Биферментная система светящихся бактерий представляет

СОДЕРЖАНИЕ:
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................... 2
1.1. Биферментная система светящихся бактерий ......................................... 2
1.2. Стабилизация биферментной системы светящихся бактерий за счет
иммобилизации в полимерные гели ................................................................... 3
1.3. Стабилизация ферментов светящихся бактерий за счет внесения
дополнительных компонентов ............................................................................ 5
1.4. Биологический мониторинг ....................................................................... 6
1.4.1
Методы ботестирования ...................................................................... 7
1.4.2 Биолюминесцентное биотестирование, основанное на светящихся
бактериях ........................................................................................................... 8
1.4.3 Биолюминесцентное
биотестирование,
основанное
на
использовании ферментативных реакций светящихся бактерий .............. 10
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.
1.1. Биферментная система светящихся бактерий
Для решения аналитических задач в биолюминесцентном анализе
широко используются светящиеся бактерии и выделенные из них ферменты,
в
том
числе
бактериальная
биферментная
система
НАДН:ФМН-
оксидоредуктаза-люцифераза (Л + Р) [1, 2, 3, 4].
Биферментная система светящихся бактерий представляет собой
реакцию, катализируемую двумя ферментами (НАДН:ФМН-оксидоредуктаза
и люцифераза), где одним из продуктов реакции является свет [5].
Принято считать, что люциферазы разных видов светящихся бактерий,
хоть и отличаются по своим физическим и каталитическим свойствам,
катализируют одну и ту же реакцию окисления длинноцепочечного
альдегида (RCHO) и восстановленного флавинмононуклеотида (FMNH2)
молекулярным кислородом (2) [6].
Вышеуказанная реакция протекает в результате сопряжения с реакцией
(1) [6], которую в свою очередь катализирует НАДН:ФМН-оксидоредуктаза.
НАДН:ФМН-оксидоредуктаза
NAD (P) H + FMN + H+
NAD (P)+ + FMNH2
(1)
люцифераза
RCOOH + FMN + H2O + свет.
RCHO + FMNH2 + O2
Методы,
основанные
на
данной
системе
ферментов,
(2)
широко
используются в медицине, фундаментальной биологии, микробиологической
промышленности и экологии, благодаря высокой чувствительности и
специфичности к анализируемым метаболитам, токсинам, мутагенам и т.
д.[4].
Однако использование ферментов светящихся бактерий осложняется их
неустойчивостью при различных воздействиях: повышенных температурах,
экстремальных значениях рН и т.д. [7, 8].
1.2. Стабилизация биферментной системы светящихся бактерий за счет
иммобилизации в полимерные гели
Иммобилизацию фермента можно определить как включение молекулы
фермента в какую-либо изолированную фазу, которая отделена от фазы
свободного раствора, но способна обмениваться с находящимися в ней
молекулами субстрата, эффектора или ингибитора [9]. Концентрации этих
веществ измеряют в свободном растворе. Фаза фермента обычно не
растворима в воде и часто представляет собой высокомолекулярный
гидрофобный полимер.
Включение фермента в полимерную матрицу осуществляется тремя
способами: 1) ковалентное связывание, 2) адсорбция, 3) физическое
включение. Возможно комбинирование этих приемов.
Ковалентное связывание
Широко
распространенный
метод, так
как
позволяет
получить
иммобилизованный фермент прочно связанный с полимерным носителем.
Недостатки данного метода, в первую очередь, сложность и большое
время изготовления препаратов (от 3 до 10 часов), а так же дороговизна.
Физическая адсорбция
Заключается в физической адсорбции на полимерной матрице без
ковалентного связывания. Сорбция может происходить с помощью ионных,
гидрофобных и водородных связей, а также за счет вандервальсовых сил.
Главный недостаток данного метода: обратимая природа связывания
фермента с носителем может приводить к его десорбции. Одна из причин,
часто вызывающих десорбцию фермента, служит добавление к нему
субстрата [10, 11].
Факторы,
принимаемые
во
внимание
при
выборе
способа
иммобилизации:
1) стабильность фермента в условиях протекания реакции;
2) реагенты, образующие поперечные сшивки, взаимодействовали с
группами не входящими в структуру активного центра;
3) поперечно сшивающий реагент должен быть как можно больших
размеров;
4) учитывать механическую прочность и форму носителя.
