Лечение Helicobacter pylori

Хеликобактер пилори
Хеликобактер пилори — это бактерия, которая обнаруживается у пациентов с
заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки.
Название бактерии хеликобактер пилори происходит от «пилори», указывающего на
главное место обитания — пилорический отдел желудка, и «хелико», которое дает
характеристику формы бактерии: винтообразный, спиралевидный.
Авторы этого открытия доктор Барри Маршал и Робин Уоррен получили престижную
нобелевскую премию в области медицины в 2005 году. Открытие хеликобактер пилори
стало революционным по трем причинам:
Было установлено, что бактерия может выживать в кислой среде желудка, что ранее
считалось невозможным, а также является причиной большинства заболеваний желудка.
Прием антибиотиков в составе терапии может вылечить или предотвратить многие
болезни желудка.
Первая особенность хеликобактер пилори заключается в противостоянии чрезвычайно
кислой среде желудка. Благодаря высокой кислотности, большинство бактерий и вирусов
гибнут в желудке. Хеликобактер сопротивляется кислотности с помощью двух
механизмов:


c момента попадания в желудок, бактерия, благодаря своим жгутикам, может
перемещаться и скрываться в слизи, которая покрывает стенки желудка и
защищает клетки.
кроме того, хеликобактер усиливает защитную секрецию аммиака,
нейтрализующего кислую среду желудка.
Таким образом, бактерия закрепляется на стенке желудка и может там оставаться в
течение многих десятилетий.
Вторая особенность хеликобактер пилори заключается в том, что бактерия является
причиной болезней желудка и двенадцатиперстной кишки.
По большому счету, размножаясь, бактерия способна разрушать клетки нашего желудка.
А именно, высвобождение вредных веществ вызывает хронические воспаления и
приводит к гастриту.
Ослабление слизистой оболочки желудка или двенадцатиперстной кишки способствует
появлению язвы и повышает риск развития рака желудка. На сегодня известно, что
хеликобактер является главной причиной рака желудка.
Третья особенность хеликобактер пилори заключатся в ее уничтожении посредством
курса лечения с применением антибиотиков и лекарственных средств, регулирующих
уровень кислотности. Сегодня мы можем сказать, что у людей, страдающих
заболеваниями желудка, есть три веские причины провериться на наличие хеликобактер
пилори.

Эта бактерия очень устойчива к кислой среде желудка и может обитать в ней на
протяжении многих лет.


Хеликобактер пилори влечет за собой иногда очень серьезные заболевания.
Эффективное лечение позволяет предотвратить болезни и их осложнения.
Лечение Helicobacter pylori
В сентябре 1997 года в г. Эшторил (Португалия) по инициативе Европейской Группы по
изучению Helicobacter pylori состоялась расширенная конференция для обсуждения
педиатрических аспектов проблемы лечения Н.pylori, затем обсуждение было продолжено
на состоявшихся в Будапеште (1998 г.), в Хельсинки (1999 г.) и Риме (2000 г.) встречах
педиатров-гастроэнтерологов [6, 25]. Итогом работы явилось формирование рабочего
алгоритма обследования и лечения детей, включающего следующие этапы:
1Выявление Н. pylori с помощью неинвазивного метода (желательно, 13С-дыхательного
теста) у ребенка с жалобами на боли в животе (в сочетании с другими жалобами или без
них) в течение более 2 недель.
2Проведение элиминационной (эрадикационной) терапии.
3При отсутствии эффекта проведение обследования Н.pylori-позитивных больных с
применением эзофагогастродуоденоскопии.
4Проведение повторной эрадикации Н. pylori при обнаружении язвенного дефекта (по
другой схеме в соответствии с чувствительностью микроорганизма к антибиотикам).
5Проведение лечения при обнаружении гастродуоденита (тактику терапии определяет
врач в соответствии с чувствительностью).
6Проведение исследования на присутствие Н. pylori с помощью неинвазивного метода
(желательно, 13С-дыхательного теста) через 2 недели и б месяцев после окончания
терапии.
Выявление Н. pylori у детей, не предъявляющих жалоб на состояние здоровья, является
поводом лишь для продолжения обследования, а не лечения. Близкие по структуре
алгоритмы приняты и за пределами Европы.
При изучении результатов лечения пилорического хеликобактериоза у детей было
отмечено, что показатели терапевтического воздействия при язвенной болезни и Н.pyloriассоциированных гастритах были несколько ниже, чем приведенные в зарубежной
литературе. Однонедельный курс «тройной» терапии включает антибиотик, с продлением
курса- Н2-блокаторы или препараты висмута продолжительностью до 3 недель.
Такая тактика лечения до последнего времени давала удовлетворительные результаты
воздействия на Н.pylori, в том числе и у детей [55], хотя в настоящий момент
представляется возможным и обоснованным в ряде случаев продление курса
антибиотиков до 2 недель, вследствие изменений чувствительности хеликобактерий.
«Классическая» тройная терапия, включающая антибиотик, препарат висмута и трихопол,
к сожалению, в последние годы постепенно утрачивает свою эффективность [32], поэтому
необходим постоянный контроль эффекта использования широко распространенных
антибактериальных средств и поиск новых антихеликобактерных препаратов. Так,
резистентность к метронидазолу после 15 лет применения проявляет уже треть
характерных для жителей Европы штаммов. Более благоприятно обстоят дела с
амоксициллином, резистентность к которому развивается медленнее. Что касается
ингибиторов протонной помпы, то противопоказаний для применения их в детском
возрасте не отмечено, но до настоящего времени вопрос о дозах и схемах применения
некоторых из них у детей до 12 лет окончательно не решен [10,20,24,37, 38]. Этим
объясняется ограниченное применение этих препаратов в детском возрасте, хотя доказана
эффективность их применения у детей с резистентными формами пилорического
хеликобактериоза и перспективность их использования в педиатрической практике.
Несколько иное отношение складывается к применению антибиотиков-макролидов [41].
Резистентность к ним развивается значительно медленнее [9]. Показана высокая
антихеликобактерная активность макролидов с 14-членным лактамным кольцом
(эритромицин, рокситромицин, кларитро-мицин, вильпрафен) [14, 26].
Кроме того, в процессе исследований выяснилось, что наряду с антибактериальным, эти
препараты могут оказывать противовоспалительное и иммуномодулирующее воздействие
[8]. Одним из проявлений противовоспалительного эффекта является воздействие
макролидов этой группы на функциональную активность фагоцитов периферической
крови, опосредованное через ферментативные системы клеток, ответственные за
образование супероксидного иона. Еще одним эффектом макролидов является влияние на
интенсивность синтеза моноцитами и макрофагами важнейших медиаторов иммунного
ответа, таких, как фактор некроза опухоли, колониестимулирующий фактор и другие.
Показано, что даже семидневный курс терапии рокситромицином сопровождается
отчетливым иммуномодулирующим воздействием на циркулирующие нейтрофилы
периферической крови [8]. Выявленный иммуномодулирующий эффект не имеет прямой
зависимости от возраста больного ребенка. Доказательство иммуномодулирующего
действия во многом объясняет эффективность макролидов при лечении Н.Pyloriассоциированных заболеваний и позволяет рекомендовать их в сочетании с
амоксициллином и ингибиторами протонной помпы как альтернативу сложившейся схеме
«тройной терапии».
Важным компонентом «тройной» терапии является использование препаратов висмута,
при этом его рекомендуется применять в форме субцитрата, а не субсалицилата, что
способствует профилактике диареи. Длительность курса приема препарата не должна
превышать 6 недель.
Поскольку в процессе антихеликобактерной терапии возникает опасность дизбиоза
кишечника, интересные в плане перспектив антихелибактерного лечения данные
получены при использовании биопрепаратов. Проведение антибактериальной терапии,
особенно «тройной терапии», при Н.pylon-ассоциированной патологии является
безусловным показанием к назначению бифидо- и лактосодержащих препаратовпробиотиков, так как микробиоценоз кишечника всегда страдает при применении
антибиотиков. Использование биопрепаратов на фоне антибактериальной терапии не
только не приводит к элиминации бифидобактерий из кишечника, но и позволяет
сохранить кишечную микрофлору.
Подавление роста условно-патогенных и патогенных микроорганизмов происходит как за
счет улучшения композиционного состава бактерий, так и за счет регуляции механизмов
неспецифической защиты и системы местного иммунитета [1, 2].
Наряду с этим определенное значение при лечении Н.pylori-ассоциированных
заболеваний придается восстановлению нарушенной моторики верхних отделов
пищеварительного тракта, внутрижелудочной кислотности, функции слизеобразования,
нарушений кишечного всасывания, а также терапии сопутствующих инфекций.
В последнее время глубокие десневые карманы полости рта рассматриваются как один из
«резервуаров хранения» хеликобактерий, что делает санацию полости рта обязательным
условием эрадикации.
До настоящего времени предметом дискуссии остается вопрос о продолжительности
терапии: одни исследователи придерживаются мнения о необходимости двухнедельного
курса, другие считают достаточным семидневный курс лечения. На основании
отечественного научно-практического опыта сделано предположение о достаточности
семидневного курса терапии в детском возрасте [18, 55].
Важно подчеркнуть, что даже после эффективной эрадикации, перспективы
реинфицирования пациентов-детей несколько выше, чем взрослых, у которых это
происходит крайне редко [23, 31,47].
На IX съезде педиатров России «Детское здравоохранение России: стратегия развития»
были приняты и утверждены схемы лечения хеликобактериоза у детей. К препаратам,
рекомендованным для использования в эрадикационной терапии, относятся следующие:
1. Коллоидный субцитрат висмута (Де-нол®) 4 мг/кг
2. Амоксициллин (Флемоксин-солютаб®) 25 мг/кг (мах - 1 г/сут.) Кларитромицин
(Клацид®, Фромилид®) 7,5 мг/кг (мах - 500мг/сут.) Рокситромицин (Рулид®) 5-8 мг/кг
(мах - 300 мг/сут.) Азитромицин (Сумамед®) 10 мг/кг (мах - 1 г/сут.)
3. Макмирор 15 мг/кг Фуразолидон 20 мг/кг Метронидазол 40 мг/кг
4. Омепразол (Лосек-МАПС®) 0,5 мг/кг Ранитидин (Зантак®) 300 мг/сут.
Основным препаратом для лечения инфекции является коллоидный субцитрат висмута
(Де-нол), с которым сочетаются антибиотики - Амоксициллин (предпочтение следует
отдавать Флемоксин-солютаб, дающему наименьшее количество осложнений и побочных
диспепсических реакций, а также минимально влияющего на состав микрофлоры
кишечника) или различные макролиды (Кларитромицин (Клацид®, Фромилид®),
Рокситромицин или Азитромицин). В настоящее время количество резистентных
штаммов к метронидазолу у детей составляет 27%, к кларитромицину - 7%. Появились
штаммы с комбинированной резистентностью к метронидазолу и антибиотикам. Именно
поэтому в последнее время уделяется большое внимание разработке новых
альтернативных схем лечения хеликобактериоза. Метронидазол из существующих схем
исключается, а вместо него все более широко применяется макмирор и фуразолидон. Эти
препараты впервые стали использоваться в гинекологии для лечения штаммов хламидии,
резистентных к метронидазолу. Как показали результаты собственных исследований,
эффективность схем лечения с применением макмирора в сочетании с Де-нолом и
амоксициллином (Флемоксин-Солютаб) составляет более 84%. Наибольшую
эффективность от применения макролидов показали схемы, сочетающие ингибиторы
протонной помпы и макролиды. Именно такое сочетание приводит к кумуляции действия
макролидов,увеличивая эффективность их воздействия на Н. pylori.
Таким образом, на IX съезде педиатров России были утверждены и рекомендованы к
применению следующие схемы лечения хеликобактериоза:
Однонедельная тройная терапия с препаратом висмута:
1. Субцитрат висмута (Де-нол)
-Амоксициллин (Флемоксин-солютаб) Кларитромицин (Клацид,Фромилид) /
азитромицин/ рокситромицин/
- /Макмирор / фуразолидон
2. Субцитрат висмута
- Кларитромицин / азитромицин/рокситромицин /
- Амоксициллин
Однонедельная тройная терапия с блокаторами Н+К+-АТФазы:
1. Омепразол (Лосек-МАПС)
- Рокситромицин / Кларитромицин / азитромицин
- Макмирор / фуразолидон
2. Омепразол (Лосек -МАПС)
- Рокситромицин / Кларитромицин / азитромицин
- Амоксициллин Однонедельная квадротерапия:
- Субцитрат висмута
- Амоксициллин / рокситромицин / Кларитромицин / азитромицин
- Макмирор / фуразолидон
- Омепразол / Ранитидин
Квадротерапия рекомендуется для лечения штаммов, резистентных к антибиотикам, при
неудачном предыдущем лечении или в том случае, когда определение чувствительности
штамма микроорганизма не представляется возможным.
Инфекция Н.pylori, воздействуя на организм, приводит к нарушению баланса микрофлоры
толстой кишки, который усугубляется после перораль-ного приема антибиотиков.
Поэтому по окончании лечения, если этого не было сделано ранее, всем детям
целесообразно назначение препаратов, нормализующих видовой состав кишечной флоры
(пробиотиков, содержащих лактобактерии и бифидобактерии), молочно-кислых
продуктов функционального питания (бифидок, бифидокефир).
В настоящее время активно разрабатывается «антихеликобактерная» вакцина [48]. В
частности, была проверена эффективность пероральной вакцины, включавшей
очищенную рекомбинантную каталазу, аналогичную ка-талазе Н.pylori. Эффективность
вакцины на основе каталаз H.felis и Н.pylori была исследована на экспериментальной
модели. Иммунизация рекомби-нантной каталазой защитила от инфекции Н.pylori
значительную часть (9 из 10) экспериментальных животных тест-группы, в то время как
все животные контрольной группы были инфицированы (20 из 20). Это исследование
содержит данные об эффективности защитной иммунизации, свидетельствующие, что
использование специфической каталазы перспективно для создания вакцин будущего.
Механизмы развития иммунных реакций при естественном инфицировании и
иммунизации различны: персистирующий на слизистой оболочке желудка Н. pylori
избирательно стимулирует индукцию интерлейкина-12 и Т-хелперов, активно
синтезирующих гамма-интерферон, в то время как рекомбинантные субстанции,
используемые в оральных вакцинах, стимулируют в основном выработку интерлейкина-10
и, соответственно, Т-хелперов, вырабатывающих интерферон менее активно [10].
Следует еще раз подчеркнуть необходимость лечения инфицированных Н.pylori детей,
являющихся прямыми родственниками больных MALT-лим-фомой или аденокарценомой.
Целесообразность такого лечения подтверждается тем фактом, что до эпохи активной
эрадикации Н.pylori число больных, страдающих язвенной болезнью и MALT-лимфомой,
имело во всем мире устойчивую тенденцию к росту.
С нашей точки зрения, недостаточное внимание в педиатрической практике уделяется
коррекции протективных механизмов, те или иные нарушения которых отмечаются у
подавляющего большинства больных с Н.pylori-ассоциированной патологией.
Поскольку тяжесть патологического процесса в слизистой оболочке желудка в
значительной мере определяется состоянием муцина, то патогенетически обоснованной
представляется терапия, направленная на позитивные изменения структуры слизистого
слоя.
Как указывалось выше, сложность лечения, прежде всего, связана с возрастными
ограничениями применения ряда лекарственных препаратов, таких как Н2гистаминоблокаторы (применяется у детей 5-летнего возраста), ингибиторов «протонной
помпы» (у детей младшего возраста возможен к применению только Лосек-МАПС®),
синтетические аналоги простагландинов и др.
Поэтому применение цитомукопротекторов, в частности, диоктаэдрического смектита
(смекты), представляется перспективным в лечении заболеваний органов верхнего отдела
желудочно-кишечного тракта у детей.
Смекта обладает уникальной дискоиднокристаллической структурой. Её частицы
образуют поливалентные связи с гликопротеинами слизи. По данным, пред ставленным
фирмой-производителем,у взрослых пациентов смек-та оказывает выраженный
позитивный эффект при лечении гастритов. Показано, что молекулы диоктаэдрического
смектита, встраиваясь в желудочную слизь, значительно повышают ее вязкость. Являясь
высокоселективным сорбентом, смекта способствует элиминации из желудка бактерий, в
т. ч. и пилорического хеликобактера, связывает и инактивирует соляную кислоту, пепсин,
желчные кислоты и лизолецитин.
Показаниями к назначению препарата являются боли в животе в анамнезе и на момент
осмотра, подтверждение наличия гастрита при эндоскопическом исследовании.
При проведенной нами монотерапии смектойудетей продолжительность лечения
составляла 21 день в возрастной дозировке 3 раза в день через 60 минут после еды.
Клиническая эффективность препарата выражалась в уменьшении болевого синдрома и
других диспепсических явлений (тошноты, изжоги, отрыжки и метеоризма), которые в
различной степени присутствовали до начала лечения у всех больных. Через неделю от
начала лечения положительная динамика была отмечена у 78% больных, у 56% пациентов
боль исчезла. Максимальный эффект от лечения достигался уже к концу 2-й недели.
Объективным подтверждением эффективности смекты явилось улучшение
эндоскопической картины слизистой оболочки желудка. Отмечена и положительная
динамика распространенности воспалительного процесса -после терапии ни у одного из
детей не было обнаружено пангастрита и/или эрозий. Частота присутствия в желудке
желчи (признак нарушения моторики), после лечения уменьшалась в 4 раза, признаки
гастро-эзофагеального и дуодено-гастрального рефлюксов отмечались реже в 2,5 раза.
