Внебольничные пневмонии: классификация, патогенез, этиология
advertisement
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА ВНЕБОЛЬНИЧНЫЕ ЭТИОЛОГИЯ, ПНЕВМОНИИ: ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, КЛАССИФИКАЦИЯ, ЛАБОРАТОРНАЯ СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР МОСКВА 2013 ПАТОГЕНЕЗ, ДИАГНОСТИКА НА 2 Внебольничные пневмонии: классификация, патогенез, этиология, эпидемиология, лабораторная диагностика на современном этапе. Аналитический обзор. Москва, 2013. – 65с. Авторы: Ежлова Е.Б., Демина Ю.В. (Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека), Ефимов Е.И., Бруснигина Н.Ф. (ФБУН Нижегородский НИИЭМ имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора), Малеев В.В. (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), Тартаковский И.С. (ФГУ НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалеи Минздрава России), Биличеко Т.Н. (ФГУ НИИ пульмонологии ФМБА России), Шкарин В.В., Ковалишена О.В., Чубукова О.А., Благонравова А.С.(ГБОУ ВПО Ниж ГМА Минздрава России) Аналитический обзор предназначен для врачей инфекционистов, терапевтов, эпидемиологов, бактериологов, врачей диагностической клинико-лабораторной службы, студентов медицинских вузов. 3 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………………… 4 Глава 1. ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ ВНЕБОЛЬНИЧНЫМИ ПНЕВМОНИЯМИ, КЛАССИФИКАЦИЯ ВП, ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ………………………………………………………………… 6 Глава 2 . ПАТОГЕНЕЗ ВП………………………………………………………………… 12 Глава 3. ЭТИОЛОГИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВП……………… 15 Глава 4. РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОСНОВНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВП К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ………………………………………………… 36 Глава 5. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА (ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ)……………………………………………………………………… … 37 Глава 6. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВП…………………………………………………………………………………………… 48 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………………………………… 54 4 ВВЕДЕНИЕ Внебольничные пневмонии (ВП) являются одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний в мире и РФ [13, 14, 25, 31, 36, 40, 41, 68]. Число взрослых больных пневмонией в год в 5 ведущих европейских странах превышает 3 млн. случаев, в США эта цифра составляет 5 млн., причем 1,2 млн. нуждается в госпитализации, из них 60 тыс. умирает. Согласно данным официальной статистики, в России заболеваемость пневмонией взрослых в 2006-2010 гг. варьировала от 344,0 до 403,4 на 100 тыс. населения. Реальная заболеваемость пневмониями существенно выше регистрируемой, общее число больных пневмонией ежегодно составляет 1,5 млн., каждый год от пневмонии погибает более 40 тысяч человек, при этом наиболее высокая смертность регистрируется у мужчин трудоспособного возраста [40, 41]. Это обусловлено проблемой выявления и учета данной нозологической формы, в частности, официальная регистрация пневмоний по традиционной для других инфекционных болезней схеме введена в РФ лишь с 01. 2011 г., по данным которой в России зарегистрировано 448418 случаев внебольничных пневмоний, заболеваемость составила 316,0 на 100 тыс. населения (Приказ Росстата от 31.12.3010 № 482). Несмотря на современное развитие медицины, этиологическая диагностика, лечение, регистрация пневмоний до настоящего времени представляет определенные трудности [1, 2, 5, 10, 11, 26]. К пневмониям достаточно часто подходят не как к инфекционным заболеваниям, вызываемым широким спектром возбудителей, а как к синдромному этиологический заболеванию диагноз без этиологической определяет прогноз расшифровки, течения болезни, хотя именно рациональную антибактериальную терапию и соответствует этиологическому принципу классификации пневмоний по МКБ-10. Данные об этиологии значительно варьируют у разных авторов и в различные периоды исследований: Streptococcus pneumoniae (1,3 - 86,3 % ), Chlamydophilla pneumoniae (2,5-8%), Mycoplasma pneumoniae ( 8-30 %), Hemophillus influenzaе ( 0,1-41,2 % ), Staphylococcus spp. (0-10,5 %), Klebsiella pneumoniae (0-10,3 %), Pseudomonas aeruginosa (0-10,5 %), грибы рода Candida (0-23,8 %). [1, 11, 13, 17, 26, 31, 36, 38, 41]. Ряд исследователей отмечают роль ассоциаций микроорганизмов в этиологии ВП – от 2,3 до 65,8 % [25, 27, 28, 37, 69]. Выявлены различия в этиологии внебольничных и внутрибольничных пневмоний, а также в зависимости от тяжести течения заболевания. Этиологическая расшифровка пневмоний - одна из существенных проблем диагностики в связи с отсутствием стандартов исследования клинического материала, использованием различных субстратов и методов исследований, сложностью интерпретации результатов, связанной при отборе образцов с риском контаминации клинического материала 5 (мокроты) микрофлорой ротоглотки и верхних дыхательных путей, недостаточной чувствительностью классических бактериологических методов исследований и другими факторами. Соответственно, и антибактериальная терапия носит преимущественно эмпирический характер. Особого внимания в настоящее время заслуживает легионеллез, на долю которого по данным разных авторов, приходится от 1,3 до 11,8% в различных странах мира и РФ [29, 36]. Несмотря на большую эпидемиологическую и медицинскую значимость пневмоний, система эпидемиологического надзора и система контроля в том виде, в котором они традиционно существуют за другими инфекциями, при пневмониях фактически отсутствуют. До 2013 года в РФ не существовало нормативных документов по эпидемиологическому надзору и контролю за внебольничными пневмониями, не проводился полноценный эпидемиологический анализ эпидемиологической ситуации и тенденций ее развития. с оценкой реальной Впервые в 2013 г. были разработаны, утверждены и введены в действие Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко МУ 3.1.2. 3047-12 «Эпидемиологический надзор за внебольничными пневмониями». Вместе с тем остается целый ряд теоретических, методических и организационных проблем в диагностике, профилактике и терапии внебольничных пневмоний, нуждающихся в решении. В данном обзоре представлены современные данные о классификации, патогенезе, этиологии внебольничных пневмоний, о распространенности и роли бактерий Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophilla pneumoniae, Chlamydophilla psittaci, Legionella pneumophilla и вирусов группы герпеса в развитии ВП, рассмотрены биологические свойства возбудителей, включая характеристику их чувствительности к антибактериальным препаратам, описаны особенности клинических проявлений ВП в разных возрастных группах, рассмотрены вопросы лабораторной диагностики ВП, особое внимание уделено молекулярно-генетическим методам исследований и определению их места в системе санэпиднадзора за ВП. 6 ГЛАВА 1. ЗАБОЛЕВАЕМОСТЬ ВНЕБОЛЬНИЧНЫМИ ПНЕВМОНИЯМИ. КЛАССИФИКАЦИЯ ВП. Пневмонии являются одним из наиболее распространенных заболеваний человека и занимают ведущее место среди причин смерти от инфекционных заболеваний [2, 11, 16, 25, 38]. Диагностика и лечение этого заболевания во всем мире остается одной из сложных проблем современного здравоохранения [26, 40]. В настоящее время пневмонии представляют собой не только медицинскую, но и экономическую проблему. Пневмонии наиболее частые причины обращения за медицинской помощью [41]. По данным зарубежных ученых ежегодные экономические затраты на терапию инфекций дыхательных путей (исключая грипп) приближаются к 40 млрд. долларов США, при этом прямые медицинские затраты (посещение врача, вызовы неотложной помощи, стоимость назначенного лечения) составляют 17 млрд. долларов, а не прямые (пропущенные дни учебы и рабочие дни) - 22,5 млрд. долларов [68]. Несмотря на внедрение во врачебную практику различных методов обследования пациентов (клинических, биохимических, рентгенологических, микробиологических исследований), этиологическая диагностика и лечение пневмоний в настоящее время представляют определенные трудности [25, 26, 39]. Парадокс проблемы пневмоний состоит в том, что, с одной стороны, достигнуты впечатляющие результаты понимания патогенеза и этиологии инфекционного процесса, повышение эффективности химиотерапии, а, с другой – происходит увеличение числа больных с тяжелым течением болезни и смертности [26]. Врачи, несмотря на наличие огромного арсенала лабораторнодиагностических методов определения возбудителей пневмонии, как и прежде осуществляют выбор антибактериальной терапии эмпирически [25]. Пневмонии широко распространены во всех регионах России [36, 37, 38]. Согласно данным официальности статистики в РФ заболеваемость пневмонией взрослого населения в 2007 году составила 351,7 на 100 тыс., в 2008 – 366,8 на 100 тыс., в 2009 – 388,2 на 100 тыс., в 2010 - 403,4 на 100 тыс., в 2011 -396,8 на 100 тыс. Однако, эти цифры не отражают истинной заболеваемости ВП в России, которые согласно расчетам достигает 14-15‰, а общее число больных ежегодно превышает 1,5 млн. человек. По данным зарубежных эпидемиологических исследований, заболеваемость ВП у лиц молодого и среднего возраста составляет 1-11,6‰, в старших возрастных группах этот показатель достигает 2544‰ [68, 70, 71]. У отдельных категорий больных (военнослужащие, пожилые люди) показатель заболеваемости существенно выше общероссийских данных. Так, по данным National Center for Health Statistics (2000), у лиц старше 60 лет заболеваемость ВП в 2 раза выше, чем у лиц молодого возраста [79]. 7 Среди причин смерти пневмония занимает одно из первых мест после заболеваний сердечно - сосудистой системы, сахарного диабета и злокачественных новообразований. Летальность от ВП составляет около 5-9%. Несмотря на невысокие цифры летальности ВП в общей популяции, у отдельных категорий больных, например у пациентов, нуждающихся в госпитализации, она доходит до 21, 9%, у пожилых больных - 46% [25, 38]. Пневмония стоит на 6-м месте среди всех болезней как причина смерти от внебольничных и на 1-м месте по летальности от внутрибольничных [39]. Рост смертности обусловлен низким качеством клинической диагностики, связанной с поздней госпитализацией, тяжестью заболевания, множеством субъективных причин неправильной диагностики и лечения [26]. Уровень диагностических ошибок при ВП достигает 40 % [25, 26]. По определению Чучалина А.Г. с соавт., пневмонии – это группа различных по этиологии, патогенезу, (преимущественно поражением морфологической бактериальных) респираторных характеристике заболеваний, отделов легких острых инфекционных характеризующихся очаговым с наличием обязательным внутриальвеолярной экссудации [39, 40]. Первое упоминание о воспалении респираторных отделов дыхательного тракта, а также о возможных методах диагностики приводится Корнелиусом, Цельсом, Томасом Виллисом, Рене Лаэннеком, Карлом Рокистанским, Вильгельмом Рентгеном [18]. Огромный прорыв в диагностике пневмонии был связан с развитием микробиологии и возможностями этиологической диагностики заболевания. В конце 19 века были открыты Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzaе, а в последствии и «атипичный» возбудитель Mycoplasma pneumoniae (1965), Legionella pneumophila (1977), Chlamydophila pneumoniae (1989), что послужило основой создания этиологической классификации пневмоний [38, 39]. В настоящее время существует большое количество классификаций, основанных на этиопатогенетическом, клинико – морфологическом принципах, а также классификации, учитывающие возраст пациента, тяжесть заболевания, условия заражения и прочее. Современные классификации пневмоний предусматривают обязательное установление этиологии, поскольку этиологический диагноз во многом определяет прогноз течения болезни и рациональное лечение [11, 23, 25, 26, 39]. Одной из основных считается международная классификация болезней Х пересмотра, которая построена по этиологическому принципу. 8 Классификация пневмонии в соответствии с международной классификацией болезней, травм и причин смерти Х пересмотра (1992 г.) Класс Х: Болезни органов дыхания Блок (J10-J18) – грипп и пневмония J13 Пневмония, вызванная Streptococcus pneumoniae J14 Пневмония, вызванная Haemophilus influenzae J15 Бактериальная пневмония, не классифицированная в других рубриках (исключенины: пневмония, вызванная Chlamydia spp. – J16.0 и «болезнь легионеров» А48.1) J15.0 Пневмония, вызванная Klebsiella pneumoniae J15.1 Пневмония, вызванная Pseudomonas spp. J15.2 Пневмония, вызванная Staphylococcus spp. J15.3 Пневмония, вызванная стрептококками группы В J15.4 Пневмония, вызванная другими стрептококками J15.5 Пневмония, вызванная Escherichia coli J15.6 Пневмония, вызванная другими аэробными грамотрицательными бактериями J15.7 Пневмония, вызванная Mycoplasma pneumoniae J15.8 Другие бактериальные пневмонии J15.9 Бактериальные пневмонии неуточненной этиологии J16 Пневмония, вызванная возбудителями не классифицированными в других рубриках (исключены: орнитоз – А70, пневмоцистная пневмония – В59) J16.0 Пневмония, вызванная Chlamydia spp. J16.8 Пневмония, вызванная другими уточненными инфекционными агентами J17.0 Пневмония при бактериальных болезнях, классифицированных в других рубриках (пневмония при актиномикозе – А42.0, сибирской язве – А22.1, гонорее А54.8, нокардиозе – А43.0, сальмонеллезе – А022.2, туляремии – А721.2, брюшном тифе – А031, коклюше – А37) J17.1 Пневмония при вирусных болезнях, классифицированных в других рубриках (пневмония при: цитомегаловирусной болезни – В25.0, кори – В05.2, краснухе – В06.8, ветряной оспе – В01.2) J17.2 Пневмония при микозах J17.3 Пневмония при паразитарных заболеваниях 9 J17.8 Пневмония при других болезнях, классифицированных в других рубриках (пневмония при: орнитозе – А70, Ку-лихорадке – А78, острой ревматической лихорадке – 100, спирохитозе – А69.8) J18 Пневмония без уточнения возбудителя J18.0 Бронхопневмония неуточненная J18.1 Долевая пневмония неуточненная J18.2 Гипостатическая пневмония неуточненная J18.8 Другая пневмония, возбудитель не уточнен J18.9 Пневмония неуточненная Не вызывает сомнения необходимость учета в каждом конкретном случае этиологического фактора заболевания. Однако трудности бактериологической диагностики возбудителя у больных пневмониями не всегда позволяют определить нозологический диагноз по этиологическому принципу [36, 37, 39, 40]. В настоящее время широкое распространение получила классификация, учитывающая условия, в которых развилось заболевание; при этом также предлагается учитывать особенности инфицирования легочной ткани и состояние иммунологической реактивности организма пациента. Подобный подход позволяет со значительной долей вероятности прогнозировать этиологию заболевания [26]. По классификации R.G. Wunderink, G.M. Mutlu пневмонии подразделяются на внебольничные и нозокомиальные. Внебольничные пневмонии, в свою очередь, делятся на: I. типичные (у пациентов с отсутствием выраженных нарушений иммунитета): бактериальные; вирусные; грибковые; микобактериальные; паразитарные; II. иммунитета: синдром приобретенного патологические состояния; Нозокомиальные пневмонии пневмонию; II. у пациентов с выраженными нарушениями III. иммунодефицита; аспирационные подразделяются на: вентилятороассоциированную прочие заболевания/ пневмонии/абсцесс I. собственно пневмонию; III. легкого. нозокомиальную нозокомиальную пневмонию у пациентов с выраженными нарушениями иммунитета: у реципиентов донорских органов; у пациентов, получающих цитостатическую терапию [25]. В настоящее время вместо термина нозокомиальная пневмония употребляется термин – пневмония, связанная с оказанием медицинской помощи. С практической точки зрения наиболее значимым является подразделение пневмоний на внебольничные и внутрибольничные. Следует подчеркнуть, что такое 10 подразделение не связано с тяжестью заболевания, основным критерием являются условия инфицирования пациента. Согласно согласительным национальным рекомендациям по ведению взрослых пациентов третьего пересмотра 2010 года, под внебольничной пневмонией следует понимать острое заболевание, возникшее во внебольничных условиях: или вне стационара, или позднее 4-х недель после выписки из него, или диагностированное в первые 48 часов от момента госпитализации, или развившееся у пациента, не находившегося в домах сестринского ухода/отделениях длительного медицинского наблюдения 14 и более суток, и сопровождающееся симптомами инфекции нижних дыхательных путей (лихорадка, кашель, выделение мокроты, возможно гнойной, боль в грудной клетке, одышка) и рентгенологическими признаками «свежих» очаговоинфильтративных изменений в легких при отсутствии очевидной диагностической альтернативы. Согласно стандартам CDC (2003, 2008) пневмония должна определяться на основании одного из четырех критериев. Хрипы или притупление перкуторного звука при физикальном исследовании 1. грудной клетки и любое из следующего: а) первичное выделение гнойной мокроты или изменение характера мокроты; б) выделение гемокультуры микроорганизма; в) выделение патогенного микроорганизма из пробы транстрахеального аспирата, бронхиального смыва или из биоптата. 2. Рентгенологическое исследование показывает новые или прогрессирующие инфильтраты, уплотнение полости, плевральный выпот, а также любое из следующего: а) первичное выделение гнойной мокроты или изменение характера мокроты; б) выделение гемокультуры микроорганизма; в) выделение патогенного микроорганизма из пробы транстрахеального аспирата, бронхиального смыва или биоптата; г) выделение вируса или обнаружение вирусного антигена в респираторном секрете; д) диагностический однократный титр антител (IgM) или четырехкратное увеличение титра антител (IgG) к патогенному микроорганизму в парных пробах сывороток; е) патогистологические признаки пневмонии. 