Требования, принимаемые во внимание при выборе носителя:
1) высокая химическая и биологическая стойкость;
2) высокая механическая прочность;
3) возможность получения различных форм – гранул, пластин, мембран,
трубочек и т.д.;
4) высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность связывания
фермента с носителем в водной фазе;
5) легкость активации фермента, связанного с носителем;
6) низкая стоимость.
Иммобилизация часто приводит к резким изменениям измеряемых
параметров ферментативной реакции (константа Михаэлиса, мах скорость
реакции, оптимумы температуры и рН, влияние ингибиторов и т.д.). Степень
этих изменений зависит от использованного метода иммобилизации и типа
ферментативной реакции.
В настоящее время предложено более десяти способов иммобилизации
ферментов светящихся бактерий на разных носителях [12, 13].
Одним из наиболее простых способов, является включение люцифераз в
полимерные гели. Важным преимуществом этого метода является то, что во
многих
случаях
иммобилизация
в
геле
приводит
к
значительной
стабилизации ферментов, поскольку многие полимерные гели обладают
высокой химической, механической и тепловой стойкостью. Этот фактор
является
особенно
важным
при
использовании
иммобилизованных
ферментов для анализа смесей характеризующихся различными значениями
рН, температуры, наличием высоких концентраций поверхностно–активных
веществ (например, для целей экологического мониторинга). Кроме того,
метод включения в полимерные гели универсален, поскольку применим для
иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем,
клеточных фрагментов и даже клеток [10, 11]. Основным недостатком метода
иммобилизации в полимерные гели является то, что полимерная матрица
может создавать препятствия для диффузии субстрата к ферменту, это может
приводить к снижению каталитической эффективности иммобилизованного
препарата.
Среди гелей различной природы наиболее перспективным носителем
для получения иммобилизованных препаратов ферментов светящихся
бактерий является крахмальный полимерный гель [14].
1.3. Стабилизация ферментов светящихся бактерий за счет внесения
дополнительных компонентов
Добавки, действующие как стабилизаторы, различаются по механизму
действия на ферменты, каталитическую активность которых они направлены
сохранить:
1) стабилизаторы SH-групп ферментов, например дитиотрейтол (ДТТ) и
меркаптоэтанол (Рис. 1);
2) стабилизаторы, увеличивающие вязкость раствора за счет увеличения
общей концентрации белка, например альбумины (Рис. 2).
(а)
(б)
Рисунок 1 – Структурные формулы ДТТ (а) и меркаптоэтанола (б) [15]
Рисунок 2 – Пространственная структура бычьего сывороточного
альбумина [16]
На рис. 1 показаны структурные формулы ДТТ и меркаптоэтанола. Оба
препарата применяются для того, чтобы «защитить» SH-группы белков от
неконтролируемого окисления. ДТТ (Рис. 1, а) предотвращает образование
неправильных внутримолекулярных и межмолекулярных -S-S- связей,
приводящих к формированию димеров и полимеров, биологическая
активность которых значительно ниже, чем у мономерных молекул. Широко
используется для восстановления дисульфидных групп белков [15].
Меркаптоэтанол является аналогом ДТТ и используется при исследовании
ферментов для защиты их сульфгидрильных групп от окисления, а также в
других случаях для предохранения легкоокисляемых соединений от действия
кислорода [15].
Среди альбуминов наиболее часто используются яичный и бычий
сывороточный альбумин (БСА), представляющий собой нейтральный белок с
молекулярной массой 64000 Да [16].
1.4. Биологический мониторинг
Экологический
позволяющим
мониторинг
сохранить
и
является
обеспечить
основным
условия,
инструментом,
необходимые
для
существования человека и других живых организмов. На сегодняшний день в
системе мониторинга загрязнения окружающей среды всё большее значение
приобретают
биологические
методы,
основанные
на
использовании
биологических объектов и позволяющие получить интегральную оценку
экологической ситуации [17, 18, 19]. Подобные методы позволяют отказаться
от химических методов анализа, которые не позволяют оценить истинную
опасность тех или иных загрязнителей на среду обитания, прогнозировать
последствия их воздействия на живые организмы [20, 21].
Биомониторинг - система наблюдений, оценки и прогноза различных
изменений в биоте, вызванных факторами антропогенного происхождения, в
настоящее
время
экологического
рассматривается
мониторинга.
