Получение полистирольных суспензий с карбоксильными
advertisement
УДК 54.057 ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИСТИРОЛЬНЫХ СУСПЕНЗИЙ С КАРБОКСИЛЬНЫМИ ГРУППАМИ НА ПОВЕРХНОСТИ ЧАСТИЦ ДЛЯ СОЗДАНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ- СИСТЕМ НА САЛЬМОНЕЛЛЕЗ Н.А. Лобанова1*, И.А. Грицкова1, Н.И. Прокопов1, Н.С. Серхачева1, А.Н. Лобанов2, Я.М. Станишевский2 1 – Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова», 119571, Россия, г. Москва, проспект Вернадского, д.86, 2 - Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов», 117198, Россия, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6. *Тел. 8(916)6727685. E-mail: lavanda20002000@yandex.ru Резюме. В статье показана возможность синтеза полистирольных микросфер с узким распределением частиц по размерам со средними диаметрами 0,5 и 0,7 мкм при полимеризации стирола в присутствии полибутадиена со степенью карбоксилирования 13% и 17% в качестве стабилизатора. На основе полученных микросфер разработаны латексные сальмонеллезные диагностикумы, сочетающие высокую активность и специфичность. Ключевые слова: гетерофазная полимеризация, полистирол, латексные диагностикумы. OBTAINING POLYSTYRENE SUSPENSIONS WITH CARBOXYL GROUPS ON THE SURFACE OF THE PARTICLES TO CREATE A DIAGNOSTIC TEST SYSTEMS FOR SALMONELLOSIS N.A. Lobanova1*, N.S. Serhacheva1, A.N. Lobanov2, Y.M. Stanishevskiy2 1 - Federal State Educational Institution of Higher Professional Education «Moscow State University of Fine Chemical Technology named after M.V. Lomonosov», 119571, Russia, Moscow, Vernadsky Avenue, 86, 2 - Federal State Educational Institution of Higher Professional Education « Peoples' Friendship University of Russia », 117198, Russia, Moscow, Miclucho-Maclay str., 6. Abstract. The article describes the possibility of synthesizing polystyrene microspheres with a narrow particle size distribution with mean diameters of 0.5 and 0.7 microns in the polymerization of styrene in presence of polybutadiene with a degree of carboxylation of 13% and 17% as stabilizer. The obtained latex microspheres designed Salmonella diagnostic tools that combine the high activity and specificity. Keywords: heterophase polymerization, polystyrene, latex diagnosticum. ВВЕДЕНИЕ Проблема синтеза полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам является актуальной, поскольку область их практического применения чрезвычайно широка. Они используются в качестве калибровочных эталонов в электронной и оптической микроскопии и светорассеивании, для определения размера пор фильтров и биологических мембран, в качестве модельных коллоидов, для исследования кинетики и механизма пленкообразования из латексов, а также в качестве полимерных носителей биологических лигандов в иммунохимических исследованиях [1]. Трудность синтеза полимерных суспензий с узким распределением частиц по размерам состоит в выборе ПАВ (поверхностно-активное вещество) и условий формирования эмульсий, обеспечивающих образование полимерномономерных частиц по одному механизму и устойчивость полимерной суспензии в процессе полимеризации. Перспективным оказался предложенный недавно синтез полимерных микросфер с диаметрами полимерных микросфер в требуемом диапазоне значений и узким распределением частиц по размерам в присутствии нерастворимых в воде ПАВ. Отличительной особенностью синтеза полимерных микросфер в присутствии нерастворимых в воде ПАВ является их высокая устойчивость с момента образования до полной конверсии мономера, обусловленная формированием прочного межфазного адсорбционного слоя на их поверхности. Механизм образования этого слоя основан на фазовой несовместимости ПАВ и образующегося полимера, и формировании структурно-механического фактора по Ребиндеру [2]. Этот новый научный подход к получению полимерных микросфер с узким распределением частиц по размерам является актуальным и требует дальнейшего развития как с точки зрения поиска новых типов доступных ПАВ, так и новых путей формирования межфазных слоев на поверхности частиц с подобными свойствами. Одним из путей решения этой проблемы может быть полимеризация мономеров в присутствии полимеров, несовместимых с образующимися в процессе полимеризации, в качестве стабилизаторов. Таким образом, целью работы являлся синтез полистирольных полимерных микросфер с узким распределением частиц по размерам в присутствии полибутадиена, несовместимого с образующимся в процессе полимеризации полимером, и обеспечивающим устойчивость полимерных суспензий на всех стадиях их синтеза и применения. