автореферат - Институт цитологии и генетики СО РАН
advertisement
На правах рукописи АДОНИНА Ирина Григорьевна ХАРАКТЕРИСТИКА САТЕЛЛИТНЫХ ПОВТОРОВ ВИДОВ Aegilops L. СЕКЦИИ Sitopsis И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ Генетика - 03.00.15 АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2007 1 Работа выполнена в лаборатории молекулярной Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск генетики злаков НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Доктор биологических наук Салина Елена Артемовна, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор биологических наук, Дымшиц Григорий Моисеевич, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск Доктор биологических наук, Агафонов Александр Викторович, Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН, г. Новосибирск ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, РАН, г. Москва Защита диссертации состоится "___"__октября__2007 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10, факс: (3833) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН. Автореферат разослан "___"__________________2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук А.Д. Груздев 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Дикие виды пшениц и эгилопсов несут в себе гены устойчивости ко многим биотическим (болезни и вредители) и абиотическим (низкие и высокие температуры, избыток или недостаток влаги и др.) факторам; характеризуются значительным разнообразием морфологических признаков, белков и ферментов, влияющих на хлебопекарные качества зерна (Friebe et al., 1996; Лапочкина, 1999; Valkoun, 2001; Гончаров, 2002). Поскольку на сегодняшний день собственный генетический потенциал хлебной (мягкой) пшеницы, Triticum aestivum L., почти исчерпан, вовлечение в селекционный процесс видов-сородичей может способствовать созданию новых, высокоурожайных и наделенных ценными признаками сортов этой важнейшей сельскохозяйственной культуры. В связи с чем, изучение генофонда диких видов представляется особенно актуальной задачей. T. aestivum является естественным аллогексаплоидом с геномной формулой BBAADD. Все пять видов Aegilops L. секции Sitopsis: Ae. speltoides Tausch; Ae. longissima Schweinf. and Muschl.; Ae. sharonensis Eig; Ae. bicornis (Forsk.) Jaub. and Spach. и Ae. searsii Feld. and Kis., рассматриваются разными исследователями в качестве возможных доноров генома B (Feldman, 2001; Гончаров, 2002), хотя в последнее время большинство данных указывают на Ae. speltoides, как на наиболее вероятного донора данного генома. Тот факт, что единого мнения в решении данной проблемы до сих пор не удалось достигнуть, свидетельствует о недостатке информации о геномах этих видов. У растений, в частности у злаков от 15% до 80% генома приходится на повторяющиеся последовательности (Lapitan, 1992; Shapiro and von Sternberg, 2005), которые могут иметь дисперсную локализацию в геноме, либо образовывать тандемные кластеры. Причины поддержания в геноме столь значительного количества разнообразных повторяющихся последовательностей остаются до конца невыясненными, что само по себе определяет интерес к изучению данной фракции ДНК. Пул некодирующих повторяющихся последовательностей ДНК в геноме подвергается постоянным изменениям. Дивергенция и становление видов часто сопровождаются образованием новых семейств видоспецифичных повторов (Flavell, 1982). В изменчивости тандемных повторов, к которым относятся как микросателлиты (simple sequence repeats – SSR) с длиной мономера не более 6 пар нуклеотидов, так и макросателлиты, длина мономера которых чаще всего колеблется в пределах от 100 до 400 пн (Zhao and Ganal, 1996; Sharma and Raina, 2005), важную роль играет варьирование числа мономеров в кластере. Гетерогенность повторяющихся последовательностей лежит в основе использования их в качестве высокополиморфных генетических маркеров, как для селекционной работы, так и в эволюционных исследованиях. Поиск новых 3 молекулярных маркеров – вот вторая, не менее важная причина, вызывающая интерес к исследованию повторяющихся последовательностей ДНК. Среди злаков, входящих в состав трибы