Динамические исследования показали значительное увеличение вязкости желудочной
слизи (р<0,01).
У большинства больных после проведенного лечения была выявлена положительная
динамика морфологических показателей: уменьшение или исчезновение признаков
воспаления (нейтрофильной и лимфоцитарной инфильтрации), желудочной метаплазии в
12-перстной кишке, а в желудке - уменьшение признаков атрофии слизистой оболочки.
Структура пришеечных клеток нормализовалась у большинства (у 92%) пациентов с
субатрофическим гастритом, бокаловидных клеток в 12-перстной кишке нормализовалась
у всех пациентов, что рассматривалось нами как свидетельство регенерации слизистой
оболочки. Усиления слизеобразования при морфологическом исследовании не отмечено.
Н.pylori не был обнаружен после лечения более чем у половины пациентов (у 53%), у
остальных степень обсемененности хеликобактериями снизилась. При исходной низкой
обсемененности микроорганизмы при повторном обследовании, как правило, не
выявлялись, а у больных с умеренной и высокой степенью обсемененности количество Н.
pylori сокращалось.
Таким образом, оказывая влияние на оба звена патогенеза заболеваний желудка - факторы
защиты и агрессии, смекта способствует восстановлению слизистой оболочки.
Эффективность препарата, с нашей точки зрения, обусловлена его способностью
улучшать реологические свойства желудочной слизи, повышая ее вязкость и тем самым
позитивно влияя на резистентность слизистой оболочки желудка к воздействию пепсина и
соляной кислоты. Положительный эффект у пациентов с моторными расстройствами
может объясняться способностью смекты связывать и элиминировать желчные кислоты и
лизолецитин - мощные цитотоксические факторы. Кроме того, снижение интенсивности
воспалительного процесса и его распространенности после приема смекты также
способствует ликвидации моторных нарушений.
Оценивая эффективность препарата, следует подчеркнуть, что важнейшим среди
оказываемых воздействий является факт купирования болевого синдрома и таких
диспепсических явлений, как изжога, отрыжка, икота, вздутие и метеоризм. Исчезновение
болевого синдрома к концу первой недели лечения, прежде всего, отмечено у детей с
неатрофическим антральным гастритом. Купирования таких диспепсических явлений, как
изжога, отрыжка, икота (клинические проявления (гастро-эзофагеальный рефлюкс),
вздутие и метеоризм, удалось достигнуть к 7-му дню лечения практически у всех
больных.
Необходимо подчеркнуть позитивное воздействие препарата на трофику тканей, что
выражалось в исчезновении эрозий у наблюдавшихся пациентов.
Анализ данных позволил сформулировать ряд положений, отражающих основные
направления действия смекты:
• смекта позитивно влияет на реологические свойства желудочной слизи, увеличивая ее
вязкость, способствуя протекции слизистой оболочки желудка;
• изменение реологических свойств слизи, а также сорбционный эффект смекты
способствуют элиминации пилорическогохеликобактера;
• влияние смекты на интенсивность моторных нарушений, по-видимому, опосредовано
изменением активности воспалительного процесса в слизистой оболочке желудке;
• смекта купирует болевой синдром и диспепсические явления, вследствие чего препарат
может применяться и при функциональных заболеваниях верхнего отдела
пищеварительного тракта у детей;
• опыт работы со "Смектой" позволяет сделать вывод о том, что применение и других
сорбентов может быть достаточно эффективным.
• необходимо продолжать исследования в этом направлении так как применение
сорбентов может, в перспективе, позволить найти выход из сложной ситуации с курацией
детей- бессимптомных носителей Н.pylori.
Проведенные исследования показали, что смекта эффективна как симптоматическое
средство при различных формах хронических гастритов у детей. У пациентов с H.pyloriассоциированным гастритом, сопровождающимся высокой степенью обсеменения
слизистой оболочки хеликобактериями, также получены положительные результаты
лечения, однако, таким больным необходимо дополнительное назначение специфических
антибактериальных препаратов. В детской клинической практике целесообразен
трехнедельный курс смекты.
Как указывалось выше, применение антибактериальных средств может приводить к
нарушению микроэкологии кишечника, что вызывает необходимость коррекции
структуры микробиоценозов. Поэтому представляется целесообразным устранение
имеющегося дисбиоза путем назначения комплексного лечения, включающего
биопрепараты, состав которых может способствовать устранению выявленной аномалии.
Нами было проведено исследование эффективности комплексной антибактериальной и
пробиотической терапии детей с Н.pylori-ассоциированными заболеваниями. Через две
недели после окончания терапии в комплексе с линексом или без него у всех пациентов
отмечено значительное клиническое улучшение. Отсутствие Н. pylori на слизистой
оболочке желудка показано у 84,6% детей, получавших только «тройную» терапию и у
92,3% больных, получавших, кроме того, линекс.
Через шесть месяцев после окончания терапии ни у одного из детей, у которых была
отмечена элиминация Н.pylori, не наблюдалось признаков клинического обострения
заболевания. Контрольное обследование с помощью дыхательного экспресс-теста
показало реинфицирование Н. pylori у 18,2% детей из группы, получавшей только
стандартную схему лечения, а в группе детей, получавших линекс, реинфекция не
выявлена ни у одного больного.
Проводилось лечение больных с документированными Н.pylori-ассоциированными
заболеваниями, сопровождавшимися сниженным количеством лактобацилл. Дети
получали противохеликобактерную антибактериальную тройную терапию в сочетании с
ацилактом. По окончании лечения клиническое улучшение было отмечено у 94,1%
обследованных детей, снижение титра антихеликобактерных антител в крови - у 70,5%
больных. Рост числа лактобацилл в желудке повышался у 88,2% больных при низкой
высеваемости оппортунистических бактерий. Через шесть месяцев ни у одного из
больных с документированной элиминацией Н. pylori признаков реинфекции не
отмечалось.
Оценивалась эффективность комбинированного лечения, включавшего стандартную
«тройную» терапию, смекту и лактосодержащие биопрепараты. Через 6 недель после
окончания лечения у всех детей отсутствовали какие бы то не было жалобы, то есть была
достигнута устойчивая клиническая ремиссия, что подтверждалось результатами
эндоскопического исследования. Гистологически подтвержденная эрадикация достигнута
у 94,1% детей. Через 6 месяцев инфицирования Н. pylori не было выявлено ни у одного из
этих больных.
Таким образом, показано, что применение в комплексе с антибиотиками биопрепаратов,
содержащих лактобациллы, способствует нормализации микрофлору желудочнокишечного тракта и препятствует повторному инфицированию Н.pylori. Это явление
можно объяснить конкурентным взаимодействием Н.pylori и лактобацилл. При этом
применение смекты и лакто-содержащего биопрепарата в качестве дополнения к
классической тройной терапии позволяет не только достичь эрадикации у большего, чем
при классической тройной терапии, количества пациентов, но и добиться тенденции к
восстановлению местных защитных механизмов, что, в свою очередь, способствует
самоизлечению и профилактике реинфекции.
Проблема антибиотикорезистентности
Helicobacter pylori у детей и выбор
терапии
Причиной недостаточной эффективности терапии многих гастродуоденальных
заболеваний является возрастающая резистентность к антибиотикам Helicobacter pylori
(Н.pylori), что обусловлено мутациями различных генов. Наибольшее практическое
значение имеют мутации 23S rРНК, лежащие в основе резистентности к кларитромицину.
Согласно международному консенсусу Маастрихт-3, схема с ингибитором протонной
помпы (ИПП), кларитромицином и метронидазолом рекомендована в качестве терапии 1
линии. Целью работы была оценка резистентности Н.pylori к кларитромицину с помощью
ПЦР-диагностики мутации 23S rРНК в биоптате слизистой оболочки желудка и оценка
эффективности стандартной схемы в сравнении со схемами с одним антибиотиком —
амоксициллином, Де-нолом и ИПП. Обследовано 68 детей с Н.pylori —
ассоциированными заболеваниями, резистентность Н.pylori к кларитромицину составила
28%. Эффективность стандартной схемы продолжительностью 10 дней составила 14%.
Эффективность схемы с амоксициллином, Де-нолом и омепразолом продолжительностью
7 дней составила 40%, продолжительностью 10 дней — 75%, при замене омепразола на
эзомепразол эффективность составила 83%. Схема с одним антибиотиком отличалась
хорошей переносимостью.
Ключевые слова:
Helicobacter pylori, антибиотикорезистентность, эрадикация.
Открытие H.pylori и доказательство его ведущей роли в развитии большинства
гастродуоденальных заболеваний кардинальным образом изменило подход к их лечению.
Хронический гастрит, язвенная болезнь, лимфома желудка, ассоциированные с Н.pyloriинфекцией, требуют проведения терапии, направленной на уничтожение микроба. В
последние годы отмечено нарастание неудач при проведении 7-дневных тройных схем
эрадикационной терапии [1,2,3]. Главной причиной их является
антибиотикорезистентность Н.pylori. Развитие резистентности Н.pylori к антибиотикам
связано с точечными мутациями различных генов (табл.1)
ТАБЛИЦА 1.
Генетические мутации как причины антибиотикорезистентности Helicobacter pylori
Антибиотики Мутирующие гены
Макролиды
Метронидазол
Фторхинолоны
Рифампицин
Амоксициллин
Тетрациклин
23S РНК
rdxA, frxA
gyrA
rpoB
pbp-1A
16S РНК
Так, резистентность к кларитромицину связана с изменением конфигурации рибосом
вследствие точечной мутации в домене V 23S rРНК [4]. Причина резистентности к
метронидазолу до сих пор окончательно не установлена. Очевидно, наиболее важна
альтерация rdxA-гена, но может быть вовлечение frxA-гена [5,6]. Низкая чувствительность
к амоксициллину возможна вследствие мутаций pbp1-гена, определяющего способность
белков Н.pylori связывать пенициллины [7]. К счастью, последняя наблюдается крайне
редко, поэтому микроб сохраняет почти 100% чувствительность к амоксициллину.
Плазмидная передача устойчивости ?-лактамазы также не свойственна Н.pylori.
В 1999-2002г в Европе было проведено проспективное мультицентровое исследование,
включавшее 16 педиатрических центров в 14 странах [8]. Всего было обследовано 1233
пациента, 41% которых были родом из Африки и Ближнего Востока. Исследовалась как
первичная (до лечения), так и вторичная (при неудачном лечении) резистентность.
Первичная резистентность к кларитромицину была выявлена у 20% детей, вторичная – у
42%. Первичная резистентность к кларитромицину была достоверно выше у детей до 6
лет, чем у подростков старше 12 лет и преобладала у жителей Южной Европы по
сравнению с Северной. Эти различия легко объяснимы более частым назначением
макролидов для лечения внежелудочных (в основном, респираторных) заболеваний у
детей раннего возраста и существованием определенных ограничений в назначении
препаратов этой группы в северо-европейских странах. В Восточной Европе отдельные
исследования также показали высокую резистентность к кларитромицину у детей. Так, в
Болгарии она составила 12,4%, а в Польше — 23,5% [9]. В России подобное исследование
было проведено в 2000г Л.В.Кудрявцевой, резистентность к кларитромицину у взрослых в
Москве составила 13% [10]. Рядом исследований была показана тенденция к росту
резистентности к кларитромицину: так, в США и Канаде до 2000г она составляла 4%, а в
2004г — 11-12% [11].
Основной причиной роста резистентности Н.pylori к кларитромицину является не столько
предшествующая неэффективная эрадикационная терапия, сколько широкое
использование макролидов при лечении других заболеваний. Поскольку дети чаще
получают препараты этой группы, то и распространенность устойчивых штаммов Н.pylori
среди них существенно выше, чем у взрослых. Так, исследование, проведенное в японских
семьях, показало, что хотя члены одной семьи обычно заражены идентичными штаммами
Н.pylori, резистентность к кларитромицину выше у детей [12]. В целом, резистентность
Н.pylori к кларитромицину возрастает пропорционально его потреблению в данном
регионе [13]. Все препараты группы макролидов характеризуются развитием
перекрестной резистентности штаммов in vitro, но не все макролиды в равной мере могут
формировать таковую у Н.pylori in vivo, поскольку это зависит также от способности
препарата накапливаться в слизистом слое. Поскольку кларитромицин быстро достигает
ингибирующей концентрации на поверхности слизистой оболочки желудка, после курса
лечения 2/3 не уничтоженных штаммов Н.pylori становятся резистентными к нему. Этого
нельзя сказать об азитромицине — он имеет низкую эффективность эрадикации (62%), но
вторичная резистентность развивается тольку в 23% случаев [14].
Резистентность Н.pylori к метронидазолу варьирует от 20 до 40% в Европе и США, но она
значительно выше в развивающихся странах (50-80%) [9]. За последнюю декаду ХХ века в
Европе произошло небольшое нарастание резистентности к метронидазолу: в 1991г она
составляла в среднем 27, 5% [15], а в 2000г — 33,1% [13]. В России резистентность к
метронидазолу выше, в 2001г в Москве и Петербурге она составила 55% [10], но в
последние годы имеет тенденцию к снижению (42%).
Интересно отметить, что частота антибиотикорезистентных штаммов Н.pylori выше у
больных хроническим гастритом (16,7% к кларитромицину, 56,4% к метронидазолу), чем
язвенной болезнью (5,6% к кларитромицину, 19,8% к метронидазолу) [16]. Возможно, это
связано с более высоким уровнем потребления антибиотиков у больных хроническим
гастритом в целом, но не исключено также и влияние особенностей токсигенности
штаммов Н.pylori. Так, при язвенной болезни почти все штаммы CagA-позитивны, в то
время как при хроническом гастрите только две трети [17]. Как известно, токсигенные
штаммы характеризуются более плотной адгезией к желудочному эпителию, что,
возможно, улучшает условия воздействия на них антибиотиков, повышает эффективность
терапии и снижает необходимость назначения повторных курсов лечения. Нами также
было показано ранее, что более низкий процент эрадикации может объясняться
иммунологической недостаточностью у пациентов с нодулярным гастритом и у детей в
возрасте до 7 лет [17].
Необходимо подчеркнуть несоответствие результатов разных методов оценки
резистентности Н.pylori к метронидазолу. Если в определении резистентности к
кларитромицину достоверность диагностики мутации 23S РНК с помощью ПЦР или
флюоресцентной гибридизации in situ не вызывает сомнений, то методы обнаружения
резистентности к метронидазолу основаны на бактериологической диагностике (метод
дисков, Е-тест) и до сих пор не стандартизованы. Возможно, этим объясняется нередкое
несовпадение результатов, полученных in vitro, и эффективности терапии in vivo.
Тем не менее, даже с учетом возможных погрешностей в определении резистентности
Н.pylori к метронидазолу, можно делать вывод о высоком, среднем или низком в целом ее
уровне в популяции. Российские данные указывают на довольно высокую резистентность
Н.pylori к метронидазолу [10]. Антибиотикорезистентность Н.pylori является главной
причиной неэффективности терапии. Так, суммируя результаты 20 европейских
исследований, в которых проведена оценка результатов стандартной тройной терапии 1
линии, включавшей ИПП, амоксициллин и кларитромицин у 2751 пациента, можно
заключить, что в случае чувствительности штаммов эрадикация достигается в среднем у
87,8%, а при устойчивости к кларитромицину — только у 18,3% пациентов [9]. Это 70%
снижение эффективности лечения подчеркивает клиническое значение резистентности
Н.pylori к кларитромицину. Еще более интересны результаты тройной терапии,
включавшей ИПП, метронидазол и кларитромицин. В случае чувствительности Н.pylori к
обоим антибиотикам эрадикация достигалась у 97%, при резистентности к
кларитромицину — у 50%, к метронидазолу — у 72,6%, к обоим антибиотикам — ни у
одного пациента. То есть, устойчивость к кларитромицину приводит в любом сочетании к
существенному снижению эффективности терапии. В то же время, устойчивость к
метронидазолу в меньшей степени отражается на результатах лечения, особенно при
удлинении курса лечения до 10-14 дней [18]. На основании этих данных сочетание
кларитромицина и метронидазола было признано более эффективным, чем амоксициллина
и кларитромицина на 1 линии терапии, а продолжительность лечения было рекомендовано
удлинить до 14 дней. Это легло в основу рекомендаций Маастрихт-3-2005, однако такое
сочетание применимо лишь в популяциях с высокой чувствительностью к обоим
антибиотикам. В случае резистентности к метронидазолу выше 40% и кларитромицину
выше 15-20% применение этих антибиотиков нецелесообразно [20]. Целью данной работы
явилась оценка резистентности к кларитромицину у детей с Н.pylori -ассоциированными
заболеваниями и разработка схем эрадикации Н.pylori, приемлемых для популяции с
высокой антибиотикорезистентностью.
Материал и методы:
Под нашим наблюдением находились 68 пациентов в возрасте от 10 до 17 лет с
хроническими заболеваниями верхних отделов пищеварительного тракта,
ассоциированных с инфекцией Н.pylori: язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки
(ЯБДПК) была диагностирована у 16 человек, хронический гастродуоденит (ХГ) — у 42
человек. В исследование были включены лишь дети, не получавшие ранее
антихеликобактерной терапии. Пациенты, получавшие в течение последних 3 месяцев
антибактериальную терапию по поводу других заболеваний, в исследование не
включались.