3. У пациента в возрасте ≤ 12 месяцев имеется два из таких симптомов, как апноэ, тахипноэ, брадикардия, тяжелое дыхание, хрипы или кашель, а также любое из следующего: а) повышенная респираторная секреция; 11 б) первичное выделение гнойной мокроты или изменение характера мокроты; в) выделение гемокультуры микроорганизма; д) выделение вируса или обнаружение вирусного антигена в респираторном секрете; е) диагностический однократный титр антител (IgM) или четырехкратное увеличение титра антител (IgG) к патогенному микроорганизму в парных пробах сывороток; ж) патогистологические признаки пневмонии. 4. У пациента в возрасте ≤ 12 месяцев проведенное рентгенологическое исследование грудной клетки показывает вновь появившиеся или прогрессирующие инфильтраты, полости, уплотнение или плевральный выпот, а также имеется любое из следующего: а) повышенная респираторная секреция; б) первичное выделение гнойной мокроты или изменение характера мокроты; в) выделение гемокультуры микроорганизма; г) выделение патогенного микроорганизма из проб транстрахеального аспирата, бронхиального смыва или биоптата; д) выделение вируса или обнаружение вирусного антигена в респираторном секрете; е) диагностический однократный титр антител (IgM) или четырехкратное увеличение титра антител (IgG) к патогенному микроорганизму в парных пробах сывороток; ж) патогистологические признаки пневмонии. Оценка тяжести состояния пациента с пневмонией при поступлении его в стационар является необходимым элементом для решения вопроса о месте лечения (в отделении общего профиля или отделение реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ)). Тяжелая ВП – это особая форма заболевания различной этиологии, проявляющаяся выраженной дыхательной недостаточностью и/или признаками тяжелого сепсиса, характеризующаяся плохим прогнозом и требующая проведения интенсивной терапии. Наличие каждого из указанных критериев достоверно повышает риск неблагоприятного исхода заболевания [25, 26, 38]. Из выше изложенного следует, что пневмонии являются актуальными инфекционными заболеваниями в РФ, имеющими высокую заболеваемость и летальность по данным официальной регистрации. Однако в настоящее время к случаям пневмоний подходят не как к инфекционным заболеваниям, вызываемым широким спектром возбудителей, а больше как к синдромному заболеванию без учета эпидемиологических и микробиологических данных[2, 41]. Истинную заболеваемость пневмониями можно определить лишь при условии правильно налаженного эпидемиологического надзора. Разработанные и утвержденные Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 10.01.2013 МУ 3.1.2. 3047-12 «Эпидемиологический надзор за внебольничными 12 пневмониями» позволят осуществлять полный комплекс мероприятий по эпидемиологическому надзору и контролю за внебольничными пневмониями. ГЛАВА 2. ПАТОГЕНЕЗ ВП Антимикробная защита легких – это сложная эшелонированная система, включающая физические (например, фильтрацию воздуха в верхних отделах, и кашель), иммунохимические факторы местного иммунитета и клеточные механизмы защиты (например, альвеолярные макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты). Среди клеточных механизмов защиты, два типа фагоцитирующих клеток: альвеолярные макрофаги (АМ) и полиморфноядерные (ПМЯ) нейтрофилы вносят наибольший вклад в раннее устранение бактерий. Известно, что АМ играют основную роль в инактивации и удалении бактерий из легких. Микроорганизмы, которые могут быть связаны с развитием пневмонии, отличаются большим разнообразием. Различные виды микроорганизмов имеют свои специфические особенности в патогенезе данного заболевания. Это может быть связано с наличием определенных факторов вирулентности у микроорганизмов или особым характером реагирования защитных систем организма на тот или иной вид возбудителя. Так, связывание эндотоксина с поверхностными рецепторами клетки, включая CD14, по всей видимости, отличается от связывания клеточной стенки грамположительных бактерий и приводит к индукции цитокинов различными путями [75]. Наиболее часто встречающимся возбудителем внебольничной пневмонии остается Streptococcus pneumoniae. Изучение этого микроорганизма привело к значительному прогрессу в понимании патогенеза пневмококковой пневмонии. Капсульный полисахарид защищает пневмококк от фагоцитоза полиморфноядерными лейкоцитами. Вирулентность пневмококка определяется химическим составом капсулы и, в меньшей степени, ее размером [109]. Очищенный капсульный полисахарид не вызывает воспалительного ответа, при инстилляции непосредственно в легкое, в отличие от недекапсуллированного пневмококка, который имеет выраженную воспалительную активность [70]. Покрытая капсульным полисахаридом, клеточная стенка доступна для некоторых компонентов острофазового ответа, что подтверждается ее способностью фиксировать комплемент. Компоненты клеточной стенки возбудителя привлекают лейкоциты в легкие, увеличивают проницаемость эндотелия сосудов мозга и легочного альвеолярного эпителия, стимулируют продукцию цитокинов, инициируют каскад свертывания [76], стимулирует продукцию тромбоцит-активизирующего фактора (PAF) [75], вызывают прямое 13 повреждение нейронов [78]. Присутствие тейхоевой кислоты в компонентах клеточной стенки увеличивает ее провоспалительную активность [72, 76, 79]. Необычная и важная особенность пневмококковой тейхоевой кислоты – это наличие фосфорилхолина. Фосфорилхолин является также критическим детерминантом биоактивности PAF. Увеличенная адгезивная способность к активированным клеткам может заключаться во взаимодействии между фосфорилхолином клеточной стенки и PAF-рецепторами, последние, положительно регулируются цитокиновой стимуляцией [61]. Существуют также наблюдения, что адгезия пневмококков in vitro усиливается вирусами и цитокинами [61]. Компоненты пневмококковой клеточной пневмонии. стенки патогена объясняют много Проверяя капсулу, клеточную стенку, особенностей и фракции цитоплазматической клеточной мембраны пневмококка на способность их стимулировать накопление белка в бронхоальвеолярной лаважной жидкости, исследователи идентифицировали фактор, который вызывал отек [82]. Он также выраженно активирует прокоагулянтный каскад [76]. Эта активность может объяснить развитие отека и отложение фибрина при ранних повреждениях легочной ткани. Лейкоциты играют основную роль в прерывании этих событий. В легком, подвергшемся воздействию относительно низкой дозы возбудителя, небольшое количество лейкоцитов выходит к месту повреждения, уничтожает пневмококки, и отек разрешается без остаточных повреждений в легких. Высокая концентрация пневмококка вызывает пропорционально больший лейкоцитоз, инициируя стадию серого опеченения [86]. Комплемент усиливает т воспалительную реакцию макроорганизма [87]. Лейкоциты перемещаются в альвеолярное пространство двумя способами. Молекулы интегрины, лейкоцитарной адгезии, семейства CD18 участвуют в привлечении приблизительно половины лейкоцитов, что доказано способностью анти-CD18 антител уменьшать количество лейкоцитов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости [77]. Дополнительно лейкоциты привлекаются менее хорошо изученным, CD18-независимым путем, который является уникальным для легочного воспаления, вызванного пневмококком [119]. Роль цитокинов при пневмонии до сих пор остается во многом не ясной, однако имеющиеся данные свидетельствуют об их исключительной роли в патогенезе данного заболевания. У пациентов с пневмонией, легкое является местом начального воспалительного ответа и есть убедительные данные в пользу того, что фактор некроза опухоли альфа (TNF-α) служит при этом ключевым медиатором [101]. У пациентов с односторонней пневмонией Dehoux и соавт. обнаружили более высокие уровни TNFальфа в бронхоальвеолярной жидкости пораженного легкого, чем в противоположном 14 легком [64]. Однако, при увеличении тяжести заболевания, цитокины могут также присутствовать в сыворотке пациентов с пневмонией. Обнаружимые уровни TNF-альфа в сыворотке были найдены у пациентов с тяжелой пневмонией [100]. Уровни TNF-и IL-1 в сыворотке постоянно повышены при тяжелой пневмонии, и степень их повышения отражает тяжесть заболевания и прогноз [64]. Их корреляция с показателями тяжести пневмонии, проверенная мультивариантным анализом, также отмечалась в исследовании Bauer с соавт. [101]. Отсутствие или ограничение эндогенной активности IL-1 положительно влияют на защиту хозяина при пневмонии, обусловленной Pseudomonas aeruginosa [105]. Была установлена диагностическая ценность при пневмонии измеряемых концентраций в крови интерлейкина 6 (IL-6) и интерферона гамма [106]. IL-6 находится более дистально в провоспалительном каскаде (дистальный цитокин) и его основные физиологические эффекты отличаются от таковых TNF-альфа и IL-1 бета. Системные эффекты IL-6 включают индуцирование лихорадки, влияние на продукцию белков острой фазы в печени, таких как C реактивный белок, и регуляцию иммунного ответа [107]. Регуляция воспалительного ответа при бактериальной пневмонии зависит от сложных взаимодействий между иммунными клетками, про- и противовоспалительными цитокинами. Интерлейкин-1 и TNF являются важными провоспалительными цитокинами. Интерлейкин-1 рецепторный антагонист (IL-1ra) конкурентно связывает рецепторы IL-1 рецептора, что оказывает ингибирующий эффект на IL-1 зависимое воспаление. Растворимый рецептор к фактору некроза опухоли I (sTNF-RI) представляет укороченную форму TNF рецептора и нейтрализует биологическую активность TNF, конкурируя с рецепторами на поверхности клеток за связывание с TNF. Синтез белка IL-1ra и выделение его лейкоцитами стимулируются LPS, GM-CSF, TNF, IL-1, и IL-10 in vitro [109]. Данные свидетельствуют о том, что TNF может быть ранним пусковым медиатором ответа IL-1ra при пневмонии [110]. В исследовании Kollinga и соавт была отмечена существенная корреляция между выделением противовоспалительных цитокинов (IL-1 рецепторный антагонист и растворимый рецептора TNF типа I ) в цельной крови при стимуляции липополисахаридом у пациентов с внебольничной пневмонией и количеством лейкоцитов в крови. Дополнительный эксперимент in vitro показал, что совместная инкубация в периферической крови мононуклеарных клеток с аутологичными PMN также приводила к заметному увеличению выделения этих цитокинов. Эти результаты показывают, что PMN могут быть ответственными противовоспалительных цитокинов при пневмонии [85]. за повышение уровней 15 В исследовании S. Donnelly и соавт. концентрации про- и противовоспалительных цитокинов (TNF, IL-1, IL-8, IL-10, IL-1 рецепторный антагонист) в жидкости бронхоальвеолярного лаважа были значительно повышены у пациентов с острым респираторным дистресс-синдромом (ОРДС), по сравнению с контролем. Не было обнаружено существенной корреляции между уровнями провоспалительных цитокинов, и уровнем смертности, однако низкие концентрации противовоспалительных цитокинов IL10 и IL-1 рецепторного антагониста в жидкости бронхоальвеолярного лаважа у пациентов с ОРДС, были связаны худшим прогнозом [65]. ГЛАВА 3. ЭТИОЛОГИЯ ПНЕВМОНИЙ И ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ Этиология ВП непосредственно колонизирующей верхние микроорганизмов лишь отделы некоторые, связана с нормальной микрофлорой, дыхательных путей. Из многочисленных обладающие повышенной вирулентностью, способны при попадании в нижние отделы дыхательных путей вызывать воспалительную реакцию. К числу таких возбудителей следует отнести пневмококк (Streptococcus pneumoniae) – 30-50% случаев заболеваний [25, 37, 38, 40, 41]. Существенное значение в этиологии ВП имеет так называемые атипичные микроорганизмы, на долю которых в сумме приходится от 8 до 30% случаев заболевания: Chlamydophila pneumoniaе, Mycoplasma pneumoniae, Legionella pneumophila [36, 40]. К редким (3-5%) возбудителям ВП относятся: Haemophilus influenzaе, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, еще реже – другие энтеробактерии [36]. В очень редких случаях ВП может вызывать Pseudomonas aeruginosa (у больных муковисцидозом). В таблице 1 представлена частота выделения различных возбудителей внебольничной пневмонии по данным исследователей разных стран мира. Ряд исследователей отмечают, что нередко у взрослых пациентов с ВП выявляется смешаная или ко-инфекция. Так, например, у каждого второго больного ВП с пневмококковой этиологией удается обнаружить признаки активной микоплазменной или хламидийной инфекции [11, 19, 28]. Частота встречаемости ассоциаций микроорганизмов при ВП по данным разных авторов варьирует от 2,3 до 65,8% [25, 41]. Исследователи публикуют сведения о самых разнообразных ассоциациях: пневмококковой инфекции с гемофильной, хламидийной, микоплазменной, легионеллезной, стафилокковой, синегнойной стрептококковой, кишечной, кандидозной [31, 51, 60, 68, 83, 95, 96]. Но, так как для исследования используются различные биологические субстраты и лабораторные методы, результаты разнородны. Важно учитывать и то, является ли один из 16 17 возбудителей в такой ассоциации копатогеном, который облегчает проникновение в легкие другого микроорганизма, или каждый из них может быть отнесен к возбудителям, находящимся в сложных взаимоотношениях (аддитивное, синергизм, антагонизм). Одновременное сосуществование нескольких инфекций, по мнению ряда авторов, может оказаться необходимым для противодействия эффективно функционирующей системе мукоцилиарного клиренса дыхательных путей [25]. В этой связи приводятся данные, подтверждающие цитопатическое действие M. pneumoniae на мерцательный эпителий слизистой оболочки бронхов и cпособность Chlamydia spp. блокировать двигательную активность ресничек респираторного тракта. Важно также и то обстоятельство, что в популяции весьма распространено бессимптомное носительство (это относится к C. pneumoniae). Среди других возбудителей ВП нередко упоминаются респираторные вирусы (вирусы гриппа типа А и В, парагриппа, аденовирус и респираторный синтициальный вирус), но, в действительности, они редко вызывают непосредственное поражение легких. Вирусные респираторные инфекции и, прежде всего, эпидемический грипп рассматриваются как ведущий фактор риска воспаления легких, являясь своеобразным «проводником» бактериальной инфекции. Однако вызываемые вирусами патологические изменения легочной ткани пневмонией не являются. Более того их необходимо четко от нее дифференцировать, поскольку подход к лечению этих двух состояний принципиально различен. С этой точки зрения представляется не вполне удачным распространенный термин «вирусно-бактериальной пневмонии», поскольку собственно бактериальная пневмония качественно отличается от вирусного поражения легких [25] . Следует помнить о том, что ВП может быть связана с новыми ранее неизвестными возбудителями, вызывающими заболевания вспышечного характера. К выявленным в последние годы возбудителям ВП относятся ТОРС-ассоциированный коронавирус, вирус птичьего гриппа, метапневмовирус [23]. Для некоторых микроорганизмов не характерно развитие бронхолегочного воспаления. Выделение их из мокроты свидетельствует о контаминации материала верхних отделов дыхательных путей, а не об этиологической значимости этих микробов. К таким микроорганизмам относятся:Streptococcus viridians, Staphylococcus epidermidis и другие коагулазанегативные стафилококки, Enterococcus spp., Neisseria spp., Candida spp. [22] Этиологическая структура ВП может различаться в зависимости от возраста больных, тяжести заболевания, наличия сопутствующей патологии. У пациентов, госпитализированных в терапевтические отделения, в этиологии ВП преобладают пневмококки, а на долю M. pneumoniae и C. pneumoniae суммарно приходится около 25%. 18 Напротив, в этиологии тяжелых ВП требующих лечения в отделении интенсивной терапии (ОИТ) возрастает роль Legionella spp., а также S. аureus и грамотрицательных энтеробактерий [36]. У пациентов молодого возраста без сопутствующих заболеваний (военнослужащие) при нетяжелом течении заболевания превалируют пневмококки, «атипичные» микроорганизмы и их сочетания [10, 19]. Летальность при ВП в зависимости от возбудителя представлена в таблице 2. Наиболее высокая летальность наблюдается при ВП, вызванном Streptococcus pneumoniae, Legionella spp., Staphylococcus аureus, Klebsiella pneumoniae. Таблица 2 Летальность при ВП [25] Возбудитель Летальность, % S. pneumoniaе 12,3 H. influenzaе 7,4 M. pneumoniaе 1,4 C. pneumoniaе 9,8 Legionella spp. 14,7 S. аureus 31,8 K. pneumoniaе 35,7 С практической позиции целесообразно выделять группы больных ВП с учетом сопутствующей патологии (ХОБЛ, сахарный диабет, застойная сердечная недостаточность, цереброваскулярные заболевания, диффузные заболевания печени и почек, хронический алкоголизм), предшествующий антибактериальной терапии и тяжести течения заболеваний. Между этими группами наблюдается различия не только в этиологической структуре, распространенности антибиотикорезистентных штаммов известных видов возбудителей, но и в прогнозе (таблица 3). 