Критический разбор подхода Zehfus’а к анализу гиброфобных ядер.

Критический разбор подхода Zehfus’а к анализу
гиброфобных ядер.
Джумашев Д.Б. 4 курс ФББ
Представленный метод идентифицирует гидрофобные кластеры в белках с
известной структурой. Кластеры образованы в белках из аминокислотных остатков
по укладке боковых групп. Компактные кластеры содержат 7 и более остатков, 65%
которых образованы гидрофобными боковыми группами и, как правило, лежат во
внутреннем пространстве белковой молекулы. Маленькие кластеры образованы
лишь боковыми группами, большие же могут охватывать значительные части
белкового остова во вторичной структуре. Эти кластеры неплохо соотносятся с теми
гидрофобными частями белка, что определены другими, более интуитивными
методиками и многие из них коррелируют с белковыми доменами. Это значительно
разнится с подходом, описанным в статье J.Heringa, P.Argos (1991, JMol Biol
220:151-171). Согласно которому кластеры, локализованные на поверхности белка,
не специфичны по гидрофобности боковых групп и размером всего 3-4 остатка.
Введение. (предисловие и цели)
Показано, что гидрофобные кластеры очень неплохо коррелируют с ранним
интермедиатом фолдинга, но только при условии достаточного количества остатков с
гидрофобными группами. В существующей модели стадийного сворачивания белковой
молекулы существует кинетический интермедиат сворачивания белка in vitro.
Существование накапливающегося метастабильного интермедиата было доказано
экспериментами ренатурации белков (1973 Птицын). Этот интермедиат по компактности
и вторичным структурам довольно близок к нативному, но не имеет, ни нативной
упаковки боковых групп, ни энзиматической активности твердого белка. Ранний
интермедиат фолдинг кинетически стабилен по причине попадания в зону минимума
свободной энергии. Кроме того гидрофобные кластеры основной молекулы и
интермедиата почти всегда совпадают. А вторичные структуры являются результатом
погружения остатков в гидрофобное ядро (Dills et al., Evans, Matusek). Следует также
отметить о существовании мнения, отвергающего существования данной стабильной
стадии, которое опирается на эксперименты по укладке малых белковых молекул, в
которой все стадии равноценны и нет энергетического минимума.
Понятие гидрофобности очень тесно коррелирует с понятием компактности для белка.
Авторы данной работы выдвигают тезис о том, что в компактными кластерами являются
области с ок. 65% гидрофобностью боковых групп. Компактный кластер в данной
формулировке сильно отличается от понятия гидрофобного ядра (кроме размеров).
На периферических областях
Компактный кластер
Гидрофобное ядро
Остовные атомы
Боковые атомы остатков
вторичных структур
В центральной области
Атомы боковых групп
Атомы остова, в составе
элементов вторичных структур
Кроме того, авторы доказали, что набор достаточно крупных кластеров (более 9 остатков)
совпадает с гидрофобными областями кинетического интермедиата фолдинга.
Цель данной работы – объяснить метод для объективной идентификации гидрофобных
областей с помощью компактных кластеров, образованных боковыми группировками.
Цель моего очерка – рассмотреть данный метод, продемонстрировать кластерную
организацию для какого-либо примера.
Результат.
Основное условие для существования гидрофобного кластера – минимальная поверхность
в принципе, для минимализации возможности контакта гидрофобного с раствором.
Компактность, как уже было объяснено, сильно связано с гидрофобностью, введенная
мера Z компактности показывает минимальную возможную поверхность по отношению
ко всему закрытому объему (статья 1986). Гидрофобность же кластеров очень зависима от
размеров: чем больше кластер, тем он менее гидрофобен. Хотя и говорилось, что остовные
атомы в компактных кластерах чаще находятся на периферических его областях, если