С целью определения чувствительности Н.pylori к кларитромицину использовали ПЦР в
биоптате слизистой оболочки антрального отдела желудка для выявления точечной
мутации 23S РНК, исследование проводилось в лаборатории молекулярной генетики
больницы №31 г.Санкт-Петербурга.
В соответствии с выбранной схемой терапии, дети были разбиты на 4 группы, идентичные
по возрасту, полу и характеру гастродуоденальной патологии. В 1 группу вошли дети,
получавшие схему, рекомендованную консенсусом Маастрихт-3. Пациенты остальных
групп получали схемы с одним антибиотиком — амоксициллином, к которому не
отмечено резистентности Н.pylori, но при этом схемы в группах отличались по
продолжительности (7 дней во 2 группе, в остальных 10 дней) или по типу ИПП
(эзомепразол или омепразол).
Группа 1: (25 пациентов)
• Эзомепразол (Нексиум) 40мг 2раза в день
• Кларитромицин 0,5 г 2 раза в день
• Метронидазол 0,5 г 2 раза в день
Продолжительность — 10 дней
Группа 2: (10 пациентов)
• Омепразол (Хелол) 20 мг 2 раза в день
• Де-нол 120 мг 4 раза в день
• Амоксициллин (Флемоксин-солютаб) 1,0 г 2 раза в день
Продолжительность — 7 дней
Группа 3: (23 пациента)
• Омепразол (Хелол) 20 мг 2 р в день
• Де-нол 120 мг 4 раза в день
• Амоксициллин (Флемоксин-солютаб) 1,0 г 2 раза в день
Продолжительность — 10 дней
Группа 4: (10 пациентов)
• Эзомепразол (Нексиум) 40 мг 2 р в день
• Де-нол 120 мг 4 раза в день
• Амоксициллин (Флемоксин-солютаб) 1,0 г 2 раза в день
Продолжительность — 10 дней
Для установления диагноза мы использовали стандартные методы обследования: ФЭГДС
с биопсией из тела и антрального отдела желудка, гистологическое исследование
биоптатов. Для диагностики Н.pylori, наряду с гистологическим исследованием,
применяли быстрый уреазный тест (Хелпил-тест®), дыхательный Хелик-тест® ООО
«АМА». Обследование с использованием всех вышеперечисленных методов проводилось
до начала терапии и спустя 6 недель после завершения лечения.
Для оценки антисекреторной эффективности ингибиторов протонной помпы (ИПП)
проводилась суточная рН-метрия с помощью аппарата “Гастроскан-24” на пятый день
терапии. Для оценки переносимости схемы использовались анкеты с ежедневным
внесением данных об объективных и субъективных симптомах у каждого пациента.
Результаты:
При определении чувствительности Н.pylori к кларитромицину из 68 обследованных
пациентов точечные мутации 23S РНК обнаружены у 19 детей, что составило 28%.
Данные суточного мониторинга рН, проведенного на 5 день приема ИПП показали, что
средний рН в теле желудка на фоне приема омепразола составил 4,88, а на фоне приема
эзомепразола — 5,9.
Анализ субъективных и объективных симптомов показал, что стандартной схема,
рекомендованная Маастрихт-3 (ИПП+кларитромицин+метронидазол), в 60%
сопровождалась побочными реакциями в виде усиления болей в животе (17%), диареи
(7%), тошноты (23,5%) и рвоты (12%). Схема с одним антибиотиком, независимо от
продолжительности (7 или 10 дней) и выбора ИПП (омепразол или эзомепразол), хорошо
переносилась детьми и лишь в 10-11% сопровождалась небольшой тошнотой. Болевой
синдром был купирован несколько быстрее у пациентов 2-4 групп (в среднем на 3 день),
чем в 1 группе (на 4-5 день).
Контрольное исследование через 6 недель показало, что среди детей 1 группы,
получавших стандартную схему (ЭКМ), эрадикация была достигнута лишь в 14%.
Пациенты 2 группы, получавшие схему с одним антибиотиком (ОДА) в течение 7 дней,
имели более высокий, но также недостаточный показатель эрадикации — 40%. При
удлинении этой схемы до 10 дней (3 группа) эрадикация достигалась уже в 75%. Замена
омепразола на эзомепразол в этой схеме (4 группа) позволило увеличить эффективность
лечения и достичь эрадикации в 83%. (рис.1).
Рис.1. Эффективность схем эрадикации: ОДА7 – омепразол+ Де-нол +амоксициллин 7
дней, ОДА10 – омепразол+ Де-нол+амоксициллин 10 дней, ЭДА 10 – эзомепразол+ Де-
нол+амоксициллин 10 дней, ЭКМ 10 – эзомепразол+кларитромицин+метронидазол 10
дней.
Обсуждение:
Эрадикация Н.pylori является основой лечения наиболее тяжелых форм
гастродуоденальной патологии у детей. Долгосрочные катамнестические наблюдения
подтверждают уменьшение частоты обострений язвенной болезни, возможность
обратного развития начальных атрофических изменений после успешной эрадикации
Н.pylori [17, 21]. Своевременная антихеликобактерная терапия, проведенная в детском
возрасте, может уменьшить риск развития рака желудка и вероятность некоторых
внежелудочных, в частности, аутоиммунных, заболеваний в дальнейшем [22]. Вместе с
тем, неудовлетворительные практические результаты классических эрадикационных схем,
высокий уровень антибиотикорезистентности Н.pylori в России заставляют проводить
повторные курсы лечения, делая терапию еще более агрессивной и усиливая скептицизм
врачей. В соответствии с Международными рекомендациями Маастрихт-3-2005,
оптимальной схемой 1 линии может быть схема, включающая ИПП, кларитромицин и
метронидазол продолжительностью 14 дней. Однако эта схема может быть назначена
только при условии популяционной резистентности в регионе, не превышающей 40% к
метронидазолу и 20% к кларитромицину. В России резистентность Н.pylori к
метронидазолу достигла критического порога (42%). Резистентность к кларитромицину
была до недавнего времени изучена только у взрослых, у них она казалась допустимой —
13%. Наше исследование, хотя и ограниченное по численности, показало значительно
более высокий показатель резистентности у детей – 28%, что превышает допустимый
порог. То есть, рекомендуемая Маастрихтом-3 терапия 1 линии в условиях России мало
приемлема, и наше исследование это подтвердило — эрадикация была достигнута лишь у
14% больных. К тому же, схема с кларитромицином и метронидазолом плохо переносится
детьми, поэтому не может быть рекомендована в детской отечественной практике. Среди
основных антибиотиков, используемых для терапии Н.pylori-ассоциированных
заболеваний, только амоксициллин может не вызывать сомнений в чувствительности к
нему возбудителя. Как строить схему лечения в этих условиях? Можно пойти по пути
поиска новых и новых антибиотиков, но это неизбежно будет увеличивать круг
резистентности и никак не снизит агрессивность лечения.
Мы выбрали другой путь, руководствуясь первой заповедью Гиппократа: «Не вреди». Мы
ограничились одним антибиотиком, к которому сохраняется чувствительность Н.pylori —
амоксициллином, дополнив его наиболее эффективным препаратом висмута — Де-нолом,
обладающим синергизмом с антибиотиками и одновременным цитопротективным
действием. Возможности этого препарата действовать даже на кокковые и
внутриклеточные формы Н.pylori, отличные от антибиотиков точки приложения,
отсутствие резистентности к нему представлялись нам более оптимальными, чем поиск
новых сочетаний антибиотиков.
Эффективное подавление желудочной секреции также является залогом успешной
эрадикационной терапии. Многие антибиотики разрушаются в кислой среде желудка, в
частности, амоксициллин действует только при рН выше 4. Поэтому правильный выбор
антисекреторного препарата может повышать результативность лечения. Среди всех ИПП
наиболее изучен омепразол, в мире накоплен достаточно большой опыт его использования
в педиатрической практике, в том числе у детей раннего возраста. Большинство
клинических и фармакокинетических исследований, проведенных у детей, показало, что
для достижения антисекреторного эффекта в течение 24 часов оптимальна доза
омепразола 1 мг/кг/сут. Недавно появившийся левовращающий изомер омепразола
эзомепразол отличается более медленным выведением и, как следствие, более
продолжительным подавлением желудочной секреции. Препарат широко апробирован у
взрослых, при изучении его фармакокинетики у детей было показано, что, начиная с 3хмесячного возраста, она не отличается от таковой у взрослых. Поэтому эзомепразол,
также как омепразол, был официально рекомендован ESPGHAN для лечения
кислотозависимых заболеваний у детей старше 3 мес., при этом его эквивалентная доза в
два раза выше, чем доза омепразола. Проведенная нами оценка антисекреторного
действия омепразола и эзомепразола в эквивалентных дозах показала эффективность и
безопасность обоих препаратов у детей. При этом более высокие значения
внутрижелудочного рН на фоне приема эзомепразола (5,9 против 4,88) сопровождались
повышением эффективности схемы эрадикации при прочих равных условиях (83% против
75%).
Сравнительное исследование эффективности в зависимости от длительности лечения
подтвердило, что 7-дневная терапия не достаточна для успешной эрадикации Н.pylori, но
и 14-дневный курс, как рекомендует Маастрихт-3, может быть излишним. 10-дневная
тройная терапия с одним антибиотиком, включавшая ИПП+ Де-нол+амоксициллин
оказалась результативной в 75-83%.
Таким образом, тщательный подбор каждого компонента эрадикационной схемы может
быть залогом ее эффективности. В условиях высокой резистентности Н.pylori к
метронидазолу и кларитромицину у детей в России может быть использована схема с
одним антибиотиком, включающая амоксициллин, Де-нол и ингибитор протонной помпы,
предпочтительно эзомепразол. Оптимальная продолжительность лечения составляет 10
дней. Схема хорошо переносится, удобна в использовании, так как предусматривает
двукратный прием препаратов, и может быть примером усиления эффективности терапии
при одновременном снижении ее агрессивности.
Выводы:
• У детей Санкт-Петербурга первичная резистентность Н.pylori к кларитромицину очень
высока и составляет примерно 28%.
• Схема 1 линии, рекомендованная Международным консенсусом Маастрихт-3-2005
(ИПП+Кларитромицин+Метронидазол), имеет низкую эффективность и плохую
переносимость у детей.
• Оптимальная продолжительность эрадикационной схемы должна составлять 10 дней.
• Эзомепразол (Нексиум) в эквивалентной дозе 2 мг/кг/с хорошо переносится, сильнее
подавляет желудочную секрецию, чем омепразол, и в результате повышает эффективность
эрадикационной терапии.
• Включение в схему Де-нола на 1 линии терапии повышает ее результативность
• Схема с одним антибиотиком – амоксициллином в сочетании с ИПП и Де-нолом
продолжительностью 10 дней имеет высокую эффективность и хорошую переносимость.
Оценка информативности и
рациональный выбор методов выявления
Helicobacter pylori при хронических
болезнях органов пищеварения у детей
ирокая распространенность инфекции Н.pylori и связь ее с развитием хронического
гастрита, язвенной болезни, MALT-омы и рака желудка делают ее одной из главных
проблем медицины, важнейшим условием успешного решения которой является точная
диагностика пилорического хеликобактериоза. За прошедшие с момента открытия
Н.pylori годы разработано значительное число методов его диагностики, среди них есть
инвазивные, требующие взятия биоптата слизистой оболочки желудка, и неинвазивные;
прямые, идентифицирующие непосредственно микроба или его антигены и непрямые,
выявляющие продукты его жизнедеятельности или антитела к нему; методы, проводимые
in vitro в различных пробах (биоптате, крови, секретах) и in vivo после приема внутрь
мочевины. Каждый из предложенных методов имеет свои преимущества и недостатки.
Поэтому в каждой конкретной ситуации выбор метода должен основываться на
соотношении стоимость/эффективность и строго соответствовать поставленной задаче:
скрининг, первичная диагностика или динамический контроль за эффективностью
эрадикационной терапии. Выбор метода диагностики зависит и от условий, в которых
проводится исследование: необходимо учитывать возможность проведения эндоскопии и
биопсии, оснащенность лаборатории, наличие необходимой техники и инструментов,
подготовку медицинского персонала. Имеет значение также возраст обследуемого
ребенка. В данной главе рассмотрены различные диагностические методы, проведена их
сравнительная оценка и определена оптимальная область использования каждого из них.
Инвазивные методы
Инвазивные методы основаны на исследовании биоптатов, полученных во время
эндоскопического исследования. Несмотря на очевидный прогресс в развитии
неинвазивных методов и тенденцию к их предпочтению в последние годы [1], эндоскопия
по-прежнему является базовым методом диагностики патологии верхних отделов
желудочно-кишечного тракта. Проведение ее регламентировано "Стандартами
диагностики и лечения болезней органов пищеварения" МЗ РФ (1998) [2]. Россия
относится к странам с высокой частотой рака желудка, что, согласно Международным
рекомендациям [3], также оправдывает широкое диагностическое использование
эндоскопии. В 2000 г. приняты рекомендации ESPGHAN и NASPGN по ведению
инфекции Н.pylori у детей [4, 5]. В обоих документах утверждается, что эндоскопия с
взятием биоптатов слизистой оболочки является предпочтительным методом диагностики
Н.pylori у детей. Детей необходимо обследовать на Н.pylori при наличии симптомов
органических заболеваний.
При первичной диагностике предпочтение отдается инвазивным методам еще и потому,
что главной целью исследования является выяснение причины симптомов, а не только
диагностика Н.pylori [6].
По нашим данным (рис. 13), Н.pylori в антральном отделе желудка у детей с Н.pyloriассоциированными гастродуоденальными заболеваниями обнаруживался почти в 2 раза
чаще, чем в фундальном отделе и луковице двенадцатиперстной кишки.
Рис. 13. Частота выявления H.pylori (в %) и степень обсемененности (1, 2, 3 балла)
биоптатов антрального отдела, тела желудка и луковицы двенадцатиперстной кишки у
детей (по материалам Е.А.Корниенко, 2000г.)При этом во всех отделах желудка и
двенадцатиперстной кишки доминировала 1 степень обсемененности. В связи с этим, для
уменьшения вероятности ошибок, необходимо исследовать не менее 2 биоптатов из
антрального отдела желудка. Кроме того, следует учитывать, получал ли пациент ранее
антисекреторные препараты, в частности ИПН, поскольку прием последних может
способствовать перемещению H.pylori в проксимальном направлении, и обнаружение
хеликобактерий становится более вероятным в биоптатах, взятых из фундального, а не из
антрального отдела желудка [7].
Бактериологический метод включает в себя несколько этапов, необходимых для
идентификации микроба: транспортировку, культивирование, изучение культуры. Метод
обладает наибольшей (до 100%) специфичностью из всех существующих методов
диагностики H.pylori, не даетложнопо-ложительных результатов, что позволило
некоторым исследователям назвать его "золотым стандартом". Однако
бактериологический метод имеет ряд существенных недостатков. Во-первых, для
успешного культивирования H.pylori необходимо произвести посев в кратчайшие сроки
после проведения биопсии, что не всегда возможно. Во-вторых, сложные условия
культивирования не позволяют широко использовать этот метод в реальных условиях. Втретьих, сроки проведения исследования не дают возможности ответить на вопрос о
наличии H.pylori ранее, чем через неделю, что влечет за собой промедление с назначением
соответствующей терапии. В-четвертых, метод относится к дорогостоящим и трудоемким,
и, если его используют с единственной целью обнаружения H.pylori, то целесообразнее
использовать более дешевые, быстрые и информативные методы.
Чувствительность бактериологического метода значительно уступает его специфичности
и составляет, по данным разных авторов, от 75 до 90% [8,9, 10]. Но лишь этот метод
позволяет не только идентифицировать микроорганизмы, но и изучить их свойства, в
частности, оценить чувствительность к различным антибактериальным препаратам. В
условиях возрастающей антибиотикорезистентности H.pylori бактериологический метод
представляет особую ценность при обследовании больных, уже получивших один или два
неудачных курса эрадикационной терапии, так как изучение индивидуальной
чувствительности к антибиотикам позволяет сформировать оптимальную схему лечения.
Повышение чувствительности бактериологического метода возможно за счет
использования ростовых добавок при культивировании, таких как сульфат железа,
пируват натрия, свиной муцин, которые улучшают рост Н.pylori в культуре [11].
В последнее время стало возможным бактериологическое исследование не только
биопсионного материала, но и желудочного сока, который извлекается с помощью
капсулы на нити - Стринг-тест [12,13].
Штаммы, полученные при культивировании, могут быть изучены методом полимеразной
цепной реакции (ПЦР), которая позволяет оценить свойства микроба, в частности
токсигенность по обнаружению генов CagA, VacA, IceA, BabA [14] и т. д., а также
устойчивость микроорганизма к макролидам по точечной мутации 23S рибосомальной
РНК [15], что может иметь важное прогностическое значение в оценке факторов риска
канцеро- и ульцерогенеза и подборе эрадикационных схем. Возможность определения
мутации 23S рибосомальной РНК непосредственно в биоптате сокращает время
исследования до нескольких часов [16,17].
Гистологический метод позволяет не только обнаружить бактерии, но и определить их
расположение на слизистой оболочке, наблюдать взаимоотношение с тканями "хозяина",
оценить характер патологического процесса, наличие и выраженность воспаления,
атрофии, метаплазии. Поэтому метод признан "золотым стандартом" в диагностике
инфекции Н.pylori [18]. Для элективной окраски Н.pylori применяют различные методики.
Наиболее распространенной в мире является специфическая окраска серебрением по
Вартину-Старри, которая отличается высокой специфичностью и чувствительностью [19].
