На правах рукописи Викторов Денис Александрович УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ
advertisement
На правах рукописи Викторов Денис Александрович УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ИНДИКАЦИИ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS PUTIDA 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич кандидат ветеринарных наук, доцент Богданов Ильгизар Исмаилович Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Тихомирова Елена Ивановна доктор биологических наук, профессор Грязнева Татьяна Николаевна Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов, г. Москва Защита диссертации состоится «17» ноября 2011 года в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал. С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ имени Н.И. Вавилова». Автореферат диссертации разослан «___» октября 2011 г. и размещен на сайте Минобрнауки РФ и www.sgau.ru Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Pseudomonas putida – часто встречающаяся бактерия, выделяемая как из внешней среды (вода, почва, растения), так и из патологического материала (Красильников, 1974; Смирнов, 1990; Weyant et al., 1996). В отечественной и зарубежной литературе имеются многочисленные сообщения, в которых освещаются отдельные биологические свойства P. putida (Сиволодскиий, 1990; Волкова, 2006; Blazevic, Koepke, Matsen, 1973; Harwood, Fosnaugh, Dispensa, 1989; Boopathi, Rao, 1999; Ribera, Monteoliva-Sanchez, RamosCormenzana, 2001; Ward, de Roo, O’Connor, 2005; Bertani et al., 2007). Данный микроорганизм является возбудителем псевдомоноза у прудовых рыб, сопровождающегося массовой гибелью рыбы (Лобунцов и др., 1971; Мусселиус, 1983; Грищенко, 1984; Вялова, Шкурина, 1995; Юнчис, 2005; Altinok, Kayis, Capkin, 2006). В единичных случаях бактерии P. putida способны вызывать заболевания у теплокровных животных и человека: абсцессы, бактериемии, раневые инфекции, инфекции мочевыводящих путей, кольпит, приводящий к самопроизвольным выкидышам, абортам (Литвин, 1997; Blazevic, Koepke, Matsen, 1973; Anaissie et al., 1987; Perz et al., 2005). Имеются сведения, что P. putida вызывает порчу пищевых продуктов (Clive de W. Blackburn, 2008). Кроме того, ряд штаммов данной бактерии проявляет фитопатогенные свойства (Пастушенко, Симонович, 1979; Burkholder, 1950). Другие штаммы, напротив, входят в состав биопрепаратов для стимуляции роста растений (Боронин, Кочетков, 2000; Lopez, Henkels, 1999). Бактерии P. putida широко известны и имеют важное научно-практическое значение благодаря своей способности окислять необычайно большое число различных органических соединений, являются объектом биотехнологических исследований при конструировании препаратов-деструкторов, в том числе со множественной деструктивной активностью (Волкова, 2006; Muller, 1992). Разработаны методы использования P. putida для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (Клюянова, 2006; Kowalski, 2002). Вышеперечисленное обуславливает научный и практический интерес к бактериям P. putida. В значительной степени это связано с недостаточно разработан- 4 ными методами индикации и идентификации данного микроорганизма при выделении из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов (Сиволодский, 1988; Васильев, Золотухин, Никишина, 1998). С середины прошлого столетия бактериофаги широко используются для диагностики различных бактериальных инфекций (Гольдфарб, 1961). Вместе с тем, использование реакции нарастания титра фага, как быстрого и точного метода индикации бактерий, для P. putida ранее не изучалось. Цель работы – усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Задачи работы: 1. Разработать среду накопления и селективную среду для выделения штаммов P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, подобрать бактериологические тесты для идентификации этих бактерий. 2. Разработать схему бактериологической идентификации и дифференциации P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на основе разработанных сред и подобранных тестов. 3. Изучить основные биологические свойства штаммов P. putida, выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. 4. Выделить бактериофаги бактерий P. putida и изучить их основные биологические свойства: морфологию негативных колоний, литическую активность, установить спектр литической активности, специфичность действия, температурную устойчивость и устойчивость к хлороформу. 