19 Таблица 3. Группы больных ВП и вероятные возбудители заболевания Характеристика пациентов ВП нетяжелого течения у лиц без сопутствующих заболеваний, не принимавших в последние 3 мес. АМП ВП нетяжелого течения у лиц с сопутствующими заболеваниями и /или принимавших в последние 3 мес. АМП ВП нетяжелого течения Место лечения Вероятные возбудители Возможность лечения в амбулаторных условиях (с медицинских позиций) S. pneumoniae M. pneumoniae C. pneumoniae Возможность лечения в амбулаторных условиях (с медицинских позиций) S. pneumoniae H. influenzaе C. pneumoniae S. аureus Enterobacteriaceae S. pneumoniae H. influenzaе C. pneumonia M. pneumoniae S. аureus Enterobacteriaceae ВП тяжелого течения Лечение в условиях стационара:отделение интенсивной терапии Лечение в условиях стационара:отделение общего профиля S. pneumoniae Legionella spp. S. аureus Enterobacteriaceae ХАРАКТЕРИСТИКА ТРУДНОКУЛЬТИВИРУЕМЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ Mycoplasma pneumoniae M. pneumoniae – единственный безусловно патогенный вид бактерий рода Mycoplasma семейства Mycoplasmataceae класса Mollicutes, известный как возбудитель респираторного микоплазмоза. Возбудитель «атипичной» пневмонии был открыт М. Eaton в 1944 году и долго фигурировал под названием «агента Итона». Считали, что это вирус, так как он проходил через бактериальные фильтры и не культивировался на обычных питательных средах. Лишь в 1962 г., когда возникли понятия «микоплазмы» и «микоплазмозы», «агент Итона» получил статус одного из видов микоплазм [18]. M. pneumoniae, как и все микоплазмы, отличается небольшими размерами (150-220 нм), выраженным полиморфизмом особей из-за отсутствия у них ригидной клеточной стенки, потребностью в холестерине, ростом на бесклеточной среде, чрезвычайно простой организацией клетки, имеющей минимальное количество органелл (цитоплазматическую мембрану, похожую на таковую у эукариот, прокариотный 20 нуклеотид и рибосомы) разнообразием форм репликации, имеющих аналоги с L-формами бактерий, зависимостью их жизненного цикла и метаболизма от клеток хозяина, с которым они связаны, способностью персистировать и паразитировать на мембранах клеток и клеточных стенках, тропизмом к строго определенным тканям, чувствительностью к тетрациклинам и к макролидным антибиотикам. Источником М. pneumoniae является человек — больной микоплазмозом или здоровый носитель микробов. М. pneumoniae передается преимущественно воздушно-капельным путем. Инфицированию способствует скученное размещение людей, находящихся в организованных коллективах (семья, школа, воинский контингент) [11, 19, 26]. Этот микроб является этиологическим фактором 10—25% острых респираторных заболеваний [71, 75, 94] и 6—25% — пневмоний [38]. Чаще страдают дети, подростки и люди молодого возраста (от 5 до 18 лет) [94]. В целом, заболеваемость носит цикличный характер. Ее повышение в различных странах и регионах регистрируется каждые 3—5 лет [66, 67, 125, 127]. Также отмечается рост заболеваемости в период эпидемий гриппа, связанный с активацией путей передачи возбудителя [15]. Респираторный микоплазмоз встречается повсеместно. Частота выявления М. pneumoniae при ВП по данным разных авторов варьирует от 6 % до 34 % [15, 19, 25, 119, 125, 131]. Хотя уровень заболеваемости респираторным микоплазмозом не имеет ярко выраженного сезонного характера, в умеренных климатических условиях доля больных с внебольничной пневмонией микоплазменной природы выше летом [107]. М. pneumoniae является этиологическим агентом до 40% и более случаев внебольничной пневмонии у детей, из них как минимум 18% случаев требуют госпитализации [60, 68, 95, 97]. Несмотря на то, что М. pneumoniae не считается неонатальным патогеном, D. Ursi с соавторами обнаружили с помощью ПЦР М. pneumoniae в назофаренгиальном аспирате младенцев с врожденной пневмонией и предположили, что в данном случае не исключалась трансплацентарная передача возбудителя [125]. Несмотря на то, что большинство случаев инфицирования взрослых М. pneumoniae носит легкий или бессимптомный характер, М. pneumoniae играет значительную роль в этиологии бактериальной ВП у взрослых. Исследования, проводимые в Израиле и Китае среди госпитализированных взрослых с ВП, показали схожие результаты. По их данным М. pneumoniae является этиологическим агентом 29% 21 случаев заболеваний ВП, являясь первым (Китай) или вторым (Израиль) после S. pneumoniae по частоте выявления [108, 110] . При респираторном ограничивается острым микоплазмозе катаром инфекционный верхних процесс, дыхательных как путей правило, (фарингит, ларингофарингит, трахеит) [59]. Реже поражаются глубокие отделы респираторного тракта (бронхит, пневмония), но и в таких случаях интоксикация обычно бывает умеренной, симптомы нарастают медленно, нередко больные переносят заболевание на ногах (отсюда термин «ходячая» пневмония). Характерным признаком является приступообразный сухой кашель. Рентгенологические симптомы бронхопневмонии выражены сильнее, чем этого можно ожидать при осмотре больного. В крови регистрируют умеренный лейкоцитоз и незначительное повышение СОЭ. Вышеперечисленная симптоматика респираторного микоплазмоза показывает отличия его от типичной певмонии, вызываемой пневмококками. Как упоминалось ранее, М. pneumoniae может быть причиной и тяжелой, требующей госпитализации пневмонии, особенно это касается детей младше 5 лет и пожилых лиц [50, 131]. Мишенью для M.pneumoniae служат клетки реснитчатого эпителия, это позволяет возбудителю атаковать респираторный тракт на всем протяжении – от носовых ходов до бронхиол. В опытах на добровольцах установлено, что для инфекционного процесса достаточно всего 10-100 бактерий (КОЕ) наиболее вирулентных штаммов микоплазм. Возбудитель внедряется между ресничками, прикрепляется к мембране эпителиоцитов. Вовлечение альвеол опосредованно через интерстициальное воспаление, инициируемое инфекцией мерцательного эпителия бронхов. M.pneumoniae располагает комплексом адгезинов, главным среди которых является белок Р1 [15]. M.pneumoniae обладают способностью преодолевать гематоэнцефалический барьер и вызывать менингит и менингоэнцефалит. Продолжительность инкубационного периода при респираторном микоплазмозе составляет от 4 до 25 сут. Заболевание протекает в форме острого респираторного заболевания или пневмонии. Острые респираторные заболевания микоплазменной природы чаще всего регистрируются среди студентов и военнослужащих в первые 3 месяца после поступления в коллективы [11, 15, 19]. Инкубационный период продолжается 4—8 сут. Обычно заболевание протекает по типу фарингита или ринофарингита. Температура тела повышается до субфебрильного уровня, развивается умеренно выраженная интоксикация в виде незначительной общей слабости [25, 66]. 22 При пневмонической форме микоплазмоза инкубационный период продолжается до 2 недель. Заболевание имеет острое начало, начинается с повышения температуры тела с ознобом и мышечно-суставными болями, с появлением общей слабости, головной боли, нарушением аппетита, выраженного сухого, а затем влажного кашля со скудным количеством слизисто-гнойной или ржавой (с примесью крови) мокроты. Максимальная температура тела в большинстве случаев достигает 39,0— 39,5° С. Лихорадка носит неправильный характер с большими суточными размахами, сопровождающимися ознобами при повышении температуры тела и потливостью при понижении. У большинства больных отмечается бледность кожи лица, инъекция сосудов склер или умеренно выраженный конъюнктивит. Иногда бывают полиморфная сыпь на коже туловища, конечностей и заднешейный лимфаденит. Частота пульса соответствует уровню температуры тела или несколько отстает от нее. У 1/3 части пациентов увеличены размеры печени. Тоны сердца приглушены, артериальное давление имеет тенденцию к понижению. У всех больных имеются признаки бронхита (над легкими множество сухих рассеянных хрипов) и пневмонии. У 3/4 части больных регистрируется односторонняя (правосторонняя) нижнедолевая пневмония, у 1/4— двусторонняя пневмония [25, 26]. Рентгенологическое исследование органов грудной клетки выявляет интерстициальные или паренхиматозные изменения в легких с образованием у отдельных пациентов инфильтративных массивных очагов, сопровождающихся ателектазом. Клинические изменения в легких сохраняются 2—3 недели, а рентгенологические 3—6 недели. Бывают случаи рецидивов заболевания [1, 4]. Клинические проявления заболеваний респираторного тракта микоплазменной этиологии не имеют достоверных отличий от подобных заболеваний, вызываемых другими возбудителями. Поэтому нозологическая их диагностика основывается преимущественно на результатах лабораторных исследований. Лабораторную экспрессдиагностику заболеваний, связанных с М. pneumoniae, можно осуществлять путем обнаружения антигенов микроба в сыворотке крови больного с помощью ИФА в «сендвич-тесте» или в реакции агрегатгемагглютинации (РАГА), а также путем выделения специфического фрагмента ДНК методом полимеразной цепной реакции. Ретроспективно подтвердить диагноз респираторного микоплазмоза представляется возможным с помощью серологических реакций (РСК и РНГА), выполняемых с пробами сыворотки крови больных, взятых в первые 4—6 дней болезни и через 10—14 сут. Диагностическое значение имеет нарастание титра микоплазменных антител в 4 раза и больше. Выделение М. pneumoniae из материала, взятого из дыхательных путей 23 больных, не имеет большого диагностического значения ввиду часто встречающегося здорового носительства микроба [63, 108,132]. При пневмонической форме микоплазмоза, при подозрении на микоплазменную пневмонию, лечение осуществляют тетрациклином, доксициклином, эритромицином, мидекамицином или азитромицином в течение 10—14 суток. Одновременно с этиотропными мероприятиями следует проводить патогенетическое лечение. При всех формах микоплазмозов прогноз благоприятный. Реконвалесценты после тяжелой формы микоплазмоза с пневмонией подлежат врачебному наблюдению в течение 3 месяцев. Специфической профилактики при респираторных микоплазмозах нет. Бактерии рода Сhlamydophila Сhlamydophila pneumoniaе В 1983 г. в США от больного фарингитом был выделен инфекционный агент, который оказался идентичным выделенному от ребенка с трахомой в 1965 г. на Тайване атипичному хламидийному штамму. Все последующие изоляты были получены от больных с заболеваниями респираторного тракта (пневмонией, бронхитом, синуситом, фарингитом и др.), среди которых было выявлено немало лиц с антителами против вновь обнаруженных хламидий. Последние получили рабочее название TWAR (Тhе Таiwan Асut Respiratory аgent), а в 1989 J.T. Grayston предложил видовое название - Chlamydia pneumoniae, подчеркивающее важность данного вида хламидий в патологии легких человека [73]. По современной классификации семейство Chlamydiaceae включает два рода, собственно Chlamydia и новый род Chlamydophila, в который перешли виды Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci и Chlamydia pecorum. С. pneumoniaе – патогенный облигатный внутриклеточный грамотрицательный микроорганизм. Таксономическую самостоятельность С. pneumoniaе подчеркивает наличие видоспецифического антигена и слабое генетическое родство (всего 10% гомологии ДНК) с другими хламидиями. С. рneumoniaе, подобно вирусам, не культивируются на искусственных питательных средах. Зависимость хламидий от клеток хозяина объясняется их неспособностью синтезировать аденозинтрифосфат, в связи с чем их называют «энергетическими паразитами». Для хламидий характерен плеоморфизм, который возникает в ходе репликативого цикла и отражает взаимопревращения двух основных морфофункциональных элементов хламидий - элементарных (ЭТ) и ретикулярных (РТ) тел. ЭТ имеют 0,2-0,3 мкм в диаметре (отсюда вирусоподобная 24 фильтруемость хламидий) и обеспечивают выживание во внеклеточной среде и заражение новых клеток, РТ крупнее (0,8-1,5 мкм) и посредством деления обеспечивают репродукцию хламидий. ЭТ С. рneumoniaе имеют не шаровидную, как у других видов хламидий, а копьевидную форму, что может быть важным для развития инфекции, т.к. заостренным концом элементарные тельца прикрепляются к эпителиальным клеткам [7, 13, 73]. Единственным резервуаром С. рneumoniaе является человек, возбудитель передается воздушно-капельным путем. Не исключено, что эпидемически значимым источником служат бессимптомные носители [13]. С. pneumoniaе и обусловленные ими заболевания широко распространены во всем мире. В разных странах 40-80% взрослого населения имеет специфические антитела [1, 13]. Они достаточно редко обнаруживаются у детей дошкольного возраста. К 20 годам половина людей в США имеет детектируемый уровень антител к С. pneumoniaе, а у пожилых лиц антитела присутствуют у 75% [72]. Пневмония и бронхит являются наиболее частыми нозологическими формами заболеваний, связанных с С. pneumoniaе, хотя бессимптомных и клинически невыраженных случаев инфекции гораздо больше. По данным Бартлетт с соавторами, С. pneumoniae является причиной 25% случаев респираторных заболеваний, включая до 10% случаев эндемических пневмоний (до 50% эпидемических), 5% случаев острых и хронических бронхитов и синуситов, 2% фарингитов [1].. Данные ряда исследований, проведенных за последние 10 лет, о частоте выявления С. pneumoniaе у больных ВП представлены в таблице 4. 25 Таблица 4. Частота выявления С. pneumoniaе у больных с ВП Страна Нидерланды Нидерланды Возрастная группа (лет) 1-88 ≥18 Кол-во обследованных 159 107 Кол-во инфицированных (%) 5 (3,1%) 0 Швеция взрослые Больные-3 (2,4%) Здоровые- 0 Германия Италия Швейцария ≥18 2-14 1-18 125 больных, 113 здоровых 546 613 50 США,Техас 6 нед.-18 лет 51-88 154 14 (9%) 1193 55 (4,6%) 62±18 ? 31 214 6 мес.-16 Лет 168 Китай, Гонконг Чили Россия, г. Барнаул США, Даллас Метод (ы) диагностики Ссылка ИФА Традиционные методы, ПЦР МИФ, мультиплексная ПЦР [116] [108] [118] МИФ, ПЦР МИФ, nested ПЦР МИФ, ПЦР, культуральный ИФА, МИФ [131] [108] [51] [97] 19% 26 (12,1%) Четырехкратное увеличение титра IgG и/или положит. IgM Культура, ИФА ИФА 10 (6%) ПЦР, культура [129] 5 (0,9%) 87 (14,1%) 4 (8%) [137] [69] [31] Как показано в таблице 4, доля ВП, обусловленных С. pneumoniaе, у детей и взрослых варьирует от 0 до 14,1%. Инкубационный период составляет 21-30 дней, более продолжительный, чем характерно для многих других респираторных патогенов [25, 33]. Патология легких, связанная с С. pneumoniaе, принадлежит к атипичным пневмониям и клинически неотличима от других инфекций подобного типа. Начало вялое, лейкоцитоза, как правило, нет, температура повышается умеренно, кашель непродуктивный, но даже при внешне бедной симптоматике хрипы в легких прослушиваются. У 85-90% больных рентгенологически определяется инфильтрация легочной ткани. Преобладает мелкоочаговая или интерстициальная пневмония, которая начинается как одностороннее поражение, но в дальнейшем в большинстве случаев (у 80% больных) процесс прогрессирует с развитием двухстороннего поражения легких. Клинические признаки полражения легких держатся 7-10 дней; рентгенологические изменения в легких исчезают через 12- 30 дней. 26 При анализе клинического течения хламидийных пневмоний также отмечено их легкое течение. Так же, как микоплазменную, хламидийную пневмонию многие больные переносят на ногах. Однако выздоровление нередко идет медленно, кашель и слабость иногда сохраняются несколько недель и даже месяцев, и несмотря на этиотропную антибиотикотерапию (тетрациклины, макролиды) возможно длительное бактерионосительство [31, 78, 129]. В редких случаях тяжелое возможно затяжное течение С. pneumoniaе- пневмонии, описано образование каверн в обоих легких одновременно [1]. In vitro С. pneumoniaе обладает резистентностью к ряду представителей беталактамных антибиотиков (пенициллины и цефалоспорины) [100]. Возбудитель чувствителен к эритромицину, кларитромицину, азитромицину (МПК90 < 0,5 мкг/мл) [47]. Штаммы С. pneumoniaе чувствительны к ряду представителей новейших фторхинолоновых препаратов IV поколения: грепафлоксацину, левофлоксацину, моксифлоксацину, тровафлоксацину и др. (МПК90 < 0,5 мкг/мл). Наиболее активным из них является гемифлоксацин (МПК90 < 0,25 мг/мл) [2, 11, 15, 17]. Специфическая профилактика при ВП, обусловленной С. pneumoniaе, не разработана. Chlamydophila psittaci Заболевания, вызываемые C. рsittaci, называются орнитозом. Впервые орнитоз описан в 1876 г. Юргенсеном (Т. Jurgensen), наблюдавшем 2-х больных с атипичной пневмонией, имевших контакт с больными попугаями. Возбудитель орнитоза — С. psittaci по основным биологическим свойствам, циклу развития не отличается от других хламидий. Возбудитель устойчив во внешней среде: сохраняет жизнеспособность при температуре 37°С в течение 2 суток, при 4-6°С – в течение недели, при -20-30°С — до 10 месяцев. Кипячение убивает его в течение 5 минут, 5% раствор хлорамина, 3% раствор лизола уничтожают его в течение 3-х часов. Орнитоз — зоонозное природноочаговое заболевание с воздушно-капельным и воздушно-пылевым механизмом передачи. Резервуаром и источником заражения для человека являются домашние и дикие птицы. Возбудитель выделяется птицами с фекалиями и отделяемым из клюва. Возможен также и фекально-оральный механизм с пищевым путем передачи. В настоящее время возбудитель орнитоза выделен более чем у 150 видов птиц. Наибольшее эпидемиологическое значение имеют домашние птицы (особенно утки и индюшки), комнатные птицы (попугаи, волнистые попугайчики, канарейки и другие мелкие певчие птицы) и, особенно, городские голуби, зараженность которых колеблется в пределах 30-80% [18, 122]. 