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Полимеризацию стирола проводили в дилатометрах при 70 оС и объемном соотношении фаз мономер/вода 1:9 соответственно. В качестве инициатора использовали персульфат калия (концентрация 1% в расчете на мономер), а стабилизатора частиц - полибутадиен со среднемассовой молекулярной массой 1000 и степенью карбоксилирования 13% и 17%. Исходные реагенты: Стирол, Aldrich, 99%, очищали от стабилизатора 5%-ным водным раствором гидроксида натрия, промывали водой до нейтральной реакции, сушили над прокаленным хлористым кальцием и дважды перегоняли в вакууме. Использовали фракцию, кипящую при 41°С (2.1 кПа), d420=0,906 г/см, nD20=1,5450. Персульфат калия, Sigma Aldrich, 99,9%. Гидроксид калия, ГОСТ 24363-80 (1 изм.) Полибутадиен - (среднемассовая ММ = 1000 Да) с разной степенью карбоксилирования, полученный в лаборатории ИОХ им. Н.Д.Зелинского. Вода, бидистиллят Жидкий азот – технический продукт, использовали для дегазирования.2.2. Синтез карбоксилированного полибутадиена проводили путем каталитического карбонилирования окисью углерода. В опытах использовался полибутадиен со среднемассовой молекулярной массой 1000 и степенью карбоксилирования 13% и 17%. Эксперименты проводились в автоклаве из нержавеющей стали с фторопластовыми вкладышами и магнитной мешалкой. Схема автоклава представлена на рисунке 1. Давление окиси углерода 50–60 атм., температура 90–150оС. Во вкладыш помещали: 1,410-2 моль полибутадиена, 7,810-5 моль PdCL2(PPh3)2, 8,610-4 моль PPh3, 6,0–12,0 мл CH2Cl2, 0,3–0,45 мл H2O. Соотношение полимер/катализатор можно варьировать. Структуру исходного полибутадиена определяется методом ИК– спектроскопии. Для определения наличия карбоксильных групп на поверхности частиц снимали спектры полимерных пленок на спектрофотометре IR–435 “Shimadzu” (Япония) и регистрировали поглощение в области 1500–2000 см-1. Характеристический пик поглощения карбонильной группы соответствует 1720–1760 см-1. Пик может быть расщеплен в случае, когда карбонилирование протекает и по третьему и по четвертому атому углерода. Продукт высушивали лиофильной сушкой и хранили в виде раствора в хлористом метилене. рис. 1. Автоклав для гидрокарбоксилирования полибутадиена 1 корпус автоклава 6 фторопластовый стакан 2 крышка автоклава 7 канал для подвода газа 3 канал для термопары 8 канал для отбора пробы 4 канал для показывающей 9 канал для манометра термопары 5 фторопластовое уплотнительное 10 магнитная мешалка 11 печка кольцо Для оценки распределения частиц полимерной суспензии по размерам использовали фотонный анализатор частиц Zetasizer NanoZS фирмы «Malvern» (Великобритания), с диапазоном измерений частиц от 0,6 до 6000 нм. Рабочий интервал температур составляет 2 оС – 120 оС, концентрации 0,1 мг/мл до 40%, угол детектирования рассеянного света 173º, в качестве источника света используется гелий-неоновый лазер с длинной волны 633 нм, мощность источника света 5 мВт. Прибор определяет размеры частиц при помощи измерения скорости флуктуации рассеянного света частицами. Измерение проводили в автоматическом режиме по стандартной методике [3]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИК-спектр и микроструктура исходного полибутадиена приведены на рисунке 2 и в таблице 1. Рис. 2. ИК–спектр исходного полибутадиена ( Mw = 1 000). Таблица 1. Микроструктура исходного полибутадиена Микроструктура Mw 1000 1,4–цис звенья 44% 1,4–транс звенья 29% 1,2 звенья 27% Карбоксилирование полибутадиена проводили в автоклаве по методике, описанной ранее. Наличие в полимерах карбоксильных групп подтверждается ИК–спектрами (рисунок 3) в области 1500–2000 см-1. В отличие от ИК–спектра исходного полибутадиена (рисунок 2) на спектре КПБ (карбоксилированного полибутадиена) появляется пик в области 1720–1760 см-1, характерный для карбонильной группы (>С=О). В данном случае пик