5. По критериям литической активности, спектру лизируемых культур и специфичности, отобрать наиболее оптимальный бактериофаг для конструирования биопрепарата. 6. На основе отобранного бактериофага создать биопрепарат для индикации и идентификации P. putida и разработать технологию его изготовления. 7. Оптимизировать схему индикации бактерий P. putida в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов с помощью биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА методом реакции нарастания титра фага. 5 Научная новизна. Впервые для выделения, идентификации и оценки распространения бактерий P. putida была предложена и использована бактериологическая схема, основанная на применении оригинальных специфических сред: среды накопления Psp-A-УГСХА с сукцинатом натрия и минеральными солями, селективной среды Psp-S-УГСХА с глюкозой, бромтимоловым синим и фурадонином, а так же подобранной системы тестов, позволяющая за 96 часов провести дифференциацию бактерий P. putida от сопутствующей микрофлоры. Применение данной схемы позволило выделить и изучить 33 штамма P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, что внесло существенный вклад в понимание биологических особенностей этих псевдомонад. Выделены и изучены по заданным биологическим свойствам бактериофаги P. putida. Впервые для целей идентификации бактерий указанного вида разработан биопрепарат на основе отобранного наиболее оптимального для данных целей бактериофага Psp10-УГСХА. Впервые разработана и апробирована на объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов схема реакции нарастания титра фага для индикации бактерий P. putida с использованием биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА, позволяющая проводить индикацию бактерий P. putida за 24 часа. Разработаны биотехнологические параметры изготовления биопрепарата бактериофага Psp10УГСХА для индикации и идентификации бактерий P. putida. Практическая значимость работы. Предложена схема по выделению, бактериологической идентификации и дифференциации, позволяющая выделять и идентифицировать штаммы P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструированная среда накопления Psp-A-УГСХА, селективная среда Psp-S-УГСХА и подобранная система биохимических тестов позволяют выделять и типировать бактерии P. putida до вида за 96 часов. Сконструирован биопрепарат на основе бактериофага Psp10-УГСХА и разработана схема индикации бактерий P. putida методом реакции нарастания титра фага (РНФ) в течение 24 часов. Результаты усовершенствования бактериологической схемы выделения и идентификации P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых 6 продуктов, изучения биологических свойств бактериофага Psp10-УГСХА, а также возможность использования биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА в схеме реакции нарастания титра фага, подтверждены актами комиссионных испытаний в Ульяновской ГСХА от 11 апреля 2011 г. По материалам диссертационной работы предложены и утверждены ректором УГСХА (29 апреля 2011 г.) «Методические рекомендации по ускоренной индикации бактерий Pseudomonas putida методом реакции нарастания титра фага в объектах санитарного надзора», «Методические рекомендации по изготовлению и контролю бактериофага Psp10-УГСХА», а также «Методические рекомендации по выделению и идентификации бактерий вида Pseudomonas putida в объектах санитарного надзора». Методические рекомендации предназначены для сотрудников медико-биологических научных учреждений и специалистов бактериологических лабораторий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Разработанная среда накопления Psp-A-УГСХА обеспечивает преимущественный рост и размножение бактерий P. putida. Сконструированная плотная селективная среда Psp-S-УГСХА является специфичной по отношению к бактериям P. putida и угнетает рост возможных ассоциантов. 2. Разработанная схема бактериологической дифференциации, включающая сконструированные среды: среду накопления Psp-A-УГСХА и плотную селективную среду Psp-S-УГСХА, а также систему бактериологических тестов, позволяет идентифицировать P. putida за 96 часов. 3. Из 14 выделенных и изученных по биологическим свойствам штаммов бактериофагов бактерий P. putida отобран один бактериофаг Psp10-УГСХА, который может быть использован для целей идентификации и индикации P. putida в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах. 4. 