27 Орнитоз регистрируется во всех странах, преимущественно у лиц, профессия которых связана с птицами, или же у тех, кто содержит комнатных птиц. Частота заболеваний орнитозом на разных территориях неодинакова и зависит от распространения орнитоза у птиц в данной местности. Заболевания могут приобретать характер эпидемических вспышек, но чаще регистрируется спорадическая заболеваемость. Показано, что 8% детей имеют антитела к С. psittaci, а среди членов семей, содержащих дома попугаев антитела выявляются в 37,5% [18, 122]. Клинические симптомы возникают не у всех инфицированных. Об этом говорит значительная прослойка серопозитивных лиц среди групп риска по контакту с С. psittaci. Больные орнитозом опасности для окружающих не представляют [18]. Часто орнитоз не распознается и проходит под диагнозом пневмония. Частота орнитозных пневмоний невелика – 1-3%, но достаточно стабильна [18]. Инкубационный период при орнитозе колеблется от 5 до 30 дней. Инфекция может протекать в острой или хронической форме. Острая форма начинается с быстрого повышения температуры до высоких цифр. В дальнейшем, при развитии пневмонии одышка не выражена, однако рентгенологически обнаруживаются очаги инфильтратов. Бактериемия в первые дни заболевания создает вероятность осложнений со стороны сердечно-сосудистой системы (миокардит, эндокардит), ЦНС (менингоэнцефалит) и др. Иногда болезнь принимает хроническое течение с ранними (через 2-4 недели) и поздними (через 3-6 месяцев) рецидивами. Это связано с возможностью С. psittaci длительно персистировать в респираторном тракте после клинического выздоровления [13]. Легочные формы орнитоза необходимо дифференцировать от острых бактериальных пневмоний (включая легионеллез), туберкулеза легких, лихорадки КУ, глубоких микозов, (аспергиллез, нокардиоз, кокцидиозный микоз, гистоплазмоз), рака легкого, в начальный период — от тифопаратифозных заболеваний, бруцеллеза, лептоспироза. Наиболее эффективными этиотропными препаратами являются антибиотики тетрациклинового ряда. Длительность курса антибиотикотерапии определятся тяжестью и течением заболевания [1, 13, 18]. Длительная антибиотикотерапия предупреждает рецидивы и переход болезни в хроническую форму. Преждевременная отмена антибиотиков и неадекватная терапия способствуют появлению рецидивов и хронизации процесса. При затянувшихся к хронических формах орнитоза хорошие результаты дают дополнительные назначения вакцинотерапии. В качестве вакцины используется орнитозный аллерген [34]. 28 Прогноз при орнитозе благоприятный. При современных методах лечения летальность составляет 2—3%. Диспансерное наблюдение за переболевшими осуществляется в течение 2 лет. Клиническое обследование проводится в первый год через 3 месяца, затем I раз в гол. При этом 1 раз в 6 месяцев проводится флюорография и ставится РСК с орнитозным антигеном. Профилактика включает в себя комплекс санитарно-ветеринарных мероприятий в птицеводческих хозяйствах, птицефабриках, питомниках, зоопарках; осуществление карантинных мер при ввозе в страну из других территории декоративных и хозяйственных птиц. На птицеводческое хозяйство, где выявлено заболевание орнитозом, накладывается на 6 месяцев ограничение, а больных птиц уничтожают. За людьми, подвергшимися риску заражения, устанавливают медицинское наблюдение в течение месяца. В очаге проводят заключительную дезинфекцию. Экстренная профилактика проводится в течение 10 дней антибиотиками тетрациклинового ряда. На каждый случай болезни подается экстренное извещение в территориальный центр санэпиднадзора. Специфической профилактики орнитоза не разработано [18]. Legionella pneumophila В последние годы проблема легионеллеза привлекает пристальное внимание различных специалистов, что связано с ежегодным ростом числа спорадических случаев и эпидемических вспышек данного заболевания. «Болезнь легионеров» относится к числу новых инфекций, сведения о которой расширяются с каждым годом. Впервые заболевание, обусловленное легионеллами, наблюдалось во время вспышки среди участников конгресса организации «Американский легион» в Филадельфии в 1976г. Тогда заболели 182 человека, из которых 29 умерли. В 1977 г. I. McDade выделил возбудителя болезни, который получил название Legionella pneumophila. В настоящее время описано более 50 видов легионелл, однако более 90 % клинически выраженных случаев легионеллеза обусловлено видом Legionella pneumophilla [98]. При этом 80-90% из этих случаев вызваны L. pneumophila серогруппы 1, а 5-10% связаны с серогруппами 4 и 6 [135, 200]. Всего вид L. pneumophila насчитывает 16 серогрупп. Другие виды (L. micdadei, L. feeleii, L. longbeachae, L. dumofii и L. bozemanii) вызывают 29 заболевания редко и, как правило, у пациентов с нарушениями клеточного иммунитета или сопутствующими заболеваниями [18, 63]. Легионеллы - аэробные грамотрицательные подвижные палочки с полярными или боковыми жгутиками. В природе распространены повсеместно в пресноводных водоемах, а также в искусственных водных системах (кондиционеры, компрессоры, водопроводные системы, увлажнители воздуха, оборудование для проведения респираторной терапии) [18, 22, 63, 174]. L. pneumophila размножаются при температуре от 25°С до 42°С, оптимальная температура для роста бактерий 35°С. Большинство случаев легионеллеза связаны с антропогенными водными системами. Легионеллы являются факультативными внутриклеточными возбудителями, в организме человека они размножаются в альвеолярных макрофагах, полиморфноядерных нейтрофилах и моноцитах крови, проникая в клетки путем фагоцитоза. Внутриклеточная локализация служит причиной неэффективности терапии легионеллезной пневмонии антибиотиками, накапливающимися преимущественно экстрацеллюлярно, в частности –в- лактамами [14, 51]. В результате исследований оказалось, что одной из особенностей экологии легионелл относится способность оброазовывать бипленки в искусственных водных системах с циркуляцией теплой воды [29, 30]. Заражение легионеллами происходит при вдыхании мелко-дисперсионного аэрозоля, содержащего бактерии. Инфицирующая доза бактерий точно неизвестна, предполагают, что она не велика, поскольку известны случаи заражения после кратковременной (несколько минут) ингаляции аэрозоля, содержащего легионеллы, на довольно большом расстоянии от источника инфекции. По данным ряда авторов при накоплении легионелл более 1000 КОЕ/л имеется реальная возможность заражения человека легионеллезом [30]. Широкое распространение искусственных водных систем привело к увеличению случаев заболевания легионеллезом в последние несколько десятилетий. Внебольничная пневмония развивается у 5-10% лиц, находящихся в зоне действия аэрозоля, контаминированного легионеллами. госпитализируются В США от 8000 до 18000 человек ежегодно с болезнью легионеров, большинство из этих случаев – спорадические. Чаще заболевание поражает лиц пожилого возраста и редко встречается у детей и молодых людей без сопутствующей патологии. Факторами, повышающими риск развития болезни легионеров, являются пожилой возраст, курение, наличие хронического заболевания легких, диабет, иммуносупрессия. Риск инфицирования повышается во время путешествий и проживания в гостиницах. [27, 63]. Эпидемические вспышки обычно связаны с водопроводной системой зданий. В 1980 – е годы в США 11% всех случаев 30 болезни легионеров носили вспышечный характер. Benkel et al. сообщают о вспышке болезни легионеров, связанной с гидромассажными SPA-процедурами [30]. Механизм передачи легионелл – воздушно-капельный или аспирационный, основной фактор передачи – мелкодисперсный аэрозоль. Отсутствие рецепторов у легионелл, с помощью которых они могли бы закрепиться на клетках мерцательного эпителия слизистой оболочки дыхательных путей, объясняет неконтагиозную природу данного заболевания. Кроме того, отсутствуют данные о носительстве и перситенции легионелл в организме человека[14, 43]. Заболеваемость легионеллезом не имеет сезонности [63]. По оценкам различных специалистов, доля L. pneumophila как этиологического агента внебольничных пневмоний у госпитализированных пациентов составляет от 2 до 15% случаев [27, 39]. Клинические проявления легионеллеза неспецифичны и наблюдаются при различных заболеваниях. Они могут варьировать в широких пределах – от симптомов легкого респираторного заболевания до тяжелых полиорганных поражений. Различают собственно болезнь легионеров, лихорадку Понтиак, лихорадку Форт-Брагг (сопровождается кожными высыпаниями) [29]. Если лихорадке Понтиак подтвержены от 80% до 100 людей, оказавшихся в зоне действия контаминированного аэрозоля, и инфекция протекает в виде острого респираторного заболевания с быстрым выздоровлением, то собственно болезнь легионеров, хотя и развивается только у 5-10% контактировавших с источником, но протекает в виде тяжелой пневмонии, зачастую с летальным исходом. Клиническая картина во многом сходна с пневмонией, вызываемой типичными возбудителями. Симптомы болезни легионеров включают лихорадку, непродуктивный кашель, головную боль, миалгии, одышку, диарею, бред. Среди внебольничных пневмоний с атипичными этиологическими агентами, болезнь легионеров имеет самые серьезные особенности клинического течения, особенно если вовремя и правильно не поставлен диагноз и не начата адекватная терапия [27, 46, 51, 63]. Хотя внелегочные проявления редки, были зафиксированы случаи легионеллезных миокардитов, перикардитов и эндокардитов, а также гломерулонефритов, панкреатитов и перитонитов [98]. Уровень смертности в результате болезни легионеров составляет 14% [74]. Диагностика предусматривает легионеллезной оценку инфекции клинической носит картины комплексный заболевания эпидемиологического анамнеза и результатами лабораторных исследований. характер с и данными 31 Эпидемиологический анамнез в некоторых случаях может иметь высокую информативность, например при наличии данных о лечении пациентов в отделениях трасплантации органов, сопровождалась онкологии, интубацией и реанимации, вентиляцией хирургии, легких, терапия которых прохождением курса иммуносупрессивной терапии, а также данных о посещении бассейгов, аквапарков, прохождении бальнеологических процедур, пребывание в гостиницах и других общественных учреждениях с кондиционерами, на круизных судах [29]. Однако для постановки диагноза легионеллеза, своевременной этиотропной терапии наличие клинических лабораторных и эпидемиологических исследований. В данных настоящее недостаточно. время Необходимы данные доступные методы имеются лабораторной диагностики легионеллезной инфекции – молекулярно-генетические (ПЦР), иммунохроматографические и иммуноферментные методы, позволившие повысить качество и скорость выявления данного заболевания. Moraxella (Branhamella) catarrhalis Впервые бактерия Moraxella catarrhalis была описана в 1896 году офтальмологами В. Мораксом и К. Аксенфельдом и названа Micrococcus catarrhalis. Позднее она была переименована в Neisseria catarrhalis в виду фенотипического сходства с нейссериями, представляющими нормальную микрофлору дыхательных путей человека. Впоследствии, из-за значительных филогенетических различий между N. сatarrhalis и так называемых истинных Neisseria species, установленных с помощью различных методов, бактерию отнесли к новому роду Branhamella, а в 1984 г. - к роду Moraxella, виду - М. catarrhalis. ДНК-секвенирование подтвердило правильность современной таксономической классификации [126]. Moraxella (Branhamella) catarrhalis – грамотрицательные, аэробные диплококки, ранее считавшиеся условно-патогенными представителями нормальной микрофлоры носоглотки. В настоящее время M. catarrhalis считается этиологически значимым возбудителем инфекций верхних и нижних дыхательных путей у детей и взрослых. [83, 126]. Степень колонизации M. catarrhalis верхних дыхательных путей зависит от возраста пациента. По данным ряда авторов частота носительства M. catarrhalis у детей достигает 75% [104, 128], тогда как у взрослых составляет всего 1-3% [90]. По данным литературы, M. сatarrhalis может вызывать у детей трахеиты, бронхиты, пневмонии [6, 48]. Причастность M. сatarrhalis к инфекциям нижних отделов дыхательных путей (ВП) подтверждают случаи выделения чистой культуры этих бактерий из крови, респираторных секретов, отобранных при бронхоскопии у 32 новорожденных и детей разных возрастов, особенно у детей с ослабленной иммунной системой [6, 48, 83]. Эстонские ученые при обследовании 209 пациентов в возрасте от 56 до 67 лет, госпитализированных с внебольничной пневмонией, установили, что M. catarrhalis являлась этиологическим агентом в 10,2% случаев заболевания [104]. Пневмонии, обусловленные M. catarrhalis, как правило, характеризуются легким течением и отличаются от бронхитов наличием инфильтратов в легких [6]. Вирусы группы герпеса Поражение легких при вирусных инфекциях остается на сегодняшний день серьезной проблемой для практической медицины. И если развитие патологического процесса в легких при «классических» респираторных вирусных инфекциях изучено достаточно полно, то клинико-морфологические особенности заболеваний органов дыхания, связанной с вирусами группы герпеса, изучены недостаточно, и самостоятельная роль этих вирусов в формировании бронхолегочной патологии дискутируется исследователями. Для цитомегаловирусной и инфекций, вызванных вирусами простого герпеса 1 и второго типов (HSV I/II), характерны латентные, субклинические варианты течения, однако в последние годы всё больший удельный вес стали составлять клинически выраженные тяжелые формы заболеваний, обусловленные первичным инфицированием, реинфекцией или реактивацией вирусов в зараженном организме [41, 117]. У 72-94% взрослого населения нашей страны выявляются в крови специфические антитела к цитомегаловирусу (CMV) и HSV I/II, что в абсолютном большинстве случаев означает и присутствие в организме самих вирусов [8, 12, 42, 44]. В группу особого риска по цитомегаловирусной и герпетической инфекциям входят лица, перенесшие пересадку органов, ВИЧ-инфицированные, онкологические больные, страдающие лейкозами и лимфомами, беременные женщины вследствие развития у них физиологической иммуносупрессии, а также недоношенные и маловесные дети [8, 18, 20]. Herpes simplex I/II (HSV I/II) HSV I и II типа принадлежат к семейству Нerpesviridaе, подсемейству Alhaherpesviridaе, роду Simplexvirus. Вирус простого герпеса был впервые выделен в 1912 г. Капсид 100 нм в диаметре, состоит из 162 капсомеров. Геном – линейная двухцепочечная ДНК. Размер генома 96 МДа. Содержание ГЦ оснований в ДНК HSV I 67%, HSV II – 69%. HSV I и II типа культивируются на культурах различных тканей, в куриных эмбрионах и являются патогенными для лабораторных животных. 33 Характеризуются коротким циклом репродукции (10-15 ч) и цитопатическим эффектом для клеток хозяина [8, 18]. Вирусы простого герпеса инактивируются при температуре 50-52°С через 30 мин, неустойчивы к действию физических и химических факторов, сравнительно легко разрушаются под воздействием ультрафиолетовых и рентгеновских лучей. При низких температурах (от -20°С до -70 °С) вирус сохраняется годами и десятилетиями. Источник инфекции – больной или носитель. Герпесвирусы распространены повсеместно. HSV I /II реплицируются в клетках эпидермиса, кожи, слизистой оболочки, внедряются в чувствительные и вегетативные нервные окончания, продолжая репликацию в ганглиях. HSV передаются со слюной, половым путем, трансплацентарно, вертикальным путем от матери к ребенку во время беременности и/или родов. Герпетическая пневмония встречается редко, является результатом вирусемии. Вирусная инфекция нижних дыхательных путей развивается вследствие распространения герпетического трахеобронхита на легочную паренхиму. Следствием гематогенной диссеминации вируса со слизистой оболочки ротовой полости или половых путей может быть двусторонняя интерстициальная пневмония. Герпетические поражения легких развиваются, как правило, у пациентов с иммуносупрессивным состоянием. Летальность при герпетической пневмонии у больных с иммунным дефицитом высокая и составляет более 80%. [15] Клиническая диагностика герпетических пневмоний крайне затруднительна в связи с неспецифическим характером клинической картины. Подозрения о герпетической природе заболеваний органов дыхания часто возникают при обнаружении у больного других поражений, вызванных вирусами этой группы, например афтозного стоматита, герпетических высыпаний на коже или поражения глаз [8, 15]. Сytomegalovirus (CMV) Цитомегаловирус человека впервые обнаружен немецким патологом Ribbert в 1882г. в тканях почек умерших детей с врожденным сифилисом, а в 1904г. он выделил цитомегалические клетки из ткани слюнных желез ребенка и назвал их протозооподобными клетками. В 1921г. исследователи Goodpasture и Talbot предложили называть эти клетки цитомегалами, а заболевание, при котором они обнаруживаются, цитомегалией [18]. CMV принадлежит к семейству Нerpesviridaе, подсемейству Betaherpesviridaе. Геном представлен линейной двухцепочечной ДНК, размер генома 145 МДа, содержание ГЦ оснований – 57%. CMV культивируется только в культуре фибробластов человека. При размножении 34 в инфицированной клетке CMV оказывает выраженное цитопатическое действие на нее, в результате обычные клетки превращаются в гигантские цитомегалические, достигая 25-40 мкм в диаметре за счет увеличения ядра и цитоплазмы. CMV термолабилен, инактивируется при температуре +56°С, длительно сохраняется при комнатной температуре, оптимальная температура для сохранения +4 °С, при замораживании до 20°С теряет инфекционность, не устойчив к действию дезинфектантов [15]. Источник CMV-инфекции – больной человек или носитель. Вирус обнаруживается в моче, слюне, желудочном соке, в различных органах, ликворе, в грудном молоке, сперме, выделениях цервикального канала, лейкоцитах периферической крови [8]. К концу первого года жизни 5-10% детей обретают серопозитивность [42]. Дети младшего возраста заражаются CMV друг от друга в яслях, детских садах, в домах ребенка. Ребенок может инфицироваться CMV через материнское молоко. CMV может передаваться при переливании цельной крови и её компонентов, а также при пересадке инфицированных органов [18, 42]. Клинически выраженная цитомегаловирусная инфекция – одно из самых частых и серьезных осложнений при пересадке органов. Она развивается у 5-25% больных, перенесших пересадку почек или печени, у 