как
один
Биомониторинг
из
важнейших
включает
видов
в
себя
биоиндикацию и биотестирование. Если под биотестированием понимают
методы
исследования,
при
котором
о
качестве
среды,
судят
по
выживаемости, состоянию и поведению специально помещенных в эту среду
организмов
(тест-объектов),
то
биоиндикация
представляет
качественную оценку параметров среды обитания и
собой
её отдельных
характеристик по состоянию биоты в природных условиях [20].
1.4.1Методы ботестирования
Биотестирование, основанное на использовании в качестве тестобъектов живых организмов, позволяет определять токсичность среды, по
средствам
нахождения
значений
параметров,
сигнализирующих
об
опасности, независимо от того, какие вещества и в каком сочетании
вызывают их изменения [22]. Очевидно, что данные параметры являются
жизненно важными функциями у рассматриваемых тест–объектов. Под
токсичностью обычно понимают степень проявления действия (повреждение,
ингибирование, генетические изменения и т.д.) разнообразных соединений и
их смесей на тест–объекты. Наиболее часто среди тест–параметров
используются
смертность,
изменчивость [23, 24, 25, 26].
выживаемость,
плодовитость,
мутационная
1.4.2Биолюминесцентное биотестирование, основанное на светящихся
бактериях
В измерительных системах биотестирования токсичности различных
сред активно используются светящиеся бактерии
[25]. Биотесты с
использованием светящихся бактерий отличаются от биотестов сделанных на
инфузориях, дафниях, водорослях, рыбах, лишь тем, что в качестве
параметра жизнедеятельности измеряется биолюминесценция.
Область использования бактериальных биолюминесцентных биотестов
достаточно широка и не ограничивается только мониторингом окружающей
среды.
Разработка биолюминесцентных биотестов обычно идет в три этапа:
1) подготовка тестовой культуры бактерий; 2) собственно измерение
свечения бактерий в присутствии или отсутствие анализируемых веществ; 3)
установление связи между параметрами свечения и количественными
характеристиками токсичности среды. Каждый из этапов имеет свои
особенности, связанные с тем, какая культура бактерий используется для
анализа.
Чувствительность светящихся бактерий к различным веществам зависит
от многих факторов, и, прежде всего, от штамма и условий культивирования
бактерий (состава питательной среды, рH среды, фазы роста бактерий и т.д.).
Светящиеся бактерии используют в биотестах в нескольких видах: клеточная
суспензия, твердая среда, лиофилизованный препарат.
Клеточная суспензия используется в биотестах для оценки токсичности
сточных вод целлюлозной промышленности в результате загрязнения их
фенольными соединениями и продуктами их распада.
Использование
многократно
твердых
использовать
высокочувствительных
сред
одну
детекторах
в
и
подобных
ту
для
же
методах
культуру
непрерывного
позволяет
клеток
в
контроля
загрязненности воздуха в шахтах, горных выработках и штольнях. При этом
компоненты среды тушат свечение бактерий, после чего через 10–15 секунд
свечение восстанавливается до исходного уровня, и можно производить
новые измерения.
Недостатком использования периодической культуры бактерий в
биотестировании является изменение их характеристик, например, удельного
свечения, в процессе роста, что сказывается на чувствительности и на
точности измерений. Использование безразмерной величины (Iо/Iк)·100% не
решает этой проблемы. К тому же важно поддержание тестовой культуры
бактерий, способной сохранять постоянную интенсивность свечения в
течение хотя бы 2–3 часов. До сих пор удельная интенсивность свечения
культуры бактерий сильно варьирует в зависимости от штамма, условий
культивирования бактерий, количества бактерий, взятых для анализа.
Проблема стандартизации культуры бактерий решается в настоящее
время двумя путями: использование непрерывной культуры светящихся
бактерий и получение реагента на основе лиофильно высушенных бактерий.
При непрерывном культивировании в люминостате возможно поддержание
культуры
бактерий
в
определенном
физиологическом
состоянии
с
постоянной в течение некоторого времени интенсивностью свечения путем
управления протоком питательной среды.
Использование
люминостата
существенно
повышает
точность
измерений, но чувствительность анализа ниже почти в 10 раз по сравнению с
периодической культурой. Кроме того, к недостаткам непрерывного
культивирования следует также отнести техническую сложность и большой
расход питательной среды. Значительными преимуществами обладают
лиофилизированные светящиеся бактерии, так как являются стандартными
тест–объектами для измерения интегральной токсичности исследуемых
водных
образцов,
исключают
необходимость
культивирования
и
поддержания бактериальных культур [27].
