990b. – Vol. 75. – P.1037-1050.
85. Arnaout M.A., Pitt J., Cohen H.J., Melamed J., Rosen F.S.,
Colten H.R. Deficiency
of a
granulocyte - membrane
(gp l50) in a boy with recurrent bacterial
glycoprotein
infections // N. Engl. J. Med.
– 1982. – Vol.306. – P.693-699.
86. Arnaout M.A., Dana N., Gupta S.K., Tenen D.-G., Fathallah
D.M. Point mutations impairing cell surface expression of the common ß
subunit (CD18) in a patient with leukocyte adhesion molecule (Leu-CAM)
deficiency // J. Clin. Invest. – 1990. – Vol.85. – P.977-981.
87. Arnaout M.A. Structure and function of the leukocyte
adhesion
molecules CD11/CD 18 // Blood. – 1990. – Vol.75. – P.1037-1050.
88. Arrayet J. L., Oberbauer A. M., Famula T. R., Garnett I., Oltjen
J.W., Imhoof J., Kehrli, Jr., M.E., Graham T.W. Growth of Holstein
calves from birth to 90 days: The influence of dietary zinc and BLAD status
// J. of Animal Science. Savoy. – 2002. – Vol.80. – Iss.3. – P. 545-552.
89. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman
J.G., Smith J.A., Struhl K. Current protocols in molecular biology. - New
York: John Wiley and Sons, 1987.
90. Awgulewitsch A., Utset M.F., Hart C.P., McGinnis W., Ruddle
F.H. Spatial restriction in expression of a mouse homeo box locus within the
central nervous system // Nature. – 1986. – Vol.320. – P.328–335.
91. Back A.L., Kwok W.W., Hickstein D.D. Identification of two molecular defects in a child with leukocyte adherence deficiency // J. Biol.
Chiem. – 1992. – Vol. 267. – P.5482-5487.
92. Batt C.A., Wagner P., Wiedmann M., Luo J., Gilbert R.O. Detection of bovine leukocyte adhesion deficiency by nonisotopic ligase chain reaction // Anim.Genet. – 1994. – Vol.25. – P.95-98.
126
93. Benedixen C., Horn P., Panitz F. et al. Mapping and identification of the CVM-gene in cattle // 29th International Conference on Animal
Genetics. Tokyo. Japan, 2004. – P.36.
94. Bierma J. BLAD-Bulls in Europe // Euroworld. – 1992. –
Vol.807. – S.111.
95. Бiрюкова О.Д. Популяцiйно-генетичний мониторинг формування генофонду украiнськоi чорно-рябоi молочноi породi: автореф.
дис. канд.
сільськогоспод.
наук. с. Чубинське
Київської
області,
2005. – 13с.
96. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eucaryotes // Nucl. Asids Res. – 1976. – Vol.3. –
P.2303-2308.
97. Boichard D., Amigue Y. Investigation on possible linkage between
the BLAD gene and a QTL for production or type traits in Holstein cattle //
46th Annual Meeting of the European Association for Animal Production.
Prague, 1995. – P.4-7.
98. Butcher E.C. Cellular and molecular mechanism that direct leukocyte traffic // Am. J. Pathol. – 1990. – Vol.136. – P. 3-11.
99. Cabanas C., Hogg N. Lymphocyte-fibroblast adhesion: a useful
model for analysis of the interaction of the leukocyte integrin LFA-1 with
ICAM-1 // Fed. Eur. Bioch. Societ. – 199l. – Vol.292. – P.284-288.
100. Citek J., Rehout V., Hajkova J., Pavkova J. Monitoring of the
genetic health of cattle in the Chech Republic // Veterinarni Medicina. –
2006. – Vol.51. – N6. – P.333 -339.
101. Cox E., Kuczka A., Tammen I., Schwenger B. Leukocyten
adhesien deficientie bij rund en hond: een erfelijke stoornis van het
immuunstelsel // Viaams. Diergeneeskd. Tijdschr.–1993. –Vol.62. – P.71-79.
127
102. Сrowley C.A., Curnutte J.T., Rosin R.E. et al. An inherited abnormality of neutrophil adhesion: its genetic transmission and its associations with a missing protein // N. Eng. J. Med. – 1980. – Vol.302. –
P.1163-1168.
103. Czarnik U., Grzybovski G., Kaminski S., Prusak B, Zabolewicz
T. Effectiveness of a program aimed at the elimination of BLAD-carrier bulls
from Polish Holstein-Friesian cattle // J. Appl. Genet. – 2007. – Vol.48. –
P.375-377.