20-50% больных после аллогенной трансплантации костного мозга, у 55-75% реципиентов легких. Риск летального исхода у больных CMV – пневмонией при отсутствии этиотропной терапии, а у части пациентов – несмотря на ее проведение составляет 45-50% при пересадке солидных органов и 80-85% при трансплантации аллогенного костного мозга [40]. Подобно всем герпесвирусам, CMV характеризуется длительным (зачастую пожизненным) пребыванием в организме. Считается, что главным местом его латенции являются мононуклеарные фагоциты (моноциты, макррофаги). Вирус также определяется в эпителиоцитах слюнных желез, почечных канальцев, выводных протоков поджелудочной железы, в гепатоцитах и других тканях. Впрочем, присутствие в них CMV не всегда отвечает критерию инертной персистенции, так как, подвергаясь репликации, вирус вызывает ограниченные поражения, которые регистрируются по появлению цитомегалических клеток [18]. У иммунокомпетентных лиц СMV-инфекция чаще всего протекает бессимптомно, однако спектр клинических проявлений данной инфекции может колебаться от мягкого мононуклеозподобного синдрома до тяжелых системных заболеваний, таких как интерстициальная пневмония, гематологические заболевания, гепатит, гастроэнтерит, и др. Подобные проявления СMV-инфекции у иммунокомпетентных лиц редко встречаются без дополнительных факторов риска, например искусственной вентиляции легких, 35 сепсиса, ожогов, переливаний крови, травм, хирургических вмешательств, хронической почечной недостаточности, стероидной терапии [12]. Для СMV-инфекции характерно постепенное, в течение нескольких недель, развитие заболевания с наличием симптомов-предвестников, опережающих выраженную органную патологию. У большинства взрослых больных отмечаются длительная волнообразная лихорадка неправильного типа с подъемом температуры тела выше 38,5ºС, слабость. Быстрая утомляемость. Сонливость, потеря аппетита, существенное снижение массы тела, реже – потливость по ночам, артралгия, миалгия. К указанным симптомам присоединяется постепенно усиливающийся сухой или со скудной мокротой кашель [40, 42]. Клинически выраженная генерализованная СMV-инфекция занимает одно из первых мест в структуре оппортунистических заболеваний у ВИЧ – инфицированных пациентов [18, 42]. Цитомегалия является одной из самых частых и тяжелых внутриутробных инфекций. По данным ряда авторов, от 0,3 до 3,0% всех новорожденных инфицированы CMV в период внутриутробного развития. У 10% из них в период от момента рождения до 3 месяцев жизни развивается клинически выраженное заболевание. Характерны дефекты развития плода, гепатит и гепатоспленомегалия, геморрагический синдром, нейросенсорная глухота, гидро- и микроцефалия, хориоретинит. Внутриутробное поражение органов дыхания служит причиной гипоплазии легких, нарушения строения бронхиального дерева и легочных сосудов плода, развития тяжелой интерстициальной пневмонии у новорожденных, которая свидетельствует о тяжелом течении заболевания и неблагоприятном прогнозе для жизни младенца [ 40]. CMV-поражение органов дыхания более вероятно у детей старше 1 месяца, инфицированных во время родов или в раннем постнатальном периоде. Начало заболевания может протекать без выраженного начального токсикоза, при нормальной или субфебрильной температуре и проявляться лишь небольшим кашлем. Эту патологию часто принимают за трахеит или трахеобронхит. На данном этапе болезни как у детей. Так и у взрослых патологические изменения в легких при физикальном и рентгенологическом исследовании отсутствуют или ограничиваются незначительным усилением легочного рисунка. В дальнейшем состояние пациентов значительно ухудшается, симптомы интоксикации становятся выраженными, пики повышения температуры тела достигают 39-40ºС, отмечаются крайне выраженная слабость, анорексия [41]. Поставить прижизненный диагноз CMV-пневмонии крайне трудно по следующим причинам: ее клиническая картина не патогномонична, вирус можно выделить из 36 легочного секрета при отсутствии клинических проявлений инфекции и гистологических признаков заболевания, у иммуносупрессивных больных вирус часто сосуществует с другими возбудителями инфекционной легочной патологии. Решение вопроса об этиологической роли CMV в развитии пневмонии, по мнению В.И. Шахгильдяна, заключается в исследовании биопсийного материала, полученного при бронхоскопии [42, 44]. ГЛАВА 4. РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОСНОВНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВП К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ В современной терапии ВП используется широкий арсенал антибактериальных средств, что теоретически обеспечивает подавление любых микроорганизмов. Тем не менее, клиническая практика свидетельствует, что применение антибиотиков не является абсолютной гарантией успешного лечения ВП [26, 40]. Неэффективность антибактериальной терапии обусловлена как объективными, так и субъективными причинами. Объективной реальностью является возрастание эпидемиологической значимости ранее малоизвестных и труднокультивируемых возбудителей пневмонии: таких как легионеллы, микоплазмы, хламидии, пневмоцисты со своеобразным спектром чувствительности к антибиотикам. Серьезной проблемой является приобретенная резистентность к антибиотикам многих мироорганизмов – возбудителей ВП [2, 5, 16]. Наконец к реалиям современной жизни следует отнести увеличение численности иммуноскомпрометированных лиц, к которым относятся люди пожилого и старческого возраста, страдающие заболеваниями, хроническими сахарным заболеваниями, диабетом, больные получающие онкологическими кортикостероиды и иммунодепрессанты, страдающие алкоголизмом и наркоманией. К субъективным причинам относятся ошибки в диагностике ВП и в тактике антибактериальной терапии [27, 37, 96]. Важной проблемой в настоящее время является распространение штаммов пневмококков со сниженной чувствительностью к пенициллину. В некоторых странах чувствительность к пенициллину пневмококков достигает 60%, причем многие из них обладают резистентностью к 3-м и более классам антибиотиков, такие штаммы называются полирезистентными. Резистентность пневмококков к пенициллину обычно сочетается с устойчивостью к цефалоспоринам 1-2 поколения, тетрациклинам, котримоксазолу. В то же время сохраняют активность цефалоспорины 3-4 поколения, респираторные фторхинолоны, ванкомицин и линеволид [26]. 37 Устойчивость S. рneumoniae к макролидам не превышает 10%, однако, в динамике отмечается некоторое увеличение доли нечувствительных к макролидам штаммов, а также рост их устойчивости к клиндамицину, что свидетельствует о смене в РФ преобладающего фенотипа резистентности [41]. Высокую активность в отношении S. рneumoniae сохраняют респираторные фторхинолоны (левофлоксацин, моксифлоксацин, гемифлоксацин), ванкомицин, эртапенем. Следует отметить сохраняющийся высокий уровень устойчивости пневмококков к тетрациклину и ко-тримоксазолу, несмотря на существенное сокращение их использования при респираторных инфекциях [41, 42]. Препаратами выбора для лечения ВП, вызванными H. influenzae являются аминопенициллины, амоксицилин/клавуланат (панклав), цефалоспорины 2-3 поколения, фторхиноломы (ципрофлоксацин, офлоксацин, левофлоксацин и пр.) [41]. Наибольшей природной активностью в отношении M. pneumoniae и C. pneumoniae обладают макролиды, тетрациклины (доксициклин), респираторные фторхинолоны. Сообщения о наличии приобретенной устойчивости вышеуказанных микроорганизмов к макролидам, тетрациклину и фторхинолонам остаются единичными и не имеют существенного клинического значения. Препаратами выбора для лечения легионелезной ВП являются макролиды (эритромицин, кларитромицин, азитромицин) высокую эффективность в клинических исследованиях продемонстрировали фторхинолоны (левофлоксацин), и доксициклин. Препаратом выбора при стафилококковых пневмониях, вызванных MSSA, является оксицилин, амоксиклав, цефалоспорины 1 поколения, линкозамиды. В случае выявления MRSA рекомендуется использование ванкомицина или линезолида [38, 40, 41] . ГЛАВА 5. ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВП (ТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ) Быстрая и точная идентификация возбудителя остается одной из наиболее сложных проблем диагностики ВП и является ключевым моментом для назначения эффективной этиотропной терапии. Диагностика пневмоний основана на клинических, эпидемиологических, рентгенологических данных и обязательно данных лабораторных методов исследования [25, 37, 39, 40]. Для выявления большинства возможных возбудителей ВП существует широкий спектр селективных питательных сред для бактериологических исследований, диагностических коммерческих тест–систем для иммунохимических, иммунологических и молекулярно-генетических методов 38 исследования. Для детекции возбудителя используют различные биологические субстраты. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, в частности, они значительно отличаются по чувствительноти, специфичности, цене, сложности выполнения, времени получения результата, требованиям к биологическому материалу и т.д. (таблица 5). В таблице 6 представлены методы лабораторной диагностики, рекомендуемые для выявления различных возбудителей ВП. Однако следует помнить, что никакие диагностические исследования не должны быть причиной задержки начала антибиотикотерапии [41]. Серологическая диагностика инфекций, вызванных M. pneumoniae, С. рneumoniaе, Legionella spp. не рассматривается в ряду обязательных методов исследования, так как исследованию подлежат парные сыворотки, отобранные в остром периоде заболевания и через 2 недели от начала болезни, носит ретроспективный характер. Кроме того, многие коммерческие тест-системы для ИФА диагностики указанных выше инфекций характеризуются низкой воспроизводимостью результатов [15, 82]. В настоящее время получили распространение иммунохроматографические тесты с определением в моче антигенов L.pneumophila (серогруппа I) и S.pneumoniae [29]. Их использование наиболее перспективно при невозможности получения качественного образца мокроты у пациентов, получающих системную антибиотикотерапию, так как прием антибиотиков существенно снижает информативность культурального исследования. Молекулярно-генетические методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот, в частности ПЦР, являются перспективными для детекции труднокультивируемых возбудителей ВП (M. pneumoniae, С. рneumoniaе, L.pneumophila) [10, 45, 46, 67]. В результате аспирации секрета ротоглотки – основного патогенетического механизма развития пневмонии – этиология заболевания в большинстве случаев связана с микрофлорой верхних дыхательных путей, состав которой зависит от внешней среды, возраста пациента и общего состояния здоровья [25, 26]. В связи с этим при проведении лабораторных методов исследования различных клинических материалов, очень важным моментом является критическая оценка спектра и количества выделенных микроорганизмов с целью разграничения колонизации от инфекции. В настоящее время в РФ основным биологическим субстратом для исследования является мокрота, которая при естественном откашливании может контаминироваться микрофлорой глотки, зева и ротовой полости. 39 В современных источниках литературы нет единой точки зрения о том, какие микроорганизмы и в каких количествах считаются этиологически значимыми. По мнению ряда авторов, выделение из мокроты Streptococcus viridians, Staphylococcus epidrmidis и других коагулазоотрицательных стафилококков, Еnterococcus spp., Neisseria spp., Candida spp. скорее всего свидетельствует о контаминации материала микрофлорой верхних отделов дыхательных путей, а не об этиологической значимости этих мироорганизмов [86]. Другие учитывают любые микроорганизмы, если они встречаются в мокроте в концентрации 10 5 КОЕ/мл, третьи – в концентрации 10 6 КОЕ/мл [76], четвертые – 10 4 КОЕ/мл [60]. Следует помнить, что состав нормальной микрофлоры верхних дыхательных путей очень разнообразный и вариабельный, и для правильной интерпретации результатов бактериологического исследования мокроты требуется алгоритм определения того или иного микроорганизма как этиологически значимого. Современные отечественные и международные руководства по лечению ВП подчеркивают необходимость установления этиологического диагноза для выбора этиотропной терапии, что существенно повышает требования к уровню лабораторного обследования больных [40]. Существуют трудности этиологической диагностики ВП, которые в значительной степени определяются отсутствием универсального информативного субстрата для исследования (слюна, мокрота, мазки из зева, бронхоальвеолярный лаваж, плевральная жидкость, бипсийный материал из органов дыхательной системы). При этом ни один из субстратов не является предпочтительным для обнаружения большинства возбудителей ВП [41]. В таблице 7 представлена информация о том, какие биологические субстраты целесообразно исследовать при выявлении определенных видов микроорганизмов – потенциальных возбудителей ВП [1]. 40 Таблица 7. Материалы, рекомендуемые для исследования при выявлении возбудителей ВП [1]. Вид возбудителя Рекомендуемые субстраты Streptococcus pneumonia Мокрота, кровь,транстрахеальный аспират, Содержимое плевральной полости при эмпиэме, биоптат легкого Мокрота, кровь,транстрахеальный аспират, Содержимое плевральной полости при эмпиэме, биоптат легкого Мокрота, биоптат легкого, плевральная Haemophillus influenza Legionella spp. жидкость, транстрахеальный аспират Мазок из носоглотки Chlamydophilla pneumoniae Chlamydophilla psitacci Mycoplasma pneumoniae Мазок из носоглотки Вирус гриппа Мазки-отпечатки из носоглотки Вирус парагриппа Смывы из носоглотки Аденовирус Смывы из носоглотки Респираторный синцитиальный вирус Мазки-отпечатки из носоглотки (RSV) Традиционно микробиологическим этиологическая диагностика ВП ограничивается исследованием мокроты. В исследовании Синопальникова А.И. описано, что диагностическая ценность микробиологических исследований мокроты «сдерживается» тем, что: а) примерно у 30 % больных пневмонией кашель имеет непродуктивный характер; б) выделение культуры возбудителя из мокроты возможно не ранее, чем через 48 часов от момента ее посева; в) ряд пневмотропных возбудителей принципиально не могут быть выделены из мокроты при использовании стандартного набора питательных сред – прежде всего это касается факультативных и облигатных внутриклеточных возбудителей (M. pneumoniae, С. рneumoniaе, L. pneumophila); г) имеются трудности в разграничении «резидентных» и патогенных микроорганизмов, колонизирующих дыхательные пути; д) для полноценного микробиологического исследования пригодны лишь образцы мокроты, содержащие менее 10 клеток плоского эпителия и более 25 лейкоцитов в поле зрения микроскопа (при х100); е) результативность 41 микробиологического исследования существенно снижается у «предлеченных» больных, т.е. у получавших антибиотики до момента забора мокроты [25]. Прижизненное определение этиологии ВП позволяет повысить качество лечения пациентов, уменьшить риск осложнений, сократить сроки реабилитации больных. Однако, в связи с приведенными выше причинами этиологический фактор ВП при бактериологическом обследовании больных не всегда удается установить. Процент положительных находок возбудителя бактериологическим методом значительно колеблется у разных авторов – от 2,1 до 96% [2, 11, 16, 17, 19, 25, 31]. В настоящее время сохраняется мнение о доминирующей роли пневмококка в этиологии ВП [38]. Однако авторы приводят разные данные по удельному весу S.pneumoniae в этиологии ВП. На это влияют методы выявления возбудителя, возраст пациента, условия лечения, наличие фактров риска. Так, по последним рекомендациям по диагностике, лечению и профилактике пневмоний, на долю пневмококка приходится от 30 до 50% случаев заболевания [27, 39, 40]. В последние годы возрастает эпидемиологическая значимость ранее малоизвестных трудно культивируемых возбудителей пневмонии, таких как M. pneumoniae, С. рneumoniaе, L. pneumophila, на долю которых в сумме приходится от 8 до 30 % случаев заболевания [36]. Клинические проявления инфекций дыхательных путей, вызванных атипичными и традиционными патогенами, существенно не отличаются [38]. Для выявления M. pneumoniae используют культуральный и иммунологические (детекция антигена в биологических субстратах, определение специфических антител в крови) методы. Выделение M. pneumoniae в культуре является трудоемким и дорогостоящим процессом, требующим исключительно богатых питательных сред со строго определенным осмотическим давлением, а также длительных (до нескольких недель) сроков инкубации [14, 29, 128]. Аналитическая чувствительность культурального метода при выявлении M. pneumoniae может быть не более 50-60% даже при самом тщательном соблюдении методик культивирования [31, 80]. Для выявления антигенов M. pneumoniae в мазках из носоглотки, мокроты и другого клинического материала пользуются реакцией иммунофлюоресценции (РИФ), реакцией агрегет-гемагглютинации (минимальный диагностический титр 1:8) и иммуноферментным методом (ИФА) (минимальный диагностический титр 1:200) [38] . Однако широкому распространению данных техник мешает низкая чувствительность и возможность перекрестных реакций с другими видами микоплазм, находящимися в дыхательных путях. Учитывая, что концентрация клеток M. pneumoniae в образцах 42 мокроты от инфицированных пациентов обычно составляет 102 - 106 КОЕ/100мкл пробы, а неамплификационные методы антиген-детекции имеют аналитическую чувствительность порядка 10 3- 104 КОЕ/100мкл пробы, поэтому их применение для диагностических целей не рекомендуется в ряде стран, в частности в США [128]. Наиболее