УДК 616-002.5:576.8.77.3 АНАЛИТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗНОЙ БИОЦИДНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ ПРИ ТУБЕРКУЛЕЗЕ ЖЕНСКИХ ГЕНИТАЛИЙ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ АКТИВНОСТИ Гучетль Е.В., Колесникова Н .В., Дорошенкова А .Е., Пономарева Л.П. Кубанская государственная медицинская акдемия, Краснодар ГУЗ «Клинический противотуберкулезный диспансер» департамента здравоохранения Краснодарского края, главный врач Брагина В.В. ТЕЗИСЫ Биоцидность, или способность к уничтожению живых объектов, является итоговым феноменом, в котором сфокусированы практически все звенья эффекторного потенциала НГ – рецепция, адгезия, хемотаксис, поглощение и образование фаголизосом, секреторная дегрануляция, метаболический взрыв. Участие НГ в противотуберкулезном иммунитете сегодня не вызывает сомнений [8]. При этом основные дефекты НГ связаны со снижением показателей адгезии и фагоцитоза [3], содержания неферментных катионных белков и оксидазной биоцидности клеток [7]. Между тем данных о зависимости показателей микробицидных систем НГ у больных с туберкулезом женских гениталий от уровня активности процесса в доступной нам литературе не обнаружено, что и побудило провести таковые исследования с учетом дополнительной антигенной нагрузки in vivo в виде пробы Манту. Оценка кислород-зависимой биоцидности НГ у больных туберкулезом женских гениталий- ТЖГ разной степени активности была проведена с помощью классического NBT-теста, где в качестве дополнительной антигенной нагрузки в стимулированном его варианте были использован туберкулин. Анализируя полученные данные в целом, следует заключить, что при туберкулезе женских гениталий наблюдаются выраженные депрессивные изменения фагоцитарной функции НГ как на системном, так и на местном уровне, что отличает состояние таковой от показателей фагоцитоза при ХНЗГ. Одновременно при туберкулезе женских гениталий и неспецифических хронических заболеваниях женской репродуктивной системы имеют место выраженные изменения показателей оксидазной биоцидности НГ на местном и системном уровне, зависимые от активности туберкулезного процесса и дополнительной антигенной нагрузки туберкулином как in vitro (стимулированный NBT-тест), так и in vivo (проба Манту). Снижение активности туберкулезного процесса в женской репродуктивной системе сопровождается более выраженной, чем при АТЖГ депрессией %ФПК, особенно на местном уровне, с отсутствием адекватного реагирования на нагрузку туберкулином in vitro, следствием чего является более значительное, чем при активном туберкулезном процессе снижение величины КМ перитонеальных и циркулирующих в крови НГ. Соответствующий характер носят изменения оксидазной биоцидности НГ после постановки пробы Манту: истощенность показателей данной функции является более глубокой как на местном, так и на системном уровне. Это позволяет считать наблюдаемые изменения при НТЖГ наиболее неблагоприятными в отношении противоинфекционной защиты, а показатели спонтанного и стимулированного NBT-теста считать диагностически- и прогностически-значимыми ее маркерами. Первыми клетками, которые сталкиваются с M.tuberculosis являются фагоциты и от их активности зависит эффективность элиминации возбудителя. Вирулентность микобактерий является вторым важнейшим фактором, определяющим результат взаимодействия «микроб – хозяин», как развитие клинически выраженной инфекции или бессимптомного носительства. При этом большое значение имеет свойство микроорганизма сохранять жизнеспособность внутри фагоцитов. Биоцидность, или способность к уничтожению живых объектов, является итоговым феноменом, в котором сфокусированы практически все звенья эффекторного потенциала НГ – рецепция, адгезия, хемотаксис, поглощение и образование фаголизосом, секреторная дегрануляция, метаболический взрыв. Известно [3], что у пациентов с первично выявленным туберкулезом легких (длительность заболевания – менее года) имеет место достоверное снижение показателей адгезии и фагоцитоза, тогда как у больных с более давним сроком начала болезни, находящихся на длительном патогенетическом лечении, парметры адгезии и фагоцитоза находятся в пределах нормы Наряду с этим, доказано [4], что у тубинфицированных детей резко снижается процент активно-фагоцитирующих клеток на фоне сохранения их поглотительной способности Принимая во внимание факт, что НГ вносят существенный вклад в механизмы иммунобиологической реакции по ограничению и подавлению микробной инфекции, необходимо учитывать их функциональную активность при разработке иммунореабилитационных программ у данной категории больных. При этом большой интерес представляет оценка фагоцитарной функции НГ периферической крови и