7 Разработан биопрепарат на основе бактериофага Psp10-УГСХА для индикации бактерий P. putida и биотехнологические параметры по его изготовлению. 5. Усовершенствованная схема индикации P. putida методом РНФ с применением биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА позволяет типировать P. putida за 24 часа. Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия». Апробация работы: Материалы диссертационной работы были представлены на: Международной научно-практической конференции Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2008, 2009, 2011), Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины» (Покров, 2009), III-й Международной научно-практической конференции молодых учёных «Молодёжь и наука XXI века» (Ульяновск 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее» (Москва, 2011), Международной научно-практической конференции «Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации» (Покров, 2011). Публикации По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК РФ. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы, собственных исследований, состоящих из объекта, материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников, приложений. Материалы диссертации изложены на 155 страницах, включают 42 таблицы и 21 рисунок. Список использованных литературных источников включает 239 наименований, в том числе 127 зарубежных. 8 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект, материалы и методы исследований Штаммы: Объектом исследования явились 2 референс-штамма бактерии P. putida №901 IV-89; ATCC 12633 IV-87, полученные из музея ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также 33 «полевых» штамма, выделенные из объектов окружающей среды. Для определения специфичности сконструированных сред, а также изучения специфичности бактериофагов использовали 3 референс-штамма бактерии P. aeruginosa №128, №381, №1677, референс-штамм бактерии P. fluorescens 13525 IV-96, 14 штаммов бактерий других родов: Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, E. coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica, Stenotrophomonas maltophila, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ при ФГБОУ ВПО Ульяновской ГСХА. Все штаммы обладали типичными биологическими свойствами. Питательные среды и реактивы: МПА (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), МПБ (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда АГВ для определения антибиотикочувствительности, диски с антибиотиками (НИЦФ Санкт-Петербург), среда Симмонса (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), хлорид бария, хлорид натрия, ацетамид, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двузамещенный, магния сульфат, нитрат калия, пептон сухой ферментативный, глюкоза, сукцинат натрия, N-N-диметил-пара-фенилендиамин, перекись водорода, индикатор феноловый красный, индикатор бромтимоловый синий, фурадонин, цетримид, агар-агар, желатин, трихлорметан, набор для окраски по Граму. Методы: Выделение, идентификацию и индикацию бактерий проводили по общепринятым микробиологическим методам (Васильев, Золотухин, Никишина, 1998; Лабинская, 2004). Морфологические, культуральные, биохимические свойства бактерий P. putida определяли по методам Д.А. Васильева (1998). Оксидазный тест проводили с применением 1% р-ра N-N-диметил-пара-фенилендиамина. Каталазную активность проводили с применением 3% р-ра перекиси водорода (Ско- 9 родумов и др., 2005). Приготовление и стерилизацию питательных сред, окраску мазков проводили согласно ГОСТ Р 51446-99. Приготовление суспензий и разведений проводили по ГОСТ Р 51426-99. Посевы на питательные среды осуществляли согласно ГОСТ Р 26670-91. Отбор и подготовку лабораторных проб проводили по ГОСТ 26668-85, ГОСТ 26669-85, ГОСТ Р 51419-99. Контроль разработанных питательных сред проводили согласно МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред». Выделение и изучение биологических свойств фагов проводили по методам Д.М. Гольдфарба (1961), И.П. Ревенко (1978), И.М. Габриловича (1973), С.Н. Золотухина (2007). Литическую активность фагов определяли по Аппельману и Грациа (Гольдфарб, 1961). Реакцию нарастания титра фага для индикации P. putida в объектах внешней среды проводили по методам В.Д. Тимакова и Д.М. Гольдфарба (1962), а также В.Я. Ганюшкина (1984). Конструирование биопрепарата проводили по методу С.