Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa
advertisement
Госпитальные инфекции, вызванные Pseudomonas aeruginosa. Распространение и клиническое значение антибиотикорезистентности Сидоренко С.В., Резван С.П., Стерхова Г.А., Грудинина С.А. Кафедра микробиологии и клинической химиотерапии Российской медицинской академии последипломного образования, Государственный научный центр по антибиотикам, Москва. Совершенствование медицинских технологий во второй половине XX века существенно расширило круг заболеваний, поддающихся эффективной терапии. Однако успехи в решении задач поддержания функции жизненно важных органов у пациентов, находящихся в критическом состоянии, сопровождаются возникновением новых проблем. К таким проблемам относится широкое распространение в отделениях интенсивной терапии госпитальных инфекций (ГИ). Так, по данным исследования EPIC, госпитальные инфекции в отделениях интенсивной терапии регистрируются более чем у 20% пациентов [1]. Принципиально важной особенностью ГИ является их этиологическая структура, существенно отличающаяся от таковой при внебольничных инфекциях. Представители семейства Enterobacteriaceae вызывают ГИ в 34,4% случаев, Pseudomonas aeruginosa - в 28,7%, Staphylococcus aureus - в 30,1% (60% из них являются метициллинорезистентными), Staphylococcus spp . (коагулозонегативные) - в 19,1%, Enterococcus spp . - в 11,7%, Yeasts - в 17,1% (сумма превосходит 100% в связи с наличием смешанных инфекций) [1]. Значение P.aeruginosa как возбудителя ГИ определяется не только достаточно высокой частотой ее распространения, но и тяжестью течения вызываемых ею заболеваний, а также трудностями в терапии. Классификация псевдомонад и элементы патогенеза инфекций Классификация семейства Pseudomonadaceae в последние годы претерпела значительные изменения, вызывая некоторую путаницу, поэтому целесообразно остановиться на ней несколько подробнее. Современная и предшествующая классификация представителей семейства Pseudomonadaceae в сокращенном варианте представлены в табл. 1 Таблица 1. Классификация семейства Pseudomonadaceae Современная классификация (по гомологии рРНK [2, 3]) Предшествующая классификация Род Pseudomonas (I группа) Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Pseudomonas stutzeri Pseudomonas mendocina Pseudomonas mendocina Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas pseudoalcaligenes и др. Pseudomonas pseudoalcaligenes и др. Род Burkholderia (II группа) Burkholderia mallei Pseudomonas mallei Burkholderia pseudomallei Pseudomonas pseudomallei Burkholderia cepacia и др. Pseudomonas cepacia и др. Род Comamonas (III группа) Comamonas acidovorans Pseudomonas acidovorans Comamonas terrigena и др. Pseudomonas terrigena и др. Род Brevundimonas (IV группа) Brevundimonas diminuta Нет Brevundimonas vesicularis Род Stenotrophomonas (V группа) Stenotrophomonas maltophilia Pseudomonas maltophilia Роды с неясной рРНK гомологией Chryseomonas luteola Pseudomonas luteola Flavimonas oryzohabitans Pseudomonas oryzohabitans Shewanella putrifaciens Pseudomonas putrifaciens Sphingomonas paucimobilus Pseudomonas paucimobilus В составе семейства Pseudomonadaceae по рРНК гомологии выделяют 5 групп. Pseudomonas aeruginosa (Pa) относится к роду Pseudomonas (I группа рРНК гомологии) и входит в подгруппу Fluorescent, наряду с P.fluorescens и P.putida. Ранее к роду Pseudomonas относили и других представителей семейства Pseudomonadaceae, однако в настоящее время они выделены в самостоятельные роды. Необходимость для клинициста в корректной идентификации Pa и родственных микроорганизмов обусловлена, в первую очередь, различиями в их природной чувствительности (устойчивости) к антибиотикам. Так, S.maltophilia обладает природной устойчивостью к карбапенемам, а B.cepacia - к аминогликозидам, при этом антибиотики обеих групп высокоактивны в отношении Pa. Вполне очевидно, что идентификация возбудителя инфекции до уровня вида может принципиально изменить характер эмпирической терапии. Практическая необходимость видовой идентификации отдельных представителей семейства Pseudomonadaceae также обусловлена задачами эпидемиологической диагностики ГИ. По сравнению с Ра подавляющее большинство микроорганизмов семейства Pseudomonadaceae, обитая в почве и воде, имеют ограниченное клиническое значение (за исключением B.mallei и B.pseudomallei - возбудителей сапа и мелиоидоза соответственно). Высокая частота выделения и более выраженная патогенность Pa связаны с наличием у этого микроорганизма ряда факторов вирулентности, способствующих колонизации и инфицированию тканей организма человека. К детерминантам вирулентности относятся факторы, способствующие адгезии, инвазии, цитотоксичности. Адгезия Pa к клеткам эпителия опосредуется ворсинками (пилями), которые обладают способностью специфически связываться с GM-1 ганглиозидными рецепторами эпителия. Секретируемый микроорганизмом фермент нейраминидаза, отщепляя остатки сиаловых кислот от рецептора, облегчает специфическую адгезию. Локальное и системное действие на организм млекопитающих оказывают и другие секретируемые Pa ферменты. Фосфолипаза С разрушает цитоплазматические мембраны эукариотических клеток, инактивирует опсонины, гидролизует сурфактант легких. Цитотоксическим действием (в том числе и в отношении макрофагов), а также способностью подавлять биосинтез белка обладает экзотоксин А. Биосинтез белка ингибируется также экзоэнзимом S. Эластаза разрушает иммуноглобулины и компоненты комплемента, ингибирует активность нейтрофилов. Функцию нейтрофилов и лимфоцитов подавляет токсин - лейкоцидин. Цитотоксическим эффектом обладает и пигмент пиоцианин, обусловливающий сине-зеленую окраску среды при выращивании микроорганизма в культуре или гнойного отделяемого инфицированных ран. Мощным индуктором системной воспалительной реакции является липополисахарид Pa. Часть штаммов Pa продуцируют капсульный полисахарид альгинат. Штаммы, продуцирующие альгинат, обычно выявляются у пациентов с хроническими инфекциями, например, на фоне муковисцидоза. Альгинат способствует формированию на поверхности эпителия пленки, которая обеспечивает защиту патогена от воздействия факторов резистентности макроорганизма и антибиотиков. Для Ра характерно разнообразие весьма тонких механизмов регуляции экспрессии факторов вирулентности. Активность механизмов регуляции направлена на быструю адаптацию микроорганизма к меняющимся условиям обитания и обеспечение максимальной экономичности с энергетической точки зрения. При пребывании микроорганизма во внешней среде факторы вирулентности не синтезируются, при попадании же во внутреннюю среду организма млекопитающих начинается интенсивный синтез этих белков, способствующих развитию инфекционного процесса. Сигналами для микроорганизма о попадании во внутреннюю среду могут быть изменения температуры, рН среды, контакт с мембраной эукариотических клеток. Распознавание таких сигналов осуществляют специфические рецепторы, локализованные в клеточной стенке микроорганизма. Передачу сигнала, обеспечивающего