ОСНОВЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ - hem

ОСНОВЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ "АНТИФОСФОЛИПИДНОГО
СИНДРОМА"
З.С.Баркаган, А.П.Момот, Л.П.Цывкина, А.Н.Мамаев, Е.В.Селиванов
Алтайский государственный медицинский университет,
г. Барнаул 2003 г.
Под термином "антифосфолипидный синдром" (АФС) объединяется группа
аутоиммунных нарушений, характеризующаяся наличием в крови в высоком титре
антител к содержащимся в плазме отрицательно заряженным мембранным фосфолипидам
- фосфатидилсерину, кардиолипину и др., а также к связанным с этими фосфолипидами
гликопротеинам (бета2-гликопротеину-I, аннексину V и/или протромбину). Другой
важной характеристикой этого синдрома является нарушение ряда параметров
свертываемости крови - развитие гипокоагуляции в различных так называемых
фосфолипид-зависимых тестах, выполняемых на бедной тромбоцитами плазме (БТП). Эта
гипокоагуляция, которая обозначается как наличие в плазме крови антикоагулянтов
волчаночного типа (АВТ), устраняется или становится значительно менее выраженной
при добавлении к БТП эмульсии нормальных фосфолипидных мембран, полученных из
разрушенных тромбоцитов, либо эритрофосфатида [2,5].
Антифосфолипидный синдром является одним из наиболее часто встречающихся видов
тромбофилии, в связи с чем его распознавание должно включаться в диагностический
процесс во всех случаях ранних и, особенно, рецидивирующих венозных и артериальных
тромбозов различной локализации, тромбоэмболий, динамических нарушений мозгового
кровообращения и ишемических инсультов, в том числе протекающих с синдромами
мигрени, нарушениями памяти, парезами, эпи-синдромом, нарушениями зрения и
другими церебрально-сосудистыми проявлениями, а также при упорном невынашивании
беременности (внутриутробная гибель плода, выкидыши), наличии ливедо, умеренной
тромбоцитопении, сочетающейся с тромбозами и ишемическими явлениями, ложно
положительной реакцией Вассермана и другими проявлениями [1,3,4,9,25,]. При этом
следует учитывать, что наряду с так называемым "первичным антифосфолипидным
синдромом" часты случаи его сочетания с системной красной волчанкой, узелковым
периартериитом и другими заболеваниями аутоиммунной природы, а также с вирусными
и лимфопролиферативными болезнями, меняющими иммунный статус организма. Эти
формы обозначаются как "вторичный АФС" и в их симптоматику входят как признаки
основного заболевания, так и АФС. К вторичному АФС могут быть отнесены и случаи
этой формы патологии, возникающие вследствие ряда лекарственных воздействий,
которые трактуются как гаптеновые иммунные антифосфолипидные синдромы.
В процессе многолетних наблюдений более, чем над 800 больными с АФС, многие из
которых направлялись в наш центр для уточнения диагноза и проведения лечения, мы
неоднократно сталкивались с рядом типичных ошибок, допускавшихся при распознавании
АФС, в результате чего он либо не выявлялся, либо, что наблюдалось несравненно чаще,
диагностировался ошибочно у больных, у которых в действительности этого синдрома не
было. Среди ошибок в распознавании АФС такая гипердиагностика имела место более,
чем в 70% случаев. Анализ этих ошибок показал, что они связаны, в основном, со
следующими причинами:
1. Недостаточно полным обследованием больных и применением ограниченного числа
рекомендуемых для такой диагностики тестов [2,11,17, 18, 26]. Так, мы неоднократно
сталкиваемся с тем, что диагноз АФС ставится лишь на основании одного
антикардиолипинового теста без определения антител к другим фосфолипидам и без
выявления эффектов так называемых "волчаночных антикоагулянтов". Между тем
известно, что антикардиолипиновый тест, несомненно являющийся наиболее "ходовым" и
стандартизированным, обладает сравнительно низкой специфичностью, поскольку
кардиолипин является компонентом лишь мембран внутриклеточных органелл,
содержится в большом количестве в плазме здоровых людей, будучи в ней заблокирован
другими компонентами [10] и бывает положительным не только при АФС, но и при
других видах патологии [11,15, 19]. В силу этого, антикардиолипиновый тест при всей
своей высокой стандартизации и воспроизводимости должен дополняться другими
методами иммунологической диагностики (см. ниже), а также комплексным определением
эффектов волчаночных антикоагулянтов. К этому нужно добавить, что
антикардиолипиновый тест может считаться положительным лишь при очень высоких его
показаниях, превышающих в несколько раз нормальный уровень этих антител. Вместе с
тем, в настоящее время подчеркивается необходимость определения при АФС не только
антикардиолипиновых антител, но и титра антител к другим мембранным фосфолипидам
(фосфатидилсерину и др.), для чего ряд фирм (Stago и др.) выпускают тест-системы,
содержащие антитела как к отдельным мембранным фосфолипидам, так и к их смесям.