расщеплен, так как карбонилирование идет равновероятно по 3 или 4 атому углерода: В таблице 2 представлены условия получения и свойства, используемых в работе карбоксилированных полибутадиенов. Видно, что степень карбоксилирования, определяемая как количество прореагировавших двойных связей исходного полибутадиена, можно варьировать в широком диапазоне от 10% до 60%. Можно отметить, что возрастание температуры, времени карбоксилирования и количества катализатора, приводит к возрастанию степени карбоксилирования. А Б Рис. 3. ИК–спектр карбоксилированного полибутадиена (А)- степень карбоксилирования – 17%, (Б) - степень карбоксилирования – 13%. Таблица 2. Условия получения и свойства КПБ. Маркировка Исходный Количество полибутадиен, катализатора, Mw , Кп Температура, о С Время, Степень час карбоксили- моль/моль рования, % мономерных звеньев КПБ–10–1 КПБ–13–1 КПБ–17–1 Mw 10 3 Кп=2 КПБ–60–1 310-4 120 2,5 10 310-4 122 3 13 1,210- 136 4 17 140 3 60 4 110-3 Степень карбоксилирования, варьировали в широком диапазоне значений от 10% до 60%, изменяя температуру, время и количество катализатора. Было исследовано влияние на протекание полимеризации добавки карбоксилированного полибутадиена, обладающего хорошей растворимостью в водных растворах щелочи (степень карбоксилирования около 60%). Скорость полимеризации при использовании водорастворимых КПБ намного превышает скорость полимеризации при использовании маслорастворимых КПБ. Так, для КПБ со степенью карбоксилирования 60% и концентрацией в водной фазе 1%, скорость полимеризации составляет 3,1%/мин, в то же время, для КПБ со степенью карбоксилирования 17% и концентрацией 10% в мономерной фазе, скорость полимеризации равна 0,45%/мин. Но при полимеризации в присутствии КПБ с высокой степенью карбоксилирования не удавалось получить полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам. Они оказались перспективными в качестве ПАВ для суспензионной полимеризации стирола и метилметакрилата. Полимеры с высокой степенью карбоксилирования (60%), обладающие хорошей растворимостью в водных растворах щелочей и практически нерастворимые в мономере (стирол), в дальнейших исследованиях не использовались. Исследования были начаты с синтеза полимерных суспензий в присутствии КПБ со среднемассовой молекулярной массой 1000 и степенью карбоксилирования 13%. На рисунках 4 и 5, синтезированных приведены микрофотографии и гистограммы полимерных суспензий. Полученные полимерные микросферы имели размер в пределах 0,5–0,7 мкм и коэффициент вариации 3– 6%. Определенной зависимости между концентрацией КПБ и размером микросфер не наблюдается (рисунок 6). Можно отметить, что с увеличением диаметра микросфер возрастает коэффициент вариации: от 11% (при среднем диаметре частиц 515 нм) до 42% (при среднем диаметре частиц 722 нм). (1) (2) Рис. 4. Микрофотографии полистирольных суспензий, синтезированных в присутствии КПБ со степенью карбоксилирования 13% (1) и КПБ со степенью карбоксилирования 17% (2) (1) Рис.5. Гистограмма распределения частиц по размерам полистирольной суспензии, полученной в присутствии КПБ со степенью карбоксилирования 13% (1) и 17% (2). (2 Рис. 6. Зависимость среднего диаметра частиц и коэффициента вариации от концентрации КПБ. Полистирольные микросферы с карбоксильными группами на поверхности (диаметром ~ 0,7 мкм), полученные методом гетерофазной полимеризации в присутствии КПБ со среднемассовой молекулярной массой 1000 и степенью карбоксилирования 13% были использованы в качестве носителей биолигандов для создания диагностических тест-систем на сальмонеллез. Перед использованием латексную суспензию в концентрации 2-4% подвергали обработке в ультразвуковом диспергаторе в течение 3-5 минут с целью устранения агломератов. Из всех испытанных буферных систем наилучшие результаты были получены при использовании глицинового буфера с рН 8,2-8,4. Оптимальным способом очистки иммуноглобулинов является метод с использованием ДЭАЭ-сефадекса А-50. При использовании метода физической адсорбции ПМ (полимерные микросферы) взаимодействуют с антителами за счет сил электростатического и гидрофобного взаимодействия. В результате проведенных исследований установлено, что методом физической