Triticeae Dum., микросателлитные повторы достаточно хорошо изучены и широко используются в качестве молекулярных маркеров у представителей родов, имеющих важное сельскохозяйственное значение, таких, как пшеница (Triticum L.), рожь (Secale L.), ячмень (Hordeum L.). Молекулярно-генетическая карта T. aestivum содержит более 1500 SSR-маркеров (Bryan et al., 1997; Pestsova et al., 2000a; Röder et al., 2004). Что касается диких видов-сородичей, - были выделены и охарактеризованы динуклеотидные микросателлитные последовательности Ae. tauschii Coss., донора генома D мягкой пшеницы (Pestsova et al., 2000a). Работы по изучению микросателлитов видов Aegilops секции Sitopsis до недавнего времени не проводились. Недостаточно изучен также потенциал макросателлитных повторов этих видов в качестве молекулярных маркеров. Таким образом, можно сделать вывод, что характеристика сателлитных повторов видов Aegilops секции Sitopsis и изучение возможности использования их в качестве молекулярных маркеров является актуальной проблемой генетики злаков и практического растениеводства. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение сателлитных повторов видов Aegilops секции Sitopsis и их использование в анализе гибридных форм злаков, а так же для уточнения филогенетических взаимоотношений между видами. В работе были поставлены следующие задачи: 1. Выявление микросателлитных локусов в геномах видов Aegilops секции Sitopsis с помощью праймеров к микросателлитам T. aestivum и их характеристика. 2. Оценка возможности использования SSR-маркеров для уточнения филогенетических взаимоотношений видов Aegilops и Triticum. 3. Анализ популяционного полиморфизма макросателлитных повторов Spelt1 и Spelt52 у видов Aegilops секции Sitopsis. 4. Изучение эффективности использования SSR и геном-специфичных субтеломерных повторов Spelt1 и Spelt52 в качестве маркеров генетического материала Aegilops при отдаленной гибридизации. Научная новизна работы. Впервые проведена оценка амплификации 253 микросателлитных маркеров T. aestivum в геномах Aegilops секции Sitopsis. 103 маркера локализованы на хромосомах исследованных видов. Продемонстрирована эффективность комплексного подхода при использовании геном-специфичных субтеломерных повторов Spelt1 и Spelt52 и SSR-маркеров T. aestivum для анализа гибридных форм мягкой пшеницы, полученных с участием Aegilops секции Sitopsis. Практическая ценность работы. Установлена хромосомная локализация 103 микросателлитных маркеров T. aestivum в геномах Aegilops секции Sitopsis. 4 Разработаны подходы к использованию геном-специфичных субтеломерных повторов Spelt1 и Spelt52 в качестве маркеров генетического материала Aegilops при отдаленной гибридизации. С помощью макро- и микросателлитных маркеров определены локализация и протяженность участков генетического материала Ae. speltoides в двух интрогрессивных линиях T. aestivum × Ae. speltoides. Основные положения диссертации, выносимые на защиту: 1. Большинство микросателлитных локусов генома B мягкой пшеницы присутствуют в геномах видов Aegilops секции Sitopsis и расположены в гомеологических группах хромосом. 2. Уровень популяционного полиморфизма микросателлитов зависит от способа размножения видов Aegilops. 3. Субтеломерные макросателлитные повторы Spelt1 и Spelt52 характеризуются не только межвидовым, но и значительным популяционным полиморфизмом. 4. SSR-маркеры T. aestivum и геном-специфичные макросателлитные повторы Spelt1 и Spelt52 эффективны при комплексном использовании для анализа гибридных форм мягкой пшеницы, полученных с участием Aegilops секции Sitopsis. Апробация работы. Результаты работы были представлены на 11ой конференции EWAC (Новосибирск, 2000); 6ой исследовательской конференции Гатерслебена (Германия, 2000); Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (Москва-Минск, 2001); 3-й Конференции BGRS (Новосибирск, 2002); Международной конференции по полиплоидии (Лондон, Великобритания, 2003); III съезде ВОГиС (Москва, 2004) и обсуждались на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (2001, 2004). Публикации. По результатам исследования опубликовано 15 работ, в том числе 7 статей в рецензируемых изданиях. Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 161 странице печатного текста, включая 8 таблиц и 21 рисунок. Список цитированной литературы содержит 199 работ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Растительный материал. В работе были использованы 16 образцов видов Aegilops секции Sitopsis (табл. 1). Семена пятнадцати из них получены от профессора М. Фельдмана (Feldman M., Вейсмановский институт науки, Израиль). Семена интрогрессивных линий, полученных от скрещивания T. aestivum сорта «Родина» (2n = 42) с Ae. speltoides К-389 (2n = 14, SS) (Лапочкина, 1999), а также семена родительских форм T. aestivum и Ae. speltoides любезно предоставлены И.Ф. Лапочкиной (Институт сельского хозяйства нечерноземных 5 районов России, Немчиновка, Московская область) и Т.А. Пшеничниковой (ИЦиГ СО РАН). Для определения хромосомной локализации микросателлитных маркеров в геноме Aegilops использовались дисомные дополненные линии T. aestivum– Ae. speltoides (Friebe et al., 2000), T. aestivum–Ae. longissima (Friebe et al., 1993), и T. aestivum–Ae. searsii (Friebe et al., 1995), любезно предоставленные профессором Б. Фрибе (Friebe B., Центр генетических ресурсов пшеницы, США). В качестве контроля использовали сорт T. aestivum “Chinese Spring”. Суммарную ДНК растений выделяли по методике Дрейпера и Скотта с применением протеиназы К (Дрейпер и др., 1991). Таблица 1. Образцы видов Aegilops секции Sitopsis, использованные в работе. Вид Ae. speltoides Tausch Геном Образец S Ae. longissima Schweinf. and Muschl. Sl Ae. sharonensis Eig Slsh Ae. searsii Feld. and Kis. Ss Ae. bicornis (Forsk.) Jaub. and Spach. Sb TS47 TS42 TS41 TS05 TS01 К-389* TL15 TL09 TL05 TL04 TL03 TH02 TH01 TE12 TE16 TB05 Географическое происхождение Израиль Израиль Израиль Израиль Израиль Израиль Иордания Израиль Израиль Израиль Израиль Израиль Израиль Сирия Египет * - образец из коллекции ВИР, Санкт-Петербург Микросателлитный анализ. Микросателлитный анализ проводили согласно методике Родер с соавторами (Röder et al., 1998). В работе использовано 253 пары праймеров SSR-маркеров мягкой пшеницы. Математическая обработка данных. Результаты микросателлитного анализа использованы для уточнения филогенетических взаимоотношений видов Aegilops и Triticum. На основании полученных данных составлялась бинарная матрица, в которой присутствие или отсутствие каждого фрагмента 6 амплификации обозначалось как 1 или 0. При помощи пакета программ PHYLIP (Version 3.57c) (Felsenstein, 1995) были определены генетические расстояния для каждой пары образцов по Нею (Nei and Li, 1979). Построение дендрограмм выполнено по методу UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) (Sokal and Rholf, 1995) с применением программы MEGA3 (Kumar, et al., 2004). Для оценки достоверности построенных деревьев, проводили бутстрепанализ для 100 повторностей, с помощью программы SEQBOOT (Felsenstein, 1995). Методы гибридизации. Макросателлитные повторы Spelt1 и Spelt52 были использованы в качестве зондов для дот-гибридизации с геномной ДНК, иммобилизованной на нейлоновом фильтре (Kafatos et al., 1979); «squash»-дот гибридизации с ДНК меристематической ткани корешков (Hutchinson et al., 1985) и флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) (Schubert et al., 1998). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Идентификация SSR-локусов в геномах видов Aegilops секции Sitopsis с помощью праймеров к микросателлитам T. aestivum. Изоляция микросателлитов непосредственно из геномов изучаемых видов – процесс трудоемкий и дорогостоящий. В нашей работе для выявления SSRлокусов Aegilops были использованы праймеры к фланкирующим районам микросателлитов T. aestivum. Для проведения микросателлитного анализа с локализацией маркеров на хромосомах были выбраны виды: Ae. speltoides, Ae. longissima, Ae. searsii и полученные с их участием пшенично – эгилопсные дополненные линии. Учитывались все воспроизводимые продукты амплификации с длиной, типичной для микросателлитных маркеров пшеницы (70–300 пн). Использование 253 SSR-праймеров мягкой пшеницы показало, что с