104. Dana N., Clayton L.K., Tennen D.G., Pierce M.W., Lachmann
P.J. Leukocytes from four patients, with complete or partial Leu-CAM deficiency contain the common -subunit procursor and -subunit messenger
RNA // J. Clin. Invest. – 1987. – Vol.79. – P.1010-1015.
105. Denholm L.J. Bovine osteogenesis imperfecta (Australia type):
morphological characterization of аn animal mode of osteogenesis imperfect
in man. Dis. Abstr. Intern. B, 1986. – Vol. 46(7). – P. 2227.
106. Distl O. The use of molecular genetics in eliminating of inherited
anomalies in cattle // Arch. Tierz. Dummerstorf. – 2005. –Vol.48. – N3. –
P.209-218.
107. Duesmann K., Schmidt W., Görlach A. Die PCR als Methode zur
Gendiagnostic im Routinebetrieb einer Besamungsstation am Beispiel der
Bovinen Leukozyten-Adhäsions-Defizienz (BLAD). in: 27. Jahrestagung
über Physiologie u. Pathologie der Fortpflanzung // Reprod. Domestic Anim.
Berlin. – 1994. – Vol.29. – P.193.
108. Duncan R.B., Carrig C.B., Agerholm J.S., Bendixen C. Complex vertebral malformation in a holstein calf: report of a case in the USA.
Journal of veterinary diagnostic investigation : official publication of the
American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc., 2001.
Vol.13(4). – P.333-336.
128
109. Dwyer D.E., Saksena N. Failure of ultra-violet irradiation and autociacing to eliminate PCR contamination // Mol. Cell. Probes. – 1992. –
Vol.6. – P.87-88.
110. Eggen A., Duchesne A., Laurent P., Grohs C., Denis C., Gautier M., Boichard D., Ducos A. Controlling genetic disorders in the french
dairy cattle population // 29 th International Conference on Animal Genetics.
Tokyo. Japan, 2004. – P.35.
111. Ehrmann S. Milchproteine: Mit dem Muster auch die Leistung
verbessern? // Der Tierzuchter. – 1993. – N3. – S.44-47.
112. Engelhardt I. Inzucht, bedeutende Ahnen und Warscheinlichkeit
fur BLAD-Merkmalstrager in der Deutschen Schwarzbuntzucht. Dissertation.
Hannover. FRG. – 1996. – 155s.
113. Fesus L., Zsolnai A., Anton I., Bárány I., Bozó S. BLAD genotypes and cow production traits in Hungarian Holstein // J. Anim. Breed. and
Genet. – 1999. – Vol. 116. – P.169.
114. Fischer A., Trung P.N., Descamps-Latscha B., LisowskaGrospierre B., Gerota I. et al. Bone-marrow transplantation for inborn error
of phagocytic cells associatted with defective adherence, chemotaxis, and oxidative response during opsonised particle phagocytosis // Lancet. – 1983. –
Vol.2. – P.473-476.
115. Funk D. BLAD, three years later // Holstein World . –
1994. – Marz. – Vol.96. – P.96-106.
116. Gehring W.J. Homeoboxes in the study of development // Science. – 1987. – Vol.236. – P.1245–1252.
117. Giger U., Golub E.E., Abrams W.R., Gibson C.W., Golub E.E.,
Abrams W.R., Shen G., Ding W., Rosenbloom J. Deficiency of leukocyte
surface glycoproteins Mo1, LFA-1, and LEU M5 in a dog with recurrant bacterial infections: an animal model // Blood. – 1987. – Vol.69. – P.1622-1630.
129
118. Gilbert R.O., Rebhun W.C., Kim C.A., Kehrli M.E.Jr., Shuster
D.E., Ackerman M.R. Clinical manifestations of leukocyte adhesion in cattle: 14 cases (1977-1991) // J. Am. Vet. Med. Assoc. – 1993. – Vol. 202. –
N3. – P.445-449.
119. Gilbert R.O., Rebhun W.C., Kim C.A., Kehrli M.E.Jr., Shuster
D.E., Ackerman M.R. Clinical manifestations of leukocyte adhesion in cattle: 14 cases (1977-1991) // J. Am. Vet. Med. Assoc. – 1993. – Vol.202. –
N3. – P.445-449.
120. Gough N.R. Cell Biology Blocking Integrin Activation at the α
Subunit // Sci. Signal. – 2011. – Vol. 4. – Issue 198. – P. 309.
121. Greene H.J., Leipold H.W., Huston K., Noordsy J.L., Dennis
S.M. Congenital defects in cattle // Ir. Vet. J. – 1973. – Vol.27. – P.37–45.
122. Greene H.J., Leipold H.W., Dennis S.M. Perosomus elumbis in
Hereford calves // Vet Med Small Anim Clin. – 1973. – Vol.68. – P.167–168.