начало синтеза фактора вирулентности, от рецептора к гену, кодирующему белок, осуществляют двухкомпонентные системы передачи сигнала. Такие системы действуют по принципу последовательной активации ферментов в реакции фосфорилирования и являются универсальными в регуляции вирулентности микроорганизмов [4]. У Ра описаны двухкомпонентные системы, регулирующие образование ворсинок и синтез экзоэнзимов [5, 6]. Кроме регуляции синтеза факторов вирулентности на уровне отдельных микробных клеток, у Ра регуляция происходит и на уровне популяции. Речь идет о феномене "кооперативной чувствительности" или "чувства кворума" (quorum sensing), заключающемся в накоплении в микробной популяции низкомолекулярных соединений (гомосеринлактонов), осуществляющих при достижении определенной концентрации дерепрессию синтеза большинства факторов вирулентности. Таким образом, экспрессия генов вирулентности оказывается зависящей от плотности микробной популяции [7]. Биологический смысл феномена, вероятно, связан с координированным началом синтеза факторов вирулентности только после достижения микробной популяцией определенного уровня плотности. Регуляции на уровне кооперативной чувствительности у Ра подвержена экспрессия большинства факторов вирулентности и вторичных метаболитов [8]. У Pa описана система секреции протеинов (так называемый III тип), обеспечивающая не только выведение экзоэнзимов из внутренней среды бактериальной клетки, но и их транслокацию внутрь эукариотической клетки, то есть к чувствительным мишеням [9]. К протеинам, секретируемым описанной системой, относятся и факторы вирулентности. Кроме описанного пути секреции токсических субстанций, у Pa показано выделение мембранных пузырьков, которые окружены двухслойной мембраной, состоящей из липополисахарида и белков наружной мембраны микробной клетки. Внутри пузырьков содержатся многие из перечисленных выше токсинов и ферментов. Сливаясь с мембранами эукариотических клеток пузырьки, высвобождают свое содержимое в их цитоплазму, что обеспечивает выраженный токсический эффект [10]. Особенности клинической картины инфекций, вызываемых Ра Вследствие наличия у Pa вышеперечисленных факторов вирулентности, инфекции, вызываемые этим микроорганизмом, потенциально более опасны, чем вызванные другими условно-патогенными микроорганизмами. Они развиваются у пациентов с ожогами, острым лейкозом, муковисцидозом, у находящихся по различным причинам на искусственной вентиляции легких (ИВЛ). Инфекция обычно локализуется в местах скопления и застоя жидкости: в трахеостомах, нижних отделах легких, постоянных катетерах мочевого пузыря, мокнущих ранах и др. Актуальной является проблема колонизации Pa сосудистых катетеров. Чаще всего ГИ, вызванные Pa, локализуются в нижних отделах дыхательных путей и в мочевыводящих путях, причем к наиболее серьезным из ГИ следует относить ИВЛассоциированные пневмонии. К факторам риска развития таких пневмоний, вызванных Pa, относятся предшествующая терапия цефалоспоринами III поколения, длительная госпитализация или обструктивные заболевания легких в анамнезе [11]. Летальность при бактериологически подтвержденной ИВЛ-ассоциированной пневмонии (обсемененность материала, полученного из нижних отделов дыхательных путей с помощью специальных щеток, защищенных от контаминации в верхних дыхательных путях, более 103 КОЕ/мл) составляет 73%, а при колонизации нижних дыхательных путей Pa (обсемененность материала менее 103 КОЕ/мл) - 19% [12]. Роль Pa в этиологии интраабдоминальных инфекций, а также инфекций кожи и мягких тканей является независимым достоверным фактором риска неудачи лечения [13]. При любой локализации первичного очага инфекции, обусловленной Ра, возможно развитие бактериемии, существенно ухудшающей прогноз заболевания. По данным многоцентрового европейского исследования (SENTRY), частота бактериемий, вызванных Pa, составляет 5% [14]. Анализ данных литературы об исходах бактериемии, вызванной Pa, опубликованных от начала 70-х до начала 90-х годов [15- 21], выявляет достаточно стабильные показатели как общей летальности (40-75%), так и летальности, непосредственно связанной с инфекцией (34-48%). Лишь в одном исследовании показатели летальности как общей, так и непосредственно связанной с инфекцией оказались существенно ниже 18 и 11% соответственно [22]. Роль Pa в этиологии внебольничных инфекций невелика, исключением являются случаи наружного отита на фоне диабета [23] и остеомиелита, развившегося как осложнение инфицированных ран стопы [24]. Спектр антибиотикочувствительности Pa имеханизмы ее резистентности Природная резистентность К основным группам антибиотиков, обладающих клинически значимой антипсевдомонадной активностью, относятся беталактамы, аминогликозиды и фторхинолоны. По уровню природной чувствительности к этим антибиотикам Pa существенно отличается от большинства грамотрицательных микроорганизмов, прежде всего от представителей семейства Enterobacteriaceae. Механизмы действия антибиотиков и устойчивости к ним Pa схематически проиллюстрированы на рис. 1 Рис. 1. Механизмы действия антибиотиков и устойчивости к ним P. aeruginosa. Аминогликозиды. Механизм действия: подавление биосинтеза белка посредством связывания с 30S-субъединицей рибосомы; диффузия через внешнюю мембрану в результате вытеснения ионов Ca2+, Mg2+ из центров связывания; транспорт через внутреннюю мембрану - энергозависимый процесс. Резистентность (AR): 1 - ферментативная инактивация, 2 - снижение проницаемости, 3 - модификация мишени действия. Беталактамы. Механизм действия: подавление функции ПСБ; диффузия осуществляется через пориновые каналы - OprF и другие (Имипенем использует для диффузии уникальный канал OprD). Резистентность (BR): 1 - изменение структуры поринового канала (снижение проницаемости), 2 - гидролиз бета-лактамазами, 3 - активный выброс при участии белка OprM, 4 - модификация мишени действия ПСБ. Резистентность к имипенему (IR) изменение структуры поринового белка OprD. Фторхинолоны. Механизм действия: ингибиция ДНК-гиразы; благодаря липофильным свойствам возможна диффузия непосредственно через мембраны, однако частично активно выводятся посредством системы MexA-MexB-OprM. Резистентность (QR): 1 - изменение структуры мишени действия (ДНК-гиразы), 2 - активация системы выведения (MexA-MexBOprM), 3 - снижение проницаемости мембраны. Одним из важных факторов, определяющих спектр природной чувствительности (устойчивости) Pa к антибиотикам, является строение ее внешней мембраны. Основным компонентом внешней мембраны у Ра, как и у других грамотрицательных микроорганизмов, является липополисахаридный слой, практически непроницаемый для экзогенных гидрофильных веществ (моно- и дисахаридов, аминокислот, коротких пептидов), транспорт которых внутрь бактериальной клетки осуществляется через пориновые каналы. Пориновые каналы представляют собой воронкообразные белковые структуры (пориновые белки), встроенные в липополисахаридный слой. Из клинически значимых антибиотиков гидрофильными свойствами обладают беталактамы, мишенью действия