2. Иммунодиагностика АФС согласно современным рекомендациям должна включать в
себя помимо определения титра антифосфолипидных антител, принадлежащим к разным
классам иммуноглобулинов, исследование антител к некоторым гликопротеинам,
фиксированным на фосфолипидных мембранах. Важнейшими из них являются бета2гликопротеин-I (бета2ГП-I), аннексин V и протромбин. Соответствующие диагностикумы
также выпускаются рядом фирм (Stago, Loxo и др.). Для повышения точности
диагностики и уточнения степени тромбогенности иммунного процесса существенное
значение имеет определение титра антител хотя бы к одному из этих белков. Наиболее
показательно в этом отношении определение титра антител к бета2-ГП-I, о чем говорит
множество публикаций и докладов на Международных конференциях, посвященных
антифосфолипидному синдрому, в том числе и работы нашей клиники [11, 20]. В
настоящее время разрабатываются также методики определения в сыворотке крови титра
антител к белково-фосфолипидным неоантигенам.
3. Следует иметь в виду, что и при достаточно полном иммунологическом обследовании
значительная часть случаев АФС (по разным данным в пределах 35-60%) остается
нераспознанным, если одновременно не определяются в плазме антикоагулянты
волчаночного типа. Последние также неоднородны как и антифосфолипидные антитела, в
связи с чем их выявление должно проводиться полным комплексом предложенных для
этого методик. Недопустимо также применение с этой целью недостаточно проверенных
"доморощенных" методов и их модификаций, не прошедших сравнения с признанными
эталонными тестами. Мы это подчеркиваем, поскольку такими мало пригодными для
использования в диагностическом процессе методиками очень засорена отечественная
литература, что часто служит источником ошибочной постановки диагноза АФС,
неправильного лечения больных. В этом мы неоднократно убеждались, подвергая
повторному обследованию больных, направленных на консультирование в нашу клинику
с якобы уже установленным АФС.
Иначе говоря, подобно тому, как один иммунологический тест не обеспечивает надежного
распознавания АФС, выявление эффектов волчаночного антикоагулянта также требует
использования полного комплекса предложенных для этого фосфолипид-зависимых
скрининговых и подтверждающих методик, прошедших апробацию в многоцентровых
исследованиях [2, 17, 18, 21, 27]. К сожалению в большинстве отечественных работ,
посвященных АФС, в том числе и выполненных в крупных научных центрах, мы не
встречаем такой четко построенной идентификации эффектов АВТ, без чего диагностика
этого синдрома не может считаться достаточно обоснованной.
Ниже будут рассмотрены основные принципы идентификации АВТ и иммунологических
маркеров АФС.
