подробней

Научно-образовательный курс «Подходы для изучения
белок-белковых взаимодействий»
Практикум. Дрожжевая двугибридная система.
В результате выполнения практикума каждый студент освоит метода
детекции белок-белковых взаимодействий в системе in vivo и отберет
потенциальные взаимодействующие друг с другом белки.
Семинары
Выполнение каждого практикума предваряется семинаром, на котором
студент знакомится с целями, особенностями и сферой использования
осваиваемых методов.
Итоговый семинар включает в себя презентации студентов результатов
их работы и обсуждение полученных результатов.
Внеаудиторная работа
К каждому практикуму студент самостоятельно знакомится с
обязательной литературой; самостоятельно интерпретирует результаты
исследования и готовит отчет по полученным результатам для итогового
семинара.
Набор обретаемых навыков
1) основы работы
с клетками дрожжей, поддержание дрожжевых
штаммов;
2) котрансформация дрожжевых клеток плазмидами;
3)
анализ
белок-белковых
взаимодействий
путем
трансформированных штаммов дрожжей на селективные среды.
высевания
Требования к исходным навыкам студента
Предполагается, что слушатели курса в полном объеме владеют
принципами
работы
с
культурами
клеток
в
ламинаре,
методами
молекулярного клонирования, выделения и очистки плазмидной ДНК.
Методика
Бактериальная и дрожжевая двугибридные системы - генетический
метод, разработанный для исследования белок-белковых взаимодействий in
vivo. При этом физическое связывание друг с другом исследуемых белков
(один из которых слит в единой рамке трансляции с ДНК-связывающим
доменом фактора транскрипции, а второй - с его доменом, активирующим
транскрипцию) запускает транскрипцию гена-репортера. Использование
данного подхода позволяет достаточно быстро отбирать кандидатные белки,
способные напрямую взаимодействовать друг с другом. В рамках данного
курса
особенности
метода
представлены
на
примере
модификации
дрожжевой двугибридной системы, основанной на дрожжевом белке
активаторе
GAL4.
Используя
данную
систему
вывод
о
наличии
взаимодействия можно делать по уровню активации трех репортерных генов.
Исходным материалом для анализа являются две плазмиды, в которые
в нужной рамке считывания клонируются последовательности кДНК двух
белков, исследуемых на предмет взаимодействия. В результате с одной
плазмиды синтезируется белок, содержащий на N-конце активационный
домен Gal4, а на C-конце – последовательность первого белка. А с другой
плазмиды синтезируется белок, содержащий на N-конце ДНК-связывающий
домен Gal4, на C-конце – последовательность второго белка. ДНКсвязывающий домен, соединенный со вторым белком связывается с
2
промоторами репортерных Gal4-активируемых генов, однако сам по себе не
способен активировать эти гены, т.к. для этого нужен активационный домен
Gal4. Если первый и второй белки взаимодействуют между собой, то
активационный домен сближается с ДНК-связывающим, и как следствие,
активируются репортерные гены.
Эксперимент включает несколько этапов.
 Сначала
дрожжи
котрансформируются
двумя
плазмидами
и
высеваются на чашки Петри с селективной средой не содержащей
аминокислоты триптофан (Trp) и лейцин (Leu) (“среда -2”). Если
котрансформация прошла успешно, то на чашке через 2-3 суток вырастают
отдельные колонии.
 Несколько колоний пересеваются истощающим штрихом на чашки
Петри со средой без триптофана (Trp), лейцина (Leu), гистидина (His) и
аденина (“среда -3”).
 Через 2-3 дня оценивают степень роста на чашках. Если белки
взаимодействуют, то активируются гены ADE2, HIS3 и, следовательно,
колонии вырастают. Если белки не взаимодействуют, то рост колоний не
наблюдается. Кроме этого параллельно можно детектировать уровень
активации гена lacZ.
Основным ограничением в использовании дрожжевых двугибридны
систем
является
ложноположительных
частое
появление
результатов.