По мнению Л.И. Аруина с соавт. (1993) [20], наиболее чувствительными оказались
окраски акридиновым оранжевым (85%) и красителем Гимзы (79%), несколько меньше
чувствительность окраски по Граму (72%). Исследование, проведенное И.А. Морозовым,
В.Н. Матушевской и соавт.(1996) [21], показало довольно низкую чувствительность
гистологического метода в сравнении с изучением мазков-отпечатков и "Де-нол -тестом" 79,7%. Возможно, такая низкая чувствительность обусловлена, с одной стороны,
особенностями самого микроба, который обитает в слое покрывающей эпителиальные
клетки слизи и не всегда плотно адгезирован к эпителию, поэтому легко вымывается при
подготовке биоптатов к исследованию. С другой стороны, и сам слизистый слой легко
отмывается в процессе подготовки биоптата. Для ликвидации этого недостатка метода
И.А. Морозов (1997) [22] предлагает укрывать поверхность биоптата слоем агарового геля
(0,85-1,0%), что позволяет сохранить поверхностный слой слизи и бактерии, находящиеся
в нем.
Интерес представляет новая технология так называемой флюоресцентной гибридизации in
situ (FISH), предложенная Trebesius К. с соавт. (2000) [23], которая не требует
культивирования Н.pylori и/или проведения ПЦР. Метод позволяет совершенствовать
морфологическое выявление микроба путем обработки срезов меченными
флюоресцирующими нуклеотидами. Нуклеотиды могут быть связаны либо с 16S
рибосомальной РНК (для идентификации Н.pylori), либо с 23S рибосомальной РНК (для
определения резистентности к макролидам). После гибридизации бактерии обнаруживают
при флюоресцентной микроскопии, при этом результаты могут быть получены в течение 3
часов. Метод имеет высокую чувствительность (91%) и специфичность (100%) и
позволяет выявить инвазию смешанными штаммами, которая обнаружена у 15% больных
[24].
Биохимический метод обнаружения Н.pylori в биоптате основан на высокой уреазной
активности хеликобактерий. В настоящее время существуют различные модификации
уреазных тестов - преимущественно, на жидкой или гелевой основе (CLOtest, Tri-Med
Specialities, Osborne Park, Western Australia и т. д.), которые просты в использовании, не
требуют дополнительных исследований и позволяют с достаточно высокой точностью
идентифицировать Н.pylori по изменению цвета индикатора в результате защелачивания
среды аммиаком, выделившимся в процессе гидролиза мочевины микробной урезой.
Большинство тестов содержат в качестве индикатора феноловый красный и изменяют
свой цвет с желтого на красный в период времени от 20 мин. до 24 час., отличаются
высокой чувствительностью (75-95%) и специфичностью (100%) [25]. Однако следует
учитывать, что при желудочном кровотечении чувствительность уреазных тестов
снижается примерно на 25% [26].
К преимуществам всех уреазных тестов следует отнести простоту выполнения и быстроту,
к недостаткам - косвенную, непрямую сущность метода, то есть обнаружение не Н.pylori
как такового, а лишь его уреазной активности. При невысокой степени обсемененности
ткани суммарная уреазная активность может быть низкой, поэтому тест может дать
ложноотрицательный результат. Именно из-за этого, по мнению Madam S. et al. (2000)
[27], у детей уреазный тест не имеет столь же высокой чувствительности, как у взрослых.
Наряду с уреазопозитивными иногда встречаются уреазонегативные штаммы Н.pylori
[28], которые нельзя обнаружить с помощью уреазного теста. С другой стороны,
присутствие в ткани большого количества транзиторной флоры, среди которой могут
встречаться менее активные уреазопродуценты (протей, псевдомонады, стрептококки и
др.) может дать ложноположительный результат теста, особенно при длительной 24часовой экспозиции в термостате [29]. В связи с этим большую специфичность имеют
лишь т. н. "холодные" тесты, то есть проводимые при комнатной температуре без
инкубации в термостате, что позволяет получить положительный ответ лишь на уреазу,
накопленную в ткани (тканевую), специфичную для Н.pylori, а не вырабатываемую
бактериями в процессе культивирования (бактериальную).
Удачным примером "холодного" теста является быстрый уреазный тест на основе
твердого волокнистого носителя - Хелпил-тест, который был разработан в 1998 г. [30].
Гигроскопичный материал теста адсорбирует жидкость из биоптата, лежащего на нем,
поэтому биохимическая реакция происходит на ограниченном пространстве под ним, что
делает сопоставимым количество уреазы и реакционной среды и повышает тем самым
чувствительность метода. Использование в качестве индикатора бромтимоло-вого синего
с более низкой рН перехода позволяет зафиксировать в реакционной среде меньшее
количество аммиака, а следовательно и уреазы, и также повысить чувствительность
метода. Тест отличается дешевизной и быстротой (1-3 мин.) и позволяет использовать
один и тот же биоптат для дальнейшего гистологического исследования, такими
свойствами не обладает ни один из существующих ныне уреазных тестов.
Чувствительность и специфичность Хелпил-теста у детей составляют 95%. Сочетание
уреазного теста с последующим гистологическим исследованием способно приблизить
точность диагностики к 100% [1].
Неинвазивные методы
Серологический метод: Инфицирование Н.pylori вызывает местный и общий иммунный
ответ макроорганизма с накоплением специфических антител. На ранних стадиях
регистрируется повышение в крови уровня специфических антител класса IgM [31], а
через 3-4 недели в крови начинает нарастать уровень IgG и IgA [32], специфичных по
отношению к антигенам клеточной стенки и жгутиков бактерий. Более информативным
считается определение специфического IgG, так как антитела именно этого класса
иммуноглобулинов преобладают в сыворотке крови. В слизистой оболочке желудка
наиболее интенсивно синтезируются антитела класса IgA, поэтому повышение в крови
специфических IgA-антител имеет ограниченную чувствительность (45%), но высокую
специфичность (95-100%) [33] и отражает степень повреждения слизистой оболочки [31].
Повышенный уровень специфических антител класса IgM удается обнаружить лишь у
27% Н.pylori-инфицированных детей [34]. В детском возрасте пороговые значения
антител к Н.pylori ниже, чем у взрослых, а специфические антитела классов IgM и IgA
вообще не являются чувствительным индикатором инфицирования хеликобактериями [35,
36].
Ввиду изложенного использование при обследовании детей критериев диагностической
оценки, применимых у взрослых, приводит к гиподиагностике, в результате чего большая
часть Н.pylori-инфицированных детей остается не выявленной. Ложноотрицательные
результаты ИФА могут быть обусловлены слабым иммунным ответом макроорганизма,
ранней стадией инфицирования, вариабельностью антигенной структуры различных
штаммов Н.pylori [37] и зависят от качества используемых тест-систем [1]. Наиболее
чувствительными серологическими тестами являются ELISA, Pyloriset EIA, Helicoblot
[38], но у детей их информативность составляет лишь 75%. В отличие от ИФА,
иммуноблоттинг (Western blotting) продемонстрировал высокую чувствительность и
специфичность в детском возрасте (95,5%) [6]. Тем не менее, не исключается полностью
возможность ложноположительных результатов [39].
Ложноположительные результаты ИФА, которые не превышают 5%, могут иметь место у
детей раннего возраста в связи с пассивной трансплацентарной передачей анти-Н.pyloriантител класса IgG от матери, при наличии антител к другим бактериям, которые могут
перекрестно реагировать с антигенами Н.pylori (Campylobacter, Helicobacter heilmanii)
после успешного лечения Н.pylori-инфекции, так как антитела в крови могут сохраняться
в течение многих месяцев [40].
Методы обнаружения антител к Н.pylori в сыворотке крови ("лабораторные" тесты) более
точны, чем тесты в капле цельной крови ("офисные тесты"). Последние просты и удобны в
амбулаторной практике, не требуют дополнительной аппаратуры, но их чувствительность
составляет всего 58-75% даже у взрослых [41,42]. Оценка тестов в определенной мере
субъективна и имеет "серую" зону сомнительных результатов, что также способствует
снижению их диагностической ценности.
Результаты серологического исследования зависят от уровня распространенности
инфекции Н.pylori в популяции. Loy C.T. и соавт. (2000) [43] показали, что в популяции с
низкой распространенностью инфекции Н.pylori (10%), точными являются лишь
отрицательные результаты и велик процент ложноположительных. В популяциях с
высокой распространенностью H.pylori (90%), напротив, точность отрицательного
результата составляет всего 63%. Поэтому серологические тесты должны быть
адаптированы к региональным условиям.
Учитывая вышеизложенное, серологический метод диагностики Н.pylori предпочтителен
для первичного скрининга и эпидемиологического обследования широких контингентов
населения. Ценность данного метода в педиатрической практике недостаточна, поэтому
согласно рекомендациям ESPGHAN [4], его использование у детей ограничено. Однако
доступность и относительно низкая стоимость сделали серологическую диагностику
Н.pylori наиболее широко применяемой в мире. В недавних исследованиях Gisbert J.P. и
соавт.(2000) [44] показано, что снижение уровня специфических антител через 3-6 мес.
после лечения может служить критерием успешной эрадикации хеликобактерий.
Обнаружение антител к Н.pylori в слюне и моче может быть альтернативой
серологической диагностики с использованием сыворотки крови, поскольку эти методы
абсолютно неинвазивны и просты в исполнении, однако проведенные исследования
показали недостаточную их чувствительность (74%) и специфичность (67%) [45,46,47].
Возможность использования этих тестов у детей в настоящее время изучается.
Обнаружение антигена Н.pylori в кале с помощью поликлональных антител (Premier
Platinum HpSA] стало возможным в последние 2 года. Несколько исследований,
проведенных в разных частях мира, убедительно показали обнадеживающие результаты
метода [48, 49]. Для проведения исследования требуется лишь небольшая порция кала,
причем пробы могут храниться при температуре -20°С неограниченно долго, что
позволяет собирать пробы у небольшого числа пациентов, а также проводить повторное
исследование при получении сомнительного результата. Недавний обзор, суммировавший
результаты мультицентровых исследований теста [50], подтвердил его высокую
чувствительность (93,1%) и специфичность (92,8%) при первичной диагностике. Те же
показатели у пациентов после эрадикационной терапии оказались несколько ниже и
составили около 90%. Точность диагностики антигена Н.pylori в кале была также доказана
у детей [51, 52, 53], что делает этот метод особенно привлекательным для оценки
эффективности эрадикационной терапии в детском возрасте. Однако у детей до 5 лет, по
данным совместного российско-итальянского исследования [54], несмотря на высокую
специфичность (97%), чувствительность теста оказалась низкой (67%), особенно при
активном гастрите, что сужает возрастные рамки использования этого метода. Широкое
внедрение метода в отечественную медицинскую практику ограничивает также его
высокая стоимость.
Обнаружение антигена Н.pylori с помощью ПЦР возможно не только в биоптате
слизистой оболочки желудка, но и слюне, зубном налете, моче и кале. Метод позволяет
обнаруживать микроб в любой форме, в том числе атипичной, кокковой, а также выявлять
различные по токсигенности и антигенной структуре штаммы. Праймер для ПЦР
получают из нуклеотидной последовательности генауреазы А или В Н.pylori [55]. Еще
один используемый праймер - нуклеотиды, получаемые из 16S rPHK H.pylori. Эти
праймеры специфичны для всех штаммов Н.pylori и не обнаруживаются у других видов
бактерий видах, поэтому ПЦР является высокоспецифичной реакцией. Более того, ПЦР наиболее чувствительный метод по сравнению с другими методами диагностики Н.pylori
и позволяет обнаружить даже 1,47 рд ДНК, что соответствует 800 микр.кл. [56].
Однако частота обнаружения микробного антигена в различных биологических
материалах может быть значительно ниже по сравнению с результатами исследования
биоптатов. Так в исследовании Sahin F.I. и соавт. (2001) [57] хеликобактерии были
обнаружены лишь в 45% образцов зубном налета по сравнению со 100% в биоптате
слизистой оболочки желудка. Специфичность метода также может существенно
варьировать в зависимости от используемого праймера и условий проведения реакции,
что объясняет довольно широкий разброс точности ПЦР в разных исследованиях. На
сегодняшний день широкое внедрение ПЦР-диагностики в отечественную практику
ограничено также из-за слабой оснащенности лабораторий и довольно высокой стоимости
метода.
Дыхательные методы
Неинвазивные дыхательные методы являются по сути биохимическими тестами in vivo,
так как основаны на регистрации в выдыхаемом воздухе продуктов гидролиза мочевины
уреазой Н.pylori - углерода, входящего в состав углекислого газа, или аммиака. В
зависимости от этого их можно подразделить на две подгруппы: углеродные и
аммиачные.
Углеродные дыхательные тесты основаны на исследовании в выдыхаемом воздухе
пациента атомов углерода С1144** или С13 после приема порции мочевины, меченной
этими изотопами. Методика проведения обоих тестов сходна, но если регистрацию С14*
проводят с помощью сцинтиллятора, то для определения С13, кот9рый не обладает
радиоактивностью, требуется высокочувствительный газовый масс-спектрометр, который
с высокой точностью может уловить микродозы С13 в выдыхаемом воздухе (0,03%).
Однако перед исследованием необходимо исключить из диеты злаки и тростниковый
сахар, так как они содержат С13 [58]. При сравнении этих двух дыхательных тестов видны
преимущества и недостатки каждого из них. Метод с определением С14* не может
использоваться у детей ввиду его радиоактивности, метод с определением С13 абсолютно
безопасен, но требует использования чрезвычайно дорогого масс-спектрометра, стоимость
которого доходит до $125 000. С целью удешевления данного метода для регистрации
соотношения С13/С12 в настоящее время разработаны другие способы - инфракрасная
спектроскопия (INFAI, IRIS) [59] и диодная лазерная спектроскопия [60]. Упрощению и
удешевлению метода способствуют также снижение дозы меченной С13 мочевины до 5075 мг и двукратный забор воздушной пробы - перед приемом мочевины и через 15-30 мин.
после него. В двух исследованиях [61, 62] подтверждена необходимость приема раствора
лимонной кислоты или пробного завтрака, включающего мочевину, что замедляет
эвакуацию из желудка и способствует растеканию раствора по большей площади желудка,
усиливая тем самым интенсивность гидролиза.
Метод отличается высокой чувствительностью и специфичностью (97-98%) и признан
"золотым стандартом" среди неинвазивных методов [63, 64]. Однако его чувствительность
зависит от возраста (рис. 14). В раннем возрасте из-за малого объема выдыхаемого
воздуха точность метода существенно снижается [65], поэтому его использование не
рекомендуется у детей до 5 лет [54]. На результаты метода может влиять физическая
активность ребенка [66], а также медикаментозная терапия. Ложноотрицательные
результаты теста были получены у пациентов, получавших ИПН, Н2гистаминоблокаторы, препараты висмута и антибиотики, поэтому контроль
эффективности эрадикационной терапии с помощью С13-дыхательного теста должен
проводиться не ранее, чем через 4 недели после ее окончания [1].
Возможность регистрации аммиака в воздухе полости рта была доказана нами при
использовании ион-дрейфового спектрометра, регистрирующего и идентифицирующего
даже единичные ионы в воздушной среде [67]. Работы по совершенствованию
дыхательной диагностике, основанные на учете выделенного аммиака проводятся также в
Японии и Великобритании [68]. Разработанный нами Хелик-тест [69] основан на
кинетической оценке концентрации аммиака в воздухе полости рта после приема
пациентом порции
Рис. 14. Чувствительность и специфичность C13 дыхательного углеродного теста (по
материалам Е.А.Корниенко, 2000г.)
мочевины (500 мг) обычного изотопного состава. Измерение концентрации аммиака
проводится с помощью индикаторной трубки, заполненной селективным хемосорбентом,
через которую прокачивается с помощью электроотсоса 2 л воздуха из полости рта, по
длине окрашенного столбика в трубке, 1 мм которого соответствует концентрации 0,3
мг/м3 аммиака. Измерение проводится дважды - до и после приема мочевины. При
возрастании концентрации аммиака в повторной пробе более чем на 0,6 мм/м3 результат
считается положительным. При сопоставлении с данными гистологического,
бактериологического, серологического методов и уреазного теста у большой группы детей
тест показал высокую чувствительность (95%) и специфичность (92%). Результаты теста
не зависят от физической активности пациента, они достаточно точны (90%) даже после
окончания эрадикационной терапии [70]. Метод прост, дешев, не требует дополнительной
аппаратуры и изотопов, результаты получается сразу же в ходе исследования, поэтому он
может быть широко использован в педиатрической практике как для первичного
скрининга, так и для оценки эффективности терапии.
Исследование продуктов гидролиза меченной N15 мочевины может быть произведено в
моче. Исследования, проведенные Krumbiegel P. и соавт. (2000) [66] по оценке N15
мочевого теста у детей показали его более высокую надежность, чем С13 дыхательного
углеродного теста, поэтому этот неинвазивный биохимический метод диагностики
Н.pylori in vivo также следует считать весьма перспективным.
Обобщая результаты использования существующих в настоящее время способов
диагностики инфекции Н.pylori, следует подчеркнуть необходимость целесообразного
выбора методов в зависимости от ситуации. При проведении эпидемиологических
исследований допустимо использование серологических методов, они же наряду с
дыхательным Хелик-тестом, удобны для первичного скрининга. При обращении к врачу с
определенными жалобами, свидетельствующими о возможности хронического
заболевания желудка и двенадцатиперстной кишки, ребенка необходимо обследовать
эндоскопическим методом, используя параллельно не менее 2 инвазивных тестов.