Способы выявления и идентификации АВТ
Все включаемые в эту группу исследования выполняются на бедной тромбоцитами плазме
(БТП). Они состоят из групп скрининговых и подтверждающих коагуляционных тестов,
выполняемых либо мануально, либо на коагулометрах современных конструкций, но не
на устаревших электрокоагулометрах и тромбоэластографах. Из скрининговых тестов
наиболее доступным, но наименее специфичным является определение каолинового
времени свертывания БТП. Наличие волчаночного антикоагулянта (ВА) может быть
заподозрено при удлинении каолинового времени более, чем в 1,25 раза по сравнению с
контролем. Вместе с тем следует помнить, что многие ВА не влияют на этот показатель и
что его нарушение может быть обусловлено не только эффектами ВА, но и другими
причинами.
Намного более информативны определения АЧТВ (АПТВ), но выполняемые не с
обычными, а со специальными фосфолипидами, высоко чувствительными к действию ВА.
Для этого, в качестве международных эталонов, признанных золотым стандартом,
применяют диагностикумы, содержащие Platelin LS (фирмы "Organon-Teknika") или
Staclot-LA (фирмы "Stago"). Многолетние испытания, проводившиеся в нашей
лаборатории, подтвердили высокую информативность этих тестов. Под влиянием АВТ
время свертывания в них удлиняется по сравнению с эталонной нормальной плазмой в 1,2
раза и более. Наличие ВА затем подтверждается другими скрининговыми и
коррекционными пробами (см. ниже).
Особое место в выявлении ВА занимают тесты с фосфолипид-зависимыми коагулазами
змеиных ядов. За рубежом с этой целью используется определение времени свертывания
при добавлении к исследуемой БТП больного и к контрольной плазме разведенного яда
гадюки Рассела [21,22,27]. В нашей лаборатории показано, что с этой же целью может
быть использован коагуляционный тест с разведенным ядом среднеазиатской гюрзы
(Vipera lebetina turanica), коагулаза которого по основным механизмам действия очень
близка к коагулазе яда гадюки Рассела [12]. В больших сериях исследований, в том числе
выполненных в нашем центре, показано, что коагуляционные тесты с фосфолипидзависимыми разведенными змеиными ядами дают высокую корреляцию с показанием
пробы с Platelin LS (коэффициент корреляции r =0.9; Р<0,02).
Для уточнения степени нарушения показаний фосфолипид-зависимых ядовых тестов
используется определение отношения показателей времени свертывания, полученных в
этих тестах, к времени свертывания, полученного в тестах с коагулазами ядов, не
чувствительных к эффектам волчаночного антикоагулянта. С этой целью за рубежом чаще
всего используется определение отношения времени свертывания в тесте с разведенным
фосфолипид-чувствительным ядом змеи Pseudonaja textilis (текстарином) к свертыванию в
тесте с фосфолипид-нечувствительным ядом Echis carinatus (песчаной эфы) [28]. Оба эти
яда являются активаторами фактора II.
В нашем центре разработан аналогичный индекс, отражающий отношение времени
свертывания в тестах с ядом гюрзы и эфы (Echis multisquamatus) той же активности.
Показания последнего не зависят от участия в процессе свертывания фосфолипидных
мембран [2, 5]. Определение этих индексов не только подтверждает то, что нарушение
гемокоагуляции у исследуемого больного действительно зависит от блокады
волчаночным антикоагулянтом плазменных фосфолипидных мембран, но и позволяет
количественно оценить степень этой блокады. В норме указанные индексы варьируют в
пределах от 0.9 до 1.1, а у больных с АФС - существенно повышены. Соответствующие
ядовые диагностикумы выпускаются в Российской Федерации фирмой "ТехнологияСтандарт" (Барнаул), за рубежом - фирмами "American diagnostica", "Loxo", "Stago" и др.
