Тезисы докладов 2005 г. - программа президиума РАН
advertisement
Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума РАН ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ Конференция 14-16 декабря 2005 года Москва, Ленинский проспект, 32а МОСКВА Фирма «Слово» 2005 УДК 6+61+615.47+615.012.6 ББК 28.7+52+53 Ф947 Фундаментальные науки – медицине. Материалы конференции. Москва, 14–16 декабря 2005 г. – М.: Фирма «Слово», 2005. – 268 с. В сборник материалов конференции включены тезисы докладов ученых из институтов РАН и организаций академической системы здравоохранения по полученным в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» результатам, представляющим интерес для ученых и специалистов, занимающихся проблемами теории и практики медицины. Составители О.Г.Газенко, М.В.Угрюмов, А.А.Макоско, В.М.Михайлов, В.В.Круговых ISBN 5-900228-59-2 © Российская академия наук, 2005 © Фирма «Слово», 2005 1. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭТИОЛОГИИ И ПАТОГЕНЕЗА РЯДА 2 РАСПРОСТРАНЕННЫХ И СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 1.1. Нейродегенеративные заболевания. Болезнь Альцгеймера ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СФИНГОМИЕЛИНОВОГО ЦИКЛА В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ МОНИТОРИНГА НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ А.В. Алесенко, А.Е. Бугрова, Т.А.Воронина, Т.Л.Гарибова, М.А.Шупик Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, Москва На инъекционной модели болезни Альцгеймера (БА) (интрацеребровентрикулярное введение бета-амилоидного пептида (25–35)) ранее мы показали, что происходит активация сфингомиелинового цикла в отдельных структурах мозга, связанных с поведенческими реакциями и памятью животных. Сфингомиелиновый цикл (СФМ-цикл) представляет собой цепь ферментативных реакций, приводящих к деградации сфингомиелина в структуре клеточных мембран. В результате гидролиза сфингомиелина сфингомиелиназой образуются продукты (церамид и сфингозин), которые являются вторичными мессенджерами и участвуют в проведении сигнала апоптоза, являющегося причиной гибели нейронов. Сигнальная система сфингомиелинового цикла взаимодействует с другими сигнальными системами, такими как система генерации активных форм кислорода, что может приводить к усилению токсического эффекта на клетки мозга цитокинов и бета-амилоидного пептида. При БА, Паркинсона, ишемических инсультах активация СФМцикла может представлять важный механизм развития нейродегенеративного процесса. На основании полученных нами данных следует, что препараты, способные ингибировать сфингомиелиназу и снижать уровень церамида в клетках мозга животных, могут быть чрезвычайно перспективными при лечении тех нейродегенеративных заболеваний, при которых активируется СФМ-цикл. Мы изучили влияние препаратов, которые успешно зарекомендовали себя в качестве нейропротекторов, на параметры СФМ-цикла и ПОЛ. Нами были выбраны мексидол и мемантин. В настоящее время эти препараты широко используются в неврологии для лечения нарушений мозгового кровообращения и в геронтологии для улучшения памяти пациентов, страдающих ее ослаблением или нарушениями. Мемантин относится к неспецифическим ингибиторам глутаматных рецепторов. 3 Препарат целенаправленно используется для лечения больных с признаками деменции Альцгеймеровского типа. В наших экспериментах препараты вводились крысам внутрибрюшинно однократно, в течение 1, 3 и 5 дней в виде одноразовой дозы. Мексидол вводили в дозах 100 и 200 мг/кг веса животных, а мемантин – 2 мг/кг веса животных. Каждый из этих препаратов вызывал ингибирование сфингомиелиназы и снижение уровня церамида – индуктора апоптоза. Мемантин, так же как и мексидол, проявил антиоксидантные свойства, которые были наиболее отчетливыми при многократных инъекциях препаратов. Самые четкие изменения изучаемых параметров были отмечены в гиппокампе. Данные эксперименты еще более подчеркивают важность открытого нами молекулярного механизма гибели нейронов с участием продуктов СФМ-цикла. На основании полученных данных в настоящее время разрабатываются схемы комбинированной терапии с использованием мексидола и мемантина. В опытах на крысах-самцах линии Вистар исследовалось влияние мексидола, мемантина и их совместного применения на амнезию условной реакции пассивного избегания, вызванную М-холиноблокатором скополамином. Установлено, что крысы, получавшие скополамин в дозе 1,5 мг/кг (в/б) до обучения условной реакции пассивного избегания в установке Passive avoidance фирмы Lafayette Instrument Co (США) через сутки воспроизводили рефлекс только в 10 % случаев, в то время как в группе контрольных животных на фоне физиологического раствора этот показатель составлял 90 %. Мемантин в дозе 1 мг/кг предупреждал развитие амнезии условного рефлекса пассивного избегания у 20 % животных, а мексидол в дозе 100 мг/кг – у 30 % крыс. При совместном применении препаратов антиамнестический эффект отмечался у 50 % животных, что свидетельствует о суммировании антиамнестических эффектов веществ. Таким образом, полученные результаты предполагают значительно более эффективную терапию при комплексном лечении больных с нейродегенеративными заболеваниями и, возможно, снижение дозы мемантина – дорогостоящего зарубежного препарата фирмы Мерц при комплексном лечении больных отечественным препаратом мексидолом. Использование системы СФМ-цикла (определение активности сфингомиелиназы и уровней церамида и сфингомиелина) может быть чрезвычайно перспективным для предклинического мониторинга препаратов, предлагаемых для лечения болезни Альцгеймера. Ингибиторы сфингомиелиназы могут рассматриваться в ряду препаратов, перспективных для дальнейшего клинического применения. 4 РАЗРАБОТКА НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА НА ОСНОВЕ ОРИГИНАЛЬНЫХ МОДУЛЯТОРОВ АКТИВНОСТИ ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ С.О. Бачурин, В.В. Григорьев, М. В. Лавров, В.А. Палюлин, Н.С. Зефиров Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка В настоящее время твердо установлено участие глутаматэргической системы ЦНС в развитии целого ряда нейродегенеративных расстройств, в частности болезни Альцгеймера (БА). Так, показано, что в гиппокампе и стриатуме больных БА происходит значительное снижение количества глутаматных рецепторов по сравнению с людьми, не страдающими БА. Таким образом, активация глутаматэргической нейротрансмиссии у больных БА (в частности, АМРА-рецепторов) может представлять интерес как стратегия создания когнитивно-стимулирующих препаратов для терапии БА. С другой стороны, обнаружено, что глутаматные рецепторы играют важную в роль патогенезе БА путем реализации нейротоксического действия бета-амилоидного пептида (АРβ). Таким образом, блокада гиперактивации глутаматных рецепторов (в первую очередь, NMDA-подтипа) АРβ может рассматриваться в качестве нейропротекторной терапии БА. В последние годы различными фармакологическими компаниями ведутся работы по практическому созданию препаратов для лечения БА по обоим указанным направлениям, в частности предложен препарат мемантин (антагонист NMDAрецепторов) и т.н. АМРАкины – позитивные модуляторы АМРАрецепторов. Целью данного проекта на этапе 2005 г. являлось исследование механизма взаимодействия ранее выявленных соединений-лидеров с NMDA- и АМРА-рецепторами электрофизиологическими методами и направленное конструирование новых позитивных модуляторов АМРАрецепторов на основе данных 3-мерного докинга на «амра-кинный» сайт рецептора. Для достижения этой цели были решены следующие задачи: 1. Был исследован механизм действия соединения-лидера NT1505 на разные подтипы ионотропных глутаматных рецепторов. Эксперименты проводили на свежеизолированных нейронах Пуркинье, выделенных из мозжечка головного мозга крыс в возрасте 12–17 дней, и нейронах коры головного мозга крыс в возрасте 7–9 дней, электрофизиологическим методом patch-clamp в конфигурации «whole cell». Проведенные исследования показали, что циклотиазид (ЦТ) – известный положительный модулятор АМРА-рецепторов – и оригинальный препарат NT1505 влияют на кривые 5 зависимости доза-ответ для каиновой кислоты (КК)- агониста АМРАрецепторов. Оба соединения вызывают непараллельный сдвиг влево кривой доза-ответ для КК в диапазоне доз последней от 10 до 4000 мкМ. Кривая доза-ответ для КК в присутствии NT1505 была сдвинута левее и выше, чем в присутствии ЦТ, что указывает на большую эффективность NT1505 по сравнению с ЦТ. Для максимальных доз КК (4000 мкМ) средняя потенциация, вызываемая ЦТ, составила 60 % (n=4), в то время как средняя потенциация, вызываемая NT1505, составила 132 % (n=5) (p<0.05). ЕС50 КК для контроля – 140 мкМ, в присутствии циклотиазида – 95 мкМ, а в присутствии NT1505 – 65 мкМ. Максимальный ток в присутствии циклотиазида увеличился в 1.65 раза, а в присутствии NT1505 – в 2.4 раза. Аналогичным, только более эффективным, образом NT1505, так же как и ЦТ, потенциировали токи, вызываемые аппликацией глутамата. Например, 30 мкМ ЦТ вызывал увеличение ответов глутамата в 7.0 раз, а 30 мкМ NT1505 – в 26.9 раз. Сходство действия ЦТ и NT1505 на ответы, вызываемые активацией АМРА-рецепторов различными агонистами в нейронах Пуркинье, позволяет нам предположить, что в основе механизма потенцирующего действия NT1505 на ответы АМРА лежит блокада десенситизации, вызываемая агонистами этих рецепторов. В другой серии экспериментов было исследовано действие NT1505 на токи, вызываемые активацией NMDA-рецепторов нейронов коры головного мозга. Важной особенностью действия NT1505 явилось то, что более эффективно он блокировал токи большей амплитуды, что указывает на неконкурентный механизм блокады NMDA-рецепторов. Таким образом, IC50 для токов различной амплитуды были различны и тем меньше, чем больше были NMDA-активируемые токи. Для максимальных токов в наших экспериментах IC50 =1.5 мкМ. 2. На основании расчетов взаимодействия ряда соединений с АМРАкинным сайтом АМРА-рецептора методом 3-мерного докинга были синтезированы новые оригинальные соединения. Исследования их активности электрофизилогическим методом patch-clamp показали, что эти соединения обладают рекордной активностью и являются лидерами в этом классе соединений в мире. В поведенческих экспериментах эти соединения также усиливают когнитивные функции у животных в крайне низких дозах (менее 0.01 мг/кг). В настоящее время происходит патентование перспективных соединений. В последующий период планируется углубленное исследование механизма действия этих веществ на различные подтипы глутаматных рецепторов in vitro и оценка их действия на память и когнитивные функции на поведенческих моделях на лабораторных животных. 6 РОЛЬ НАРУШЕНИЙ В ОБОНЯТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ В ГЕНЕЗЕ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И РАЗРАБОТКА НА ЭТОЙ ОСНОВЕ НОВЫХ ПОДХОДОВ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ ДАННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ Н.В.Бобкова1, Н.И.Медвинская1, И.В.Нестерова1, И.Ю.Александрова1, А.Н.Самохин1, Ю.Г.Гершович1, П.М.Гершович1, И.Э.Лежнева2, Е.М.Жеребкер2, Л.М.Царева2, Б.В.Бахарев1 Институт биофизики клетки РАН, Пущино Больница Пущинского научного центра РАН, Пущино 1) 2) Характерной особенностью болезни Альцгеймера (БА) является длительная бессимптомная фаза ее развития. Это обстоятельство практически исключает возможность исследования механизмов возникновения и ранней диагностики этого заболевания в клинике, и только использование адекватных моделей на животных позволяет решить эти вопросы. Однако подавляющее большинство существующих в настоящее время моделей воспроизводят в основном поздние, а не начальные «доамилоидные» стадии заболевания. На протяжении последних лет нами разрабатывается модель спорадической формы БА на бульбэктомированных (БЭ) мышах. Удаление обонятельных луковиц у животных вызывает специфический нейродегенеративный процесс, сопровождающийся массовой гибелью нейронов в структурах мозга, которые поражаются и при БА. При этом наблюдается возрастание уровня мозгового бета-амилоида, холинергический дефицит и потеря пространственной памяти. Однако в мозге БЭ мышей были обнаружены лишь единичные бляшкоподобные образования, взаимодействующие с моноклональными антителами к бета-амилоиду и окрашиваемые тиофлавином S. По-видимому, это обусловлено особенностями первичной структуры бета-амилоида мышей, отличающегося тремя аминокислотными остатками от структуры человеческого белка и способностью к образованию фибрилл. Поэтому мы исследовали эффекты удаления обонятельных луковиц у морских свинок, первичная структура бета-амилоида которых полностью идентична структуре человеческого бета-амилоида. У БЭ морских свинок наблюдался не только подъем мозгового уровня бета-амилоида, но и многочисленные мозговые экстраи внутриклеточные депозиты на фоне резкого ухудшения пространственной памяти. Полученные данные явились необходимым звеном в доказательстве валидности модели БА на БЭ животных и важности нарушений в обонятельной системе в генезе БА. 7 Уникальной особенностью данной модели является наличие бессимптомного периода, когда развитие нейродегенерации сдерживается компенсаторными механизмами, в частности, активацией нейрогенеза. В иммуногистохимических исследованиях установлено, что в мозге БЭ животных через 4 недели после операции усиливается процесс включения бромдиоксиуридина в ДНК нейрональных клеток, что является доказательством активации пролиферативной активности в мозге на фоне нейродегенерации. Эти данные послужили отправной точкой к исследованию возможности предотвращения развития нейродегенерации у БЭ мышей путем трансплантации в их мозг фетальной ткани обонятельной луковицы, для которой характерен нейрогенез в течение всей жизни организма и крайне низка вероятность малигнизации. В результате исследования было обнаружено, что трансплантация в неокортекс эмбриональных клеток способствует восстановлению пространственной памяти у БЭ животных, вызывает в пораженных структурах мозга увеличение клеточной плотности и процент нормально функционирующих нейронов наряду со снижением выраженности таких клеточных патологий как пикноз, кариолизис и цитолиз. Все это позволяет рассматривать трансплантацию фетальных клеток обонятельной луковицы как один из перспективных подходов к лечению БА на основе клеточной терапии. Для доказательства связи нарушения обоняния и БА была начата работа по изучению состояния обонятельной чувствительности у трансгенных животных линии B6C3-Tg(APP695)85Dbo Tg(PSEN1)85Dbo, несущих мутированные гены белка-предшественника бета-амилоида и пресенилина1 человека и являющихся общепринятой моделью наследственной формы БА, в сопоставлении с уровнем пространственной памяти в разные возрастные периоды. Было установлено, что Tg(+/-) и контрольные неTg(-/-) животные не различаются пороговой чувствительностью к раствору масляной кислоты на протяжении первых четырех месяцев жизни. Однако уже в 6 месяцев обнаруживается ослабление обонятельной чувствительности только в группе трансгенных животных, выраженность которого нарастает с возрастом. Интересно отметить, что нарушение пространственной памяти у Tg(+/-) мышей впервые обнаруживается только в 8 месяцев. Эти данные свидетельствуют о том, что нарушение обонятельной чувствительности у Tg(+/-) мышей опережает проявление дефицита памяти и может рассматриваться как один из ранних маркеров развития патологического процесса. Возможности использования показателей обонятельной чувствительности к разным запахам для диагностики некоторых форм деменции было посвящено исследование, проводимое совместно с врачами Больницы Пущинского научного центра РАН. Для объективизации этих 8 исследований был разработан подход количественной оценки реакций ЭЭГ на предъявление различных одорантов. Полученные данные позволяют выдвинуть новое представление об участии обонятельных луковиц в генезе БА. Специфика нарушений обонятельной функции может быть положена в основу разработки ранней диагностики БА, чему и предполагается посвятить дальнейшие исследования. КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ И ДРУГИХ ВИДАХ НЕЙРОПАТОЛОГИИ А.Г.Габибов1), Н.А.Пономаренко1), О.М.Дурова2) И.И.Воробьев1), A.А.Белогуров1), И.Н.Куркова1), Г.Б.Телегин3), В.К.Мисиков2), С.В.Сучков2), В.Д.Кнорре1), А.И.Алехин4), Н.Г.Гончаров4) Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва 2) Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского, Москва 3) Филиал института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Пущино 4) ЦКБ РАН, Москва 1) Механизмы развития системных аутоиммунных заболеваний, а также этиологические факторы, приводящие к возникновению этих нарушений, сегодня остаются непознанными. При этом патологическая роль аутоантител в разрушении тканей и клеточных структур не вызывает сомнений. Среди заболеваний аутоиммунной природы рассеянный склероз (РС) представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему. Факторы, приводящие к массовой демиелинизации нервных волокон при данном заболевании, неизвестны. Одна из наиболее обоснованных теорий патогенеза отводит основную роль в разрушении миелина воспалительному процессу, связанному с аутоиммунными реакциями. Общепризнано, что развитие аутоиммунной компоненты заболевания связано с Т-клеточной составляющей иммунного ответа. В последнее время, однако, появились данные об участии В-клеточного звена в патогенезе демиелинизирующего процесса. В частности, электронная микроскопия высокого разрешения продемонстрировала значительное скопление аутоантител к основному белку миелина в районах демиелинизации у больных рассеянным склерозом и на моделях 9 животных, характеризующихся развитием экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ), патологии близкой к РС. В этой связи участие аутоантител к основному белку миелина, обладающих специфической протеолитической активностью по отношению к антигену может играть роль в патогенезе заболевания. В ходе выполнения работ по программе «Фундаментальные науки – медицине» в прошлые годы нашим коллективом было однозначно показано наличие подобной активности в сыворотке больных рассеянным склерозом у мышей линии SJL, развивающих ЕАЕ. Проблемы развития каталитического ответа в ходе развития РС, возможные корреляции активности со стадией инвалидизации (EDSS), специфичность деградации аутоантигена находились в сфере наших научных интересов в текущем году. Нами была составлена когорта больных с РС (48), инсультом (8), миелопатией (5) и здоровых доноров (20). Удалось показать иммуногистохимически на срезах мозга крысы, что выделенные каталитические антитела из сывороток крови больных РС и мышей, развивающих ЕАЕ, обладают специфической связывающей способностью с миелиновыми структурами. Это подтверждает возможную функцию каталитических антител in vivo. Анализ уровней каталитической активности высокоочищенных антител привел к выводу о корреляции катализа с уровнем инвалидизации пациентов. Так, наивысшая активность наблюдалась у пациентов со значениями EDSS 5-6 единиц, что соответствует максимальным значениям. Принципиально это дает возможность выработать диагностические критерии развития данной патологии. Проблема создания серологических тест-пакетов для диагностики и прогноза рассеянного склероза до сих пор не решена. Безусловно, применение ЯМР томографии оказывает незаменимую услугу врачу в верификации диагноза РС. Однако иммунологические методики, как более простые и дешевые не утратили своего значения. Нами также в ходе исследования усовершенствована техника ELISA при определении уровня антител, связывающих основной белок миелина (ОБМ). Связывающая и расщепляющая ОБМ активности аутоантител в комплексе могут быть использованы как диагностический критерий прогрессии РС. Методами масс-спектрометрии MS-MS, SELDI исследованы сайты специфического расщепления ОБМ под действием антител. Показано, что антитела «выщепляют» иммунодоминантные фрагменты молекулы. Реком-бинантный белок, содержащий в своем составе энцефалитогенный пептид оказался хорошим субстратом для каталитических аутоантител. Расщепление проходило лишь в области энцефалитогенного пептида. Ограниченный трипсинолиз ОБМ и указанного «искусственного» субстрата характеризовался отличными сайтами щепления. Таким образом, нами была показана «эпитоп-специфическая» каталитическая активность аутоантител. 10 Значительной каталитической активности при других исследованных патологиях обнаружено не было. ОБЩИЕ МЕХАНИЗМЫ ГИБЕЛИ НЕЙРОНОВ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПАТОЛОГИЯХ РАЗНОГО ТИПА: МИТОТИЧЕСКАЯ КАТАСТРОФА Н.В.Гуляева, 2)А.Б.Гехт, 1)В.А.Маркевич, 3)М.Н.Захарова, Л.Г.Хаспеков, 5)И.П.Белецкий, 1)М.Ю.Степаничев, 1)М.В.Онуфриев 1) 4) Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва 2) Российский государственный медицинский университет, Москва 3) НИИ неврологии РАМН, Москва 4) ГУ НИИ мозга РАМН, Москва 5) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 1) Как правило, подходы к исследованию нейродегенерации предусматривают анализ патогенетических факторов определенной патологии и закономерностей ее развития. Результаты исследований конкретных патологий, связанных с нейродегенерацией, крайне редко рассматриваются в рамках концепции об общности причин и механизмов развития таких заболеваний. Несмотря на очевидные различия между разными нейродегенеративными заболеваниями (локализация и тип гибнущих нейронов, неврологические последствия и т.д.), результаты исследований последних лет указывают на удивительную общность молекулярных механизмов гибели нейронов. Представляется перспективным исследование в рамках концепции об универсальном механизме нейродегенерации различного генеза, связанном с патологической отменой запрета на активацию клеточного цикла. Механизмы такого запрета, действующего в норме в терминально дифференцированных клетках, в частности нейронах, до сих пор не ясен. Неисследованными остаются и механизмы патологической экспрессии компонентов клеточного цикла в гибнущих нейронах. В рамках проекта проводится комплексное исследование, направленное на выяснение участия митотической катастрофы (аберрантного клеточного цикла) в нейродегенерации различного типа. Основные направления включают исследование механизмов гибели нейронов при моделировании нейродегенерации на животных и в культурах нервных и нейроноподобных клеток, а также исследование биологического материала (ликвор, образцы мозга), полученных от неврологических больных. На моделях нейродегенерации, вызванной адреналэктомией, фокальной ишемией, судорожной активностью, введением бета-амилоидного пептида 11 показана экспрессия белков-компонентов клеточного цикла, что подтверждает возможность моделирования митотической катастрофы нейрона (механизма нейродегенерации, показанного в селективно уязвимых областях мозга при различных неврологических заболеваниях). Установлено, что нейродегенерации и амнезии при центральном введении бетаамилоидного пептида предшествует нарушение нейрогенеза в гиппокампе. В ранние сроки после введения фрагмента бета-амилоидного пептида (25–35) (в период до проявления когнитивного дефицита) происходит подавление нейрогенеза в гиппокампе крыс, которое может быть связано с избыточной генерацией оксида азота за счет экспрессии NO-синтазы и окислительным стрессом. Предполагается, что нарушения нейрогенеза и нейродегенерация могут быть связанными событиями, опосредующими возникновение амнезии, характерной для этой модели болезни Альцгеймера. В экспериментах на другой модели болезни Альцгеймера, трансгенной линии мышей с оверэкспрессией фермента киназы гликогенсинтазы 3бета (линия GSK-3бета), при которой, наряду с нейродегенерацией, наблюдаются изменения когнитивных функций, характерные для этого заболевания, установлено, что нарушения развития и сохранения длительной посттетанической потенциации могут быть в значительной степени компенсированы LiCl. Поскольку экспрессия GSK-3бета является фактором, вызывающим активацию клеточного цикла в нейронах, можно предположить, что, ингибируя фермент, Li предотвращает этот процесс. На культурах клеток-зерен мозжечка продемонстрирована экспрессия компонентов клеточного цикла при каспаза-3-зависимой апоптозо-подобной гибели нейронов, индуцированной амилоидными пептидами. Модуляция экспрессии каспазы-3 в клетках нейробластомы В-103 приводила к изменению экспрессии кавеолина, белка, регулирующего рост и пролиферацию клеток, а также кавеолин-зависимой киназы Lck. Возможно, активация каспаза-3-зависимой гибели нейронов, связанная с экспрессией белков клеточного цикла, опосредована кавеолин-зависимым механизмом. В ликворе больных с боковым амиотрофическим склерозом обнаружен и охарактеризован не описанный ранее протеолитический фермент, активность которого коррелирует с гибелью нейронов и течением заболевания. В настоящее время проводится исследование биологического материала, полученного от неврологических больных с различными заболеваниями, в рамках гипотезы о возможной связи активации определенных протеаз и аберрантного клеточного цикла в нейронах. Таким образом, многоуровневое исследование (модели in vivo, клеточные культуры, биологический материал от больных) и сравнительный анализ полученных данных позволяют найти наиболее реальные подходы к исследованию молекулярных механизмов нейродегенерации. 12 ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ НА РАЗВИТИЕ ДЕМЕНЦИИ И БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА – НОВЫЙ ВЗГЛЯД НА МЕТАБОЛИЗМ АМИЛОИДНОГО ПЕПТИДА, МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ И.А. Журавин1), Н.Н. Наливаева1,4), С.А. Плеснева1), Н.Л. Туманова1), Д.С.Васильев1), Н.М. Дубровская1), Е.Г. Кочкина1), М.Ф. Баллюзек2), Н.Л. Самус2), В.П. Анисимов3), L. Fisk4), A.J. Turner4) 1) Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова, РАН, Санкт-Петербург, 2)Клиническая больница РАН, Санкт-Петербург, Россия 3) Институт онкологии им. Н.Н.Петрова Минздрава РФ, Санкт-Петербург 4) Institute of Molecular and Cellular Biology, Faculty of Biological Sciences, University of Leeds, Leeds LS2 9JT, U.K. В последние годы становится все более очевидным, что нейродегенеративные процессы в ЦНС (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.) сопровождаются молекулярно-клеточными изменениями в мозге, связанными с холинергической системой и метаболизмом амилоидного пептида. Метаболизм амилоидного пептида в нервной ткани является динамичным и тонко регулируемым процессом, и баланс его образования и катаболизма зависит не только от состояния организма и ткани мозга в целом, но также от множества внутренних и внешних факторов в ходе всей продолжительности жизни человека (Landrigan et al., Environ. Health Perspect. 2005, 113:1230–33). Это позволяет расширить поиск путей, направленных на предотвращение накопления этого нейротоксичного пептида, с целью профилактики и лечения болезни Альцгеймера. Все большее число научных центров акцентируют свое внимание на поиске соединений, способных препятствовать образованию токсических концентраций А за счет повышения активности ферментов его катаболизма (Turner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 2004, 1035: 1–20; Hama & Saido, Med. Hypotheses, 2005, 65: 498–500). Оценивая данные литературы и результаты, накопленные авторами данного проекта, становится ясно, что поиск препаратов для лечения болезни Альцгеймера ведется в нескольких направлениях – поиск препаратов для нормализации состояния холинергической системы; использование статинов и антиоксидантов, поиск соединений, повышающих активность ферментов катаболизма амилоидного пептида, таких, как неприлизин (НЕП), эндротелин-конвертирующий фермен (ЕСЕ-1) и инсулин-деградирующий фермент (IDE). 13 Исследования, проводимые в ходе выполнения данного проекта в 2005 году, расширили наши представления о роли различных амилоиддеградирующих ферментов в функционировании нервных клеток в норме и после гипоксии или ишемии. Показано, что НЕП, ЕСЕ-1 и IDE изменяются в клетках нервной ткани при гипоксии и ишемии мозга поразному. Наиболее существенные изменения наблюдались в уровне экспрессии ЕСЕ-1 и НЕП (как при гипоксии и ишемии целого организма, так и на клеточных моделях), в то время как изменение содержания IDE было статистически недостоверным. Снижение экспрессии IDE имело место в клетках нейробластомы при окислительном стрессе после добавления в культуральную среду перекиси водорода, в то время как уровень ЕСЕ-1 практически не изменялся, а НЕП изменялся в наиболее значительной степени. При исследовании тканей мышей с ускоренной программой старения (линия HER2) было обнаружено, что в мозге у этих животных (так же как в коре мозга крыс) происходит значительное возрастное снижение содержания НЕП вплоть до практически отсутствия этого фермента у мышей, достигших возраста 9 месяцев. Полученные данные свидетельствуют об универсальном характере возрастного дефицита НЕП в ткани мозга. Не выявлено изменений экспрессии ЕСЕ и IDE в мозге, а НЕП в почках мышей с ускоренной программой старения. Анализ сигнальных механизмов, вовлеченных в регуляцию экспрессии НЕП и ЕСЕ, с целью выяснения роли холинергических агонистов, а также агонистов опиоидных рецепторов в этих процессах, показал, что длительное воздействие форболовых эфиров приводило к снижению экспрессии как НЕП, так и ЕСЕ-1 в клетках нейробластоы NВ7, которое не изменялось в присутствие ингибитора ПКС (BIS1), что свидетельствует о том, что снижение экспрессии НЕП и ЕСЕ-1 регулируется другими сигнальными системами, не опосредуемыми ПКС. Действие как соматостатина, так и опиоидного агониста DAGO (D-Aла2, MeФен4,[Гли(ол)5]энкефалин) не приводило к изменениям уровня экспрессии НЕП в клетках нейробластомы NВ7 и SK-N-SH, но повышало уровень экспрессии ЕСЕ-1. Полученные предварительные данные свидетельствуют, что антиоксидант – полифенол эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG), способен при длительном воздействии повышать активность НЕП. Анализ уровня активности ацетил-(АХЭ) и бутирил-(БХЭ) холинэстераз в плазме крови показал, что у пациентов с нарушением внимания и памяти после лечения инатилином активность АХЭ и БХЭ увеличивалась (в 2–4 раза). В группе пациентов с сердечно-сосудистыми нарушениями после лечения назначенными препаратами, увеличивалась активность БХЭ, а активность АХЭ не изменялась. В обеих группах увеличение активности ферментов наблюдалось в большей степени у более «молодых» пациентов. Таким образом, характеристика 14 ферментативной активности АХЭ и БХЭ в плазме крови может служить простым, информативным и, самое главное, доступным тестом в клинике для диагностики заболевания, степени его тяжести и результатах терапии. Исследования, проводимые в рамках данного проекта, являются высокоприоритетными и конкурентными, поскольку позволяют существенно расширить имеющиеся представления о патогенезе болезни Альцгеймера и предложить стратегию как профилактики, так и терапии этого и других нейродегенеративных заболеваний. ПРОБЛЕМА СОЗНАНИЯ И НАРУШЕНИЕ ЦЕНТРАЛЬНЫХ РЕГУЛЯЦИЙ ПРИ НЕРВНО-ПСИХИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ А.М.Иваницкий, Г.Н.Болдырева, Э.А.Костандов, М.Н.Русалова, Н.Е.Свидерская, В.Б.Стрелец Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва Высшие функции человеческого мозга, такие как мышление, эмоции и, наконец, его сознание, возникают в результате сложного взаимодействия мозговых структур. Поэтому исследование такого взаимодействия и регуляторных влияний одних полей коры на другие является ключом для понимания природы психической сферы человека как в норме, так и при патологии. Эта идея объединяет исследования по проекту, которые включают шесть разделов. Фундаментальные исследования мозговых основ сознания провдились в лаборатории А.М.Иваницкого. Была продолжена разработка гипотезы о связи селективного вербального внимания с памятью. Согласно данной гипотезе, все слова, как значимые, так и незначимые в данной ситуации, воспринимаются, но затем происходит торможение записи нерелевантных сигналов в декларативную память, в результате чего они вытесняются из сознания. Эти данные были подтверждены результатами исследования дипольных источников, показавших участие гиппокампального комплекса в процессах внимания. Был также применен тест на «память узнавания». Оказалось, что человек мог назвать предъявленные ему ранее незначимые слова в списке, показанном ему после опыта, хотя он и не мог вспомнить их без такой подсказки. Эти данные существенно подтверждают исходную гипотезу. Другим направлением работ было изучение быстрой автоматической системы анализа смысла слова. Установлено, что реакция мозга различна на конкретные и абстрактные слова, начиная уже с первых 100 мс после показа слова. Эти данные важны для понимания некоторых видов патологии внимания и памяти. В лаборатории Г.Н.Болдыревой проведено исследование компонента Р300 слухового вызванного потенциала. У здоровых испытуемых 15 выявлена статистически значимая связь его амплитуды с характеристиками внимания, определяемыми психологическим тестированием. При акцентировании внимания на целевой стимул параллельное предъявление раздражителей другой модальности (в частности, зрительной) не приводит к достоверным изменениям латентности и амплитуды ответа, что свидетельствует о направленности всех ресурсов внимания на решение главной задачи. При пассивном прослушивании параллельное введение зрительных стимулов значимо снижает амплитуду и увеличивает латентность Р300, что отражает процесс распределения и/или переключение внимания. Исследование больных с тяжелой черепно-мозговой травмой показало, что особенности выраженности компонента Р300 АВП коррелируют со степенью угнетения сознания. Эти данные способствуют объективной оценке текущего функционального состояния, а также прогнозированию течения болезни. В лаборатории Э.А.Костандова разработана модель исследования неосознаваемых зрительных установок у детей дошкольного и младшего школьного возрастов. С ее помощью выявлен критический период развития когнитивных функций (6,2–7 лет), когда установки становятся пластичными, что обеспечивает более адекватное опознание новых сигналов. Анализ функции когерентности корковых потенциалов показал, что в этом возрасте происходит вовлечение лобной коры в процесс функциональной организации зрительного восприятия. Модель зрительной установки была апробирована на детях с патологией центральной нервной системы («минимальные мозговые дисфункции»). У детей с признаками незрелости фронто-таламической системы установки имели выраженный ригидный характер. В группе М.Н.Русаловой исследован феномен «асимметрия сознания». Для решения проблемы соотношения асимметрии сознания с индивидуальными характеристиками человека разработан тест определения преобладания «правополушарного» или «левополушарного» типов сознания. Показано, что у лиц, имеющих высокие баллы по шкале «левополушарное сознание» отмечено преобладание связей в альфадиапазоне в левом полушарии, тогда как «правополушарному сознанию» соответствовало значительное преобладание связей в альфа-полосе в правом полушарии. В лаборатории Н.Е.Свидерской проведено сопоставление пространственной организации ЭЭГ у мужчин и женщин, страдающих хроническим алкоголизмом, с нормативными данными. Показано, что в норме половые различия по ряду интегральных показателей ЭЭГ выражены значительно меньше, чем при патологии. Данные объясняют известный факт более тяжелого и злокачественного течения хронического алкоголизма у женщин по сравнению с мужчинами. У женщин 16 достоверно выше мощность медленных колебаний ЭЭГ, но ниже мощность высокочастотной части спектра. Это коррелирует с более выраженной прогредиентностью тормозно-дегенеративных процессов в мозге у женщин, в основе чего лежат нарушения баланса катехоламинергической и адренергической медиаторных систем. Снижение информационно-энергетического показателя у женщин по сравнению с мужчинами в патологии может свидетельствовать об ослаблении контроля сознания над когнитивными процессами. В лаборатории В.Б.Стрелец получены новые данные о функциональном расщеплении полушарий у больных шизофренией. Выполнение когнитивных заданий в норме связано с выраженной синхронностью на высокочастотном гамма-ритме; у больных шизофренией такая синхронность отсутствует. Выполнение нейропсихологических проб у здоровых сопровождается усилением внутрикорковых функциональных связей, в том числе межполушарных. У больных шизофренией обеих групп, у которых отмечалось нарушение межполушарных связей, выполнение нейропсихологических проб, требующих межполушарной интеграции, оказалось нарушенным. ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК И ФАКТОРЫ АПОПТОЗА В МОЗГЕ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ – МОДЕЛЕЙ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И В КЛЕТКАХ КРОВИ ОТ ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ АЛЬЦГЕЙМЕРА Ю.Г.Каминский1), А.С.Погосян1), А.А.Овсепян2), Е.А.Косенко1), К.Монтолиу3), В.Фелипо3) 1) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2) Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Пущино 3) Институт цитологических исследований, Валенсия (Испания) Введение -амилоидных (А) пептидов животным в мозг приводит к нарушению функций митохондрий, индукции маркеров апоптоза каспазы-9 и каспазы-3, накоплению белка р53 в ядрах неокортекса. Все это – свидетельство того, что А-пептиды являются мощными проапоптотическими стимуляторами, вызывающими повреждение ядерной ДНК. Мы выявили новое звено в патологическом каскаде, индуцируемом каспазой-3 в присутствии А25-35. Эта протеаза активирует дезоксирибонуклеазу (каспазой активируемую дезоксирибонуклеазу, КАД), которая может расщеплять ДНК генома на нуклеосомальные фрагменты. Здесь мы приводим результаты исследования роли таких факторов апоптоза, как КАД, -кальпаин, m-кальпаин, катепсины В и D, а также Н2О2, в действии А-пептидов на мозг. Оказалось, что уже через 7 17 дней после однократного введения А25-35 крысам в желудочки мозга наблюдается тенденция к повышению количества (и активности) КАД в клеточных ядрах неокортекса, а через 14 дней оно увеличивается на 20–25 %. В максимальной степени (на 44 %) повышается содержание КАД в ядрах гиппокампа, тогда как в мозжечке оно не изменяется. Фрагментация ДНК в ядрах мозжечка отсутствовала, а в неокортексе оказалась менее четко выраженной, чем в гиппокампе. Инкубация клеточных ядер гиппокампа контрольных животных с белковой фракцией, полученной из гиппокампа опытных крыс, стимулировала фрагментацию ДНК в контрольном препарате. Если же белковую фракцию гиппокампа опытных животных предварительно обработать антителами, которые «связывают» КАД, т.е. если провести иммунопреципитацию КАД, то такие экстракты не способны вызывать фрагментацию ДНК в контрольном образце. Аналогичные результаты получены in vitro с применением ингибиторов каспазы-3, и они подтверждают, что А25-35 активирует каспазу-3 в мозге, что степень активации различна в разных отделах мозга, и каспаза-3 индуцирует, в свою очередь, КАД-нуклеазу, повреждающую ядерную ДНК. Обнаруженное нами ранее накопление кальция в цитозоле мозга при действии вводимых А-пептидов может индуцировать кальпаины – нелизосомальные кальций-зависимые протеазы другого класса. Кальпаины претендуют на роль -секретазы, участвующей в протеолитическом расщеплении предшественника амилоидных белков. Для определения -кальпаина и m-кальпаина мы использовали иммуноферментный анализ и флуорогенный специфический субстрат. Выяснено, что протеолитическая активность кальпаина повышается уже через 7 дней после введения А 25-35 и дополнительно – через 14 дней. Активность m-кальпаина в неокортексе и мозжечке изменяется недостоверно. Наибольшую активность обе формы кальпаина проявляют в гиппокампе. Основными ферментами лизосом являются катепсины и эндонуклеазы – например, ДНКаза II. В наших экспериментах через 7 дней после введения А25-35 активность катепсинов В и D в цитоплазматических фракциях неокортекса, гиппокампа и мозжечка не менялась, т.е. мембраны лизосом сохранялись неповрежденными. Через 14 дней после введения А25-35 гомеостаз лизосом нарушался: в цитоплазме и митохондриях гиппокампа появлялись лизосомальные - и -галактозидазы, в митохондриях – лизосомальные катепсины В и D. Преинкубация несинаптических митохондрий неокортекса с катепсином В в течение 1 минуты стимулировала образование Н2О2 в этих митохондриях на 35 %; более длительная инкубация способствовала выходу цитохрома с из митохондрий в среду – более тяжелому их повреждению. Таким образом, не только митохондрии, растворимый цитозоль и ядра, но также и 18 лизосомы и их протеолитические ферменты участвуют в патологическом процессе при БА. Проникающий в нейрон кальций стимулирует активность кальпаинов m и , повреждающих мембраны лизосом, катепсинов В и D, которые повреждают митохондриальные мембраны и усиливают образование Н2О2 в митохондриях. Нарушение гомеостаза кальция, активация кальпаинов, развитие окислительного стресса, нарушения в лизосомальной системе, сопровождающиеся высвобождением из лизосом агрессивных белков, являются самыми ранними событиями в общем пусковом механизме развития патологических процессов в мозге у крыс на экспериментальной модели БА. Самым же интригующим оказалось то, что аналогичные изменения КАД, - и m-кальпаинов, катепсинов В и D и Н2О2 наблюдаются в мозге трансгенных мышей-моделей БА и в лимфоцитах крови от пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КАЛЬЦИЙСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ИХ АНТИРАКОВОЕ ДЕЙСТВИЕ И ФОРМИРОВАНИЕ АМИЛОИДНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ С.Е. Пермяков1), В.Н. Уверский1), И.В. Першикова1), А.П. Жадан1), А.Г. Бакунц1), Л. Берлинер2), Ч. Брукс3), Г. Махатадзе4), Е.А. Пермяков1) 1) Институт биологического приборостроения РАН, Пущино, Московская обл., Россия 2) Денверский университет, Денвер, Колорадо, США 3) Университет штата Огайо, Колумбус, Огайо, США 4) Пенсильванский университет, Херши, Пенсильвания, США В рамках выяснения молекулярных механизмов антиракового действия некоторых форм α-лактальбумина продолжено исследование физико-химических свойств комплексов α-лактальбумина с гистонами и поли-аминокислотами poly-Lys и poly-Arg, в качестве моделей гистонов. Методами собственной триптофановой флуоресценции, кругового дихроизма и сканирующей микрокалориметрии показано, что обнаруженное нами ранее состояние LAMPA α-лактальбумина в комплексе с основными полиаминокислотами, характеризующееся низкой термостабильностью и низким сродством к кальцию, реализуется также и в комплексе с гистонами I, II, и III. Обнаружено, что α-лактальбумин образует с гистонами комплексы различной стехиометрии, что регулируется концентрацией ионов кальция в растворе. Продолжено исследование фибриллообразования α-лактальбумина в различных 19 условиях. Показано, что при нейтральных рН интактный α-лактальбумин, даже будучи в состоянии расплавленной глобулы при повышенных температурах, плохо образует амилоидные фибриллы. Обнаружено, что αлактальбумин с расщепленной единичной пептидной связью (1-40/41123), а также α-лактальбумин с удаленным 12-членным участком (1-40/53123) хорошо образуют амилоидные фибриллы даже при нейтральных рН. Методы генетической инженерии применены для исследования электростатических взаимодействий в α-лактальбумине в связи с его способностью к образованию фибрилл. Созданы около 15 мутантных белков с заменами в N-концевой части молекулы заряженных аминокислотных остатков на незаряженные. Методами сканирующей микрокалориметрии и собственной триптофановой флуоресценции исследованы тепловая стабильность и сродство к кальцию полученных мутантов. Обнаружено, что такие мутации могут приводить как к увеличению стабильности белка и его сродства к ионам кальция, так и уменьшению этих параметров. Методы Тенфорда-Кирквуда и ПуассонаБольцмана были применены для расчета энергии заряд-зарядовых взаимодействий в α-лактальбумине. Обнаружена качественная корреляция экспериментальных и теоретических величин изменения энергии стабилизации молекулы α-лактальбумина в результате точечных мутаций, что позволяет теоретически предсказывать влияние точечных замен поверхностных заряженных аминокислотных остатков на стабильность белка и его сродство к кальцию и тем самым на его склонность к агрегации. Публикации Permyakov S.E., Pershikova I.V., Zhadan A.P., Goers J., Bakunts A.G., Uversky V.N., Berliner L.J., and Permyakov E.A. Conversion of human lactalbumin to an apo-like state in the complexes with basic poly-amino acids: toward understanding of the molecular mechanism of antitumor action of HAMLET. J. Proteome Res. (2005) 4, 2, p. 564-569. Permyakov S.E., Makhatadze G.I., Owenius R., Uversky V.N., Brooks C.L., Permyakov E.A., and Berliner L.J. How to improve nature: study of the electrostatic properties of the surface of α-lactalbumin. Protein Eng. Design and Selection (2005) 18, 9, p. 425-433. ВЫЯСНЕНИЕ РОЛИ САРКОМЕРНЫХ ЦИТОСКЕЛЕТНЫХ БЕЛКОВ В ОБРАЗОВАНИИ АМИЛОИДОВ И В ПАТОГЕНЕЗЕ АМИЛОИДОЗОВ С ЦЕЛЬЮ РАЗРАБОТКИ МЕТОДА ИХ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ З.А. Подлубная1), Л.Г. Марсагишвили1), М.Д. Шпагина1), В.И. Емельяненко1), И.М. Вихлянцев1), С.Л. Малышев1), И.М. Ильинский2), 20 А.А. Федюшин3), В.Л. Николаев-Пасухин3) 1) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино; 2) НИИ трансплантологии и искусственных органов МЗ РФ, Москва; 3) Больница ПНЦ РАН, Пущино Амилоидозы – болезни, которые наступают в результате нарушения сворачивания белка и характеризуются отложениями его нерастворимых фибрилл (амилоидов) в разных органах и тканях. Амилоидные отложения обнаруживаются при таких заболеваниях человека как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, синдром Дауна, второй тип диабета, полиамилоидные полинейропатии, прионные амилоидозы и др. Амилоиды найдены и мышцах при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах, однако не уделялось должного внимания изучению нейродегенеративных и мышечных заболеваний как сочетанных нарушений. Предупреждение амилоидных заболеваний или их выявление на ранних стадиях и назначение своевременного лечения является нерешенной задачей современной медицины. Для этого необходимо знание амилоидогенеза: выявление общих свойств амилоидов разных белков, знание факторов, регулирующих их образование и разрушение, их эффектов на жизнедеятельность клеток. Несмотря на разную природу белков-предшественников, их амилоидные фибриллы имеют общие свойства: β-складчатую структуру с отдельными β-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями Конго красным (КК) и тиофлавином Т (ТТ). В экспериментах in vitro трансформации αспиральной структуры большинства белков в β-складчатость добиваются, используя условия, резко отличающиеся от физиологических (высокие значения температуры – 50–70 ˚С, низкие значения рН, детергенты, длительные времена инкубации и т. п.). Молекулы саркомерных цитоскелетных белков семейства тайтина, амилоидогенные свойства которых мы открыли впервые, уже содержат более ~90 % β-складчатой структуры, необходимой для образования амилоидных фибрилл, что является преимуществом при исследовании их амилоидогенеза. С помощью электронной микроскопии мы показали, что в условиях, близких к физиологическим, тайтин и все белки его семейства (Х-, С- и Нбелки) формируют спиральные фибриллы, сходные по структуре с амилоидами в мозге при болезни Альцгеймера, и/или линейные фибриллы и их пучки, характерные для многих известных амилоидогенных белков. Их амилоидная природа была нами подтверждена также поляризационной и люминесцентной микроскопией с красителями КК и ТТ. Кроме того, на специфичность связывания ТТ с амилоидами Х-, Н-, и С-белков по сравнению с этими белками в молекулярной форме указывает увеличение 21 интенсивности флуоресценции красителя (в 10, 9, и 7 раз соответственно) и сдвиг спектра поглощения КК в длинноволновую область в присутствии фибрилл этих белков. Идентичность спектров кругового дихроизма Х-, Ни С-белков в молекулярной и фибриллярной формах свидетельствует об отсутствии существенных изменений во вторичной структуре белков в процессе фибриллообразования. Н-, С- и Х-фибриллы, существенно снижали АТФазу актомиозина (АМ) in vitro, что указывает на их прямой негативный эффект на функциональную активность сократительной системы даже на ранних стадиях формирования амилоидных отложений. Для выяснения возможных подходов к разрушению амилоидных отложений in vivo нами проведено in vitro тестирование эффекта антибиотиков на амилоиды исследуемых белков. Антибиотик тетрациклин разрушает Х-, С- и Н-фибриллы, подобно его действию на амилоиды Аβ-пептида и тау белка при болезни Альцгеймера, на депозиты хантингтина при болезни Хантингтона, а также на амилоидные фибриллы прионного белка. Заметим, что в случае тетрациклина и его производных мы имеем дело с лекарствами, не только разрушающими зрелые фибриллы, но и ингибирующими образование новых амилоидов. Несомненно, что вещества, обладающие обоими этими эффектами, более ценны в терапии амилоидозов. Интересно, что разрушение Х-, С- и Нфибрилл антибиотиком приводит к возрастанию АТФазы АМ до исходного уровня, что свидетельствует об отсутствии токсического действия самого лекарства и образуемых им фрагментов фибрилл на АМ систему. Таким образом, открыты новые белки-предшественники амилоидов и вероятные участники амилоидогенеза не только в мышцах, поскольку белки, подобные тайтину, найдены и в других тканях. Из-за высокого исходного содержания β-складчатости белки легко образуют амилоиды in vitro, что может представлять опасность быстрого роста их амилоидных отложений in vivo. Полученные результаты подтверждают наше предположение о возможности сходных подходов к разрушению разных амилоидов в связи с их общими физико-химическими свойствами. Эти подходы и пути управления амилоидогенезом в органах и тканях могут быть in vitro разработаны с использованием амилоидов саркомерных цитоскелетных белков семейства тайтина. Исследования будут направлены на поиск: (1) новых нетоксичных препаратов, разрушающих зрелые амилоидные фибриллы и ингибирующих рост новых фибрилл; (2) белков-маркеров в крови пациентов иммунологическими методами для разработки тест-систем доклинической диагностики амилоидозов. Такими маркерами могут оказаться и цитоскелетные белки семейства тайтина или их фрагменты. 22 ДИАГНОСТИКА РАННИХ ФОРМ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА C.Н.Пчелина1,2), О.Н.Иванова2), Н.М.Ханина1), А.М.Шейдина1), Е.П.Демина1), А.Ф.Якимовский2), А.Л.Шварцман1) Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова РАН, Гатчина, С.-Петербург 2) Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. И.П.Павлова, С.-Петербург 1) Болезнь Паркинсона (БП) – второе по частоте встречаемости нейродегенеративное заболевание после болезни Альцгеймера. Частота встречаемости заболевания доходит до 1 %, причем из всех случаев 17 % приходится на так называемую раннюю форму БП с началом до 50 лет. Диагностика БП затруднена. Окончательный клинический диагноз, даже при развернутой картине заболевания, может быть поставлен на основе данных аутопсии. В настоящее время ведется активный поиск биомаркеров, в том числе генетических, позволяющих производить раннюю диагностику заболевания, а также при необходимости проводить дифференциальный диагноз с другими неврологическими заболеваниями. В настоящее время известно шесть генов, мутации в которых приводят к развитию моногенных форм БП, и кроме этого картировано еще шесть локусов, связанных с БП. В большинстве случаев моногенные формы БП достаточно редки. По существующим данным наиболее частым молекулярным дефектом, ответственным за наследственные формы БП, являются мутации в гене паркина (PARK2). Ген PARK2 содержит 12 экзонов и кодирует белок паркин, состоящий из 465 аминокислот. Показано, что паркин является одним из ферментов убиквитин-протеасомной системы, обеспечивающей протеасомную деградацию белков в клетке. Различные мутации в гене PARK2 (делеции/дупликации различных экзонов, точечные мутации) обнаруживаются в 50 % случаев аутосомно-рецессивного ювенильного паркинсонизма (AR-JP), а также в 20 % случаев ранней БП (начало до 50 лет). Целью настоящего проекта явилось выявление ранних форм БП, связанных с мутациями в гене PARK2. Поиск мутаций в 12 экзонах гена PARK2 был проведен у 42 человек с ранней формой БП (18 мужчин, 24 женщины, средний возраст начала заболевания 45±6.2 лет) с использованием метода количественной ПЦР в реальном времени с зондами TaqMan, а также исследованием конформаций однонитевых фрагментов ДНК (SSCP-анализ) и прямого секвенирования. Для проведения SSCP-анализа и секвенирования были использованы праймеры, фланкирующие экзоны гена PARK2, описанные 23 ранее. Для проведения ПЦР в реальном времени TaqMan нами были разработаны зонды и праймеры на все экзоны гена PARK2 с использованием программы PrimerExpress. Нормирование результатов проводили с помощью измерений соответствующих показателей для гена -актина (Синтол, Россия). Из 42 пациентов с ранней формой БП мутации в гене PARK2 были выявлены у 7 больных (16.7 %). Пациент 1 (мужчина, начало заболевания 32 года, отец болен БП) имел дупликацию экзона 4 в гетерозиготном состоянии. Ранее данная мутация была обнаружена также в семьях с псевдодоминантным типом наследования. Пациент 2 (мужчина, начало заболевания в 43 года) имел аминокислотную замену Arg334Cys в функционально-значимом районе паркина. Ранее данная мутация была обнаружена в гомозиготном состоянии у больных AR-JP и не встречалась в контроле. Пациент 3 (женщина, начало заболевания в 52 года, мать больна БП) имел аминокислотную замену Ser167Asn и дупликацию экзонов 2 и 3. Выявленная замена Ser167Asn является полиморфным вариантом гена PARK2. По данным зарубежных авторов ее частота у больных и в контроле составляет 3–5 %. В нашем исследовании данный вариант был выявлен у 2 пациентов, и его частота среди обследованных больных составила 4.8 %. Дупликация 2–3 была описана ранее в геторозиготном состоянии у больного с ранней формой БП. Пациент 4 (женщина, начало заболевания в 44 года) имела делецию экзонов 8 и 9. Ранее делеция экзонов 8–9 в гомозиготном состоянии была описана у больных AR-JP. Пациент 5 (женщина, начало заболевания в 45 лет) имел ранее описанные делеции экзонов 7 и 10. В трех последних случаях (пациенты 3, 4 и 5) нам не известно, локализуются ли мутации на одной или разных хромосомах. У пациента 6 (женщина, начало заболевания в 52 года) и пациента 7 (женщина, начало заболевания в 50 лет, братья и сестры больны БП) была выявлена ранее не описанная делеция экзона 9 в гетерозиготном состоянии. Делеция экзона 9 гена PARK2 приводит к сдвигу рамки считывания и изменению функционально-значимого домена паркина (IRB и RING2), ответственного за взаимодействие с Е2 субъединицей убиквитин-лигазного комплекса. Таким образом, нами была показана высокая частота мутаций в гене PARK2 у больных с ранней формой БП. В настоящее время проводится сравнение ответа на применяемую терапию у больных с выявленными мутациями в гене PARK2 и остальных больных с ранней формой БП. 24 ПАТОЛОГИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МОЗГА – МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ, РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) А.С.Базян, Г.А.Григорьян, М.Е.Иоффе, Г.Н.Кузнецова, Е.В.Лосева, В.В.Раевский Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН Предполагается, что ритмический пейсмекер, индуцирующий тремор при паркинсонизме и пик-волновую активность при absence эпилепсии локализован в ретикулярном ядре таламуса. ГАМКергические нейроны ретикулярного ядра фазически гиперполяризуют таламокортикальные клетки мишени и вызывают в них индуцируемый гипперполяризацией, потенциал–зависимый пик отдачи. ДА система мозга контролирует пейсмекер ретикулярного ядра таламуса, контролируя возбуждающие и тормозные синаптические входы таламических нейронов. Известно, что паркинсонизм развивается при дегенерации ДА системы мозга. Но дефицит ДА системы наблюдается и при absence эпилепсии. Установлено, что у крыс линии WAG/Rij в n. accumbens и n. caudatus уменьшена плотность D1 рецепторов, ответственных за дофаминергическую upрегуляцию. В моторной, соматосенсорной, париетальной коре и в n. caudatus увеличена плотность D2/ D3 рецепторов, обеспечивающих дофаминергическую down-регуляцию. Таким образом, дофаминергический дефицит у этих крыс обусловлен ДА рецепторами. Исследование мусцимолиндуцируемого потока 36Cl– через ГАМКА рецепторы в синаптонейросомы коры мозга показало, что у крыс WAG/Rij активность ГАМКА рецептора значительно выше, чем у контрольных крыс Вистар. Причем реакция принципиально отличается от клонико– тонической судорожной активности, при которой активность ГАМК А рецептора значительно ниже, чем у контрольных крыс Вистар. В специальных сериях исследований выявлена многоуровневая регуляция гистаминергической системой мозга пик-волновой активности в таламо-кортикальных нейрональных петлях крыс линии WAG/Rij. НОВЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПАТОГЕНЕЗЕ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (синдром гиперпролактинемии, болезнь Паркинсона) М.В.Угрюмов Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва 25 Нервные и нейроэндокринные регуляции обеспечиваются нейротрансмиттерами и нейрогормонами, причем нарушение метаболизма этих межклеточных сигналов, возникающее при гибели синтезирующих их нейронов, приводит к развитию нейродегенеративных заболевании. Так, при дегенерации дофаминергических нейронов гипоталамуса и черной субстанции среднего мозга развиваются соответственно синдром гиперпролактинемии и болезнь Паркинсона. В дофамин(ДА)-продуцирующих центрах мозга, наряду с дофаминергическими нейронами, обладающими полным набором ферментов синтеза ДА – тирозингидроксилазой (ТГ) и декарбоксилазой ароматических L-аминокислот (ДАА), были обнаружены нейроны, экспрессирующие только один из ферментов (Meister et al., 1988). Исследования, проведенные нами в рамках программы «Фундаментальные науки – медицине» в 2002–2005 гг., показали, что большая популяция моноферментных нейронов содержится в гипоталамусе (Ershov et al., 2002 а, b), причем эти нейроны синтезируют ДА по конвейерному принципу (Ugrumov et al., 2002 a, b, 2004). Получены доказательства того, что кооперативный синтез ДА моноферментными нейронами является компенсаторной реакцией при функциональной недостаточности дофаминергических нейронов, в частности, при их дегенерации (Ershov et al., 2005). Такие же моноферментные нейроны были обнаружены нами и в стриатуме, однако только при фармакологически вызванной дегенерации дофаминергических нейронов черной субстанции. Этот факт рассматривается как показатель включения в стриатуме компенсаторного синтеза ДА при функциональной недостаточности ниграстриатной дофаминергической системы. Если усиление или включение кооперативного синтеза ДА недофаминергическими нейронами при функциональной недостаточности дофаминергической системы доказано, то вопрос о регуляции этого процесса остается открытым. Поэтому целью проекта 2005 г. явилась проверка нашей гипотезы о том, что экспрессия ферментов синтеза ДА в недофаминергических нейронах гипоталамуса и стриатума находится под ингибиторным контролем афферентов, который ослабляется или снимается в патологии. В качестве модели гипоталамических нейронов использованы вазопрессинергические нейроны супраоптического ядра, в которых при осмотической стимуляции экспрессируется ТГ. В работе поставлены задачи определить, на каком этапе онтогенеза включается экспрессия гена и синтеза ТГ и участвуют ли в регуляции этих процессов норадренергические афференты. Исследование проведено на крысах на 21-й эмбриональный день (Э21), 3-й постнатальный день (П3) и П13 с использованием количественной и полуколичественной иммуноцитохимии и гибридизации in situ. Животных всех возрастных групп подвергали солевой нагрузке, причем в ряде случаев на фоне 26 введения празозина – ингибитора 1-адренорецепторов. Крысам на П3 также вводили фенилэфрин – агонист 1-адренорецепторов. Согласно полученным данным ТГ начинает экспрессироваться в нейронах в ответ на солевую нагрузку на П3. Число нейронов, экспрессирующих ТГ при солевой нагрузке, сокращается в 3 раза с П3 по П13. Учитывая то, что в этот период развития осуществляется иннервация супраоптического ядра, нами была сформулирована гипотеза о том, что экспрессия ТГ ингибируется норадренергическими афферентами. По полученным данным ТГ не экспрессируется в осмотически стимулированных нейронах на фоне введения празозина на Э21, однако на П3 и П13 это комбинированное воздействие приводит к усилению экспрессии ТГ. При этом на П13 у животных с более развитой афферентной иннервацией, количество ТГ-иммунореактивных нейронов втрое меньше, чем на П3. Напротив, введение животным фенилэфрина приводит к снижению уровня экспрессии ТГ в осмотически стимулированных нейронах. Регуляция экспрессии ТГ в нейронах стриатума была изучена на модели развития нигростриатной дофаминергической системы в онтогенезе у крыс. С этой целью экспрессию ТГ оценивали иммуногистохимически в нейронах стриатума у плодов крыс до формирования дофаминергического афферентного контроля (Э17, Э18, Э21) и в ранний постнатальный период (П2, П7) – в процессе формирования этого контроля. У плодов крыс в стриатуме и в смежных областях мозга обнаружены многочисленные ТГ-иммунореактивные нейроны, число которых уменьшается по мере врастания в эти отделы мозга дофаминергических афферентных волокон. В ранний постнатальный период в процессе образования синаптических связей ТГиммунореактивные нейроны перестают выявляться, что свидетельствует о формировании к этому времени афферентного ингибиторного контроля. Таким образом, полученые данные свидетельствуют о наличии ингибиторного катехоламинового контроля экспрессии ферментов синтеза ДА в недофаминергических нейронах гипоталамуса и стриатума. СОЗДАНИЕ АНТИАМИЛОИДОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА НА ОСНОВЕ МИМЕТИКОВ ТРАНССАЙРЕТИНА 1,2) A.Л. Шварцман , С.В.Саранцева1), А.Е.Тараскина1), О.Л.Рунова2), Е.И.Талалаева2), М.Витек 3) 1 3 Петербургский Институт ядерной физики им. Константинова РАН, Гатчина, С.-Петербург 2 Институт экспериментальной медицины РАМН, С.-Петербург Медицинский центр Университета Дюка, Северная Каролина, США 27 Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой наиболее распространенную форму первичных нейродегенеративных заболеваний, которая характеризуется прогрессирующей потерей памяти, расстройством речи и распадом интеллекта. Многочисленные наблюдения поддерживают гипотезы о важнейшей роли амилоидоза в этиологии БА. Основной компонент амилоидных бляшек, найденных в аутоптатах мозга больных, представляет собой короткий пептид (39–43 аминокислоты), названный амилоид--протеином (A). Предполагается, что именно А является первичным патологическим агентом абсолютно во всех случаях БА, и его повышенная продукция и последующие полимеризация и фибриллизация обусловливают всю цепочку изменений в мозге больных. Естественно, что наиболее очевидным подходом в создании фармакологических препаратов для лечения БА является получение таких соединений, которые могли бы подавлять полимеризацию и агрегацию растворимого A. Здесь, однако, необходимо учитывать следующее обстоятельство. Реальный механизм А фибриллогенеза вовлекает образование как линейных олигомеров, так и большого числа промежуточных структур (круговых олигомеров, протофибрилл, аморфных агрегатов). Какие из этих интермедиатов являются нейротоксическими в настоящее время непонятно и поэтому при создании ингибиторов амилоидоза необходимо понимать, какие именно взаимодействия блокируются этими ингибиторами. Основной целью нашего исследования явилось создание ингибиторов А амилоидоза на основе миметиков транссайретина (ТТР) и определения механизма их действия. Ранее мы показали, что основной белок спинномозговой жидкости ТТР связывает циркулирующий А и подавляет in vitro и in vivo агрегацию и образование A амилоидных фибрилл (Schwarzman et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.USA., 91:8368–8372). Исследования, проведенные нами в рамках программы «Фундаментальные науки–медицине» в 2004–2005 гг., позволили нам идентифицировать последовательность А связывающего домена ТТР и показать, что синтетические пептиды-миметики этого домена также могут ингибировать образование амилоида (Schwarzman et al., 2004, Amyloid: J. Protein Folding Disord. 11: 1–9; Schwarzman et al., 2005, Amyloid: J. Protein Folding Disord. 12: 1–12). Используя метод сайт-направленного мутагенеза, мы нашли, что А связывающий домен рекомбинантного ТТР включает аминокислотные остатки VHVFRKAADDTWEPFASGKTSESGELHGLTT (TTR30–60) ТТР мономера. Последовательное уменьшение этой последовательности показало, что 28 минимальный участок А связывающего домена, обладающего ингибиторной активностью, содержит аминокислотные остатки ADDTWEP (TTR 37–43) ТТР мономера. Для подтверждения специфичности связывания А с ТТР-миметиками мы синтезировали также мутантные ТТР пептиды TTR30–60 M and TTR37–43 M, в которых глутаминовая кислота в позиции 42 была замещена на глицин. Пептиды TTR30–60 и TTR 37–43 значительно снижали агрегацию А in vitro, рост амилоида на синтетических подложках, содержащих уже сформировавшиеся агрегаты А, и накопление амилоида в культуре эндотелиальных клеток. Электронно-микроскопические исследования показали, что совместная инкубации А и ингибиторов приводит к образованию аморфных агрегатов, олигомеров и коротких фибрилл. В отличие от ТТР ни один из пептидов не подавлял образования круговых олигомеров и протофибрилл, однако ТТР-миметики, по всей вероятности блокировали их ассоциацию в зрелые фибриллы. Мутантные ТТР пептиды TTR30–60 M и TTR37–43 M характеризовались сниженной ингибиторной активностью и практически не влияли на накопления амилоида на синтетических подложках и в культуре эндотелиальных клеток. На основании полученных результатов мы можем предполагать, что пептиды-миметики ТТР ингибируют взаимодействие промежуточных амилоидных структур. Ингибирование этих взаимодействий должно иметь такой же сетевой эффект на образование амилоида как и ингибирование первоначальных этапов А полимеризации. Поскольку в настоящее время мы не знаем, какие интермедиаты амилоидного каскада являются нейротоксичными, создание новых ингибиторов А амилоидоза должно быть направлено не только на поиск соединений, ингибирующих полимеризацию А, но также и на подавление различных стадий процесса формирования и роста амилоида. В практическом плане ингибирование этих взаимодействий может иметь даже более более важное значение, поскольку на момент диагноза и начала лечения пациенты с БА уже имеют различные А отложения в мозге. КОГНИТИВНЫЕ ФУНКЦИИ И ЭМОЦИИ: НАРУШЕНИЯ ЭМОЦИОНАЛЬНО-ВОЛЕВОЙ СФЕРЫ ЧЕЛОВЕКА КАК ФАКТОР 29 ПАТОГЕНЕЗА ХРОНИЧЕСКИХ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И.Р.Ильюченок1), О.П.Миронова2), А.И.Стрельцова1), А.С. Калуга 2) 1) Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Москва 2) Центральная клиническая больница РАН, Москва Исследование направлено на выявление механизмов влияния эмоций человека на процессы мышления. Было высказано предположение, что эмоциональные сдвиги, как в положительную, так и в негативную сторону, могут влиять на патогенез хронических заболеваний, связанных с сосудистыми церебральными нарушениями. Обследованы больные с цереброваскулярными заболеваниями разной степени тяжести (гипертоническая болезнь, дисциркуляторная энцефалопатия, состояния после перенесенного инсульта, всего 80 человек). Для оценки психофизиологического профиля больных были использованы как классические, так и новые тесты – опросники Спилбергера и Тейлора, корректурная проба, задачи на категоризацию слов, мнестические задачи. Большое значение было уделено временным характеристикам мыслительных операций. Показано, что в группе больных со сходными неврологическими показателями, и соответственно диагнозами, имеются существенные различия по данным когнитивной деятельности (внимание, память, мышление). Поэтому, в основу анализа легло сопоставление групп больных с разной степенью выраженности, или отсутствием, того или иного когнитивного дефекта. Были получены данные о взаимосвязи эмоционального состояния больного и особенностей его мыслительной деятельности. Также предложенные методы позволили количественно описать определенные психические феномены, возникающие при цереброваскулярных расстройствах (эмоциональная лабильность, конкретность мышления, легко вырабатываемая установка, затруднение при необходимости тонкой категоризации понятий). Возможность объективного подхода к оценке психоэмоциональных нарушений у больных, их более тонкий анализ, позволят корректировать лечение, в том числе психотерапевтическое, необходимость которого стала очевидна после проведенного исследования. 1.2. Общие вопросы этиологии и патогенеза 30 КЛЕЩЕВЫЕ ИНФЕКЦИИ: ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ ПЕРЕНОСЧИКОВ И РИСК ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ В УСЛОВИЯХ РАСТУЩЕГО АНТРОПОГЕННОГО ПРЕССА А.Н. Алексеев 1), Е.В. Дубинина1), П.А. Чиров2), В.Н. Куликов3), Е.С. Светашова4) Зоологический институт РАН, Санкт-Петербург Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Саратов 3) Научно-производственная и диагностическая фирма Helix, СанктПетербург 4) Государственный научно-исследовательский институт озерного и речного рыбного хозяйства, Санкт-Петербург 1) 2) С конца ХХ века человечество живет в стремительно изменяемой им среде. Не вдаваясь в причины глобального потепления климата, нельзя не принимать во внимание рост числа двигателей внутреннего сгорания и объемов выбрасываемых ими выхлопных газов, содержащих как ионы тяжелых металлов, так и создающую парниковый эффект углекислоту, неуклонный рост среднезимних температур. Совокупность этих факторов влияет на те компоненты биоты (в нашем случае иксодовых клещей – переносчиков многих тяжелых заболеваний человека), развитие которых связано с успехом переживания в исходно эволюционно жестких зимних условиях, а строение экзоскелета зависит от усвоения кальция, а не кадмия и свинца. Для здоровья человека значимы последствия этих факторов – изменения физиологических свойств как самих переносчиков, так и возбудителей клещевых инфекций (вирусов, бактерий, простейших, грибов). Авторами настоящего сообщения впервые установлено, что под влиянием антропогенного пресса (прежде всего, накопления ионов кадмия в среде и организме переносчиков) появились и численно увеличиваются субпопуляции клещей рода Ixodes, толерантных к кадмию, обладающие рядом новых, неблагоприятных с точки зрения распространения клещевых инфекций, свойств. Рост числа аномалий с 37 в апреле 2000 г. до 52 % в 2005 г. в одном и том же (контрольном) очаге под С.Петербургом сопровождается ростом доли особей, зараженных патогенными для человека возбудителями (с 39.3 до 70 %). Доказано, что такие клещи чаще полиинфицированы клещевыми патогенами, а также более агрессивны, т.