Абдул Хафиз Абделати Иссам Йосеф

На правах рукописи
Абдул Хафиз Абделати Иссам Йосеф
ИССЛЕДОВАНИЯ РАЗВИТИЯ И ВЫДЕЛЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ И
ЭФИРНЫХ МАСЕЛ АИРА БОЛОТНОГО И ВЕРБЛЮЖЬЕЙ КОЛЮЧКИ,
ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В АСТРАХАНСКОЙ ОБЛАСТИ
Специальности:
03.02.01 – Ботаника,
03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Астрахань – 2011
Работа выполнена на кафедре биотехнологии и биоэкологии Государственного
образовательного учреждения высшего профессионального образования
«Астраханский государственный университет»
доктор биологических наук, профессор
Егоров Михаил Алексеевич
Научный руководитель:
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук
Шахмедова Галина Сафяровна
доктор химических наук, профессор
Брыкалов Анатолий Валерьевич
Ведущая организация:
ГНУ «Астраханская опытная станция» ГНЦ РФ
ВНИИР им. Н.И. Вавилова РАСХН РФ
Защита состоится «12» мая 2011 года в «10:00» часов на заседании
диссертационного совета Д 212.009.10 при Астраханском государственном
университете по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1. Естественный
институт АГУ.
Тел. /факс: (8512) 51-82-64
Е-mail: sovetei@rambler.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского
государственного университета по адресу: 414056, г. Астрахань, ул. Татищева,
20а, www.aspu.ru
Автореферат разослан «
» апреля 2011 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук, профессор
2
Федотова А.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Использование лекарственных растений
растет во всем мире. По данным Всемирной Организация здравоохранения (ВОЗ),
приблизительно 80% мирового населения в настоящее время использует травяные
лекарственные средства непосредственно в чаи или с водой, молоком и
алкоголем. Хотя современные синтетические медицинские препараты в основном
используются в развитых странах, использование растительных препаратов
значительно возросло. Отмечается постоянно высокий спрос на растительный
материал. Следует отметить, что большинство растений представляют лишь
частично интерес для биотехнологии и генетики и их лечебный потенциал не
раскрыт (Oliver и Wim, 2007). Травянистые цветковые растения представлены во
флоре Астраханской области 1105 видами (88,1 %). Раздельно рассматриваются
группы наземных (1013 вида), земноводных (42 видов и 2 гибрида) и водных трав
(48 видов) (Лактионов, 2009).
Аир болотный (Acorus calamus L., Araceae) является многолетним
растением содержаним аромакомпоненты, распространенным в Центральной
Азии, Индии и Гималаях. Хотя ареалы его распространения в Европе сильно
сократились, он и сейчас является привычным растением для северных
болотистых регионов с умеренным климатом. Аир произрастает в дикой природе
по краям болот, по берегам рек и прудов. Растение имеет корневище, и листья с
приятным, слегка сладковатым запахом, что обусловлено содержанием эфирного
масла. Сушеные корни аира болотного давно используются в лекарственных
препаратах как спазмолитическое, противоязвенное средство, при приготовлении
вкусовых горьких настоек и закуски (Rost,1979; Hanelt, 2001). Корень аира имеет
давнюю историю медицинского применения. Он известен как народное средство
лечения артрита, невралгии, диареи, диспепсии, выпадения волос и других
заболеваний (Махлаюк, 1992). Препараты аира применяют в качестве
ароматической горечи для улучшения аппетита и пищеварения, при болезнях
почек, печени и желчного пузыря и как тонизирующее средство при угнетении
центральной нервной системы. Эфирное масло корневищ аира используют для
отдушки в парфюмерной и пищевой промышленности (Полуденный и др., 1979).
Верблюжья колючка (Alhagi pseudalhagi Bieb., Fabaceae) распространена на
всей территории Индии, где она используется в традиционной травяной медицине
(Kirtikar и Basu, 1984; Singh и др., 1999; Viramani и др., 1992). Верблюжья
колючка встречается на юге европейской части России и в Западной Сибири, в
Казахстане и Средней Азии, на Кавказе. Растёт в сухих степях, глинистых и
щебнистых полупустынях и пустынях, по берегам рек и каналов, на пустырях и
залежах (Махлаюк, 1992). Верблюжью колючку используют для профилактики
дизентерии, при воспалениях толстой и двенадцатиперстной кишки и желчного
пузыря, гастритах и язвенной болезни желудка, иногда назначают при
простудных заболеваниях, ангинах и кашле. Верблюжью колючку наружно
используют для лечения гнойных ран, при экземе, при гнойных отитах и других
заболеваниях (Кьосев, 2005).
3
Остаются не раскрытыми вопросы возможности использования этих видов
растений для получения ценных биологических компонентов в Астраханской
области.
Климатические особенности Астраханской области, инсоляция, низкая
влажность, почвы, растительный покров, особенности сезонных изменений
гидрологического режима определяют уникальные условия, но в тоже время
сложные для развития растений. Однако комплекс этих исторически
сложившихся в регионе фактров позволяет растениям интенсивнее накапливать
ценные биологически активные компоненты определения их возможность
использование с учетом запасов сырья и необходимостью их культивирования в
различных отраслях (Сухенко, 2010). Актуальность работы заключается, в
исследовании популяций
аира болотного и верблюжьей колючки
произрастающих на территории Астраханской области и содержащихся в этих
растенях биологических активных веществ в зависимости от химического состава
почв, на которых они произрастают.
Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы – исследовать
развитие растений и разработать методы выделения биологически активных
веществ из аира болотного и верблюжьей колючки, произрастающих в
Астраханской области. Определить лучшие условия для развития растений.
Выявить основные биологически активные вещества эфирных масел и экстрактов
растений, осуществить исследования анти-бактериальных свойств. Разработать
технологию изготовления водно-спиртовых экстрактов аира болотного и
верблюжьей колючки для их использования в различных производствах. Для
достижения поставленной цели следовало решить следующие задачи:
1. Исследовать особенности морфологического развития аира болотного и
верблюжьей колючки, произрастающих в различных местах в
Астраханской области.
2. Определить основные физические и химические свойства почв из мест
произрастания растений.