которых являются пенициллинсвязывающие белки (ПСБ), локализованные в цитоплазматической мембране. Следовательно, для проявления активности беталактамным антибиотикам необходимо, преодолев внешнюю мембрану, попасть в периплазматическое пространство. Основным пориновым белком, ответственным за транспорт беталактамных антибиотиков через внешнюю мембрану, является OprF. Определенную роль играют также белки OprC, OprE, OprB [25-27]. Тот факт, что проницаемость внешней мембраны Pa в 12-100 раз ниже, чем у E.colшi [28], вероятно, связан с особенностями строения их пориновых белков. У Pa описан своеобразный пориновый белок - OprD (ранее именовавшийся D2), который используется только для транспорта карбапенемных антибиотиков. Естественными субстратами для OprD являются дипептиды, с которыми карбапенемы обладают определенным структурным сходством [29, 30]. Различия в уровне антипсевдомонадной активности отдельных беталактамов в значительной степени объясняются различиями в их способности диффундировать через внешнюю мембрану Ра. Наибольшую природную активность проявляют карбапенемные антибиотики (меропенем несколько активнее имипенема), поскольку они обладают сравнительно небольшой молекулярной массой, кроме этого, их транспорт через внешнюю мембрану облегчает наличие в молекуле двух противоположных электрических зарядов. Далее в порядке убывания антипсевдомонадной активности следуют: цефалоспорины IV поколения цефпиром и цефепим (обладающие свойствами цвиттерионов [31]), азтреонам, цефалоспорины III поколения цефтазидим, цефоперазон и цефпирамид, уреидопенициллины (прежде всего пиперациллин), тикарциллин и карбенициллин. На уровень природной активности беталактамных антибиотиков в отношении Pa оказывает влияние также способность этого микроорганизма к синтезу индуцибельных хромосомных бета-лактамаз. Указанные ферменты относятся к классу С, они разрушают все беталактамы, кроме карбапенемов и некоторых цефалоспоринов IV поколения, их активность не подавляется такими ингибиторами как сульбактам, клавуланат, тазобактам. Синтез ферментов начинается после контакта с аминопенициллинами, цефалоспоринами I-II поколений, карбапенемами. Карбоксипенициллины, уреидопенициллины, цефалоспорины III поколения являются слабыми индукторами, но чувствительны к гидролизу этим ферментом [32]. Таким образом, уровень природной активности беталактама в отношении Pa зависит от баланса трех его свойств: способности проникать через внешнюю мембрану микроорганизма, способности индуцировать синтез хромосомных бета-лактамаз и устойчивости к гидролизу этими ферментами. Гидрофобные (липофильные) и амфифильные антибиотики, такие как фторхинолоны, тетрациклины и хлорамфеникол, способны проникать через внешнюю мембрану грамотрицательных микроорганизмов (в том числе псевдомонад), минуя пориновые каналы [33]. Липофильные антибиотики достаточно хорошо проникают и через цитоплазматическую мембрану в цитоплазму, где локализуются мишени их действия (рибосомы и ферменты топоизомеразы). Однако, несмотря на хорошую способность проникать через внешнюю мембрану Pa, перечисленные антибиотики обладают лишь незначительной антипсевдомонадной активностью или вовсе лишены ее. Фактором, ограничивающим уровень их природной активности, является наличие у Pa (и других псевдомонад) механизма активного выведения липофильных антибиотиков из цитоплазмы - выброса (efflux pump) [34]. Система, осуществляющая выброс, состоит из трех белков. Белки МехА и МехВ связаны с цитоплазматической мембраной и осуществляют транспорт из цитоплазмы в периплазму, белок OprM локализован во внешней мембране и осуществляет выведение из периплазмы во внешнюю среду. Гены белков МехА, МехВ, OprM организованы в единый оперон, уровень их экспрессии регулируется геном mexR. Кроме описанной, у Pa существуют и другие системы выброса. Из группы гидрофильных антибиотиков наибольшее клиническое значение имеют фторированные хинолоны, а среди них ципрофлоксацин, обладающий максимальной антипсевдомонадной активностью, однако следует иметь в виду, что МПК препарата в отношении Pa приблизительно в 10 раз выше, чем в отношении E.coli. Новые фторхинолоны, в частности клинафлоксацин, проявляют более высокую антипсевдомонадную активность [35]. Определенный вклад системы выброса вносят и в природную устойчивость Pa к беталактамным антибиотикам. Так, накапливаются данные о том, что в выведении беталактамных антибиотиков из периплазматического пространства участвует белок OprM [36]. На уровне природной активности аминогликозидных антибиотиков особенности строения внешней мембраны и системы выброса Pa сказываются лишь в незначительной степени. Величины МПК аминогликозидов в отношении Pa близки к таковым для других грамотрицательных бактерий (например, E.coli). Транспорт этих препаратов через внешнюю мембрану осуществляется в результате феномена самоактивации. Аминогликозиды (поликатионы по физико-химическим свойствам) вытесняют дивалентные катионы из участков их связывания в липополисахаридном слое, что приводит к дестабилизации и повышению проницаемости последнего [37]. Транспорт аминогликозидов через цитоплазматическую мембрану микроорганизмов является энергозависимым. Наибольшую природную активностью в отношении Pa проявляют тобрамицин, гентамицин, нетилмицин, сизомицин и амикацин. "Старые" аминогликозиды (стрептомицин, канамицин, неомицин) существенно уступают перечисленным антибиотикам. Приобретенная антибиотикорезистентность Pa и ее механизмы Беталактамы. Как было отмечено выше, беталактамные антибиотики являются одними из основных антипсевдомонадных средств. Однако приобретенная резистентность к этой группе антибиотиков является весьма распространенным явлением среди Pa. Основным механизмом резистентности является дерепрессия продукции хромосомных бета-лактамаз класса С. Основой феномена являются мутации в генах, регулирующих продукцию указанных ферментов [32]. Мутации, ведущие к дерепрессии синтеза хромосомных беталактамаз, возникают спонтанно, независимо от воздействия антибиотиков. Однако на фоне терапии, когда происходит элиминация чувствительных микроорганизмов, штаммыгиперпродуценты приобретают преимущества. Селекция может происходить на фоне лечения антипсевдомонадными пенициллинами, в том числе и защищенными, а также цефалоспоринами III поколения. На фоне лечения карбапенемными антибиотиками селекции не происходит, так как, обладая устойчивостью к гидролизу хромосомными беталактамазами, эти препараты подавляют и дерепрессированные мутанты. В меньшей степени подобным свойством обладают цефалоспорины IV поколения. Дерепрессированные штаммы Pa проявляют устойчивость ко всем беталактамным антибиотикам, кроме карбапенемов и, частично, цефалоспоринов IV поколения. Однако некоторое повышение МПК отмечается и для этих антибиотиков. Кроме хромосомных бета-лактамаз, у Pa описаны многочисленные и разнообразные плазмидные бета-лактамазы, относящиеся к трем основным классам: А, D, и В. Ферменты различаются по своему субстратному профилю (способности разрушать те или иные беталактамы) и