помощью 88% праймеров маркеров генома B, 72% праймеров маркеров Агенома и 74% праймеров к SSR-локусам генома D выявляются фрагменты амплификации с ДНК исследованных видов (Adonina et al., 2005). Таким образом, наибольший процент праймеров, обеспечивающих амплификацию фрагментов ДНК видов Aegilops секции Sitopsis приходится на праймеры маркеров B-генома T. aestivum. Это естественно, поскольку данные виды рассматриваются в качестве доноров именно этого генома мягкой пшеницы. То, что маркеры геномов A и D мягкой пшеницы амплифицируются у видов секции Sitopsis, может свидетельствовать о древнем происхождении этих районов ДНК, а также об их высоком уровне консервативности. Больше всего маркеров T. aestivum, 70%, амплифицируется в геноме Ae. speltoides. Для этого же вида было выявлено наибольшее количество полиморфных маркеров, 161 из 177 амплифицирующихся (90%). Внутри вида Ae. longissima оказались полиморфными 75% амплифицирующихся маркеров. Более высокий уровень полиморфизма микросателлитных маркеров у Ae. speltoides, объясняется тем, что данный вид – единственный перекрестноопыляемый представитель секции Sitopsis. 7 Использование дополненных пшенично – эгилопсных линий позволило нам локализовать 103 маркера на хромосомах исследованных видов Aegilops. В качестве примера на рисунке 1 представлен амплификационный профиль маркера Xgwm382 у видов Aegilops и в дополненных линиях. Рис. 1 Амплификационный профиль маркера Xgwm382 в геномах видов Aegilops и дополненных пшенично - эгилопсных линий. Данные электрофореза обработаны с помощью компьютерной программы Fragment Analyzer: (а) - дополненные линии T. aestivum– Ae. speltoides; (б) - дополненные линии T. aestivum–Ae. longissima; (в) - дополненные линии T. aestivum–Ae. searsii. Стрелками обозначены фрагменты амплификации, соответствующие видам Aegilops. Горизонтальная шкала отражает размер фрагментов в пн, рассчитанный исходя из длины внутренних стандартов (73 пн и 231 пн). Большинство маркеров имеет гомеологичную локализацию в геноме S видов Aegilops секции Sitopsis. Все эти маркеры представлены на схематичной консенсусной карте хромосом генома B мягкой пшеницы (рис. 2). Три случая негомеологичной хромосомной локализации SSR-маркеров T. aestivum в геноме Aegilops были отмечены нами как возможные транслокации (рис. 2). 8 Рис. 2 Схематичная консенсусная карта хромосом B-генома T. aestivum (Röder et al., 1998). На карте отмечены SSR-маркеры T. aestivum, для которых была определена предположительная хромосомная локализация в геномах изученных видов Aegilops. Жирным шрифтом выделены маркеры, локализованные на гомеологичных хромосомах геномов A и D T. aestivum и маркеры, картированные в G-геноме T. timopheevii (Salina et al., 2006a); стрелками указана их примерная локализация на консенсусной карте. Звездочками отмечены предполагаемые транслокации. 9 Использование SSR-маркеров для уточнения филогенетических взаимоотношений видов Aegilops и Triticum. SSR-маркеры были использованы нами для оценки филогенетических отношений между видами Aegilops и Triticum. Для построения дендрограммы, включающей всех представителей секции Sitopsis (рис. 3) мы провели дополнительно микросателлитный анализ видов Ae. sharonensis и Ae. bicornis с использованием 45 пар праймеров. В анализ так же были включены: T. timopheevii (вид с геномом G) и T. aestivum (вид с геномом B). Каждая пара праймеров выявляла от 2 до 16 микросателлитных аллелей. Рис. 3 Дендрограмма 15 образцов видов Aegilops секции Sitopsis, 4 линий T. timopheevii и T. aestivum (сорт “Chinese Spring”). Генетическая дистанция рассчитана, исходя из данных по 463 микросателлитным аллелям. На дереве отмечены соответствующие бутстреп-значения для ветвей. На представленной дендрограмме (рис. 3) образцы группируются преимущественно согласно видам, за исключением кластера, образованного тремя видами: Ae. longissima, Ae. sharonensis и Ae. bicornis. Это может объясняться недостаточным для разделения данной группы видов числом маркеров, использованных при построении дендрограммы, и возможно связано с тем, что, по мнению ряда исследователей, вид Ae. sharonensis произошел в результате межвидовой гибридизации Ae. bicornis и Ae. longissima. 