3. Осуществить дистилляцию эфирных масел, а также оценить количество
эфирного масла в каждой пробе экстрактов.
4. Исследовать химический состав и определить основные биологически
активные вещества, содержащиеся в эфирных маслах.
5. Сделать анализ растительных экстрактов на определение чистоты от
тяжелых металлов и остатков пестицидов.
6. Изучить антибактериальную активность эфирных масел и экстрактов
аира болотного и верблюжьей колючки.
7. Выявить пути получения использования эфирных масел и растительных
экстрактов содержащих биоактивные вещества.
Научная новизна. Впервые изучены оптимальные условия роста аира
болотного (A. calamus L.) и верблюжьей колючки (A. pseudalhagi Bieb.) в
Астраханской области. Показаны оптимальные условия для развития аира
болотного и верблюжьей колючки с целью выявления лучших показателей роста
и высокого содержания эфирных масел.
4
Впервые, выяснен химический состав летучих масел, извлеченных из
корневищ аира болотного, произрастающего в Астраханской области. Определено
наличие азарона и других перспективных биологически активных веществ (БАВ)
в эфирном масле корневищ аира.
Проведено определение чистоты спиртовых экстрактов из верблюжьей
колючки и аира болотного на содержание тяжелых металлов и остатков
пестицидов.
Предложено использование летучих растительных масел аира болотного,
произрастающего на территории Астраханской области в парфюмерии и
косметике.
Практическая значимость работы. На основе изучения биологических
особенностей A. calаmus L. экспериментально показана возможность его
использования в условиях Астраханской области для получения ценного сырья.
Результаты исследования могут быть использованы в сельском хозяйстве для
определения оптимальных условий для выращивания растений аира болотного и
верблюжьей колючки и получение растений с высоким качеством и содержанием
эфирных масел. Результаты химического и хроматографического анализов
эфирных масел аира болотного (A. calаmus L.), которые могут быть использованы
для получения экстрактов и биологических активных веществ, необходимых в
качестве антимикробных компонентов. Возможно использование полученного
эфирного масла из аира болотного, произрастающего на территории
Астраханской области в парфюмерии и косметике.
Апробация работы. Полученные экспериментальные исследования по
данной работе представлены на научных конференциях: V Всероссийской
конференции студентов и молодых ученых с элементами научной школы
«Актуальные проблемы инновационного развития агропромышленного
комплекса», Астраханский государственный университет, г. Астрахань, 29
октября – 1 ноября 2009 г.; Международной научно-практической конференции
«Приоритеты и интересы современного общества»,
Астраханский
государственный университет, г. Астрахань, 12-13 апреля 2010 г.;
Международной конференции с элементами научной школы для молодежи
«Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии»,
Министерства образования и науки РФ, Астраханский государственный
университет, г. Астрахань, 7 – 10 декабря 2010 г.
Публикации. По результатам полученных исследований опубликовано 9
работ, отражающее основное содержание диссертации, в том числе 5 статей в
журналах, рекомендованных ВАК.
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав,
заключения, выводов, списка литературы. Общий объём работы составляет 171
страницу, содержит 10 таблиц, 26 рисунков и 2 приложений. Список литературы
включает 187 источников, из них 101 на иностранных языках.
5
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Образцы аира болотного были собраны в трех разных участках
Приволжского района Астраханской области: I участок - около села Килинчи, и
участки II и III - около села Три Протока. Были собраны растения,
произрастающие на берегах рек, которые протекают через эти села. Экземпляры
верблюжьей колючки были собраны в трех разных местах (I, II и III) от поселка
Начало (Приволжский район Астраханской области).
Образцы растений были доставлены в лабораторию биотехнологий АГУ
(Технопарк, поселок Начало, Приволжский район Астраханской области), где
были проведен анализ морфологических признаков с последующей сушкой.
Растения сохранялись в хорошо проветриваемом месте. Почвенные образцы
также были собраны с данных участков, высушены и подготовлены к
физическому и химическому анализу. Анализ был проведен в агрохимической
лаборатории Астраханского государственного университета.
Собранные данные включают различные вегетативные параметры роста:
аира болотного
 Количество листьев (шт).
 Вес зеленых листъев (г).
 Среднюю высоту растений (см).
 Общий вес (вес стеблей, листьев и
 Масса корневища (г).
корневища) (г).
верблюжьей колючки
 Количество боковых ветвей
 Общий вес (вес стеблей,
(шт).
листьев и корней) (г).
 Высота растений (см).
Методы получения эфирных масел:
Образцы растений (100 г. высушенных растений) были подвергнуты
гидродистилляции в течение 2 часов с использованием аппарата Clevenger для
получения эфирного масла (Clevenger, 1928). В настоящее время наиболее
популярным методом извлечения является перегонка с водяным паром, при
котором вода нагревается до получения пара, который несет в себе самые летучие
химические вещества и ароматический материал. Затем пар, собранный в
результате перегонки, охлаждается в конденсаторе. Извлеченные эфирные масла
хранили в чистых стеклянных флаконах, в темном месте при температуре 4°С.
Процент выхода изолированного эфирного масла, был рассчитан относительно
их сухого веса.
Хроматографический анализ:
Хроматографический анализ проводили с использованием Shimadzu GC-MS
(модели QP-5000, Shimadzu Ко, Киото, Япония) в режиме электронного удара.
Ионизации 70 eV напряжения и температуры источника ионов и инжектор были
250o C и 300° соответственно. Капиллярной колонкой использовали DB-WAX (60
× 0,2 мм, идентификатор, и 0,25 мкм толщина пленки; J и W, США). Температура
печи, запланированная на 40o C (изотермический на 1 минут) возросла до 180o C в
20o C/min и 220o C в 1o C/min затем 300° С в 20о C/min и держали 10 мин. Гелий
использовали в качестве газа-носителя при скорости потока 1ml/min, с
инжектором объема 1ml 1:20 использованием коэффициента распределения.
6
Методы экстракции БАВ из растений:
Растения были собраны нами в Приволжском районе Астраханской области.
Части растений, мыли, высушивали и извлекали отдельно спиртом 40% в течение
48 часов при периодическом встряхивании. Экстракты фильтровали,
стерилизовали и хранили в холодильнике.