по чувствительности к ингибиторам [38]. Для практики важны следующие моменты: бета-лактамазы класса А (ТЕМ, PER, SHV, PSE группы) угнетаются ингибиторами, класса D (OXA группа) - устойчивы к ингибиторам. И те, и другие не способны разрушать карбапенемные антибиотики. Устойчивость Pa к беталактамным антибиотикам, связанная с продукцией бета-лактамаз класса А (угнетаемых ингибиторами), встречается не часто, вследствие этого защищенные пенициллины (например, пиперациллин/тазобактам) имеют лишь незначительные преимущества в сравнении с незащищенными. Бета-лактамазы класса В (так называемые металлоэнзимы) у Pa встречаются редко (описаны практически только в Японии), однако они обладают крайне неблагоприятным свойством - способностью гидролизовать карбапенемы [39]. Вполне возможно, что у Pa существуют бета-лактамазы и других классов, гидролизующие карбапенемы [40]. Имеется единичное сообщение о выделении у Pa бета-лактамазы группы SHV, предположительно гидролизующей большинство беталактамов, включая меропенем, но не активной в отношении имипенема [41]. Основным механизмом устойчивости Pa к карбапенемным антибиотикам является утрата в результате мутации поринового белка OprD (или снижение его экспрессии). Этот механизм в большей степени поражает имипенем, чем меропенем, так как транспорт последнего может осуществляться и через другие пориновые белки [42]. Именно высокой специфичностью белка OprD объясняются наблюдаемые на практике случаи избирательной устойчивости к имипенему при сохранении чувствительности к меропенему, а иногда и к другим беталактамам. В настоящее время обсуждается возможная роль системы выброса МехА-МехВ-OprM в повышении устойчивости к беталактамным антибиотикам. Имеются данные о возможности селекции в процессе терапии штаммов Pa, продуцирующих повышенное количество белка OprM и обладающих сниженной чувствительностью к беталактамам [43]. Вероятно, выброс меропенема осуществляется более эффективно, чем имипенема [44]. На практике ситуация значительно осложняется тем, что штаммы Pa могут обладать одновременно несколькими механизмами резистентности к беталактамным антибиотикам. Например: дерепрессия хромосомных бета-лактамаз может сочетаться с продукцией плазмидных и со снижением проницаемости внешней мембраны. Интерпретация результатов оценки чувствительности, а главное - прогнозирование эффективности лечения инфекций, вызванных такими штаммами, связаны со значительными трудностями. Аминогликозиды. Устойчивость Pa к аминогликозидным антибиотикам опосредуется тремя механизмами, перечисленными в порядке возрастания частоты и клинической значимости: модификация участка связывания рибосом с антибиотиками, снижение транспорта внутрь бактериальной клетки (нарушение проницаемости внутренней или внешней мембраны), ферментативная инактивация антибиотиков. Инактивация аминогликозидных антибиотиков осуществляется путем модификации их молекулы тремя группами ферментов: ацетилтрансферазами (присоединяют остаток уксусной кислоты), фосфотрансферазами (присоединяют остаток фосфорной кислоты) и нуклеотидилтрансферазами (присоединяют остаток адениловой кислоты). Гены перечисленных ферментов локализованы на плазмидах. Каждый из аминогликозидмодифицирующих ферментов обладает характерным субстратным профилем [45]. К сожалению, достаточно часто штаммы Pa могут продуцировать одновременно несколько ферментов. Вследствие этого, оценив чувствительность к некоторым из аминогликозидных антибиотиков, прогнозировать уровень чувствительности к другим не представляется возможным. Продукция аминогликозидмодифицирующих ферментов обычно приводит к высокому уровню устойчивости; незначительное снижение уровня чувствительности Pa, как правило, связано с нарушением транспорта аминогликозидов внутрь бактериальной клетки. Фторированные хинолоны. Как уже было отмечено выше, фторированные хинолоны выводятся из цитоплазмы Pa в результате активности системы выброса MexA-MexB-OprM. Регуляция активности системы выброса осуществляется геном mexR, в результате мутаций в указанном гене уровень экспрессии белков системы выброса может значительно возрастать, что сопровождается повышением устойчивости Pa к фторированным хинолонам. Не менее важным механизмом устойчивости к фторхинолонам является модификация мишеней действия этих препаратов. Мишенями действия хинолонов в бактериальной клетке являются два фермента, контролирующих пространственную организацию ДНК (ДНК- гираза и топоизомераза IV). У грамотрицательных микроорганизмов основной мишенью является ДНК-гираза, а у грамположительных - топоизомераза IV [46, 47]. Хинолоны ингибируют активность этих ферментов, связываясь с небольшим участком их молекул, называемым "хинолоновым карманом". При возникновении мутаций (аминокислотных замен) в области "хинолонового кармана", на его участке, обозначаемом как "область, детерминирующая устойчивость к хинолонам", сродство препаратов к ферментам снижается, величина МПК препарата в отношении микроорганизма возрастает, то есть проявляется резистентность. Единичные мутации сопровождаются незначительным повышением МПК; чем больше мутаций накапливается у штамма, тем выше его устойчивость. Так, высокий уровень резистентности Pa к ципрофлоксацину может быть результатом двух мутаций в генах фермента ДНК-гиразы и одной - в генах топоизомеразы IV [48]. Возможно также формирование резистентности в результате селекции мутаций, обеспечивающих повышение активности систем выброса [49]. Вполне реальной является также комбинация нескольких механизмов резистентности, например: модификация чувствительной мишени и усиление активного выброса [50]. Другие антибиотики. Из антибиотиков других групп определенное клиническое значение в лечении инфекций, вызываемых Pa, может иметь полимиксин В. Механизм его действия связан с нарушением целостности внешней мембраны микроорганизма (действие по типу поверхностно-активных веществ). Достоверных случаев устойчивости Pa к полимиксину В не описано. Показатель чувствительности к полимиксину В может быть использован для дифференцировки Pa от некоторых родственных микроорганизмов. Распространение резистентности Pa в отделениях интенсивной терапии (собственные данные и анализ литературы) Нами было проанализировано распространение антибиотикорезистентности Pa в отделениях реанимации и интенсивной терапии новорожденных в ГКБ N7 Москвы в период между двумя последующими плановыми санитарными обработками с августа 1997 по июнь 1998 г. К особенностям отделений относится то, что практически все поступающие пациенты в течение различных промежутков времени лечились в других учреждениях и, как правило, получали антибактериальную терапию. В исследование были включены последовательные штаммы Ра (всего 141), выделенные за период наблюдения, при этом от каждого пациента в исследование включали не более 1 штамма Ра. Источниками выделения в подавляющем большинстве случаев был эндотрахеальный аспират; кровь, ликвор и моча составили незначительное количество образцов. Выделенные микроорганизмы были оценены либо как этиологические