Н. Золотухина (2007). Статистическую обработку результатов исследований проводили по стандартным методикам (Бейли, 1970; Ашмарин, Воробьев, 1987). Обработку результатов осуществляли с помощью программы SPSS statistics 17.0. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Биологические свойства и антибиотикочувствительность референс-штаммов P. putida Исследованы тинкториальные и культуральные свойства 2-х референсштаммов P. putida для определения стабильности свойств и их обоснованного использования при составлении бактериологической схемы выделения и идентификации P. putida в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах. Оба референс-штамма P. putida были представлены мелкими грамотрицательными палочками, подвижными благодаря наличию полярного пучка жгутиков. На стандартных средах референс-штаммы P. putida образовывали колонии мелкие (1-2 мм) и средние (2-4 мм), правильной округлой формы, с ровным краем, рельеф куполообразный, поверхность гладкая, влажная, блестящая, цвет молочно-мутный или желтоватый, прозрачны в проходящем свете, структура однородная, консистенция пастообразная. 10 Исследование биохимических свойств референс-штаммов P. putida позволило сделать заключение, что окисление глюкозы является характерным признаком, который можно использовать для дифференциации P. putida от бактерий, защелачивающих глюкозу. Оксидазный и каталазный тесты были также положительны у обоих референс-штаммов P. putida. Установлено, что эти штаммы имеют ферменты аргининдегидролазу и способны утилизировать цитрат натрия и ацетат натрия. Отсутствие желатиназной активности оказалось также характерным видовым признаком изученных референс-штаммов P. putida. Все полученные нами результаты исследования биохимических свойств референс-штаммов P. putida согласуются с литературными данными (Weyant et al., 1996). Определили антибиотикочувствительность этих штаммов P. putida к гентамицину, амикацину, ампициллину, цефазолину, эритромицину, доксициклину, левомицитину, тетрациклину, фурадонину и фурагину. Отмечена устойчивость P. putida к нитрофурановым препаратам, что согласуется с данными литературы (Смирнов, Киприанова, 1990). Было установлено, что температурный оптимум культивирования изученных референс-штаммов P. putida составляет 28 ºС. Также было установлено, что у исследуемых штаммов отсутствует способность к росту при 41 ºС за 120 часов, но наблюдается рост при 4 ºС после 96 часов культивирования. Исследование биохимических свойств референс-штаммов P. putida и определение их антибиотикочувствительности позволили нам использовать полученные данные при подборе тестов бактериологической идентификации P. putida в объектах внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Конструирование накопительной среды для P. putida Известно, что псевдомонады достаточно неприхотливы и способны расти на простых питательных средах. Однако, при выделении P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов возникают сложности, связанные с ростом сопутствующей микрофлоры, оказывающей антагонистическое воздействие на P. putida. Поэтому представлялось актуальным конструирование 11 накопительной среды, позволяющей обеспечить преимущественный рост бактерий P. putida, подавляя развитие сопутствующих микроорганизмов. Подбор компонентов среды накопления осуществлялся на основании анализа данных литературы. В качестве источника углерода был выбран сукцинат натрия (Покровский, 2002; Weyant, 1996). Источником азота являлся нитрат калия. Калий фосфорнокислый одно- и двузамещённый создают буферную систему в среде, магний сернокислый и кальций хлористый обеспечивают нормальное осмотическое давление среды и необходимы для обеспечения биохимических процессов в клетках P. putida. Концентрации компонентов подбирали экспериментально. В результате проведенных исследований остановились на следующей прописи: сукцинат натрия – 4,0 г, нитрат калия – 0,5 г, фосфат калия двузамещённый – 0,5 г, фосфат калия однозамещённый – 0,1 г, сульфат магния – 0,2 г, хлорид кальция – 0,1 г, вода дистиллированная – 1000 мл. pH готовой среды накопления Psp-AУГСХА – 7,1. Все компоненты среды накопления Psp-A-УГСХА смешивали и кипятили 12 минуты до полного растворения компонентов, фильтровали через бумажный фильтр и автоклавировали при 1,1 атм. в течение 15 минут. Для контроля качества среды накопления мы засевали 0,1 мл со 100 м.