Поэтому
ложноотрицательных
на
настоящий
и
момент
существует несколько подходов для преодоления данных проблем:
1) Использование нескольких генов-репортеров
2) Создание плазмид с доменами белка GAL4, расположенными на Сконце.
3
3) Проверка не целого белка на взаимодействие, а только его
отдельных доменов.
4) Использование
концентрациях
ингибиторов,
исключают
которые
в
определенных
ложноположительный
рост
отрицательных контролей.
Во время выполнения практикума будут рассмотрены все эти
способы.
При выполнении задачи плазмиды, кодирующие тестируемые белки,
будут котрансформированы в клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae Pj694A. Этот штамм в норме не способен синтезировать аденин и аминокислоты
гистидин (His), триптофан (Trp), лейцин (Leu). Транскрипционный фактор
Gal4 также не экспрессируется. В геном встроены гены ADE2, HIS3 и LacZ
под Gal4-активируемыми промоторами. Если эти гены активируются (в
присутствии Gal4), то дрожжи становятся способными синтезировать аденин,
гистидин и β-галактозидазу. Эти гены выступают в качестве репортерных,
дрожжи при их активации могут расти на селективной среде, не содержащей
аденина и гистидина. При выполнении задачи для анализа будут
использованы как полноразмерные белки, так и отдельные домены. Вывод о
взаимодействии будет делаться на основании анализа всех 3 репортерных
систем, представленных в штамме Pj69-4A.
Список оборудования и материалов:
Материалы:
1) Свежие клетки штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Pj69-4A:
MATa trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3-200 gal4 gal80 LYS2::GAL1HIS3 GAL2-ADE2 met2::GAL7-lacZ.
4
2) Среда YPDA (на 100 мл): 2 г пептона, 1 г дрожжевого экстракта, 1.7 г
агара, 95 мл воды. Среда автоклавируется в течение 1часа и
охлаждается до 55°С. Добавляется 5 мл 40% глюкозы и 1.5 мл 0.2%
раствора сульфата аденина (стерильные растворы).
3) Минимальная среда SD без двух аминокислот (“среда - 2”) (на 100 мл):
0.67 г дрожжевой среды без аминокислот, 85 мл дистиллированной
воды. Среда автоклавируется в течение 1часа и охлаждается до 55°С.
Добавляется
5 мл 40% глюкозы и 10 мл раствора “10x dropout –
2”(стерильные растворы).
4) Среда SD без трех аминокислот и аденина (“среда - 3”) (на 100 мл):
0.67 г дрожжевой среды без аминокислот, 85 мл дистиллированной
воды. Среда автоклавировалась в течение 1.5 часов и охлаждалась до
55°С. Добавлялись 5 мл 40% глюкозы и 10 мл раствора “10x dropout –
3”(стерильные растворы).
5) Растворы: 50% PEG 3380; 0,1 М ацетат лития; 20 мг/мл ДНК спермы
лосося; 3мМ ZnCl2.
6) Буфер «I»: 50 мМ фосфат калия рН 7.6, 1мМ MgCl2.
Буфер «II»: 1 мг/мл субстрата CPRG в буфере «I».
7) Стерильные пробирки, наконечники
Оборудование:
1) Шейкер-инкубатор;
2) Центрифуга;
3) Термостат/инкубатор
4) Планшетный анализатор
Протокол:
Первый день:
5
Дрожжи Saccharomyces cerevisiae штамма Pj69-4A пересеять в 15-мл
культуральную пробирку в жидкую среду YPDA с помощью стерильной
петли. Наращивать в термостатированном шейкере-инкубаторе (температура
30°С, скорость вращения 250-300 rpm) до поздней лог-фазы (оптическая
плотность OD600~1, определяется визуально).
Второй день:
Культуру разбавить в 10 раз средой YPDA и выращивать 3 часа при тех же
условиях. 1,5 мл суспензии клеток осадить центрифугированием при 4000 g в
течение 10 секунд, супернатант удалить. К осадку добавить 1 мл 0,1М
ацетата лития, инкубировать 10 минут на качалке при температуре 30°C,
центрифугировать при 4000 g в течение 10 секунд. Надосадочную жидкость
удалить. После этого в пробирку с осажденными клетками добавить
последовательно 270 мкл 50% PEG 3380, растворенного в 0,1 М ацетате
лития, 25 мкг денатурированной ДНК спермы лосося и 50 мкл смеси двух
плазмид в 0,1 М ацетате лития (масса каждой плазмиды в смеси 400-800 нг).