агенты инфекции, либо как колонизующая микрофлора. Антибиотикочувствительность выделенных микроорганизмов оценивали методом двукратных серийных микроразведений в соответствии с рекомендациями Национального комитета по клиническим и лабораторным стандартам США (NCCLS) [51]. Сравнительные данные об активности основных антипсевдомонадных антибиотиков в отношении выделенных штаммов представлены в табл. 2 Распределение МПК изучавшихся антибиотиков и относительное количество чувствительных, промежуточных и устойчивых к ним штаммов приведено на рис.2 Таблица 2. Сравнительная активность антибиотиков в отношении изученных штаммов P. aeruginosa R Антибиотики Меропенем I S % штаммов 9 9 МПK50 МПK90 Среднегеометрическая МПK Диапазон МПK 1,14 0,031-64 мкг/мл 82 2 8 Имипенем 15 4 Цефтазидим Цефепим 81 2 16 2,32 0,031-256 37 18 45 16 64 8,40 0,031-256 16 31 53 8 32 7,54 0,5-256 Пиперациллин/тазобактам 45 15 40 64 256 37,82 0,1-256 Ципрофлоксацин 44 1 55 0,5 64 1,38 0,031-256 Гентамицин 60 1 39 256 256 25,78 0,25-256 Амикацин 10 1 89 4 32 5,56 0,5-256 Примечание: S - чувствительные, I - промежуточные, R - устойчивые штаммы. Рис. 2. Диаграммы распределения МПК антибиотиков в отношении изученных штаммов P.aeruginosa (S - чувствительные; I - промежуточные; R - устойчивые) Очевидно, что среди беталактамных антибиотиков карбапенемы отличаются наибольшим уровнем антисинегнойной активности и к ним реже всего встречается устойчивость. По величине среднегеометрической МПК меропенем в 2 раза активнее имипенема. При сопоставлении диаграмм распределения МПК имипенема и меропенема выявляется, что для последнего характерен сдвиг в сторону более низких значений в сравнении с имипенемом. Так, не было обнаружено штаммов с МПК меропенема более 64 мкг/мл. Обращает на себя внимание высокая частота устойчивости к базовому антипсевдомонадному цефалоспорину III поколения - цефтазидиму: устойчивыми к нему оказались 37% штаммов, промежуточными - 18%. Несколько большей активностью отличался цефалоспорин IV поколения цефепим: 16% штаммов были устойчивы к антибиотику, 31% относились к промежуточным. Отмечена высокая частота резистентности к защищенному пенициллину пиперациллину/тазобактаму: 45% штаммов были устойчивыми, 15% - промежуточными. Основываясь на основных свойствах бета-лактамаз Pa, можно утверждать, что частота резистентности к другим антипсевдомонадным пенициллинам (карбенициллину, тикарциллину) будет еще выше. Анализируя возможные механизмы резистентности к беталактамным антибиотикам, следует признать, что наиболее распространенным, вероятно, является дерепрессия (гиперпродукция) хромосомных бета-лактамаз. В пользу этого предположения свидетельствует наибольшая частота распространения резистентности к пиперациллин/тазобактаму и цефтазидиму, то есть к антибиотикам, разрушаемым хромосомными бета-лактамазами класса С (ингибитор бета-лактамаз тазобактам не способен подавлять функцию этих ферментов). Частота резистентности к цефепиму - цефалоспорину IV поколения, обладающему умеренной устойчивостью к хромосомным бета-лактамазам, ниже. При сопоставлении диаграмм распределения величин МПК очевиден сдвиг в сторону более низких значений для цефепима в сравнении с цефтазидимом (см. рис. 2). Повышение МПК карбапенемов в отношении части штаммов до 4-8 мкг/мл также можно объяснить гиперпродукцией хромосомных бета-лактамаз, однако, высокий уровень устойчивости (особенно к имипенему), вероятно, связан с комбинацией нескольких механизмов. При анализе перекрестной устойчивости между карбапенемами было установлено, что 9 штаммов устойчивы к обоим карбапенемам одновременно, 12 штаммов устойчивы только к имипенему, а 2 устойчивы только к меропенему. Были обнаружены по одному штамму соответственно с избирательной устойчивостью и промежуточным ее уровнем только к имипенему, при сохранении чувствительности ко всем другим изученным антибиотикам. Подобный фенотип может наблюдаться (как было отмечено выше) при снижении экспрессии белка OprD. К крайне неблагоприятным фактам следует отнести высокую частоту устойчивости к ципрофлоксацину, достигающую 44%. О механизмах устойчивости резистентных к нему штаммов можно судить лишь предположительно, скорее всего, речь идет о комбинации нарушений проницаемости внешней мембраны, активации систем активного выброса и о мутациях в генах топоизомераз. В пользу комбинации нескольких механизмов устойчивости говорит и наличие штаммов с высоким уровнем МПК (64 мкг/мл и более). Для аминогликозидных антибиотиков оказались характерными значительные различия в частоте распространения резистентности. Так, если к гентамицину устойчивыми оказались 60% штаммов (причем для большинства из них МПК была равна или превышала 256 мкг/мл), то к амикацину резистентность была выявлена лишь у 10% штаммов. Определенный интерес представлял анализ распространения различных фенотипов резистентности, при этом как единую группу рассматривали устойчивые и промежуточные штаммы. Такой подход с практической точки зрения представляется вполне обоснованным, поскольку при инфекциях, вызванных штаммами с промежуточным уровнем устойчивости, клинический эффект вероятен при формировании в очаге концентраций антибиотиков, существенно превышающих терапевтические, что возможно далеко не всегда. Следует также отметить, что промежуточные штаммы, как правило, обладают детерминантами устойчивости. В целом, из 141 изученного штамма Pa 100 (71%) штаммов обладали детерминантой резистентности хотя бы к одному антибиотику. Наиболее распространенные фенотипы приведены в табл. 3 Таблица 3. Наиболее распространенные фенотипы у изученных штаммов P. aeruginosa Фенотип (антибиотики, к которым выявляли одновременную устойчивость) Число штаммов % Цефтазидим + цефепим + пиперациллин/тазобактам + ципрофлоксацин + гентамицин 25 17,7 Меропенем + имипенем + цефтазидим + цефепим + пиперациллин/тазобактам + ципрофлоксацин + гентамицин 16 11,3 Меропенем + имипенем + цефтазидим + цефепим + пиперациллин/тазобактам + ципрофлоксацин + гентамицин + амикацин 2 1,4 Цефтазидим + цефепим + пиперациллин/тазобактам + гентамицин 6 4,3 Другие фенотипы 51 36,2 Чувствительные штаммы 41 29 На основании полученных данных можно предположить, что в отделениях циркулируют два ведущих клона Pa. Для первого (25 штаммов) характерна устойчивость к цефалоспоринам III-IV поколений и полусинтетическим пенициллинам (скорее всего связанная с гиперпродукцией хромосомных бета-лактамаз класса С) в сочетании с устойчивостью к гентамицину и ципрофлоксацину. Для второго (16 штаммов) характерна дополнительная устойчивость к карбапенемам. Штаммы второго фенотипа сохраняли чувствительность только к амикацину. Из 16 штаммов с высоким или промежуточным уровнем устойчивости к карбапенемам 13 были выделены у пациентов, получавших эти антибиотики. Тот факт, что предшествующая терапия карбапенемами является фактором риска развития инфекций, вызванных штаммами Ра, устойчивыми к этим антибиотикам, хорошо известен. Следует также отметить, что лечение другими беталактамами (в том числе цефалоспоринами III-IV