Биотесты на светящихся бактериях часто превосходят известные
биотесты по быстродействию, точности, чувствительности и простоте,
позволяют контролировать одновременно значительное число токсикантов.
Последнее обстоятельство очень важно для мониторинга окружающей среды,
загрязненной большим количеством веществ.
1.4.3 Биолюминесцентное биотестирование, основанное на
использовании ферментативных реакций светящихся бактерий
Долгое время в экологическом мониторинге из биолюминесцентных
систем использовался только интегральный тест на светящихся бактериях.
Вместе с тем в литературе имелось достаточно большое количество данных,
убедительно демонстрирующих высокую чувствительность люциферазных
реакций к действию токсических веществ. При этом сравнение их влияния на
биолюминесценцию in vivo и in vitro показывает существование зависимости
между степенью токсичности в анализируемом образце и изменением
параметров
свечения
обеих
биолюминесцентных
систем,
но
чувствительность систем in vitro была часто выше в 100–1000 раз. Кроме
того, все изменения, происходящие в организме под действием поллютантов,
начинаются на молекулярном уровне, поэтому использование в качестве
тест–объектов
ферментов,
отвечающих
за
один
из
параметров
жизнедеятельности светящихся бактерий – светоизлучение – кажется
закономерным. Более того, переход от систем in vivo к системам in vitro
позволил
создать
реагент,
увеличивающий
точность
биотеста.
Это
послужило основой для выдвижения в 1990 концепции нового направления
биотестирования и биолюминесцентного анализа – люциферазных биотестов
токсичности. Принцип люциферазных биотестов состоял в обнаружении
токсических свойств тестируемых веществ и смесей по их влиянию на
биолюминесцентные
биолюминесцентных
ферментативные
биотестов
лежало
реакции.
В
ингибирование
основе
люциферазы
компонентами анализируемых смесей.
В экологии интегральные биолюминесцентные методы in vivo и in vitro
рекомендованы
для
непрерывного
экспресс–контроля
состояния
окружающей среды промышленных районов и природно–хозяйственных
комплексов, для контроля залповых вредных выбросов предприятий, для
оценки эффективности детоксикации сточных вод и работы очистных
сооружений, а также для оценки экологической опасности предприятий и
отдельных районов.
Однако широкое распространение ферментативных тестов ограничено
быстрой инактивацией ферментов. Решить проблемы, связанные со
стабилизацией
ферментов,
препараты ферментов.
возможно,
используя
иммобилизованные
1
Kudryasheva N.S. Bioluminescence and exogenous compounds. Physico-
chemical
basis
for
bioluminescent
assay.
/
N.S.
Kudryasheva
//
J. Photochem.Photobiol B, 1. – 2006. – 77-86.р.
2
Roda,
A.
Biotechnological
applications
of
bioluminescence
and
chemiluminescence. / A. Roda, P. Pasini, M. Mirasoli, E. Michelini, and M.
Guardigli // Trends Biotechnol. 22. – 2004. – 295-303р.
3
Rozhko, T.V. Comparison of Effects of Uranium and Americium on
Bioluminescent Bacteria. / T.V. Rozhko, N.S. Kudryasheva, M.A. Aleksandrova,
L.G. Bondareva, A.Ya. Bolsunovsky, and G.V. Vydryakova // Journal of Siberian
Federal University. Biology, 1. – 2008. – 60–65 р.
4
Кратасюк В.А. Исследование светящихся бактерий в биолюминесцентном
анализе / В. А. Кратасюк, И. И. Гительзон // Успехи микробиологии, 1987. –
№21. – 3-30 с.
5
Hastings, J.W. Bioluminescence and chemiluminescence. / J.W. Hastings, C.H.
Johnson // Methods in Enzymology, 360. – 2003. – 75-105 р.
Данилов В. С. Бактериальная биолюминесценция [Текст]:учеб. ./ В. С.
6
Данилоа, Н. С. Егоров. – М.: изд-во МГУ, 1990. – 152 с.
Кузнецов
7
А.М.
Проблемы
и
перспективы
биолюминесцентного
тестирования в экологическом мониторинге / А. М. Кузнецов, Н. А.
Тюлькова, В. А. Кратасюк, В. В.Абакумова, Э. К.Родичева // Сибирский
экологический журнал, 1997. – №5. – 459-465 с.
Петушков В.Н., Кратасюк Г.А., Кратасюк В.А., Белобров П.И. (1982)
8
Биохимия, 47, 1773–1777 c.