123. Grobet L., Charlier C., Hanset R. Diagnostic genomigue de la
BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency) // Ann. Med.Vet. – 1993. –
Vol.137. – P.27-31.
124. Gurlt E.F. Lehrbuch der pathogischen Anatomie der HausSaugethiere, 2. Teil, Atlas, G. Reimer, Berlin, Germany, 1832. – N1. – P. 88–
91.
125. Gurlt E.F. Uber thierische Missgeburten. August Hirschwald, Berlin, Germany, 1877. – P.8–9.
126. Habermehl K.H. Zur Genese und Variationsbreite des Perosomus
elumbis // Monatsh Tierheilkd. – 1954. – Vol. 6. – P.276–284.
127. Hagemoser W.A., Roth J.A., Lofstedt J., Fagerland J.A. Granulocytopathy in a Holstein heifer // J. A. Vet. Med. Assoc. – 1983. –
Vol.183. – P.1093-1094.
130
128. Haldane J.B.S. "The cost of natural selection" // J. of Genetics. –
1937. – Vol.55. – P.511-524.
129. Haubner G.C. Kalbsmissgeburt mit partiellem Mangel der Ruckenwirbelsaule und des Ruckenmarkes Perosomus elumbis Gurlt). Bericht
Uber das Veterinarwesen im Konigreiche Sachsen fur das Jahr 1877, pp. 52–
53. Buchhandlung Zahn & Jaensch, Dresden, Germany, 1878.
130. Healy P.J. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) - another genetic defect of Holstein/Friesians // Aust.Vet. J. – 1992. – Vol.69. – N8.
– P.190.
131. Hemler M.E. VLA proteins in the integrin family: structures,
functions and their role on leukocytes // Annu. Rev. Immunol. – 1990. –
Vol.8. – P.365-400.
132. Herzog A., Adam R. Zur Neuromyodysplasia congenita (kongenitale Arthrogrypose) der Hintergliedmassen beim Kalb. Dtsch Tieraerztl Wochenschr. – 1968. – Vol.75. – P.237–243.
133. Hibbs M.L., Wardlaw A.J., Stacker S.A., Anderson D.C., Lee
A., Roberts T.M., Springer T.A. Transfektion of cells from patients with
leukocyte adhesion deficiency with an integrin  subunit (CD18) restores
lymphocyte function-associated antigen -1 expression and function // J. Clin.
Invest. – 1990. – Vol.85. – P.674-681.
134. Holland P.W.H., Hogan B.L.M. Spatially restricted patterns of
expression of the homeobox-containing gene Hox 2.1 during mouse embryogenesis. Development. – 1988. – Vol.102. – P.159–174.
135. Hynes R.O. Integrins: a family of cell surface receptors // Cell. –
1987. – Vol.48. – P.549-554.
136. ICAR Guidelines approved by the General Assembly held in Riga, Latvia on June 2010. Copyright ICAR, 2011. – 485p.
131
137. Jones C.J. Perosomus elumbis (vertebral agenesis and arthrogryposis) in a stillborn Holstein calf // Veterinary Pathology. – 1999. –
Vol.36. – N1. – P. 64-70.
138. Joest E. Drei Falle von Perosomus elumbis beim Kalbe. Bericht
uber die Konigliche tierarztliche Hochschule zu Dressden fur das Jahr 1908,
pp. 144–147 and plate V. Buchhandlung Zahn & Jaensch, Dresden, Germany,
1909.
139. Joest E. Zwei Falle von Perosomus elumbis beim Rind. Bericht
uber die Konigliche tierarztliche Hochschule zu Dresden fur das Jahr 1911,
pp. 270–273. Buchhandlung Zahn & Jaensch, Dresden, Germany, 1912.
140. Jorgensen C.B., Agerholm J.S., Pedersen J., Thomsen P.D. Bovine leukocyte adhesion deficiency in danish holstein-friesian cattle // Acta
Vet. Scand. – 1993. – Vol.34. – P.231-236.
141. Kahle M. Kennzeichung des BLAD-Status weiblicher Tiere // Rind
in Bild. – 1994. – N2. – P.20.
142. Kanae Y., Endoh D., Nagahata H., Hayashi M. A method for
detecting complex vertebral malformation in Holstein calves using polymerase chain reaction–primer introduced restriction analysis // J. Vet. Diagn. Invest. – 2005. – Vol.17. – P.258–262.
143. Kantanen J. Genetic diversity of domestic cattle (B. taurus) in
North Europe. Joensuu. – 1999. – 100p.