местых очагов воспаления при внелегочном туберкулезе различной степени активности. Известно, что нейтрофильные гранулоциты (НГ) периферической крови в период обострения хронических инфекций характеризуются различными дисфункциями, которые чаще всего представлены нарушениями фагоцитарной активности и способности к киллингу и перевариванию бактериальных антигенов [4,5,10,11]. Это приводит к персистенции бактериальной инфекции, нарушению элиминации антигенов и иммунных комплексов, в свою очередь, отягощающих течение основного процесса, ухудшающих прогноз заболевания и индуцирующих формы заболеваний, резистентных к традиционной терапии [1,2,6,9]. Участие НГ в противотуберкулезном иммунитете сегодня не вызывает сомнений [8]. При этом основные дефекты НГ связаны со снижением показателей адгезии и фагоцитоза [3], содержания неферментных катионных белков и оксидазной биоцидности клеток [7]. Между тем данных о зависимости показателей микробицидных систем НГ у больных с туберкулезом женских гениталий от уровня активности процесса в доступной нам литературе не обнаружено, что и побудило провести таковые исследования с учетом дополнительной антигенной нагрузки in vivo в виде пробы Манту. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.1 Характеристика исследуемого контингента Для реализации цели настоящего исследования обследовано 67 больных туберкулезом женских половых органов, 32 больных хроническими неспецифическими заболеваниями женских половых органов поступивших в ГУЗ «Клинический противотуберкулезный диспансер» департамента здравоохранения Краснодарского края (КПТД) с 1995 по 2002 гг. и 55 практически здоровых лиц. Больные были разделены на 3 подгруппы: «а» - составили пациенты с активным туберкулезом (АТЖГ), «б» - с неактивным туберкулезом (НТЖГ), «в» – с неспецифическими заболеваниями женских гениталий (ХНЗЖГ). У всех больных заболевание выявлено впервые. Таблица 1.1. Распределение больных по характеру процесса и возрасту Группа Возраст в годах Всего До 25 лет 26-40 лет Старше 40 1а АТЖГ 14(43,8%) 13(40,6%) 5(15,6%) 32 1 б НТЖГ 7(20%) 14(40%) 14(40%) 35 1 в ХНЗЖГ 7(21,8% 11(34,4%) 14(43,8%) 32 Все пациенты прошли унифицированное обследование. Проведен анализ жалоб и анамнестических данных, общеклинического, иммунологического рентгенологического обследования (рентгенография грудной клетки, гистеросальпингография), бактериологического, молекулярно-генетического (ПЦР), морфологического исследования крови и перитонеальной жидкости Дугласова пространства. Группа Количество больных(чел.) СОЭ> 15 мм/час Лейко циты>10х109/л АТЖГ 32 (100%) 11 (34,4%) 3 (9,4%) Таблица.1.2 Клинико-лабораторная характеристика больных НТЖГ ХНЗГ 35 32 (100%) (100%) 3 (8,6%) 1 (2,9%) 3 (9,4%) 1 (3,1%) Лимфоциты <20% Лимфоциты >40% Моноциты >8% Эозинофилы >4% Проба Манту нормергия Проба Манту гиперэргия Проба Манту отрицательная МБТ бактериология МБТ 2 (6,2%) 2 (5,1%) 1 (3,1%) 12 (38,5% 3 (8,6%) 1 (3,1%) 7 (21,9%) 1 (2,9%) 1 (3,1%) 1 (3,1%) 1 (2,9%) 1 (3,1%) 25 0 0 (78,1%) 2 (6,2%) 0 0 5 (15,6%) 35 (100%) 32 8 (25%) 21 (65,6%) 0 (100%) 0 4 (11,4%) 1 (3,1%) ПЦР Клиническая оценка больных с заболеваниями женских гениталий показала, что жалобы на боли предъявляли больные всех подгрупп, но чаще пациентки с АТЖГ. Бесплодие наблюдалось у больных всех подгрупп с одинаковой частотой(78,1%-94,2%). Нарушение менструального цикла фиксировалось как у больных туберкулезом, так и у пациенток с ХНЗЖГ. Таблица 1.3 Частота основных жалоб больных туберкулезом женских гениталий Группы Форма заболевания женских половых органов Частота основных жалоб (количество больных) Боли Бесплодие (количество (количество больных) больных) 1а АТЖГ 22(68,7%) 25(78,1%) Нарушение цикла (количество больных) 19(59,4%) 1б НТЖГ 17(48,6%) 33(94,2%) 9(25,7%) 35 1в ХНЗЖГ 14(43,8%) 28(87,5%) 11(34,3%) 32 Всего больных 32 При этом у больных с АТЖГ была яркая клиническая картина с симптомами интоксикации различной степени выраженности (слабость, потливость, повышение температуры тела, снижение аппетита и т.