адсорбции не удалось получить стабильные латексные диагностикумы. Известно, что при физической адсорбции в Основными системе протекают процессами, различные оказывающими динамические влияние на процессы. стабильность диагностикумов, полученных методом физической адсорбции, являются процессы десорбции белковых молекул, а также замена одних белковых молекул на другие, или обмен на такие же молекулы. Следствием этого является зависимость адсорбированного слоя от времени и присутствие в системе белковых молекул с измененной конформацией, что обусловливает быстрое снижение чувствительности полученных препаратов. Метод химической активации функциональных групп ПМ позволял получить более прочную и долговременную ковалентную связь носителя с антителами, а также обеспечивал оптимальную адсорбцию антител на поверхности ПМ, по сравнению с физической адсорбцией. Одностадийный метод активации с использованием ВРК (водорастворимые карбодиимиды) и двухстадийный метод «активированных» эфиров при подборе оптимальных физико-химических параметров давали хорошие результаты. При использовании для активации функциональных групп водорастворимых карбодиимидов, время активации 10–15 минут при постоянном перемешивании и температуре 4–6С. Время сенсибилизации ПМ антителами составляло 1,5–2 часа при температуре 4–6С при постоянном перемешивании. Затем диагностикум выдерживали 10–14 часов при температуре 4С. Конечная концентрация диагностикума составляла 2%. К преимуществам данного способа следует отнести его простоту. Однако, из-за того, что белковые молекулы содержат как карбоксильные, так и аминогруппы, возможно протекание меж– и внутримолекулярного сшивания, что снижает использовании биохимическую данного активность способа лиганда. возможны Кроме значительные того, при изменения ориентации и конформации белковых молекул, т.к., они являются высоко динамичными структурами, что может привести к неспецифической агглютинации. В значительной степени этот недостаток устраняется путем использования двухстадийного метода активации. На первой стадии карбоксильные группы переводили в активную (но стабильную) форму и ПМ отделяли методом фильтрования через мембранные дисперсионной среды с фильтры с диаметром пор 0,45 мкм от оставшимися в ней непрореагировавшими компонентами, а на второй стадии проводили ковалентное связывание с иммуноглобулинами. При этом использовали гидроксисукцинимид и ВРК в соотношении – 2:1 (по массе). Реактивы к суспензии ПМ добавляли порционно, на встряхивателе. Активация протекала в течение 30 минут при постоянном перемешивании и температуре 4-6С. Активированные таким образом ПМ отмывали фильтрованием от избытка реагентов. Сенсибилизацию ПМ осуществляли в течение 2,5-3 часов на встряхивателе при температуре 4-6С. Диагностикум дополнительно выдерживали 18-20 часов при 4-6С. Итоговая концентрация диагностикума составляла 2%. Концентрацию адсорбированного иммуноглобулина определяли измерением оптической плотности исходного раствора иммуноглобулина и оптической плотности фильтрата, содержащего несвязавшиеся иммуноглобулины на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Количество адсобированных на поверхности ПМ иммуноглобулинов составляла 90 мкг/см3 2%-ной суспензии ПМ. Для блокады несвязавшихся активных групп весьма удачным оказалось использование 0,5М раствора глицина в течение 20-30 минут при постоянном перемешивании. Однако, при подборе оптимальной концентрации иммуноглобулинов или антител, необходимость в блокаде свободных активных групп может отпадать. При получении латексных диагностикумов двухстадийным методом «активированных» эфиров, чувствительность препаратов была выше, чем при использовании одностадийного метода с применением водорастворимых карбодиимидов и составляла 106 м.к./см3. Проверку специфичности полученных поливалентных и монорецепторных сальмонеллезных агглютинации) диагностикумов на стекле с проводили чистыми в РЛА культурами (реакции латекс- микроорганизмов гомологичных и гетерологичных родов и видов. Параллельно ставили необходимые контроли. Результаты приведены в таблицах 3, 4 и 5. Таблица 3. Результаты проверки специфичности поливалентного сальмонеллезного диагностикума Наименования культур Контроль Контроль- микроорганизмов (109 м. к./см3) (физ.