Методы изучения генетич. полиморфизмов. Штрих
advertisement
1 Методы изучения генетического полиморфизма растений и животных. Штрих-кодирование Под генетическим полиморфизмом понимается состояние длительного разнообразия генотипов, когда частота даже наиболее редко встречающихся генотипов в популяциях превышают 1%. Генетический полиморфизм поддерживается за счет мутаций и рекомбинаций генетического материала. Как показывают многочисленные исследования, генетический полиморфизм широко распространен. Так, по теоретическим расчетам в потомстве от скрещивания двух особей, различающихся лишь по десяти локусам, каждый из которых представлен 4 возможными аллелями, окажется около 10 млрд. особей с различными генотипами. Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими разновидностями – аллелями, что обусловливает разнообразие признаков внутри вида. Различия между аллелями одного и того же гена, как правило, заключаются в незначительных вариациях его "генетического" кода. Большинство известных полиморфизмов выражаются либо в заменах одного нуклеотида, либо в изменении числа повторяющихся фрагментов ДНК. Полиморфизмы нуклеотидных последовательностей обнаружены во всех структурных элементах генома: экзонах, интронах, регуляторных участках и т.д. Тем не менее, вариации, затрагивающие кодирующие фрагменты генов и отражающиеся на аминокислотной последовательности их продуктов, встречаются относительно редко и не имеют отношения к анализируемой конкретной проблеме, для которой в первую очередь важны возможные последствия полиморфизма интронов и 5'концевых некодирующих последовательностей. Анализ данного феномена в существенной степени зависит от того, насколько вариабельны собственные функции белка, кодируемого различными аллелями, что справедливо и в отношении ферментов образования и метаболизма стероидных гормонов. Бурному развитию исследования генет. полиморфизма (с 2005 г. постгеномная эра) способствовало определение полной нуклеотидной последовательности генома человека. К настоящему моменту в открытых базах данных есть информация о нескольких миллионах SNP в геноме человека, лишь небольшая часть из которых (примерно 1%) расположены в транскрибируемых регионах и могут оказывать влияние на структуру и функцию продукта, кодируемого данным геном. Точечные нуклеотидные полиморфизмы (SNP-Single Nucleotide Polimorphisms), а также другие мутации ДНК (делеции, инсерции) могут быть ассоциированы с развитием мультифакториальных заболеваний, таких как сахарный диабет 1 и 2 типов, сердечнососудистые, бронхо-легочные, онкологические и другие заболевания. Зная о наличии определенного перечня полиморфизмов у пациента, можно предупредить развитие заболевания или скорректировать лечение уже проявившейся патологии. Генотипирование позволяет повысить безопасность лечения, подобрать дозу препарата и избежать нежелательных побочных эффектов. Современные методы выявления генетич полиморфизма отличаются точностью, чувствительностью и пропускной способностью. К традиционным методам относятся: 1. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ, Restriction fragment length polymorphism, RFLP) — это способ исследования геномной ДНК, путем разрезания ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции и дальнейшего анализа размеров образующихся фрагментов (рестриктов) путем гель-электрофореза (ДНК электрофореза). 2 Метод заключается в подборе рестриктазы (фермент, расщепляющий ДНК вблизи строго которая узнавала бы последовательность с одним аллелем и не узнавала бы с другим. Две молекулы ДНК будут разрезаны на фрагменты одинаковой длины, если молекулы идентичны. Но если в одной молекуле есть сайт рестрикции, а в другой нет, то фрагменты будут различной длины. Если в одной молекуле будет больше пар оснований до сайта рестрикции, чем в другой, то фрагменты также будут различными и т.д. На практике это означает, что, разрезая эндонуклеазами рестрикции часть генома двух индивидуумов одного вида, можно получить фрагменты различной длины, в зависимости от строения проверяемой части генома индивидуума. Это также значит, что при сравнении гомологичных районов обеих хромосом пары можно получить фрагменты различной длины. Такая картина наблюдается, если в хромосоме есть делеция, или гденибудь между сайтами рестрикции существует инсерция — мутация, убирающая сам сайт рестрикции, а также если аллели генов различны между сайтами рестрикции. В результате после амплификации, рестрикции и электрофореза на геле наблюдаются полосы разных длин, комбинации которых соответствуют различным генотипам. При использовании данного исследования получаются различные результаты от различных образцов, и при помощи данного метода можно идентифицировать некоторые различия в последовательности нуклеотидов ДНК, в случае, когда