144. Kawasaki E.S. Sample preparation from blood, cell and other fluids. PCR protocols, a guide to methods and applications // Academic Press.
San Diego. N.Y. USA, 1990. – P.146-152.
145. Kehrli M.E., Schmalstieg C., Anderson D.C., Van Der Maaten
M.J., Hughes B.J., Akermann M.R., Wilhemsen C.L., Brown G.B., Stevens M.G., Whetstone C.A. Molecular identification of deficiency of the
132
Mac-1 (CD11b/CD18) glycoprotein // Am. J. Vet. Res. – 1990. – Vol.51. –
P.1826-1836.
146. Kehrli M.E.Jr., Shuster D.E., Ackermann M.R. Leukocyte adhesion deficiency among Holstein cattle // Cornell Vet. – 1992. – Vol.82. –
P.103-109.
147. Keizer G.D., Tevelde A.A., Schwarting R., Figdor G., De Vries
J.E. Role of p150,50 in adhesion, migration, chemotaxis and phagocytosis of
human monocytes // Eur. J. Immunol. – 1987. – Vol.17. – P. 1317-1322.
148. Kiiman H., Kaart T., Saveli O. Somatic cell count as item of milk
quality and udder health. XI Baltic animal breeding and genetics conference,
2005. – P.54-57.
149. Kishimoto T.K., Larson R.S., Corbi A.L., Dustin N.L., Staunton
D.E., Springer T.A. The leukocyte integrins // Adv. Immunol. – 1989. –
Vol.46. – P.149-182.
150. Koch P., Fischer H., Schumann F. Erbpathologie der landwirtschafllichen Haustiere. Berlin – Hamburg, 1957.
151. Kornfeld R., Kornfeld S. Assembly of asparagine-linked oligosaccarides // Annu. Rev. Biochem. – 1985. – Vol.54. – P.631-664.
152. Koumans J.T.M., Van Haeringen H. A simple and rapid method
for the isolation of DNA for genotyping purposes from milk samples. XXV
Intern. Conf. on Anim. Genet. Tours. France, 1996. – Р.147.
153. Krauss J.C., Mayo-Bond L.A., Rogers C.E., Weber K.L., Todd
R.F. An in vivo animal model of gene therapy for leukocyte adhesion deficiency // J. Clin. Invest. – 1991. – Vol.88. – P.1415-1417.
154. Kuczka A., Kuhlmann E., Schwenger B. und and. BLAD im
Griff // Der Tierzuchter. – 1993. – N1. – S.32-35.
155. Le Deist F., Blanche S., Keable H., Gaud C., Pham H.,
Descamps-Latscha B., Wahn V., Griscelli C., Fischer A. Succesful HLA
133
nonindentical bone marrow transplantation in three patients with the leukocyte adhesion deficiency // Blood. – 1989. – Vol.74. – P.512-516.
156. Lee J.K., Schook L.B., Rutherford M.S. Cloning and expression
of the porcine CD18 adhesion molecule // 4th International Veterinary Immunology Symposium. Davis. California. USA, 1995. – P.150.
157. Li Yan-hua, Han Guang-wen, Zhang Sheng-li, Li Ning, Sun
Feng-jun. Detection of Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency (BLAD)
and Haplotype Analysis // Acta veter. zootechn. Sinica. – 2008. – Vol.39. – N
9. – P.1285-1288.
158. Li H., Gyllensten U.B., Cui X. F., Saiki R.K., Erlich H.A.,
Arnheim N. Amplification and analysis of DNA s equences in single
human sperm and diploid
cells
//
Nature (Lond on). – 1988. –
Vol.335. – P.414-417.
159. Lidauer M.
Bedeutung der Erbfehler fur die osterreichische
Braunviehzucht // Osterreichisches Braunvieh. – 1992. – N69. – S.16-18.
160. Lindemann M. Untersuchungen zur Syndromatologie, Atiologie
und Vorkommen der Hypotrichie, Hypertrichie und Epitheliogenesis imperfecta in der hessischen Rinderpopulation. Diss. Giessen, 1978.
161. Lisowska-Grospierre B., Bohler M.-C., Fischer A., Mawas C.,
Springer T.A., Giscelli C. Defectife membrane expression of the LFA-1
complex may be secondary to the absence of the  chain in a child with recurent bacterial infection // Eur. J. Immunol. – 1986. – Vol. 16. – P.205-208.
162. Lopez Rodrigues C., Nueda A., Grospierre B., Sanchez-Madrid
F., Fischer A., Springer T.A., Corbí A.L. Characteriziation of two new
CD18 alleles causing severe leukocyte adhesion deficiency // Eur. J. Immunol. – 1993. – Vol.23. – P.2792-2798.