е. более эпидемиологически опасны. Благодаря материалам отечественных и зарубежных коллег установлено, что все клещи рода Ixodes, переносчики циркумполярно распространенного иксодового клещевого боррелиоза (ИКБ или болезни Лайма) имеют в составе популяций особей с аномалиями экзоскелета, численность 31 которых тем больше, чем интенсивнее антропогенная нагрузка. Даже в рекреационной зоне США до 14 % основных переносчиков болезни Лайма Ixodes scapularus имеют аномалии экзоскелета. В частном владении в Англии число европейских клещей Ixodes ricinus с аномалиями составило 10–14 %. В Дании (остров Амагер, международный аэропорт Каструп) уже в 2000 г. их число достигало 20 %, а в лесах вблизи Невшателя (Швейцария, 2005 г.) – 19.8 %, в Литве (в парках Вильнюса, апрель 2005 г.) – 43 %. Наиболее высокий процент клещей с аномалиями (от 42 до 80 %) выявлен нами в районе промышленного центра так называемого троеградия (Польша). Эти работы, начатые впервые нами в начале 90-х годов на таежных клещах Ixodes persulcatus и лесных Ixodes ricinus, показали неуклонный рост доли аномальных клещей во всех регионах России: от Калининградской области до окрестностей Владивостока (от 25–30 % в начале мониторинга, до 48–50 % в 2005 г.). В Вологодской области (Череповец, окрестности комбината «Северсталь») в 2005 г. оно превысило 50 %. Количественный анализ содержания ионов тяжелых металлов в среде и организме клещей доказал наличие корреляции аномалий с содержанием кадмия; концентрация его в аномальных особях в 1.25–2.0 раза выше, нежели в нормальных. Получены данные о наследственном характере аномалий и зависимости частоты их появления от концентрации кадмия в материнских особях. Данные о более частой встречаемости ИКБ в аномальных особях статистически достоверно подтверждены в масштабе большинства территорий бывшего СССР – от Красноярского края до Литвы (29.4 против10.5 %). Впервые в мировой практике была определена «вульгарная», считавшаяся непатогенной, микрофлора (бактерии, бациллы и грибы) организма клещей, и сопоставление ее с наличием заведомо патогенных для человека возбудителей. Микрофлора аномальных особей оказалось более богатой видами: 47 видов против 28. Укус любого клеща, его насыщение и передача любой из клещевых инфекций невозможны без подавления иммунной системы теплокровного хозяина. В связи с этим присутствие любых других представителей «вульгарной» микрофлоры, способных вызвать оппорунистические инфекции и утяжелить основное заболевание, приобретает особое значение. Показано, например, что в 56 % случаев из всех исследованных аномальных особей гриб Penicillum citrinum, обнаруживаемый при кератите, поражении легких и мочеполовых путей, сочетался с боррелиями, возбудителями гранулоцитарного (2 случая) и моноцитарного эрлихиоза (3). В ряде случаев он сочетался с другим видом гриба – Aspergillus niger – частым возбудителем вторичной инфекции при поражении легких у лиц с иммунодефицитом. В аномальных клещах возбудитель гранулоцитарного эрлихиоза был встречен вместе с такими бактериями, как Alcaligenes fecalis и 32 Staphylococcus saprophyticus, доказанными агентами оппортунистических инфекций. Доля таких сочетаний в аномальной части популяции составила 58 %, тогда как в нормальных клещах 4 % (χ2=9.832). Учитывая преобладание в аномальных клещах двойных и тройных инфекций, полученные современные данные об их сочетании с «условно патогенной» микрофлорой доказывают еще большую опасность этой антропогенно создаваемой, толерантной к кадмию, части популяции переносчиков рода Ixodes. ВЛИЯНИЕ ГЕЛИОГЕОМАГНИТНОЙ АКТИВНОСТИ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ, ВКЛЮЧАЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ОРГАНИЗМ Т.К.Бреус1), Р.М.Баевский2), Т.А.Зенченко1), Р.М.Заславская1), Н.Г.Клейменова1), С.И.Климов1) , О.В. Козырева3), А.А.Петрукович 1) , С.И.Рапопорт 4), А.Н.Рогоза 5), Е.В.Цагареишвили5), Н.И.Хорсева 1), А.Г.Черникова 2) Институт космических исследований РАН ГНЦ РФ м Институт медико-биологических проблем РАН 3) Институт физики Земли РАН 4) Московская медицинская академии им. И.М.Сеченова 5) НИИ кардиологии им. А.Л.Мясникова 1) 2) В исследованиях, проводимых в ИКИ РАН совместно с институтами РАН и РАМН, ранее было показано, что основной биологической мишенью для воздействия гелиогеомагнитной активности (ГМА) является сердце и сердечно-сосудистая система. Поскольку биологическая эффективность магнитных бурь сходной интенсивности оказывается различной, предполагается, что различие определяется «волновым почерком» бурь. Биотропным спектральным компонентом ГМА могут быть микропульсации в диапазоне частот ритмов сердца, например, Рс1 (0.5–2 Гц). Проведенный анализ показал, что присутствие Рс 1 во время геомагнитных возмущений в 70 % случаев сопровождается аномальным возрастанием числа инфарктов миокарда в Москве и возрастанием числа внезапных смертей в Болгарии. Появление Рс1 за сутки до начала магнитной бури и существование сезонного зимнего максимума в их продолжительности коррелируют с появлением аномального числа инфарктов и внезапной смерти. Характерно, что сезонные максимумы других геомагнитных показателей приходятся на весну/осень, а медицинские эффекты до начала магнитных бурь не получали до этого разумных объяснений. В летнее время, однако, даже сильные магнитные 33 бури с Рс1 не сопровождались возрастанием числа инфарктов. Предполагается, что чувствительность организма в зимнее время повышается из-за его неустойчивости, связанной с изменением продукции гормона мелатонина вследствие недостаточной освещенности. Другим показателем, реагировавшим на гелиогеомагнитную активность в ранее проведенных нами исследованиях, было артериальное давление (АД). Анализ базы данных НИИ кардиологии, содержащей результаты трехмесячного мониторирования 27 пациентов с диагнозом «гипертония» (2001–2003 гг.) показал, что примерно у 30 % пациентов имеются тренды и колебания, не объяснимые на фоне проводившейся терапии. Сопоставление с индексами геомагнитной активности свидетельствует, что для этих пациентов имеется значимая положительная корреляция с уровнем геомагнитной активности с запаздыванием отклика АД на ГМА примерно на 2 сут. Был также проведен анализ результатов 24-часового мониторирования АД и частоты сердечных сокращений (ЧСС) у космонавтов в предполетный период и во время длительных космических полетов. Всего проанализировано 24 наземных предполетных записей и 28 записей, полученных в период от 4 до 6 месяцев полета. После 4-х месячного пребывания в невесомости происходил рост АД и ЧСС у космонавтов перед началом и во время магнитной бури. После бури (менее чем через сутки) наблюдалось восстановление значений АД до значений в контрольной группе, в то время как ЧСС оставалась повышенной. С целью разработки медикаментозной профилактики инфарктов миокарда и обострений ишемической болезни сердца при геомагнитных бурях в 2005 г. было проведено исследование эффективности препарата мелатонина на фоне традиционного лечения в группах больных, страдающих стабильной стенокардией в сочетании с гипертонической болезнью, а также в группе пациентов, перенесших инфаркт миокарда и страдающих сердечной недостаточностью (44 пациента). Включение мелатонина в комплексную терапию при указанных патологиях приводило к стойкому клиническому эффекту – уменьшению количества и продолжительности эпизодов болей в области сердца, а также к антиишемическому эффекту по данным ЭКГ. Наблюдались также выраженный гипотензивный эффект и хронокоррекция циркадианных ритмов АД, свидельствовавшая об уменьшении энергетических затрат миокарда. Выявление возможных отдаленных последствий воздействия солнечной и геомагнитной активности (ГМА) в период эмбриогенеза на здоровье детей в постнатальный период и их развитие проводилось с использованием психофизиологических показателей около 3500 детей в различных районах Москвы. Поскольку изменение этих показателей отражает воздействие экологических факторов не только глобального, но и местного масштаба, 34 на первом этапе необходимо было исключить эффекты региональной экологической обстановки и подготовить «нормировочную карту» для дальнейшего анализа эффектов ГМА. Установлено, что в экологически неблагополучных районах (Братеево, Нагатино) степень нарушения психофизиологических показателей детей достоверно (p<0,05) выше, чем в экологически благоприятных (Новые Химки). В годы с высокой солнечной активностью частота встречаемости сильного и среднесильного типов силы нервной системы среди рожденных детей выше, чем в годы минимумов солнечной активности. Была подготовлена научная программа: «Основные исследования и методы мониторирования потенциально опасных и катастрофических явлений с использованием микроспутников», а также модельный состав соответствующего комплекса аппаратуры для микроспутника «Чибис», который предполагается запустить в 2007 г. ГИПЕРТЕРМИЧЕСКАЯ ДЕТОКСИКАЦИЯ ХИМИЧЕСКИ ЗАВИСИМЫХ БОЛЬНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АППАРАТУРЫ ВЧ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ПОЛЯ Н.П.Веселкин Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН РАЗРАБОТКА, ОБОСНОВАНИЕ И КОНЦЕПЦИЯ КОМПЛЕКСНОГО МЕДИКО-ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА А.Г.Гамбурцев 1), О.И.Аптикаева 1), С.И.Степанова 2), Л.Г.Хетагурова 3) 1) Институт физики Земли им. О.Ю. Шмидта РАН Государственный научный центр – Институт медико-биологических проблем РАН 3) Институт биомедицинских исследований Владикавказского научного центра РАН и Правительства РСО-Алания 2) Для того, чтобы знать, каковы особенности динамики процессов в окружающей среде, как уменьшить их негативные последствия, производят их мониторинг. Разработаны концепции, проводятся разные виды мониторинга. Однако вариации во времени различных показателей рассматриваются изолированно. В окружающих средах с природной, антропогенной и социальной – происходят изменения во времени, которые влияют на здоровье людей. Сейчас усиливаются антропогенная нагрузка на биосферу, социальная напряженность, природные катастрофы. Поэтому необходимо находить причинно-следственные 35 связи между процессами, стремиться к пониманию того, как окружающие среды влияют на здоровье и качество жизни людей, научиться прогнозировать поведение процессов, предотвращать и/или минимизировать отрицательные явления. Это можно сделать, если создать и развернуть систему комплексного медико-экологического мониторинга (КМЭМ), особенно в неблагоприятных в экологическом отношении регионах России. Работы были поддержаны научным сообществом и Межведомственными комиссиями Совета Безопасности РФ. Цель работы: установить закономерности динамики процессов в окружающих средах и медицинских показателей, установить причинноследственные связи между ними, улучшить методы прогнозирования неблагоприятных событий и ситуаций, создать предпосылки для практического осуществления КМЭМ и в результате способствовать улучшению здоровья и качества жизни людей. На 2005 год были поставлены следующие задачи. Изучить влияние окружающей среды на здоровье и качество жизни людей. Провести поиск причинно-следственных связей между медицинскими показателями и параметрами процессов, протекающих в окружающей среде. Сформулировать основные свойства динамики медицинских показателей и процессов, происходящих в окружающей среде. Развить и обосновать концепцию КМЭМ, получить выводы о возможной практической его постановке. Получены новые результаты и проведено сопоставление результатов, описывающих динамику медицинских показателей и параметров окружающих сред. В частности обработаны очень содержательные и интересные данные о количестве вызовов Скорой помощи в Москве за 1995–1999 гг. и другие годы. Результаты изложены в книге «Экология человека в изменяющемся мире» под ред. акад. В.А. Черешнева (УрО РАН, 2005) и ряде статей (публикации поддержаны Программой). В процессе многолетнего мониторинга качества здоровья населения Северной Осетии по критерию ритмической организации жизненно важных функций и процессов у рабочих промышленных предприятий, студентов-медиков и педагогов в условиях нарастающей экологической и психоэмоциональной стресс-прогрессирующей угрозы получены результаты, выявляющие признаки десинхроноза – патологического процесса, который составляет патогенетическую основу нарушений здоровья, способствует росту заболеваемости населения, отягощает течение болезней и препятствует процессам выздоровления, что крайне важно с позиций как фундаментальной, так и прикладной науки – для грамотного построения профилактических, лечебных и реабилитационных мероприятий по восстановлению здоровья населения. Установлено прогрессирующее нарастание в популяции доли лиц с 36 десинхронозом, что поддерживает отрицательные тенденции в демографической ситуации региона. Развита концепция КМЭМ и сформулированы предложения по практическому осуществлению системы такого мониторинга. Концепция содержит три основных блока. Первый блок — это мониторинг и анализ процессов, развертывающихся в окружающих средах во времени и в пространстве. Второй блок – это мониторинг и анализ вариаций медицинских показателей – у групп людей и отдельно взятых людей (здоровых и больных, мужчин, женщин и детей разного возраста) в разных условиях. Третий блок — сопоставление результатов, поиск причинно-следственных связей, продвижение в проблеме прогнозирования негативных процессов и явлений. При построении основ концепции КМЭМ учитываются следующие позиции. Комплексность и согласованность наблюдений и обработки. Выбор параметров и репрезентативных групп обследуемых лиц. Учет свойств динамики процессов в биосфере. Период опроса. Масштабы и дискретность составления тематических карт. Представление о сильных и слабых, прямых и косвенных, быстрых и медленных воздействиях на биосферу и человека со стороны окружающих сред. На основании анализа результатов фактических наблюдений в разных сферах, в том числе медицинских показателей, выявлены закономерности в динамике процессов. Кратко обозначим некоторые из них. 1. Изменения состояния объектов биосферы характеризуются трендовыми, ритмическими, импульсными и шумовыми вариациями, а также изменениями уровня. Структура сложных временных рядов, может быть обусловлена суперпозицией доминирующих ритмов. 2. Реакция объектов биосферы на внешние воздействия часто носит нелинейный характер, что выражается, например, в несоблюдении принципа суперпозиции или в сильной реакции на слабые воздействия. 3. Объекты биосферы не реагируют на все воздействия одновременно; они «выбирают» те воздействия, на которые в данное время они «предпочитают» реагировать. Другими словами, реакция на внешние воздействия носит избирательный характер, - при этом чувствительность к воздействиям изменяется во времени. 4. Один и тот же объект биосферы в разные интервалы времени (по расположению на временной шкале) может реагировать на одинаковые воздействия по-разному. Однотипные объекты (например, разные люди) в одно и то же время могут по-разному реагировать на одни и те же внешние воздействия. 5. Реакции биологических объектов на внешние воздействия зависят не только от характера воздействий, но и от свойств самих объектов. Для биосферы и ее объектов характерны периоды синхронизации и десинхронизации. Одним из проявлений реакции на внешние воздействия является десинхронизация ритмических процессов в организме человека. 6. 37 Величины периода ритмов варьируют в очень широких пределах. Процессам свойственна переменная полиритмичность. 7. Биосфера и ее объекты проявляют стремление к самоорганизации и хаотизации. Смены упорядоченных и хаотических состояний происходят то ритмично, то беспорядочно. Выше отмечены общие особенности динамики процессов, протекающих в разных объектах, в том числе в разных организмах (например, у новорожденных, взрослых здоровых людей, пожилых, больных). В то же время имеются различительные особенности динамики процессов в разных объектах – они отмечаются в контрасте, амплитуде, скорости смены состояний. РОЛЬ ПСИХОСОЦИАЛЬНЫХ СТРЕССОРОВ В ДИНАМИКЕ УГРОЖАЮЩИХ ЖИЗНИ БОЛЕЗНЕЙ (НА ПРИМЕРЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ) А.Л.Журавлев1), Н.В.Тарабрина1), Г.П.Генс2), Л.И. Коробкова2), О.А.Ворона1), М.А.Падун1) 1) Институт психологии РАН 2) Московский Государственный медико-стоматологический университет В современных отечественных и зарубежных исследованиях показано, что онкологическим заболеваниям часто сопутствуют серьезные психологические и психиатрические проблемы. Установление диагноза злокачественного новообразования является сильным психотравмирующим стрессором для каждого человека, сопровождающимся, как правило, переживанием интенсивных негативных эмоций страха, чувства беспомощности, оцепенения. Далеко не все онкологические больные могут успешно преодолевать переживаемый ими стресс. У некоторой части онкологических пациентов определяются симптомы, обусловленные стрессом: избегающее поведение, навязчивые мысли, усиление возбудимости, что говорит о развитии у этих больных посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) или его признаков. В настоящее время исследователи пришли к выводу, что нет достаточных данных о том, что психосоциальные факторы могут быть причиной рака. Также противоречивым остается вопрос о том, что психосоциальные факторы могут способствовать росту опухоли и рецидиву заболевания. Однако известно, что наличие ПТСР приводит к ухудшению социального функционирования и различным формам психической дезадаптации, что, безусловно, приводит к отягощению основного заболевания. 38 Задачей исследования был анализ психологического дистресса у больных раком молочной железы (РМЖ), а также изучение взаимосвязей показателей переживания жизненных стрессов с характеристиками посттравматических состояний. Испытуемые. Исследование проводилось на базе химиотерапевтического и онкохирургического отделений ЦКБ им. Семашко (Москва). Обследовано 75 больных, прооперированных и завершивших лечение по поводу диагноза «рак молочной железы» I-III стадии, без отдаленных метастаз. На период обследования больные находились в состоянии ремиссии. Средний возраст испытуемых составил 51,4+7,2 г. (от 38 до 72 лет), образование – 13,5+1,7 г. Методы. 1. Шкала клинической диагностики CAPS для клинической диагностики уровня выраженности симптоматики ПТСР и частоты ее проявления. 2. Шкала субъективной оценки тяжести воздействия травматического события. 3. Миссиссипская шкала для оценки посттравматических реакций. 4. Опросник травматических ситуаций. 5. Опросник ситуативной и личностной тревожности Спилбергера-Ханина. 6. Опросник оценки выраженности психопатологической симптоматики. 7. Опросник депрессивности Бека. Результаты. Результаты проведенного интервью и анализ данных по методике CAPS показали, что в исследуемой выборке больных РМЖ выделяется группа женщин, показатели которых соответствуют клинической картине ПТСР (n=18) и группа женщин (n=31), у которых наблюдаются отдельные признаки посттравматического стресса (выполняется хотя бы один из критериев ПТСР по DSM-IV, помимо критерия А – факта наличия травматического события). Анализ данных показал, что количество и субъективная оценка интенсивности влияния на человека жизненных стрессов были значимо взаимосвязаны с уровнем признаков посттравматического стресса (p<0.05), в особенности с симптоматикой избегания воспоминаний о травмирующем событии при реагировании на актуальную травму, в нашем случае – на заболевание РМЖ. Из психопатологических симптомов особенно отчетливо выделялись взаимосвязи признаков посттравматического стресса и симптомов депрессии, тревожности и психотизма (p<0.01). Кроме того, показатель влияния на индивида пережитых в течение жизни травмирующих событий взаимосвязан с уровнем личностной тревожности (p<0.05): испытуемые с более высоким уровнем личностной тревожности субъективно оценивали травматические события как более значимые. Анализ клинических случаев показал, что высокий уровень личностной тревожности способствовал возникновению феномена т.н. «кумулятивного стресса», что выделило таких больных в группу риска развития ПТСР. 39 Таким образом, количество предшествующих жизненных стрессов и особенности реагирования на них взаимосвязаны с интенсивностью посттравматических реакций, возникающих в ответ на диагностирование опасного для жизни заболевания. Дальнейшие исследования будут направлены на изучение роли посттравматических стрессовых состояний в вероятности рецидива онкологического заболевания. НОВЫЙ ПОДХОД К ЭТИОЛОГИИ И ПАТОГЕНЕЗУ ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИШЕМИЯ МОЗГА И СОН В.М.Ковальзон1), Г.Н. Фесенко1), А.В.Ревищин1), Е.М.Руцкова2), М.М.Свинов2), 2) Е.В.Голобородько , В.Б.Дорохов2), В.В.Логинов2), Г.А.Иваницкий2), А.Н.Евдокименко3), И.М.Русакова3), Я.И.Левин4), О.П.Миронова5) Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н.Северцова РАН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН 3) Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В.Ломоносова 4) Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова 5) Отделение неврологии ЦКБ РАН, Москва 1) 2) Мозговой инсульт – важнейшее социальное заболевание, являющееся одной из основных причин смертности и инвалидности людей трудоспособного и пожилого возраста в России. Нами предложена гипотеза о том, что сон вообще и его парадоксальная фаза (ПС) в особенности являются специфическими состояниями, во время которых реализуется восстановительная функция мозга. В частности, возможно, что именно в ПС происходит репарация нервной ткани после ишемии; при этом нейротрансплантат из эмбриональной ткани, включающий стволовые клетки, ускоряет это восстановление, что должно найти свое отражение в изменении структуры сна. Действительно, классические морфологические исследования последствий мозговой ишемии и гипоксии выявили не только дегенеративные, но и восстановительные процессы в мозговой ткани, включая пролиферацию стволовых клеток. С другой стороны, классические исследования шотландского сомнолога Ian Oswald, выполненные еще в 1960-е годы, ясно показали важнейшую роль ПС в процессах тканевого восстановления в головном мозге. В исследованиях на испытуемых – здоровых и больных с ишемическим инсультом, а также в опытах на экспериментальных моделях, нами проводится проверка вышеприведенной гипотезы. Группа испытуемых с мозговым инсультом различной локализации подвергается 40 неврологическому, полиграфическому, томографическому и психологическому обследованию. Контрольную группу составляют практически здоровые испытуемые того же возраста и полового состава. Предварительные данные показывают, что сохранность дельта-сна и ПС является важнейшим фактором в восстановлении функций мозга и определении витального прогноза; критической точкой при этом является 10 % представленность дельта-сна, при которой еще сохраняется возможность восстановления ПС и функциональных характеристик мозга. Из вышеприведенной гипотезы также следует, что у переживающих экспериментальную мозговую ишемию крыс можно ожидать возникновения объективных количественных изменений структуры естественного сна, связанных с активацией собственных репаративных (восстановительных) функций мозга. С целью проверки следствия этой гипотезы взрослые лабораторные крысы-самцы, с предварительно вживлёнными под пентобарбиталовым (40 мг/кг, в/б) и хлорал-гидратным наркозом стандартными электродами для записи ЭЭГ и ЭМГ, подвергаются затем полной перманентной окклюзии одной или обеих общих сонных артерий. У переживших эту процедуру животных ежедневно в одно и то же время либо в течение трех часов (с 9 до 12), либо круглосуточно в условиях свободного поведения проводят полиграфическую регистрацию вплоть до 40-го дня после окклюзии. Анализ полиграмм выявляет многократное увеличение представленности ПС в 1-й и 2-й дни после окклюзии – до 20 % от времени записи; в последующем процент ПС постепенно снижается и достигает контрольного уровня 2,5 % к 40-му дню. Уни- и билатеральная окклюзия вызывают одинаковые эффекты. Медленный сон претерпевает менее заметные изменения, хотя в 1-й день записи наблюдается его достоверное увеличение. Аналогичные опыты проводятся на «пожилых» кроликах-самцах шиншилла (возраст 2–2,5 года, вес 4–5 кг) с предварительно вживленными (под местной анестезией) стандартными электродами для записи полиграммы; окклюзию проводят под хлорал-гидратным наркозом (0,5 г/кг, в/б). Как и у крыс, уровень выживания составляет 25–30 %. Пережившие животные подвергаются непрерывной круглосуточной цифровой безбумажной полиграфической регистрации до окклюзии (0 день, контроль), а также на 5-е, 9-е, 18-е и 24-е сутки после ее проведения. Предварительные данные показывают постепенное увеличение представленности ПС после окклюзии: от 1,6 % от времени записи (24 ч) в контроле (до окклюзии) до 4,5 % на 18-е сутки. МС также претерпевал значительное увеличение: от 31,5 % в контроле до 48 % на 18-е сутки. Динамика этого возрастания обеих фаз сна была различна для темного и светлого периодов суток. На 24-е сутки оба показателя начали снижаться. Небольшие расхождения между двумя сериями опытов (на крысах и 41 кроликах) могут быть объяснены такими факторами, как видовые, возрастные отличия объектов, а также некоторые различия в экспериментальных условиях. Результаты явно свидетельствуют в пользу гипотезы о важнейшей роли ПС в восстановлении ткани мозга. Поддержано программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» (11-П) и грантом РГНФ № 04-06-00262а. ИЗМЕНЕНИЯ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН И НЕРВНОМЫШЕЧНЫХ СИНАПСОВ ПРИ ГИПОКИНЕЗИИ И ПЕРВИЧНОЙ МИОПАТИИ. ПОИСК ПУТЕЙ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ Е.Е. Никольский1), Б.С. Шенкман2), З.А. Подлубная3), Т.Л. Немировская2), Э.A. Бухараева1), А.М. Мухина2), И.М. Вихлянцев3), О.В. Туртикова2), О.В.Тяпкина1), И.Н. Чистяков2) 1) Казанский Институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН 2) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН 3) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН Важным компонентом патогенеза мышечных расстройств, развивающихся при гипокинезии, может быть увеличение базальной концентрации Ca2+ в цитоплазме мышечных и нервных клеток (Григорьев и др. 2004), приводящее к изменению экспрессии сократительных и регуляторных белков и лавинообразному ускорению протеолитических процессов, инициируемых, главным образом, Ca 2+-зависимыми протеазами (кальпаинами). В настоящем исследовании была предпринята попытка скорректировать последствия патологического процесса в мышечных волокнах, основанная на предотвращении увеличения концентрации Ca2+ в мышечном волокне и/или на ингибировании активности кальпаинов. Для предотвращения накопления Ca2+ в волокне использовали нифедипин – блокатор Ca2+-каналов L-типа, который применяли на фоне антиортостатического вывешивания крыс. 42 самца крыс линии Wistar были разделены на 3 группы: контроль («К», n=14), вывешивание 14 суток («В», n=14), вывешивание в сочетании с введением нифедипина («ВН», n=14). Установлено, что уровень внутриклеточного Ca2+ в покое в группе «В» был выше по сравнению с контролем. Доля мышечных волокон медленного типа в группе «В» снижалaсь, а быстрых и гибридных волокон – повышалась. Площадь поперечного сечения мышечных волокон I и II была ниже (p<0.05), чем в группе «К». По данным электрофореза доля тяжелых цепей миозина у вывешенных животных также снижалась, а быстрого типа – повышалась. Введение 42 нифедипина уменьшало уровень внутриклеточного Ca 2+ по сравнению с группой «В». Доля медленных волокон в группе «ВН» была больше, а быстрых – меньше по сравнению с группой «В». Таким образом, введение нифeдипина на фоне гипокинезии снижало концентрацию внутриклеточного Ca2+ и частично предотвращало трансформацию медленных волокон в быструю сторону. В то же время, введением блокатора L-каналов не удалось предотвратить наблюдаемое при гипокинезии снижениe уровня белков саркомерного цитоскелета (титина и небулина). Применение L-аргинина – донора NO, являющегося ингибитором кальпаинов, на фоне гипокинезии позволило уменьшить степень редукции площади поперечного сечения волокон и изменение соотношения экспрессии медленной и быстрой изоформ тяжелых цепей миозина. При обработке L-аргинином мышей линии MDX, являющихся биологической моделью миодистрофии Дюшенна, также наблюдались благоприятные сдвиги в сторону снижения деградации титина и небулина. Есть основания полагать, что сочетанное применение нифедипина и Lаргинина может найти место среди способов патогенетической терапии миодистрофии Дюшенна и последствий гипокинезии. Поскольку гиподинамия наряду с изменением скелетных мышечных волокoн приводит к снижению лабильности нервно-мышечных синапсов, то важным представлялся анализ состояния синаптического контакта у животных, содержащихся в условиях антиортостатического вывешивания. При этом было учтено, что реакция синапсов в мышцах разного типа («быстрые» и «медленные») может быть различной. Было изучено влияние опорной разгрузки на спонтанную квантовую секрецию медиатора, оцениваемую по средней частоте миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) в синапсах мышц разного функционального профиля. В контроле частота МПКП была выше в «быстрых» мышцах, чем в «медленных». Калиевая деполяризация двигательных нервных окончаний приводила к росту частоты МПКП в обеих мышцах, но эффект был более выражен в синапсах «быстрой» мышцы. Лишение животных опоры вызывало изменение частоты МПКП в синапсах обеих мышц, однако динамика и выраженность этих изменений были различными. В «быстрой» мышце частота МПКП не изменялась в ходе месячной опорной разгрузки и только на 35 сутки увеличивалась на 75 % от контроля. В «медленной» мышце частота МПКП к концу 1 недели снизилась на 25 % и оставалась на таком уровне до 35 суток. В синапсах мышц животных, содержащихся в условиях опорной разгрузки, калиевая деполяризация, а также действие негидролизуемого аналога ацетилхолина – карбахолина, активирующего пресинаптические холинорецепторы, приводили к росту частоты МПКП в синапсах обеих мышц, однако характер реакции как на калиевую деполяризацию, так и на карбахолин в «быстрой» и «медленной» мышцах был различен и зависел от длительности опорной 43 разгрузки. Обнаружение особенностей реакции механизмов, контролирующих спонтанную квантовую секрецию медиатора из моторных нервных окончаний, иннервирующих волокна разного функционального типа у животных, содержащихся в условиях гравитационной разгрузки позволяет думать, что патогенез гипогравитационного синдрома может включать в себя не только изменения сократительного аппарата мышцы, но и нарушение механизмов, реализующих как процессы экзоцитоза медиатора, так и участвующих в обеспечении их саморегуляции. РАЗРАБОТКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ПАТОЛОГИЙ; РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В ДЕГЕНЕРАЦИИ СЕТЧАТКИ ГЛАЗА Г.Р.Каламкаров, М.А.Островский, О.Г.Лунгина, Т.Ф. Шевченко Институт биохимической физики РАН, Москва В ходе выполнения проекта были продолжены работы по исследованию возможностей разработанного нами метода для диагностики аутоиммунных заболеваний. Как оказалось, многие офтальмологические патологии, особенно патологии, затрагивающие сетчатку глаза, на ранних стадиях сопровождаются появлением в крови и слезной жидкости больных антител к некоторым антигенам. Нами было выявлено два таких антигена с условными названиями С-антиген и I-антиген. Наиболее интересным результатом, полученным при применении такого метода, оказалась возможность ранней диагностики диабетической ретинопатии у больных сахарным диабетом, еще не имеющим глазных патологий. Ранее нами установлено, что у 30 % больных сахарным диабетом в крови выявляются иммуноглобулины класса IgM и IgG и к антигенам сетчатки и межклеточного матрикса. Проведенное в течение трех лет исследование показало, что в 70% случаев у этих больных с течением времени появлялись клинические признаки ДР. Таким образом, предлагаемый подход является методом доклинического выявления глазной патологии у больных сахарным диабетом. Такой же подход был применен и при прогнозировании отдаленных последствий травм глаза. Нами установлено, что в 90 % случаев при ожоговой травме 3 степени в крови больных выявляются антитела на антигены сетчатки. У большинства больных после успешного лечения уровень антител в крови падал. Однако в тех случаях, когда после успешного лечения уровень антител в крови не снижался, с течением времени наблюдался рецидив, и заболевание переходило в хроническую 44 форму. Таким образом, нами предложен иммунологический метод предсказания осложнений при ожоговых травмах глаза по выявлению в крови больных антигенов из сетчатки и межфоторецепторного матрикса. Большинство заболеваний глаза индуцируется дегенерацией зрительных клеток. Наружные сегменты зрительных клеток непосредственно контактируют с пигментным эпителием и сосудистой оболочкой глаза; нарушение их фагоцитоза приводит к последующей дегенерации сетчатки и появлению в крови антигенов, способных вызывать аутоиммунные заболевания. Мы исследовали влияние оксида азота на апоптоз зрительных клеток, вызываемый интенсивным освещением. Нами установлено, что оксид азота играет ключевую роль в этом процессе апоптоза зрительных клеток сетчатки, и его регуляция может существенно влиять на течение дегенеративных процессов. На основании этих исследований нами предложен класс нитросодержащих соединений, которые эффективно защищают сетчатку глаза от острой и хронической ишемии отека сетчатки. ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ РАЗВИТИЯ СИНДРОМА ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ В.А.Отеллин1), Л.И.Хожай1), Д.Э.Коржевский2), Н.Г.Павлова3), Н.Н.Константинова3), А.Н.Старорусская3) Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург 3) НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта РАМН, Санкт-Петербург 1) 2) Пренатальное развитие человека в условиях измененной среды микроокружения является важной фундаментальной проблемой, социальная значимость которой возрастает в связи с ухудшением демографической ситуации в нашей стране. Клинические, морфологические, иммунологические исследования показывают, что беременность, осложненная различными акушерскими (невынашивание, многоплодие, гестоз) и экстрагенитальными (гипертоническая болезнь, заболевания почек, сахарный диабет) заболеваниями, а также при действии различных вредных факторов (экологических, социальных, стрессовых) сопровождается развитием недостаточности функции плаценты, приводящей, при отсутствии возможности ее корригировать, к задержке развития и в тяжелых случаях к внутриутробной гибели плода. В настоящее время существуют клинические методы диагностики синдрома плацентарной недостаточности (ультразвуковая допплерометрия) и известно, что при его развитии происходят структурные и функциональные изменения в системе мать-плацента-плод, приводящие к нарушению плацентарной гемодинамики и гипоксии 45 плода. Механизм же развития этих нарушений остается неизвестным, что делает невозможным разработку адекватных прогностических критериев и эффективных приемов патогенетической терапии. С целью изучения клеточных механизмов, лежащих в основе нарушения плацентарной гемодинамики проведено комплексное клиникоморфлогическое исследование, на первом этапе которого были определены клеточные и тканевые элементы, изменяющие свои морфофункциональные характеристики при развитии синдрома плацентарной недостаточности. Оказалось, что на этапе формирования плаценты в условиях, приводящих к развитию плацентарной недостаточности, изменяются состав и структурная организация популяции клеток Кащенко-Гофбауэра (плацентарных макрофагов). Их число существенно возрастает, увеличивается количество цитоплазатических вакуолей. Этот процесс совпадает по времени с развитием компенсаторных изменений плацентарного кровотока, направленных на устранение гипоксии плода. В то же время, изменений структурно-функциональных характеристик фибробластов, капиллярного эндотелия и гладкомышечных элементов более крупных кровеносных сосудов не наблюдается. На поздних сроках при развернутой клинической картине декомпенсированной плацентарной недостаточности популяция плацентарных макрофагов существенно уменьшается. В это время регистрируется комплекс морфологических изменений в сосудах, строме ворсинок и вневорсинчатом трофобласте, свидетельствующий о нарушении плацентарного кровотока и уменьшении проницаемости плацентарного барьера. В большинстве случаев такие изменения, как тромбоз плацентарных сосудов, кровоизлияния, утолщение базальных мембран, кальцификация стромы ворсинок и дегенерация трофобласта носят мозаичный характер. При этом обнаруживается снижение пролиферативной активности трофобластических элементов и капиллярного эндотелия. В ряде капилляров наблюдается локальное исчезновение маркера CD31, ответственного за адгезию тромбоцитов и эндотелиоцитов. Увеличение межкапиллярных пространств вызвано значительным отложением коллагена IV типа, который аккумулируется периваскулярно. Полученные данные свидетельствуют об участии плацентарных макрофагов в обеспечении адаптационных реакций сосудистой системы плаценты в условиях измененного микроокружения, приводящих к угрозе гипоксии. В качестве объектов приложения регуляторных воздействий, по-видимому, выступают различные клетки плаценты, но определяющая роль среди них принадлежит капиллярным эндотелиоцитам. В связи с полученными данными в дополнение к плану предполагается исследовать экспрессию eNOS и других эндотелиальных регуляторов, а также оценить регуляторный потенциал плацентарных макрофагов in vitro. 46 В рамках экспериментального раздела исследования (выполненного на лабораторных животных) установлено, что введенные беременным самкам экзогенные глюкокортикоидные гормоны (которые применяются в клинике при нарушениях развития плода), вызывают структурные нарушения фетальной части плаценты. Это проявляется в значительной гибели клеток трофобласта в разных отделах плаценты, нарушением (или задержкой) формирования фетальных сосудов, а также патологическом изменении лабиринта, что может способствовать неполноценному снабжению плаценты материнской кровью. Возникающая при этих состояниях гипоксия обусловливает функциональную недостаточность плаценты и представляет угрозу для нормального пренатального развития плода. В частности, в этих условиях нами отмечены нарушения развития формаций мозга, изменение их цитоархитектоники, клеточного состава и морфометрических характеристик, что после рождения сочетается с отклонениями в обучении и эмоциональной сфере. В последующем основное внимание в работе будет уделено завершению экспериментов и проведению клинико-морфологических сопоставлений с целью совершенствования диагностики, прогноза и лечения больных с плацентарной недостаточностью. НОВЫЙ ПОДХОД В ИЗУЧЕНИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ЭТИОЛОГИИ И ПАТОГЕНЕЗА ДИАБЕТА: ПОИСК ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ В ГОРМОНАЛЬНЫХ СИГНАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМАХ ПРИ ДИАБЕТЕ 1 И 2 ТИПОВ М.Н. Перцева1), Л.А. Кузнецова1), С.А. Плеснева1), А.О. Шпаков1), В.М. Бондарева1), О.В.Чистякова1), С.И. Морозова2), М.Ф. Баллюзек2), Е.А. Манова2) 1) Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М.Сеченова РАН, 2) Клиническая больница РАН, Санкт-Петербург Сахарный диабет относится к одной из острейших социальных и экономических проблем современной медицины. В связи с этим поиск новых подходов для выяснения причин и методов лечения этого заболевания, относится к первоочередным задачам фундаментальной и прикладной науки. На основе разработанного в лаборатории инновационного подхода в изучении молекулярных основ диабета, включающего: а) концепцию молекулярных дефектов в гормональных сигнальных системах как ключевых причин эндокринных заболеваний (Перцева, Шпаков, 2004); б) открытые авторами аденилатциклазные сигнальные механизмы (АЦСМ) действия инсулина и релаксина; в) передовую пептидную стратегию в выявлении молекулярных дефектов в 47 этих АЦСМ, в 2005 г. были проведены следующие исследования: 1) сравнительное изучение функционального состояния АЦСМ действия гормонов инсулина и релаксина и составляющих их блоков при диабете 2 и 1 типов на экспериментальных стрептозотоциновых (СТЦ) моделях у крыс и при этой патологии у человека; 2) поскольку инсулиновая резистентность (ИР) периферических тканей играет ключевую роль в патогенезе диабета, были исследованы на экспериментальных моделях возможные молекулярные механизмы ее возникновения в мышечных тканях при диабете. Результаты исследования: 1 этап. Стрептозотоциновый диабет 2 и 1 типов. 1. На неонатальной СТЦ модели диабета 2 типа у крыс в скелетных мышцах впервые обнаружено резкое снижение (в 4–5 раз) активирующего действия инсулина и релаксина и совместного их влияния с гуаниновым нуклеотидом (ГН) на активность аденилатциклазы (АЦ). Показано, что это связано с нарушением функций дистальных отделов АЦСМ действия этих гормонов: увеличение каталитической активности АЦ, ослабление функций Gs-белка и их сопряжения. Выявленные функциональные дефекты в АЦСМ исследуемых гормонов ведут к нарушению передачи инсулинового и релаксинового сигналов через эти сигнальные механизмы. Аналогичная картина функциональных нарушений в инсулин- и релаксинкомпетентных АЦСМ наблюдалась и при СТЦ диабете 1 типа в мышцах крыс. 2. Инсулиновая резистентность (ИР). Учитывая нарушение функций инсулинкомпетентного АЦСМ и уменьшение реактивности к инсулину ферментов углеводного обмена в скелетных мышцах крыс, обнаруженные нами при диабете, исследовали возможную роль протеинкиназы С (ПКС) в возникновении ИР. Предполагается, что вызываемое этим ферментом фосфорилирование по серину/треонину белков, входящих в инсулиновую сигнальную систему, может быть причиной нарушений его функции. Нами установлено, что в экспериментах in vitro активация ПКС диацилглицерином приводит в скелетных мышцах нормальных крыс к выраженному снижению функций инсулин- и релаксинкомпетентной АЦСМ, а у крыс с экспериментальным диабетом 2 типа эти функциональные нарушения еще более углубляются. Полученные данные свидетельствуют в пользу ПКС-зависимого механизма возникновения ИР при диабете 2 типа. 3. С использованием пептидной стратегии, основанной на применении С-концевых пептидов -субъединиц G-белков стимулирующего (385–394 s) и ингибирующего (346–355 i2) типов, было показано, что основные функциональные дефекты в АЦ механизмах действия биогенных аминов (лигандов адренергических рецепторов, серотонина) в скелетных мышцах и миокарде крыс с СТЦ диабетом 48 локализованы на этапе функционального сопряжения рецепторов биогенных аминов с G-белками. 4. На впервые разработанной СТЦ модели диабета 1 типа у моллюска Anodonta cygnea обнаружены следующие нарушения: на фоне четкого увеличения уровня гликемии в гемолимфе выявлены функциональные дефекты в инсулинкомпетентном АЦСМ, а также в регуляции инсулином активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) в гладких мышцах моллюска, сходные с подобными в скелетных мышцах крыс со СТЦ диабетом 1 типа. 2 этап. Диабет 2 и 1 типов у человека. При исследовании функционального состояния АЦСМ действия гормонов инсулиновой природы в миометрии беременных женщин, страдающих диабетом 2 типа, впервые были обнаружены следующие нарушения: а) увеличение (в 3-4 раза) базальной активности АЦ; б) снижение стимулирующего влияния in vitro на АЦ инсулина и релаксина, а также их совместного действия с ГН. Следовательно, одной из причин нарушения проведения инсулинового и релаксинового сигналов через АЦСМ является возрастание каталитической активности АЦ и ослабление функций G s-белка и его сопряжения с АЦ. Наряду с этими изменениями, при диабете 2 типа в миометрии практически исчезает регуляция инсулином активности Г6ФДГ, что может быть связано с развитием ИР этой ткани. Таким образом, картина функциональных нарушений в АЦСМ действия инсулина и релаксина при диабете 2 типа в миометрии человека и скелетных мышцах крыс (СТЦ модель) обладает рядом сходных черт с диабетом 1 типа, выявленных нами в этих объектах. 3 этап. Разработка и апробация предлагаемых диагностических тестов для диабета. В рамках совместных исследований авторов проекта и клинической больницы РАН (С.-Петербург) была продолжена разработка новых молекулярных тестов для диагностики диабета, основанных на: 1) функциональных изменениях инсулинкомпетентной АЦ сигнальной системы (открытой ранее авторами) и 2) изменениях активности Г6ФДГ и ее реактивности к инсулину в эритроцитах и плазме крови больных диабетом. Показана возможность использования предложенных тестов как при диабете 1, так и 2 типов и их информативность в плане диагностики заболевания. Планируется (2006 г.) продолжить исследования: 1) функциональных нарушений в гормональных сигнальных системах при диабете 1-го и 2-го типов на экспериментальных моделях (крысы и моллюски) и у человека; 2) молекулярных механизмов инсулиновой резистентности тканей при этих типах диабета на клеточных культурах как модельных системах. 49 РОЛЬ АДГЕЗИОННЫХ G БЕЛОК-СОПРЯЖЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ А.Г. Петренко1), И.Е. Деев1), Н.В. Попова1), О.В. Серова1), К.А.Кондукторов1), М.А. Лагарькова2), В.К. Боженко3) Институт биоорганической химии РАН, Москва Институт молекулярной биологии РАМН, Москва 3) ГУ РНЦРР Минздрава России 1) 2) Механизмы появления и развития злокачественных опухолей связаны с нарушением нормальной экспрессии белков-онкогенов. Это может быть вызвано как изменением их уровня вследствие нарушений регуляции экспрессии, так и изменением их функциональных свойств вследствие мутаций. Среди известных онкогенов особое место занимают рецепторные тирозин-киназы и тирозин-фосфатазы, такие как, например, рецепторы факторов роста клеток. Отличительной структурной чертой данных белков является наличие двух функциональных доменов: внеклеточной части со структурными модулями, характерными для белков клеточной адгезии и внутриклеточной каталитической части, осуществляющей стимуляцию передачи внутриклеточных сигналов. Нами был открыт мозгоспецифичный рецептор CIRL и два его близких структурных гомолога, принадлежащие суперсемейству G белок-сопряженных рецепторов. Данные рецепторы имеют необычно большие N-концевые внеклеточные части со структурными модулями, характерными для белков клеточной адгезии и, следовательно, представляют собой природные гибриды сигнальных рецепторов и молекул клеточной адгезии. Таким образом, физиологическая роль данных рецепторов заключается в активации внутриклеточных сигнальных каскадов с участием G белков в результате прямых межклеточных контактов. Было показано, что CIRL-1 и CIRL-3 экспрессируются преимущественно в нервной ткани, в то время как CIRL-2 встречается практически во всех тканях. Нами было установлено, что CIRL, кодируемый одним геном, состоит из двух различающихся нековалентно связанных субъединиц – р120 и р85, что необычно для G белок-сопряженных рецепторов. Двухсубъединичная структура CIRL является следствием эндогенного внутриклеточного протеолиза. Мы также показали, что, вследствие вторичного протеолиза, у части рецепторов отщепляется внеклеточная растворимая форма, состоящая в основном из р120. Для подробного структурно-функционального анализа трех рецепторов семейства CIRL нами были получены эпитоп-специфичные антитела против каждой из двух субъединиц всех трех рецепторов. Поскольку рецепторы CIRL присутствуют в тканях в низких концентрациях (порядка 50-100 фмоль/мг мембранного белка), требовалось получить антитела с высоким 50 титром и специфичностью. Использование куриц для получения антител к «сложным» антигенам является общепринятым современным подходом. Для получения антител внеклеточные N-концевые и внутриклеточные Сконцевые фрагменты рецепторов были экспрессированы в бактериях и очищены хроматографией. Курицы были иммунизированы по стандартной схеме, и антитела выделяли из куриных яиц. Специфичность полученных антител анализировалась Вестерн-блотами гомогенатов тканей, клеточных линий с экзогенно экспрессированными рецепторами, а также окрашиванием срезов тканей. Таким образом были получены антитела, способные специфично окрашивать субъединицы рецепторов как на Вестерн-блотах мембран мозга, так и на срезах мозга. В качестве контроля были использованы ткани из нокаутных мышей. Мы проанализировали распределение данных рецепторов в тканях и внутри клеток. Нами были получены плазмиды, кодирующие каждый из трех рецепторов с присоединенными цветными флуоресцентными белками различных цветов. Для высокочувствительного анализа распределения рецепторов в живых клетках данные конструкции экспрессировали в эукариотических клетках и исследовали флуоресцентной микроскопией. Параллельно проводилось окрашивание экспрессированных клеток антителами против р120, что дополнительно позволило выявить распределение растворимых форм рецепторов. Интересно, что окрашивание антителами срезов мозга крысы позволило выявить существенные различия в распределении двух субъединиц. В частности, сильное окрашивание антителами против р120 выявило субпопуляцию нейронов в области коры мозга. Поскольку данные нейроны не выделялись при окрашивании анти-р85 антителами, мы предполагаем, что они содержат белок, являющийся рецептором растворимой формы субъединицы р120. Также нами был изучен эффект от экспрессии рецепторов, соединенных с флуоресцентным белком на морфологию трансфецированных клеток. Было обнаружено образование множественных отростков из трансфецированных клеток. Нами были выявлены клетки, не экспрессирующие рецепторы, но в то же время аккумулирующие субъединицу р120 в значительных количествах. Данные клетки имели принципиально отличную морфологию, выражающуюся в наличие сферической сети отростков окружающих клетки. Полученные нами антитела были также использованы для анализа распределения рецепторов в трансформированных клеточных линиях и опухолевых тканях. Предварительные результаты данных исследований свидетельствуют о том, что экспрессия рецепторов в них отличается от нормальных тканей. Полученные данные позволяют рассчитывать, что анализ распределения рецепторов CIRL и, в частности, их растворимых 51 форм, сможет стать одним из индикаторов развития злокачественных опухолей. МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПАСПОРТИЗАЦИЯ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ И ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ФАРМАКОТЕРАПИИ КОЖНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ПРИМЕРЕ ПСОРИАЗА И ВИТИЛИГО Л.А. Радкевич1, Ан.Л. Пирузян1, С.А. Брускин1,2, И.М. Корсунская1, О.В. Жукова2, Ю.В. Шнейдер2, И.В. Голденкова 1,2, Т.В. Наседкина3, Ж.Кожекбаева 3 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН 2 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва 3 Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Москва Актуальной задачей современной медицины является изучение факторов индивидуальной предрасположенности человека к различным заболеваниям. Отмечено, что в различных популяциях частота заболеваемости той или иной патологией различна, и это отличие связано не только с различными экологическими или социальными условиями, но также обусловлено генетическими различиями, приводящими к вариабельности в метаболических параметрах. В 1990 году академиком Л.А.Пирузяном выдвинута и опубликована концепция фармакологической метрологии, согласно которой постулируется, что генетические особенности организма определяют кинетику метаболических превращений лекарственных препаратов. Значительная гетерогенность наблюдается не только в реакции пациентов на лекарственные препараты, а также в отношении побочных эффектов лекарственных препаратов, в связи с чем требуется разработка научных основ для определения критериев соответствующей лекарственной терапии для каждого отдельного пациента, с учетом этнических особенностей. В ходе проведенного исследования разработаны новые подходы к оценке метаболического и генетического статуса больных псориазом. Для метаболической и генетической паспортизации человека, и в дальнейшем для разработки индивидуальной фармакотерапии, нами была разработана Индивидуальная информационная карта (ИИК), включающая более 50 критериев. Разработанная нами Индивидуальная информационная карта позволяет: – выявить изменения в метаболизме при псориазе, которые характерны для мультифакториальных заболеваний в целом, а также для различных групп больных и отдельных пациентов; 1 52 – выяснить закономерности между клинической картиной, метаболическим статусом и генетическими детерминантами пациентов с псориазом; – выявить закономерности между используемой фармакотерапией и метаболическим и генетическим статусом пациентов с псориазом; – легко формализовать данные о различных вовлеченных системах и процессах, и представлять их в виде, доступном для моделирования; – строить и уточнять модели без их существенных перестроек и проводить верификацию моделей. На основании теоретических разработок, подтвержденных экспериментальными данными, показана возможность предложенной ИИК для создания унифицированной базы данных о пациентах с мультифакториальной патологией на примере псориаза, а также для выявления общих, групповых и индивидуальных особенностей исследуемой патологии. Показано, что ИИК с унифицированными критериями является корректным инструментом для эпидемиологических исследований и генетического анализа патологии. Следует особо подчеркнуть, что использование совокупности унифицированных критериев для описания пациента с мультифакториальной патологией позволит проводить сравнительный анализ экспериментальных данных, получаемых различными исследователями, как в области изучения патогенеза и генетики патологии, так и в области индивидуального ответа пациента на применение лекарственных препаратов. Был проведен сбор информационного и клинического материалов, полученных от здоровых и пациентов из двух генетически отличающихся выборок – московской (гетерогенная) и дагестанской (изолированная). Клинический материал был использован для проведения биохимических, иммунологических и генетических исследований. На основании результатов проведенного исследования заболеваемости псориазом в Дагестане удалось показать существенные различия в проявлении псориаза между различными этносами, населяющими Дагестан, что расширило спектр проявлений данной патологии и привнесло ряд существенных дополнительных параметров при анализе псориаза. Изучение полиморфизма по группам крови у больных псориазом трех различных этнических групп Дагестана свидетельствует о необходимости поиска новых генетических маркеров с целью выявления предрасположенности индивидуумов к псориазу. На примере псориаза показано, что для исследования мультифакториальных заболеваний с целью выявления генетических корреляций и роли наследственности в этиологии и патогенезе Республика Дагестан является удобной и адекватной модельной популяцией. В основе такой модели лежат такие факторы, как наличие более 10 различных обособленных 53 этнических групп, отсутствие (или малое количество) межэтнических браков, доступность информации и легко прослеживаемые родословные. Апробированы различные подходы к лечению псориаза. На основании полученных данных показано, что при применении препарата Глутоксим время пребывания пациента в стационаре короче в среднем на 10 дней по сравнению с контрольной группой. Выявлена корреляция между клиническим эффектом и типом возникновения псориаза (ранний или поздний). Показано, что препарат Глутоксим оказывал положительный эффект только в группе пациентов с ранним типом возникновения псориаза. Интенсивные исследования в области генома человека позволили выявить в среднем около 40 000 генов. Среди них есть гены, полиморфизм в которых коррелирует с рядом патологий, а также с вариациями в отношении метаболизма целого спектра лекарственных препаратов, потенциальных канцерогенов и ксенобиотиков. К таким генам относится ген NAT2, который определяется как ген, ответственный за полиморфное распределение активности N-ацетилирования у человека. Генетические исследования показали, что индивидуумы могут быть классифицированы как быстрые и медленные ацетиляторы на основании скорости метаболизма лекарственных препаратов за счет действия Nацетилтрансферазы. Проведенный анализ клинического материала здоровых индивидуумов и пациентов с псориазом по классическому генетическому маркеру (NAT2) позволяет сделать предварительный вывод о корреляции заболевания псориазом с NAT2 фенотипом. Выявлена взаимосвязь между фенотипом (быстрый, средний, медленный) и генотипом (наличие той или иной мутации в гене NAT2) ацетилирования. Выявлены новые мутации в гене NAT2, которые строго характеризуют соответствующий фенотип ацетилирования для населения различных регионов России. На основе этих данных экспериментальный образец биочипа был модифицирован с учетом выявленных у населения России аллельных вариантов NAT2 гена. Созданный на основе полученного материала гелевый микрочип дает возможность продолжить исследования без фенотипирования по генетическому полиморфизму NAT2 пациентов с целью установления корреляции предрасположения к заболеванию псориазом с генотипом. Таким образом, предложенная нами стратегия исследования, связанная со сбором и анализом информационного и клинического материалов, а также с выявлением взаимосвязи между фенотипом и генотипом ацетилирования, как одного из основных показателей предрасположенности индивидуумов к заболеваниям и ответу на лекарственные препараты, является основой для дальнейшей разработки 54 метаболической и генетической паспортизации человека с целью ранней диагностики и индивидуальной фармакотерапии. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ ЭТИОПАТОГЕНЕЗА КОЛЛАГЕНОПАТИЙ. РАЗВИТИЕ НОВОГО ПОДХОДА К ДИАГНОСТИКЕ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ ПРИ ВРОЖДЕННЫХ ДЕФЕКТАХ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ В.Г. Туманян1), Е.С. Котовская2), Д.Р. Моноселидзе3), М.Л. Сименовский4), 4) П.А. Вавилов , С.Г. Раденска-Лопвук, И.В. Филатов1), Л.Е. Рагулина1), Ю.В. Мильчевский1), Н.Г. Есипова1) ИМБ РАН ФГУ ГБЦМ по г. Москве 3) Институт физики АН Грузии 4) ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава 1) 2) Этиопатогенез социально-значимых заболеваний (приводящих к инвалидизации в детском возрасте), таких как синдромы Марфана и Элерса-Данлоса (Данло), коренится в патологии соединительной ткани (к типу плотной оформленной соединительной ткани относят как дермальный слой кожи, так и клапаны сердца и кровеносные сосуды). Ненормальность развития соединительной ткани, в свою очередь, обусловлена мутациями в генах коллагенов, вызывающими связанные с заменами аминокислот дефекты в молекулах коллагена. Патологическая вовлеченность сердечно-сосудистой системы является одним из основных сопутствующих клинических проявлений этих врожденных заболеваний. Был осуществлен прижизненный интраоперационный забор биоматериала (аорта, клапаны сердца) у больных с фенотипическими признаками нарушений структуры соединительной ткани и при клинических диагнозах «аневризма аорты» и «дисгистеогенез» (10 случаев). Были определены термодиминамические параметры денатурации (ΔHD, ΔCD, ΔTD и TD) коллагена непосредственно в составе сердечной мышцы в температурном интервале 25–100 оС. Показано, что процесс денатурации исследуемых тканей охватывает температурный интервал 55–90 оС и характеризуется одним асимметричным и интенсивным пиком теплопоглощения: для нормы около 66 оС, а в случае патологии 63–64,5 о С. Деконволюция кривой зависимости ΔHD=f(TD) дает три стадии перехода. Обнаружено, что величина энтальпии денатурации зависит от термостабильности коллагена и равна в случае нормы (TD=66 оС) 6,1 кал/грамм, а в случае патологии (TD=63,5 оС) 3,0 кал/грам. Установлено, 55 что денатурационный скачок теплоемкости также зависит от тяжести болезни (более термостабильный коллаген в тканях имеет более высокий инкремент денатурации). Показано также, что количество суммарной воды в патологических тканях выше, чем в здоровой ткани. Однако это различие, способное объяснить понижение TD коллагена не может объяснить двукратное падение ΔHD для патологии относительно нормы. Кроме того, использованы гистохимические и иммуногистохимические методы исследования биоптатов; выявлено, что критерии предлагаемой сравнительной шкалы оценки процессов (воспаление, наличие кровоизлияний и признаков атеросклеротического поражения) позволяют дифференцировать больных с наиболее выроженными особенностями строения соединительной ткани, что способствует более глубокому пониманию клинического состояния больных и прогноза течения основного заболевания. Из контингента наблюдаемых детей-инвалидов с синдромами ЭлерсаДанлоса и Марфана (69 человек) были отобраны семьи, особо отягощенные по существенным критериям (синкопальные состояния и т.д.); также анализировали семьи, имеющие близнецов – четыре семьи. Были продолжены поиски прогностических маркеров, отражающих особенности строения соединительной ткани, прежде всего ее основной структуры – коллагена. С помощью сервера DFIRE рассчитаны ΔΔG, соответствующие заменам аминокислот в основных типах коллагенов человека. Оказалось, что ассоциированные с серьезной патологией замены (замены глицина на другую аминокислоту, а именно G-A, G-D, G-R G-V) дают отрицательный знак приращения свободной энергии ΔΔG, тогда как нейтральным (неглициновым, таким как P-L, P-T) заменам соответствует положительный знак. Таким образом, в противоположность тому, что типично для глобулярных белков, для соответствующих заболеванию замен характерна стабилизация молекулы, а для не приводящих к патологии замен – дестабилизация. Повышение температуры денатурации тройной спирали ведет к увеличенной гидратации макромолекулы, что в свою очередь должно иметь следствием уменьшение стабильности ткани ввиду уменьшения количества непосредственных межмолекулярных контактов. Соответствующие рентгенографические исследования проводятся. ПСИХОНЕЙРОЭНДОКРИНОТЕРАПИЯ ПОСТСТРЕССОРНЫХ ДЕПРЕССИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ) В.Г.Шаляпина Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН, Санкт-Петербург 56 Из популяции крыс Вистар отбирали особей с активной и пассивной стратегией приспособительного поведения по расчетным индексам поведенческой пассивности и психомоторной реактивности в статистиковероятностной модели. Двукратным водно-иммерсионным воздействием в парадигме стресс-рестресс у них моделировали посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР), которое оценивали по некогнитивному и когнитивному дефицитам в Т-образном лабиринте. Установлено, что в неизбегаемой аверсивной среде только пассивные особи формируют ПТСР по типу астенической депрессии с признаками двигательного и исследовательского дефицита, усиления тревожности, снижения эмоциональности, изменения профиля латерализации, а также агедонии и снижения выработки пищевых условных рефлексов (О.Г.Семенова, М.Г.Семенова). Важным диагностическим маркером ПТСР у пассивных крыс является снижение гормональной функции гипофизарноадренокортикальной системы (ГАС) с повышением ее чувствительности к дексаметазону (дексаметазоновый тест) и снижением реактивности к кортиколиберину (СRН-тест). Аверсивное воздействие на фоне адреналэктомии усиливало развитие психопатологии, а заместительное введение кортикостерона предотвращало ее (В.В.Ракицкая, М.Г.Семенова). В биохимическом исследовании показано, что дефицит кортикостероидов у пассивных животных приводит к резкому усилению в гипоталамусе, гиппокампе, стриатуме и коре головного мозга перекисного окисления белков, а возрастание окислительной модификации белков с одновременным снижением супероксиддисмутазы в крови может служить еще одним диагностическим критерием формирования у пассивных особей устойчивого патологического состояния (А.В.Вьюшина). У активных особей постстрессорная психопатология после неизбегаемых воздействий протекает по типу тревожно-депрессивного синдрома без нарушения функции ГАС и выраженных метаболических изменений. Первичным патогенетическим фактором ее развития является дизрегуляция стресс-активационных, кортиколиберинергических механизмов как гипоталамического, так и экстрагипоталамического уровней. Кортиколиберин (СRН) у них вызывает тревогу и депрессию, а предварительное введение астрессина (антагонист СRН) предотвращает их. Объективные доказательства сделанным заключениям получены в исследованиях на переживающих срезах коры головного мозга крыс с использованием методики микростимуляции и регистрации фокальных потенциалов (А.А.Мокрушин). Судя по амплитуде и длительности АМПА и НПДА компонентов, у активных животных преобладают 57 возбудительные процессы, а в ходе развития постстрессорной психопатологии происходит их снижение. При тетанизации «афферентного входа» к корковым нейронам у активных крыс развивается долговременная посттетаническая потенциация и реже – долговременная депрессия. У пассивных особей в срезах доминирует тормозной ГАМК-зависимый ТПСПМ компонент, который резко возрастает после воздействия. Тетанизация срезов у этих животных, как правило, приводит к долговременной депрессии, что свидетельствует о патологических изменениях электрической активности нейронов коры. Введение в среду инкубации кортикостерона предотвращает ее, что не только подтверждает его «терапевтический» эффект, но и является основанием для поиска новых стероидных антидепрессантов (нейростероидов) как позитивных модуляторов ГАМКрецепторов. 2. РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ И СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ 2.1. Общие вопросы диагностики ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ К БЕЛКАМ - МАРКЕРАМ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ, ИМЕЮЩИМ ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ В КЛИНИЧЕСКОЙ ОНКОГЕМАТОЛОГИИ А.А. Богданов1), Н.М. Владимировна1), Т.И. Булычева2), Л.Г.Романова1), О.В. Зацепина1) 58 1) Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва 2) Гематологический научный центр РАМН, Москва Общеизвестно, что выявление пула пролиферирующих клеток при злокачественных заболеваниях системы крови и других онкологических заболеваниях является важнейшим показателем при оценке прогностического течения заболевания и выборе адекватного курса лечения. В мировой практике для этих целей обычно используют антитела к двум ядерным белкам – PCNA (proliferating cell nuclear antigen) и Ki-67, которые являются функциональными компонентами ДНК полимераз и появляются в клетках (ядрах и ядрышках) на стадии репликации ДНК (Gerdes et al., 1983; Leelle, 1990; Larsen et al., Endl, Gerdes, 2000; Ben-Izhak et al., 2002; Mao et al., 2002 и другие). Однако отечественные антитела к Ki-67 и PCNA до сих пор отсутствуют, а их аналоги приобретаются у зарубежных (западных) производителей, несмотря на высокую стоимость. Это обстоятельство значительно затрудняет широкое применение антител к данным белкам в медицинских учреждениях страны. С другой стороны, из клинической онкогематологии хорошо известно, что отсутствие PCNA(Ki-67)-положительных клеток не всегда исключает возможности благоприятного течения заболевания. Есть основания полагать, что одна из причин этого – отсутствие подходов для выявления клеток, активированных к пролиферации, но находящихся на стадиях предсинтетического периода репликации ДНК и потому «не узнаваемых» антителами к Ki-67 и PCNA. В связи с этим идентификация новых (более ранних) маркеров активации клеток к пролиферации и получение качественных антител к ним также имеет огромное значение для прогнозирования течения онкозаболеваний и выбора адекватной схемы лечения. Основной целью нашего проекта являлась разработка технологий, направленных на получение отечественных антител для выявления пролиферирующих и активированных к пролиферации опухолевых клеток человека. Для получения антител к известному маркеру пролиферации клеток белку PCNA, исходя из баз данных о его аминокислотной последовательности у человека, нами были подобраны и синтезированы несколько пар специфических праймеров. кДНК гена амплифицирована с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и по стандарной методике клонирована в вектор, позволяющий получать Tag-белок. Полученные плазмиды использованы для трансформации компетентных бактерий и отобраны клоны, в которых ПЦР-реакция выявила присутствие несущего вектора и праймеров, комплементарных гену белка PCNA. Рекомбинантный PCNA выделен с помощью аффинной хроматографии, после чего его аминокислотная последовательность дополнительно 59 проверена методом масс-спектрометрии. Всего было синтезировано и выделено около 3 мг белка PCNA, чистота которого составляла более 90 %. Иммунизация первой партии животных и получение гибридом были произведены по схеме, использованной нами ранее (Булычева и др., 2000). В результате получены моноклональные антитела, которые на иммуноблотах проявляли ответ в области, характерной для белка PCNA (~ 32–34 кДа), но не обладали достаточной иммунореактивностью на клеточном уровне. Для получения антител с большей аффинностью последующие иммунизации производили по схемам, разработанным в ходе выполнения проекта. К настоящему времени сильный иммунный ответ выявлен у всех иммунизированных животных, а соответствие антигенов белку PCNA находится в состоянии проверки методами иммуноблотирования и непрямой иммунофлуоресценции. В качестве сверхраннего маркера пролиферативной активации опухолевых клеток человека нами выбран фактор сборки рибосом, множественный фосфопротеин ядрышка B23/нуклеофозмин, который начинал экспрессироваться в пролиферирующих лимфоцитах человека до появления в них позднего маркера пролиферации клеток Ki-67 (Dergunova et al., 2003). Для иммунизации животных разработан простой протокол экстракции нативного белка В23 из ядер клеток HeLa растворами низкой ионной силы, что давало возможность получать обе изоформы белка (В23.1 и В23.2) в количествах, достаточных для иммунизации. Скрининг полученных моноклональных антител на иммуноблотах позволил отобрать гибридный клон, продуцирующий антитела к белку с подвижностью, совпадающей с подвижностью белка В23.1 (~ 38 кДа). В настоящее время производится обогащение антител с целью идентификации антигена прямым структурным анализом белка. НОВЫЙ НЕИНВАЗИВНЫЙ МЕТОД НЕПРЕРЫВНОЙ (ОТ УДАРА К УДАРУ) ОЦЕНКИ СОКРАТИМОСТИ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА СЕРДЦА ЧЕЛОВЕКА: ПЕРВАЯ ФАЗА ИСПЫТАНИЙ В.М. Хаютин1), О.Л. Виноградова2), Е.Ю. Берсенев2), В.В. Ермишкин1), Е.В. Лукошкова1) Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росздрава РФ, Москва 2) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва 1) Сократимость левого желудочка (ЛЖ) сердца – важнейшее свойство, определяющее его насосную функцию. Резкое ухудшение сократимости миокарда – одна из причин «сердечной» смерти. Создание неинвазивного, 60 безопасного, непрерывно действующего (при каждом кардиоцикле) и недорогого метода оценки сократительной функции ЛЖ, который мог бы применяться в разных физиологических условиях (физические упражнения и т.