они располагаются в сайте рестрикции. В виду того, что технологии секвенирования ДНК могут охарактеризовать ДНК очень точно, ПДРФ был разработан как первый и дешевый метод для массового применения. Таким образом, метод включает в себя следующие этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК идентификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрикции, путем блот-гибридизации по Саузерну. Анализ разнообразия ПДРФ является важным инструментом в картировании генома, локализации генов, ответственных за генетические заболевания, определения риска заболевания, получения генетических отпечатков и определения родства. Так, например, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов наследуются по законам Менделя и представляются незаменимыми при определении генов наследственных болезней, например болезни Хантингтона (генетическое заболевание нервной характерной для него последовательности нуклеотидов), системы, характеризующееся постепенным началом обычно в возрасте 30-50 лет и сочетанием прогрессирующего хореического гиперкинеза и психических расстройств). Ученые исследуют популяции с высокой частотой заболевания болезнью на наличие ПДРФ, наследуемого страдающими от болезни людьми, но не встречающегося у здоровых людей. Это хороший индикатор того, что полиморфизм длин рестрикционных фрагментов расположен около гена болезни. Также в редких случаях, которые очень удобны для проведения диагностики, мутировавший ген изменяет непосредственно ПДРФ. Например, при серповидноклеточной анемии отсутствует сайт рестрикции (короткая последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, которая распознаётся ферментом эндонуклеазой рестрикции-модификации (рестриктазой)) в гене больных людей, но он есть в гене людей здоровых (рис. 1). В результате у нормальных клеток два фрагмента в ПДРФ, а у клеток больных людей — только один. 3 Благодаря простоте и надёжности метод получил широкое распространение и до сих пор популярен, хотя и имеет некоторые ограничения – во-первых, он позволяет детектировать только SNPs, расположенные в сайтах рестрикции, а во-вторых, годится лишь для детекции уже известных мутаций. На слайде представлена информация о достоинствах, недостатках, коммерческой доступности, оборудовании, области применения и стоимости расходных материалов. Достоинства: Очень дешев - цена зависит только от цены рестриктазы, не требует высокой квалификации персонала и дорогостоящего оборудования, всем необходимым оснащена любая ПЦР-лаборатория, занимающаяся, например, диагностикой инфекций, возможно генотипирование единичных образцов ДНК. Недостатки: Достаточно долгое время анализа - более 6-8 часов до получения результата, низкая производительность, отсутствие возможности автоматизации. Коммерческая доступность: Отечественными фирмами продаются наборы как и для уже давно известных полиморфных маркеров, так и для новых полиморфизмов. Оборудование: Стандартное оборудование ПЦР-лаборатории. Область применения: Типирование средних по размеру выборок (до нескольких сотен образцов), до 10-20 полиморфных маркеров. Стоимость расходных материалов: 10-60 руб. на пробу на один полиморфный маркер. 2. Как я уже говорила метод Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов годится лишь для детекции уже известных мутаций. Последнее ограничение удалось обойти, поменяв местами этапы амплификации и рестрикции. Данный метод получил название полиморфизм длины амплификационных фрагментов (ПДАФ, AFLP - amplification fragment length polymorphism). Аналогичен полиморфизму длин рестрикционных фрагментов, но применяется для повторов и полиморфизмов типа вставка/удаление (рис. 2). Сначала геномная ДНК обрабатывается набором рестриктаз (как правило, сочетанием двух рестриктаз, узнающих 6и и 4х нуклеотидные последовательности). К полученным фрагментам лигируются адапторы. Для последующей амплификации используются праймеры, комплементарные адапторной последовательности и заходящие за сайт рестрикции на три произвольно выбранных нуклеотида. Триплеты обеспечивают амплификацию лишь некоторой части рестрикционных фрагментов. Метод позволяет анализировать большое количество SNPs без знания их нуклеотидной последовательности. Рис. 2 AFLP анализ штаммов E.coli. По два независимых анализа штаммов BL21, BL21F'IQ, DH5[alpha], DH5[alpha]F'IQ, HB101. Стрелками отмечены полиморфные сайты. У метода достоинства и недостатки как у ПДРФ. Коммерческая доступность: отечественными фирмами продаются наборы как и для уже давно известных медикам полиморфных маркеров, так и для новых полиморфизмов. Широко используется в наборах для идентификации личности. 