10 Согласно полученной дендрограмме, Ae. speltoides располагается ближе к T. timopheevii, чем другие виды секции Sitopsis. Это подкрепляет предположение о том, что Ae. speltoides является наиболее вероятным донором генома G полиплоидных пшениц. T. aestivum (вид с геномом B) равноудален от всех представителей секции Sitopsis. С использованием большего числа SSR-праймеров (68 пар) была построена дендрограмма для Ae. speltoides, Ae. longissima, Ae. searsii и T. aestivum, на которой Ae. speltoides и T. aestivum образуют один кластер с величиной бутстрепа, равной 96, а Ae. longissima и Ae. searsii образуют второй кластер. Полученные данные указывают на Ae. speltoides, как на наиболее вероятного донора генома B T. aestivum. В целом, в обоих случаях кластерный анализ выявляет одни и те же особенности, которые согласуются с основными современными представлениями о филогенетических отношениях между исследуемыми видами. Например, по разным признакам многие исследователи выделяют Ae. speltoides среди остальных представителей секции Sitopsis. На построенных нами дендрограммах образцы Ae. speltoides так же расположенны обособленно от остальных видов секции Sitopsis. Следует отметить, что с увеличением количества маркеров, использованных для построения дендрограммы трех видов Aegilops и T. aestivum, увеличиваются значения бутстрепов для всех ветвей, что говорит о большей достоверности итоговой дендрограммы, построенной с использованием большего числа маркеров. Изучение популяционного полиморфизма видоспецифичных макросателлитных субтеломерных повторов Aegilops секции Sitopsis. На настоящий момент известно два семейства видоспецифичных макросателлитных повторов представителей секции Sitopsis: Spelt1 и Spelt52. Оба повтора имеют субтеломерную локализацию, изучены их структура и межвидовой полиморфизм. Для использования Spelt1 и Spelt52 в качестве маркеров было необходимо исследование их популяционного полиморфизма у видов Aegilops. Проведенная нами дот-гибридизация повторов Spelt1 и Spelt52 с ДНК различных образцов Aegilops показала значительный полиморфизм количественного содержания изучаемых повторов между разными образцами одного вида. Внутри большинства образцов Aegilops были так же выявлены достоверные различия по содержанию Spelt1 и Spelt52. С помощью флуоресцентной гибридизации in situ мы изучили распределение блоков повторов на хромосомах индивидуальных растений Ae. speltoides K-389 и Ae. longissima TL05. Для идентификации хромосом использовался зонд pSc119.2. 11 Рис. 4 Гибридизация in situ зонда Spelt52 (черный) на хромосомы индивидуальных растений Ae. longissima TL05: (а) – растение 1; (б) – растение 2; (в) – растение 3; (г) - растение 4. Обнаружен значительный полиморфизм по числу блоков повтора Spelt52 (рис. 4). У Ae. longissima картировано 4 сайта Spelt52 на гаплоидный геном. По трем из них наблюдается полиморфизм, как между индивидуальными растениями, так и между гомологичными хромосомами (рис. 5). Результаты дотгибридизации так же свидетельствуют о достоверных различиях между индивидуальными растениями в содержании повтора. У Ae. speltoides полиморфными оказались два из четырех сайтов Spelt52 (рис. 5). Все хромосомы Ae. speltoides К-389 несут блоки Spelt1 на каждом плече, за исключением хромосомы 4S, у которой единственный блок локализован на длинном плече (рис. 5). Среди проанализированных растений не было отмечено полиморфизма по количеству блоков Spelt1, несмотря на то, что при дот-гибридизации ДНК наблюдались статистически достоверные различия в содержании повтора между индивидуальными растениями. 