Наиболее удобен при этом Хелпил-тест с последующим гистологическим исследованием
тех же биоптатов. При проведении контроля эффективности эрадикационной терапии у
детей предпочтительны неинвазивные тесты: исследование антигена Н.pylori в кале с
помощью HpSA или ПЦР, С13 дыхательный углеродный тест или Хелик-тест. Выбор
тестов зависит от возможностей медицинского учреждения. При неудачной попытке
эрадикации показано бактериологическое исследование и определение чувствительности
штамма Н.pylori к антибиотикам для построения индивидуальной схемы лечения. Более
детальное изучение штамма микроорганизмов с помощью ПЦР и определение его
токсигенности может иметь прогностическое значение в оценке вероятности
формирования тяжелых форм гастродуоденальной патологии. Учитывая ограниченные
возможности всех без исключения методов, применение одновременно нескольких из них
у каждого больного существенно увеличивает точность диагностики. Понимание
сущности каждого из методов, их правильный выбор и сочетанное применение являются
надежной гарантией постановки своевременного и правильного диагноза и важнейшим
условием рационального лечения.
В соответствии с Приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от
03.08.1999 года N 303 введен в действие Отраслевой Стандарт: «Протоколы ведения
больных. Общие положения. 91500.09.0001-1999», являющийся частью Системы
нормативных документов по стандартизации Здравоохранения Российской Федерации.
Отраслевой стандарт предполагает следующие критерии оценки методов диагностики:
ТАБЛИЦА 6
Сравнение методов диагностики бактерии H.pylori по показателям
Отраслевого Стандарта "Протоколы ведения больных.
Общие положения. 91500.09.0001-1999", Москва 1999
Метод
I
Гистологический*
Бактериологический*
Метод отпечатков*
Де-Нол тест*
Хелпил-тест*
ЧВ% СП% ПЦ%
ОП% БМ%
СД
СМ$****
ПЦ1 ПЦ2 ОП1 ОП2
100 100 100 100 100 0 <100 Высокая
12$
95
100 95
95
95
100 90 100 100 100
100 100 95 95 100
100 100 95 95 100
5 <100 Отсутствует
5 <100
5 <100
5 <100
Высокая
Низкая
Высокая
80$
1$
2$
>1$
ХЕЛИК-тест***
Дыхательный(С13)**
Блоттинг
ПЦР(кал)***
II
ПЦР (биоптат)*
ПЦР (кровь)
ПЦР (зубнойналет)
Fast read
Kvidel
QiuckStrip
92,4
100
100
100
90,6
100
100
100
86,6
100
100
94
100 100 96
100 100 94
94
-
-
28,6
0
0
0
100 Высокая
>1$
100 Отсутствует 10-50$
<100 Низкая
18-20$
100
Низкая
6-10$
84,8
100
100
94
92,6
100
100
92
92
92
96
94
0 <100
0 <100
-
-
10 <100
93,3 100 92,5 80 91,7 25 <100
91,4 100 90,4 80 90,2 27 <100
91,1 100 90,2 80 89,7 26 <100
Средняя
Средняя
Крайне
низкая
Высокая
Высокая
Высокая
5-10$
5-10$
5-10$
4,5-5$
4,7-5$
4,3-5$
I - использование данных методов возможно в диагностике результатов лечения
II - использование данных метоов невозможно в диагностике результатов лечения
* - инвазивные методы исследования, предполагающие проведение биопсии;
** - полностью неинвазивный метод, результаты даются по данным литературы;
*** - полностью неинвазивные методы исследования;
**** - стоимость дана на период проведения исследований (1995-2000 гг.)
• чувствительность - частота положительных результатов при наличии заболевания;
• специфичность - частота отрицательного результата при отсутствии заболевания;
• прогностическая ценность - вероятность заболевания при положительном результате и
вероятность отсутствия - при отрицательном; отношение правдоподобия - отношение
вероятности данного результата у лиц с заболеванием к вероятности данного результата у
лиц без заболевания;
• безопасность метода - суммарная частота побочных эффектов и осложнений при
применении данного метода диагностики;
• степень доступности - отношение числа граждан страны, которые могут получить
своевременно данную услугу с учетом территориальных особенностей регионов и
разобщенности медицинских учреждений, наличия соответствующего оборудования и
специалистов к числу граждан, не могущих своевременно получить такую услугу;
• стоимость метода исследования с учетом капитальных затрат, текущих прямых расходов
и косвенных расходов;
• соотношение стоимость/эффективность - ориентировочные расчеты по стоимостной
целесообразности использования того или иного метода диагностики при данном
заболевании.
Результаты, полученные по указанным критериям, в разных исследованиях исследованиях
отличаются и зависят от обследуемого контингента. В таблице 6 дана оценка части
методов диагностики в сравнении с «золотым стандартом» по результатам исследований,
проведенных в МНИИП и ДХ МЗ РФ в 1995-2000 гг. [72]. Названные выше методы легли
в основу диагностического алгоритма заболеваний верхних отделов пищеварительного
тракта (схема 2), принятого
СХЕМА 2
Диагностический алгоритм инфекции H.pylori у детей
на IX съезде педиатров России в 2001 г. Согласно ему, все дети с жалобами на боли в
животе должны обследоваться на наличие Н pylori неинвазивны-ми методами. В случае
отсутствия микроорганизмов дети должны обследоваться всеми доступными
инструментальными и лабораторными методами, для постановки правильного диагноза.
Детям, у которых HP выявляется повторно, необходимо провести эндоскопическое
исследование со взятием биопсии и определением свойств штамма микроорганизма, для
назначения адекватной терапии. Дети, у которых HP выявляется впервые, при наличии
абдоминального синдрома могут получать эрадикационную терапию. Для выявления язв
на поверхности слизистой оболочки необходимо провести эндоскопическое исследование.
Родственникам больных детей рекомендуется провести диагностику на хеликобактериоз и
назначить эрадикационную терапию. Контроль за эрадикацией проводится через 6 недель
после окончания лечения.
Актуальные проблемы диагностики
хеликобактериоза
Хеликобактериоз — одна из наиболее серьезных проблем гастроэнтерологии в связи с
тем, что распространенность инфицирования Helicobacter pylori прогрессивно возрастает,
данное заболевание все чаще выявляется у людей молодого трудоспособного возраста, а
также с тем, что данный микроорганизм признан канцерогеном первого порядка.
Следовательно, разработка алгоритмов ранней и точной диагностики хеликобактериоза
позволит улучшить качество лечения и диспансерного наблюдения данной категории
пациентов. Кроме того, все большее внимание уделяется проблеме реинфекции, в связи с
тем необходимо уточнение сроков проведения контрольных тестов на H. pylori для
дифференцировки реинфицирования и неуспешности эрадикационной терапии.
Несмотря на то, что Маастрихтским соглашением III в качестве рекомендуемых методов
диагностики H. pylori утверждены дыхательный тест с мочевиной, меченной 13С, и
иммуноферментный анализ H. pylori в кале [1], существование большого количества
различных методов диагностики инфекции H. pylori подтверждает постулат о том, что
уникального метода, так называемого «золотого стандарта», для диагностики
хеликобактериоза пока не существует. Все многообразие методов диагностики данного
микроорганизма можно разделить на инвазивные (требуют проведения
фиброгастродуоденоскопии) и неинвазивные (не требуют проведения
фиброгастродуоденоскопии), прямые (определение собственно H. pylori) и косвенные
(определение продуктов жизнедеятельности H. pylori). Основные и наиболее часто
используемые методы диагностики хеликобактериоза представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Методы диагностики инфекции Helicobacter pylori
Инвазивные методы
Неинвазивные методы
А) бактериологический метод
Б) гистологический метод
В) быстрый уреазный тест (Хелпилтест)
Г) молекулярно-генетический метод
(полимеразная цепная реакция) —
исследование биоптатов
А) серологический метод (скрининг)
Б) молекулярно-генетический метод
(полимеразная цепная реакция) — исследование
кала
В) уреазный дыхательный тест (13С, 14С
мочевина)
Прямые
Не прямые (косвенные)
А) бактериологический метод
Б) гистологический метод
В) молекулярно-генетический метод
(полимеразная цепная реакция) —
исследование биоптатов
Г) молекулярно-генетический метод
(полимеразная цепная реакция) —
исследование кала
А) быстрый уреазный тест (Хелпил-тест)
Б) уреазный дыхательный тест (13С, 14С
мочевина)
В) дыхательный тест (Хелик-тест) с
кинетической оценкой концентрации аммиака в
воздухе полости рта после приема пациентом
порции карбамида
Г) серологический метод (скрининг)
Инвазивные методы, как правило, используются при прохождении пациентом комплекса
первичных диагностических мероприятий, т.к. в данном случае назначение
фиброгастродуоденоскопии является обязательным. Потенциальные показания для
использования неинвазивных методов несколько шире. К ним относятся скрининговое
обследование взрослых, обследование детей с жалобами на периодическую
абдоминальную боль, оценка успешности эрадикации, научные показания (оценка
распространенности инфекции, изучение ассоциации между наличием H. pylori и экстрапищеварительными нарушениями) [2].
Как уже упоминалось выше, ни один метод диагностики H. pylori нельзя считать
универсальным. Каждый метод исследования H. pylori имеет свои преимущества и
недостатки, методы различаются по чувствительности и специфичности. Во время
проведения многочисленных сравнительных исследований установлено, что результаты
различных методов не всегда идентичны, следовательно, чтобы избежать получения
ложнонегативных или ложнопозитивных результатов, для более точной диагностики
наличия инфекции необходимо использовать как минимум два метода и результат считать
положительным или отрицательным при совпадении показателей обоих методов
исследования. Некоторые авторы рекомендуют даже использование трех методов для
того, чтобы говорить об отсутствии инфекции [3].
К наиболее достоверным методам идентификации микроорганизма традиционно
относятся бактериологический, гистологический и молекулярно-генетический методы.
Бактериологический (культуральный) метод является одним из наиболее информативных
и специфичных методов. Специфичность его составляет практически 100%,
чувствительность более 90% [2, 4]. Основу метода составляет культивирование
микроорганизма на специальных питательных средах при определенных температурных
условиях. Преимуществом метода является то, что он обеспечивает возможность
выделения чистой культуры H. pylori, изучения морфологических, биохимических и
биологических свойств микроорганизма, определения антибиотикорезистентности
возбудителя [2]. Однако у этого метода существуют и недостатки, к которым относятся:
отсроченное получение результатов на 7-10 дней, трудность транспортировки материала
для сохранения микроорганизма в жизнеспособном состоянии, высокие требования к
условиям культивирования (определенные питательные среды, ограничение доступа
кислорода), снижение эффективности выделения H. pylori в случае низкой
обсемененности, при отсутствии обострения инфекции и визуальных признаков
воспаления. Недостатком данного метода считается его неспособность определять
кокковые формы H. pylori [5], тогда как в настоящее время в достаточно высоком
проценте случаев у H. pylori-позитивных пациентов в слизистой оболочке желудка
преобладают именно кокковые формы возбудителя. В широкой клинической практике
данный метод не применяется. В основном он используется в научных целях или при
определении резистентности H. pylori к антибиотикам в случае неэффективности терапии
первой линии при планировании дальнейшего лечения [6].
Гистологический метод — наиболее объективный метод диагностики H. pylori, ведь
используя именно этот метод, Warren и Marshall описали наличие спиралевидной
бактерии в слизистой оболочке желудка больных активным хроническим гастритом [7].
Он позволяет обнаружить микроорганизм в гистологических препаратах слизистой
оболочки желудка, определить степень обсемененности и расположение микробных тел
(поверхностное, внутриэпителиальное), форму микроорганизма (вегетативную или
кокковую), а также пути взаимодействия H. pylori с тканями организма человека и
наличие морфологических изменений слизистой оболочки желудка, связанных с инвазией
микроба (признаки воспаления, атрофия, метаплазия, дисплазия) [8]. В основе метода
лежит микроскопическое морфологическое и морфометрическое исследование
парафиновых срезов, окрашенных различными способами: гематоксилин-эозином, по
Романовскому-Гимзе, генциан-виолетом, по Генту, толуидиновым синим, а также
использование иммуногистохимического метода [2, 5]. К преимуществам этого метода
диагностики относятся удобство хранения и транспортировки образцов, возможность
проведения ретроспективного анализа, проведения оценки взаимосвязи между степенью
обсемененности H. pylori и состоянием слизистой оболочки желудка. Недостатками
метода являются длительное приготовление парафиновых срезов, некоторая
субъективность в определении степени изменения слизистой оболочки желудка,
невозможность отдифференцировать виды Helicobacter и тем более их генотип,
возможность получения ложнонегативных результатов в связи с неправильным забором
гастробиопсийного материала (биопсия только из антрального отдела желудка, скудные
биоптаты, не содержащие эпителия и слизи), а также наличия участков кишечной
метаплазии, погрешностей окраски [5]. Наряду с собственно гистологическим методом,
может использоваться цитологическое исследование мазков со слизистой оболочки
желудка, что позволяет существенно уменьшить время получения результатов анализа [2].
Существенное повышение результатов диагностики инфекции достигается при
использовании иммуногистохимического метода с моноклональными антителами против
H. pylori [9]. Принцип данного метода основан на высокоспецифичном связывании
антител к H. pylori, которые в дальнейшем можно визуализировать с помощью
химической реакции с антигенами клеточной стенки микроба. В результате прошедшей
иммуногистохимической реакции только те бактериальные клетки, которые имеют
антигены, специфичные для H. pylori, в том числе и кокковые формы H. pylori, будут
иметь характерное окрашивание [5]. К сожалению, широкое использование данного
метода ограничено из-за его высокой стоимости и технической сложности [10].
Последним достижением в области гистологического исследования является
использование fluorescence in situ hybridization, позволяющий высоко точно и напрямую в
залитых в парафин биоптатах определять не только наличие H. pylori, но и штаммов,
резистентных к кларитромицину [11].
Молекулярно-генетический метод (полимеразная цепная реакция) является
высокочувствительным и специфичным и по диагностической ценности имеет
преимущества перед другими методами диагностики H. pylori, включая гистологический и
курьтуральный методы [5, 12]. Преимуществами данного метода являются высокая
специфичность (обеспечивается подбором праймеров, комплементарных уникальной
нуклеотидной последовательности исследуемого микроорганизма), высокая
чувствительность (позволяет диагностировать не только острые, но и латентные варианты
инфекции, возможно выявление даже единичных бактерий), возможность определения как
вегетативных (спиралевидных), так и кокковых форм H. pylori, возможность определения
отдельных генов микроорганизма для оценки его патогенности, возможность определения
микроорганизма в течение 5-6 часов (экспресс-метод).
Метод состоит из трех этапов: выделение ДНК из клинического образца (биоптата),
амплификация специфических фрагментов ДНК, детекция продуктов амплификации.
Геном H. pylori содержит около 1600 генов. На сегодняшний день полностью определена
нуклеотидная последовательность у двух штаммов микроорганизма: 26695 и J.88 [13, 14].
Существует ряд генов H. pylori, роль которых в продуцировании специфических белков факторов патогенности микроорганизма - установлена. Именно эти гены — гены острова
патогенности H. pylori - определяют при проведении молекулярно-генетического
исследования (таблица 2).