4 3. Аллель-специфичная амплификация с детекцией результатов электрофорезом (allele-specific PCR) и сюда же можно отнести Аллель-специфичная амплификация с детекцией результатов амплификатором в реальном времени (allele-specific real-time PCR) Объединяет в себе множество подходов, но основная идея заключается в том, что полимераза с разной эффективностью обрабатывает полностью спаренный и неспаренный нуклеотид на 3`-конце праймера. Аллельные варианты различаются за счёт того, что 3' концевой нуклеотид одного из праймеров гибридизуется непосредственно с позицией SNP. Степень дискриминации мисматчей (спаривание несосответствующих друг другу (mismatch) оснований ДНК) можно повысить вводя дополнительный, неспаренный нуклеотид во второй или третей позиции с 3' конца этого же праймера. Ещё один способ повышения специфичности - проведение в той же пробирке конкурирующей ПЦР реакции. К сожалению, хуже всего различаются мисматчи типа G:T, которые соответствуют наиболее часто встречающемуся типу SNPs - транзициям (это мутация замены оснований, когда одно пуриновое основание замещается на другое пуриновое основание (аденин на гуанин или наоборот), либо пиримидиновое основание на другое пиримидиновое основание (тимин на цитозин или наоборот) C<=>T (G<=>A). В идеале стараются добиться полного подавления амплификации неспецифического фрагмента. К настоящему времени разработано множество методик аллель-специфичной ПЦР и из очень капризного метода начала 90-х она превратилась в удобный для применения инструмент. Именно этот метод реализован в наборах «SNP-экспресс» производства ООО НПФ “Литех”: Анализу подвергается геномная ДНК человека, выделенная из лейкоцитов цельной крови или из слюны С образцом выделенной ДНК параллельно проводятся две реакции амплификации с аллель-специфичными праймерами. В зависимости от формата набора детекция результатов проводится в режиме реального времени или методом электрофореза в агарозном геле. Преимуществом использования амплификатора в реальном времени является отсутствие этапа электрофореза и снижение вероятности контаминации, а также уменьшение времени анализа. Результаты анализа позволяют дать три типа заключений: нормальная гомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота. Реагент ДНК-экспресс кровь Рис. 4. Анализ геномной ДНК человека, выделенной из лейкоцитов цельной крови 5 Рис. 5. Анализ геномной ДНК человека, выделенной из лейкоцитов цельной крови На рис. 6. представлены электрофореническая схема детекции и детекция результатов с помощью Real-time ПЦР, где К – отрицательный контроль, 1 – нормальная гомозигота, 2 – гетерозигота 3 – мутантная гомозигота. На втором рисунке детекция результатов в режиме Real-time PCR. Результат оценивался по расположению … 4. Аллель-специфичные зонды (allele-specific hybridization). Наборы ABI TaqMan, наборы с FLASH-детекцией. Основан на способности полимеразы разрушать встречающиеся комплементарные олигонуклеотидные зонды (5`->3` экзонуклеазная активность). Зонд содержит флуоресцентный краситель на 5`-конце и тушитель флуоресценции на 3`-конце. Полностью комплементарный зонд (один аллель) расщепляется полимеразой, краситель высвобождается и сигнал флуоресценции, соответствующий этому аллелю, растет. Дуплекс с зондом с одним неспаренным нуклеотидом (второй аллель) имеет меньшую температуру плавления и не разрушается, а отщепляется полимеразой целиком. По отношению уровней флуоресценции от обоих зондов судят о наличии в пробе одного или другого аллеля. Основная разница между наборами разных производителей Наборы ABI TaqMan, наборы с FLASH-детекцией – в методах увеличения различия в температурах плавления, что определяет качество дискриминации аллелей, и улучшения соотношения сигнал/шум, что определят чувствительность. 6 Достоинства, недостатки, коммерческая доступность, оборудование и область применения представлены на слайде. Достоинства: Не требует высокой квалификации персонала, обладает высокой производительностью, возможна автоматизация. Недостатки: Большой срок поставки зарубежных наборов, сложности с генотипированием единичных образцов (возрастает стоимость). Коммерческая доступность: Наборы TaqMan® SNP Genotyping Assays от Applied Biosystems, наборы сFLASH-детекцией, наборы AmpliFlash Оборудование: Стандартное оборудование ПЦР-лаборатории, ПЦР-детектор "Джин" (для малых выборок, 2000 евро) или реал-тайм амплификатор (для больших выборок, от 20 тыс. евро). Область применения: Типирование средних и больших по размеру выборок (до нескольких десятков тысяч образцов), до 100-200 полиморфных маркеров. 5. Элонгация праймера (SBE – single-base primer extension) Наборы ABI SNaPShot, MassARRAY iPLEX, минисиквенирование на биочипах, Luminex 100, Perkin-Elmer FP-TDI и др. Основан на присоединении дидизоксинуклеотида, комплементарного позиции SNP, к 3`-концу праймера и последующей детекции продукта присоединения различными методами – капиллярным электрофорезом (SNaPShot), масс-спектрометрией (MassARRAY), ДНК-микрочипами и т.