Некоторые виды АВТ, отличающиеся высокой тромбогенностью [29], вызывают
значительное замедление свертывания и в коагуляционном тесте с разведенным тканевым
тромбопластином. Реагент разводится так, чтобы нормальное протромбиновое время было
в пределах 45-55 с [2, 4, 13, 14, 17, 18]. Это определение также используется в комплексе
диагностических тестов, выявляющих эффекты АВТ. Под влиянием АВТ протромбиновое
время в плазме больного удлиняется по сравнению с эталонной нормальной плазмой в 1,2
раза и более. Однако нужно иметь в виду большое разнообразие выпускаемых разными
фирмами тканевых тромбопластинов - получение их из разных исходных продуктов,
неодинаковую чувствительность к действию АВТ и др. [2]. Поэтому в маркировках фирмпроизводителей должна быть указана возможность использования предлагаемого
разведенного тромбопластина для определения антитромбопластиновой активности АВТ.
Качественно новым этапом в разработке методов диагностики АФС явилось создание в
нашей лаборатории тестов, с помощью которых можно не косвенно, а путем прямого
измерения оценивать степень блокады плазменных фосфолипидных мембран
волчаночными антикоагулянтами [2, 6, 8, 15, 16]. В их основе лежит удаление плазменных
фосфолипидных мембран (ПФМ) в процессе микрофильтрации БТП через фильтр с
диаметром пор 0,2 мкм. Наиболее простой способ, применяющийся для скрининга,
заключается в определении каолинового времени свертывания (КВ) в БТП больного до и
после ее микрофильтрации. Прокоагулянтную активность ПФМ оценивают по формуле,
рассчитанной по калибровочным кривым:
X(%) = 10 3.8(lgtb-lgta)+1 ,
где ta- КВ до микрофильтрации, tb- КВ после микрофильтрации.
Нормальные показания теста приведены в таблице.
Таблица 1.
Прокоагулянтная активность плазменных фосфолипидных мембран у здоровых
людей
Показатели
Х
± SD
±m
Пределы нормальных
колебаний (X±1.5SD)
Каолиновое время, с
87.2
11.8
1.2
69.5-104.9
а) до фильтрации
159.3
23.9
2.4
123.5-195.1
99.8
18.4
1.8
72.2-127.4
б) после фильтрации
Прокоагулянтная активность
ПФМ, %
У больных с АВТ в крови в 83% случаев определяется снижение активности ПФМ в
плазме в среднем до 55% (от 0 до 70%), что обусловлено блокадой их
антифосфолипидными антителами. Вместе с тем, снижение активности ПФМ в плазме
больных может быть связано не только с их инактивацией АВТ, но и вследствие
количественного уменьшения в процессе формирования тромба и в первой фазе ДВСсиндрома [7].
Подтверждающие тесты направлены на исключение наличия в плазме больных других
ингибиторов свертывания крови, не относящихся к АВТ и не связанных с блокирующим
действием последних на прокоагулянтную активность плазменных фосфолипидных
мембран. С этой целью определяют исправляется ли выявленное нарушение
свертываемости крови добавлением к БТП больного нормальной БТП в отношении 1:1
или 0,4:1,0 и таким же добавлением к БТП больного взвеси из тщательно разрушенных
тромбоцитов, содержащих избыток нормальных фосфолипидных мембран. Для этого
может быть использован реагент "тромбоцитин" фирмы "Технология-Стандарт"
(диагностикум "Люпус-тест"), либо приготовленная в собственной лаборатории эмульсия
из тщательно отмытых и затем разрушенных повторным (не менее трех раз)
замораживанием и размораживанием нормальных тромбоцитов. За рубежом (фирмы
Stago, Organon-Teknika и др.) готовятся специальные "подтверждающие" диагностические
наборы, в которые входит наряду с реагентами для выполнения АПТВ, чувствительного к
АВТ, фосфолипидный компонент из разрушенных тромбоцитов, гексагональные
фосфолипиды.
Следует особо подчеркнуть то давно установленное обстоятельство, что АВТ гетерогенны
и отличаются друг от друга по механизму действия на свертывающую систему крови [17]
и у разных больных с АФС нарушены то одни, то другие коагуляционные тесты.