Содержимое пробирки ресуспендировать до гомогенного состояния.
Пробирку поместить в качалку на 30°С на 30 минут. Затем инкубировать на
42°С в течение 2 минут. Пробирку поставить охлаждаться в лед на
полминуты. Клетки осадить на 4000 g в течение 20 секунд, надосадочную
жидкость удалить. К осадку добавить 150 мкл деионизованной воды (mQ).
Содержимое пробирки аккуратно, но тщательно ресуспендировать и высеять
на чашку с селективной средой, не содержащей аминокислоты лейцин и
триптофан (“среда – 2”). Чашки поместить в термостат на 30°С на двое суток,
до появления отдельных колоний.
6
Третий день (спустя 2 дня):
1) Выросшие колонии пересеять истощающим штрихом на чашки с
селективной средой, не содержащей аденин и аминокислоты Leu, Trp и
His (“среда SD– 3”), и на такие же чашки с добавлением 5, 10, 25, 50 мМ
3-АТ (ингибитор продукта гена HIS3). Выращивать дрожжи в термостате
на 30°С в течение 3 дней. Уровень роста колоний на чашках оценивать
визуально.
2) Выросшие колонии (по 5-10 штук) инокулировать в стерильные
пробирки, содержащие 5 мл среды SD-2, и поставить в качалку на 30°С,
300 rpm на ночь.
Четвертый день:
Выросшие за ночь в пробирках культуры пересеять в 5 мл среды YPD
до OD600=0.3. Растить 3 часа в качалке при 30°С, 250 rpm. 1,5 мл культуры
центрифугировать в течение 30 сек, 5000g. Осадок суспендировать в 300 мкл
буфера «I». Перенести 100 мкл суспензии в новую пробирку. Заморозить в
жидком азоте (30 сек), перенести на 37°С до полного оттаивания. Повторить
эту процедуру 3 раза. В плашке смешать 40 мкл полученной суспензии и 260
мкл буфера «II», отметить стартовое время. Когда некоторые пробы начнут
менять цвет с желтого на розовый реакцию остановить добавлением 100 мкл
3мМ ZnCl2. Суспензии осветлить центрифугированием (1 мин, 8000g).
Супернатанты перенести в плншет, измерить OD575.
Активность β-галактозидазы рассчитать по формуле:
U = 1000 x OD575 / (t x V x OD600)
t = время инкубации, мин.
V = 0,1x Концентрационный фактор
7
Концентрационный фактор = 5
OD600 = OD600 1 мл культуры. (Оставшиеся 200 мкл суспензии в буфере
«I» довести водой до 1 мл и измерить OD600).
Результаты практического задания
Слушатели практикума были разбиты на 4 группы, каждой из
которых был выдан определенный набор плазмид для тестирования. В
результате выполнения практикума слушатели должны были заполнить
таблицы, представленные ниже, в соответствии с ростом трансформантов
на селективных средах и с бета-галактозидазным тестом. После
заполнения слушатели должны были объяснить получившиеся результаты
и сделать вывод о взаимодействующих молекулах.
8
9
10
11
12
Список литературы.
1. Fields S, Song O. A novel genetic system to detect protein-protein
interactions. Nature. 1989; 340(6230):245-6.
2. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S.The two-hybrid system: a
method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of
interest. Proc Natl Acad Sci U S A, 1991, 88(21):9578-82.
3. Fields S, Sternglanz R. The two-hybrid system: an assay for protein-protein
interactions. Trends in Genetics, 1994, 10:286-92
4. Gietz R.D., Triggs-Raine Barbara, Robbins Anne, Graham Kevin, Woods
Robin. "Identification of proteins that interact with a protein of interest:
Applications of the yeast two-hybrid system". Mol Cel Biochem , 1997,
172 (1-2): 67–79.