д.) и в клинике (прикроватный монитор, суточное мониторирование и др.), является важной, но нерешенной проблемой физиологии человека и медицины. При возбуждении симпатической нервной системы (СНС) сократимость левого желудочка повышается. Это отражается в уменьшении длительности периода предызгнания (Д-ПП) – показателя инотропного состояния ЛЖ. Длительность этого периода измеряют как интервал времени между некоторой устойчиво определяемой точкой на переднем фронте QRS комплекса ЭКГ и моментом открытия аортального клапана. В «Руководстве по методам импедансной кардиографии» (Sherwood et al., 1990) этот момент времени рекомендуют определять по точке на кривой дифференцированной импедансной кардиограммы, которая находится между малой волной В и основной волной С (именно последняя, волна С, отражает изгнание крови из ЛЖ). Однако надежно определять момент открытия аортального клапана по этой точке, притом в каждом кардиоцикле, не представляется возможным, так как волна В, а потому и точка В, крайне непостоянны. Исходя из представления Рашмера о ЛЖ как источнике “импульса силы”, за окончание периода предызгнания мы приняли физически строго определенный момент времени, соответствующий максимальному ускорению нарастания сигнала пульсовой волны импедансной аортограммы. Предварительное испытание нового метода показало, что при воздействиях, возбуждающих СНС, Д-ПП, измеряемая в последовательных кардиоциклах, уменьшается. Это позволило приступить к первой фазе развернутых испытаний метода, цель которых – детальное изучение динамики изменений нового показателя сократимости ЛЖ в сопоставлении с динамикой изменений артериального давления (АД: непрерывная неинвазивная регистрация по методу Пеняза) при функциональных пробах. Изометрическое сокращение мышц предплечья (30 % максимального произвольного усилия, 2 мин). Во время пробы происходит прогрессирующее повышение АД, особенно интенсивное во второй половине пробы. При этом у одних испытуемых Д-ПП постепенно уменьшалась, у других – не изменялась. Первый вариант соответствует ожидавшемуся повышению сократимости ЛЖ при возбуждении СНС. Второй вариант определяется тем, что повышение диастолического АД во время пробы задерживает открытие аортального клапана и тем самым препятствует проявлению укорочения Д-ПП в ответ на возбуждение СНС. Укорочение Д-ПП, тем не менее, неизменно обнаруживалось по окончании пробы, причем наибольшее укорочение (среднее значение в 61 положении лежа – 27 %) достигалось за 10–20 с. Затем Д-ПП медленно возвращалась к исходной величине. Восстановление АД происходило существенно быстрее. Проба Вальсальвы (40 мм рт. ст., 20 с). Во время пробы приток крови к сердцу уменьшается. Это приводит к уменьшению объема ЛЖ, а соответственно, и к укорочению длины его мышечных волокон. Поэтому скорость их сокращения уменьшается, а Д-ПП увеличивается. За несколько секунд до конца пробы Д-ПП начинала уменьшаться, несмотря на продолжающееся ограничение венозного притока. Сразу после пробы, когда приток крови к сердцу возрастает, Д-ПП становилась значительно меньше исходной (в среднем на 33.2 % в положении лежа). Следовательно, во время пробы сократимость ЛЖ повышалась. Действительно, из литературы известно, что во время пробы и в течение некоторого короткого времени после нее возбуждение СНС усилено. Еще через несколько секунд достигался максимум повышения АД, при котором оно оказывалось выше исходного. Последующее восстановление Д-ПП и АД происходило примерно с одинаковой скоростью. Ортостатическая проба. При наклоне тела на 60о (головой вверх) изменения Д-ПП при кистевом жиме и пробе Вальсальвы сохраняли тот же характер, но проявлялись сильнее (максимальное уменьшение Д-ПП на 29 и 49% соответственно). Заключение. Впервые детально, т.е. для каждого последовательного кардиоцикла, сопоставлена динамика влияний рефлекторного возбуждения СНС на инотропное состояние ЛЖ и величину АД. При этом установлено полное соответствие ожидавшихся и реально происходивших изменений сократимости ЛЖ. Выявлен момент оптимальной для всех испытуемых оценки (относительной, в % к исходному значению) повышения сократимости ЛЖ – достижение минимума Д-ПП по окончании функциональных проб. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИЧИН АПОПТОТИЧЕСКОЙ ГИБЕЛИ ГЕПАТОЦИТОВ В ДИНАМИКЕ РАЗВИТИЯ ХОЛЕСТАТИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ И ПРИ ВОССТАНОВЛЕНИИ ЖЕЛЧЕТОКА Л.Б. Дудник1), А.Н. Цюпко1), М.А. Шупик1), А.В. Алесенко1), В.В. Яснецов2), Л.Д. Смирнов1), В.С. Шашков2) 1) Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва Одной из наиболее распространенных причин поражения печени является нарушение оттока желчи, обусловленное механическим 62 препятствием желчетоку при желчнокаменной болезни или опухолях гепатопанкреодуоденальной области (холестаз). Ведущая роль в гибели гепатоцитов при холестазе отводится процессам апоптоза, однако причины его развития при данной патологии исследованы недостаточно. Пути, по которым проходит сигнал апоптоза, наряду с другими возможностями, включает активацию сфингомиелинового цикла, генерацию активных форм кислорода, приводящую к усилению процессов пероксидного окисления липидов (ПОЛ), и повышение уровня провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли – альфа (ФНО-). В настоящей работе исследовано изменение активности ключевого фермента сфингомиелинового цикла сфингомиелиназы (СФМазы), экспрессии ФНО- поражения печени при холестазе, вызванном перевязкой общего желчного протока у крыс. Обнаружены однотипные фазовые сдвиги изученных показателей: выраженное снижение на ранних сроках холестаза (3–6 сут) и резкое повышение – на поздних сроках (12–16 сут после начала эксперимента) в условиях развившейся патологии. Выявленные изменения могут отражать баланс между действием двух основных компонентов желчи – билирубина, накапливающегося на ранних стадиях холестаза и имеющего антиоксидантные, противовоспалительные и антиапоптотические свойства, и обладающих противоположными качествами желчных кислот, влияние которых доминирует на поздних стадиях патологического процесса. Известно, что хирургические вмешательства у больных с механической желтухой сопровождаются большим числом осложнений, тяжелейшим из которых является развитие печеночной недостаточности, способной приводить к летальному исходу. В связи с этим определение сроков и видов проводимых оперативных вмешательств, а также выработка методов прогнозирования осложнений послеоперационного периода и их профилактики являются чрезвычайно актуальными. Нами было установлено, что при 6–9-дневной продолжительности застоя желчи в печени подопытных животных восстановление желчетока приводит к нормализации активности СФМазы, содержания ФНО-α и уровня продуктов ПОЛ. При более длительном, 12-дневном холестазе, удаление фактора, препятствующего току желчи, не приводило к нормализации исследуемых показателей: активность СФМазы, содержание ФНО-α и продуктов ПОЛ сохранялись на уровне, значительно превышающем контрольные показатели. Таким образом, при моделировании холестатического повреждении печени и восстановлении желчетока обнаружены однонаправленные и одновременные изменения всех изученных показателей. Выявлена статистически значимая положительная корреляция между экспрессией ФНО-α активностью СФМазы и интенсивностью ПОЛ, что подтверждает 63 известную из литературных данных взаимосвязь между процессами ПОЛ и цитотоксическим действием ФНО-α, а также активацией ФНО-α сфингомиелинового цикла. Полученные данные показывают, что апоптотическая гибель гепатоцитов, возникающая при холестатическом повреждении печени и хирургическом лечении холестаза на поздних сроках развития патологии может быть обусловлена активацией сфингомиелинового цикла, интенсификацией процессов ПОЛ и усиленной экспрессией ФНО-α. Любой из этих факторов способен самостоятельно индуцировать гибель гепатоцитов, а их синергетическое взаимодействие может резко усиливать проапоптотический потенциал каждого из них и приводить к повреждению печени. Так, активация СФМазы приводит к усиленной генерации вторичного посредника сигнала апоптоза – церамида, обладающего прооксидантным действием, продукты ПОЛ сами являются индукторами апоптоза и способны активировать СФМазу и увеличивать экспрессию ФНО-α, а повышение уровня ФНО-α может приводить к активации СФМазы и индукции окислительного стресса. Изучение триады: сфингомиелиновый цикл, ФНО-α, ПОЛ – является, на наш взгляд, чрезвычайно перспективным и может способствовать более полному пониманию механизма индукции апоптоза в клетках печени, что позволит обозначить новые подходы к предупреждению и лечению заболеваний этого органа. ОСОБЕННОСТИ СОДЕРЖАНИЯ ФАКТОРА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ HLDF И АУТОАНТИТЕЛ К НЕМУ У ПАЦИЕНТОВ С ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИЕЙ В.М.Липкин1), М.А.Грудень2), И.А.Kостанян1), Н.К. Яковлева2), Е.И. Елистратова2), А.Н.Шалавин3), В.В.Юрасов2), И.С.Денищук3), Е.А.Широков3), С.М.Драницына1), М.В.Гапон1), В.В.Шерстнев2) 1) Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва 2) ГУ Институт нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН, Москва 3) Второй ЦВКГ им. П.В.Мандрыка, Москва В настоящее время наблюдается постоянное увеличение удельного веса хронических форм нарушений мозгового кровообращения и, в первую очередь, дисциркуляторной энцефалопатии (ДЭ) в общей структуре цереброваскулярных заболеваний. ДЭ – это синдром диффузного или/и многоочагового поражения головного мозга в результате хронической недостаточности мозгового кровотока или/и повторных эпизодов острых нарушений мозгового кровообращения. 64 Причем у больных с изначальными проявлениями недостаточности мозгового кровообращения более чем в 33 % случаев развивается ДЭ. Согласно современным представлениям о патогенезе цереброваскулярной патологии ключевую роль в нарушении микроциркуляции в нервной ткани, сопровождаемом недостаточностью трофического обеспечения и развитием аутоиммунных реакций, играют белки, обладающие трофической, ростовой и апоптотической активностью. Особый интерес обращен на факторы, являющиеся регуляторами как процессов роста, выживаемости, так и апоптотической гибели эндотелиальных, нервных и глиальных клеток. К числу указанных факторов относится белок HLDF (human leukemia differentiation factor), который, как было показано нами ранее, вовлечен в механизмы патогенеза острых нарушений мозгового кровообращения. Целью настоящего исследования являлось сравнительное определение содержание белка HLDF, а также аутоантител к нему в сыворотке крови больных с ДЭ гипертонического генеза, пациентов с артериальной гипертензией без выраженных признаков энцефалопатии и группы контроля сопоставимого возраста. Оценивали патогенетическое значение изучаемых молекулярных факторов. Проведено комплексное клинико-инструментальное обследование 3-х групп пациентов. Первая – пациенты с гипертонической болезнью (n=18), уровень кровяного давления которых был стабильно повышен – АД 180/90 (средний возраст 63,02,0 года). Вторая – пациенты с I, II, III стадиями ДЭ (n=50, 64,26,7 года), третья группа представляла «возрастную норму» людей (n=26) сопоставимого возраста без указанных выше заболеваний и хронической патологии внутренних органов. У всех больных проведено изучение клинической картины заболевания с привлечением данных анамнеза, неврологического и соматического статусов. Локализацию и характер очаговых изменений в мозге, диагностированных клинически, подтверждали данными РКТ и/или МРТ головного мозга. Состояние магистральных артерий головы и интракраниальных артерий оценивали по данным ультразвуковой допплерографии либо по результатам дуплексного сканирования. Всем больным проводили обследование сердечно-сосудистой системы, включающей ЭКГ, ЭХО-КГ, мониторирование ЭКГ и АД, а также общеклинические анализы крови и мочи. Определяли биохимические критерии функциональной активности печени и почек, исследовали гемореологические показатели. Определение количественного содержания HLDF и уровня АТ к ним проводили, используя специально разработанные оригинальные тест-системы с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ЕLISA), у пациентов всех групп на 1 сут обследования. В сыворотке крови пациентов группы «возрастная норма» концентрации HLDF составила 52,0±5,2 нмоль/л, титры АТ к HLDF составляли: 1:4800±675. Пациенты первой группы характеризуются резко 65 сниженным содержанием HLDF – 0,70±0,03 нмоль/л (р<0,01) при также пониженном уровне АТ первого порядка (1:1244±198) по сравнению с «возрастной нормой». Больные с ДЭ гипертонического генеза также демонстрировали сниженное по сравнению с группой «возрастной нормы» содержание HLDF в сыворотке крови 0,80±0,01 нмоль/л, причем его содержание практически не зависело от стадии формирования. Выявлены определенные закономерности между содержанием HLDF и АТ к нему с данными клинического обследования. Так, у пациентов с ДЭ выявлены отрицательные корреляции между общей их мобильностью (r=0.6; р<0.005) и нарушениями движений в конечностях (r=-0.5; р<0.002) и концентрацией HLDF. У больных с ДЭ обнаружены также отрицательные корреляции между содержанием HLDF и величиной систолического АД (r=-0.4; р<0.04), а также с систолическим АД при взятии крови (r=-0.34; р<0.05) и с вариабельностью систолического АД (r=-0.56; р<0.001). Выявлены особенности в содержании HLDF и АТ к нему в крови у мужчин и женщин при ДЭ. Полученные данные свидетельствуют, что белок HLDF и антитела к нему вовлечены в механизмы развития различных стадий ДЭ и указывают на «гипертонический генез» выявленных при ДЭ изменений исследованных молекулярных показателей. Шерстнев В.В., Грудень М.А., Костанян И.А., Елистратова Е.А., Шалавин А.Н., Юрасов В.В., Яковлева Н.Е., Мурашев А.Н., Широков В.М., Липкин В.М. Участие фактора дифференцировки HLDF в регуляции функций сердечно-сосудистой и нервной систем. 2005. Материалы I съезда физиологов СНГ. Т.1, с. 13. Шерстнев В.В., Грудень В.М., Елистратова Е.И., Скворцова В.И., Юрасов В.В., Яковлева Н.К., Костанян И.А., Шалавин А.Н., Липкин В.М., Денищук И.С., Широков Е.А. Исследование участия молекулярных факторов развития и гибели клеток в механизмах патогенеза дисциркуляционной энцефалопатии. Тезисы докладов XIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Украина, Крым. 31 мая– 9 июня 2005 года.– С. 290. СОСТОЯНИЕ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ СОСУДИСТОГО РУСЛА У ЗДОРОВЫХ И БОЛЬНЫХ ЛИЦ 1) 2) 2) В.М.Михайлов , Ю.И.Гурфинкель , М.И.Кудуткина , Б.Б.Ушаков 1) ГНЦ РФ – Институт медико–биологических проблем РАН 66 1) 2) Центральная клиническая больница МПС Появление качественно новой телевизионной и вычислительной техники, а также средств программирования сделало возможным обработку больших массивов видеоинформации и получение количественных характеристик такого динамично меняющегося процесса, как капиллярный кровоток. Предварительные пилотные исследования показали, что микроциркуляторное русло здоровых людей и пациентов с сердечно-сосудистой патологией по-разному реагирует на отрицательное давление, создаваемое в нижней части тела. Цель работы. Изучение особенностей микроциркуляции крови в сосудистом русле человека с использованием компьютерного капилляроскопа (КК) в покое и при воздействии отрицательного давления, прикладываемого к нижней половине тела (ОДНТ) у здоровых лиц и пациентов с артериальной гипертензией (АГ) и ишемической болезнью сердца (ИБС). Материалы и методы. Использовался лабораторный комплекс, созданный нами при тесном взаимодействии с НИИ Прецизионного приборостроения. Основу его составляет компьютерный капилляроскоп, позволяющий исследовать капилляры ногтевого ложа, получать численные характеристики диаметра капилляров, скорости капиллярного кровотока, размера периваскулярной зоны (ПЗ), количества эритроцитарных агрегатов, длительности стаза. Неинвазивность исследования предоставляет хорошую возможность для многократных наблюдений. Особенности микроциркуляции при проведении пробы ОДНТ в изделии ПВК «Чибис» исследовали у 7 здоровых добровольцев, 18 пациентов с АГ на фоне ИБС и у 5 пациентов с ИБС, имеющих нормальные значения артериального давления. До проведения пробы с воздействием ОДНТ всем участникам эксперимента были проведены исследования ЭКГ в 12 стандартных отведениях в покое, эхокардиографические обследования с определением фракции выброса, компьютерная капилляроскопия в покое и другие инструментальные и лабораторные исследования, позволившие допустить их к проведению функционально-нагрузочных проб, в том числе и ОДНТ. Программа исследований была одобрена комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ – ИМБП РАН. При проведении пробы с воздействием ОДНТ регистрировали показатели ЭКГ в 12 отведениях, частоту сердечных сокращений (ЧСС), систолическое (АДс) и диастолическое артериальное давление крови (АДд). Рассчитывали пульсовое артериальное давление (АДп) и коэффициент Kv по формуле: Kv = Vа / Vв, где Vа – скорость кровотока в 67 артериальном отделе капилляра, а Vв – в венозном. Перед проведением пробы обследуемые воздерживались от курения и приема содержащих кофеин напитков. Результаты исследований и обсуждение Исследование в покое. Первая группа. ПЗ для здоровых добровольцев составила 88,9±11,01 мкм. Диаметры артериального, переходного и венозного отделов капилляров составили для этой группы 5,3±1,80; 9,6±2,87 и 7,1±1,57 мкм соответственно. Фракция выброса составила 63,9±3,80 %. Для второй группы (пациенты с АГ на фоне ИБС) ПЗ составила 97,8±12,77 мкм. Диаметры артериального, переходного и венозного отделов капилляров составили для этой группы 7,6± 2,27 мкм; 14,5±3,13 мкм и 10,8±2,55 мкм соответственно. Фракция выброса составила 60±6,5 %. Для третьей группы (пациенты с ИБС) ПЗ составила 98,6±13,52 мкм. Диаметры артериального, переходного и венозного отделов капилляров составили для этой группы 7,1±4,04 мкм; 13,5±3,81 мкм и 9,7±3,23 мкм соответственно. Фракция выброса составила 51,6±3,2 %. Сравнительный анализ полученных данных показывает, что периваскулярная зона капилляра у больных имеет отчетливую тенденцию к увеличению, по сравнению с группой здоровых на 8,9 мкм (P<0,05) и на 9,7 мкм для 2 и 3 групп соответственно. Диаметр артериального, переходного и венозного отделов капилляров у больных был больше: на 2,35 мкм (р <0,05), 1,81 мкм; 4,83 мкм (P<0,05) и на 3,86 (P<0,05), 3,67 мкм (р <0,05) и на 2,56 мкм (P<0,05) для 2 и 3 групп соответственно. Скорость капиллярного кровотока в покое составила 515,9±280,08 мкм/с; 473,3±212,62 мкм/с; и 350,9±171,47 мкм/с для лиц 1, 2 и 3 групп соответственно. По показателю фракции выброса имелись различия между 1 и 3, а также между 2 и 3 группами. Фракция выброса у больных была отчетливо снижена по сравнению с группой здоровых на 3,9 % (P<0,05) и на 12,3 % (P<0,05) для 2 и 3 групп соответственно. Больные с ИБС без АГ имеют фракцию выброса на 8,4 % (P<0,05) меньше, чем больные, имеющие сочетание ИБС и АГ. Полученные результаты исследований продемонстрировали наличие существенных различий в капилляроскопической картине у здоровых и больных. В первую очередь следует отметить увеличение диаметра капилляра и периваскулярной зоны в группах больных, что, по-видимому, обусловлено наличием тканевого отека. Проба с воздействием ОДНТ. Использование компьютерной капилляроскопии в ходе пробы ОДНТ позволило получить новую информацию о влиянии ортостаза на микроциркуляторное сосудистое русло и впервые раздельно оценить скорость кровотока в артериальном, переходном и венозном отделах капилляров. Полученные результаты исследований 68 показывают, что микроциркуляторное русло здоровых добровольцев и пациентов с ИБС, а также пациентов с АГ на фоне ИБС по-разному реагируют на отрицательное давление, создаваемое в нижней части тела. Воздействие ОДНТ выявило различную динамику средних значений скорости капиллярного кровотока и коэффициента Кv во всех группах. Максимальные значения скорости капиллярного кровотока и минимальные величины коэффициента Кv отмечены в группе пациентов с ИБС и АГ, где скорость в венозном отделе капилляра превалировала над скоростью в артериальном отделе капилляра (Кv был меньше 1), тогда как у здоровых добровольцев Кv не опускался ниже 1,09. Полученные данные показали, что исследование микроциркуляции здоровых, а также пациентов с АГ и ИБС может быть использовано для дополнительной оценки функционального состояния сердечнососудистой системы человека и его ортостатической устойчивости, в частности, применительно к практике клинической и космической медицины. ЭЛЕКТРОКАРДИОГРАФИЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ И ДИСПЕРСИОННОЕ КАРТИРОВАНИЕ ЭКГ. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ Р.М. Баевский1), Г.Г. Иванов2), А.З. Кабулова1) , И.А. Кудашева1) 1) ГНЦ РФ – Институт медико–биологических проблем РАН 2) ММА им. И.М. Сеченова, Москва В последние десятилетия в кардиологии все в большей мере развиваются технологии, которые базируются на непрерывном анализе электрокардиографических сигналов от цикла к циклу (“beat-to-beat”), что позволяет судить о динамических процессах управления сердечной деятельностью. В 70-90-е годы мы были свидетелями бурного развития анализа вариабельности сердечного ритма (ВСР) – метода, который открыл новые горизонты в изучении вегетативной регуляции кровообращения, процессов экстракардиального управления. Начиная с 80-х годов начались активные исследования в области изучения низкоамплитудных составляющих ЭКГ-сигнала, не выявляемых с помощью стандартной электрокардиографии. Речь идет об анализе низкоамплитудных (10–30 мкВ) высокочастотных составляющих в конце Р-зубца и комплекса QRS (поздние потенциалы) и низкоамплитудных колебаний (дисперсий) от цикла к циклу на протяжении P-QRS-T. Эти колебания тесно связаны с электрофизиологическими свойствами миокарда, что открывает возможность выявления патологических изменений задолго до того, как появляются симптомы заболевания или клинически значимые изменения на электрокардиограмме. 69 В настоящем сообщении представлены результаты клиникофизиологических испытаний двух методов исследования низкоамплитудных колебаний электрического потенциала сердца. Первый из них – давно апробированный в клинике для прогнозирования опасных нарушений сердечного ритма – электрокардиография высокого разрешения (ЭКГ ВР). Этот метод основан на регистрации и измерении низкоамплитудных (5–20 мкВ) высокочастотных (свыше 20–50 Гц) электрических сигналов, которые локализуются в конце комплекса QRS или начале сегмента ST, а также в конце зубца Р. Однако ЭКГ ВР мало применялась при исследовании практически здоровых людей и лиц опасных профессий, где нарушения ритма могут быть результатом реакции миокарда на стресс. Второй метод – дисперсионное картирование ЭКГ (ДК ЭКГ) – разработан в России только несколько лет назад. Он позволяет выявлять самые начальные энерго-метаболические и коронарные изменения в миокарде, недоступные традиционной электрокардиографической оценке. Оба эти метода взяла на вооружение космическая медицина, разрабатывающая новые технологии прогнозирования функционального состояния человека, длительное время находящегося в стрессорных условиях. Прежде всего, важно было выяснить диапазон нормальных значений показателей ЭКГ ВР и ДК ЭКГ у здоровых людей в условиях повседневной деятельности, связанной с профессиональным стрессом. Для этого была выбрана группа спасателей МЧС, которая исследовалась в начале и конце суточного дежурства. Группа состояла из 23 мужчин (средний возраст 355 лет). Никто из обследуемых не предъявлял жалоб, в анамнезе отсутствовали указания на перенесенные сердечно-сосудистые заболевания. На основании анализа результатов исследования были разработаны критерии нормы, которые использовались для оценки данных при обследовании пациентов с острым инфарктом миокарда (ОИМ) различной локализации. Следует отметить, что метод ЭКГ ВР оказался чувствительным при проведении ортостатической нагрузочной пробы как у здоровых лиц, так и у больных, что отражало возможность использования отдельных показателей (амплитуда и длительность) при анализе гемодинамических изменений, а также при оценке тяжести течения ОИМ. Исследования пациентов с ОИМ методом ДК ЭКГ позволили выявить существенные изменения дисперсионных характеристик миокарда. В таблице представлены значения показателя «Миокард», который отражает суммарную площадь всех дисперсионных отклонений от нормы, выраженную в %. Таблица. Значения показателя «Миокард» в обследованных группах 70 Обследованные группы Здоровые (n=47) ОИМ задней стенки (n=23) ОИМ (20-25с) задней стенки(n=23) ОИМ передней стенки (n=25) ОИМ (20-25с) передней cтенки (n=25) «Миокард», % 12,9+0,6 22,3+2,2* 21,7+3,3* 28,2+3.2* 23,7+2,7* Примечание: *достоверность различий с группой здоровых (P<0,05). Как следует из представленных данных, показатель «Миокард» у пациентов с ОИМ достоверно выше, чем у здоровых людей. При ОИМ передней стенки он был выше, чем при ОИМ задней стенки. На 20–25-е сутки заболевания наблюдалась тенденция к некоторому уменьшению этого показателя. На данном этапе развития метода ДК ЭКГ еще трудно дать окончательную интерпретацию наблюдаемым отклонениям. Известно, что даже в здоровом сердце в результате периодических процессов де- и реполяризации миокарда при каждом сокращении имеются незначительные вариации электрического потенциала, величина которых проявляется в виде низкоамплитудных колебаний (дисперсии) ЭКГ-сигнала. При различных патологических процессах изменяются амплитуды таких колебаний, и дисперсионные характеристики ЭКГ могут отражать изменения процессов метаболизма мембран и клеточных структур. В целом можно заключить, что метод ДК ЭКГ при разработке и уточнении его диагностических возможностей может быть полезен в клинической практике и в плане наблюдения за динамикой развития инфаркта миокарда, контроля проводимой лекарственной терапии. В настоящее время наиболее оптимально, с нашей точки зрения, использование метода ДК ЭКГ для решения скрининговых задач при массовых профилактических осмотрах, диспансерном обследовании и периодических освидетельствованиях лиц, работающих в стрессорных условиях. Что касается метода ЭКГ ВР, то его применение в профилактической медицине также целесообразно проводить (особенно в динамике) по показаниям у лиц, профессиональная деятельность которых связана с длительными стрессорными воздействиями. НОВЫЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД К РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ И МОНИТОРИНГУ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С.А. Недоспасов, С.В. Хлгатян, П.В. Белоусов, Е.П. Королева, Ю.В. Шебзухов, Т.С. Кадачигова, А.А. Мещеряков, О.В. Гурова, М.Р. Личиницер, Д.В. Купраш Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН 71 Институт физико-химической биологии им. Белозерского, МГУ Городская клиническая больница № 24 Росздрава РФ Онкологический научный центр им. Блохина РАМН В 2005 году усилия были сконцентрированы на анализе репертуара серологически детектируемых антигенов в сыворотках больных раком легкого и раком кишечника. Проведен иммуноскрининг экспрессионной рекомбинантной библиотеки в векторе на основе бактериофага пулом сывороток крови пациентов с раком легкого. На основании проведенного скрининга были идентифицированы, очищены и охарактеризованы различными методами 4 новых серопозитивных клона, кодирующих белки ELAVL1 (Hu antigen R), ELAVL2 (Hu antigen B), регулятор клеточного деления KIAA1387, и ДНКсвязывающий белок SON. Отсутствие или низкая серореактивность в группе здоровых доноров по данным серологического анализа в дот-блот формате позволяет рассматривать клоны KIAA1387 и SON как новые кандидатные антигены, ассоциированные с раком легкого. Была также изучена специфичность антиядерных нейрональных антител в сыворотке крови HuB/HuR-позитивного пациента с мелкоклеточным раком легкого. На основании экспериментов по HuR/HuB кросс-блокировке в иммуноблоттинге впервые была показана независимость гуморального ответа на HuR от HuB – специфичного ответа, что позволяет рассматривать клон Tes-501 (HuR) как кандидатный раковоассоциированный антиген в широком спектре онконозологий. Был проведен систематический сбор обширной коллекции сывороток больных раком толстой кишки с целью ответа на вопрос, на какой стадии заболевания появляется гуморальный иммунный ответ у раковых больных на некоторые антигены. Мы изучали распределение иммунного ответа на ранее идентифицированные антигены MO-REN-46/ALS2CR3, MO-Tes25/RAP80, HDAC3, а также р53 в качестве контроля у пациентов с разными стадиями рака толстой кишки. На основании анализа 495 сывороток пациентов с предраковыми состояниями, первичными и метастазирующими опухолями частота встречаемости антител на MO-REN-46 оказалась практически одинакова на стадии предрака и на последующих стадиях, в то время как частота встречаемости антител на MO-Tes-25 и HDAC3 росла с прогрессией заболевания. 72 ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРОКСИРЕДОКСИНОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПОРАЖЕННЫХ ТКАНЕЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ В.И.Новоселов1), В.А.Янин1), С.Е.Амелина1), С.К.Соодаева2), Н.И.Косякова3 Институт биофизики клетки РАН, Пущино Институт пульмонологии МЗ РФ, Москва 3) Пущинский медицинский центр, Пущино 1) 2) Ранее нами было показано, что основным антиоксидантом в трахее и бронхах млекопитающих является пероксиредоксин VI. С целью дальнейшего исследования роли пероксиредоксина в защитных системах респираторных эпителиальных тканях нами была разработана экспериментальная модель ожоговой травмы верхних дыхательных путей. В этой модели ожог проводился с помощью микропарогенератора, разработанного в нашем институте, пар от которого через микроканюлю вводился непосредственно в трахею крысы. Степень ожога контролировалась гистологическими методами и путем подбора времени экспозиции можно было получать любую степень ожога. Кроме того, данная модель позволяет получение ожога разной степени на одной трахее. В результате проведенных исследований нами было показано, что при тепловом ожоге средней степени уровень экспрессии белков теплового шока (БТШ-70) повышался через час после ожога и возвращался на исходный уровень через 3 ч, уровень экспрессии цитокинов (IL2, IL6, TNFα и др.) резко повышался через 8 ч после ожога и оставался высоким в течение трех сут. Одновременно происходила существенная активация бокаловидных клеток эпителия трахеи, которые интенсивно секретировали пероксиредоксин VI в слизь трахеи. В последующем происходило истощение бокаловидных клеток, что приводило к резкому уменьшению пероксиредоксина в слизи эпителия трахеи. При тяжелом тепловом ожоге верхних дыхательных путей происходила массовая гибель как реснитчатых, так и бокаловидных клеток, что также приводило к резкому уменьшению уровня пероксиредоксина VI в эпителии трахеи. Отсутствие основного антиоксиданта в эпителии трахеи приводило к полному разрушению эпителиальной ткани. Таким образом, в случае массовой гибели клеток в эпителиальной ткани необходимо введение экзогенного пероксиредоксина. Пероксиредоксины проявляют свои антиоксидантные свойства только при активации определенными тиолами. Тем не менее, как было показано нами ранее, при применении пероксиредоксинов без активаторов при лечении воспалительных процессов в органах, где 73 пероксиредоксин присутствовал изначально в больших количествах, было эффективно (в частности, при лечении воспалительных процессов органов дыхания). Это, по-видимому, объясняется тем, что в таких органах оставался довольно высокий уровень активаторов пероксиредоксина. В случае использования пероксиредоксина при лечении других органов необходимо использование активированного пероксиредоксина. Широко используемый in vitro активатор пероксиредоксина – дитиотреитол (ДТТ) – оказался сильно токсичным для животных, поэтому не может быть использован в качестве активатора пероксиредоксина в лекарственных препаратах. Из большого количества протестированных тиолов наиболее перспективным оказалась дигидролипоевая кислота. Ее активирующая способность была примерно одинаковая с ДТТ и она была нетоксична для организма. Полученная нами лекарственная композиция перксиредоксин VI-дегидролипоевая кислота была протестирована при лечении резаных ран и была в несколько раз эффективней лекарственной композиции, содержащей только пероксиредоксин VI. РАЗРАБОТКА ТЕСТА НА МНОЖЕСТВЕННУЮ ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СИНТЕЗА И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА YB-1 (Р50) В КЛЕТКАХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ Л.П. Овчинников1), А.В. Сорокин1), О.В.Скабкина1), А.В. Вайман2), Д.Н. Лябин1), Е.Ю. Рыбалкина2), Т.П. Стромская2), А.А. Селютина1), С.Г. Гурьянов1), А.А. Ставровская2) 2) 1) Институт белка РАН, Пущино НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва Белок YB-1 (р50) является членом мультифункционального семейства ДНК/РНК-связывающих белков с эволюционно консервативным доменом холодового шока. YB-1 адаптирует клетки к росту при пониженных температурах, увеличивает их устойчивость к ксенобиотикам и ионизирующей радиации, предотвращает раковую трансформацию клеток по некоторым сигнальным путям и, наоборот, может приводить к раку, создавая хромосомную нестабильность. YB-1 проявляет свойства шаперона нуклеиновых кислот и принимает участие практически во всех ДНК- и мРНК-зависимых процессах, включая репликацию, репарацию и рекомбинацию ДНК, транскрипцию и сплайсинг мРНК, глобальную регуляцию трансляции и времени жизни мРНК. Функционируя в качестве фактора транскрипции, YB-1 регулирует экспрессию генов, содержащих Y-бокс, в том числе гена главного 74 комплекса гистосовместимости II, гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 и генов циклинов. Повышенная концентрация YB-1 в клетках может служить признаком их ракового перерождения, а локализация YB-1 в ядрах опухолевых клеток рассматривается в качестве раннего маркера множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) при ряде злокачественных новообразований. Ранее нами были получены данные, свидетельствующие в пользу того, что (1) YB-1 регулирует МЛУ, определяемую одновременно несколькими белками, т.е. многофакторную МЛУ; (2) число клеток с локализацией YB-1 в ядре в популяциях различных резистентных к химиопрепаратам клеточных линий повышено, однако, оно может значительно различаться в разных линиях; (3) изменения количества YB-1 в клетках не являются обязательным признаком сформированной лекарственной устойчивости клеточных популяций и не коррелируют с уровнем лекарственной устойчивости резистентных клеток. Эти данные позволили нам сформулировать основные принципы выработки теста на МЛУ: во-первых, тест должен быть комплексным, т.е. должен включать как исследование внутриклеточной локализации YB-1, так и определение количества мРНК YB-1 в клетках; во-вторых, положительный результат теста следует рассматривать как показатель существования многофакторной МЛУ в данной опухоли. В текущем году мы получили экспериментальное подтверждение данного положения и провели ряд исследований материалов, взятых от больных с несколькими формами злокачественных новообразований молочной железы, мочевого пузыря и острым нелимфобластным лейкозом. Результаты этих тестов показали, что (1) образцы новообразований одного типа, взятые от разных пациентов, значительно различаются по количеству мРНК YB-1; (2) изменение количества мРНК YB-1 может быть показателем рецидивирования опухолей мочевого пузыря (эти данные нуждаются в расширении); (3) в опухолях разного типа наблюдается многофакторная МЛУ; (4) изменения количества мРНК YB-1 коррелируют с изменениями количества мРНК MRP1 в двух типах исследованных новообразований, а также в экспериментальном материале; (5) получены антитела, хорошо выявляющие характер внутриклеточной локализации YB-1 на срезах опухолей. В рамках данного проекта мы изучили молекулярные механизмы, регулирующие синтез YB-1 в клетке на уровне трансляции и его ядерноцитоплазматическое распределение. Мы показали, что синтез YB-1 находится под контролем двух мажорных белков мРНП: самого YB-1 и поли(А)-связывающего белка РАВР, и зависит от концентрации и соотношения этих белков. РАВР активирует трансляцию мРНК YB-1, даже если она не содержит поли(А) хвоста, а YB-1 избирательно ингибирует свой синтез при низких 75 соотношениях YB-1/мРНК. Мы локализовали специфические участки связывания РАВР и YB-1 на мРНК YB-1 в 3’ концевой нетранслируемой области и показали, что эти участки перекрываются. YB-1 вытесняет РABP со своей мРНК и ингибирует свой синтез на одном из ранних этапов его инициации, в то время как РАВР восстанавливает синтез YB-1, вытесняя YB-1 из комплекса. Распределение YB-1 между ядром и цитоплазмой зависит от сигналов ядерной локализации и цитоплазматического удержания, которые находятся в С-концевой части молекулы белка. Мы выделили специфическую протеазу, отщепляющую от YB-1 сигнал цитоплазматического удержания. Методами иммунохимического, ингибиторного и масс-спектрального анализов протеаза была идентифицирована как 20S протеасома. Этот фермент расщепляет в молекуле YB-1 пептидную связь между Glu219 и Gly220 независимо от убиквитинилирования YB-1 и присутствия ATP. Отщепление С-концевого фрагмента от YB-1 под действием протеасомы in vivo происходит в условиях генотоксического стресса и ведет к накоплению укороченного белка в клеточном ядре. РАЗРАБОТКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОВЕРКА НОВЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЗГА, ОСНОВАННЫХ НА АНАЛИЗЕ ДИНАМИКИ СПЕКТРОВ ЭЛЕКТРОЭНЦЕФАЛОГРАММ Ю.В.Обухов1), Д.Ю.Боснякова1), Г.Д.Кузнецова2), А.А.Морозов1) Институт радиотехники и электроники РАН Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН 1) 2) Целью проекта является разработка новых методов спектральной обработки и анализа нестационарных электроэнцефалограмм, направленных на создание новых технологий диагностики и лечения заболеваний мозга различной этиологии. В результате выполнения проекта в 2005 г. был создан и экспериментально апробирован программно-алгоритмический комплекс вейвлет обработки и анализа динамических электроэнцефалограмм для диагностики абсенс эпилепсии и аутизма. Этот комплекс обеспечивает анализ динамики вейвлет спектров ЭЭГ сигналов в отдельных отведениях, а также анализ связности и синхронности сигналов в различных отведениях методами логического программирования и нелинейной динамики. В 2005 г. продолжались нейрофизиологические исследования абсенс эпилепсии на генетической линии крыс WAG/Rij, проводимые совместно с нейрофизиологами и фармакологами Ун-та Radboud (г. Наймеген, Нидерланды) и Ун-та г. Куопио (Финляндия). Частото-временная структура разрядов пик-волна является существенной характеристикой абсенс 76 эпилепсии. Она дает новую информацию о механизме пароксизмальной активности данного типа. Анализ изменений частотно-временной структуры разрядов, происходящих под воздействием различных фармакологических препаратов может быть полезен для оценки эффективности лекарственной терапии. Однако частотные характеристики разрядов при абсенс эпилепсии почти не изучались. Для анализа частотно-временной структуры разрядов в рамках проекта разработано специальное модифицированное вейвлет преобразование Морле и комплекс-программ, которые позволяют строить для разрядов графики зависимости основной частоты от времени. Учитывая положительные результаты, полученные на животных, в 2005 г. мы приступили к анализу ЭЭГ пациентов с диагнозом абсенс эпилепсия. Записи были любезно предоставлены проф. В.В.Гнездицким (Институт неврологии РАМН). У 6 (из 22) пациентов были обнаружены разряды пик волна, частотно-временная динамика которых полностью соответствовала описанной выше, отличаясь только более низкой основной частотой (3.5–3.0 Гц) и более длительной периодичностью. В настоящее время ведется дополнительный анализ этих случаев типичной абсенс эпилепсии (локализация, последовательность включения различных областей коры, влияние используемой медикаментозной терапии на структуру разрядов и др.). Кроме этого проводится анализ частотно временной структуры разрядов у остальных 16 пациентов (атипичная абсенс эпилепсия, ювенильная эпилепсия, смешанные формы эпилепсии). На основании проделанной работы может быть сделано заключение, что с помощью модифицированного вейвлет преобразования Морле можно проводить классификацию различных типов эпилептической активности. Результаты работы будут переданы в Институт неврологии РАМН, где данные пациенты проходят лечение (для использования полученных данных при возможной коррекции проводимой медикаментозной терапии). Разработан новый логико-вероятностный метод описания и поиска закономерностей в сложных пространственно-временных сигналах ЭЭГ, основанный на логике первого порядка и медианном анализе. Идея разработанного метода состоит в том, чтобы объединить дедуктивные возможности логического программирования (языка Пролог) и непараметрические статистические методы (а именно, методы медианного анализа). Для поиска и проверки свойств, формализованных средствами логики первого порядка, традиционно используются методы и средства логического программирования, однако в данном случае использование стандартных методов невозможно вследствие того, что атомарные предикаты , , , , и др. должны иметь статистический смысл, а именно: должны обозначать статистически значимые отличия выборок экспериментальных данных, относящихся к соответствующим пространственно-временным областям. 77 Разработанный логико-вероятностный метод описания и поиска закономерностей в пространственно-временных данных ЭЭГ эксперимента объединяет дедуктивные возможности логического программирования с возможностями (непараметрических) статистических методов. В настоящее время разработанный логико-вероятностный метод реализован на базе объектно-ориентированного логического языка Акторный Пролог и используется для анализа экспериментальных нейрофизиологических данных, полученных в рамках совместного проекта ИРЭ РАН и Психологического института РАО. КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ДОБРОКАЧЕСТВЕННЫХ И ПРЕДОПУХОЛЕВЫХ ПРОЦЕССОВ, ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В КОМПЬЮТЕРНОМ АНАЛИЗАТОРЕ «МОРФОЛОГ-СЕТЬ» Г.М. Попова, Ю.О. Дружинин, В.Н. Степанов, И.Ф. Дятчина 1), А.М. Берщанская, Н.В. Мельникова2) 1) Институт проблем управления им. В.А. Трапезникова РАН, Москва 2) ФГУ «РНЦРР Росздрава», Москва Актуальность проблем исследований доброкачественных, предопухолевых процессов и злокачественных новообразований предстательной железы (ПЖ): доброкачественной гиперплазии (ДЖГ), простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН), рака предстательной железы (РПЖ) – определяется высокой частотой этих заболеваний у мужчин и настоятельной потребностью прогнозирования их развития. Большинство диагностических программ заболеваний ПЖ включают анализ крови на простатический специфический антиген (ПСА). Однако, будучи органоспецифичным, ПСА не является однозначным маркером РПЖ, что приводит к большому риску ложноположительных заключений при использовании ПСА в качестве теста для выявления рака [1]. При повышенном уровне сывороточного ПСА проводится биопсия ПЖ, которая позволяет в большинстве случаев верифицировать характер процесса. Морфологическая дифференциальная диагностика препарата биоптата ПЖ, выполняемая врачом-морфологом, более надежна, но нередко носит субъективный характер. В данной работе сделана попытка автоматизировать процесс биопсийной диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований, а также предопухолевых процессов ПЖ с использованием светового микроскопа и компьютерного анализатора «Морфолог-Сеть» [2]. 78 В ходе выполнения проекта в 2004–2005 гг. при поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» были решены следующие задачи: – создана математическая модель описания основных типов эпителиальных структур в биоптатах предстательной железы. Выделены следующие типы микрообъектов: одиночные эпителиальные клетки (ЭК); группы эпителиальных клеток (ГЭК); солидные комплексы (СК); криброзные структуры (КС); малые однорядные округлые железистые структуры, ядра которых лежат строго по контуру (МОЖС); средних размеров однорядные округлые ЖС (СОЖС); крупные однорядные округлые ЖС (КОЖС); двух-, частично трехрядные и/или ажурные с псевдососочками ЖС (ДРиПС); многорядные (трех- и более рядности) и/или с сосочками ЖС (МРиС). В особый вид отнесены неопределенные ЖС (НЖС), в том числе: малых и средних размеров, структуры неопределенной рядности (имеющие 1–3 ядра второго ряда, либо ядра, лежащие частично не по контуру структуры и попадающие во второй ряд) и однорядные ЖС, морфометрические параметры которых не позволяют классифицировать их как МОЖС или СОЖС. Модель позволила установить значимые признаки и их комбинации для распознавания и классификации железистых структур: – разработаны методы и программные средства обработки, морфометрического анализа и классификации изображений микрообъектов в стеклопрепаратах, окрашенных иммуногистохимическим методом (моноклональные антитела к ПСА, хромоген диаминобензидин); – разработана методика морфометрической количественной диагностики состояния ткани ПЖ на основе анализа изображений клеточных и тканевых структур; – разработана нейронная сеть для распознавания основных типов эпителиальных структур, построенная на основе параметризованных признаков, выявленных при создании математической модели с учетом рядности ядер ЖС. Для принятия компьютерного заключения о состоянии ПЖ реализована программная надстройка принятия решения. Количественная диагностика процессов в биоптатах ПЖ (согласно разработанной методике) выполняется автоматически на основе морфометрического анализа, распознавания и дифференцированного счета всех перечисленных типов микрообъектов, присутствующих в анализируемом препарате, с учетом степени информативности фрагментов изображений, количественных оценок частоты их встречаемости и позволяет получить следующие варианты заключений: ДЖГ, ПИН, РПЖ, а также заключение о неопределенном характере процесса. Заключение о неинформативном материале дается при отсутствии эпителиальных структур. 79 В случае РПЖ в системе производится автоматическое определение индекса (степени) злокачественности по методу Глисона путем количественного анализа вариантов эпителиальных структур рака. В случае заключения о неопределенном характере процесса для уточняющей диагностики требуется проведение дополнительного иммуногистохимического исследования биоптата ПЖ с антителами к высокомолекулярным цитокератинам. Высокомолекулярные цитокератины позволяют выявить слой базальных клеток в железистых структурах ПИН и ДЖГ, отсутствующий в высокодифференцированном раке (РВД). Проведенные исследования показали, что для достоверности компьютерного заключения о состоянии ПЖ, к анализу с помощью высокомолекулярного цитокератина следует прибегать в следующих случаях: – если в препарате среди структур, типичных для ПИН и ДЖГ, имеются малые округлые железистые структуры, характеризующие РВД, хотя их и менее 5 % от общего количества распознанных микрообъектов; – если в препарате среди структур, типичных для ПИН и ДЖГ, имеются неопределенные ЖС (НЖС), причем в любом количестве. Следует заметить, что если компьютерная система выдает заключение «РПЖ», то независимо от количества НЖС проводить реакцию на высокомолекулярные цитокератины не требуется. На наш взгляд, использование компьютерных анализаторов изображений микрообъектов позволяет врачам-морфологам получить большой объем принципиально новой количественной диагностической информации о состоянии биоптата ПЖ за счет морфометрического анализа и дифференцированного счета всех эпителиальных железистых структур, присутствующих в анализируемом препарате. На основании компьютерного заключения о состоянии биоптата ПЖ оценки степени злокачественности РПЖ по Глисону, представленного компьютерным анализатором «Морфолог-сеть», врач сможет достоверно и надежно принять окончательное диагностическое решение. При этом возможно сохранение картин изображений эпителиальных структур, на основании которых устанавливается диагноз. Решение поставленной задачи имеет большое научное и прикладное значение, так как полученные результаты найдут широкое применение в онкологической практике (клинико-диагностических, патологоанатомических лабораториях и отделениях) для уменьшения человеческого фактора при постановке диагноза. Они также будут полезны и необходимы в качестве обучающих программ при подготовке врачей-морфологов. ЛИТЕРАТУРА 80 1. Любимова Н.В., Кушлинский Н.Е., Стогова Э.В. и др. Клиническое значение общего и свободного простатического специфического антигена при раке предстательной железы // Клин. лаб. диагностика. 1998, № 2. С. 7–9. 2. Попова Г.М., Степанов В.Н., Дружинин Ю.О., Берщанская А.М., Мельникова Н.В. Формализация процедуры морфометрической диагностики доброкачественных и злокачественных новообразований простаты в системе «Морфолог-Сеть» //Фундаментальные науки – медицине. Матер. конф. М., 2004. - М.: Фирма «Слово», 2004. С. 128–131. НОВЫЕ КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ИХ ЛЕЧЕНИЯ А. Н. Саприн, В. А. Суханов, Л. А. Пирузян Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва Ранее для оценки индивидуальной предрасположенности организмов к развитию онкологических и других заболеваний нами был разработан и предложен для использования «Условный критерий метаболического статуса организма» (УКМСО), основанный на соотношении активностей ключевых ферментов метаболизма и детоксикации ксенобиотиков (ФМДК), включающих семейства цитохромов Р-450, эпоксидгидролаз (ЭГ), глутатион-S-трансфераз (ГSТ) и др. Показано, что значения УКМСО определяются полиморфизмом и специфическим соотношением активностей ФМДК. Необходимость близких значений УКМСО у донора и реципиента была также убедительно показана при пересадке кожи. Однако этот метод неудобен в практическом плане, поскольку требует забора проб органов и тканей. Разработанный нами двойной прижизненный генетико-фенотипический метод комплексной оценки полиморфизма системы ФМДК, основанный на хроматографическом анализе метаболитов ксенобиотиков в биологических жидкостях с одновременным анализом методом RT-PCR полиморфизма генов ФМДК, определяющих их активность, позволяет наиболее точно прогнозировать развитие онкологических заболеваний. В модельных экспериментах на инбредных мышах линий C57BL/6 и DBA/2, отличающихся по фенотипическим и генотипическим признакам, было показано, что в зависимости от полиморфизма ФМДК, у этих линий мышей наблюдается разная чувствительность к развитию опухолей под действием проканцерогенов. При этом исследование комутагенного действия химических соединений представляет интерес с практической точки зрения, поскольку организм человека подвергается воздействию 81 преимущественно комбинации веществ. Известно, что мутагенный эффект полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) зависит от их метаболической активации в микросомах печени. Индукция или ингибирование отдельных ферментов, участвующих в метаболизме ПАУ, может усиливать или ослаблять их мутагенные и канцерогенные свойства. В сравнительном эксперименте с использованием микросом печени в тесте Эймса нами установлено, что ингибирование активности микросомальной ЭГ (мЭГ) неконкурентным ингибитором – 2,2-дибромо1-(4-нитрофенил)-этанолом (Ин) приводит к увеличению мутагенного эффекта бенз(а)антрацена (БА) в 150–200 раз. В экспериментах на животных in vivo нами были получены данные, подтверждающие связь между генетически детерминированным метаболическим статусом линейных мышей и их устойчивостью к токсическому действию проканцерогенов. Выявлена более высокая чувствительность к ПАУ линии мышей C57ВL/6 по сравнению с линией DBA/2, что подтверждается данными по острой токсичности БА в дозах 50 и 30 мг/кг со 100 % летальным исходом для мышей C57ВL/6, тогда как для линии DBA/2 гибели животных не наблюдалось. Совершенно противоположный эффект был получен при использовании Ин. Все мыши линии DBA/2 погибали к 7 мес. при дозах 5 и 1 мг/кг, в то время как количество переживших мышей линии C57ВL/6 составило 70 % при дозе 5 мг/кг и 75 % при дозе 1 мг/кг. Еще более значительные различия были получены при комбинированном введении БА и Ин. Острая токсичность при дозах 1, 3, 6 и 11 мг/кг наблюдалась, в основном, для мышей линии DBA/2, которые погибали к 3 мес, тогда как количество переживших мышей линии C57ВL/6 к 14 мес составляло 75 % – при дозе 6 мг/кг, и 80 % – при дозе 3 мг/кг. Полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности мышей линии C57ВL/6 к БА по сравнению с линией DBA/2, что может быть связано с более высокой (почти в 2 раза) активностью мЭГ у мышей линии C57ВL/6, чем у линии DBA/2. Это увеличивает уровень образования из эпоксидов ПАУ дигидродиолов, которые могут вновь эпоксидироваться на цитохроме Р-450, приводя к накоплению чрезвычайно токсичных, мутагенных и канцерогенных дигидродиол-эпоксидов ПАУ, которые уже не являются субстратами ЭГ. Пониженная активность мЭГ, как в случае с мышами линии DBA/2, может быть ингибирована значительно меньшими количествами Ин, что также приводит к накоплению реакционно-опасных метаболитов. Получены данные корреляционного анализа активностей ключевых ФМДК (цит. Р-450, ЭГ, ГST) с экспрессией кодирующих их генов и чувствительностью к генотоксическому действию БА для двух линий мышей. 82 Результаты проведенной работы подтверждают существование связи между генетически детерминированными индивидуальными особенностями метаболических процессов и чувствительностью к токсическому и мутагенному действиям ПАУ. В этих процессах важную роль играют активность и полиморфизм системы ФМДК. При оценке потенциальной опасности веществ, в том числе лекарственных соединений, необходимо учитывать их возможное влияние на активность ферментов, участвующих в их метаболизме. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИДРОМЕХАНИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЗАКРУЧЕННЫХ ВИХРЕВЫХ ПОТОКОВ КРОВИ В МАГИСТРАЛЬНЫХ ОТДЕЛАХ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ И НОВЫЕ МЕТОДЫ ЕЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ 1) ,2) С.Г. Чефранов , Р.И. Асфандияров3), В.Н. Блажко1), Л.А. Бокерия4), А.Ю. Городков4), Г.И.Кикнадзе5), 6), А.Г. Чефранов7), 8), А.С. Чефранов1), 9) Институт физики атмосферы им. А.М.Обухова РАН, Москва Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 3) Астраханская государственная медицинская академия, Астрахань 4) Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН, Москва 5) Институт физических проблем им. П.Л. Капицы РАН, Москва 6) ЗАО «Басэрт», Москва 7) Таганрогский радиотехнический университет им. В.Д. Калмыкова, Таганрог 8) Восточно-Средиземноморский университет, Газимагуса, Северный Кипр 9) «Медиа-Звезда», МО РФ, Москва 1) 2) При развитии большинства болезней сердца и сосудистой системы, а также при любых хирургических вмешательствах на уровне сердца и магистральных сосудов происходят изменения в геометрии кровеносного русла, сопряженные с нарушением относительно устойчивой закрученной макроструктурной организации потока крови. Действительно, обобщение теоремы Гельмгольца-Рэлея (А.С.Чефранов, С.Г.Чефранов, 2003) о минимизации скорости диссипации кинетической энергии для закрученных однородно-винтовых потоков, может отвечать именно наблюдаемой уникальной энергетически оптимальной работе сердечно-сосудистой системы при отсутствии патологии в ее функциональном состоянии. Морфологические исследования сердца и магистральных сосудов (Р.И.Асфандияров и др. 1983, 2005; А.Ю. Городков и др. 1996, 2004) позволили выявить 83 структуры обеспечивающие вихревое закручивание потоков крови. При этом получены данные и об эволюционном аспекте формирования таких структур на различных этапах онтогенеза (С.Б.Моталин, 2002; Р.И.Асфандияров, С.Б.Моталин, 2005), когда, наоборот, выявляются тенденции в морфологических изменениях, коррелируемых со стремлением к установлению энергетически оптимальной гемодинамики закрученных потоков. Предложен метод количественного анализа трехмерного поля скорости закрученного потока крови по компьютерной реконструкции данных МР-велосиметрии и МР-томографии (Л.А.Бокерия, А.Ю.Городков, Г.И.Кикнадзе и др. 2004, 2005). При этом численная обработка данных осуществляется на основе использования точных решений уравнений гидродинамики (Г.И.Кикнадзе, Ю.Л.Краснов, 1986) и других известных гидродинамических методов (В.Н.Блажко, А.Ю.Городков, Г.И. Кикнадзе, А.Г.Чефранов, С.Г.Чефранов, 2005). Это дает основу для развития новых неинвазивных методов функциональной диагностики сердечно-сосудистой системы исходя из количественного определения степени закрученности потока крови в магистральных отделах этой системы. В частности, предложен новый метод оценки величины интегральной спиральности потока крови при использовании относительно более доступных (в сравнении с МР-велосиметрией) данных цветной допплерометрии. При этом применяются известные и новые гидродинамические оценки величин циркуляции и спиральности поля скорости в инжектируемых кольцевых вихрях и струях (P.G. Saffman, 1978; M. Gharib et al., 2005; В.Н. Блажко, А.Ю. Городков, А.Г. Чефранов, С.Г. Чефранов, 2005). Получены выводы о связи измеряемых временных вариаций поля давления с параметрами реализуемых в потоке крови закрученными когерентными вихревыми структурами (В.Н. Блажко, С.Г. Чефранов, 2005). Установлено обобщение для соответствующего спектра флуктуаций поля давления с учетом вихревой перемежаемости потока и эластических свойств стенок, ограничивающих кровеносный поток (А.Г. Чефранов, С.Г. Чефранов, 2005). СОЗДАНИЕ МЕТОДОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ИЗМЕРЕНИЕ УРОВНЯ ВНУТРЕННЕГО ШУМА ЗРИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗАТОРА, КАК МЕРЫ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА. Ю.Е. Шелепин 1), А.К. Хараузов 1), Э.В. Бойко 2), Г.Е. Труфанов 2), В.А. Фокин 2), С.В. Пронин 1), О.А. Вахрамеева 1), С.А. Коскин 2), Н.Н. Красильников 3), В.Н. Чихман 1), А.В.Севостьянов 2) 84 Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 2) Военно-медицинская академия, 3) Университет аэрокосмического приборостроения, Санкт-Петербург 1) Цель данного проекта предполагает создание методов измерения функционального состояния мозга человека на основе измерения уровня внутреннего шума зрительной системы. Развито новое направление в медицинской метрологии – измерение коэффициента эффективности работы зрительной системы как меры функционального состояния системы глаз – мозг на основе измерения статистических характеристик внутреннего шума. Для данного проекта ключевым является проведение визоконтрастометрии при отсутствии или наличии помехи с заданными статистическими характеристиками. Пространственные и временные частотные характеристики зрительной системы измерены с помощью психофизических и электрофизиологических методов (текущей ЭЭГ и вызванных потенциалов). Внутренний шум измерен как эквивалентный. Для измерения уровня и статистических характеристик внутреннего шума проведено сравнение с моделью согласованной фильтрации (оптимальным наблюдателем) в рамках теории статистических решений. Дифференциальная диагностика оказалась возможной благодаря применению различных видов стимулов и помехи, сочетания психофизических, электрофизиологических методов и метода анатомического и функционального топографа мозга на основе ядерномагнитного резонанса (МРТ и фМРТ). Созданная автоматизированная психофизиологическая установка позволяет одновременное проведение психофизических и модельных экспериментов. Создан метод сравнительных измерений человек (пациент) – компьютерная модель оптимального наблюдателя. Управление стимулами и помехой методами цифровой обработки изображений в интерактивном режиме позволяет сразу в ходе измерений проводить сравнение обработки сигнала реальным наблюдателем и моделью и измерять функциональные возможности зрительного анализатора, уровень внутреннего шума, эффективность его работы. Созданные методы чувствительны и указывают не только наличие нарушений проводящих путей, ядер и корковых областей, но и степень функциональных нарушений. Исследованы различные источники внутреннего шума. Внутренний шум измерен при нарушении работы зрительного анализатора – у пациентов с глаукомой, макулодистрофией сетчатки, системными заболеваниями головного мозга (рассеянным склерозом), сотрясением, отравлениями, сосудистыми поражениями и т.д. 85 Проведены измерения количества информации, обрабатываемой в мозге в задачах различения двумерных бинарных матриц и матриц другого типа, образованных из решеток Габора. Методом тестирования зрительной системы с помощью матриц, сделанных из множества решеток Габора, образующих случайные или упорядоченные наборы с разной пространственной частотой и ориентацией. Измерены характеристики вызванных потенциалов и текущей ЭЭГ при наблюдении этих изображений. Обнаружены различия ранних компонентов вызванных потенциалов при предъявлении упорядоченных и случайных (хаотических) матриц. Предложен новый метод стимуляции путем вращения отдельных элементов матрицы. Получены различия и в частотном спектре ЭЭГ в режиме распознавания случайных и упорядоченных матриц. Эти особенности вызванных потенциалов и ЭЭГ при наблюдении случайных и упорядоченных структур представляют особый интерес для понимания процесса обработки информации в зрительной системе человека. Установлено методами локализации источников вызванных потенциалов и фМРТ различное расположение в головном мозге человека механизмов, дающих отклик на упорядоченные и случайные матрицы. Исследован отклик фМРТ на решетки на однородном фоне и фоне помехи. Сопоставлены результаты психофизических измерений внутреннего шума с результатами других измерений, обеспечивающими оценку состояния головного мозга. Заключение. Разработаны новые, пригодные для широкого (массового) применения методы измерения уровня внутреннего шума фовеолярного и периферического зрения, у здоровых наблюдателей и у больных. Получены нормативы уровня внутреннего шума зрительного анализатора и на его основе оценки функционального состояния головного мозга. МАГНИТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ НАНОРАЗМЕРНЫЕ ГЕМОСОРБЕНТЫ (ФЕРРОКАРБОНЫ). СТРУКТУРА, СОРБЦИОННЫЕ И РЕОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Ю.Г. Яновский1), Ю.Н. Карнет1), Кузнецов А.А.2), Г.Н. Ковалев1), Е.И. Зарайский3), Н.С. Снегирева1) 1) ИПРИМ РАН, 2)ИБХФ РАН, 3)НИИ морфологии человека РАМН Согласно литературным данным существующие методы детоксикации в эфферентной медицине, в том числе гемосорбция (гемоперфузия), в ряде случаев малоэффективны (разрушаются форменные элементы крови (ФЭК), 86 требуются значительные объемы крови больного, дорогостоящее оборудование и др.). Начатые в 1990 году работы по использованию принципиально новой схемы операций гемосорбции с применением смеси двух суспензий – крови и тонко диспергированных магнитных частиц (МЧ), лишены этих недостатков. На этапе экспериментов на животных в схеме операции гемосорбции суспензия МЧ, введенная в экстракорпоральную систему, движется вместе с потоком крови и приводит к быстрому и эффективному процессу сорбции токсинов различной молекулярной массы (возможно, эффект сорбции, в определенной мере, связан с большой удельной поверхностью магнитных наночастиц). По завершении процедуры сорбции феррокарбоны удаляются с помощью магнитного сепаратора с высокоградиентным магнитным полем, и очищенная кровь возвращается в организм. Несмотря на очевидные преимущества, до настоящего времени столь перспективный метод детоксикации не получил широкого развития. Одной из причин является недостаточная информация о зависимости процесса гемосорбции от физико-химических и структурных особенностей и реологического поведения наноразмерных магнитных гемосорбентов. Прогресс в этой области может быть достигнут с привлечением новых современных методов моделирования, виртуального анализа, повышения точности методов исследования сорбции токсинов и др. Решению именно этих задач и был посвящен данный этап работы, который включил в себя разработку методов и подходов для комплексного исследования гранулометрического состава, структуры, физических характеристик и сорбционных свойств частиц феррокарбонов, а также создание алгоритмов и программ для компьютерного моделирования (метод Монте-Карло) их структуры в магнитных полях с целью анализа их сорбционных свойств в зависимости от физико-химии поверхности. Такая комплексная постановка задачи по праву может считаться важной ступенью нанотехнологического моделирования структуры и свойств этих уникальных материалов с целью оптимизации их поведения применительно к задачам гемосорбции. Авторами разработан новый иммуноферментный метод исследования сорбции токсинов в статическом режиме (на базе фотометра Stat Fax R2100, Awareness Technology, USA), чувствительность которого составляет 1 нг/мл. Анализ микрофотографий образцов магнитных гемосорбентов методами растровой электронной микроскопии, зондовой микроскопии (NanoSurf, Швейцария) и бесконтактной трехмерно отображающей оптической интерферометрии (NewView, США) свидетельствует о широкой гамме изменения геометрических параметров частиц сорбента (например, их диаметры колеблются от 30 нм до 12–15 мкм). Об этом же говорят и данные о структуре поверхности наночастиц феррокарбона. В 87 совокупности это указывает как на различие реологического поведения таких суспензий, так и на эффективность их сорбции. Исследования реологического поведения суспензий, моделирующих кровь, смешанную с частицами феррокарбона, показывают, что миграция растворов таких сложных суспензий подчиняется закономерностям движения вязких жидкостей в кровеносных сосудах и капиллярах и описывается уравнением Уошберна. Поскольку в это уравнение, описывающее неньютоновское течение, входит вязкость крови η, то необходимо сопоставлять данные по вязкости для модельных суспензий со временем, затрачиваемым ими на нормальное и тангенциальное движение в капиллярах. Для идентификации параметров данного уравнения (вязкость среды, время ее движения) необходимо было разработать методы экспериментального определения указанных величин. Для оценки временных параметров таких сред авторы предложили использовать индикатор деформируемости эритроцитов автоматизированный (ИДА-1); а для оценки вязкости – метод капиллярной вискозиметрии (вискозиметр Оствальда). Анализ полученных данных показал, что наблюдается хорошая корреляция изменения (роста) вязкости смесей от концентрации и времени их нормального движения через пористую перегородку (модель кровеносного сосуда). Эффективность сорбции in vitro в магнитном поле изучали на примере барбитурата, для чего использовали иммобилизованный на бычьем сывороточном альбумине барбитурат и кроличьи антитела против барбитуратов (иммуноглобулины кроликов, меченные пероксидазой хрена); реакция проявлялась в изменении окраски раствора токсина, окружавшего пробу ферроуглеродных частиц. Итак, разработан новый высокочувствительный иммуноферментный метод исследования процесса сорбции токсинов сорбентами, изучены возможные структурные особенности нано-, микро- и макроструктуры феррокарбонов, реологические свойства модельных гемосуспензий, эффективность сорбции in vitro в магнитном поле, предложен способ компьютерного моделирования (методом Монте-Карло) структуры и поведения гемосорбентов в магнитных полях различной напряженности. 88 2.2. Биофотоника ЛАБОРАТОРНАЯ ТОМОГРАФИЯ С СУБМИЛЛИМЕТРОВЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ В.Е.Асадчиков1), А.В.Бузмаков1), С.В.Савельев2), Р.А.Сенин1), М.В.Чукалина1) Институт кристаллографии РАН, Москва НИИ морфологии человека РАМН, Москва 1) 2) Разрешение современных медицинских томографов не превышает 0,9 мм. Для целей медицинской диагностики in vivo и гистологических исследований такое разрешение в ряде случаев не является достаточным. Целью настоящей работы является разработка теоретических и экспериментальных основ для создания лабораторных томографов с более высоким разрешением. Следует отметить, что повышение разрешения почти неизбежно связано с уменьшением поля зрения. Для современных оптических систем соотношение поля зрения и разрешения составляет примерно 1000. Таким образом, повышение разрешения до 0,1 мм может быть достигнуто при исследовании образцов с линейными размерами до 10 см. Изучение рентгеновскими методами объектов биологической природы таких размеров целесообразно проводить с использованием более мягкого, чем для медицинских томографов излучения, в диапазоне длин волн 0,5–2,5 Å, поскольку именно в этом диапазоне длин волн можно повысить контраст между различными биологическими тканями (следует отметить, что именно данный диапазон длин волн традиционно используется в рентгеноструктурных исследованиях). Для достижения разрешения порядка 0,1 мм нами был модифицирован созданный ранее в Институте кристаллографии рентгеновский дифрактометр с линейным позиционно-чувствительным детектором. Созданный на этой базе томограф обладает следующими параметрами: разрешение лучше 0,2 мм, диаметр зоны исследования – до 100 мм, чувствительность – от 5х10-4 до 20 мм-1. На данном приборе были исследованы образцы различной биологической природы. На примере восстановления пространственной структуры лиофилизированных особей сибирского углозуба Salamandrella keyserlingii показано, что примененный нами подход позволяет не только визуализировать различия в плотностях хрящевых и костных элементов скелета, но и осуществить анализ мягких тканей. В частности, удается идентифицировать неминерализированные покровы, межтканевую мезенхиму и функциональные клеточные конструкции внутри этих тканей. 89 При исследовании пространственной структуры эпифизов головного мозга человека in vitro впервые обнаружен факт уменьшения содержания солей кальция и отсутствие связности областей кальцификации при наличии таких патологий, как синдром Альцгеймера и шизофрения. В этих исследованиях достигнуто пространственное разрешение не ниже 0,2 мм. С целью повышения разрешения нами создан лабораторный рентгеновский томограф, позволяющий получать реконструкции объектов с линейными размерами до 1 см с разрешением до 10 мкм. На этом томографе исследована пространственная структура костей гекконов Pachydactylus bibroni. Выявлены все характерные особенности строения большой берцовой кости этого животного с разрешением порядка 10 мкм. Результаты рентгенотомографических и гистологических исследований не позволяют сделать заключение о декальцификации костей этих рептилий при пребывании в невесомости. РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ ТЕСТИРОВАНИЯ И ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СОСУДОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ СОВРЕМЕННЫХ МАТРИЧНЫХ ИНФРАКРАСНЫХ ТЕРМОВИЗИОННЫХ СИСТЕМ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ Г.Р.Иваницкий, А.А.Деев, Е.П.Хижняк, Л.Н.Хижняк Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино Конечная цель всей работы состоит в создании на базе современного поколения тепловизоров методических основ, алгоритмов и математического обеспечения для медицинской диагностики различных заболеваний с целью организации в больницах, медпунктах школ и вузов сети тепловизионных кабинетов для ранней диагностики заболеваний различной этиологии (сосудистые и сердечно-сосудистые заболевания, рак, нарушения эндокринной и других систем организма) [1–4]. Любая диагностическая система получает распространение при условии, что соотношение цена/качество достигает некоторого минимального уровня. Цена тепловизоров при прочих равных параметрах зависит от стоимости изготовления их матрицы и устройства ее температурной стабилизации. Охлаждаемые камеры дороже в 3–5 раз по сравнению с микроболометрическими камерами без дополнительного охлаждения. Естественно возникает вопрос – можно ли дешевые микроболометрические камеры использовать для медицинской диагностики и оснащать ими диагностические кабинеты? 90 В настоящее время нами уже организованы три кабинета ранней термографической диагностики сосудистых заболеваний на базе Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино), Медицинской академии им. И.М.