Анализ тяжелых металлов и пестицидов:
Образцы экстрактов аира болотного и верблюжьей колючки, подвергли на
анализ тяжелых металов и пестицидов в «Испытательной лаборатории» ФГУ
«Астраханский центр стандартизации, метрологии и сертификации» (аттестат
аккредитации РОСС.RU. 0001.21 ПФ17 от 28.03. 2008г.). Тяжелые металлы
согласно методикам (МУ Но. 5178-90; ГОСТ Р 51301-99; ГОСТ 26930-86). и
пестициды согласно методикам (МУ Но. 4120-86; ГОСТ Р 51395-99).
Микробиологические методы исследования:
Испытания антимикробной активности были проведены в отношении
Staphylococcus aureus (ВКПМ В-1899), Bacillus subtilis (ВКПМ В-1919) и
Escherichia coli (ВКПМ В-1911). Штаммы были использованы из Всероссийской
коллекции промышленных микроорганизмов ФГУПГосНИИ Генетика, Москва,
Россия.
Антибактериальную активность экстрактов растений определяли двумя
способами: кубок диффузии на питательный среде агар (Anon, 1996). Экстракты
выполнены в питательных пластинах агара использованием пробки буром (6 мм)
и посевной содержащий 106 колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл бактерии
распространяли на твердые плиты стерильным тампоном, смоченным в суспензии
бактерий. Затем 50 мкл экстракта помещали в чашки, контроль также включены
50 мкл спирта 40%. метод диск диффузии (Lorian, 1996). На дисках были введены
в чистую стеклянную бутылку. Стерилизовали при температуре 121°С в течение
15 минут в автоклаве. Разведенный отвар был использован для проверки
экстрактов на антибактериальную активность. Стерильные диски (6 мм
диаметром) были выдержаны в экстрактах аира болотного и верблюжьей колючки
(в течении 24 часов). Все пластины инкубировали в течение 72 ч при 37°C.
Полученные экспериментальные данные обрабатывали с помощью
статистических методов анализа (Плохинский, 1972).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование развития аира болотного и верблюжьей колючки
произрастающих на различных почвах Астраханской области
Особенности развития аира болотного
Результаты показали, что все измеряемые морфологические характеристики
растений, имели самые высокие значения на участке III (с. Три Протока,
Приволжского района) по сравнению с участками I и II. В таб. 1 и рисунке 1
представлены значение количества листьев растений, собранных на 3-х участках.
Анализируемые показатели на III участке были выше по сравнению с участков I и
II в эквиваленте 7,3 и 14,6%, соответственно.
7
Таблица 1
Влияние типа почвы на вегетативные параметры растений аира болотного в
период 2008/2009 г.
Вегетативные
параметры
Количество
листьев
(шт)
Высота
растений
(см)
Масса
корневища
(г)
Вес зеленых
листьев (г)
Общий вес
(г)
I (тяжелый суглинок)
3,8 ± 0,71
80,5 ± 7,14
47,5 ± 4,02
38,5 ± 3,20
86,0 ± 7,00
II (тяжелый суглинок)
3,5 ± 0,50
68,4 ± 4,50
41,6 ± 5,00
17,4 ± 3,14
59,0 ± 4,57
III (глина)
4,1 ± 0,67
102,4 ± 5,12
79,7 ± 5,33
57,2 ± 4,50
136,9 ± 8,67
Вегетативные параметры
140
120
I (тяжелый суглинок)
II (тяжелый суглинок)
III (глина)
100
80
60
40
20
лис
ество
ч
и
л
Ко
0
)
)
)
г)
(шт)
ес (г
ев (г
й (см
ща (
ий в
тъев
истъ
тени
неви
л
щ
с
р
б
а
х
о
р
О
к
ы
а
та
елен
Масс
Высо
Вес з
Рис. (1): Влияние типа почы на вегетативные параметры
растений аира болотного в период 2008/2009 г.
Выявлено увеличение средних значений высоты растений на участке III по
сравнению с участками I и II соотношений 21,4 и 33,2% соответственно. Вес
корневища был больше на III участке 40,4 и 47,8% по сравнению с участками I и
II соответственно. Так же отличился в сторону увеличения вес зеленых листьев на
32,7 и 69,6%, соответственно. Результаты перегонки эфирных масел от общей
массы корневищ растений, показали, что корневищи растений, собранные с
третьего участка, содержат наибольшее количество эфирного масла по сравнении
с I и II участками на 27,5 и 47.5%, соответственно (рис. 2).
Результаты проведенных анализов почвы показали низкие значения рН
почвы, собранной с участка III (рН=6,3) по сравнению с участками I и II. Также
было обнаружено, что на участке III была глинистая почва, а почва I и II участков
– тяжелый суглинок (рис. 3).
8
Эфирные масла (мл\кг)
I (тяжелый суглинок)
4
3,5
II (тяжелый суглинок)
III (глина)
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Количество эфирного масла (мл/кг)
I (тяжелый суглинок)
2,9 ± 0,30
II (тяжелый суглинок)
2,1 ± 0,22
4 ± 0,35
III (глина)
Рис. (2): Влияние типа почвы на содержание
эфирных масел в аире болотном в период
2008/2009г.
8
1, тяжелый суглинок
Свойств почвы
7
2, тяжелый суглинок
6
3, глина
5
4
3
2
1
0
pH
Гигроскопиче
ская
влажность, %
Гумус, %
Сумма солей,
%
1, тяжелый суглинок
7,01
3,22
3,75
0,17
2, тяжелый суглинок
6,56
4,91
1,36
0,36
3, глина
6,3
6,63
3,8
0,75
Рис. (3): Результаты анализа почвы районов, в которых были собраны
образцы аира болотного.
Особенности развития Верблюжья колючка
Alhagi pseudalhagi Bieg. (leguminosae) полукустарник с очень длинным
корнем и глубоко расположенными подземными горизонтальными побегами, с
растопыренно-ветвистым стеблем, многочисленными колючками. Листья
простые, овальные. Цветки мотылькового строения, розовые или красные.
Растения были собраны с трех разных участков (I, II и III) от п. Начало,
Приволжский район Астраханской области.