д.), наблюдаемыми у 17 больных(53,1%). Методом посева обнаружены МБТ у 8(25%) женщин, методом ПЦР – у 21(65,6%). С момента появления первых признаков заболевания до поступления больных в стационар прошло от 3 до 18 месяцев. В детстве по поводу виража туберкулиновых проб в противотуберкулезных диспансерах наблюдались 12,5% больных (4 женщины). У 16(50%) пациенток диагноз установлен по клинико-рентгенологическим признакам, а у 14(43,7%) - диагноз верифицирован на основании морфологического исследования. Морфологическое изучение (Таблица 1.4) крови позволило у 19 (59,4%) женщин определить изменения, указывающие на активность специфического процесса. В частности повышение СОЭ (>15 мм/час) найдено у 11(34,4% ) больных, лейкоцитоз (> 10 000\мкл) – у 3 (9,4% ), лимфопения (< 20%) – у 2 (6,2% ), лимфоцитоз (> 40%) – у 12 (38,5% ), моноцитоз (> 8%) – у 7(21,9% ), эозинофилия (> 4%) – у 1 (3,1% ). Форма заболе вания АТЖГ НТЖГ ХНЗГ Конт роль СОЭ мм/час Таблица 1.4 Показатели лейкограммы у больных с туберкулезом женских гениталий Нейтрофилы ЛимфоцитыМоноциты Эозинофилы Лейкоциты(109/л) % % % % 15,00±4,0 14,00±1,0 16,00±2,0* 12,00±2,0 7,00±4,8 7,10±5,2 6,50±3,4 6,00±2,2 45,60±2,02* 54,20±3,9 51,10±1,4 65,5±5,0 45,8±1,43 36,5±3,37 35,4±2,5* 44,0±2,9 6,5±1,5* 6,0±2,0 5,5±2,0 4,0±1,0 1,5±1,0 1,4±0,7 1,5±2,0 1,7±0,25 Примечание:*- различие достоверно по сравнению с ХНЗГ при (p<0,05) Ú-различие достоверно по сравнению между группами больных туберкулезом при (p<0,05) Как следует из приведенных данных, наиболее часто изменялись СОЭ, количество лейкоцитов и лимфоцитов. В то же время у 6 (28,1% ) больных гематологические показатели оставались в пределах нормы. Специфическую аллергическую реакцию определяли пробой Манту с 2ТЕ с оценкой реакции согласно инструкции по применению туберкулиновых проб. При этом у 25 (78,1% ) больных реакция оказалась нормергической ( папула от 5 до 20 мм), у 2 (6,2%) имели гиперергические проявления, а у 5 пациенток (15,6% ) – проба Манту была отрицательной. При сравнении данных гистеросальпингограмм отмечено, что проходимость маточных труб с их незначительной деформацией в ампулярном отделе сохранялась у 11 (34,4%) больных активным туберкулезом гениталий, причем характерные рентгенологические признаки зафиксированы у 7(21,9%) больных. У 35 женщин выявлен неактивный туберкулез женских гениталий: диагноз подтвержден патогистологически, МБТ методом посева не были выявлены, а методом ПЦР - обнаружены у 4(11,4%). Длительность заболевания у 4 обследованных составила более 10 лет, у 16 – более 5 лет, а у 15 - от 3 до 5 лет. В детстве по поводу виража туберкулиновых проб в противотуберкулезных диспансерах наблюдались 2 женщины (5,7%). Морфологическое исследование крови выявило следующее: повышение СОЭ (>15 мм/час) - у 3(8,6% ) больных, лейкоцитоз (> 10 000\мкл) – у 1( 2,9% ), лимфопению (< 20%) – у 2 (5,1% ), лимфоцитоз (> 40%) – у 3 (8,6% ), моноцитоз (> 8%) – у 1(2,9% ), эозинофилию (> 4%) – у 1 пациентки (2,9% ). При сравнении данных гистеросальпингограмм отмечено, что проходимость маточных труб с их незначительной деформацией в ампулярном отделе сохранялась у 7(14,3%) больных с неактивным туберкулезом гениталий. Характерные рентгенологические признаки зафиксированы у 11(31,4%) больных неактивным туберкулезом гениталий. 1.2. Методы исследования Оценка кислород-зависимой биоцидности НГ у больных туберкулезом женских гениталий- ТЖГ разной степени активности была проведена с помощью классического NBT-теста, где в качестве дополнительной антигенной нагрузки в стимулированном его варианте были использован туберкулин. При этом как в спонтанном, так и в стимулированном тесте определяли процентное содержание формазан-позитивных клеток (%ФПКсп., %ФПКст.), и рассчитывали коэффициент мобилизации (КМ) по отношению %ФПК в стимулированном и спонтанном NBT-тесте. Исследовались нейтрофилы крови и перитонеальной жидкости Дугласова пространства. Перитонеальные макрофаги получали из перитонеальной жидкости Дугласова пространства. С этой целью пробирки с ПЖДП центрифугировали при 2,500 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость убирали, а к осадку добавляли 1 мл среды 199 и осторожно ресуспендировали. Количество клеточных элементов подсчитывали в камере Горяева. 1.2.1 Реакция бактериального фагоцитоза нейтрофилов сопределением степени завершенности (Нестерова И.В., 1996) Каплю капилярной крови из пальца наносили на середину хорошо обезжиренного стекла, добавляли 10 мкл гепарина, и 10 мкл микробной взвеси Candida albicans на физрастворе. Инкубировали в термостате во влажной камере в течение 120 минут при 37°С. Мазки сушили, фиксировали в метаноле в течение 5 минут и окрашивали по Романовскому в течение 5-10 минут. Промывали в дистиллированной воде, сушили, микроскопировали под иммерсией в световом микроскопе. При этом оценивали поглотительную способность и переваривающую функцию фагоцитов. Определялись следующие показатели: - процент фагоцитоза – процент НГ, поглотивших микробы (%ФАН), из общего числа посчитанных нейтрофилов; - фагоцитарное число (ФЧ) – среднее число фагоцитированных микробов, приходящееся на 1 «активный» НГ (ФАН); - фагоцитарный интегральный индекс (ФИ) – среднее число фагоцитированных микробов, деленное на 100 НГ. - индекс переваривания (ИП) = Муб Ф (среднее число убитых микробов на 1 посчитанный НГ). 1.2.2 Оценка активности оксидазной микробицидной системы нейтрофилов 1.2.2.1 Спонтанный NBT-тест (Нестерова И.