Сеченова (Москва) и Центра реабилитации при МЦ УД Президента РФ (Кубинка). На данный момент изучены более 1000 пациентов с разными заболеваниями ног (варикозное расширение вен, атероматоз, до и после хирургического шунтирования сосудов или замены поврежденных сосудов на протезы). Данный этап исследований состоял также в количественной оценке точности измерения температуры в различных участках тела человека с помощью двух инфракрасных камер разных диапазонов длин волн 3–5 мкм и 8–12 мкм [5]. При исследовании в первую очередь нас интересовало влияние точности измерения температуры на диагностику различных вариантов сосудистых патологий [6]. Необходимо было определить влияние температуры окружающей среды (температуры в комнате) на измерение температуры тела человека, а также провести сравнение тепловых изображений пациентов с помощью охлаждаемых и неохлаждаемых микроболометрических камер, чтобы ответить на вопрос – пригодны ли дешевые микроболометрические инфракрасные камеры для измерения абсолютной температуры? Существенным аспектом при сравнении камер является метрология измерения температуры живых объектов с помощью инфракрасных камер, т.е. достижение требуемой точности и регламентация условий измерения. С помощью двух инфракрасных систем, работающих в диапазонах длин волн 3–5 и 8–12 мкм, было проведено такое сравнение и показано, что при введении калибровочных поправок результаты измерения не отличаются [5]. Таким образом, при создании диагностических кабинетов можно значительно экономить финансовые средства, используя дешевые микроболометрические камеры на основе двуокиси ванадия или аморфного кремния и разработанную методику их калибровки. Вместе с тем нами было обнаружено, что камеры диапазона 3–5 мкм не только точнее измеряют температуру в каждой точке (до 0.02 0 С), но одновременно и более чувствительны к рефлексам подсветки кожи от внешних источников тепловых излучений, что связано с лучшим совпадением их спектральной чувствительности со спектрами излучения электроосветительных приборов. Для камер с диапазоном 8–12 мкм влияние осветительных приборов оказывается менее существенным, что является их достоинством. Однако при использовании любых камер в помещениях медицинских тепловизионных диагностических кабинетов необходимо поддерживать температуру на постоянном уровне, избегать прямых подсветок пациентов осветительными приборами и производить измерения при одном и том же расстоянии пациента от объектива камеры. 91 ЛИТЕРАТУРА 1. Иваницкий Г.Р., Деев А.А., Маевский Е.И., Хижняк Е.П., Хижняк Л.Н. / Возможности термографии в современной медицине: исследование пространственного изменения температуры кожи человека при введении перфторана // ДАН, 2003, т. 393, № 3, с. 419–423. 2. Иваницкий Г.Р., Деев А.А., Крестьева И.Б., Хижняк Е.П., Хижняк Л.Н. / Особенности температурных распределений в области глаз // ДАН, 2004, т. 398, № 5, с. 709–714. 3. Maevsky E.I., Ivanitsky H.R. et all / Chapter 26. “Perftoran” // In book: “Blood Substitutes” (Ed. R.Winslow), Oxford: Elsevier, 2005, pp. 288– 297. 4. Иваницкий Г.Р. / Биомедицина и тепловидение // Вестник Российской академии наук, 2006, № 1 (в печати). 5. Иваницкий Г.Р., Хижняк Е.П., Деев А.А., Хижняк Л.Н. / Тепловидение в медицине: сравнительная оценка инфракрасных систем диапазонов длин волн 3–5 и 8–12 мкм для диагностических целей // ДАН (в печати). 6. Иваницкий Г.Р., Деев А.А., Крестьева И.Б., Хижняк Л.Н., Хижняк Е.П. / Влияет ли ритм дыхания на температурный портрет человека? // ДАН (в печати). ИССЛЕДОВАНИЕ, РАЗРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ МЕДУЧРЕЖДЕНИЙ РАН МЕТОДОВ И ПРИБОРОВ ГЛУБИННОЙ ТЕРМОГРАФИИ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА Ю.В.Гуляев1), Ю.В.Обухов1), Н.Г.Гончаров2) 1) Институт радиотехники и электроники РАН, Москва 2) Центральная клиническая больница РАН Одним из перспективных и актуальных методов, позволяющих решать многие задачи ранней неинвазивной диагностики различных заболеваний, мониторинга лечения и профилактического обследования, является метод динамической термографии. Пассивный неинвазивный метод динамической термографии основан на измерении и анализе динамики распределения температуры поверхности тела человека (инфракрасная термография) или глубинного распределения температуры (радиотермография и акустотермография) в процессе реакции организма на различные нагрузки – фармакологические, функциональные и др. 92 В рамках проекта изготовлен и поставлен во 2-ю поликлинику РАН инфракрасный термограф и выполнены пуско-наладочные работы. Продолжались теоретические и экспериментальные исследования принципов построения пассивного глубинного акустического термотомографа. Теоретически рассмотрен эффект частичной когерентности теплового излучения нагретого тонкого слоя биоткани. Частичная когерентность теплового излучения наблюдается вследствие эмиссии энергии из неоднородной волны ближнего поля через дифракционную решетку в виде интерференционной картины при перемещении решетки вдоль нагретого слоя биоткани. Видность полос интерференционной картины пропорциональна амплитуде вариации температуры вдоль нагретого слоя биоткани. По результатам работ по радиотермографии мозга подготовлена кандидатская диссертация очной аспирантки ИРЭ РАН Босняковой Д.Ю. Для акустической термотомографии построена теория и оценены характеристики полукруглого термоакустического томографа со сканированием тела от 0о до 180о. Получены аналитические решения задачи акустотермотомографии. Для томографа с плоской конфигурацией датчиков выполнено сравнение точности восстановления распределения температуры при использовании Фурье- и вейвлет-декомпозиции. Поскольку использование фокусированного ультразвука при гипертермии приводит к локальному нагреву ткани, то вейвлет-представление таких температурных распределений с локальными флуктуациями компактнее, чем их Фурье-представление. Показано, что компактность вейвлетпредставления позволяет существенно сократить число неизвестных при решении обратной задачи акустической термотомографии и повысить точность восстановления температурного распределения по сравнению с использованием Фурье-представления. Предложен метод выбора компактного вейвлет-базиса для температурных распределений, получаемых в процессе гипертермии. Теоретически исследованы возможности восстановления двумерного температурного распределения в биообъектах с помощью линейных фазированных решеток с учетом реальных диаграмм направленности и без использования данных о коэффициенте поглощения. Метод позволяет за время измерений около полутора минут восстановить распределение температуры в исследуемой области с точностью приблизительно 0.5 К при нагреве области на 5-10 К. 93 СИНТЕЗ ФТОРОСУЛЬФАТО- И ФТОРОФОСФАТОМЕТАЛЛАТОВ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ЭФФЕКТИВНЫХ РЕНТГЕНОЛЮМИНОФОРОВ – ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЕЙ ИЗОБРАЖЕНИЯ ДЛЯ РЕНТГЕНОСКОПИИ И ФЛЮОРОГРАФИИ Д.Л. Мотов1), М.М. Годнева1), Н.Н. Борозновская2), А.В. Климкин2) Институт химии КНЦ РАН, Апатиты Институт оптики атмосферы СО РАН, Томск 1) 2) С целью выявления эффективных люминофоров синтезирован путем осаждения из растворов в соответствующих сульфатных системах набор из 56 в основном ранее неизвестных соединений: – титана: K4Ti4O5(SO4)5.10H2O(1), K2TiF2(S04)2 (2), Rb2TiF2(SO4)2.2H2O(3), Cs2TiF2(SO4)2. 3H2O(4); – циркония: сульфатоцирконат -K2Zr2O2(SO4)3.6H2O(5); фторид -ZrF4.3H2O(6) фтороцирконаты(ФЦ) Na5Zr2F13(7), Na7Zr6F31(8), -Na2ZrF6(9), K3ZrF7(10), K2ZrF6(11), - KZrF5(12), -KZrF5(13), KZrF5.H2O (14), (NH4)3ZrF7 (15), -NH4ZrF5(16), Rb3ZrF7(17), Rb2ZrF6(18), RbZrF5.H2O(19), Rb5Zr4F21.3H2O(20), Cs2ZrF6(21), Cs5ZrF21.3H2O(22), CsZrF5.H2O(23), -CsZrF5.H2O(24), Cs2Zr3F14.1.5H2O(25); оксофтороцирконаты (ОФЦ) K2Zr3OF12(26), Rb2Zr3OF12(27), -CsZrOF3.H2O(28); фторосульфаты (ФС): Zr2O2F2SO4.5H2O(29), -ZrF2SO4.2.5H2O(30), -ZrF2SO4.2.5H2O(31); фторосульфатоцирконаты (ФСЦ) -Na2ZrF2(SO4)2.2.5H2O(32), - K3ZrF5SO4.H2O(33), K3ZrF3(SO4)2(34), K2ZrF4SO4(35), K2ZrF2(SO4)2.2.5H2O(36), K3Zr2F7(SO4)2.4H2O(37), K3Zr2F9SO4.2H2O(38), (NH4)3Zr2F9SO4.2H2O(39), (NH4)2ZrF4SO4(40), (NH4)2ZrF2(SO4)2.2.5H2O(41), Rb2ZrF4SO4(42), Rb2ZrF2(SO4)2.3H2O(43), Rb3Zr2F9SO4.2H2O(44), RbZrO2F(SO4)2.6H2O(45), RbZr2O2F(SO4)2.5H2O(46), Rb0.1—0.4ZrO0.6-1.4F0.7-1.4(SO4)0.3-0.9.nH2O(47), Cs2ZrF4SO4(48), Cs2ZrF2(SO4)2.2H2O(49), Cs8Zr4F2(SO4)11.16H2O(50), CsZr2O2F(SO4)2.6H2O(51), Cs0.1-0.4ZrO0 .8-1.0F0.7-1.3(SO4)0.4-0..9.nH2O(52); – гафния: 94 K2HfF6(53), K3HfF5SO4.H2O(54), -K2HfF2(SO4)2.2H2O(55), K2HfF2(SO4)2.2.5H2O(56). Фосфатная система ZrO(NO3)2 – H3PO4 – KF –H2O изучена впервые и при этом выделено два фторофосфатоцирконата (ФФЦ) K4Zr4F5(PO4)5(57), K5Zr4F8(OH)7(PO4)2.11H2O(58). Все соединения идентифицированы методами РФА и кристаллооптики. Соединения с титаном (1–4), цирконаты с аммонием (15, 16, 39, 41), цезием (25) и гептацирконаты с калием (10), аммонием (15) и рубидием (17) не люминесцируют. Многие ФЦ, ОФЦ и ФСЦ имеют интенсивную рентгенолюминесценцию (РЛ) в оптическом или ультрафиолетовом диапазоне длин волн. РЛ первых ФФЦ оказалась средней интенсивности. Наиболее перспективны как люминофоры ФЦ с калием (11, 13), рубидием (18, 20), цезием (21, 22), ФСЦ с рубидием (44) и цезием (48, 50), ОФЦ рубидия (27), а также калиевый фторогафнат (53). Наиболее высокая интенсивность излучения выявлена у ФСЦ с рубидием (44). После нагревания образцов до 100–300 оС интенсивность может быть значительно увеличена. Например, для (27) она повышается в 1,6 раза, достигая максимальной среди всех соединений величины 11000 усл. ед. Различия РЛ для модификаций, не подвергавшихся термообработке, равные для ФЦ (23, 24) и ФС (30, 31) – по ~ 400 усл.ед , а также для ФЦ (12, 13) – 2100 усл. ед., подтверждает роль структурного фактора, но роль химического состава значительно выше (табл.). Таблица. Интенсивность излучения (усл. ед.) соединений циркония (без термообработки) Соединение NH4+ Na+ K+ Rb+ Cs+ M2ZrF6 - 165 5500 5500 MZrF5.H2O - - 300 700 450 M2ZrF4SO4 30 - 35 125 2200 M3Zr2F9SO4.2H2Oх 0 - 600 9500 0 - 400 84 750 - - 100 6800 - M2ZrF2(SO4)2.nH2O M2Zr3OF12 х) Соединения изоструктурны. 95 4500 - Большинство соединений с интенсивным свечением имеют основную полосу излучения в спектре РЛ в диапазоне длин волн 280–380, нм (F*), но ряд соединений излучает в диапазоне 390–550 нм (O*). Замещение фтора на SO4-группы приводит к смещению основной полосы излучения в спектре РЛ в сторону более длинных волн. При этом интенсивность излучения, как правило, снижается, но может быть значительной, как это наблюдается для соединения 50 после нагревания до 300 оС (3700 усл. ед). C повышением числа координированных молекул MF интенсивнось излучения достигает максимума при мольном отношении MF/Zr, равном шести для соединений с К+, Rb+ и Cs+. Соединения гафния или циркония аналогичного состава излучают по интенсивности практически одинаково, но полоса излучения для гафния смещена в сторону более коротких волн. Потенциальными люминофорами для рентгеноскопии и флюорографии являются Rb3Zr2F9SO4.2H2O, Rb2Zr3OF12, а также M2Zr(Hf)F6 (M- K, Rb, Cs). ЛОКАЛЬНАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ПРИ ТРЕХВОЛНОВОМ ЛАЗЕРНОМ ВОЗБУЖДЕНИИ БИОТКАНЕЙ В.В. Смирнов1), В.В. Соколов2), Н.Н. Булгакова1), В.И.Фабелинский1), Д.В. Соколов3) Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена 3) Московская городская клиническая онкологическая больница № 62 1) 2) Развитие лазерной, волоконной и оптоэлектронной техники способствовало разработке метода «оптической биопсии», который включает флуоресцентную визуализацию биологических тканей с последующим проведением локальных измерений спектров флуоресценции в выявленных подозрительных участках. Основной задачей «оптической биопсии» в клинической онкологии является выявление очагов избыточного накопления фотосенсибилизатора на участках визуально неизмененной слизистой оболочки полых органов для выполнения прицельной биопсии и диагностики предрака, раннего рака, первично-множественного опухолевого поражения; остаточной опухоли или раннего рецидива после эндоскопического, хирургического или лучевого лечения [1, 2]. Диагностическая точность «оптической биопсии» во многом определяется объективными данными локальной спектроскопии в зонах визуальной флуоресценции, выявление которых носит субъективный характер. 96 В этой связи основной целью проводимых исследований было продолжение и углубление начатых в рамках выполнения проектов 2002– 2004 гг. разработок аппаратуры для лазерной «оптической биопсии» и методик локальной флуоресцентной спектроскопии. Помимо опухолетропных и оптических свойств фотосенсибилизатора, локализации, строения и размеров опухоли, эффективность локальной флуоресцентной спектроскопии зависит от спектрального состава возбуждающего лазерного излучения, методики измерений спектров и обработки полученных данных. Наиболее перспективные для целей флуоресцентной диагностики современные фотосенсибилизаторы на основе порфиринов и хлоринов имеют несколько полос поглощения в видимом диапазоне спектра (400–650 нм). Для возбуждения их флуоресценции могут быть использованы доступные в настоящее время компактные диодные лазерные источники. Это существенно расширяет технические возможности, но в то же время требует оптимизации выбора лазерного источника возбуждения с учетом глубины проникновения возбуждающего излучения, предполагаемой глубины инвазии опухолевого поражения, необходимости ориентации в просвете органа в свете возбуждающего излучения и ряда других особенностей измерений спектров флуоресценции in vivo. В рамках выполнения проекта 2005 г. была проведена клиническая апробация спектрофлуориметра с тремя длинами волн возбуждения флуоресценции (408 нм, 532 нм, 638 нм). Анализ полученных результатов позволил разработать алгоритмы расчетов эффективных спектральнофлуоресцентных диагностических параметров в зависимости от длины волны лазерного возбуждения флуоресценции и оптимизировать выбор лазерного источника в соответствии с целями флуоресцентного исследования, размерами опухолевого поражения и используемым фотосенсибилизатором. Определены пороговые значения спектральных диагностических параметров, имеющие положительное прогностическое значение при флуоресцентном детектировании злокачественных опухолей некоторых локализаций на ранних стадиях их развития. Так, положительная прогностическая ценность метода «оптической биопсии» в диагностике начального центрального рака легкого составила 91 %. Литература 1. В.И. Чиссов, В.В. Соколов, Н.Н. Булгакова, Е.В. Филоненко Флуоресцентная эндоскопия, дермаскопия и спектрофотометрия в диагностике злокачественных опухолей основных локализаций. Российский биотерапевтический журнал, том. 2, № 4, 2003. С. 45–56. 97 2. В.В. Соколов, В.И. Чиссов, Е.В. Филоненко, Л.В.Телегина, А.Х. Трахтенберг, Г.А. Франк, Н.Н. Булгакова Флуоресцентная диагностика раннего центрального рака легкого. Пульмонология, № 1, 2005. С.107– 116. ЛАЗЕРНЫЕ ИЗОТОПИЧЕСКИЕ ДЫХАТЕЛЬНЫЕ ТЕСТЫ ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ Е.В.Степанов1), В.Т.Ивашкин2), А.В.Лапшин2), Е.К.Баранская2) 2) 1) Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва Московская медицинская академия им. М.И. Сеченова, Москва Цель исследований состояла в разработке новых методов и средств неинвазивной медицинской диагностики заболеваний органов пищеварения, основанных на лазерном анализе изотопического состава выдыхаемого воздуха, с помощью препаратов, обогащенных стабильным изотопом углерода 13С. Для изотопического анализа применялся лазерный спектрофотометр, разработанный в ИОФАН и позволяющий регистрировать изменения отношения концентраций 12СО2 и 13СО2 в выдыхаемом воздухе с чувствительностью ~ 0.5 ‰. Были исследованы характеристики лазерного 13С-уреазного дыхательного теста (13С-УДТ) применительно к диагностике различных нозологических форм H.pylori-ассоциированных заболеваний (язвы желудка и двенадцатиперстной кишки, гастритов и дуоденитов) и проведено сопоставление с данными морфологического анализа. Метод был применен для оценки эффективности различных схем медикаментозной терапии. Исследования показали, что лазерная диагностика позволяет уверенно определять инфицированность H. pylori, обеспечивая количественные данные о степени колонизации слизистой, и контролировать ход терапии и эффективность применяемых схем лечения. Она дает надежные данные об эрадикации H. pylori после проведения терапии без риска возможного инструментального заражения. Методика проведения 13С-УДТ достаточно проста, быстра, оперативна и комфортна для пациентов. Распределение результатов 13С-УДТ у пациентов с диспепсическими жалобами и болевым синдромом, полученные до и после эрадикационной терапии, отражают эпидемиологию заболеваний гастродуоденальной зоны, распространенность инфекцией H. pylori и закономерности колонизации ею ЖКТ, а также эффективность действия терапии и 98 особенности восстановления колонии бактерий при неудачной терапии. Возрастное распределение демонстрирует среднестатистическое нарастание колонизации ЖКТ к среднему возрасту и уменьшение по мере старения организма, подтверждает участие H. pylori в развитии гастродуоденальной патологии и отражает возрастное развитие атрофических изменений в слизистой. Распределение средних результатов 13С-УДТ при различных заболеваниях свидетельствует о том, что для каждой нозологической формы характерна определенная частота заболеваний, не связанных с инфекцией H. pylori. Причем язвенная болезнь как желудка, так и ДПК в подавляющем большинстве случаев (более 90 %) ассоциируется с наличием H. pylori, тогда как хронический гастрит и эрозивный дуоденит достаточно часто (до 25 % случаев) не имеют инфекционного характера. Было обнаружено, что результаты 13С-УДТ проявляют близкую к линейной зависимость от гистологической оценки колонизации как в каждом из топографических отделов гастродуоденальной зоны, так и от суммарной колонизации. Это позволяет выявить специфику топографии заселения слизистой при различных нозологических формах. В частности, показано, что высокая степень концентрации бактерий приводит скорее к образованию язв, а дисперсное распределение инфекции по большой площади более вероятно служит причиной воспаления слизистой. При сопоставлении данных 13С-УДТ с оценкой параметров воспаления выявлено, что чем выше оценка выраженности воспаления (т.е. сильнее хронизация воспалительного процесса), тем больше значение дыхательного теста. В то же время, среднее значение дыхательного теста не зависит от суммарной оценки степени нейтрофильной инфильтрации гастродуоденальной слизистой (и, таким образом, от остроты воспалительного процесса). Результат дыхательного теста также практически не зависит от степени атрофии при ее низких значениях. При нарастании атрофических изменений слизистой наблюдается тенденция к снижению показателей дыхательного теста, подтверждающая факт, что бактерии H. pylori, как правило, не заселяют атрофированную слизистую. Установление факта инфицированности на основании данных лазерного 13C-УДТ по всем диагностическим характеристикам (чувствительность, точность, специфичность) близко к результатам гистологического исследования множественных биопсий как до терапии, так и после нее. Все определяемые параметры выше 90 %. Исследования показали высокую продуктивность использования 13 лазерного С-УДТ в анализе результативности проводимой эрадикационной терапии. С помощью этого метода нами было показано, что применение схем на основе ингибиторов протонной помпы и комбинированного висмут-содержащего антисекреторного препарата, не содержащих метронидазол, является высокоэффективным. Полученная в 99 исследовании эффективность схем эрадикации H. pylori, включавших ранитидин висмут цитрат (пилорид), омепразол (лосек, омез), рабепразол (париет) в комбинациях с различными антибиотиками (кларитромицин, амоксициллин, фуразолидон), составила от 80 до 100 %. Для схем с применением метронидазола была получена существенно более низкая эффективность эрадикации – 53 %. РАЗРАБОТКА МЕТОДА МОНИТОРИНГА ОПУХОЛЕЙ НА ОСНОВЕ КОМПЛЕМЕНТАРНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ОПТИЧЕСКОЙ КОГЕРЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ Н.М.Шахова 1), Е.В.Загайнова 2), О.С.Стрельцова 3), А.Г.Орлова 1), Е.Э.Юнусова 2), В.А.Каменский 1), И.В.Турчин 1) 1) Институт прикладной физики РАН 2) ГОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия 3) ГУЗ Областная клиническая больница им. Н.А.Семашко, Нижний Новгород Стандартным методом диагностики рака мочевого пузыря является цистоскопия, интерпретация данных при которой вызывает затруднения в 20–40 % случаев [1], делая актуальным выполнение рандомной биопсии. При этом было показано, что при выполнении рандомных биопсий только в 12 % случаев (128 из 1033) были обнаружены неопластические изменения уротелия, то есть 88 % биопсий можно было не выполнять [2]. Наибольшие затруднения вызывают опухоли без образования видимых папиллярных разрастаний, так называемый плоский подозрительный участок. В то же время этот вид неоплазии имеет высокую степень прогрессирования и инвазии – от 42 до 83 % случаев [3]. По данным M.J.Swinn с соавт. при проведении 193 биопсий плоских подозрительных зон малигнизация была выявлена только в 23 случаях (12 %), остальные участки оказались доброкачественными [4]. Из вышеизложенного вытекает актуальность поиска метода, позволяющего повысить информативность традиционной диагностики. Новый метод диагностики рака мочевого пузыря, примененный в нашей работе, базировался на одновременном использовании флуоресцентной цистоскопии и оптической когерентной томографии (ОКТ). Был использован оптический когерентный томограф, созданный в ИПФ РАН (Н.Новгород). Длина волны излучения 1280 нм, разрешение по глубине – 15 мкм, латеральное – 30 мкм. Получение одного ОКТ изображения размером 200х200 пикселей занимает 3 с. ОКТ томограф оборудован эндоскопическим зондом (2,7 мм в диаметре), который при исследовании вводился через рабочий канал цистоскопа. Для 100 флуоресцентной цистоскопии использовался стандартный флуоресцентный цистоскоп фирмы Карл Шторц. В качестве флуорофора использовано внутрипузырное введение 50 мл 3 % раствора аллосенса (5аминолевулиновая кислота). Сценарий исследования включал несколько этапов: стандартная цистоскопия в белом свете, затем флуоресцентная цистоскопия в синем свете, оптическая когерентная томография флуоресцирующих зон с последующей их биопсией. Исследования запротоколированы с видеозаписью всех этапов. С использованием предложенного метода обследовано 19 пациентов с подозрением на рак мочевого пузыря. В исследуемой группе получено 70 флуоресцирующих зон, которые обследованы с использованием ОКТ и подвергнуты морфологической верификации. 14 зон представлены экзофитными опухолями, корректно детектированными стандартной цистоскопией. 56 участков флуоресценции соответствовали плоским подозрительным участкам при стандартной цистоскопии. Из них 48 по гистологическим данным были доброкачественными (ложно позитивный результат флуоресценции). При этом по данным ОКТ в 39 случаях получены структурные изображения, что является признаком доброкачественности (истинно негативный результат). 9 из 48 флуоресцирующих доброкачественных зон были ложноположительными и по данным ОКТ (гнезда Брунна – 3, лейкоплакия – 2, железистый цистит – 2, хроническое воспаление в тригональной зоне – 2). 8 из 56 флуоресцирующих зон были злокачественными по данным гистологического анализа, то есть имели истинно положительную флуоресценцию. Важным является то, что лишь 2 из них выглядели подозрительными в белом свете, остальные были пропущены стандартной цистосокпией. 8 из 8 малигнизированных флуоресцирующих зон имели «раковый» тип ОКТ изображений, то есть ОКТ корректно идентифицировала все зоны (истинно положительный результат). В нашем исследовании ОКТ не продемонстрировала ни одного ложноотрицательного случая, и лишь 19 % ложноположительных. Комбинация с ОКТ позволила бы в 81 % случаев избежать проведения биопсии ложноположительных флуоресцирующих зон. По предварительной оценке чувствительность нового метода диагностики рака мочевого пузыря на базе комплементарного использования ОКТ и флуоресценции составила 100 %, специфичность – 81,3 %. Результаты клинического исследования по применению флуоресцентной цистоскопии с 5-аминолевуленовой кислотой выявили чувствительность 97 % и специфичность около 60 % [5]. По данным других авторов по анализу 1460 биопсий установлено, что 57 % рака in situ и 32 % всех неопластических участков были пропущены белой цистоскопией и выявлены с помощью флюоресценции [6]. При этом количестве остается высоким процент ложного свечения гиперплазии 101 уротелия, плоскоклеточной метаплазии [7]. При оптической когерентной томографии важным диагностическим признаком развития неоплазии является нарушение контрастной границы между слоями стенки мочевого пузыря. Анализ клинических данных показал, что ОКТ с хорошей чувствительностью (98–100 %) и специфичностью (72–85 %) детектирует неоплазию, значительно повышая информативность рандомных биопсий, проводимых при стандартной цистоскопии [8]. По нашему мнению, комбинация ОКТ и флуоресцентной цистоскопии позволит максимально оптимизировать процедуру диагностики рака мочевого пузыря. Однако для статистически достоверного подтверждения результатов необходимо продолжение клинических исследований. Литература Переверзев А.С., Петров С.Б. Опухоли мочевого пузыря. - Харьков: Факт, 2002. - 301 с. May F., Treiber U., Hartung R., Schwaibold H. Significance of random bladder biopsies in superficial bladder cancer. Europen urology, 44, 2003, p. 47-50. Hudson M, Liss A, Harry W Carcinoma in situ of the bladder. V. 153(3) Аmrch, 1995. P.564-572. Swinn MJ, Walker MM, Harbin LJ, Adshead JM, Witherow R o’N, Vale JA, Patel A Biopsy of the red patch at cystoscopy: Is it worthwhali? Europen urology, 45, 2004, P. 471-474. Kriegmair M, Baumgartner R, Knuchel R, Stepp H, Hofstadter F, Hofstetter A. Detection of eraly bladder cancer by 5-aminolevulinic acid induced porphyrin fluorescence. J. Urology. 1996. V. 155, P. 105. Zaak D, SteppH, Baumgartner R et al., Endoscopic detection of urinary bladder cancer with 5-aminolevulinic acid based fluorescence endoscopy. J. Urol. 1999. V. 161, P. 170. Baumgartner R, Wagner S, Zaak D et al. Fluorescence diagnosis of bladder tumor by use of 5-aminolevulinic acid: fundamental and results., Tutlingen, Germany: Endo-Press, p. 58, 2000. Manyak M, Gladkova N, Makkari J, Zagaynova E et al. Evaluation of superficial bladder transitional-cell carcinoma by optical coherence tomography. J of endourology. 2005. V. 19, P 570-574. ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОАГРЕГАЦИИ КРИСТАЛЛИНОВ И ШАПЕРОННЫХ СВОЙСТВ КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ПЕПТИДОВ Л.В.Соустов1), Н.М.Битюрин1), Е.В.Челноков1), Н.В.Сапогова1), В.В.Немов2), Ю.В.Сергеев3), А.К. Тимофеева5), А.В.Кривандин4), К.О.Муранов4), М.А.Островский4) 1) Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород 102 НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной, Н. Новгород Национальный институт глаза Национального института здоровья, США 4) Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, г. Москва 5) МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва 2) 3) При воздействии на хрусталик глаза УФ излучения с длинами волн (290-320) нм белки хрусталика -, - и -кристаллины модифицируются и образуют агрегаты, которые способны рассеивать и поглощать излучение в ультрафиолетовом и видимом диапазонах спектра. Такие процессы являются одной из причин развития возрастной катаракты. Наиболее подверженным агрегации является -кристаллин, в меньшей степени кристаллин, а -кристаллин является молекулярным шапероном и защищает - и -кристаллины от денатурирующих воздействий. По предыдущим проектам в рамках Программы «Фундаментальные науки – медицине» нами были, в частности, проведены исследования влияния некоторых короткоцепочечных пептидов на скорость УФиндуцированной агрегации -кристаллина и его смеси с -кристаллином. Было установлено, что агрегация смеси этих белков существенно замедляется при добавлении в нее D- пантетина и L- карнозина. В проекте 2005 года начато исследование УФ-индуцированной агрегации полного набора основных белков хрусталика глаза, т.е. смеси -, - и -кристаллинов. Установлено, что присутствие в этой смеси - кристаллина почти в три раза увеличивает скорость ее фотоагрегации. Проведено исследование влияния N-ацетилкарнозина и D-пантетина на агрегацию смеси трех кристаллинов. Показано, что если Nацетилкарнозин слабо влияет на скорость агрегации, то добавление Dпантетина уменьшает ее до трех раз. Эти результаты представляют не только научный, но и практический интерес. В настоящее время они используются в качестве тестовых при проведении в Институте глазных болезней РАМН (Москва) экспериментов на интактных животных с целью создания нового антикатарактального препарата. На основании результатов, полученных нами с 2002 года, построена теоретическая модель УФ агрегации в водных растворах основных белков хрусталика глаза. Согласно этой модели пороговое увеличение рассеяния света в растворе начинается тогда, когда раствор образовавшихся димеров в растворителе становится пересыщенным. Это приводит к агрегации избыточных димеров и образованию сильно рассеиващих конгломератов. Первоначальное накопление димеров при воздействии УФ излучения происходит при взаимодействии фотоактивированных мономеров или фотоактивированных с исходными мономерами. Первый процесс доминирует при лазерной агрегации, в то время как второй процесс существенен при воздействии на хрусталик естественного освещения малой интенсивности. Важным параметром модели является время темновой дезактивации 103 фотоактивированного состояния. Наши эксперименты показывают, что вводимые нами добавки влияют на этот параметр. Так как время, необходимое для агрегации белков при естественном освещении оказывается обратно пропорциональным времени дезактивации, то введение добавок, уменьшающих этот параметр, позволяет увеличить время развития катаракты. Хотя кинетика агрегации белков при лазерном и естественном УФ облучении оказывается различной, наша методика позволяет оценить влияние добавок на время жизни фотоактивированного состояния, и тем самым произвести экспресс отбор добавок, которые могут рассматриваться как потенциальные антикатарактальные препараты. 104 2.3. Информатика РАЗРАБОТКА МАТЕМАТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ И ПРОГРАММНЫХ СРЕДСТВ ОБРАБОТКИ МЕДИЦИНСКОЙ ИНФОРМАЦИИ С ЦЕЛЬЮ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЗНАНИЙ И ПОДДЕРЖКИ ПРИНЯТИЯ ОПТИМАЛЬНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ Ю.И.Журавлев 1) , В.В.Рязанов А.В.Кузнецова 1,5) 3,5) , О.В.Сенько 1,5) , А.С.Заковряшин , Г.Н.Мачак , 4) Вычислительный центр им. А.А.Дородницына РАН РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 2) 1) 2) Институт биохимической физики им. Н.М.Эммануэля РАН 1586 Окружной военный клинический госпиталь МВО РФ 3) 4) ООО «Центр технологий анализа и прогнозирования «РЕШЕНИЯ» 5) Проведены работы, направленные на повышение эффективности методов извлечения знаний из медицинских данных. Проведено тестирование метода поиска закономерностей (знаний), основанного на построении статистически верифицированных оптимальных разбиений, на представительных наборах модельных задач. По результатам экспериментов произведена коррекция метода с целью исключения закономерностей, частично не соответствующих сценарию. Разработан новый метод распознавания, основанный на статистически взвешенном голосовании по системам закономерностей, которые находятся с использованием моделей различного вида и различного уровня сложности. Разработаны модификации методов распознавания, основанных на синтезе решающих деревьев и использовании логистических решающих функций. Все разработанные методы включают в себя эффективные процедуры автоматического обучения. Проведены исследования, подтвердившие возможность использования разработанных методов в качестве средств решения задач медицинской диагностики и прогнозирования. Была произведена модификации создаваемой ООО «РЕШЕНИЯ» в сотрудничестве с Вычислительным центром им. А.А.Дородницына РАН программной системы для интеллектуального анализа медицинских данных и решения диагностических и прогностических медицинских 105 задач. В систему включены средства решения прогностических задач для данных, представленных в виде временных рядов. Созданы эффективные средства визуализации данных и знаний. Подготовлены представительные базы данных по больным остеогенной саркомой, с посттравматическими стрессовыми расстройствами, базы данных, содержащие значения электропроводности в биологически активных точках по методике Фолля у представительных групп испытуемых различного возраста. Проведены исследования по прогнозированию результатов химиотерапии у больных остеогенной саркомой по показателям, доступным до начала лечения. Наилучшие результаты были достигнуты при прогнозировании ответа по генетическим переменным, характеризующим ядра клеток опухолевых тканей. Так, точность прогноза в группе пациентов с хорошо выраженным ответом составила 92 %, а в группе больных со средним или слабым уровнем ответа – 64 %. Проведено исследование по поиску значимых для прогнозирования факторов в острый период психогенных расстройств, возникших в условиях боевой обстановки, с построением математической модели прогнозирования отдаленных последствий перенесенной психической травмы. Из исходной панели психометрических показателей отобрано 13 показателей, статистически значимо связанных с отдалёнными последствиями. Создан прогностический алгоритм с точностью прогноза 85 % для группы больных без признаков посттравматического стрессового расстройства через год после лечения и 79 % в группе больных с признаками затяжного течения. Была проведена работа по решению задачи оценки биологического возраста (БВ) по состоянию биоактивных точек, определяемых по методу Фолля с использованием методов распознавания. В ходе исследования были построены алгоритмы оценки принадлежности испытуемого к возрастной категории ниже или выше границы для всех возрастов с шагом 5 лет как для мужчин, так и для женщин, а также выявлены наборы информативных показателей состояния меридианов по Фоллю для распознавания при оценке биологического возраста с делением по всем возрастам и полам. Литература 1. Ю.И.Журавлев, В.В.Рязанов, О.В.Сенько, РАСПОЗНАВАНИЕ. Математические методы. Программная система. Практические применения. Издво «ФАЗИС», Москва, 2005, 168 стр. 2. Г.Н.Мачак, А.Б.Лукьянченко, Б.И.Долгушин, Н.В.Кочергина, Э.Р.Вирашке, О.В.Сенько, А.В.Кузнецова. Критерий эффективности предоперационной химиотерапии остеосаркомы. Роль лучевых методов. Вопросы онкологии. 2005, № 3. 3. А.С. Заковряшин, С.Е. Заковряшина, И.В. Доровских, О.В. Сенько, А.В. Кузнецова, А.А. Козлов. Прогнозирование отдаленных последствий психогенных 106 расстройств у военнослужащих в остром периоде боевой психической травмы (с использованием логико-статистических методов). Неврология и психиатрия им С.С.Корсакова. 2006, № 2. ТЕЛЕМЕДИЦИНСКАЯ IP-СЕТЬ МОБИЛЬНОЙ ДИСТАНЦИОННОЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ А.П.Казанцев1), А.А.Сенин1), С.И.Федорова2), Н.А.Арапов3), Д.В.Давыдов4), А.А.Тарасов4), В.И.Шокин5), Т.В.Неведомская5) 1) Институт биологического приборостроения РАН, Пущино (МО) Московский областной научно-исследовательский клинический институт, Москва 3) Отраднинская участковая больница, Семеновское (МО) 4) ООО «Альтоника», Москва 5) ФГУП «ЦНИИ «Комета», Москва 2) Современная организация здравоохранения основана на системе лечебных учреждений стационарного характера. Мобильные подразделения, такие как скорая медицинская помощь, например, только дополняют эту структуру, рассчитанную на сложившуюся инфраструктуру населенных пунктов, транспорта и связи. Остро стоит проблема недостаточного медицинского обслуживания населения в сельской местности и на удаленных территориях. Кроме того, с развитием транспорта и связи жизнь людей становится все более мобильной, и появляются новые трудно решаемые вопросы для организации здравоохранения, когда от медицины требуется адекватная мобильность. При чрезвычайных ситуациях и во время военных действий появляется необходимость в экстренной и масштабной медицинской помощи. Когда при катастрофических обстоятельствах происходит перемещение больших масс людей, также необходимы мобильная медицина катастроф и высоко мобильная военно-полевая медицина. Развивающаяся телемедицина призвана решать эти проблемы, однако существующие системы рассчитаны опять же на стационарную сеть лечебных учреждений. В этой связи ученые и практикующие врачи все более настойчиво ставят вопрос о создании мобильных телемедицинских комплексов для массового обслуживания населения. В течение последних лет нами разрабатывались мобильные комплексы дистанционной электрокардиографии, как наиболее востребованный вид телемедицинской техники. На их основе в Московской области были развернуты пилотные сети телемедицинского обслуживания населения. Также разработан и апробирован комплекс мобильной телемедицины для 107 скорой кардиологической помощи. Показано, что повышается эффективность работы медицинского персонала и достигается высокое качество обслуживания населения при низком уровне затрат. По программе «Фундаментальные науки – медицине» в настоящее время создается типовой мобильный программно-аппаратный комплекс дистанционной функциональной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний как корпоративная IP-сеть портативных измерительновычислительных микрокомплексов – клиентов сети – и кардиологических сетевых анализаторов-серверов. Клиентские микрокомплексы – инструменты периферийных врачей, должны включать в себя электрокардиографы и (или) суточные мониторы ЭКГ и (или) АД. В микрокомплексах в качестве управляющих и коммуникационных компьютеров применяются миниатюрные карманные персональные компьютеры с беспроводной цифровой связью, коммуникаторы или смартфоны; используются внутренние беспроводные соединения по технологии Bluetooth. Инструменты специалистов функциональной диагностики или кардиологов – сетевые анализаторы, представляют собой портативные ноутбуки или стационарные ПК с кардиологическим и серверным программным обеспечением. Основой архитектуры сети является распределенная информационная система. Применяются технологии Smart Client и Push Messaging. В сети обеспечивается циркуляция разных видов данных для функциональной диагностики сердечно-сосудистых заболеваний. Используются специальные прикладные протоколы, применяются меры защиты данных и целостности системы. Предполагается интеграция в единое информационное пространство медицинских учреждений. 108 ИСТОЩЕНИЕ И АКТИВАЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ДЛИТЕЛЬНОЙ АНТИГЕННОЙ НАГРУЗКЕ. АНАЛИЗ ДАННЫХ И МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ Г.И. Марчук1), А.А. Романюха1), И.С. Литвинов2), Т.Е. Санникова1) Институт вычислительной математики РАН, Москва Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва 1) 2) Эффективность иммунной защиты от патогенов зависит от многих факторов и меняется во времени, в частности стареет. Явление старения иммунной системы включает снижение продукции Т-лимфоцитов в тимусе, постепенное истощение пула нативных периферических Тлимфоцитов и связанное с ним сужение спектра распознаваемых антигенов, накопление клеток памяти и снижение репликативного потенциала, прежде всего периферических Т лимфоцитов. Известно, что скорость старения иммунитета различна у разных индивидов и зависит от величины антигенной нагрузки, увеличивается при наличии хронических инфекционных и аутоиммунных заболеваниях. Установлено, что при ВИЧ-инфекции скорость старения иммунитета увеличивается примерно в семь-восемь раз по сравнению с нормой. Вместе с тем в литературе отсутствуют данные по влиянию на скорость старения или истощения иммунитета против конкретного патогена повышенной нагрузки данным патогеном. Очевидно, что такие данные представляют большой интерес, так как позволят уточнить представления о фундаментальных механизмах иммунной защиты и выработать практические рекомендации. Мы провели исследование динамики концентрации в крови специфических к антигенам микобактерий CD4+ лимфоцитов в зависимости от длительности контакта источником патогена – больными активной формой туберкулеза. Исследования проводились у медицинского персонала туберкулезной больницы. Это гарантировало отсутствие туберкулезной инфекции у обследуемых и позволяло построить зависимость уровня активности специфического иммунитета от стажа работы с больными. Полученные результаты выявили нетривиальный, двухфазный характер исследуемой зависимости. В течение первых пяти-шести лет наблюдается монотонное снижение концентрации специфических к микобактериям CD4+ лимфоцитов (примерно в 6 раз), затем наблюдается относительно быстрый подъем концентрации специфических лимфоцитов и, к 10–12 году стажа, она составляет примерно 75 % от исходной, после этого момента наблюдается медленное монотонное снижение концентрации специфических лимфоцитов, вплоть до 40 лет стажа. 109 Полученная закономерность определяется в основном двумя процессами: – истощением и активацией специфического иммунитета индивида, – отбором персонала (увольнением после определенного периода работы). В частности, известно, что пик увольнений среднего медицинского персонала туберкулезных отделений приходится на 5–6 годы стажа. Обработка полученных данных показала, что отбор не может полностью объяснить наблюдаемую зависимость. Для объяснения наблюдаемой закономерности мы предположили, что успешная защита от длительно поступающего патогена включает три фазы: истощения пула наивных клеток, продуктивного иммунного ответа (в отсутствие значимой инфекции?), нормального старения пула клеток памяти. Для описания этого процесса разработана математическая модель. Полученные оценки параметров могут быть использованы для выработки рекомендаций по защите здоровья медицинского персонала. Представляется важным исследовать механизм и условия перехода от первой ко второй фазе защиты от патогена. Литература A. Romanyukha, A. I. Yashin. 2003. Age related changes in population of peripheral T cells: towards a model of immunosenescence. Mechanisms of Ageing and Development. 124, pp. 433-443. T. E. Sannikova, S. G. Rudnev, A. A. Romanyukha, A. I. YASHIN. 2004. Immune system aging may be affected by HIV infection: the mathematical model of immunosenescence. Russ. J. Numer. Anal. Math. Modelling, Vol. 19, No. 4, pp. 315– 329. ВОЗРАСТНЫЕ МОДЕЛИ СОМАТИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА В.А.Орлов, О.Б. Фетисов, И.Б.Шавырин, Т.И. Алексеенко ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН, Москва Здоровье человека с его невероятно сложным устройством организма является предметом исследований для многих научных дисциплин. Безграничная многомерность структур и функций (на организменном, системно-органном, тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном 110 уровнях) делают почти нереальным интегрирование всех наблюдаемых показателей в одномерную систему измерений. Однако на бытовом уровне человечество с древних времен умело отличать сильного и здорового человека от слабого и больного, здоровое животное от больного. В последние десятилетия с появлением кибернетики, общесистемной методологии и электронной микроскопии медикобиологическая наука сконцентрировалась на изучении субклеточных и молекулярных элементов живого организма человека. Как известно, хорошее или плохое физическое самочувствие человека является интегративным результатом информационных (нейрогуморальных) процессов, протекающих на всех уровнях организма. Например, латентная ишемия в клетках головного мозга или сердца повлечет ухудшение самочувствия человека, а низкая резистентность желудка и кишечника к бактериальной интервенции и ослабленная иммунная система не защитят человека от возникновения дискомфорта. Подобных примеров можно описать очень много. Особую тревогу у специалистов сегодня вызывают так называемые «болезни цивилизации» и, в первую очередь, те, которые порождаются гипокинезией. Многочисленные исследования ученых свидетельствуют, что малоподвижный стиль жизни нескольких поколений населения и комфортностерильная среда обитания привели к снижению резистентности (иммунодефицит) и негативным адаптационным изменениям в костномышечной, нервной, сердечно-сосудистой, дыхательной, гормональной и других системах организма людей. Физиологический взгляд на соматическое здоровье человека предопределяет измерение и оценку функциональных возможностей целого организма и его систем, ответственных за обеспечение жизнедеятельности и адекватные реакции на стрессовые воздействия среды для сохранения гомеостаза и удовлетворительного самочувствия. Этот концептуальный подход использован нами при разработке донозологической программы обследования групп населения, включающей комплекс тестовых процедур и измерение 20 физиологических и антропометрических показателей организма. Целевое обследование населения, проводимое совместно с Ассоциацией «Народный СпортПарк», в течение ряда лет аккумулировало массив в количестве 200 тыс. человек. Математико-статистическая обработка этой базы данных позволила уточнить границы нормы у практически здоровых людей в каждой возрастной группе с выборкой не менее 1000 человек. Полученные данные свидетельствуют о широких границах коридора норм по всем измеренным показателям (весо-ростовой индекс, ЖЕЛ, работоспособность, крупные мышечные группы, зрительно-двигательная реакция, проба с задержкой дыхания, гибкость позвоночника, величина PWC170 и показатели кардиореспираторной системы – МПК, УОК, МОК). Анализ данных собственных обследований и доступных публикаций позволил уточнить по всем показателям организма среднегрупповые 111 значения и полярные показатели от возрастного «идеала» и зоны предпатологии. На основе перцентильного подхода для каждого показателя организма в каждой возрастной зоне были выделены 6 подзон со своими числовыми границами и присвоением им качественных оценок (хорошо, удовлетворительно, плохо). Это позволило сформировать таблицы матричного типа для отображения границ возрастной нормы для всех контролируемых характеристик организма и представить их в виде моделей соматического здоровья для человека в возрасте от 6 до 60 лет. Они будут продемонстрированы участникам данной конференции. Разработанные возрастные модели соматического здоровья следует рассматривать как начальную попытку обозначить ориентиры и индикаторы для контроля состояния организма человека с помощью хорошо известных и легко измеряемых показателей. Дальнейшие углубления исследований в этой области позволят внести существенные коррективы в модельные нормативы с учетом климатогеографических, этнических и экологических особенностей регионов. Вместе с тем практикующие врачи уже сегодня могут воспользоваться нормативами из возрастных моделей соматического здоровья при проведении диспансеризаций и профосмотров населения. Следует отметить, что массовое обследование населения на основе данной донозологической программы не выявило ни одного человека, у которого все 20 показателей организма были бы отнесены к зоне с оценкой отлично или, наоборот, к зоне предпатологии. Профиль соматического здоровья каждого человека имеет выраженную индивидуальность, при этом ряд показателей имеют высокие оценки, в то время как другие принадлежат лишь к удовлетворительной или очень низкой нормативной зоне. Исследование стиля жизни и наследственных факторов каждого человека может дать ответ о «происхождении» слабых звеньев организма, а также построить индивидуальную модель желательного состояния организма и определить пути к ее достижению с помощью целевой функциональной тренировки. Такой подход к профилактике и оздоровлению населения сулит перспективные результаты. Выдающийся российский врач Н.И.Пирогов утверждал: «Будущее за медициной предохранительной». СИСТЕМА КОМПЛЕКСНОЙ ИНФОРМАЦИОННОЙ ПОДДЕРЖКИ ДЛЯ ВРАЧА-АЛЛЕРГОЛОГА В.С. Переверзев-Орлов1), Е.А. Ващенко1), М.А. Витушко1),, В.Б. Гервазиева2), С.Н. Жирова2), В.П. Калманова2) И.И. Стенина1), Е.Ю. Чикина2) 112 Институт проблем передачи информации РАН, Москва Консультативно-диагностический Центр ГУ НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН, Москва 1) 2) На основе технологий создания баз знаний и инструментальной системы PS, разработанных в ИППИ РАН, создан прототип консультативной системы для врача-аллерголога. Система поддерживает эффективный сбор информации о пациенте в удобном для врача режиме диалога, генерацию текста истории болезни, порождение диагностических гипотез и формирование рекомендаций по обследованиям и лечению. Применение системы позволит сокращать затраты времени врача на ведение истории болезни, расширять представления врачей о стандартах диагностики и лечения разнообразных клинических форм аллергии с учетом опыта и знаний отечественной аллергологической школы и осуществлять активную информационную поддержку решений врача при планировании обследовании лечения пациента. Работа имеет инновационный характер. Разрабатываемая сейчас версия системы предназначена для семейных врачей и включает вопросник и базу знаний для анализа характера высыпаний у пациента. Создан структурированный сценарий диалога системы с врачом, обеспечивающий необходимую полноту сбора информации о пациенте. Вопросник содержит также полную терминологическую справочную информацию в виде текстов и фотографий. Ответы врача заносятся в базу данных пациента. Основываясь на этих данных, генератор текстов формирует стилистически правильный текст с описанием исследуемого случая, полностью соответствующий форме занесения данных в историю болезни и другие документы. На основе информации о пациенте синдромная база знаний позволяет выдвинуть гипотезы о характере патологического процесса и рекомендации по дополнительным обследованиям и лечению. Синдромная база знаний является вариантом нейронной сети, объединяющим направленные пороговые сети, соответствующие различным синдромам. Такие сети могут рассматриваться как формализация исторически сложившегося в медицине способа представления и передачи знаний. Для выдвигаемых системой диагностических гипотез и рекомендаций предлагаются обоснования в нескольких формах: в виде обычных текстов и изображений из медицинских учебных пособий, диагностических таблиц и в виде иерархических структур симптомокомплексов из базы знаний с отметкой того, какие именно симптомы наблюдаются у данного пациента и каким образом система оценивает наличие того или иного диагноза в рассматриваемом случае. Предусмотрена также возможность изменения врачом любых заключений системы в ходе анализа конкретного случая заболевания. 113 Литература 1. E.Vaschenko, M.Vitushko, V.Pereverzev-Orlov. Potentials of Learning on the Basis of Partner System. "Pattern Recognition and Image Analysis", v. 14 (2004), № 1, pp. 84-91. 2. Е.А. Ващенко, М.А. Витушко, И.И. Стенина. В.С. ПереверзевОрлов. Интегральная ПС для комплексной поддержки решений врача. // Труды конференции "Современные инфокоммуникационные технологии в системе охраны здоровья", Москва, 13–14.11.2003. С. 19-21. 3. M.A. Vitushko, N.D. Gurov, V.S. Pereverzev-Orlov, A syndrome as a tool for presenting concepts, pattern recognition and image analysis,V. 12, № 2, 2002, pp. 194-205. 4. Е.А.Ващенко, М.А.Витушко, Н.Д.Гуров, В.С.Переверзев-Орлов. Технологии создания партнерских систем. //Труды конференции «Медицинская кибернетика в клинической практике», 1999. С. 21-30. МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЙ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ ГЛАЗНОГО ДНА ДЛЯ СИСТЕМЫ КОМПЬЮТЕРНОЙ ДИАГНОСТИКИ В.А.Сойфер1) , В.В.Котляр1), А.Г. Храмов1), Н.Ю. Ильясова1), А.В.Куприянов1), А.В. Устинов1) , Н.А.Гаврилова2) 1) Институт систем обработки изображений РАН, Самара 2) Московский государственный медико-стоматологический университет, Москва Сахарный диабет (СД) является одной из важнейших медико-социальных проблем в настоящее время и стоит в ряду приоритетов национальных систем здравоохранения всех стран мира. Одним из наиболее частых и прогностически неблагоприятных проявлений СД является диабетическая ретинопатия (ДР). В связи с тем, что развитие ДР начинает формироваться с сосудистых изменений (изменений абсолютных и относительных соотношений диаметров артериальных и венозных сосудов, рост новых сосудов, их повышенная извитость и т.д.), разработка диагностических методов исследования сосудов глазного дна с использованием цифровых и компьютерных технологий может являться одним из перспективных направлений в диагностике ранних стадий ДР. Развитие этого направления в настоящее время связано с совершенствованием систем для получения высококачественных изображений глазного дна и разработкой методов количественной оценки состояния кровотока. Целью проводимой НИР является разработка математических методов формирования диагностических признаков на основе цифрового анализа изображений глазного дна, математических методов оценивания биомеханических характеристик сосудов, позволяющих повысить точность и информативность диагностики сосудистой патологии. 114 С медицинской точки зрения наиболее важными параметрами, влияющими на постановку диагноза и выбор тактики лечения, являются локальное изменение диаметра сосуда и характер относительного изменения трассы сосудов в пространстве. В настоящее время в офтальмологии сложились методы измерения диаметра сосудов сетчатки, большинство из них основаны на построении профиля яркости поперечного сечения сосуда в заданной оператором точке. Основным недостатком подобных методов, несмотря на высокую точность измерения толщины поперечного сечения, являются высокая трудоемкость и вероятность ошибки в случае измерения вблизи границы сосуда или измерения на локальном сужении сосуда или месте изгиба. В настоящей работе предлагается использовать новый метод оценивания параметров на основе параметрической аппроксимации. Предложенный метод позволяет производить оценку толщины ветвей в произвольных точках трассы сосудов на изображениях. В основе аппроксимационных методов оценки лежит идея параметрической аппроксимации яркостного профиля выделенного на изображении фрагмента исследуемого сосуда. Для определения параметра толщины объекта на основе трех различных моделей яркостного профиля был разработан спектральный алгоритм аппроксимации, позволяющий производить аппроксимацию дискретного спектра последовательности аналитическим непрерывным спектром. Экспериментальные исследования аппроксимационных методов оценки параметров толщины на модельных изображениях показали высокую точность работы метода оценки толщины и устойчивость к искажениям. Для оценки геометрических параметров также использовался метод, основанный на применении искусственных нейронных сетей. Метод позволяет оценивать толщину и направление сосудов на изображениях в заданных точках, что дает возможность определения важных параметров объектов (характеристики трассы, толщины сосудистого русла и т.д.). В результате сравнительного анализа существующих методов оценки параметров на изображениях было установлено, что данный алгоритм более всего применим к сериям изображений одного типа. В этом случае данный алгоритм превосходит по точности полученных результатов существующие алгоритмы оценки параметров. Однако следует отметить то, что недостатком данного алгоритма является трудоемкость процесса обучения в случае, когда необходимо одновременно производить оценку параметров на изображениях различного типа. Данные методы и алгоритмы включены в разрабатываемую систему компьютерной диагностики. В предлагаемой системе впервые введены средства количественного анализа сегментов изображений и применения полученной количественной информации в повседневной клинической практике. Оболочка программного комплекса в виде экспертной системы призвана облегчить внедрение и практическое использование программ. 115 По результатам исследования была опубликована статья [Измерение биомеханических характеристик сосудов для ранней диагностики сосудистой патологии глазного дна, Н.Ю.Ильясова, А.В.Куприянов, М.А.Ананьин, Н.А.Гаврилова, Компьютерная оптика. Выпуск № 27, с. 165-170]. Приняты к публикации следующие статьи: [Method of the Functional Tag Field in the Analysis of Ocular Fundus Images, A.M. Malafeev and A.V. Kupriyanov, Pattern Recognition and Image Analysis, Vol. 15, No. 3, 2005], [The Development of a Computer Method for Studying Retinal Image Pathologies, N.Yu. Ilyasova, I.N. Adamenko, M.A. Ananyin, V.V. Jatulchik, and N.А. Gavrilova, Pattern Recognition and Image Analysis, Vol. 15, No. 3, 2005], [Estimation of Geometrical Diagnostic Features the Optical Disk Images, N.Yu. Ilyasova, A.V. Kupriyanov, A.V. Ustinov, M.A. Ananin, and N.A. Gavrilova, Pattern Recognition and Image Analysis, Vol. 15, No. 3, 2005], [Method for Estimation of Directions of the Optic Disk’s Vessels, in the Fundus Images, M.A. Anan’in and N.Yu. Il’yasova, Pattern Recognition and Image Analysis, Vol. 15, No. 2, 2005]. Учреждения Росздрава, с которыми проводятся в данный момент исследования: 1) Московский государственный медикостоматологический университет, кафедра глазных болезней, 2) ООО «Офтальмодел», Москва, 3) Самарский научно-исследовательский центр «Медицинские технологии». МЕТОДЫ ДИНАМИЧЕСКОГО НАБЛЮДЕНИЯ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СОСТОЯНИЯ ПРЕДСЕРДИЙ И ЖЕЛУДОЧКОВ СЕРДЦА НА ОСНОВЕ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ С СОДЕРЖАТЕЛЬНО-ОБРАЗНЫМ ПРЕДСТАВЛЕНИЕМ ДАННЫХ Л.И. Титомир1), В.Г. Трунов1), Э.А.И. Айду1), Е.В. Сидорова1), О.А. Рогинко2), Т.А. Сахнова3) 1) Институт проблем передачи информации РАН, Москва 2) Центральная клиническая больница РАН, Москва 3) Российский кардиологический научно-производственный комплекс, Москва Разработанные на предыдущем этапе выполнения программы РАН «Фундаментальные науки – медицине» “экономичная” система электрокардиографических отведений “Франк-М” и метод дипольной электрокардиотопографии «ДЭКАРТО» обеспечивают существенное повышение диагностической информативности электрокардиографических измерений по сравнению со стандартной электрокардиографией и бόльшую наглядность представления данных, 116 что облегчает их эвристический анализ, особенно при кратковременном и долговременном динамическом наблюдении за состоянием сердца. На этапе выполнения работ в 2005 г. особое внимание было уделено топографическому представлению периода завершения цикла возбуждения сердца (реполяризации). Были разработаны алгоритмы построения интегральных карт реполяризации (карт ускорения реполяризации) и моментных карт реполяризации. Эти карты (дэкартограммы реполяризации) позволяют более точно оценить состояние сердца при различных состояниях организма испытуемого. При научном сотрудничестве с Институтом нормальной и патологической физиологии Словацкой Академии наук были проведены измерения электрокардиографических сигналов у группы здоровых лиц в спокойном состоянии и при различных изменениях состояния организма – на вдохе и на выдохе, в разных позах (стоя и лежа), при мышечном напряжении, при умственном напряжении (решение математических задач) и др. Данные этих измерений были обработаны по методу ДЭКАРТО, в результате установлено, что моментные и интегральные дэкартограммы, в особенности дэкартограммы реполяризации, могут служить эффективным индикатором состояния организма, в частности при психофизиологических нагрузках, отражая комплексные изменения характеристик сердечно-сосудистой и нервной систем. Была проведена экспериментально-клиническая оценка эффективности параметров, используемых в методе ДЭКАРТО для диагностики увеличения предсердий и гипертрофии желудочков сердца, на материале электрокардиографических измерений, выполненных на базе Российского кардиологического научно-производственного комплекса на группах здоровых и больных испытуемых (около 300 человек). Получены значения чувствительности и специфичности распознавания указанных патологических состояний, существенно превышающие соответствующие характеристики общепринятых в стандартной электрокардиографии критериев. В частности, при специфичности ≈ 90 % чувствительность дэкартографических параметров достигает ≈ 40 % для больных с умеренной гипертрофией и ≈ 75 % для больных с выраженной гипертрофией (эти значения более чем вдвое превышают значения соответсвующих параметров при использовании критериев стандартной электрокардиографии). В сотрудничестве с ЦКБ РАН продолжены экспериментальноклинические измерения электрокардиограмм у лиц пожилого возраста с кардиосклеротическими изменениями и проведена обработка полученных данных по методу ДЭКАРТО. Для уменьшения трудоемкости процедуры обследования испытуемых была использована система отведений с электродами, расположенными по схеме стандартной электрокардиографии (12 отведений) с синхронной регистрацией сигналов по 8 117 каналам. К измеренным сигналам применяется эффективный алгоритм пересчета сигналов в 3 ортогональные компоненты вектора сердца. Это позволяет за один сеанс измерительной процедуры получить необходимые исходные данные для построения стандартных электрокардиограмм, векторкардиограмм и дэкартограмм. Осуществлен сбор электро-кардиографических данных у верифицированных групп здоровых и больных испытуемых для оценки критериев динамического наблюдения за состоянием сердечно-сосудистой системы на основе метода ДЭКАРТО. На следующих этапах проекта предусматривается разработка эффективного метода определения отдела сердца, пораженного ишемией на различных стадиях, с использованием униполярных грудных отведений системы «Франк-М», которые, в отличие от обычных векторкардиографических отведений, обладают высокой чувствительностью к пространственной локализации ишемического очага. Проведена успешная предварительная апробация этого подхода на математических моделях сердца как электрического генератора и грудной клетки как объемного проводника. РАЗРАБОТКА ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ ИНФОРМАЦИОННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЙ КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ И РЕАЛИЗАЦИЯ АЛГОРИТМИЧЕСКОПРОГРАММНОГО КОМПЛЕКСА, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕГО ЕЕ ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ И.Б.Гуревич2), В.А. Власова2), И.А. Воробьев3), Д.М.Мурашов2), А.А.Трыкова2) 2) Вычислительный центр им. А.А.Дородницына РАН, Москва 3) Гематологический научный центр РАМН, Москва Одной из наиболее серьезных проблем современной онкологии и практической медицины является развитие системы ранней диагностики злокачественных новообразований на базе автоматизированных диагностических комплексов. Новым этапом в исследовании морфологии клеток являются получение и анализ данных, извлекаемых из цифровых изображений высокого разрешения, обладающих очень высокой диагностической информативностью. Извлечение из этих изображений диагностически существенной информации и ее анализ с помощью информационной технологии, базирующейся на современных математических методах распознавания образов и анализа изображений, позволит создать автоматизированные и интерактивные алгоритмическопрограммные комплексы для выявления и классификации опухолевых 118 клеток. Основными задачами текущего этапа (2005 г.) экспериментального исследования технологии являлись разработка методов анализа изображений препаратов и диагностических методик. На предшествующем этапе НИР в соответствии с разработанной ранее функциональной схемой информационной технологии было сформировано признаковое пространство – набор количественных характеристик, отражающих особенности структуры и рисунка хроматина клеточных ядер. Полученные признаковые описания ядер лимфоидных клеток необходимы для разработки методик дифференциальной диагностики гемобластозов. Важной задачей при разработке диагностических методик являются определение структуры взаимосвязей между признаками и минимизация числа признаков, позволяющих дискриминировать клетки от пациентов, относящихся к различным нозологиям. Для этого были произведены кластерный и факторный анализы признакового описания клеточных ядер [2, 3]. Применялись следующие методы факторного анализа: метод главных факторов, центроидный метод и метод максимума правдоподобия. Кластерный анализ производился методом «ФОРЭЛЬ». Результаты анализа показали, что: а) около 80 % всех ядер попадают в 5 крупных кластеров; б) популяции ядер больных с различными диагнозами распределены по кластерам неодинаково; в) структура таксономии задается тремя признаками, значения которых группируются в компактных областях. Другим направлением исследований являлась разработка методов анализа изображений ядер и процедур вычисления признаков, обладающих свойством инвариантности относительно таких преобразований изображений ядра, как поворот, сдвиг, линейное преобразование яркости, а также являющихся малочувствительными к точности фокусировки микроскопа и другим изменениям условий съемки препаратов. На базе подхода пространства масштабов разработаны яркостный и текстурный методы анализа изображений клеточных ядер [1, 2], позволяющие получить такие признаки, как общее количество экстремумов яркости на семействе размытых изображений, образующих пространство масштабов, порожденное предъявленным изображением ядра, и отношение детерминанта матрицы вторых моментов, вычисленной в окне заданного размера по значениям модуля градиента яркости, к ее следу. На основе этих признаков получены диагностические критерии, позволяющие классифицировать клеточные ядра и формулировать диагностические решения. Диагностическая эффективность сформированных критериев тестировалась с помощью нескольких алгоритмов распознавания: k-ближайших соседей, линейной машины, метода опорных векторов и комплексного комитетного метода. Результаты тестирования подтвердили эффективность предложенных 119 методов анализа изображений ядер и сформулированных диагностических критериев, причем продемонстированная точность классификации оказалась не ниже уровня экспертной оценки. По результатам выполненных в 2005 г. исследований можно сделать следующие выводы: 1) в результате проведенного факторного и кластерного анализа получено признаковое описание, которое позволяет проводить диагностику рассматриваемой группы заболеваний; разработана процедура постановки диагноза; 2) разработаны и программно реализованы методы анализа изображений и процедуры вычисления признаков, малочувствительные к условиям получения изображений и качеству препаратов; 3) предложенные методы анализа изображений и процедуры вычисления признаков могут быть использованы для дифференциальной диагностики гемобластозов. Результаты исследований доложены на 8-й Всероссийской научной конференции «Методы и средства обработки сложной графической информации» (Нижний Новгород, 12–16 сентября 2005 г.) и на Международной конференции «Перспективные информационные и медицинские технологии для здоровья населения» (AITTH 2005, Минск, Белоруссия, 8–10 ноября 2005 г.). Следующий этап проекта будет посвящен автоматизации анализа изображений гистологических препаратов. Будут использованы 2 типа снимков, полученных: а) при небольшом увеличении микроскопа (объективы х4, х10) для оценки возможностей анализа пространственного распределения новообразований из опухолевых клеток в составе лимфоузлов и количественного сопоставления с существующими качественными характеристиками (фолликулярная гиперплазия, нодулярный рост, диффузный рост и др.); б) при большом увеличении микроскопа (объектив х100) для сравнения возможностей анализа структуры ядра (в т.ч. хроматина ядра) на цитологических и гистологических препаратах, а также для исследования различных очаговых образований в составе лимфатических узлов. Предполагается, что информация о структуре ткани может анализироваться методами гранулотекстурного анализа, а анализ клеток планируется проводить методами, разработанными для цитологических препаратов. По результатам НИР опубликованы следующие работы: 1. В.М.Власова, И.Б.Гуревич, Д.М.Мурашов, О.Сальветти. Технология автоматизированного анализа изображений цитологических препаратов органов лимфатической системы // Тезисы докладов 8-й Всероссийской научной конференции «Методы и средства обработки сложной графической информации», Нижний Новгород, 12–16 сентября, 2005. – С. 42–46. 120 2. S.Ablameyko, S.Di Bona, I.Gurevich, I.Koryabkina, D.Murashov, Nefyodov, O.Salvetti, A.Trykova, I.Vorobjev. Towards automated analysis of cytological and histological specimen images // Proceedings of the International Conference on Advanced Information and Telemedicine Technologies for Health (AITTH2005), November 8–10, 2005, Minsk, Belarus. – Р. 27–31. 3. S.Di Bona, I.B.Gurevich, I.V.Koryabkina, A.V.Nefyodov, and O.Salvetti. Two Approaches to Medical Image Analysis: Comparison and Synthesis // Pattern Recognition and Image Analysis: Advances in Mathematical Theory and Applications.–MAIK «Nauka/Interperiodica», 2005.–Vol. 15, No. 2.–P. 539–542. 3. ПРИБОРЫ И МАТЕРИАЛЫ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ, НОВЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ 3.1. Материалы РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЕВЫХ ИМПЛАНТАТОВ С ПРОГРАММИРУЕМО ИЗМЕНЯЕМЫМИ В ПРОЦЕССЕ ЭКСПЛУАТАЦИИ СВОЙСТВАМИ Л.И.Валуев1), Г.А.Сытов1), И.Л.Валуев1), Д.В.Давыдов2) Институт нефтехимического синтеза им. А.В.Топчиева РАН Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» Минздравсоцразвития РФ 1) 2) Внедрение в клиническую практику протезов различных органов и тканей выявило необходимость создания дополнительного ассортимента материалов, способных увеличивать свои размеры по мере увеличения возраста пациента. Для решения этой проблемы предложено использовать реакции сополимеризации с неионогенными сомономерами, функциональная группа которых в процессе эксплуатации изделия способна гидролизоваться с образованием карбоксильных групп. При 121 физиологических значениях рН карбоксильные группы диссоциируют, что приводит к увеличению степени набухания полимеров за счет электростатического отталкивания одноименно заряженных групп, то есть к увеличению размеров имплантата. Предложенный подход реализован на примере эластичного орбитального имплантата-эндопротеза для офтальмологической реконструктивно-восстановительной хирургии, который представляет собой сферу с диаметром 16–18 мм. Имплантат получали радикальной сополимеризацией в стеклянной форме водных растворов (рН 7.4) 20 % масс. гидроксиэтилметакрилата (ГЭМА), 1–3 % масс. акриламида и 1–3 % масс. сшивающего агента, используя в качестве инициатора полимеризации окислительно-восстановительную систему персульфат аммония - N,N,N',N'-тетраметилэтилендиамин. В экспериментах in vitro показано, что термостатирование синтезированных имплантатов в модельных условиях (рН 9.0, 45 0С) приводит к гидролизу амидных групп сополимера и увеличению диаметра имплантата, который стремится к диаметру имплантата на основе сшитого сополимера ГЭМА с акриловой кислотой. В экспериментах in vivo при имплантации протезов в орбиту глаза кролика обнаружено, что и в условиях живого организма сополимеры ГЭМА с акриламидом также подвергаются гидролизу, хотя и с существенно меньшей скоростью. Это приводит к увеличению диаметра имплантата с исходных 16–18 мм до 17-21 и 25–27 мм через 12 и 24 месяца имплантации соответственно. Проведенные санитарно-химические исследования разработанных материалов на основе сшитых сополимеров гидроксиэтилметакрилата показали низкий уровень токсичности, отсутствие мутагенной активности и пирогенности. НАНОРАЗМЕРНЫЕ БИОКОМПОЗИТЫ Ca10(PO4)6(OH)2 /КАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗА ДЛЯ КОСТНЫХ ИМПЛАНТАТОВ В.