Результаты исследования показали, что образцы верблюжьей колючки на
участке № III (песок) являются наилучшими по морфологическим признакам
(количеству боковых ветвей, высоте растений, общий весу) в сравнении с
растениями, собранными на участках I и II (глина) (таб. 2 и рис. 4).
9
Таблица 2
Влияние типа почвы на вегетативны параметры
растений верблюжьей колючки в период 2008/2009 г.
Высота
растения (см)
Общий вес
(гм)
I (глина)
1,9 ± 0,2
81,5 ± 5,14
107,9 ± 7,07
II (глина)
2,1 ± 0,3
75,2 ± 4,67
91,0 ± 5,40
III (песок)
2,5 ± 0,22
82,7 ± 4,62
117,8 ± 6,43
Участки
Вегетативные параметры
Количество
боковых
ветвей (шт)
Вегетативные
параметры
I (глина)
II (глина
III (песок)
120
100
80
60
40
20
0
х
ковы
во бо
чест
Коли
ветв
т)
ей (ш
та р
Высо
м
ия (с
асте н
)
ий
Общ
вес (г
)
Рис. (4): Влияние типа почвы на вегетативные параметры
растений верблюжьей колючки в период 2008/2009г.
Полученные результаты свидетельствуют также о содержании наибольшего
количества эфирных масел в растениях, которые были собраны на участке III (0,3
мл \ кг) по сравнению с растениями, собранными на участках I и II, содержавших
эфирные масла без каких-либо значительных различий между отдельными
местами (рис. 5).
Эфирные масла
(мл\кг)
0,3
I (глина)
0,25
0,2
II (глина)
0,15
III (песок)
0,1
0,05
0
Количеств о эферного
масла (мл/кг)
I (глина)
0,28 ± 0,02
II (глина)
0,24
± 0,03
III (песок)
0,3
± 0,03
Рис. (5): Влияние типа почвы на
содержание эфирного масла в верблюжьей
колючки в период 2008/2009г.
В результате проведенного анализа почвы (рис. 6), было обнаружено, что на
участке III была песчаная почва, а на участках I и II - глинистая. Анализ также
показал высокий уровень рН почвы на участке III (рН = 7,55) и низкий процент
гигроскопической влажности, а также низкое по сравнению с участками I и II
содержание в ней гумуса и минеральных солей.
10
Свойств почвы
8
I , глина
II , глина
III , песок
7
6
5
4
3
2
1
0
pH
Гигроскопичес
кая
влажность, %
Гумус, %
Сумма солей,
%
I , глина
6,97
4,46
4,29
0,25
II , глина
7,49
4,66
3,34
0,18
III , песок
7,55
1,6
0,58
0,1
Рис. (6): Результаты анализа почвы районов, в которых были
собраны растения верблюжья колючка.
Полученные результаты показывают, что верблюжья колючка не
требовательна к почве с хорошими химическими свойствами, однако требует от
неё хороших физических свойств, которым и удовлетворяет песчаная почва,
поскольку она значительно поглощает избыточную воду. Более крупное
расстояние между частицами песчаной почвы, также способствует росту корней,
что в свою очередь, приводит к интенсивному вегетативному росту растения и
улучшению его морфологических характеристик.
Исследование летучих органических компонентов эфирных масел аира
болотного (Acorus calamus) методом газовой хроматографии и
масс-спектрометрического анализа
Эфирное масло аира было извлечено методом дистилляции в течение 2
часов с использованием аппарата Кливенгера и проанализировано с помощью ГХ/
МС (рис. 7). Определены летучие органические соединения и приведены в
соответствии с их элюцией
на DB-WAX колонки. В общей сложности
предварительно
определены
14
летучих
органических
соединений
принадлежащих к следующим химическим классам: монотерпены (2),
сесквитерпены (5), кетоны (1), спирты (2), амиды (1), алкены (1), и эфиры (2).
В эфирном масле аира были обнаружены эфирные соединения азарон и 1,2Диметокси-4-метокси-l-пропенилбензол. В группе спирты они присутствуют в
значительном количестве. Линалоол и уксусная кислота,эфир,3-гедрокси-6изопропенил-4,8a-диметил-1,2,3,5,6,7,8,8a-октагидронафталин-2-ила
были
обнаружены как главные компоненты группы алкоголя. Были обнаружены пять
соединений
сесквитерпенов:
-γ-мууролен,
-шуобунон,
-дегидроксиизокаламендиол, -Спиро [4,5] декан-7-он,1,8-диметил-8,9-эпокси-4-изопропил, и
6-[1-(Гидроксиметил)винел]-4,8a-диметил-4a,5,6,7,8,8a-гексагидро-2(1H)нафталенон. Точно такие же составы, связанные с группой монотерпенов
являются бета-пинен (β-пинена), а также камфен. Помимо этих углеводородов
11
терпенов из других групп были также обнаружены такие, как кетон (камфора),
амиды (9-Ацетамедо-1-метил-3,6-диазагомоадамантан) и алкены (1,2,3,4Тетраметил-5-метилен-1 ,3-циклопентанден). Хроматограмма (рис. 7) показывает,
что азарон является доминирующим соединением.
Азарон
Рис. 7: G /MS хроматограмма летучих органических компонентов, полученных из аира болотного.
Качественные исследования химических компонентов эфирного масла дают
базовое представление для комплексной оценки состава этих масел. Процентный
состав эфирного масла обеспечивает, пожалуй, наиболее важные параметры для
его характеристики. Поэтому наша дискуссия концентрируется в направлении
характеристики отдельных компонентов и их фармакологических свойств,
основанных на предыдущих исследованиях. Азарон, как эфир содержится в
некоторых растениях, таких как аир и копытень, обеспечивая аромат эфирного
масла. Он используется в уничтожении вредителей и бактерий (рис. 8).
Монотерпены относятся к классу терпенов, которые состоят из 2 единиц
изопрена (молекулярная формула C10H16). Монотерпены могут быть линейным
(ациклические) или содержать кольца. Биохимические изменения, такие как
окисление или перегруппировки производят соответствующие монотерпеноиды.
В этом исследовании обнаружен индикатор монотерпеновых соединений - бетапинен и камфен.
Сесквитерпены входят в класс терпенов, которые состоят из 3 единиц
изопрена C15H24. Как монотерпены, сесквитерпены могут быть ациклическими
или содержат кольца, в том числе есть много уникальных комбинаций.