9
Тривен М. Иммобилизованные ферменты [Текст]:науч. изд. / М. Тривен. –
М.: Мир, 1983. – 213 с.
10
Березин И. В. Иммобилизованные ферменты / И.В. Березин, Н.Л. Клячко,
А.В. Левашов, К. Мартинек // В 8 кн.Биотехнология; М.: Высшк. шк, 1987. –
159 с.
11
Кратасюк В.А. Свойства иммобилизованной в крахмальный гель
люциферазы /В. А. Кратасюк // Люминесцентный анализ в медико–
биологических исследованиях: сб. науч. ст. / Рига: РМИ, 1986. – С. 93 – 97.
12
Kratasyuk V.A. Polymer Immobilized Bioluminescent System for Biosensor and
Bioinvestigations / V.A. Kratasyuk, E.N. Esimbekova // PBM Series, V.1. – 2003.
– 307-341р.
13
Ugarova, N. Mechanism of peroxidase-catalyzed oxidation. / Ugarova N., O.
Lebedeva // Appl. Biochem. Biotechnol., 15. – 1987. – 35–51 р.
14
Есимбекова
биферментной
Е.Н.
Сравнение
системы
иммобилизованной
и
растворимой
надн:фмн-оксидоредуктаза-люцифераза
/
Е.Н.
Есимбекова, И.Г. Торгашина, В.А. Кратасюк // Биохимия, 2009. – Т.74. – № 6.
– 853-859 с.
15
Фирсов Н. Н. Микробиология: словарь терминов [Текст]: науч. изд. / Н. Н.
Фирсов. – М: Дрофа, 2006. – 467 с.
16
Holowachuk E. W. Bovine serum albumin: cDNA sequence and expression / E.
W. Holowachuk, J. K. Stoltenborg , R. G. Reed, T. Peters T. // 1991. – №4. – 235240 р.
17
Medvedeva S. E. Bioluminescent Bioassays Based on Luminous Bacteria / S.
E. Medvedeva, N. A.Tyulkova, A. M. Kuznetsov, E. K. Rodicheva // Journal of
Siberian Federal University, 2009. – №2. – 418-452 p.
18
Черкашен С. А. Биотестирование: терминология, задачи, основные
требования и применение в рыбохозяйственной токсикологии / С.А.
Черкашин
//
Известия
Тихоокеанского
научно-исследовательского
рыбохозяйственного центра, 2001. – Т128, – 1020-1035 с.
19
Ахиянц И.Л. Биотестирование водной среды волго-каспия / И. Л. Ахиянц,
Л.Г. Сентюрова // Успехи современного естествознания. – 2004. – № 1. – 1214с.
20
Лобанов А.В., Шувалова Ю.В., Зырина А.Е., Китова А.Е., Макаренко А.А.,
Кувичкина
Т.Н.,
Фесай
А.П.,
Решетилов
А.Н.
Биосенсоры
для
экологического контроля // Экологические системы и приборы. - 2001. - № 6.
- 72-76 с.
21
Бадтиев Ю.С., Кулемин А.А. Методика биоиндикации окружающей
природной среды // Экологический вестник России. - 2001. - № 4. - 27-29 с.
23
Ахиянц И.Л. Биотестирование водной среды волго-каспия / И. Л. Ахиянц,
Л.Г. Сентюрова // Успехи современного естествознания. – 2004. – № 1. – С.
12-14
24
Бянкин А.Г. Биомониторинг водной среды с помощью органа обоняния
рыб / А.Г. Бянкин // Исследованно в России. – 2003. – С. 1186-1208.
25
Гарипова Р.Ф. Биотестирование водных вытяжек почв, подвергшихся
воздейстию выбросов Оренбургского газохимического комплекса / Р.Ф.
Гарипова, А.Ж. Калиев // Вестник ОГУ. – 2004. – №4. – С. 90-92.
26
Radetski C.M. Evaluation of the genotoxic, mutagenic and oxidant stress
potentials of municipal solid waste incinerator bottom ash leachates / C.M.
Radetski, B. Ferrari, S. Cotelle, J.-F. Masfaraud, J.F. Ferard // Science of the Total
Environment. – 2004. – №333. – P. 209–216.
27
Кудряшева Н.С. Физико–химические основы биолюминесцентного анализа
/ Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есимбекова; Краснояр. гос. ун–т. –
Красноярск, 2002. – 154 с.