Т. Калинников, Н.А. Захаров, Ж.А. Ежова, Е.М. Коваль Институт общей и неорганической химии имени Н.С. Курнакова Разработка материалов для костного протезирования является актуальной задачей медицинского материаловедения. Сравнительно недавно появились сообщения об использовании в качестве имплантационного материала наночастиц (НЧ) Ca10(PO4)6(OH)2 (ГА). Ультрадисперсная структура и высокая удельная поверхность НЧ ГА обеспечивают важные преимущества 122 для их взаимодействия с клетками живого организма, создавая уникальные возможности лечения ряда сложных дефектов костных тканей. Улучшению растворимости ГА способствует использование в качестве имплантатов органоминеральных композитов (ОМК) на основе НЧ ГА и натуральных либо синтетических полимеров. Особый интерес вызывают ОМК на основе органических полимеров – полисахаридов. Это связано с биосовместимостью, биорастворимостью, пластичностью и способностью к адгезии последних, а также с рядом их уникальных характеристик (способность устанавливать связи с хрящевой тканью, возможностью создавать на их основе ОМК с регулируемой растворимостью ГА в плазме крови). Задачи исследования включали: – изучение влияния природного полимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) [С6Н7О2(ОН)3х(ОСН2СООН)х]n, x = 0,08 – 1,5 [11] на образование ГА в ходе его осаждения из водного раствора и моделирование процесса остеогенеза in vitro; – исследование воздействия условий синтеза и последующей обработки синтезированных ОМК на их основные физико-химические характеристики; – оценку перспектив использования полученных биосовместимых материалов в медицинской практике. Синтез ОМК на основе ГА и КМЦ проводили осаждением из водного раствора (14 суток при комнатной температуре и постоянном перемешивании), содержащего СаCl2, водный раствор аммиака, КМЦ, (NH4)2HPO4 при рН=10, отношении Са2+/РО43- = 1,67, концентрациях (NH4)2HPO4 и КМЦ в исходном растворе 0,05 мол/л и 0,05 % соответственно. Отжиг в течение 2 ч порошкообразных образцов проходил на воздухе (1000 0С). Синтезированные продукты идентифицировали методами рентгеновской дифрактометрии, термогравиметрии, ИК спектроскопии и электронной микроскопии. Показано, что разработанная методика позволяет получать органоминеральные нанокомпозиты ГА/КМЦ с размерами частиц ГА ~14 нм (табл.). Использованный подход позволит решить ряд важных задач, связанных с применением нанокристаллического ГА в имплантологии: – увеличивая эффективность имплантата за счет повышения растворимости ГА; – уменьшая вероятности миграции ГА в окружающие ткани за счет связи НЧ ГА с макромолекулами КМЦ; – повышая прочностные характеристики имплантатов на основе ОМК, сопоставимые с прочностью керамики; 123 – открывая широкие возможности использования распространенных натуральных полисахаридов в качестве лекарственных препаратов для передовых медицинских технологий. Исследования проводились при финансовой поддержке программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине». 124 Таблица Остаточные концентрации, рН и состав твердых фаз в системе СаCl2-(NH4)2HPO4-C8H11O7Na-NH3-H2O (25 0C)* n1 n2 pH 1,5 1,67 1,67 1,67 1,67 1,67 1,67 0,04 0,02 0,04 0,08 0,02 0,04 0,08 7,5 10 10 9,7 10 10 9,6 Найдено в растворе, г-ион/л·103 Са2+ РО430,2 0,2 0,3 0,5 0,2 0,4 0,5 1,6 Отсутствует То же - Рассчитано в твердой фазе, n3 1,55 1,666 1,664 1,66 1,666 1,662 1,66 Состав твердой фазы Фаза переменного состава Ca10(PO4)6(OH)20,1C8H11O7Na9H2O Ca10(PO4)6(OH)20,2C8H11O7Na9H2O Ca10(PO4)6(OH)20,5C8H11O7Na9H2O Ca10(PO4)6(OH)20,1C8H11O7Na6H2O Ca10(PO4)6(OH)20,2C8H11O7Na6H2O Ca10(PO4)6(OH)20,5C8H11O7Na12H2O Обозначение композита ** I K1 I K2 I K3 II K1 II K2 II K3 В исходных смесях: (NH4)2HPO4 – 0,05 моль/л; n1=CaCl2/(NH4)2HPO4; n2= C8H11O7Na/(NH4)2HPO4. В твердых фазах: n3=Ca2+/PO43-. **I – низковязкая КМЦ; II – высоковязкая КМЦ. * ПОЛИСАХАРИДОВ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК КОЖИ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ТРАНСПЛАНТАЦИИ НА РАНЕВУЮ ПОВЕРХНОСТЬ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ ТЕХНОЛОГИЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ Е.Ф. Панарин1), Л.А.Нудьга1), В.А.Петрова1), Г.М. Михайлов1), М.Ф. Лебедева1), А.Д. Вилесов1), А.М. Бочек1), С.А. Волков2), Г.П.Пинаев3), М.И.Блинова3), Н.М.Юдинцева3) 1) Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт-Петербург 2) Санкт-Петербургский государственный университет информационных технологий, механики и оптики 3) Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Предварительные исследования по созданию матричных материалов для культивирования клеток кожи человека на основе природных полисахаридов – хитина и хитозана – показали перспективность использования полисахаридов в виде пленочных и тканых материалов. Исследования были продолжены в направлении создания композиционных пленок и рассасывающихся тканых матричных материалов на основе указанных полимеров. При формовании пленок в качестве модифицирующих полимеров были использованы нетоксичные полимеры, широко используемые в медицине: поливиниловый спирт (ПВС), целлюлоза и специально подготовленный коллаген. К растворам хитина в диметилацетамиде с 5 % хлорида лития добавляли растворы ПВС и целлюлозы в этом же растворителе; коллаген вводили в раствор хитозана в 2 %-ной уксусной кислоте. Пленки из композиций на основе хитина формовали сухомокрым способом, отмывали от хлорида лития и хранили в 50 %-ном водном растворе этанола. Пленки на основе хитозана формовали сухим способом и прогревали при 120 0С. Тестирование показало, что введение в хитин ПВС и целлюлозы приводит к ухудшению условий роста клеток на композиционных пленках – наблюдалась лишь частичная адгезия фибробластов и отсутствие образования монослоя. Введение коллагена в хитозан, наоборот, приводит к улучшению адгезии и пролиферации клеток, которые зависят от количества коллагена в композиционной пленке. При посеве нормальных дермальных фибробластов кожи человека на образцы композиционных пленок хитозана с коллагеном (5 и 10 %) через сутки наблюдалась адгезия клеток на поверхности пленок и нормальная морфология клеток, сопоставимая с контролем. Через 6 суток клетки сформировали монослой. На пленке с 2,5 % коллагена закрепилось меньшее количество клеток, чем в предыдущих вариантах и контроле, но они сохранили нормальную морфологию и жизнеспособность. Лучшие результаты по культивированию фибробластов были получены на пленочных хитозановых матрицах, содержащих коллаген. Для лучшего обеспечения клеток питательными веществами, миграции их с матрицы на раневую поверхность и уменьшения площади резорбируемой матрицы при перенесении на рану слоя клеток, выросших на ней, проведено с помощью лазерного излучения перфорирование композиционных хитозановых пленок, содержащих коллаген. Благодаря порам может облегчаться миграция клеток с матрицы на раневую поверхность, т.е. Трансплантированные клетки могут мигрировать не только с краев матрицы, но и через поры по всей ее поверхности, не дожидаясь полной резорбции. На перфорированном образце пленки клетки адгезировали и росли на самой пленке между порами, но они не смогли преодолеть края пор и закрыть их («перекинуться через них»), чтобы образовался сплошной монослой. В этом направлении необходимы дальнейшие исследования с целью совершенствования технологии перфорирования пленок для получения пор с ровными и гладкими краями. Для проведения экспериментов по культивированию фибробластов на матрице, сотканной из волокон полимера, методом ручного ткачества была изготовлена ткань из некрученых нитей на основе хитина. Волокна были закреплены по краям образцов прядильным раствором хитина, из которого были сформованы и сами волокна. Матрицы подвергали поверхностной модификации, изменяя степень дезацетилирования хитиновых волокон. До начала культивирования клеток образцы были простерилизованы путем автоклавирования, затем предварительно выдерживались в питательной среде в течение 5 суток с ежедневной ее заменой. После такой подготовки на образцы высевали нормальные дермальные фибробласты кожи человека. Для культивирования клеток использовали питательную среду DMEM (фирмы ICN) с добавлением фетальной сыворотки коров (фирмы HyClone). Поскольку тканые матрицы непрозрачны, состояние культивируемых на них клеток оценивали с помощью сканирующей микроскопии. Результаты тестирования образцов показали, что фибробласты образуют на волокнах оболочку толщиной от 2 до 5 мкм. В ряде случаев оболочки срастаются, а между волокнами формируются тяжи из фибробластов. По мере увеличения степени дезацетилирования матричных волокон на соответствующих образцах отмечаются образования, которые могут быть погибшими клетками или сорбированными белками жизнедеятельности клеток. Полученные результаты позволяют сделать положительное заключение о возможности культивирования фибробластов на композиционных хитозановых пленках и тканых матрицах из хитиновых волокон с модифицированной поверхностью. 2 ПОСЛОЙНЫЙ ЛАЗЕРНЫЙ СИНТЕЗ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИМПЛАНТАТОВ НА ОСНОВЕ ТИТАНА И НИКЕЛИДА ТИТАНА А.Л. Петров1), И.М. Байриков3), М.В. Кузнецов2), Ю.Г. Морозов2), С.В. Фокеев3), И.В.Шишковский1), В.И. Щербаков1) Самарский филиал Физического института им. П.Н. Лебедева РАН, Самара 2) Институт структурной макрокинетики и проблем материаловедения РАН, Черноголовка 3) Самарский государственный медицинский университет, Самара 1) Разработка биосовместимых материалов и способов создания на их основе функциональных имплантатов, сочетающих в себе такие свойства, как прочность, пластичность, быстроту изготовления и точность воспроизведения строго индивидуальной для каждого человека формы, является приоритетным направлением современного материаловедения. Типы костей в человеческом теле отличаются своим строением, поэтому довольно проблематично получить прочность фиксации, надеясь только на биологическую имплантацию. Однако имплантаты можно формировать с внутренней заранее смоделированной на компьютере структурой, которая может подражать естественно встречающимся биологическим структурам. Например, нитинол, имеет даже в пористом состоянии высокую удельную прочность, коррозионную стойкость и, кроме того, уникальный эффект памяти формы. И хотя огромное большинство имплантатов (в основном на базе сплавов титана) было уже создано при использовании традиционных производственных методов порошковой металлургии, их механические и биологические характеристики нельзя считать оптимальными, и существует очевидная потребность в новых производственных процессах. Коллектив Самарского отделения ФИАН проводит исследования по быстрому прототипированию трехмерных изделий с помощью селективного лазерного спекания (СЛС) с 1993 года. Образцы никелида титана точно установленной формы были впервые в мире синтезированы нами путем оригинальной комбинации СЛС и саморапространяющегося высокотемпературного синтеза. Послойное СЛС композиции из порошков титана и никеля с добавкой гидроксиаппатита было дополнено изучением структуро- и фазообразования в этой системе, а также физических, механических и химических свойств конечных продуктов (в кооперации с ИСМАН). Была также показана возможность послойного лазерного синтеза пористых имплантатов как из порошка чистого титана (возможна добавка гидроксиаппатита), так и из готового никелида титана. Экспериментально были исследованы макро- и микроструктура, фазовый 3 состав продуктов спекания, плотность, влагопоглощение, открытая пористость и коррозийное поведение трехмерных образцов, синтезируемых образцов. Спеченные изделия показали следующие характеристики: пористость (до 40 %), типичный размер структуры ~2–2.5 мм, низкую плотность ~3.3–4.1 г/см3 (которая сопоставима с плотностью кости) и высокую стойкость к кислотным и щелочным средам [1]. В сотрудничестве с СамГМУ подготовлена и вживлена экспериментальная партия синтезированных путем СЛС имплантатов на основе титана и никелида титана для изучения условий их биосовместимости. Литература 1. Шишковский И. В. Селективное лазерное спекание и синтез функциональных структур. Автореф. дис. д.ф.-м.н. Институт структурной макрокинетики и проблем материаловедения РАН, Моск. обл., г. Черноголовка, 2005, 38 с. НАПРАВЛЕННАЯ ВНУТРИЯДЕРНАЯ ДОСТАВКА АЛЬФАЭМИТТЕРОВ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ИХ ПРОТИВОРАКОВОГО ДЕЙСТВИЯ А.С. Соболев1), А.А. Розенкранц1), В.Г. Лунин1), Р.А. Алиев2), Д.А. Царев2), И.Г. Тананаев3), Б.Ф. Мясоедов3) 1) Институт биологии гена РАН, 2)НИИ ядерной физики им. Д.В. Скобельцына МГУ, 3)Институт геохимии и аналитической химии им. В.И.Вернадского РАН Возникновение и постоянный рост интереса к испускающим альфачастицы радионуклидам (альфа-эмиттерам (АЭ)), наблюдаемый в последнее десятилетие в мире, обусловлен рядом их свойств, выгодно отличающих их от других противоопухолевых препаратов. Считается, что наибольший интерес для терапии рака представляют такие АЭ, как 211At и 225 Ac. Все используемые в настоящее время варианты доставки АЭ позволяют специфически доставить их, в лучшем случае, к поверхности клетки-мишени. Однако давно известно, что самым уязвимым местом для действия -частиц является клеточное ядро. Поэтому не всякая -частица от АЭ, доставленных к поверхности клетки-мишени (например, с помощью специфических антител), будет столь же эффективна, как каждая -частица, испущенная радионуклидом в ядре клетки. Один из перспективных АЭ, 225Aс, является материнским нуклидом для трех дочерних АЭ: 221Fr, 217At и 213Bi с периодами полураспада 4,9 мин, 32 мс и 45,6 мин соответственно. Если 225Aс доставлять лишь к поверхности клетки-мишени, то трудно надеяться на специфическое воздействие всеми четырьмя АЭ только на эти клетки: поток межклеточной жидкости может перенести дочерние нуклиды к другим, в т.ч. нормальным клеткам. Мы 4 полагаем, что доставка 225Aс в ядра клеток-мишеней будет способствовать 1) увеличению специфичности действия этого АЭ и его дочерних радионуклидов и 2) увеличению эффективности эндорадиотерапии за счет использования всех четырех АЭ. В рамках проекта 225Ac (период полураспада Т1/2=10 сут) выделяется из генераторного раствора из материнского изотопа 229Th. В качестве основного метода получения очищенных концентрированных растворов 225 Ac в работе предполагается использовать высокоскоростной ионный обмен. Хроматографическое разделение Th, Ra и Ас основано на комбинации комплексообразующих свойств этих элементов и различия их коэффициентов распределения между ионообменниками и растворами минеральных кислот. В работе был проведен систематический экспериментальный поиск наиболее эффективных сорбентов для извлечения актиния и весьма актуальным оказалось использование волокнистых сорбентов нового поколения типа КУ-2, представляющие собой волокно из пористого полиакрилонитрила, наполненное в процессе формования тонкодисперсным комплексообразующим сорбентом, лишены многих из этих недостатков. Результаты пока носят оценочный характер, но будут уточнены по установлению генератора на основе тория-229. Астат-211 (Т1/2=7,2 ч) получали на 120-см циклотроне по реакции 209 Bi(α,2n)211At, при этом особое внимание было обращено на изотопную чистоту, так как в побочной реакции 209Bi(α,3n)210At образующийся 210At дает дочерний очень токсичный 210Po. Для этого была подобрана толщина алюминиевого экрана перед висмутовой мишенью, при которой астат-210 не обнаруживался. Астат-211 выделяли сухой отгонкой из облученной альфа(~30 МэВ) Bi-мишени. Модульный рекомбинантный транспортер (МРТ) для внутриядерной доставки АЭ НМР-(СЯЛ SV40)-ДТокс-ЭФР (Mr=75,117 кД) был получен в E. coli путем индуцибельной экспрессии соответствующих химерных генов, выделен и очищен при помощи адсорбционной хроматографии. МРТ включает в себя последовательности: 1) эпидермального фактора роста человека (ЭФР), связывающегося с интернализуемыми клеточными рецепторами, сверхэкспрессированными на клетках-мишенях; 2) транслокационного домена дифтерийного токсина (ДТокс), обеспечивающего выход конструкции из замкнутых закисляемых внутриклеточных компартментов; 3) сигнала ядерной локализации большого Т-антигена вируса SV-40 (СЯЛ SV40), а также 4) бактериального гемоглобиноподобного белка (НМР), служащего носителем для АЭ. Все модули этого МРТ оказались функциональными, т.е. соответствующий модуль 1) связывался с высоким сродством с рецептором ЭФР человека (модуль с ЭФР), 2) обладал мембранолитическим действием при рН эндосом (модуль с ДТокс) и 3) 5 взаимодействовал с альфа/бета-импортиновым димером, обеспечивающим транспорт в ядро (модуль с СЯЛ SV40). МРТ эффективно накапливался в ядрах раковых клеток-мишеней, таким образом демонстрируя свою пригодность для внутриядерной доставки АЭ. Была отработана методика астатинирования этого МРТ с помощью Nоксисукцинимидного эфира 3-211At-астатобензойной кислоты и последующей очистки полученного 211At-МРТ. Предварительные опыты на клетках эпидермоидной карциномы человека А431 со сверхэкспрессированными рецепторами к ЭФР показали, что 211At, доставляемый в ядра этих клеток с помощью МРТ (211At-МРТ), в несколько десятков раз более эффективен, чем свободный 211At. 6 3.2. Приборы АППАРАТУРНО-ПРОГРАММНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВНЕШНЕГО ДЫХАНИЯ И ФИЗИЧЕСКОЙ РАБОТОСПОСОБНОСТИ ЧЕЛОВЕКА Ю.Я. Кисляков 1), Л.П. Кислякова 1), В.М.Михайлов 2), И.А. Полукаров 2) 1) Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург 2) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем, Москва Возможность массового контроля основных показателей системы дыхания, характеризующих особенности ее морфологии, биомеханики, легочной вентиляции, газообмена и аэробного энергообмена во многом определяет эффективность диагностики и прогноза состояния здоровья и работоспособности человека. Цель проекта – разработка на основе современной методологии, микроэлектронных и информационных технологий аппаратурно-программного комплекса, повышающего информативность и производительность методов измерений этих показателей. Основными задачами работ в 2005 году явились: а) разработка макета комплекса; б) его медико-технические исследования; в) разработка документации на технологические опытно-конструкторские работы по созданию прототипа комплекса. Разработанный макет комплекса представляет собой компьютеризированную диагностическую систему модульного типа для одновременной регистрации давления, скоростных и объемных характеристик вдоха и выдоха, а также содержания респираторных газов (О2 и СО2) в потоках вдыхаемого и выдыхаемого воздуха, на основе которых рассчитываются показатели состояния систем аэробного энергообмена и внешнего дыхания. Он состоит из трех измерительных (параметров дыхания, содержания О2 и СО2) модулей, микропроцессорного модуля управления, модуля компьютерного анализа и блока пробоподготовки. Измерительные модули связаны с микроконтроллером модуля управления, организующим процессы регистрации исследуемых параметров и передачи информации в компьютер. Модуль измерений параметров дыхания обеспечивает непрерывную регистрацию характеристик давления, потока и объема вдыхаемого и выдыхаемого воздуха с помощью высокочувствительного тензометрического датчика. Модули аналитического контроля содержания О2 (метод амперометрии, миниатюрный быстродействующий мембранный О2-электрод) и СО2 (метод молекулярной корреляционной спектроскопии в инфракрасном диапазоне на основе полупроводниковых лазерных технологий) осуществляют непрерывные высокоточные 7 измерения содержания этих газов в потоках воздуха. Блок пробоподготовки состоит из термостатируемой проточной ячейки с встроенными сенсорами механики потоков и газового анализа и устройства автоматической подачи проб воздуха. Модуль компьютерного анализа обеспечивает калибровку, измерение и расчет исследуемых показателей, контроль качества измерений, вычисления показателей внешнего дыхания, физической работоспособности и состояния здоровья испытуемого. Проведенный анализ ранее выполненных методических и технологических исследований, вариантов технических решений по созданию комплекса, позволил достичь высоких аналитических характеристик макета. Это обусловлено применением при его разработке отечественных электронных микрочипов, позволяющих с погрешностью +0.1 % измерять токи от 10-14 до 10-7 А; высокоэффективных светоизлучающих лазерных диодов в области 4.26 мкм и фотодетекторов с высокой чувствительностью в этой области спектра. Основные технические характеристики модулей. Диапазон нормируемых измерений содержания О2 и СО2 в газовых смесях 0–200 и 0–100 мм рт.ст. (0–30 и 0–20 об %) соответственно. Предел абсолютной погрешности измерений температуры в диапазоне 20–40 0С составляет +0.1 0С; атмосферного давления в диапазоне 630–800 мм рт.ст. – +0.5 мм рт.ст. Основные характеристики измерительных модулей макета определены в медико-физиологических исследованиях. Первая серия посвящена измерениям параметров механики дыхания на специальном калибровочном стенде, имитирующем газовые потоки при вдохе и выдохе. Показано, что абсолютная погрешность измерений объемной скорости выдоха в диапазоне 0.2–10 л/с составляет не более +2 %. Вторая серия заключалась в измерениях содержания О2 и СО2 в стандартных статических калибровочных газовых смесях (содержание О2 в диапазоне – 200, а СО2 в диапазоне 0–150 мм рт.ст.). Показано, что абсолютная погрешность измерений для О2 составляет не более +0.3 и для СО2 – +0.4 мм рт.ст. Третья серия измерений содержания О2 и СО2 в потоковых калибровочных смесях и смесях, имитирующих их содержание в выдыхаемом воздухе, показала, что абсолютная погрешность измерений составляет для О2 и СО2 не более +0.4 и +0.5 мм рт.ст. соответственно. На этапе технологических ОКР планируется расширение нормируемого диапазона измерений содержания О2 и СО2. Результаты свидетельствуют о высоком качестве измерений и универсальности комплекса. На их основе разработаны медико-технические требования и техническое задание на технологические опытно-конструкторские работы. Полная реализация проекта позволит разработать высокоинформативный, надежный и простой в эксплуатации, высокопроизводительный, относительно дешевый аппаратурный 8 комплекс для экспрессного контроля функции внешнего дыхания, энергообмена и физической работоспособности человека. По своим техническим характеристикам он будет соответствовать лучшим зарубежным аналогам, а по функциональным и экономическим показателям превосходить их. Комплекс является базовым инструментальным и методическим звеном системы тестирования состояния здоровья людей разного пола и возраста в нормальных и экстремальных условиях. Практически все больницы, поликлиники, спортивные, военные и оздоровительные учреждения остро нуждаются в таких комплексах. НОВЫЙ ПРИБОР ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ГЛИКЕМИИ Х.А. Курданов1), А.Д. Эльбаев1), Л.М. Батырбекова1), М.Х. Курданова1), Р.А. Перковский2) Центр медико-экологических исследований – Филиал Государственного научного центра РФ – Института медикобиологических проблем РАН, Нальчик, Россия 2) Московский государственный технический университет им. М. Баумана, Москва 1) Совершенствование методов оперативного контроля уровня гликемии, которая является основным информативным показателем сахарного диабета, активно ведется в нашей стране и за рубежом. В настоящее время получили распространение индивидуальные глюкометры (например, фирм One Touch, Life Scan, Roche Diagnostics, Bayer, Medic Sense/Abbot и др.). Их недостатком является инвазивный принцип анализа крови, все они работают совместно с тест-полосоками, что вызывает у пациентов боль и дискомфорт, сопровождается опасностью занесения инфекций. По имеющимся у нас сведениям, надежный неинвазивный глюкометр к настоящему времени не создан. Цель проекта – разработка нового портативного автоматического прибора для неинвазивной диагностики уровня гликемии. Принцип неинвазивной диагностики гликемии основан на использовании закономерностей корреляционной связи показателей системной гемодинамики и уровня глюкозы в крови в соответствии с патентом РФ на изобретение «Способ определения концентрации глюкозы в крови» (№ 2198586, приоритет 21.11.2000) /Эльбаев А.Д., Акаева С.А., Курданов Х.А./. Составлена компьютерная программа «Диагностика гликемии» для расчета концентрации глюкозы в крови. 9 Разработана конструкция прибора «Омелон». Прибор содержит электронное автоматическое устройство (тонометр) для определения артериального давления компрессионным методом. В качестве информативного признака для измерения максимального (систолического) АД и минимального (диастолического) АД используются параметры пульсовой волны. Микропроцессор содержит программное обеспечение на языке DELPHI 5 OBJECT PASKAL для расчета содержания глюкозы в крови. Соотношения значений систолического и диастолического АД являются исходными данными алгоритма вычисления концентрации глюкозы в крови в соответствии с программой «Диагностика гликемии». Вначале с помощью автоматического тонометра измеряют показатели систолического и диастолического АД на левой руке (мм рт.ст.). Эти показатели высвечиваются на дисплее прибора, запоминаются и передаются в программу «Диагностика гликемии», которая встроена в блок микропроцессора. Затем измеряют показатели систолического и диастолического АД на правой руке (мм рт.ст.), которые также высвечиваются на дисплее, запоминаются и передаются в программу «Диагностика гликемии». После измерения АД на обеих руках автоматически запускается алгоритм определения содержание глюкозы в крови. Расчет уровня глюкозы осуществляется по четырем параметрам АД, поэтому программа не будет работать после измерения АД только на одной руке. Выходные данные прибора (показатели АД и уровень глюкозы крови) представляются в цифровом виде на индикаторе прибора. Нажатием кнопок управления на клавиатуре прибора переключаются показания на дисплее: отображение артериального давления, отображение содержания глюкозы крови в ммоль/л, отображение содержания глюкозы крови в мг/дл. Прибор работает от внутреннего источника питания – аккумуляторной батареи напряжением 4,8 В. Диапазон измеряемого уровня глюкозы крови – от 3 до 20 ммоль/л (от 36 до 364 мг/дл). Погрешность расчета в сравнении с биохимическим анализом составляет ±9–10 % при точности измерения АД ±2 мм рт.ст. Прорабатывается возможность распечатки результатов измерения и подключения прибора к ЭВМ. Прибор комплектуется манжетой, изготовленной в соответствии с ГОСТ 6915-89. В конструкции прибора предусмотрена индикация ошибок в процессе измерения АД. Для предотвращения избыточного давления в манжете производится программная остановка нагнетания при достижении требуемого давления. Технические характеристики прибора определены в соответствии с требованиям ГОСТ Р 50444-92, ГОСТ 28703-90. Манометр и пневматическая система, входящие в состав прибора, выбраны в соответствии ГОСТ 6915-89. Условия эксплуатации прибора – в закрытом 10 помещении и на открытом воздухе. Вид климатического исполнения – УХЛ 4.2 по ГОСТ 15150-80. По устойчивости к механическим воздействиям прибор соответствует требованиям ГОСТ Р 50444-92. При выполнении режимов и условий эксплуатации прибор обеспечивает средний срок службы 5 лет (без учета пневмокамер). Средний срок службы пневмокамер – 3 года. Критерием предельного состояния прибора является нецелесообразность его дальнейшего восстановления при затратах на ремонт более 60 % первоначальной стоимости. Изготовлен опытный образец прибора "ОМЕЛОН-1". Подана заявка на патент РФ "Портативный прибор для определения концентрации глюкозы в крови" (№ 2004136942 от 16.12.2004) /Эльбаев А.Д., Эльбаева Р.И., Курданов Х.А., Перковский Р.А./. Область применения прибора – для индивидуального пользования, а также для врачебного контроля в поликлиниках и отделениях лечебных учреждений. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВНУТРИТКАНЕВОЙ ЛАЗЕРНОЙ КОАГУЛЯЦИИ ИЗЛУЧЕНИЕМ ТВЕРДОТЕЛЬНОГО ЛАЗЕРА В ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКОМ РЕЖИМЕ ГЕНЕРАЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЛОКАЛИЗОВАННЫХ ОПУХОЛЕЙ ПОЧКИ И ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Р.В. Серов1), В.А. Голубева2), А.В. Иванов2), С.В. Зонтов2), Д.Г. Кочиев1), А.В. Лукин3), А.В. Теодорович3) Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва Институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей, Москва 3) Кафедра эндоскопической урологии РМАПО, Москва 1) 2) Для больных раком почки и простаты надежда на излечение связана, прежде всего, с радикальными методами лечения – радикальным удалением органа (нефрэктомия, простатэктомия). В ряде случаев больные не могут перенести эти операции из-за их высокой травматичности, необходимости интубационного наркоза и возможной кровопотери. Кроме того, в случае единственно функционирующей почки радикальный метод лечения невозможен. Предлагаемый к разработке метод лазерной внутритканевой коагуляции для лечения локализованных опухолей почки и предстательной железы позволяет воздействовать на опухоль через пункционный доступ при наведении ультразвуковыми методами или с 11 помощью компьютерной томографии. Доставка излучения и коагуляция тканей опухоли осуществляется волоконным катетером. В отличие от методов интерстициальной термотерапии воздействие осуществляется через волоконный катетер с прямым выводом излучения, а длительность воздействия в одном подходе не превышает 10 с. Целью работы являлось определение необходимых параметров излучения скальпеля-коагулятора лазерного хирургического комплекса «Лазурит», доз воздействия, размеров области коагуляции и характера повреждения тканей. Определение оптимальных параметров и режима воздействия проводилось в условиях in vivo в клинике на экспериментальных животных – собаках. Выбор режима воздействия на ткани осуществлялся в серии на четырех экспериментальных животных на основе анализа изменений в тканях через трое суток после воздействия. Установленный для тканей почки и предстательной железы режим воздействия (длительность – 10 с, выходная мощность лазерного излучения – 20 Вт, частота повторения импульсов – 100 Гц) проверен на повторной серии из четырех экспериментальных животных. Получена динамика процессов заживления и изменения в тканях при морфологическом исследовании препаратов сразу после воздействия, а также через 3, 7 и 14 сут. При общей дозе воздействия 200 Дж область коагуляции в тканях почки имела овальную форму, имеющую следующие размеры: до 15 мм в длину, вдоль канала ввода волокна, и до 7 мм – в диаметре поперечного сечения. Сразу после воздействия в разрезе почки макроскопически определяется утолщение капсулы почки и сформированный узкий канал, заканчивающийся в глубине паренхимы почки полостью, заполненной кровянистой жидкостью. Морфологическое исследование показало, что в зоне поражения развиваются деструктивные изменения с убыванием поражения в сторону здоровой ткани и расширением их в глубине раны с формированием обширной полости, заполненной жидкостью с элементами крови на границе коркового и мозгового слоев. Тканевые структуры, окружающие полость, некротизированы на глубину до 3 мм. Строма отечная с кровоизлияниями и небольшими лейкоцитарными инфильтратами. Через трое суток под капсулой почки и в верхних слоях коркового вещества в зоне ввода волокна наблюдаются признаки регенерации, выражающиеся в разрастании молодой соединительной ткани. Одновременно с этими процессами в глубоких слоях раны (в зоне полости) сохраняются участки с некротическими и дистрофическими изменениями тканевых структур. В строме появляются мелкие скопления фибробластов, характерные для начала регенерации. Вокруг зоны повреждения в строме сохранной ткани органа выявляются очаговые 12 инфильтраты из лимфоидных и плазматических клеток, характеризующие иммунный ответ на лазерное повреждение. Аналогичные изменения наблюдаются и в ткани предстательной железы. Область изменения ткани имеет вид сферической полости размером до 15 мм в диаметре, окруженной 2-3 мм полоской некротизированной ткани, за которой располагается отечная строма, инфильтрированная нейтрофильными лейкоцитами и содержащая молодые фибробласты. Здесь же имеются железистые структуры с активной пролиферацией эпителиальных клеток, что свидетельствует о начале активной репаративной регенерации ткани предстательной железы. Предварительные результаты анализа изменений в тканях после оказанного воздействия дают основания для разработки клинических методик лечения новообразований почки и предстательной железы. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ФОРМИРОВАНИЯ ГЛУБОКИХ ЛАЗЕРНЫХ КАНАЛОВ В БИОТКАНЯХ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ФУНКЦИЙ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ЧЕЛОВЕКА В.Я.Панченко1), И.И.Беришвили2), В.В.Васильцов1), А.К.Дмитриев1), В.И.Денисенко3), В.Г.Полушкин4), В.А. Ульянов1) Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, Троицк, 2) Научный центр сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н.Бакулева, Москва 3) Больница РАН, Троицк 4) Инженерный центр новых технологий ИЯИ РАН, Троицк 1) Тенденцией последнего десятилетия является применение в медицинской практике высокоинтенсивного лазерного излучения для стимуляции восстановления кровоснабжения тканей, структуры и функций жизненно важных органов человека методом создания в тканях глубоких лазерных каналов. Процесс формирования глубокого канала под действием высокоинтенсивного лазерного излучения сопровождается разрушением ткани в области воздействия (лазерная рана), тепловым (термический некроз ткани и неповреждающее тепловое воздействие) и механическим (в результате генерации ударных волн при воздействии лазерных импульсов) повреждением окружающих канал тканей. Предполагается, что эти эффекты оказывают стимулирующее воздействие для восстановления функций тканей и органов человека. Такой подход, в частности, позволил разработать принципиально новый метод лечения ишемической болезни сердца – метод лазерной реваскуляризации миокарда, в процессе которой в сердечной мышце с помощью мощного 13 лазерного излучения создаются глубокие (до 20-25 мм) каналы. Установлено, что такого рода лазерное воздействие стимулирует рост новых микрососудов в пораженной области миокарда. Наряду с лазерной реваскуляризацией миокарда, создание глубоких лазерных каналов в тканях является перспективным методом стимуляции процессов: а) регенерации патологически измененных тканей печени в результате цирроза; б) восстановления кровоснабжения ишемизированных мышц нижних конечностей человека; в) направленной регенерации участков костной ткани. В данной работе представлены результаты исследований по формированию глубоких лазерных каналов в сердечной мышце и в печени in vitro. Использовалось импульсное лазерное излучение с длиной волны 2.94 и 10.6 мкм, что позволяло варьировать в широких пределах степень теплового воздействия на окружающие канал ткани (вплоть до его отсутствия) и степень механического повреждения тканей в результате ударно-волнового действия лазерного импульса (от воздействия на клеточном уровне до разрывов стенок канала). На основании клинических данных обсуждается механизм положительного эффекта лазерной реваскуляризации миокарда. Представлены результаты разработки и создания мощных импульсных СО2 лазера серии «Перфокор» и Er:YAG лазера для формирования глубоких лазерных каналов в биотканях. АДАПТИВНАЯ УПРАВЛЯЮЩАЯ СИСТЕМА ДЛЯ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПРОТЕЗА ВЕРХНЕЙ КОНЕЧНОСТИ НА ОСНОВЕ НОВОГО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОГО БИОНИЧЕСКОГО МЕТОДА АВТОНОМНОГО АДАПТИВНОГО УПРАВЛЕНИЯ А.А. Жданов1), К.К. Щербина2), Г.Н. Буров2), Е.Л. Полян1) Институт системного программирования РАН, Москва 2) Научно-практический центр медико-социальной экспертизы, протезирования и реабилитации инвалидов им. Г.А. Альбрехта Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, Санкт-Петербург 1) Разрабатывается адаптивная система управления для протеза верхней конечности на основе нового бионического метода «автономного адаптивного управления» (ААУ), отличающегося способностью к обучению и переобучению непосредственно в процессе управления, многокритериальностью управления, а также тем, что при создании 14 системы управления не требуется разрабатывать точную математическую модель объекта управления [1]. Последнее обстоятельство особенно существенно для такого сложного объекта, как протез, поскольку многие параметры системы «человек-протез-среда» изменяются малопредсказуемым образом в ходе функционирования и плохо поддаются предварительной формализации. В этих обстоятельствах именно применение системы ААУ может сыграть решающую роль. Мы рассматриваем конечность здорового человека как сложный орган, содержащий в себе определенное множество сенсоров и информационных каналов передачи управляющей информации от нервной системы к исполнительным органам и обратно в нервную систему для обеспечения обратных связей, и совокупности исполнительных органов, имеющих свою определенную структуру и свойства. У здорового человека нервная система в процессе филогенетического и онтогенетического развития приспособлена к управлению этой подсистемой (конечностью). При утере части конечности и замене ее протезом, даже весьма сложным по составу сенсорных элементов и исполнительных устройств, выпадает большая часть таких исполнительных органов и информационных каналов. При этом возникает задача организации правильной передаточной функции от той части живого органа, которая остается у инвалида и через которую он передает управляющие команды, к исполнительным органам протеза. Эта задача крайне сложна по той причине, что в ней все функциональные зависимости и их параметры очень индивидуальны и весьма трудно формализуемы. С помощью механики можно обеспечить выполнение только сравнительно простых передаточных функций с ручной настройкой параметров. Однако даже при использовании встроенного в протез микропроцессора, в память которого можно было бы записать самую сложную передаточную функцию, последнюю очень трудно сформулировать и настроить заранее. Причины те же – в таком передаточном звене, как протез, очень много параметров, зависящих от индивидуальных особенностей инвалида. А именно, заранее неизвестно, какие «выходные сигналы» инвалида можно использовать в качестве управляющих, как их интерпретировать, как выполнить желаемое инвалидом движение протеза с учетом индивидуальных особенностей протеза и поврежденной конечности и других многочисленных плохопредсказуемых и плохоформализуемых условий. Ситуация осложняется и тем, что даже после настройки такой системы параметры человека со временем начинают изменяться. Мы исходим из убеждения, что ряд указанных проблем удастся преодолеть в результате использования адаптивной системы управления, которая способна эмпирически находить «передаточные функции» и «законы управления» для протеза как объекта управления в заранее 15 плохоформализуемых условиях, и далее корректировать их при изменении свойств человека, протеза или среды. Для построения адаптивной системы управления мы используем метод ААУ, отличающийся от других методов (например, искусственных нейронных сетей, нечетких контроллеров) способностью обучаться и переобучаться непосредственно в процессе использования. К настоящему времени система управления ААУ построена. Разработаны образцы протезов верхней конечности. В рамках проекта проведены эксперименты на компьютерных моделях динамических объектов управления, воспроизводящих некоторые свойства протеза, продемонстрировавшие способность системы к адаптивному управлению при обучении «протеза» движению по указываемой желаемой (опорной) траектории и при отсутствии заранее задаваемой математической модели «протеза». В настоящее время проводятся работы, обеспечивающие соединение управляющей системы с протезом верхней конечности с вычленением плеча. Основные задачи в текущий момент состоят в уточнении целевых функций, критериальных зависимостей, возможностей сенсорной системы (в первую очередь механической, впоследствии – миоэлектрической [2]) и соответствующая доработка управляющей системы. Литература 1. Жданов А.А. Метод автономного адаптивного управления // Известия Академии наук. Теория и системы управления, 1999, № 5. С. 127-134. 2. Гурфинкель В.С., Малкин В.Б., Цетлин М.Л., Шнейдер А.Ю. Биоэлектрическое управление // М.: Наука, 1972. 242 с. 16 3.3. Лекарства ГЕНЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НИТРОЗИЛЬНЫХ [Fe-S] КОМПЛЕКСОВ – НОВОГО КЛАССА ДОНОРОВ ОКСИДА АЗОТА ДЛЯ ТЕРАПИИ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С.М. Алдошин 1), С.В. Васильева 2), Н.А. Санина 1) 1) Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка 2) Институт биохимической физики РАН, Москва Открытие уникальной роли NO как медиатора терапевтического действия ряда жизненно важных препаратов инициировало всестороннее изучение его биологической активности, а в дальнейшем – направленное конструирование новых стабильных кристаллических доноров NO как перспективных лекарственных препаратов для комплексной терапии сосудистых, онкологических и инфекционных заболеваний. Для этих целей нами были впервые синтезированы структурные аналоги природных «депо» NO-активных участков нитрозильных негемовых белков «семейства g=2.03»: тетранитрозильные биядерные комплексы Na2[Fe2(2-S2O3)2(NO)4]∙4H2O (ТНКЖтио) Na2[Fe2S2(NO)4]∙8H2O(КСР),[Fe2(SC2H3N4)2(NO)4]2H2O (ТНКЖатриа), [Fe2(SС3H3N2)2(NO)4] (ТНКЖимидазо) и [Fe2(SC2H3N4)2(NO)4] (ТНКЖтетразо), а также моноядерный комплекс Fe(SC2H3N3)(SC2H2N3)(NO)2]1/2H2O (ДНКЖтриа) и изучены их строение и физико-химические свойства [1-4]. Высокая генетическая активность этих соединений была установлена в экспериментах по индукции экспрессии генов альтернативных ДНКрепарационных систем, выявлении их молекулярно-генетических механизмов и негативной интерференции, зависимости от уровня клеточного железа [5-7]. Изучены механизмы квази- и суперквази- адаптации – теоретически обоснованных и экспериментально доказанных нами фундаментальных процессов репарации ДНК, которые развиваются при трансдукции оксидом азота сигнала резистентности E. coli к алкилирующим соединениям, в т.ч. известным канцеролитикам. Получены свидетельства функциональных преимуществ нитрозирования SH-групп в структуре белка – хемосенсора Ada в сравнении с их алкилированием как начальном этапе осуществления этим белком важнейшей регуляторной функции в ada, alkA, alkB и aidB промоторах. Прямой количественной корреляции между концентрацией NO, генерируемой в растворах кристаллическими донорами (по данным измерительной системы «InNO-T», США), и трансдуцирующей активностью соединений не установлено. Сравнительный анализ генетических характеристик нового явления (включая варианты с использованием хелаторов свободного железа), кинетики выделения донорами свободного NO и данных ЭПР 17 спектроскопии позволяет заключить, что трансдукция генетических сигналов донорами NO опосредована формированием внутриклеточных динитрозильных комплексов железа (ДНКЖ) – экзогенного NO с эндогенными тиолами и свободным железом. Именно ДНКЖ являются интермедиатами взаимодействия доноров NO с клеточными мишенями, включая сенсоры и регуляторы процессов репарации ДНК. На клетках крови млекопитающих и в стандартных модельных системах E. coli и Salmonella typhimurium впервые детально изучены цитои генотоксические (в т.ч. мутагенные) характеристики кристаллических (стабильных) доноров NO – ди- и тетранитрозильных комплексов железа с синтетическими лигандами – в сравнении с ранее изученными комплексами NO с природными лигандами – динитрозильными комплексами железа (ДНКЖ) с глутатионом, цистеином (исходно водные растворы), а также нитрозоглутатионом (GSNO). Выявлены дозовые зависимости цитотоксического и цитостатического действия доноров NO на клетках млекопитающих. Хотя NO прямо не взаимодействует с ДНК, в аэробных условиях он превращается в реакционноспособные соединения оксида азота (ROS), главным из которых является пероксинитрит ONOO-. ONOOпреимущественно окисляет гуанин в 7,8-дигидро-8-оксигуанин с последующей деградацией до 8оксиГ (9) и 8-нитрогуанина, потенциально мутагенных (трансверсии ГЦ–ТА) и летальных повреждений. Репарация 8-нитрогуанина ведет к депуринизации ДНК с формированием апуриновых и апиримидиновых сайтов и далее – к одно- и двунитевым разрывам в ДНК. Используя метод Comet Assay, установлено, что кристаллические доноры оксида азота ТНКЖтио и ТНКЖтетразо в концентрациях, 10-кратно превышающих физиологические, вызывали формирование двунитевых разрывов в ДНК лимфоцитов крови мышей. Позитивная sfiA-индуцирующая активность всех изученных доноров NO как показатель развития мутагенной error-prone SOS-репарации ДНК позволила нам предположить мутагенную активность доноров. В тестах Эймса изученные соединения в диапазоне миллимолярных концентраций проявили мутагенную активность, величина которой зависела от природы лигандов и стабильности комплексов. Наиболее активным был наименее стабильный ДНКЖцис (максимальное превышение His+ ревертантов над контролем – 9 раз). Значительно меньшей мутагенной активностью обладали ТНКЖтио, ДНКЖглу и GSNO. ТНКЖимидазо и ТНКЖтетразо были отнесены к слабым мутагенам, хотя лиганды этих соединений обладают выраженными мутагенными свойствами. Полное отсутствие мутагенной активности установлено для КСР. Предобработка клеток хелатором железа о-фенантрнолином подавляла мутагенную активность всех изученных соединений, включая GSNO, до 18 уровня спонтанного фона. Значительную антимутагенную активность проявил один из витаминов группы Н1. Таким образом, впервые полученные нами результаты об индукции донорами оксида азота структурных и мутационных повреждений в ДНК, с одной стороны, прямо подтверждают позитивную корреляцию между большим количеством NO, выделяемого макрофагами при хронических воспалительных явлениях, и развитием различных форм рака у человека. С другой стороны, выдающаяся канцеролитическая активность соединений любых классов облигатно сопряжена с их генотоксичностью, способностью взаимодействовать с клеточной ДНК. Анализ данных, полученных при проведении фундаментальных исследований нового класса кристаллических доноров оксида азота, стал основанием для передачи этих соединений в ГУРОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина и Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ для предклинических испытаний. Работа выполнена при финансовой поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине». Литература 1. Н. A. Санина, С. M. Aлдошин. Известия Академии наук. Серия химическая, 2004, 11, 2326-2345; 2. N.A. Sanina; O.A. Rakova; S.M. Aldoshin et al. Mendeleev Commun., 2004, 14, 1, 78; 3. N. A. Sanina, S. M. Aldoshin, Т.N. Rudneva et al. Russ. J. of Coordination Chemistry, 31, 2005, 5, 301-306; 4. N.A. Sanina, S. M. Aldoshin, T. N. Rudneva et al. Journal of Molecular Structure, 2005, 752, 1-3, 110-114; 5. С.В. Васильева, М.В. Ступакова, И.И. Лобышева и др. Биохимия. 2001. Т. 6. № 9. С. 1209-1214. 6. С.В. Васильева, Е.Ю. Мошковская, Н.А. Санина и др., Биохимия, 2004, 69, 8, 1088-1095; 7. S.V. Vasil’eva, N.A. Sanina, E.Yu. Moshkovskaya et al. Dokl. Biol. Sciences, 2005, 402, 230-232. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ОБРАЗОВАНИЯ И РАСТВОРЕНИЯ МОЧЕВЫХ КАМНЕЙ IN VITRO И IN VIVO Б.Д.Березин 1), М.Б.Березин 1), А.В.Кустов 1), А.И.Стрельников 2), А.А.Шевырин 2) 2) 1) Институт химии растворов РАН Урологический центр Ивановской государственной медицинской академии 19 Мочекаменная болезнь (МКБ) относится к числу сравнительно опасных и распространенных заболеваний. Основным методом удаления камней из почек является хирургическое вмешательство, нередко сопровождающееся тяжелыми последствиями. Значительно меньше распространен метод дистанционной ударно-волновой литотрипсии (ДУВЛ), также сопровождающийся многочисленными последствиями и осложнениями. Применение этих методов ограничивается после каждого рецидива. На современном этапе биохимии и медицины целесообразно развивать методы консервативного лечения МКБ и профилактику заболевания. Авторы этого сообщения в течение нескольких лет изучали возможности разработки химиотерапевтических методов растворения уже образовавшихся оксалатных и фосфатных камней в почках и мочевых каналах (мочеточник, мочевой пузырь, уретра) однокомпонентными (комплексоны – трилон Б, аминокислоты, ксидифон, цитраты) и многокомпонентными растворами (комплексоны + ДМСО, мочевина, соли тетраалкиламмония, лечебные препараты – уролесан, ксидофон, экстракты лекарственных трав). Результаты этих исследований были отрывочными. В литературных источниках о подобного рода исследованиях не сообщалось. Последнее свидетельствует о том, что в мировой практике таких работ нет. Систематические исследования стали проводиться нами в рамках проекта Программы Президиума РАН. В качестве основных направлений решения изложенной выше проблемы были следующие: 1) Термодинамический расчет равновесий растворения оксалатов кальция в различных комплексонах. 2) Исследование кинетики равновесной растворимости мочевых камней и их синтетических аналогов (в отсутствие органической фазы) в динатрий-этилендиаминтетраацетате (Na2H2Edta) в водном растворе и в многокомпонентных растворах, содержащих вещества, способные воздействовать на растворимость не только СаС2О4 или Са3(РО4)2, но и на органическую фазу мочевых камней. 3) Изучение процесса кристаллизации СаС2О4 и его ингибирование, вплоть до полного подавления, путем введения в водный раствор СаС12 и Н2С2О4 комплексообразующих, сильно сольватирующих добавок биологически активных веществ. Представляют интерес данные по энергетике процесса кристаллизации в различных условиях, кинетике процесса и условиям полного подавления кристаллизации солей Са2+. 4) Изучение действия трилона Б, который стал применяться в большом списке препаратов и материалов бытового и технического назначения, в том числе в медикаментах, на биосистемы животных. 5) Проведение литературной проработки и теоретического обсуждения путей биогенного возникновения Н2С2О4 в процессе обмена органических веществ. Первый автор перенес 6 сеансов ДУВЛ и два рецидива МКБ. 20 В результате этих исследований было установлено, что растворение СаС2О4 термодинамически неблагоприятно. Константа равновесия (Кр) процесса растворения химически чистых кристаллов СаС2О4 в водном трилоне Б, одном из самых сильных комплексонов: СаС2О4 (тв.) + H2Edta2– ↔ СаEdta2– + Н2С2О4 (1) Kp CaEdta H C O K H Edta 2 2 2 2 2 ПРСаС 2 О4 4 y CaEdta2 K дисс. H 2 Edta (2) К дисс. Н 2 С 2 О4 равна 2.3·10 , т.е. очень мала, а растворимость СаС2О4 в водном растворе Na2H2Edta при стандартной температуре составляет 5·10-4 г/л. Сместить равновесие растворения СаС2О4, в том числе и мочевых камней, вправо можно за счет роста сольватирующей способности раствора. С этой целью в состав бинарных и многокомпонентных жидких систем вводили добавки, сильно сольватирующие этилендиаминтетраацетат кальция и щавелевую кислоту и не способствующие их диссоциации на ионы (ДСМО, мочевина, декстрины, соли тетраалкиламмония). Эти добавки сильно разрушают структуру воды, благоприятствуют гидратации продуктов реакции и ингибируют реакции щавелевой кислоты и ее солей с ионами: Са2+: Са2+ + Н2С2О4 → СаС2О4 (тв.) + 2Н+ (3) Результаты исследований, выполненные методами термодинамики растворения, термохимии, визуальной микроскопии, изложенные в серии из трех докладов, а также теоретической обработки литературных данных позволяют надеяться на успешное решение проблемы ингибирования камнебразования в почках и нижних мочевых органах за счет создания растворных композиций из комплексонов и сольватирующих добавок и частичного растворения камней, застрявших в мочеточниках, мочевом пузыре и уретре. -10 Литература 1. Руководство по урологии. Под ред. Н.А.Лопаткина. Т. 2. М.: Медицина, 1998. 764 с. 2. Тиктинский О.Л. Уролитаз. Л.: Медицина, 1980. 192 с. 3. Ормантаев К.С., Чичасова О.Я. Обмен веществ в детском организме. АлмаАта: Казахстан, 1975. 250 с. 21 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НЕТОКСИЧНОГО ЛПС ИЗ RHODOBACTER CAPSULATUS PG (ЛПСRb.caps) НА АКТИВАЦИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЭНДОТОКСИНОВОГО ШОКА. С.В.Грачев 1,2), И.Р.Прохоренко 1), М.Г.Винокуров 2), В.С.Зубова 1), Е.В.Золотущенко 1), С.В.Прохоренко 1,2) 1) Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино 2) Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова В настоящее время cепсис продолжает оставаться одной из актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и стабильно высокой летальности. Активатором патологических процессов при грамотрицательном сепсисе являются компоненты грамотрицательных бактерий – липополисахариды (эндотоксины). Липополисахарид (ЛПС), поступая в кровь из клеточной стенки бактериальных клеток, связывается с ЛПС-связывающим белком (LBP), и затем этот комплекс взаимодействует с CD14 рецептором. Далее образовавшийся комплекс ЛПС-LBP-CD14 взаимодействует с Toll like 4 рецептором. Сборка указанного рецепторного комплекса вызывает активацию путей внутриклеточной сигнализации, приводя к синтезу различных цитокинов. В патогенезе сепсиса важная роль принадлежит нейтрофилам. Целью настоящей работы было исследование действия ЛПС из Rhodobacter capsulatus (ЛПСRb.caps.) подалять активацию нейтрофилов эндотоксинами из Enterobacteriacia и исследовать роль плазмы в этих процессах. Адгезия нейтрофилов к эндотелию сосудов является критической прелюдией к воспалению, опосредованному нейтрофилами. Известно, что эндотоксины влияют на экспрессию 2-интегринов на нейтрофилах. Эксперименты по адгезии нейтрофилов к поверхности были проведены нами на плашках, покрытых фибриногеном, поскольку из литературных данных известно, что связывание нейтрофилов с фибриногеном реализуется через CD11b-рецепторы нейтрофилов. Адгезия нейтрофилов при культивировании в течение 60–120 мин практически не изменялась. Процент живых клеток определяли методом проточной цитометрии. Инкубация культивируемых нейтрофилов в присутствии 100 нг/мл липополисахарида из Salmonella typhimurium (ЛПСS.typh.) и 500 нг/мл ЛПСS.typh. приводила к дозозависомому увеличению величины адгезии этих клеток при увеличении концентрации ЛПСS.typh. Адгезия нейтрофилов при действии ЛПСRb.caps была значительно меньше, чем адгезия в присутствии ЛПСS.typh, и близка к контролю. Предварительное культивирование нейтрофилов в присутствии 100 нг/мл ЛПСRb.caps (60 мин) значительно снижало величину 22 адгезии нейтрофилов при последующем добавлении и культивировании (60 мин) ЛПСS.typh 100 нг/мл и 500 нг/мл по сравнению с адгезией в присутствии только ЛПСS.typh. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что при предварительной инкубации нейтрофилов с ЛПСRb.caps происходит связывание ЛПСRb.caps с CD14 рецепторами, что, в свою очередь, препятствует связыванию ЛПСS.typh с этими рецепторами и снижает экспрессию интегринов в мембране нейтрофилов. В присутствии аутологической плазмы адгезия нейтрофилов увеличивалась по сравнению с адгезией, наблюдаемой в присутствии эмбриональной телячьей сыворотки. Общий характер зависимости действия ЛПС разной структуры на адгезию, однако, не изменялся: адгезия в присутствии была близка контрольной адгезии, а предварительная инкубация нейтрофилов с ЛПСRb.caps значительно снижала адгезию при действии ЛПСS.typh. Увеличение адгезии нейтрофилов в присутствии плазмы связано с присутствием в плазме различных эндогенных хемотаксических факторов. Блокирование экспрессии CD11b/CD18 мембранных рецепторов нейтрофилов ЛПСRb.caps в ответ на эндотоксины было показано нами также в экспериментах с использованием меченными флуоресцеином антителами к CD11b. Предварительное инкубирование нейтрофилов с ЛПСRb.caps отменяло ЛПСE.coli-индуцированную экспрессию CD11b/CD18 мембранных рецепторов нейтрофилов. Далее было исследовано действие ЛПСRb.caps и ЛПСE.coli на фагоцитоз нейтрофилами FITC-меченных пекарских дрожжей. В присутствии 200 нг/мл эндотоксина происходило увеличение фагоцитоза по сравнению с контрольными клетками на 35 %. Действие 500 нг/мл ЛПСRb.caps вызывало уменьшение величины фагоцитоза на 10 % по сравнению с контролем. Предварительное инкубирование исследуемых клеток с 500 нг/мл ЛПСRb.caps в течение 5 мин перед добавлением 200 нг/мл эндотоксина полностью отменяло увеличение фагоцитоза под действием ЛПСE.coli и было на 5 % меньше, чем в контроле. Для оценки эффективности подавления липополисахаридом Rb. сapsulatus эндотоксин-зависимого фагоцитоза нейтрофилов были выполнены эксперименты, в которых исследовали защитное действие ЛПСRb.caps (в концентрации от 50 до 500 нг/мл) при постоянной концентрации эндотоксина E. coli (200 нг/мл). Значительное ингибирование фагоцитоза нейтрофилов наблюдалось уже при соотношении ЛПСRb.caps/ЛПСE.coli, равном 0,5; при этом происходило снижение величины фагоцитоза от 134 % до 106 % (в контроле – 100 %). При соотношении ЛПСRb.caps/ЛПСE.coli, равном 1, величина фагоцитоза была равна контролю. При изменении соотношения ЛПСRb.caps/ЛПСE.coli от 1 до 2,5 величина фагоцитоза изменялась от 100 % до 95 %, не достигая при этом величины фагоцитоза при действии одного ЛПСRb.caps. Т.о., 23 полученные результаты показывают, что ЛПС из Rb. capsulatus блокирует увеличение адгезии нейтрофилов по механизму подавления экспрессии CD11b/CD18 мембранных рецепторов. ПРИРОДНЫЕ И МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫЕ ЛАКТОНЫ – ИНГИБИТОРЫ ФАРНЕЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ – КАК ОСНОВА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ АНТИНЕОПЛАСТОВ 2) С.Г.Клочков 1), С.В.Афанасьева 1), Н.С. Зефиров 1), С.О. Бачурин 1), Ю.Н.Булычев 2) 1) Институт физиологически активных веществ РАН, Черноголовка Институт экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва Действие ингибиторов фарнезилтрансферазы (ФТИ) основано на уникальном аспекте патофизиологии неопластов – необходимости фарнезилирования белков Ras для развития их онкогенной активности. Для того, чтобы неактивный белок-предшественник Ras активировался и встроился в мембрану клетки, необходима модификация цистеинового конца молекулы. ФТИ способны возвратить Ras-трансформированные клетки к нормальному фенотипу, вызывают регрессию опухоли без проявлений токсичности. Очень небольшое количество ферментов, белков в организме должно быть фарнезилировано, поэтому, в случае применения ФТИ, мы получаем избирательное воздействие на опухолевые клетки, в которых для большинства опухолей характерна высокая экспрессия онкогенов Ras (это около 30 % неопластов человека). За последние годы в многочисленных исследованиях на культурах клеток и моделях животных показано, что ФТИ могут быть эффективными противоопухолевыми препаратами и их противоопухолевый эффект гораздо шире, чем просто Ras-ингибирование, и связан не только с Rasонкогеном. Этот аспект требует дополнительного и самого пристального внимания. В связи с этим поиск новых ФТИ является важной задачей, особенно поиск соединений, отличающихся по структуре от уже известных ингибиторов. Одним из перспективных классов соединений, которые могут быть использованы в качестве основы для разработки антинеопластов с проаптотическим действием, являются природные сесквитерпеновые лактоны (A. Rivero et al. European Journal of Pharmacology 2003, 482, 77– 84). Нами была проведена работа по сбору биологического материала и выделению сесквитерпеновых лактонов – потенциальных ингибиторов фарнезилтрансферазы – из растений России. Для выделения сесквитерпеновых лактонов использовали методы препаративной ВЭЖХ, позволяющие получать чистые вещества в значительных количествах. 24 Всего было выделено более двадцати сесквитерпеновых лактонов. Часть из них выделена в препаративных количествах, достаточных для проведения работ по модификации и исследованию биологической активности производных. На рисунке приведены некоторые структуры выделенных сесквитерпеновых лактонов – ингибиторов фарнезилтрансферазы. Полученные соединения в мягких условиях регио- и стереоселективно вступают в реакцию с аминами с образованием продуктов присоединения по активированной CH2-группе лактонного цикла (реакция Михаэля). Для соединений, не имеющих активированной двойной связи, были разработаны методики ее введения. Был исследован широкий круг первичных и вторичных аминов, определены границы применения данной реакции. Всего синтезировано более 100 производных. O O OR H O O H O O O H O O O O O O O H O O O H O N O O O O O H O O Нами разработан и успешно применен спектрофлуориметрический метод определения фарнезилтрансферазной активности на основе фарнезилтрансферазы, выделенной из мозга крыс и синтетического флуоресцирующего пептида Dansyl-GCVLS. Были протестированы исходные сесквитерпеновые лактоны и некоторые их синтетические производные. Обнаружены соединения с удельной активностью на уровне известных ингибиторов фарнезилтрансферазы: IC50 для ряда соединений находится в диапазоне 0,3–5 M. Анализ полученных результатов позволяет наметить пути дальнейшей модификации полученных соединений с целью повышения их активности в качестве ингибиторов фарнезилтрансферазы и использования в качестве 25 основы для разработки эффективных и селективных антинеопластов с антипролиферативным и проапоптотическим действием. РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ СИНТЕЗА СОЕДИНЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ, В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ ПРЕНИЛУКСУСНЫХ КИСЛОТ С.Г. Злотин1), Г.В. Крышталь1), Г.М. Жданкина1), А.Г. Коноплянников2) 1) Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН, Москва Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск 2) В 1950–1970 годы в Институте органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН были разработаны отечественные синтетические ранозаживляющие препараты изопреноидного ряда «цигерол» и «метапрогерол». Эти соединения, родственные витаминам группы А, обладают высокой ранозаживляющей активностью и практически не имеют вредных побочных эффектов. «Цигерол» производился в СССР до 1994 г. и широко использовался для лечения ран, трофических язв, ожогов (в том числе радиационных), послеоперационных нагноений и др. «Метапрогерол» по результатам клинических испытаний был рекомендован как средство, стимулирующее восстановительные процессы в поврежденной сердечной мышце у больных инфарктом миокарда. К сожалению, производство «метапрогерола» не было налажено, а производство «цигерола» было прекращено из-за нетехнологичности (использование щелочных металлов и безводных растворителей) и низкой рентабельности существовавших в то время схем синтеза. В настоящей работе, выполненной в лаборатории тонкого органического синтеза им. И.Н.Назарова ИОХ РАН, предлагаются новые методы синтеза ациклических изопреноидов с применением ионных растворителей и катализаторов, так называемых «ионных жидкостей», отличающиеся высокой селективностью и высоким выходом продуктов. Показано, что алкилирование диэтилмалоната и этилацетоацетата галогенпроизводными ациклических изопреноидов состава С5, С10 и С15 в среде ионных жидкостей тетрафторборат [bmim][BF4] и гексафторфосфат [bmim][PF6] 1-бутил-3-метилимидазолия в присутствии депротонирующих агентов К2СО3 и LiOH.H2O приводит к образованию производных соответствующих пренилуксусных кислот с выходом 54–70 %. 26 Взаимодействием синтезированных соединений с циклогексилбромидом и аминогалоидалканами различного строения в системах [bmim][BF4] – КОН и [bmim][РF6] – КОН получены продукты исчерпывающего алкилирования СН-кислот – ключевые полупродукты в синтезе «цигерола» и «метапрогерола», других ациклических изопреноидов, имеющих родственную химическую структуру. При этом применение [bmim][BF4] и [bmim][РF6] в качестве растворителей на обеих стадиях синтеза существенно (на 15–25 %) повышает суммарные выходы полупродуктов в расчете на коммерчески доступные исходные соединения по сравнению с реакциями в обычных органических растворителях. Преимуществами реакций в ионных жидкостях являются также легкость выделения продуктов и возможность регенерации ионного растворителя. Синтезированные производные пренилуксусных кислот были преобразованы в ранозаживляющие препараты «цигерол» и «метапрогерол» и их неизвестные ранее структурные аналоги, различающиеся длиной изопреноидной цепи и природой заместителя в положении к карбоксильной группе, с помощью реакций щелочного гидролиза и декарбоксилирования (декарбонилирования). Выходы на завершающих стадиях процесса составили 70–85 %. В настоящее время в рамках проекта в Медицинском радиологическом научном центре РАМН (Обнинск) на клеточных тест-системах и экспериментальных животных изучается способность полученных соединений активировать регенеративные процессы в поврежденных тканях в условиях трансплантации стволовых клеток. В опытах использованы мезенхимальные стволовые клетки, полученные культивированием аутологичного костного мозга, клетки, избирательно дифференцированные в направлении кардиомиобластов, гемопоэтические стволовые клети. Предварительные результаты показывают, что «метапрогерол» и некоторые его структурные аналоги повышают эффективность трансплантации стволовых клеток различного типа, обеспечивающей замещение поврежденных или погибших клеток различных жизненно важных органов и тканей (в частности, клеток мышцы сердца, головного мозга, легких, костного мозга и др.). Предполагается, что такое действие препаратов реализуется через их воздействие на «микроокружение» трансплантированных и резидентных стволовых клеток. В целом, в ходе выполнения проекта новые методологические приемы проведения реакций СН-кислот с алкилирующими агентами впервые применены для получения «цигерола», «метапрогерола» и их структурных аналогов. В результате разработаны усовершенствованные схемы синтеза этих фармацевтических препаратов и получены новые 27 соединения, обладающие ранозаживляющей активностью, в ряду производных пренилуксусных кислот. Мы выражаем благодарность Фонду содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере за финансовую поддержку отдельных этапов работы (Гос. контракт № 2864р/5295). ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА КСИМЕДОН ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТОВ А.И. Коновалов1), И.Г. Мустафин2), Г.В. Черепнев4), В.С. Резник1), И.С. Рагинов3) 1) Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КНЦ РАН, Казань 2) Республиканский центр профилактики и борьбы со СПИД МЗ РТ, Казань 3) Казанский государственный медицинский университет 4) Республиканская клиническая больница № 2 МЗ РТ, Казань Ведущим звеном патогенеза ВИЧ-инфекции является развитие вторичного иммунодефицита вследствие развития дисфункции и уменьшения количества CD4+Т-лимфоцитов (CD4+Т-Лф) (Fauci, 1988; Levy, 1993; Mellors, 1996; Badley, 2000). Несмотря на то, что выявлено несколько причин уменьшения числа СD4+Т-Лф при ВИЧ-инфекции, ведущим фактором, обусловливающим снижение абсолютного числа СD4+Т-Лф, несомненно, является их гибель по механизму апоптоза (Badley, 2000). Многочисленные механизмы, вносящие свой вклад в ВИЧассоциированный апоптоз лимфоцитов, включают хроническую иммунологическую активацию; gp120/160-связывание CD4-рецептора; усиленную продукцию моноцитами, макрофагами, В-клетками и CD8+Тклетками ВИЧ-инфицированных пациентов цитотоксических лигандов или вирусных белков, убивающих неинфицированные СD4+Т-клетки. Прогресс в фундаментальных исследованиях апоптоза создает предпосылки для применения полученных результатов в экспериментальной и клинической медицине. Фармакология апоптоза становится областью интенсивных исследований, а развитие возможностей медикаментозного контроля нарушений апоптоза приобретает растущее значение для разработки перспективных терапевтических технологий. Высокоактивная антиретровирусная терапия (комбинация двух ингибиторов обратной транскриптазы с одним или 28 несколькими ингибиторами ВИЧ-1 протеазы) значительно уменьшает заболеваемость и смертность ВИЧ-инфицированных больных. Некоторые ингибиторы ВИЧ-1 протеазы помимо антиретровирусной активности обладают собственными иммуномодулирующими и антиапоптогенными свойствами (Phenix et al., 2002). Механизм антиапоптогенного действия ингибиторов ВИЧ-1 протеазы связан с предотвращением падения трансмембранного митохондриального потенциала m (Phenix et al., 2001). В качестве нейропротекторов при СПИД-ассоциированной деменции и ВИЧ-индуцированной нейропатии предпринимаются попытки использовать антагонисты кальциевых каналов (нимодипин) (Navia et al., 1998), защищающие нейроны от ВИЧ-1 gp120-индуцированного апоптоза (Lipton, 1991). Отечественное лекарственное средство, негликозидный аналог пиримидин-нуклеозидов, ксимедон обладает регенерирующей, системной иммуномодулирующей (Слабнов и соавт., 1997, Цибулькин и соавт., 1998), m-зависимой антиапоптогенной (Cherepnev et al., 2002) и нейрорегенерирующей активностью (Рагинов и соавт., 1997). Раннее нами было показано, что ксимедон ингибирует апоптоз CD4 T клеток Jurkat и рабдомиобластов человека. Механизмы антиапоптогенного эффекта ксимедона (1 mM) опосредованы: стимуляцией ко-экспрессии белков репрессоров апоптоза BCL-2 и BAG-1, ограничением падения трансмембранного митохондриального потенциала m, поддержанием фосфатидилсериновой асимметрии клеточной мембраны, ограничением роста проницаемости цитоплазматической мембраны на дистальных этапах апоптотического каскада, стимуляцией активности фермента ДНК топоизомеразы I. Исходя из этого, было проведено экспериментально-клиническое исследование применения ксимедона как средства патогенетической терапии при ВИЧ-инфекции с целью профилактики развития вторичного иммунодефицита. Проведенные исследования на 26 ВИЧ-инфицированных показали, что 2-месячный курс применения ксимедона предотвращал развитие вторичного иммунодефицита у 53 % больных. Среди ВИЧинфицированных данной группы клинико-лабораторные показатели не изменялись в течение наблюдаемого периода (12 мес), а у части пациентов определялась позитивная динамика лабораторных показателей: содержание CD4-Т-лимфоцитов достоверно повысилось при снижении «вирусной нагрузки» (количество копий РНК ВИЧ в плазме крови). Была выявлена корреляция между степенью активации Т-лимфоцитов у ВИЧинфицированных и снижениием уровня CD4-Т-лимфоцитов, а также их подверженностью к спонтанному апоптозу. Применение ксимедона сопровождалось снижением содержания активированных Т-лимфоцитов 29 (экспреcсирующих маркеры HLA-DR, CD38) на фоне повышения содержания CD4-Т-лимфоцитов и снижения их чувствительности к спонтанному апоптозу in vitro. Однако следует отметить, что влияние препарата на клиникоиммунологические показатели было неоднозначным среди ВИЧинфицированных больных. В 47 % случаев применение препарата ксимедон не предотвращало развития вторичного иммунодефицита при ВИЧ-инфекции. Неоднозначный эффект применения ксимедона у ВИЧинфицированных больных требует проведения дифференцированного исследования влияния препарата на клинико-лабораторные показатели в группах больных с различным исходным клинико-иммунологическим состоянием. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСОВ ФОСФОПАНТЕТЕИН-АДЕНИЛИЛ-ТРАНСФЕРАЗЫ (PPAT) MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS КАК ОСНОВЫ ДЛЯ РАЦИОНАЛЬНОГО СИНТЕЗА ЭФФЕКТИВНЫХ АНТИТУБЕРКУЛЕЗНЫХ СРЕДСТВ И.П. Куранова1), Е.А. Смирнова1), В.Р. Самыгина1), Р.С. Есипов1), Л.А. Чупова2), Е.А. Ильина2), Т.Е. Иванова2), В.