134
163. Lubieniecki K., Grzybowski G. Diagnostyka molekularna
wrodzenego niedoboru leukocytarna czasteczek adhezyjnych (BLAD)
u
bydla // Med. Wet. – 1997. – Vol.53. – N3. – P. 214-217.
164. Mahon K.A., Westphal H., Gruss P. Expression of homeobox
gene hox 1.1 during mouse embryogenesis. Development. – 1988. –
Vol.104.(Suppl.). – P.187–195.
165. Maiguel D., Faridi M.H., Wei C., Kuwano Y., Balla K.M., Hernandez D., Barth C.J., Lugo G., Donnelly M., Nayer A., Moita L.F.,
Schürer S., Traver D., Ruiz P., Vazquez-Padron R.I., Ley K., Reiser J.,
Gupta V. Small Molecule–Mediated Activation of the Integrin CD11b/CD18
Reduces Inflammatory Disease. Sci. Signal. – 2011. – N4.
166. Мариуца А.Е. Популяцiйно-генетичний механiзми адаптацii i
розповсюдження напiвлетальних рецесивних мутацiй на прикладi
BLAD у великоi рогатоi худоби: автореф. дис. канд.
сільськогоспод.
наук. - Київ, 2005. – 10с.
167. Marron B.M., Robinson J.L., Gentry P.A., Beever J.E. Identification of a mutation associated with factor XI deficiency in Holstein cattle.
Animal Genetics, 2004. – V.35. – P.454-456.
168. Matsuura S., Kishi F., Tsukahara M., Nunoi H., Matsuda I.,
Kobayashi K., Kajii T. Leukocyte adhesion deficiency: Identification of
nofel mutations in two Japanese patients with a severe form // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1992. – Vol.184. – N3. – P.1460-1467.
169. Mc Vey D.S., Tizard I. Primary immunodeficiencies of food animals. Vet. Clinics
North Am., Food Animal Practice. – 1993. – Vol. 9. –
Nl. – P.65-75.
170. Meylan M., Abegg R., Sager H., Jungi T.W., Martig J. Fallvorstellung: Bovine Leukozyten-Adhäsions-Defizienz (BLAD) in der Schweiz.
Schweiz. Arch. Tierheilk. – 1997. – Vol.139. – P. 277-281.
135
171. Millar P., Lauvergne J. J., Dolling C. Mendelian inheritance in
cattle.
Wageningen.
EAAP
Publication
n°
101.
COGOVICA-
COGNOSAG,Wageningen pers/Rome, Clamart,Wageningen, 2000. – 590p.
172. Miller L.E., Bainton D.F., Borregaard N., Springer T.A. Stimulated mobilization of monozyte Mac-1 and p150,95 adhesion proteins from
an intracellular vesicular compartment to the cell surface // J. Clin. Invest. –
1987. – Vol.80. – P.535-544.
173. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucl. Asids Res. –
1988. – Vol.16. – N3. – P.1215.
174. Mirck M.H., Von Bannisseht-Wijsmller T., TimmermansBesselink W.J. et al. Optimization of the PCR test for the mutation causing
bovine leukocyte adhesion deficiency // Cell. Moll. Biol. – 1995. – Vol. 41. –
P.695-698.
175. Muller K., Bernadina W.E., Kalsbeek H.C., Wensing T., Elving
L., Verbeek B. BLAD: bovine leukocyte adhesion deficiency // Tijdschr. Diergeneeskd, 1993. –Vol. 118. – P.183-184.
176. Muller K.E., Hoek A. Antigen-specific immune responses in cattle
with inherited 2 - integrin deficiency // Veter. Immunol. Immunopathol. –
1997. – Vol.58. – N1. – P.39-53.
177. Mullis K., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H.
Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain
reaction. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. Cold Spring
Harbor. USA. – 1986. – Vol.51. – P.263-273.
178. Nagahata H., Miura T., Tagaki K., Ohtake M., Noda H., Yasuda T., Nioka K. Prevalence and allele frequency estimation of bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) in Holstein-Friesian cattle in Japan // J.
Vet. Med. Sci. – 1997. – Vol. 59. – P.233-238.
136
179. Nagahata H. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD): A
Review // J. of Vet. Med. Sci. – 2004. – Vol. 66. – N12. – P.1475-1482.
180. Nasreen F., Altaf Malik N., Naeem Riaz M., Anver Qureshi J.
Detection and screening of bovine leukocyte adhesion deficiency in Pakistan
using molecular methods // Hereditas. – 2009. – Vol.146. – N2. – P.74-78.