Биохимические изменения, такие как окисление или перегруппировки производят
соответствующие сесквитерпеноиды. Сесквитерпены в основном используются в
косметике, парфюмерии как душистые вещества и фиксаторы запахов.
12
Рис.8. Масс-спектры основных соединений азарона определенных в аире болотном.
Линалоол - важное соединение, используется в продуктах питания в
качестве пищевых добавок (JECFA, 1999), в фармакологии, как седативное
действие индуктора, глутаматергического ингибитора нейронов (Pamela и др.,
1992). Линалоол входит в состав 60-80% парфюмерных продуктов гигиены и
моющих средств, включая мыло, шампуни, лосьоны.
Оценка остатков тяжелых металлов и хлорорганических пестицидов в
экстрактах аира болотного и верблюжьей колючки
Результаты анализов концентраций тяжелых металлов (мг/кг) в аире
болотном собранном в районе с. Три Протока, Приволжского района
Астраханской области приведены в таблице 3. Полученные данные
свидетельствуют, что количество тяжелых элементов в спиртовом экстракте из
аира были следующими (мг/кг): Cd (0,01), мышьяк (0,02), ртуть (0,001), свинца
(0,03). Эти результаты сравнивали с российскими стандартами, которые
содержатся в СанПиН (1.2.681-97), МДУ, ПДК, ФОН, а также стандартами
немецкого федерального министерства здравоохранения, мы обнаружили, что
значения концентраций тяжелых металлов, которые были получены при анализе гораздо меньше, чем допускается стандартом. Так, концентрация кадмия в
экстракте была (0,01) по сравнению с МДУ (0,3), ПДК (0,3), а также со значением
в немецком стандарте (0,1), что указывает на безопасные значения
присутствующего кадмия. Концентрация мышьяка в экстракте составила (0,02).
Сравнивая значения СанПиН (5,0), МДУ (0,5), ПДК (0,1) и немецкого стандарта
(0,5) определено, что имеющаяся концентрация мышьяка не существенна.
Выявленное содержание ртути и свинца ниже допустимых пределов,
13
0,03
мг/кг
Свинец
ФОН
4
мг/кг
0,001
ПДК
Ртуть
мг/кг
3
МДУ
0,02
мг/кг
Мышьяк
Допустимый
предел, мг/кг
(СанПиН
1.2.681-97)
Федеральное
Министерство
здравоохране
ния в
Германии
2
Оценка
резултатов
0,01
Незначительные
количества
Кадмий
мг/кг
1
Фактическое
значение
№
п/п
Наименование
показателя
свидетельствует, что экстракт аира является безопасным в использовании, и
содержит нетоксичное количество тяжелых металлов.
Таблица 3
Содержание тяжелых металлов в экстракте аира болотного, мг/кг
-
0,1
0,3
0,3
0,08
5,0
0,5
0,5
0,1
-
0,2
0,2
0,05 0,01
5,0
1,0
5,0
1,0
0,05
1,2-3,9
МДУ, ПДК, ФОН (Димиденок и Харина, 2005)
Свинец
0,02
мг/кг
4
ФОН
0,003
мг/кг
Ртуть
ПДК
3
мг/кг
0,02
МДУ
Мышьяк
Допустимый
предел, мг/кг
(СанПиН 1.2.68197).[90]
Федеральное
Министерство
здравоохранения в
Германии мг/кг
[91]
2
Оценка резултатов
0,01
Незначительные
количества
Кадмий
мг/кг
1
Фактическое
значение
№
п/п
Наименование
показателя
Результаты анализа концентраций тяжелых металлов (мг/кг) в верблюжьей
колючке собранной в Астраханской области, приведены в таблице 4. Из
таблицы видно, что количество тяжелых элементов в спиртовом экстракте были
следующими (мг/кг): Cd (0,01), мышьяк (0,02), ртуть (0,003), свинец (0,02).
Сопоставляя эти результаты с российским стандартом, а также стандартом
немецкого федерального министерства здравоохранения, мы обнаружили, что
концентрация тяжелых элементов, которые получены при анализе гораздо ниже,
чем допускается стандартом.
Таблица 4
Содержание тяжелых металлов в экстракте верблюжьей колючки, мг/кг
-
0,1
0,3
0,3
0,08
5,0
0,5
0,5
0,1
-
0,2
0,2
0,05
0,01
0,05
5,0
1,0
5,0
1,0
1,2-3,9
МДУ, ПДК, ФОН (Димиденок и Харина, 2005)
14
Так, концентрация кадмия в экстракте составила (0,01) по сравнению с
МДУ (0,3), ПДК (0,3), а также со значением немецкого стандарта (0,1) присутствие кадмия в выявленных значениях безопасно. Кроме того,
концентрация свинца в экстракте была (0,02), в сравнении со значениями СанПиН
(5,0), МДУ (5,0), ПДК (1,0), ФОН (1,2-3,9) и немецким стандартом (1,0) –
определено, что концентрация свинца не существенна. Содержание ртути и
свинца ниже допустимых пределов, подтверждает, что экстракт верблюжьей
колючки является безопасным в использовании и содержит нетоксичное
количество тяжелых металлов.
Анализ на пестициды:
Содержание пестицидов в экстрактах аира болотного (мг/кг) приведены в
таблице 5. Результаты анализа пестицидов показали что все пестициды, которые
были обнаружены (альдрин, альфа изомер ГХЦГ, гамма изомер ГХЦГ, гептахлор,
ДДД, ДДТ, ДДЭ, кельтан) содержатся в небольших количествах и практически
не присутствуют и это ниже допустимых норм российских стандартов,
изложенных в (ГОСТ Р 51359-99). Например, концентрации альдрина в экстракте
(0,00008) - по сравнению со стандартными спецификациями (0,02), поэтому,
сравнивая все характеристики пестицидов со стандартом, мы видим, что
концентрации пестицидов являются очень низкими. Полученные результаты
подтверждают безопасность экстракта аира болотного.