Н.Степаненко2), Д.В. Чувиховский2) Институт кристаллографии РАН, Москва Институт биоорганической химии РАН, Москва 1) 2) Целью настоящей работы является исследование методом рентгеноструктурного анализа пространственной структуры фосфопантетеин-аденилил-трансферазы Micobacterium tuberculosis в комплексах с функциональными лигандами. Фосфопантетеин-аденилил-трансфераза (PPAT) Micobacterium tuberculosis относится к ключевым ферментам, ответственным за развитие микобактерии. Фермент участвует в синтезе коэнзима А, вовлеченного в большое число метаболических путей, в частности в синтез компонентов 30 клеточной стенки микобактерий. Ингибирование PPAT прекращает рост бактерии. Это обстоятельство, а также отличие PPAT от аналогичного фермента человека делает данный белок перспективной молекулярной мишенью для создания противотуберкулезных средств нового поколения. Рациональный подход к синтезу селективных ингибиторов ферментов основывается на понимании механизма действия белка-мишени и знании его пространственной структуры в разных функциональных состояниях. Рекомбинантная микобактериальная фосфопантетеин-аденилилтрансфераза (PPAT) была получена в клетках E. сoli и очищена хроматографией на cефарозе и гель-фильтрацией на сефадексе G-25. Чистота препарата по данным гель-электрофореза превышала 95 %. Кристаллы, по размеру и качеству пригодные для рентгеноструктурного анализа, выращены методом диффузии паров растворителя из растворов белка в 22 мМ HEPES буфере, pH 8.0, содержащим 0.3–0.5 моля NaCl при концентрации белка 12–17 мг/мл. В качестве осадителя использовали 6–10 %-ные растворы 2-метил-2,4пентандиола (MPD) в том же буфере, содержащем 20 мМ кобальт гексамина. Кристаллы появлялись в течение 4–5 дней и достигали максимального размера (0.2-0.3 мм) через три недели. Как показало рентгенографическое исследование, кристаллы принадлежат к пространственной группе R32, имеют следующие параметры ячейки: а = b = 99.58º, с = 115.45 Å и дифрагируют до разрешения выше 2 Å. Поскольку при микробиологическом синтезе в клетках E. coli фермент может присоединить низкомолекулярные соединения, содержащиеся в клетках бактерии–хозяина, в том числе прочно связываемые функциональные лиганды, был проведен полный рентгеноструктурный анализ полученных кристаллов. Дифракционный набор до разрешения 2.0 Å собран на рентгеновском аппарате с отпаянной трубкой в качестве источника рентгеновского излучения, снабженным детектором MAR 345. Набор обработан по программам DENZO и SCALEPACK. Полнота набора 90.6 %, I/σ = 3,1, Rфактор 8.39 %. Структура, рассчитанная по координатам модели апофермента, депонированным в Protein Data Bank, была уточнена по программе REFMAC до R-фактора 21%. Анализ атомной модели показал, что закристаллизованный белок представляет собой нативный фермент, в активном центре которого лиганды отсутствуют. Для получения кристаллического комплекса с АТФ методом настаивания был подобран состав консервирующего раствора с концентрациями АТФ, при которых не происходит разрушения кристаллов. Проводится рентгеноструктурное исследование кристаллов, выдержанных в растворах с АТФ. 31 АНТИМИКРОБНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ЛИЗОАМИДАЗА: КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В E.coli ГЕНОВ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ЭНДОПЕПТИДАЗ Л1 (alpA) и Л5 (alpB) И.С. Кулаев, Ю.С. Лаптева, А.Е. Калинин, О.Н. Хохлова, М.Г Шляпников, И.М. Цфасман, О.А. Степная, И.Э. Грановский Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Одна из важнейших проблем терапии инфекционных заболеваний – возникновение резистентности к существующим антибиотикам у патогенных микроорганизмов. Еще одна не менее важная проблема – это появление новых патогенов, таких как дрожжевые и мицелиальные грибы, которые вызывают тяжелые инфекционные заболевания у людей с ослабленной иммунной системой, после антибиотикои кортикостероидной терапии. В связи с резким обострением опасности биотерроризма особый интерес вызывают новые способы борьбы с эпидемиологически значимыми патогенами, в частности со спорообразующими бактериями рода Bacillus, к которым относится Bacillus anthracis – возбудитель сибирской язвы. В ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН на основе ферментов и полисахарида бактерии Lysobacter sp. XL1 семейства Lysobacteraceae создан новый антимикробный препарат лизоамидаза. Лизоамидаза обладает широким спектром действия. Она способна быстро и эффективно разрушать клетки многих устойчивых к антибиотикам патогенных бактерий и дрожжей, нарушать жизнеспособность грибного мицелия и препятствовать прорастанию грибных и бактериальных спор. Высокая эффективность препарата связана с действием пяти (Л1 – Л5) бактериолитических ферментов, входящих в ее состав. Поиск и клонирование генов бактериолитических ферментов Lysobacter sp. XL1, определение их первичной последовательности, а также конструирование штаммовпродуцентов этих белков с использованием E. coli и других бактерий является перспективным для получения антибактериальных препаратов с заданными свойствами на основе бактериолитических ферментов лизоамидазы. К настоящему времени определена нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК Lysobacter sp. XL1 размером около 8 т.п.н., в составе которого идентифицированы две ОРС, кодирующие литические эндопептидазы Л1 (alpA) и Л5 (alpB), размером 1197 и 1200 п.н. соответственно. Установлена гомология последовательностей AlpA и 32 AlpB с сериновыми протеазами и предсказано, что они синтезируются в виде препробелков. Белки AlpA и AlpB идентичны между собой на 59 %. Гены alpA и alpB литических ферментов AlpA и AlpB Lysobacter sp. XL1 клонированы и экспрессированы в E. coli. В клетках E. coli происходит успешное созревание обоих ферментов и их секреция во внешнюю среду. Оптимизированы условия экспрессии исследуемых генов в E. coli. При этом литическая активность накапливалась в культуральной жидкости до 25 ЛЕ/мл как при экспрессии alpA, так и alpB. Получены очищенные препараты белков AlpA и AlpB для их последующей характеристики. СОЗДАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОГО И ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА ИЗ ЛИЧИНОК ВОСКОВОЙ МОЛИ, ОБЛАДАЮЩЕГО ЛЕЧЕБНЫМ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ ПРИ ТЯЖЕЛЫХ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ, А ТАКЖЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ ПРИ ПРОСТУДНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И ГРИППЕ М.Н. Кондрашова1), Е.Г. Литвинова1), А.А. Овсепян1), Э.К. Мубаракшина1), Н.И. Косякова2), А.С. Погосян2), И.В. Михайлова 3), Е.В. Семенова3), Ж.Н. Казарец3), А.А. Селищева4) 1) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2) Больница ПНЦ РАН, Пущино 3) Противотуберкулезный диспансер, Серпухов 4) ЦНИИ туберкулеза РАМН Нами разработан, запатентован (патент РФ № 2038086) и зарегистрирован МЗ РФ (№ 77.99.23.У8597.7.05) природный, нетоксичный биологически активный препарат из личинок большой восковой моли c противотуберкулезным, кардиопротекторным и иммуномодулирующим действием, организовано его производство и выпуск под названием «Натуральный экстрактЪ доктора Мухина» (НЭДМ). Препарат представляет собой спиртовой экстракт личинок, выращиваемых вне улья по стандартизированной методике (ТУ9197-02517664661-05). Многолетними исследованиями установлено, что препарат стимулирует физическую активность, регулирует энергетический обмен, стимулирует иммунную систему. Показана способность НЭДМ предотвращать негативные последствия перегрузки организма железом. Отличительной особенностью нашего препарата является его высокая антиоксидантная активность (АОА). Наличие АОА в НЭДМ может 33 определять широкий спектр его лечебного действия, поскольку многие патологические состояния связаны с развитием окислительного стресса. Нами разработан метод стандартизации препарата – по его АОА. Определение АОА проводится по разработанному в нашей лаборатории (ИТЭБ РАН) запатентованному методу (патент РФ № 2144674). За год нами наработано 15000 доз НЭДМ и мы можем увеличить его выпуск в 2-3 раза. 4000 доз передано нами бесплатно в 5 различные медицинских учреждений, в том числе в больницу ПНЦ РАН, ЦНИИ туберкулеза РАМН и Противотуберкулезный диспансер г. Серпухова – для исследований и применения в комплексной патогенетической терапии. Получены статистически достоверные результаты уменьшения тяжести симптомов и снижения средней длительности обострения заболевания у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких в сочетании с патологией сердечно-сосудистой системы при применении НЭДМ в комплексной терапии у этих больных. Прием НЭДМ на фоне базисной терапии приводил к повышению концентрации лизоцима и sIgA в секрете верхних дыхательных путей, положительному сдвигу показателей гуморального иммунитета. Включение НЭДМ в комплексную терапию больных с впервые выявленным туберкулезом приводило к уменьшению количества дней нетрудоспособности и значительному снижению числа больных, переведенных на инвалидность (40 % в группе больных, не принимавших НЭДМ и 0 % в группе больных, пролеченных с применением НЭДМ). Отмечено также снижение заболеваемости острыми респираторными инфекциями у медперсонала противотуберкулезного диспансера, принимавшего НЭДМ с профилактической целью. На модели экссудативно-некротического туберкулеза у мышей при сочетанном применении изониазида и НЭДМ ни в одном случае в цитоплазме альвеолярных макрофагов не были выявлены туберкулезные бактерии. Применение одного изониазида приводило только к снижению количества туберкулезных бактерий в этих клетках по сравнению с контролем. Использование спиртовой формы препарата ограничивает его применение с профилактической целью, а также для лечения детей, беременных женщин, лиц с алкогольной зависимостью. Нами получены две неспиртовые сухие формы препарата: на основе пищевого сорбита и препарат из лиофилизованных личинок. Оба препарата обладают высокой АОА. Спиртовые экстракты, полученные из лиофилизированных личинок, обладают значительно более высокой АОА по сравнению с НЭДМ, при этом существенно снижается время экстракции по сравнению со стандартным способом получения НЭДМ. 34 Таким образом, лиофилизация позволяет лучше сохранить целебные компоненты, присутствующие в личинках, что позволяет усилить лечебные свойства препарата. Кроме того, лиофилизированные личинки могут служить основой для создания новых форм препарата или использоваться самостоятельно, например, для повышения иммунитета, а также для лечения и профилактики различных заболеваний, в т.ч. и вирусных инфекций у с/х и домашних животных и птиц. В экспериментах in vitro выявлено усиливающее действие (до 60 %) как спиртового экстракта, так и сухих препаратов на хемилюминесцентный ответ нейтрофилов человека на специфический активатор, что свидетельствует о его способности оказывать иммуномодулирующее действие на организм. Работа поддержана Программой фундаментальных исследований Президиума Российской академии наук «Фундаментальные науки – медицине», Программой Российской академии наук «Поддержка инноваций» и ОАО «ДИОД». ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОКИНМОДУЛИРУЮЩИХ И АНТИВИРУСНЫХ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ – ГЛИПРОЛИНОВ Н.Ф.Мясоедов1), Ф.И.Ершов2), О.Н.Учакина2), П.Н.Учакин2), М.В.Мезенцева2), А.А.Зозуля 3) , И.М.Сургучева2) , О.Ю.Соколов3) Институт молекулярной генетики РАН, Москва ГУ научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН, Москва 3) Научный центр психического здоровья РАМН, Москва 1) 2) В патогенезе всех известных инфекционных и неинфекционных заболеваний отмечается дисбаланс в продукции и рецепции растворимых медиаторов, таких как нейропептиды, гормоны, цитокины. Как известно, развитие адекватного иммунного ответа напрямую зависит от соотношения клеточно-опосредованных (Тип-1) и гуморальных (Тип-2) иммунных реакций, регулируемых двумя группами цитокинов, дисбаланс в продукции которых приводит к развитию вторичных иммунодефицитов. Отмечено, что больные, страдающие различными психоневрологическими расстройствами, более подвержены инфекционным заболеваниям, которые часто протекают в тяжелой форме. В связи с этим представлялось важным проверить наличие корригирующих иммунотропных свойств у нового отечественного олигопептидного препарата Селанк, синтезированного в Институте 35 молекулярной генетики РАН. Селанк относится к новому классу регуляторных пептидов – глипролинов и проходит в настоящее время третью фазу клинических испытаний в качестве анксиолитика. Основной целью проведенных исследований явилось изучение влияния Селанка на цитокиновый профиль в норме и патологии. Иммунологические данные сопоставлялись с выраженностью клинического психо- и нейротропного эффектов препарата и данными психологического и биохимического исследований, проводимых параллельно. Мониторинг цитокинового профиля проводился у 27 человек в возрасте 36.7±9.5 лет с тревожно-фобическими расстройствами на фоне приема препарата Селанк. Исходя из клинического диагноза, все обследованные были разделены на группу с генерализированными тревожными расстройствами (ГТР, n=13) и неврастенией (n=14). В качестве маркерных цитокинов в работе использовались: интерферон (ИФН)-α – показатель противовирусного звена иммунитета, ИФН-γ и интерлейкин (ИЛ)-12, регулирующие клеточно-опосредованные иммунные реакции, а также ИЛ-4, -6, и-10, отвечающие за развитие гуморального иммунитета. Концентрации цитокинов определялись иммуноферментным методом с использованием коммерческих тестсистем. Влияние Селанка на Тип-1/Тип-2 иммунный баланс оценивалось по Т1/Т2 индексу и калькулировалось по соотношению концентраций ИФН-γ/ИЛ-4 (Т-клеточный ответ) и ИЛ-12/ИЛ-10 (моноцитарно/макрофагальный ответ). Иммуномодуляторные свойства Селанка оценивались также по его способности индуцировать экспрессию генов цитокинов: ИФН-α, -γ, ИЛ-1, 2, -4, -6, -10, и -12 в иммуноцитах периферической крови здоровых людей и страдающих различными формами депрессивных расстройств. Статистическая достоверность полученных результатов определялась с помощью дисперсного анализа и с использованием критерия хи-квадрат. Для выявления возможных взаимосвязей между изучаемыми параметрами, использовались корреляционный тест Пирсона и методы линейной регрессии. Показан эффект Селанка в отношении возбудителей наиболее распространенных и до сих пор плохо контролируемых вирусных инфекций: вируса гриппа типа А (штамм Н3N2) и вируса простого герпеса 1-го типа (ВПГ-1). Анализ содержания цитокинов в сыворотке больных, принимавших Селанк на протяжении 14 дней, выявил следующее. Статистически достоверное (р<0.05) снижение ИФН-γ и ИЛ-10 было обнаружено в обеих группах обследованных. Одновременно с этим содержание ИЛ-6 в сыворотке больных обеих групп достоверно увеличилось, но не превысило нормальных значений сывороточного содержания этого 36 цитокина в крови здоровых людей. Содержание ИФН-, ИЛ-4, и ИЛ-12 в сыворотке больных не изменилось. Изменения в Т1/Т2 индексе Тклеточного (ИФН-γ/ИЛ-4) и моноцитарно/макрофагального (ИЛ-12/ИЛ10) ответов носили противоположно направленный характер и имели достоверную обратную корреляционную зависимость (r=-0.61; p<0.001). Полученные лабораторные данные сопоставимы с результатами позитивных клинических эффектов препарата. У больных ГТР и неврастенией Селанк оказывал выраженный терапевтический эффект, сравнимый с действием бензодиазепинового транквилизатора Медазепама. При этом Селанк не вызывал побочных эффектов, свойственных бензодиазепинам (седация, дневная сонливость, расстройство просыпания и т.д.). Результаты проведенного исследования позволяют заключить, что препарат Селанк обладает иммунокоррегирующими свойствами, модулируя продукцию цитокинов, контролирующих баланс клеточноопосредованных и гуморальных иммунных реакций. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ДЕФЕНСИНОВ NP-1 РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ НА ПЕРВИЧНЫЕ АФФЕРЕНТНЫЕ (СЕНСОРНЫЕ) НЕЙРОНЫ А.Д. Ноздрачев, Ю.А. Толкунов, Ю.Н. Андрианов, Е.Л. Поляков, И.В. Рыжова, М.Е. Симанина Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург В работе исследовалось влияние человеческого синтетического дефенсина NP-1 (Sigma) и полусинтетического антибиотика клафорана (Cefotaxime- цефотаксима) (Aventis) на развитие потенциалов действия в первичных афферентных (сенсорных) нейронах. Исследования проводились на препаратах тонкой кишки морской свинки с использованием методики внутриклеточной регистрации и на изолированном вестибулярном аппарате лягушки при регистрации афферентной активности нервных волокон, иннервирующих полукружные каналы. В опытах на препаратах тонкой кишки установлено, что серотонин (1х10-12 – 1х10-11 моль/л) вызывал появление в первичных афферентных 37 нейронах характерных монофазных потенциалов действия длительностью 1,1±0,3 мс, а интерлейкин-1β (1х10-12 -1х10-10 моль/л) – потенциалов действия, отличающихся длительным генераторным потенциалом (4,2±0,3 мс), более продолжительным спайком (2,1±0,4 мс) и следовой гиперполяризацией (10±0,5 мс). Под влиянием дефенсина NP-1 (1х10-12 – 1х10-11 моль/л) и клафорана (1х10-8 – 1х10-7 моль/л) происходило изменение фаз развития потенциалов действия при нанесении серотонина и интерлейкина-1β. При этом монофазные потенциалы при аппликациях серотонина становились многокомпонентными и их общая длительность возрастала до 18-20 мс. Наоборот, многокомпонентные потенциалы при аппликациях интерлейкина1β уменьшались по длительности и становились монофазными. Высокие концентрации дефенсина NP-1 (1х10-5 моль/л) и клафорана (1х10-4 моль/л), которые, вероятно, близки к терапевтическим концентрациям, не оказывали влияния на развитие потенциалов действия в первичных афферентных нейронах при аппликациях серотонина и интерлейкина-1β. Полученные данные не имеют принципиальных различий с результатами опытов, в которых использовался синтетический кроличий дефенсин NP-1. Они также свидетельствуют о наличии модулирующих и анальгетических свойств у антибиотиков животного происхождения – дефенсинов NP-1 (кролика и человека), а также у другого антибиотического (полусинтетического) препарата – клафорана. Целью другой части работы явилось изучение влияния дефенсина NP1 человека на синаптическую передачу и ответы, вызываемые действием агонистов эндогенного нейропередатчика L-глутамата, -амино-3гидрокси-5-метил-4-изоксазол-пропионовой кислоты (АМПА), каината и N-метил-D-аспартата (НМДА) в афферентном синапсе изолированного вестибулярного аппарата лягушки. В опытах использовалась методика внешней перфузии и регистрации афферентной активности нервных волокон, иннервирующих полукружные каналы животного. Показано, что дефенсин NP-1 человека в концентрации 1х10-13 – 1х10-8 моль/л оказывает тормозное влияние, снижая частоту разрядов афферентных нервных волокон в соответствии с концентрацией препарата. С целью определения видовой специфичности различных дефенсинов в вестибулярном сенсорном эпителии проведено сопоставление эффектов дефенсина NP-1 человека и дефенсина NP-1 кролика, исследованного нами ранее. Оказалось, что кривая доза-ответ в обоих случаях состоит из почти линейной характеристики, за которой следует зона насыщения. Проведенный статистический анализ чувствительности афферентных синапсов к действию дефенсинов NP-1 кролика и человека не выявил статистически значимых различий между ними при всех используемых концентрациях. В работе была проведена проверка рабочей гипотезы о том, что одним из возможных механизмов ауторегуляции афферентного потока в 38 сенсорном синапсе вестибулярного аппарата является взаимодействие дефенсинов с ионотропными АМПА, НМДА и каинатными рецепторами. С этой целью исследовано влияние дефенсина NP-1 человека на ответы, вызываемые действием агонистов глутамата АМПА, НМДА и каината. Показано, что ответы, вызываемые агонистами L–глутамата в присутствии дефенсина NP-1 человека, были существенно ниже ответов, наблюдаемых в нормальном растворе. Анализ полученных результатов показал, что НМДА-, и не-НМДА-подтипы глутаматных рецепторов вовлечены в механизм действия дефенсина в вестибулярном аппарате лягушки. Следовательно, действие дефенсина NP-1 можно рассматривать как один из механизмов модуляции синаптической передачи в волосковых рецепторах, действуя в биологически значимых концентрациях. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии у различных видов дефенсинов NP-1 модулирующих и, возможно, анальгетических свойств в вестибулярной сенсорной системе организма, а также об отсутствии видовой специфичности такого эффе 39 МИКОЛИКОПИН – НОВОЕ ПРИРОДНОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ РАКА ПРОСТАТЫ Е.П. Феофилова1), В.М. Терешина1), А.С. Меморская1), Н.Г.Гончаров 2) 1) Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН, Москва 2) Центральная клиническая больница РАН, Москва В настоящее время лечение злокачественных гормоночувствительных опухолей является актуальной проблемой современной онкологии. По данным литературы эндокринотерапия рака предстательной железы (РПЖ) с использованием хирургических методов лечения, а также целого арсенала современных противоопухолевых препаратов (агонистов люлиберинов, антиандрогенов, цитостатиков) не является «панацеей» для этого заболевания. По данным статистики, несмотря на значительный прогресс в терапии РПЖ, частота случаев развития РПЖ за последнее десятилетие увеличилась на 22–30 %. Заболеваемость РПЖ по «рейтингу» среди новообразований занимает сейчас 10–11 место в структуре онкологических заболеваний, а в экономически развитых странах выходит на первое место. В конце 20-го века медики обратили внимание на то, что люди, которые потребляют много овощей и фруктов, меньше болеют РПЖ. Особый интерес вызвало наблюдение, что употребление помидор значительно останавливает это заболевание. Дальнейшие исследования, проводившиеся в течение 10 лет, подтвердили это наблюдение, и было установлено, что действующим веществом является каротиноид ликопин, который в значительном количестве содержится в помидорах (около 30 мг/ кг). Оказалось, что именно ликопин обладает наиболее высокой антиоксидантной активностью среди каротиноидов. Этот каротиноид индуцирует также клеточные взаимодействия, участвует в координации роста клеток, но, в отличие от β-каротина, не обладает активностью провитамина А, т.е не метаболизируется в витамин А, и остается основным каротиноидом плазмы крови. Высокая антиоксидантная активность связана с иммуномодулирующим действием, поэтому ликопин заинтересовал медиков как потенциальный противоопухолевый препарат. Внимание к ликопину значительно возросло после того, как было установлено, что каротиноиды присутствуют в простате и преобладающим является ликопин, который накапливается в трех органах – яичках, надпочечниках и, главным образом, простате. Благодаря высокой антиоксидантной активности и предполагаемому антираковому эффекту ликопин уже с 1990 г. активно входит в пищевые 40 добавки. Так, например, за рубежом уже в 1996 г. предложен как потенциальный антираковый препарат «Betatene», представляющий собой 4 % суспензию ликопина томатов. В России научно-промышленной фирмой «Инвест» разработан препарат «Томатол», получаемый из томатной пасты путем экстракции ликопина растворителями. Его предлагается использовать в качестве лечебно-профилактического средства, однако томатная паста не является стабильным и конкурентно способным источником сырья. В продажу в настоящее время поступает кристаллический ликопин из томатов, который стоит также достаточно дорого. Учитывая несомненную перспективность ликопина и его широкое использование в настоящее время пока в виде пищевых добавок, встает вопрос о получении этого каротиноида микробиологическим способом, который обеспечил бы его широкое и дешевое производство. До начала наших исследований промышленный биотехнологический способ получения ликопина из грибов не был разработан. Мы считали наиболее перспективным использовать для разработки биотехнологического способа получения этого каротиноида мукоровый гриб Blakeslea trispora, который является рекордсменом по выходу каротиноидов. Изменив путь биосинтеза каротиноидов, нам удалось получать в условиях завода выход ликопина до 1,5 г/л, а в дальнейшем, используя ликопин как активное начало, был разработан способ получения нового лекарственного средства, названного Миколикопином. Это биологически активное средство, представляющее собой желатиновые капсулы, содержит 2 % ликопина и БАВ (убихиноны, производные ретиналя, эссенциальные жирные кислоты, среди которых линолевая кислота составляет 59 %, пальмитолеиновая – 3 %, а в составе фосфолипидов преобладает фосфатидилэтаноламин (75 %). В лаборатории по созданию нетоксичных иммуномодуляторов РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН проведены испытания, показавшие, что Миколикопин кроме антиоксидантного обладает антимутагенным, радиопротекторным и иммуномодулирующим действием. В опытах на животных в лаборатории экспериментальной эндокринной терапии опухолей РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН установлена способность Миколикопина на 50–70 % задерживать развитие РПЖ. Данные лаборатории лекарственной токсикологии ВИЛАР в хроническом эксперименте на собаках свидетельствуют о его низкой токсичности и отсутствии противопоказаний для его применения в клинике. Разработаны условия хранения препарата и установлены его сроки годности – в течение 3 лет. В настоящее время проводятся расширенные испытания Миколикопина на животных, целью которых является подтверждение его 41 действия на РПЖ, сравнение с применяемыми препаратами, в частности с сурфагоном, и установление возможного аддитивного эффекта. 4. СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ РАДИОБИОЛОГИИ НОВАЯ МЕТОДОЛОГИЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КАНЦЕРОГЕННЫХ ЭФФЕКТОВ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА ОСНОВЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ИНФОРМАЦИИ О МЕХАНИЗМАХ ФОРМИРОВАНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГЕНОМА С.Г.Андреев1), Ю.А.Эйдельман1), И.В.Сальников1), А.В.Алещенко1), Л.П.Семенова1), Л.Р.Борисова1), И.К.Хвостунов1), Е.А.Красавин2), Р.Д.Говорун2), И.В.Кошлань2), Н.А.Кошлань2) 1) Институт биохимической физики РАН им. Н.М.Эмануэля, Москва 2) Объединенный институт ядерных исследований, Дубна 42 Прогнозирование канцерогенных рисков облучения в область малых доз радиации требует (*) знания фундаментальных радиобиологических закономерностей эффектов радиации на различных уровнях биологической организации, от молекулярного до уровня клеток и клеточных популяций; (**) наличия методов интеграции этих знаний в единую технологию прогнозирования рисков. Для изучения механизмов повреждения генома были проведены теоретические и экспериментальные исследования действия радиации на хромосомы клеток человека. А именно, исследовали индукцию хромосомных аберраций в первом пострадиационном митозе и задержанных (отдаленных) аберраций в потомках облученных клеток (хромосомная нестабильность). Была проверена гипотеза, что радиация индуцирует специфические АХ, которые являются ранними (инициирующим) событиями радиационного лейкемогенеза. С помощью разработанных методов прогнозирования типов и частот внутри- и межхромосомных аберраций были рассчитаны частоты специфических радиационноиндуцированных аберраций (t(12;21), t(9;22), t(4;11), t(8;21), t(15;17)), которые известны как маркеры различных типов лейкозов (миелоидные, лимфоидные). Экспериментальное определение частот таких АХ в малых дозах при эпидемиологических исследованиях невозможно. Полученные результаты обсуждаются в связи с наблюдаемыми частотами различных типов радиационно-индуцированных лейкозов. Для исследования междонорных вариаций в индукции инициирующих событий канцерогенеза были определены вариации частот АХ, образовавшихся в интерфазе, для разных доноров. Экспериментальное измерение АХ стандартно осуществляется в метафазе первого деления при одном фиксированном времени наблюдения. Поскольку к моменту наблюдения в метафазе оказывается лишь малая часть клеток (как с аберрациями, так и без них), восстановление частот АХ, образовавшихся в интерфазе, возможно только теоретическим путем. Показано, что дозовые зависимости частот АХ не зависят от характеристик клеточного цикла для разных доноров. Для оценки отдаленных последствий облучения были изучены закономерности радиационно-индуцированной хромосомной нестабильности (АХ в потомках облученных клеток) в экспериментах по действию излучений с различными ЛПЭ – -радиации, ускоренных протонов, азота – на клетки китайского хомячка V79. В качестве экспериментальной модели хромосомной нестабильности использовались HPRT-мутантные субклоны. Было обнаружено появление клонов клеток с нестабильными АХ (дицентрики, фрагменты, интерстициальные делеции), выявлена высокая генотипическая нестабильность клонов, обусловленная анеу- и полиплоидией клеток. С ростом ЛПЭ хромосомная нестабильность мутантных субклонов снижалась. На основе проведенных 43 экспериментов и литературных данных разработаны биофизический механизм и количественная модель радиационно-индуцированной хромосомной нестабильности. Модель позволяет предсказывать дозовые зависимости частот аберраций в потомках облученных клеток и их модификацию в зависимости от генотипа клеток. Полученные экспериментальные и расчетные данные по индукции АХ как инициирующего события, а также предложенный механизм возникновения хромосомной нестабильности были интегрированы в стохастическую двухстадийную модель радиационного канцерогенеза. Проведены оценки вероятности того, что специфические канцерогенные хромосомные перестройки могут образовываться как результат хромосомной нестабильности в процессе длительной пролиферации клеток. Обсуждаются научные и практические аспекты полученных результатов. ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА У ЛЮДЕЙ, ПОДВЕРГАВШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ РАДИАЦИИ В.Г. Безлепкин1), Г.В Васильева1), М.Л. Захарова2), Е.Н. Кириллова2), М.Г. Ломаева1), К.Н. Муксинова2), Н.П. Сирота1), Л.А. Фоменко1) 1) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино 2) ФГУП Южно-Уральский институт биофизики ФМБА, Озерск Индуцированный воздействием ионизирующей радиации аллельный полиморфизм некодирующих повторов ДНК, в частности микросателлитов (МКС) и МКС-ассоциированных последовательностей, в определенных ситуациях может быть причиной формирования состояния повышенной вариабельности или нестабильности генома (НСГ) в клетках тканей животных и человека, подвергавшихся облучению. Такое состояние характеризуется увеличением вероятности апоптоза и отсроченной гибели клеток, а также повышением частоты мутаций как в соматических, так и в половых клетках. Сохраняясь в потомстве выживших после облучения клеток, состояние НСГ в существенной мере повышает вероятность развития канцерогенеза и других патологий у облученных индивидов и, возможно, у их потомков. Исследование количественных закономерностей геномной изменчивости на молекулярном уровне как в кодирующих, так и в неэкспрессирующихся 44 последовательностях ДНК в клетках облученного организма является актуальным для решения теоретических и прикладных задач современной радиобиологии, радиационной генотоксикологии и эпидемиологии. Проект выполнялся сотрудниками ИТЭБ РАН и ЮУрИБФ при участии членов ВНТК, сформированного из специалистов Больницы ПНЦ РАН, в рамках договора о научном сотрудничестве. Среди кадровых профессионалов ПО «Маяк» (г. Озерск), зарегистрированных в радиобиологическом депозитарии ЮУрИБФ, выделены 5 групп доноров (по 10 человек; старшая возрастная группа), подвергшихся облучению в условиях технологического процесса и в аварийных ситуациях. Группы формировались с учетом величины дозовых нагрузок (в основном за период 50-х годов 20 века; общий диапазон от 50 до 300 сГр) по внешнему гамма-излучению для каждого из регистрантов. В состав контрольной группы доноров того же возраста, что и подвергшиеся облучению, включены работники ПО «Маяк», не работавшие в профильных цехах предприятия, а также жители г. Озерска, не занятые на этом производстве. На каждого из индивидов, включенных в регистр и предоставивших кровь для анализов, оформляются профессиональные, дозиметрические и медико-биологические сведения. Сбор образцов крови доноров, подвергшихся облучению, выполнен сотрудниками радиобиологического отдела ЮУрИБФ. Технология ДНКфингерпринтинга на основе ПЦР со «случайно выбранным» праймером (AP-PCR) была использована для определения спонтанной и индуцированной излучением НСГ по уровню полиморфизма «анонимного генетического маркера» – набора продуктов амплификации МКСассоциированных последовательностей. Проведенный подбор нескольких праймеров позволяет параллельно анализировать изменчивость широкого спектра МКС-повторов. В силу высокой индивидуальной генетической вариабельности людей, анализ дозовой зависимости мутационных изменений ДНК был дополнен исследованиями на мышах линии BALB/c, характеризующейся повышенной генетической вариабельностью. Анализы выполнены на препаратах ДНК из пролиферирующих (селезенка, эпителий кончика хвоста) и постмитотических тканей (кровь, головной мозг) животных, облученных в дозах от 50 до 200 сГр. Продукты AP-PCR-амплификации ДНК человека и мыши разделялись электрофорезом в 6 % ПААГ с последующей визуализацией окрашиванием азотнокислым серебром. Для корректного сравнения сложных наборов амплифицированных фрагментов на ДНКфингерпринтах (до 70 полос), на основе метода цифровой системы гельдокументирования, в рамках выполнения проекта разработано специальное программное обеспечение (Скосырев и др., 2005). Выявлена выраженная тенденция повышения уровня МКС-полиморфизма в ДНК крови работников ПО «Маяк» (г. Озерск), подвергшихся облучению в 45 дозах 200–300 сГр. Сопоставление уровня полиморфизма, дозовой нагрузки и диагностируемых хронических заболеваний в группах обследованных регистрантов радиобиологического депозитария позволяет предполагать, что наблюдаемые генетические изменения являются следствием именно радиационного воздействия. Острое облучение самцов или самок мышей в дозах 100 и 200 сГр приводит к достоверному повышению вариабельности некодирующих повторов генома потомства, полученного от спаривания самцов, подвергнутых облучению, с необлученными самками или самцами, соответственно. Обнаружены разнонаправленные изменения уровня МКС-полиморфизма относительно величин, характерных для потомства необлученных самцов: повышение в селезенке, но снижения в мозге и легких. Зарегистрировано увеличение частоты микроядер в клетках костного мозга облученных животных и их потомства. Выполнение проекта дает принципиально новые результаты, позволяющие оценивать уровень индуцированной НСГ у людей, подвергшихся воздействию радиации, по некодирующим последовательностям ДНК. Доля последних в геноме существенно выше представительства генов, и учет мутационной изменчивости простых повторов позволит в перспективе более корректно определить дозовый выход и частоту мутаций, индуцированных ионизирующей радиацией в соматических клетках человека. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ мтДНК В КЛЕТКАХ КРОВИ ЛЮДЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ А.И. Газиев, Т.Е. Ушакова, М.В. Патрушев, В.Н. Малахова, В.Е.Антипова, Н.А.Гуляева, И.И.Бельская, Л.В.Патрушева Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино В клетках тканей человека, в зависимости от их энергетических потребностей, представлены от нескольких сот до нескольких тысяч копий митохондриальной ДНК (мтДНК), содержащих гены, кодирующие и обеспечивающие синтез 13 полипептидов системы дыхательной цепи. Установлено, что мтДНК реплицируется независимо от клеточного цикла и репликации ядерной ДНК (яДНК), в митохондриях недостаточно эффективно функционируют различные системы репарации ДНК. Частота структурных нарушений мтДНК, индуцируемых эндогенными и экзогенными агентами, в 10–100 раз выше, чем в яДНК. От частоты этих нарушений или степени поврежденности мтДНК в значительной мере зависят гибель клеток и развитие дегенеративных процессов, различных 46 патологий и старения. Вместе с тем сведений о формировании нарушений мтДНК в клетках человека или животных, подвергшихся радиационному воздействию, в литературе ограничены, хотя возможность их возникновения кажется очевидной. Недавние наши исследования, выполненные в рамках программы Президиума РАН «Фундаментальные исследования – медицине», показали, что мтДНК в клетках крови пациентов в процессе проведения радиохимиотерапии (РХТ) опухолей, а также в клетках головного мозга и селезенки гамма-облученных мышей повреждается с большей частотой и репарируется с низкой скоростью по сравнению с яДНК. При этом одновременно наблюдается переход фрагментов мтДНК в цитозоль клеток мозга и селезенки облученных мышей. В тканях мышей после их гамма-облучения в сублетальных дозах наблюдается увеличение количества копий мтДНК относительно яДНК. В соответствии с основной задачей проекта в 2005 г. были продолжены исследования по изучению структурных изменений мтДНК в клетках крови людей, подвергшихся радиационному воздействию и прошедших сеансы РХТ опухолей. Были проведены анализы изменения количества копий мтДНК в клетках крови больных (21 женщин) раком молочной железы (РМЖ) в процессе РХТ, с использованием двух вариантов метода ПЦР: ПЦР на длинных фрагментах ДНК с одновременной амплификацией мтДНК (16211 п.о.) и ядерного гена β- глобина (2056 п.о.) и ПЦР в реальном времени в совмещенной системе с одновременной регистрацией кинетики амплификации фрагментов мтДНК и ядерного гена gapdh. Определяли также возникновение больших делеций и точечных мутаций мтДНК клеток крови тех же пациентов. При этом во всех случаях анализы выполнялись до проведения сеансов РХТ и через 7 дней после их завершения. Проведен также выборочный анализ наличия точечных мутаций мтДНК в клетках крови группы доноров-профессионалов ПО «Маяк», подвергшихся внешнему гамма-облучению. Для скрининга мутаций мтДНК использовали метод анализа полиморфизма конформации однонитевых фрагментов ДНК, получаемых обработкой продуктов ПЦР-амплификации участков мтДНК рестриктазами и метод электрофореза продуктов ПЦР участка мтДНК в градиенте температуры в заданном времени. В результате анализов получены резко различающиеся индивидуальные показатели у больных РМЖ как по изменению количества копий мтДНК относительно яДНК, так и по выявленным большим делециям мтДНК в клетках крови, в ответ на генотоксическое действие средств РХТ. Часть копий мтДНК клеток крови пациентов с РМЖ может содержать большие делеций, частота которых повышается после сеансов РХТ. У половины пациентов с РМЖ через неделю после проведения сеансов РХТ в клетках крови наблюдается активация синтеза новых копий мтДНК, что указывает на развитие компенсаторной реакции в этих клетках как следствие нарушения конститутивной системы 47 биогенеза энергии. Результаты определения точечных мутаций мтДНК показали, что их частота существенно повышается у пациентов, прошедших сеансы РХТ, и особенно у пациентов, у которых в клетках крови обнаруживается увеличение копий мтДНК. Эти данные указывают, что в клетках крови пациентов, прошедших сеансы РХТ, вновь синтезированные молекулы мтДНК содержат мутантные копий. Данные анализов частоты точечных мутаций мтДНК клеток крови доноровпрофессионалов, подвергшихся хроническому внешнему облучению, сравнивали с результатами таких же анализов, выполненных на образцах ДНК крови, полученной от здоровых доноров разного возраста (23–25 и 63–68 лет). Результаты исследований показали, что частота точечных мутаций мтДНК клеток крови, полученной от доноров-профессионалов, подвергшихся внешнему хроническому гамма-облучению (накопленная доза 200–300 сГр) значительно выше по сравнению с таковой у контрольных доноров разных возрастов. Дальнейшее развитие исследования с охватом большой когорты доноров-профессионалов позволит оценить роль выявляемого повышения точечных мутаций мтДНК путем сравнения их частоты с данными анализов индивидуальных медицинских и дозиметрических сведений об обследуемых донорах. СОЗДАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ УСТАНОВКИ ДЛЯ СКРИНИНГА ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА, ПОДВЕРГШИХСЯ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ А.И. Газиев, Н.А. Гуляева, И.И. Бельская, В.Г. Безлепкин, В.Н. Антипова, Н.П. Сирота Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино Разработка чувствительных методов и средств определения нарушений в генетических структурах клеток организма после действия ионизирующей радиации (ИР) является актуальной задачей для оценки риска развития отдаленных последствий и для ретроспективной диагностики доз облучения. В настоящее время существует ряд методов и подходов определения генетических эффектов действия ИР на человека, основанных на оценке нарушений ядерного генома. В последнее время, наряду с ядерным геномом, митохондриальная ДНК (мтДНК) рассматривается как более чувствительная мишень для действия ИР и других генотоксических агентов. МтДНК более уязвима для эндогенных и экзогенных повреждающих агентов, чем ядерная ДНК (яДНК). В мтДНК образуется больше повреждений при действии на клетки и многоклеточные организмы ИР, чем в соразмерном фрагменте яДНК. В 48 митохондриях менее эффективно протекает репарация различных повреждений ДНК, чем в ядрах, а частота точечные мутаций, индуцируемых эндогенными и экзогенными агентами, в мтДНК в 10–100 раз выше, чем в яДНК. Более того, мтДНК имеет гипервариабельный Dloop участок, содержащий некодируемые последовательности, в котором закрепляются точечные мутации с повышенной частотой. Исходя из основной задачи нашего проекта, мы попытались адаптировать метод гель-электрофорез во временном температурном градиенте (ВТГЭ) для определения точечных мутаций на участке D-loop мтДНК после его ПЦР-амплификации и создать макет прибора для такого электрофоретического анализа с обеспечением его программой контроля градиента температур. В настоящее время существует много методов для определения точечных мутаций в ДНК для использования в клинике. Однако все они непригодны из-за их низкой чувствительности или дороговизны для скрининга неизвестных мутаций, возникающих «случайно» в ДНК клеток облученного организма. Применение метода ВТГЭ со специальной программой контроля температур, а также использование в качестве маркерной мишени участка D-loop митохондриального генома позволило создать чувствительную тестсистему для скрининга неизвестных точечных мутаций в данном гипервариабельном участке мтДНК. Принцип метода электрофореза ДНК ВТГЭ был предложен ранее в ряде публикаций. Разделение гомодуплексов (нормальных локусов-Wt) и гетеродуплексов (мутантных локусов-Mu) связано с различным их режимом плавления и с изменением электрофоретической подвижности в полиакриламидном геле (ПААГ), температура которого повышается постепенно в процессе электрофореза. Принцип проведения лабораторного анализа точечных мутации в D-loop участке мтДНК в клетках крови пациентов заключается в следующем. На образцах общей ДНК клеток крови проводят ПЦР путем фланкирования праймерами двух фрагментов участка D-loop мтДНК. Продукты ПЦР подвергают денатурации при 95 оС и охлаждают до 45 оС со скоростью 1– 1.1 оС/мин. Полученные гомо-гетеродуплексы наносят на 6 % ПААГ в денатурирующей среде, формируемой постоянной концентрацией мочевины и температурным градиентом во времени (0.5–3 °C/ч). В процессе электрофореза двунитевая ДНК будет частично денатурироваться со снижением их электрофоретической подвижности. Поскольку денатурация мутантных (Mu) и нормальных (Wt) фрагментов ДНК одинакового размера происходит при различных температурах, то их электрофоретическая подвижность при заданных условиях будет различаться. Нами собрана установка, подобран оптимальный режим, позволяющий определять наличие мутаций во фрагментах ДНК размером 300–800 п.о. В вертикальные закрывающиеся электрофоретические 49 камеры введены элементы, регистрирующие изменение температуры на О 0,1 С. Электрофорез проводится погружением камер в термостатируемый блок при 140–150 V в течение 6–8 часов при постоянном возрастании температуры в камере на 1,5–2,0 °C/час. Поддержание роста температуры в камере с ПААГ при заданном режиме производится с помощью специальной компьютерной программы. С использованием данной системы нами проанализировано наличие точечных мутации во фрагментах участка D-loop мтДНК клеток крови трех больных (64–72 лет) раком молочной железы (РМЖ) после проведения сеансов радио-химиотерапии. При этом параллельно анализировали образцы мтДНК клеток крови трех молодых людей (23–25 лет) и в качестве эталонного образца использовали мтДНК пациента с синдромом NARP, несущего мутацию (Т→С в позиции 8993 мтДНК) в гене АТФ-азы 6. Полученные результаты показали наличие точечных мутаций в D-loop участке мтДНК клеток крови пациентов с РМЖ и воспроизводимость получаемых данных. Метод ВТГЭ позволяет проводить скрининг неизвестных точечных мутаций в чувствительном генетическом маркере (D-loop участке мтДНК) одновременно в 10–20 образцах в день. Метод может быть также использован для выявления неизвестных точечных мутаций в любых генах. Дальнейшая работа в этом направлении покажет возможность использования анализа точечных мутаций в гипервариабельном участке мтДНК методом ВТГЭ для проведения ретроспективной биодозиметрии. ИЗУЧЕНИЕ СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ-АДАПТОГЕНОВ И МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА ВЕЛИЧИНУ И ДЛИТЕЛЬНОСТЬ СОХРАНЕНИЯ ПЕРЕКРЕСТНОГО АДАПТИВНОГО ОТВЕТА В УСЛОВИЯХ IN VIVO С.И. Заичкина1), О.М. Розанова1), Г.Ф. Аптикаева1), А.Х. Ахмадиева1), Е.Н. Смирнова1), С.П. Романченко1), О.А. Вахрушева1), Н.И. Косякова2) Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, 2) Больница Пущинского научного центра, отделение иммунологии, Пущино 1) Ранее при исследовании радиационного адаптивного ответа у мышей нами было обнаружено, что малые дозы ионизирующей радиации переводят организм в адаптированное состояние, отличающееся 50 повышенной стабильностью генома и сохраняющееся практически до конца жизни животных. В предыдущем проекте был проведен поиск и выявлен ряд веществ-адаптогенов среди разных соединений, способных, как и малые дозы радиации, переводить организм в адаптированное состояние, которое можно выявить только с помощью дополнительного облучения большой дозой в лабораторных условиях (перекрестный адаптивный ответ). Поскольку современный человек часто подвергается одновременному действию как химических, так и физических факторов окружающей среды, в том числе постоянно растущему радиационному фону, целью проекта являлось исследование сочетанного действия веществадаптогенов и малых доз ионизирующей радиации на величину и длительность сохранения перекрестного адаптивного ответа в условиях in vivо, а также изучение влияния антиоксиданта кверцетина как ингибитора белков теплового шока на величину радиационного и перекрестного адаптивного ответа. В качестве веществ адаптогенов были исследованы перекись водорода как индуктор окислительного стресса в клетке, антиоксидант природного происхождения кверцетин и иммуномодуляторы (дезоксирибонуклеат натрия, дибазол, кальций хлористый). В экспериментах были использованы самцы мышей линии SHK. Данные соединения были введены животным в концентрациях, используемых в медицинской практике для профилактики и лечения различных заболеваний. Время, способ и режим введения веществ были отработаны в специальных предварительных экспериментах. Животные через определенные промежутки времени после введения адаптогенов были облучены дозой 0,1 Гр (0,125 Гр/мин) ионизирующего излучения. Другая группа животных была облучена только дозой 0,1 Гр. Через 24 ч обе группы были облучены выявляющей дозой 1,5 Гр (мощность дозы 1 Гр/мин). В качестве источника гамма-излучения использовалась установка ГУБЭ 60Со. На каждую экспериментальную точку брали не менее 5 мышей. Через 28 ч после выявляющего облучения животных забивали методом цервикальной дислокации и по стандартной методике готовили цитологические препараты костного мозга. С каждого препарата анализировали не менее 2000 полихроматофильных эритроцитов для подсчета клеток с микроядрами. В результате проведенных экспериментов было обнаружено, что сочетанное действие гамма-радиации и исследуемых веществ-адаптогенов на величину радиационного адаптивного ответа не только не уменьшало, но даже приводило к ее увеличению (независимо от того, в какой последовательности производилось воздействие этими факторами на животных), в отличие от действия ранее исследованных антиоксидантных 51 ферментов, которые приводили к исчезновению радиационного адаптивного ответа. Поскольку перекись водорода, как и малые дозы радиации, индуцировала перекрестный адаптивный ответ in vivo, не отличающийся от радиационного ни по величине, ни по временным параметрам, было изучено сочетанное действие перекиси водорода и тех же веществадаптогенов на величину перекрестного адаптивного ответа. Оказалось, как и при индукции радиационного адаптивного ответа, величина перекрестного адаптивного ответа не уменьшалась. Эксперименты по изучению возможности длительного сохранения адаптированного состояния организма при обработке животных перекисью водорода продемонстрировали, что однократное введение мышам низких концентраций перекиси водорода, так же как и в случае малых доз гамма-облучения, индуцирует перекрестный адаптивный ответ, сохраняющийся в течение всей жизни животного. ИНДИВИДУАЛЬНАЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЧЕЛОВЕКА В АСПЕКТЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА. СНИЖЕНИЕ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫХ ЭФФЕКТОВ В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА Г.Д.Засухина 1), Н.С. Кузьмина 1), И.М. Васильева 1), С.П.Громов 2), А.И.Ведерников 2), А.Н.Семячкина 3) Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН 2) Центр фотохимии РАН 3) Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии МЗ РФ 1) В клетках человека существует ряд систем, обеспечивающих гомеостаз при воздействии мутагенов физической и химической природы. Генетический полиморфизм существует по всем исследованным системам: различным типам репарации ДНК, антиоксидантной защиты, биотрансформации ксенобиотиков и т.п. Нами было проведено исследование в 2 направлениях: 1) определение активности защитных механизмов в лимфоцитах пациентов с ингибированной системой восстановления γ–индуцированных повреждений ДНК (синдром ЭлерсаДанлоса) по критериям репарации ДНК, активности супероксиддисмутазы (СОД), системы GSTM1 и GSTT1, радиоадаптивного ответа; 2) сравнение антимутагенной активности природных и синтетических антимутагенов в репаративно-дефектных клетках человека. В клетках всех обследованных пациентов с синдромом Элерса-Данлоса активность СОД – ключевого 52 фермента антиоксидантной защиты – была на уровне такового в клетках здоровых доноров. Определение GSTM1 у пациентов с этим синдромом выявило нулевой генотип у 5 из 22 детей, тогда как в контрольной группе это соотношение составило 16 из 34 человек. Данные по контрольной группе соответствуют литературным данным о примерно 50 % нулевом генотипе GSTM1 среди европейского населения (Wang et al., 2003 и др.). Можно предполагать, исходя из небольшой выборки нашего исследования, что происходит как бы «отбор» GSTM1 положительного генотипа у пациентов с синдромом Элерса-Данлоса. Возможно, что этот фермент, наряду с ферментами антиоксидантной защиты, может в какойто степени компенсировать дефект по восстановлению γ–индуцированных повреждений ДНК. Антимутагенные свойства были исследованы в клетках пациентов с синдромом Элерса-Данлоса и здоровых доноров при сравнении чесночного экстракта (ЧЭ) и наиболее эффективного одного из 5 изученных краун-соединений. Если коэффициент защиты в опытах с γ– радиацией в клетках здоровых доноров с ЧЭ был равен 88 %, у краун– соединения – 73 %, то в репаративно-дефектных клетках эти показатели были 44 и 41 %, соответственно. Следовательно, можно повышать устойчивость клеток к γ–радиации с использованием антимутагенов, даже если клетки дефектны по системе восстановления γ–индуцированных повреждений ДНК. Таким образом, нами развивается новый подход к изучению механизмов защиты клеток человека к γ–радиации и метод повышения устойчивости клеток к мутагенам на основе комплексного изучения генетического полиморфизма по системам, обеспечивающим клеточный гомеостаз. УСТОЙЧИВОСТЬ МЛЕКОПИТАЮЩИХ К ДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ. РОЛЬ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ И.К. Коломийцева, Д.А. Игнатьев, Л.Н. Маркевич, Н.И. Перепелкина, Л.В. Сложеникина, Л.А. Фиалковская Институт биофизики клетки РАН, Пущино Действие повреждающих факторов среды на млекопитающих включают эволюционно выработанные механизмы ответа на воздействие на уровне клеток, органов, тканей и физиологических систем организма. Сигнальные системы клеток играют важнейшую роль в формировании ответа на повреждающее воздействие. Ответные реакции метаболизма клеток 53 млекопитающих на воздействие энергетических факторов, например ионизирующего излучения и температуры среды, могут иметь черты сходства и различия. Выяснение механизмов устойчивости млекопитающих к действию радиации и низких температур представляет особый интерес для экспериментальной практики, медицинской радиологии, космической биологии. Целью наших исследований является изучение клеточного метаболизма и сигнальных систем у млекопитающих при действии ионизирующих излучений, пониженной температуры окружающей среды и сочетанном влиянии этих факторов. Нами было показано, что состояние гипобиоза увеличивает выживаемость крыс при общем воздействии рентгеновского излучения в дозах 6–15 Гр с ФИД 1,4; эти исследования продолжены в 2005 г. с использованием более высоких доз излучения. Показано, что в отличие от эффекта зимней спячки гибернаторов, увеличивающей радиоустойчивость при всех формах лучевой гибели, при искусственном гипобиозе обычных теплокровных повышение дозы ведет к снижению радиозащитного эффекта. При общем облучении в дозе 20 Гр, а также при локальном облучении головы в дозе до 200 Гр предварительное охлаждение существенно не влияло на продолжительность жизни крыс. Охлаждение после облучения (8 Гр), напротив, уменьшало примерно в 2 раза время жизни животных. Для выяснения механизмов модификации радиорезистентности мы использовали модель адаптивного ответа. Крыс облучали через 3 и 6 ч в разрешающей дозе 6,5 Гр после адаптивной дозы 0,1 сГр. При облучении через 3 ч нормотермных крыс по продолжительности жизни получен положительный эффект (порядка 20 %). Эффект адаптивного ответа не был выявлен у крыс, получивших выявляющую дозу в состоянии гипотермии. Возможно, охлаждение защищает кроветворную систему от излучения путем включения стрессорных механизмов (например, выброса гормонов). Мы изучали влияние излучения в адаптивной и выявляющих дозах на орнитиндекарбоксилазу (ОДК, фермент, продуцирующий полиамины, регулирующие клеточную пролиферацию и дифференцировку) в лимфоидных органах – селезенке и тимусе. После доз радиации в 1, 2 и 6 Гр через 2 ч, 1, 7 и 30 сут были обнаружены немонотонные колебания активности фермента. Активность ОДК в тимусе и селезенке изменялась антибатно, например, через 1 сут после облучения в дозе 1 Гр в селезенке отмечен рост активности ОДК до 166±7 %, при этом в тимусе наблюдали глубокое угнетение – до 11,2±2,3 %. При малой дозе (0,1 сГр) через 1 сут отмечено достоверное снижение активности фермента и в тимусе, и в селезенке. Было также показано, что рост активности ОДК в тимусе коррелирует с увеличением доли тимоцитов, находящихся в синтетической стадии (S). Таким образом, в наших опытах адаптивный ответ проявлялся при угнетении пролиферации лимфоидных клеток и не суммировался с защитным эффектом гипотермии. Были продолжены исследования влияния искусственного гипобиоза на липиды мембран неокортекса. Показано, что липидный состав ядер нейроглии более 54 подвержен влиянию гипотермии по сравнению с липидным составом ядер нейронов. В ядрах клеток нейроглии, одновременно с отмеченным ранее (2004 г.) падением количества сфингомиелина, нарастает количество холестерина. В ядрах нейронов наблюдается лишь тенденция к росту холестерина. Известно, что количества холестерина и сфингомиелина взаимозависимы и ферментативное разрушение сфингомиелина цитоплазматических мембран сфингомиелиназой (в культуре клеток) сопровождается выходом холестерина из цитоплазматической мембраны во внутриклеточную среду. Рост холестерина ядер может быть следствием активации цитоплазматической сфингомиелиназы. Возможно участие холестерина в сигнальных системах нервных клеток. Как известно, через 48 ч после воздействия на крыс летальных доз излучения, на общем фоне гибели клеток критических систем, развиваются компенсаторные процессы. Для выявления роли липидов мембран в увеличении радиорезистентности крыс, облученных в состоянии гипотермии, мы исследовали количество белка, ДНК, РНК и липидов гомогената коры головного мозга в норме и через 48 ч после следующих воздействий: 1) рентгеновского излучения в дозе 8 Гр, 2) охлаждения животных до 14–19 °С и 3) совместного действия этих факторов. В этих же условиях исследовали количество белка, липидов и РНК микросомальной фракции, а также количество белка и липидов в ядрах клеток нейронов и нейроглии. Получены предварительные данные, свидетельствующие об активации синтетических функций в тканях неокортекса под влиянием гипотермии и сочетанного воздействия гипотермии и излучения. НОВЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К МЕХАНИЗМАМ ПОВЫШЕННОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ У ЧЕЛОВЕКА В.М.Михельсон, И.М.Спивак, Н.М.Плескач, А.Г.Сотников, В.В.Прокофьева, Н.В.Смирнова Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Основным контингентом людей, имеющих наследственно повышенную чувствительность к ионизирующей радиации, являются гетерозиготные носители мутации в гене АТМ, которая в гомозиготном состоянии вызывает атаксию-телеангиэктазию (АТ) – наследственный синдром, характеризующийся, наряду с повышенной радиочувствительностью, ускоренным старением и рядом других нарушений. Гетерозиготное носительство этого гена фенотипически не выражено, хотя его распространенность составляет, по разным оценкам, от 5 до 10 % человеческой популяции. Кроме повышенной радиочувствительности, гетерозиготное носительство гена АТМ сопровождается высокой частотой 55 развития злокачественных опухолей в молодом возрасте. Таким образом, раннее выявление такого носительства необходимо в первую очередь в радиологических и онкологических больницах, где ведется облучение в лечебных целях. Нашей задачей была разработка пригодных для использования в клинике методов раннего выявления гетерозиготного носительства гена АТМ. С целью более подробного изучения гена АТМ в нашей лаборатории были получены клеточные штаммы (диплоидные фибробласты и лимфобластоидные линии) от нескольких семей с АТ (больных и их кровных родственников, являющихся гетерозиготными носителями АТ). В полученных штаммах был исследован клеточный ответ на гаммаоблучение. К началу второго года работы нами была выявлена природа непонятного ранее сочетания повышенной радиочувствительности хромосом при АТ и ряде других наследственных заболеваний с радиорезистентностью репликативного синтеза ДНК в поврежденных радиацией клетках таких больных. Методом ДНК-фиброавторадиографии было выявлено уменьшение числа одновременно реплицирующихся кластеров репликонов, приводящее к тому, что скорость репликации ДНК в облученных клетках этих больных практически не снижается в контрольных точках клеточного цикла (check-points), что не дает клетке времени на репарационные процессы. При этом сами механизмы репарации ДНК при этих болезнях могут быть и не нарушены (как при АТ) и серьезно нарушены (как при пигментной ксеродерме). В этом году мы исследовали гетерозиготных носителей гена АТМ – родителей и других родственников больных. В этом году методом проточной цитофлуориметрии мы показали, что в клетках лиц, гетерозиготных по АТ, также почти отсутствует G2-арест клеточного цикла после γоблучения. Таким образом, к модифицированному нами в 2004 г. для быстрой детекции пониженной репаративной способности клеток методу электрофореза отдельных клеток (ДНК-комет), апробированному в СПб больнице РАН, Центральном научно-исследовательском рентгенорадиологическом институте и СПб онкологическом институте, добавлен метод фиброавторадиографического определения специфического дефекта репликации ДНК в клетках. Оба метода позволяют, т.о., выявить повышенную радиочувствительность. АТМ играет решающую роль в чекпойнтах повреждений ДНК, контролируя начальное фосфорилирование многих ключевых белков общего ответа, например таких, как Р53, MDM2, BRCA1, CHK2, MDC1 и NSB1. У больных АТ и их кровных родственников было выявлено изменение временных показателей стабилизации белка Р53 после гаммаоблучения в дозе 5 Гр, причем время задержки появления детектируемых 56 методом иммунофлуоресценции количеств белка Р53 у больных и их фенотипически здоровых кровных родственников по сравнению с клетками здорового донора было одинаковым (1 час). Известно, что в клетках больных АТ, как и при других синдромах наследственного преждевременного старения, резко укорочены теломеры хромосом. Мы показали, что длины теломер в клетках гетерозиготных носителей гена АТМ характеризуются существенно большим разбросом, чем в клетках здоровых доноров. Впрочем, для диагностики гетерозиготного носительства АТ эта методика представляется малопригодной, в т.ч. и по причине ее относительной методической сложности. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ГРУПП РИСКА НА ОСНОВАНИИ АНАЛИЗА АДАПТИВНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ, ПОВРЕЖДЕНИЙ И РЕПАРАЦИИ ДНК ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЛЕТЧИКОВ И КОСМОНАВТОВ, ПОДВЕРГАЕМЫХ РАДИАЦИОННЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ 1) И.И. Пелевина , М.М. Антощина2), В.А. Бондаренко3), Н.Ю. Воробьева1), Ю.И. Воронков3), В.Я. Готлиб1), О.В. Кудряшова1), А.Н. Осипов1), Н.И. Рябченко2), А.М. Серебряный4), В.В. Цетлин3) 1) Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва 2) Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск 3) ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН 4) Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва Одна из важных проблем современной радиобиологии и медицины – выявление групп риска среди лиц, постоянно подвергаемых воздействию радиации и других агентов в малых дозах. Это относится и к летчикам, летающим на больших высотах, и к космонавтам, подвергающимся воздействию целого ряда факторов – радиации, вибрации, шуму, невесомости, стрессу и др. Показано, что у них могут возникать нарушения на молекулярном, цитогенетическом уровнях, на уровне целого организма. Так, обнаружено значительное увеличение частоты аберраций хромосом стабильного и нестабильного типа, микроядер (Romano et al., 1997; Heimers, Brenner, 2000; Федоренко и др., 2000, 2002; Lim, 2005, Esposito et al., 2001; Javicoli et al., 2003; Nicholas et al., 2003). У космонавтов в ряде случаев отмечается ослабление иммунной системы, повышение частоты вирусных инфекций, потеря костной массы, нарушения нервной системы и, возможно, повышение риска возникновения злокачественных опухолей (Raffnson et al., 2000; Dicello, 2003). 57 Целью работы является определение индивидуальной чувствительности к условиям полета, к дополнительному облучению, способности к адаптации и выделение на этой основе групп риска, для которых продолжительные полеты являются нежелательными. Всего было обследовано 15 пилотов, 1 космонавт и 11 физически здоровых доноров в возрасте 30-50 лет. Лимфоциты крови этих лиц исследовали методом ДНК-комет, характеризующим поврежденность ДНК, до и после дополнительного облучения в дозе 1,0 Гр; анализировали частоту лимфоцитов с аберрациями хромосом и типы аберраций хромосом до и после дополнительного облучения; определяли способность к адаптации – снижению повреждающего действия радиации в результате предварительного облучения клеток в малой дозе. Методом ДНК-комет было обнаружено, что у пилотов (в среднем) исходная поврежденность ДНК (в условных единицах) несколько выше, чем у контрольных доноров: у пилотов она составляет 9.67 ± 0.34 (разброс 2,49 – 31,7), у доноров – 5.49 ± 0.24 (разброс 3.33 – 8.58). Различия достоверны. После дополнительной радиационной нагрузки в дозе 1.0 Гр средняя поврежденность ДНК у пилотов также выше, чем у контрольных доноров: 21.81 ± 0.57 (разброс 6.79 до 53.0) против 13.29 ± 0.40 (разброс 8.1 – 21.9). Но особенно следует отметить, что в контрольной популяции отмечается незначительная индивидуальная вариабельность степени поврежденности ДНК как спонтанной, так и после дополнительного облучения, в то время как у пилотов обнаружены существенные индивидуальные различия по обоим параметрам. У некоторых из них степень поврежденности ДНК до и после дополнительного облучения достигает значений, выходящих за границы соответствующих 95 % доверительных интервалов распределений. Различия между пилотами и контрольными донорами выявлены также и по радиочувствительности (разности между поврежденностью ДНК после облучения и исходной поврежденностью): у пилотов она составляет (в среднем) 11,2 ± 0,5, у доноров 7,80 ± 0,45. Различие достоверно. При изучении частоты клеток с аберрациями хромосом достоверных различий между контрольными донорами и пилотами обнаружено не было. Не различались они и по частоте поврежденных клеток после дополнительного облучения в дозе 1.0 Гр. Исследование способности к адаптации – адаптивного ответа (облучение лимфоцитов в адаптирующей дозе 0.05 Гр и затем в повреждающей дозе 0.5 Гр) не выявило ни одного случая индукции адаптивного ответа у летчиков, в контрольной группе доноров адаптивный ответ развивается в 69 % случаев. Обследование космонавта, проведенное несколько лет спустя после длительного космического полета, показало, что по спонтанной поврежденности ДНК он не отличается от контрольных доноров, но у 58 него снижена радиочувствительность и выявлена способность к адаптивному ответу. Проведенные исследования дают основание полагать, что полеты на больших высотах могут вызывать нарушения генетического аппарата клеток и повышать чувствительность к последующим радиационным нагрузкам. Снижение адаптивных способностей у пилотов может говорить об уменьшении защитной реакции к экстремальным условиям окружающей среды. Особенно следует подчеркнуть, что высокой чувствительностью к условиям полетов и дополнительной радиационной нагрузке обладает лишь часть летчиков. Это свидетельствует о возможности выделения индивидуального риска. НОВЫЕ РАДИОПРОТЕКТОРЫ ЦЕЛЕВОГО НАЗНАЧЕНИЯ. 1. РАДИОПРОТЕКТОР ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНДОМЕТОФЕН: МЕХАНИЗМЫ РАДИОПРОТЕКТОР-ИНДУЦИРОВАННОГО ПОВЫШЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА И ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ М.К. Пулатова1), В.Л. Шарыгин1), Т.Г. Шлякова2), Г.А. Чернов2), И.Н. Тодоров3), Ю.И. Митрохин3) Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва 2) ГНЦ РФ – Институт биофизики при Федеральном медикобиологическом агентстве, Москва 3) Институт проблем химической физики РАН, Черноголовка, Московская область 1) Работа направлена на разработку фундаментальных основ и прикладных аспектов создания отечественных радиопротекторов целевого назначения. В результате проведения комплексных исследований был создан радиопротектор индометофен (ИМ), эффективный в условиях длительного облучения с низкой мощностью дозы. Противолучевые свойства радиопротекторов длительного действия связаны с их способностью повышать общую неспецифическую резистентность организма. Радиопротектор ИМ предназначен для снижения риска возникновения непосредственных и отдаленных последствий действия на организм низких доз радиации. Высокий защитный эффект ИМ 59 проявляется при его применении в диапазоне доз от 30 до 100 мг/кг. В случае протяженного облучения мышей в дозе LD72|30 в/б введение 30 мг/кг ИМ обеспечивало 80 %, а при пероральном введении – 95% выживаемости животных. Однократное пероральное введение ИМ повышает радиорезистентность животных на срок до 2 недель без побочных эффектов. В 2005 г. продолжены исследования молекулярноклеточных механизмов реализации радиозащитных свойств ИМ в опытах на собаках, мышах и крысах и его доклиническое изучение. С этой целью были наработаны новые партии лекарственной формы препарата, субстанции ИМ и плацебо в ЦХЛС-ВНИХФИ. Полученные партии препаратов были подвергнуты контрольному анализу на микробиологическую чистоту и соответствие их физико-химических свойств паспортным данным. Биохимический анализ показал, что применение радиозащитных доз ИМ не оказывало существенного влияния на состав периферической крови у собак. Не были выявлены и клинические нарушения. К фундаментальным результатам, существенным для понимания механизмов реализации противолучевого эффекта ИМ, можно отнести следующие: – ИМ активирует синтезы дезоксирибонуклеотидов (дРНФ), ДНК и белков в органах животных, в том числе в костном мозге, селезенке и тимусе. Максимальная интенсивность синтеза дРНФ была на 5–7 сут после применения ИМ и составляла на 5 сут 2,30 0,28 и на 6 сут – 2,69 0,30. Облучение защищенных животных в эти сроки приводило к оптимальной защите по тесту выживаемости. Увеличение скорости синтеза белков в органах мышей составляло 130–140 % от контроля. Повышенный уровень биосинтеза белков сохранялся в течение длительного времени с нормализацией к 30 сут. Синтез ДНК в селезенке и печени был также стимулирован ИМ, но не столь значительно по сравнению с радиопротектором индралином. Высокий уровень синтеза дРНФ в органах сохранялся и в первые часы после облучения, когда у незащищенных животных синтез дРНФ был существенно подавлен. Таким образом, ИМ обеспечивал повышение радиорезистентности клеток к моменту облучения и в пострадиационном периоде. Активируя синтез четырех типов дРНФ, ИМ приводил к увеличению их пулов, что необходимо для срочной репарации радиационно-индуцированных повреждений ДНК и предотвращения образования новых повреждений, обычно возникающих в органах незащищенных животных из-за низких концентраций дРНФ и их дисбаланса. Установлено, что ИМстимулированные биосинтезы ДНК и белков в органах животных ослабляют ингибирующий эффект облучения на биосинтезы макромолекул в первые 24 ч и обеспечивают более раннее и интенсивное развитие компенсаторно-восстановительных реакций. 