к. индикаторного штамма P. putida АТСС 12633 в колбы со 100 мл среды Psp-AУГСХА и в контрольные колбы с таким же объёмом МПБ. Для контроля посевной дозы делали высев на чашки Петри с МПА. Через 6 ч термостатирования при температуре 28 оС проводили посев бактериологической петлёй из опытных и контрольных колб на чашки Петри с МПА. После культивирования в течение 18 ч при 28 оС наблюдали рост типичных по морфологии колоний P. putida в количестве от 15 до 25. Аналогичные результаты были получены в контрольных вариантах с МПБ, что свидетельствовало о высокой чувствительности среды Psp-A-УГСХА. При росте P. putida на среде Psp-A-УГСХА было замечено слабое помутнение молочного или желтоватого цвета в верхнем слое среды толщиной 2-3 см. Желтоватый цвет планктонная биомасса бактерий приобретала вследствие образования пигмента пиовердина клетками P. putida. Данный пигмент проявляет флуо- 12 ресцентные свойства. Таким образом, была сконструирована и зарегистрирована среда накопления Psp-A-УГСХА для выделения P. putida. Конструирование плотной селективной среды для P. putida При конструировании селективной среды было решено использовать специфичное свойство бактерий рода Pseudomonas окислять глюкозу до глюконовой кислоты в аэробных условиях. Для индикации снижения pH среды вследствие образования кислоты было решено применить индикатор бромтимоловый синий в концентрации 0,03 г/л. Концентрацию остальных компонентов среды подбирали экспериментально. В качестве ингибитора посторонней микрофлоры в селективной среде, на основании антибиотикочувствительности, был выбран фурадонин в концентрации 200 мг/л. Состав плотной селективной среды: D-глюкоза – 10,0 г, пептон – 2,0 г, фурадонин – 200,0 мг, калий фосфорнокислый двузамещённый – 0,05 г, магний сернокислый – 0,1 г, бромтимоловый синий – 0,03 г, агар-агар – 15,0 г, вода дистиллированная – 1000 мл. Способ приготовления: все компоненты кроме D-глюкозы и фурадонина смешивали и автоклавировали при 1,1 атм. в течение 15 минут. Затем в остывшую до 50 ºС основу среды вносили D-глюкозу и фурадонин в указанных выше концентрациях, рН среды доводили до 7,1-7,2. Готовая среда была травянисто-зеленого цвета. Бактерии штамма P. putida ATCC 12633 образовывали на этой среде круглые, гладкие, ярко-оранжевого цвета колонии. Цвет среды вокруг колоний менялся с травянисто-зеленого на жёлтый за счёт снижения pH при окислении глюкозы. Специфичность селективной среды определяли сравнительным высевом чистых суточных культур бактерий P. putida, P. aeruginosa, P. fluorescens, A. hydrophila, P. mirabilis, M. morganii, K. pneumoniae, Salmonella spp., S. aureus, Streptococcus spp., B. cereus, E. coli, E. cloacae, C. freundii, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, S. maltophila на поверхность среды в чашках Петри. Культивировали посевы при 37 оС в течение 96 часов; посевы P. putida и P. fluorescens – при 28 оС в течение 96 часов. Контролем жизнеспособности являлся посев указанных бактериальных культур на МПА и культивирование при аналогичных условиях. 13 Отмечено, что на сконструированной селективной среде росли P. putida, P. aeruginosa, P. fluorescens. Данная среда была использована как среда второго порядка в схеме выделения и идентификации P. putida, а так же в качестве теста на способность бактерий к окислению глюкозы в аэробных условиях, и зарегистрирована как селективная среда Psp-S-УГСХА. Подбор тестов бактериологической дифференциации P. putida Для целей бактериологической дифференциации P. putida были предложены следующие тесты, необходимость которых была обоснована результатами наших исследований: тест на оксидазу, каталазу, желатиназу, окисление глюкозы в аэробных условиях, чувствительность к хлориду бария, окраска бактериальных клеток по Граму, подвижность бактериальных клеток, утилизация ацетамида, реакция «стекающая капля» с бактериофагом Psp10-УГСХА. В качестве дополнительных исследований предложены тесты на способность к росту при 4 ºС и при 41 ºС. Тест на способность к окислению глюкозы проводили на разработанной нами селективной среде Psp-S-УГСХА. Результат данного теста считали положительным при изменении цвета среды с травянисто-зеленого на жёлтый. Для теста на способность бактерий к росту в присутствии хлорида бария, в МПА добавляли указанную соль из расчета 2 г/л. Среду стерилизовали в автоклаве при 1,1 атм. в течение 15 минут. Суточную бульонную культуру P. putida штрихом засевали на поверхность скошенного агара и помещали в термостат на 24 ч при температуре 28 ºС. Через указанное время