распространенным методом диагностики M. pneumoniae-инфекции в настоящее время является исследование на наличие специфических антител к антигенам микоплазм. Однако, применение серологических методов как единственного средства детекции редких и труднокультивируемых возбудителей заболеваний органов дыхания имеет серьезные ограничения. Серологические тесты требуют одновременного выявления специфических антител в парных сыворотках, отобранных в острой фазе заболевания и через 2-3 недели, поэтому диагноз может быть поставлен на основании четырехкратного увеличения титра антител только ретроспективно [102, 119, 128]. J.W. Dorigo-Zetsma с соавторами показали, что у пожилых людей с пневмонией, у которых M. pneumoniae выявлялась методом ПЦР, а серологически это не подтверждалось, может быть дефицит антител за счет естественной недостаточности гуморального звена иммунной системы вследствие процесса старения [66]. Ряд современных тест-систем позволяет выявлять специфические IgM антитела в ранние сроки болезни. Однако, у взрослых пациентов может не происходить выработки IgM в ответ на повторное инфицирование атипичными агентами, в таких случаях реинфекция приводит непосредственно к IgG-ответу. Наконец, атитела класса G могут длительно присутствовать после перенесенного заболевания. Чувствительность и специфичность серологических методов колеблются от 55 до 100% в зависимости от метода и испытуемой группы пациентов [28, 119]. Для диагностики ВП, вызванных бактериями рода Chlamydophila используют культуральные, серологические (реакция связывания комплемента (РСК), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), микроиммунофлюоресценция – (МИФ), ИФА) методы, метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) [39, 40, 85]. Определение хламидий культуральным специализированных лабораториях, поскольку их методом рост возможно происходит только в в монослое эукариотических клеток [15]. Кроме того, из-за чувствительности возбудителей к факторам внешней среды критическое значение имеют условия забора, транспортировки и хранения проб клинического материала, предназначенных для исследования культуральным методом [77, 90]. Для работы с C. psittaci необходимо соблюдение особых мер безопасности, поэтому культуральные исследования при орнитозе проводятся только в немногих референтных лабораториях. С. рneumoniaе отличается слабым и медленным ростом на культурах клеток, поэтому исследование является длительным, дорогим, 43 трудоемким и мало чувствительным, проводится только в научных целях в специализированных лабораториях [40]. Хламидийные антигены могут выявляться в респираторных образцах с помощью ПИФ с использованием видовых и родовых специфических моноклональных антител. Данный метод для выявления С. рneumoniaе недостаточно чувствителен (50%) и мало эффективен из-за низкой концентрации возбудителя. Клиническим материалом для данного исследования может служить не только мокрота, но и мазки из глотки. Однако антиген может выявляться в течение нескольких месяцев после перенесенной острой инфекции, затрудняя интерпретацию результатов. Для C.psittaci не получены специфические антитела вследствие высокой антигенной вариабельности данного возбудителя [29, 39]. Наиболее распространены респираторного тракта для диагностики хламидийных инфекций серологические методы. В РСК используется родовой специфичный антиген, метод является относительно чувствительным и специфичным в диагностике орнитоза. Ввиду того, что у взрослых большая часть инфекций С. рneumoniaе является реинфекциями, ответ в РСК отсутствует или слабый – лишь 10-25% больных имеют диагностически значимые титры комплементсвязывающих антител [13, 39]. Описано несколько методов ИФА, существуют коммерческие тесты на ее основе, однако их существенное превосходство над РСК не показано [39]. Метод МИФ позволяет выявить видоспецифический антительный ответ, который, однако, может быть отсрочен на 4-6 недель, особенно в случае реинфекции С. рneumoniaе. Кроме того, МИФ может пропускать случаи инфекции C.psittaci, что определяется набором сероваров, включенных в тест. Широкое распространение носительства и персистенции хламидий, наличие нескольких видов возбудителей, имеющих общий родовой антиген, значительно затрудняет интерпретацию результатов серологической диагностики. Достоверным показателем инфекции одним из видов хламидий может быть только выявление антител в высоких титрах 1:64, 1:256 к одному из видов при постановке реакции с антигенами всех видов хламидий [29]. Существует несколько основных традиционных методических подходов к диагностике легионеллезной внебольничной пневмонии: культуральный метод, выявление возбудителя в клиническом материале с помощью метода иммунофлюоресценции, определение растворимого антигена легионелл в моче, исследование уровня антител в сыворотке крови пациентов [29, 30, 39, 46, 49]. 44 Материалом для культурального исследования служат кровь, мокрота, плевральная жидкость, образцы, полученные при бронхоскопии, биоптаты легкого, аутопсийный материал. Культуральное исследование обладает 50-60% чувствительностью и 100% специфичностью. Для культивирования возбудителя используют специальные селективные питательные среды, инкубацию проводят в атмосфере, обогащенной 2,5-3% СО2, при 350С и влажности около 65% не менее 5-7 суток. Основные проблемы, связанные с проведением культурального исследования, включают отсутствие мокроты у пациентов, предшествующее лечение антибиотиками, длительность и высокая стоимость исследования [29, 102]. Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) используется для выявления L. pneumophila в острый период заболевания в клиническом материале, полученном из нижних дыхательных путей инвазивными методами (материал бронхоскопии, биопсии, плевральный экссудат). В мокроте возбудитель выявляется редко [39]. Метод имеет 2566% чувствительность [36, 39, 40]. Выявление растворимого антигена L.pneumophila серогруппы 1 в моче иммуноферментным методом является достаточно высокочувствительным (70-95%) и специфичным (80%) тестом. Результаты могут быть получены быстро в ранние сроки заболевания, что делает этот метод ценным для своевременной диагностики заболевания. Следует отметить, что этот метод позволяет выявлять только антигены L.pneumophila серогруппы 1 и не определяет инфекцию, вызванную другими Legionella spp [29]. Серологическая диагностика легионеллеза носит в основном ретроспективный характер, так как нарастание титров специфических антител отмечается не ранее 14-21-го дня от начала болезни. Достоверным серологическим критерием легионеллеза у пациента с клинически и рентгенологически подтвержденной внебольничной пневмонией считается 4-кратное и более нарастание уровня специфических антител к L.pneumophila при исследовании парных сывороток в реакциях непрямой иммунофлюоресценции или микроагглютинации [39, 52, 54]. Для обнаружения M. catarrhalis в материале из респираторного тракта чаще всего используют бактериоскопический и бактериологический методы, при этом дифференциация истинного возбудителя от нормальных контаминантов того же вида представляет определенную сложность. Таким образом, важное значение имеет качественное получение исследуемого материала [39, 69]. Для диагностики инфекций, вызванных вирусами простого герпеса, используются вирусологические, цитоморфологические, серологичесикие методы (РСК, РПГА, ИФА, МИФ). Вирусологическое обнаружение HSV I/II путем заражения клеточных 45 культур, заражения 12-13-дневных куриных эмбрионов, заражения лабораторных животных доступно лишь для специализированных вирусологических лабораторий. Продолжительность данных исследований составляет от 2 до 14 дней. Преимуществами вирусологических методов являются высокие чувствительность и специфичность, а также возможность проведения дополнительной дифференцировки выделенных штаммов антигенным и биологическим свойствам. Недостатками этих методов являются высокая стоимость, ограниченная доступность и относительная длительность [15]. Цитологическим подтверждением инфекции служит присутствие в соскобах с пораженных участков крупных, многоядерных клеток с внутриядерными ацидофильными включениями. Однако метод не является специфичным, т.к. схожая картина наблюдается при инфицировании клеток рядом других вирусов [15]. Классические серологические реакции типа РСК, РПГА в силу их низкой чувствительности, высокой трудоемкости, невозможности автоматизации в настоящее время отступают иммуноферментных на второй тест-систем план. для Имеется выявления большой HSV выбор коммерческих I/II-антигенов. Однако специфичность данного метода может снижаться из-за возможности перекрестных реакций вируса простого герпеса I и II типа с другими герпесвирусами человека (цитомегаловирусом, вирусом Эпштейна-Барр и др.). Чувствительность метода составляет в зависимости от периода заболевания от 35 до 75%. Метод ИФ заключается в регистрации реакции антиген-антитело с использованием коммерческих меченых антигерпетических антител. Метод характеризуется доступностью, экспрессностью, невысокой стоимостью, к его недостаткам можно отнести невысокие чувствительность и специфичность, субъективность при учете результатов. Определение противогерпетических антител (нарастание титра, выявление IgM антигел) имеет значение лишь при первичной инфекции, т.к. они обнаруживаются у большинства людей, а рецидивы, как правило, не дают серологических сдвигов [15, 82]. При определении активной CMV-инфекции используются серологические, вирусологические, гистологические методы. В настоящее время можно считать доказанным, что определение в крови больного специфических антител класса IgМ и/или существенного увеличения титров антител класса IgG, наличие CMV в слюне, моче, сперме, вагинальном секрете недостаточно ни для установления факта активной репликации вируса, ни для подтверждения диагноза манифестной CMV-инфекции [7, 12, 24]. Напротив, обнаружение вируса (его антигенов или ДНК) в крови имеет важное диагностическое значение. Определение в лейкоцитах крови структурного раннего вирусного антигена (рр65) иммуноцитохимическим методом говорит об активной 46 вирусной инфекции [50, 80]. Обнаружение вирусных антигенов быстрым культуральным методом в биологическом материале путем анализа инфицированных ими клеток культуры считается достаточно специфическим методом, доказывающим наличие у больного инфекционно активного вируса [19]. ГЛАВА 6. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВП Молекулярно-биологические методы, такие как ПЦР и ее модификации, являются важным инструментом для этиологической диагностики пневмоний, особенно ВП, вызванных трудно культивируемыми микроорганизмами, что подтверждается многочисленными клиническими испытаниями [10, 57, 58, 66, 67, 76, 80, 81, 92, 94, 107, 110]. Метод ПЦР позволяет исследовать любой биологический субстрат, не зависит от жизнеспособности микроорганизма, обладает высокой чувствительностью, специфичностью, скоростью получения результата, возможностью одновременного исследования большого числа проб. Ряд авторов [39, 94] не одобряет применение ПЦР для выявления бактериальных возбудителей ВП (пневмококков, хламидий, микоплазм и др.), а рекомендует использовать его лишь для обнаружения вирусных этиологических агентов. С нашей точки зрения, это не логично и не обосновано, так как другие методы (иммунологические, серологические) менее достоверны и информативны. За последние годы на основе ПЦР разработаны современные диагностические технологии, обладающие высокой чувствительностью, специфичностью, в которых преодолены недостатки исходного варианта. Разработаны и утверждены в 2012 году Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко Методические рекомендации МР 4.2.0060-12 «Выявление редких труднокультивируемых форм возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания с использованием метода ПЦР» [10]. Сущность (амплификации) ПЦР метода исследуемых заключается локусов в нуклеиновых многократном кислот повторении термостабильной полимеразой с тем, чтобы наработать достаточное для классических методов детекции (электрофореза и гибридизации) количество ДНК. Этот процесс достигается введением в реакционную смесь коротких молекул ДНК (праймеров), комплементарных искомой нуклеотидной последовательности того инфекционного агента, который необходимо обнаружить. Связывание праймеров с соответствующими участками ДНК/РНК приводит к образованию локальной двухцепочечной структуры, узнаваемой полимеразой, которая начинает достраивать ее в направлении 5҆ - 3҆, утилизируя дезоксинуклеозидтрифосфаты, 47 присутствующие в реакционной смеси. Таким образом, если один из праймеров связывается с прямой цепью, а другой – с обратной, происходит наработка продукта, ограниченного с двух сторон этими праймерами. Поскольку каждый из вновь образованных участков ДНК также является матрицей для дальнейшей амплификации, происходит экспоненциальное достигается изменением увеличение температуры их количества. реакционной Цикличность смеси: сначала реакции происходит денатурация двухцепочечных молекул ДНК при температурах, близких к 100ºС (как правило, 95ºС), затем охлаждение до температуры связывания (отжига) праймеров с комплементарными участками нуклеиновых кислот, далее нагрев до оптимальной температуры работы термостабильной полимеразы, в результате чего происходит синтез ДНК (как правило, 72ºС) [40, 110]. Трехстадийные циклы повторяются друг за другом. Каждый цикл удваивает количество копий участка-мишени. Происходит экспоненциальное увеличение количества фрагмента ДНК приблизительно по формуле 2 n, где n число циклов амплификации. Праймеры включаются в продукты синтеза и определяют размеры амплифицируемого фрагмента. Он равен расстоянию между 5'концами праймеров, отожженных на исследуемом участке ДНК. При детекции инфекционных агентов проводится не менее 40 циклов ПЦР. Если в исследуемом образце нет нуклеиновых кислот выявляемого микроорганизма, специфический фрагмент ДНК не синтезируется. Затем происходит пост-ПЦР-анализ полученных продуктов амплификации (ампликонов) при помощи электрофореза или гибридизации. Принцип электрофореза заключается в разделении ампликонов под действием электрического поля в агарозном или полиакриламидном геле. Гибридизация заключается в нанесении на твердую фазу (например, микропланшет) олигонуклеотидных зондов, комплементарных внутренней структуре исследуемых ампликонов (прямая гибридизация), или полученных ампликонов (обратная гибридизация). Добавление в первом случае ампликонов, а во втором – зондов, меченных либо радиоактивными метками, либо флуоресцентными, либо конъюгированными с ферментом. Способным осуществлять цветную реакцию (например, пероксидаза хрена), приводит к образованию комплексов, которые можно обнаружить при помощи соответствующих методов. С целью контроля ингибирования ПЦР современные ПЦР-диагностикумы содержат внутренние контрольные образцы ДНК (ВКО). Они вносятся в исследуемую пробу на стадии обработки и амплифицируются на стадии ПЦР наряду с ДНК выявляемого инфекционного агента. При этом синтезируется фрагмент ДНК, отличающийся по размеру от фрагмента «ДНК-мишени». Отсутствие фрагмента ВКО при 48 отсутствии специфического фрагмента свидетельствует о подавлении ПЦР. Для предотвращения контаминации реактивов и исследуемых проб фрагментами ДНК продуктами ПЦР (ампликонами) используются ферментативные системы инактивации ампликонов. Чувствительность и специфичность ПЦР приближаются к 100%. Для решения конкретных задач разработаны различные модификации метода ПЦР. Вложенная (nested) ПЦР, в которой ПЦР-продукт, синтезированный с ДНКмишени с использованием первой пары праймеров на первом этапе, служит в качестве матрицы и подвергается амплификации с использованием второй пары праймеров на втором этапе. При этом фрагмент, синтезированный на втором этапе, имеет меньший размер и представляет собой последовательность нуклеотидов центральной части первого фрагмента. За счет двухстадийности метод обладает большей, чем одношаговая ПЦР, специфичностью и чувствительностью, особенно когда в пробе присутствует минимальное количество возбудителя [40]. Возможность количественного определения возбудителя ВП имеет важное диагностическое значение. Так, J. W. Dorigo-Zetsma с соавторами предположили, что концентрация микробных клеток M. pneumoniae в пробе может быть связана с тяжестью клинического заболевания [67]. С помощью полуколичественной nested ПЦР, основанной на разведении нуклеиновой кислоты, выделенной из смывов с задней стенки зева пациентов с M. pneumoniae-инфекцией, они рассчитали, что микробная нагрузка в образцах составляла госпитализированных от 20 до пациентов 3830 КОЕ/мл. Средняя была значительно нагрузка выше, чем в в пробах пробах негоспитализированных [66, 67]. Сообщается о разработке новых тест-систем, использующих принцип nested ПЦР для выявления мутаций микроорганизмов, отвечающих за резистентность к антибиотикам [93]. Методы, базирующиеся на амплификации РНК, также являются высокочувствительными вследствие большого числа копий rРНК в микробных клетках, кроме того, положительный результат анализа говорит о жизнеспособности микроорганизма-мишени. ПЦР с гибридизационно-ферментным выявлением продуктов амплификации обладает высокой специфичностью и может иметь более высокую чувствительность по сравнению со стандартным способом визуализации продуктов ПЦР после электрофореза в агарозном геле [46]. С целью уменьшения себестоимости и повышения эффективности исследования разработаны мультиплексные ПЦР тест-системы, позволяющие выявлять в 49 одной реакции нескольких инфекционных агентов. При этом используется не одна пара, а