размеры кластера более 15 остатков, остовные атомы начинают погружаться внутрь
кластера. Такие кластеры даже легче обнаружить по величине Z, которая понижается в
связи с увеличением компактности кластера. Большой сводный рис. 1 (fig.1 [1]) содержит
в себе представленные компактные кластеры некоторого набора белков, кроме того
первым указано гидрофобный кор. Координаты компактного кластера наглядно
продемонстрированы около последовательности белка, в которой для условности
обозначены лишь вторичные структуры, каждый кластер отличается сплошной либо
штрихованной указателями. Сплошной в случае совпадения данного кластера с
гидрофобным кластером в кинетическим интермедиатом, который был получен и
охарактеризован в статьях посвященных белковым структурам. Параметры,
характеризующие компактный кластер: размер (количество остатков его образующих), Zпоказатель, ξ-показатель (нормировка на размер), доля гидрофобных остатков.
Построение кластеров имеет одну особенность – прерывная природа кластеров, но не
стоит считать это недостатком метода.
Рис.1
Общие тенденции.
На разных белковых структурах было показано, что кластеры маленького размера более
гидрофобны, находятся в меньшей доступности, т.е. в «глубине молекул» и не
затрагивают области вторичных структур, связанных водородными связями. Большие
кластеры, так или иначе, соседствуют, включают в себя кластеры поменьше, менее
гидрофобны и распространяются на области вторичных структур. Минусом, как было
показано, данного алгоритма кластеризации является то, что размеры кластера могут
выйти за границы четко отличимого домена, но в таком случае эту ошибку легко
детектировать визуальными средствами. В обратном случае алгоритм может поделить
суперкластер на два или более отдельных. Можно принять два кластера примерно одного
размера за один при перекрывании больше 30%. А вообще алгоритм чаще принимал
перекрывающиеся компактные кластеры как отдельные причем, существующие
одновременно.
Жадный алгоритм, т.е. алгоритм наращивания, осуществлялся добавлением одного
аминокислотного остатка на каждом шаге, причем таким образом, чтобы боковая группа
имела минимальный контакт с остатками вне кластера. Авторами было проведено
сравнение с методом Swindell’a (1995) определения гидрофобных участков для белков
интерлейкина 1β, миоглобина и ингибитора панкреотического трипсина. Для первых двух
со схожестью и показателем надежности 88% и 67% произошло совпадение гидрофобных
ядер Swindell’а и компактных кластеров. Однако для ингибитора панкреотического
трипсина, в котором не было остатков, которые обладали большим количеством
гидрофобных контактов, не было найдено ядер. Компактных же кластеров нашлось 4,
один из которых являлся довольно важным, как показало сравнение с ранним
интермедиатом фолдинга.
Кстати экспериментально обнаруженные гидрофобные области кинетических
интермедиатов почти, всегда, совпадали с компактными кластерами, для которых был
определен нижний порог в 9 остатков. Случаи несовпадения авторы называют
экспериментальные неточности, когда учитывался водородный обмен в областях только
вторичных структур либо, когда он производился в областях доступности растворителя. Я
же полагаю, что экспериментальные способы обнаружения гидрофобных участков, будь
то стабильный интермедиата или нативный белок, редко приносят неточных результатов,
кроме случаев с цитохромом С и убиквитином. Эти небольшие белки могут не иметь
интермедиатов, попадающих под определение раннего интермедиата фолдинга,
вследствие немного другого механизма укладки, о чем уже говорилось ранее. Отдельно
стоит отметить расположение гидрофобных кластеров по отношению к β-листам. Так как
эти структуры могут иметь остатки с гидрофобными боковыми группами по обе стороны
от листа, часто гидрофобные кластеры определялись и с той и с другой стороны листа.
Описание метода.