д. Решение на базе проточной цитофлуорометрии (Luminex 100) отличается не только чрезвычайно высокой производительностью, но и чрезвыйчайно высокой ценой (более 100 тыс. евро). Достоинства, недостатки, коммерческая доступность, оборудование область применения представлены на слайде. 6. Лигирование олигонуклеотидных зондов (oligonucleotide ligation assay) При проведении этих реакций специфические ДНК- или РНК- последовательности исследуют путем использования их в качестве матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотидных зондов. ДНК-зонды для лигирования подбирают таким образом, чтобы они были полностью комплементарны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации, причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят флуоресцентную метку, а другой метят биотином. После гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК-лигазами из термофильных микроорганизмов. Такие ферменты работают при высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях, необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При наличии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, непосредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие терминального неспаренного основания в смежно расположенных последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лигирования, и при определенных условиях проведения реакции сшивки между зондами в этом случае не происходит. Метод включает несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также дотированные последовательности. В дальнейшем проводят электрофоретический/каппилярный анализ меченых однонитевых фрагментов ДНК. На Рис. 7. представлена схема Лигирования 7 а) к одноцепочечной матрице присоединяют праймер, примыкающий к тому сегменту матричной ДНК, который хотят секвенировать; б) синтезируют короткие олигонуклеотидные зонды, в которых в заданной позиции содержится один из четырёх нуклеотидов — А, Т, G или С, в) после того как один из зондов находит комплементарный нуклеотид в матрице, лигаза сшивает его с праймером Достоинства, недостатки, коммерческая доступность, оборудование, область применения представлены на слайде. 7. Гибридизация олигонуклеотидных зондов (Hyb Probes) Был создан для приборов LightCycler, но получил распространение и для других систем из-за своей простоты и дешевизны. Основан на тримолекулярном взаимодействии ДНК и двух зондов в области нуклеотидной замены и различий в кривых плавления. Гибридизующийся зонд в этом случае используется в качестве матрицы для синтеза ДНК с иммобилизованного олигонуклеотида. Вместо dNTP, можно добавлять в реакцию меченые ddNTP одновременно для терминации реакции синтеза и мечения получающегося продукта. Таким образом можно получить информацию о следующем за праймером нуклеотиде, соответствующем позиции SNP. В отличие от чипов, используемых для гибридизационного анализа (the Affymetrixв chip; Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), в этом случае олигонуклеотиды иммобилизуются на поверхности за 5' конец, оставляя 3'конец свободным для элонгации. Существует множество вариаций этой методики и сама реакция может заключаться как в непосредственной элонгации праймера (если праймер лежит вплотную к SNP, (рис. 8, где представлена схема аллельспецифического удлинения праймеров, иммобилизованных на матрице), так и в элонгации, определяемой праймером (если 3' нуклеотид праймера соответствует одному из аллельных состояний SNP и элонгация праймера зависит от того, комплементарен этот нуклеотид матрице или нет). Кроме минисеквенирования на твердой фазе, существуют и другие способы детекции продуктов реакции минисеквенирования, например ELISA, или разделение в геле В качестве иммобилизованной на микроматрице ДНК используются как синтезированные олигонуклеотиды, так и ПЦР-продукты. Связь с подложкой может осуществляться например, за счет посадки биотинилированных фрагментов на стептавидиновые частицы, или за счет образования ковалентных связей с дисульфидными группами на 5'конце олигонуклеотида. ddNTP можно метить флуоресцентными красителями, биотином (если только его уже не использовали для пришивки олигонуклеотида к матрице) или гаптенами (низкомолекулярные вещества, не обладающие иммуногенностью и приобретающие их при увеличении молекулярного веса (например за счет которые можно детектировать с помощью конъюгированных с щелочной фосфатазой или пероксидазой антител в формате ELISA. Для успешного широкомасштабного генотипирования кроме создания микроматрицы, требуется наладить еще и проведение надежного множественного ПЦР. Достоинства, недостатки, коммерческая доступность, оборудование, область применения на слайде. прикрепления к специальному белку-носителю- т. н. «шлепперу»), 