Таблица 2
Отдельные гены и факторы патогенности Helicobacter pylori и возможная их роль в
патогенезе хеликобактериоза [15 с дополнениями]
Фактор патогенности
(белок)
Свойства факторов патогенности
cagA
(cytotoxinassociated gene)
CagA
Цитотоксин, маркер «острова
патогенности» H. pylori, участвует в
ремоделировании тканей, ангиогенезе,
язвообразовании, развитии атрофии, в
процессе деградации и разрушения
межклеточного матрикса и базальной
мембраны, опухолевой инвазии и
метастазировании посредством индукции
комплекса uPA (urokinase-type plasminogen
activator) и uPAR (urokinase-type
plasminogen activator receptor) в раковые
клетки в желудке, стимуляции выработки
интерлейкина-8, способствует повышению
активности антрального гастрита
cagC, cagE
(cytotoxinassociated gene)
CagC, CagЕ
Цитотоксины, стимулируют выработку
интерлейкина-8
cagH
CagH
Цитотоксин, маркер интактного острова
Ген
патогенности, стимулирует выработку
интерлейкина-8
(cytotoxinassociated gene)
CagF
Цитотоксин, вовлечен в процесс
распознавания и доставки CagA в каналы
Т4СС (IV секреторной системы)
VacA
Цитотоксин, фактор адгезии, увеличивает
проницаемость мембран по отношению к
анионам, достоверно уменьшает скорость
реэпителизации экспериментальных язв и
пролиферацию эпителиоцитов за счет
нарушения функции клетки, связанных с
целостностью ее цитоскелета, пассивный
транспорт мочевины через эпителиальные
клетки желудка, влияет на выживание H.
pylori в клетках хозяина, снижает
содержание АТФ в эпителиоцитах,
стимулирует апоптоз клеток
BabA1, BabA2
Фактор адгезии, рецептор клеток Lewis,
предположительно связан с более высокой
частотой развития язвенной болезни
двенадцатиперстной кишки, осложнений
инфекции H. pylori, а также с
аденокарциномой желудка (BabA2)
oipA
(outer
inflammatory
protein)
OipA
Поддерживает воспаление СОЖ, связан с
секрецией интерлейкина-8 и интерлейкина6, со степенью обсемененности H. pylori
СОЖ, выраженностью нейтрофильной
инфильтрацией, с развитием
интерстициальной метаплазии
sabA
(sialic acidbinding adhesin)
SabA
Поддерживает воспаление, способствует
персистенции инфекции H. pylori
iceA1, iceA2
(induced by
contact with
epithelium)
IceA1, IceA2
Фактор адгезии
flaA,fla B
(flagellin A- and
B-subunit)
FlaA, FlaВ
Обеспечивают подвижность
Уреаза (UreA, UreB,
UreC, UreI)
Является собственно маркером инфекции
H. pylori и фактором защиты
микроорганизма от действия соляной
кислоты, обеспечивает длительное
персистирование H. pylori в желудке
человека, усиливает воспалительные
реакции посредством активации
cagF
(cytotoxinassociated gene)
vacA
(vacuolatingassociated
cytotoxin)
babA1, babA2
(blood group
antigen-binding
adhesion)
ure A, ureB, ure
C, ureI
моноцитов, нейтрофилов, секреции
цитокинов, образования свободных
радикалов и окиси азота. Считается, что
большая субъединица уреазы — UreB —
действует как аттрактант для лейкоцитов
hopQ, hopP, hopZ
(HP outer
HopQ, HopP, HopZ
membrane
protein)
Обеспечивает колонизацию и
обсемененность слизистой оболочки
желудка
hpaA
(adhesion gene of
Helicobacter
pylori)
Фактор адгезии
HpaA
napA
(neutrophilNapA
activating protein)
Активатор окислительного стресса,
способен индуцировать процесс
освобождения свободных радикалов в
нейтрофилах, что приводит к
повреждению СОЖ человека
rdxA
(oxygeninsensitive
NADPH
nitroreductase),
frxA
(NADPH flavin
oxidoreductase),
fdxB
(ferredoxin-like
protein)
RdxA, FrxA, FdxB
ферменты окислительного метаболизма,
участвуют в формировании резистентности
к метронидазолу
23S rRNA
Точечные мутации
A2144G, A2143G,
участвуют в формировании резистентности
A2143C, A2115C,
к кларитромицину
A2142G, C2182T, T2717C
и др.
sodB
kat
Супероксидисмутаза
Позволяет H. pylori подавлять иммунный
ответ организма хозяина, катализируя
реакцию превращения бактерицидных
соединений кислорода, высвобождаемых
активированными в результате инфекции
нейтрофилами, в кислород и воду,
являющиеся безвредными для микроба
Каталаза
Позволяет H. pylori подавлять иммунный
ответ организма хозяина, катализируя
реакцию превращения бактерицидных
соединений кислорода, высвобождаемых
активированными в результате инфекции
нейтрофилами, в кислород и воду,
являющиеся безвредными для микроба
Следует заметить, что по данным молекулярно-генетического метода можно косвенно
судить о прогнозе заболеваний, ассоциированных с H. pylori. Так, например, если у
пациента с язвенной болезнью выявляется микроб, содержащий 1-2 гена острова PAI H.
pylori, то с высокой степенью вероятности, прогноз будет благоприятным, с другой
стороны, если у молодого практически здорового человека при профилактической
фиброгастродуоденоскопии выявляются воспалительно-деструктивные изменения и
присутствует H. pylori, содержащий 5-6 генов острова PAI, то прогноз неблагоприятен,
если своевременно не провести эрадикационную терапию. Однако не следует забывать,
что, согласно Маастрихтскому консенсусу III, различие в штаммах H. pylori, содержащих
разное количество и вид генов, не освобождает пациента от прохождения курса
антихеликобактерной терапии.
Если говорить о неонвазивных методах диагностики H. pylori, следует уделить особое
внимание дыхательным тестам, определению микроорганизма в кале и серологическому
методу диагностики.
В основе работы дыхательных тестов лежит биохимический метод определения
инфицированности H. pylori слизистой оболочки желудка по уреазной активности
микроорганизма, а именно способности уреазы разлагать мочевину до NH4+ и HCO3- с
последующим образованием из HCO3- СО2, который, попадая в кровоток, затем
выделяется через легкие и может быть определен в выдыхаемом воздухе. Радиоизотопный
уреазный дыхательный тест с мочевиной, меченной радиоактивным углеродом С13 или
С14, считается наиболее точным для диагностики H. pylori из неинвазивных методов и
известен с 1987 года [16]. Чувствительность и специфичность радиоизотопного уреазного
дыхательного теста достигает 90% по данным большинства исследований, однако для
данного теста в ряде случаев отмечены ложноположительные результаты по сравнению с
гистологическим методом [2]. Вместе с тем способ проведения этого теста до сих пор
четко не стандартизирован, а используемые реактивы достаточно дороги [2]. Возможность
использования для проведения дыхательного теста детекции паров аммиака (второй
метаболит гидролиза мочевины) в воздухе ротовой полости после приема обследуемым
мочевины нормального изотопного состава существенно повысила частоту использования
дыхательных тестов, т.к. способствовала удешевлению метода, а также повышению его
безопасности, поскольку не используются радиоактивные изотопы. Согласно данному
принципу в России в 1997 году ООО «АМА» (Санкт-Петербург) разработан «Хелик-тест»,
показатели которого не зависят от возраста и характера гастродуоденальой патологии, а
свидетельствуют лишь о наличии или отсутствии H. pylori [17]. Следует заметить, что
дыхательные тесты не рекомендуется проводить больным, получающим антисекреторную
терапию во избежание получения ложноотрицательных результатов с учетом возможного
взаимодействия соляной кислоты и аммиака [18]. Особенно актуальным считается
использование дыхательных тестов у детей в связи с ограничением применения
инвазивных методов диагностики H. pylori в детском возрасте.
Для определения H. pylori в кале используется иммуноферментный анализ выявления
антигена H. pylori и полимеразная цепная реакция с детекцией генов острова патогенности
H. pylori (ureC, cagA). Иммуноферментный анализ выявления антигена H. pylori в кале
является высокочувствительным и специфичным методом и признан стандартом в
диагностике H. pylori у детей и взрослых как до, так и после проведения эрадикационной
терапии. Единственным ограничением широкого применения данного метода является его
высокая стоимость по сравнению с другими способами диагностики H. pylori.
Полимеразная цепная реакция с детекцией генов острова патогенности H. pylori —
относительно новый экспериментальный метод, чувствительность и специфичность
которого четко не определены.
Серологический метод диагностики основан на определении антител IgG к H. pylori и IgG
к цитотоксину CagA H. pylori в крови. Данный метод показан для скрининга в популяции,
для первичной диагностики инфекции H. pylori, однако мало информативен у детей в
связи со слабым иммунным ответом, с помощью этого метода невозможно различить
прошедшую или текущую инфекцию, следовательно, он не рекомендован для оценки
эффективности эрадикации H. pylori [19, 20]. Согласно многочисленным литературным
данным, оценку эффективности эрадикации следует проводить не ранее, чем через 1,5-2
месяца после окончания терапии и отдавать предпочтение неинвазивным методам
исследования, если нет необходимости в проведении контрольной
фиброгастродуоденоскопии, что особенно актуально в детском возрасте [2, 13, 15, 17, 18].
Как видно из вышеизложенных данных, все методы диагностики H. pylori имеют свои
преимущества и недостатки, следовательно, для получения четкого представлены о
наличии H. pylori в организме человека необходимо соблюдать следующие правила
диагностики:
1. Использование 2-х и более методов диагностики H. pylori
2. Использование сочетания методов из разных групп: инвазивный+неинвазивный,
прямой+непрямой для первичной диагностики H. pylori
3. Использование метода ПЦР как наиболее точного для диагностики H. pylori, а
также для определения молекулярно-генетических особенностей микроорганизма
для оценки его вирулентности, формирования представления о дальнейшем
течении и прогнозе заболевания
4. Использование для контроля эрадикации H. pylori преимущественно неинвазивных
методов не ранее, чем через 1,5-2 месяца после окончания терапии.
При сравнительном анализе эффективности различных методов диагностики H. pylori у
взрослых больных H. pylori-ассоциированными заболеваниями, проведенном на кафедре
пропедевтики внутренних болезней СПбГМА имени И.И. Мечникова, было установлено,
что по данным быстрого уреазного и дыхательного теста H. pylori выявлялся у 100%
пациентов, гистологическим методом определялся у 70%, методом ПЦР — у 70%
больных. Получение положительных результатов уреазного теста и Хелик-теста при
отрицательных — гистологического метода или ПЦР может объясняться не
ложноположительными результатами, а тем, что при проведении уреазного и Хелик-теста
определяются продукты жизнедеятельности H. pylori, а не сам микроорганизм, который
может не попасть в биоптат, исследуемый с помощью гистологического метода или ПЦР.
Кроме того, при оценке информативности методов диагностики H. pylori было выявлено,
что результаты бактериологического метода в 25% случаев были отрицательными при
положительных результатах других методов исследования, что связано со сложностью
культивирования H. pylori, следовательно, только на данные бактериологического метода
не рекомендуется ориентироваться во избежание ложноотрицательных результатов.
Обращает на себя внимание тот факт, что при проведении ПЦР ген ureC, который
традиционно считается маркером наличия инфекции H. pylori, у пациентов СанктПетербурга определялся только в 78% случаев, что доказывает высокую изменчивость
микроорганизма. Следовательно, необходимо проводить определение не только гена ureC,
но и хотя бы еще одного часто встречающегося гена H. pylori, например, гена cagA или
ureI, что уже внедрено в практику в некоторых европейских странах.
Также нами была проведена сравнительная оценка результатов различных методов
выявления инфекции H. pylori с последующей разработкой алгоритма оптимизации
диагностики хеликобактериоза.
Для этого было обследовано 135 пациентов от 17 до 72 лет с патологией верхних отделов
пищеварительного тракта (37% больных язвенной болезнью, 63% - с хроническим
гастродуоденитом). Пациентам проводилась фиброгастродуоденоскопия с взятием
биоптатов из тела и антрального отдела желудка для верификации H. pylori следующими
методами: быстрый уреазный тест, «Хелик-тест», гистологическое исследование,
полимеразная цепная реакция (ПЦР) с детекцией ureC и cagA генов острова патогенности
микроорганизма, бактериологическое исследование (посев биоптатов слизистой оболочки
желудка для выявления роста H. pylori).
При сравнении полученных результатов было установлено, что максимальное количество
положительных результатов определялось при использовании быстрого уреазного теста,
минимальное количество — при посеве биоптатов (рисунок 1).
Рис. 1. Сравнительная характеристика результатов различных методов диагностики H.
pylori
По оси абсцисс — методы исследования
По оси ординат — количество положительных результатов, %
Кроме того, нами был проведен корреляционный анализ в отношении совпадения
показателей различных методов диагностики, на основании которого установлена
корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и ПЦР (ген ureC)
(рисунок 2), быстрого уреазного теста и гистологического исследования (H. pylori в теле
желудка) (рисунок 3), «Хелик-теста» и гистологического исследования (H. pylori в теле
желудка) (рисунок 4). На основании этого можно утверждать. Что использование
комбинаций этих методов будет наиболее информативно для диагностики инфекции.
Рис. 2. Корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и ПЦР (ген
ureC)
По оси абсцисс — результаты быстрого уреазного теста, баллы 0-3,
По оси ординат — результаты ПЦР (ген ureC) (0—отрицательный, 1—положительный)
Рис. 3. Корреляционная связь между результатами быстрого уреазного теста и
гистологического исследования (H. pylori в теле желудка)
По оси абсцисс — результаты быстрого уреазного теста, баллы 0-3
По оси ординат — результаты гистологического исследования (H. pylori в теле желудка),
(0-отрицательный, 1—положительный)
Рис. 4. Корреляционная связь между результатами «Хелик-теста» и гистологического
исследования (H. pylori в теле желудка)
По оси абсцисс — результаты «Хелик-теста», (0—отрицательный, 1—положительный)
По оси ординат — результаты гистологического исследования (H. pylori в теле желудка),
(0—отрицательный, 1—положительный)
На основании полученных данных нами были сделаны следующие выводы разработаны
рекомендации:
1. Получение положительных результатов уреазного теста и «Хелик-теста» при
отрицательных — гистологического метода или ПЦР может объясняться не
ложноположительными результатами, а тем, что при проведении уреазного и
«Хелик-теста» определяются продукты жизнедеятельности H. pylori, а не сам
микроорганизм, который может не попасть в биоптат, исследуемый с помощью
гистологического метода или ПЦР.
2. «Хелик-тест» рекомендуется как точный неинвазивный метод при проведении
оценки эффективности эрадикационной терапии, особенно в детском возрасте.
3. Для повышения точности диагностики хеликобактериоза рекомендуется
использовать как минимум два, а лучше три, метода исследования,
предпочтительно сочетание быстрого уреазного теста или «Хелик-теста» с
гистологическим методом исследования (биоптат из тела желудка) или ПЦР
(детекция гена ureC).
Влияние антисекреторных и антацидных
средств на чувствительность уреазного
теста при диагностике хеликобактерной
инфекции
Центральным объектом большого числа научных исследований в области
гастроэнтерологии, начиная с середины прошлого столетия, стала париетальная клетка.
Вслед за открытием на ней гистаминовых рецепторов и созданием первых Н2-блокаторов
пришло осознание того, что наиболее оптимальной мишенью для селективного
подавления кислой желудочной секреции является водородно-калиевая АТФаза. Путем
химических модификаций пиридин-2-ацетамида, который первоначально предполагалось
использовать как антивирусное средство, был получен пиридин-2-метилтиобензимидазол,
а затем тимопразол. Эти субстанции обладали выраженной антисекреторной активностью,
не зависящей от гистаминовых рецепторов, но связанной с подавлением активности
водородно-калиевой АТФазы париетальных клеток [1]. В 1979 г. на основе этих
соединений был синтезирован, а в 1988 г. был разрешен к клиническому применению
омепразол.
Бурный прогресс в создании антисекреторных средств был обусловлен также открытием в
1983 г. этиологической роли Helicobacter pylori в развитии хронического гастрита и
язвенной болезни двенадцатиперстной кишки [2]. Оказалось, что повышение
внутрижелудочного рН является обязательным условием для оптимального действия
антибактериальных препаратов, включаемых в курс антихеликобактерной терапии.
Антисекреторные препараты надежно подавляют секрецию соляной кислоты
париетальными клетками и длительно удерживают в желудке нейтральные значения рН,
при которых антибиотики медленнее деградируют и дольше оказывают свое
бактерицидное и бактериостатическое воздействие. Антацидные препараты в этом плане
не могут составить конкуренции антисекреторным средствам.
Механизм действия невсасывающихся антацидов на основе препаратов алюминия
(фосфат, гидроокись) связан с адсорбцией уже высвободившейся из париетальных клеток
соляной кислоты и ее последующей медленной нейтрализацией. Препараты катионной
группы, к которым относится фосфат алюминия, не приводят к изменению кислотнощелочного баланса крови, не вызывают повышения рН желудочного содержимого выше
нейтрального значения. Их действие, в отличие от всасывающихся антацидов анионной
группы (натрия гидрокарбонат, карбонаты магния и кальция, магния гидроокись), не
сопровождается реакцией «рикошета». Невсасывающиеся антациды — это препараты
местного действия.
Антисекреторные препараты — обязательный компонент лекарственных схем для
эрадикации H. pylori. Круг показаний к проведению антихеликобактерной терапии
определен Маастрихтским соглашением [3,4]. Они включают такие широко
распространенные заболевания, как язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки,
функциональная диспепсия, гастроэзофагеальная рефлюксная болезнь, а также поражения
гастродуоденальной слизистой оболочки, обусловленные приемом нестероидных
противовоспалительных препаратов. Есть данные об успешном использовании
антисекреторных средств при панкреатитах [5,6].
Однако широкое использование антисекреторных средств имеет и негативные аспекты.
Быстрое снятие с помощью этих препаратов неприятных ощущений при гиперацидных
состояниях, большой выбор препаратов и их доступность в аптечной сети все чаще
приводят к самостоятельному бесконтрольному приему пациентами антисекреторных
средств. Кроме того, сами врачи иногда назначают мощные антисекреторные препараты в
виде монотерапии без выяснения статуса пациента по хеликобактерной инфекции, и это
дает серьезный повод для беспокойства.
В настоящее время установлено, что прием антисекреторных препаратов в виде
монотерапии вне курса антибактериальной терапии и при наличии H. pylori приводит к
расширению ареала распространения микроорганизма в желудке. Если при высокой
кислотной продукции H. pylori обнаруживается, главным образом, в антральном отделе,
то при возрастании внутрижелудочного рН (на фоне монотерапии антисекреторными
средствами) этот микроорганизм начинает в большом количестве выявляться и в теле
желудка. Это сопровождается выраженным усилением морфологических и
иммунологических проявлений воспаления слизистой оболочки желудка (рис. 1).
Доказательства тому получены как для Н2-блокаторов [7], так и для ингибиторов
протонного насоса [8,9]. К таким же последствиям приводит и продолжение терапии
антисекреторными средствами после безуспешно проведенного курса эрадикационной
терапии [10,11]. Усиление активности гастрита с вовлечением новых зон слизистой
оболочки закладывает основу для хронизации воспаления, развития последующих
рецидивов язвенной болезни и гастроэзофагеальной рефлюксной болезни.