181. Nelson C., Rabb H., Arnaout M.A. Genetic cause of the leukocyte adhesion molecule deficiency // J. Biol. Chem. – 1992. – Vol.265. – N5.
– P.3351-3357.
182. Norman H.D., Miller R.H., Wright R., Wiggans G.R. Herd and
state means for somatic cell count from dairy herd improvement // J. Dairy
Sci. – 2000. – Vol. 83. – P.2782-2788.
183. Norouzy A., Nassiry M.R., Eftekhari Shahrody E.F., Javadmanesh A., Mohammad Abadi M. R., Sulimova G. Identification of bovine
leukocyte adhesion deficiency (BLAD) carriers in Holstein and Braun Swiss
AI bulls in Iran // Генетика. – 2005. – Том.41. – N12. – С.1697-1701.
184. Oguni T., Takeda Ray M., Tsuji T., Sugimoto Y., Moritomo Y.,
Matsumoto M., Mishina Y., Kunieda T. Identification and control of a
dwarfism gene in Japanese brown cattle // 29 th International Conference on
Animal Genetics. Tokyo. Japan, 2004. – P.35.
185. Oner Y., Keskin A., Elmaci C. Identification of BLAD, DUMPS,
Citrullinamia and Factor XI Deficiency in Holstein Cattle in Turkey // Asian
Journal of Animal and Veterinary Advaces. – 2010. – Vol.5. – N1. – P.60-65.
186. Petersen A.H., Thomsen Bo, Nielsen V.H., Nissen P.H. Molecular genetic dissection of inherited diseases in farm animals // DIAS Report
Animal Production. Tjele, 2002. – P.43-57.
187. Pfeiffer I., Brennig B. Frequency of the canine leukocyte adhesion
deficiency (CLAD) mutation among Irish red setters in Germany. J. Anim.
Breed. Genet. – 2005. – Vol.122. – P.140-142.
137
188. Pigott R., Power C. The adhesion molecule fastbook // Harcourt
Brace & Company (Hrsg.). Academic Press. London UK, 1993.
189. Poli M.A., Dewey R., Semorile L., Lozano M.E., Albarino C.G.,
Romanowski V., Grau O. PCR screening for carriers of bovine leukocyte
adhesion deficiency (BLAD) and uridine monophosphate sinthase (DUMPS)
in Argentine Holstein cattle // Zentralbl. Vet. Med. A. – 1996. – Vol.43. –
P.163-168.
190. Qin Chu, Dongxiao Sun, Ying Yu, Yi Zhang and Yuan Zhang.
Identification of complex vertebral malformation carriers in Chinese Holstein
// J. Vet. Diagn. Invest. – 2008. – Vol.20. – P. 228-230.
191. Patel R.K., Krishna M. Singh, Kalpesh J. Soni, Jenabhai B.
Chauhan, Krothapalli R.S. Sambasiva Rao. Low incidence of bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) carriers in Indian cattle and buffalo
breeds // J Appl Genet. – 2007. – Vol.48. – N2. – P.153–155.
192. Renshaw H.W., Chatburn C., Brayn G.M., Bartsch R.C., Davis
W.C. Canine granulocytopathy syndrome: neutrophil dysfunction in a dog
with recurrant infections // J. Am. Vet. Med. Assoc. – 1975. – Vol.166. –
P.443-447.
193. Renshaw H.W., Davies W.C.
Canine granulocytopathy syn-
drome: an inherited disorder of leukocyte function // Am. J. Pathol. – 1979. –
Vol.95. – P.731-744.
194. Rezaee A.R., Nassiry M.R., Valizadeh R., Tahmoorepour M.,
Javadmanesh A., Zarei A., Janati H. Study of complex vertebral malformation disorder in Iranian Holstein bulls // World J. of Zoology. – 2008. –
Vol.3. – N2. – P.36-39.
195. Ribeiro L.A., Baron E.E., Martinez M.L., Coutinho L.L. PCR
screening and allele frequency estimation of bovine leukocyte adhesion defi-
138
ciency in Holstein and Gir cattle in Brazil // Genet. Mol. Biol. – 2000. –
Vol.23. – P.1415-1457.
196. Robinson J.L., Burns J.L., Magura C.E., Shanks R.D. Low incidence of citrullinemia carriers among daily cattle of the United States // J.
Dairy Sci. – 1993. – Vol.76. – N3. – P. 853-858.
197. Rutten V.P.M.G., Hoek A., Muller K.E. Identification of monoclonal antibodies with specificity to α - or ß - chains of ß 2 integrins using peripheral blood leucocytes of normal and Bovine Leucocyte Adhesion Deficient (BLAD) in cattle Vet. Immun. Immunopathol. – 1996. – Vol.52. –
P.341-345.