несколько пар праймеров, специфичных к разным объектам [74, 94, 98, 107, 129, 131]. Наиболее важным достижением последних лет в развитии и совершенствовании ПЦР является разработка технологии ПЦР в реальном времени (Real-time PCR). В отличие от классического метода в данном варианте ПЦР отсутствует отдельная стадия детекции продукта амплификации, информация о синтезе фрагмента ДНК или отсутствии синтеза снимается прибором непосредственно на стадии ПЦР. Остаются только два этапа: обработка и амплификация. Для осуществления ПЦР в реальном времени в реакционную смесь вводятся дополнительные флуоресцентные компоненты, которые по мере увеличения количества копий синтезируемого фрагмента параллельно увеличивают сигнал флюоресценции [52, 83, 125]. Сигнал считывается оптическим модулем ДНКамплификатора. Технология «ПЦР в реальном времени» имеет следующие преимущества: - в данном варианте возможна количественная оценка возбудителя в анализируемом субстрате, так как существует связь между характером кривой нарастания оптического сигнала и исходным количеством копий ДНК; - из-за отсутствия стадии детекции пробирки с ампликонами (фрагментами ДНК) не открываются, в результате чего сводится к нулю возможность контаминации продуктами ПЦР исследуемого материала и реактивов, что уменьшает вероятность получения ложноположительного результата; - значительно снижена трудоемкость и уменьшена продолжительность исследования; - возможно проведение мультиплексного анализа (в одной пробирке можно исследовать 56 специфических нуклеотидных последовательностей – возбудителей ВП). -существенно повышена достоверность исследования, объективность оценки качества результатов, так как флуоресцентные методы детекции результатов ПЦР полностью автоматизированы, учет и обработку данных проводит компьютерное программное обеспечение, таким образом исключаются субъективные ошибки при анализе результатов. D. Hardegger применил метод real-time ПЦР для обнаружения M. pneumoniae и установил, что real-time ПЦР имеет сходные показатели чувствительности с nested ПЦР, но позволяет определять количество M. pneumoniae в пробе и сочетается с уменьшением доли ручного труда и времени исследования [76]. В одном из вариантов real-time ПЦР, получивший наименование TaqMan, наряду с праймерами для амплификации, в реакционную смесь входит третий олигонуклеотид, гомологичный центральной части участка-мишени. Он содержит на одном из концов метку - флюорофор, на другом – метку – гаситель флюоресценции. Данный праймер 50 гибридизуется с исходными ДНК–матрицами и вновь синтезированными ампликонами, при этом флюорофор и гаситель расположены рядом, за счет чего уровень флюоресценции невелик. У свободных зондов флюоресценция также гасится. В ходе синтеза ампликонов меченый олигонуклеотид мешает ДНК-полимеразе продвигаться по матрице и разрушается ею за счет экзонуклеазной активности. В результате флюорофор и гаситель разобщаются, и сигнал флюоресценции увеличивается. При синтезе каждого нового ампликона происходит гидролиз одного меченного праймера. Параллельно экспоненциальному нарастанию количества ампликонов идет экспоненциальное нарастание сигнала флюоресценции [47]. Наряду с разновидностями метода ПЦР для практической диагностики используется ряд других технологий, также базирующихся на принципе амплификации нуклеиновых кислот. Наибольшее распространение для диагностики ВП получила изотермическая транскрипционная амплификация - NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification). Этот метод позволяет проводить амплификацию РНК при фиксированном температурном режиме (41о С) за счет совместного действия трех ферментов: обратной транскриптазы, РНКазы Н и РНК-полимеразы фага Т7 E. coli [94]. Разновидности современных ПЦР тест систем для выявления возбудителей ВП представлены в таблице 8. Все новации последних лет в области молекулярно-генетических методов нашли свое отражение в этиологической диагностике воспалительных и инфекционноаллергических заболеваний органов дыхания, в частности внебольничных пневмоний. Большое количество публикаций 2002-2012 гг., посвященных выявлению инфекционных агентов - возбудителей ВП с применением ПЦР тест- систем, показали существенное преимущество молекулярно-биологических методов в чувствительности, специфичности, быстроте исполнения по сравнению с традиционными культуральными и иммунологическими методами [10, 66, 73, 76, 92, 98, 99, 100, 107, 110, 118, 122, 129, 131]. Так ПЦР анализ 856 носоглоточных проб на М.pneumoniae u C. рneumoniae занял 7 дней, аналогичное количество сывороток на антитела к этим микроорганизам исследовали 13 дней [52]. В России ПЦР-тест системы для выявления возбудителей ВП производят ЦНИИЭ, ЗАО «НПФ ДНК-технология», ООО НПФ «Литех», ЗАО «Вектор-Бест», «Ниармедик», «Диагенис». Лидером среди отечественных производителей является Центральный НИИ эпидемиологии, тест системы которых существенно (на 25-30%) дешевле аналогичных систем других производителей. 51 Таким образом, ПЦР-анализ, как и другие методы амплификации нуклеиновых кислот, является ценным диагностическим инструментом, который способен улучшить диагностику инфекционных заболеваний органов дыхания, включая внебольничные пневмонии, и должен широко использоваться в клинической медицине. Молекулярногенетические методы могут успешно использоваться и для контроля этиотропной терапии ВП, и для генотипирования эпидемически значимых штаммов - широкого спектра возбудителей внебольничных пневмоний. Таблица 8. Примеры современных тест-систем для выявления возбудителей ВП Тип и характеристика тест- Назначение тест-системы Страна системы (ссылка) Сопряженная с обратной транскрипцией мультиплексная ПЦР тестсистема с гибридизационноферментным выявлением продуктов ПЦР Мультиплексная ПЦР тестсистема с электрофоретическим выявлением продуктов амплификации Мультиплексная real-time ПЦР тест-система с возможностью количественного определения патогенов Real-time ПЦР тест-система с возможностью контроля ингибирования амплификации Мультиплексная real-time NASBA тест-система Мультиплексная ПЦР тестсистема с гибридизационноферментным выявлением продуктов ПЦР Триплексная SYBR green realtime ПЦР без экстракции ДНК Выявление 9 инфекционных агентов в одном исследовании: M. pneumoniae, С. pneumoniaе, вирусы гриппа А и В, вирусы парагриппа 1 и 2 типа, энтеровирус, аденовирус, респираторносинтициальный вирус Выявление 3 инфекционных агентов в одном исследовании: M. pneumoniae, С. pneumoniaе, L. pneumophila Германия [118] Турция [107] Количественное определение 3 Швейцария инфекционных агентов в одном [131] исследовании: M. pneumoniae, С. pneumoniae, L. pneumophila Выявление M. pneumoniae с предотвращением ложноотрицательного результата Выявление 3 инфекционных агентов в одном исследовании: M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella spp. Высокочувствительное выявление 5 инфекционных агентов в одном исследовании: M. pneumoniae, C. pneumoniae, L. pneumophila, L. micdadei, B. Pertussis Выявление 3 инфекционных агентов в одном исследовании: M. pneumoniae, C. pneumoniae, Legionella spp. с использованием высокочувствительного флуоресцентного индикатора двухцепочечной ДНК Бельгия [125] Бельгия [94] США [85] Таиланд [84] 52 Список литературы 1. Барлетт Д. Д. Инфекции дыхательных путей. Пер. с англ. /Д. Д. Барлетт. – М.: Бином. 2000. –192с. 2. Бачинская Е.Н. Возбудители внебольничных пневмоний на пороге нового тысячелетия // Антибиотики и химиотерапия. –2000. – Т. 45. №11. – С. 21-28. 3. Белоцерковская Ю. Г. Роль Chlamydophila pneumoniae в бронхолегочной патологии человека / Ю. Г. Белоцерковская, А. И. Синопальников // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2008. – Т. 10.- №1. - С. 15-24. 4. Булгакова В.А. Хламидийная и микоплазменная инфекции при атопической бронхиальной астме у детей /В.А. Булгакова, И.В.Зубкова //Инфекционные болезни.2008.- Т.6.- №3.- с.56-60. 5. Вишнякова Л.А. Роль Streptococcus pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae и Chlamydia pneumoniae при внебольничной пневмонии у детей/ Л.А.Вишнякова, М.А. Никитина, С.И. Петрова и др.// Пульмонология.- 2005.-№3. – с.43-47. 6. Волков И.К. Moraxella catarrhalis при хронических и рецидивирующих заболеваниях органов дыхания у детей/ И. К. Волков, Л.К. Катосова, Н. Ю. Щербакова и др.// Антибиотики и химиотерапия: ежемесячный научно-практический журнал/ Государственный НЦ по антибиотикам (М.). -М.: Медицина, 2004. -Том 49. № 8/9. -С. 4347. 7. Ведяков А.М. Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловируной инфекции у больных с аллотрансплантатами органов /А.М. Ведяков, М.С. Долгих // Тер.архив. – 1998. – Т.4. – С. 45-48. 8. Гранитов В.Н. Герпесвирусная инфекция. – М.: Мед.книга. -2001. -80с. 9. Егоров А.М. Хламидии: молекулярная организация клетки и некоторые особенности патогенеза инфекций/ А.М. Егоров, Ю.О. Сазыкин // Антибиотики и химиотерапия. –2000. –Т. 45. - №4. –С. 3-5. 10. Ефимов Е.И. воспалительных Выявление редких заболеваний органов труднокультивируемых дыхания с форм использованием возбудителей метода ПЦР: методические рекомендации (МР 4.2.0060-12) /Е.И. Ефимов, В.Н Мазепа, Н.Ф. Бруснигина, О.М. Черневская, К.А. Орлова, М.А. Махова, Е.В. Сперанская, Н.Н. Кленина, Л.Е. Скобло // Бюллетень нормативных и методических документов госсанэпиднадзора. – Москва.- 2012 .- выпуск 4. – декабрь (50) .- С.136-143. 53 11. Казаков С.П. Особенности диагностики и лечения атипичных легочных заболеваний в Российском госпитале в Косово / С.П.Казаков, Ю.В. Папенко, Б. Хоркаи // Военномедицинский журнал. –2004. - №3. – С. 38-39. 12. Каражас Н.В. Эпидемиологическая характеристика цитомегаловирусной инфекции и пневмоцитоза как оппортунистических инфекций. Автореф. дис. д-ра мед. наук. – М. – 2002. – 40 с. 13. Карапетян Т.А. Внебольничная пневмония сегодня/ Т.А. Карапетян//Вестник СанктПетербургского университета Серия 11: Медицина.-2008.- №1.-С.1-14. 14. Катосова Л.К. Этиологическая диагностика острых пневмоний у детей /Л.К. Катосова, Т.В. Спичак, С.С. Ким и др.// Вопросы диагностики в педиатрии.-2009.-№2.- с.27-31. 15. Козлова В.И. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий / В.И. Козлова, А.Ф. Пухнер. 6-е изд. – М.: Триада-Х. – 2003. – 440 с. 16. Лещенко В.И. Внебольничные пневмонии: диагностика и лечение /В.И. Лещенко, З.И. Бобылева // Medlinks.ru 01.02.2003 17. Манзенюк И.Н. Пневмония, вызванная Chlamydophila (Chlamydia) pneumoniae: клиника, диагностика и лечение / И.Н. Манзенюк, М.С. Воробьева, С.С. Ямникова // Антибиотики и химиотерапия. – 2001. – Т. 46. - № 1. – С. 22-29. 18. Маянский А.Н. Микробиология для врачей/ А.Н. Маянский – Н.Н. НГМА. – 2001. 394с. 19. Мельниченко П.И. Особенности эпидемиологии и профилактики пневмоний у военнослужащих в условиях локальных войн и вооруженных конфликтов./ П.И.Мельниченко, П.И.Огарков, С.Д. Жоголев, Харитонов М.А., В.Н. Комаревцев // Военно-медицинский журнал. – 2001. - №8. – С. 54-61. 20. Нисевич Л.Л. Врожденные вирусные инфекции и маловесные дети / Л.Л. Нисевич, А.Г. Талалаев, Л.Н. Каск и др. // Вопр. совр. пед. – 2002. – Т.1. – С. 9-13. 21. Орджоникидзе Н.В. Цитомегаловирусная инфекция и беременность / Н.В. Орджоникидзе, В.Л. Тютюник // Акуш. и гин. – 2002. - №3. – С. 59-63. 22. Покровский В.И. Этиологическая диагностика и этиотропная терапия острых пневмоний/ В.И Покровский, С.В. Прозоровский, В.В. Малеев и др. – М.: Медицина. – 1995. – 272с. 23. Покровский В.И. Коронавирус SARS – возбудитель атипичной пневмонии (временные методические рекомендации) / В.И. Покровский, В.В. Малеев, О.И. Киселев, А.А. Соминина, В.В. Зарубаев, Т.В. Сологуб, В.И. Киселев – СПб. М.: Лаборатория оперативной печати ф-та журналистики СпбГУ – 2003. - 55 с. 54 24. Русакова Е.В. Серологическая расшифровка этиологического диагноза смешанных респираторных инфекций // Е.В. Русакова, А.А. Хардина, И.С. Тартаковский и др. // Смешанные инфекции. –М.: Б.и. -1986. – С.37-41. 25. Синопальников А.И. Тяжелая внебольничная пневмония: этиологическая структура / А.И. Синопальников, О.В. Фесенко, Ю.Г. Тихонов, В.К. Дуганов // Антибиотики и химиотерапия. –2001. –Т. 46, №6. –С. 6-11. 26. Синопальников А.И. «Трудная» пневмония./ А.И. Синопальников, А.А. Зайцев // - М. 2010. – 56с. 27. Смолянинов А.Б. Внебольничные пневмонии. Современные представления об этиологии, патогенезе, диагностике и лечении внебольничных пневмоний /А.Б. Смолянинов, С.Н. Гресь // СПб: Нордмед-издат. – 2002. – 39с. 28. Сперанская Е.В. Изучение распространенности редких и труднокультивируемых возбудителей воспалительных заболеваний органов дыхания/ Е.В. Сперанская, В.Н. Мазепа, Е.И. Ефимов, Н.Ф. Бруснигина //ЖМЭИ. – 2012. №5. – с.3-8. 29. Тартаковский И.С. Современные подходы к диагностике атипичных пневмоний // Клинич. микроб. и антимикр. химиотерапия. – 2000. - №2. – С. 60-68. 30. Темежникова Н. Д. Лабораторная диагностика легионеллеза / Н. Д. Темежникова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. - №11. - С. 34-39. 31. Трубников Г.В. Внебольничная пневмония с атипичной (микоплазменной и хламидийной инфекцией)/ Г.В. Трубников, И.Г. Полякова, Л.Ю. Бутакова// Терапевтический архив.- 2009.- Т. 81.- №1.- с.16-20. 32. Фризе К. Инфекционные заболевания беременных и новорожденных / Пер. с нем. К. Фризе, В. Кахель. – М.: Медицина. – 2003. – 424 с. 33. Хроническая обструктивная болезнь легких. Практическое руководство для врачей / Под ред. А.Г. Чучалина // 2-е изд. – М. – 2004. – 278с. 34. Цизерлинг В.А. Роль хламидийной инфекции в патологии человека / В.А. Цизерлинг, Г.В. Шастина, В.Ф. Мельникова и др.//Ученые записки – СПБ,.: - Т.VI. -№ 4. – С. 92-99. 35. Цитомегаловирусная инфекция у детей раннего возраста. Руководство для врачей / Под ред. Н.А. Коровиной, А.Л. Заплатникова, А.В. Чебуркина, И.Н. Захаровой // 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Медпрактика. - М. – 2001. – 64 с. 36. Чубукова О.А. Совершенствование эпидемиологического и микробиологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за внебольничными пневмониями. Автореф. дис. канд. мед.наук. - Нижний Новгород. – 2012. – 26с. 55 37. Чучалин А.Г. Внебольничная пневмония у взрослых: практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике / А.Г. Чучалин, А.И. Синопальников, С.В. Яковлев, Л.С. Страчунский. – М. – 2003. – 30 с. 38. Чучалин А.Г. Пневмония с точки зрения доказательной медицины / А.Г. Чучалин, А.Н. Цой, В.В. Архипов, И.Б. Левшин. – М. –2002. – 111 с. 39. Чучалин А.Г. Пневмония / А.Г. Чучалин, А.И. Синопальников, Н.Е. Чернеховская. – М.: Экономика и информатика. - 2002. – 480 с. 40. Чучалин А.Г. Пневмония / А.Г. Чучалин, А.И. Синопальников, Л.С. Страчунский. – М.: МИА. - 2006. – 464 с. 41. Чучалин А.Г. Внебольничная пневмония у взрослых. Практические рекомендации по диагностике, лечению и профилактике /А.Г. Чучалин, А.И. Синопальников, Р.С. Козлов, И.Е. Тюрин, С.А. Рачина. – М. 2010. – 60 с. 42. Шахгильдян В.И. Клиническая характеристика, диагностика и лечение цитомегаловирусной инфекции // Мед. кафедра. – 2003. - №1. – С. 51-59. 43. Шахгильдян В.И. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧинфицированных пациентов / В.И. Шахгильдян, О.Ю. Шипулина, Н.В. Каражас // Эпид. и инф. болез. – 2001. - №1. – С. 36-40. 44. Шахгильдян В.И. Клинико-лабораторная характеристика, диагностика и лечение цитомегаловирусной инфекции у больных ВИЧ-инфекцией: Автореф. дис. канд.мед.наук. – М. – 1999. – 24 с. 45. Шипулина О.Ю. Полимеразная цепная реакция в диагностике цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов /О.Ю. Шипулина, В.И. Шахгильдян, Г.А.Шипулин // Вопр. вирус. – 1998. - №2. – С. 91-105. 46. Яцишина С.Б. Разработка и применение ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией для обнаружения Legionella pneumophila/ С. Б. Яцишина, С. А. Портенко, Т. С. Астахова и др.// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии: двухмесячный научно-практический журнал. -М.: С-ИНФО, 2008. -№2. - С. 29-37. 47. Apfalter P. Comparison of a new quantitative ompA-based real-Time PCR TaqMan assay for detection of Chlamydia pneumoniae DNA in respiratory specimens with four conventional PCR assays / P. Apfalter, W. Barousch, M. Nehr et al. // J. Clin. Microbiol. – 2003 – V. 41.- №2. - P. 592-600. 48. Abuhammour W.M. Moraxella catarrhalis bacteremia: a 10-year experience/ W.M. Abuhammour, N.M. Abdel-Haq, B.I. Asmar et al.//South. Med. J.-1999.-Vol. 92.-P. 1071-1074. 56 49. Albert-Weissenberger C. Legionella pneumophila—a human pathogen that co-evolved with fresh water protozoa/ C. Albert-Weissenberger, C. Cazalet, C. Buchrieser//Cell. Mol. Life Sci.2007. –Vol.64.-P.432-448. 50. Allice T. Qvantitation of cytomegalovirus DNA by real time plymerase chein reaction in peripheral blood specimens of patient with solid organ transplants: comparison with end-point PCR and pp65 antigen test / T. Alice, M. Enrietto, F. Pittaluga et al. // J. Med. Virol. - 2006. Vol. 78, № 7. - P. 915-922. 51. Baer G. Role of Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae as causative agents of community-acquired pneumonia in hospitalised children and adolescents / G. Baer, G. Engelcke, M. Abele-Horn et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2003 – V.22. – №12. - P. 742-745. 52. Ballard A. L. Detection of Legionella pneumophila using a real-time PCR hybridization assay/ A. L. Ballard, N. K. Fry, L.Chan et al. // J. Clin..Microbiol. – 2000.- Vol.38.-P. 4215– 4218. 53. Bartlet J.G. Practice guidelines for management of community acquired pneumonia in adults. Guidelines from the infectious diseases of America.// Clin. Infect. Diseases. - 2000. - V.31. P.347-382. 