Вследствие этого выявление АВТ ни в коем случае не должно ограничиваться
выполнением лишь одного или части перечисленных выше тестов. Полноценная
диагностика должна базироваться на комплексном использовании всех перечисленных
выше определений, в сочетании с иммунологическим исследованием титра негативно
заряженных мембранных антифосфолипидных антител (АФА и антител к некоторым
связанным с фосфолипидами гликопротеинам, см. ниже).
Алгоритм выявления АВТ в исследуемой плазме представлен на рис.1.
pic.1 (для открытия рисунка нажмите ссылку)
Методы иммунной диагностики
Опыт нашей клиники, как и многочисленные исследования других авторов,
свидетельствует о том, что выявление антифосфолипидных антител (АФА),
принадлежащих к различным классам иммуноглобулинов (с тромбогенностью чаще всего
ассоциируются иммуноглобулины IgG и IgA), должно базироваться не только на
иммуноферментном определении титра антикардиолипиновых антител [11,20], хотя эта
методика наиболее отработана, стандартизирована и достаточно важна, но и с
исследованием других АФА. Так, установлена высокая частота и патогенность при этой
патологии антител к фосфатидилсерину и к связанным с этими фосфолипидами белка бета2ГП-I и аннексину V [13, 20, 23-25]. Особенно же важно, что дополнительное
определение не только антикардиолипиновых, но и других антител к негативно
заряженным фосфолипидам, как свидетельствуют и наши исследования, существенно
увеличивают в комплексе с определением АВТ число диагностируемых случаев АФС [11].
Следует особо подчеркнуть, что высокий уровень антител к мембранным фосфолипидам
отнюдь не является специфической особенностью только АФС, хотя и высоко характерен
для последнего. Поэтому полноценная диагностика этого синдрома и связанной с ним
тромбофилии, упорного невынашивания беременности и других клинических проявлений,
может быть достигнута только путем развернутого исследования как всех эффектов
волчаночных антикоагулянтов, так и важнейших антифосфолипидных антител и их
белковых компонентов. Основные вехи этих исследований приведены в схеме на рис.1.
При АФС часто обнаруживаются также в высоком титре антитела к компонентам
сосудистой стенки (коллагену, эндотелию) и ДНК, нарушается взаимодействие
фосфолипидных мембран с важнейшим антикоагулянтом - протеином С, обнаруживаются
иммунные сдвиги, обусловленные вирусными инфекциями. Выявление этих нарушений
не имеет при данном синдроме диагностического значения, но проливает свет на
некоторые стороны его патогенеза и на механизмы формирования тромбофилического
статуса.
Таким образом, полноценная диагностика АФС должна базироваться на комплексном
исследовании системы гемостаза с определением всех возможных эффектов АВТ и
иммунологическом определении титра антител к отрицательно заряженным
фосфолипидам (кардиолипину, фосфотидилсерину) и к связанным с фосфолипидными
мембранами гликопротеинам. Определение лишь отдельных из указанных параметров и
неполное выполнение тестов, выявляющих АВТ, не может считаться достаточным для
постановки диагноза (рис. 2).
Рис.2. Выявление высокого уровня АФА в сыворотке крови больных с волчаночным
антикоагулянтом (1-антитела к фосфатидилсерину IgM, 2 - антитела к фосфатидил-серину
IgG, 3 - антитела к кардиолипину IgM, 4 - антитела к кардиолипину IgG ).
Литература
1. Баркаган З.С. // Проблемы гематол. и перелив. крови. - 1996. - №3. - С.5-15.
2. Баркаган З.С., Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М., Ньюдиамед,
1999. - 217с.
3. Баркаган З.С., Сердюк Г.В. // Гематол. и трансфузиол. - 1991. - №4. - C.3-5.
4. Баркаган З.С., Сердюк Г.В., Дорохов А.Е. // Тезисы IV Всесоюзного съезда
ревматологов. - Минск, 1991. - С.54.
5. Баркаган З.С., Цывкина Л.П., Цеймах И.Я.// Способ диагностики антифосфолипидного
синдрома: Патент на изобретение №2104550 от 10/2 1998. РФ.