- Набор данных координат из PDB,

- Удаление гетероатомов,

- Введение параметра компактности Z, как отношение SAS (поверхности
доступной для растворителя) к минимально возможной поверхности. Учет атомов
как боковой цепи так и остова.

-Кластеризация. Здесь уже учитывались только боковые составляющие
аминокислотных остатков, т.к. остов по природе гидрофилен и содержит
водородные связи. Однако это не исключает возможности попадания атомов остова
в кластер на более поздних стадиях. Кластеризация прерывна по причине
двусторонности например β-листов.

-Компактность всех кластеров: каждая боковая группа дополняет какой-либо
кластер, каждый кластер входит в состав какого-то набора кластеров, и тот набор
кластеров, который к моменту прохождения алгоритма через все боковые остатки
покажет минимальную компактность и является лучшим.
Алгоритм кластеризации







Выбрать остаток, точнее его боковую группу и найти во всем множестве других
боковых групп компактную пару. Затем найденной паре найти третью боковую
группу, чтобы получить максимально компактный триплет и т.д.
Компактность определяется Z-величиной (Zehfus, 1993)
Проверка разных наборов кластеров на минимальную компактность. Осложнено
фактом зависимости кластеров от размера. Введение ξ-независимой величины,
среднеквадратичного отклонения случайной величины Z.
Сравнение кластеров в различных наборах происходило в сторону с большим
значением ξ - величины.
Два сравнимых по размерам кластера принимались сходными по набору остатков,
если более 50% аминокислотных остатков меньшего кластера входило в состав
большего. В этом случае учитывался кластер с большим значением ξ – величины.
Гидрофобность кластеров по сравнению со всей структурой белка заметно выше.
Если среднее количество гидрофобных остатков в исследуемых белках – 42%, то в
кластере оно повышается до 65%.
Когда определение оптимальных кластеров завершено, происходит установление
иерархии гидрофобных областей, по размеру. Самые большие кластеры образуют
гидрофобные ядра, выше гидрофобных ядер только та условная часть молекулы,
которая включает в себя почти всю гидрофобную и около гидрофобную часть
белка.
Кластерная организация на примере бычьего панкреотического ингибитора трипсина
(6PTI).
Данный белок для иллюстрирования я взял из следующих соображений. Во-первых, он
мал, и содержит небольшое количество кластеров, во-вторых, этот белок был отмечен в
статье, как неподходящий разбору по методу Swindell’a, но показывающий результаты по
данному алгоритму, и, в-третьих, не смотря на его небольшие размеры, экспериментально
было показана структура кинетического интермедиата фолдинга (правда на примере
аналогичного пептида). И в этой структуре гидрофобная область совпала с одним из
четырех кластеров, найденных по методу Zefhus’a.
Рис.2
Обозначения: h – спираль, s- бета-тяж, A, B – домены, столбцы (соответственно): размер
кластера, Z-score, ξ-score, процент гидрофобных остатков.
На ниже приведенных рисунках отмечены области гидрофобных кластеров, как окружения
атомов боковых групп аминокислотных остатков, входящих в тот или иной кластер.
Рис. 3 Белок BPTI в формате остова
Рис. 4 Гидрофобное ядро (Core1) белка BPTI
Рис. 5. Красным отмечен кластер UnitII, а желтым кластер IA. Последний является
подкластером гидрофобного ядра (CoreI)
Гидрофобное ядро 1 (Core 1) – как суперкластер является той структурой, которая неплохо
соответствует интермедиату фолдинга, роль такого интермедиата играл пептид PαPβ
(Staley, Kim. 1990).
Список литературы
1. Zehfus M.H. 1999. Protein Science 4:1188-1202
2. J.Heringa, P.Argos. 1991. JMol Biol 220:151-171
3. Zehfus MH. 1997. Protein Sci. Jun; 6(6):1210-9
4. Zehfus MH. 1987. Continuous compact protein domains. Proteins Struct Funct. Genet. 2:90110.
5. Zehfus MH. 1993. Improved calculations of compactness and a reevaluation of continouous
compact units. Proteins Struct. Funct. Genet. 16:293-300.
6. Zehfus MH, Rose GD. 1986. Compact units in proteins. Biochemistry 25:5759-5765
7. Swindells MB. 1995b. A procedure for the automatic determination of hydrophobic
cores in protein structures. Protein Sci 4:93-102.
8. Staley JP, Kim PS. 1990. Role of a subdomain in the foldingo f bovine pancreatic trypsin
inhibitor. Nature 344:685-688.