5. Deane C, Salwinski L, Xenarios I, Eisenberg D. "Protein interactions: two
methods for assessment of the reliability of high throughput
observations". Mol Cell Proteomics , 2002, 1 (5): 349–56.
6. Haiyuan Yu et al. "High-Quality Binary Protein Interaction Map of the
Yeast Interactome Network". Science, 2008, 322 (5898): 104–110.
Список дополнительной литературы:
1. Joung J, Ramm E, Pabo C. "A bacterial two-hybrid selection system for
studying protein-DNA and protein-protein interactions". Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 2000, 97 (13): 7382–7.
13
2. Hurt J, Thibodeau S, Hirsh A, Pabo C, Joung J. "Highly specific zinc finger
proteins obtained by directed domain shuffling and cell-based
selection". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2003, 100 (21): 12271–6.
3. Whipple F. "Genetic analysis of prokaryotic and eukaryotic DNA-binding
proteins in Escherichia coli". Nucleic Acids Res, 1998, 26 (16): 3700–6.
4. Stagljar I, Korostensky C, Johnsson N, te Heesen S. "A genetic system based
on split-ubiquitin for the analysis of interactions between membrane
proteins in vivo". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1998, 95 (9): 5187–92.
5. Gommans W, Haisma H, Rots M. "Engineering zinc finger protein
transcription factors: therapeutic relevance of switching endogenous gene
expression on or off at command". J Mol Biol, 2005, 354 (3): 507–19.
14
Тестирование
I. Был проведен двугибридный скрининг с использованием классической
дрожжевой двугибридной системы, основанной на
котрансформации плазмид, несущих ДНК-связывающий или
активационный домен, слитые с последовательностями изучаемых
белков, в дрожжевой штамм:
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, ade2-101, gal4Δ,
gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS–Gal1TATA–His3, GAL2UAS–Gal2TATA–Ade2
URA3 : : MEL1UAS–Mel1TATAAUR1-C MEL1 met2::GAL7-lacZ.
В результате получены следующие результаты:
Минимальная среда без добавления триптофана, лейцина,
гистидина («-3»)
DBD-X
DBD-Y
AD-A
+
+
AD-B
+
+
AD-C
+
AD-D
+
AD-E
Минимальная среда «-3» с добавлением 20мМ 3-АТ
AD-A
AD-B
AD-C
AD-D
AD-E
DBD-X DBD-Y
+
+
+
+
-
1. Расшифруйте название дрожжевого штамма. Какие гены не
функциональны? Какие гены восстановлены в результате сайтспецифической рекомбинации? Какие гены можно использовать
в качестве репортерных при постановке дрожжевой
двугибридной системы? Какие гены можно использовать для
селекции котрансформированных клеток дрожжей?
15
2. Какие выводы можно сделать на основе полученных
результатов? Достаточно ли данных для однозначной
интерпретации результатов? Какие контрольные эксперименты
Вы можете предложить провести?
II. В результате двугибридного скрининга с использованием классической
дрожжевой двугибридной системы, основанной на
котрансформации плазмид, несущих ДНК-связывающий или
активационный домен, слитые с последовательностями изучаемых
белков, в дрожжевой штамм:
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, ade2-101, gal4Δ,
gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS–Gal1TATA–His3, GAL2UAS–Gal2TATA–Ade2
URA3 : : MEL1UAS–Mel1TATAAUR1-C MEL1 met2::GAL7-lacZ
в контрольных экспериментах были получены следующие
результаты:
Минимальная среда без добавления триптофана, лейцина,
гистидина («-3»)
DBD
DBD-X
DBD-Y
AD-A
AD
+
AD-B
+
1. Как Вы объясняете поведение изучаемых белков? Можно ли их
использовать в классической дрожжевой двугибридной системе?
2. Как бы Вы изменили условия постановки дрожжевой
двугибридной системы для каждого из белков? Какие
дополнительные тесты Вы предлагаете провести?
16