поколений) фактором риска формирования устойчивости к карбапенемам не является [52]. Как уже было отмечено выше, на фоне терапии цефалоспоринами III поколения происходит селекция гиперпродуцентов хромосомных бета-лактамаз, устойчивых к этим антибиотикам, но чувствительных к карбапенемам. Особое беспокойство вызывает выделение 2 штаммов, устойчивых ко всем изученным антибиотикам. Возможность эффективной терапии инфекций, вызванных такими штаммами, в настоящее время представляется сомнительной. Кроме приведенных в табл. 3, был выявлен еще 51 штамм с другими фенотипами резистентности, большинство из которых было представлено 1-2 штаммами, которые, скорее всего, были клонально разнородными. Сопоставление полученных нами данных о частоте распространения антибиотикорезистентности среди Pa с результатами, полученными в других регионах, свидетельствует о значительной вариабельности. Так, среди 150 штаммов, полученных в отделениях интенсивной терапии в Бельгии, частота устойчивости Ра к пиперациллин/тазобактаму, цефтазидиму и цефепиму была на 20-30% ниже, а к имипенему на 20% выше, чем в нашем исследовании. Наиболее активными антибиотиками оказались амикацин, пиперациллин/тазобактам и цефепим [53]. Сходные данные были получены при изучении 615 штаммов, выделенных в отделениях интенсивной терапии в Швейцарии. Было установлено, что к амикацину чувствительны 79,6% штаммов, к карбенициллину - 67,0%, цефтазидиму - 73,4%, ципрофлоксацину - 55,8%, имипенему - 64,1%, пиперациллину 88,1%, пиперациллин/тазобактаму - 92,4% [54]. В нашем исследовании частота чувствительности к пиперациллин/тазобактаму и цефтазидиму оказалась намного ниже, а к имипенему существенно выше, самыми активными антибиотиками оказались меропенем и амикацин. Сообщается, что среди штаммов Pa, выделенных в Северной Америке, частота устойчивости к карбапенемам была несколько ниже и составила 4,2% для меропенема и 12.5% для имипенема [55]. Как и в нашем исследовании, карбапенемы оказались наиболее активными антибиотиками. Представление о том, что микрофлора больных, находящихся в отделениях интенсивной терапии, онкологии и гематологии закономерно отличается высоким уровнем резистентности, опровергается данными, полученными в Австралии и Новой Зеландии. Так, среди 246 штаммов Ра от больных из отделений перечисленного профиля чувствительными к цефтазидиму были 88% штаммов, цефпирому - 73%, пиперациллин/тазобактаму - 70%, имипенему - 85%, ципрофлоксацину - 89% и даже к гентамицину - 81% [56]. Уместно напомнить, что в нашем исследовании чувствительными к гентамицину были лишь 39% штаммов. Такие выраженные колебания в распространении резистентности можно объяснить лишь принципиальными различиями в политике применения антибиотиков. Приведенные соображения, по нашему мнению, однозначно свидетельствует о невозможности разработки универсальных рекомендаций по эмпирической терапии инфекций, вызванных Pa, не учитывающих данных локального мониторинга антибиотикорезистентности. Этиотропная терапия инфекций, вызванных Pa Изложенные выше факты об особенностях биологии микроорганизма, уровне его природной устойчивости и распространении приобретенной резистентности к антибиотикам объясняют причины значительных сложностей этиотропной терапии инфекций, вызванных Pa. Одним из ключевых является вопрос о предпочтении комбинированной или монотерапии. До конца 60-х годов инфекции, вызванные Pa, практически всегда были летальными, существенного улучшения в результатах лечения не произошло и после внедрения в клиническую практику схем монотерапии гентамицином или карбенициллином [57]. Причем неудачи лечения наблюдали и в тех случаях, когда возбудитель был чувствителен к этим антибиотикам. Выявление в экспериментах in vitro синергизма в отношении Pa между аминогликозидами и беталактамами [58] и подтверждение этого факта при экспериментальных инфекциях [59] послужило основанием для широкого внедрения терапии карбенициллином в сочетании с аминогликозидами [60]. Последующее появление более активных антипсевдомонадных препаратов, таких как цефалоспорины III-IV поколений, фторхинолоны и карбапенемы, вновь стимулировало интерес к сравнительной оценке эффективности комбинированной и монотерапии инфекций, вызванных Pa. К сожалению, рандомизированных проспективных исследований, посвященных сравнению эффективности при тяжелых Pa-инфекциях схем комбинированной и монотерапии, в доступной литературе обнаружить не удалось. Результаты единичных проспективных нерандомизированных исследований противоречивы [20, 61]. Большинство данных об эффективности лечения псевдомонадных инфекций были получены в клинических испытаниях, направленных на сравнение эффективности схем лечения тяжелых инфекций различной локализации или лихорадки на фоне нейтропении. Псевдомонадную этиологию инфекций выявляли лишь у незначительной части пациентов, включенных в такие испытания. К наиболее популярным схемам лечения псевдомонадных инфекций относятся схемы, основанные на комбинации цефтазидима с аминогликозидными антибиотиками (чаще всего с амикацином). Комбинацию цефтазидим + амикацин более всего используют в качестве эталонной схемы при оценке эффективности новых схем и препаратов. В качестве примера можно привести ряд исследований. Так, меропенем при септицемии оказался равным по эффективности как с комбинацией цефтазидим + амикацин, так и с цефтазидимом как средством монотерапии [62]. При ИВЛ-ассоциированной пневмонии равной эффективностью обладали комбинации цефтазидим + амикацин и пиперациллин/тазобактам + амикацин [63]. При нозокомиальных инфекциях различной локализации меропенем был равен по эффективности имипенему [64]. В нерандомизированном исследовании была показана равная эффективность монотерапии цефтазидимом и меропенемом Pa-инфекции на фоне муковисцидоза [65]. При отсутствии данных сравнительных рандомизированных проспективных испытаний определенную ценность могут иметь другие типы исследований. Так, в одной из недавних работ был проведен ретроспективный анализ зависимости летальности при бактериемии, вызванной Pa, от адекватности антибактериальной терапии (адекватность оценивали по результатам изучения антибиотикочувствительности). Монотерапию уреидопенициллинами или аминогликозидами не расценивали как адекватное лечение, даже если возбудитель оказывался чувствительным ко всем антибиотикам. К адекватной терапии относили монотерапию карбапенемами, фторхинолонами, цефалоспоринами III поколения, комбинированную терапию антипсевдомонадными пенициллинами и аминогликозидами, при чувствительности возбудителя ко всем антибиотикам. Оказалось, что если эмпирическая терапия была адекватной или ее корректировка по результатам бактериологического исследования была проведена в течение первых 2-4 дней, то общая летальность составила 26-27%, а непосредственно связанная с инфекцией - 17%. В случае неадекватной терапии летальность составляла соответственно 48 и 45% [66]. В проспективном исследовании 2124 случаев бактериемии было установлено, что комбинированная терапия беталактамами и