12 Рис. 5 Обобщенная идиограмма хромосом Ae. speltoides K-389 и Ae. longissima TL05 после FISH с пробами Spelt1 (левый гомолог) и Spelt52 (правый гомолог). * Непостоянные сайты гибридизации * Гетероморфизм между гомологичными хромосомами Таким образом, у разных растений внутри одной популяции могут наблюдаться как изменение числа сайтов локализации изучаемых повторов на хромосомах, так и количественные вариации повторов в пределах отдельных блоков. Использование тандемных повторов, в качестве маркеров для анализа гибридных форм мягкой пшеницы, полученных с участием Aegilops секции Sitopsis. В задачи нашей работы входила оценка эффективности использования геном-специфичных макросателлитных повторов Spelt1, Spelt52 и SSRмаркеров для анализа гибридных форм мягкой пшеницы, полученных с участием Aegilops секции Sitopsis. Всего было проанализировано 11 интрогрессивных линий, полученных путем скрещивания мягкой пшеницы сорта «Родина» с Ae. speltoides К-389 (Лапочкина, 1999). Дот-гибридизация с радиоактивно-меченными зондами (рис. 6) показала достоверное присутствие повтора Spelt1 в семи линиях, наиболее выделяются по содержанию Spelt1 линии: 32/98w, 170/98i, 178/98i. Повтор Spelt52 был 13 выявлен в восьми линиях, наиболее выделяется по содержанию Spelt52 линия 182/98i. 6000 *** 5000 имп. 4000 Spelt1 *** *** 3000 Spelt52 *** 2000 *** 1000 ** ** 0 1 2 3 *** *** ** ** *** 4 5 6 7 8 9 интрогрессивные линии *** *** 10 ** 11 12 Рис. 6 Результаты дот-гибридизации повторов Spelt1, Spelt52 с ДНК интрогрессивных линий T. aestivum × Ae. speltoides: 1 – 32/98w; 2 – 75/98w; 3 – 84/98w; 4 – 167/98i (73/00i); 5 – 170/98i (76/00i); 6 – 172a/98i (78/00i); 7 – 172b/98i (79/00i); 8 – 178/98i (81/00i); 9 – 182/98i (84/00i); 10 – 207/98i (102/00i); 11 – 255/98i (103/00i); 12 - T. aestivum «Родина». В скобках указаны новые обозначения линий (персональное сообщение И.Ф. Лапочкиной) далее в работе линии обозначаются в соответствии с публикациями (Salina et al., 2001; Adonina et al., 2004). Увеличение содержания повтора по сравнению с T. aestivum «Родина» достоверно при: **Р≥0,99, ***Р≥0,999. С помощью гибридизации in situ продемонстрировано, что линии: 32/98w, 170/98i, 178/98i несут от двух до четырех хромосомных плеч или субтеломерных районов Ae. speltoides с блоками повтора Spelt1, в остальных линиях данный метод не выявил блоков Spelt1. Ни в одной из исследованных линий методом FISH не было выявлено сайтов гибридизации со Spelt52. Рис. 7 Авторадиогамма, меченного зонда Spelt1 с Ae. speltoides: 1 – 32/98w; 172a/98i; 8 – 172b/98i; 9 – Ae. speltoides K389. полученная после «squash»-дот гибридизации радиоактивнораздавленными корешками интрогрессивных линий T. aestivum × 2 – 75/98w; 3 – 84/98w; 4 – 207/98i; 5 – 167/98i; 6 – 170/98i; 7 – 178/98i; 10 –182/98i; 11 – 255/98i; 12 - T. aestivum «Родина»; 13 - 14 Высокая копийность повтора Spelt1 позволяет использовать его для первичной оценки интрогрессии без выделения ДНК, методом гибридизации меченого зонда с меристематической тканью корешков (рис. 7). Причем интенсивность сигнала коррелирует с количеством блоков Spelt1, выявленных в соответствующих линиях с помощью FISH. Таким образом, из двух, рассматриваемых в работе геном-специфичных повторяющихся последовательностей, наиболее удобным маркером субтеломерных участков хромосом Ae. speltoides К-389 оказался тандемный повтор Spelt1. Линия 170/98i с одним блоком Spelt1 на гаплоидный набор хромосом является удобной моделью для исследования динамики количественных изменений Spelt1 у потомков одного растения, полученных путем самоопыления, поскольку изучать данный аспект в поколениях растений Ae. speltoides сложно из-за множественных участков локализации повтора в геноме данного вида. На рисунке 8 представлены результаты дот-гибридизации ДНК потомков одного из растений этой линии с зондом Spelt1. В 11 случаях с разной степенью достоверности наблюдается уменьшение содержания повтора по сравнению с родительским растением. Достоверного увеличения содержания повтора в потомстве нами не обнаружено. Таким образом, выявлена тенденция к элиминации повтора Spelt1 при самоопылении пшенично-эгилопсных гибридов, которая может быть обусловлена гибридным дисбалансом. 140% 120% 100% ** * ** * ** 80% ** ** * ** * *** 60% 40% 20% 0% 0 5 10 15 20 25 30 номер растения Рис. 8 Результаты дот-гибридизации ДНК потомков одного из растений линии 170/98i с радиоактивно меченым зондом Spelt1. За 100% принято количественное содержание Spelt1 в родительском растении. Изменение содержания повтора по сравнению с родительским растением достоверно при: *Р≥0,95, **Р≥0,99, ***Р≥0,999. 