60 – Контроль в пострадиационный период за изменениями ряда метаболических показателей (пулы Fe3+-трансферрина, Cu2+церулоплазмина, метгемоглобина и адреналина в крови; антиоксидантная, супероксиддисмутазная, глутатионпероксидазная активности плазмы крови; активности ингибиторов протеаз 2макроглобулина и антитрипсина в плазме крови; скорости синтеза дРНФ, ДНК, РНК и белков в органах) позволил установить, что в облученном организме развиваются неспецифические компенсаторновосстановительные реакции, характеризующиеся фазовой зависимостью. Ключевым звеном в развитии этих реакций является активация синтезов дРНФ, ДНК и белков в органах. Интенсивность восстановительных реакций линейно зависела от дозы облучения вплоть до летальной, при которой они приобретали характер гиперреакций. При этом организм начинал испытывать состояние физиологического напряжения, длительное сохранение которого вызывало срыв восстановительных реакций из-за истощения биосинтетического и биоэнергетического потенциалов и гибель животных. Установлено, что эффективные радиопротекторы, в числе которых индометофен и индралин, предотвращали развитие гиперформы восстановительных реакций, которые возникали у незащищенных животных. – Обосновано использование ряда маркеров периферической крови для отбора добровольцев, формирования групп испытуемых и оценки повышения резистентности организма человека при проведении клинического изучения ИМ в 2006 году. СОЗДАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИРОДНОГО И ТЕХНОГЕННОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, СПОСОБНЫХ СВЯЗЫВАТЬ СОЛИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И РАДИОНУКЛИДЫ А.В. Суслов, И.Н. Суслова, Е.М. Коротких, В.П. Степанова, Б.Ф. Яровой Санкт-Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, Гатчина Одним из наиболее перспективных методом решения проблемы очистки окружающей среды от различных видов загрязнений, содержащих соли тяжелых металлов и радионуклидов, является биоремедиация, т.е. использование микроорганизмов. Для того, чтобы получить наибольшее видовое разнообразие, нами была собрана коллекция (более 2000) микроорганизмов из природной и техногенной среды с экстремальными условиями, таких как полуостров Камчатка и острова Курильской гряды, а также штаммов микроорганизмов, 61 полученных нами из технологических вод реактора ВВР-М и цеха водоочистки ПИЯФ. За отчетный период нами выделен и изучен целый ряд штаммов дрожжей, принадлежащих видам Rodotorula aurantiaca, Rodotorula mucilagenoza, Cryptococcus laurentii, способных активно расти как на твердой, так и в жидкой Д-среде, содержащих до 10 мМ/л солей урана UO2(NO3)2∙6H2О, U238O2(CH3COO)2∙2H2O. В настоящее время проводится работа по определению сравнительных характеристик этих штаммов и эффективности связывания ими ионов U+6. На основе метода TXRES (Total-Reflection X-Ray Fluorescence Spectrometry) нами разработана методика определения сравнительных характеристик микроорганизмов при моноионном связывании в стандартных условиях роста по константам сорбции Ленгмюра. Используя эти характеристики, можно получить быстрый метод селекции микроорганизмов, обладающих максимальными эффективностями связывания, вне зависимости от видовой принадлежности. На основании полученных результатов мы приходим к выводу, что штамм дрожжей Debaryomyces hansenei N272, выделенный из природного изолята, хоть и способен расти при концентрациях солей 133Cs+1 и (или) 87Sr+2 до 100 мМ/л, имеет различные механизмы связывания этих ионов. Дальнейшие исследования позволят выяснить механизмы связывания клетками данных металлов. Методом 16S RNA идентификации, полученных нами из технологических вод реактора ВВР-М и цеха водоочистки ПИЯФ бактериальных штаммов, идентифицированы шесть видов, обладающих перспективными характеристиками связывания ионов 133Cs+1 и (или) 87 +2 Sr и повышенной радиорезистентностью. Здоровье населения, проживающего в местах с высоким уровнем техногенных загрязнений почвы и грунтовых вод, в значительной степени зависит от наличия в окружающей среде микроорганизмов, способных связывать опасные для здоровья вещества с высокой эффективностью, что не позволило бы им проникать в грунтовые воды и в следствии этого попадать в пищевой цикл высших организмов, человека в том числе. Одним из вариантов очистки окружающей среды от растворимых солей металлов и радионуклидов на сегодняшний день является восстановление/окисление ионов металлов из растворимых форм в нерастворимые. Предполагается, что наилучшие результаты можно получить при взаимодействии загрязнителей с микроорганизмами, уже присутствующими в местах загрязнений, вне зависимости от механизмов этих процессов. Однако в силу ряда обстоятельств это не всегда может быть выполнено. По этой причине штаммы микроорганизмов природного происхождения, способные связывать ионы тяжелых металлов и радионуклиды, представляют 62 наибольший научный и технологический интерес для биоремедиации мест загрязнений от таких поллютантов in situ. ДИНАМИКА ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ГИСТОНА Н2АХ КАК НОВЫЙ МАРКЕР ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА НА РАДИАЦИОННЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГЕНОМА Н.В. Томилин, М.П. Светлова, Л.В. Соловьева, В.А. Гаврилов, В.М. Михайлов Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург Двойные разрывы ДНК (ДР), образующиеся при действии ионизирующей радиации (ИР) и некоторых химических агентов, относятся к наиболее серьезным повреждениям клеток, ведущих к их гибели или к образованию хромосомных перестроек и рака. ДР образуются при действии многих противораковых фармпрепаратов, что является причиной их цитотоксичности и терапевтической эффективности. Ранней реакцией клетки на образование ДР является фосфорилирование по серину-139 минорного гистона Н2АХ (образование ф-Н2АХ), которое происходит в мегабазных доменах хроматина около каждого разрыва (Rogakou et al., 1998; 1999) и необходимо, как это недавно выяснено, для предупреждения образования неправильных воссоединений концов ДНК, ведущих к хромосомным перестройкам. Н2АХ входит в состав нуклеосомных коровых частиц, являющихся фундаментальными структурными единицами хроматина. Фосфорилирование Н2АХ в хроматине можно выявлять иммунологическими методами и использовать как маркер ДР при облучении или обработке клеток химическими агентами. В данном проекте предусмотрены как фундаментальные исследования механизма образования фокальных центров ф-Н2АХ в клеточном ядре (раздел 1), так и прикладные исследования индивидуальных вариаций динамики образования ф-Н2АХ, которые позволят использовать этот тест в медицине как показатель реакции генома на повреждения (раздел 2). В 2005 году в работе по разделу 1 был изучен вопрос о соотношении между общей плотностью хроматина и локализацией фокальных центров ф-Н2АХ, индуцированных ИР. Для этого в культивируемых клетках китайского хомячка был экспрессирован человеческий ген гистона Н2АХ, слитый с геном зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ), и показано, что ЗФП-Н2АХ хорошо интегрируется в хроматин и его распределение в ядре коррелирует с плотностью хроматина и ДНК. Это распределение неравномерно, и выявляются примерно 5-кратные вариации плотности ЗФП-Н2АХ, однако фокальные центры ф-Н2АХ, которые были мечены в наших экспериментах красной флуоресцентной меткой, локализовались 63 как в малокомпактном, так и в высококомпактном хроматине, причем количественный анализ интенсивности обеих меток показал отсутствие корреляции между ними. Это противоречит ранее предложенной гипотезе о том, что образование фокальных центров ф-Н2АХ сопровождается компактизацией хроматина (Fernandez-Capetillo et al., 2003). Нам, однако, удалось получить доказательства ремоделирования хроматина в фокальных центрах ф-Н2АХ. Это было показано при исследовании транскрипции путем прямого включения в живые клетки 5бромуридин трифосфата, когда было обнаружено, что включение этого предшественника в РНК подавляется в участках ядра, содержащих фокусы ф-Н2АХ. В этих участках вявляется также специфическая модификация гистона Н3 – его диметилирование по лизину-9 (H3K9m2), характерное для факультативного гетерохроматина, но не выявляется триметилирование гистона Н3 по лизину-9 (H3K9m3), характерное для конститутивного гетерохроматина. Известно, что образование H3K9m2 подавляет транскрипцию в неактивной Х хромосоме без ее заметной компактизации. Таким образом, фосфорилирование Н2АХ по серину-139 в участках хроматина, содержащих ДР, сопровождается, по-видимому, его факультативной гетерохроматинизацией без компактизации. H3K9m2 наряду с ф-Н2АХ может быть одним из элементов «гистонового кода» тяжелых повреждений генома, к которым относятся ДР. Что касается работы по разделу 2, то в 2005 году был синтезирован фосфорилированный по серину пептид, соответствующий по последовательности С-концевому пептиду гистона Н2АХ, и проведена его коньюгация с белком-носителем гемоцианином. Этот коньюгат будет далее использован для получения большого количества поликлональных кроличьих антител на ф-Н2АХ и для разработки количественного иммуноферментного теста для выявления ф-Н2АХ в облученных лимфоцитах пациентов. В предварительных исследованиях, в которых использовались коммерческие моноклональные антитела на ф-Н2АХ (фирмы Upstate Biotechnology, США), показано, что после облучения клеток в дозе 5 Гр, ф-Н2АХ можно уверенно выявлять иммунологическими методами в лимфоцитах, полученных из нескольких миллилитров донорской крови. СОПОСТАВИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РИСКОВ ХРОНИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ, ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ РАДИОЧАСТОТ, ХИМИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И СОЦИАЛЬНОГО СТРЕССА НА ЗДОРОВЬЕ НАСЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНОВ РОССИИ А.В.Шафиркин1), А.С. Штемберг1), И.Б.Ушаков2), Ю.Г. Григорьев3), А.Л. Васин3) 64 ГНЦ РФ – Институт медико-биологических проблем РАН Научно-исследовательский испытательный институт военной медицины МО России 3 ГНЦ РФ – Институт биофизики при Федеральном медико-биологическом агентстве В работе анализируются и сопоставляются результаты длительных хронических экспериментов и материалы эпидемиологических наблюдений профессиональных групп населения, подвергающихся воздействию ионизирующих излучений (ИИ), электромагнитных полей высоких и сверхвысоких частот (ЭМП ВЧ и СВЧ), низких нетепловых интенсивностей, а также ряда других комплексных факторов, проводившиеся в период 1960–2000 гг. в различных исследовательских центрах страны. Анализ этих данных, касающихся механизмов и характера изменения здоровья в отдаленный период у представителей профессиональных групп, показал, что при действии различных факторов отмечается неспецифический характер отдаленных неблагоприятных проявлений, связанных с увеличением частоты различных нарушений, обусловленных перенапряжением основных регуляторных систем организма. Отмечены большая скорость исчерпания функциональных и психологических компенсаторных резервов организма и проявления ускоренного его старения. Если сравнивать характер и частоты жалоб на ухудшение самочувствия у лиц обследованных групп, а также частоты заболеваний со стороны основных регуляторных систем организма, то возможно сопоставить величины интенсивности и значения дозовых характеристик действующих факторов с равноэффективными значениями мощности и суммарной дозы воздействия ИИ, для которых нами представлены алгоритмы расчета суммарного радиационного риска в течение жизни и оценены величины сокращения продолжительности жизни (СПЖ). Так, например, характер нарушений в центральной нервной системе (ЦНС) и сердечно-сосудистой системе (ССС) у лиц, работающих в ЭМП ВЧ и СВЧ, оказался аналогичным спектру нарушений, отмеченному при анализе результатов обследований работников предприятий атомной промышленности, подвергавшихся в 50-е годы прошлого столетия относительно высоким уровням воздействия ИИ от 150 до 400 сЗв. Расчеты показывают, что максимальное значение дополнительного риска смертности составит при этом 12 %, а СПЖ – 4 года. Эти расчетные значения риска отдаленных эффектов воздействия ЭМП соизмеримы с минимальными оценками, представленными в литературе (5–10 лет). На основе разработанной нами ранее модели, количественно определяющей степень снижения физиологических и психических резервов организма при воздействии различных факторов, удается в некоторой степени объяснить характер изменения коэффициентов 1 2 65 смертности населения в периоды 1960-1990 гг. и в последующем периоде до 2002 г. В частности, в работе показано очень сильное негативное воздействие на здоровье населения химического загрязнения окружающей среды. Сопоставление объемов годовых выбросов загрязняющих веществ в атмосферу и приращения логарифмов коэффициентов смертности населения показало четкую положительную коррелятивную связь. Проведенные нами расчеты показали, что риск для здоровья населения от годового химического загрязнения атмосферы в крупных промышленных центрах с развитой транспортной сетью в период 1980–1990 гг. в таких городах, как Москва, Санкт-Петербург, Липецк, Омск, Челябинск, оказался в 16 раз более высоким, чем риск отдаленных последствий допустимого годового уровня воздействия ионизирующих излучений для работников атомной промышленности и в 300 раз опасней, чем допустимые уровни ИИ для населения, регламентируемые нормами радиационной безопасности НРБ-99. Сравнительный анализ показал, что скорость ежегодного приращения логарифмов коэффициентов смертности в результате кардинальных экономических преобразований в стране за период с 1991 по 1994 г. оказалась в среднем в 8,5 раз более высокой, чем ежегодный прирост в результате комплексного воздействия химического, радиационного и других факторов за период 1960–1990 гг. Резкое увеличение смертности явилось результатом длительно действующего социального стресса, связанного с существенным ухудшением экономического положения в семьях, увеличением безработицы, с изменением приоритетов и ценностей в обществе, с потерей жизненных ориентиров и развитием глубокой депрессии у значительной части населения. На интенсивность психоэмоциональной напряженности в максимальной степени влияла кратность уменьшения доходов на душу населения. При снижении реальных доходов в семьях за период с 1991 по 1994 г. в 5 раз коэффициенты смертности за этот период в среднем по России, в том числе для городов Москвы, С.-Петербурга и других промышленных центров (Екатеринбург, Пермь, Челябинск) увеличились в 1,4 раза. Скорость ежегодного увеличения логарифмов коэффициентов смертности оказалась в 6,3 раза большей по сравнению с той, которая наблюдалась за период 1960–1990 гг. В ряде субъектов Российской Федерации (Кемеровской, Ленинградской областях и др.) интенсивность социального стресса была более сильно выражена, что связано как со снижением доходов, так и дополнительными трудностями трудоустройства. Увеличение коэффициентов смертности составило в этих регионах 1,53 раза. Скорость ежегодного нарастания смертности превысила наблюдаемую за предыдущие 30 лет в 8,7 раза. В ряде областей Дальневосточного региона: в Камчатской, Сахалинской, Магаданской и в Чукотском АО, где наряду с трудностями 66 трудоустройства имел место ряд природных стихийных бедствий (землетрясения, наводнения и др.), увеличение коэффициентов смертности составило в среднем 1,93 раза. Оно превысило прежнюю скорость ежегодного нарастания в 13 раз. В различных регионах страны это увеличение составило от 3 до 26 раз. В определенной степени дополнительное влияние на усиление социального стресса оказывало кардинальное изменение приоритетов и шкалы ценностей в обществе, а также морального климата, лишивших большинство населения уверенности в улучшение своего положения в будущем и усиливших беспокойство за судьбу своих детей. Следует отметить, что если в среднем по стране увеличение коэффициентов смертности составило 1,38 раза, то в возрастных группах мужчин 30–50 лет смертность возросла в 1,85 раза, что свидетельствует о максимальной выраженности психоэмоционального стресса у мужчин трудоспособного возраста, максимально ответственных за судьбу своих семей. Таким образом, представленная в работе модель, описывающая характер снижения компенсаторных резервов организма при хроническом действии ряда экологических и социальных факторов, позволяет сопоставлять риски воздействия этих факторов на здоровье населения. Полученные результаты могут непосредственно быть использованы в оперативной работе Федеральных санитарно-гигиенических служб России и отдельных регионов РФ при проведении мероприятий, направленных на укрепление здоровья населения различных регионов страны и улучшения демографической обстановки, а также при решении задач гигиенического нормирования воздействия физических и химических факторов окружающей среды и ряда профессиональных факторов. Показана возможность осуществления прогноза характера изменения здоровья населения страны при планировании первостепенных социальных мероприятий и мер по улучшению экологической обстановки. По материалам исследований в 2005 г. опубликованы следующие работы: 1. Шафиркин А.В., Григорьев Ю.Г. Радиобиологическое обоснование радиационного риска при осуществлении пилотируемого полета на Марс. Материалы III Сисакяновских чтений. Дубна, 2005, С. 155-191 2. Григорьев Ю.Г., Шафиркин А.В., Васин А.Л. Биоэффекты микроволнового излучения низких нетепловых интенсивностей (к обоснованию предельно допустимых уровней) //Авиакосмическая и экологическая медицина, 2005, Т. 39, № 4, С. 3-18 3. Шафиркин А.В., Васин А.Л. Риск для здоровья человека хронического действия ЭМП высоких и сверхвысоких частот. // Материалы 6 Международного симпозиума по электромагнитной совместимости и электромагнитной экологии 21-24 июня 2005 г. Санкт-Петербург, 2005. С. 297-301. 67 ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ У ЛЮДЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ, ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ИХ ЗДОРОВЬЯ И ПРОГНОЗ ОТДАЛЕННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОСЛЕДСТВИЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ РАДИАЦИИ В РЯДУ ПОКОЛЕНИЙ В.А. Шевченко1 , А.В.Рубанович 1, А.В.Агаджанян 1, Э.А.Акаева 1, Т.В.Елисова 1, Э.Л.Иофа 1, Л.Н.Костина 1, Г.И. Кузнецова 1, Н.С.Кузьмина 1 , А.Е.Мязин 1, И.Н.Нилова 1, О.Г.Панушкина 1, Л.Е.Сальникова 1, Г.П.Снигирева 2, И.И.Сусков 1 Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии Росздрава», Москва 1 2 Проведено комплексное изучение генетических эффектов у людей, подвергшихся радиационному воздействию (профессионалы-атомщики г. Сарова, ликвидаторы аварии на ЧАЭС, жители территорий с радионуклидными загрязнениями), а также у их детей с применением чувствительных цитогенетических и молекулярно-генетических методов. Средняя частота дицентриков, колец, реципрокных FISH-транслокаций – маркеров радиационного воздействия в лимфоцитах крови профессионалов-атомщиков (109 чел.), подвергшихся 40 лет назад гамманейтронному облучению в связи с созданием ядерного оружия, в 3 раза превышала контрольный уровень. Рассчитанные по частоте транслокаций дозы облучения составили от 0 до 1,84 Гр (с учетом характера облучения). Из сформированной группы профессионалов-атомщиков (81 чел.), подвергшихся свыше 40 лет назад воздействию бета-излучения трития и его оксидов, на данный момент исследован уровень и спектр хромосомных аберраций у 54 человек. Средняя частота дицентриков+колец у этой группы облученных людей в 2, 6 раза превышала контрольный уровень. С целью реконструкции поглощенных доз строятся калибровочные кривые дозаэффект для бета-излучения окиси трития. Продолжено многолетнее изучение динамики аберраций хромосом у ликвидаторов аварии на ЧАЭС. Показано, что на протяжении всего периода обследования (1986–2004 гг.) уровень радиационных маркеровдицентриков в лимфоцитах крови достоверно превышает контрольный уровень. Продолжено изучение состояния генома у детей и их родителей, проживающих на территориях с радионуклидными загрязнениями, а также в семьях ликвидаторов аварии на ЧАЭС. В обоих поколениях выявлены повышенные уровни хромосомных нарушений, что, как правило, сопровождается снижением репарационной способности геномной ДНК. Отмечена высокая индивидуальная вариабельность частот дисгеномных эффектов в организме облученных родителей и их детей. С 68 целью изучения закономерностей индукции геномной нестабильности проведены эксперименты по моделированию накопления поглощенной дозы. У детей, подвергающихся низкоинтенсивному воздействию радиации в малых дозах, выявлена повышенная чувствительность к тестирующему облучению in vitro как по сравнению с их родителями, так и детьми контрольной группы. В процессе выполнения проекта пополнен банк ДНК, который содержит генетический материал 370 человек (профессионалы-атомщики, ликвидаторы аварии на ЧАЭС, жители территорий с радионуклидными загрязнениями, а также их облученные и необлученные потомки). Проведено изучение уровня полиморфизма 5 минисателлитных локусов у детей профессионалов, подвергшихся 40-50 лет назад воздействию радиоактивного трития и его соединений. К настоящему моменту обследовано 20 семей профессионалов-атомщиков (28 детей) и 22 семьи контрольной группы (25 детей). Достоверных отличий от контрольного уровня по этому показателю не выявлено. Проведен анализ заболеваемости ликвидаторов аварии на ЧАЭС и профессионалов-атомщиков г. Сарова, а также детей, родившихся от отцов-ликвидаторов, и детей, проживающих на территориях с радионуклидными загрязнениями. Проводится анализ сопряженности выявленных цитогенетических и иммунологических отклонений в зависимости от структуры заболеваемости. Таким образом, полученные данные (по критерию хромосомных аберраций) свидетельствуют о наличии радиационно-индуцированных повреждений в организме спустя десятилетия после перенесенного облучения, а также о трансгенерационной передаче геномной нестабильности последующим поколениям. Для интегральной оценки состояния поврежденности генома проводятся дальнейшие посемейные исследования с охватом репрезентативного количества аллелей высоковариабельных мини//микросателлитных локусов и обследованных семей. Расширение банка ДНК облученных людей даст возможность проведения всего комплекса молекулярно-генетических исследований. Оценка корреляциионных связей между цитогенетическими, молекулярно-генетическими и клиникоиммунологическими показателями дает возможность разработать критерии отбора облученных людей и их детей с различной индивидуальной радиочувствительностью, риском развития радиационно-индуцированной патологии, что необходимо для выбора адекватной индивидуально обоснованной тактики профилактических и лечебных мероприятий. БИОХИМИКО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАРУШЕНИЙ СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ДЕТЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ 69 РАДИАЦИИ В МАЛЫХ ДОЗАХ ПОСЛЕ ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ КАТАСТРОФЫ В. А. Шевченко 1), Г.Ф.Иваненко 2), Е. Б. Бурлакова 2) Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва 1) 2) Для оценки действия низкоинтенсивного облучения в малых дозах, в наиболее важном диапазоне радионагрузок для огромных контингентов пострадавших от атомных катастроф, необходим поиск новых подходов и критериев. В данной работе проведен анализ возможных корреляционных связей цитогенетических показателей в лимфоцитах с уровнем восстановленного глутатиона(GSH), витаминов Е и А в плазме крови у детей, проживающих в регионах загрязненных радионуклидами Чернобыльской катастрофы (Мценск, 1–5 Ки/км2, Болхов, 5–10 Ки/км2 и Чечерск, 15–20 Ки/км2). Детей обследовали через 5-6-7 лет после аварии на ЧАЭС в возрасте от периода новорожденности до 12 лет. Группой сравнения были дети и взрослые, не подвергавшиеся радиационным воздействиям. Анализ полученных результатов показал, что ответ исследуемых систем детского организма на действие радиации имеет сложный характер: наблюдается как прямая, так обратная зависимость исследуемых показателей у детей от величины дозовых нагрузок на их матерей (Дм). Общая накопленная доза (как от внешних, так и от инкорпорированных радионуклидов) на матерей, проживающих в районах радиационного загрязнения после аварии, на порядок превышает прямые антенатальные на плод (Да). Известно, что дети более чувствительны к действию радиации, чем взрослые, поэтому очень важно изучить влияние материнских суммарных дозовых нагрузок на отдаленные цитогенетические и биохимические изменения в периферической крови их детей и сравнить ответ детского организма на действие низкоинтенсивной радиации с ответом взрослого человека. Из результатов следует, что низкие дозовые нагрузки (до 30 сЗв) вызывают увеличение как цитогенетических показателей в лимфоцитах, так и содержание водо- и жирорастворимых антиоксидантов (глутатиона, витаминов Е и А) в плазме крови у детей в отдаленные (5-6-7 лет) сроки после аварии на ЧАЭС. С увеличением дозовых нагрузок (более 30 сЗв) наблюдаемое увеличение цитогенетических нарушений в лимфоцитах сопровождается снижением уровня GSH в плазме крови у детей. Система антиоксидантов у взрослой популяции людей (ликвидаторы аварии на ЧАЭС) подобным образом отвечает на действие ионизирующей радиации в малых дозах. Необходимо отметить, что у основной группы 70 обследованных людей, приблизительно у 60 % детей и взрослых, значения исследуемых систем находятся в пределах нормы. Таким образом, обнаруженный нами качественно разный ответ организма на действие низких и высоких доз ионизирующей радиации является объективным показателем радиационно-индуцированных биохимико-цитогенетических нарушений и, по нашему мнению, может служить основой для формирования патологических состояний у детей, что позволит использовать эти показатели при разработке способов индивидуальной диагностики в патогенезе различных заболеваний, включая онкологические. ВЫЯВЛЕНИЕ ОБЩНОСТИ И РАЗЛИЧИЙ МЕХАНИЗМА И ЭФФЕКТОВ ДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И ХИМИЧЕСКИХ ТОКСИКАНТОВ В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ ДОЗ НА РЕГУЛЯЦИЮ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В СИСТЕМАХ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ СЛОЖНОСТИ ДЛЯ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОСЛЕДСТВИЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ И МОНТОРИНГА ПОПУЛЯЦИЙ ЖИВОТНЫХ, ОБИТАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО РАДИАЦИОННОГО ФОНА Л.Н. Шишкина1), М.А. Смотряева1), М.В. Козлов1), В.В. Урнышева1), В.А. Меньшов1), Н.В. Хрустова1), Е.В. Кушнирева1), Н.И. Шелудченко1), А.Г. Кудяшева2), Н.Г. Загорская2), О.Г. Шевченко2) 1) Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва 2) Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар Оценка биологических последствий совместного действия ионизирующей радиации и химических агентов затруднена вследствие непредсказуемости эффектов от разных факторов, а также отсутствия линейной зависимости биохимических изменений от исходного уровня антиоксидантного (АО) статуса тканей, интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в них и функционального состояния организма. Ранее нами обнаружена более высокая чувствительность и более длительное сохранение нарушений интенсивности ПОЛ при слабых радиационных воздействиях по сравнению с генетическими показателями в крови животных. Сохранение измененного АО статуса в тканях потомков полевок-экономок, размноженных в условиях вивария от родителей, в течение более 70 лет обитающих на территориях с разным 71 уровнем радиоактивного загрязнения, также существенно зависело от обеспеченности липидов тканей родителей антиоксидантами. Целью данной работы являлось исследование совместного действия ионизирующей радиации и химических агентов на состояние процессов ПОЛ и функциональных тестов в системах разной степени сложности (ткани лабораторных животных и мышевидных грызунов из природных популяций), а также роли процессов ПОЛ в токсигенизации среды культивирования условно-патогенной микрофлорой (УПМ) человека и животных в зависимости от кинетических характеристик липидов. Изучено влияние интенсивности процессов ПОЛ на масштаб и характер взаимосвязи между количеством внеклеточной ДНК и содержанием вторичных продуктов ПОЛ как в плазме крови интактных мышей SHK и линии Balb/c, так и при совместном действии рентгеновского излучения в сублетальных дозах и малотоксичных химических агентов (твин-80, ацетон) в малых дозах или при воздействии экстрактов из питьевой воды с разным содержанием бенз(а)пирена (БП) и полихлорбифенилов (ПХБ) в широком диапазоне концентраций. Обнаружено, что совместное действие факторов физической и химической природы или наличие более высокой концентрации ПХБ в экстрактах из питьевой воды вызывает более существенное изменение масштаба данной взаимосвязи по сравнению с величинами коэффициентов линейной регрессии для контрольных групп мышей. Отсутствие линейной зависимости масштаба изменения коэффициента линейной регрессии прямой взаимосвязи между количеством внеклеточной ДНК и содержанием вторичных продуктов ПОЛ в плазме крови мышей как от дозы рентгеновского излучения, так и от концентрации экстрактов с разным содержанием БП и ПХБ свидетельствует о неодинаковой чувствительности интенсивности процессов ПОЛ, проницаемости мембран лимфоцитов и/или фрагментации ДНК к совместному действию факторов разной природы. Важность степени окисленности липидов (содержание в них пероксидов) или наличие у липидов антипероксидной активности на клеточном и органном уровнях обусловлена соотношением скоростей образования и утилизации пероксидов в биологической системе. Это оказывает влияние на вклад липидов в развитие процесса автоокисления при температурах, приближенных к физиологическим, и переход процесса автоокисления из медленного в автоускоренный режим, что подтверждено компьютерным анализом экспериментальных данных. Показано, что масштаб и характер взаимосвязей и между соотношением отдельных фракций фосфолипидов (ФЛ) и обобщенными показателями состава ФЛ в печени интактных мышей линии Balb/c и спустя месяц после совместного действия рентгеновского излучения и химических агентов, как и эффект неспецифической токсигенизации липидсодержащих сред после роста УПМ, обусловлены кинетическими характеристиками липидов. 72 Низкоинтенсивное -излучение в пренатальный и ранний постнатальный периоды развития животных оказывает существенное влияние на состояние процессов ПОЛ в тканях и мышей линии CBA, и поколения F2 полевок-экономок от родителей, отловленных на участках с разным радиационным фоном. Достоверное изменение способности липидов печени к окислению и структурного состояния мембранной системы органа и отсутствие взаимосвязи между содержанием продуктов ПОЛ и активностью каталазы в печени мышей линии CBA из опытных групп обнаружено спустя 3 месяца после облучения мышей с мощностями доз 5 и 40 мР/ч на ранних стадиях онтогенеза. Анализ полученных результатов позволяет заключить, что биологические последствия воздействия факторов разной мощности и природы на организмы обусловлены масштабом их влияния на состояние тесно скоординированных в норме параметров физико-химической системы регуляции ПОЛ и функциональных тестов на клеточном и органном уровнях. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВОДНОЙ ПОДСИСТЕМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ С МИЛЛИМЕТРОВЫМИ ВОЛНАМИ И РАДИОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ А.К.Лященко1), А.С.Лилеев1), Т.А.Новскова2), И.В.Родштат2) 1) Институт общей и неорганической химии РАН, Москва Институт радиотехники и электроники РАН, Фрязино 2) Как в случае ионизирующей, так и неионизирующей радиации главным агентом воздействия является вода биологических систем. Имеется характерная специфика их взаимодействия с мм-излучением по сравнению с другими частотными диапазонами. В настоящее время физиологические следствия действия КВЧ (крайне высоких частот) однозначно установлены. КВЧ терапия широко используется в клинической практике и дает существенные результаты. Исходные условия и ограничения в трактовке молекулярных механизмов данного явления могут быть сформулированы на основе клинической практики, биологических и физико-химических исследований. Несмотря на их некоторую противоречивость, они должны быть общими в единой схеме описания и учитываться в рамках предлагаемых моделей. Рассматриваемые эффекты относятся ко всем клеточным системам: от семян и клеточных колоний до человеческого организма. С одной стороны, взаимодействие здесь связано с кожными покровами (т.к. мм излучение поглощается уже на глубине 2-3 мм), с другой стороны, 73 реакция проявляется на уровне целостного организма (например, при радиопротекторном действии мм волн). Речь идет о слабых энергетических эффектах, т.к. мощность излучения очень мала (~10 мВт/см2). Тем самым эти воздействия для организма в целом можно считать информационными (макроинформация за время 10-3 – 10-6 с). В то же время показано (в том числе и авторами проекта), что поглощение мм волн, в первую очередь, связано с водной подсистемой. Оно осуществляется при изменении ее структурно-кинетических характеристик за интервалы 10–10 с, т.е. это микроинформация и она диссипирует на больших временных интервалах. Соответственно, вопрос о передаче информации на уровень процессов, связанных с долгоживущими состояниями систем, составляет одну из главных нерешенных проблем. Делается попытка проследить цепочку изменений от информационных сигналов мм волн низкой интенсивности на уровне водной подсистемы клетки до реакций на уровне целого организма, в частности, при радиопротекторном действии мм волн. Развиваемый подход представляет единую схему, объединяющую задачи разных уровней: 1) физикохимическое взаимодействие мм волн с растворами клетки и межклеточной жидкости; 2) первичная мишень мм волн на уровне клетки; 3) биохимические и биофизические следствия воздействия, обеспечивающие появление долговременных процессов; 4) биохимическая и сенсорная рецепции; 5) радиопротекторный эффект мм волн. Рассматриваемый круг задач является частью более общей проблемы эффектов слабых воздействий на биологические объекты. На основе собственной модели структуры воды и теоретической схемы, связывающей ее динамику с диэлектрическими спектрами, рассчитаны и дана интерпретация спектральных зависимостей во всей области ориентационной поляризации 0–800 см-1. Выделены особенности мм-диапазона и конкретных «лечебных» частот (7,1; 5,6; 4,9 и 2 мм). В случае длины волны 2 мм поглощение обусловлено (по крайней мере, частично) другими молекулярно-кинетическими процессами, чем в остальных трех случаях. Показана специфика структурного взаимодействия с водой для диметилсульфоксида, широко использующегося в медицинской практике. В этом случае как полярные, так и неполярные группы молекулы стабилизируют структуру воды. Проведены измерения микроволновых свойств модельных растворов электролитов и растворов с компонентами биологических жидкостей (NaCl, KCl, KH2PO4, KOH, HCL и др.) при 25 оC и температуре человеческого организма (35 оC). Определены дипольные и ионные потери на различных частотах, и найдены изменения состояний воды, реализующиеся за время 10 11 с. Установлены характерные отличия для 74 растворов KH2PO4 по сравнению с другими системами с гидрофильной гидратацией ионов. С использованием дебаевской модели в интервале температур 15–35 о C рассчитано поглощение во всем ММ-интервале. Результаты проверены по собственным и литературным экспериментальным данным. Установлены растворы и интервалы частот, где поглощение больше, чем в воде (-параметр селективности). Для большинства изученных систем характерна смена знака по сравнению с водой. В то же время она характеризуется разными значениями частот мм диапазона. Наблюдается изменение с температурой. Предлагается механизм, объясняющий избыточное поглощение, на структурном уровне, определяющем молекулярно-кинетические процессы. Разные лечебные частоты отличаются по величине . Они охарактеризованы через параметры, определяющие отличия подвижности молекул воды и ионов в их гидратных оболочках. На этой количественной основе развита и конкретизирована модель первичной мишени мм волн (наноструктурный уровень организации). Она определяется дифференцированным поглощением в градиентных по составу и концентрациям электролитов в областях микронеоднородной цитоплазмы, межклеточной жидкости и изменением пространственного распределения анионов и катионов (в частности, ионов К + в растворах KH2PO4) в зонах цитоплазмы и других структурах клетки. В результате различные градиенты для разных лечебных частот соотнесены с данными медицинской практики об их эффективности. Обосновывается, что следствием указанных процессов может быть влияние на K-Na насосы клетки, приводящее к изменениям метаболизма, мембранного потенциала и передачи нервного импульса (на сенсорном уровне всего организма). На клеточном уровне роль КВЧ была показана в литературе для пентозофосфатного метаболизма. В частности, наблюдается повышение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Этот процесс сопряжен с активностью К насоса и увеличением доли ионов К+ в клетке. С другой стороны, радиационное воздействие сопровождается угнетением активности пентозофосфатного цикла. Причем наиболее чувствительным к радиационным воздействиям, в частности, к –облучению, ферментом цикла является глюкозо-6фосфатдегидрогеназа. Обратный эффект КВЧ воздействия может частично блокировать радиационные повреждения на уровне метаболических процессов клетки. Ранее было также показано, что мм волны интенсифицируют выделение физиологически активных веществ (2-макроглобулин, гепарин, гистамин и др.). 2-макроглобулин – второй по значимости фактор антитромбинового резерва. С другой стороны, при летальном 75 облучении экспериментальных животных его количество снижается на 30–40 % по сравнению с контролем. Известно также, что увеличение концентрации фибриногена В и понижение концентрации 2макроблобулина в плазме крови после радиационного воздействия свидетельствуют о развитии ДВС синдрома (диссеминированное внутрисосудистое свертывание крови), который является характерным проявлением деструкции тканей при лучевой болезни. Имеется успешное использование КВЧ терапии при ДВС синдроме при инсульте, инфаркте миокарда и острых деструктурных панкреатитах. При этом речь идет о влиянии на процессы микроциркуляции и внутрисосудистые факторы свертывания крови. Одним из факторов этого влияния является 2-макроглобулин, выделяющийся в процессе биохимической рецепции мм волн. Таким образом, КВЧ терапия приводит к регрессу ДВС синдрома и снижению его летальных признаков, наблюдаемых также при лучевой болезни человека и экспериментальных животных. Механизмы радиопротекторного действия мм волн могут быть поняты на указанной основе. ПРОТИВОЛУЧЕВОЙ ЭФФЕКТ АНТИОКСИДАНТА ФЕНОЗАНА Е.Б.Бурлакова, А.Н.Голощапов, С.М.Гуревич, Г.П.Жижина, Т.М.Заварыкина, А.И.Козаченко, Е.М.Миль, Л.Г.Наглер, Ю.А.Трещенкова, Л.Д.Фаткуллина Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва Поиск радиопротекторных соединений, эффективных при действии ионизирующей радиации в малых дозах, очень актуален. Цель настоящей работы – изучить возможности применения синтетического антиоксиданта (АО) фенозана (1-β-4-окси-3,5-дитретбутил-фенил-1пропионата К) в малых и сверхмалых концентрациях в качестве профилактического радиопротектора при облучении низкоинтенсивной радиацией в малых дозах. Было проведено изучение действия γ-излучения 137 Сs в дозе 1,2 сГр и фенозана в концентрациях 10 -14 и 10-4 моль/кг, а также их совместный эффект на 3-месячных мышах линии F1(CBAxC57Bl) на биофизические и биохимические характеристики важнейших компонентов клетки. Исследование проводили по следующей схеме: раствор фенозана вводили мышам внутрибрюшинно ежедневно в течение 4 дней, а затем через 1 день мышей забивали или подвергали 76 облучению с мощностью дозы 0,6 сГр/сут. Эффекты регистрировали сразу же и через 30 дней. Было обнаружено, что введение интактным мышам фенозана в дозах 10-14 и 10-4 моль/кг существенно влияет на многие изучаемые характеристики: повышает содержание белка р53 в плазме крови и адсорбцию ДНК селезенки на НЦ фильтрах, изменяет активность антиоксидантных ферментов печени и ферментов гликолиза мозга, снижает уровень перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах крови и повышает микровязкость эритроцитарных мембран. Обе дозы фенозана понижают эффективность альдолазы и в меньшей степени влияют на ЛДГ в цитоплазме клеток мозга, но повышают активность Cu,Zn-СОД в цитозоле печени, что указывает на неоднозначное изменение процессов регуляции разных ферментативных систем. Действие на мышей гамма-радиации в дозе 1,2 сГр, индуцируя в организме активные кислородные радикалы, вызывает изменения большинства изучаемых характеристик, противоположные влиянию фенозана, например, микровязкости липидов мембран, снижение активности глутатионредуктазы и особенно глутатионпероксидазы (ГП) в цитозоле и митохондриях печени. Облучение в дозе 1,2 сГр вызывает образование двунитевых разрывов ДНК селезенки на 1 сут, повышение уровня гемолиза эритроцитов и количества МДА (на 30 сут после воздействия). Облучение существенно влияет на «эффективность» (отношение Vmax / Km) гликолитических ферментов в субклеточных фракциях мозга. Активность альдолазы возрастает в цитоплазме, микросомах и синаптосомах в 1,3; 1,6 и 2 раза соответственно, что может приводить к нарушению регуляции активности фермента. Активность ЛДГ также повышается в цитоплазме, что приводит к увеличению интенсивности гликолиза в клетках мозга. Некоторые из характеристик изменялись при облучении однонаправленно с изменениями, вызываемыми фенозаном, например, адсорбция ДНК на НЦ фильтрах и микровязкость липидов субмитохондриальных частиц печени. О наличии радиопротекторных свойств у фенозана свидетельствуют следующие полученные результаты. Значительное повышение содержания белка р53 при совместном действии фенозана и радиации может свидетельствовать о включении сигнальных путей остановки клеточного цикла в сверочных точках, что способствует репарации повреждений генома. Обе использованные концентрации фенозана 10-14 и 10-4 моль/кг предотвращают радиационную индукцию двунитевых разрывов ДНК. Введение 10-14 моль/кг фенозана способствует нормализации процесса гемолиза, уровня МДА в эритроцитах и микровязкости их мембран при облучении. Повышение активности глутатионовых ферментов (ГП и глутатионтрасферазы) в цитозоле и 77 митохондриях печени мышей также свидетельствует о защитном действии обеих доз фенозана в ответ на облучение в малой дозе. Одним из параметров, характеризующих функционирование ферментов АО системы, можно рассматривать отношение активностей СОД/ГП в печени облученных и необлученных животных. Оказалось, что при совместном действии фенозана и радиации эта величина в цитозоле и митохондриях сохраняется на уровне контроля, что указывает на нормализацию активности этих ферментов. Защитный эффект фенозана в цитоплазме при облучении выражался в снижении величины Vmax / Km ферментов гликолиза до контрольного уровня, в нормализации регуляции их активности и интенсивности гликолиза. Выводы 1. Обнаружено существенное влияние введенного АО фенозана как в дозе 10-4 моль/кг, так и в сверхмалой дозе 10-14 моль/кг на многие биохимические и биофизические характеристики важных макромолекулярных и супрамолекулярных структур в организме мышей линии F1(CBAxC57Bl). 2. Выявлено продолжительное действие фенозана в обеих концентрациях на многие из этих характеристик. 3. Показано, что фенозан в концентрациях 10 -14 и 10-4 моль/кг при введении животным перед облучением в дозе 1,2 сГр низкоинтенсивной гамма-радиации проявляет радиопротекторное действие по ряду изученных биохимических и биофизических параметров. МОДЕЛИРОВАНИЕ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВЫСОКОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ТЯЖЕЛЫХ ЧАСТИЦ НА БЕЛКИ ХРУСТАЛИКА ГЛАЗА – КРИСТАЛЛИНЫ С ПОМОЩЬЮ УФ ОБЛУЧЕНИЯ К.О. Муранов1), H.Б. Полянский1), Г.Н. Тимошенко2), М.А. Островский1) 1) Институт биохимической физики РАН им. Н.М. Эмануэля, Москва, 2) Объединенный институт ядерных исследований, Дубна Эпидемиологические исследования показывают, что космические лучи являются важным фактором, вызывающим заболевание катарактой космонавтов и летчиков дальней авиации [1, 2]. Космические лучи составляют собой смесь излучений, при этом защита от их главного компонента – высокоэнергетических тяжелых частиц (ВЭТЧ) – существенно затруднена. Поэтому важной практической и теоретической задачей является исследование механизма возникновения катаракты под действием ВЭТЧ. Общепринято, что образование нерастворимых 78 белковых агрегатов является важным этапом в патогенезе катаракты. В наших недавних исследованиях показано, что облучение растворов кристаллинов ядрами бора высоких энергий вызывает скрытые повреждения белков хрусталика глаза, которые проявляются лишь при Lкристаллина из хрусталика глаза быка [3]. Изучение действия ВЭТЧ достаточно дорогостоящая задача, так как требует использование ускорителя заряженных частиц, поэтому целью нашего исследования было создание модели, с помощью которой можно изучать механизм действия ВЭТЧ, в частности, на кристаллины хрусталика глаза. Как известно, при пролете ВЭТЧ образуются активные молекулы (радикалы), вероятно, такие радикалы и взаимодействуют с белком, вызывая его повреждение. Аналогичная картина наблюдается при действии на белок УФ излучения, только в данном случае известен «приемник» излучения – аминокислотные остатки, содержащие циклические структуры с системой сопряженных двойных связей (триптофан и др.). Можно было ожидать, что при некоторой дозе энергии повреждение молекулы окажется аналогичным повреждению, полученному при облучении ВЭТЧ. Были исследованы свойства молекул L-кристаллина при действии различных доз УФ облучения. Показано, что предварительное облучение L-кристаллина (1 мг/мл) из хрусталика быка диапазоне доза от 2.63+0.6 и до 25.88+0.66 кДж/м2 вызывает достоверное ускорение УФ индуцированной агрегации белка, тогда как доза 1.05+0.02 кДж/м2 значимого эффекта не вызывает. Изучение полипептидного состава облученных образцов показало, что начиная с дозы 13.13+0.3 кДж/м2 в L-кристаллина, дальнейшее облучение до дозы 25.88+0.66 кДж/м2 Lкристаллина. Исследование триптофановой флуоресценции показало, что в дозах от 1.05+0.02 и до 5.25+0.12 кДж/м2 ультрафиолетовый свет не оказывает сколько-нибудь существенного влияния на интенсивность флуоресценции белка. Затем интенсивность начинает уменьшаться, что может свидетельствовать как о конформационных перестройках в молекуле, так и о распаде триптофановых остатков в результате фотохимических реакций. Гель-фильтрация (Sephacryl S200) облученных образцов показала отсутствие изменений гидродинамического радиуса L-кристаллина при УФ облучение в дозе 2.63+0.6 кДж/м2 полностью повторяют эффекты, которые обнаруживаются при действии ВЭТЧ бора в дозе 4 Gy (3). Таким образом, с помощью облучения УФ светом можно моделировать процесс повреждения белковой молекулы при действии ВЭТЧ. Литература 79 1. Cucinotta F.A., Manuel F. K., Jones J., Iszard G., Murrey J., Djojonegro B., and Wear M. (2001). Space radiation and cataracts in astronauts. Radiat.Res. 156, 460-466. 2. Rafnsson V., Olafsdottir E., Hrafnkelsson J., Sasaki H., Arnarsson A., and Jonasson F. (2005). Cosmic radiation increases the risk of nuclear cataract in airline pilots: a population-based case-control study. Arch.Ophthalmol. 123, 1102-1105. 3. М.А. Островский, К.О. Муранов, А.К. Тимофеева, А.В. Кривандин, Т.Б. Фельдман, М.Ю. Логинова, М.А. Яковлева, Г.Н. Тимошенко “Исследование повреждающего действия ядер бора (B11) высоких энергий (32 МэВ/нуклон) на белки хрусталика глаза - кристаллины и зрительный пигмент сетчатки – родопсин”, тезисы конференции «Фундаментальные науки – медицине». Москва, Фирма «Слово», 2004, С. 229. ЭФФЕКТИВНОСТЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ РАДИОЗАЩИТНЫХ СРЕДСТВ И ЭКРАНИРОВАНИЯ ПРИ -ОБЛУЧЕНИИ В СМЕРТЕЛЬНЫХ И СВЕРХСМЕРТЕЛЬНЫХ ДОЗАХ В.С.Шашков, С.К.Карсанова, В.В.Яснецов ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН Анализ результатов экспериментального и клинического изучения радиопротекторов показал, что к числу основных недостатков, затрудняющих их практическое использование при чрезвычайных аварийных радиационных ситуациях, радиотерапии злокачественных новообразований и др., относятся сравнительно низкая эффективность у крупных лабораторных животных (собаки, обезьяны) и полное отсутствие защитного эффекта в области сверхсмертельных доз облучения. Это также относится к спасательным операциям при радиационных катастрофах и, вероятно, к длительным межпланетным полетам с человеком на борту. В последнем случае имеется в виду разработка системы радиационной безопасности межпланетных космических миссий, планируемых в обозримом будущем, в первую очередь, очевидно, полета на Марс. В связи с этим задачей настоящей работы явилось изучение в эксперименте эффективности применения радиозащитных средств и экранирования различных областей тела животных с целью выбора наиболее эффективного радиопротектора и участков экранирования, а также выяснение возможного механизма их защитного действия В I серии экспериментов, проведенных на белых беспородных мышахсамцах массой 1822 г, оценивали сравнительную эффективность радиопротекторов. Животных подвергали -облучению на установке ГУБЭ800 в минимальных абсолютно смертельных дозах (8,59 Гр). Оценку противолучевого эффекта проводили по выживаемости в течение 30 суток и средней продолжительности жизни погибших животных. В качестве радиозащитных средств использовали цистамина дихлоргидрат, 80 аминоэтилизотиуроний, мексамин и индралин, которые вводили внутрибрюшинно (в/б) за 1520 минут до облучения. Анализ полученных данных показал, что наибольший защитный эффект дает индралин. При исследовании противолучевого действия индралина в зависимости от дозы оказалось, что наиболее эффективной дозой препарата является 75 мг/кг. II серию экспериментов проводили на 40 мышах линии (CBAC57BL) F1. Количество стволовых клеток определяли подсчетом макроскопических гемопоэтических колоний в селезенке (ГКС) на 710 сутки после введения индралина и облучения в дозе 9 Гр. Было обнаружено, что однократное в/б введение индралина мышам в дозе 75 мг/кг за 1520 минут до облучения приводит к увеличению числа ГКС в 5,3 раза (с 5,50,7 в контроле до 29,13,0 в опыте; р<0,05). Эти данные позволяют заключить, что в механизме радиозащитного действия индралина одну из ведущих ролей играет сохранение кроветворения на достаточно высоком уровне. В III серии опытов проводили экранирование различных частей тела крыс при -облучении (10 Гр) с помощью стальных пластин шириной от 2 до 5 см и толщиной до 15 см, что обеспечивало резкое снижение общей дозы облучения за экраном и уменьшение общей поглощенной дозы. Было, в частности, обнаружено, что экранирование области живота животных увеличивает выживаемость крыс до 27±4 %, а индралин (в/б 75 мг/кг) был практически неэффективен (6±3 %). Следует отметить, что для проявления защитного эффекта экранирования существует некоторая минимальная масса защищенных тканей, например кишечника и органов кроветворения, сохранение нормальной функции которых крайне необходимо для последующего восстановления пораженных тканей организма. Итак, индралин эффективен при -облучении в диапазоне минимальных абсолютно смертельных доз (8,59 Гр). При сверхсмертельных дозах облучения (10 Гр и более) защитное действие индралина нивелируется. Экранирование некоторых участков тела крыс уменьшает поражающий эффект ионизирующего излучения и ускоряет процессы пострадиационного восстановления. При повышении доз облучения до сверхсмертельных экранирование становится мало- или неэффективным. КОМПЛЕКСНЫЕ ПРОЕКТЫ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА. НОВЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИЗ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ 81 В.А. Стоник, Н.П. Мищенко, С.А. Федореев, Д.Л. Аминин, И.Г. Агафонова, С.А. Авилов, В.М. Богуславский, Н.Г. Прокофьева Дальневосточное отделение РАН Биологические ресурсы Дальнего Востока России являются богатым источником низкомолекулярных природных соединений, которые представляют интерес для разработки на их основе новых лекарственных препаратов. В продолжение наших работ в этом направлении мы получили ряд новых данных, связанных с созданием новых природных гепатозащитных, ноотропных и иммуномодулирующих медицинских средств. Ранее в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН при участии ряда медицинских организаций страны были созданы и разрешены к применению в России медицинские препараты серии «гистохром» для лечения инфаркта миокарда и различных глазных болезней. Недавно при поддержке Программы Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» была завершена разработка, а также зарегистрирован в России и внесен в список разрешенных к применению лекарств новый отечественный гепатозащитный препарат «максар». В 2005 году мы исследовали новые природные источники гепатозащитных веществ [1-3], изучили возможность использования «гистохрома для кардиологии» по новому назначению – для лечения гемморрагического инсульта [4-6] и выполнили ряд работ в рамках доклинических испытаний нового иммуномодулирующего препарата «кумазид» [7-9]. С целью выяснения роли отдельных групп полифенолов в реализации гепатопротекторных свойств растительных полифенольных комплексов (ПФК) нами было проведено сравнительное изучение гепатопротекторных свойств препаратов, приготовленных из традиционного растительного сырья (ПФКД) и из клеточных культур (ПФКК) Маакии амурской. ПФКД представлял собой активную субстанцию препарата «максар», а ПФКК был получен в БПИ ДВО РАН (акад. Ю.Н. Журавлев, дбн В.П. Булгаков). Гепатозащитные свойства этих веществ сравнивались в опытах in vivo при экспериментальном СCl4гепатите крыс. Терапевтическую эффективность гепатопротекторов оценивали по их влиянию на выживаемость животных, морфологические и биохимические показатели печени и сыворотки крови. Как ПФКД, так и ПФКК предупреждали гибель животных и препятствовали развитию морфологических и метаболических нарушений печени. Содержание некротизированных клеток снижалось, соответственно, в 1,9 и 2,9 раза, гепатоцитов с дистрофией − в 1,7 и 3,5 раза, количество двуядерных гепатоцитов возрастало в 2,2 и 4,9 раза, что указывает на усиление процессов регенерации печени. Плотность клеточного инфильтрата уменьшалась в 1,9 и 3,1 раза, и он локализовался, преимущественно, периваскулярно. Значительно возрастало количество 82 гепатоцитов нормального строения, уменьшалось венозное полнокровие. Между гепатоцитами появлялась молодая соединительная ткань с большим содержанием клеточных элементов − фибробластов и фиброцитов. Более эффективно восстанавливал гистоархитектонику печени ПФКК, под влиянием которого венозное полнокровие исчезало, не определялись очаги диапедезных кровоизлияний, чаще восстанавливалась структура печеночных триад. Терапия обоими гепатопротекторами сопровождалась улучшением биохимических показателей. Оба препарата статистически равно эффективно уменьшали активность в крови АсАТ (в 1,3−1,2 раза), АлАТ (в 1,5−1,6 раза), ЩФ (в 1,3−1,5 раза), ГТФ (в 2,4−2,2 раза) по сравнению с показателями контрольной группы. Содержание общего билирубина под влиянием обоих препаратов снижалось по сравнению с контролем в 1,4−1,5 раза, непрямого − в 2,2−1,9 раза, общих липидов − в 1,4 раза, белка возрастало в 1,3 раза. Кроме того, с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ) было подтверждено, что на фоне индуцированного ССl4-гепатита терапия гепатопротекторами ПФКД и ПФКК оказывает защитное действие на клетки печени, гепатоциты. С учетом различий в химическом составе ПФК из ядровой древесины и из клеточной культуры Маакии амурской, которая не содержит моно- и димерных стильбенов, был сделан вывод, что гепатопротекторное действие ПФКД и ПФКК обусловлено наличием изофлавоноидов даидзеина, ретузина, генистеина, афромозина, формононетина, оробола, текторигенина, маакиаина и медикарпина. Более детальное исследование химического состава ПФКК показало, что в отличие от ПФКД, в нем до 70 % изофлавоноидов содержатся в виде малонилглюкозидов. Очевидно, что очень высокая гепатопротекторная активность ПФКК может быть обусловлена более высокой биодоступностью этих соединений. СCl4-гепатит сопровождается повышением уровня холестерина в крови в 1,8 раза. ПФКД препятствовал развитию гиперхолестеринемии, снижая содержание холестерина в 1,5 раза. Гипохолестеринемический эффект ПФКД (препарат «максар»), очевидно, зависит от содержания в нем моно- и димерных стильбенов. Этим эффектом ПФКК не обладает. Таким образом, препарат из клеточных культур Маакии амурской проявляет (из-за различий в его химическом составе) более сильное гепатопротекторное действие, чем «максар», но не обладает, в отличие от «максара», гипохолестеринемическим эффектом. На основе этого препарата возможно создание нового лекарственного средства для профилактики и лечения заболеваний печени. Методом МРТ проведено исследование влияния препарата «гистохром» на протекание модельного геморрагического инсульта у экспериментальных животных. Подобраны разовая и курсовая дозы препарата, позволяющие получить эффект при лечении экспериментального геморрагического инсульта у крыс. Предложенная нами схема экспериментов оказалась вполне результативной для выявления способности «гистохрома» уменьшать размеры гематомы и отека, 83 сопровождающего геморрагический инсульт. Применение «гистохрома» приводило к более быстрому уменьшению последствий экспериментального инсульта у крыс по сравнению с контролем или использованием препарата «дицинон». На основании полученных результатов предложена схема применения «гистохрома для кардиологии» при лечении геморрагического инсульта у людей. Поданы документы в Фармкомитет РФ для получения разрешения на клинические испытания этого препарата по новому назначению. Разработан метод анализа эхинохрома и его метаболитов в биологических жидкостях (кровь, цереброспинальная жидкость) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Во всех образцах цереброспинальной жидкости, взятой у крыс опытной группы в интервале времени от 30 минут до 6 часов после введения «гистохрома», этим методом обнаружен эхинохром (активная субстанция «гистохрома») и продукты его окисления, что доказывает способность «гистохрома» проникать через гематоэнцефалический барьер. Ранее в рамках гранта Программы "Фундаментальная наука – медицине" была начата разработка нового иммуномодулирующего препарата на основе биоактивных тритерпеновых гликозидов из дальневосточного промыслового вида кукумарии Cucumaria japonica, т.н. «кумазида». Был создан новый метод получения активной субстанции, наработана ее опытная партия и выполнена серия доклинических испытаний, подтвердивших высокую иммуномодулирующую активность и низкую токсичность «кумазида». В продолжение доклинических испытаний «кумазида» было установлено, что он вызывает дозозависимую стимуляцию гуморального иммунного ответа в опытах in vivo. При использовании концентраций 1, 10 и 100 мкг/мышь число антителообразующих клеток к эритроцитам барана увеличивается в 1,5, 2 и 7 раз, соответственно. Эффект «кумазида» реализуется не за счет увеличения числа ядросодержащих клеток в селезенках, а за счет увеличения количества активных антителопродуцентов. В опытах in vivo «кумазид» практически не влияет на выраженность ГЗТ (гиперчувствительность замедленного типа) у мышей к эритроцитам барана. Установлено, что препарат вызывает достоверное дозозависимое повышение продукции фактора некроза опухоли (ФНО-α) мононуклеарными клетками крови человека и проявляет тенденцию к стимуляции интерлейкина 6. В то же время малые дозы препарата (0,1; 1 мкг/мл) практически не влияют на пролиферативную активность лимфоцитов и цитотоксическую активность NK-клеток (натуральные киллеры) человека по отношению к клеткам эритромиелоидной линии К-562. Препарат не влияет на продукцию основных Th1-цитокинов интерферона γ и интерлейкина 12. Проведены дополнительные опыты по выявлению противоопухолевого действия препарата на мышах с использованием МРТ. Анализ их результатов опытов показал, что «кумазид» в дозе 1 мкг/кг при пероральном введении тормозит рост опухоли в профилактической группе животных с экспериментальной мышиной карциномой Эрлиха как 84 в асцитной, так и в солидной форме. При введении «кумазида» до и после перевивки асцитной формы опухоли процент торможения роста достигает 43 %, тогда как в лечебной группе ингибирования роста опухоли не наблюдается. Кумазид вызывает торможение роста солидной формы карциномы Эрлиха в концентрации 1.0 мкг/кг. Оптимальными для торможения роста опухоли оказались следующие условия. Животных поили препаратом в течение 14 дней (7 дней до и 7 дней после инъекции опухолевых клеток). Рост опухолей у этих животных практически не наблюдался за три недели эксперимента при полной гибели контрольных мышей. Проведено исследование возможного гормоноподобного действия препарата «кумазид» и его активного компонента – кукумариозида А2-2 – с помощью трансгенной двугибридной дрожжевой клеточной системы, содержащей ген эстрогенного рецептора человека hER- и ген ß-галактозидазы в качестве репортерного гена. Было показано, что кукумариозид А2-2 в диапазоне концентраций 10-10–10-6 М не взаимодействует с эстрогенными рецепторами. Кроме того, в экспериментах по выявлению противоопухолевых свойств в условиях гормон-замещающей терапии с помощью этой же двугибридной системы показано, что кукумариозид А2-2 в диапазоне концентраций 10-8 – 10-5 М практически не конкурирует за места связывания 17-эстрадиола с эстрогенным рецептором человека и не отменяет действие стероидного гормона. С помощью техники молекулярных флуоресцентных зондов было изучено влияние препарата «кумазид» in vitro на некоторые внутриклеточные мишени. В качестве тест-систем использовали перитонеальные макрофаги, лимфоциты селезенки, гепатоциты печени и клетки асцитной карциномы Эрлиха мышей. Показано, что «кумазид» вызывает индукцию конденсации хроматина (ЕС50 =52 мкг/мл) в клетках асцитной карциномы Эрлиха. Однако появления фосфатидилсерина, дополнительного маркера индукции апоптоза, на внешней поверхности мембран опухолевых клеток, детектируемого с помощью молекулярного флуоресцентного зонда Annexin V-FITC (флуоресцеин изотиоционат), обнаружено не было. Кроме того, «кумазид» стимулирует лизосомальную активность макрофагов и активирует неспецифическую эстеразу в цитоплазме лимфоцитов. Были продолжены доклинические испытания токсических свойств «кумазида». Показано, что острая токсичность препарата на мышах при внутрибрюшинном введении составляет 80±6,7 мг/кг (ЛД50), т.е. примерно в 4 раза ниже, чем у кукумариозида А2-2 (20-25 мг/кг). Начаты исследования по оценке кумулятивных свойств и 3-месячной хронической токсичности препарата, а также параметров жизни крыс в течение 5 месяцев наблюдения согласно требованиям Фармкомитета РФ. Таким образом, было показано, что комплекс полифенолов из клеточной культуры Маакии амурской можно использовать для разработки на его основе нового гепатозащитного средства, получены данные, указывающие на перспективность применения препарата «гистохром для кардиологии» по новому 85 назначению – для лечения геморрагического инсульта, продолжены доклинические исследования иммуномодулирующего препарата «кумазид». Литература 1. Саратиков А.С., Чучалин В.С., Ратькин А. В., Ратькин Е.В., Федореев С.А., Булгаков В.П. Гепатопротекторные свойства полифенольных комплексов из древесины и клеточной культуры Маакии амурской // Экспер. и клин. фармакол., 2005. Т. 68. № 2. С. 51-54. 2. Федореев С.А., Музарок Т.И., Селецкая Л.Д., Веселова М.В., Кулеш Н.И., Глебко Л.И., Покушалова Т.В., Чучалин В.С., Саратиков А.С., Булгаков В.П., Журавлев Ю.Н. "Гепатопротекторное средство" // Патент РФ № 2244553. Б.И. № 2. 2005. 3. Fedoreyev S.A., Kulesh N.I., Rat’kin E.V., Agafonova I.G., Veselova M.V., Chuchalin V.S., Saratikov A.S. , Bulgakov V.P., Glebko L.I., Vasilevskaya N.A. Comparative study of hepatoprotective properties of polyphenols from Мaackia amurensis heartwood and cell culture // The 9th International Congress Phytopharm 2005 and PSE Yong Scientists Meeting on "Plants and Heaith", St.-Petersburg. June 22-25 2005, P. 706-712. 4. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Стоник В.А., Козловская Э.П., Гусев Е.И., Гусева М.Р., Мартинов М.Ю. Препарат Гистохром для лечения геморрагического инсульта. Способ лечения геморрагического инсульта // Решение о выдаче патента РФ № 2004111044/15 от 19. 07. 2005. 5. Стоник В.А., Гусев Е.И., Мартынов М.Ю., Гусева М.Р., Щукин И.А., Агафонова И.Г., Мищенко Н.П., Федореев С.А. Поиск веществ для лечения геморрагического инсульта. Использование магнитно-резонансной томографии в оценке эффективности гистохрома // ДАН. 2005. Т. 405. № 5. С. 1-3. 6. Mischenko N.P., Fedoreyev S.A., Turkutuykov P.V., Gerasimenko A.V. Destruction product Study of the drug Histochrome // The 9 th International Congress Phitopharm 2005 and PSE Yong Scientists Meeting on "Plants and Heaith", St.-Petersburg. June 22-25 2005, P. 175-179. 7. Aminin D.L., Pinegin B.V., Pichugina L.V., Zaporozhets T.S., Agafonova I.G., Boguslavski V.M., Avilov S.A., Stonik V.A. Immunomodulatory properties of Сumaside. Abstr. Int. Conf. Pacifichem 2005, Honolulu, Hawaii, USA, December, 2005 (in press). 8. Aminin D.L., Pinegin B.V., Pichugina L.V., Zaporozhets T.S., Agafonova I.G., Boguslavski V.M., Avilov S.A., Stonik V.A. Immunomodulatory properties of cucumariosides. Abstr. Int. Conf. PICES XIV MEQ Poster-2223, р. 189, Vladivostok, Russia, September 29–October 9, 2005. 9. Aminin D.L., Pinegin B.V., Pichugina L.V., Zaporozhets T.S., Agafonova I.G., Boguslavski V.M., Silchenko A.S., Avilov S.A., Stonik V.A. Immunomodulatory properties of Сumaside. Int. Immunopharm., 2005 (in press). 86 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ СИБИРИ В.В.Власов Сибирское отделение РАН В институтах СО РАН были проведены исследования, направленные на создание новых средств профилактики, лечения и диагностики заболеваний. Проведен токсико-фармакологический скрининг и исследование ноотропного действия клатратов глицирризиновой кислоты и стевиозида с флуоксетином и фенибутом. Полученные результаты показали возможность создания низкодозных ЦНС-активных лекарственных препаратов путем получения комплексов психотропных препаратов с глицирризиновой кислотой и стевиозидом. Разработаны малые интерферирующие РНК, подавляющие экспрессию гена c-myc и ингибирующие пролиферацию раковых клеток. На основе пептидных и олигонуклеотид-пептидных структур разработаны синтетические искусственные катализаторы расщепления РНК (химические РНКазы), потенциальные противовирусные соединения, установлены участки структуры РНК, наиболее чувствительные к этим соединениям. Предложен подход к получению с помощью химических рибонуклеаз противогриппозной вакцины. Разработаны эффективные тест-системы для детекции лекарственно устойчивых штаммов возбудителей туберкулеза и различных штаммов вирусов гепатита С и ВИЧ-1. Разработаны чувствительные методы детекции инфекционных агентов, переносимых клещами: боррелий, бартонелл, бабезий, эрлихий, риккетсий и вируса клещевого энцефалита. Исследована распространенность этих агентов в клещах сибирского региона и их наличие в крови пациентов, укушенных клещами. Обнаружены характерные изменения субфракций липопротеинов в крови больных рассеянным склерозом. В крови этих больных обнаружены каталитические антитела, расщепляющие миелин. Найдена ассоциация между врожденным пороком сердца и полиморфизмом генов B1AR (бета-1-адренорецепторы) и MTHFR (метилентетрагидрофолатредуктаза). Получены генетически модифицированные растения моркови, продуцирующие интерлейкин 18 человека. Разработана технология производства биодеградируемых материалов на основе полигидроксибутирата: материалов для получения препаратов пролонгированного действия, стентов, а также волокон и сетчатых структур для клеточной инженерии. 87 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ УРАЛА В.А.Черешнев, Б.Г.Юшков Уральское отделение РАН Сохранение здоровья населения – основная цель современной медицины. От ее достижения во многом зависит биобезопасность страны. Однако эффективное решение данной задачи во многом определяется глубиной разработки фундаментальных вопросов биологии, физиологии, генетики, экологии. Целью данного проекта явилось изучение методами фундаментальных наук механизмов нарушений различных физиологических функций у человека, разработка, экспериментальная и клиническая апробация средств и методов диагностики и лечения заболеваний человека, а также разработка мероприятий по охране окружающей среды Уральского региона. Реализация проекта осуществлялась по следующим направлениям: получение новых препаратов, разработка новых методов диагностики, расшифровка на основе фундаментальных законов биологии отдельных звеньев патогенеза, диагностики и лечения заболеваний, отработка подходов к повышению адаптивных возможностей организма и мониторингу здоровья населения. По каждому из перечисленных направлений получены новые данные, соответствующие современному уровню мировой науки. Получение новых препаратов В рамках настоящей работы разработаны научные основы технологии опытного производства субстанции фармацевтического препарата, представляющей собой суммарную высокоочищенную фракцию экдистероидов серпухи венценосной. Разработана нормативная документация для регистрации новой адаптогенной экдистероидсодержащей биологически активной добавки «Серпистен». На основе продуктов переработки возобновляемого растительного сырья осуществлен синтез соединений, перспективных для фотодинамической и бор-нейтронзахватной терапии рака и фотосенсибилизаторов для фотодинамической стерилизации донорской крови. Разрабатывается способ получения физиологически активных долихолов из доступного многотоннажного сырья – вторичных продуктов переработки древесины. На основе долихолов возможно получение препаратов с противовирусной, противоязвенной и иммуномодулирующей активностями. 