аминогликозидами не проявляла преимуществ в сравнении с монотерапией беталактамами, исключением были случаи инфекций на фоне нейтропении и инфекций, вызванных Pa [67]. Таким образом, следует признать, что при инфекциях, вызванных Pa, комбинированная терапия, вероятно, предпочтительнее монотерапии, исключение могут составить карбапенемные антибиотики (в первую очередь, меропенем, как обладающий наибольшей активностью). Однако повсеместно наблюдаемое нарастание частоты устойчивости Pa к карбапенемам требует взвешенного подхода к их назначению. Эти антибиотики целесообразно резервировать для эмпирической терапии тяжелых и крайне тяжелых инфекций, при наличии подозрений о их псевдомонадной этиологии, либо для случаев выделения микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам других групп. Следует иметь в виду, что длительное лечение тяжелых Ра-инфекций антибиотиками разных групп может привести к формированию штаммов микроорганизма, устойчивых ко всем известным антипсевдомонадным препаратам [68]. В целом, хотя определенный прогресс в антибактериальной терапии тяжелых госпитальных инфекций, вызванных Pa, очевиден, частота неудач остается крайне высокой. Складывается впечатление, что современные представления о патогенезе этой патологии не учитывают какие-то существенные особенности, возможно, что микроорганизм обладает еще не обнаруженными факторами вирулентности, которые в будущем могут служить мишенями специфической терапии. АНТИБИОТИКИ И ХИМИОТЕРАПИЯ, 1999-N3, стр. 25-34. ЛИТЕРАТУРА 1. Vincent J.L. The prevalence of nosocomial infection in intensive care units in Europe: Results of the European prevalence of infection in intensive care (EPIC) study. JAMA 1995; 274: 8; 639-644. 2. Gillardi G.L. Pseudomonas and related genera. In: Manual of clinical microbiology. 5th ed. Balows A., ed. Washington DC. 1991; 429-441. 3. Palleroni N.J. Family I: Pseudomonadaceae. In: Bergey's manual of systematic bacteriology. Kraig N.R., Holt J.G. (Eds.). Baltimore 1984; 1: 141-219. 4. Stock J.B., Ninfa A.J., Stock A.M. Protein phosphorylation and regulation of adaptive response in bacteria. Microbiol Rev 1989; 53: 450-490. 5. Frank D.W., Iglewski B.H. Cloning and sequence analysis of a transregulatory locus required for exoenzyme S synthesis in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 1991; 173: 6460-6468. 6. Hobbs M., Collie E.S.R., Free P.D. et al. PilS and PilR, a two-component transcriptional regulatory system controlling expression of type 4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol 1993; 7: 669- 682. 7. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E. P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators. J Bacteriol 1994; 176: 269-275. 8. Pesci E.C., Inglewski B.H. The chain of command in Pseudomonas quorum sensing. Trends Microbiol 1997; 24: 132-134. 9. Yahr T.L., Mende-Mueller L.M., Friese M.B., Frank D.W. Identification of type III secreted products of the Pseudomonas aeruginosa exoenzyme S regulon. J Bacteriol 1997; 179: 7165-7168. 10. Kadurugamuwa J.L, Beveridge T.J. Natural release of virulence factors in membrane vesicles by Pseudomonas aeruginosa and the effect of aminoglycoside antibiotics on their release. J Antimicrob Chemother 1997; 40: 615-621. 11. Talon D., Mulin B., Rouget C. et al. Risks and routes for ventilator-associated pneumonia with Pseudomonas aeruginosa. Amer J Resp Crit Care Med 1998; 157: 978-984. 12. Fagon J.Y, Chastre J, Domart Y. et. al. Mortality due to ventilator-associated pneumonia or colonisation with Pseudomonas or Acinetobacter species: Assessment by quantitative culture of samples obtained by a protected specimen brush. Clin Infect Dis 1996; 23: 538-542. 13. Falagas M.E., Barefoot L., Griffith J. et. al. Risk factors leading to clinical failure in the treatment of intraabdominal or skin/soft tissue infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1996; 15: 913-921. 14. Fluit A. C., Jones M. E., Schmitz F.-J. et. al. Antimicrobial Resistance among clinical blood isolates in Europe: results from the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program 1997. Therapy. 38th Interscience Conference on antimicrobial agents and chemotherapy. Sept. 24-27, 1998, San Diego 1998; Abst. E-86. 15. Baltch A.L., Griffin P.E. Pseudomonas aeruginosa bacteremia: a clinical study of 75 patients. Am J Med Sci 1977; 274: 119-120. 16. Bodey G.P., Jadeja L., Elting L. Pseudomonas bacteremia: Retrospective analysis of 410 episodes. Arch Intern Med 1985; 145: 1621-1629. 17. McKendrick M.W., Geddes A.M. Pseudomonas septicaemia in general hospital: seven years' experience. Quart J Med 1981; 199: 331-344. 18. Lechi A., Arosio E., Pancera P. et al. Pseudomonas septicaemia. A review of 60 cases observed in a university hospital. J Hosp Infect 1984; 5: 29-37. 19. Gallaghar P.G., Watanakunakorn C. Pseudomonas bacteremia in a community teaching hospital, 1980 - 1984. Rev Infect Dis 1989; 11: 846-852. 20. Hilf M., Yu V.L., Zuravleff J.J. et al. Antibiotic therapy for Pseudomonas aeruginosa bacteremia: outcome correlation in a prospective study of 200 patients. Am J Med 1989; 87: 540546. 21. Mallolas J., Gatell J.M., Miro J.M. et al. Prognostic factors for Pseudomonas aeruginosa bacteremia [Letter]. Am J Med 1991; 90: 134-134. 22. Vidal F., Mensa J., Almela M. et al. Epidemiology and outcome of Pseudomonas aeruginosa bacteremia, with special emphasis on the influence on antibiotic treatment. Analysis of 198 episodes. Arch Intern Med 1996; 156: 2121-2126. 23. Laughlin T.J., Armstrong D.G., Caporusso J., Lavery S.A. Soft tissue and bone infection from puncture wounds in children. West Med J 1997; 166: 126-128. 24. Pedersen H.B., Rosborg J. Necrotizing external otitis: aminoglycoside and beta-lactam treatment combined with surgical treatment. Clin Otolaryngol 1997; 22: 271-274. 25. Yoshida E., Nakae T. Identification of porin in the outer membrane of Pa that forms small diffusion pores. J Biol Chem 1989; 264: 6297- 6301. 26. Nikaido H., Nikaido K., Harayama S. Identification and characterization of porins in Pseudomonas aeruginosa. J Biol Chem 1991; 266: 770-779. 27. Bellido F., Martin N.L., Siehnell R.J., Hancock R.E.W. Reevaluation, using intact cells, of the exclusion limit and role of porin OprF in Pseudomonas aeruginosa outer membrane permeability. J Bacteriol 1992; 174: 5196-5203. 28. Nikaido H., Hancock R.E.W. Outer membrane permeability in Pseudomonas aeruginosa. In: The bacteria. Sokatch J. ed. Orlando 1986; 10: 145-193. 29. Huang H., Hancock R.E.W. Genetic definition of the substrate selectivity of Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin protein Opr D. J Bacteriol 1993; 175: 7793-7800. 30. Trias J., Nikaido H. Protein D2 channel of the Pseudomonas aeruginosa outer membrane has a binding site for amino acids and peptides. J Biol Chem 1990; 265: 15680-15684. 31. Watanabe N.A. Newer antipseudomonal cephalosporines. J Chemother 1996; 8: Suppl. 2: 4856. 32. Livermore D.M. -lactamases in laboratory and clinical resistance. Clin Microbiol Rev 1995 ; 8: 557 - 584. 