8 Также существуют химические методы для изучения генетических полиморфизмов. Достоинством химического расщепления является практически 100% узнавание всех типов гетеродуплексов. В настоящее время на это не способен ни один ферментативный метод. Кроме того, возможно локализация и идентификация мутаций. Недостаток достаточно сложная процедура и токсичные реактивы. Ещё один способ химической детекции SNPs - зависящий от структуры дуплекса гидролиз сильно флуоресцирующего acridinium ester в слабощелочных условиях (проходит эффективнее, если флуорофор находится в непосредственной близости от мисматча). Детектируется исчезновение флуоресценции после гидролиза. Было описано химическое лигирование, способное эффективно различать как 5', так и 3' концевые мисматчи. 1. Дискриминация аллельных вариантов электрофорезом SSCP (single strand conformation polymorphism) и анализ гетеродуплексов первыми начали применяться для обнаружения полиморфных участков ДНК. Благодаря простоте и относительно высокой чувствительности эти методы постоянно модернизируются и широко используются и в настоящее время. 2. Полиморфизм конформации одноцепочечной ДНК Традиционный SSCP анализ включает денатурацию ПЦР-продуктов и разделение их в неденатурирующем геле (Pис. 9). Электрофоретическая подвижность одноцепочечных фрагментов зависит в этом случае от их нуклеотидной последовательности, определяющей характер вторичных и третичных структур, и меняется даже при отличии в один нуклеотид. Простота метода, умеренная стоимость и возможность использования флуоресцентной метки и капиллярного электрофореза (ABI Prism 310) позволяет легко автоматизировать процесс и анализировать одновременно большое количество локусов. 3. Анализ гетеродуплексов В этом случае денатурированные тестерный и анализируемый ПЦР-продукты не разделяют в геле, а сначала позволяют им ренатурировать. Одноцепочечные фрагменты образуют дуплексы. Если последовательности двух цепей полностью комплементарны, то будут образовываться гомодуплексы, если они отличаются хотя бы на один нуклеотид гетеродуплексы. Гомо- и гетеродуплексы имеют разную электрофоретическую подвижность и могут быть разделены в неденатурирующем геле. В лабораторных исследованиях меченые Су-5 ПЦР-продукты с известным нуклеотидом в позиции SNP смешиваются с анализируемыми ПЦР-продуктами. К физическим методам детекции генетических полиморфизмов относят: Массспектрометрическое секвенирование, Резонансный перенос энергии флуоресценции, Флуоресценция, зависящая от локального окружения. Масс-спектрометрическое секвенирование Альтернативой существующим методам детекции полиморфных участков ДНК является масс-спектрометрическое дифференциальное секвенирование. Время, затрачиваемое на анализ каждого образца этим методом составляет всего несколько секунд. На примере гена ТР53 было показано, что метод очень чувствителен, достоверно детектирует гомо- и гетерозиготы и позволяет оценить долю SNP при анализе нескольких 9 образцов одновременно. Ионизированные молекулы ДНК отрываются от подложки методами MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionisation) и ESI (electrospray ionisation). Они разгоняются в электрическом поле и направляются через вакуумную камеру к детектору. Время движения регистрируется. Время обратно пропорционально скорости молекулы, которая, в свою очередь прямо пропорциональна отношению массы летящей молекулы к ее заряду. Эти параметры (отношение массы к заряду) - уникальны для каждой молекулы и определяются исключительно ее нуклеотидной последовательностью, поэтому чувствительность метода чрезвычайно высока. Метод позволяет работать с нанолитрами образца ( Масс-спектрометрический анализ успешно применяется для визуализации результатов детекции SNP другими методами, например минисеквенированием или инвазивным расщеплением. Резонансный перенос энергии флуоресценции Резонансный перенос энергии флуоресценции - ещё одно физическое явление, активно использующееся для SNP анализа. Оно позволяет следить за состоянием молекулы зонда в пробирке оптическими методами, непосредственно в ходе реакции. Принцип явления заключается в том, что если два флуорофора расположены в непосредственной близости друг от друга (в большинстве реализаций метода - на одном олигонуклеотиде) и спектр испускания первого совпадает со спектром поглощения второго (тушителя), то при возбуждении первого вместо флуоресценции будет происходить передача энергии на тушитель. При увеличении расстояния между флуорофором и тушителем (например, если какой либо из флуорофоров отщепляется от олигонуклеотида) флуоресценция восстанавливается. Наиболее широко используется резонансное тушение флуоресценции в TaqMan системе, позволяющей контролировать кинетику ПЦР амплификации непосредственно в ходе