проводили учет результатов. Рост ингибировался у всех исследуемых штаммов P. putida. Поскольку температура культивирования может являться критерием дифференциации различных видов псевдомонад (Weyant, 1996), при получении сомнительных результатов вышеперечисленных тестов нами рекомендовано исследовать способность бактерий к росту при температурах 4 ºС и 41 ºС. 14 Разработка бактериологической схемы выделения и идентификации P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов При разработке бактериологической схемы выделения и идентификации бактерий P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов нами были учтены следующие свойства P. putida: наличие оксидазы, каталазы, отсутствие желатиназной активности, способность к окислению глюкозы в аэробных условиях, ингибирование роста P. putida хлоридом бария, наличие мелких грамотрицательных палочек в мазках при окраске по Граму, наличие подвижности, отсутствие способности к утилизации ацетамида, наличие дорожки лизиса в реакции «стекающая капля» с бактериофагом Psp10-УГСХА, способность к росту при 4 ºС и отсутствие роста при 41 ºС. Разработанная схема выделения и идентификации бактерий P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов представлена на рисунке 1. Предложенная схема выделения и идентификации P. putida позволяет выделять и идентифицировать бактерии до вида, исключая возможных ассоциантов, за 96 часов. С использованием усовершенствованной схемы выделения и идентификации P. putida из сточных вод города Ульяновска, образцов воды и почвы Ульяновской области, мяса с рынков города Ульяновска без органолептических признаков порчи, мяса рыбы нами было выделено 33 штамма, биологические особенности которых представлены в таблице. Характеристика выделенных фагов P. putida Следующим этапом наших исследований стало выделение бактериофагов P. putida из объектов внешней среды. Материалом для выделения являлись сточные воды. Всего исследовано 76 проб, из которых выделено 14 культур бактериофагов. Морфологию негативных колоний бактериофагов изучали методом агаровых слоев по Грациа. Выделенные бактериофаги имели различные типы негатив- 15 ных колоний: диаметр от 0,5 до 5,0 мм, с мутным и прозрачным центром, с зоной вторичного лизиса и без неё. Дальнейшим этапом изучения биологических свойств выделенных бактериофагов было определение их литической активности. Изучили литическую активность 14 выделенных бактериофагов P. putida методами, предложенными Аппельманом и Грациа (Гольдфарб, 1961). Определили количество фаговых корпускул в 1 мл, для каждого выделенного бактериофага. По результатам полученных данных нами было решено в дальнейших исследованиях использовать наиболее активные из всех выделенных нами бактериофагов Psp1-УГСХА, Psp4b-УГСХА, Psp10-УГСХА и Psp17-УГСХА характеризующиеся максимальным количеством активных корпускул фага в 1 мл. Рис. 1. Схема выделения и идентификации P. putida Примечание: * – дополнительные тесты, проводятся в случае сомнительных результатов. 16 Таблица – Биологические свойства референс-штаммов и выделенных нами полевых штаммов P. putida № п/п штаммы P. putida каталаза желатиназа лизин орнитин аргинин индол уреаза сероводород цитрат натрия ацетат натрия нитратредуктаза глюкоза лактоза мальтоза манит сахароза Окисление углеводов оксидаза Ферментативная активность 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 АТСС 12633 №901 003 011bln 013brn 013bot 014art 014art 014art 014art 015art 015art 015art 015art 017art 017art 017art 017art 017art 017art 017art 017art 017art 017art 017art 017art 026brp 026brp 026brp 026brp 026brp 026brp 026brp 026brp 026brp + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + - + + + + + + + - - 17 Титр селекционированных бактериофагов Psp1-УГСХА, Psp4b-УГСХА, Psp10-УГСХА и Psp17-УГСХА по Грациа: 2х1010, 2х1010, 4х1010, 6х109 соответственно, фаговых корпускул в 1 мл. Титр бактериофагов Psp1-УГСХА, Psp4bУГСХА, Psp10-УГСХА и Psp17-УГСХА по Аппельману: 10-9, 10-10, 10-9, 10-8, соответственно. Установили, что наиболее широким спектром литической активности по отношению к исследуемым культурам обладал штамм фага Psp10-УГСХА, который лизировал 30 из 35 штаммов P. putida (85,7%). Фаги Psp1-УГСХА и Psp17-УГСХА лизировали 28 из имеющихся у нас 35 штаммов P. putida (80%). Фаг Psp4bУГСХА лизировал 25 из 35 штаммов P. putida (71,4%) Поэтому фаг Psp10-УГСХА был выбран для конструирования биопрепарата для