88 Синтезированы новые аминофенолы с изоборнильным заместителем и пренилфенолы, являющиеся перспективными антиоксидантами. Синтезирован ряд вербенилсульфидов на основе цис-вербенола. Полученные тиолы были протестированы на антимикотическую активность. Получены оптически активные азотсодержащие производные камфорохинона, представляющие интерес как потенциально биологически активные соединения с противовирусным действием. Разработана методика синтеза розина – гликозида родиолы розовой (Rhodiola rosea L.). Разработаны научные основы создания новых онкопротекторных энтеросорбентов на основе природного растительного сырья. В результате скрининговых фармакологических исследований производных 3,4-дигидроизохинолина, аналогов природных изохинолиновых алкалоидов, было выявлено соединение под шифром Г-104, представляющее собой N-(3,3-диметил-3,4-дигидроизохинолил-1)-6’аминокапроновую кислоту, обладающую анальгетическими свойствами. Разработка новых методов диагностики Создана аппаратурно-технологическая линия для производства эритроцитарного псевдотуберкулезного иммуноглобулинового сухого диагностикума на основе антител к Б-антигену Yersinia pseudotuberculosis. По отработанной технологии на АТЛ получены три серии диагностикума, качество которых соответствует требованиям проекта фармакопейной статьи предприятия на препарат. Используя полученные нормативные значения в сравнительном анализе CD-фенотипа лимфоцитов, а также определив уровни поствакцинальных антител в крови детей, рожденных от здоровых матерей, по сравнению с таковыми у детей, рожденных от ВИЧинфицированных матерей, было установлено достоверное повышении функциональной активности иммунной системы у детей группы риска. Проведена разработка и клиническая апробация нового относительно простого метода определения концентрации циркулирующих иммунных комплексов. Получены очищенные реагенты для турбидиметрического определения человеческих иммуноглобулинов классов M, G, A. Проведена экспериментальная оценка танталовых гелевых рентгеноконтрастных средств. Отработана методика определения микроэлементного состава твердых тканей зуба на масс-спектрометре ELAN-9000 (фирмы PerkinElmer), включающая многостадийную схему послойного кислотного растворения эмали и дентина зуба и последующий микроанализ растворов. Расшифровка механизмов патогенеза заболеваний 89 Обнаружено, что необлученные линии животных с дефектами репарации, антиоксидантной защиты и апоптоза имеют более высокую скорость старения, чем линия дикого типа. Проведены исследования последовательности деполяризации интрамуральных слоев предсердий (на примере копытных животных). На основе компьютерных томографических срезов построены трехмерные модели торса животных и человека. Получены принципиально новые данные, касающиеся патогенеза ряда заболеваний человека, влияния на заболеваемость изменений экологических социальных условий, создающие основу для совершенствования методов диагностики и терапии болезней сердечно-сосудистой системы. Показано влияние активности макрофагов на биохимические процессы в регенерирующей печени, а также особенности влияния различных звеньев иммунной системы на регенерацию тканей с различной восстановительной способностью. Установлено влияние селезёнки на формирование неоднородности эритроцитов в норме и при резекции печени, а также влияние клеток костного мозга на процессы ангиогенеза в ишемизированной конечности. Продолжено исследование цитокинового профиля, острофазного ответа, наличия признаков паракоагуляции, стрессорных гормонов (кортизол, АКТГ), продуктов тканевого распада (тропонин-I, миоглобин), количественное определение в крови катионного белка эозинофилов, β2микроглобулина при ряде клинических моделях острого и хронического системного воспаления: тяжелые травмы, краш-синдром, гангрены нижних конечностей, массивные кровопотери, сепсис, системные аутоиммунные заболевания и др. Выявлен характер и отличительные патогенетические и клинико-лабораторные особенности развития отдельных фаз системного воспаления; определены основные дифференциальные клинико-лабораторные критерии системного воспаления как типового патологического процесса. Полученные данные о биологических свойствах микрофлоры, выделенной от больных при ряде инфекционно-воспалительных заболеваний лор-органов (средний отит), кишечника (сальмонеллез), репродуктивного тракта женщин (трихомониаз, сальпингоофорит) и мочевыделительных путей (пиелонефрит) свидетельствуют о важной роли персистентных свойств возбудителей в детерминации характера течения данной патологии. Кроме того, показано, что особенности развития некоторых инфекционно-воспалительных заболеваний, как итога паразито-гостальных отношений, обусловлены результатами функционирования систем "факторы персистенции патогенов – факторы неспецифической защиты макроорганизма" (например, "антилизоцим – лизоцим", "антилактоферрин – лактоферрин", "антикомплемент – комплемент"). В практическом отношении важно, что отдельные персистентные свойства (антилизоцимная, антикомплементарная, антилактоферриновая активности) и их совокупность (персистентный потенциал), наряду с некоторыми клинико-лабораторными, в том числе 90 бактериологическими и иммунологическими, признаками, обладают высокой информативностью. Разработана математическая одномерная модель электромеханической функции однородного и неоднородного миокарда, с помощью которой могут быть объяснены такие клинические явления, как «память сердца» (cardiac memory), некоторые типы нарушения ритма, снижение насосной функции сердца в определенных случаях и терапевтическая эффективность ресинхронизации сердца. На основании неинвазивной (ультразвуковой) оценки времени изоволюмического расслабления левого желудочка удалось продемонстрировать явление артериальной гипертензии у плода человека при плацентарной недостаточности и синдроме задержки его (плода) развития. Теоретическое обоснование новых методов лечения Получены данные об антагонистической активности низкомолекулярного катионного пептидного фактора варнерина, выделяемого бактериями штамма Staphylococcus warneri IEGM KL-1, запатентованного в качестве продуцента низкомолекулярного пептидного соединения, ингибирующего рост грамположительных бактерий. В экспериментах на животных показана возможность образования на вшитой под кожу полихлорвиниловой основе соединительнотканных аутопротезов. Описана динамика их формирования и приживления, а также ее особенности в условиях измененного функционального состояния иммунной системы. Разработка методов профилактики заболеваемости и мониторинга здоровья населения На примере Уральского региона разработан и апробирован метод количественных оценок генетического риска, существующего для населения территорий, подвергающихся техногенному воздействию, путем экстраполяции данных по уровню хромосомных нарушений у грызунов с тех же территорий. Разработан модельный аппарат определения латентных характеристик наркомании. Создана методология и таблицы "героинового эквивалента" для перевода различных видов наркотических веществ в сопоставимый вид. Разработана методика расчета социальной стоимости наркомании в регионе. Изучение механизмов адаптации организма к действию неблагоприятных факторов Проведено исследование механизмов адаптации человека к действию повреждающих факторов среды обитания, а именно комплексного загрязнения на организменном, органном и субклеточном уровнях. Дана оценка энергетического, микроэлементного обмена и системы крови в регуляции физиологических функций и обеспечения морфофункционального состояния, обеспечивающего организму устойчивый адаптивный статус в условиях перманентного комплексного 91 влияния как низких, так и высоких уровней загрязнения среды естественными и искусственными радионуклидами и выбросами тяжёлых металлов. Получены новые данные, подтверждающие, что процесс выведения избыточного количества тяжёлых металлов из организма относится к энергозависимым, а элиминация токсичных металлов сопровождается активацией окислительного метаболизма и повышенным синтезом митохондриального белка. Выявлена этиопатогенетическая роль тяжёлых металлов (свинца и кадмия) в формировании хронической плацентарной недостаточности, проявлением которой является гипоксия плода, обусловливающая возрастание перинатальной заболеваемости и смертности этих детей в общей популяции в 2-3 раза. Установлено, что у жителей Севера Европейской территории в сыворотке крови определяется широкий спектр различных аутоантител и высокий уровень регистрации повышенных их концентраций. Содержание аутоантител зависит от сезона и фотопериодичности: средняя концентрация и частота регистрации аномальных высоких концентраций аутоантител нарастают в зимний период, достигают максимума в феврале и снижаются в мае, в период восстановления естественной солнечной радиации. Уровни аутоантител нарастают с возрастом, наиболее значимое возрастание их наблюдается после 60 лет вне зависимости от пола. Содержание аутоантител повышается на фоне подавления процессов Т- и В–клеточной лимфопролиферации, дифференцировки и апоптоза иммунокомпетентных клеток. Механизм участия аутоантител в процессах утилизации некробиоза осуществляется при активации системы комплемента классическим и альтернативным путем, а также пролиферации и дифференцировки моноцитов. Полученные в ходе выполнения проекта данные носят не только фундаментальный характер, но и отличаются практической направленностью, что позволяет внедрять их в медицинскую практику. 92 ИССЛЕДОВАНИЕ, РАЗРАБОТКА, КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ И ВНЕДРЕНИЕ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ НА БАЗЕ ЦКБ РАН ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ БАЗАЛЬНО-КЛЕТОЧНОГО РАКА КОЖИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Ю.С.Романко, А.И.Алехин, Н.Г.Гончаров, В.В.Попучиев, В.А.Кузьмин, Т.Д.Некипелова Центральная клиническая больница РАН ГУ – Медицинский радиологический научный центр РАМН Институт биохимической физики РАН Неуклонный рост заболеваемости злокачественными новообразованиями кожи является важнейшей проблемой современной медицины и обусловливает важное практическое значение совершенствования методов лечения пациентов с данной патологией. Базально-клеточный рак кожи (БКРК) является наиболее распространенным эпителиальным новообразованием кожи. Эту проблему способна выполнить новая медицинская технология – фотодинамическая терапия (ФДТ). ФДТ – это фотохимиотерапия, при которой при взаимодействии фотосенсибилизатора (ФС) со светом в присутствии кислорода образуется синглетный кислород, который вступает в реакции с клеточными структурами, вызывая повреждение и гибель клеток. ФДТ имеет широкий спектр эффектов, как прямых (на клеточном уровне), так и непрямых, связанных с повреждением сосудов опухоли и иммуномодуляцией. Понимание механизмов ФДТ может позволить сделать ее клиническое применение более эффективным. Возможности ФДТ были ограничены из-за высокого риска тяжелых форм кожной светочувствительности. При разработке новых ФС и методов лечения важное значение в ФДТ имеет знание всей совокупности элементарных механизмов фотохимических и быстрых химических процессов с участием сложных органических молекул красителей и родственных гетероциклических соединений. Предложен новый подход в синтезе ФС для фотомедицины на основе бифункциональных соединений карбоцианиновых красителей, бискарбоцианинов, дигидрохинолинов, фуродигидрохинолинов и других гетероциклических молекул красителей и родственных соединений. Экспериментально доказано, что комплексообразование таких ФС с биомакромолекулами (ДНК, белки) приводит к сильному увеличению выхода триплетов и, как следствие этого, увеличивается эффективность генерации синглетного кислорода. Этот эффект обусловлен уменьшением процессов внутренней конверсии и фотоизомеризации в результате уменьшения подвижности ФС при комплексообразовании с 93 биомакромолекулами. Сочетание различных молекулярных фрагментов в одной молекуле реализует эффективное комплексообразование ФС с биомакромолекулами и одновременно высокий квантовый выход триплетов и, как следствие, синглетного кислорода, при этом исключены нежелательные процессы фотокроссинга молекул двухцепочечных ДНК и молекул ДНК с различными белками. Методом импульсного фотолиза получены спектрально-кинетические характеристики короткоживущих триплетных состояний комплексов ФС с биомакромолекулами. Установлено сильное различие в реакционной способности для свободных молекул ФС и их комплексов в реакциях с кислородом и рядом других тушителей триплетов. Сформулирован принцип синтеза и целенаправленного отбора новых ФС – поиск красителей с высокими квантовыми выходами интеркомбинационной конверсии в триплетное состояние в комплексах с биомакромолекулами и высокими константами скорости реакции комплекса в триплетном состоянии с кислородом. Проведено сравнение спектрально-кинетических характеристик для ряда применяемых на практике и новых фотосенсибилизаторов для фотомедицины. На сегодняшний день клиническое применение ФДТ тормозится также недостатком знаний о механизмах необратимой клеточной гибели. Была проведена экспериментально-клиническая разработка новых эффективных методов лечения базально-клеточного рака кожи с использованием ФДТ с применением Фотодитазина и лазера Аткус (661 нм). Экспериментальная часть работы выполнена на белых беспородных крысах. В качестве объекта исследования использовали саркому-М-1. Согласно полученным данным, максимальный терапевтический эффект по изменению кинетики роста новообразований в экспериментальных условиях достигается при плотности энергии 600 Дж/см2. Установлены основные механизмы ФДТ с использованием Фотодитазина: разрушение микроциркуляторного русла, быстрое ингибирование пролиферативной и функциональной активности опухолевых клеток, индукция апоптоза, развитие некроза в ранние сроки. Фотохимическими мишенями Фотодитазина являются: стенки кровеносных сосудов, плазматическая мембрана опухолевых клеток и внутриклеточные структуры, ответственные за пролиферацию. Методом ФДТ пролечены 114 пациентов с солитарными и множественными формами БКРК. В качестве ФС использованы препараты Фотогем (производное гематопорфирина – 630 нм), Фотолон (комплекс хлорина Е6 и его производных с поливинилпирролидоном, 666 нм) и Фотодитазин (хлорин Е6 – 661 нм). Показатель непосредственной полной регрессии опухоли после ФДТ с Фотогемом при БКРК не превышает 59,4 %. Полная регрессия опухоли для Фотолона и Фотодитазина – 85,5 и 95,0 %, что доказывает высокую результативность ФС хлоринового ряда. Разработаны клинические показания для проведения ФДТ больных БКРК. Результаты комплексного морфофункционального исследования показали, что Фотодитазин обладает выраженной фотодинамической 94 эффективностью в экспериментах на крысах с саркомой М-1. Слабые признаки фотохимического повреждения саркомы М-1 при использовании Фотодитазина представляют естественную фототоксичность этого препарата, которая обусловлена взаимодействием обычного света и накопленного в опухоли ФС. Эффект Фотодитазина по ингибированию роста саркомы М-1 и патоморфологическим характеристикам повреждения паренхимы опухолей составил 100 %, включая полную резорбцию опухолей у животных при дозе 600 Дж/см 2. Установлена положительная нелинейная корреляция между наблюдаемыми противоопухолевыми эффектами и плотностью подведенной световой энергии. Механизмы ФДТ с использованием Фотодитазина включают: разрушение микроциркуляторного русла, быстрое ингибирование пролиферативной и функциональной активности опухолевых клеток, индукцию апоптоза и развитие некроза в ранние сроки. Установлено, что тканевыми и клеточными мишенями Фотодитазина как ФС являются стенка сосудов, плазматическая мембрана опухолевых клеток, а также внутриклеточные структуры и механизмы, ответственные за пролиферацию. Клиническими показаниями для проведения ФДТ больных БКРК с использованием ФС хлоринового ряда являются обширные новообразования, не подлежащие лучевому и хирургическому лечению; рецидивные и остаточные опухоли, устойчивые к традиционным методам лечения; распространенность БКРК Т 1-3 при проведении радикального курса ФДТ (изъязвление и признаки кровотечения из опухолей); множественная форма БКРК; опухоли «неудобных» локализаций; высокий риск осложнений лучевого и хирургического лечения; отказ пациентов от лучевого и хирургического лечения. Проведение ФДТ с использованием ФС хлоринового ряда позволяет снизить количество побочных реакций и избежать осложнений. Непосредственные результаты после ФДТ больных с БКРК с использованием Фотогема по показателю непосредственной полной регрессии опухоли не превышали 59,4 %. Отмечен высокий процент непосредственной полной регрессии опухоли после ФДТ с использованием Фотолона (85,5 %) и Фотодитазина (95,0 %). ФДТ с использованием Фотолона и Фотодитазина обеспечивает улучшение отдаленных результатов лечения больных БКРК, повышая при этом безрецидивную 3-летнюю выживаемость до 90,4 и 92,3 % соответственно, по сравнению с 54,7 % в группе, в которой при лечении использовали Фотогем. АППАРАТНО-ПРОГРАМНЫЙ ЛЕЧЕБНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ХОДЬБЫ ЧЕЛОВЕКА 95 В.Е.Беленький, Н.Г.Гончаров, А.И.Алехин, Т.Л.Осканян, А.А.Гришин ЦКБ РАН В последние десятилетия двадцатого века по данным ВОЗ, наряду с сохранением лидирующего места за сердечно-сосудистыми и онкологическими заболеваниями, отмечается прогрессивный рост численности больных и инвалидов с патологией опорно-двигательной и нервной систем. Сегодня существуют множество хирургических и консервативных методов лечения переломов костей, заболеваний суставов, функциональных расстройств нервной системы. Однако организм человека как целостная система не может быть возвращен к норме лишь путем автономного «ремонта» отдельных его подсистем и органов. Необходимы методические приемы, направленные на восстановление всех систем, обеспечивающих выполнение основных локомоторных актов, с помощью которых человек активно перемещается в пространстве, совершает руками сложные бытовые и рабочие движения. Хорошо известно, что движение является основным стимулом деятельности всех систем организма. Поэтому совершенствование лечебных физических упражнений будет всегда оставаться одной из важных задач восстановительной медицины. В последние годы наметился новый подход к решению проблем реабилитации. Лучший результат при лечении получают не в покое, а при движении, то есть в период специфической деятельности органов опоры и движения. Теоретические предпосылки и клинические наблюдения дают основание предположить, что разработка наметившегося нового направления даст возможность активизировать восстановительные процессы и обеспечить стабильность результатов лечения. В этой связи особую актуальность приобретают разработки технических средств и способов, которые позволят реализовать этот проект. В качестве базовых объектов при реабилитации пациентов с патологией опорно-двигательной и нервной систем целесообразно использовать ходьбу, циклические движения рук, занятия на тренажерах. В этом случае при наблюдении за динамикой реабилитационного процесса необходимо оценивать наряду с клиническими показателями и биомеханические параметры. Исходя из этой концепции, предлагается в качестве базовой технологии использовать функциональную электростимуляцию (ФЭС) – направление, сформировавшееся и быстро развивающееся в последние годы. ФЭС обеспечивает возможность в процессе выполнения человеком естественных сложных движений воздействовать на функционирующие структуры и ткани органов опоры и движения. В этом случае при наблюдении за динамикой реабилитационного процесса необходимо оценивать наряду с клиническими показателями и биомеханические параметры. 96 При такой постановке вопроса важно затронуть еще один аспект – использование биомеханики в практике работы больниц, оздоровительных центров. В настоящее время в целом ряде медицинских дисциплин (травматология, ортопедия, неврология, протезирование) накопилось немало проблем, косвенно или напрямую связанных с одной и той же причиной – отсутствием инструмента, позволяющего оценивать конечный результат работы врача – исход болезни или, если имеется в виду реабилитация пациента, – степень восстановления ходьбы, движения рук и, в конечном итоге, качество жизни. Исходя из этой концепции, предлагается в качестве базовой технологии использовать ФЭС – направление, сформировавшееся и быстро развивающееся в последние годы. ФЭС обеспечивает возможность в процессе выполнения человеком естественных сложных движений воздействовать на функционирующие структуры и ткани органов опоры и движения. АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕПЛОВИЗИОННЫЙ КОМПЛЕКС «МЕД-ИК» А.И.Алехин ¹, В.П.Калинушкин ², Н.Г.Гончаров ¹, В.А.Юрьев ², С.И.Ляпунов, А.В.Пронин ³ ¹Центральная клиническая больница РАН ²Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН ³ЗАО «Матричные технологии», Москва Знание температуры по всему телу позволяет резко увеличить возможности диагностики состояния человеческого организма. Наиболее совершенным способом регистрации пространственного распределения температуры является метод инфракрасной (ИК) термографии. Термографический метод диагностики основан на регистрации собственного инфракрасного излучения с поверхности кожи человека. Высокоточный и высокоскоростной дистанционный анализ температуры пациента по его собственному инфракрасному излучению позволяет получать информацию, зачастую недоступную для других методов медицинской диагностики. Термодиагностика абсолютно безвредна для человека. Более того, быстрота обследования, достигаемая с помощью этого метода, позволяет выявлять широкий круг заболеваний уже при первичном обследовании пациента. 97 Первое клиническое применение метода связано с именем R.N.Lawson, который использовал термографию при обследовании женщин с патологией молочных желез (1958 г.). Опыт российских медиков показывает, что с помощью термовидения можно диагностировать заболевания и осуществлять мониторинг лечения: ЛОР-органов, щитовидной железы, предстательной железы, позвоночника и суставов, некоторых заболеваний сосудистой системы (синдром Рейно, диабетическая микрои макроангиопатия, облитерирующий эндоартериит, варикозная болезнь) и др. В настоящее время созданы и уже выпускаются тепловизоры 3-го поколения с высокой чувствительностью и достаточным пространственным разрешением, работающие в телевизионном режиме. Именно эти приборы в последнее десятилетие применяются в медицинской практике, но в основном за рубежом. В России тепловизоры 3-го поколения только выходят на рынок медицинских услуг. Российским представителем такого класса приборов является отечественная ИК-камера «ЛИК-2». Опыт, полученный специалистами, работающими с этой ИК-камерой, позволяет сделать вывод о том, что для широкого использования термовизионного метода только одного, даже очень хорошего тепловизора недостаточно. Необходимо создание термовизионных комплексов. Такой комплекс должен состоять из адаптированного к той или иной задаче тепловизора; необходимой компьютерной техники и математического обеспечения и, при возникновении потребности, дополнительной аппаратуры. Создание термовизионных комплексов стало возможным в результате тесного взаимодействия разработчиков и производителей тепловизоров, с одной стороны, и работников медицинских учреждений – с другой. До последнего времени создать такой альянс было крайне трудно, т.к. в России отсутствовало серийное производство тепловизоров высокого качества. Зарубежные фирмы, работающие на медицинском рынке России, предлагают к продаже высокочувствительные тепловизоры, но продажа термовизионных комплексов не входит в круг их интересов. Проблемы, связанные с практической эксплуатацией тепловизора и тем более термовизионного комплекса (включая методики диагностики заболеваний), по мнению создателей ИК-камеры «ЛИК-2», не должны стоять перед практикующими врачами. Поэтому решение таких задач должно ложиться на плечи разработчиков комплексов, что не предусматривается зарубежными фирмами. Трудноразрешимой проблемой для медицинских работников является и обслуживание тепловизоров (регламентные работы, ремонт), а также обновление программного обеспечения. Эти задачи предлагают решить разработчики и производители термовизионного комплекса «МЕД-ИК». В настоящее время организовано серийное производство тепловизоров «ЛИК-2». Как показали испытания, этот прибор по своим параметрам не уступает зарубежным аналогам, а по ряду важных технических характеристик превосходит их. Стоимость прибора 35–45 98 тыс. долларов (в зависимости от комплектации), что примерно в 2–2,5 раза меньше цены зарубежных тепловизоров того же класса. Отечественный термовизионный комплекс «МЕД-ИК» создан для диагностики заболеваний и контроля за лечением пациентов в стационарах и поликлиниках, для работы в мобильных условиях, для диспансерных и профилактических осмотров населения, для быстрого реагирования в случае возникновении эпидемической ситуации. Тепловизор «ЛИК-2» позволяет регистрировать излучение в области 3-5 мкм, что близко к максимуму интенсивности теплового излучения черного тела при температуре 300 К. Поэтому с помощью тепловизора можно регистрировать тепловое излучение всех объектов, имеющих температуру окружающей среды. Прибор работает в режиме реального времени (частота кадров 25 в секунду), при температуре жидкого азота (77 К), число элементов (пикселей) – 256х256 (в настоящее время готовится прибор с числом элементов 512х512). Чувствительность прибора 0.03 град. «ЛИК-2» в известной степени аналог видеокамеры, только работающий в инфракрасном диапазоне с соответствующим количеством пикселей (256х256). Общий вес ИК-камеры 1,8-2,4 кг, размеры 12х14х18 см. Термовизионный прибор «ЛИК-2» сертифицирован Минздравом Российской Федерации. Оптика, которой оснащен тепловизор «ЛИК-2», позволяет вести наблюдение с расстояния от нескольких десятков сантиметров до десятидвадцати метров с минимальным пространственным разрешением примерно 1 мм. Тепловизор сопряжен как с компьютером, так и с ноутбуком. «ЛИК-2» связан с компьютером через стандартный коммуникационный порт USB–2,0. Имеется также аналоговый (телевизионный) выход. С помощью комплекса Мед-ИК можно снимать, хранить, редактировать, а также экспортировать в стандартизированные для просмотра форматы тепловые «снимки» и «фильмы», производить измерения с заданным интервалом времени, а также представлять измеренную информацию в виде графиков, гистограмм, срезов. Информация может поступать в любую телекоммуникационную сеть передачи данных, включая Интернет. Термовизионный комплекс может работать в широком диапазоне условий, однако клинические испытания в ЦКБ РАН показали, что необходимыми и достаточными являются следующие условия: размер кабинета 15 кв.м, температура воздуха 20–22 оC, время адаптации пациента к температуре окружающей среды 15-20 минут, время обследования от 1 минуты до 1 часа в зависимости от задач и целей врача. Пациентами проводимое обследование оценивается как комфортное. Неинвазивность метода позволяет повторять обследование как угодно часто. Появляется возможность осуществлять высоко-эффективный контроль проводимого лечения при проведении лечебных манипуляций и процедур, при хирургических операциях, а также вести наблюдение за пациентом в послеоперационный период. 99 Термографический комплекс успешно работает в ЦКБ РАН «Узкое» с 2004 года. Опыт, накопленный за время работы в ЦКБ РАН, позволяет сделать вывод о том, что термовизионный комплекс «МЕД-ИК» может использоваться врачами для диагностики практически всех заболеваний, которые приводят к тем или иным (повышение или понижение) изменениям температуры человеческого организма. Комплекс «МЕД-ИК» является одним из первых медицинских термовизионных диагностических комплексов, созданных в России на базе отечественных матричных тепловизоров 3-го поколения. В перспективе термовизионный метод даст возможность перейти на качественно иной вид диагностики и понимания патологических процессов, происходящих в организме человека. СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЖЕНСКОГО БЕСПЛОДИЯ В.И.Кулаков, К.Г.Серебренникова, Т.В.Лопатина, Н.В.Чумакова, В.Ф.Меняшева Центральная клиническая больница РАН Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Бесплодие, оставаясь одной из актуальных проблем гинекологии, приобретает на современном этапе все большее социальное значение. Данные статистических исследований свидетельствуют о том, что 15 % супружеских пар в России являются бесплодными. В структуре бесплодного брака женское бесплодие составляет 50-60 %, в связи с чем актуальным является разработка и внедрение в практическую гинекологию современных технологий диагностики и лечения женского бесплодия. Существенное место в диагностике и лечении бесплодия занимают новые хирургические технологии, позволяющие поставить точный диагноз и провести малотравматичную коррекцию выявленных изменений без последующего развития спаечного процесса. Эндоскопические методы являются как одним из этапов диагностики, так и патогенетически обоснованным этапом терапии инфертильности. Хирургическое эндоскопическое лечение трубно-перитонеального фактора, эндометриоза и опухолевидных образований яичников как причины бесплодия с последующей реабилитацией позволяют добиться беременности в 45 % случаев. При неэффективности проведенных лечебных мероприятий целесообразно с целью восстановления фертильности использование методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Эффективность преодоления бесплодия методами ВРТ составляет 28– 35 %. Методы ВРТ позволяют не только эффективно преодолевать 100 бесплодие, но и приводят к созданию новых способов профилактики наследственных заболеваний, эффективному лечению мужской инфертильности, коррекции эндокринных нарушений. Фундаментальные исследования в области биологии и генетики способствуют усовершенствованию диагностики причин бесплодия и внедрению современных вспомогательных репродуктивных технологий. Однако до сих пор не установлены достоверные критерии, с помощью которых можно прогнозировать возможность получения качественных ооцитов, ведутся дебаты о значимости используемых схем стимуляции суперовуляции и эмбриологических модификаций для повышения эффективности программ ВРТ. Все более широко используется генетическая диагностика, позволяя не только выявить генетическую этиологию бесплодия, но и решить задачу пренатальной диагностики еще до наступления беременности. Проведение предимплантационной генетической диагностики позволяет повысить эффективность программ ВРТ и существенно уменьшить генетический риск, а следовательно, решить задачу рождения здорового ребенка. Таким образом, эффективность восстановления репродуктивной функции складывается из оценки состояния репродуктивной системы с помощью стандартизованного алгоритма обследования, диагностики факторов бесплодия, проведения комплексной поэтапной терапии в зависимости от клинической формы заболевания. Активное внедрение последних достижений медицинской науки в клиническую практику позволит найти решение многих задач в лечении и диагностике бесплодия, обеспечит доступность их большему числу врачей и пациентов. ТЕРАПИЯ БЕСПЛОДИЯ МЕТОДОМ ЭКО И ПЭ У ЖЕНЩИН ПОСЛЕ ОПЕРАЦИЙ НА ЯИЧНИКАХ К.Г.Серебренникова, Т.В.Лопатина, А.О.Духин, В.Ф.Меняшева, Н.В.Чумакова Центральная клиническая больница РАН Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Объем оперативного вмешательства при хирургическом лечении опухолевидных образований яичников (ООЯ) в значительной степени определяет эффективность восстановления репродуктивной функции, в том числе в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Цель 101 Определение эффективности экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО и ПЭ) у женщин после оперативного лечения опухолевидных образований яичников. Материалы и методы В наше исследование вошли 52 женщины в возрасте от 20 до 38 лет, обратившиеся в связи с бесплодием и имеющие в анамнезе операции на яичниках по поводу функциональных или эндометриоидных кист. Первичное бесплодие было у 20 (38,5 %) пациенток, вторичное у 32 (61,5 %). По объему оперативного вмешательства на яичниках все пациентки были распределены на две группы: в первую группу (n = 24) вошли женщины с односторонней аднексэктомией, во вторую (n = 28) – с одноили двухсторонней цистэктомией. 24 (46,2 %) пациентки из исследуемых групп оперированы лапаротомным доступом, 28 (53,8 %) – лапароскопическим. С целью реабилитации перед проведением ЭКО и ПЭ пациенткам с эндометриоидными кистами назначались прогестагены в непрерывном режиме, с функциональными кистами – низкодозированные комбинированные оральные контрацептивы. Пациентки исследуемых групп достоверно (p<0,05) не отличались по возрасту, длительности бесплодия, характеру менструальной функции, базальному уровню ФСГ. Стимуляция суперовуляции пациенткам обеих групп проводилась сочетанием препаратов рФСГ (Гонал-Ф) и чМГ (Меногон) на фоне десенситизации гипофиза агонитом ГнРг (Декапептил) по 0,1 мг со 2-го дня менструального цикла. Критериями назначения овуляторной дозы ХГ явилось достижение фолликулами диаметра 18–22 мм, толщины эндометрия 8–10 мм, уровня эстрадиола 300 пмоль/л на каждый лидирующий фолликул. Трансвагинальная пункция фолликулов, аспирация ооцитов, их оплодотворение и культивирование эмбрионов осуществлялись по общепринятой методике. Результаты У 52 пациенток проведено 58 циклов стимуляции суперовуляции. Перенос эмбрионов был произведен во всех циклах стимуляции. Длительность стимуляции суперовуляции у пациенток первой группы составила 10±2,3 дня, во второй группе аналогичный показатель равен 9,2±0,2 дня. В первой группе суммарная доза рФСГ и чМГ на один цикл стимуляции составила в среднем 2550±150 МЕ, во второй – 3000±250 МЕ. Среднее количество полученных ооцитов в группе пациенток с односторонней аднексэктомией составило 5,2±2,8, эмбрионов 2,4±0,6, аналогичные показатели пациенток после операций на яичниках в объеме цистэктомии составили 9,6±1,4 и 5,3±1,7. Частота наступления беременности на перенос эмбрионов в первой группе составила 17,6 %, во второй – 22,2 %. Выводы 102 Эффективность терапии бесплодия методом ЭКО и ПЭ операциями на яичниках определяется объемом вмешательства, что достоверно влияет на состояние резерва, количество полученных ооцитов и частоту беременности. у пациенток с оперативного овариального наступления НОВЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИЗ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В МЕДИЦИНЕ Е.П. Феофилова1), В.М. Терешина1), А.С.Меморская1), Н.Г.Гончаров2), Л.М.Дулькин2) , Т.А.Полетаева2), А.Л.Гаганов 3) 1) Институт микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН, Москва 2) Центральная клиническая больница РАН, Москва 3) Поликлиника № 2 ЦКБ РАН, Москва В последние годы мицелиальные грибы стали источниками получения ценных лекарственных препаратов, влияющих на иммунную систему, обладающих холестеринпонижающей, антивирусной, гипогликемической и антираковой активностями. В настоящее время многие представители царства Fungi считаются готовыми лекарственными препаратами, а биологически активные вещества (БАВ) из грибов широко используют в медицине. В этой области грибы оказались настолько востребованными, что появилось новое направление медицины – фармакологическая микология. Развитие этой новой отрасли медицины обусловлено возможностью создания замкнутых экологически чистых технологий, использованием недефицитного сырья, получением нескольких конечных продуктов и близостью грибов к высшим эукариотам. Доклад посвящен созданию новых технологий получения из мицелиальных грибов новых лекарственных средств – Миколикопина и пищевых волокон, их применению в медицине и возможности использования в условиях ЦКБ РАН. В Институте микробиологии РАН был разработан способ получения из грибов нового лекарственного средства, названного Миколикопином, представляющего собой желатиновые капсулы, содержащие 2 % ликопина и БАВ гриба (убихиноны, производные ретиналя, эссенциальные жирные кислоты, фосфолипиды и др.). В РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН проведены испытания, показавшие, что Миколикопин кроме антиоксидантного обладает антимутагенным, радиопротекторным и иммуномодулирующим действием. В опытах на животных установлена способность Миколикопина на 50-70 % задерживать развитие рака предстательной железы (РПЖ). Данные лаборатории лекарственной токсикологии ВИЛАР в хроническом эксперименте на собаках 103 свидетельствуют о его низкой токсичности и отсутствии противопоказаний для его применения в клинике. В настоящее время совместно с сотрудниками отделения урологии ЦКБ РАН проведен критический анализ литературных данных за последние 10 лет о способности ликопина задерживать развитие РПЖ и разработана программа медико-биологических испытаний на животных на модели рака простаты с использованием Миколикопина и сурфагона – агониста гормона люлиберина. Настоящий доклад посвящен также новым биотехнологиям получения других биологически активных веществ из грибов и изучению их химического состава. Приводятся данные о составе базидиом ряда съедобных грибов и обсуждается использование в медицине трегалозы, маннита и хитин-глюканового комплекса (ХГК). Более подробно обсуждается биотехнология получения и значение ХГК грибов в качестве диетических волокон, интенсифицирующих деятельность желудочнокишечного тракта, сорбирующих раковые клетки, ионы тяжелых и радиоактивных металлов, снижающих уровень холестерина в крови и препятствующих ожирению. По новой технологии из плодовых тел съедобного гриба Pleurotus ostreatus (вешенки), выращенных в ЗАО Агрокомбината «Московский», получены пищевые волокна для диетического питания. Совместно с сотрудниками второго терапевтического отделения ЦКБ РАН начаты предварительные клинические испытания пищевых волокон из грибов, используемых в качестве диетического питания, установлена оптимальная доза, улучшающая деятельность желудочно-кишечного тракта. В заключительной части доклада обсуждается перспективность фармакологической микологии и приводятся данные о новом медицинском использовании препарата из грибов – Микоране. Этот препарат с первоначальным назначением как противоожоговый и ранозаживляющий, разрешенный к применению в клиниках Минздравом РФ, в течение 3 лет изучается в поликлинике № 2 ЦКБ РАН. Получены результаты, позволяющие использовать Микоран по новому назначению – у пациентов с трофическими нарушениями (пролежни). ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОДДЕРЖКИ ЛЕЧЕБНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА. СОЗДАНИЕ 104 ИНТЕГРИРОВАННОЙ ИНФОРМАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ ЛЕЧЕБНОПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ 1) Н.Г.Гончаров, 1)А.И.Алехин, 2)Я.И.Гулиев, 2)В.Л.Малых 1) ЦКБ РАН, 2)ИПС РАН Интегрированные медицинские информационные системы (МИС) лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) предназначены для информатизации деятельности всех служб ЛПУ и должны предоставлять необходимую информацию и сервисы как для внутриучрежденческих задач, так и для внешнего взаимодействия. Работы велись в направлении поиска научных и технологических решений ключевых проблем проектирования и создания интегрированных медицинских информационных систем (МИС): Исследование основных принципов МИС, которые должны учитываться при создании таких систем. Разработка архитектуры информационной системы для "сложных" предметных областей, каковой является медицина. Создание концептуальной модели единой электронной медицинской карты. Интеграция медицинской информации с финансовоэкономическими данными. На основе исследований сформулированы основные принципы, на которых должны основываться интегрированные МИС и которые должны учитываться при проектировании и реализации таких систем: 1. Концентрация информации вокруг пациента. 2. Обеспечение масштабируемости МИС. 3. Интеграция информационных потоков ЛПУ. 4. Охват в системе всех сторон жизнедеятельности учреждения. 5. Автоматизация оформления документации. 6. Автогенерация статистических отчетов. 7. Представление медицинской информации в динамике. 8. Редактируемые справочники, позволяющие настройку МИС. 9. Многосторонний финансовый учет и анализ медицинских услуг. 10. Изменение технологии работы учреждения с оптимизацией бизнес-процессов в результате внедрения МИС. 11. Обеспечение необходимого регламента доступа к медицинской информации. 12. Обеспечение телемедицинских функций. В части стандартов описания Единой медицинской карты (ЕМК) основной концептуальный вывод таков – в России и в мире в настоящее время нет устоявшихся "окончательных" стандартов в области медицинской информатики. Единственно верным стратегическим решением в этой ситуации представляется разработка архитектуры, 105 ориентированной на стандарты. Нами сделан вывод о возможной концепции стандарта описания медицинской информации, который должен будет заключать в себе как жестко формализованные концепты предметной области, так и свободно конструируемые по заданным правилам информационные структуры. Такая архитектура была разработана в ИЦМИ ИПС РАН и получила название HL-X (по аналогии со стандартом HL7). Стандарты должны определять понятия и концепты предметной области и правила конструирования информационных структур на основе понятийного и концептуального тезауруса предметной области. Еще одна концептуальная идея архитектуры HL-X – введение процесса концептуализации предметной области непосредственно в саму информационную систему. В архитектуру системы в качестве концептуальной основы введен метауровень информационных объектов (ИО), соответствующих концептам и понятиям предметной области. В качестве второго уровня концептуализации предметной области в архитектуру МИС Интерин был введен метауровень HL-X документа. На этом уровне информация представляется в виде документов, имеющих формализованные модели, основанные на понятиях и концептах предметной области. Благодаря этому уровню информация из медкарты может быть представлена в формате XML, который как нельзя лучше подходит для экспорта и импорта данных между узлами единого информационного пространства (ЕИП). В настоящее время построены метамодели ЕМК в виде иерархии информационных объектов и XML модели отдельных документов (дневников, осмотров, эпикризов, специализированных протоколов), основанные на словарях понятий и концептов. Полученные результаты могут оказать влияние на процесс стандартизации и развития отечественной медицинской информатики. СОДЕРЖАНИЕ 1. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭТИОЛОГИИ И ПАТОГЕНЕЗА РЯДА РАСПРОСТРАНЕННЫХ И СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ 106 1.1. Нейродегенеративные заболевания. Болезнь Альцгеймера ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СФИНГОМИЕЛИНОВОГО ЦИКЛА В КАЧЕСТВЕ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ МОНИТОРИНГА НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ НОВОГО ПОКОЛЕНИЯ А.В.Алесенко, А.Е. Бугрова, Т.А.Воронина, Т.Л.Гарибова, М.А.Шупик 3 РАЗРАБОТКА НОВЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА НА ОСНОВЕ ОРИГИНАЛЬНЫХ МОДУЛЯТОРОВ АКТИВНОСТИ ИОНОТРОПНЫХ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ С.О.Бачурин, В.В.Григорьев, М.В.Лавров, В.А.Палюлин, Н.С.Зефиров 5 РОЛЬ НАРУШЕНИЙ В ОБОНЯТЕЛЬНОЙ СИСТЕМЕ В ГЕНЕЗЕ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И РАЗРАБОТКА НА ЭТОЙ ОСНОВЕ НОВЫХ ПОДХОДОВ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ ДАННОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ Н.В.Бобкова, Н.И.Медвинская, И.В.Нестерова, И.Ю.Александрова, А.Н.Самохин, Ю.Г.Гершович, П.М.Гершович, И.Э.Лежнева, Е.М.Жеребкер, Л.М.Царева, Б.В.Бахарев 7 КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ПРИ РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ И ДРУГИХ ВИДАХ НЕЙРОПАТОЛОГИИ А.Г.Габибов, Н.А.Пономаренко, О.М.Дурова, И.И.Воробьев, A.А.Белогуров, И.Н.Куркова, Г.Б.Телегин, В.К.Мисиков, С.В.Сучков, В.Д.Кнорре, А.И.Алехин, Н.Г.Гончаров 10 ОБЩИЕ МЕХАНИЗМЫ ГИБЕЛИ НЕЙРОНОВ ПРИ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПАТОЛОГИЯХ РАЗНОГО ТИПА: МИТОТИЧЕСКАЯ КАТАСТРОФА Н.В.Гуляева, А.Б.Гехт, В.А.Маркевич, М.Н.Захарова, Л.Г.Хаспеков, И.П.Белецкий, М.Ю.Степаничев, М.В.Онуфриев 12 ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕЙСТВИЯ ОСТРОЙ И ХРОНИЧЕСКОЙ ГИПОКСИИ НА РАЗВИТИЕ ДЕМЕНЦИИ И БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА – НОВЫЙ ВЗГЛЯД НА МЕТАБОЛИЗМ АМИЛОИДНОГО ПЕПТИДА, МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ И.А.Журавин, Н.Н.Наливаева, С.А. Плеснева, Н.Л.Туманова, Д.С.Васильев, Н.М.Дубровская, Е.Г.Кочкина, М.Ф.Баллюзек, Н.Л. Самус, В.П. Анисимов, L. Fisk, A.J.Turner 14 ПРОБЛЕМА СОЗНАНИЯ И НАРУШЕНИЕ ЦЕНТРАЛЬНЫХ РЕГУЛЯЦИЙ ПРИ НЕРВНО-ПСИХИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ А.М.Иваницкий, Г.Н.Болдырева, Э.А.Костандов, М.Н.Русалова, Н.Е.Свидерская, В.Б.Стрелец 16 107 ФРАГМЕНТАЦИЯ ДНК И ФАКТОРЫ АПОПТОЗА В МОЗГЕ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ – МОДЕЛЕЙ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА И В КЛЕТКАХ КРОВИ ОТ ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ АЛЬЦГЕЙМЕРА Ю.Г.Каминский, А.С.Погосян, А.А.Овсепян, Е.А.Косенко, К.Монтолиу, В.Фелипо 19 ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КАЛЬЦИЙСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ ИХ АНТИРАКОВОЕ ДЕЙСТВИЕ И ФОРМИРОВАНИЕ АМИЛОИДНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ С.Е.Пермяков, В.Н.Уверский, И.В.Першикова, А.П.Жадан, А.Г. Бакунц, Л.Берлинер, Ч.Брукс, Г.Махатадзе, Е.А.Пермяков 21 ВЫЯСНЕНИЕ РОЛИ САРКОМЕРНЫХ ЦИТОСКЕЛЕТНЫХ БЕЛКОВ В ОБРАЗОВАНИИ АМИЛОИДОВ И В ПАТОГЕНЕЗЕ АМИЛОИДОЗОВ С ЦЕЛЬЮ РАЗРАБОТКИ МЕТОДА ИХ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ З.А.Подлубная, Л.Г.Марсагишвили, М.Д. Шпагина 23 ДИАГНОСТИКА РАННИХ ФОРМ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА C.Н.Пчелина, О.Н.Иванова, Н.М.Ханина, А.М.Шейдина, Е.П.Демина, А.Ф.Якимовский, А.Л.Шварцман 25 ПАТОЛОГИЯ ДОФАМИНЕРГИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ МОЗГА: МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ, РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО–КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) А.С.Базян, Г.А.Григорьян, М.Е.Иоффе, Г.Н.Кузнецова, Е.В.Лосева, В.В.Раевский 27 НОВЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ПАТОГЕНЕЗЕ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (синдром гиперпролактинемии, болезнь Паркинсона) М.В.Угрюмов 28 СОЗДАНИЕ АНТИАМИЛОИДОГЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА НА ОСНОВЕ МИМЕТИКОВ ТРАНССАЙРЕТИНА A.Л.Шварцман, С.В.Саранцева, А.Е.Тараскина, О.Л.Рунова, Е.И.Талалаева, М.Витек 30 КОГНИТИВНЫЕ ФУНКЦИИ И ЭМОЦИИ: НАРУШЕНИЯ ЭМОЦИОНАЛЬНО-ВОЛЕВОЙ СФЕРЫ ЧЕЛОВЕКА КАК ФАКТОР ПАТОГЕНЕЗА ХРОНИЧЕСКИХ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И.Р.Ильюченок, О.П.Миронова, А.И.Стрельцова, А.С.Калуга 1.2. Общие вопросы этиологии и патогенеза 33 108 КЛЕЩЕВЫЕ ИНФЕКЦИИ: ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ ПЕРЕНОСЧИКОВ И РИСК ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ В УСЛОВИЯХ РАСТУЩЕГО АНТРОПОГЕННОГО ПРЕССА А.Н.Алексеев, Е.В.Дубинина, П.А.Чиров, В.Н.Куликов, Е.С.Светашов 34 ВЛИЯНИЕ ГЕЛИОГЕОМАГНИТНОЙ АКТИВНОСТИ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ, ВКЛЮЧАЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКИЙ ОРГАНИЗМ Т.К.Бреус, Р.М.Баевский, Т.А.Зенченко, Р.М.Заславская, Н.Г.Клейменова, С.И.Климов, О.В.Козырева, А.А.Петрукович, С.И.Рапопорт, А.Н.Рогоза, Е.В.Цагареишвили, Н.И.Хорсева, А.Г.Черникова 36 ГИПЕРТЕРМИЧЕСКАЯ ДЕТОКСИКАЦИЯ ХИМИЧЕСКИ ЗАВИСИМЫХ БОЛЬНЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АППАРАТУРЫ ВЧ ЭЛЕКТРОМАГНИТНОГО ПОЛЯ Н.П.Веселкин 39 РАЗРАБОТКА, ОБОСНОВАНИЕ И КОНЦЕПЦИЯ КОМПЛЕКСНОГО МЕДИКО-ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА А.Г.Гамбурцев, О.И.Аптикаева, С.И.Степанова, Л.Г.Хетагурова 39 РОЛЬ ПСИХОСОЦИАЛЬНЫХ СТРЕССОРОВ В ДИНАМИКЕ УГРОЖАЮЩИХ ЖИЗНИ БОЛЕЗНЕЙ (НА ПРИМЕРЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ) А.Л.Журавлев, Н.В.Тарабрина, Г.П.Генс, Л.И.Коробкова, О.А.Ворона, М.А.Падун 42 НОВЫЙ ПОДХОД К ЭТИОЛОГИИ И ПАТОГЕНЕЗУ ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА: ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ИШЕМИЯ МОЗГА И СОН В.М.Ковальзон, Г.Н.Фесенко, А.В.Ревищин, Е.М.Руцкова, М.М.Свинов 44 ИЗМЕНЕНИЯ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН И НЕРВНОМЫШЕЧНЫХ СИНАПСОВ ПРИ ГИПОКИНЕЗИИ И ПЕРВИЧНОЙ МИОПАТИИ. ПОИСК ПУТЕЙ КОРРЕКЦИИ НАРУШЕНИЙ Е.Е.Никольский, Б.С.Шенкман, З.А.Подлубная, Т.Л.Немировская, Э.A.Бухараева, А.М.Мухина, И.М.Вихлянцев, О.В.Туртикова, О.В.Тяпкина, И.Н.Чистяков 45 РАЗРАБОТКА ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЛАЗНЫХ ПАТОЛОГИЙ; РОЛЬ ОКСИДА АЗОТА В ДЕГЕНЕРАЦИИ СЕТЧАТКИ ГЛАЗА Г.Р.Каламкаров, М.А.Островский, О.Г.Лунгина, Т.Ф.Шевченко 49 ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕХАНИЗМОВ РАЗВИТИЯ СИНДРОМА ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ 109 В.А.Отеллин, Л.И.Хожай, Д.Э.Коржевский, Н.Г.Павлова, Н.Н.Константинова, А.Н.Старорусская 50 НОВЫЙ ПОДХОД В ИЗУЧЕНИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ОСНОВ ЭТИОЛОГИИ И ПАТОГЕНЕЗА ДИАБЕТА: ПОИСК ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ В ГОРМОНАЛЬНЫХ СИГНАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМАХ ПРИ ДИАБЕТЕ 1 И 2 ТИПОВ М.Н.Перцева, Л.А.Кузнецова, С.А.Плеснева, А.О.Шпаков, В.М.Бондарева, О.В.Чистякова, С.И.Морозова, М.Ф.Баллюзек, Е.А.Манова 52 РОЛЬ АДГЕЗИОННЫХ G БЕЛОК-СОПРЯЖЕННЫХ РЕЦЕПТОРОВ В КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ А.Г.Петренко, И.Е.Деев, Н.В.Попова, О.В.Серова, К.А.Кондукторов, М.А.Лагарькова, В.К.Боженко 55 МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ПАСПОРТИЗАЦИЯ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ И ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ФАРМАКОТЕРАПИИ КОЖНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ НА ПРИМЕРЕ ПСОРИАЗА И ВИТИЛИГО Л.А.Радкевич, Ан.Л.Пирузян, С.А.Брускин, И.М.Корсунская, О.В.Жукова, Ю.В.Шнейдер, И.В.Голденкова, Т.В.Наседкина, Ж.3.Кожекбаева 57 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ ЭТИОПАТОГЕНЕЗА КОЛЛАГЕНОПАТИЙ. РАЗВИТИЕ НОВОГО ПОДХОДА К ДИАГНОСТИКЕ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ ПАТОЛОГИИ ПРИ ВРОЖДЕННЫХ ДЕФЕКТАХ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ В.Г.Туманян, Е.С.Котовская, Д.Р.Моноселидзе, М.Л.Сименовский, П.А.Вавилов, С.Г.Раденска-Лопвук, И.В.Филатов, Л.Е.Рагулина, Ю.В.Мильчевский, Н.Г.Есипова 61 ПСИХОНЕЙРОЭНДОКРИНОТЕРАПИЯ ПОСТСТРЕССОРНЫХ ДЕПРЕССИЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ) В.Г.Шаляпина 63 2. РАЗРАБОТКА И УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ И СРЕДСТВ ДИАГНОСТИКИ 2.1. Общие вопросы диагностики ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ К БЕЛКАМ – МАРКЕРАМ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ, ИМЕЮЩИМ ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ В КЛИНИЧЕСКОЙ ОНКОГЕМАТОЛОГИИ А.А.Богданов, Н.М.Владимирова, Т.И.Булычева, Л.Г.Романова 65 110 НОВЫЙ НЕИНВАЗИВНЫЙ МЕТОД НЕПРЕРЫВНОЙ (ОТ УДАРА К УДАРУ) ОЦЕНКИ СОКРАТИМОСТИ ЛЕВОГО ЖЕЛУДОЧКА СЕРДЦА ЧЕЛОВЕКА: ПЕРВАЯ ФАЗА ИСПЫТАНИЙ В.М.Хаютин, О.Л.Виноградова, Е.Ю.Берсенев, В.В.Ермишкин, Е.В.Лукошкова 67 ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИЧИН АПОПТОТИЧЕСКОЙ ГИБЕЛИ ГЕПАТОЦИТОВ В ДИНАМИКЕ РАЗВИТИЯ ХОЛЕСТАТИЧЕСКОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ ПЕЧЕНИ И ПРИ ВОССТАНОВЛЕНИИ ЖЕЛЧЕТОКА Л.Б.Дудник, А.Н.Цюпко, М.А.Шупик, А.В.Алесенко, В.В.Яснецов, Л.Д.Смирнов, В.С.Шашков 69 ОСОБЕННОСТИ СОДЕРЖАНИЯ ФАКТОРА ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ HLDF И АУТОАНТИТЕЛ К НЕМУ У ПАЦИЕНТОВ С ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИЕЙ В.М.Липкин, М.А.Грудень, И.А.Kостанян, Н.К.Яковлева, Е.И.Елистратова, А.Н.Шалавин, В.В.Юрасов, И.С.Денищук, Е.А.Широков, С.М.Драницына, М.В.Гапон, В.В.Шерстнев 71 СОСТОЯНИЕ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ СОСУДИСТОГО РУСЛА У ЗДОРОВЫХ И БОЛЬНЫХ ЛИЦ В.М.Михайлов, Ю.И.Гурфинкель, М.И.Кудуткина, Б.Б.Ушаков 74 ЭЛЕКТРОКАРДИОГРАФИЯ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ И ДИСПЕРСИОННОЕ КАРТИРОВАНИЕ ЭКГ. ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КЛИНИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЕ Р.М.Баевский, Г.Г.Иванов, А.З.Кабулова, И.А.Кудашева 77 НОВЫЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ПОДХОД К РАННЕЙ ДИАГНОСТИКЕ И МОНИТОРИНГУ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С.А.Недоспасов, С.В.Хлгатян, П.В.Белоусов, Е.П.Королева, Ю.В.Шебзухов, Т.С.Кадачигова, А.А.Мещеряков, О.В.Гурова, М.Р.Личиницер, Д.В.Купраш 79 ИССЛЕДОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПЕРОКСИРЕДОКСИНОВ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ПОРАЖЕННЫХ ТКАНЕЙ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ В.И.Новоселов, В.А.Янин, С.Е.Амелина, С.К.Соодаева, Н.И.Косякова 81 РАЗРАБОТКА ТЕСТА НА МНОЖЕСТВЕННУЮ ЛЕКАРСТВЕННУЮ УСТОЙЧИВОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СИНТЕЗА И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА YB-1 (Р50) В КЛЕТКАХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ Л.П.Овчинников, А.В.Сорокин, О.В.Скабкина, А.В.Вайман, Д.Н.Лябин, Е.Ю.Рыбалкина, Т.П.Стромская, А.А.Селютина, С.Г.Гурьянов, А.А.Ставровская 82 111 РАЗРАБОТКА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПРОВЕРКА НОВЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ МОЗГА, ОСНОВАННЫХ НА АНАЛИЗЕ ДИНАМИКИ СПЕКТРОВ ЭЛЕКТРОЭНЦЕФАЛОГРАММ Ю.В.Обухов, Д.Ю.Боснякова, Г.Д.Кузнецова, А.А.Морозов 85 КОЛИЧЕСТВЕННАЯ МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА Г.М.Попова, Ю.О.Дружинин, В.Н.Степанов, И.Ф.Дятчина 87 НОВЫЕ КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К РАЗВИТИЮ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ИХ ЛЕЧЕНИЯ А.Н.Саприн, В.А.Суханов, Л.А.Пирузян 90 МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИДРОМЕХАНИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЗАКРУЧЕННЫХ ВИХРЕВЫХ ПОТОКОВ КРОВИ В МАГИСТРАЛЬНЫХ ОТДЕЛАХ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ СИСТЕМЫ И НОВЫЕ МЕТОДЫ ЕЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ С.Г.Чефранов, Р.И.Асфандияров, В.Н.Блажко, Л.А.Бокерия, А.Ю.Городков, Г.И.Кикнадзе, А.Г.Чефранов, А.С.Чефранов 92 СОЗДАНИЕ МЕТОДОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ИЗМЕРЕНИЕ УРОВНЯ ВНУТРЕННЕГО ШУМА ЗРИТЕЛЬНОГО АНАЛИЗАТОРА, КАК МЕРЫ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА Ю.Е.Шелепин, А.К.Хараузов, Э.В.Бойко, Г.Е.Труфанов 94 МАГНИТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ НАНОРАЗМЕРНЫЕ ГЕМОСОРБЕНТЫ (ФЕРРОКАРБОНЫ). СТРУКТУРА, СОРБЦИОННЫЕ И РЕОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ Ю.Г.Яновский, Ю.Н.Карнет, А.А.Кузнецов, Г.Н.Ковалев 96 2.2. Биофотоника ЛАБОРАТОРНАЯ ТОМОГРАФИЯ С СУБМИЛЛИМЕТРОВЫМ РАЗРЕШЕНИЕМ В.Е.Асадчиков, А.В.Бузмаков, С.В.Савельев, Р.А.Сенин, М.В.Чукалина 99 РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ ТЕСТИРОВАНИЯ И ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ СОСУДОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ СОВРЕМЕННЫХ МАТРИЧНЫХ ИНФРАКРАСНЫХ ТЕРМОВИЗИОННЫХ СИСТЕМ ВЫСОКОГО РАЗРЕШЕНИЯ Г.Р.Иваницкий, А.А.Деев, Е.П.Хижняк, Л.Н.Хижняк 100 112 ИССЛЕДОВАНИЕ, РАЗРАБОТКА И ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ МЕДУЧРЕЖДЕНИЙ РАН МЕТОДОВ И ПРИБОРОВ ГЛУБИННОЙ ТЕРМОГРАФИИ ТЕЛА ЧЕЛОВЕКА Ю.В.Гуляев, Ю.В.Обухов, Н.Г.Гончаров 103 СИНТЕЗ ФТОРОСУЛЬФАТО- И ФТОРОФОСФАТОМЕТАЛЛАТОВ КАК ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ЭФФЕКТИВНЫХ РЕНТГЕНОЛЮМИНОФОРОВ – ПРЕОБРАЗОВАТЕЛЕЙ ИЗОБРАЖЕНИЯ ДЛЯ РЕНТГЕНОСКОПИИ И ФЛЮОРОГРАФИИ Д.Л.Мотов, М.М.Годнева, Н.Н.Борозновская, А.В.Климкин 104 ЛОКАЛЬНАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ ПРИ ТРЕХВОЛНОВОМ ЛАЗЕРНОМ ВОЗБУЖДЕНИИ БИОТКАНЕЙ В.В.Смирнов, В.В.Соколов, Н.Н.Булгакова, В.И.Фабелинский, Д.В.Соколов 107 ЛАЗЕРНЫЕ ИЗОТОПИЧЕСКИЕ ДЫХАТЕЛЬНЫЕ ТЕСТЫ ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ОРГАНОВ ПИЩЕВАРЕНИЯ Е.В.Степанов, В.Т.Ивашкин, А.В.Лапшин, Е.К.Баранская 109 РАЗРАБОТКА МЕТОДА МОНИТОРИНГА ОПУХОЛЕЙ НА ОСНОВЕ КОМПЛЕМЕНТАРНОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ОПТИЧЕСКОЙ КОГЕРЕНТНОЙ ТОМОГРАФИИ И ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДИАГНОСТИКИ Н.М.Шахова, Е.В.Загайнова, О.С.Стрельцова, А.Г.Орлова, Е.Э.Юнусова, В.А.Каменский, И.В.Турчин 111 ИССЛЕДОВАНИЕ ФОТОАГРЕГАЦИИ КРИСТАЛЛИНОВ И ШАПЕРОННЫХ СВОЙСТВ КОРОТКОЦЕПОЧЕЧНЫХ ПЕПТИДОВ. Л.В.Соустов, Н.М.Битюрин, Е.В.Челноков, Н.В.Сапогова, В.В.Немов, Ю.В.Сергеев, А.К.Тимофеева, А.В.Кривандин, К.О.Муранов, М.А.Островский 114 2.3. Информатика РАЗРАБОТКА МАТЕМАТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ И ПРОГРАММНЫХ СРЕДСТВ ОБРАБОТКИ МЕДИЦИНСКОЙ ИНФОРМАЦИИ С ЦЕЛЬЮ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ЗНАНИЙ И ПОДДЕРЖКИ ПРИНЯТИЯ ОПТИМАЛЬНЫХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ Ю.И.Журавлев, В.В.Рязанов, О.В.Сенько, Г.Н.Мачак, А.В.Кузнецова, А.С.Заковряшин 116 ТЕЛЕМЕДИЦИНСКАЯ IP-СЕТЬ МОБИЛЬНОЙ ДИСТАНЦИОННОЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ А.П.Казанцев, А.А.Сенин, С.И.Федорова, Н.А.Арапов, Д.В.Давыдов, А.А.Тарасов, В.И.Шокин, Т.В.Неведомская 118 113 ИСТОЩЕНИЕ И АКТИВАЦИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА Г.И.Марчук, А.А.Романюха, И.С.Литвинов, Т.Е.Санникова 120 ВОЗРАСТНЫЕ МОДЕЛИ СОМАТИЧЕСКОГО ЗДОРОВЬЯ ЧЕЛОВЕКА В.А.Орлов, О.Б. Фетисов, И.Б.Шавырин, Т.И.Алексеенко 122 СИСТЕМА КОМПЛЕКСНОЙ ИНФОРМАЦИОННОЙ ПОДДЕРЖКИ В.С.Переверзев-Орлов, Е.А.Ващенко, М.А.Витушко, В.Б.Гервазиева 124 МАТЕМАТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЙ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ ГЛАЗНОГО ДНА ДЛЯ СИСТЕМЫ КОМПЬЮТЕРНОЙ ДИАГНОСТИКИ В.А.Сойфер, В.В.Котляр, А.Г.Храмов, Н.Ю.Ильясова, А.В.Куприянов, А.В.Устинов, Н.А.Гаврилова 126 МЕТОДЫ ДИНАМИЧЕСКОГО НАБЛЮДЕНИЯ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СОСТОЯНИЯ ПРЕДСЕРДИЙ И ЖЕЛУДОЧКОВ СЕРДЦА НА ОСНОВЕ ИНФОРМАЦИОННЫХ ТЕХНОЛОГИЙ С СОДЕРЖАТЕЛЬНО-ОБРАЗНЫМ ПРЕДСТАВЛЕНИЕМ ДАННЫХ Л.И.Титомир, В.Г.Трунов, Э.А.И.Айду, Е.В.Сидорова, О.А.Рогинко, Т.А.Сахнова 128 РАЗРАБОТКА ТЕОРЕТИЧЕСКИХ ОСНОВ ИНФОРМАЦИОННОЙ ТЕХНОЛОГИИ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ИЗОБРАЖЕНИЙ КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТОВ И РЕАЛИЗАЦИЯ АЛГОРИТМИЧЕСКОПРОГРАММНОГО КОМПЛЕКСА, ОБЕСПЕЧИВАЮЩЕГО ЕЕ ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ И.Б.Гуревич, В.А. Власова, И.А.Воробьев, Д.М.Мурашов, .А.Трыкова 130 3. ПРИБОРЫ И МАТЕРИАЛЫ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ, НОВЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ 3.1 Материалы РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЕВЫХ ИМПЛАНТАТОВ С ПРОГРАММИРУЕМО ИЗМЕНЯЕМЫМИ В ПРОЦЕССЕ ЭКСПЛУАТАЦИИ СВОЙСТВАМИ Л.И.Валуев, Г.А.Сытов, И.Л.Валуев, Д.В.Давыдов 134 НАНОРАЗМЕРНЫЕ БИОКОМПОЗИТЫ Ca10(PO4)6(OH)2 /КАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗА ДЛЯ КОСТНЫХ ИМПЛАНТАТОВ В.Т.Калинников, Н.А.Захаров, Ж.А.Ежова, Е.М.Коваль 135 МАТРИЧНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ПРИРОДНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК КОЖИ ЧЕЛОВЕКА И ИХ ТРАНСПЛАНТАЦИИ НА РАНЕВУЮ ПОВЕРХНОСТЬ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЕ ДЛЯ ТЕХНОЛОГИЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ Е.Ф.Панарин, Л.А.Нудьга, В.А.Петрова, Г.М.Михайлов, М.Ф.Лебедева, А.Д.Вилесов, А.М.Бочек, С.А.Волков, Г.П.Пинаев, М.И.Блинова, Н.М.Юдинцева 138 114 ПОСЛОЙНЫЙ ЛАЗЕРНЫЙ СИНТЕЗ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИМПЛАНТАТОВ НА ОСНОВЕ ТИТАНА И НИКЕЛИДА ТИТАНА А.Л.Петров, И.М.Байриков, М.В.Кузнецов, Ю.Г.Морозов, С.В.Фокеев, И.В.Шишковский, В.И.Щербаков 140 НАПРАВЛЕННАЯ ВНУТРИЯДЕРНАЯ ДОСТАВКА АЛЬФАЭМИТТЕРОВ ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ИХ ПРОТИВОРАКОВОГО ДЕЙСТВИЯ А.С.Соболев, А.А.Розенкранц, В.Г.Лунин, Р.А.Алиев, Д.А.Царев, И.Г.Тананаев, Б.Ф.Мясоедов 141 3.2. Приборы АППАРАТУРНО-ПРОГРАММНЫЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВНЕШНЕГО ДЫХАНИЯ И ФИЗИЧЕСКОЙ РАБОТОСПОСОБНОСТИ ЧЕЛОВЕКА Ю.Я.Кисляков, Л.П.Кислякова, В.М.Михайлов, И.А.Полукаров 144 НОВЫЙ ПРИБОР ДЛЯ НЕИНВАЗИВНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Х.А.Курданов, А.Д.Эльбаев, Л.М.Батырбекова, М.Х.Курданова, Р.А.Перковский 146 РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВНУТРИТКАНЕВОЙ ЛАЗЕРНОЙ КОАГУЛЯЦИИ ИЗЛУЧЕНИЕМ ТВЕРДОТЕЛЬНОГО ЛАЗЕРА В ИМПУЛЬСНО-ПЕРИОДИЧЕСКОМ РЕЖИМЕ ГЕНЕРАЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЛОКАЛИЗОВАННЫХ ОПУХОЛЕЙ ПОЧКИ И ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ Р.В.Серов, В.А.Голубева, А.В.Иванов, С.В.Зонтов 149 РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ФОРМИРОВАНИЯ ГЛУБОКИХ ЛАЗЕРНЫХ КАНАЛОВ В БИОТКАНЯХ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ФУНКЦИЙ ТКАНЕЙ И ОРГАНОВ ЧЕЛОВЕКА В.Я.Панченко, И.И.Беришвили 151 АДАПТИВНАЯ УПРАВЛЯЮЩАЯ СИСТЕМА ДЛЯ БИОЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ПРОТЕЗА ВЕРХНЕЙ КОНЕЧНОСТИ НА ОСНОВЕ НОВОГО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОГО БИОНИЧЕСКОГО МЕТОДА АВТОНОМНОГО АДАПТИВНОГО УПРАВЛЕНИЯ А.А.Жданов, К.К.Щербина, Г.Н.Буров, Е.Л.Полян 152 3.3. Лекарства ГЕНЕТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НИТРОЗИЛЬНЫХ [Fe-S] КОМПЛЕКСОВ – НОВОГО КЛАССА ДОНОРОВ ОКСИДА АЗОТА ДЛЯ ТЕРАПИИ СОЦИАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ С.М.Алдошин, С.В.Васильева, Н.А.Санина 155 115 ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ОБРАЗОВАНИЯ И РАСТВОРЕНИЯ МОЧЕВЫХ КАМНЕЙ IN VITRO И IN VIVO Б.Д.Березин, М.Б.Березин, А.В.Кустов, А.И.Стрельников, А.А.Шевырин 158 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ НЕТОКСИЧНОГО ЛПС ИЗ RHODOBACTER CAPSULATUS PG (ЛПСRb.caps) НА АКТИВАЦИОННЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЭНДОТОКСИНОВОГО ШОКА С.В.Грачев, И.Р.Прохоренко, М.Г.Винокуров, В.С.Зубова, Е.В.Золотущенко, С.В.Прохоренко 160 ПРИРОДНЫЕ И МОДИФИЦИРОВАННЫЕ СЕСКВИТЕРПЕНОВЫЕ ЛАКТОНЫ – ИНГИБИТОРЫ ФАРНЕЗИЛТРАНСФЕРАЗЫ – КАК ОСНОВА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ НОВЫХ АНТИНЕОПЛАСТОВ С.Г.Клочков, С.В.Афанасьева, Н.С.Зефиров, С.О.Бачурин, Ю.Н.Булычев 162 РАЗРАБОТКА НОВЫХ МЕТОДОВ СИНТЕЗА СОЕДИНЕНИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИМИ СВОЙСТВАМИ, В РЯДУ ПРОИЗВОДНЫХ ПРЕНИЛУКСУСНЫХ КИСЛОТ С.Г.Злотин, Г.В.Крышталь, Г.М.Жданкина, А.Г.Коноплянников 165 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ОТЕЧЕСТВЕННОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА КСИМЕДОН ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ВТОРИЧНЫХ ИММУНОДЕФИЦИТОВ А.И.Коновалов, И.Г.Мустафин, Г.В.Черепнев, В.С.Резник, И.С.Рагинов 167 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ КОМПЛЕКСОВ ФОСФОПАНТЕТЕИН-АДЕНИЛИЛ-ТРАНСФЕРАЗЫ (PPAT) MICOBACTERIUM TUBERCULOSIS КАК ОСНОВЫ ДЛЯ РАЦИОНАЛЬНОГО СИНТЕЗА ЭФФЕКТИВНЫХ АНТИТУБЕРКУЛЕЗНЫХ СРЕДСТВ И.П.Куранова, Е.А.Смирнова, В.Р.Самыгина, Р.С.Есипов, Л.А.Чупова, Е.А.Ильина, Т.Е.Иванова, В.Н.Степаненко, Д.В.Чувиховский 170 АНТИМИКРОБНЫЙ ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ЛИЗОАМИДАЗА: КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ В E. coli ГЕНОВ БАКТЕРИОЛИТИЧЕСКИХ ЭНДОПЕПТИДАЗ Л1 (alpA) и Л5 (alpB) И.С.Кулаев, Ю.С.Лаптева, А.Е.Калинин, О.Н.Хохлова, М.Г.Шляпников, И.М.Цфасман, О.А.Степная, И.Э.Грановский 171 116 СОЗДАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОГО И ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ПРЕПАРАТА ИЗ ЛИЧИНОК ВОСКОВОЙ МОЛИ, ОБЛАДАЮЩЕГО ЛЕЧЕБНЫМ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ ПРИ ТЯЖЕЛЫХ БРОНХОЛЕГОЧНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ А ТАКЖЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ ПРИ ПРОСТУДНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ И ГРИППЕ М.Н.Кондрашова, Е.Г.Литвинова, А.А.Овсепян, Э.К.Мубаракшина, Н.И.Косякова, А.С.Погосян, И.В.Михайлова, Е.В.Семенова, Ж.Н.Казарец, А.А. Селищева 173 ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОКИНМОДУЛИРУЮЩИХ И АНТИВИРУСНЫХ СВОЙСТВ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ – ГЛИПРОЛИНОВ Н.Ф.Мясоедов, Ф.И.Ершов, О.Н.Учакина, П.Н.Учакин, М.В.Мезенцева, А.А.Зозуля, И.М.Сургучева, О.Ю.Соколов 175 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ДЕФЕНСИНОВ NP-1 РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ НА ПЕРВИЧНЫЕ АФФЕРЕНТНЫЕ (СЕНСОРНЫЕ) НЕЙРОНЫ А.Д.Ноздрачев, Ю.А.Толкунов, Ю.Н.Андрианов, Е.Л.Поляков 178 МИКОЛИКОПИН – НОВОЕ ПРИРОДНОЕ ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Е.П.Феофилова, В.М.Терешина, А.С.Меморская, Н.Г.Гончаров 180 4. СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ РАДИОБИОЛОГИИ НОВАЯ МЕТОДОЛОГИЯ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ КАНЦЕРОГЕННЫХ ЭФФЕКТОВ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА ОСНОВЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ИНФОРМАЦИИ О МЕХАНИЗМАХ ФОРМИРОВАНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГЕНОМА С.Г.Андреев, Ю.А.Эйдельман, И.В.Сальников, А.В.Алещенко, Л.П.Семенова, Л.Р.Борисова, И.К.Хвостунов, Е.А.Красавин, Р.Д.Говорун, И.В.Кошлань, Н.А.Кошлань 183 ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА У ЛЮДЕЙ, ПОДВЕРГАВШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ РАДИАЦИИ В.Г.Безлепкин, Г.В.Васильева, М.Л.Захарова, Е.Н.Кириллова 185 ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ мтДНК В КЛЕТКАХ КРОВИ ЛЮДЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ А.И.Газиев, Т.Е.Ушакова, М.В.Патрушев, В.Н.Малахова, В.Е.Антипова, Н.А.Гуляева, И.И.Бельская, Л.В.Патрушева 187 117 СОЗДАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ УСТАНОВКИ ДЛЯ СКРИНИНГА ТОЧЕЧНЫХ МУТАЦИЙ В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА, ПОДВЕРГШИХСЯ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ А.И.Газиев, Н.А.Гуляева, И.И.Бельская, В.Г.Безлепкин, В.Н.Антипова, Н.П.Сирота 189 ИЗУЧЕНИЕ СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ ВЕЩЕСТВ-АДАПТОГЕНОВ И МАЛЫХ ДОЗ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА ВЕЛИЧИНУ И ДЛИТЕЛЬНОСТЬ СОХРАНЕНИЯ ПЕРЕКРЕСТНОГО АДАПТИВНОГО ОТВЕТА В УСЛОВИЯХ IN VIVO С.И.Заичкина, О.М.Розанова, Г.Ф.Аптикаева, А.Х.Ахмадиева 192 ИНДИВИДУАЛЬНАЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЧЕЛОВЕКА В АСПЕКТЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА. СНИЖЕНИЕ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫХ ЭФФЕКТОВ В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА Г.Д.Засухина, Н.С.Кузьмина, И.М.Васильева, С.П.Громов, А.И.Ведерников 194 УСТОЙЧИВОСТЬ МЛЕКОПИТАЮЩИХ К ДЕЙСТВИЮ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И НИЗКИХ ТЕМПЕРАТУР ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ. РОЛЬ МЕМБРАННЫХ ЛИПИДОВ И.К.Коломийцева, Д.А.Игнатьев, Л.Н.Маркевич, Н.И.Перепелкина, Л.В.Сложеникина, Л.А.Фиалковская 195 НОВЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К МЕХАНИЗМАМ ПОВЫШЕННОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ У ЧЕЛОВЕКА В.М.Михельсон, И.М.Спивак, Н.М.Плескач, А.Г.Сотников, В.В.Прокофьева, Н.В.Смирнова 197 РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ГРУПП РИСКА НА ОСНОВАНИИ АНАЛИЗА АДАПТИВНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ, ПОВРЕЖДЕНИЙ И РЕПАРАЦИИ ДНК ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ ЛЕТЧИКОВ И КОСМОНАВТОВ, ПОДВЕРГАЕМЫХ РАДИАЦИОННЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ И.И.Пелевина, М.М.Антощина, В.А.Бондаренко, Н.Ю.Воробьева 199 НОВЫЕ РАДИОПРОТЕКТОРЫ ЦЕЛЕВОГО НАЗНАЧЕНИЯ. 1. РАДИОПРОТЕКТОР ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНДОМЕТОФЕН: МЕХАНИЗМЫ РАДИОПРОТЕКТОР-ИНДУЦИРОВАННОГО ПОВЫШЕНИЯ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА И ДОКЛИНИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ОРГАНИЗМА М.К.Пулатова, В.Л.Шарыгин, Т.Г.Шлякова, Г.А.Чернов, И.Н.Тодоров 202 118 СОЗДАНИЕ КОЛЛЕКЦИИ ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИРОДНОГО И ТЕХНОГЕННОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ, СПОСОБНЫХ СВЯЗЫВАТЬ СОЛИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ И РАДИОНУКЛИДЫ А.В.Суслов, И.Н.Суслова, Е.М.Коротких, В.П.Степанова, Б.Ф.Яровой 204 ДИНАМИКА ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ГИСТОНА Н2АХ КАК НОВЫЙ МАРКЕР ЭФФЕКТИВНОСТИ КЛЕТОЧНОГО ОТВЕТА НА РАДИАЦИОННЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ ГЕНОМА Н.В.Томилин, М.П.Светлова, Л.В.Соловьева, В.А.Гаврилов, В.М.Михайлов 206 СОПОСТАВИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РИСКОВ ХРОНИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩИХ ИЗЛУЧЕНИЙ, ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ РАДИОЧАСТОТ, ХИМИЧЕСКОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И СОЦИАЛЬНОГО СТРЕССА НА ЗДОРОВЬЕ НАСЕЛЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ РЕГИОНОВ РОССИИ А.В.Шафиркин, А.С.Штемберг, И.Б.Ушаков, Ю.Г.Григорьев, Л.Васин 208 ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ У ЛЮДЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ, ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ИХ ЗДОРОВЬЯ И ПРОГНОЗ ОТДАЛЕННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОСЛЕДСТВИЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ РАДИАЦИИ В РЯДУ ПОКОЛЕНИЙ В.А.Шевченко, А.В.Рубанович, А.В.Агаджанян, Э.А.Акаева, Т.В.Елисова, Э.Л.Иофа, Л.Н.Костина, Г.И.Кузнецова, Н.С.Кузьмина, А.Е.Мязин, И.Н.Нилова, О.Г.Панушкина, Л.Е.Сальникова, Г.П.Снигирева, И.И.Сусков 211 БИОХИМИКО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАРУШЕНИЙ СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ДЕТЕЙ, ПОДВЕРГШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ РАДИАЦИИ В МАЛЫХ ДОЗАХ ПОСЛЕ ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ КАТАСТРОФЫ В.А.Шевченко, Г.Ф.Иваненко, Е.Б.Бурлакова 213 ВЫЯВЛЕНИЕ ОБЩНОСТИ И РАЗЛИЧИЙ МЕХАНИЗМА И ЭФФЕКТОВ ДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ И ХИМИЧЕСКИХ ТОКСИКАНТОВ В ШИРОКОМ ДИАПАЗОНЕ ДОЗ НА РЕГУЛЯЦИЮ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В СИСТЕМАХ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ СЛОЖНОСТИ ДЛЯ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОСЛЕДСТВИЙ ВОЗДЕЙСТВИЯ И МОНТОРИНГА ПОПУЛЯЦИЙ ЖИВОТНЫХ, ОБИТАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОГО РАДИАЦИОННОГО ФОНА Л.Н.Шишкина, М.А.Смотряева, М.В.Козлов, В.В.Урнышева, В.А.Меньшов, Н.В.Хрустова, Е.В.Кушнирева, Н.И.Шелудченко, А.Г.Кудяшева, Н.Г.Загорская 215 119 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВОДНОЙ ПОДСИСТЕМЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ С МИЛЛИМЕТРОВЫМИ ВОЛНАМИ И РАДИОПРОТЕКТОРНЫЙ ЭФФЕКТ А.К.Лященко, А.С.Лилеев, Т.А.Новскова, И.В.Родштат 217 ПРОТИВОЛУЧЕВОЙ ЭФФЕКТ АНТИОКСИДАНТА ФЕНОЗАНА Е.Б.Бурлакова, А.Н.Голощапов, С.М.Гуревич, Г.П.Жижина, Т.М.Заварыкина 221 МОДЕЛИРОВАНИЕ ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВЫСОКОЭНЕРГЕТИЧЕСКИХ ТЯЖЕЛЫХ ЧАСТИЦ НА БЕЛКИ ХРУСТАЛИКА ГЛАЗА – КРИСТАЛЛИНЫ С ПОМОЩЬЮ УФ ОБЛУЧЕНИЯ К.О.Муранов, H.Б.Полянский, Г.Н.Тимошенко, М.А.Островский 223 ЭФФЕКТИВНОСТЬ И МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ РАДИОЗАЩИТНЫХ СРЕДСТВ И ЭКРАНИРОВАНИЯ ПРИ -ОБЛУЧЕНИИ В СМЕРТЕЛЬНЫХ И СВЕРХСМЕРТЕЛЬНЫХ ДОЗАХ В.С.Шашков, С.К.Карсанова, В.В.Яснецов 225 КОМПЛЕКСНЫЕ ПРОЕКТЫ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА. НОВЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИЗ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОГО БИОЛОГИЧЕСКОГО СЫРЬЯ В.А.Стоник, Н.П.Мищенко, С.А.Федореев, Д.Л.Аминин, И.Г.Агафонова, С.А.Авилов, В.М.Богуславский, Н.Г.Прокофьева 227 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ СИБИРИ В.В.Власов 232 ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ УРАЛА В.А.Черешнев, Б.Г.Юшков 233 ИССЛЕДОВАНИЕ, РАЗРАБОТКА, КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ И ВНЕДРЕНИЕ НОВЫХ МЕДИЦИНСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ НА БАЗЕ ЦКБ РАН ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ БАЗАЛЬНО-КЛЕТОЧНОГО РАКА КОЖИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) Ю.С.Романко, А.И.Алехин, Н.Г.Гончаров, В.В.Попучиев, В.А.Кузьмин, Т.Д.Некипелова 238 120 АППАРАТНО-ПРОГРАМНЫЙ ЛЕЧЕБНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ХОДЬБЫ ЧЕЛОВЕКА В.Е.Беленький, Н.Г.Гончаров, А.И.Алехин, Т.Л.Осканян, А.А.Гришин 241 АВТОМАТИЗИРОВАННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ТЕПЛОВИЗИОННЫЙ КОМПЛЕКС «МЕД-ИК» А.И.Алехин, В.П.Калинушкин, Н.Г.Гончаров, В.А.Юрьев, С.И.Ляпунов, А.В.Пронин 242 СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЖЕНСКОГО БЕСПЛОДИЯ В.И.Кулаков, К.Г.Серебренникова, Т.В.Лопатина, Н.В.Чумакова, В.Ф.Меняшева 245 ТЕРАПИЯ БЕСПЛОДИЯ МЕТОДОМ ЭКО И ПЭ У ЖЕНЩИН ПОСЛЕ ОПЕРАЦИЙ НА ЯИЧНИКАХ К.Г.Серебренникова, Т.В.Лопатина, А.О.Духин, В.Ф.Меняшева, Н.В.Чумакова 246 НОВЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИЗ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В МЕДИЦИНЕ Е.П.Феофилова, В.М.Терешина, А.С.Меморская, Н.Г.Гончаров, Л.М.Дулькин, Т.А.Полетаева, А.Л.Гаганов 248 ИНФОРМАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ПОДДЕРЖКИ ЛЕЧЕБНОДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА. СОЗДАНИЕ ИНТЕГРИРОВАННОЙ ИНФОРМАЦИОННОЙ СИСТЕМЫ ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ УЧРЕЖДЕНИЙ Н.Г.Гончаров, А.И.Алехин, Я.И.Гулиев, В.Л.Малых 250 121 Фирма «Слово» 123007, Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 A Тел./факс (095) 193-55-22 E-mail: firmslovo@yahoo.com http://www. firmslovo.narod.ru Формат 60 x 88/16. Бумага офсетная №. 1. Печ. л. 17. Тираж 450 экз. 122