реакции. Для детекции используется не способный удлиняться зонд, несущий флуорофор и тушитель и комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда Taq полимераза разрушает его в ходе ПЦР реакции за счёт экзонуклеазной активности, сопряжённой с синтезом ДНК, флуоресцентная группа переходит в раствор и отдаляется от тушителя. Используя два аллель-специфических зонда с различными флуоресцентными метками можно надёжно различать гомо и гетерозиготы (Pис. 10, 11). В методе минисеквенирования для детекции связавшихся меченых ddNTPs можно использовать систему FRET (fluorescence resonance energy transfer). Включенные при элонгации флуоресцентно-меченые ddNTP получают энергию от FITC расположенного на 5' конце праймера. Для детекции используется TaqManв system(ABI 700). Другой способ зарегистрировать точечные мутации в одной пробирке - это гибридизовать несущий мутацию фрагмент ДНК с одноцепочечными олигонуклеотидами, которые становятся флуоресцентными, когда связываются с полностью комплементарными молекулами. Такие олигонуклеотиды (molecular beacons) сами по себе имеют структуру шпильки, при этом флуорофор и тушитель на концах шпильки оказываются близко друг от друга. Шпилька разрушается при гибридизации molecular beacon с комплементарным фрагментом ДНК. Количество SNP, одновременно детектируемых таким способом, зависит от количества используемых флуорофоров и качества molecular beacons (эффективности тушения в неактивном состоянии). Флуоресценция, зависящая от локального окружения Использование в качестве репортерного флуорофора terbium chelate позволяет проводить TaqMan подобный анализ без использования тушитель, так как флуоресценция terbium chelate зависит от локального окружения и гораздо слабее в ассоциации с одноцепочечной ДНК, чем в растворе. 10 Таким образом, большое количество более чувствительных и избирательных подходов для выявления SNP были введены в последние годы. Методы SNP генотипирования успешно применяются при исследовании таких важных аспектов медицины, как анализ Y-хромосомы и определение гаплотипов мтДНК. Идеального метода для SNP типирования нет, и выбор соответствующей методики определяется тем, что необходимо исследователю Штрих-кодирование На сегодняшний день науке известно около 1,7 млн. видов живых организмов, в то время как по оценочным данным их существует не менее 10 млн. Таким образом, 80% видов еще не описано. Если бы изучение биоразнообразия продолжалось классическими методами, то на полную каталогизацию Природы понадобились бы многие десятилетия. Новый метод – ДНК-штрихкодирование – значительно ускоряет этот процесс. Международная программа «Штрихкод жизни» ставит своей целью создание библиотеки штрихкодов для всех видов на Земле. В идеале каждый штрихкод должен однозначно идентифицировать вид (так же, как штрихкод на упаковке товара). Таким образом, ДНК-штрихкодирование – новый метод каталогизации биологического разнообразия – основан на том, что каждый из существующих на планете видов животных и растений можно однозначно идентифицировать по сравнительно небольшому фрагменту его генома. По этой метке любой организм, даже поврежденный, сохранившийся в виде какого-то фрагмента или находящийся на ранней стадии развития (не похожей на взрослое его состояние), мог бы быть точно определен. Использование в биологической систематике нуклеотидных последовательностей – не новая концепция, и программа «Штрихкод Жизни» – отнюдь не первая в ряду молекулярно-биологических баз данных, созданных для решения в том числе и проблем биосистематики. До 80-х годов ХХ века описание видов живых организмов, эволюционных взаимосвязей между ними, построение филогенетических (эволюционных) деревьев осуществлялись, как правило, на основе сравнительной эмбриологии, анатомии, морфологии и палеонтологических материалов. В 1982 г. была создана одна из первых международных открытых баз генетических данных, GenBank . Анализ нуклеотидных последовательностей во многом меняет устоявшиеся представления о родстве видов и самой их идентичности, а иногда приводит к глобальному пересмотру крупных таксонов. Так, в результате исследования гена 16S рРНК в 1985 году американец Карл Вёзе разделил прокариотические организмы, которые ранее все назывались просто «бактериями», на два надцарства: эубактерии («настоящие» бактерии) и археи . В обзорной работе, написанной сотрудницей Ботанического института им. В.Л. Комарова В.С. Шнеер, подробно рассказывается о ДНК-штрихкодировании, его истории, области применения и перспективах. В 2003 году канадский ученый Пол Хеберт (Paul Hebert ) предложил использовать для видовой идентификации живых организмов короткие стандартные последовательности цепи ДНК (это и называется ДНК-штрихкодированием, DNA barcoding) гена, который есть у всех животных и растений. Это ген цитохромоксидазы 1, Со-1 (соответствующий белок принимает участие в процессах дыхания). Со-1 – это 11 короткий ген, состоящий примерно из 650 нуклеотидов. Благодаря 2-м этим обстоятельствам он и получил предпочтение среди других маркеров. В 2004 году был основан международный консорциум «Штрихкод жизни» («Consortium for the Barcode of Life, CBOL ). 