15 С целью определения протяженности и локализации участков интрогрессии генетического материала Ae. speltoides в геноме пшеницы мы провели микросателлитный анализ двух интрогрессивных линий: 170/98i и 178/98i. Рис. 9 Электрофореграмма результатов ПЦРамплификации микросателлитных маркеров T. aestivum с ДНК интрогрессивных линий и родительских форм: (а) Xgwm369: 1 - T. aestivum (сорт «Родина»), 2 - Ae. speltoides К-389, 3 – линия 170/98i, 4 – линия 178/98i, 5 – маркер длины фрагментов; стрелкой обозначен фрагмент амплификации T. aestivum (сорт «Родина»); (б) Xgwm437: 1 – линия 178/98i, 2 – линия 170/98i, 3 - Ae. speltoides K-389, 4 - T. aestivum (сорт «Родина») 5 – маркер длины фрагментов; а б 7D 3A Xgwm369 Xgwm1014 Xgwm44 C Xgwm676 7D C Xgwm32 Xgwm1014 Xgwm44 C Xgwm437 Xgwm428 Xgwm676 Xgwm437 Xgwm155 Xgwm428 Xgwm480 Xgwm37 Xgwm37 Рис. 10 Схематическое изображение замещения хромосом и предполагаемой транслокации в интрогрессивных линиях: (а) 170/98i и (б) 178/98i. Хромосомный материал Ae. speltoides выделен черным цветом. C – центромера. Локализация микросателлитных маркеров (Xgwm) указана в соответствии с данными для T. aestivum (Röder et al., 1998). Микросателлитный анализ проводился путем продуктов амплификации ПЦР после их разделения геле и окрашивания бромистым этидием. Для использовано 83 пары праймеров, обеспечивавших каждую хромосому и выявлявших полиморфизм 16 визуального сравнения в 6% полиакриламидном данной работы было от 3 до 6 маркеров на между родителями. С помощью 9 маркеров были выявлены изменения в геноме линии 170/98i относительно родительского сорта пшеницы и с помощью 10 маркеров – в геноме линии 178/98i. На рисунке 9 в качестве примера приведены электрофореграммы результатов ПЦР для маркеров: Xgwm369 и Xgwm437. Результаты микросателлитного анализа позволили нам установить замещение хромосомы 7D пшеницы на 7S-хромосому Aegilops у обеих линий и предположить наличие терминальной транслокации в коротком плече хромосомы 3A у линии 178/98i (рис. 10). Результаты in situ гибридизации для этих линий согласуются с данными SSR-анализа. Один блок Spelt1 в линии 170/98i соответствует замещение 7S(7D). Два блока повтора Spelt1, выявленные в линии 178/98i и локализованные на разных хромосомах вполне могут свидетельствовать о замещении 7S(7D) и предполагаемой терминальной транслокации в коротком плече хромосомы 3A. Следует отметить, что в нашей работе у Ae. speltoides К389 блоки повтора Spelt1 на хромосоме 7S были обнаружены на обоих плечах, и полиморфизм между растениями по количеству сайтов локализации Spelt1 не был выявлен. Однако, поскольку для других образцов Ae. speltoides, не рассматриваемых в данной работе, было показано существование полиморфизма по количеству сайтов локализации Spelt1, возможно, что и у Ae. speltoides К-389, такой полиморфизм существует, но встречается реже, чем полиморфизм по сайтам повтора Spelt52. Отсутствие одного из блоков можно так же объяснить его потерей в процессе облучения пыльцы при получении интрогрессивных линий. ВЫВОДЫ 1. Установлено, что более 80% микросателлитных маркеров T. aestivum амплифицируются в геномах Aegilops секции Sitopsis и более половины из них выявляют внутривидовой полиморфизм. Наиболее высокий уровень полиморфизма SSR-локусов обнаружен у перекрестноопыляемого вида, Ae. speltoides. 2. 103 SSR-маркера мягкой пшеницы локализовано на хромосомах трех видов Aegilops секции Sitopsis: Ae. speltoides, Ae. longissima и Ae. searsii. Большинство из них имеет гомеологичную хромосомную локализацию в геноме S относительно T. aestivum. Три случая негомеологичной локализации обусловлены транслокациями, возникшими в процессе дивергенции видов секции Sitopsis. 3. Продемонстрирована возможность использования SSR-маркеров для уточнения филогенетических взаимоотношений видов Aegilops и Triticum. Результаты кластерного анализа свидетельствуют о том, что Ae. speltoides является наиболее вероятным донором генома B T. aestivum. 