33. Nikaido H., Thanassi D.G. Penetration of lipophilic agents with multiple protonation sites into bacteria cells; tetracyclines and fluoroquinolones as examples. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37: 1393-1399. 34. Poole K., Krebes K., McNally C., Neshat S. Multiple antibiotics resistance in Pseudomonas aeruginosa: evidence for involvement of an efflux operone. J Bacteriol 1993; 175: 7363-7372. 35. Ednie L.M., Jacobs M.R., Appelbaum P.C. Comparative activities of clinafloxacin against gram-positive and -negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother 1998; 42: 1269-1273. 36. Srikumar R., Li X. Z., Poole K. Inner membrane efflux components are responsible for betalactam specificity of multidrug efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol 1997; 179: 24: 7875-7881. 37. Hancock R.E.W., Bell A. Antibiotic uptake in Gram-negative bacteria. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1988; 7: 713-720. 38. Bush K., Jacoby G.A., Medeiros A.A. A functional classification scheme for -lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrob Agents Chemother 1995; 39: 1211-1233. 39. Senda K., Arakawa Y., Nakashima K. et al. Multifocal outbreaks of metallo-beta-lactamaseproducing Pseudomonas aeruginosa resistant to broad-spectrum beta-lactams, including carbapenems. Antimicrob Agents Chemother 1966; 40: 349-353. 40. Lee K., Chong Y., Shin H.B., Yong D. Rapid increase of imipenem-hydrolyzing Pseudomonas aeruginosa in a Korean Hospital. 38th Intersci Conf on Antimicrob Agents Chemother Sept. 24-27, 1998. San Diego1998; Abst. E-85. 41. Hawkey P.M., Chanawong A., Lulitanond A. et al. SHV-5 extended-spectrum -lactamase from Pseudomonas aeruginosa in Thailand. Ibid. Abst. C-174a. 42. Edwards J.R. Meropenem: a microbiological overview. J Antimicrob. Chemother 1995; 36: Suppl. A, 1-17. 43. Ziha-Zarifi I., Llanes C., Kohler T., Plesiat P. In vivo emergence of multidrug-resistant mutants of Pseudomonas aeruginosa-overexpressing the MexA-MexB-OprM-efflux system. 38th Interscience Conf. Antimicrob. Agents and Chemother Sept. 24-27, 1998, San Diego, California. Am Soc Microbiol 1998; Abst. C-128. 44. Kohler T., Michea-Hamzehpour M., Epp S.F., Pechere J-C. Carbapenem activity in Pseudomonas aeruginosa: respective contribution of OprD and efflux systems. Ibid; 1998; Abst. C127. 45. Miller G.H. Nature and rate of aminoglycoside resistance mechanisms. Clin Drug Invest 1996; 12: Suppl. 1: 1-12. 46. Roca J. The mechanisms of DNA topoisomerases. Trends Biochem Sci 1995; 20: 156-160. 47. Drlica K., Zhao X. DNA gyrase, topoisomerase IV, and 4-quinolones. Microbiol Molec Biol Rev 1997; 61: 377-292. 48. Nakano M., Deguchi T., Kawamura T. et al. Mutations in the gyrA and parC genes in fluoroquinolone-resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41: 2289-2291. 49. Kohler T, Micheahamzehpour M., Plesiat P., Kahr A.L., Pechere J.C. Differential selection of multidrug efflux systems by quinolones in Pseudomonas aeruginosa. Ibid: 2540-2543. 50. Lomovskaya O., Lee A., Mistry A. et al. Multidrug resistance pumps as important targets for antibacterial therapy. 38th Intersci Conf Antimicrob Agents Chemother Sept. 24-27 1998, San Diego. 1998; Abst. C-120. 51. National Committee for Clinical Laboratory Standards. (1997). Method for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard M7-A4, 4th ed. NCCLS, Villanova, PA. 52. Troillet N, Samore M.H., Carmeli Y. Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa: Risk factors and antibiotic susceptibility patterns. Clin Infect Dis 1997; 25: 5: 1094-1098. 53. Pierard D., Emmerechts K., Lauwers S. Comparative in vitro activity of cefpirome against isolates from intensive care and haematology/oncology units. J Antimicrob Chemother 1998; 41: 443-450. 54. Bonfiglio G., Laksai Y., Franceschini N. et al. In vitro activity of piperacillin/tazobactam against 615 Pseudomonas aeruginosa strains isolated in intensive care units. Chemotherapy 1998; 44: 305-312. 55. Iaconis J.P., Pitrin D.H., Sheikh W., Nadler H.L. Comparison of antibacterial activities of meropenem and six other antimicrobial agents against Pseudomonas aeruginosa isolates from North American studies and clinical trials. Clin Infect Dis 1977; 24: Suppl. 2: 191-196. 56. Fernandes C., Pritchard R., Morris A., Benn R. In vitro evaluation of cefpirome: an Australian study of isolates from intensive care unit and hematology/oncology patients. Diagn Microbiol Infect Dis 1998; 30: 493-495. 57. Andriole V.T. Pseudomonas bacteremia: can antibiotic therapy improve survival? J Clin Lab Med 1979; 94: 196-200. 58. Weinstein R.J., Young L.S., Hewitt W.L. Comparison of methods for assessing in vitro antibiotics synergism against Pseudomonas and Serratia. J Clin Lab Med 1975; 86: 853-862. 59. Khakoo R.A., Kluge R.M. Effectiveness of carbenicillin and gentamicin in a rat model against infection with Pseudomonas aeruginosa resistant to gentamicin or gentamicin and carbenicillin. J Antimicrob Chemother 1979; 5: 53-59. 60. Baltch A.L., Smith R.P. Combination of antibiotics against Pseudomonas aeruginosa. Am J Med 1985; 79: Suppl. 1A: 8-16. 61. Bodey G.P., Feld R., Burgess M.A. Beta-lactam antibiotics alone or in combination with gentamicin for therapy of gram-negative bacillary infections in neutropenic patients. Am J Med Sci 1976; 271: 179- 186. 62. Solberg С. O., Sjursen H. Safety and efficacy of meropenem in patients with septicaemia: A randomised comparison with ceftazidime, alone or combined with amikacin. J Antimicrob Chemother 1995; 36: Suppl. A: 157-166. 63. Brun-Buisson C, Sollet J.P., Schweich H. et al. Treatment of ventilator-associated pneumonia with piperacillin-tazobactam/amikacin versus ceftazidime/amikacin: A multicenter, randomised controlled trial. Clin Infect Dis 1998; 26: 346-354. 64. Garau J, Blanquer J., Cobo L. et al. Prospective, randomised, multicenter study of meropenem versus imipenem/cilastatin as empiric monotherapy in severe nosocomial infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1997; 16: 789-796. 65. Byrne S., Maddison J., Connor P. et al. Clinical evaluation of meropenem versus ceftazidime for the treatment of Pseudomonas spp infections in cystic fibrosis patients. J Antimicrob Chemother 1995; 36: Suppl. A: 135-143. 66. Siegman-Igra Y., Ravona R., Primerman H., Giladi M. Pseudomonas aeruginosa bacteremia: An analysis of 123 episodes, with particular emphasis on the effect of antibiotic therapy. Intern J Infect Dis 1998; 2: 211-215. 67. Leibovici L, Paul M., Poznanski O. et al. Monotherapy versus beta-lactam-aminoglycoside combination treatment for gram-negative bacteremia: A prospective, observational study. Antimicrob Agents and Chemother 1997; 41: 5: 1127-1133. 68. Denhollander J.G., Horrevorts A.M., Vangoor M.L.P.J. et. al. Synergism between tobramycin and ceftazidime against a resistant Pseudomonas aeruginosa strain, tested in an in vitro pharmacokinetic model. Ibid; 95-100.