2005 год – Россия присоединилась к этому проекту. И вступило также 69 организаций из 31 страны (университеты, естественно-научные музеи, зоопарки, ботанические сады, агентства, занимающиеся природоохранной деятельностью, и т.д.) 2006 год – их численность составила 133. Конечная цель проекта – «идентифицировать» все известные и пока неизвестные виды и дать возможность легко определять принадлежность того или иного организма к конкретному виду. Сейчас биологами описано около 1 млн. 700 тыс. видов животных и растений (не считая микробов). Предполагается, что всего существует не менее 10 млн. видов, то есть большинство их еще не выявлено. Сформированы два подпроекта: Fish-BOL, по которому будут даны «штрих-коды» 20 000 видов морских и пресноводных рыб и «Птицы Северной Америки» (10 000 видов должны быть кодированы к 2010 году). К 2006 г. кодированы - 2453 видов рыб. 2007 год – прошла вторая международная конференция по описанной проблематике в рамках глобальной инициативы (Тайбэй, сентябрь 2007). В России начал реализовываться пилотный проект по штрих-кодированию видов рыб. И было проведено рабочее совещание по этой теме (Владивосток, 12-15 июня 2007 г.). Программа «Штрихкод Жизни» особенный упор делает на стандартизацию и координирование работы. Информация о живых организмах, чьи штрихкоды вносятся в библиотеку, обязана быть максимально четкой. «Штрихкод Жизни» предполагает создание библиотеки ДНК-штрихкодов (ДНКШК) для всех видов, живущих на планете, путем прочтения одного и того же участка генома каждого из них. Основные требования к эталонному участку ДНК: 1) небольшой размер (от 500 до 600-800 нуклеотидов); 2) последовательность нуклеотидов ДНК-ШК должна быть одинаковой у особей одного вида и достоверно различаться у особей разных видов; 3) во избежание ошибок последовательность нуклеотидов должна быть прочитана в обоих направлениях (с обеих цепочек ДНК); 4) необходимо знать прямой и обратный праймеры , чтобы можно было без труда выделить нужный участок ДНК из клеток исследуемого организма; 5) количество полиморфных (т.е. различающихся у разных особей одного и того же вида) позиций (нуклеотидов) в последовательности не должно превышать 1%. По такому ДНК-ШК можно опознать живое существо даже по крошечному фрагменту любой ткани, практически не повреждая организм. Определение по штрихкоду особенно актуально в случаях, когда классические методы «не работают». Например, если имеются внешне неотличимые виды-двойники, или, наоборот, виду присущ половой диморфизм. Важно и то, что выбранные участки ДНК будут совпадать у особей на любой стадии развития: от яиц или семян до взрослых половозрелых организмов. ДНК-ШК упрощает определение мелких и морфологически вариабельных видов. Большую роль штрихкодирование играет в исследовании редких видов, которых нежелательно убивать даже в научных целях. Оно позволяет проводить так называемый неинвазивный анализ (без проникновения, не нарушающий телесную целостность): по зубам, перьям, меху, 12 яичной скорлупе, сброшенной коже, по выделяемой слизи и слюне. Естественно, ДНК также можно выделить из музейных образцов: гербариев, скелетов, заспиртованных препаратов. Создатели программы «Штрихкод Жизни» предполагают возможность существования универсального для всех организмов (или по крайней мере для эукариот) ДНК-ШК и предлагают в качестве эталона использовать 5'-фрагмент первой субъединицы митохондриального гена, кодирующего белок цитохром-С-оксидазу (СО1 ). В группу каталогизируемых живых организмов не попадают пока прокариоты (по причине отсутствия у них митохондрий как таковых). Для растений фрагмент СО1 не подходит в качестве эталона в силу низкой и очень неравномерной вариабельности этой последовательности. Поэтому штрихкодирование растений осуществляют при помощи других фрагментов ДНК (ITS , ядерная рРНК, участки хлоропластного генома). У грибов длина СО1 существенно варьирует из-за присутствия интронов, поэтому в филогенетике грибов используют различные последовательности ядерной ДНК. Однако у животных разных видов уровни внутри- и межвидовой вариабельности фрагмента СО1 различаются в среднем в 5-20 раз, и метод ДНК-ШК в целом неплохо работает. Так например, по традиции таксономисты и систематики описывают виды словесно — как выглядят, как живут, как размножаются и т. п. «Штрихкод жизни» предлагает новый подход. Идея проста: у представителя любого вида выделить в его митохондриальной