54. Benkel D.H. Outbreak of Legionnaires disease associated with a display whirpool spa/ D.H. Benkel, E.M. McClure, D. Woolard et al.// Int J Epidemiol. – 2000.- Vol. 29.-№6. -P.1092-1098. 55. Blasi F. Epidemiology of Chlamydia pneumoniae./ F. Blasi, P. Tarsia, C.Arosio et al.// Clin. Microbiol. Infect. – 1998. - V. 4.- P.1-6. 56. Boe J. Lung transplantation / J. Boe, M. Estenne, W. Weder // Eur. resp. monograph. – 2003. – V.8. – P. 300. 57. Boman J. Rapid diagnosis of respiratory Chlamydia pneumoniae infection by nested touchdown polymerase chain reaction compared with culture and antigen detection by EIA/ J. Boman, A. Allard, K. Persson, et al. // J. Infect. Dis. - 1997. -Vol.175. - P.1523-1526. 58. Boman J. Molecular diagnosis of Chlamydia pneumoniae infection/ J. Boman, C.A. Gaydos, T.C. Quinn// J. Clin. Microbiol.-1999.-Vol.37.-№12.-P. 3791-3799. 59. Coombes B.K. cDNA array analisis of altered gene expression in human endothelial cells in response to Chlamydia pneumoniae infection / B.K. Coombes, J.B. Mahony // Infect. Immun. – 2001. – V. 69. - №3. – P. 1420-1427. 60. Carroll K.C. Laboratory Diagnosis of Lower Respiratory Tract Infections: Controversy and Conundrums/ K.C. Carroll//J. Clin. Microbiol. - 2002.-Vol. 40(9).-P. 3115–3120. 57 61. Cundell D.R. Relationship between colonial morphology and adherence of Streptococcus pneumoniae. / D.R. Cundell , J.N. Weiser J.N., J. Shen J., A. Young, E.I. Tuomanen. //Infect Immun . -1995. -№ 3 Р. 57-61. 62. Cunha B.A. Legionnaires' disease: clinical differentiation from typical and other atypical pneumonias/ B.A. Cunha// Infect. Dis. Clin. North. Am.- 2010.-Vol. 24.-P. 73-105. 63. Davis C.P. Isolation of Mycoplasma pneumoniae from synovial fluid samples in a patient with pneumonia and polyarthritis/ C.P. Davis, S. Cochran, J. Lisse et al.// Arch. Intern. Med.1988.-Vol.148.-P.969-970. 64. Dehoux M.S. Compartmentalized cytokine production within the human lung in unilateral pneumonia. /M.S. Dehoux, A. Boutten, J. Ostinelli et al. //Am J. Respir Crit Care Med. -1994 Vol.150. - P.710–716 65. Donnelly S. The Association between Mortality Rates and Decreased Concentrations of Interleukin-10 and Interleukin-1 Receptor Antagonist in the Lung Fluids of Patients with the Adult Respiratory Distress Syndrome / S. Donnelly, R.M. Strieter., P.T Reid., S.L Kunkel, M.D.Burdick, I. Armstrong.// Eur Respir J. – 1996. - Vol. 125 Iss. 3 H 191-196 66. Dorigo-Zetsma J.W. Molecular detection of Mycoplasma pneumoniae in adults with community-acquired pneumonia requiring hospitalization/ J.W. Dorigo-Zetsma, R.P. Verkooyen, H.P. van Helden et al.//J. Clin. Microbiol. -2001. - Vol. 39.- P. 1184–1186. 67. Dorigo-Zetsma J. W. Results of molecular detection of Mycoplasma pneumoniae among patients with acute respiratory infection and in their household contacts reveals children as human reservoirs/ J. W. Dorigo-Zetsma, B. Wilbrink, H. van der Nat et al.//J. Infect. Dis.-2001.Vol.183.-P.675-678. 68. Esposito S. Characteristics of Streptococcus pneumoniae and atypical bacterial infection in children 2-5 years of age with community-acquired pneumonia/ S. Esposito, S. Bosis, R. Cavagna et al.// Clin. Infect. Dis.- 2002.-Vol.35.- №11.-P.1345-1352. 69. Fernandez M. Community acquired pneumonia in a hospitalized community: etiological study / M. Fernandez, M. Zagolin, M. Ruiz et al. // Rev. Med. Chil. – 2003. – V.131.- P. 498504. 70. Garbino J. Prospective epidemiologic survey of patients with community-acquired pneumonia requiring hospitalization in Switzerland / J. Garbino, R. Sommer, A. Gerber et al. // Int. J. Infect. Dis. – 2002. – V.6. - №4. – P. 288-293. 71. Gonzales R. Uncomplicated acute bronchitis / R. Gonzales, M.A. Sande // Ann. Intern. Med. – 2000. – V.133. – P. 981-991. 58 72. Grayston J. T. A new respiratory tract pathogen: Chlamydia pneumoniae strain TWAR / J. T. Grayston, L. A. Campbell, C. C. Kuo et al. // J. Infect. Dis.C. H. - 1990.-Vol. 161.P.618-625. 73. Gullsby K. Simultaneous detection of Chlamydophila pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae using molecular beacons in a duplex real-time PCR/ K. Gullsby, M. Storm, K. Bondeson// J. Clin. Microbiol.- 2008.- Vol. 46.- №2.-P.727-731. 74. Haaheim H. Laboratory diagnosis of respiratory diseases: PCR versus serology / H. Haaheim, L. Vorland, T.J. Gutteberg // Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. – 2001. - V. 20. – № 4-7. - P. 1255-1258. 75. Hammerschlag M. Pneumoniae due Chlamydia pneumonia in Children: Epidemiology, Diagnosis, and Treatment//Pediatric Pulmonology -2003. – V. 36.– P. 384-390. 76. Hardegger D. Rapid detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples by real-time PCR // J. Microbiol. Methods – 2000. – V.41. – P. 45-51. 77. Hindiyeh M. Laboratory diagnosis of atypical pneumonia/ M. Hindiyeh, K. C. Carroll//Semin. Respir. Infect.-2000.-Vol. 15.-P.101-113. 78. Heumann D . Gram-positive cell walls stimulate synthesis of tumor necrosis factor alpha and interleukin-6 by human monocytes. /D. Heumann , C. Barras, A. Severin, M.P. Glauser, A. Tomasz //Infect Immun . -1994. – v. 62. P.2715- 2721. 79. Howard L.S. Microbiological profile of community-acquired pneumonia in adults over the last 20 years/ L.S. Howard, M. Sillis, M.C. Pasteur et al.// J. Infect.-2005.-Vol. 50.-№2.-P. 107113. 80. Ieven M. Currently used nucleic acid amplification tests for the detection of viruses and atypicals in acute respiratory infections/M. Ieven// J. Clin. Virol. -2007.- Vol. 40.-№4.P.259-76. 81. Johansson N. Etiology of Community-Acquired Pneumonia: Increased Microbiological Yield with New Diagnostic Methods/N. Johansson, M. Kalin, A. Tiveljung-Lindell et al.// Clin. Infect. Dis. -2010.-Vol.50.-№2. -P. 202-209. 82. Juven T. Clinical profile of serologically diagnosed pneumococcal pneumonia/ T. Juven, J. Mertsola, P. Toikka et al.// Pediatr. Infect. Dis. J. – 2001. –Vol. 20. -№ 11. -Р.1028-1033 83. Kais M. Quantitative detection of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Moraxella catarrhalis in lower respiratory tract samples by real-time PCR/ M. Kais, C. Spindler, M. Kalin et al.// Diagn. Microbiol. Infect. Dis.-2006.-Vol. 55.-№3.-P.169-178. 84. Kerdsin A. Development of triplex SYBR green real-time PCR for detecting Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, and Legionella spp. without extraction of DNA/ A. Kerdsin, R. Uchida, C. Verathamjamrus et al.// Jpn. J. Infec.t Dis.- 2010.-Vol.63.-№3.-P.173180. 59 85. Khanna M. The Pneumoplex assays, a multiplex PCR-enzyme hybridization assay that allows simultaneous detection of five organisms, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia(Chlamydophila) pneumoniae, Legionella pneumophila, Legionella micdadei, and Bordetella pertussis, and its real-time counterpart/ M. Khanna, J. Fan, K. Pehler-Harrington et al.// J. Clin. Microbiol.-2005.-Vol.43.-P.565-571. 86. Kollinga U. K. Leucocyte response and anti-inflammatory cytokines in community acquired pneumonia / U. K. Kollinga, F. Hansena, J. Brauna et al. //Thorax - 2001( February )-Vol.56. – P.121-125. 87. Korppi M. Р How to diagnose Mycoplasma pneumonia etiology in a child with pneumonia?/ M. Korppi// Eur. J. Pediatr. – 2011.-Vol. 170. -№12. -P. 1619. 88. Kuoppa Y. Quantitative detection of respiratory Chlamydia pneumoniae infection by rialtime PCR / Y. Kuoppa, J. Boman, L. Scott et al. // J. clin. microbiol. – 2002. – V.40. – P. 22732274. 89. Kuroki H. Characterization of children with Mycoplasma pneumoniae infection detected by rapid polymerase chain reaction technique / H. Kuroki, M. Morozumi, N. Chiba, K. Ubukata // J. Infect. Chemother. – 2004. – V. 10. – №1. - P. 65-67. 90. Kurz H. Epidemiology and morbidity of mycoplasma as causative agent for communityacquired pneumonia in hospitalized children in a Community Hospital in Vienna / H. Kurz, , H. Göpfrich// Wien Med Wochenschr.- 2011.- Vol.161.-№7-8.-P.180-183. 91. Lidman C. Limited value of routine microbiological diagnostics in patients hospitalized for community-acquired pneumonia/ C. Lidman, L.G. Burman, A. Lagergren et al.// Scand. J. Infect. Dis.- 2002.-Vol. 34.-№12.-P.873-879. 92. Liu F.C. Rapid diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection in children by polymerase chain reaction/ F.C. Liu, P.Y. Chen, F.L. Huang et al. // J. Microbiol. Immunol. Infect. – 2007. Vol. 40. - №6. - P.507-512. 93. Lin C. Nested PCR-linked capillary electrophoresis and singl-strand conformation polymorphisms for detection of macrolide-resistant Mycoplasma pneumonia in Beijing, China/ C. Lin, S. Li, H. Sun et al. // J. Clin. Microbiol. – 2010..-Vol. 48. -№12.- P. 4567-4572. 94. Loens K. Detection of Mycoplasma pneumoniae by real-time nucleic acid sequence-based amplification / K. Loens, M. Ieven, D. Ursi et al. // J. Clin. Microbiol. – 2003. - V. 41. – №9. - P. 4448-4450. 95. Lui G. Role of “atypical pathogens” among adult hospitalized patients with communityacquired pneumonia /G. Lui, M. Ip, N. Lee et al.//Respirology – 2009 – Vol.14.- №8, P. 10981105. 60 96. Luna C.M. Community-acquired pneumonia: etiology, epidemiology and outcome at a Teaching Hospital in Argentina/ C.M. Luna,A. Famiglietti, R. Absi et al. // Chest- 2000.Vol.118.- №5.-P.1344-1354. 97. Matsushima T. Etiology and management of community-acquired pneumonia in Asia/ T. Matsushima, N. Miyashita, T.M. File// Curr. Opin. Infect.Dis.-2002.-Vol.15. - №2.-P.157-162. 98. McDonough E. A. A multiplex PCR for detection of Mycoplasma pneumoniae, Chlamydophila pneumoniae, Legionella pneumophila, and Bordetella pertussis, in clinical specimens/ E.A. McDonough, C.P. Barrozo, K.L. Russell et al.//Mol. Cell. Probes.-2005.Vol.19.-P.314-322. 99. Mérault N. Specific Real-Time PCR for Simultaneous Detection and Identification of Legionella pneumophila Serogroup 1 in Water and Clinical Samples/ N. Mérault, C. Rusniok, S. Jarraud et al.// Appl. Environ. Microbiol. -2011.-Vol. 77. –P. 1708–1717. 100. Mygind T. Evaluation of real-time PCR for identification and quantification of Chlamydia pneumoniae by comparison with immunohistochemistry / T. Mygind, S. Birkelund, E. Falk et al. // J. Microbiol. Methods. – 2001. – V. 46. – P. 241-251. 101. Moussa K. Phagocyte function and cytokine production in community-acquired pneumonia. / K. Moussa, H.J. Michie, I.A. Cree et al. //Thorax -1994. - Vol.49. –P.107–111. 102. Murdoch D.R. Nucleic acid amplification tests for the diagnosis of pneumoniae // Clin. Infect. Dis. – 2003. – V. 36. – P. 1162-1170. 103. Murdoch D.R. Diagnosis of Legionella infection/ D.R. Murdoch// Clin. Infect. Dis.- 2003.-Vol.36.-P.64-69. 104. Murphy T.F. Lung infections. 2. Branhamella catarrhalis: Epidemiological and clinical aspects of a human respiratory tract pathogen/ T.F. Murphy// Thorax. -1998.-Vol.53.-P.124–128. 105. Nelson S. Pathophysiology of pneumonia. / S. Nelson, C.M. Mason, J. Kolls, et al. // Clin Chest Med. - 1995. – Vol. 16.- P. 1–12 106. Oosterheert J.J. Impact of Rapid Detection of Viral and Atypical Bacterial Pathogens by Real-Time Polymerase Chain Reaction for Patients with Lower Respiratory Tract Infection /J.J. Oosterheert , A.M. van Loon, R.Schuurman et al.//Clin. Infect Dis.-2005.-Vol.41.-№10.-P.14381444. 107. Pinar A. Rapid detection of bacterial atypical pneumonia agents by multiplex PCR / A. Pinar, N. Bozdemir, T. Kocagoz, R. Alacam // Cent. Eur. J. Public. Health. – 2004. – V. 12. – №1. - P. 3-5. 108. Principi N. Role Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae in children with community-acquired lower respiratory tract infections/N. Principi, S. Esposito, F.Blasi et al.//Clin. Infect. Dis.-2001.-Vol.32.-P.1281-1289. 61 109. Pugin J, CD14 is a pattern recognition receptor./ J. Pugin, D. Heumann D., A.Tomasz et al// Immunity. – 1994. V. 1. P.509-516. 110. Qasem J.A. Polymerase chain reaction as a sensitive and rapid method for specific detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical samples/ J.A. Qasem, Z.U. Khan, G. Shiji et al.//Microbiol. Res.-2002.-Vol.157.-P. 77-82. 111. Raggam R. B. Single-run, parallel detection of DNA from three pneumonia-producing bacteria by real-time polymerase chain reaction/ R. B. Raggam, E. Leitner, J. Berg et al. // J. Mol. Diagn.- 2005.-Vol.7. - P.133-138. 112. Rakovskaya I.V. Application of different methods in the diagnosis respiratory mycoplasmosis/ I.V. Rakovskaya, L.G. /Gorina, N.A. Zigangirova rt al.// Zh. Microbiol. Epidemiol. Immunobiol. -2002. -№ 5. –Р. 57-62. 113. Revello M. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant / M. Revello, G.Gerna // Clin. Microbiol. Rev. – 2002. – V. 10. – P. 680-715. 114. Riesenfeld-Orn I, Production of interleukin-1 but not tumor necrosis factor by human monocytes stimulated with pneumococcal cell surface components. / I. Riesenfeld-Orn , S. Wolpe , J.F. Garcia-Bustos, M.K. Hoffmann, E. Tuomanen. //Infect Immun -1989. - №57Р.1890-1893. 115. Severe acute respiratory syndrome (SARS) ||Weekly epidemiological report. WHO. Zheneva. – 2003. – № 14. – P. 97-120 116. Schneeberger P.M. Diagnosis of atypical pathogens in patients hospitalized with community-acquired respiratory infection / P.M. Schneeberger, J.W. Dorigo-Zetsma, A. van der Zee et al. // Scand. J. Infect. Dis. – 2004. - V. 36. - №4. – P. 269-273. 117. Shen Z. The detection and clinical features of human cytomegalovirus infection in infants/ Z. Shen, S.Q. Shang, C.C. Zou et al.//Pediatr. Pathol.-2010. -Vol. 29(6).-P. 393-400. 118. Strålin K. Design of a multiplex PCR for Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae to be used on sputum samples/K. Strålin, A. Bäckman, H. Holmberg et al.// APMIS.-2005. –Vol.113.- P.99-111. 119. Templeton K.E. Comparison and evaluation of real-time PCR, real-time nucleic acid sequence-based amplification, conventional PCR, and serology for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae / K.E. Templeton, S.A. Scheltinga, A.W. Graffelman et al. // J. Clin. Microbiol. – 2003. – V. 4. - № 9. – P. 4366-4371. 120. Theiler R.N. Umbilical cord blood screening for cytomegalovirus DNA by quantitative PCR / R.N. Theiler, A.M. Caliendo, S. Pargman // J. Clin. Virol. - 2006. - Vol. 37, № 4. - P. 313316. 62 121. Tondella M.L. Development and evaluation of real-time PCR-based fluorescence assays for detection of Chlamydia pneumoniae / M.L. Tondella, D.F. Talkington, B.P. Holloway et al. // J. Clin. Microbiol. – 2003 - V. 41. – P. 4366-4371. 122. Tong C.Y. Detection of Chlamydia pneumoniae and Chlamydia psittaci in sputum samples by PCR / C.Y. Tong, M. Sillis // J. Clin. Pathol. – 1993. – V. 46. – P. 313-317. 123. Trevejo R.T. Evaluation of the polymerase chain reaction in comparison with other diagnostic methods for the detection of Chlamydia psittaci / R.T. Trevejo, B.B. Chomel, P.H. Kass // J. Vet. Diagn. Invest. – 1999. - V.11. - №6. – P. 491-496. 124. Tuomanen E.I., Рathogenesis of pneumococcal infection. /E.I. Tuomanen, R. Austrian., H. Robertmasure // The new england journal of medicine -1995. -Vol. 332. - No. 19 - Р.1280 – 1284. 125. Ursi D. Detection of Mycoplasma pneumoniae in respiratory samples by real-time PCR using an inhibition control / D. Ursi, K. Dirven, K. Loens et al. // J. Microbiol. Methods. – 2003. – V. 55. – P. 149-153. 126. Varon E. Impact of antimicrobial therapy on nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Branhamella catarrhalis in children with respiratory tract infections/ E. Varon, C. Levy, F. de la Rocque et al.//Clin. Infect. Dis. - 2000.- Vol.31.-P. 477–481. 127. Vervloet L.A. Infection by Mycoplasma pneumoniae and its importance as an etiological agent in childhood community-acquired pneumonia/ L.A. Vervloet, C. Marguet, P.A. Camargos // Braz. J. Infect. Dis. -2007.-Vol. 11.-№5.-P.507-14. 128. Waites K. B. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen/ K. B. Waites, D.F. Talkington// Clin. Microbiol. Rev.-2004.- Vol.174.-P. 697–728. 129. Wang Y. A multiplex PCR-based reverse line blot hybridization (mPCR/RLB) assay for detection of bacterial respiratory pathogens in children with pneumonia/Y. Wang, F. Kong, Y. Yang et al.//Pediatr. Pulmonol.- 2007.- Vol. 43.- №2.- P.150-159. 130. Wang G.C. Cytomegalovirus Infection and the Risk of Mortality and Frailty in Older Women: A Prospective Observational Cohort Study/ G.C. Wang, W.H.L. Kao, P. Murakami et al. // Am. J. Epidemiol.-2010.-Vol.171.-№10.-P.1144–1152. 131. Welti M. Development of a multiplex real-time quantitative PCR assay to detect Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila and Mycoplasma pneumoniae in respiratory tract secretions / M. Welti, K. Jaton, M. Altwegg et al. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2003. – V. 45. - №2. – P. 85-95. 63 132. Yamazaki T. Comparison of PCR for sputum samples obtained by induced cough and serological tests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infection in children/ T.Yamazaki, M. Narita, N. Sasaki et al.// Clin. Vaccin. Immunol.- 2006.- Vol. 13.-P. 708–710. 133. Yaradou D.F. Integrated real-time PCR for detection and monitoring of Legionella pneumophila in water systems/D.F. Yaradou, S. Hallier-Soulier, S. Moreau et al.//Appl. Environ. Microbiol.-2007. -Vol.73. -P.1452-1456. 134. Yerly S. Cytomegalovirus quantification in plasma by an automated real-time PCR assay./ G.Shi, L. Perrin, C. Van Delden et al.//J.Clin.Virol.-2007.-V.8.- №4. -P. 298-303. 135. Yu V. L. Distribution of Legionella species and serogroups isolated by culture in patients with sporadic community-acquired legionellosis: an international collaborative survey/ V.L.Yu, M.C. Pastoris, J.E. Stout et al. // J. Infect. Dis. - 2002. - Vol. 186. -P. 127-128.