198. Rusc A., Kaminski S. Prevalence of complex vertebral malformation carriers among Polish Holstein-Friesian bull // J. Appl. Genet. – 2007.
– Vol.48. – P.247-252.
199. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Scharf S.J., Higuchi R.,
Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostabile DNA-polymerase // Science. – 1988. –
Vol.239. – P.487-491.
200. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual // Cold Spring Harbour Laboratory Press. New York, 1989.
201. Sanchez-Madrid F., Nagy J.A., Robbins E., Simon P., Springer
T.A. A human leukocyte differentiation antigen family with distinct subunits and a common -subunit // J. Exp. Med. – 1983. – Vol.158. –
P.1785-1803.
202. Sargeant J.M., Schukken Y.H., Leslie K.E. Ontario bulk milk
somatic cell count reduction programm: progress and outlook // J. Dairy Sci.
– 1998. – Vol. 81. – P.1545-1554.
203. Sastre L., Kishimoto T. K., Gee C., Roberts T. Springer T. A.
The mouse leukocyte adhesion proteins Mac-l and LFA-I: Studios on mRNA
139
translation an protein glycosylation with emphasis on Mac-l
// Immunol.
– 1986. – Vol.137. – P.1060-1065.
204. Schellander K., Peki J., Taka T. A., Kopp E. Diagnosis of bovine freemartinism by the polymerase chain reaction method // Animal Genetics. – 1992. – Vol.23. – P.549-551.
205. Scott M.P., Carroll S.B. The segmentation and homeotic gene
network in early drosophila development. Cell.–1987. – Vol.51. – P.689–698.
206. Schilcher F., Hotter H., Tammen I., Schuh M. Occurrence of
bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) of Holstein Friesian in Austria
[German] // Wiener Tierarztliche Monatsschrift.–1995.– Vol.82. – P.207-212.
207. Shanks R.D., Popp R.G., Mccoy G.C., Nelson D.R. Robinson
J.L. Identification of the homozygous recessive genotype for the deficiency
of uridine monophosphate synthase in 35-day
bovine
embryos
// J. Re-
prod. Fertil. – 1992. – Vol. 94. – P.5-10.
208. Shuster D.E., Kehrli M.E.Jr., Ackermann M.R., Gilbert R.O.
Identification and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion deficiency in holstein cattle // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. – 1992a. –
Vol.89. – P.9225-9229.
209. Shuster D.E., Bosworth B.T., Kehrli M.E.Jr. Siguence of the
bovine CD18-encoding cDNA: comparison with the human and
murine
glycoproteins // Gene. – 1992b. – Vol.114. – P.267-271.
210. Schutz E., Scharfenstein M., Brenig B. Implication of complex
vertebral malformation and bovine leukocyte adhesion deficiency DNAbased Testing on disease frequency in the Holstein population // J. Dairy Sci.
– 2008. – Vol.91. – P.4854-4859.
211. Sligh J.E., Hurwitz M.Y., Zhu C., Anderson D.C., Beaudet A.L.
An initiation codon mutation in CD 18 in association with the moderate phenotype of leukocyte adhesion deficieney // J. Biol. Chem. – 1992. – Vol.267.
140
– S. 714-718.
212. Springer T.A. Adhesion receptors of the immune system //
Nature. – 1990. – Vol.346. – P.425-434.
213. Stadler P., Van Amstel S.R., Van Rensburg B.J. Williams M.C.
Verdagte oorerflike Granulositopatie in vier Holstein Frieskalwers (Suspected inherited granulocytopathy in four Holstein Friesian calves) // J. S. Afr.
Vet. Assoc. – 1993. – Vol.64. – N4. – P.172-177.
214. Stöber M., Pohlenz J., Leibold W., Simon D., Kuczka A.,
Schwenger B., Lienau A., Kuhlmann E., Tammen I., Piturru P. Deficienza di adesione dei leucociti nei bovini (BLAD) un difetto ereditario da porre
sotto vigilanza // Praxis Vet. – 1992. – Vol.8. – N3. – P.5-7.
215. Tajama M., Irie M., Kirisawa R., Hagiwara K., Kurosawa T.,
Takahashi K. The detection of a mutation of CD18 gene in bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) // J.Vet. Med. Sci. – 1993. – Vol.55. – N1.
– P.145-146.
216. Takahashi M., Miyagawa K., Abe S., Kurosawa T., Sonoda M.,
Nakade T., Nagahata H., Noda H., Chihaya Y., Isogai E. Bovine granulocytopathy syndrome of
Holstein -Friesian calves and heifers //
Jpn. J. Vet. Sci. – 1987. – Vol.49. – N1. – P.733-736.