Таблица 5
Содержание пестицидов в экстракте аира болотного, мг/кг
№
п/п
Наименование показателя
Фактическое
значение
мг/кг
1
Альдрин
0,00008
2
3
4
5
6
7
8
Альфа изомер ГХЦГ
(циклохлорциклогексана)
Гамма изомер ГХЦГ
(циклохлорцик-логексана)
Гептахлор
ДДД (1,1-дихлор-2 ,2-бис (рхлорфенил) этан)
ДДТ (1,1,1-трихлор-2 ,2-бис
(р-хлорфенил) этан)
ДДЭ (1,1-дихлор-2 ,2-бис (рхлорфенил) этилена)
Кельтан
Оценка резултатов
Незначительные
количества
Незначительные
количества
Незначительные
количества
Незначительные
количества
Незначительные
количества
Незначительные
количества
Незначительные
количества
Незначительные
количества
0,00008
0,00008
0,00008
0,0002
0,0002
0,0002
0,0002
Допустимый
предел, мг/кг
(ГОСТ Р 51359-99)
0,02
0,02
0,01
0,02
0,03
0,06
0,02
0,02
Содержание пестицидов в экстрактах верблюжьей колючки (мг/кг)
приведены в таблице 6.
15
Таблица 6
Содержание пестицидов в экстрактах верблюжьей колючки, мг/кг
№
п/п
Наименование показателя
Фактическое
значение
мг/кг
Оценка резултатов
Допустимый
предел, мг/кг
(ГОСТ Р 51359-99)
1
Альдрин
0,00008
Незначительные
количества
0,02
2
Альфа изомер ГХЦГ
(циклохлорциклогексана)
0,00008
Незначительные
количества
0,02
3
Гамма изомер ГХЦГ
(циклохлорциклогексана)
0,00008
Незначительные
количества
0,01
4
Гептахлор
0,00008
Незначительные
количества
0,02
5
ДДД (1,1-дихлор-2 ,2-бис (рхлорфенил) этан)
0,0002
Незначительные
количества
0,03
6
ДДТ (1,1,1-трихлор-2 ,2-бис
(р-хлорфенил) этан)
0,0002
Незначительные
количества
0,06
7
ДДЭ (1,1-дихлор-2 ,2-бис (рхлорфенил) этилена)
0,0002
Незначительные
количества
0,02
8
Кельтан
0,0002
Незначительные
количества
0,02
Результаты анализа остатков пестицидов в верблюжьей колючке,
свидетельствует, что они безопасны и не имеют токсического эффекта. Сравнение
остаточных количеств пестицидов по российским стандартам (ГОСТ Р 51359-99)
показало, что концентрации пестицидов в исследуемых образцах является очень
низкими. Полученные данные подтверждают безопасность полученного экстракта
верблюжьей колючки.
Антибактериальная активность эфирного масла и спиртовых экстрактов
аира болотного и верблюжьей колючки
Результаты анализа антимикробной активности показали, что эфирное
масло и спиртовые экстракты аира болотного (A. calamus) и верблюжьей колючки
(A. pseudalhagi) при использовании метода дисков подтвердили некоторую
антибактериальную активность: эфирного масла и экстрактов против
деятельности всех исследованных бактерий; Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis
и Escherichia coli. Антибактериальная активность зоны торможения роста
показана в таблице 7.
Спиртовый экстракт дисков аира болотного обладает низкой ингибирующей
активностью в отношении золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus),
сенной палочки (Bacillus subtilis) и кишечной палочки (Escherichia coli) с узкой
зоной торможения 10,8-15,3 мм. Эфирное масло из аира болотного проявило
низкую антибактериальную активность и имеет узкую зону торможения против
всех использованных бактерий (11,3-14,8 мм). Диски со спиртовым экстрактом
16
Alhagi pseudalhagi показали низкую тормозящую активность в отношении
золотистого стафилококка, сенной палочки и кишечной палочки с узкой зоны
торможения 12,0-14,5 мм.
Таблица 7
Антибактериальная активность эфирного масла и спиртовых экстрактов (метод дисков)
изучаемых растений от некоторых бактерий на 50 мкл (зона торможения измеряется в мм)
Диаметр зоны задержки роста (мм)
Escherichia coli
Вариант
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
24ч
48ч
72ч
24ч
48ч
72ч
24ч
48ч
72ч
Экстракт
аира
болотного
15,3 ± 0,25
14,0 ± 0,35
14,0 ± 0,41
11,0 ± 0,30
10,8 ± 0,25
10,5 ± 0,50
14,5 ± 0,62
13,5 ± 0,81
13,5 ± 1,16
Масло аира
болотного
14,8 ± 0,31
14,3 ± 0,50
13,0 ± 0,25
12,0 ± 0,41
11,3 ± 0,25
11,3 ± 0,25
13,5 ± 1,19
13,0 ± 0,86
13,0 ± 0,70
Экстракт
верблюжьей
колючки
13,5 ± 0,35
12,0 ± 0,50
12,0 ± 0,50
13,0 ± 0,50
12,0 ± 0,35
12,0 ± 0,35
14,5 ± 0,55
13,6 ± 0,80
13,5 ± 1,11
Результаты настоящего исследования показали, что β-азарон фракция,
которая считается активным компонентом эфирного масла растения аира
болотного, обладает слабой антибактериальной активностью (Grosvenor и др.,
1995; McGaw и др., 2002), хотя об отсутствии в корневище аира болотного
антибактериальной активности β-азарона сообщалось ранее (De и др., 1999;
McGaw и др., 2002).
В таблице 8, показано влияние эфирного масла и спиртовых экстрактов по
методу скважин (лунки) на рост S.aureus, B. subtilis, and E. coli. По нашим
данным, эфирное масло, полученное из корневищ аира болотного и спиртовых
экстрактов аира болотного и верблюжьей колючки имеет малоустойчивый эффект
торможения роста вышеупомянутых бактерий.