4. Количественный анализ показал существование достоверных внутрипопуляционных различий в содержании повторов Spelt1 и Spelt52. В случае Spelt52 обнаружен полиморфизм распределения блоков повтора в 17 геноме, как между индивидуальными растениями, так и между гомологичными хромосомами. Выявлена тенденция к элиминации повтора Spelt1 при самоопылении гибридов T. aestivum × Ae. speltoides. 5. На примере анализа интрогрессивных линий T. aestivum × Ae. speltoides продемонстрирована эффективность комплексного использования геномспецифичных макросателлитных повторов: Spelt1, Spelt52 и SSR-маркеров для контроля получения гибридных форм мягкой пшеницы с участием видов Aegilops секции Sitopsis. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых изданиях: Salina E.A., Pestsova E.G., Adonina I.G., Vershinin A.V. Identification of a new family of tandem repeats in Triticeae genomes // Euphytica. 1998. V. 100. P. 231– 237. Adonina I.G., Salina E.A., Efremova T.T., Pshenichnikova T.A. The study of introgressive lines of Triticum aestivum x Aegilops speltoides by in situ and SSR analyses // Plant Breeding. 2004. V. 123. P. 220-224. Salina E.A., Adonina I.G., Vatolina T. Yu., Kurata N. A comparative analysis of the composition and organization of two subtelomeric repeat families in Aegilops speltoides Tausch. and related species // Genetica. 2004. V. 122. P. 227-237. Adonina I.G., Salina E.A., Pestsova E.G., Röder M.S. Transferability of wheat microsatellites to diploid Aegilops species and determination of chromosomal localizations of microsatellites in the S genome // Genome. 2005. V. 48. P. 959-970. Salina E.A., Lim Y.K., Badaeva E.D., Shcherban A.B., Adonina I.G., Amosova A.V., Samatadze T.E., Vatolina T.Yu., Zoshchuk S.A., Leitch A. R. Phylogenetic reconstruction of Aegilops section Sitopsis and the evolution of tandem repeats in the diploids and derived wheat polyploids // Genome. 2006. V. 49. P. 1023-1035. Адонина И.Г., Салина Е.А. Механизмы изменчивости субтеломерных повторов «Spelt1» в потомстве интрогрессивной линии T. aestivum L.× Ae. speltoides Tausch. // Генетика. 2007. Т. 43, №4, Стр. 458-460. Зощук С.А., Бадаева Е.Д., Зощук Н.В., Адонина И.Г., Щербань А.Б., Салина Е.А. Исследование внутривидовой дивергенции пшениц группы Timopheevi методом гибридизации in situ с семействами тандемных повторов Spelt1 и Spelt52 // Генетика. 2007. Т.43. Другие работы: Salina E.A., Adonina I.G., Efremova T.T., Lapochkina I.F., Pshenichnikova T.A. The genome-specific subtelomeric repeats for study of introgressive lines T.aestivum × Ae.speltoides // Abstracts of the 11th EWAC Conference dedicated to the memory of O.I. Maystrenko, 24-28, July, 2000. Novosibirsk. Russia. Salina E.A., Adonina I.G., Efremova T.T., Lapochkina I.F., Pshenichnikova T.A. The genome-specific subtelomeric repeats for study of introgressive lines T.aestivum × Ae.speltoides // EWAC newsletter. 2001. P. 161-164. 18 Салина Е.А., Адонина И.Г. Перспективы использования микро - и макросателлитов для анализа гибридного генотипа пшеницы // Международный симпозиум «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология». Москва-Минск. 2001. С.146-147. Vatolina T., Scherban A., Adonina I., Salina E. The genomic organization and evolution of Aegilops speltoides subtelomeric regions // Proc. 3d Inter. Conf. BGRS. Novosibirsk. Russia. 2002. P. 75-77. Salina E., Numerova O.M., Adonina I., Feldman M. Differences in organization and evolution of subtelomeric repeats of Aegilops speltoides // Abstr. Conf. "6-th Gatersleben research conference". Gatersleben. 2002. P. 89. Salina E., Numerova O.M., Adonina I., Feldman M. The organization and evolution of subtelomeric repeats in diploid and polyploid wheat species // Abstr. International Polyploidy Conf.. London. 2003. P. 30. Адонина И.Г., Салина Е.А. Полиморфизм микросателлитных локусов у диплоидных предшественников В-генома мягкой пшеницы Triticum aestivum // III Съезд ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». Москва. 2004. С. 140. Salina E.A., Adonina I.G., Lim Y.K., Shcherban A.B., Badaeva E.D., Feldman M., Leitch A.A. 2005. The dynamics of subtelomeric repetitive DNA changes during evolution and amphiploids formation. Intern. Timofeeff-Ressovsky Conf, Yerevan, 811 September. 19