217. Tammen I. Weiterentwicklung des DNA-Tests auf BLAD(Bovine
Leukozyten Adhasions defizienz) fur den Einsatz in Rinderzucht und
klinischer Diagnostik. Hannover, 1994. – 128s.
218. Thomsen B., Horn P., Panitz F., Bendixen C., Petersen A.H.,
Holm L., Nielsen V.H., Agerholm J.S., Arnbjerg J., Bendixen C. A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP-N- acetylglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation // Genome Res.
– 2006. – Vol.16. – P.97-105.
219. Treviranus A. Klinische Befunde und Abstammung von Jungrin-
141
dern mit Boviner Leukozyten-Adhäsions-Defizienz (BLAD). Hannover.
Tierarzt. Hochsch., 1994. – 152s.
220. Trowald-Wigh G., Hakansson L., Johannisson A., Norrgran L.
Leukocyte adhesion protein deficiency in Irish setter dogs // Vet. Immunol.
Immunopathol. – 1992. – Vol.3. – P.261-280.
221. Turbina I.S., Eskin G.V., Turbina G.S., Marzanov N.S. The
characteristic of bull- sires for gene BLAD-syndrome Book of abstracts of
the 54th annual meeting of the European Association for Animal Production.
Roma. Italy, 2003. – P.60.
222. Viana J.L., Fernandez A., Iglesias A., Santamarina G. Diagnóstico
y control de las principales enfermedades genéticas(citrulinemia, DUMPS y
BLAD) descritas en ganado Holstein-Frisón // Med. Vet. – 1998. – Vol.15. –
P.538-544.
223. Vătăşescu-Balcan R.A., Manea M.A., Georgescu, S.E., Dinischiotu A., Tesio C.D., Costache M. Evidence of single point mutation inducing BLAD disease in Romanian Holstein-derived cattle breed // Biotechnology in Animal Husbandry. – 2007. – Vol.23. – N.5-6. – P.375-381.
224. Wardlaw A.J., Hibbs M.L., Stacker S.A., Springer T.A. Distinct
mutations in two patients with leukocyte adhesion deficiency and their functional correlates. J. Exp. Med. – 1990. – Vol.172. – P.335-345.
225. Weisman J.S., Berkow R.L., Plaut G., Torres M., Mcguire
W.A., Coates T.D., Haak R.A., Floyd A., Jersild R., Baehner R.L. Glycoprotein-180 deficieney: genetics and abnormal neutrophil activation // Blood.
– 1985. – Vol.65. – P.696-704.
226. Weitzmann J.B., Wells C.E., Wright A.H., Clark P.A. Law S.K.
The gene organisation of the human ß2-integrin subunit (CD18) // FEBS Lett.
– 1991. – Vol. 294. – P.97-103.
227. Williams D.A., Orkin S.H. Somatic gene therapy. Current Status
142
and future prospects // Clin. Invest. – 1986. – Vol.72. – P.1053-1056.
228. Williams W.L. Studies in teratology. Cornell Vet. – 1931. – Vol.
21. –P.25–53.
229. Wilson J.M., Ping A.J., Krauss J.C., Mayo-Bond L. Correction
of CD18-Deficient Lymphocytes by retrovirus-mediated gene transfer // Science (Waschington). – 1990. – Vol.248. – P.1413-1416.
230. Wilson R.W., Ballantyne C.M., Smith C.W., Montgomery C.,
Bradley A., O'Brien W.E., Beaudet A.L. Gene targeting yields a CD18mutant mouse for study of inflammation // J. Inmunol. – 1993a. – Vol.151. –
P.1571-1578.
231. Wilson R.W., Yorgfuji T., Lorbnzo L., Smith W., Anderson D.
C., Belmont J.W., Beaudet A.L. Expression of human CD 18 in murine
granulocytes and improved efficiency for infection of deficient human lymphoblasts // Hum. Gene Ther. – 1993b. – Vol.4. – P.25-34.
232. Womack J.E. Molecular genetics arrives on the farm // Nature. – 1992. – Vol.360. – P.108-109.
233. Zietschmann H. Perosomus elumbis beim Kalb. Bericht uber d.
Veterinarwesen im Konigreiche Sachsen fur das Jahr 1911, pp. 73–74. Buchhandlung Zahn & Jaensch, Dresden, Germany, 1912.
234. Zsolnai A., Fesus L. Simultaneous analysis of bovine к-casein and
BLAD alleles by multiplex PCR followed by parallel digestion with two restriction enzymes. Animal Genetics. – 1996. – Vol.27. – N3. – P.207-209.
143
ПРИЛОЖЕНИЕ