Рис.1. Монотерапия антисекреторными средствами при хеликобактерном гастрите
усиливает воспаление в слизистой оболочке тела желудка
В таких условиях особое значение приобретает надежная верификация наличия или
отсутствия хеликобактерной инфекции в организме при первичном обращении больных
до назначения антисекреторных средств либо при контроле эрадикационной терапии.
Однако здесь возникли неожиданные препятствия. Оказалось, что при приеме
антисекреторных препаратов резко возрастает число ложно-отрицательных результатов
дыхательного теста, используемого для контроля эрадикации H. pylori. Это было показано
как на фоне приема Н2-блокаторов [12], так и приема ингибиторов протонового насоса
[13]. Авторы этих работ связывают снижение чувствительности дыхательного теста с
уменьшением степени обсеменения слизистой оболочки желудка микроорганизмами. В
основе использования дыхательного теста лежит, как известно, выявление активности
уреазных ферментов в популяции микроорганизмов, колонизирующих слизистую
оболочку желудка. Между тем, в литературных источниках нет данных о влиянии
антисекреторных и антацидных препаратов на чувствительность быстрого уреазного теста
с использованием желудочных биоптатов.
В проведенной нами работе установлено, что прием антисекреторных средств,
предшествующий диагностическим мероприятиям по выявлению H. pylori, приводит к
снижению чувствительности быстрого уреазного теста, тогда как прием антацидных
препаратов не влияет на определение активности уреазных ферментов [14].
Нами было обследовано 40 больных с хеликобактерным гастритом, у 12 из которых при
эзофагогастродуоденоскопии была выявлена язвенная болезнь двенадцатиперстной кишки
или желудка. Для скрининга хеликобактерной инфекции использовался серологический
тест — Pyloriset ScreenII (Orion Diagnostica, Финляндия). Всем больным проводился
быстрый уреазный тест (PLIVA-Lachema, Чехия), а также цитологическое и
гистологическое исследование биоптатов слизистой оболочки желудка. Все больные были
разделены на 3 группы (табл.): принимавшие до обследования антисекреторные
препараты — 17 пациентов; принимавшие до обследования антацидные препараты
(Фосфалюгель; Yamanouchi, Нидерланды) — 13; не принимавшие препараты до
обследования — 10 (группа сравнении).
У всех больных первой группы, принимавших ингибиторы протонной помпы или Н2блокаторы в период от 6 до 30 дней перед эзофагогастродуоденоскопией, в слизистой
оболочке желудка цитологическим и гистологическим методами был обнаружен H. pylori.
Лишь у трех больных этой группы быстрый уреазный тест дал положительную реакцию (у
этих больных была выявлена высокая степень обсеменения H. pylori). Таким образом, у
большей части больных имели место ложно-отрицательные результаты быстрого
уреазного теста.
Во второй группе больных (прием Фосфалюгеля) и в группе сравнения использование
гистологического и цитологического методов также позволило во всех случаях выявить
присутствие H. pylori в слизистой оболочке желудка, и это всегда сопровождалось
положительной реакцией в быстром уреазном тесте. Интенсивность реакции при этом
коррелировала со степенью обсемененности слизистой оболочки H. pylori.
По данным Центрального НИИ гастроэнтерологии, частота ложно-отрицательные
результатов различных уреазных тестов при сравнении с данными морфологического
исследования составляет от 30% до 55%. Однако сопоставления с приемом пациентами
антисекреторных или антацидных средств в этом случае не проводилось, а ложноотрицательные результаты объяснялись недостаточно высокой чувствительностью
использованных методов.
Одной из причин ложно-отрицательных результатов при приеме антисекреторных
препаратов является наличие у H. pylori собственного механизма кислотно-щелочного
гомеостазирования (см. Таблицу). Известно, что геном H. pylori несет в себе гены,
кодирующие как уреазные ферменты (факторы антикислотной защиты), так и ферменты
окислительного метаболизма, играющие роль фактора антищелочной защиты (рН >8
губителен для H. pylori). Гиперацидное состояние, развивающееся при хеликобактерном
гастрите, приводит к длительному снижению рН в слизистой оболочке желудка. Это
побуждает H. pylori направлять весь свой энергетический потенциал на максимальную
мобилизацию активности уреазных ферментов. Прием мощных антисекреторных средств
приводит к периодическим подъемам рН в слизистой оболочке желудка до значений в
интервале 8> pH >6. При приближении к этим значениям энергетический потенциал H.
pylori переключается на мобилизацию активности окислительно-восстановительных
ферментов. Окисление субстратов в этих реакциях сопровождается генерацией протона,
закисляющего окружающую среду.
Таблица. Сравнение результатов использования уреазного теста с данными
гистологического исследования биоптатов желудка у больных, принимавших
антисекреторные и антацидные средства
Группы больных
Контроль (n=10)
Принимавшие антисекреторные средства (n=17)
Гистология HP
+++
++
+
Число больных
2
3
5
уреазный тест
+
+
+
Число больных
3
7
5
Уреазный тест
+
-
-
Принимавшие Фосфалюгель (n=13)
Число больных
2
5
6
Уреазный тест
+
+
+
Между тем, энергетический и пластический потенциал микроорганизма лимитирован —
он может синтезировать лишь ограниченное количество того или иного фермента.
Поэтому в условиях нейтральной среды H. pylori синтезирует меньше уреаз (которые в
этих условиях не нужны) и больше оксидаз (потребность в которых велика), что ведет к
снижению выявляемости микроорганизма в уреазных тестах.
Исходя из этого, становится понятным, почему Фосфалюгель не влияет на
чувствительность уреазного теста. Этот препарат содержит фосфат алюминия,
являющийся невсасывающимся катионным антацидом местного действия. Фосфалюгель
быстро повышает рН в слизистой оболочке желудка до 3. На этом уровне кислотности
нейтрализующая активность фосфата алюминия практически прекращается. Этого
достаточно для купирования гиперацидного состояния, но не приводит к повышению рН
желудочного содержимого выше нейтрального значения. Соответственно, при приеме
Фосфалюгеля не наблюдается перестройки ферментного метаболизма H. pylori. Этот
микроорганизм сохраняет высокую активность своих уреазных ферментов и хорошо
выявляется при проведении соответствующих тестов.
Таким образом, в проведенном нами исследовании впервые установлено снижение
чувствительности быстрого уреазного теста на фоне приема ингибиторов протонового
насоса и блокаторов гистаминовых Н2-рецепторов, что следует учитывать как на этапе
первичной диагностики хеликобактерной инфекции, так и на этапе контроля после курса
эрадикационной терапии. Реализация антацидных свойств Фосфалюгеля не изменяет
чувствительности уреазного теста, что не препятствует обнаружению H. pylori на любом
этапе диагностики.
На этапах диагностического поиска следует отменять антисекреторные препараты, а при
необходимости купирования у больных болевого синдрома и явлений гиперацидизма
назначать Фосфалюгель в стандартной дозировке до окончательной установки диагноза и
назначения этиотропного лечения.
Контроль эрадикации после курса проведенной антихеликобактерной терапии должен
осуществляться не менее чем через 2 недели после отмены антисекреторных препаратов.
Наличие хеликобактерной инфекции должно служить строгим противопоказанием к
монотерапии антисекреторными средствами, о чем обязательно следует информировать
пациентов для пресечения практики самолечения.
Уреазная система Helicobacter pylori [The
urease system of Helicobacter pylori]
Заселение желудков человека и других млекопитающих бактериями вида Helicobacter
требует специального пояснения, так как все эти бактерии - ГРАМнегативные
нейтралофилы. Практически всегда гастрит, т.е. воспаление желудка, возникает в
результате инвазии НР, при этом только в 20% случаев наблюдаются характерные
признаки язвенной болезни желудочно-кишечного тракта. Бактерии заселяют обычно
антральный и фундальный отделы желудка, а также переходную зону.
Известно, что микроорганизм Helicobacter pylori постоянно синтезирует фермент уреазу,
направляя до 15% усилий по синтезу протеинов на его производство (Scott D.R. et.al.,
1998). Такой уровень продуцирования уреазы выше, чем у любой другой бактерии, что
обусловлено важностью этого процесса для обеспечения выживания НР.
Это предположение было многократно подтверждено на животных моделях, когда
инфицирование мышей, хорьков и свиней сопровождалось повышением уреазной
активности (Tsuda M. et al., 1994, Andrutis K.A. et al., 1995, Eaton K.A. et al., 1991). Пока не
совсем понятно, связана ли эта потребность в уреазе с колонизацией, или также и с
инфицированием.
В вопросе о кислотности среды обитания бактерии исследователи не пришли пока к
единому мнению. Одни полагают, что существует значительный градиент рН от
желудочного содержимого до поверхности слизистой оболочки (Schade C., Flemstrom G.,
Holm L., 1994). При рН содержимого около 2.0 рН поверхности эпителия клетки может
быть на уровне 6.0. Эти цифры получены при измерении поверхностного рН с
использованием рН-микроэлектродов с открытым кончиком. Однако другие методы,
такие как, например, конфокальная микроскопия с использованием рН-чувствительных
флуоресцентных красителей, не показывают такого градиента рН (Chu S., 1999).
В то же время даже микроэлектроды показывают, что градиент рН пропадает, если
желудочное содержимое имеет рН<2.0 и среднее за 24 часа внутрижелудочное рН в
человеческом желудке имеет величину порядка 1.4. Это означает, что Helicobacter pylori
должен быть способен существовать в высококислотной окружающей среде, а не при
весьма близких к нейтральным значениям рН на поверхности желудка.
Кислотная активация внутрибактериальной уреазы.
Значение рН, при котором Н.pylori колонизирует желудок, соотносится со значением рН,
при котором его фермент уреаза работает наилучшим образом или вообще способен
работать. Оптимум рН уреазы, продуцируемой желудочными Helicobacter, - нейтральный,
т.е. уреаза имеет высокую активость при рН 7.5 - 8.5 и отсутствие активности при рН<4.5.
Выяснилось, что данный фермент присутствует как внутри бактериальной клетки, так и на
ее поверхности. Количество поверхностной уреазы значительно меньше
внутрибактериальной; способ появления энзима на поверхности является в настоящее
время предметом оживленной дискуссии (Phadnis S.H. et al., 1996; Vanet A, Labigne A.,
1998). По одной гипотезе наличие уреазы обусловлено секрецией, по другой - клеточным
лизисом. Однако представить реальный механизм выведения наружу с помощью секреции
не только всех шести составляющих генного кластера уреазы и атома никеля, но и
образование из них активного фермента, довольно трудно (Alm R.A., Trust T. J., 1999;
Odenbreit S. et al., 2000). Поэтому гипотеза о лизисном происхождении поверхностной
уреазы приобретает все больше сторонников (Marcus E.A., Scott D.R., 2001; Weeks D.L.,
2000).
Уреаза, находящаяся на поверхности бактерии, не обладает активностью при рН ниже 4.5,
поэтому не может обеспечивать сопротивление кислотности окружающей клетку среды.
Функция, выполняемая поверхностной уреазой, пока не вполне определена. Возможно, ее
присутствие препятствует или уменьшает появление дополнительной желудочной
инфекции или предотвращает более мощный антигенный ответ.
По-видимому, сопротивляемость кислотности желудка осуществляет уреаза, находящаяся
внутри микроорганизма. Если это так, то внутрибактериальная уреаза должна обладать
уреазной активностью в кислой среде для генерирования нейтрализующего аммиака NH3,
который будет образовывать NH4+ в кислоте.
В отличие от поверхностной или свободной уреазы, внутрибактериальная уреаза
проявляет низкую активность при нейтральном рН, быстрое увеличение между рН 6.0 и
5.0 и затем равномерное ее снижение до рН 2.5 c остающейся даже при рН 2.0 некоторой
активности. Активность измерялась по выделению 14СО2 из меченой мочевины и по
скорости защелачивания при различных значениях рН на микрофизиометре (Scott D.R.
et.al., 1998; Rectorschek M., 1998).
При значениях рН между 6.5 и 5.5 наблюдается 10-кратная активация уреазы. Возможно,
действительная степень активации еще выше, так как измерения рН с помощью
микрофизиометра с малым содержанием буфера показывают величину, близкую к 20кратной.
Буферное действие внутрибактериальной уреазы на периплазм.
Зависимость активности внутрибактериальной уреазы от величины рН показывает, что
неповрежденная бактерия способна генерировать NH3 в кислой среде, а именно это
необходимо для противостояния желудочной кислотности. Концентрация мочевины в
нормальном желудочном соке - около 1 - 2 мМ. Мочевина (карбамид) находится там
благодаря диффузии через эпителий, при этом мочевине не требуются специальные
носители, аналогичные найденным в почках или красных кровяных клетках (Hediger M.A.,
1996). Желудочный сок может содержать до 100 мМ HCl; 1 мМ мочевины, независимо от
того, насколько эффективно она будет утилизирована, недостаточно, чтобы противостоять
этой кислотности, если пытаться сделать это во внешней окружающей среде. Однако,
периплазм, который лежит между внутренней и внешней мембраной этой Грамнегативной бактерии, имеет очень маленький объем, порядка доли фемтолитра, и имеет
некоторую степень защиты от кислоты благодаря наружной мембране и клеточной стенке.
Периплазм к тому же является первым внешним по отношению к цитоплазме
пространством, где появится NH3, продуцированный в клетке. Поэтому именно периплазм
оказывается той областью, где аммиак, генерированный внутрибактериально, имеет
возможность обеспечить сопротивление желудочной кислоте. В литературе приводятся
два способа доказательства этого: прямой и косвенный.
Мембранный потенциал сквозь внутреннюю мембрану является функцией градиента рН
между периплазмом и цитоплазмой. По мере того как периплазм становится более
кислым, увеличивая рН-градиент по отношению к цитоплазме, мембранный потенциал
будет уменьшаться, обеспечивая постоянную движущую силу для потока протонов через
синтазу АТФ. Это протонная движущая сила - биоэнергетическая основа жизни, и для
выживания бактерии эта сила должна поддерживаться у нее на высоком уровне у (Kashket
E.R., 1985).
У бактерии HP (Meyer-Rosberg K. et al., 1996) при рН 7.0 эта сила составляет в общем
около -220 мВ (примерно 1,4 ед. рН внутри и -140 мВ снаружи). Такой уровень протонной
движущей силы сохраняется в диапазоне рН между 4.0 и 8.0, и необратимо теряется при
рН < 4,0 в отсутствие мочевины.
Однако при добавлении ~1 мМ мочевины между рН 3.0 и 5.0 потенциал быстро возрастает
до постоянного значения ~ -100 мВ. Это происходит даже в присутствии сильного буфера
(Scott D.R. et.al., 1998). Простейшее объяснение этого явления - забуферивание
периплазма до рН~6,2 с помощью аммиака, генерированного внутрибактериальной
уреазой. Эксперименты с уреазонегативными микроорганизмами показывают, что за
реализацию такого эффекта отвечает именно фермент уреаза, а уменьшение сигнала при
использовании высоких концентраций селективного ингибитора уреазы - фторофамида подтверждает, что это именно внутриклеточная уреаза, а не поверхностная.
Meyer-Rosberg K. et al. (1996) помещали НР в рН-чувствительную камеру и измеряли
величину рН этой камеры в стационарном состоянии в присутствии мочевины при
различных начальных значениях рН. Бактерия в присутствии мочевины очень быстро
увеличивает значение рН в камере до 6,2 при начальном значении рН между 3,0 и 5,5.
Прямое доказательство повышения значения периплазматического рН можно
продемонстрировать, используя конфокальную микроскопию. НР, выращенная совместно
с желудочной АГС, хорошо адгезирована и иммобилизирована, что позволяет
осуществлять микроскопию с большим увеличением. Флуоресцентный рН-краситель,
BCECF, проникает через внешнюю мембрану, которая содержит порины, но не может
проникнуть через внутреннюю мембрану микроорганизма. Краситель сигнализирует о
повышении рН увеличением флуоресценции и поэтому должен обозначить изменение рН
периплазма при добавлении мочевины. Действительно, в статье Athmann C. et al., 2000
приведены фотографии, показывающие свечение периплазма. При микроскопии in vivo
периплазм с увеличением рН очерчивается в ограниченном пространстве, в
непосредственной близости к бактерии. Если бы это было снаружи, за внешней
мембраной, контур периплазматического пространства не был бы так хорошо выделен изза быстрой диффузии NH3 в раствор.
Начальное изменение рН при добавлении мочевины в кислой среде (при рН 5.5)
происходит в периплазме, а затем - во внутренней среде живых микроорганизмов. При
нейтральном значении рН нет таких изменений, что согласуется с невысокой активацией
внутрибактериальной уреазы при этих значениях рН.
Данные Athmann C. et al. показывают, что бактериальные клетки действительно
забуферивают в первую очередь периплазматическое пространство при кислых значениях
рН, используя внутрибактериальную уреазную активность. Это не происходит в ureIнегативных микроорганизмах. Если в систему добавить детергент, который нарушает
проницаемость мембраны и позволяет BCECF проникать в цитоплазм, то в таком случае
добавление мочевины приводит к защелачиванию цитоплазмы, и флуоресцентное
свечение наблюдается уже по всей клетке.