6. Мамаев А.H. Прокоагулянтная активность плазменных фосфолипидных мембран при
тромбофилиях: Автореф. канд. дисс. -Барнаул, 1997. - 20 с.
7. Момот А.П., Бишевский К.М., Мамаев А.Н., Бaркaгaн З.С. // В кн: Сборник научных
трудов Российской конференции "Актуальные вопросы службы крови и
трансфузиологии". - С-Петербург, 1995. - С.126-127.
8. Момот А.П., Баркаган З.С., Мамаев А.Н., Бишевский К.М. // Клиническая лабораторная
диагностика. - №8. - 1997. - С.20-22.
9. Насонов Е.Л., Алекберова З.С., Калашникова Л.А. и др. // Клин.мед. - 1988. - №2. - С.4.
10. Саенко В.А., Ротт Г.М., Поверенный А.М. // Бюлл. экспер. биол. мед. - 1989.-№2. С.217-219.
11. Селиванов Е.В. Иммунные нарушения и особенности лабораторной диагностики
антифосфолипидного синдрома: Автореф. канд. дисс. -Барнаул, 1998. - 33 с.
12. Цывкина Л.П. Клинико-диагностическое значение герпетотоксинов в распознавании
основных видов патологии системы гемостаза: Автореф. докт. дисс. - Барнаул, 1997. - 35
с.
13. Amiral J., Larrivar J., Clureau D. et al. // Haemostasis, 1994. - Vol.24. - P.191-203.
14. Arnout J., Vanrusselt M., Huybrechts E. et al. // Br. J. Haematol. - 1994. - Vol.84. - P.94-99.
15. Barkagan Z.S., Momot A.P., Mamaev A.N. // In:14 th International Congress on Thrombosis.
Montpellier. - 1996. - Abstr. 51. - P.342.
16. Barkagan Z.S., Mamaev A.N., Momot A.P., Ceimah I. // In: XIIIth Meeting of the
International Society of Haematology. Istambul.- 1995. - P.945.
17. Brandt J.T., Barna L.K., Triplet D.A. // Thromb.Haemost. - 1995. -Vol.74. - №6. - P.15971603.
18. Brandt J.T., Triplet D.A., Alving B., Scharrer I. //Thromb.Haemost. - 1995. - Vol.74. - №4. P.1185-1190.
19. Cohen J., Bakimer R., Blank M. et al. // Clin. Exp. Immunol., 1994.-Vol.97. - №2. - P.181186.
20. Eschwedel V., Toti F., Grunebaschki L. et al. // Thromb. Haemost. - 1993. - Vol.69. - №6. P.121.
21. Exner T., Sochynsky C.L. // Thromb. Haemost. - 1993. - Vol.69. - №6. - P.1034.
22. Lindhoff-Last E., Bauersach S.R., Mosch G. et al. // Ann. Hematol. - 1997. - Vol.74. Suppl.2. - Abstr.142. - P.94.
23. McNeil P.H. Simpson R.J. Chesterman C.N. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1990. - Vol.87. P.4120-4124.
24. Oosting J.D., Derksen R.H.W.M., Entjes H.T. et al. // Thromb. Haemost. -1992. - Vol.67. P.499-503.
25. Staub H.L., Harris E.N., Khamashta M.A. et al. // Ann. Rheum. Dis. - 1989. - Vol.48. - №2. P.166-169.
26. The antiphospholipid syndrome /Eds. Asherson R.A., Cervera R., Piette J., Shoenfeld Y. New York:CRC Press. - Rota Raton. - 1996. - 339 p.
27. Triplett D.A., Stocker K.F., Unger G.A. et al. // Thromb. Haemost. - 1993. - Vol.69. - №6. P.1222.
28. Triplett D.A., Stocker K.F., Unger G.A., Barna L.K. // Thromb. Haemost. -1993. - Vol.70. P.925-931.
29. Wijns W., Daoud N., Droeshout P., Capel P. // Thromb. Haemost. -1993. - Vol.69. - №6. P.1034-1039.