ДНК стандартный для всего живого участок, секвенировать его (то есть определить последовательность нуклеотидов) и занести информацию в соответствующую базу данных, размещенную в интернете. Предположим, вы нашли какое-то необычное растение. Чтобы узнать, что это такое, надо определить штрихкод этого растения и сравнить его с уже имеющимися в базе данных. Если расхождение с известным кодом менее 3%, то найденное растение можно отнести к тому же виду, к которому принадлежит штрихкод из базы данных. Если же расхождение заметно больше 3%, то имеет смысл уже говорить об открытии нового вида. В наше время определение штрихкода (то есть нуклеотидной последовательности) — вполне стандартная процедура. Нужны только аппараты для полимеразной цепной реакции (ПЦР) и автоматические секвенаторы. Однако уже очень скоро на рынке появятся карманные мобильные секвенаторы, напоминающие мобильные телефоны и удобные для работы в полевых условиях. Если вы поймали неизвестную бабочку, достаточно оторвать у нее лапку и засунуть в этот секвенатор. Через какое-то время секвенатор, связанный с базой данных в интернете, сообщит, относится ли ваша бабочка к новому виду или к уже известному. Бабочку, конечно, жалко. Но справедливости ради надо отметить, что прежде для выделения ДНК перетерли бы в ступке десятки насекомых, а сейчас, благодаря новейшим методикам, хватит одной лапки Проект «Штрихкод жизни» активно распространяется по всему миру. Теперь и в России займутся штрихкодированием. В первую очередь это коснется исчезающих, редких, особо охраняемых и эндемичных видов растений и животных России. 13 В статье приведены интересные примеры выявления новых видов животных с помощью ДНК (не всегда митохондриальной). Жуков рода Rivacindela и бабочек рода Dioryctria сначала разбили на кластеры на основе анализа ДНК, а затем уже нашли морфологические и поведенческие отличия между полученными группировками. В пробах мелких донных пресноводных организмов была проведена идентификация последовательностей ДНК и на ее основе выявлены виды простейших, нематод, ракообразных и т.д. Ученые назвали такой метод «обратной таксономией». В.С. Шнеер описывает также результаты масштабного исследования ДНК китообразных. !!! Среди критических замечаний, высказываемых по поводу ДНКштрихкодирования, преобладают предостережения о несводимости науки таксономии к данному методу. В.С. Шнеер подчеркивает, что ДНК-штрихкодирование – только инструмент таксономии, а вовсе не тождественное с ней понятие. Метод в данном случае не покушается на Большую Науку. Высказываются и другие претензии к штрихкодированию (возможно, частично связанные с изначально завышенными ожиданиями). Так, в некоторых таксономических группах перекрываются интервалы внутри- и межвидовой вариабельности, молодые виды не всегда поддаются определению с помощью ДНК-ШК, внутриклеточные паразиты могут влиять на изменения митохондриальных генов. Много замечаний по неточности и неполноте исследования музейных коллекций, на базе которых строится библиотека штрихкодов. В статье неоднократно подчеркивается принятое на сегодняшний день мнение о необходимости комплексной работы молекулярных биологов и специалистов по систематике рассматриваемых групп. Обнаружение в каком-то таксоне группы организмов, отличающихся только по ДНК-ШК, не означает автоматического присвоения этой группе нового видового статуса, а скорее подчеркивает необходимость дальнейшего изучения таксона. Безусловным преимуществом обсуждаемого метода является его демократичность. Во-первых, планируется возможность комментариев и критики внесенных данных не только самими авторами, но и третьими лицами. Во-вторых, стандартизированная библиотека штрихкодов находится в свободном сетевом доступе. Втретьих, появление миниатюрных компьютеризованных секвенаторов , разработке которых уделяется большое внимание, позволит практически на бытовом уровне определять живые организмы обыкновенным людям (не специалистам-систематикам), что значительно расширит описание биоразнообразия в местном и глобальном масштабе. В.С. Шнеер также указывает области практического применения ДНКштрихкодирования: экологический мониторинг, карантинные службы, медицина, ветеринария, криминалистика, судебно-медицинская экспертиза, контроль лекарственных средств и продуктов питания. Интенсификация изучения биоразнообразия особенно актуальна в связи с тем, что по некоторым данным в результате негативного влияния хозяйственной деятельности человека каждый час с лица Земли исчезают три вида животных и четыре вида растений. Если эти данные верны, то за год биосфера нашей планеты теряет более 60 тысяч видов. Необходимость охраны природы не вызывает сомнений, но природоохранная деятельность предполагает предварительное этой природы каталогизирование.