Таблица 8
Антибактериальная активность эфирного масла и спиртовых экстрактов (метод лунки)
изучаемых растений от некоторых бактерий на 50 мкл (зона торможения измеряется в мм)
Диаметр зоны задержки роста (мм)
Вариант
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
24ч
48ч
72ч
24ч
48ч
72ч
24ч
48ч
72ч
Экстракт
аира
болотного
14,0 ± 0,35
13,0 ± 0,35
12,3 ± 0,50
12,3 ± 0,60
11,8 ± 0,41
11,5 ± 0,50
13,5 ± 1,11
12,7 ± 0,75
12,4 ± 0,80
Масло аира
болотного
14,5 ± 0,41
13,3 ± 0,50
13,3 ± 0,35
14,0 ± 0,50
14,0 ± 0,50
14,0 ± 0,50
14,0 ± 0,70
13,0 ± 0,70
13,0 ± 0,52
Экстракт
верблюжьей
колючки
13,5 ± 0,25
13,0 ± 0,25
13,0 ± 0,35
12,3 ± 0,25
10,0 ± 0,35
10,0 ± 0,35
13,7 ± 0,80
12,6 ± 0,62
12,2 ± 0,50
17
Растительные экстракты с целью воздействия на микроорганизмы
источники болезней использовались на протяжении сотен лет в практике
народной медицины. Системное изучение влияния растительных экстрактов на
антибактериальную
активность
проводится
для
получения
новых
антибактериальных соединений. Учитывая биоразнообразие растений в
Астраханской области, необходимо осуществлять дальнейшие комплексные
исследования выявленных биокомпонентов данных растений для обнаружения их
антибактериальной активности.
Приготовление опытных образцов экстрактов из растений
выбранными способами
Моделирование технологической схемы производства и контроль основных процессов:
Схема технологического контроля
Сбор растений
Промывание
Высушивание
Резка растений
Взвешивание образца
Образец помещается в бутылки
Добавление спирта 40%
Бутылки помещаются на шейкер
Фильтрация экстракта
Хранение экстракта в небольших темного цвета бутылках
Стерилизация
Этикетирование и упаковка
Маркирование
Хранение
Реализация
18
Описание технологического процесса
1. Сбор растений.
2. Промывание растений осуществлять на месте их сбора и в лаборатории.
Растения многократно промывать в проточной воде, допускается промывать в
чанах. Продолжительность промывания – не менее 5 минут.
3. Высушивание. Высушивать растения в лабораторных условиях в
естественных условиях на затененых площадках. Сушку проводить на воздухе в
не солнечную погоду при температуре не выше 25-30 0С. В течение суток
растения следует переворачивать 2-3 раза.
4. Резка растений: разрезают на мелкие кусочки около 1-2 см в длину.
5. Образцы взвешивают на цифровых весах (убедиться, что весы правильно
работают).
6. Образцы помещаются в бутылки со спиртом, используемом в процессе
экстракции.
7. Добавляется спирт 40% в масштабе 1:1 (на каждые 100 граммов добавить
100 мл спирта).
8. Бутылки размещаются (содержащие образцов и спирта) на шейкер на 5-6
дней по 6 часов в день при средней скорости.
9. Фильтрация экстракта.
10. Хранить экстракт в небольших темного цвета бутылках.
11. Стерилизация.
12. Этикетирование и упаковка. На каждую бутылку с экстрактом наклеить
художественно оформленную этикетку с указанием:
- товарного знака.
- наименования предприятия-изготовителя и его подчиненности.
- наименования экстракта и его типа.
- вместимости, мл.
- обозначения настоящего стандарта.
- даты окончания гарантийного срока хранения (наносится просечкой,
штамповкой или другим способом, обеспечивающим четкое прочтение).
- надписи: «Желательно употребить до указанной даты».
После этикетирования стеклянные бутыли с экстрактом упаковать в ящики
из гофрированного картона по ГОСТ 13516-86, ТУ 13-021041-166-91 предельной
массой продукта 20 кг, полимерные ящики по ТУ 15-1056-89, предельной массой
продукта 20 кг.
Ящики из гофрированного картона с продукцией должны быть оклеены
клеевой лентой на бумажной основе по ГОСТ 18251 или полиэтиленовой лентой с
липким слоем по ГОСТ 20477.
13. Маркирование. На ящики из гофрированного картона наклеить этикетку с
указанием вида продукции, массы нетто, даты изготовления, срока хранения и
наименования предприятия-изготовителя и нанесением манипуляционных знаков
«Хрупкое. Осторожно». Транспортную маркировку осуществлять по ГОСТ 14192.
14. Хранение. Хранить готовый продукт в сухих затемненных помещениях
при температуре окружающего воздуха не ниже 0 0С и не выше 12 0С до 1 года
19
с даты выработки. Относительная влажность воздуха в складских помещениях
для хранения экстракта должна быть не более 75 %.
15. Реализация. Для реализации экстракт можно транспортировать всеми
видами транспорта при температуре от 0 до 25 0С в соответствии с правилами
перевозки грузов.
Технологические инструкции
 Технологическая инструкция и технические условия по изготовлению
водно-спиртового экстракта аира болотного (Acorus calamus) для
использования в производстве парфюмерии и косметики.
 Технологические инструкции и технические условия по изготовлению
водно-спиртового экстракта верблюжей колючки (Alhagi pseudalhagi) для
использования в производстве пищевых добавок.
1.
2.
3.
4.
5.
ВЫВОДЫ
Полученные результаты показали, что образцы аира болотного,
произрастающего возле села Три Протока Приволжского района
Астраханской области, являются лучшими по количеству листьев, высоте
растений, весу корневищому, весу зеленых лестъев, общему весу растения, а
также по содержанию эфирных масел.
Анализ почвы третьего участка (возле села Три Протока) показал её
оптимальные физические и химические характеристики для роста аира
болотного в сравнении с двумя предыдущими районами, где она была
нейтральной или кислой (рН 6.3) с высоким содержанием гигроскопичной
влаги, гумуса и питательных веществ (6,63, 3,8, 0,75%, соответственно).
Полученные результаты указывают, что песчаные почвы с высоким
показателем рН (7,55) и с пониженной гигроскопической влажностью,
гумусом и питательными веществами являются оптимальными для роста
верблюжьей колючки (количество боковых ветвей, высота растений, общий
вес).