В. и соавт., 1996) На середину хорошо обезжиренного предметного стекла помещали каплю крови в ЭДТА, добавляли 10 мкл гепарина (2 ед), затем добавляли 10 мкл физраствора и 10 мкл 0,1% раствора NBT. Мазок инкубировали в термостате при 37˚С в течение 15 минут. Излишек крови осторожно удаляли наклоном стекла под 45˚, фиксировали в метаноле в течение 2 минут, подсушивали и докрашивали ядра 0,5% раствором нейтрального красного. Подсчитывали клетки с восстановленным формазаном (% формазан позитивных клеток %ФПК) по принципу Kaplow L.S. (1955). Рассчитывали средний цитохимический индекс (СЦИ): СЦИ =- 1а + 2b + 3c + 4d %ФПК= b+c+d 100 где a, b, c, d -количество НГ соответственно 1, 2, 3, 4 степени Оценка микробицидной системы нейтрофильных гранулоцитов в 1.2.2.2 нагрузочных тестах in vitro (стимулированный NBT-тест) На середину двух хорошо обезжиренных предметных стекол помещали каплю биожидкости, добавляли 10 мкл гепарина (2 ед.), затем в NBT-стимулированный тест добавляли туберкулин и 10 мкл 0.1% раствора нитросинего тетразолия. Нужное разведение готовили из сухого очищенного туберкулина следующим образом: содержимое ампулы с препаратом разводили 1 мл растворителя, получали основной раствор туберкулина, содержащий в 1 мл 50000 ТЕ. Первое разведение туберкулина, соответствующее 10000 ТЕ в 1мл готовят путем разведения основного раствора в 4 мл растворителя. Второе разведение туберкулина готовили путем разведения первого в 10 раз, т.е. к 1 мл первого разведения прибавляли 9 мл растворителя, в итоге 1000 ТЕ в 1мл (100 ТЕ в 0,1 мл). получали А в NВТ-спонтанный - 10 мкл физраствора и 10 мкл0,1% раствора NВТ. Оба мазка инкубируются в термостате при 37°С в течение 15 минут. Излишек биожидкости осторожно удаляли наклоном стекла под 45° и на предметных стеклах оставался микролейкоконцентрат, ограниченный хорошо видимыми контурами капли. Мазки фиксировали в метаноле в течение 1 минуты. Подсушивали и докрашивали ядра 0,5% раствором нейтрального красного. Подсчитывали клетки с восстановленным формазаном (% формазан позитивных клеток - %ФПК) по принципу Kaplow L.S. (1955). Расчитывали средний цитохимический индекс (СЦИ) и коэффициент мобилизации (КМ): СЦИ =- 1а + 2b + 3c + 4d %ФПК= b+c+d 100 где a, b, c, d -количество НГ соответственно 1, 2, 3, 4 степени, КМ = % формазан-позитивных НГ в стимулированном NBT % формазан-позитивных НГ в спонтанном NBT или КМ(СЦИ) = СЦИ NBTстимулированного СЦИ NBTспонтанного 2.1 Результаты исследования 2.1.1 Фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов крови при туберкулезе женской репродуктивной системы Таблица 2.1.1 Фагоцитарная активность и переваривающая способность НГ периферической крови при туберкулезе женских гениталий разной степени активности (М±м,р) Группа %ФАН ФИ ФЧ ИП АТЖГ 24,40±2,06 0,36±0,03 1,45±0,04 1,20±0,05 р1<0,05 p1<0,001 p1<0,001 p1<0,001 p2<0,01 21,46±1,20 0,32±0,02 1,46±0,06 1,18±0,04 p1<0,001 p1<0,001 p1<0,001 р1<0,001 p2<0,01 35,20±0,50 34,50±3,60 1,85±0,02 1,90±0,08 5,50±0,05 5,50±0,04 р2<0,001 1,50±0,05 1,50±0,04 НТЖГ ХНЗГ Контроль Примечание: P1 – достоверность различий с контролем; Р2 – достоверность различий с ХНЗП; Р3 – достоверность различий между группами больных МПТ Проведенными исследованиями установлено (Таблица 2.1.1), что при туберкулезе женских гениталий относительно практически здоровых лиц имеет место достоверное подавление относительного содержания активно-фагоцитирующих клеток. Рис.2.1.1 Относительно содержание активных фагоцитов при туберкулезе женских гениталий разной степени активности АТЖГ – активный туберкулез НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий женских гениталий ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий Контроль – практически здоровые лица Причем наиболее выраженное – при неактивном туберкулезном процессе (в 1,4 раза). В то же время при хронических неспецифических заболеваниях гениталий этот показатель не отличается от такового в контроле. Однако снижение ИП было менее значительно, хотя и достоверно снижено (р<0,05) у больных ТЖГ по отношению к сравниваемым группам. Несмотря на то, что при АТЖГ исследуемые показатели были выше, чем при НТЖГ, отсутствие достоверных различий между ними не позволяет использовать их в качестве критериев активности туберкулезного процесса. Однако их оценка имеет диагностическое значение при дифференцировании заболеваний женской репродуктивной системы воспалительного или туберкулезного характера(Рис.2.1.1). Рис.2.1.2 Поглотительная способность (ФИ,ФЧ) и переваривающая активность (ИП) НГ при туберкулезе женских гениталий разной степени активности АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий Контроль – практически здоровые лица