Кинетический механизм активации
Активация уреазы внутри Н.pylori происходит при рН около 6,0. Кажущаяся константа
Михаэлиса Км,арр свободной уреазы равна 0,7 мМ. В неповрежденной бактерии при
нейтральном рН Км,арр - более 200 мМ, т.е реакция ферментативного гидролиза протекает
почти в 300 раз медленней. Это показывает, что существует ограничение
внутрибактериальной уреазной активности. Скорее всего имеет место ненасыщаемый
процесс, такой как диффузия мочевины через внутреннюю мембрану. При кислых рН,
когда реализуется полная активность уреазы, значение Км,арр становится равным константе
Михаэлиса свободной уреазы, т.е. 0,7 мМ. Ограничение на внутрибактериальную
активность исчезает. Самое простое объяснение такого кинетического поведения
внутрибактериальной уреазы - это что проницаемость внутренней мембраны
микроорганизма для мочевины возрастает при кислых рН. При нейтральных рН уреазная
активность ограничена медленным проникновением мочевины, концентрация мочевины
внутри бактерии никогда не достигает значений, близких к уровню Км,арр, за исключением
очень высоких и нефизиологических концентраций. В кислой среде проницаемость
внутренней мембраны для мочевины возрастает, скорость поступления карбамида из
внешней среды (т.е. среды макроорганизма) настолько велика, что позволяет увеличивать
уреазную активность. Очевидно, это эффективный механизм для разблокирования
доступа мочевины к внутрибактериальной уреазе.
UreI
Генный кластер НР образуют семь генов Два из них, ureA и ureB, кодируют структурные
субъединицы. Они образуют димер, которому для образования активной уреазы требуется
вставка Ni2+ (Mobley H.L., 1995)
Это осуществляется согласованными действиями четырех участвующих в этом генов, три
из которых необходимы для синтеза активной уреазы. Эти гены ureE, F, G, H
ассоциированы парами. Как показано с помощью двухгибридного дрожжевого анализа, Е
образует пару с G и F - с H (Voland P., Sachs G., 2000). В дальнейшем UreE и UreH
ассоциируют с UreB. После ureB в кластере находится активаторный отрезок, немедленно
за которым следует ureI, а затем E,F,G,H.
Предполагается, что именно ureI принимает участие в механизме регулирования течения
мочевины через внутренннюю мембрану.
Для определения свойств ureI был проведен ряд экспериментов.
Во-первых, D.R.Scott и др. (2000) выделили данный протеин во всех желудочных
бактериях вида Helicobacter и не обнаружен ни в одной из нежелудочных Helicobacter,
проверенных этой группой исследователей. Очевидно, ureI важен для обитания бактерии
именно в желудке млекопитающих. Удаление ureI приводит к потере кислотной
активации внутрибактериальной уреазы. Мутанты с удаленным ureI показывают
нормальную уреазную активность в лизатах. Мутанты также неспособны выживать при
рН < 4.0 даже в присутствии 2.5 М мочевины, в то время как нативные микроорганизмы
делают это без труда. Это показывает, что ureI является важным элементом,
обеспечивающим выживание микроорганизма в кислой среде и что мочевина при этом
взаимодействует с ureI. По всей видимости, функцией ureI является активация
транспортировки мочевины.
Skouloubris S. et al. (1998) в своей работе по транскрипции/трансляции уреазы in vitro
показали, что белок имеет шесть «вшитых» в мембрану сегментов.
Скорость доступа мочевины к бактериальной цитоплазме, необходимая для обеспечения
высокой уреазной активности, может быть достигнута путем размещения канала для
мочевины во внутреннюю бактериальную мембрану. Только в этом случае
внутриклеточная уреазная активность способна обеспечивать направленный внутрь
градиент мочевины, требуемый для образования NH3 бактерией НР в кислой среде.
Измерение транспортировки мочевины в неповрежденной бактериальной клетке без
специального оборудования очень проблематично. Проницаемость, т.е. способность
мочевины проникать через немодифицированный бислой при комнатной температуре,
равна 4·10-6 см/с.
Исходя из величины соотношения площади поверхности к объему бактериальной клетки
(размер бактерии примерно 2,5x0,5 µм; объем - 5.8·10-15 мл), можно предположить, что
мочевина вступает в реакцию за доли секунды при пассивном распределении. Таким
образом, высокая активность внутрибактериальная уреазы при адекватной скорости
поступления мочевины делает ненужным расход энергии на аккумуляцию субстрата.
В качестве средства определения функции ureI были использованы ooциты Xenopus. Они
имеют объем примерно в тысячу раз больший, чем бактерии Н.pylori, при соотношении
объема к поверхности в несколько тысяч крат меньшем. Эти клетки были выбраны для
выяснения механизма действия системы пассивной транспортировки, проявляемой
бактерией. Измерялась транспортная функция по отношению к 14С-мочевине после
введения РНК, кодирующей ureI. Поглощение мочевины определялось как функция рН.
Данная зависимость имеет заметное сходство с зависимостью активности уреазы от
величины рН. рН, при котором происходит 50% увеличение максимального поглощения,
равно 6.0, т.е. имеет то же самое значение, что и рН стационарного состояния,
достигаемого в периплазме при добавлении мочевины в кислой среде (Rectorschek M.,
1998).
Данное значение перехода рН наводит на мысль, что существуют один или более
гистидинов, которые должны быть протонированы для активации транспортировки
мочевины. Изменение гистидинов в первой периплазматической петле не повлияло на
транспортировку мочевины в ооциты при кислых значениях рН, в то время как изменение
терминального гистидина и двух гистидинов во второй периплазматической петле
уничтожило ее кислотную активацию. Эта вторая петля, следовательно, является частью
«ворот», которые открываются на протонирование гистидинов.
Транспортировка мочевины при кислых значениях рН не зависим от температуры и
ненасыщаем. Это означает, что после активации не происходит фактического изменения
или специфического взаимодействия мочевины со стенками поры. Согласно D.L.Weeks,
D.R.Scott, P.Voland, E.A.Marcus, Cathmann, K. Melchers, G.Sachs, 2000, ureI демонстрирует
свойства канала для поступления в клетку мочевины, который открывается протоном.
Свойства ureI приведены в табл.1.
ТАБЛИЦА 1
Свойства ureI
Белок внутренней мембраны бактерии с шестью мембранными сегментами.
Селективный по отношению к мочевине, ненасыщаемый, не зависящий от температуры.
Кислотно-активируемый с рН50 = 6.2.
Канал для транспорта мочевины, открываемый протоном.
Срабатывание благодаря протонированию гистидина во второй петле.
Ускоряет поступление мочевины в кислой среде в 300 раз.
Дает возможность функционировать внутрибактериальной уреазе в кислой среде.
Предотвращает защелачивание при нейтральных рН.
Допускает колонизацию желудка при 1 ммоль/л мочевины
Уникальный олигомерный амидопорин
Существует предварительные доказательства того, что ureI является олигомером,
возможно, димером или более высокой формой. В настоящее время изучаются вопросы о
стуктуре и функции ureI как переносчика мочевины. Вероятно также, что он осуществляет
транспортировку наружу NH3, помогая те самым предотвратить защелачивание
цитоплазмы (Scott D.R., Marcus E.A.., Sachs G., 2000).
Данный протеин гомологичен предполагаемым амидным переносчикам (Chebrou H., Bigey
F., Arnaud A., Galzy P., 1996). Однако, похоже, что ureI является уникальным белком,
способным транспортировать только мочевину, а не такие с ней сходные по свойствам
вещества, как тиомочевина, формамид или маннитол. Его следует рассматривать как
члена семейства амидопоринов по аналогии с аквапоринами, которые, как известно,
присутствуют в E.coli.
С выяснением механизма действия ureI связывают надежды на возможность открытия
блестящих фармацевтических перспектив. Данный протеин может стать уникальной
целью для монотерапевтической эрадикации НР. Ингибирование процесса
транспортировки мочевины при рН < 4.0 должно быстро стать летальным для бактерии
НР. Лекарственное средство такого рода будет иметь то преимущество, что ему не нужно
будет проникать через внутреннюю мембрану бактерии.
История открытия H.pylori
Среди многочисленных факторов возникновения хронических воспалительных
заболеваний верхних отделов пищеварительного тракта в настоящее время одно из
основных мест занимает инфекционный.
В течение длительного времени считалось, что слизистая оболочка желудка практически
стерильна [21]. Бактерии, попадающие в желудок вместе с пищевыми массами, слюной в
большом количестве (105 в 1 мл), быстро погибают под воздействием соляной кислоты,
лизоцима и иммуноглобулина [6]. Было также известно, что при повышении рН
желудочного содержимого на поверхности слизистой оболочки желудка наблюдается рост
микроорганизмов. Однако наличие микробов считалось не причиной, а следствием
гипохлоргидрии [25]. Различные представители микрофлоры часто выделялись из
некротических масс дна язв, но их значение в этиологии и патогенезе язвенной болезни не
признавалось [5, 24]. Некоторые исследователи допускали возможность микробной
природы возникновения острого гастрита, но предпочтение отдавали микроорганизмам,
поражающим желудок гематогенным путем [3, 31, 38].
В 1893 г G.Bizzozero [7], а спустя 3 года H.Salomon[34] впервые описали спиральные
микроорганизмы, располагающиеся в толще слизи и на поверхности слизистой оболочки
желудка кошек и собак, которых они назвали “желудочными спириллами”. Присутствие
“спирилл” на поверхности слизистой оболочки желудка человека подтвердили, в своих
работах W.Krienitz (1906)[20] и E.S.Rosenow и A.H.Sanford (1915) [33]. В 1938 году
J.L.Doenges [11] обнаружил спириллы в 42% из 242 некропсий желудка, но из-за аутолиза,
сделавшими препараты непригодными для гистологической диагностики, заключение не
было сделано. A.S.Fredberg и L.E.Barron в 1940г при исследовании желудков,
резецированных по поводу язвенной болезни, в 37% обнаружили на поверхности
слизистой оболочки извитые микроорганизмы [15]. Они отмечали, что “спириллы”
заселяют ткань в области “доброкачественных и злокачественных” язв. Эти
микроорганизмы определялись с помощью импрегнации серебром, но их культивирование
было неудачным. Однако, в 1954 году E.D.Palmer [27], исследовал 1040 желудочных
операционных биопсий (не применяя серебрения) и не нашел спиралевидных организмов.
После этого он сделал вывод, что “желудочные спириллы” попадают на поверхность
слизистой оболочки желудка через рот и размножаются только на регенерирующих
участках эпителия. С тех пор извитые микроорганизмы на слизистой оболочке желудка
уже не привлекали внимания исследователей и описывались в литературе в виде
курьезных наблюдений [19].
С начала 60-х годов стала стремительно развиваться фиброволоконная эндоскопия,
появилась возможность производить прицельную биопсию из измененных участков
слизистой оболочки. H.W.Steer в 1975 году вновь описал обнаруженные им у больного
гастритом спиралевидные организмы, находящиеся в тесном контакте со слизистой
оболочкой антрального отдела желудка [35]. Однако выделить и культивировать их ему не
удалось.
Переломный момент во взглядах на природу воспалительных заболеваний верхних
отделов пищеварительного тракта произошел после опубликования в 1983 г.
австралийскими учеными B.J.Marshall и J.R.Warren [39] результатов своих исследований.
Эти исследователи сумели выделить и культивировать спиралевидные микроорганизмы со
слизистой оболочки желудка больного, страдающего гастритом. Дальнейшие
исследования свойств открытого ими микроорганизма позволили отнести его к роду
Campylobacter по ряду сходных с представителями этого рода свойств. Новый
микроорганизм был обнаружен на поверхности слизистой оболочки желудочнокишечного тракта (другие представители этого рода обитают на поверхности слизистой
оболочки тонкой или толстой кишки). Так же как и другие кампилобактерии желудочный - являлся микроаэрофильным, грамотрицательным, каталазо- и
оксидазоположительным микроорганизмом [5, 39]. Однако, в отличие от других
представителей рода Campylobacter, “бактерии Варрена” не гидролизовали гиппуратов, не
восстанавливали нитратов, были устойчивы к действию налидиксовой кислоты [6, 26, 29].
Отличительной особенностью этого микроорганизма является выделение большого
количества уреазы. Новый микроорганизм, который первоначально получил название
CLO (Campylobacter Like Organism), отвечал всем постулатам Коха, для признания его
причиной развития воспалительной реакции слизистой оболочки желудка и
двенадцатиперстной кишки: 1.Этот микроорганизм был обнаружен в биоптатах слизистой
оболочки желудка у больных с гастритом или язвенной болезнью. 2. Его смогли выделить
в чистом виде из биоптата слизистой оболочки желудка человека, страдающего гастритом
и культивировать in vitro. 3. Третий постулат Коха доказал на себе один из
первооткрывателей CLO - B.Marshall. Он выпил чистую культуру, полученную от
больного гастритом, содержащую 106 микроорганизмов. Уже на 7 день появились первые
признаки диспепсии, а на 10 день у B.Marshall определялись все признаки гастрита,
который был подтвержден эндоскопически и гистологически [26].
Новый микроорганизм был включен в международную таксономию бактерий в 1985 году
под именем Campylobacter pyloridis [1]. Позднее, в 1987 году, он был переименован в
Campylobacter pylori [32]. Выделение этого микроорганизма доказало несостоятельность
теории о стерильности слизистой оболочки желудка. Однако его значение в патогенезе
пептических заболеваний вызывало определенный скептицизм среди ученых.
Проводимые, в дальнейшем, многочисленные исследования показали, что Campylobacter
pylori значительно отличается по своим свойствам от других представителей рода
Campylobacter. В 1989 году Goodwin C.S. с соавт [14]. продемонстрировали, что эта
бактерия генетически не принадлежит к роду Campylobacter и назвали ее Helicobacter
pylori по особенностям роста in vivo, по общим принципам культивации и по месту
локализации. H.pylori представляет собой небольшую извитую бактерию, обитающей
только в желудке человека. H.pylori является истинным патогеном, поскольку вызывает
воспаление, хотя среди инфицированных людей встречается и бессимптомное течение
заболевания [30]. Патогенность этого микроорганизма обеспечивается многими
факторами. Высокая подвижность H.pylori рассматривается как важнейший фактор
вирулентности. Благодаря спиралевидной форме и наличию 4-6 концевых флагелл
H.pylori способны быстро проникать через желудочную слизь и располагаться на
поверхности слизистой оболочки желудка [10,12]. Другим важным фактором
вирулентности является высокая адгезивная способность H.pylori к клеткам эпителия
слизистой оболочки желудка, которая ассоциируется с дегенеративными изменениями
эпителиальных клеток [17]. H.pylori способны продуцировать и высвобождать большое
количество ферментов (уреаза, каталаза, муциназа, липаза, фосфолипаза А2 и
гемолизины) и токсинов, таких как вакуолизирующий токсин (VacA), 120-128 кДа
цитотоксин ассоциированный протеин (CagA), которые способствуют быстрой
деструкции эпителиальных клеток с разрушением субэпителиальных тканей и
экстрацеллюлярного матрикса [8, 11, 15, 16, 28, 36, 37].
В настоящее время известно более 19 видов представителей рода Helicobacter,
обнаруживающиеся у различных животных и птиц (Таблица). Некоторые из них могут
иметь нескольких хозяев. На поверхности слизистой оболочки желудка человека кроме
H.pylori нередко определяются H.cinaedi и H.heilmanii. Местом постоянного обитания этих
микроорганизмов является слизистая оболочка кошек и собак. При попадании этих
микроорганизмов в желудок человека, они могут участвовать в развитии острой
воспалительной реакции. Однако, в отличие от H.pylori, они легко выводятся из организма
при проведении адекватного лечения. Другие виды рода Helicobacter встречаются у
человека намного реже или не встречаются вообще [4].
ТАБЛИЦА
Таксономия бактерий рода Helicobacter
Название
Acinomix
Billis
Bizzozoro
Canis
Cinaedi
Felis
Fenneliae
Хозяин
Гепард
Мышь
Собака
Собака
Человек, кошка
Кошка, собака
Человек
Локализация
Желудок
Печень
Желудок
Желудок
Желудок
Желудок
Кишечник
Заболевания у
человека
Артриты
Колит, энтерит
Гастрит
Heilmanii (Gastrospirillum
hominis)
Hepaticus
Muridarum
Mustelae
Nemestrinae (Gastrospirillum
hominis 1)
Pamatensis
Pullorum
Pylori
Rappini
sp.Bird В
sp.Bird С
sp.strain Mains
«CLO»-3
Человек, кошка,
собака
Мышь
Мышь, крыса
Хорек
Макаки
Желудок
Печень
Кишечник
Желудок
Желудок
Желудок
Домашние птицы,
свиньи
Желудок
Домашние птицы
Желудок
Человек
Желудок,
Человек, собака, овцы кишечник
Птицы
Кишечник
Птицы
Человек
Кишечник
Человек
Кишечник
Гастрит, ЯБ,
рак
Колит, энтерит
Артриты
Проктиты
Проводимые во многих странах исследования показали, что при длительном
взаимодействии H.pylori со слизистой оболочкой желудка, развивается атрофия
последней. Дальнейшие изменения слизистой оболочки могут привести к развитию
злокачественных новообразований. В 1994 году H.pylori был признан канцерогеном 1
класса [18].
Изучение H.pylori, его свойств, влияние на развитие патологических процессов в
организме хозяина продолжается уже более 15 лет. За это время были определены
основные способы диагностики этого микроорганизма, аспекты эпидемиологии, методы
лечения заболеваний, связанных с H.pylori-инфекцией. Однако, прогресс не
останавливается на месте. В диагностике появляются все более чувствительные и
специфичные методы, арсенал лекарственных препаратов пополняется новыми формами.
Разрабатываются способы профилактики инфекции хеликобактериоза с помощью
различных вакцин.