Из анализов образцов эфирного масла аира болотного получены
четырнадцать биологически активных компонента: 1) Азарон, 2) Бета-пинен
(β-пинен), 3) Камфен, 4) 1,2,3,4-Тетраметил-5-метилен-1 ,3-циклопентанден,
5) Линалоол, 6) Камфора, 7) γ-Мууролен, 8) Шуобунон, 9) Дегидроксиизокаламендиол, 10) 1,2-Диметокси-4-метокси-l-пропенилбензол, 11)
Уксусная
кислота, эфир,3-гедрокси-6-изопропенил-4,8a-диметил1,2,3,5,6,7,8,8a-октагидронафталин-2-ила,
12)
9-Ацетамедо-1-метил-3,6диазагомоадамантан, 13) Спиро [4,5] декан-7-он,1,8-диметил-8,9-эпокси-4изопропил,
14)
6-[1-(Гидроксиметил)винел]-4,8a-диметил-4a,5,6,7,8,8aгексагидро-2(1H)-нафталенон.
Результаты химических анализов показали чистоту образцов аира болотного
и верблюжьей колючки на содержание тяжелых металлов (кадмий, мышьяк,
ртуть, свинец), и пестицидов (альдрин, альфа изомер ГХЦГ, гамма изомер
ГХЦГ, гептахлор, ДДД, ДДТ, ДДЭ, кельтан), что свидетельствует о
20
6.
7.
возможности безопасного использования их в различных производствах.
Полученные результаты были сравнены со стандартами на допустимые
нормы, действующие в России и в европейских странах.
Эфирное масло, извлеченное методом гидродистилляции и спиртовые
экстракты из аира болотного и верблюжьей колючки обладают различной
степенью торможения роста Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis и
Escherichia coli. Исследования подтверждают, необходимость дальнейшего
изучения антибактериальных свойств этих растений для расширения
возможностей их практического применения.
Представлена технология изготовления водно-спиртовых экстрактов аира
болотного (Acorus calamus) и верблюжьей колючки (Alhagi pseudalhagi)
произрастающих в Астраханской области для их использования в различных
производствах.
РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Изучение биологических особенностей произрастания аира болотного
показало перспективность его возделывания в условиях Астраханской области.
2. Возможно использование дикорастущей верблюжьей колючки в
Астраханской области для получения экстрактов с целью их применения в
производстве пищевых добавок и в фармацевтической отрасли.
3. Рекомендуется расширение культивирования аира болотного для
получения из него эфирных масел, так как они имеют большое значение в
производстве лекарственных средств, использовании в пищевых добавках в
производствае парфюмерии и косметики, что может быть в дальнейшем
востребовано в Астраханской области.
1.
2.
3.
4.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В
ВЕДУЩИХ РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ ИЗДАНИЯХ:
Абдул-Хафиз И.Й. Влияние качественного состава почв Астраханской
области на рост и количество эфирных масел аира болотного / И.Й. АбдулХафиз, М.А. Егоров // Вестник Алтайского государственного аграрного
университета № 4 (66), 2010. – С. 30-34.
Абдул-Хафиз И.Й. Биологические исследования роста верблюжьей колючки
на различных почвах Астраханской области / И.Й. Абдул-Хафиз, М.А.
Егоров // Вестник Алтайского государственного аграрного университета № 5
(67), 2010. – С. 61-64.
Абдул-Хафиз И.Й. Исследования летучих органических компонентов
эфирных масел аира болотного (Acorus calamus) методом газовой
хроматографии и масс-спектрометрического анализа / И.Й. Абдул-Хафиз,
М.А. Егоров // Естественные науки № 4 (33), 2010. – С. 152-160.
Абдул-Хафиз И.Й. Оценка остатков тяжелых металлов и хлорорганических
пестицидов в экстрактах аира болотного (Acorus calamus) и верблюжьей
колючки (Alhagi pseudalhagi) собраных в Астраханской области / И.Й.
Абдул-Хафиз, М.А. Егоров // Естественные науки № 4 (33), 2010. – С. 46-52.
21
5.
6.
7.
8.
9.
Абдул-Хафиз И.Й. Антибактериальная активность эфирного масла и
спиртовых экстрактов аира болотного (Acorus calamus) и верблюжьей
колючки (Alhagi pseudalhagi) собранных в Астраханской области / И.Й.
Абдул-Хафиз, М.А. Егоров и Л.Т. Сухенко // Вестник Алтайского
государственного аграрного университета № 3 (77), 2011. – С. 50-54.
ПУБЛИКАЦИИ В ДРУГИХ ИЗДАНИЯХ
Абдул-Хафиз И.Й. Возможность получения эфирных масел из
лекарственных растений: верблюжья колючка и аир болотный,
произрастающих в Астраханской области / И.Й. Абдул-Хафиз, М.А. Егоров //
Материалы V всероссийской научной конференции студентов и молодых
ученых с элементами научной школы «Актуальные проблемы
инновационного развития агропромышленного комплекса», АГУ, г.
Астрахань, 29 октября – 1 ноября 2009 г. Астрахань, издательский дом
«Астраханский университет», 2009. – С. 54-55.
Абдул-Хафиз И.Й. Изучение изменений роста и содержания эфирного масла
в аире болотном, произрастающем в различных районах Астраханской
области / И.Й. Абдул-Хафиз // Материалы международной научнопрактической конференции «Приоритеты и интересы современного
общества», АГУ, г. Астрахань, 12-13 апреля 2010 г. Астрахань, издательский
дом «Астраханский университет», 2010. – С. 212-214.
Абдул-Хафиз И.Й. Биоэкологические исследования для оценки
эффективности роста верблюжьей колючки (Alhagi pseudalhagi) в
Астраханской области / И.Й. Абдул-Хафиз, М.А. Егоров // Материалы
международной конференции с элементами научной школы для молодежи
«Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии»,
АГУ, г. Астрахань, 7 – 10 декабря 2010 г. Астрахань, издательский дом
«Астраханский университет», 2010. – С. 313-316.
Абдул-Хафиз И.Й. Антибактериальные свойства эфирных масел и
экстрактов некоторых растений Астраханской области / И.Й. Абдул-Хафиз,
М.А. Егоров и Л.Т. Сухенко // Материалы международной конференции с
элементами
научной
школы
для
молодежи
«Экокультура
и
фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии», АГУ, г.
Астрахань, 7 – 10 декабря 2010 г. Астрахань, издательский дом
«Астраханский университет», 2010. – С. 316-318.
22