индикации и идентификации бактерий P. putida. Результаты определения специфичности всех выделенных бактериофагов, в том числе Psp10-УГСХА, показали, что они строго специфичны по отношению к P. putida и не лизировали бактерии других видов и родов. Бактериофаг Psp10-УГСХА проявил выраженную устойчивость к воздействию обработки хлороформом в соотношении 1:10 в течение 40 минут. Также изучили устойчивость бактериофага Psp10-УГСХА к температуре. Выяснено, что бактериофаг Psp10-УГСХА инактивировался при температуре выше 66 ºС в течение 30 минут. Разработка технологических параметров изготовления и контроля биопрепарата для идентификации P. putida Нами была проведена серия исследований по определению оптимальных технологических параметров изготовления и контроля биопрепарата для идентификации P. putida. Технологические параметры изготовления биопрепарата: оптимальная температура культивирования фага Psp10-УГСХА – 28 ºС, оптимальное соотношение бактериофага Psp10-УГСХА и бактериальной культуры – 1:2, т.е. 0,2 мл фага х 0,4 мл индикаторной культуры, 18 оптимальное время взаимодействия бактериофага Psp10-УГСХА с бактериальной суспензией индикаторной культуры P. putida при температуре 28 оС составляет 8 часов, обработка фаголизата хлороформом в соотношении 1:10 в течение 20 минут, хранение биопрепарата в условиях холодильника при температуре 4-6 ºС в герметичных флаконах до 1 года без снижения активности (сроки наблюдения). При контроле биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА на литическую активность учитывали следующие параметры: титр бактериофага Psp10-УГСХА составляет не менее 10-10 по Аппельману и не менее 4х1010 по Грациа. Разработка оптимальных условий постановки реакции нарастания титра фага с применением биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА При исследовании оптимальных условий постановки РНФ с применением биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА для индикации бактерий P. putida, мы установили количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение и оптимальное время РНФ. По результатам проведенных опытов было установлено, что количество фаговых частиц в опытных пробирках более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах, при контаминации МПБ клетками P. putida в концентрации 103 м.к/мл. Полученные экспериментальные данные позволяют считать, что наиболее оптимальным является временной режим РНФ при 7 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом с предварительным подращиванием исследуемого материала в течение 5 часов при температуре 28 ºС. Такой режим позволяет провести индикацию бактерий P. putida в количестве 103 м.к./мл, в течение 24 часов. Схема постановки РНФ с применением биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА для индикации бактерий P. putida представлена на рисунке 2. Таким образом, на основе детального изучения биологических свойств различных штаммов P. putida, была разработана, обоснована и апробирована схема выделения и идентификации P. putida из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов; создан биопрепарат на основе отобранного бактериофага Psp10-УГСХА, позволяющий в короткие сроки проводить индикацию P. putida в объектах внешней среды, пищевом сырье и пищевых продуктах. 19 Рис. 2. Схема постановки реакции нарастания титра фага для индикации бактерий P. putida Примечание: реакция считается положительной, если количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №1 превышает количество негативных колоний, образовавшихся на чашке Петри №3 в 5 и более раз. 20 Выводы 1. Сконструированы среды – накопительная среда Psp-A-УГСХА с сукцинатом натрия и минеральными солями и селективная среда Psp-S-УГСХА с глюкозой, бромтимоловым синим и фурадонином, обладающие высокой специфичностью и позволяющие выделять штаммы P. putida. 2. Усовершенствована бактериологическая схема выделения и идентификации P. putida, основанная на сконструированных средах и подобранных тестах, включающих тесты на оксидазу, каталазу, желатиназу, чувствительность к хлориду бария, подвижность, утилизацию ацетамида, окисление глюкозы в аэробных условиях, окраску по Граму, реакцию «стекающая капля» с бактериофагом Psp10-УГСХА, способность к росту при 4 ºС и при 41 ºС. С использованием разработанной схемы из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов выделено и идентифицировано 33 «полевых» штамма P. putida. 3. Выделены и изучены по биологическим свойствам 14 культур бактериофагов бактерий P. putida, литическая активность которых варьировала от 10-7 до 10-10 по методу Аппельмана и от 6х107 до 4х1010 по методу Грациа, а спектр литической активности составил от 71,4 до 85,7%. Выделенные бактериофаги строго специфичны по отношению к P. putida и не лизируют бактерии других видов и родов; проявляют устойчивость к хлороформу в течение 40 минут и инактивируются при температуре 66 ºС в течение 30 минут. 4. Отобран бактериофаг Psp10-УГСХА, имеющий оптимальные для конструирования биопрепарата свойства: спектр литической активности 85,7%; титр 10-10 по методу Аппельмана и 4х1010 по методу Грациа. 5. Разработаны параметры постановки реакции нарастания титра фага с использованием биопрепарата на основе бактериофага Psp10-УГСХА для ускоренной индикации бактерий P. putida, позволяющие обнаружить в исследуемом материале указанные бактерии в концентрации от 103 м.к. в 1 г (1 мл) в течение 24 часов. 6. Установлены оптимальные технологические показатели для изготовления специфического биопрепарата бактериофага Psp10-УГСХА: соотношение 21 количества фаголизата к количеству взвести бактериальных клеток индикаторного штамма P. putida – 1:2, оптимальное время инкубирования при температуре 28 ºС – 8 часов, обработка фаголизата хлороформом в соотношении 1:10 в течение 20 минут, хранение биопрепарата в условиях холодильника при температуре 4-6 ºС в герметичных флаконах до 1 года без снижения активности. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Викторов Д.А. Использование экологической пластичности бактерий ро- да Pseudomonas в научно-хозяйственной практике / Д.А. Викторов, И.И. Богданов // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, посвящённой 65-летию Ульяновской ГСХА. 20-22 мая 2008. – Ульяновск, 2008. – Т. 4. – С. 108-110. 2. Викторов Д.А. Обоснование причин изучения бактерий Pseudomonas putida / Д.А. Викторов, И.И. Богданов // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, посвящённой 65-летию Ульяновской ГСХА. 20-22 мая 2008. – Ульяновск, 2008. – Т. 4. – С. 111-114. 3. Викторов Д.А. Разработка системы тестов для выделения и идентифика- ции Pseudomonas putida / Д.А. Викторов, И.И. Богданов, А.Г. Шестаков, Д.А. Васильев // Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения: Материалы Международной научно-практической конференции. 26-28 мая 2009. – Ульяновск, 2009. – Т. 4. – С. 21-25. 4. Викторов Д.А. Система тестов для диагностики псевдомоноза рыб, вы- зываемого бактерией Pseudomonas putida / Д.А. Викторов, И.И. Богданов, А.Г. Шестаков // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: Материалы конференции молодых учёных, ГНУ ВНИИВВиМ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ. – Покров, 2009. – С. 136-140. 5. Викторов Д.А. Разработка методов лечения, профилактики и диагностики псевдомоноза аквариумных рыб с использованием биопрепарата на основе бакте- 22 риофагов / Д.А. Викторов, О.А. Тен // Ветеринарная медицина домашних животных: Сборник статей. – Казань, 2010. – Вып. 7. – С. 87-88. 6. Викторов Д.А. Разработка биопрепарата на основе бактериофагов бакте- рии Pseudomonas putida для диагностики псевдомоноза рыб / Д.А. Викторов, Д.А. Васильев // Биологически активные вещества микроорганизмов: прошлое, настоящее, будущее: Всероссийский симпозиум с международным участием, Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 27-29 января 2011. – Москва, 2011. – С. 24. 7. Викторов Д.А. Выделение бактериофагов бактерии Pseudomonas putida – возбудителя псевдомоноза рыб / Д.А. Васильев, Д.А. Викторов, С.Н. Золотухин, И.И. Богданов // Задачи ветеринарной науки в реализации доктрины продовольственной безопасности Российской федерации: Материалы Международной научно-практической конференции. 16-17 марта 2011. – Покров, 2011. – С. 181-184. 8. Викторов Д.А. Выделение бактериофагов бактерий Pseudomonas putida и их селекция в целях создания биопрепарата для диагностики псевдомоноза рыб / Д.А. Васильев, Д.А. Викторов, И.И. Богданов // Естественные и технические науки. – 2011. – №2(52). – С. 79-82. 9. Викторов Д.А. Выделение бактерий-нефтедеструкторов рода Pseudomo- nas / Д.А. Викторов, А.М. Артамонов, М.М. Сидорова, И.И. Богданов, Д.А. Васильев // Ветеринарная медицина XXI века: инновации, опыт, проблемы и пути их решения: Материалы Международной научно-практической конференции. – Ульяновск, 2011. – Т. 3. – С. 72-75.