р-р) ный пре- 1* 2** парат 1 2 3 4 5 1. Salmonella london - - + - 2. Salmonella infantis - - + - 3. Salmonella dublin - - + + 4. Salmonella anatum - - + - 5. Salmonella gallinarum (pullorum) - - + + 6. Salmonella enteritidis - - + + 7. Salmonella virchow - - + - 8. Salmonella choleraesuis - - + - 9. Salmonella typhimurium - - + - «+» – положительный результат реакции «-» – отрицательный результат реакции 1* – поливалентный сальмонеллезный диагностикум 2** – монорецепторный сальмонеллезный диагностикум к группе D При проверке использованием специфичности гетерологичных диагностических культур семейства тест-систем с Enterobacteriaceae перекрестных реакций отмечено не было. При РЛА с гомологичными культурами микроорганизмов наблюдали образование хорошо видимых агглютинатов с просветлением фона. Чувствительность полученных диагностикумов оценивали в РЛА с разведениями чистых культур микроорганизмов гомологичных видов в концентрации от 109 до 104 м.к./см3. Таблица 4. Проверка чувствительности поливалентных сальмонеллезных диагностикумов Наименование Контроль культур (физ р-р) Концентрация микроорганизмов, м.к./см3 109 108 107 5х106 106 105 1.Salmonella dublin - + + + + - - 2.Salmonella anatum - + + + + - - 3.Salmonella gallinarum - + + + + - - 4.Salmonella enteritidis - + + + + - - 5.Salmonella virchow - + + + + - - 6.Salmonella choleraesuis - + + + + - - 7. Salmonella typhimurium - + + + + - - (pullorum) «+» – положительный результат реакции «–» – отрицательный результат реакции Таблица 5. Проверка чувствительности монорецепторных диагностикумов к группе D Наименования Контроль культур (физ р-р) Концентрация микроорганизмов, м.к./см3 109 108 107 5х106 106 105 1.Salmonella dublin - + + + + - - 2..Salmonella gallinarum - + + + + - - - + + + + - - (pullorum) 3..Salmonella enteritidis «+» – положительный результат реакции «–» – отрицательный результат реакции Чувствительность препаратов составляла 5х106 м.к./см3. Наблюдали образование хорошо заметных агглютинатов с просветлением фона в течение 1–2 минут после смешивания компонентов при отрицательных контролях. Из полученных данных видно, что максимальная чувствительность диагностических препаратов составляла 5х106 м.к./см3. При этом концентрация иммуноглобулинов составляла 92 – 94 мкг/см3 при значении рН среды 8,0 – 8,2. Полученные поливалентные и монорецепторные сальмонеллезные диагностикумы хранили при температуре +4С, периодически определяя активность препаратов (с интервалом 1 раз в неделю). При создании диагностикумов с помощью вышеописанного метода их чувствительность сохранялась на первоначальном уровне в течение 5 – 6 месяцев. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, при полимеризации стирола в присутствии полибутадиена со степенью карбоксилирования 13% и 17% при их концентрации 3 % масс. в расчете на мономер, были синтезированы полимерные суспензии с узким распределением частиц по размерам, устойчивые в процессе синтеза и в физиологическом растворе со средними диаметрами 0,5 и 0,7 мкм. Разработанные нами латексные сальмонеллезные диагностикумы сочетают высокую активность и специфичность, а их использование характеризуется методической простотой и быстротой, характерной для агглютинационных тестов. Приведенные выше результаты показывают, что, несмотря на значительное количество предлагаемых в научной литературе способов получения латексных диагностикумов, в каждом конкретном случае необходим подбор индивидуальных условий и режимов с учетом характеристик поверхности полимерных микросфер, функциональных групп, расположенных на поверхности полимерных микросфер, условий их активации, адсорбции антител и оптимального соотношения сорбента и белка. ЛИТЕРАТУРА 1. Дж. Уайтсайдс. Нанотехнологии в ближайшем десятилетии. Прогноз направлений, исследований / Под. Ред. М. К. Роко. Пер. с англ. — М.: Мир. 2002. 292 с. 2. П.А. Ребиндер. Механические свойства и стабилизирующие действия адсорбционных слоев в зависимости от степени их насыщения // Коллоидный журнал. 1958. №2. Т. 20. С. 527-535. 3. Determination of Particle Size. Photon Correlation Spectroscopy. ISO TS 24/SC4/WG7 Fourth Draft, 1993.