Сходный характер изменений отмечен и в отношении показателей поглощения и переваривания бактериального антигена (БАГ). В частности, наблюдалось 5-ти кратное снижение величины ФИ и почти 4-х кратное - ФЧ при АТЖГ и НТЖГ относительно ХНЗГ и контроля(Рис.2.1.2). После пробы Манту (Таблица 2.1.1.1) при активном и неактивном женских гениталий уменьшается % активно-фагоцитирующих клеток (%Ф), по сравнению с контрольными показателями, при активном туберкулезе в 1,6 раза, при неактивном – в 2 раза (23,20±1,20 против 48,90±2,45). Таблица 2.1.1.1 Влияние пробы Манту фагоцитарнуюя активность и переваривающую способность НГ крови у больных туберкулезом женских гениталий (М±м,р) Показатели Группа %ФАН АТЖГ Показатели до пробы Манту ФИ ФЧ 24,40±2,06 0,36±0,03 1,45±0,04 р1<0,05 p1<0,001 p1<0,001 p2<0,01 %ФАН после пробы Манту ФИ ФЧ 29,9±2,30 0,54±0,06 1,45±0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 НТЖГ 21,46±1,20 0,32±0,02 1,46±0,06 p1<0,001 p1<0,001 p1<0,001 p2<0,01 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p3<0,05 23,20±1,20 p3<0,05 0,33±0,02 1,46±0,02 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p3<0,05 p3<0,05 1,86±0,05 4,58±0,05 р1<0,05 2,00±0,03 р1<0,05 4,08±0,05 ХНЗГ 35,20±0,50 1,85±0,02 5,50±0,05 p3<0,05 40,30±0,20 Контроль 34,50±3,60 1,90±0,08 5,50±0,04 р1<0,05 48,90±2,45 Примечание: P1 – достоверность различий с контролем Р2 – достоверность различий с ХНЗГ Р3 – достоверность различий между группами Сходный характер изменений отмечен и в отношении показателей поглощения и переваривания бактериального антигена (БАГ). В частности, наблюдалось 4-х кратное снижение величины ФИ и почти 3-х кратное - ФЧ при АТЖГ относительно ХНЗГ и контроля. Однако снижение ИП было менее значительно, хотя и достоверно снижено (р<0,05) у больных ТЖГ по отношению к сравниваемым группам (Таблица 2.2.2) После пробы Манту по сравнению с исходными показателями при АТЖГ % активно-фагоцитирующих клеток (%Ф) возрос на 22%, при НТЖГ – на 8 %, при ХНЗГ на 14%, в то же время как контроле возрос на 41%. ФИ увеличился на 50% при АТЖГ, на 3% при НТЖГ. В контроле и при ХНЗГ он практически не изменился. . ФЧ увеличилось на 35% при АТЖГ, на 6% при НТЖГ. При ХНЗГ оно уменьшилось до 83,2%. 2.2.1 Фагоцитарная активность перитонеальных нейтрофилов больных с туберкулезом женских гениталий Между тем исследование показателей фагоцитарной функции НГ при ХНЗГ и ТЖГ на местном уровне позволила определить некоторые критерии степени активности туберкулезного процесса (Рис.2.2.1.1). Рис.2.2.1.1Относительно содержание активных фагоцитов перитонеальной жидкости при туберкулезе женских гениталий разной степени активности АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий Контроль – практически здоровые лица Во всяком случае, на это указывает достоверно более низкий %ФАН не только в сравнении с контролем и ХНЗГ, но и по отношению к НТЖГ (17,10±0,03 против 20,00±0,05 при НТЖГ и против 33,80±2,60 – в контроле). При ХНЗГ данный показатель также имел достоверные отличия от такового у женщин с ТЖГ, однако по отношению к контролю наблюдалась лишь тенденция к снижению количества активных фагоцитов (32,00±1,50). Обращает на себя внимание также более глубокая депрессия ФИ нейтрофилов перитонеальной жидкости при НТЖГ (0,38±0,03) в сравнении с активным туберкулезным процессом (0,51±0,04), тогда как ФЧ оказывается достоверно более Рис.2.2.1.2 Поглотительная способность (ФИ,ФЧ) и переваривающая активность (ИП) НГ перитонеальной жидкости при туберкулезе гениталий разной степени активности женских АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий Контроль – практически здоровые лица высоким при АТЖГ (2,98±0,03 против 1,90±0,04 при НТЖГ) (Рис.2.1.2). Между тем показатели поглощения БАГ при ХНЗГ достоверно не отличались от контроля, имея лишь незначительную тенденцию к снижению, что коррелировало со сходной картиной изменений в периферической крови. Переваривающая способность клеток, как и у НГ периферической крови, была угнетена в меньшей степени, чем поглотительная, однако достоверно отличалась от таковой в группе с ХНЗГ и практически здоровых лиц. Анализируя полученные данные в целом, следует заключить, что при туберкулезе женских гениталий наблюдаются выраженные депрессивные изменения фагоцитарной функции НГ как на системном, так и на местном уровне, что отличает состояние таковой от показателей фагоцитоза при ХНЗГ. При этом для НГ периферической крови больных ТЖГ характерна тенденция к более выраженному снижению %ФАН, ФИ и ИП, а для НГ перитонеальной жидкости – достоверное снижение %ФАН, прямо коррелирующее с усилением активности туберкулезного процесса. После пробы Манту при активном и неактивном женских гениталий уменьшается % активно-фагоцитирующих клеток (%Ф), по сравнению с контрольными показателями, при активном туберкулезе в 1,6 раза, при неактивном – в 2 раза (23,20±1,20 против 48,90±2,45). Таблица 2.2.2 Влияние пробы Манту фагоцитарную активность и переваривающую способность перитонеальных НГ у больных туберкулезом женских гениталий (М±м,р) Показатели Группа %ФАН АТЖГ Показатели до пробы Манту ФИ ФЧ 17,10±0,06 0,51±0,03 2,98±0,04 р1<0,05 p1<0,001 p1<0,001 p2<0,01 НТЖГ 20,00±0,02 0,38±0,02 1,90±0,06 p1<0,001 p1<0,001 p1<0,001 p2<0,01 ХНЗГ Контроль 32,00±1,50 33,80±2,60 2,00±0,02 2,20±0,08 6,25±0,05 6,75±0,04 %ФАН после пробы Манту ФИ ФЧ 28,20±0,03 0,59±0,06 2,34±0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p3<0,05 22,40±0,05 p3<0,05 0,36±0,02 1,61±0,02 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p3<0,05 p3<0,05 29,90±2,20 p3<0,05 0,54±0,05 1,96±0,15 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 39,90±2,45 1,40±0,03 3,50±0,15 Примечание: P1 – достоверность различий с контролем Р2 – достоверность различий с ХНЗГ Р3 – достоверность различий между группами ТГ Сходный характер изменений отмечен и в отношении показателей поглощения и переваривания бактериального антигена (БАГ). В частности, наблюдалось 4-х кратное снижение величины ФИ и почти 3-х кратное - ФЧ при АТЖГ относительно ХНЗГ и контроля. Однако снижение ИП было менее значительно, хотя и достоверно снижено (р<0,05) у больных ТЖГ по отношению к сравниваемым группам (Таблица 2.2.2). После пробы Манту по сравнению с исходными показателями при АТЖГ % активно-фагоцитирующих клеток (%Ф) возрос на 47%, при НТЖГ – на 12 %, при ХНЗГ на 21%, в то же время как контроле возрос на 18%. ФИ увеличился на 15% при АТЖГ, при НТЖГ уменьшился на 6%. В контроле он составил 63,6% и при ХНЗГ он практически не изменился. ФЧ уменьшилось на 22% при АТЖГ, на 16 % при НТЖГ. При ХНЗГ оно уменьшилось до 87,4% в контроле уменьшилось до 52%. 3.1.1 Кислород-зависимый метаболизм нейтрофилов периферической крови больных с туберкулезом женских гениталий Анализ результатов оценки оксидазной биоцидности НГ периферической крови в спонтанном NBT-тесте показал (Рис.3.1), что при активном туберкулезе женских гениталий (АТЖГ) достоверно увеличивается %ФПК (3,90±0,70 против 2,00±0,50 у практически здоровых лиц). Данные изменения носят специфический для активного туберкулезного процесса характер, поскольку при хронических неспецифических заболеваниях гениталий (ХНЗГ) процентное содержание ФПК не отличалось от контроля (2,10±0,30), а при неактивной форме заболевания (НТЖГ) отмечается лишь незначительная тенденция к увеличению %ФПК (2,25±0,30). При дополнительной антигенной нагрузке туберкулином in vitro адекватный контрольному ответ оксидазной биоцидной системы отмечается лишь при ХНЗГ (%ФПК=8,70±0,30 против 9,1±0,50 в контроле), тогда как при ТЖГ имеет место недостаточное возрастание %ФПКст., обуславливающее снижение величины КМ, наиболее выраженное – при НТЖГ (1,25±0,30 против 3,00±0,05 в контроле). Дефекты оксидазной биоцидности НГ при ТЖГ особенно отчетливо прослеживаются при сравнении полученных данных NBT-теста с таковыми после пробы Манту (Таблица 2.1). В частности, показано, что у здоровых лиц туберкулиновая проба вызывает достоверное 4-х кратное возрастание %ФПК Рис.3.1 Показатели NBT-теста нейтрофилов периферической крови при туберкулезе женских гениталий разной степени активности АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий Контроль – практически здоровые лица в спонтанном тесте и 6-ти кратное – в стимулированном с сохранением адекватного реагирования на туберкулин in vitro, о чем свидетельствует величина КМ (2,18 ±0,03). Между тем при ТЖГ наблюдается лишь 1,5-кратное возрастание %ФПК как в спонтанном, так и в стимулированном NBT-тесте с соответствующей выраженной депрессией величины КМ (0,85±0,20). При НТЖГ имело место не только более низкий, чем при АТЖГ, процент ФПК в спонтанном тесте, но и его дальнейшее снижение при дополнительной антигенной нагрузке in vitro c достоверным снижением величины КМ (0,95±0,10). Таблица 3.1 Влияние пробы Манту на оксидазную биоцидность нейтрофилов периферической крови у больных туберкулезом женских гениталий (М±м,р) Группа Показатели NBT-теста %ФПКсп до пробы Манту %ФПКст. КМ Показатели NBT-теста после пробы Манту %ФПКсп %ФПКст. КМ АТЖГ 3,90±0,70 4,50±0,60 1,90±0,70 5,70±0,50 5,10±0,50 0,85±0,20 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,001 р1<0,001 р1<0,001 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,001 p2<0,001 p3<0,05 2,25±0,30 p3<0,05 2,80±0,50 1,25±0,30 p3<0,05 4,25±0,40 3,90±0,50 p3<0,001 1,95±0,10 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 p3<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 ХНЗГ p3<0,05 2,10±0,30 p3<0,05 8,70±0,30 2,10±0,30 p3<0,05 2,80±0,25 11,20±0,20 1,88±0,30 Котроль 2,00±0,50 9,10±0,50 р1<0,01 3,00±0,05 р1<0,001 8,20±0,45 р1<0,05 12,40±0,30 р1<0,05 2,18±0,03 НТЖГ Примечание :P1 – достоверность различий с контролем Р2 – достоверность различий с ХНЗГ Р3 – достоверность различий между группами больных ТЖГ Отличительной особенностью НГ больных с ХНЗГ после пробы Манту явилось максимально низкое значение %ФПК в спонтанном тесте (в 6 раз более низкое, чем в контроле). Однако при этом сохраняется адекватное реагирование показателей оксидазной биоцидности на дополнительную антигенную нагрузку туберкулином in vitro, о чем свидетельствует величина КМ в данной группе больных, соответствующая таковой в диапазоне контроля (1,88±0,30). 3.2 Кислород-зависимый метаболизм перитонеальных нейтрофилов больных с туберкулезом женских гениталий Анализ полученных результатов исследования оксидазной биоцидности перитонеальных НГ свидетельствует о наличии достоверных изменений показателей спонтанного и стимулированного NBT-теста при его постановке до и после пробы Манту. В частности установлено (Рис.3.2), что при АТЖГ имеет место достоверное (р<0,05) возрастание %ФПК в перитонеальной жидкости (5,10±0,05), что в среднем в два раза превышает уровень такового в Рис.3.2 Показатели NBT-теста перитонеальных нейтрофилов при туберкулезе женских гениталий разной степени активности АТЖГ – активный туберкулез женских гениталий НТЖГ - неактивный туберкулез женских гениталий ХНЗГ – хронические неспецифические заболевания женских гениталий Контроль – практически здоровые лица группе с НТЖГ (2,50±0,06), ХНЗГ (2,10±0,30) и у здоровых лиц (2,80±0,40). Дополнительная нагрузка туберкулином in vitro позволила выявить адекватное увеличение процента клеток, содержащих формазан, лишь в контрольной группе (10,10±0,20) и при хронической неспецифической патологии гениталий (7,70±0,20), тогда как при ТЖГ отмечалось достоверное по отношению к контролю снижение %ФПКст. при АТЖГ (6,50±0,60) и более значительное – при НТЖГ (2,80±0,50). Такой характер изменений %ФПК в стимулированном NBT-тесте отразился на величине коэффициента мобилизации, который был максимально снижен при НТЖГ ( 1,15±0,30 против 3,10±0,04 в контроле)) и достоверно отличался от такового у здоровых лиц при АТЖГ (1,80±0,65). Между тем при ХНЗГ значения КМ перитонеальных НГ не отличался от таковых в контроле (3,30±0,09), что свидетельствует об отсутствии явных и скрытых нарушений в кислород-зависимой биоцидности НГ перитонеальной жидкости при заболеваниях женских гениталий нетуберкулезного характера. Постановка пробы Манту в исследуемых группах позволила установить (Таблица 3.2), что в группе практически здоровых женщин происходит достоверное увеличение %ФПК в спонтанном и стимулированном NBT-тесте с сохранением КМ на уровне адекватного реагирования, соответствующем таковому до нагрузки туберкулином in vivo (3,20±0,05). Между тем данные спонтанного NBT-теста в клинических группах свидетельствовали о почти трехкратном снижении %ФПК при ХНЗГ, а также уменьшении данного показателя при НТЖГ в 1,9 раза и при АТЖГ – в 1,2 раза. Важное диагностическое значение имеет достоверно более низкое снижение %ФПК при ХНЗГ в сравнении с активным ТЖГ (р<0,05), в то время как между значениями данного показателя в группах больных АТЖГ и НТЖГ достоверных отличий обнаружено не было. Анализ показателей стимулированного NBT-теста после постановки пробы Манту свидетельствует о том, что при туберкулезе женских гениталий наблюдается возрастание %ФПК, но менее выраженное, чем в контрольной группе. В частности, при АТЖГ этот показатель увеличился на 20%, а при НТЖГ – лишь на 6%. Между тем при ХНЗГ имело место существенное возрастание %ФПК (в 3,3 раза). Тем не менее, величина КМ в сравниваемых клинических группах была достоверно более низкой, чем в контроле, причем Таблица 3.2 Влияние пробы Манту на оксидазную биоцидность перитонеальныхнейтрофилов у больных туберкулезом женских гениталий (М±м,р) Группа Показатели NBT-теста %ФПКсп АТЖГ НТЖГ до пробы Манту %ФПКст. КМ Показатели NBT-теста после пробы Манту %ФПКсп %ФПКст. КМ 5,10±0,05 6,50±0,60 1,80±0,65 7,50±0,30 9,10±0,50 1,85±0,50 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p3<0,05 2,50±0,06 p3<0,05 2,80±0,50 1,15±0,30 p3<0,05 4,90±0,20 p3<0,05 5,20±0,40 1,25±0,20 p3<0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 р1<0,05 p3<0,05 ХНЗГ Контроль p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 p2<0,05 2,10±0,30 p3<0,05 7,70±0,20 p3<0,05 2,30±0,09 p3<0,05 3,40±0,45 p3<0,05 11,20±0,20 2,85±0,05 2,80±0,40 р1<0,05 10,10±0,20 р1<0,05 3,10±0,04 р1<0,05 9,15±0,25 р1<0,05 13,20±0,30 р1<0,05 3,20±0,05 Примечание: P1 – достоверность различий с контролем Р2 – достоверность различий с ХНЗГ Р3 – достоверность различий между группами больных ТЖГ максимальное снижение имело место при НТЖГ (1,25±0,20 против 3,20±0,05 в контроле), что в целом свидетельствует о снижении резервных микробицидных возможностей перитонеальных НГ после пробы Манту. 4.1 Выводы Анализируя полученные результаты исследования в целом, следует заключить, что при туберкулезе женских гениталий и неспецифических хронических заболеваниях женской репродуктивной системы имеют место выраженные изменения показателей оксидазной биоцидности НГ на местном и системном уровне, зависимые от активности туберкулезного процесса и дополнительной антигенной нагрузки туберкулином как in vitro (стимулированный NBT-тест), так и in vivo (проба Манту). Постановка последней у практически здоровых лиц вызывает достоверное возрастание количества формазанпозитивных клеток в периферической крови и перитонеальной жидкости в среднем в 4 раза, а при постановке стимулированного NBT-теста – в 5,5 раз, что позволяет микробицидным кислород-зависимым системам здоровых лиц после пробы Манту сохранять адекватное реагирование на нагрузку туберкулином in vitro. Между тем при активном туберкулезном процессе в женской репродуктивной системе наблюдается активация оксидазной биоцидности НГ как на системном, так и на местном уровне с признаками истощенности ее при дополнительной антигенной нагрузке туберкулином in vitro, подтверждающейся достоверным снижением величин КМ циркулирующих и перитонеальных НГ. После пробы Манту у больных данной группы выявлено еще более значительное истощение мобилизационных и резервных возможностей кислород-зависимого метаболизма циркулирующих НГ, так как при этом существенно снижается не только КМ, но и %ФПК. Перитонеальные НГ при этом страдают в меньшей степени, сохраняя некоторую адекватность реагирования на туберкулин в системе in vitro, тем не менее, величина КМ не достигает уровня контроля. Снижение активности туберкулезного процесса в женской репродуктивной системе сопровождается более выраженной, чем при АТЖГ депрессией %ФПК, особенно на местном уровне, с отсутствием адекватного реагирования на нагрузку туберкулином in vitro, следствием чего является более значительное, чем при активном туберкулезном процессе снижение величины КМ перитонеальных и циркулирующих в крови НГ. Соответствующий характер носят изменения оксидазной биоцидности НГ после постановки пробы Манту: истощенность показателей данной функции является более глубокой как на местном, так и на системном уровне. Это позволяет считать наблюдаемые изменения при НТЖГ наиболее неблагоприятными в отношении противоинфекционной защиты, а показатели спонтанного и стимулированного NBT-теста считать диагностически- и прогностически-значимыми ее маркерами. Литература: 1. Бережная Н.М., Пинчук В.Г. Возможности иммунотерапии злокачественного роста //Биохимия человека и животных.- Киев: Наук.думка,1987.-Вып.10.-с.495219.Бобров Н.Н. Картина крови в клинике туберкулеза.-М.:Изд.АМН СССР,1950.219с. 2. Дзержинская И.И. Микрофагоциты крови и их роль у больных с опухолевыми процессами мочеполовых органов // Тез. докл. 1 съезда иммунологов России, Новосибирск,1992.-с.134. 3. Кисина Т.Е., Кноринг Б.Е., Калинина Н.М. Функциональная активность нейтрофилов при туберкулезе легких//Медицинская иммунология,- 2001-т3№2 с221. 4. Нестерова И.В., Колесникова В.В. Цитокиновая регуляция и функционирующая система нейтрофильных гранулоцитов //Гематология и трансфузиология,1999.№2.18-20. 5. Нестерова И.В. Интралейкоцитарная микробицидная система нейтрофильных гранулоцитов у здоровых детей и при гнойно-септических заболеваниях: Дис. …канд.мед.наук.- М.,1980.-249с. 6. Нестерова И.В., Колесникова В.В. Современные представления о роли системы нейтрофильных гранулоцитов //Русск. журнал иммунологии, 1999.т.4,№3.-с.229-234. 7. Сахарова И.Я,Ариэль Б.М.,Скворцова Л.А. и др. Показатели приобретенного иммунитета и катионные белки нейтрофильных гранулоцитов при туберкулезе легких// Проблемы туберкулеза,- 2003-№10-с50-53. 8. Чернушенко Е.Ф., Петренко В.М., Панасюкова О.Р., Иммунологические механизмы и прогностические критерии прогрессирования туберкулеза//Аллергология и иммунология, 2001- т2- №2.-с102. 9. Jacobs J., Norman M.A. A familial defect of neutrophil che-motahxis with asthma, cezema and recurrent skininfectlons //Pe-diat.Res.-1977.-11,N6.-p.732-736. 10. Lukas Josip. Novija sornanja omedusobrom djelovanju j funkkkeijama stsnica immunooskog sustavo // an.Klin.Colnice: Dr.M.Stoiandvic.-1990.- Vol.29.-№3-4.p.131-141. 11. Konig W.. Schonfeld W., Raulf M., Knoller J.. Sheffer J., Brom J. The neutrophil and leukotrienes role in health and disease //Eicosanoids.-1990.-3,N1.-P.1-22.